Kalanchoë VS Jararaca

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
JÚLIA MORAIS FERNANDES
Bryophyllum pinnatum E Kalanchoe laciniata: ESTUDO FITOQUÍMICO,

METABOLÔMICO E AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO DA ATIVIDADE
FOSFOLIPÁSICA DA PEÇONHA DE Bothrops erythromelas DE EXTRATOS
OBTIDOS SOB DIFERENTES CONDIÇÕES DE CULTIVO
NATAL, RN
2019
JÚLIA MORAIS FERNANDES
Bryophyllum pinnatum E Kalanchoe laciniata: ESTUDO FITOQUÍMICO,

METABOLÔMICO E AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO DA ATIVIDADE
FOSFOLIPÁSICA DA PEÇONHA DE Bothrops erythromelas DE EXTRATOS
OBTIDOS SOB DIFERENTES CONDIÇÕES DE CULTIVO
Tese de Doutorado apresentada à Coordenação do

Programa de Pós-graduação em Ciências
Farmacêuticas, como requisito para obtenção do
título de Doutor em Ciências Farmacêuticas.
ORIENTADOR:
Profª. Drª. Silvana Maria Zucolotto Langassner
CO-ORIENTADOR:
Prof. Dr. Matheus Freitas Fernandes Pedrosa
NATAL, RN
2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Fernandes, Júlia Morais.

Bryophyllum pinnatum e Kalanchoe laciniata: estudo
fitoquímico, metabolômico e avaliação da inibição da atividade
fosfolipásica da peçonha de Bothrops erythromelas de extratos
obtidos sob diferentes condições de cultivo / Júlia Morais
Fernandes. - 2019.
250 f.: il.
Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde,
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Natal, RN,
2019.
Orientadora: Silvana Maria Zucolotto Langassner.
1. Crassulaceae - Tese. 2. Metabolômica - Tese. 3. Marcadores

químicos - Tese. 4. Fitoterápicos - Tese. I. Langassner, Silvana
Maria Zucolotto. II. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 582.6/.9
Elaborado por ANA CRISTINA DA SILVA LOPES - CRB-15/263

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Dedicatória
À Aida Maria de Morais, minha mãe, meu espelho e inspiração, a pessoa mais forte e
determinada desse mundo, uma mulher batalhadora e vencedora, fonte inesgotável de amor e
dedicação, o melhor que há em mim! Amo-te com o amor mais verdadeiro desse mundo!
A Rayllan Rodrigues, meu amor, meu lar, meu abrigo mais seguro, seu amor,
paciência, confiança e compreensão foram a motivação para que eu conseguisse vencer mais
essa etapa tão importante da minha vida. Amo-te!
À tia Aíla, meu ponto forte e me amparo nas horas mais duras e difíceis, sua alegria,
ternura, carinho e compaixão me inspiram todos os dias, e foram combustível para que eu
conseguisse alcançar mais essa vitória.. Amo-te com o amor de uma filha!
A José Maria (in memoriam), meu voinho, que se estivesse ainda entre nós nessa vida
terrena estaria se regozijando com essa conquista em minha vida, mas tenho certeza que seja
aonde ele estiver, está comemorando comigo esse momento. Saudades eternas!
À minha orientadora, Silvana Zucolotto, por toda a dedicação, apoio e paciência

durante toda essa trajetória, e por ensinar-me tanto com suas atitudes e ações, fazendo-me
crescer como profissional e como pessoa. Um verdadeiro anjo que Deus colocou no meu
caminho.
Ao meu tio José Ailson (in memoriam), que nos deixou tão cedo, mas que vibrava
comigo e se alegrava a cada vitória. Sua alegria, fé e bom humor sempre foram inspiradoras
para mim. Saudades eternas!
Júlia Morais Fernandes

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Agradecimentos
AGRADECIMENTOS
A Deus - Pai, Filho e Espírito Santo - meu refúgio e minha fortaleza, meu alicerce,
minha força e vida. O autor dessa vitória! À Nossa Senhora que sempre foi meu amparo em
momentos de desespero e de esperança, que sempre me acompanhou e nunca me deixou abalar!
Rezar, sempre foi a melhor maneira de acalmar meu coração e diminuir a ansiedade que me
acometeu durante essa fase tão complicada. Se Deus não está fazendo, é porque Ele já fez.
A Rayllan Rodrigues por todo seu amor, amizade, companheirismo, incentivo, ânimo,
e, principalmente paciência. Obrigada por me ajudar a superar todos obstáculos de mais uma
etapa, muitas vezes acreditando mais em mim do que eu mesma. Obrigada por ter feito esse
doutorado comigo, ajudando-me muitas vezes em experimentos desde muito cedo da manhã até
muito tarde da noite, ou por me acompanhar aos finais de semana ao laboratório, ou por ser
figurinha carimbada nas minhas coletas e durante as épocas de cultivo. Obrigada por ter sido o
maior incentivador do período sanduíche e por ter atravessado o Atlântico só me fazer
companhia e aplacar um pouco a saudade. Você é o meu lar!
À minha mãe, Aida M. Morais, minha rainha, por fazer com que tudo isso fosse
possível! Se hoje posso completar outra etapa da minha vida, a senhora é a força, o incentivo,
o amparo mais protetor e o alicerce de toda essa vitória.
À tia Aíla, a quem dedico o amor de uma filha, que me amparou nas infinitas vezes que
precisei, das gargalhadas que me arrancou em momentos de aflição, por ser um porto seguro,
pelos conselhos e afagos que me faziam sempre mais forte para continuar.
Ao meu pai, Jonas Fernandes, por todo amor, carinho, incentivo e compreensão.
Aos meus irmãos, Victor, Sara, Lucas e Bruna por me proporcionarem alegria quando
mais preciso, por me encherem de orgulho todos os dias, por todo amor, incentivo, força e fé.
À minha irmã Sara, amiga, cúmplice, confidente e companheira de todas as horas e
momentos. Sempre somos tão fortes juntas! Minha sis que me auxiliou em tantas coletas e até
em preparo de amostras, sempre dando muitas gargalhadas com nossos mungangos, e tornando
aquele trabalho menos árduo. Obrigada por ter sido um dos meus pontos mais fortes durante o
período sanduíche, sem sua companhia diária, mesmo distante, eu não teria conseguido!
Obrigada por ter ido até lá aplacar um pouco a nossa saudade! Você é a minha pessoa!
À Profa. Silvana Zucolotto, minha eterna orientadora, por todo ensinamento, apoio,
carinho, amizade e confiança, além de paciência e compreensão nas horas em que tanto precisei.
Nosso encontro aconteceu na hora certa em minha e só me trouxe coisas boas. Deus sabe de
tudo nessa vida, e hoje vejo o propósito Dele nesse nosso encontro. São quase dez anos nessa
caminhada juntas, e só tenho coisas boas para falar de ti e a agradecer por essa parceria incrível

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Agradecimentos
que construímos nesses anos com bastante transparência e sinceridade. Obrigada pela primeira
oportunidade quando me aceitastes na iniciação científica, sendo sua primeira aluna na UFRN,
e por todas as outras que vieram depois. Sou extremamente grata por me orientar com tanta
dedicação, e por me incentivar sempre a galgar algo novo nessa caminhada. Obrigada por
ensinar-me tanto com suas atitudes e ações, fazendo-me crescer como profissional e como
pessoa. Como te disse uma vez, sou extremamente privilegiada por te ter como orientadora!
Ao meu co-orientador, Prof. Matheus Pedrosa, pelas oportunidades dadas e por todo
conhecimento na área de toxinologia que vem me transmitindo.
Ao Prof. Raphael Grougnet, meu co-orientador estrangeiro, por ter recebido-me de
braços abertos em seu laboratório na Université Paris Descartes. Por toda atenção e cuidado
dispensado durante todo o meu período sob sua tutela nesse estágio doutoral. Agradeço
imensamente por ensinar-me com enorme paciência, das horas que gastou comigo no RMN
tanto para que eu aprendesse a operar o equipamento com total segurança e liberdade, quanto
para discutir infinitos espectros em frente ao computador. Não tenho palavras para agradecer o
quanto você foi indispensável para o meu crescimento e amadurecimento científico.
Ao Prof. Edgar pela valiosa ajuda na execução das análises quimiométricas do estudo
metabolômico e interpretação dos resultados. Obrigada pela disponibilidade de sempre sanar
os diversos questionamentos que tenho sobre essa área.
À Profa. Raquel Brandt pelo apoio, ensinamentos e carinho, auxiliando-me com suas
tão valiosas contribuições e ideias.
À Profa. Renata Mendonça pelas ideias, carinho e apoio, pela valiosa ajuda nos
experimentos de RMN e de CLAE. Além de tudo, por ter trazido as mudas autênticas de K.
laciniata e B. pinnatumda UFC para que pudéssemos iniciar todo esse trabalho.
Agradeço imensamente ao Prof. Lula, que me deu a primeira oportunidade na pesquisa
e me ajudou a entender melhor o que eu queria. Recebeu-me de braços abertos em seu
laboratório naquela sua tranquilidade característica.
À Dra. Katerina, do Benaki Institute, em Atenas, pela ajuda na realização das análises
por CLUE-EM/EM dos extratos da metabolômica da B. pinnatum.
Ao Prof. Josean Tavares e ao doutorando Lucas Silva, da UFPB, pela ajuda na realização
das análises por CLAE-EM/EM dos extratos da metabolômica de K. laciniata.
Ao Prof. Eduardo Azevedo pela valiosa ajuda na revisão do inglês dos artigos.
Aos Profs. Raquel Brandt, Renata Mendonça e Arnóbio Silva por terem aceito fazer
parte da minha banca de Exame de Qualificação de Doutorado, e pelas valiosas sugestões e
contribuições para melhorar esse trabalho.

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Agradecimentos
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas por todo

ensinamento e conhecimento transmitido. À Fábia e Gibson pela paciência e auxílio.
À Lívia Matos e Anne Costa, pós-graduandas que acompanhei durante minha iniciação
científica, pelos ensinamentos e pela tão generosa parceria e amizade. À Magda Assunção por
até hoje compartilhar comigo seus conhecimentos e ensinamentos.
Aos colegas do Grupo de Pesquisa em Produtos Naturais Bioativos (PNBio) pela
amizade, ajuda, apoio e troca de experiências. Em especial gostaria de agradecer a todos os
alunos de iniciação científica que me acompanharam durante algum momento nesse tempo de
laboratório, as Lorenas (Cunha e Maria), Fabrício, Jordan (também técnico agrícola, que me
deu várias dicas de cultivo), Estela, Raquel e Juliana. Em especial à Lorena Cunha e Raquel
Padilha, a primeira que foi um pilar no início do doutorado, impecável na elaboração e execução
de experimentos, e a segunda que muito me ajudou e apoiou nesse último ano de doutorado, na
reta final, sempre muito dedicada, atenciosa e disposta a me acompanhar em todos os
experimentos, obrigada meninas pela amizade, carinho e confiança, a participação de vocês foi
fundamental para realização desse trabalho.
Gostaria de agradecer também aos meus companheiros Edilane e Anderson, que
trabalham com as mesmas plantas, por partilhamos tantos momentos e nos ajudarmos em
muitos experimentos. Cada descoberta e resultados positivos em relação as espécies, fazíamos
muita festa. Eu sou extremamente grata por poder partilhar da parceria e amizade de vocês.
A Renato Dantas (Baby tentação, minha cria), também do GPNBio, por ter sido o
melhor companheiro de pesquisa ever que alguém poderia ter! Nossas discussões e devaneios
sobre os experimentos e perspectivas são impagáveis! Sua companhia no sanduíche, mesmo
que por um período curto, fez tudo ser mais alegre. Além de tudo por ter me presenteado com
a sua verdadeira e inestimável amizade, a qual cuido todos os dias com boas doses de carinho.
A Emerson por seu companheirismo, amizade, troca de experiências e discussões
valiosíssimas sobre pesquisa, perspectivas de futuro e coisas triviais da vida, desde quando
entramos no lab., na graduação.
À Letícia pela parceria e amizade sincera, lutamos muito para manter o rota sempre
funcionando rsrsrs... ô saga!
Ainda agradecer à Gabriele Pereira por ter me ajudado a padronizar os estudos de
cultivos. Bem como à Fernanda e Larissa pelas valiosas discussões sobre metabolômica,
experimentos e trivialidades... rsrsrs.
Ao técnico do Laboratório de Farmacognosia, Luiz pela paciência e compreensão.

6
Agradecimentos
Aos colegas do Laboratoire de Farmacognosie da Université Paris Descartes. À

Tesvetilina, a búlgara mais amável e doce do planeta, grande amiga e companheira dessa
jornada, presente de Deus. A Sérgio, amigo chileno e parceiro de horas sem fim no laboratório,
sem você esse sanduíche não teria sido o mesmo, quantas gargalhadas juntos. Aos meus gregos
mais queridos Cristina, Aleksandros e Prof Marina. Ao francês mais brasileiro que conheci,
Romam, que sorte a nossa, esse encontro! À Nabiha, minha doce e meiga amiga árabe, e todas
as meninas tunisianas que trabalhavam no laboratório no início do meu período lá. Também
aos profs. e pesquisadores Sabrina, Marina, François Hugo, Xavier, Thomas (Engenier du
laboratoire) e Silvie Michel (la directrice). Aos técnicos que me ajudaram Olivier, Alexander e
Sabrina (que se tornou uma grande amiga), especialmente a Karime e Pascoal que tanto me
auxiliaram nos experimentos de RMN e EM. E as secretárias no Gislene e Marise.
Aos colegas do Laboratório de Tecnologia e Biotecnologia Farmacêutica (TecBioFar),
em especial à Juliana Félix e Jacinthia Beatriz por terem me auxiliado nos experimentos de
atividade biológica. Também à Manoela Torres por ter liofilizado todos os meus 150 extratos
da metabolômica que iria levar para Paris.
Ao Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos (LCQMed), especialmente
ao Prof. Leandro por ter disponibilizado o TFA para as análises de validação por CLAE. À
Dayane por todas as vezes que me ajudou tirando dúvidas de CLAE.
Ao Laboratório de Sistemas Dispersos (LASid), especialmente a Lucas (companheiro
de PDSE) e Alexandrino, que sempre liofilizaram minhas amostras e quando precisei de algo
do Lasid, sempre estiveram disponíveis a ajudar, fora as nossas conversas e choradeiras juntos.
À técnica Sarah Sued e à doutora em botânica Rúbia Santos Fonseca do Herbário Prisco
Bezerra da UFC pela confecção da excicata da espécie B. pinnatum. E ao pessoal da Farmácia
Viva do Horto Francisco José de Abreu Matos por nos forneceram mudas autênticas das
espécies para iniciar todo esse trabalho.
Aos técnicos da Central Analítica do Instituto de Química, Elânia e Jônatas, pela ajuda
na execução dos experimentos por CLAE. Solícitos não, depois! E à equipe da Escola Agrícola
de Jundiaí (EAJ), Anderson, Eduardo, Jefferson e Luizinho, que me ajudaram durante a
execução dos experimentos de cultivo e estresses.
Agradeço aos amigos que partilharam comigo essa experiência do doutorado, pela
parceria nos trabalhos, amizade, carinho e respeito mútuo, em especial a Ana Luiza, Gabriel
Azevedo, Renato Ribeiro, Jacyra Gomes e Lyghia. Aos Amigos da Maison do Brésil, em
especial a Juliana, Camilo, Dani, Marina, Kimie, Taci e Gabriel. Também aos moradores do
nosso quatriéme étage (Hernandes, Luciana, Igor, Dumet, Mariem, Amine, Sophie, Marília,

7
Agradecimentos
Carol, Laís, Cláudio e Diogo) e aos funcionários Fred, Ablo (in memoriam) e Jane. Esse período
foi mais fácil por contar com a amizade de vocês!
Aos funcionários sempre tão solícitos, Bênia, Roger, Nilma, D. Ana e Fernando.
À Capes pelo auxílio financeiro concedido na forma de bolsa de doutorado e na forma
de bolsa de doutorado sanduíche no exterior (Capes/PDSE). Ao CNPq pela aprovação do
projeto Universal nº 14/2014. E ao CNRS, órgão que fomenta a pesquisa na França, por todos
os recursos disponibilizados durando o estágio doutoral na Université Paris Descartes.
E a todos aqui não citados, que de alguma forma contribuíram com uma parcela especial
para a realização deste trabalho.

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Epígrafe
“Os que confiam no Senhor são como

montes de Sião, eternamente firme.”
Salmos 125:1
“Para tudo há um tempo, para cada coisa

há um momento debaixo dos céus.”
Eclesiastes 3:1
“Deus te vê, Deus te entende... Basta

confiar, saber esperar e Ele agirá.”
Eliana Ribeiro
“A imaginação é mais importante que a

ciência, porque a ciência é limitada, ao passo que
a imaginação abrange o mundo inteiro.”
Albert Einstein
“Talvez não tenha conseguido fazer o

melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito.
Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus,
não sou o que era antes.”
Marthin Luther King
“Seja a mudança que você quer ver no

mundo.”
Mahatma Gandhi
“A alegria está na luta, na tentativa, no

sofrimento envolvido e não na vitória
propriamente dita.”
Mahatma Gandhi

Resumo
RESUMO
As espécies Kalanchoe laciniata (L.) DC. e Bryophyllum pinnatum (Lam) Pers.

(Crassulaceae), conhecidas popularmente como saião ou coirama, são utilizadas no Brasil,
especialmente na região Nordeste, e seu uso destaca-se no tratamento de problemas
inflamatórios. Na literatura são encontrados relatos sobre a constituição química dessas
espécies, com destaque para a presença de flavonoides glicosilados derivados da patuletina,
canferol e quercetina, no entanto, ainda não se sabe quais são os compostos ativos. Somado a
isso, carecem de estudos de controle de qualidade que contribuam na autenticação e
diferenciação de K. laciniata e B. pinnatum, especialmente por Cromatografia Líquida de Alta
ou Ultra Eficiência (CLAE ou CLUE) e/ou Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Tendo em
vista que B. pinnatum faz parte da Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse do SUS,
faz-se necessário aprofundar os estudos com as espécies para garantir a segurança, eficácia e
qualidade de um possível medicamento fitoterápico com essas espécies. Dentro deste contexto,
a proposta tem como objetivo realizar uma abordagem metabolômica e farmacológica das
espécies K. laciniata e B. pinnatum. Para atingir esse objetivo, a metodologia do estudo foi
dividida nas seguintes partes: i: isolamento e caracterização dos marcadores químicos dos
extratos das folhas das espécies; ii: quantificação dos marcadores químicos; iii: abordagem
metabolômica dos extratos em resposta ao estresse induzido por suspensão de rega e salinidade;
iv: ensaios não-clínicos in vitro para avaliar os efeitos inibitórios dos extratos frente a enzima
PLA2 que auxilia no desencadeamento do envenenamento causado por Bothrops erythromelas.
Como resultados mais significativos: i. por meio da técnica de Cromatografia em Partição
Centrífuga (CPC) foi possível isolar os flavonoides majoritários de B. pinnatum de forma rápida
e eficiente, além de obter uma substância até hoje não descrita para o gênero, a sarmentosina;
ii. a) quantificar três flavonoides no extrato de B. pinnatum por CLUE-DAD e sugerir o
flavonoide quercetina 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-ramnopiranosídeo (BP1), como
marcador específico para a espécie e b) desenvolver e validar um metodologia por RMN para
quantificar a sarmentosina no extrato de B. pinnatum; iii. pela abordagem metabolômica dos
dados gerados por CLUE-EM/EM foi observado que as condições de seca e salinidade podem
influenciar na produção de diferentes metabólitos pela planta, indicando que as espécies são
resistentes a suspensão de rega até o 20º dia, mas que a menor quantidade de salinidade na água
de rega já induz diferenças na produção de metabólitos, especialmente compostos fenólicos; iv.
as atividades in vitro evidenciaram o potencial das espécies em inibir a PLA2, uma toxina
importante no envenenamento, e mostraram que os extratos obtidos a partir dos estresses salino
e hídrico influenciam diretamente na sua inibição. Diante do exposto, este trabalho significou
um grande avanço no estudo com as espécies, uma vez que a investigação química e
farmacológica foi aprofundada. Dessa forma, foram obtidos através de uma metodologia
eficiente e verde desenvolvida por CPC, os marcadores do extrato de B. pinnatum em grande
quantidade, bem como validação de um método para quantificação dos mesmos de acordo com
os parâmetros da RDC 166/2017, até então não encontradas na literatura. Além disso, foi
possível sugerir determinadas condições de cultivo que influenciam na produção de metabólitos
pelas plantas, possivelmente ligados com a atividade antiveneno apresentada pelos extratos de
ambas espécies.
PALAVRAS-CHAVE: Crassulaceae; metabolômica; marcadores químicos; fitoterápico.

Abstract
ABSTRACT
Kalanchoe laciniata (L.) DC. and Bryophillum pinnatum (Lam) Pers. (Crassulaceae)
known populary as saião or coirama are used in Brazil, mainly in the Northeast region, and
their use remarks in the anti-inflammatory problems treatment. Regarding chemical
composition, patuletin, kaempferol and quercetin glycosylates derivates are the main
compounds decribed, however the active compounds are not known. Besides, there are not
enough control quality studies that can be contribute to authentication and differentiation
between K. laciniata and B. pinnatum, especially by High or Ultra Performance Liquid
Chromatography (HPLC or UPLC) coupled Mass Spectrometer (MS) and/or Nuclear Magnetic
Resonance (NMR). Once B. pinnatum is in Renisus (Relação Nacional de Plantas Medicinais
de Interesse do SUS), it is necessary to increase studies with the both species to ensure safety,
efficacy and quality of the possible herbal drug can be developed and distributed by SUS. In
this context, the proposal is performed a metabolomic and pharmacologic approach with K.
laciniata and B. pinnatum species. To achieve this goal, the methodology was divided: i:
isolation and characterization of main compounds of leaves extracts of both species; ii:
quantification of chemical markers; iii: metabolomic approach of the extracts in response to
stress induced by drought and salt stress; iv: in vitro assays to evaluate the inhibitory effects of
the extracts against the enzymes that trigger the Bothrops erythromelas envenomation. The
most significant results were i. by the centrifugal partition chromatography (CPC) technique
application, it was possible to isolate quickly and efficiently the majors flavonoids of B.
pinnatum, besides it has enabled the isolation of substance not described for the genus, named
sarmentosin; ii. a) to quantify three flavonoids in the extract of B. pinnatum by UPLC-DAD
and to suggest the flavonoid quercetin 3-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→2)-O-α-L-
rhamnopyranoside as a specific marker it, and b) to develop and validate an NMR methodology
to quantify sarmentosin in the extract of B. pinnatum; iii. metabolomic approach obtained by
UPLC-MS/MS data showed that drought and salinity conditions can influence production of
different metabolites, indicating that both species are resistant to watering suspension up to the
20th day, but that the lower amount of salinity in the irrigation water already induces differences
in metabolic production, mainly phenolic compounds; iv. in vitro activities showed the potential
of the species in inhibiting PLA2, an important toxin in poisoning, and showed that extracts
obtained from saline and water stress directly influence its inhibition. In this context, this work
represented a chemical and pharmacological advance in the study of these species. Thus,
through an efficient and green methodology developed by CPC, the markers of B. pinnatum
extract in large quantities were obtained, as well as the validation of a method to quantify them
according to the parameters of RDC 166/2017, until so not found in the literature. In addition,
it was possible to suggest certain cultivation conditions that influence the production of
metabolites by plants, possibly linked with the antivenom activity presented by extracts of both
species.
KEY-WORDS: Crassulaceae; metabolomic; chemical markers; herbal medicine.

Lista de Figuras
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Estrutura do rotor. .................................................................................................. 61

Figura 2 – Células e ductos dentro do rotor do CPC. .............................................................. 62
Figura 3 – Modos de operação do CPC. Modos ascendente e descendente. ........................... 62
Figura 4 – Modus operandi das técnicas de separação em contracorrente do tipo hidrostática,
como a CPC. ............................................................................................................................. 63
Figura 5 - Esquema representativo da CC com XAD-4 do EHE liofilizado de B. pinnatum. 74
Figura 6 - Teste de escolha do sistema solvente para CPC por CCD. .................................... 75
Figura 7 – Diluições da curva de calibração de cada flavonoide isolado (BP1, BP2 e BP3).. 81
Figura 8 - Diluições da curva de calibração do EHEL de B. pinnatum................................... 82
Figura 9 – Análise do parâmetro de repetibilidade. ................................................................ 82
Figura 10 – Análise do parâmetro de precisão intermediária. ................................................. 83
Figura 11 – Análise do parâmetro de recuperação. ................................................................. 83
Figura 12 - CCDs dos extratos hidroetanólicos de B. pinnatum. ............................................ 88
Figura 13 - Cromatograma CLUE-DAD do EHEL de B. pinnatum (A) 254 nm e (B) 340 nm.
.................................................................................................................................................. 89
Figura 14 - Cromatograma CLUE-EM/EM do EHEL de B. pinnatum (A) modo negativo e (B)
modo positivo. .......................................................................................................................... 90
Figura 15 – Fragmentação EM/EM do composto nitrogenado sarmentosina no modo positivo
(superior) e no modo negativo (inferior). ................................................................................. 92
Figura 16 - Mecanismo de fragmentação da sarmentosina. .................................................... 93
Figura 17 - Estrutura química da sarmentosina identificada. .................................................. 93
Figura 18 - Resumo do processo de isolamento conduzido para B. pinnatum. ....................... 96
Figura 19 - Análise por CCD dos flavonoides isolados e elucidados. .................................... 97
Figura 20 – Cromatograma obtido por CLUE-DAD do EHEL de B. pinnatum. .................... 97
Figura 21 - Espectro de RMN de 1H do flavonoide Bp1 (MeOD, 400 MHz). ...................... 100
Figura 22 - Espectro de RMN COSY do flavonoide Bp1 (MeOD, 400 MHz). .................... 101
Figura 23 - Espectro de RMN HSQC do flavonoide Bp1 (MeOD, 400 MHz e 100 MHz). . 102
Figura 24 - Espectro de RMN HMBC do flavonoide Bp1 (MeOD, 400 MHz e 100 MHz). 103
Figura 25 – Estrutura química de Bp1. .................................................................................. 104
Figura 26 - Esquema da via do ácido chiquímico. ................................................................ 107
Figura 27 - Esquema da rota biosintética de Bp1. ................................................................. 108

Lista de Figuras

Figura 34 - Identificação estrutural dos flavonoides isolados de B. pinnatum ...................... 118
Figura 35 - Espectro de RMN de 1H do flavonoide Bp6 (D2O, 400 MHz). .......................... 120
Figura 36 - Espectro de RMN COSY do flavonoide Bp6 (D2O, 400 MHz). ........................ 121
Figura 37 - Espectro de RMN de 13C do flavonoide Bp6 (D2O, 400 MHz).......................... 122
Figura 38 - Espectro de RMN HSQC do flavonoide Bp6 (D2O, 400 MHz). ........................ 123
Figura 39 - Espectro de RMN HMBC do flavonoide Bp6 (D2O, 400 MHz). ....................... 124
Figura 40 - Espectro de RMN de 1H do flavonoide Bp5 (D2O, 400 MHz). .......................... 125
Figura 41 - Identificação estrutural KMC e ácido málico. .................................................... 126
Figura 42 - Espectro de RMN de 1H do composto Bp7 (MeOD, 400 MHz). ....................... 128
Figura 43 - Espectro de RMN de 13C do composto Bp7 (MeOD, 400 MHz). ...................... 129
Figura 44 - Espectro de RMN COSY do composto Bp7 (MeOD, 400 MHz)....................... 130
Figura 45 - Espectro de RMN HSQC do composto Bp7 (MeOD, 400 MHz)....................... 131
Figura 46 - Espectro de RMN HMBC do composto Bp7 (MeOD, 400 MHz). .................... 132
Figura 47 - Identificação estrutural da sarmentosina. ........................................................... 133
Figura 48 - Espectro de RMN de 1H do Bp8 (MeOD, 400 MHz). ........................................ 136
Figura 49 - Identificação estrutural do 1-octen-3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→6)-β-
glicopiranosideo. .................................................................................................................... 137
Figura 50 - Curva analítica da linearidade para cada flavonoide individual. ........................ 141
Figura 51 - Curva analítica da linearidade para cada flavonoide dentro do extrato. ............. 142
Figura 52 – Cromatogramas obtidos do EHEL de B. pinnatum na análise da robustez........ 145
Figura 53 - Concentração (%) de cada flavonoide isolado no EHEL de B. pinnatum. ......... 146
Figura 54 - Espectros de RMN de 1H 400 MHz do extrato de B. pinnatum (A), da sarmentosina
(B) e do padrão interno cafeína (C) em MeOD:D2O (3:2, v/v). ............................................. 150
Figura 55 - Curva analítica da linearidade para a sarmentosina. ........................................... 151
Figura 56 - Espectro de RMN de 1H 400 MHz do EHEL de B. pinnatum com o padrão interno
cafeína em MeOD:D2O (3:2, v/v)........................................................................................... 151
Figura 57 - CCDs dos extratos hidroetanólicos de K. laciniata. ........................................... 163
Figura 58 - Cromatograma CLUE-EMAR/EM do EHEL de K. laciniata (A) modo negativo e
(B) modo positivo. .................................................................................................................. 164

Lista de Figuras
Figura 59 - Resumo do processo de isolamento conduzido para K. brasiliensis. ................. 166

Figura 60 - Estrutura da patuletina. ....................................................................................... 167
Figura 61 - Espectro de RMN de 1H do flavonoide Kl2 (MeOD, 400 MHz).Fonte: Adaptado
de Resultados experimentais. ................................................................................................. 169
Figura 62 - Espectro de RMN de 13C do composto Bp7 (MeOD, 400 MHz). ...................... 171
Figura 63 - Espectro de RMN Cosy do flavonoide Kl2 (MeOD, 400 MHz e 100 MHz). .... 173
Figura 64 - Espectro de RMN HSQC do flavonoide Kl2 (MeOD, 400 MHz e 100 MHz). .. 174
Figura 65 - Espectro de RMN HSQC do flavonoide Kl2 (MeOD, 400 MHz e 100 MHz). .. 175
Figura 66 - Estrutura química de Kl2 .................................................................................... 177
Figura 67 - Ilustração esquematizada do estudo de estresse hídrico. .................................... 187
Figura 68 - Ilustração esquematizada do estudo de estresse salino. ...................................... 188
Figura 69 - Registo da evolução morfológica macroscópica das mudas de B. pinnatum durante
o estudo de estresse hídrico. ................................................................................................... 195
Figura 70 - Gráfico que ilustra a média em % (±DP) o rendimento do EHEL do estresse hídrico
de B. pinnatum. ....................................................................................................................... 195
Figura 71 - PCA realizado com todos os indivíduos submetidos ao estresse hídrico de B.
pinnatum. Dados no modo positivo. ....................................................................................... 198
Figura 72 - PCA realizado com todos os indivíduos submetidos ao estresse hídrico de B.
pinnatum. Dados no modo negativo. ...................................................................................... 198
Figura 73 - PCA realizado com todos os grupos T20 e T30 versus Grupos controles. Dados no
modo positivo. ........................................................................................................................ 199
Figura 74 - PCA realizado com todos os grupos T20 e T30 versus Grupos controles. Dados no
modo negativo. ....................................................................................................................... 199
Figura 75 - PLS realizado com todos os grupos T20 e T30 versus Grupos controles. Dados no
modo positivo. ........................................................................................................................ 200
Figura 76 - PLS realizado com todos os grupos T20 e T30 versus Grupos controles. Dados no
modo positivo. ........................................................................................................................ 200
Figura 77 - Registo da evolução morfológica macroscópica das mudas de K. laciniata durante
o estudo de estresse hídrico. ................................................................................................... 202
Figura 78 - Gráfico que ilustra a média em % (±DP) o rendimento do EHEL do estresse hídrico
para K. laciniata ..................................................................................................................... 202
o estudo de estresse salino. ..................................................................................................... 204

Lista de Figuras
Figura 80 - Gráfico que ilustra a média em % (±DP) o rendimento do estresse salino para B.
pinnatum. ................................................................................................................................ 204
Figura 81 - PCA realizado com todos os grupos tratados versus grupos controles do estresse
salino. Dados no modo positivo. ............................................................................................ 206
Figura 82 - PCA realizado com todos os grupos tratados versus grupos controles do estresse
salino. Dados no modo negativo............................................................................................. 206
Figura 83 - PLS realizado com todos os grupos tratados versus grupos controles do estresse
salino. Dados no modo positivo. ............................................................................................ 207
Figura 84 - PLS realizado com todos os grupos tratados versus grupos controles do estresse
salino. Dados no modo negativo............................................................................................. 207
Figura 85 - Gráfico que ilustra a média da concentração de sarmentosina em mg/g do extrato
de B. pinnatum obtido do estudo de estresse hídrico.............................................................. 209
o estudo de estresse salino. ..................................................................................................... 211
Figura 87 - Gráfico que ilustra a média da concentração de sarmentosina em mg/g do extrato
de B. pinnatum obtido do estudo de estresse hídrico.............................................................. 211
Figura 88 - Inibição da atividade fosfolipásica da peçonha de B. erythromelas para os extratos
de cada grupo controle e tratamento de estresse hídrico de B. pinnatum. .............................. 222
de cada grupo controle e tratamento de estresse salino de B. pinnatum................................. 223
de cada grupo controle e tratamento de estresse hídrico de K. laciniata................................ 224
de cada grupo controle e tratamento de estresse salino de K. laciniata. ................................ 225

Lista de Tabelas
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Condições cromatográficas para análise por CCD. ................................................ 72

Tabela 2 - Sistemas bifásicos testados para separação por CPC. ............................................ 76
Tabela 3 - Procedimentos realizados por CPC para a espécie B. pinnatum. ........................... 77
Tabela 4 - Procedimentos realizados por CLMP para a espécie B. pinnatum. ........................ 77
Tabela 5 - Especificações de fase móvel e amostras da 1ª CLMP de B. pinnatum. ................ 78
Tabela 6 - Especificações de fase móvel e amostras da 2ª e 3ª CLMP de B. pinnatum. ......... 79
Tabela 7 - Procedimento realizado por CC em gel de filtração molecular para a espécie B.
pinnatum. .................................................................................................................................. 79
Tabela 8 – Dados de máximos de UV dos compostos encontrados no EHEL de B. pinnatum.
.................................................................................................................................................. 90
Tabela 9 - Dados espectroscópicos de RMN de 1H (400 MHz) para o flavonoide Bp1 de B.
pinnatum em MeOD. .............................................................................................................. 104
Tabela 10 - Dados espectroscópicos de RMN 1H (400 MHz) para o flavonoide Bp2 de B.
pinnatum em MeOD. .............................................................................................................. 111
pinnatum em MeOD. .............................................................................................................. 114
pinnatum em MeOD. .............................................................................................................. 117
Tabela 13 – Dados químicos e rendimentos dos quatro flavonoides isolados de B. pinnatum.
................................................................................................................................................ 118
Tabela 14 - Dados espectroscópicos de RMN de 1H (400 MHz) para KMC e Ácido Málico em
D2O. ........................................................................................................................................ 126
Tabela 15 - Dados espectroscópicos de RMN de 1H (400 MHz) para sarmentosina em CD3OD.
................................................................................................................................................ 133
Tabela 16 - Dados espectroscópicos de RMN de 1H (400 MHz) para Bp8 em CD3OD. ...... 137
Tabela 17 - Parâmetros de System Suitability ........................................................................ 139
Tabela 18 - Parâmetros de seletividade avaliados. ................................................................ 139
Tabela 19 - Parâmetros de validação do método analítico para o Bp1. ................................. 143
Tabela 20 - Parâmetros de validação do método analítico para o Bp2 .................................. 144
Tabela 21 - Parâmetros de validação do método analítico para o Bp3. ................................. 144
Tabela 22 - Parâmetros de validação do método analítico para EHEL de B. pinnatum. ....... 144

Lista de Tabelas
Tabela 23 - Concentração dos compostos Bp1, Bp2 e Bp3 nas amostras do EHEL de B.
pinnatum ................................................................................................................................. 146
Tabela 24 - Parâmetros de validação do método analítico para o sarmentosina. .................. 151
Tabela 25 - Procedimentos realizados por CPC para a espécie K. laciniata. ........................ 160
Tabela 26 - Procedimentos realizados por CLAE prep para a espécie K. laciniata. ............. 161
Tabela 27 - Fases móveis utilizadas para cada procedimento de CLAE em escala preparativa
para K. laciniata. .................................................................................................................... 161
Tabela 28 - Procedimento realizado por CLMP para a espécie K. laciniata. ........................ 162
Tabela 29 - Especificações de fase móvel e amostras da 1ª CLMP de K. laciniata.............. 162
Tabela 30 - Dados espectroscópicos de RMN de 1H (400 MHz) para Kl2 em MeOD. ....... 176
Tabela 31 – Análise da água de irrigação. ............................................................................. 188

Lista de Siglas de Abreviaturas
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AcOEt Acetato de Etila

ACN Acetonitrila
AF Ácido Fórmico
Anova Analysis of variance (análise de variância)
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
Asp Aspartato
Asp49 Aspartato na posição 49
Bje Bothrops erythromelas
BP Bryophyllum pinnatum
Bp Denominação dos compostos isolados de B. pinnatum (Bp1, Bp2, Bp3, Bp4, Bp5,
Bp6, Bp7 e Bp8)
CAM Metabolismo do Ácido Crassuláceo
CC Coluna cromatográfica
CCD Cromatografia em Camada Delgada
CIM Concentração Inibitória Mínima
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLUE Cromatografia Líquida de Ultra Velocidade
CH2Cl2 Diclorometano
CLMP Cromatografia Líquida de Média Pressão
COSY Homonuclear Correlation Spectroscopy
CPC Cromatografia de Partição Centrífuga
Cp Coeficiente de partição
DAD Detector de arranjo de diodos
DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DMSO-d6 Dimetilsulfóxido-hexadeuterado
D2O Deuterium oxide (água deuterada)
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid (ácido etilenodiamino tetra-acético)
EHE Extrato Hidroetanólico
EHEL Extrato Hidroetanólico Liofilizado
EM Espectrometria de Massas
EtOH Etanol
Ext. Extrusão
FE Fase Estacionária
FBS Fetal bovine serum (soro fetal bovino)
FM Fase Móvel

Fr. Fração
His Histidina
HMBC Heteronuclear MultipleBond Correlation Spectroscopy
HMQC Heteronuclear MultipleQuantum CorrelationSpectroscopy
ICH International Conference on Harmonisation
IL-7 Interleucina 7
i.p. Intraperitoneal
KMC Dimalato de Kalancosine
KL Kalanchoe laciniata
Kl Denominação dos compostos isolados de K. laciniata (Kl1, Kl2, Kl3, Kl4, Kl5 e
Kl6)
Lys Lisina
Lys49 Lisina na posição 49
MeOD Metanol Deuterado
MeOH Metanol
MPO Mieloperoxidase
MPV Matéria prima vegetal
m massa
N Números de pratos teóricos
OMS/WHO Organização Mundial de Saúde/ World Health Organization
OMS Organização Mundial da Saúde
PLA2 Fosfolipase
QB Quantidade de Biomassa
RDC Resolução da Diretoria Colegiada
Renisus Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS
RDC Resolução da Diretoria Colegiada
r Resolução dos picos
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RMN de Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13
13
C
RMN de 1H Ressoância Magnética Nuclear de Hidrogênio
Rf Fator de Retenção
SAB Soro antibotrópico
SABC Soro antibotrópico-crotálico
SABL Soro antibotrópico-laquético
SAV Soroterapia antiveneno
SUS Sistema Único de Saúde
TFA Ácido Trifluoroacético

TPO Tireóide-peroxidase
t Tailing factor (fator de calda)
UV Ultravioleta
USP United States Pharmacopeia
Vol. Volume
Tr Tempo de retenção

Sumário
SUMÁRIO
APRESENTAÇÃO ................................................................................................................. 24
CAPÍTULO 1 – REVISÃO DE LITERATURA – Artigo publicado na revista Brasileira

de Farmacognosia em junho/2019 ......................................................................................... 27
CAPÍTULO 2 - ESTUDO QUÍMICO DE Bryophyllum pinnatum .................................... 59

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 59
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ...................................................................................... 61
2.1 CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO CENTRÍFUGA (CPC) ........................................ 61
2.2 CONSIDERAÇÕES SOBRE CONTROLE DE QUALIDADE E PADRONIZAÇÃO DE
PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS .................................................................... 65
3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 70
3.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 70
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 70
4 METODOLOGIA................................................................................................................ 71
4.1 MATERIAL VEGETAL .................................................................................................... 71
4.2 PREPARAÇÃO DO EXTRATO HIDROETANÓLICO DAS FOLHAS DE B. pinnatum
.................................................................................................................................................. 71
4.3 ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) .................... 72
4.4 ANÁLISES POR CLUE-DAD E CLUE-EM/EM ............................................................. 72
4.4.1 Análise por Cromatografia Líquida de Ultra Velocidade (CLUE)........................... 72
4.4.2 Análise por Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (CLUE-EMAR/EM) ....... 73
4.5 FRACIONAMENTO E ISOLAMENTO DOS COMPOSTOS ......................................... 74
4.5.1 Fracionamento por XAD-4 ........................................................................................... 74
3.5.2 Isolamento por Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC) ................................. 75
4.5.3 Isolamento por Cromatografia Líquida de Média Pressão (CLMP) ........................ 77
4.5.4 Purificação por Gel de Filtração Molecular................................................................ 78
4.6 ANÁLISE POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN) ............................ 79
4.7 ANÁLISE POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS (EM) ............................................. 80
4.8 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA POR
CLUE-dad PARA A QUANTIFICAÇÃO DOS FLAVONOIDES ......................................... 80
4.8.1 Seletividade .................................................................................................................... 81
4.8.2 Linearidade .................................................................................................................... 81
4.8.3 Precisão ........................................................................................................................... 82
4.8.4 Exatidão .......................................................................................................................... 83
4.8.5 Limite de Detecção (LOD) e Limite de Quantificação (LOQ)................................... 84
4.8.6 Robustez ......................................................................................................................... 81
4.9 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA POR RMN
PARA A QUANTIFICAÇÃO DE SARMENTOSINA ........................................................... 84
4.9.1 Substância referência (SR) e padrão interno (PI) ...................................................... 84
4.9.2 Preparação da amostra para as análises de RMN ...................................................... 85
4.9.3 Determinação do D1 (Relaxation delay - tempo de espera de relaxamento) ............. 85
4.9.4 Instrumentação e parâmetros de aquisição e processamento ................................... 85
4.9.5 Método de validação e quantificação ........................................................................... 86
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 88
5.1 ANÁLISE, FRACIONAMENTO E ISOLAMENTO ........................................................ 88
5.2 IDENTIFICAÇÃO E ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS
DE B. pinnatum. ....................................................................................................................... 97

Sumário
5.2.1 Identificação dos flavonoides ........................................................................................ 97

5.2.2 Identificação dos compostos Bp5 e Bp6 ..................................................................... 118
5.2.2 Identificação do composto Bp7................................................................................... 126
5.2.2 Identificação do composto Bp8................................................................................... 134
CLUE-DAD PARA QUANTIFICAÇÃO DOS FLAVONOIDES MAJORITÁRIOS DE b.
pinnatum ................................................................................................................................. 138
5.4 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANLÍTICA POR RMN
PARA A QUANTIFICAÇÃO DE SARMENTOSINA ......................................................... 148
6 CONCLUSÕES.................................................................................................................. 153
CAPÍTULO 3 - ESTUDO QUÍMICO DE Kalanchoe laciniata........................................ 155

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 155
2 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 157
2.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................................... 157
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................... 157
3 METODOLOGIA.............................................................................................................. 158
3.1 MATERIAL VEGETAL .................................................................................................. 158
3.2 PREPARAÇÃO DO EXTRATO HIDROETANÓLICO DAS FOLHAS DE K. laciniata
................................................................................................................................................ 158
3.3 ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) .................. 159
4.4 ANÁLISES POR CLUE-EM/EM .................................................................................... 159
3.5 FRACIONAMENTO E ISOLAMENTO DOS COMPOSTOS ....................................... 159
3.5.1 Isolamento por Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC) ............................... 159
3.5.2 Isolamento por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Preparativa (CLAE prep)
................................................................................................................................................ 160
3.5.3 Isolamento por Cromatografia Líquida de Média Pressão (CLMP) ...................... 161
3.6 ANÁLISE POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN) .......................... 162
3.7 ANÁLISE POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS (EM) ........................................... 162
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 163
4.1 FRACIONAMENTO, ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS DE
Kalanchoe laciniata................................................................................................................ 163
DE K. laciniata ....................................................................................................................... 166
5 CONCLUSÕES.................................................................................................................. 178
CAPÍTULO 4 – ESTUDO DE CULTIVO E METABOLÔMICO DE Bryophyllum

pinnatum E Kalanchoe laciniata .......................................................................................... 180
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 180
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .................................................................................... 182
2.1 UM POUCO SOBRE METABOLÔMICA E ESTRESSES ABIOÓTICOS ................... 182
3 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 184
2.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................................... 184
4 METODOLOGIA.............................................................................................................. 185
4.1 MATERIAL VEGETAL .................................................................................................. 185
4.2 CULTIVO DAS ESPÉCIES ............................................................................................. 185
4.2.1 Indução de estresse hídrico ......................................................................................... 186
4.2.2 Indução de estresse salino ........................................................................................... 187

Sumário
4.3 PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS E ANÁLISES ......................................................... 189

4.4 ANÁLISE MORFOLÓGICA MACROSCÓPICA E QUANTIDADE DE BIOMASSA 189
4.4.1 Análise estatística ......................................................................................................... 190
4.5 METABOLÔMICA GLOBAL de B. pinnatum e K. laciniata – METABOLISMO
SECUNDÁRIO POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ULTRA EFICIÊNCIA (CLUE-
EM/EM) .................................................................................................................................. 190
4.5.1 Instrumentação e parâmetros de análise ................................................................... 190
4.5.2 Preparação das amostras ............................................................................................ 191
4.5.3 Tratamento de dados ................................................................................................... 191
4.6 METABOLÔMICA ALVO DE B. pinnatum – QUANTIFICAÇÃO DE FLAVONOIDES
E SARMENTOSINA ............................................................................................................. 192
4.6.1 Análise dos extratos e quantificação dos flavonoides por CLUE-DAD .................. 192
4.6.2 Análise dos extratos e quantificação de sarmentosina por RMN de H 1 do estresse
salino ...................................................................................................................................... 192
4.1 INDUÇÃO DE ESTRESSE HÍDRICO PARA A ESPÉCIE B. pinnatum ....................... 194
4.3 INDUÇÃO DE ESTRESSE HÍDRICO PARA A ESPÉCIE K. laciniata ....................... 201
4.3 INDUÇÃO DE ESTRESSE SALINO EM B. pinnatum .................................................. 203
4.4 INDUÇÃO DE ESTRESSE SALINO EM K. laciniata ................................................... 210
6 CONCLUSÕES.................................................................................................................. 212
7 PERSPECTIVAS ............................................................................................................... 213
CAPÍTULO 5 – ESTUDO ANTIOFÍDICO IN VITRO de Bryophyllum pinnatum e

Kalanchoe laciniata ............................................................................................................... 215
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 215
2 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 218
2.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................................... 218
3 METODOLOGIA.............................................................................................................. 219
3.1 MATERIAL VEGETAL E EXTRATOS ......................................................................... 219
3.2 VENENO OFÍDICO ........................................................................................................ 219
3.3 INIBIÇÃO DA ATIVIDADE FOSFOLIPÁSICA ........................................................... 219
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................... 220
5 CONCLUSÕES.................................................................................................................. 227
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 229
APÊNDICES

23
Apresentação

24
Apresentação
APRESENTAÇÃO
O presente estudo tem como objetivo realizar uma abordagem metabolômica e
antiofídica dos extratos das espécies Kalanchoe laciniata e Bryophyllum pinnatum, obtidos sob
as diferentes condições de cultivo de suspensão de rega e salinidade. A partir da proposta
pretende-se também fornecer dados sobre segurança e eficácia de extratos de Kalanchoe
laciniata e Bryophyllum pinnatum. É importante destacar que Bryophyllum pinnatum está na
Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse do SUS (RENISUS), publicada pelo
Ministério da Saúde em fevereiro de 2009, com a sinonímia de Kalanchoe pinnata, o que
justifica a necessidade de desenvolver estudos comparativos entre essas espécies. Os resultados
podem contribuir ainda para o desenvolvimento de fitoterápicos, a partir do fortalecimento de
toda cadeia produtiva de um produto que possa ser desenvolvido com essas espécies, tanto pelo
desenvolvimento de metodologias analíticas para o controle de qualidade do derivado vegetal
e do produto acabado através da quantificação dos marcadores quanto pela padronização de
condições de cultivos da matéria-prima vegetal.
É importante salientar que esse trabalho é a continuação do mestrado da autora, e
contempla algo ainda não encontrado na literatura, que é a investigação da produção de
metabólitos pelas espécies frente a condições de estresse salino e hídrico, e como essas
condições podem interferir na atividade biológica dos extratos. Além disso, foram conduzidos
estudos in vitro com os extratos para avaliar a inibição da atividade fosfolipásica da peçonha
de Bothrops erythromelas, uma das toxinas mais importantes envolvidas nos efeitos locais e
sistêmicos desencadeados pelo envenenamento botrópico.
Adicionalmente, foi realizado um estágio doutoral no exterior, em Paris, França, no
Laboratoire de Pharmacognosie e Chimie de Substances Natureles, da Université Paris
Descartes, supervisionado pelo MCF-HDR Dr. Rapahel Grougnet. O estágio doutoral foi
realizado no período de 1 ano, iniciando em abril de 2017 e terminando em março de 2018, e
teve como objetivos: i. aplicar a técnica de Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC),
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Preparativa e Cromatografia Líquida de
Média Pressão (CLMP) no isolamento dos compostos majoritários nos extratos de B. pinnatum
e K. laciniata; ii. usar as técnicas de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e Espectrometria
de Massas (EM) na elucidação estrutural de compostos isolados; iii. usar a RMN como
ferramenta para desenvolvimento e validação de metodologia analítica para quantificação de
compostos; iv. analisar por Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência acoplada a EM/EM para
análise do perfil metabólico dos extratos obtidos a partir de mudas submetidas aos estresses
salino e hídrico.

25
Apresentação
Resumidamente, para atingir esse objetivo, a metodologia do estudo foi dividida nas
seguintes partes: i: isolamento e caracterização dos marcadores químicos do extrato das folhas
das espécies; ii: quantificação dos marcadores químicos; iii: abordagem metabolômica dos
extratos em resposta ao estresse induzido suspensão de rega e salinidade; iv: ensaios não-
clínicos in vitro para avaliar os efeitos inibitórios dos extratos frente a PLA2, que serão divididas
em diferentes capítulos para facilitar o entendimento.
Diante dos objetivos expostos, a tese foi organizada em sete capítulos, a saber:
O Capítulo 1 apresenta o artigo de revisão desenvolvido durante o doutorado e publicado
na Revista Brasileira de Farmacognosia, contemplando uma revisão integrativa a respeito das
espécies K. laciniata e B. pinnatum.
O Capítulo 2 apresenta o estudo fitoquímico do extrato das folhas de B. pinnatum
abordando o isolamento dos compostos majoritários através de técnicas de CPC e CLMP e as
suas identificações por RMN e EM, além do desenvolvimento e validação de metodologia de
duas metodologias analíticas, uma por CLUE-DAD para quantificação dos flavonoides
majoritários do extrato e a outra por RMN para quantificação de sarmentosina. Adicionalmente,
foi realizada pequena revisão de literatura sobre CPC e controle de qualidade de plantas
medicinais e fitoterápicos.
O Capítulo 3 descreve apresenta o estudo fitoquímico do extrato das folhas de K.
laciniata abordando o isolamento dos compostos majoritários através de técnicas de CPC,
CLAE preparativa e CLMP e a elucidação completa por RMN e EM de um flavonoide isolado,
e a análise preliminar dos demais por RMN.
O Capítulo 4 aborda todo o estudo metabolômico conduzido para investigar as
alterações na produção de metabólitos frente aos estresses hídrico e salino de B. pinnatum e K.
laciniata.
O Capítuto 5 descreve os estudos in vitro dos extratos de B. pinnatum e K. laciniata
obtidos a partir de diferentes condições de cultivo de estresse salino e hídrico frente enzimas
do veneno de B. erythromelas

26
Capítulo 1 – Revisão de Literatura:

Bryophyllum pinnatum e Kalanchoe Laciniata

27
Capítulo 1 – Fundamentação Teórica
CAPÍTULO 1 – REVISÃO DE LITERATURA – ARTIGO PUBLICADO NA REVISTA

BRASILEIRA DE FARMACOGNOSIA EM JUNHO/2019
Review article
Kalanchoe laciniata and Bryophyllum pinnatum: an updated review about

ethnopharmacology, phytochemistry, pharmacology and toxicology
Júlia M. Fernandes1, Lorena M. Cunha1, Eduardo Pereira Azevedo³, Estela M. G.
Lourenço1, Matheus F. Pedrosa2, Silvana M. Zucolotto*,1
1
Grupo de Pesquisa em Produtos Naturais Bioativos, Laboratório de Farmacognosia,
Departamento de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN,
Brazil
2
Laboratório de Tecnologia e Biotecnologia Farmacêutica, Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.

3
Laboratório de Farmacotécnica, Departamento de Farmácia, Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
*Corresponding author: Silvana M. Zucolotto (silvanazucolotto@ufrn.net)
Received 19 September 2018; Accepted 30 January 2019; Available online 7 June 2019.

Revista Brasileira de Farmacognosia 29 (2019) 529–558
www.elsevier.com/locate/bjp
Review
Kalanchoe laciniata and Bryophyllum pinnatum: an updated review

about ethnopharmacology, phytochemistry, pharmacology and
toxicology
Júlia M. Fernandes a , Lorena M. Cunha a , Eduardo Pereira Azevedo c
, Estela M.G. Lourenço a
,
Matheus F. Fernandes-Pedrosa b , Silvana M. Zucolotto a,∗
a
Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil
b
Laboratório de Tecnologia e Biotecnologia Farmacêutica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil
c
Laboratório de Farmacotécnica, Departamento de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil
a r t i c l e i n f o a b s t r a c t
Article history: The species Kalanchoe laciniata (L.) DC. and Bryophyllum pinnatum (Lam) Pers. are native from Brazil and
Received 19 September 2018 Madagascar, respectively. Both belonging to the Crassulaceae family and being widely used by popu-
Accepted 30 January 2019 lation as a natural anti-inflammatory agent. These species have similar leaf morphology and for this
Available online 7 June 2019
reason, they are known by the same popular name as “saião” or “coirama”. Several studies have been
published involving different parts and preparations of these species. Therefore, this review aims to pro-
Keywords: vide an update overview about the traditional uses, chemical constitution, pharmacology and toxicology
Comparison
of K. laciniata and B. pinnatum species. An extensive literature review was conducted in different sci-
Flavonoid
Traditional use
entific databases. Various chemical constituents have been identified in extracts from different parts of
Phytochemical K. laciniata and B. pinnatum, being flavonoids the major compounds. They have been traditionally used
Pharmacology to treat inflammation, microbial infection, pain, respiratory diseases, gastritis, ulcers, diabetes and can-
Toxicology cer tumors. Non-clinical in vitro assays evaluated mainly the antimicrobial and antioxidant activities,
while in vivo assays evaluated the leishmanicide, anti-inflammatory and immunomodulatory activities.
Regarding toxicity, few studies have been conducted for the two species. The information reported in
this work might contribute to the recognition of the importance of K. laciniata and B. pinnatum species,
as well as to direct further studies.
© 2019 Published by Elsevier Editora Ltda. on behalf of Sociedade Brasileira de Farmacognosia. This is
an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/
4.0/).
Introduction laciniata (L.) DC. is native from Brazil and Bryophyllum pinnatum
(Lam) Pers. from Madagascar (Allorge-Boiteau, 1996; Gehrig et al.,
The Crassulaceae family comprises approximately 33 genera 2001). Even though these plants are naturalized in Brazil, they are
and 1500 species distributed worldwide, except for Australia and not endemic (Zappi, 2015).
the Pacific Islands (Allorge-Boiteau, 1996). This family presents Kalanchoe laciniata and B. pinnatum are both popularly known
xeromorphic characteristics that allows its species to adapt to as “saião” or “coirama” and have been used to treat inflammatory
bright light and water scarcity (Herrera, 2008). It has an important disorders (Amaral et al., 2005). Due to the various ethnopharmaco-
role on the research of biochemical, ecophysiological and phyloge- logical reports attributed to these species, several research groups
netic aspects related to the Crassulacean Acid Metabolism (CAM), have conducted studies to prove their pharmacological or biological
which is an evolutive adaptation of the pathway of photosynthetic properties. In addition, some researchers have carried out phyto-
carbon assimilation (Osmond, 1978). Among species, Kalanchoe chemical studies resulting in the identification of different classes
of secondary metabolites, as well as the isolation of various con-
stituents, specially from their leaves and aerial parts. Therefore,
this review aims to provide an updated overview about the tradi-
∗ Corresponding author. tional uses, chemical constitution as well as pharmacological and
E-mail: silvanazucolotto@ufrnnet.br (S.M. Zucolotto).
https://doi.org/10.1016/j.bjp.2019.01.012
0102-695X/© 2019 Published by Elsevier Editora Ltda. on behalf of Sociedade Brasileira de Farmacognosia. This is an open access article under the CC BY-NC-ND license
(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
530 J.M. Fernandes et al. / Revista Brasileira de Farmacognosia 29 (2019) 529–558
Fig. 1. Leaves (A) and inflorescences (B) of Kalanchoe laciniata (L.) DC.
toxicological aspects of K. laciniata and B. pinnatum species. This Kalanchoe laciniata constitutes a subligneous and perennial veg-
study might be used as a guide to further investigations involving etable with 30–100 cm in height. Its leaves are succulent, oval
these species. or obval, opposites, shortly petiolate and crenate (Corrêa, 1984;
Barroso, 1991; Amaral et al., 2005). The flowers are yellow-orange
Material and methods in collor, small, abundant, arranged in composite summits of
stamps or paniculate, hermaphrodites, gamopetalas with corolla
An extensive literature review was conducted in different scien- longer than the cup, with the presence of scaly carpels that become
tific databases such as PubMed, Web of Science, Scopus, Scielo, The polispermos follicles. Their fruit is a follicle with 6 cm long that con-
Cochrane Library. The study covered several aspects of the vegetal tains brown oblong seeds (Lorenzi and Matos, 2000; Amaral et al.,
species like botany, phytochemistry, traditional uses, pharmacol- 2005).
ogy and toxicology. In addition, the scientific names, synonyms The Bryophyllum pinnatum (Lam) Pers. species (Fig. 2) is
and popular names of major species identified by the botanical popularly known as “saião” and “coirama” throughout Brazil;
databases “Flora do Brasil”, Tropicos, International Plant Names “folha-de-pirarucu”, in Pará State; “fortuna” and “roda-da-fortuna”
Index and The Plant List were included. The common names found in Minas Gerais; “zakham-hayat” in Asia and Africa; life-plant in
in the book “Coletânea científica de plantas de uso medicinal” Mexico; love-plant, canterburry, bells and cathedral bells in the
(Amaral et al., 2005) were also used. The data were updated in April United States of America and Europe (Amaral et al., 2005; Joseph
2018. et al., 2011). This species is found in Brazil, China, India and Africa
and in all tropical countries. In Brazil, it is found in Northeast (Bahia,
Botanical information Ceará and Paraíba), North (Acre), Southeast (Espírito Santo, Rio
de Janeiro, Minas Gerais and São Paulo), Midwest (Distrito Fed-
Kalanchoe laciniata and Bryophyllum pinnatum exhibit similari- eral, Mato Grosso do Sul and Mato Grosso) and South (Paraná, Rio
ties concerning their leaf morphologies, which include decussate, Grande do Sul and Santa Catarina) regions, mainly in the coastal
succulent, glabrous, oval to elliptical leaves with crenate border and Caatinga zones (Amaral et al., 2005; Zappi, 2015). B. pinnatum
(Hyakutake and Grotta, 1972; Anjoo and Saluja, 2010; Moreira (Lam) Pers. is the accepted name and B. calycinum and Kalanchoe
et al., 2012). Due to such similarities, these species are known by pinnata are its botanic synonyms (The Plant List, 2010; Zappi, 2015;
the same popular name (Moreira et al., 2012). The knowledge of Tropicos, 2019).
leaf anatomy is important for registration purpose and for quality Bryophyllum pinnatum is a perennial, succulent and corpulent
control of herbal medicines (Moreira et al., 2012; Anvisa, 2014). vegetable with glabrous and tuberous stem. This species can reach
The K. laciniata (L.) DC. specie (Fig. 1) is popularly known up to 150 cm in height. The oldest stalks have a light color while
as “saião”, “corama-branca”, “folha-da-fortuna”, “para-tudo”, the youngest ones are reddish with defilements. Its leaves are vari-
“fortuna-de-flores-amarelas”, “folha-da-costa”, “folha-grossa” in able and decussates, being the lowest ones generally simple or
Alagoas, “coerana” in Pernambuco, and “erva-da-costa” in Bahia. sometimes imparinates. The leaves are 30 cm long, the upper are
This species is found in almost all states of the Northeast region (Rio 3-5-7 foliated, long petiolate, thick, fleshy and dark with crenate
Grande do Norte, Ceará, Pernambuco, Paraíba, Bahia and Sergipe), borders. The inflorescences are hermaphrodites, tubular, pendu-
Southeast (Espírito Santo, Rio de Janeiro, Minas Gerais and São lous, monopetalas, pale green or yellow-red, with cup swollen and
Paulo), South (Paraná and Santa Catarina), Midwest (Federal Dis- corolla longer than the cup. The fruit are in the form of hoods
trict and Mato Grosso do Sul) and North (Acre) regions, mainly in which become scaly polispermos follicles that are housed within
the coastal zone (Allorge-Boiteau, 1996; Amaral et al., 2005; Zappi, the hoods (Amaral et al., 2005; Jessica, 2008; Joseph et al., 2011;
2015). The accepted name for this specie is K. laciniata (L.) DC. Moreira et al., 2012).
and others botanics synonyms are Kalanchoe brasiliensis and Kalan- The main characteristic that differentiates K. laciniata and B. pin-
choe crenata (The Plant List, 2010; Zappi, 2015; Tropicos, 2019). natum species is the leaf aspect as K. laciniata has a corrugated or
Although K. laciniata is the accepted name, most of the works found subcrenated border (Fig. 3), whereas B. pinnatum leaf is significantly
use its synonym of K. brasiliensis. crenate (Lorenzi and Matos, 2000).
J.M. Fernandes et al. / Revista Brasileira de Farmacognosia 29 (2019) 529–558 531
Fig. 2. Leaves (A) and inflorescences (B) of Bryophyllum pinnatum (Lam) Pers.
Fig. 3. Leaves of Kalanchoe laciniata (A) and Bryophyllum pinnatum (B).
Chemical constituents have been described for B. pinnatum but derived from canferol
(Tatsimo et al., 2012). However, a quick search in the literature
Various chemical constituents for K. laciniata and B. pinnatum reveals that acetylated rhamnoses of patuletin have only been
have been reported in the literature, where they have been isolated described for K. laciniata and K. gracilis by Costa et al. (1994) and
mainly from the leaves of both species. The aqueous and methanolic Liu et al. (1989), respectively. Thus, these compounds are consid-
are the most commonly used extracts of K. laciniata and B. pinnatum, ered as potential candidates for specific markers of these species by
respectively. Among the constituents that have been identified so presenting themselves as differentiators in relation to most other
far, flavonoids represent the class of secondary metabolites most species, especially B. pinnatum. It is worth pointing out that until
commonly found, being the major component in both species. the date of this publication, no study have been published about
However, for K. laciniata, some patuletin aglycone derivatives have the description of the bioactive compounds for this specie as only
been identified, whereas for B. pinnatum, quercetin, kaempferol and two studies were conducted by bioassay-guided isolation by Costa
luteolin aglucons were found. In addition, chlorophylls, carotenoids et al. (1994) and Trevisan et al. (2006). Box 1 summarizes the main
and polysaccharides have been identified for K. laciniata. compounds already described for K. laciniata.
Despite the widespread use of K. laciniata and B. pinnatum by folk Widely used by the general population, B. pinnatum species
medicine practitioners, their chemical constituents have not been has several studies that dealt with the isolation and elucidation
fully elucidated. Moreover, only few studies involved the isolation of its major compounds. Several classes of chemical compounds
and elucidation of their chemical constituents, where the major- have been described for B. pinnatum, which includes fatty acids,
ity of the studies indicates the presence of glycosylated flavonoids, acyclic and aromatic organic acids, amino acids, sugars, vitamins,
derived from the acetylation of the rhamnose ring of patuletin in minerals, bufadienolides, ketones, fenantrenics derivatives, sterols,
different positions. The acetylation occurs at the end of the biosyn- flavonoids, long chain hydrocarbons, triterpenoids, phenolic acids,
thetic route of flavonoids, usually through esterifications of the saponins and gums (Amaral et al., 2005). However, flavonoids,
hydroxyl groups (Aguiar et al., 2007). Flavonoids derived from pat- steroids and terpens are the compounds most frequently isolated
uletin have already been described for another species of the genus, from B. pinnatum. In relation to flavonoids, glycosylated derivatives
K. spathulata (Gaind et al., 1981). Acetylated rhamnose flavonoids from the quercetin, kaempferol and luteolin aglycones have been
Box 1: Chemical compounds reported for Kalanchoe laciniata species.

Plant part Classification Extract Compound Reference
Fresh leaves, green Chlorophylls, Peroxide-free diethyl – Stobart et al. (1967)

callus carotenoids ether fraction of 80%
(v/v) acetone–water
extract
Fresh stems, leaves Flavonoids Juice Kalambroside A (1); Costa et al. (1994)
Kalambroside B (2);
Kalambroside C (3);
Patuletin 3-O-␣-L-
rhamnopyranosyl-7-O-
(3 -O-acetyl-␣-L-
rhamnopyranoside) (4);
Patuletin
3-O-(4 -O-acetyl-␣-L-
rhamnopyranosyl)-7-O-
(3 -O-acetyl-␣-L-
rhamnopyranoside) (5);
rhamnopyranoside (6);
␣-L-rhamnopyranoside
(7)
Leaves Flavonoids and Aqueous and butanolic – Almeida et al. (1997)
carbohydrates fraction of juice
Leaves Flavonoids Ethyl acetate extract 3,7-Di-O-␣-L- Trevisan et al. (2006)
rhamnopyranosyl-8-
methoxy quercetin
(8)
3,7-Di-O-␣-
rhamnopyranosyl-
kaempferol
(9)
3-O-␣-L-
rhamnopyranosyl-
3,3 ,4 ,5,7-pentahidroxi-
8-methoxyflavone
(10)
Leaves Organic salt Juice Complexed between a Costa et al. (2006)
hydro amino acid and
malic acid (1:2)
Dried leaves Polysaccharides – – Bhatti et al. (2013)
Fresh leaves Flavonoids Ethanolic extract 50% Patuletin 3-O-␣-L- Costa et al. (2015)
␣-L-rhamnopyranoside
(7)
described for this species. Quercetin 3-O-␣-l-arabinopyranosyl- very peculiar molecule has been described for few species of other
(1 → 2)-O-␣-l-rhamnopyranoside was the first derivative isolated botanical families, but not as the major compound. Nascimento
for B. pinnatum, as reported by Muzitano et al. (2006a,b). Although et al. (2018) state that this unusual flavonoid can be used as a
quercetin is a common aglycone derivate, its 3-O diglycosidic bond marker for B. pinnatum. In addition, this major component has
is quite peculiar as it is a rhamnose–arabinose dimer that is not shown potent anti-inflammatory (Ferreira et al., 2014) and leish-
very common and in fact, has never been reported for leaves of manicidal (Muzitano et al., 2009) activities. The compounds already
other species of the genus Kalanchoe (Nascimento et al., 2015). This described for B. pinnatum are summarized in Box 2
.
Box 2: Chemical compounds reported to Bryophyllum pinnatum species.

Plant Classification Type of extract Compound Reference
part
– Polysaccharides, Sap Glycosylated derivatives of quercetin Maksyutina and Zub

minerals, flavonoids (1969)
Leaves Alkanes, triterpenes, Petroleum ether C26–C34; ␣-amyrin; ␤-amyrin; Sitosterol Gaind and Gupta (1972)
steroids
Fresh Organic acids, steroids, Methanolic extract Bryophynol (11); -taraxasterol (12); Siddiqui et al. (1989)
leaves hydrocarbons, phenolic Bryophyllol (13); 18␣-oleanane (14);
compounds, flavonoids Bryophollone (15); bryophollenone;
24-ethyl-25-hydroxycholesterol (16)
Shoots Steroids Dichloromethane extract Stigmast-24-enol (17); (24S)-stigmast-25-enol Akihisa et al. (1991)
(18); 25-metylergost-24(28)-enol (19);
(24R)-ergost-5-enol (20); (24S)-ergost-5-enol
(21); ergost-5,24(28)-dienol (22);
(24S)-ergosta-5,25-dienol (23);
(24R)-stigmast-5-enol (24);
(22E,24S)-stigmast-5,22-dienol (25);
stigmast-5,24-dienol (26);
(24Z)-stigmast-5,24(28)-dienol (27);
(24R)-stigmast-5,25-dienol (28); (24S)-
25-metylergost-5,24(28)-dieno (30);
(24Z)-stigmast-7,24(28)-dienol (32);
(24R)-stigmast-7,25-dienol (33);
(24S)-stigmast-7,25-dienol (34)
Whole Bufadienolide Chloroform fraction of the Bersaldegenin-1,3,5-orthoacetate (35) Xiuzhen et al. (1992)
fresh orthoacetate methanolic extract of the
plant aqueous residue
Leaves – Acid fraction 89.3% of palmitic acid (C16), 10.7% of stearic Almeida et al. (2000)
acid (C18) and traces of arachidic (C20) and
behenic acids (C22)
Leaves Bufadienolides Methanolic extract Bryophyllin A (36) Supratman et al. (2000,
2001)
Leaves Bufadienolides Methanolic extract Bryophyllin C (37) Supratman et al. (2001)
Leaves Bufadienolides Methanolic extract Bersaldegenin-3-acetate (38) Supratman et al. (2001)
Dried Alkaloids, flavonoids, Aqueous, ethanolic, diethyl – Okwu and Jsiah (2006)
leaves phenols, tannins, ether and 20% acetic acid
vitamins, minerals extracts
Fresh Flavonoid Aqueous extract Quercitrin (quercetin Aoki et al. (2014), Cruz
leaves 3-O-␣-L-rhamnopyranoside) (39) et al. (2008), Muzitano
et al. (2006a,b)
Dried Minor vinylic aliphatic Ethanolic extract 1-Octen-3-O-␣-L-arabinopyranosyl-(1 → 6)-␤ Almeida et al. (2006)
leaves alcohol diglycoside glucopyranoside
Leaves Protein Tampon TEGN Rubisco (ribulose 1,5-bisphosphate Abat et al. (2008)
carboxylase-/Oxigenase)
Powdered Alkaloids, tannins, Petroleum ether, chloroform, – Devbhuti et al. (2008)
plant steroids, flavonoids, methanolic, aqueous extracts
sugars, organic acids
Leaves Flavonoids Aqueous extract Quercetin 3-O-␣-L-arabinopyranosyl (1 → 2) Cruz et al. (2008),
␣-L-rhamnopyranoside (40); kaempferol Muzitano (2006)
3-O-␣-L-arabinopyranosyl (1 → 2)
␣-L-rhamnopyranoside (kapinnatoside) (41)
Leaves Phenolic acids, Ethyl acetate and methanol Gallic acid; caffeic acid; coumaric acid; Abdellaoui et al. (2010)
flavonoids extract kaempferol-3-O-rutinoside (42)
Dried Phenanthrene alkaloid Ethanolic extract 1-Ethanamino-7-hex-1-yne-5 -one phenanthrene Okwu and Nnamdi
leaves (2011a)
Powdered Flavonoids Ethanolic 5i Methyl 4i ,5,7-trihydroxyflavone Okwu
plant extract 4i ,3,5,7-Tetrahydroxy-5-methyl-5i -propenamine; and
anthocyanidines Nnamdi
(2011b)
Leaves Bufadienolides, Juice – Wächter et al. (2011)
flavonoids, cinnamic
acids
Roots Steroids, alkaloids, Aqueous, chloroform, ethanol, – Majaz et al. (2011)
saponins, glycosides ether extract
flavonoids, tannins,
carbohydrates,
proteins, amino acids
Leaves Steroids, esters Ethanolic extract Stigmast-4,20(21),23-trien-3-one (43); Afzal et al. (2012)
stigmata-5-en-3␤-ol (44);
␣-amyrin-␤-D-glucopyranoside (45);
n-undecanyl noctadec-9-en-1-oate; n-dodecanyl
n-octadec-9-en-1-oate
Leaves Alkaloids, glycosides, Chloroform extract – Biswas et al. (2012)
gums, saponins,
tannins, reducing
sugars
Box 2: Continued
Leaves Phenols, flavonoids Petroleum ether, chloroform, – Bhatti et al. (2012)
ethanol 95% extract
Leaves Cardiotonic glycosides, Chloroform extract – Mahata et al. (2012)
alkaloids
Leaves Flavonoids Methanolic extract Kaempferitrin (46); kaempferol Tatsimo et al. (2012)
3-O-␣-L-(2-acetyl)
rhamnopyranoside-7-O-␣-L-rhamnopyranoside
(47); kaempferol 3-O-␣-L-(3 -acetyl)
(48); kaempferol 3-O-␣-L-(4-acetyl)
(49); kaempferol 3-O-␣-D-glucopyranoside-7-O-
␣-L-rhamnopyranoside (50); afzelin (51);
␣-rhamnoisorobin (52)
Air- Flavonol glycosides Petroleum ether extract 7-O-methylkaempferol-3-O-␣-L-rhamno- Bodakhe et al. (2013)
dried pyranosyl-(1 → 6)-O-␤-D-galactopyranoside
pow- (53); kaempferol-14-O-␣-L-rhamnopyranosyl-
dered (1 → 3)-O-␣-L-rhamnopyranosyl-(1 → 6)-O-␤-D-
leaves galactopyranoside
(54)
Dried Flavonol Methanolic extract 3 ,4 -Dimethoxy quercetin (55) Darmawan et al. (2013)
leaves
Leaves Flavonol glycosides, Methanolic extract 4 -O-␤-D-glucopyranosyl-cis-p-coumaric acid; Fürer et al. (2013)
flavonoids, phenolic syringic acid ␤-D-glucopyranosyl ester
glycosides
Shoots Steroid Petroleum ether extract Stigmasterol Kamboj and Saluja
(2017)
Leaves Flavonoids, steroids, Ethanolic extract – Joshi and Chauhan
terpenoids, phenolics, (2013)
alkaloids, glycosides,
tannins.
Dried Flavonoid, phenolic Ethyl acetate fraction of Quercetin Aoki et al. (2014)
leaves acids methanolic extract Chibli et al. (2014)
Dried Flavonoids, saponins Aqueous extract – Alhaji et al. (2014)
leaves
Leaves Flavonoids Methanolic extract Rutin; luteolin; luteolin 7-O-␤-glucoside (56) Chibli et al. (2014)
Leaves Steroidal glycoside, Methanol, ethylacetate, – Tariq et al. (2015)
bufadienolides petroleum ether extracts
Leaves Bufadienolides Dichloromethane, ethanol Bersaldegenin-1-acetate (57); Oufir et al. (2015)
extracts Bersaldegenin-3-acetate (58);
Bersaldegenin-1,3,5-orthoacetate (59); Bufalin
(60)
Leaves Phenolic compounds Acetone and methanol extracts KPB-100; KPB-200 Cryer et al. (2017)
Box 2: Continued
Traditional uses species against snake and scorpion bites have also been reported
elsewhere.
The traditional medicinal uses of K. laciniata and B. pinnatum are The extract of K. laciniata leaves has been used for the treat-
shown in Boxes 3 and 4 , respectively. As can be seen from these ment of chilblains, burns, erysipelas, wounds, cough, bronchitis,
boxes, the leaf is the part of the plant mostly used by the popula- flu, gastritis, ulcers, otitis, kidney stone, diabetes, anxiety, microbial
tion, whereas the juice is the most frequent mode of preparation for diseases, snakebite, pain and inflammation. In addition, it has been
both species. Some of the properties are common for both species used to treat cancerous tumors, osteoarticular rheumatism, jaun-
and those have been used to treat: (i) skin problems, (ii) problems dice, yellow fever, other liver disorders, headache, prostate tumors
in the respiratory system, (iii) pain, (iv) inflammation and (v) dis- and hemorrhoids. K. laciniata have been used mainly in the form of
orders in the gastrointestinal system. The inflammatory and gastric decoction, syrup, juice, poultice and maceration of its leaves (Silva
problems (ulcers and gastritis) are the most commonly treated dis- et al., 2002). The popular uses of K. laciniata species are reported in
orders. In addition, K. laciniata and B. pinnatum have been used in Box 3.
the form of plaster or poultice to treat dermatological disorders The extract of B. pinnatum leaves have been used for the
and burn wounds. The antivenom activities of the leaves of both treatment of severe disorders such as gastritis, ulcers, cough,
Box 3: Medicinal popular uses of Kalanchoe laciniata reported in the literature.

Plant part Popular use Preparation Reference
Leaves, stem Otitis, skin diseases – Cos et al. (2002)

Leaves Healing – Fonseca-Kruel and Peixoto (2004)
Leaves Bronchitis, flu and sore Juice, syrup and poultice Medeiros et al. (2004)
Leaves Ovarian and uterine Pure juice or mixed with other plants for syrup Morais et al. (2005)
inflammations preparation
Leaves – Tea and syrup Pereira et al. (2005)
Leaves Ulcers and gastritis – Lisboa et al. (2006)
Leaves Ulcers and gastritis Juice Silva et al. (2006)
Leaves Coughing, gastritis, diabetes, – Albuquerque et al. (2007a)
pains in general
Leaves General pain, ulcer, gastritis, – Albuquerque et al. (2007b)
injury, general inflammation,
asthma, lung problems, kidney
stone
Leaves Chilblains, burns, wounds, – Boscolo and Valle (2008)
erysipelas, ulcers, scurvy, flu
and bronchitis
Leaves Anxiolytic effects – Rodrigues et al. (2008)
Leaves Respiratory system disorders – Leitão et al. (2009)
Leaves Healing, flu and cough Plaster, syrup and juice Albertasse et al. (2010)
Leaves, root Depurative, blood thinner, Decoction, tincture, leave soaking, refreshment, Cartaxo et al. (2010)
uterine inflammation, cough, licking, poultice, warm in oil or infusion
influenza, expectorant, healing,
pains in general, inflammation
in general
Aerial part Fever, fracture, ear pain Maceration Hubert et al. (2013)
Leaves To treat snakebite victims Paste Moura et al. (2015)
Leaves, aerial parts, roots, Microbial diseases Decoction, sap, maceration, heating in the ash Ngezahayo et al. (2015)
whole plant
Leaves Facilitation of delivery, Decoction, maceration Yemele et al. (2015)
bleeding during pregnancy,
postpartum abdominal pain
Leaves Snakebite Paste Moura et al. (2015), Félix-Silva et al. (2017)
bronchitis, various bacterial, viral and fungal infections, leishma- Other activities
niasis, pain, inflammation, some tumors, respiratory infections,
diabetes, hypertension, flu and fever (Perry and Metzger, 1980; Action on immune system
Silva et al., 1995; Moreira et al., 2002; Medeiros et al., 2004; Amaral Action on nervous system
et al., 2005; Kamboj and Saluja, 2009). This species is part of the
traditional Indian medicine. The part of the plant mostly used is its Action on urinary system
leaves, prepared as decoction, infusion, juice, syrup, poultice and Gastroprotective action
paste. The popular uses of the species B. pinnatum are summarized
Anti-snake action
in Box 4.
Antidysiphydeemic action
Antidiabetic action
Pharmacological activities
Antioxidant action
The studies that investigated the pharmacological properties of Antimicrobial action

K. laciniata and B. pinnatum usually assessed the activities of the
juice or extracts from the leaves and/or aerial parts of these plants. 0 10 20 30
Regarding the type of extract, most studies with K. laciniata used KP KB

hydroethanolic, whereas for B. pinnatum the ethanolic (in vitro) and
aqueous (in vivo) were the most commonly used extracts. Fig. 4. Graphical representation of the number of pharmacological studies for Kalan-
However, there is a large difference in the number of studies choe laciniata and Bryophyllum pinnatum.
between the two species, being B. pinnatum the most studied one,
therefore, following the trend that has already been observed in It is worth to point out that no comparative study between these
the chemical and ethnopharmacological studies, which had been species has been carried out so far, especially those related to phar-
previously discussed in this article. Fig. 4 presents an overview of macological aspects. There are only two studies, Fernandes et al.
the main pharmacological activities that have been studied (in vitro (2016) and Araújo et al. (2018), which compare the anti-snake and
and in vivo) for the two species in addition to the number of studies gastroprotective activities, respectively. Thus, more studies that
that have been published so far for each plant. compare some pharmacological activities between K. laciniata and
It is clear from Fig. 4 that a larger number of studies have been B. pinnatum would be interesting to see, especially those related to
reported for B. pinnatum, which suggests that there is more room for their traditional uses.
studies that investigate additional pharmacological activities for K.
laciniata, especially in vivo studies. Moreover, this figure indicates Kalanchoe laciniata
that the gastroprotective activity (alti-ulcer, for instance) is not well Several non-clinical assays related to the evaluation of phar-
explored yet for these plants, especially for K. laciniata. macological activities of K. laciniata are described in the literature.
Box 4: Medicinal popular uses of Bryophyllum pinnatum described in the literature.

Plant part Popular use Preparation Reference
Leaves Bruises, swellings Raw leaf applied directly to the affected area Arnason et al. (1980)
Not reported Tonic – Mello (1980)
Leaves Otitis, sinusitis – Sandberg and Cronlund (1982)
Leaves Boils, sores Warm leaf juice applied over the injured area Sebastian and Bhandari (1984)
two or three times a week. Leaves are bound on
wounds to hasten suppuration
Not reported Dermatological disorders – Esquivel and Zolla (1986)
Leaves Leprous sores and motor disorders. The leaves are dry-fried and used in a complex Elliott and Brimacombe (1987)
Fever preparation. The juice of the leaves is rubbed
on the forehead to reduce fever
Not reported Cancer – Mathew and Unithan (1992)
Leaves Scabies, leucoderma Juice and decoction Bhandary et al. (1995)
Leaves Hypertension Decoction Longuefosse and Nossin (1996)
Leaves Constipation, fever Juice Ong and Nordiana (1999)
Not reported Inflammation, stomach pain Tea Muñoz et al. (2000)
Leaves General pain, cough, bronchitis, flu, – Begoss et al. (2002)
pneumonia, dermatitis
Leaves Bronchitis, ulcers, chilblain Juice with milk and smear leaves Moreira et al. (2002)
treatment, at syrup form
Whole plant, leaf Rheumatoid arthritis, tummy bug, Medicine bath, rubbing or massage Long and Li (2004)
injuries from falls, numbness of
limbs, bruise, burn, ulcer
Leaves Cough, bronchitis, chilblain, ulcer Syrup, juice with milk, smear leaves Medeiros et al. (2004)
Leaves Bladder problems, “cooling”, – Lans (2006)
kidney and other urinary problems,
bladder stones, hypertension, high
cholesterol
Leaves Abscess The leaves are crushed and the paste is layered Saikia et al. (2006)
on the boils
Leaves Analgesic, psychotropic Decoction, squeezed sap after healing, boiled Banzouzi et al. (2008)
Leaves Relieve abdominal and back pain, Decoction, poultice Coe (2008)
stop postpartum abdominal pain,
stop excessive menstrual
hemorrhage, reduce fever
Leaves Burn, wound Pounded Inta et al. (2008)
Liniment and poultices
Leaves Wounds, bruises, boils, jaundice, – Sikdar and Dutta (2008)
snakebite, dysentery, urinary
trouble and quick healing of
wounds
Leaves Gastritis, ulcer, kidney, dry cough Mixture, syrup, cataplasm, mixture or Coelho-Ferreira (2009)
with chest pain, cough, erysipelas, compress, distillate, “garrafada”
any swelling, cataract, ulcer
Leaves Fever, headache, nausea, wound Direct application of the leaves on the site Giovannini and Heinrich (2009)
Leaves Coughs, mucus, fever, sudden loss Juice squeezed from the leaves is taken two Hossan et al. (2009)
of consciousness (epilepsy-like), teaspoonfuls twice daily. Paste of leaves is
constipation, piles applied to rectum
Leaves Kidney stone One teaspoonful juice was taken twice a day up Kosalge and Fursule (2009)
to 1 month
Leaves Asthma Heated on low fire, sap squeezed, mixed with Ruysschaert et al. (2009)
melasse (juice of Saccharum officinale and
juice of Citrus aurantifolia and drunk
Leaves Headache, pain, depurative if high Crushed and rubbed on the forehead; Sanz-Biset et al. (2009)
dose – emetic; mal aire squeezed, the juice obtained is drunk; slightly
boiled, for drinking and bathing (for children)
Leaves Lumbar pain In natura – plaster Garcia et al. (2010)
Leaves Cancer, inflammation Infusion Kamboj and Saluja (2009)
Leaves Migraine, headache Juice with coconut or andiroba oil Kamboj and Saluja (2009)
Leaves Furuncle, skin ulcers Heat the leaves and use them topically Kamboj and Saluja (2009)
Seed Stye disease Juice obtained from crushed seeds is applied to Rahmatullah et al. (2010)
eyes (1–2 drops, 2–3 times daily)
Leaves Headache Crumpled leaf application Boulogne et al. (2011)
Leaves Liver problems In nature Costa and Mayworm (2011)
Leaves Bone pain, inflammation, Crushed and compressed Panyaphu et al. (2011)
muscular-skeletal system disorders
(broken bone)
Leaves Bone fracture, constipation and Paste (topical) and water decoction with sugar Tangjang et al. (2011)
kidney stone problem (oral)
Leaves Antidiabetic Juice of boiled leaves (100 g) is prescribed Tarak et al. (2011)
orally twice a day
Leaves Cuts – Bhat et al. (2012)
Leaves Stomach ulcer Raw leaves eaten daily in empty stomach Bosco and Arumugam (2012)
Leaves, roots Hypertension Decoction, infusion, mixture Gbolade (2012)
Leaves Wart. Skin diseases, wounds, Prepare a poultice and apply on wart Nunkoo and Mahomoodally
scabies, stop bleeding (2012)
Box 4: Continued
Leaves Scorpion sting Venomous insect Paste (external) Prabu and Kumuthakalavalli
bite, rheumatism, stiff joints, kidney (2012), Bahekar et al. (2012)
stones
Leaves Treating amenorrhea Treating Hot infusion Srithi et al. (2012)
morning sickness
Leaves Sexual transmitted infections A mixture of chopped leaves, chopped Opuntia Wet et al. (2012)
(gonorrhea) stricta stem and Euphorbia hypericifolia (whole
plant) all boiled in 2 l of water and administered
once a day as an enema
– Gastrointestinal disorders The dose is 45–180 grains mixed with twice its Kadir et al. (2013)
amount of melted butter
Leaves Remove kidney stone, bladder, Extract, paste Mahmood et al. (2013)
pancreatic, emollient
Aerial herbal material Guinea worm Poultice as a paste and decoction Agyare et al. (2014)
Leaves Eczema, pruritus – Bhat et al. (2014)
Leaves, flower Diabetes, hypertension, analgesic, Juice extract Ezuruike and Prieto (2014)
inflammation, wound ulcers,
anti-parasitic, insect bites,
anti-cancer, cough, diarrhea,
sedative, diuretic, antimicrobial,
convulsions
Leaves, root Cholera, diarrhea, and dysentery, Juice, decoction Islam et al. (2014)
ulcer, urinary diseases, Leaf juice and decoction of root
gastrointestinal disorders
Leaves Kidney stone 1 cup (50 ml) fresh juice three times a day for Choudhury et al. (2014)
5–10 days or till removal of stones
Leaves Coughing, whooping cough 2–3 spoonful of leaf paste is taken as drink 2–3 Kadir et al. (2014)
times daily for 3 weeks
Leaves Pain in the feet, diabetic Prepare a decoction with the leaves and use it Mootoosamy and
neuropathy (diabetes and related as a footbath Mahomoodally (2014)
complications)
Leaves Snakebite 1–2 spoons of leaf decoction are given every 1 h Félix-Silva et al. (2017), Sarkhel
after snakebite (2014), Sikdar and Dutta (2008)
Leaves Legs pain, body ache, Decoction Sreekeesoon and
antimicrobial, anti-ulcer, Heated oil is applied evenly on leaf which is Mahomoodally (2014)
antinociceptive, anti-inflammatory, carefully tied to pain site. Bath with decoction
antidiabetic, neurosedative and of leaves for legs pain and body ache
muscle relaxant, hepatoprotective,
joint pain (rheumatism)
Leaves Stone disease, kidney stone – Agarwal and Varma (2015)
Leaves Allergy, dysentery Crushed extract Choudhury et al. (2015a)
Leaves Digestive system disorder Extract from the crushed leaves Choudhury et al. (2015b)
Leaves Malaria, fever Leaves juice (orally administered) for malaria Frausin et al. (2015)
and fever
Leaves Cold Decoction, juice Picking et al. (2015)
Whole plant Diabetes Fresh juice Tarafdar et al. (2015)
Leaves Menstrual pain, kidney stone, – Xavier et al. (2015)
worms in stomach
Stem, leaves Antitumor activity – Tene et al. (2007) apud
Bailon-Moscoso et al. (2015)
Leaves Sprain Leaves decocted or grilled on fire. Applied the Chassagne et al. (2016)
leaves on the affected limb for few hours
Several non-clinical studies have investigated the numerous phar- Bryophyllum pinnatum
macological activities of K. laciniata. Summaries of the non-clinical Several non-clinical in vitro and in vivo studies have been
in vitro and in vivo studies are presented in Boxes 5 and 6 , respec- reported for B. pinnatum as summarized in Boxes 7 and 8 , respec-
tively. tively. In contrast to the K. laciniata species where most studies
Regarding the non-clinical in vivo studies, anti-inflammatory investigated its anti-inflammatory activity, the studies performed
and immunomodulatory have been the most frequently investi- for B. pinnatum evaluated its leishmanicidal, anti-diabetic, anti-
gated activities so far. This fact is probably due to the popular inflammatory, immunomodulatory and anti-cancer properties.
use of K. laciniata for treating inflammatory disorders. Besides B. pinnatum is used in folk medicine to treat various diseases. For
these activities, K. laciniata have been investigated to treat against this reason, several in vitro studies were carried out in order to ver-
snake bites by Bothrops species, B. jararaca and B. arternus, where ify the pharmacological properties of those species, which includes
it showed great potential to ameliorate the local effects induced hepatoprotective, leishmanicide, immunomodulatory, antimicro-
by the snake venom, especially the hemorrhagic reaction. Finally, bial, antioxidant, anticancer, and antiurolithiatic activities. Studies
although often recommended by folk medicine practitioners to use have shown the potential activity of B. pinnatum against hemato-
K. laciniata for gastroprotection, there is only one article that inves- logical parasites such as Leishmania, Plasmodium and Trypanossoma,
tigated its potential use to treat gastric ulcer. Therefore, there are whose properties are important due to the very limited pharma-
so many pharmacological activities that still lack investigation on cological alternatives for treating these neglected diseases, where
this species. researches in this area are of outmost importance.
Box 5: Non-clinical in vitro studies performed for Kalanchoe laciniata.

Plant part Extract/fraction/compound Method Result Reference
Reversible and time-dependent inhibitory effects on CYP2C19 and CYP3A4 activities

Whole herb Methanol extract Crude methanol extract and A significant time-dependent inhibition of Awortwe et al.
fractions of K. crenata were tested samples on CYP3A4 with crude (2015)
incubated and methanol and fractions were observed.
preincubated with
recombinant human
CYP2C19 and CYP3A4.
Leishmanicidal activity
Aerial parts Mixture of solvents Antileishmanial activity The K. crenata showed no activity against Hubert et al. (2013)
consisting of methanol and against promastigotes promastigotes forms of L. donavani.
methylene chloride (v/v) forms of L. donavani – cell
viability.
Antibacterial activity
Aerial parts Hydroalcoholic extract Diffusion in solid medium Only the essential oil showed activity Silva et al. (2009)
(leaves and stems), (leaves), the alcohol method to determination of against methicilin resistant Staphylococcus
essential oil (stems), essential oil the minimum inhibitory aureus (MRSA). This action was considered
(leaves) concentration (MIC). bacteriostatic with the reduction to one
log10 CFU/ml after 6 h of exhibition at the
concentrations 4 and 8%.
Antiviral activity
Leaves Aqueous extract Antiviral activity against The extract showed reasonable antiviral Schiavo (2005)
herpes virus bovine HBV activity, with inhibition index 10−4.48 and
type I. high therapeutic index (88.16%).
Acetylcholinesterase inhibition
Leaves Hexane, methanol, ethyl Microplate assay with the The methanol and ethyl acetate showed Trevisan et al.
acetate extract enzyme 100% inhibition at the concentration (2006)
acetylcholinesterase 2 mg/ml. The ethyl acetate had IC50 0.16 mg.
(AchE).
Leaves Ethyl acetate, methanol Microplate assay based on In the microplate assay, the ethyl acetate Feitosa et al. (2011)
extracts Ellman’s method and TLC and methanol extracts showed 100%
(thin-layer inhibition. The ethyl acetate extract
chromatography) assay. presented IC50 0.16 mg/ml. In the TLC assay,
the ethyl acetate extract showed
positive/false-positive result and methanol
extract showed negative result.
Thyroid peroxidase inhibition
Leaves Aqueous extract TPO (thyroid peroxidase) of At the dose 2 ␮M, the extract caused Ferreira et al. (2000)
tissue samples obtained significant inhibition of TPO
during thyroidectomy. iodine-oxidation activity.
Larvicide activity
Leaves Hexane, methanol, ethyl Larvicide activity against Significant larvicide activity to hexane and Trevisan et al.
acetate extract Aedes aegypti gnat larvae. ethyl acetate extracts, but not to isolated (2006)
flavonoid (3-O-␣-LL-rhamnopiranosil-
3,3 ,4 ,5,7-pentahydroxi-8-metoxiflavon) at
the concentration of 500 ppm.
Antihistaminic activity
Leaves Juice (without solvents), Assays with Guinea pig The juice and fractions changed response Almeida et al.
aqueous, butanol fractions ileum. curve to histamine, displaying an (1997)
antihistamine effect.
Lymphoproliferative activity
Leaves Juice (without solvents) Lymphoproliferative The concentration of flavonoids 2 Costa et al. (1994)
and isolated compounds activity in human (0.25 ␮g/ml) and 1 (0.5 ␮g/ml) that inhibited
(Box 1 compound 1–7) lymphocites. the lymphocyte proliferation was 80 and 40
times, respectively, greater than the juice
(20 ␮g/ml).
Anti-inflammatory activity
Leaves Juice (without solvents) Inflammation induced by The inhibition of lymphocytes proliferation Ibrahim et al. (2002)
Zymozan. was dose-dependent, with the inhibitory
concentration of 50% at 50 ␮g/ml.
Antioxidant activity
Whole plant Methanol extract TBARS (thiobarbituric Treatment of the rats with the extract for six Fondjo et al. (2012)
acid-reactive substances), weeks lowered MDA level by 34–44%, but
MDA (malondialdehyde) increased CAT levels by 78–176%, and SOD
activity, SOD (superoxide levels by 116–257%.
dismutase) activity and CAT
(catalase) activity.
Phospholipase A2 activity
Leaves Hydroethanolic extract Phospholipase A2 activity The extract showed significant inhibitory Fernandes et al.
was determined activity of PLA2 . (2016)
turbidimetrically in 96-well
microplates using an egg
yolk suspension.
Box 6: Non-clinical in vivo studies performed for Kalanchoe laciniata.

Plant part Extract/fraction/ Dose and rout Method Animal model Result Reference
compound
Leaves Aqueous 1 (before 0.25, 0.5, 1.0, Paw edema Wistar rats All concentrations of extract 1 Mourão et al.
flowering) Aqueous 2.0 g/kg, i.p. induced by inhibited the paw edema 4 h (1999)
2 (after flowering) carrageenan after carrageenan injection,
while the extract 2 showed no
anti-inflammatory activity.
Aerial parts Juice and a product 480 mg/kg (juice), Paw edema C57B110 male The dose 240 mg/kg, i.p., KMC Costa et al.
of juice purification i.p.; 240 mg/kg induced by mice significantly reduced the rats (2006)
(KMC) (kalanchosine zymosan popliteal lymphonodes
dimalate – KMC – in increasing. The dose
water), i.p. 480 mg/kg, i.p., of juice of K.
laciniata obtained the similar
result, indicating that KMC is at
least twice more active then the
juice.
Leaves Methanol extract 300, 600 mg/kg, Paw edema Wistar rats The dose 600 mg/kg exhibited Dimo et al.
oral induced by the maximum (2006)
carrageenan anti-inflammatory effect
(43.47%) in 30 min.
Adjuvant treatment to poisoning (local anti-inflammatory activity)
Aerial parts Aqueous extract Extract and topic Hemorrhagic Adult mices The extract and the formulation Fonseca et al.
formulation (3:7 – activity induced showed significant results in (2004)
extract:lanette and by Bhotrops reducing edema, hemorrhagic
cream) alternus halo and necrosis prevention
induced by Bothrops alternatus
venom.
Leaves Aqueous extract Preincubation of Hemorrhagic assay Swiss mice In the concentration 1:48 the Moura et al.
venom with the induced by B. extract showed a significant (2015)
extract jararaca reduction in hemorrhage (57%).
Leaves Hydroethanolic 125, 250, Paw edema and Swiss albino In pre-treatment protocol, the Fernandes et al.
extract 500 mg/kg, i.p. hemorrhagic mice extract reduced the (2016)
activity induced by hemorrhagic activity reaching
Bhotrops jararaca about 40%, and in the
post-treatment protocol, it did
not show activity. In the
antiendematogenic activity, K.
laciniata did not show any
antiendematogenic activity in
both treatment protocols.
Immunomodulatory activity
Leaves Aqueous extract 200 ␮l, oral; 160, Paw edema C57B110 male The inflammation was reduced Ibrahim et al.
320, 480 or induced by mice after 7 days of treatment. (2002)
960 mg/kg, i.p. zymosan
Aerial parts Product of juice 480 mg/kg of juice Administration of C57BL/10 and KMC promoted selective Paiva et al.
purification (w/o and 160 mg/kg of juice and KMC at C57BL/10ScCr inhibition of B-cell (2008)
use of solvents): KMC (kalanchosine the mice with male mice lymphopoiesis, by inhibiting
KMC dimalate), i.p. posterior removal IL-7.
of cells for analysis
Anti-dyslipidemic potential
Whole plant Methanolic extract 50, 68 mg/kg, oral Diabetes and Male Wistar After six weeks of treatment, Fondjo et al.
nephropathy were rats the doses reduced the blood (2012)
induced in the rats level of the glucose, the
with streptozotocin triacylglycerides, the total
cholesterol and the LDL
cholesterol. The HDL level was
enhanced and hence decreased
the atherogenic index. The
extract reduced the glucosuria
and proteinuria.
Antihyperglycaemic potential
Whole plant Hydroethanolic 135, 200 mg/kg, oral Diabetes was Adult male Both doses reduced the blood Kamgang et al.
extract induced by Wistar rats glucose levels in normal and (2008)
hypercaloric diabetic rats without real
sucrose diet over 4 dose-dependant effect, 6 h after
months a single oral administration.
Analgesic activity
Leaves Methylene 150, 300 mg/kg, oral Writhing test, Adult Swiss The extract significantly Nguelefack
chloride/methanol Formalin test and albino mice reduced the writhing reaction et al. (2006)
(1:1) extract Analgesy meter test and adult induced by acetic acid, reduced
Wistar rats the licking time at the first
phase of observation, in the
second phase, animals treated
showed no sign of pain and
reduced the animal’s sensitivity
to pain.
Box 6: Continued
Plant part Extract/fraction/compound Dose and rout Method Animal model Result Reference
Anticonvulsant activity
Leaves Methylene 150, 300, Pentylenetetrazol, Adult Swiss The extracts increased the Nguelefack
chloride/methanol 600 mg/kg, oral Thiosemicarbazide albino mice latency period and reduced the et al. (2006)
(1:1) extract and Strychnine and adult duration of seizures in a dose
sulphate-induced Wistar rats dependent manner. The dose
seizures 600 mg/kg delayed the onset of
convulsion and reduced the
duration of convulsion.
Cardiovascular effects
Leaves n-Butanol extract 2, 5, 10 mg/kg, via Effect of extract on Guinea pigs The slow administration of the Nguelefack
cannula in the right blood pressure, n-butanol extract resulted in a et al. (2008)
femoral vein heart rate, ECG significant transient fall in
blood pressure that lasted for
4 min, induced a dose
dependent fall in heart rate and
a modification of the
electrocardiogram curve.
Antitumor activity
Leaves Hydroethanolic 62.5, 250 mg/kg, i.p. Implant in mice Female albino Both doses showed an upper Silva (2007)
extract tumor cells: Ehrlich Swiss mice inhibition to 50% for
carcinoma and sarcoma-180. For Ehrlich
sarcoma-180 Carcinoma, the highest
inhibition was 66.59% for the
higher dose.
Leaves Aqueous extract 50 mg/kg, i.p. Antitumor activity Female albino The extract showed inhibitory Machado and
in mice infected Swiss mice effect of tumor growing against Melo-Júnior
with sarcoma-180 sarcoma-180, with tumor mass (2009)
reduction 52.8%.
Gastroprotective
Leaves Aqueous extract 125, 250, Gastrics lesions Female Wistar The pre-treatment protects the Araújo et al.
500 mg/kg, oral induced by ethanol rats mucosa of rats against the (2018)
and indomethacin gastric damage and
significantly reduced damage
by improving parameters
related to oxidative stress and
inflammation on mucosal
structures.
The potential use of B. pinnatum against Leishmania amazonensis extract of this plant was able to antagonize the hemorrhage and
has been investigated in vitro (Muzitano et al., 2006a,b) and in vivo edema as well as to inhibit the phospholipase A2 from the venom.
(Muzitano et al., 2009), where the authors demonstrated such activ- The extract of B. pinnatum was active in pre- and post-treatment
ity with the leaves extract (320 mg/kg body weight), as well as protocols, indicating the potential antiophidic activity of Kalanchoe
with the isolated flavonoids, 3-O-␣-l-arabinopyranosyl (1 → 2)-␣- species against local effects induced by B. jararaca snake, suggesting
l-rhamnopyranoside and quercetrin (16 mg/kg body weight), with their potential use as a new source of bioactive molecules against
both being able to significantly reduce parasite load (Muzitano bothropic venom.
et al., 2009). In the same article, Muzitano et al. (2009) studied the Unlike K. laciniata, the antiulcer activity of B. pinnatum has
oral metabolism of flavonoids from B. pinnatum in a murine model been studied extensively in recent years. The work published by
of cutaneous leishmaniasis. In addition, they performed another Araújo et al. (2018) showed that the pre-treatment with B. pinna-
study investigating the influence of cultivation conditions, season tum juice protects the mucosa of rats against the gastric damage
of collection and extraction method on the content of antileishma- of indomethacin and ethanol-induced gastric lesions and reduced
nial flavonoids, where they demonstrated that active flavonoids damage by improving parameters related to oxidative stress and
were more abundant when the leaves were collected during the inflammation on mucosal structures. However, additional stud-
summer season and after aqueous extraction at 50 ◦ C. ies are necessary in order to investigate what active components
Regarding the in vivo studies, the most investigated activ- are responsible for such activity and the mechanisms of action
ities are leishmanicidal, hepatoprotective, immunoprotective, involved. In addition, further clinical studies are necessary to prove
anti-inflammatory, anti-ulcer, antihypertensive, antinociceptive, the gastroprotective activity of B. pinnatum in humans.
wound healing, anti-asthmatic, antitussive, antidiabetic and anti- In this current literature review, only one clinical study was
convulsant. Although these studies have demonstrated the several found that evaluated the efficacy and safety of capsules contain-
pharmacological activities attributed to B. pinnatum, it seems that ing B. pinnatum extract in the treatment of overactive bladder
its full potential is far from being proved and additional studies are syndrome. The clinical study of phase II, prospective, multicenter,
needed in order to fully investigate its pharmacological properties, double-blind randomized, placebo-controlled was conducted with
its mechanisms of action and its pharmacokinetics. twenty female patients and suggests that this species might have
Another interesting area of research is the anti snake-bite activ- potential use in the treatment of overactive bladder (Betschart et al.,
ity. Snake-related accidents are a serious public health problem and 2013). In addiction to this article, the same research group investi-
have been included on the WHO’s List of Neglected Tropical Dis- gated the effects of the leaves juice, fractions enriched in flavonoids
eases since 2009 (Gutiérrez et al., 2013). Fernandes et al. (2016) and bufadienolides as well as a flavonoid aglycone mixture and
investigated the activity of B. pinnatum against the local effects individual aglycones on detrusor contractility as a major target in
induced the venom of B. jararaca, where they showed that the overactive bladder treatment, where the authors found that several
Box 7: Continued
Leaves Juice Salmonella/mammalian At a dose 0.25 mg/ml, the juice caused a statistically Umbuzeiro-Valent et al.
microsome assay significant reduction in the mutagenicity of 2AA (1999)
(Ames test) (p ≤ 0.05) and the percent of inhibition was more then
90% at higher doses in all conditions tested.
Hepatoprotective activity
Leaves Juice, ethanolic extract Isolation of hepatocytes The concentrate and ethanolic extract significantly Yadav and Dixit (2003)
and examination of the decreased the GOT (glutamyl oxalacetic acid
effect of toxicants along transaminase) level by 55.55 and 36.50% and GPT
with the test samples (glutamyl pyruvate transaminase) level by 69.57 and
38.61%, respectively.
Acetylcholinesterase activity
Leaves Ethyl acetate, methanol Microplate assay to The ethyl acetate extract showed a strong inhibition of Feitosa et al. (2011)
extracts AChE inhibitory activity acetylcholinesterase activity.
and positive and false
positive activity in TLC
Antidiabetic activity
Stalk Aqueous, ethanolic ␣-Amylase inhibition The ethanol extract showed significant inhibitory Matthew et al. (2013a)
extracts activity of ␣-amylase enzyme in relation to the aqueous
extract.
Phospholipase A2 activity
Leaves Hydroethanolic 50% Phospholipase A2 The extract showed significant inhibitory activity of Fernandes et al. (2016)
extract activity was determined PLA2 .
turbidimetrically in
96-well microplates
using an egg yolk
suspension
Box 8: Non-clinical in vivo studies performed for Bryophyllum pinnatum.

Plant part Extract/fraction/ Dose and route Method Animal model Result Reference
compound
Gastroprotective activity
Leaves Methanolic extract 100, 300 mg/kg, i.p. Ulcer induced by Charles-Foster rats, The extract exhibited a Pal and Chaudhuri
indomethacin, albino guinea pigs significant inhibitory effect on (1991)
serotonin, reserpine, aspirin-induced ulcers.
acetic acid ethanol and Pretreatment at 300 mg/kg
stress; Lesion gastric in inhibited the formation of
pylorus-ligated induced indomethacin-induced gastric
by acetylsalicylic acid, ulcers. There was a significant
Duodenal ulcers inhibitory effect on ulcer
induced by histamine formation by serotonin and
reserpine. The extract protected
against of ulcers by stress. The
extract reduced the severity of
ulcers and caused a significant
reduction of ulcer index in the
ethanol-induced ulcers.
Leaves Methanolic extract 10, 20, 40 mg/kg of Indomethacin induced Adult male albino The extract had a Adesanwo et al.
aqueous extract gastric ulceration Wistar rats dose-dependent (2007)
gastro-protective effect on
indomethacin induced
ulceration. With results, the
extract could probably be more
potent then propranolol in the
measured variables.
Leaves Aqueous extract 1 and 2 g/kg, oral Gastric lesion induced Male Wistar rats The aqueous extract showed Braz et al. (2013)
by indomethacin significant anti-ulcerogenic
effect when compared with the
negative standard. The
ranitidine and aqueous extract
at 1 and 2 g/kg reduced the
ulceration in 45.49%, 49.51%,
respectively.
Whole plant Aqueous extract 500 and 750 mg/kg Ulcer induced by Female Wistar rats The extract at dose of Sharma et al. (2014)
and mucilage ethanol 750 mg/kg p.o. and mucilage at
dose of 500 mg/kg p.o.
markedly decrease the
incidence of ulcers in rats.
There was a decrease in the
gastric volume, free and total
acidity and ulcerative index
was 72.69 for extract and
69.65% for mucilage.
Box 7: Non-clinical in vitro studies performed for Bryophyllum pinnatum.

Anti-helmintic activity
Aerial herbal material Hydroethanolic (50:50, Anti-helmintic activity No activity was observed for the extract of B. pinnatum. Agyare et al. (2014)
v/v) extract against the free-living
model nematode
Caenorhabditis elegans
Antibacterial and antifungal activities
Leaves Methanolic extract Agar-well diffusion Five of the tested bacteria (Bacillus subtilis, Escherichia Akinpelu (2000)
(60%) method coli, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae and S.
aureus) were sensitive to extract at 25 mg/ml. K.
pneumoniae, P. aeruginosa and C. albicans were
resistant to the extract.
Leaves Ethanolic extract (70%) Agar-well diffusion Broad-spectrum antimicrobial activity was detected in Aqil and Ahmad (2003)
method crude extracts, being active against Gram-positive and
Gram-negative bacteria, yeast and filamentous fungi
(C. albicans, Rhizoctonia bataticola, A. niger and
Alternaria alternate).
Leaves Aqueous, methanolic Agar-well diffusion, The methanolic extract was most active, inhibiting S. Akinsulire et al. (2007)
extracts, extract with MIC and minimum aureus, Enterococcus faecalis, B. subtilis e P.
Palmwine and with gin bactericidal aeruginosa. The other extracts showed moderate
and with brew corn concentration (MBC) activity.
Leaves Alcoholic (90%), Cup Plate Method The most active extract was the aqueous one followed Jain et al. (2010)
aqueous extract (Zone of Inhibition) by the alcoholic extract. The susceptibility decreasing
order for the aqueous extract: Enterobacter
aerogenes > E. coli > Shigella dysenteriae > Salmonella
enterica var. Typhi > S. aureus > B.
subtilis > Staphylococcus epidermidis > Micrococcus
luteus. And for the ethanolic extract: S. aureus > S.
enterica var. Typhi > S. dysenteriae > E. aerogenes > E.
coli > B. subtilis.
Stem Methanolic, aqueous Agar-diffusion method The methanol extract had significant antibacterial Nwadinigwe (2011)
extracts action against B. subtilis and S. aureus at 100, 50 and
25 mg/ml. Also, the aqueous extract presented
antibacterial effect against S. enterica var. Typhi and B.
subtilis at the same concentrations.
Leaves, stems Petroleum ether, Agar-disc diffusion Both extracts showed moderate activity against all Chowdhury et al. (2011)
aqueous extracts method tested fungal strains (A. niger, Blastomyces
dermatitides, C. albicans, Pityrosporum ovale,
Trichophyton spp. and Microsporum spp.). The
petroleum ether extract was more effective against
Microsporum spp., whereas C. albicans was more
susceptible to aqueous extract.
Leaves Chloroform extract Agar-disc diffusion The extract exhibited low level of antibacterial activity Biswas et al. (2012)
method against B. subtilis, B. megaterium, S. aureus, E. coli, P.
aureginosa, S. enterica var. Typhi and S. dysenteriae.
The highest inhibition was against E. coli, while no
antibacterial activity was found against V. cholerae.
Whole plant Methanolic extract Disk-diffusion method The methanol exhibited weak antimicrobial effect Sharker et al. (2012)
against B. cereus, Bacillus megaterium, B. subtilis,
Sarcina lutea, S. aureus, E. coli, Salmonella entérica
var. Typhi, Salmonella paratyphi, Shigella boydii, S.
dysenteriae, P. aeruginosa, Vibrio mimicus, Vibrio
parahaemolyticus, Aspergillus niger, C. albicans and
Sacharomyces cerevisiae.
Whole plant Methanolic extract MIC The extract presented antibacterial and antifungal Tatsimo et al. (2012)
activities with MIC values ranging from 32 to 512 ␮g/ml.
The microorganisms tested were S. aureus, P.
aeruginosa, Salmonella enterica var. Typhi, C. albicans,
Candida parapsilosis and Cryptococcus neoformans.
Root, stem, leaf and Methanolic, aqueous MIC, agar-well diffusion The stem methanolic extract showed higher Sharma et al. (2014)
whole plant extracts method antibacterial activity being effective against
Corynebacterium diphtheriae, Micrococcus luteus, B.
subtilis, Alcaligenes faecalis, Bordetella bronchiseptica
and Serratia marcescens. Aqueous extract of leaf was
only active against B. subtilis and A. faecalis, while
methanolic extract had no activity.
Leaves Methanolic and ethyl Anti-Helicobacter Methanol extract showed a significant anti-Helicobacter Mabeku et al. (2017)
acetate extracts activity for activity with MIC and MBC values of 32 and 256 ␮g/ml,
determination of MIC respectively
and MBC
Antitrypanosomal activity
Leaves Aqueous extract Micro titer plate No observable reduction in motility at 10 mg/ml, Alhaji et al. (2014)
method motility reduced slightly at 20 mg/ml and highly
reduced motility at 40 mg/ml.
Box 7: Continued
Anti-hepatitis C virus activity

Leaves Methanolic extract HUH7it-1 cells (human The crude methanol extract exhibited anti-HCV activity Aoki et al. (2014)
hepatocellular with a IC50 17.2 ␮g/ml.
carcinoma) were
infected with the HCV
genotype 2a strain
JFH1 in the presence of
crude methanol
extracts
Antiplasmodial activity
Leaves Ethanolic extract SYBR green I-based Good antiplasmodial activity (IC50 11–20 ␮g/ml) was Singh et al. (2015)
fluorescence assay observed in leaf ethanol extract.
Leishmanicide activity
Leaves Aqueous extract, Antileishmania activity The aqueous extract and the flavonoid isolated showed Muzitano et al. (2006a)
isolated flavonoid against Leishmania activity against Leishmania amazonensis.
amazonensis
(antiamastigote and
antipromastigote)
Antioxidant activity
Leaves Aqueous extract DPPH and oxide radical The extract had significant antioxidant and oxidative Harlalka et al. (2007)
scavenging, reducing radical scavenging activities.
power, antilipidic
peroxidation
Leaves Methanolic extract DPPH radical A dose dependent radical scavenging activity was Gupta et al. (2009)
scavenging observed with the maximum activity (63.97%) at the
highest dose comparable to the standard BHT.
Leaves Alcoholic, aqueous DPPH scavenging The aqueous extract presented more antioxidant Jain et al. (2010)
extract method activity then the alcoholic one. Aqueous and alcoholic
extracts and ascorbic acid exhibited 74.7, 58.4 and
88.6% inhibition, respectively, and the EC50 (␮g/ml)
–144.23, 117.42 and 96.15 ␮g/ml, respectively.
Roots Aqueous, ether, DPPH and oxide radical The methanolic extract had more effective antioxidant Majaz et al. (2011)
chloroformic, scavenging methods, activity then the other extracts.
methanolic extracts reducing power
Whole plant Methanolic extract Method of A significant antioxidant activity was verified. Sharker et al. (2012)
Brand-Williams
Whole plant Methanolic extract DPPH radical The methanolic extract showed antioxidant activity Tatsimo et al. (2012)
scavenging method with an IC50 of 52.48 ␮g/ml.
Leaves Aqueous extracts DPPH radical Supplemental blue light improved the antioxidant Nascimento et al. (2015)
scavenging method activity.
Leaves Aqueous extract Thiobarbituric acid When compared with ascorbic acid (standard), the Alhaji et al. (2014)
(TBA) test, reducing extract showed low antioxidant activity.
power, DPPH and
hydrogen peroxide
Root, stem, leaf, Methanolic, aqueous Hydroxyl and Aqueous and methanolic extracts of root, stem, leaf Sharma et al. (2014)
whole plant extract superoxide radical and whole plant showed antioxidant activity.
scavenging, ferrous
chelating activities
Leaves Methanolic extract Phosphomolybdenum The extract exhibited significant antioxidant and free Phatak and Hendre
assay, ferric reducing radical-scavenging activity. (2015a)
ability, hydroxyl radical
scavenging,
thiobarbituric acid
reactive substance
assay, metal
ion-chelating capacity
Leaves Aqueous, methanolic DPPH, The methanolic 50% extract was the most active. The Gupta et al. (2015)
and methanolic 50% ␤-carotene-linoleate study indicated that the extracts can be a potent
extracts method, metal (ferrous antioxidant. And they were active against the
ion) chelating method, tyrosinase.
lipid peroxidation
inhibition; electron
paramagnetic
resonance
spectroscopy, inhibition
of DNA breakage
activity, browning
potential, tyrosinase
inhibition assay
Leaves Methanolic extract DPPH scavenging, DPPH radical, hydroxyl radical and reducing power Mabeku et al. (2017)
reducing power, and assays showed IC50 values of 25.31 ± 0.34, 55.94 ± 0.68
hydroxyl radical and 11.18 ± 0.74 ␮g/ml, respectively.
scavenging assay
Leaves Hydroethanolic 70% DPPH scavenging The extract presented antioxidant activity. Hara et al. (2018)
method
Box 7: Continued
Leaves Aqueous extract Mast cell degranulation The extract prevented the mast cell degranulation Cruz et al. (2008)
in mesentery and antigen-induced, at 100 ␮g/ml for 30 min, and the
histamine release assay histamine release at 0.5 mg/ml for 1 h.
Leaves Aqueous extract, Effect of Kp, flavonoid Treatments with Kp and QE inhibited degranulation and Cruz et al. (2012)
isolated compounds quercetin (QE), cytokine production of bone marrow-derived mast cells
quercitrin (QI) on mast following IgE/Fc␧RI crosslinking. Treatment with Kp
cell activation significantly reduced levels of TNF in supernatant.
Antiproliferative activity
Leaves Ethanolic extract, acid Evaluation in The acid fraction was 20 times more effective then the Almeida et al. (2000)
fraction lymphocytes of mice ethanolic extract in inhibiting lymphocyte proliferation.
BALB/c inguinal
lynphonodes and
human peripheral
blood
Thombolytic activity
Whole plant Methanolic extract Method of Prasad The extract presented moderate thrombolytic activities Sharker et al. (2012)
(16.41%).
Treatment of the overactive bladder syndrome
Leaves Juice Strips of porcine The juice extract inhibited contractions induced by Schuler et al. (2012)
detrusor were prepared electrical field stimulation and relaxes
in Krebs solution and carbachol-induced contractions.
contractility was
measured
Leaves Methanolic extract Detrusor muscles trips At 10% concentration, the extract reduced the Fürer et al. (2015)
were prepared from contractility of the detrusor to 58.6 ± 13.3% after 74 min,
porcine bladder sand, after a dose-independent initial increase in contractility
the electrically induced during the first 40 min.
muscle contractility
measured
Leaves Juice Detrusor muscles trips The pretreatment increased contraction strength of Bachamann et al. (2017)
were prepared from porcine detrusor strips relative to the negative control.
porcine urinary
bladders
Antiurolithic activity
– Ethanolic extract Crystallization of The extract has antiurolithic activity and has the ability Yasir and Waqar (2011)
calcium oxalate crystals in reduced the size of crystals.
Leaves Aqueous extract Nucleation assay The extract had greater capacity to dissolve calcium Phatak and Hendre
(turbidity method), oxalate. The extract inhibited the crystallization. The (2015b)
aggregation assay extract was slightly better in comparison to Cystone
(standard) in inhibiting the formation of COD crystals.
Tocolysis activity
Leaves Aqueous extract Contractility was Inhibition of spontaneous contraction was Gwehenberger et al.
measured in strips of concentration-dependent. The extract increased (2004)
term myometrium contraction frequency by 91% and inhibited
exposed to increasing oxytocin-stimulated contractions by 20% with slightly
concentrations of B. decreased frequency.
pinnatum
– Juice Stimulation by oxytocin The juice prevented the oxytocin-induced increase in Simões-Wüst et al.
activity [Ca2+ ]i in human myometrial cells in a dose-dependent (2010)
manner, reaching a ca. 80% inhibition at a 2%
concentration.
Leaves Leaf press juice (BPJ) Repeated addition of The BPJ decreased amplitude and inhibited Wächter et al. (2011)
BPJ in several dilutions contractility significantly faster and increased
(undiluted, 1–10%) on frequency significantly faster then the control.
myometrium strips
Anticancer activity
Leaves Bufadienolides of Inhibitory effect on All bufadienolides showed inhibitory activity and Supratman et al. (2001)
methanolic extract early antigen of briofilin A exhibited the highest activity (IC50 = 0.4 ␮M)
Epstein–Barr virus in among the compounds. Thus, bufadienolides are
the induction Raju cell potential cancer chemopreventive agents.
activation by a tumor
promoting gene
Leaves Chloroform extract MTT, electrophoretic The extract inhibited cervical cancer cell growth by Mahata et al. (2012)
mobility shift, northern 30%. Results shown depict a dose-dependent decrease
blotting and assays in in the level of HPV18 transcripts in cells treated with
cervical cancer cells crude extract.
Antimutagenic activity
Leaves Ethyl acetate, Antimutagenic activity The ethyl acetate and petroleum ether extracts Obaseiki-Ebor et al.
methanol, petroleum against EMS (ethyl exhibited potent antimutagenic activities at the (1993)
ether extracts methanosulfonate)- non-toxic concentrations of 200 and 400 ␮g/plate.
induced reversion
mutations in S.
typhimurium
Box 8: Continued
compound
Leaves Aqueous extract 125, 250, Gastrics lesions Female Wistar rats The pre-treatment with protects Araújo et al. (2018)
500 mg/kg, oral induced by ethanol and the mucosa of rats against the
indomethacin gastric damage of
indomethacin and
ethanol-induced gastric lesions,
and significantly reduced
damage by improving
parameters related to oxidative
stress and inflammation on
mucosal structures.
Helicobacter pylori activity
Leaves Methanolic extract 125, 250, Inoculation of H. pylori Swiss mice The extract showed a Mabeku et al. (2017)
500 mg/kg, oral in mice significant anti-Helicobacter
activity and reduced H. pylori
colonization of gastric tissue
from 100% to 17%.
Leaves Aqueous extract 25–800 mg/kg, oral Fresh egg Young adult Wistar The extract produced dose- and Ojewole (2005)
albumin-induced paw rats time-related, significant
edema reductions in the fresh egg
albumin-induced acute
inflammation in the rat hind
paw.
Leaves Methanolic extract 500 mg/kg, i.p. Paw edema induced by Sprague Dawley Significant activity was Gupta et al. (2009)
formaldehyde in rats rats and Swiss observed at the third hour after
albino mice carrageenan injection, with
72.64% reduction in paw
volume.
Leaves Aqueous extract 400 mg/kg (AQ); Carrageenan induced Wistar albino rats The AE and ED were active in Afzal et al. (2012)
(AE), esteroidal 300 mg/kg (ED), rat paw edema method reducing inflammation (87.29
derivative (ED) oral and 84.45% respectively)
somewhat less then diclofenac.
Leaves Ethanolic extract 0.1, 0.5, 1.0 mg/ear Ear edema induced by Male Swiss albino The topical application of Chibli et al. (2014)
in 20 ml of acetone, croton oil, arachidonic mice extract (0.5 and 1 mg/ear)
topically applied on acid (AA), phenol and significantly inhibited the
the right ear ethyl phenylpropiolate croton oil induced mice ear
(EPP), capsaicin. edema as well as the edema
caused by AA, phenol,
capsaicin and EPP.
Flowers Aqueous extract 3, 10, 30 mg/kg, Croton oil-induced Adult male Swiss Extract produced a Ferreira et al. (2014)
subcutaneously mice ear edema mice (25–35 g) dose-related antiedematogenic
effect evidenced by the
reduction in croton oil-induced
mice ear edema by 50.8, 54.2,
and 64.4%, respectively.
Flowers Aqueous extract 300 mg/kg, Carrageenan-Induced Adult male Swiss The pretreatment with extract Ferreira et al. (2014)
subcutaneously Pleurisy mice (25–35 g) or dexamethasone reduced the
leukocyte migration into the
pleural cavity by 56.1 and
43.9%, respectively. The
pretreatment reduced the
TNF-␣ concentration in pleural
exudates by 44.7 and 69.8%,
respectively.
Leaves Aqueous extract 400 mg/kg by Shock anaphylactic Male BALB/c mice Oral protection was Cruz et al. (2008)
gavage; 200 mg/kg, model and Lou-M rats accompanied by decreased
i.p. production of OVA specific IgE
antibodies, reduction of
eosinophilia, and decreased
production of IL-5, IL-10 and
TNF-␣.
Leaves Aqueous extract 400 mg/kg by Airway allergic disease BALB/c mice The extract decreased the Cruz et al. (2012)
intragastric model development of
hyporesponsiveness airway,
metaplasia and caliciform cells
and IL-5, IL-5 and TNF
production.
Box 8: Continued
compound
Wound healing potential

Leaves Petroleum ether, 400 mg/kg, oral Resutured incision Albino rats All the three extracts showed Khan et al. (2004)
alcohol, water wound, dead space significant increase in the
extracts wound, excision wound breaking strength of incision
wound. Water extract showed
significant increase in wound
contraction and formation of
scars on 17th post wounding
day.
Leaves Ethanolic extract 100 mg/kg, topical Excision wound model Male Sprague On the 11th day post-wounding, Nayak et al. (2010)
Dawley rats there was a significant increase
in the wound-healing activity.
Progressive reduction in the
wound area of the extract
treated animals was observed
by day 11 (86.3%).
Leaves Aqueous extract 1 ml of extract, A purulent infection Adult male Wistar The transgenic extract exhibits Lebedeva et al.
wild-type and topical was modeled in rat and rats favorable effect on healing of (2017)
transgenic infected with S. aureus wounds infected with S. aureus
and P. aeruginosa and with a combination of S.
aureus with P. aeruginosa. The
extract not transgenic was
active, but not as the transgenic
ones.
Leaves Aqueous extracts 1 ml of extract, After wounding, the Adult male Wistar The transgenic extract exhibits Zakharchenko et al.
of wild-type and topical rats were infected with rats favorable effect on healing of (2017)
transgenic plant C. albicans wounds infected with C.
albicans.
Bronchospasmolytic effects/effects on the contractile responses/anti-asthmatic and antitussive properties
Leaves Aqueous extract 200 mg/kg/day and Effects on the Adult guinea pigs The extract did not relax Ozolua et al. (2010a)
400 mg/kg/day, oral contractile responses of histamine or carbachol-induced
isolated tracheal rings precontractions. The presence
of the extract in organ baths
significantly reduced the
maximal contractile response
to cumulative concentrations of
histamine or carbachol
irrespective of the experimental
group. The aqueous extract
exhibited antispasmodic effects
on the guinea pig tracheal
rings.
Leaves Aqueous extract 200, 400 mg/kg/day Phenol red expectorant Adult guinea pigs The extracts significantly Salami et al. (2013)
method (antitussive increased the time for guinea
effects) pigs to experience
preconvulsive dyspnea;
reduced muscus viscosity in
the sensitized group. Both
doses also significant reduced
the bouts of cough but only
400 mg/kg/day inhibited the
amount of phenol red
secretion.
Leaves Aqueous extract 0.001, 0.01, 0.1, 1, Reduce the force of Adult guinea pigs The effect of the extract on the Mans et al. (2015)
10 mg/ml smooth muscle acetylcholine-induced force of
contraction of isolated contraction was apparent at
guinea pig trachea 10 mg/ml and involved a
chains induced by decrease of approximately 50%
acetylcholine or when compared to that
histamine produced by acetylcholine
3 × 105 M alone.
Analgesic activity
Leaves Aqueous extract 400 mg/kg (AQ); Acetic acid induced Swiss albino male ED is possessing a significant Afzal et al. (2012)
(AE), esteroidal 300 mg/kg (ED), writhing in mice mice analgesic activity when
derivative (ED) oral compared with a standard drug
showing 75.72% of protection
as compared to that of aqueous
extract of B. pinnatum and
diclofenac (100 mg/kg, i.p.).
Box 8: Continued
compound
Action on the gabaergic system

Leaves Juice 4.0 g/kg, i.p. Measure potentiation Wistar male rats of The juice had no effect on the Agostinho et al.
“sleeping-time” 220–250 g GABAergic system in rats in (1992)
induced by working conditions.
benzodiazepines and
seizure threshold
measure
Antinociceptive activity
Leaves Aqueous extract 25, 50, 100, 200, ‘Hotplate’ (thermal) and BALB/c albino mice The extracts (50–800 mg/kg i.p.) Ojewole (2005)
400, 800 mg/kg i.p. ‘acetic acid’ (chemical) produced significant
test antinociceptive effects against
thermally- and chemically
induced nociceptive pain
stimuli.
Leaves Methanolic extract 100, 200, 400 mg/kg Acetic acid-induced Male Swiss albino The extract demonstrated a Morshed et al.
body weight), oral gastric pain model mice significant dose-dependent (2010)
reduction in the number of
writhings. The highest
inhibition of writhings was
observed at a dose 400 mg/kg.
Flowers Aqueous extract 30, 100, 300 mg/kg, Acetic acid-induced Swiss mice Pretreatment of mice with Ferreira et al. (2014)
subcutaneous abdominal writhing extract at 100 and 300 mg/kg
produced antinociception
evidenced by the reduction of
the number of acetic
acid-induced writhings by
30.1% and 70.1%, respectively,
and extract (30 mg/kg) was
ineffective.
Anticonvulsant activity
Leaves Extraction with 50, 100, 200 mg/kg, Strychnine- and Swiss mice Treatment caused a Yemitan and
saline solution oral picrotoxin-induced dose-related delay of the onset Salahdeen (2005)
convulsion to tonic convulsion caused by
strychnine and picrotoxin. Even
if it was unable to prevent
convulsion, an inhibition of
mortality was also observed
with 100 and 200 mg/kg.
Roots, stem Methanolic extracts 100, 200, 400, Induction of seizures by BALB/c mice The extract exhibited a Mora-Pérez and
800 mg/kg, oral pentylenetetrazole dose-dependent increase in Hernández-Medel
model latency to myoclonus, clonus, (2016)
and tonic–clonic seizures,
acting similar to diazepam and
offering 100% protection
against the lethal effects of
pentylenetetrazol.
Locomotor activity
Leaves Aqueous extract 4.0 ml/kg Avoidance active Male Wistar rats The juice significantly Nassis et al. (1995)
(Juice) two-way increased the percentages of
avoidance (90.30 ± 7.60%) and
leakage (9.36 ± 1.78%) of the
animals observed.
Stems Ethanolic, aqueous 300, 600 mg/kg, v.o. Evaluate the Swiss albino mice The ethanolic extract showed a Matthew et al.
extract CNS-depressant higher CNS-depressive activity (2013b)
activity of extracts on in comparison to aqueous
the locomotor activity extract, but similar effect to the
standard drug
(chlorpromazine).
Neurosedative activity
Leaves Extraction with a 50, 100, 200 mg/kg, Pentobarbitone- Swiss mice The aqueous extract produced Yemitan and
saline solution oral induced sleep, significant CNS depressant Salahdeen (2005)
Hole-board method and effects. It produced a significant
Evasion test and dose-related prolongation
of the onset and duration of the
sleeping time on
pentobarbitone-induced
hypnosis, and a reduction in
head-dip and an increase in
percentage of mice remaining
in box in the head-dip and
evasion tests.
Box 8: Continued
compound
Muscle relaxant activity

Leaves Extraction with a 50, 100, 200 mg/kg, Chimney test, Traction Swiss mice A loss of muscle coordination Yemitan and
saline solution oral test, climbing and in the inclined screen, traction Salahdeen (2005)
inclined screen test and climbing tests, and in the
chimney test were observed.
Hepatoprotective activity
Aerial parts Ethanolic, aqueous 250, 500 mg/kg, oral Injury hepatic induced Wistar albino male The ethanolic extract had no Afzal et al. (2013)
extracts by DENA rats significant effect in the
parameters. The dose of
500 mg/kg of ethanolic extract
significantly increased SGPT
and ALP level. Treatment with
both doses of aqueous extract
significantly reversed the
parameters at a
dose-dependent manner.
Leaves Juice, ethanolic 200 mg/kg, CCl4 -induced Albino Wistar rats Juice concentrate decreased Yadav and Dixit
extract intraperitoneal hepatotoxicity of either sex the SGOT, SGPT, SALP and (2003)
(75–150 g) SBLN levels by 51.69, 92.47,
72.50 and 105.50%,
respectively. Ethanolic extract
decreased the same levels by
29.45, 81.37, 45.82 and 49.00%.
Antileishmania activity
Leaves Aqueous extract Oral: 4 and 8 mg; Limiting dilution assay, Male BALB/c mice The oral treatment significantly Silva et al. (1995)
i.v.: 2 mg; i.p.; topic: delayed-type delayed disease onset. When
50 ␮l hypersensitivity (DTH) started in the early stages of
reaction and antibody infection, daily oral dose of
production 8/0.2 mg/ml prevented growth
of the lesion and the effect was
long lasting, accompanied by a
significant reduction in the
number of viable parasites.
Leaves Aqueous extract 400 mg/kg by Visceral leishmaniasis, Female BALB/c The extract prevented parasite Gomes et al. (2009)
gavage using the Leishmania mice growth in both the spleen and
chagasi infection in the liver, reduced levels of IgG
mice parasite specific serum and
decreased ability of spleen cells
to produce IL-4, but not IFN-c
and nitric oxide.
Leaves Aqueous extract, Oral, 320 mg/kg/day Antileishmania activity BALB/c mice All treatments had controlled Muzitano et al.
isolated flavonoids to extract and in mice infected with L. the growth of the lesion caused (2009)
16 mg/kg/dia. amazonensis by L. amazonensis and
significantly reduced parasitic
load. These flavonoids were as
effective as crude aqueous
extract at dose 320 mg/kg.
Antimalarial activity
Aerial part Hydroethanolic 100, 250, 500, Antimalarial activity Rodent malaria The extract presented an Muñoz et al. (2000)
70% extract 1000 mg/kg/day Plasmodium intermediary activity by
vinckeipetteri inhibiting 63% of the parasite
growth at 1000 mg/kg.
Antihypertensive activity
Leaves Aqueous extract 12.5, 25.0 mg/kg Blood pressure Cats The dose of 12.5 mg/kg Ghasi et al. (2011)
body weight, i.v. determination produced a slight reduction in
the blood pressure by
3–4 mmHg. At 25.0 mg/kg, the
fall in the blood pressure was
still slight; it reduced by
8–9 mmHg. The extract given to
the cat was increased to
37.5 mg/kg and the fall in blood
pressure was between 8 and
12 mmHg. 50 mg/kg reduced
the blood pressure more
markedly by 8–15 mmHg.
Box 8: Continued
compound
Leaves Aqueous extract 25 mg/kg/day, Extract effect on blood Male albinos Wistar The extract significantly Bopda et al. (2014)
50 mg/kg/day or pressure in rats prevented the increase in
100 mg/kg/day by, normotensive and systolic and diastolic blood
gavage hypertensive rats (NaCl pressure in rats with high level
18% for 4 weeks) of salt. The co-administration of
25, 50 and 100 mg/kg/day,
significantly decreased the
blood pressure at 32, 24 and
47% (PAS) and 35, 33 and 56%
(for DBP) respectively. No
significant changes were
reported for cardiac frequency.
Antidiabetic activity
Leaves Aqueous extract 25, 50, 100, 200, Streptozotocin Young adult Wistar Pre-treatment of the fasted rats Ojewole (2005)
400, 800 mg/kg, (STZ)-induced diabetes rats with relatively moderate to
oral mellitus high doses aqueous extract
produced significant reductions
in the blood glucose
concentrations of both fasted
normal and fasted diabetic rats.
Leaves Ethanolic extract 500 mg/kg Streptozotocin-induced Wistar strain albino The postprandial test results Ogbonnia et al.
diabetic rats rats showed that the plant extract (2008)
exerted some hypoglycaemic
effects on the blood glucose
level in the fasting normal rats.
Stalk Aqueous and 300, 600 mg/kg, Diabetes I Wistar rats The extracts had a good Matthew et al.
ethanolic extracts oral Alloxan-induced hypoglycemic and (2013a)
antihyperglycemic activity.
Leaves Aqueous extract Oral: 200, 400 and Diabetes induced by Albino rats The extract decreased the Aransiola et al.
800 mg/kg and D-glucose glucose level after 120 min (2014)
glybenclamide administration. The dose of
2 mg/k + 800 mg/kg 200 mg/kg showed significant
of extract decrease in the glucose level
compared to the other doses
performance. The association
of glybenclamide promoted the
major decreased in the glucose
level.
Leaves Aqueous extract 3 mature leaves Streptozotocin-induced Adult Sprague rats There was a decreasing trend Menon et al. (2015)
∼9.96 g/70 kg or diabetic rats in the average food intake
about 0.14 g/kg among the groups (normal
group > diabetic group > treated
diabetic group.
Leaves Aqueous extract 3 mature leaves Streptozotocin-induced Adult There was weight loss and Menon et al. (2016)
∼9.96 g/70 kg or diabetic rats Sprague–Dawley reduced food consumption in
about 0.14 g/kg rats the treated diabetic group.
Serum glucose levels were
reduced. Serum catalase
activity was significantly
increased in the treated diabetic
group. There was a significant
increase in Mg ATPase activity.
Hypocholesterolemic activity
Leaves Ethanolic extract 500 mg/kg Evaluation of Wistar strain albino The extract clearly Ogbonnia et al.
hypolipidaemic effects rats demonstrated the presence (2008)
in animals treated with hypolipidemic agents in the
extract for 21 days extract. There was also a
significant decrease in both
triglyceride and LDL cholesterol
levels while significant increase
in HDL cholesterol levels.
Leaves Aqueous extract 3 mature leaves Streptozotocin-induced Adult Sprague rats There was a significant Menon et al. (2015)
∼9.96 g/70 kg r diabetic rats elevation in triglyceride level in
about 0.14 g/kg the diabetic group, which was
reduced toward normal level by
the treatment. Total cholesterol
level was also elevated in the
diabetic group and there was a
decreasing trend toward the
normal group by the treatment.
Additionally, HDL cholesterol
was significantly reduced.
Box 8: Continued
compound
Hormonal activity
Leaves Aqueous extract 4.0 mg/kg, s.c. Effects on the release of Wistar rats The rats that received the juice Nassis et al. (1996)
(Juice) gonadotropins showed lordosis coefficient
(sexual receptivity) higher then
the control group. It was
observed a significancy for
latency to ejaculation treated
animals compared to control.
Effect on hematological parameters
Leaves Methanolic extract 100, 200, 400, Animals were treated Adult male Wistar Hemoglobin, packed cell Ufelle et al. (2011)
600 mg/kg, oral with extracts at the rats volume and total white blood
doses once daily during cell of all treated rats were
28 days increased. The platelet count
was decreased in all treated
groups but only in group A
(100 mg/kg). The blood film
report revealed normocytic and
normochromic red blood cells.
Nephroprotective activity
Leaves Aqueous extract 125 mg/kg/day, i.p. Nephrotoxicity induced Male albino Wistar The extract protects rat kidneys Harlalka et al.
by gentamicine at the rats from gentamicin-induced (2007)
dose 100 mg/kg/day histopathological changes. This
during 8 days extract also normalized the
gentamicin-induced increases
in urine and plasma creatinine,
blood urea and blood urea
nitrogen levels.
Leaves Aqueous extract 25 and 50 mg/kg, Nephrotoxicity induced Albino Wistar rats The pre-treatment with the two Anadozie et al.
oral for 14 days by CCl4 i.p. during 7 doses inhibits arginase II (2018)
days preventing renal oxidative
damage occasioned by CCl4 . In
addiction reduced endothelial
NO, functional SH groups,
oxidative enzymatic antioxidant
status and normalizing the
histological architecture of the
kidney.
Antilithic activity
Leaves Ethanolic and 100, 200, Renal calculi induced Male albino Wistar The extracts attenuated the Yadav et al. (2016)
hydroethanolic 70% 400 mg/kg, oral by ethylene glycol rats EG-induced decrease in body
extracts weight and elevation in urinary
parameters and serum
biochemical parameters. Also
decrease in urine volume, pH,
magnesium and creatinine
clearance, oxidative and
histological damages in
kidneys.
Adjuvant treatment to poisoning (local anti-inflammatory activity)
Leaves Hydroethanolic 125, 250, Paw edema and Swiss albino mice In the pre-treatment protocol, Fernandes et al.
50% extract 500 mg/kg, i.p. hemorrhagic activity the extract reduced the (2016)
induced by Bhotrops hemorrhagic activity reaching
jararaca about 40% and in the
post-treatment protocol about
30%. In the antiedematogenic
activity, B. pinnatum was active
inhibiting about 66% and 30%
in pre and post-treatment
protocols, respectively.
metabolites of the leaves juice may inhibit detrusor contractility in vivo toxicity assays reported in the literature for K. laciniata and
(Bachamann et al., 2017), supporting the previous clinical study. B. pinnatum species are shown in Boxes 9 and 10, respectively.
Although most studies have shown that both species present
low toxicity and good safety, one study observed some reactions
to the central nervous system attributed to K. laciniata, as well as
Toxicology
spasms, tachycardia, fine and coarse tremors and aggression (Silva,
2007). Other study reported a reduction in the sensitiveness of the
Acute toxicity of K. laciniata species has been investigated in
rats to noise and touch, which also presented jerkiness and lethargy
various types of extracts made from leaves or the whole plant.
(Fondjo et al., 2012). For B. pinnatum, some studies have reported
On the other hand, the toxicological studies involving B. pinnatum
cytotoxicity (Sowemimo et al., 2007; Abdellaoui et al., 2010; Biswas
were performed mainly with extracts of the leaves. The in vitro and
Box 9: Non-clinical in vitro and in vivo toxicity studies reported for Kalanchoe laciniata.
Plant part Extract Dose and rout Method Result Reference
In vitro toxicity
Leaves Methanolic extract – Cytotoxicity against K. crenata showed Kuete et al. (2017)
human carcinoma cells good cytotoxicity
activity against
mesothelioma, lung
and breast cancer cells,
but the best activity
was against
mesothelioma. The
extract induced
apoptosis via ROS
production.
Whole plant Methanolic 70% and – Genotoxic potential The methanolic and Sharif et al. (2017)
hexane extract using Ames assay n-hexane extracts
(Salmonella exhibited significant
typhimurium) and mutagenicity and
cytotoxicity was cytotoxicity.
evaluated using MTT
assay
In vivo toxicity
Leaves Aqueous 1 (before 0.25–5 g/kg, i.p. Acute toxicity using No toxicity was Mourão et al. (1999)
flowering) and aqueous Swiss mice observed within 48 h of
2 (after flowering) administration.
Leaves Hydroethanolic extract 1000–3000 mg/kg, i.p. Acute toxicity using The LD50 was Silva (2007)
(90%) Swiss mice 1925 mg/kg and
numerous reactions to
central nervous system
level to escape
reactions, spasms,
tachycardia, fine and
coarse tremors,
aggression, among
others were observed.
Whole plant Water–ethanol extract 0.2, 0.4, 0.8, 1.5, 3, Acute toxicity using Neither mortality nor Kamgang et al. (2008)
5 g/kg, oral male Wistar rats gross behavior change
was observed at
different doses up to
5 g/kg.
Leaves Hydroethanolic extract 250 mg/kg, gavage Mutagenicity: A mutagenic effect of Paiva and Batitucci
(50%) micronucleus assay the extract was (2008)
in vivo in mouse bone observed. However,
marrow using mice more studies are
necessary to prove and
evaluate the effects.
Whole plant Methanol extract 2, 4, 6, 8, 10 g/kg, oral Acute toxicity using The doses 4, 6, 8 and Fondjo et al. (2012)
male Wistar rats 10 g/kg reduced the
sensitiveness of rats to
noise and touch, which
also showed jerkiness
and lethargy, and
induced soft feces and
66% mice death within
30 min of
administration. The
10 g/kg dose caused
100% mice death. The
LD50 was 4.4 g/kg.
Leaves Hydroethanolic extract 250, 500, 1000, Acute toxicity and The extract showed low Fonseca (2014),
(50%) 2000 mg/kg, gavage subchronic toxicity acute and subchronic Fonseca et al. (2018)
using Swiss mice in vivo toxic effects.
Swiss mice The biochemical
parameters were not
affected and there were
no significant
hematologic changes
between the groups
studied. The extract
showed slight liver
changes at doses 500
and 1000 mg/kg
through the liver
enzymes linked to the
hepatic histopathology,
as a characteristic sign
extract metabolism.
Box 10: Non-clinical in vitro and in vivo studies reported for Bryophyllum pinnatum.
Plant part Extract Dose and route Method Result Reference
In vitro toxicity
Whole plant Ethanolic extract – Brine shrimp lethality LD50 values of extracts with Sowemimo et al.
(80%) test and standard ≤100 mg/ml was considered active (2007)
telomerase elongation and those with <20 were
assay TRAP (telomere considered very active.
repeat amplification
protocol)
Stalks, Ethanolic extract – Cytotoxicity against six Non-cytopathogenic effect at Gonçalves et al.
leaves, flowers cell lines concentrations between 2 and 5%. (2009)
Leaves Methanolic extract – Cytotoxicity in The extract had strong cytotoxicity, Abdellaoui et al.
keratinocytes for 48 h because the viability of (2010)
keratinocytes is fully recovered
only for the extract at lower
concentrations (≤0.78 mg/ml).
Leaves, Petroleum ether, – Brine shrimp lethality Both extracts exhibited lethality Chowdhury et al.
stems aqueous extracts bioassay against the brine shrimp nauplii. (2011)
The respective LC50 and LC90 of the
petroleum ether (25.12 and
177.83 ␮g/ml) and aqueous extract
(25.12 and 173.78 ␮g/ml) were
assessed.
Leaves Chloroform extract – Brine shrimp lethality Moderate level of general toxicity Biswas et al. (2012)
bioassay in the brine shrimp lethality
bioassay (LC50 125.89 and LC90
234.42 ␮g/ml) was observed.
Leaves Hexane, – MTT assay The extracts exhibited potential Kaewpiboon et al.
dichloromethane, in vitro cytotoxicity against the four (2012)
ethanolic extract human cell lines tested.
Leaves Aqueous, ethanolic, – MTT assay in BHK The aqueous and ethanolic extracts Joshi and Chauhan
methanolic extract assay; and neutral red showed better responses compared (2013)
assay (cytotoxicity) to the methanolic one. The
concentration of 10 mg/ml of the
ethanolic extract inhibited the
cancerous growth.
In vivo toxicity
Leaves Aqueous extract 16 mg/0.2 ml Normal BALB/c mice Absence of chronic toxicity to the Torres-Santos et al.
PBS/day; 30 days received 16 mg the liver, heart or kidney. (2003)
gavage for 30 days
Whole plant Ethanolic extract 10, 100, 1000 ␮g/ml Brine shrimp lethality Bryophyllum calycinum was Sowemimo et al.
(80%) test considerably toxic and consistent (2007)
with the brine shrimp results.
Leaves Methanolic, 350–2600 mg/kg Swiss albino male mice The LD50 values of methanolic Devbhuti et al.
aqueous extracts methanolic and and rats, i.p., with extract in mice and rats were (2008)
aqueous; graded doses. The 1159.03 and 1459.69 mg/kg,
500–3000 mg/kg methanolic and respectively, and the aqueous
methanolic, i.p. aqueous extracts were extract were 957.02 and
also administered 1064.21 mg/kg, respectively. The
orally in graded doses extracts were non-toxic orally in
in mice and rats to test doses up to 3 g/kg body weight in
their oral toxicity mice and rats.
Leaves Aqueous extract 1, 2, 3, 4, 5 g/kg, Acute and sub-acute The oral LD50 of the extract was Ozolua et al. (2010b)
oral toxicological indeterminable as there were no
experiments in deaths recorded and no obvious
Sprague-Dawley rats toxicological signs at 5 g/kg body
weight. However, by the
intraperitoneal route, the LD50 was
estimated in 1.8 g/kg.
Leaves Aqueous, ethanolic 5, 50, 500, Acute toxicity by OECD The extracts were safe up to a dose Afzal et al. (2013)
extracts 2000 mg/kg, oral 420 using male Wistar of 2000 mg/kg.
rats
Leaves Ethanolic extract 100, 200 mg/kg, oral Effect of extract on The extract at the doses showed Akpantah et al.
microanatomy of male abnormalities in the animal’s testis, (2014)
Wistar rat’s testis for 8 as increasing numbers of
weeks intercellular spaces within the
seminiferous epithelium, reduction
and increase of the lumen,
suggesting cell disintegration.
Leaves Ethanolic and 2000 mg/kg, oral Acute toxicity by OECD No toxic symptoms or mortality or Yadav et al. (2016)
hydroethanolic 70% 423 using Male albino moribund stage observed with
extracts Wistar rats single acute limit dose level of
2000 mg/kg in any animal during 14
consecutive days.
et al., 2012; Kaewpiboon et al., 2012). In addition, abnormalities in Aguiar, C.M., Alencar, S.M., Tsai, S.M., Park, Y.K., 2007. Transformações enzimáticas
the animal’s testis were observed in one study (Akpantah et al., de flavonoides. Bol. Centro Pesqui. Process. Aliment. 25, 61–76.
Agyare, C., Spiegler, V., Sarkodie, H., Asase, A., Liebau, E., Hensel, A., 2014. An
2014). ethnopharmacological survey and in vitro confirmation of the ethnopharmaco-
Therefore, it seems likely to infer that K. laciniata and B. pinnatum logical use of medicinal plants as anthelmintic remedies in the Ashanti region,
are safe to use acutely but is necessary performed additional studies in the central part of Ghana. J. Ethnopharmacol. 158, 255–263.
Akihisa, T., Kokke, W.C.M.C., Tamura, T., Matsumoto, T., 1991. Sterols of Kalanchoe
to investigate their sub-chronic and chronic toxicity. pinnata: first report of the isolation of both C-24 epimers of 24-alkyl-25 -sterols
from a higher plant. Lipids 26, 660–665.
Conclusion Akinpelu, D.A., 2000. Antimicrobial activity of Bryophyllum pinnatum leaves. Fitoter-
apia 71, 193–194.
Akinsulire, O.R., Aibinu, I.E., Adenipekun, T., Adelowotan, T., Odugbemi, T., 2007.
Several studies related to the botanical, chemical, ethnopharma- In vitro antimicrobial activity of crude extracts from plants Bryophyllum pinna-
cological, pharmacological and toxicological aspects of B. pinnatum tum and Kalanchoe crenata. Afr. J. Tradit. CAM 4, 338–344.
Akpantah, A.O., Obeten, K.E., Edung, E.S., Eluwa, M.A., 2014. The effect of ethanolic
have been conducted. On the other hand, only few studies about the extract of Bryophyllum pinnatum on the micro anatomy of the testes of adult
chemical and pharmacological aspects of K. laciniata species have males Wister rats. Eur. J. Biol. Med. Sci. Res. 2, 37–44.
been reported. Toxicological studies are scarce for both species. Albertasse, P.D., Thomaz, L.D., Andrade, M.A., 2010. Plantas medicinais e seus usos na
comunidade da Barra do Jucu, Vila Velha, ES. Rev. Bras. Plantas Med. 12, 250–260.
Therefore, when we consider the several traditional uses of K. Albuquerque, U.P., Monteiro, J.M., Ramos, M.A., Amorim, E.L.C., 2007a. Medicinal and
laciniata, it becomes detrimental to scientifically evaluate the phar- magic plants from a public market in northeastern Brazil. J. Ethnopharmacol.
macological properties that have been attributed to this species. 110, 76–91.
Albuquerque, U.P., Medeiros, P.M., Almeida, A.L.S., Monteiro, J.M., Lins Neto, E.M.F.,
Despite the various traditional uses and non-clinical pharmacolog- Melo, J.G., Santos, J.P., 2007b. Medicinal plants of the caatinga (semi-arid)
ical studies reported for B. pinnatum and K. laciniata, clinical studies vegetation of NE Brazil: a quantitative approach. J. Ethnopharmacol. 114,
are still scarce. More studies should be conducted in order to iden- 325–354.
Alhaji, U.I., Samuel, N.U., Aminu, M., Chidi, A.V., Umar, Z.U., Umar, U.A., Adewale,
tify the specific compounds that are responsible for the reported
B.M., 2014. In vitro antitrypanosomal activity, antioxidant property and phy-
pharmacological activities for both species. Finally, the information tochemical constituents of aqueous extracts of nine Nigerian medicinal plants.
reported in this review may contribute to recognizing the impor- Asian Pac. J. Trop. Dis. 4, 348–355.
tance of K. laciniata and B. pinnatum as important plant sources for Allorge-Boiteau, L., 1996. Madagascar centre de speciation et d’origine du genre
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C.Z., 1997. Estudo da atividade antihistamínica da Kalanchoe brasiliensis. Arq.
Authors’ contributions Med. ABC 1–2, 7–10.
Almeida, A.P., Silva, S.A.G., Souza, M.L.M., Lima, L.M.T.R., Rossi-Bergmann, B., Moraes,
JMF and LMC contributed in data collect, systematization of arti- V.L.G., Costa, S.S., 2000. Isolation and chemical analysis of a fatty acid fraction of
Kalanchoe pinnata with a potent lymphocyte suppressive activity. Planta Med.
cles in boxes and drafter the first version of the paper. JMF and
66, 134–137.
EMGL were responsible for drawn chemical structures and in chem- Almeida, A.P., Muzitano, M.F., Costa, S.S., 2006. 1-Octen-3-O-␣-
ical box. JMF contributed in drafter the final version of the paper l − arabinopyranosymbeta-glucopyranoside, a minor substance from the
leaves of Kalanchoe pinnata (Crassulaceae). Rev. Bras. Farmacogn. 16, 485–489.
and to critical reading of the manuscript. MFP and EPA contributed
Amaral, A.C.F., Simões, E.V., Ferreira, J.L.P., 2005. Coletânea científica de plantas de
to critical reading of the manuscript. EPA was responsible for the uso medicinal. Fiocruz, Curitiba.
revision of the English manuscript. SMZL was responsible for the Anadozie, S.O., Akinyemi, J.A., Agunbiade, S., Ajuboye, B.O., Adewale, O.B., 2018.
project concept and, critical reading of the manuscript and super- Bryophyllum pinnatum inhibits arginase II activity and prevents oxidative dam-
age occasioned by carbon tetrachloride (CCl4 ) in rats. Biomed. Pharmacother.
vision of this study. All the authors have read the final manuscript 101, 8–13.
and approved the submission. Anjoo, K., Saluja, A.K., 2010. Microscopical and preliminary phytochemical studies
on aerial part (leaves and stem) of Bryophyllum pinnatum Kurz. Pharmacogn. J.
2, 254–259.
Conflicts of interest Anvisa, 2014. Resolução de Diretoria Colegiada n◦ 26 de 13 de maio de 2014.
Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos e o registro e a
notificação de produtos tradicionais fitoterápicos. Ministério da Saúde, Agên-
The authors declare no conflicts of interest.
cia Nacional de Vigilância Sanitária, http://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/
anvisa/2014/rdc0026 13 05 2014.pdf (accessed January 2017).
Appendix A. Supplementary data Aoki, C., Hartati, S., Santi, M.R., Firdaus, R.L., Hanafi, M., Kardono, L.B.S., Shimizu, Y.,
Sudarmono, P., Hotta, H., 2014. Isolation and identification of substances with
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58
Capítulo 2 - Estudo Fitoquímico de Bryophyllum pinnatum

59
CAPÍTULO 2 - ESTUDO FITOQUÍMICO DE Bryophyllum pinnatum
1 INTRODUÇÃO
Bryophyllum pinnatum (Lam) Oken, nativa de Madagascar, conhecida popularmente
como saião ou coirama, é usada largamente na medicina tradicional, na forma de suco das
folhas, por sua ação anti-inflamatória (AMARAL; SIMÕES; FERREIRA, 2005). No tocante a
sua origem, é um espécie naturalizada no Brasil, no entanto não é endêmica, visto que pode ser
encontrada em diversos biomas ou regiões brasileiras, especialmente nas regiões nordeste,
sudeste e sul (GIUFFRE; GOEBEL; CADDAH, [s.d.]). O nome desse gênero é sinônimo
heterotípico de Kalanchoe (GIUFFRE; GOEBEL; CADDAH, [s.d.]), e a espécie, Bryophyllum
pinnatum é o nome aceito (THE PLANT LIST, 2013), por isso foi escolhido para ser utilizado
nesse trabalho. B. pinnatum apresenta diversas sinonímias (TROPICOS.ORG, [s.d.]), dentre as
quais a mais comumente utilizada em grande parte dos trabalhos publicados é Kalanchoe
pinnata (Lam.) Pers. (TROPICOS.ORG, [s.d.]). K. pinnata, no entanto, também é um nome
aceito segundo o site Flora do Brasil 2020. Através da revisão integrativa realizada para essa
espécie (capítulo 1), é possível contabilizar mais de uma centena de trabalhos científicos
realizados com B. pinnatum. Dentre os trabalhos químicos, é possível dizer que os flavonoides
são a classe de metabólitos secundários mais descritos e considerados de grande importância
para a espécie, sendo tratados como majoritários.
Diversos flavonoides já foram descritos para B. pinnatum, a maioria deles derivados da
quercetina e do canferol (DE ARAÚJO et al., 2018; FERNANDES et al., 2016; MUZITANO
et al., 2006a). Um deles merece especial atenção, a quercetina 3-O-α-L-arabinopiranosil-
(1→2)-O-α-L-ramnopiranosídeo, isolado pela primeira vez para a espécie por Muzitano e cols
(2006). Estudo realizado por Nascimento e cols (2018) reforçaram que esse flavonoide
incomum pode ser usado como marcador para B. pinnatum. Nesse trabalho foi realizado um
estudo de otimização da metodologia de obtenção do extrato aquoso para aumentar o teor dessa
substância e reduzir os custos do processo extrativo. Os resultados mostraram que a obtenção
de um extrato enriquecido com esse flavonoide majoritário pode ser melhorada com o aumento
da temperatura de extração para 40 ºC e redução do tempo de extração (NASCIMENTO et al.,
2018). Somado a isso, para esse componente majoritário, há relatos na literatura de sua
atividade anti-inflamatória (FERREIRA et al., 2014) e leishimanicida (MUZITANO et al.,
2006a), apresentando-se como candidato a marcador ativo para esta espécie.
Nosso grupo de pesquisa vem desenvolvendo trabalhos com B. pinnatum há cerca de 10
anos, especialmente na área de fitoquímica, por meio da análise dos extratos hidroetanólicos e

60
aquosos por CLAE-EM/EM, e farmacológicos direcionados a atividade antibotrópica, anti-

inflamatória tópica, anticolítica e antiúlcera (DE ARAÚJO et al., 2018, 2019; FERNANDES et
al., 2016). No entanto, ainda não foi possível obter compostos isolados em rendimento
adequado para aprofundar nos estudos farmacológicos e analíticos com a espécie. Dessa forma,
o isolamento e a identificação das substâncias majoritárias nos extratos das folhas de B.
pinnatum se faz necessário para um melhor investigação de suas atividades biológicas, bem
como para serem usados como marcadores químicos no controle de qualidade da droga vegetal,
produto intermediário e produto acabado de um possível fitoterápico que possa ser
desenvolvido com a espécie.
Nesse contexto, foi utilizada a Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC) para tentar
obter os compostos majoritários de B. pinnatum de uma forma rápida, eficiente e com
rendimento adequado. Além disso, técnicas de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e
Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (CLUE) foram utilizadas no desenvolvimento de
metodologias analíticas para quantificação dos marcadores dessa espécie obedecendo a RDC
166/2017.
Por fim, é importante ressaltar que o objetivo desse fracionamento não foi a obtenção
de moléculas novas, mas a obtenção em quantidades suficientes dos compostos majoritários
para serem usados como padrão para a quantificação dos extratos, para o estudo metabolômico
e, também, para investigação da atividade biológica.
A seguir, será apresentada uma breve revisão de literatura para melhor compreensão da
técnica de CPC como importante ferramenta de isolamento de produtos naturais bem como
uma breve explanação sobre controle de qualidade de plantas medicinais e fitoterápicos, com
foco nas legislações brasileiras que regulamentam essa área e nos métodos que foram utilizados
para a validação de métodos analíticos para quantificação dos compostos de B. pinnatum

61
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO CENTRÍFUGA (CPC)

A Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC), uma das várias técnicas de
cromatografia líquido-líquido baseada na partição entre duas fases imiscíveis, tem sido bastante
utilizada para o isolamento de produtos naturais, principalmente de origem vegetal, desde o seu
desenvolvimento através de uma parceria entre a Sanki. Eng. Ltd. e o Dr. Yochiro Ito (inventor
da cromatografia em contracorrente) e a sua introdução no Japão em 1982 (BOJCZUK;
ŻYŻELEWICZ; HODUREK, 2017; FRIESEN et al., 2015; SKALICKA-WOŹNIAK;
GARRARD, 2015; BERTHOD; RUIZ-ÁNGEL; CARDA-BROCH, 2009; MARCHAL;
LEGRAND; FOUCAULT, 2003).
A CPC é uma separação em contracorrente do tipo hidrostática, isto é, o rotor (figuras
1 e 2) é composto por uma série de células que giram em torno de um único eixo (FRIESEN et
al., 2015; KȨDZIERSKI; KUKUŁA-KOCH; ŁGOWNIAK, 2014). Como toda técnica em
contracorrente, a CPC baseia-se na separação de substâncias entre dois líquidos imiscíveis, um
funciona como fase estacionária, retido dentro da coluna devido a força centrífuga gerada pelo
rotor em movimento, e outro como fase móvel, bombeado através da fase estacionária
(FRIESEN et al., 2015; BERTHOD et al., 2009; BERTHOD; RUIZ-ÁNGEL; CARDA-
BROCH, 2009; MARSTON; HOSTETTMANN, 2006). Devido a isso e de acordo com as
características da amostra, o Cromatógrafo de Partição Centrífuga, pode operar em dois modos
(figura 3): ascendente, quando a fase móvel é a fase menos densa, ou descendente, quando a
fase móvel é a fase mais densa (BOJCZUK; ŻYŻELEWICZ; HODUREK, 2017;
KȨDZIERSKI; KUKUŁA-KOCH; ŁGOWNIAK, 2014).
Figura 1 – Estrutura do rotor.
Fonte: BOJCZUK; ŻYŻELEWICZ; HODUREK, 2017.

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Figura 2 – Células e ductos dentro do rotor do CPC.
Fonte: BOJCZUK; ŻYŻELEWICZ; HODUREK, 2017.
Figura 3 – Modos de operação do CPC. Modos ascendente e descendente.
Fonte: Adaptado de BOJCZUK; ŻYŻELEWICZ; HODUREK, 2017.
Na CPC, as substâncias são separadas de acordo com o seu coeficiente de partição ou

distribuição (KD), isto é, na sua distribuição relativa entre as fases móvel e estacionária do
sistema solvente, sendo que as que tem mais afinidade pela fase móvel eluem primeiro (KD <
1), e os que tem mais afinidade pela fase estacionária (KD > 1) são retidos por mais tempo na
coluna, e poderá ser “extrusado”, um mecanismo indisponível para cromatografia líquida
baseada em uma fase sólida (BOJCZUK; ŻYŻELEWICZ; HODUREK, 2017; LIU et al., 2015;
ABDELLAOUI et al., 2010; MARSTON; HOSTETTMANN, 2006). Dessa forma, o KD é um
parâmetro invariante de qualquer analito em um sistema solvente particular e um parâmetro
característico importante em um experimento de separação em contracorrente. (LIU et al.,
2015). É importante acrescentar que a “extrusão” é uma das vantagens da técnica de CPC, ou
seja, poder recuperar todo o extrato ou fração que foi injetado no equipamento, assim, retirando
os compostos que ficam retidos pelo bombeamento da fase estacionária da coluna no final da
corrida de eluição. O esquema de separação que ocorre dentro do CPC pode ser visualizado na
figura 4.

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Figura 4 – Modus operandi das técnicas de separação em contracorrente do tipo hidrostática, como a CPC.
Fonte: Adaptado de BOJCZUK; ŻYŻELEWICZ; HODUREK, 2017.
A escolha do solvente apropriado é fundamental para separações em contracorrente e

pode requerer um investimento de tempo significante que pode ocupar 90 % do tempo destinado
a realizar a separação (PAULI; PRO; FRIESEN, 2008). Uma sistemática bastante utilizada para
a escolha do sistema bifásico de solventes consiste em preparar a mistura de solventes em
pequena escala (tubos de ensaio), agitar e, depois de atingir o equilíbrio, separar as fases.
Então, uma pequena quantidade de amostra (cerca de 1 a 4 mg) é pesada em um tubo de
ensaio e é adicionado um pequeno volume de cada fase (2 a 4 mL) ao tubo. Após agitar
vigorosamente o tubo de ensaio (cerca de 1 a 2 min), para que ocorra a distribuição do(s)
analito(s) entre as fases, as mesmas serão separadas, secas sob pressão reduzida e, analisadas
por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ou por Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE) (BIANCHI et al., 2018; MANDOVA et al., 2017; DESTANDAU et al.,
2015; FRIESEN et al., 2015; BERTHOD et al., 2009; BERTHOD; RUIZ-ÁNGEL; CARDA-
BROCH, 2009; MARSTON; HOSTETTMANN, 2006; MOREL et al., 2012). Para análise por
CCD, um sistema ótimo fornece uma distribuição igual entre as duas fases e valores de Rf dos
componentes da amostra entre 0,2 e 0,5. Para análise por CLAE, a área do pico de cada
componente nas diferentes fases (superior e inferior) são comparadas (PAULI; PRO;
FRIESEN, 2008).

64
Atualmente, com o avanço da tecnologia, as técnicas de separação em contracorrente,

especificamente no caso dessa revisão, a CPC, podem ser acopladas a diferentes detectores de
modo a acompanhar a separação. O detector mais comumente utilizado é o Ultravioleta-Visível
(UV-Vis), no entanto, uma ampla gama de compostos não pode ser visualizada. Devido a isso,
diversos outros detectores vem sendo acoplados de forma a garantir um melhor
acompanhamento da separação dos compostos, como o ELSD (Detector de Espalhamento de
Luz Evaporativo), EM (Espectrometria de Massas) e até mesmo, em equipamentos mais
avançados, o RMN (Ressonância Magnética Nuclear) (MICHEL; DESTANDAU; ELFAKIR,
2014).
A técnica de CPC vem ganhando popularidade como um método de separação para
produtos naturais, embora a técnica de HSCCC (High Speed Counter-Current Chromatography
– Cromatografia em Contracorrente de Alta Velocidade), uma técnica de separação em
contracorrente do tipo hidrodinâmica, ainda seja a mais utilizada (SKALICKA-WOŹNIAK;
GARRARD, 2015). Além de todas as vantagens que as técnicas em contracorrente apresentam
– como i. a ausência de um suporte sólido, o que diminui consideravelmente ou elimina a
possibilidade de degradação das substâncias, bem como diminui o gasto na aquisição de
colunas; ii. não há necessidade de pré-tratamento de amostra; iii. maior capacidade de trabalhar
com grandes volumes e com amostras mais concentradas e em maiores quantidades; iv. uso de
solventes grau analítico que são menos onerosos; v. não há perda de resolução cromatográfica
no scaling up; entre outros –, a CPC ainda apresenta vantagens em relação a HSCCC como
maior controle da fase estacionária e menor perda de resolução no scaling up (BOJCZUK;
ŻYŻELEWICZ; HODUREK, 2017).
Por fim, a CPC, assim como todas as separações em contracorrente, é considerada como
um técnica de “green chromatography” (ou cromatografia verde, ou ainda química verde –
green chemistry), por ter um baixo consumo de solvente (BOJCZUK; ŻYŻELEWICZ;
HODUREK, 2017). Devido ao aumento da preocupação e da regulamentação ambiental em
diversos países, a preocupação com o impacto ambiental é uma tendência e vem influenciando
desde o desenvolvimento de métodos até o de tecnologias e técnicas analíticas (FUNARI et al.,
2013). Dessa forma, o isolamento por CPC diretamente do extrato bruto é um método
importante em química verde, uma vez que não temos a produção de resíduo sólido do
adsorvente usado em cromatografia sólido-líquido, e a quantidade de solventes orgânicos
utilizados é reduzida, uma vez que o método é realizado diretamente do extrato hidroetanólico
(FRIESEN et al., 2015).

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2.2 CONSIDERAÇÕES SOBRE CONTROLE DE QUALIDADE E PADRONIZAÇÃO DE

PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS
Cerca de um terço dos medicamentos aprovados pela Food and Drug Administration
(FDA) nos últimos 20 anos são baseados em produtos naturais ou seus derivados, e cerca de
um quarto de todos os medicamentos aprovados pela FDA e/ou pela Agência Médica Europeia
(EMA) são derivados de plantas (THOMFORD et al., 2018). Além de seu papel na descoberta
de novos fármacos, as plantas medicinais podem ser a base para o desenvolvimento de
fitoterápicos, e são parte integrante dos sistemas médicos tradicionais em todo o mundo
(PFERSCHY-WENZIG; BAUER, 2015; MOSIHUZZAMAN et al., 2008).
Nesse contexto, a demanda por fitoterápicos tem aumentado constantemente nas últimas
duas décadas, também em países industrializados, devido a sua acessibilidade, disponibilidade
local e sustentabilidade potencial (PFERSCHY-WENZIG; BAUER, 2015;
MOSIHUZZAMAN et al., 2008). Isso levou a Organização Mundial da Saúde a criar um
documento com estratégias a serem atingidas por seus países membros entre os anos de 2014 e
2023. Assim, os países membros devem desenvolver, melhorar e aplicar políticas, regulamentos
e diretrizes que reflitam as suas realidades, entre as quais destaca-se fortalecer a garantia de
qualidade, segurança, uso apropriado e efetividade da medicina tradicional através da
regulamentação de produtos, práticas e profissionais por meio da educação e treinamento,
desenvolvimento de habilidades, serviços e terapias (BURTON; SMITH; FALKENBERG,
2015; WHO, 2013).
Os fitoterápicos são definidos como produtos obtidos de matéria-prima ativa vegetal,
exceto substâncias isoladas, com finalidade profilática, curativa ou paliativa, incluindo
medicamento fitoterápico (MF) e produto tradicional fitoterápico (PTF) (BRASIL, 2014a).
Agências reguladoras no Brasil, como a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)
e o Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO), bem
como a Conferência Internacional de Harmonização (ICH) estabeleceram normas rígidas para
garantir a qualidade, segurança e eficácia de plantas medicinais e fitoterápicos. Essas agências
determinam os parâmetros que devem ser seguidos ao validar novos métodos analíticos para
controle de qualidade (MOTTA; DA COSTA; BASTOS, 2017).
A fim de garantir a qualidade, segurança e eficácia adequadas dos medicamentos à base
de plantas, é necessário considerar muitos desafios específicos para estes produtos que podem
ocorrer em todas as etapas da produção, incluindo cultivo/coleta, processamento pós-colheita e
fabricação. Essas etapas podem alterar o conteúdo de metabólitos secundários, e mantê-los sob
controle requer métodos de análise apropriados em todas as etapas da fabricação. Além disso,

66
devido às complexas misturas fitoquímicas presentes nas plantas medicinais e fitoterápicos, sua
padronização não é uma tarefa fácil (INDRAYANTO, 2018; PFERSCHY-WENZIG; BAUER,
2015; KUNLE; EGHAREVBA; AHMADU, 2012).
A padronização de extratos de fitoterápicos é realizada com base no teor de substância
marcadora presente no extrato. A RDC 26/2014, legislação que dispõe sobre fitoterápicos no
Brasil, determina a caracterização do marcador e sua posterior quantificação no
desenvolvimento de um produto fitoterápico, garantindo sua presença desde a matéria-prima
(IFAV - insumo farmacêutico ativo vegetal) até o produto acabado (fitoterápico). Nesse
contexto, marcador é definido como substância ou classe de substâncias utilizada como
referência no controle da qualidade da matéria-prima vegetal e do fitoterápico,
preferencialmente tendo correlação com o efeito terapêutico do fitocomplexo, sendo
denominado de marcador ativo, mas também como marcador analítico quando não
demonstrada, até o momento, sua relação com a atividade terapêutica do fitocomplexo
(BRASIL, 2014a, 2014b; SOARES; FERREIRA, 2016). A variação permitida de teor de
marcador no produto acabado não pode ser maior que 15%, quando se tem o marcador ativo,
ou 20%, quando se tem o marcador analítico (BRASIL, 2014b).
Os marcadores são escolhidos conforme sua indispensabilidade a eficácia dos produtos
(marcadores clínicos), na sua importância farmacológica (marcadores ativos) ou apenas na sua
finalidade analítica (marcadores analíticos). Nesse âmbito, os extratos vegetais passaram a ser
classificados de acordo com o conhecimento sobre seu conteúdo químico em: extratos
padronizados, extratos quantificados e outros extratos. No primeiro deles, extratos
padronizados são aqueles cujos marcadores são substâncias conhecidas com atividade
terapêutica comprovada (marcadores clínicos), em detrimento dos extratos quantificados nos
quais não se conhece os efeitos terapêuticos das substâncias no extrato e sua eficácia é atribuída
a um intervalo de concentração de substâncias farmacológicas relevantes. Por últimos, os outros
extratos são aqueles nos quais a eficácia está relacionada a reprodutibilidade do processo de
fabricação e os marcadores analíticos são usados no controle de processo (SOARES;
FERREIRA, 2016; EMA, 2011).
Previamente a padronização ou quantificação dos marcadores, o método analítico deve
ser validado. A validação do método é aplicada para garantir a confiabilidade, reprodutibilidade
e qualidade do método (MOEIN; EL BEQQALI; ABDEL-REHIM, 2017). Existem diferentes
tipos de validação: i. o primeiro é a validação completa e é executado para o novo método
bioanalítico desenvolvido; ii. a segunda é a validação parcial e é executada quando são feitas
modificações do método bioanalítico já validado (por exemplo: novo sistema de detecção,

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mudança na matriz da amostra ou faixa de calibração); a terceira é a validação cruzada que é

uma comparação dos parâmetros de validação quando dois ou mais métodos bioanalíticos são
usados para gerar dados dentro do mesmo estudo. Além disso, a validação cruzada é
considerada quando os dados são gerados usando técnicas analíticas diferentes ou modificações
no método validado. A validação completa pode envolver linearidade (curva padrão), exatidão,
precisão intra-dia (repetibilidade) e inter-dia (precisão intermediária), robustez, seletividade
(especificidade), reprodutibilidade e sensibilidade (BRASIL, 2017a; MOEIN; EL BEQQALI;
ABDEL-REHIM, 2017). Cada parâmetro da validação será abordado mais adiante neste
capítulo, nos tópicos de Metodologia e Resultados de Discussão, seguindo a legislação
brasileira atualmente em vigor, a RDC nº 166 de 24 de julho de 2017.
De maneira geral, o uso dos marcadores no controle de qualidade tem mostrado ser
inadequado para refletir a complexidade multicomponente das misturas presentes em
formulações à base de plantas medicinais. Isso porque, ocorre ação sinérgica da mistura de
componentes no extrato vegetal, e associar a atividade de uma preparação a uma suposta
entidade química ignora matrizes complexas compostas por centenas ou dezenas de milhares
de metabólitos que geralmente resistem à separação física e tentativas de explicar as atividades
biológicas observadas. É nesse âmbito que se insere o uso de fingerprints, ou seja, a impressão
digital espectroscópica e/ou cromatográfica, que surgiu como ferramenta alternativa para
garantir a qualidade dos materiais e preparações à base de plantas. Um fingerprint é um perfil
ou padrão característico que representa quimicamente a composição da amostra e que fornece,
geralmente, a maior quantidade de informação possível, permitindo tipificar o perfil químico
do extrato vegetal (ALLARD et al., 2018; INDRAYANTO, 2018; PFERSCHY-WENZIG;
BAUER, 2015; CHOI; VERPOORTE, 2014; TISTAERT; DEJAEGHER; HEYDEN, 2011;
ZENG et al., 2008).
O uso de fingerprints é preconizado por agências de regulação sanitária do mundo
inteiro como a European Agency for the Evaluation of Medicinal Products (EMA), Food and
Drug Administration (FDA) and China Food and Drug Administration (CFDA).
Neste capítulo, utilizaremos apenas a quantificação dos marcadores do extrato de B.
pinnatum, realizada por Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência acoplada a detector de
arranjo de diodos (CLUE-DAD) para a quantificação dos flavonoides, e a Ressonância
Magnética Nuclear (RMN) para a quantificação de sarmentosina. Adicionalmente, será
estabelecido também os perfis químicos por CLUE-DAD e RMN.
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica importante em
bioanálise e um dos métodos mais populares em química analítica para análise quali e

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quantitativa. Seu emprego é indispensável em vários laboratórios, devido a sua eficiência,

reprodutibilidade, fácil automação, baixo custo e possibilidade de analisar vários constituintes
como amostras complexas de plantas medicinais (SAHU et al., 2018; MOEIN; EL BEQQALI;
ABDEL-REHIM, 2017; KUNLE; EGHAREVBA; AHMADU, 2012; LANÇAS, 2009;
LIANG; XIE; CHAN, 2004). As colunas utilizadas são de diversos tipos e, por isso, têm uma
ampla gama de seletividade sendo, portanto, a CLAE aplicada para a separação de vários
fármacos e metabólitos em diferentes matrizes. As colunas de C18 são comumente utilizadas
para separação de compostos de plantas medicinais. Sua eficiência é altamente dependente do
tamanho de partícula (atualmente 3 -5 µm), e na medida em que esse tamanho de partícula
diminui, a pressão aumenta drasticamente (MOEIN; EL BEQQALI; ABDEL-REHIM, 2017;
TISTAERT; DEJAEGHER; HEYDEN, 2011; LIANG; XIE; CHAN, 2004).
Uma das principais vantagens da CLAE é a possibilidade de acoplar à técnica a
diferentes detectores. O principal tipo de detector usado na análise de plantas medicinais é
UV/Vis, para a detecção de substâncias que absorvem na região do ultravioleta, e sua variante,
o DAD (detector de arranjo de diodos), que permite uma varredura no espectro de absorção UV
da molécula. Outros tipos de detectores comumente utilizados na análise de plantas medicinais
são: o detector de espalhamento de luz evaporativa (ELSD) para compostos que não absorvem
no UV, Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e Espectrômetro de Massas (EM). O detector
de UV é econômico, mas pode ser usado somente para alta concentração de analítica (faixa
µM), para pequenos volumes de amostra e baixos níveis de concentração (nM, pM)
espectrometria é o mais útil detector (MOEIN; EL BEQQALI; ABDEL-REHIM, 2017;
TISTAERT; DEJAEGHER; HEYDEN, 2011; LIANG; XIE; CHAN, 2004).
A CLUE (Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência) oferece alta velocidade de
separação mesmo em níveis normais de pressão. Ao maximizar o desempenho da coluna e do
sistema, a CLUE minimiza o tempo de análise, sendo até 10 vezes mais rápido que a
cromatografia líquida convencional (DATAR, 2015; GANGADASU, 2015). Dessa forma,
aumenta a eficiência da análise e conserva o gradiente de solvente, mas contribui com a
separação dos componentes, com resultados reprodutíveis e altamente robustos, especialmente
usando colunas com tamanho de partícula menores que 2,2 µm (GANGADASU, 2015).
A espectroscopia de RMN (Ressonância Magnética Nuclear) é uma boa ferramenta para
análises qualitativas e, também, para determinações quantitativas (RMNq) de produtos naturais
e misturas complexas com boa reprodutibilidade e robustez (ROULARD et al., 2017;
SIMMLER et al., 2014; BHARTI; ROY, 2012). A RMNq é uma técnica analítica não
destrutiva, sensível, precisa e universal, no entanto, ainda pouco utilizada para produtos naturais

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apesar de crescente nos últimos anos (SIMMLER et al., 2014; PAULI; JAKI; LANKIN, 2005).
Por isso, tem se tornado valiosa para a análise de misturas complexas e quantificação sem a
necessidade de separação cromatográfica (SIMMLER et al., 2014).
É importante ressaltar que o desenvolvimento do método é a etapa que exige mais
cuidado, uma vez que a otimização dos parâmetros de aquisição e processamento vão garantir
a precisão e reprodutibilidade das análises espectrais baseada na integração dos sinais de
interesse. A intensidade da integração é proporcional ao número de núcleos que aquele sinal
representa dentro de uma molécula, informação valiosa para RMNq (PAULI; JAKI; LANKIN,
2005; SIMMLER et al., 2014). Recentemente, um método desenvolvido para quantificar
prunasina e amigdalina, glicosídeos cianogênios, mostrou que RMN é um método rápido e de
alto desempenho para quantificar esse tipo de metabólito secundário (PIMENTA et al., 2014).
Para se validar um método por RMNq, um padrão interno (PI) ou externo (PE) é
requerido. As características de um padrão interno requeridas são: alta pureza, baixo custo,
estável e quimicamente inerte, não volátil e não higroscópico e solúvel nos solventes de RMN
usados rotineiramente. Além disso, o sinal do solvente deve ter o mínimo de interferência
possível com o sinal que se deseja quantificar (PAULI; JAKI; LANKIN, 2005).

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3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL

Isolar, caracterizar e quantificar o (s) marcador (es) do extrato hidroetanólico a 50 %
das folhas frescas da espécie Bryophyllum pinnatum.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Isolar, por técnicas cromatográficas, especialmente a CPC, os flavonoides e outros
componentes do extrato hidroetanólico 50 % das folhas de B. pinnatum, e obtê-los em grande
quantidade;
• Identificar os compostos isolados do extrato hidroetanólico 50 % das folhas de B. pinnatum
por técnicas espectroscópicas como UV, EM e RMN;
• Desenvolver e validar metodologia analítica por CLUE-DAD para quantificação dos
flavonoides majoritários no extrato hidroetanólico 50 % das folhas de B. pinnatum;
• Desenvolver e validar metodologia analítica por RMN para quantificação de outros
componentes do extrato hidroetanólico 50 % das folhas de B. pinnatum.

71
4 METODOLOGIA
Essa parte do trabalho foi realizada em parceria com o Laboratoire de Pharmacognosie
(UMR CNRS 8638) da Université Paris Descartes – Paris V, sobre a supervisão do MCF-HDR
Professor Dr. Raphael Grougnet, em estágio doutoral realizado no período de um ano. Além
disso, a parte de validação de método por CLUE-DAD foi realizada no Instituto de Química da
UFRN. As análises por CLUE-EM/EM foram realizadas em parceria com a pesquisadora Dra.
Aikaterini Termentzi do Benaki Phytoptological Institute em Atenas, Grécia.
4.1 MATERIAL VEGETAL

Mudas autenticadas de Bryophyllum pinnatum (Lam) Pers. foram obtidas do Horto de
Plantas Medicinais da Universidade Federal do Ceará (UFC) em 2015. As mudas obtidas no
foram utilizadas para iniciar o cultivo das espécies por propagação vegetativa a partir das folhas
em local de cultivo da Escola Agrícola de Jundiaí (EAJ-UFRN), na cidade de Macaíba
(coordenadas geográficas latitude: 5º 51’ 30” S e longitude: 5º 51’ 30” W). O cultivo foi
realizado em solo adubado com esterco bovino e rega diária. A coleta das folhas de B. pinnatum
foi realizada antes do florescimento, como idade aproximada de 5 meses. Para recuperação
rápida da planta após o florescimento, as partes mais secas e amareladas eram podadas, para
que novos brotos surgissem mais rápido.
A coleta foi realizada em janeiro de 2017. O material vegetal foi catalogado e
identificado pela botânica Dra. Rúbia Santos Fonseca (Herbário Prisco Bezerra da UFC), onde
foi depositada uma exsicata sob registro UFC 57335. A autorização de coleta foi obtida no
Sistema de Autorização e informação em Biodiversidade (SISBIO), sob número 35017. Já a
autorização do Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento
Tradicional Associado está sob número A7EA798 obtida 25 de março de 2018.
4.2 PREPARAÇÃO DO EXTRATO HIDROETANÓLICO DAS FOLHAS DE B. pinnatum

A solução extrativa das folhas de B. pinnatum foi obtida por meio do método
previamente padronizado por Matos (2009). A matéria-prima vegetal (folhas sem talos a fresco)
foi processada por turboextração em liquidificador industrial por 5 minutos com álcool etílico
50%, na proporção 1:1, p/v (droga vegetal: solvente).
O extrato processado foi filtrado a vácuo, obtendo-se então o extrato hidroetanólico 50%
das folhas (EHE) B. pinnatum (BP). O extrato foi submetido à evaporação da fase alcoólica sob
pressão reduzida com o auxílio de um evaporador rotatório (Buchi®) a temperatura não superior
a 45 ºC. O EHE reduzido foi liofilizado obtendo-se o extrato liofilizado de B. pinnatum (EHEL).

72
No processo de liofilização, as amostras foram previamente congeladas em freezer a -80 oC.

Para esta coleta, a partir de 6,5 kg de folhas frescas, foram obtidos 130 g de EHEL (2 % de
rendimento).
4.3 ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

Antes de começar os processos de fracionamento, EHEL de B. pinnatum foi analisado
por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) para investigação do perfil químico, como
técnica de análise preliminar. As condições de análise estão descritas na tabela 1. Após todos
os processos cromatográficos para purificação e isolamento, os extratos, frações e compostos
obtidos também foram analisados por CCD para o acompanhamento das análises.
Tabela 1 - Condições cromatográficas para análise por CCD.

Condição Fase Móvel Fase Estacionária Revelador
AcOEt: AF: MeOH: H2O Vanilina Sulfúrica +
I Cromatoplacas de Gel
(10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v) aquecimento
de Sílica 60 F254
AcOEt: AF: MeOH: H2O (WAGNER;
II Merck®
(10:1,5:1,6:0,5, v/v/v/v) BLADT, 1996)
Legenda: AcOEt: Acetato de Etila; AF: ácido fórmico; MeOH: metanol; H2O: água.
Fonte: Autoria Própria
4.4 ANÁLISES POR CLUE-DAD E CLUE-EM/EM
4.4.1 Análise por Cromatografia Líquida de Ultra Velocidade (CLUE)

O extrato e os compostos isolados obtidos foram analisados por Cromatografia Líquida
de Ultra Eficiência acoplado a detector de arranjo de diodo (CLUE-DAD) para investigação do
perfil químico e quantificação. Foi usado um cromatógrafo da marca Shimadzu®, modelo LC-
20AD, equipado com detector DAD modelo SPD-M20A, auto injetor, forno para coluna e
software LabSolutions®. Os reagentes utilizados foram: Acetonitrila (ACN) grau HPLC (J.T.
Baker®), Ácido Trifluoroacético (TFA) grau PA (J.T. Baker ®), Metanol grau HPLC (J.T.
Baker®) e água Milli-Q®.
Para a análise dos flavonoides isolados do EHEL foi desenvolvido um método com as
seguintes condições cromatográficas: coluna C18 Phenomenex® Kinetex (150 x 4,6 mm, 2,6 µm)
equipado com uma coluna guarda C-18 Phenomenex® (4.0 × 2.0 mm i.d.). Como fase móvel,
foi desenvolvido um gradiente de ACN (solvente A) e água acidificada com 0,3 % de TFA
(v/v) (B), com 7–15% B, 0–3 min; 15–20% B, 3–12 min; 20–22% B, 12–30 min. O fluxo foi
mantido constante em 0,7 mL/min, o volume de injeção de 12 µL e a detecção realizada a 254

73
e 340 nm com a aquisição de espectros UV na faixa de 190 a 450 nm. A temperatura da coluna
foi mantida em 30 ºC.
• Preparação das amostras:
As amostras foram solubilizadas em uma mistura de metanol e água (1:1, v/v). A
concentração final do EHEL de B. pinnatum foi de 2 mg/mL e para os compostos isolados e
frações, 100 μg/mL. Após a total dissolução e previamente às análises, as amostras foram
filtradas em membranas de 0,45 μm (MillexTM, Merck®).
4.4.2 Análise por Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (CLUE-EMAR/EM)

As análises de CLUE-EMAR/EM foram realizadas em Cromatógrafo Líquido de Ultra
Eficiência acoplado (Dionex Ultimate 3000 UHPLC, Thermo Scientific®) a Espectrômetro de
Massas de Alta Resolução (EMAR/MS) Orbitrap Q-Exactive (Thermo Scientific®) para
investigação do perfil químico previamente o isolamento. Os reagentes utilizados foram:
Acetonitrila grau UPLC-MS (Merck®), Ácido grau UPLC-MS (Merck®) e água Milli-Q®. Uma
coluna Hypersil Gold UPLC C18 (2.1 × 100 mm, 1.9 μm; Thermo Scientific®) foi utilizada.
O gradiente de eluição desenvolvido foi (A) água acidificada com 0,1 % de ácido
fórmico (v/v) e (B) acetonitrila. O programa de eluição foi: 5% B, de 0-3 min; 5-95 % de B, de
5-21 min; 95% de B, de 21-13 min; 95-5% de B, de 23-24 min; 5 % de B, de 24-30 min. O
fluxo foi de 0,220 mL/min e o volume de injeção de 5 μL. A temperatura da coluna foi mantida
em 40 ºC, enquanto a temperatura do amostrador foi mantida a 10 ºC.
A ionização foi realizada por IES (Ionização por Eletro Spray) nos modos positivo e
negativo. As condições do EMAR para ambos os modos foram: temperatura capilar de 350 ºC,
voltagem do spray de 2,7 kV; nível de radiofrequência S-lens de 50 V; fluxo do gás de 40
unidades arbitrárias; fluxo do gás auxiliar de 5 unidades arbitrárias; temperatura do gás auxiliar
de 50 ºC.
As análises foram realizadas pelo modo transformada de Fourrier (TF) do LTQ orbritap
(EMFT) no modo full scan, aplicando uma resolução de 70000, enquanto a aquisição do
espectro de massa foi realizada sempre usando o modo centroide. Foi usada um resolução de
35000 para a aquisição dos dados, permitindo um fragmentação EM/EM dos três íons mais
intensos de cada pico excedendo o limiar predefinido, aplicando uma exclusão dinâmica de 10s.
A energia de colisão normalizada foi estabelecida em 40,60 e 100. A aquisição e a análise de
dados foram concluídas empregando o software Xcalibur® 2.1.
• Preparação das amostras:

74
As amostras foram solubilizadas em uma mistura de metanol e água (1:1, v/v). A

concentração final dos extratos de B. pinnatum foi de 1 mg/mL e para os compostos isolados,
100 μg/mL. Após a total dissolução e previamente às análises, as amostras foram filtradas em
membranas de 0,22 μm (MillexTM, Merck®).
4.5 FRACIONAMENTO E ISOLAMENTO DOS COMPOSTOS
4.5.1 Fracionamento por XAD-4

A partir de 100 g de EHEL de B. pinnatum, foi realizada uma coluna cromatográfica
clássica (CC) com adsorvente Amberlite XAD-4, uma resina de polímero não-iônico composta
por cadeias de poliestireno reticuladas com divinilbenzeno (KU; LEE, 2000) que adsorve
compostos poliaromáticos com relativo baixo peso molecular. Foi utilizado um gradiente
composto por água 100 % até etanol (EtOH) 100 %. O EHEL foi diluído em 1 L de água
aquecida a 50 ºC e filtrado em papel de filtro, obtendo-se um precipitado (2,06 g) que contém
substâncias menos polares que do extrato. O filtrado foi eluído pela coluna empacotada com
300 mL de XAD-4 (esse adsorvente, apesar de sólido, é medido em volume e não em termos
de massa) e eluído com mais 1 L de água, e posteriormente com os gradientes (figura 5).
Foram obtidas 12 frações que foram secas sob pressão reduzida em evaporador rotatório
(Büchi®) a temperatura não superior a 40 ºC e analisadas por CCD utilizando as duas condições
descritas na tabela 1. Após secagem, as frações foram solubilizadas em EtOH, com exceção da
fração A que foi solubilizada em MeOH. Em todas as frações foi observado precipitado. Os
rendimentos finais estão descritos na figura 5.
Figura 5 - Esquema representativo da CC com XAD-4 do EHE liofilizado de B. pinnatum.
Insolúvel → 2,0644 g
Legenda: EHEL BP – Extrato Hidroetanólico Liofilizado de B. pinnatum; - Sol. – parte solúvel; ppt – parte
precipitada. Fonte: Autoria própria.

75
3.5.2 Isolamento por Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC)

Os procedimentos por CPC foram realizados em Cromatógrafo de Partição Centrífuga
(CPC) da marca Gilson® Armen® Spot equipado com duas colunas (rotores) com volumes 250
mL (rotor 2) e 1 L (rotor 1), injeção manual com loop que variou até o volume de 50 mL.
4.5.2.1 Seleção do sistema solvente para CPC

O sistema solvente binário foi selecionado de acordo com a avaliação do coeficiente de
partição (KD). Esse teste simula uma partição líquido-líquido, que de fato é o princípio do
funcionamento da CPC. É importante tomar nota que a fase inferior é a mais densa, ou aquosa,
e a fase superior é a menos densa, ou orgânica.
O KD foi estimado por CCD de acordo com metodologia adaptada de Mandova e cols
(2017), como ilustrado na figura 6. Foi realizado um teste em pequena escala em tubo de ensaio
objetivando encontrar o melhor sistema bifásico para separação desses compostos, ou seja,
aquele que apresentasse uma melhor separação dos compostos e tivesse o menor tempo de
separação de fases. A mistura de solventes foi preparada em tubo de ensaio pequeno, e então
agitado e mantido em repouso até a completa separação de fases. Logo depois, foi adicionada
uma pequena quantidade de EHEL (1,0 a 1,5 mg) ao sistema binário dentro do tubo, e agitado
novamente por 1 min. Após a completa separação de fases, cada fase foi coletada e analisada
por CCD (MANDOVA et al., 2017). Os sistemas testados estão descritos na tabela 2.
Figura 6 - Teste de escolha do sistema solvente para CPC por CCD.
Fonte: Autoria própria.

76
Tabela 2 - Sistemas bifásicos testados para separação por CPC.
Proporção
Sistema Tempo de separação
AcOEt: EtOH: H2O (v/v/v)
I 7:1:4 15 s
II 7:1:5 40 s
III 7:2:5 3 m 40 s
IV 8:2:5 2 m 01 s
V 8:3:5 28 s
VI 8:2,5:5 2 m 08 s
VII 9:3:5,5 18 s
VIII 9:3:6 40 s
Legenda: AcOEt – acetato de etila, EtOH – etanol; H2O – água; m – minutos; s – segundos.
4.5.2.2 Procedimentos realizados por CPC

Após as análises por CCD, o sistema VII composto por AcOEt: EtOH: H2O (9:3:5,5,
v/v/v) foi escolhido para a realização da CPC com pequena modificação para grande escala. A
esse sistema foi adicionado 0,5 mL de ciclohexano (CHex) para acelerar a separação de fases.
Logo, o sistema VII ficou AcOEt: EtOH: H2O:CHex (9:3:5,5:0,5, v/v/v/v).
Foram realizados 5 processos de separação por CPC para a espécie B. pinnatum que
estão descritos abaixo na tabela 3. Em todos os procedimentos foi utilizado o sistema solvente
VII e equipamento operado em modo ascendente, no qual a fase “estacionária” é a fase inferior
e a fase móvel é a superior. A fase inferior foi carregada usando uma rotação de 500 rpm e fluxo
de até 100 mL/min, sendo o rotor preenchido com um volume e meio de coluna (ou rotor), onde
o rotor 1 tem volume máximo de 1000 mL e o rotor 2 tem volume máximo de 250 mL. A fase
superior foi carregada com rotação de 1200 rpm e fluxo de até 20 mL/min até atingir o equilíbrio
entre as duas fases. As amostras utilizadas para separação por CPC foram sempre dissolvidas
no sistema solvente composto por 80 % de fase inferior e 20 % de fase móvel. Após coletar
todas as frações com a fase móvel, foi realizada extrusão da fase estacionária e as frações
também foram coletadas. Após uso, a limpeza do rotor foi realizada com MeOH:H2O (1:1, v/v),
e os primeiros 300 mL coletados separadamente para verificar se não havia nenhum composto
retido.
As subfrações de cada análise por CPC foram analisadas por CCD utilizando as
condições descritas na tabela 1 e por Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de H1, sendo
posteriormente reunidas conforme semelhança.

77
Tabela 3 - Procedimentos realizados por CPC para a espécie B. pinnatum.

Massa Vol. Fluxo FE Vol. Fr.
Amostra Fluxo FM
Código Rotor da Fr. n Ext. Ext. n
utilizada (mL/min)
amostra (mL) (mL/min) (mL)
1ª CPC BP 2 FrASol 1g 15 15 58 60 30 38
2ª CPC BP 1 FrASol 8,3 g 25 20 160 60 30 48
3ª CPC BP 1 FrASol 10 g 20 20 161 50 30 29
4ª CPC BP 2 Fr F-G 1g 12 15 237 15 20 30
5ª CPC BP 2 EHEL BP 2g 15 15 171 60 30 27
Legenda: CPC – Cromatografia de Partição Centrífuga; Vol. – volume; Fr. – Frações; n – número de frações
coletadas; FM – Fase móvel; FE – Fase Estacionária; Ext. – Extrusão; FrASol – parte solúvel em MeOH da fração
aquosa do XAD-4; Fr F-G – frações F e G completas do XAD-4; EHEL BP – extrato hidroetanólico liofilizado de
B. pinnatum. Fonte: Autoria própria.
Resumidamente, as três primeiras CPCs foram realizadas com o objetivo de isolamento,

a partir da fração aquosa solúvel resultante do procedimento por XAD-4, sendo a primeira
apenas um teste em pequena escala para verificar a adequabilidade e eficiência do sistema
binário de separação desenvolvido. A 4ª CPC foi realizada com o objetivo de isolar apenas
flavonoides a partir de uma fração enriquecida resultante também do fracionamento por XAD-
4. E por último, o EHEL foi testado diretamente nesse sistema solvente para avaliar como seria
o isolamento por CPC dos mesmos componentes diretamente do extrato bruto.
4.5.3 Isolamento por Cromatografia Líquida de Média Pressão (CLMP)

O isolamento por CLMP foi realizado para a obtenção da substância sarmentosina, um
glicosídeo nitrila descrito pela primeira vez para o gênero. Para alcançar esse objetivo, dois
processos de separação com frações oriundas da 2ª e 3ª CPC BP foram realizados na tabela 4.
Tabela 4 - Procedimentos realizados por CLMP para a espécie B. pinnatum.

Massa
Amostra Dimensões da Fase Fluxo Vol.
Código da Adsorvente n
utilizada coluna (suporte) móvel (mL/min) (mL)
amostra
Fr 05 Ext/ 2ª sílica gel 60 Tabela
1ª CLMP BP 1,2 g cartucho de 40 g 25 15 195
CPC BP (20-45 µm) 5
Fr MeOH:H2O/ sílica gel 60 Tabela
2ª CLMP BP 1g cartucho de 40 g 20 15 121
3ª CPC BP (20-45 µm) 6
Legenda: CLMP – Cromatografia Líquida de Média Pressão. BP – Kalanchoe pinnata; Vol. – volume.
Os procedimentos foram realizados em Cromatógrafo Líquido de Média Pressão

Buchi®. As amostras foram solubilizadas em 40 mL de MeOH e levada a secura total com sílica
gel 60 (70-200 mesh) na proporção 1:1 (p/p – amostra:sílica) utilizando evaporador rotatório

78
Buchi® a temperatura não superior a 40 ºC. As condições de fase móvel e especificações da

coleta de frações estão descritas nas tabelas 5, para a 1ª CLMP BP, e 6, para a 2ª CLMP BP.
As frações dos dois procedimentos foram analisadas por CCD (item 3.3 deste capítulo)
com as condições descritas na tabela 1, e quando necessário foi realizada análise por RMN.
Pelos dois procedimentos foi possível obter o composto isolado sarmentosina.
4.5.4 Purificação por Gel de Filtração Molecular

A cromatografia em coluna clássica (CC) utilizando como adsorvente Sephadex LH-20
foi realizada para a purificação de compostos minoritários obtidos a partir das frações
resultantes de procedimentos da CPC. A tabela 7 abaixo descreve as especificações para cada
CC com Sephadex LH-20.
Tabela 5 - Especificações de fase móvel e amostras da 1ª CLMP de B. pinnatum.

Sistema Fase móvel Volume
I AcOEt 100 % 100 mL
II AcOEt:AF:MeOH:H2O (10:0,5:0,2:0,1) 200 mL
III AcOEt:AF:MeOH:H2O (10:0,5:0,4:0,2) 100 mL
IV AcOEt:AF:MeOH:H2O (10:0,5:0,4:0,2) 200 mL
V AcOEt:AF:MeOH:H2O (10:0,5:0,4:0,2) 200 mL
VI AcOEt:AF:MeOH:H2O (10:0,5:0,8:0,4) 200 mL
VII AcOEt:AF:MeOH:H2O (10:0,5:0,8:0,4) 100 mL
VIII AcOEt:AF:MeOH:H2O (10:0,6:1,0:0,6) 200 mL
IX AcOEt:AF:MeOH:H2O (10:0,6:1,2:0,6) 200 mL
X AcOEt:AF:MeOH:H2O (10:0,6:1,2:0,6) 200 mL
XI AcOEt:AF:MeOH:H2O (10:0,6:1,2:0,6) 100 mL
XII AcOEt:AF:MeOH:H2O (10:0,6:1,6:0,6) 200 mL
XIII AcOEt:AF:MeOH:H2O (10:0,6:2,0:0,6) 300 mL
XIV AcOEt:MeOH (1:1) 300 mL
Legenda: AcOEt: Acetato de Etila; AF: ácido fórmico; MeOH: metanol; H2O: água

79
Tabela 6 - Especificações de fase móvel e amostras da 2ª e 3ª CLMP de B. pinnatum.

II AcOEt: MeOH (98:2) 100 mL
III AcOEt: MeOH (95:5) 100 mL
IV AcOEt: MeOH (90:10) 100 mL
500 mL (2ª CMPLC)
V AcOEt: MeOH (85:15)
200 mL (3ª CMPLC)
VI AcOEt: MeOH (80:20) 200 mL
VII AcOEt: MeOH (75:25) 100 mL
VIII AcOEt: MeOH (70:30) 100 mL
IX AcOEt: MeOH (60:40) 100 mL
X AcOEt: MeOH (50:50) 100 mL
XI AcOEt: MeOH (40:60) 100 mL
XII AcOEt: MeOH (20:80) 100 mL
XII MeOH 100 % 200 mL
Legenda: AcOEt: Acetato de Etila; MeOH: metanol.
Tabela 7 - Procedimento realizado por CC em gel de filtração molecular para a espécie B. pinnatum.
Amostra Massa da Dimensões da Fase Fluxo
Código Adsorvente n
utilizada amostra coluna (suporte) móvel (mL/min)
Fr 96-131/ Sephadex
1ª SEPH BP 65,9 mg 23 x 1,5 cm MeOH 0,7 60
4ª CPC BP LH 20
Legenda: SEPH – Coluna Clássica com Sephadex LH-20; BP – Bryophyllum pinnatum; MeOH – Metanol.
4.6 ANÁLISE POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN)

Extrato e substâncias isoladas foram analisados por Ressonância Magnética Nuclear
(RMN) em um equipamento Bruker® de 400 MHz. Todas as amostras foram dissolvidas em 0,5
mL de MeOD (metanol deuterado), e quando não solúveis, foi utilizado D2O (deutério óxido),
obtidos de Euriso-top®, France. Normalmente, foi utilizado, no mínimo, 10 mg de cada amostra
analisada no RMN, de maneira a diminuir o tempo de análise e melhorar a aquisição do sinal.
Quando não dispúnhamos de tal quantidade, o tempo de análise era mais demorado devido ao
maior número de scans necessários para conseguir um bom espectro para elucidação. Foram
obtidos os espectros de RMN de hidrogênio-1H (dependendo da concentração, o número de
scans foi variável de 8 à 32), RMN de carbono-13C (jmod – 512 scans), COSY (cosygp –
mínimo 2 scans e cpsylr – mínimo 2 scans), NOESY, HMBC (mínimo 4 scans) e HSQC
(mínimo 2 scans). Para todas as leituras o shiming foi feito automático, e quando necessário
ajustado manualmente. Após aquisição do FID (Free Induction Decay), foi realizado a FT
(Fourier Transformate) para todos os espectros.

80
4.7 ANÁLISE POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS (EM)

Compostos isolados também foram analisados em Espectrômetro de Massas (EM) por
injeção direta em um equipamento Waters® Micromass® LCT Premier™ TOF Mass
Spectrometer. A massa de alta resolução foi obtida em um espectrômetro de massas Q-TOF1
ESI (Waters®). As amostras foram diluídas em metanol e injetadas diretamente no
espectrômetro de massas. O espectro foi obtido com elevada resolução, utilizando capilar e
placa de extremidade com 3,5 KV e 500 V, respectivamente. O fluxo do gás nitrogênio foi de
4 L/min e a temperatura foi de 180 ºC. Os espectros foram obtidos por ionização no modo
positivo (+) e modo negativo (-). Em modo positivo é possível observar íons sódio (MNa+ -
M+23) e seus homodímeros (2 MNa+ - M+46).

CLUE-DAD PARA A QUANTIFICAÇÃO DOS FLAVONOIDES
O método desenvolvido para quantificação dos flavonoides majoritários do EHEL das
folhas de B. pinnatum por CLUE-DAD foi validado de acordo as exigências da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária – Anvisa, seguindo os parâmetros estabelecidos pela RDC nº
166 de 24 de julho de 2017 (BRASIL, 2017a): linearidade, precisão, exatidão, seletividade,
robustez, limite de detecção (LOD) e quantificação (LOQ). Para validação foi utilizado o
método do padrão externo, na qual o padrão usado está presente no extrato, nesse caso, os
flavonoides isolados do EHEL das folhas de B. pinnatum, a saber: Bp1, Bp2 e Bp3.
Foi utilizado um Cromatógrafo Líquido de Ultra Velocidade acoplado a detector de
arranjo de diodo (CLUE-DAD) da Shimadzu®. No item 4.4.1 deste capítulo estão descritas
todas as especificações do equipamento, reagentes, fase estacionária e fase móvel utilizada,
bem como o preparo das amostras para solubilização e injeção no equipamento. Todas as
análises estatísticas foram realizadas utilizando o software Microsoft® Excel®.
Previamente ao início da validação, foi realizada o system suitability (verificação da
adequabilidade do sistema) do método desenvolvido de acordo com os parâmetros
estabelecidos na United States Pharmacopeia (USP) para garantir resolução (r > 1,5), pratos
teóricos, (P > 2000), fator de calda (T ≤ 2,0) e fator de capacidade (k’ ≥ 2,0) para cada pico a
ser validado e subsequentemente quantificado (USP, 2003). As análises foram realizadas em
triplicata com três replicatas para cada injeção e a média e o desvio padrão relativo (DPR) foi
calculado.

81
4.8.1 Seletividade
Foi determinada por análise e comparação dos dados cromatográficos (tempo de
retenção e pureza de pico observada pelo espectro de UV) no EHEL das folhas de B. pinnatum
com aqueles obtidos dos compostos isolados Bp1, Bp2 e Bp3 em triplicata.
4.8.2 Linearidade
A linearidade de um método deve ser demonstrada por meio da sua capacidade de obter
respostas analíticas diretamente proporcionais à concentração de um analito em uma amostra,
estabelecendo uma relação linear por toda a faixa de trabalho. Essa determinação deve ser feita
usando no mínimo, 5 (cinco) concentrações diferentes para as soluções preparadas em, no
mínimo, triplicata (BRASIL, 2017a).
A linearidade e a subsequente quantificação foram realizadas a partir das curvas de
calibração de cada composto isolado (Bp1, Bp2 e Bp3) em 7 níveis de concentração (25 % a
175 %) separadamente. As áreas dos picos do cromatograma obtidas no comprimento de onda
de 340 nm foram plotadas em função das concentrações das soluções de Bp1, Bp2 e Bp3, para
a obtenção das equações da reta (regressão linear). A linearidade da equação de regressão foi
determinada para cada composto separadamente a partir do coeficiente de correlação (r²).
As soluções estoque (70 µg/mL para Bp1 e 10 µg/mL para Bp2 e Bp3) foram diluídas
separadamente em MeOH:H2O (1:1, v/v) de maneira a obter a solução que foi diluída para obter
as seguintes concentrações 8.75, 17.5, 26.25, 35, 43.75, 52.5 e 61.25 para Bp1; 1.25, 2.5, 3.75,
5, 6.25, 7.5 e 8.75 μg/mL para Bp2 e 0.75, 1.5, 2.25, 3, 3.75, 4.5 e 5.25 μg/mL para Bp3. Cada
solução foi analisada em triplicata. O esquema de diluições para melhor entendimento está
descrito na figura 7.
Figura 7 – Diluições da curva de calibração de cada flavonoide isolado (BP1, BP2 e BP3).

82
Adicionalmente, foi realizada a avaliação do parâmetro de linearidade do EHEL das

folhas de B. pinnatum. Para tal foi realizada uma curva de calibração com EHEL em 5 níveis
de concentração, a saber 1, 2, 3, 4 e 5 mg/mL (figura 8). Cada concentração foi preparada
individualmente (p/v) do EHEL em MeOH:H2O (1:1, v/v). As áreas dos picos do cromatograma
obtidas a 340 nm foram plotadas em função das concentrações conhecidas das soluções do
EHEL, para a obter as equações de regressão para cada pico majoritário do EHEL de B.
pinnatum e investigar o coeficiente de correlação (r²) para cada um.
Figura 8 - Diluições da curva de calibração do EHEL de B. pinnatum.
4.8.3 Precisão
A precisão deve ser demonstrada pela dispersão dos resultados, calculando-se o desvio
padrão relativo (DPR) da série de medições conforme a fórmula "DPR = (DP/CMD) x 100",
em que DP é o desvio padrão e CMD, a concentração média determinada. E deve ser
determinada por meio da repetibilidade e precisão intermediária (BRASIL, 2017a).
• Repetibilidade: 9 determinações contemplando o intervalo linear do método analítico,

ou seja, 3 concentrações (baixa 50%, média 100 % e alta 150%) com 3 réplicas em cada
nível (figura 9). Foram preparadas três amostras individuais para cada concentração e
depois analisadas em triplicatas.
Figura 9 – Análise do parâmetro de repetibilidade.
• Precisão intermediária: 9 determinações contemplando o intervalo linear do método

analítico, ou seja, 3 concentrações (baixa 50 %, média 100 % e alta 150 %) com 3
réplicas em cada nível, em 3 dias diferentes por três analistas diferentes (figura 10).

83
Foram preparadas três amostras individuais para cada concentração e depois analisadas
em triplicatas.
Figura 10 – Análise do parâmetro de precisão intermediária.
4.8.4 Exatidão
A exatidão de um método analítico deve ser obtida por meio do grau de concordância
entre os resultados individuais do método em estudo em relação a um valor aceito como
verdadeiro (BRASIL, 2017a). A exatidão foi determinada pelo método da recuperação (RCP),
no qual quantidades conhecidas da substância referência (flavonoides isolados Bp1, Bp2 e Bp3)
foram adicionadas a amostra (EHEL 2 mg/mL). Foram realizadas 9 determinações
contemplando o intervalo linear do método analítico, ou seja, 3 concentrações (baixa 50 %,
média 100 % e alta 150 %) com 3 réplicas em cada nível (figura 11). A fórmula abaixo foi
utilizada para calcular a recuperação: RCP % = [(amostra fortificada – extrato) / padrão] x 100.
Figura 11 – Análise do parâmetro de recuperação.

84
4.8.5 Limite de Detecção (LOD) e Limite de Quantificação (LOQ)

O limite de detecção (LOD) é a menor quantidade do analítico presente na amostra que
pode ser detectado, e o limite de quantificação (LOQ), por sua vez, é a menor quantidade do
analítico presente na amostra que pode ser quantificado com precisão e exatidão (BRASIL,
2017a). Para este trabalho, determinou-se o LOD e LOQ através dos parâmetros da curva de
calibração, utilizando as seguintes fórmulas:
LOD % = 3,3 x Ϭ LOQ % = 10 x Ϭ
IC IC
Onde: IC é a inclinação da curva de calibração, Ϭ é o desvio padrão obtido a partir do desvio

padrão do intercepto com o eixo Y de, no mínimo, 3 curvas de calibração construídas contendo
concentrações do analito próximas ao suposto limite de detecção.
4.8.6 Robustez
A robustez indica a capacidade do método analítico em resistir a pequenas e deliberadas
variações das condições analíticas (BRASIL, 2017a). Para validação do método desenvolvido,
a robustez foi avaliada por meio de pequenas modificações no fluxo da fase móvel e na
temperatura da coluna.
4.9 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA POR RMN

PARA A QUANTIFICAÇÃO DE SARMENTOSINA
Foi desenvolvida e validada parcialmente uma metodologia analítica por RMN para a
quantificação da substância sarmentosina no extrato hidroetanólico liofilizado (EHEL) das
folhas frescas de Bryophyllum pinnatum. Essa metodologia foi desenvolvida baseada e
adaptada dos trabalhos publicados por Karkoula e cols. (KARKOULA et al., 2012), que
trabalharam com validação interna, e por Roulard e cols. (ROULARD et al., 2017), que
quantificaram os glicosídeos cianogênios linustatina e neolinustatina após validação externa.
4.9.1 Substância referência (SR) e padrão interno (PI)

Sarmentosina, utilizada como substância referência (SR), foi isolada a partir do EHEL
das folhas de B. pinnatum (item 2.6 deste capítulo). Sua elucidação estrutural foi realizada por
meio de um extensivo estudo dos espectros de RMN e do fragmentograma do espectro de
massas.

85
A cafeína (95 % de pureza), usada como padrão interno (PI), foi adquirida de Sigma-
Aldrich®. A solução de PI foi preparada a 2 mg/mL, diariamente, previamente às análises.
Todos os solventes utilizados nos experimentos foram obtidos de Eurisop® (Metanol d-
4 – MeOD:água > 0,02 e 99,80 % D; Óxido de Deutério – D2O: 99,90 % D).
4.9.2 Preparação da amostra para as análises de RMN

O EHEL (30 mg) e a cafeína (1 mg) foram pesados em um eppendorf® em balança de
alta precisão (Sartorius®), sendo posteriormente dissolvida em uma mistura de 500 µL
(micropipeta Gilson®) de MeOD:D2O na proporção 3:2. A mistura foi homogeneizada em
banho de ultrassom por 15 min e centrifugada por 2 min a uma rotação de 1400 Xg. O
sobrenadante foi transferido para tudo de RMN de 5 mm (Norell® 507-HP-7). A escolha da
cafeína como padrão interno foi baseada no trabalho publicado por Godecke e cols (GÖDECKE
et al., 2013), e o preparo para amostra foi baseado e adaptado do protocolo publicado por Kim,
Choi e Verpoorte (KIM; CHOI; VERPOORTE, 2010).
4.9.3 Determinação do D1 (Relaxation delay - tempo de espera de relaxamento)

Para a encontrar o D1 ideal para as análises de quantificação, de maneira a garantir
reprodutibilidade de cada espectro, foi realizada a determinação do T1 por meio de uma
sequência de pulsos específicas denominada de Inversão e Recuperação (IR). Resumidamente,
nessa sequência de IR, é fornecido primeiro um pulso de 180º para inverter a população de spin,
e posteriormente a um tempo t, é fornecido um pulso de 90º, e finalmente ocorre a detecção.
Esse processo é realizado diversas vezes com t diferentes até atingir um valor máximo
constante, sendo possível visualizar o gráfico gerado pelo software do equipamento. Após a
obtenção do T1, é calculado o D1, que corresponde 5T1, no mínimo. O T1 determinado foi de 3
s para os sinais de interesse, e o D1 foi fixado em 20 s.
4.9.4 Instrumentação e parâmetros de aquisição e processamento

O equipamento de RMN utilizado foi um Bruker® 400 MHz como descrito no item 2.7
deste capítulo, equipado com software TopSpin® versão 3.5. Os espectros foram processados
utilizando os softwares TopSpin® 3.5 e MestReNova®, e os dados tratados com ajuda dos
softwares R® versão 3.5.0 e Microsoft® Excel® 365. Os espectros foram adquiridos de forma a
suprimir o sinal de água utilizando a técnica de presat, e como parâmetros de aquisição foi
utilizado um número de scans (ns) de 8, largura espectral de 0 à 16 ppm (e SW de 8 ppm), D1
de 20 s, DS de 0. Após aquisição do FID (Free Induction Decay), foi realizado a FT (Fourier

86
Transformate), obtendo os espectros de RMN de 1H, que posteriormente que tiveram suas fases
corrigidas (do inglês phasing) manualmente e, suas linhas de base corrigidas automaticamente,
para então ser realizada a integração dos picos de interesse.
4.9.5 Método de validação e quantificação

A quantificação foi baseada na razão da integração entre o sinal do hidrogênio vinílico
do sarmentosina em 6,7 ppm e o sinal do hidrogênio da cafeína em 7,9 ppm (situado
estruturalmente entre dois nitrogênios). Essa metodologia foi baseado no artigo de Karkoula e
cols (KARKOULA et al., 2012). O método foi validado parcialmente seguindo os parâmetros
estabelecidos pela RDC nº 166 de 24 de julho de 2017, a saber: linearidade, precisão,
seletividade, limite de detecção (LOD) e quantificação (LOQ). Todos os parâmetros da
resolução foram detalhados no item 4.9, de forma que agora será mostrado apenas como foi
realizado cada um para uma validação interna.
4.9.5.1 Linearidade
As curvas de calibração foram realizadas pela adição de quantidades conhecidas de PI
as soluções diluídas do extrato liofilizado de B. pinnatum. As soluções dos pontos da curva de
calibração foram nas concentrações de 50 a 150 %, de modo que as concentrações do extrato
foram de 15, 30, 45, 60 e 105 mg/mL. A razão entre as integrações dos sinais de sarmentosina
versus cafeína e a concentração correspondente das soluções da curva foram determinadas por
regressão linear.
4.9.5.2 Precisão
A precisão foi determinada pela repetibilidade (precisão intra-dia) e precisão
intermediária (inter-dia) da seguinte maneira:
• Repetibilidade: 9 determinações contemplando o intervalo linear do método analítico,
ou seja, 3 concentrações (baixa, média e alta) com 3 réplicas em cada nível.
• Precisão intermediária: 9 determinações contemplando o intervalo linear do método
analítico, ou seja, 3 concentrações (baixa, média e alta) com 3 réplicas em cada nível,
em 3 dias diferentes.
4.9.5.3 Limite de Detecção (LOD) e de Quantificação (LOQ)

Para este trabalho, determinou-se o LOD e LOQ através dos parâmetros da curva de
calibração, assim como descrito no item 3.8.5. deste capítulo
87
4.9.5.4 Seletividade
Segundo a RDC Nº 166 de 2017, estão isentos de demonstração da seletividade,
métodos não cromatográficos, como a RMN. Mas a seletividade foi avaliada pela ausência de
sobreposição (overlapping) de pelo menos um sinal de sarmentosina com o sinal de outros
constituintes dos PI cafeína no espectro de RMN de 1H.

88
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS

A partir das CCDs do EHEL reveladas com vanilina sulfúrica (figura 12) e por meio de
comparação com a literatura (WAGNER; BLADT, 1996), é possível notar a presença marcante
de flavonoides devido a coloração amarelada das bandas cromatográficas, considerados
metabólitos majoritários na espécie. Além disso, é possível sugerir a presença de outros tipos
metabólitos como esteroides, devido a coloração violácea de algumas bandas cromatográficas,
e de taninos, devido a coloração rosa que é possível visualizar no ponto de aplicação. Essa
análise foi realizada para caracterização do perfil químico, realizada previamente ao
fracionamento e isolamento de compostos, e serviu como base para a escolha dos métodos de
purificação.
Figura 12 - CCDs dos extratos hidroetanólicos de B. pinnatum.
Legenda: Fase móvel: (A) acetato de etila: ácido fórmico: MeOH: H2O (10:0,5:0,6:0,2, v/v/v); (B) acetato de etila:
ácido fórmico: MeOH: H2O (10:0,5:0,6:0,2, v/v/v); Adsorvente: gel de sílica 60 F254; Revelador: (a) vanilina
sulfúrica + aquecimento e (b) UV 254 nm. BP – B. pinnatum. Fonte: Resultados Experimentais.
O EHEL também foi analisado por CLUE-DAD para investigação do perfil químico e
foi possível observar a presença de compostos fenólicos, sobretudo flavonoides a partir das
informações dos espectros UV dos picos e comparação com a literatura (MABRY;
MARKHAM; THOMAS, 1970), como ilustrado na figura 13 e tabela 8. Nessa técnica, a
identificação dos flavonoides foi realizada com base na comparação do tempo de retenção, por
espectro de UV dos picos majoritários e co-injeção das substâncias isoladas e/ou padrão +
extrato, pela observação de aumento da área do pico. Os cromatogramas foram visualizados

89
sob dois comprimentos de onda: 254 nm e 340 nm (MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970;
SANTOS et. al, 2005; MATSUBARA; RODRIGUEZ-AMAYA, 2006).
Em relação aos flavonoides, o espectro UV apresenta duas bandas de absorção máxima.
A primeira delas, a banda II, encontra-se entre 240 e 285 nm, correspondendo à absorção do
grupo benzoíla, relacionada ao anel A. A banda I, possui absorção 300 e 400 nm,
correspondente ao grupo cinamoil e relacionada aos anéis B e C (MABRY; MARKHAM;
THOMAS,1970). O tipo de flavonoide e o esquema de oxigenação da sua estrutura ocasionam
alterações na posição e intensidade relativa de cada um dos máximos de absorção. Substituintes
simples, tais como metil, metoxila e grupo hidroxila não-dissociados, geralmente efetuam
apenas pequenas alterações na posição da absorção máxima. Sabe-se que, na maioria das vezes,
um aumento da oxigenação na estrutura química provoca um desvio das bandas para maiores
comprimentos de onda (MABRY; MARKHAM; THOMAS,1970).
Em relação a constituição química, diversos flavonoides já foram descritos para B.
pinnatum, a maioria deles derivados da quercetina e do canferol (AFZAL et al., 2012; CHIBLI
et al., 2014; DE ARAÚJO et al., 2018; FERNANDES et al., 2016b; MUZITANO et al., 2006a).
Figura 13 - Cromatograma CLUE-DAD do EHEL de B. pinnatum (A) 254 nm e (B) 340 nm.
Legenda: FE: coluna C18 Phenomenex (150 x 4,6 mm, 2,6 µm); FM: gradiente ACN:TFA 0,3%; fluxo: 0,7 mL/min;
detecção: 254 (A) 340 nm (B). Fonte: Resultados experimentais.

90
Tabela 8 – Dados de máximos de UV dos compostos encontrados no EHEL de B. pinnatum.

Composto Espectro Ultravioleta Núcleo Sugestivo
1 353 Ácido fenólico
2 310 e 365 nm
3 256 e 344 nm
4 257 e 344 nm
5 251 e 348 nm Flavonoides derivados
6 264 e 344 nm de quercetina e canferol
7 251 e 342 nm
8 259 e 350 nm
9 266 e 343 nm
Fonte: Resultados experimentais.
Na análise por CLUE-EM/EM (figura 14) foi possível confirmar a presença dos
flavonoides. No fragmentograma, todas as substâncias que apresentaram tempo de retenção
superior a 8 min foram identificadas como fenóis, com destaque aos flavonoides do tipo O-
glicosídicos, como descrito por Fernandes e cols (2016). As agliconas encontradas foram a
flavona eupafolina (316 m/z) e os flavonóis patuletina (332 m/z), quercetina (302 m/z) e
canferol (286 m/z). Os açúcares conjugados com essas estruturas são hexoses (como a glicose),
pentose (como arabinose) e desóxi-hexoses (como a ramnose). Os compostos foram
identificados com base no espectros de massas dos íons precursores e íons produtos nos modos
MS1, MS2 e MS3.
Figura 14 - Cromatograma CLUE-EM/EM do EHEL de B. pinnatum (A) modo negativo e (B) modo positivo.
Legenda: FE: coluna C18 Hypersil Gold UPLC (100 x 1,9 mm, 2,1 µm); FM: gradiente ACN: ácido fórmico 0,1%;
fluxo: 0,22 mL/min; eluição acompanhada nos modos negativo (A) e positivo (B) (item 3.4). Fonte: Resultados
experimentais.

91
É possível observar um pico intenso no perfil CLUE-EM/EM no EHEL de B. pinnatum,

correspondente a um flavonoide majoritário de MM = 580 ([M-H]- = 579 e [M-H]+ = 581), com
tempo de retenção de 10,29 e 10,28 min, respectivamente, modos negativo e positivo. Após
análise dos fragmentos e comparação com a literatura, foi possível confirmar a presença de
quercetina 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-α-L-ramnopiranosídeo, a partir da massa da
quercetina (302 m/z), e de perdas de unidades m/z do íon molecular que sugerem a presença de
uma ramnose e um pentose.
Nesse fragmentograma, tanto no modo positivo quando no negativo, foram observados
dois picos com tempo de retenção de 2,37 e 1,83 min. Para esses dois picos a massa do íon
molecular é 320.0989 [M-H]- para o modo negativo, sugerindo uma fórmula molecular de
C12H18O8N, e 276.1079 [M+H]+para o modo positivo, o que sugere uma fórmula molecular de
C11H18O7N. A regra do nitrogênio indica que são cerca de duas moléculas que contêm um
número ímpar de átomos de nitrogênio. A partir da fragmentação MS/MS (figura 15) para o
modo negativo é possível que fragmento o m/z seja um aduto com ácido fórmico, que é muito
comum em tais sistemas cromatográficos, assim, pode ser concluído que a fórmula molecular
confirmada é C11H17O7N, para ambas as substâncias eluídas a 1,84 e 2,37 min. É a primeira vez
na literatura que substâncias nitrogenados são descritos para o gênero Kalanchoe (ou
Bryophyllum), no entanto, já foram descritos para a família Crassulaceae (BJARNHOLT et al.,
2012; NAHRSTEDT; WALTHER; WRAY, 1982; NISHIDA; ROTHSCHILD;
MUMMERYT, 1994). Alguns desses metabólitos, especialmente aqueles com baixa ou
nenhuma absorção de UV, não são facilmente detectados e, consequentemente, não relatados,
mesmo que possam estar presentes em grande quantidade. Experimentos EM/EM confirmam a
estrutura e mostram que ambos os compostos eluídos a tR de 1.87 e 2.37 min são glicosídeos
hidroxinitrilas (isômeros), como ilustrado na figura 15. A estrutura foi confirmada em mais
detalhes pela perda da unidade de açúcar em ambos modos originando, para o modo positivo,
o principal íon EM/EM é 114,0549, que representa a aglicona nitrílica após a remoção da porção
glicose (162) e para o modo negativo o principal íon EM/EM é 94,0273, que representa a
aglicona nitrílica após a remoção de toda a porção de glicose (182 m/z) (figuras 15 e 16).
Após compreensão do mecanismo de fragmentação (figura 16) e comparação com dados
da literatura, sugere-se tratar-se da sarmentosina (figura 17) (BJARNHOLT et al., 2012;
NAHRSTEDT; WALTHER; WRAY, 1982; NISHIDA; ROTHSCHILD; MUMMERYT,
1994). Esse fato, levou ao interesse no seu isolamento, e processos cromatográficos foram
conduzidos para obtenção desse composto e análise por RMN.

92
Em estudos prévios realizado por nosso grupo de pesquisa, alguns flavonoides já haviam
sido isolados em pequenas quantidades, por técnicas cromatográficas clássicas, o que dificultou
a completa elucidação estrutural e impossibilitou caracterizar os compostos ativos, o
mecanismo de ação e realizar a avaliação do teor nos extratos. Dessa forma, uma marcha de
isolamento foi desenvolvida para obter quantidades suficientes de compostos, especialmente,
que pudessem ser caracterizados e utilizados como marcadores das espécies, e, também para
obter quantidade suficiente para testar atividade biológica, a fim de caracterizar o marcador
ativo, ou seja, um dos compostos responsável pela atividade biológica no extrato.
Figura 15 – Fragmentação EM/EM do composto nitrogenado sarmentosina no modo positivo (superior) e no modo
negativo (inferior).

93
Figura 16 - Mecanismo de fragmentação da sarmentosina.
Figura 17 - Estrutura química da sarmentosina identificada.
5.2 FRACIONAMENTO E ISOLAMENTO

O fracionamento por XAD-4 realizado a partir do EHEL de B. pinnatum, mostrou-se
bastante eficiente na obtenção de frações enriquecidas em flavonoides, uma vez que o XAD-4
é uma resina de afinidade para derivados fenólicos. Essas frações enriquecidas apresentaram
bons rendimentos e foram utilizadas para obtenção de compostos isolados. Duas frações foram
usadas para o isolamento, a fração aquosa solúvel (Fr ASol) de rendimento 19,98 g, e a fração
resultante da união das frações 5:5 e 4:6 (FrF e FrG, respectivamente) com 1,02 g de
rendimento. As demais frações foram armazenadas para serem utilizadas futuramente. A partir
das frações enriquecidas, foram realizados 4 processos de separação por CPC.
Previamente ao isolamento por CPC, foi realizada a avaliação do coeficiente de partição
(Kd) por meio de CCD a fim de se escolher o melhor sistema solvente para separação por CPC.
Essa análise é uma interessante ferramenta qualitativa para avaliar a distribuição dos compostos
entre as duas fases do sistema bifásico. Diante dos resultados apresentados por CCD, o sistema
escolhido foi o VII, composto por AcOEt: EtOH: H2O (9:3:5,5, v/v/v) com pequena
modificação para grande escala, uma vez que a esse sistema foi adicionado 0,5 mL de

94
ciclohexano (CHex) para acelerar a separação de fases. Logo, o sistema VII ficou AcOEt:
EtOH: H2O:CHex (9:3:5,5:0,5, v/v/v/v).
O método de separação desenvolvido por CPC mostrou-se eficiente, especialmente para
substâncias de polaridade intermediária e, também, polares. A partir dos processos por CPC foi
possível obter quatro flavonoides, simultaneamente, em um único processo (dois derivados
glicosilados da quercetina – flavonoides Bp3 e Bp1 – e dois derivados glicosilados do canferol
– flavonoides Bp4 e Bp2). Foi isolado também um ácido orgânico, denominado Bp5, e uma
mistura desse ácido com outra substância, denominada Bp6, numa proporção provável de 2:1.
Além disso, foram obtidas frações enriquecidas que podem posteriormente serem purificadas.
A partir de frações purificadas da extrusão da CPC, também foi possível identificar outra
substância parcialmente purificada, Bp7, um glicosídeo hidroxinitrila já descrito na literatura
para a família, no entanto sendo este o primeiro relato para o gênero. Embora não fosse o
objetivo, essa substância também foi isolada em trabalhos posteriores, seja possível avaliar sua
influência na atividade do extrato. Somado a isso, como essa substância se apresentou
majoritária nas frações, seria interessante investigar o seu potencial como marcador, uma vez
que até o momento, apenas flavonoides foram os descritos como possíveis marcadores para
essa espécie. Para a obtenção dessa substância pura, foi utilizada a técnica de CLMP a partir
das frações da extrusão da 2ª e 3ª CPC BP, como descrito na tabela 3.
Foi identificado um álcool vinílico nas frações purificadas da CPC, uma substância
minoritária no extrato, denominado Bp8, o qual só foi possível a elucidação estrutural após
purificação da fração por uma CC com Sephadex LH-20. A identificação desse álcool vinílico
não era o objetivo desse procedimento.
A partir desses resultados é possível afirmar que o processo de isolamento por CPC para
a espécie B. pinnatum foi satisfatório pela obtenção de seis substâncias ao final dos processos
e de frações promissoras para isolamento. Uma análise por CPC durou, no máximo, 2 h, e os
rendimentos dos componentes majoritários são incomparáveis com outras técnicas já descritas
para a espécie. Em apenas uma análise, com 8 g de fração aquosa (proveniente do XAD-4), foi
possível obter, pelo menos 149,9 mg do flavonoide majoritário (Bp1), um rendimento
aproximado de 1,86 %. Utilizando uma fração enriquecida em flavonoides proveniente do
fracionamento por XAD-4 (4º CPC BP), o rendimento apresenta-se ainda melhor, no qual a
partir de 1 g dessa fração foram obtidos 177 mg do flavonoide majoritário com rendimento
aproximado de 17,7 %.
Essa não é a primeira vez que a técnica de CPC é utilizada para B. pinnatum, Abdellaoui
e cols. (ABDELLAOUI et al., 2010), obtiveram uma fração polar ativa a partir do extrato

95
metanólico de B. pinnatum e identificaram seus constituintes por LC-MS/MS, no entanto não

obtiveram nenhuma substância isolada.
Como os resultados com a fração enriquecida foram promissores, também foi realizado
uma análise por CPC com 2 g do EHEL de B. pinnatum, e a partir dele os quatro flavonoides
foram isolados novamente diretamente do extrato bruto, em no máximo 2 h de análise,
mostrando-se uma técnica ainda mais eficiente, na qual a partir de 2 g do EHEL, foram obtidos
27,5 mg de Bp1, apresentando um rendimento de 1,34 %.
Diante do exposto, a Cromatografia de Partição Centrífuga foi utilizada para tentar obter
os compostos majoritários, de uma forma rápida e com um rendimento satisfatório. É
importante ressaltar que o objetivo desse fracionamento não foi a obtenção de moléculas novas,
mas a obtenção em quantidades suficientes dos compostos majoritários para serem usados como
marcadores para a quantificação dos extratos, para o estudo metabolômico e para investigação
da atividade biológica.
Todo o processo de fracionamento está representado na figura 18. A identificação e
elucidação estrutural das substâncias isoladas está descrito no próximo tópico (5.3 Identificação
e elucidação estrutural das substâncias isoladas de B. pinnatum).

96
Figura 18 - Resumo do processo de isolamento conduzido para B. pinnatum.
Legenda: Fase móvel para análise das CCDs: AcOEt: HCOOH: MeOH: H2O (10:1,5:1,6:0,5, v/v/v/v) e revelação com Vanilina sulfúrica + aquecimento. Fonte: Autoria própria
baseada em resultados experimentais

97

DE B. pinnatum.
5.3.1 Identificação dos flavonoides

Os quatro flavonoides isolados (Bp1, Bp2, Bp3 e Bp4), apresentaram-se como um pó
amarelo amorfo, e foram analisados por RMN e EM, e sugerindo-se tratar de dois derivados
glicosilados de quercetina e dois derivados glicosilados de canferol. A figura 19 mostra a
análise por CCD (condições descritas na tabela 1) dos quatro flavonoides, e a figura 20 mostra
o perfil por CLUE-DAD.
Figura 19 - Análise por CCD dos flavonoides isolados e elucidados.
Dados: Fase Móvel – AcOEt: Ácido Fórmico: Água: Metanol (10:1,5:1,6:0,5, v/v/v/v); Adsorvente – gel de sílica
60 F254; Revelador - Vanilina Sulfúrica + aquecimento e visualização no visível. Legenda: F1 – flavonoide Bp4;
F2 – flavonoide Bp3; F3 – flavonoide Bp2; F4 – flavonoide Bp1. Fonte: Adaptado de resultados experimentais.
Figura 20 – Cromatograma obtido por CLUE-DAD do EHEL de B. pinnatum.
Legenda: FE: coluna C18 Phenomenex (150 x 4,6 mm, 2,6 µm); FM: gradiente ACN:TFA 0,3%; fluxo: 0,7 mL/min;
detecção: 340 nm (item 3.4). Fonte: Adaptado de resultados experimentais.
Com parte da massa obtida de cada substância pura foram realizadas as análises por
ressonância magnética nuclear como RMN de 1H, COSY, HSQC, HMBC e quando necessário

98
NOESY, sendo possível atribuir deslocamentos químicos para cada hidrogênio e carbono. O
solvente utilizado para obtenção dos espectros foi MeOD. Para a elucidação estrutural foram
utilizados os espectros de RMN e comparação com dados da literatura.
A seguir será descrito detalhadamente o flavonoide Bp1, por ser majoritário para a
espécie, e posteriormente os outros flavonoides de maneira mais sucinta, seguindo a ordem:
flavonoide Bp2, Bp3 e Bp4. Uma vez que a estruturas desses flavonoides estão todas
relacionadas ao Bp1 não será necessária uma descrição detalhada, e a elucidação será baseada
nas diferenças em relação ao primeiro flavonoide. Além disso, não se trata de compostos
inéditos, pois já foram isolados pelo menos uma vez para B. pinnatum, e alguns também já
foram descritos para outras espécies.
5.4.1.1 Identificação de Bp1

O primeiro flavonoide identificado foi denominado Bp1, e seus dados de RMN foram
comparados com dados da literatura de isolamentos anteriores (JOU et al., 2004; MUZITANO
et al., 2006a; NIELSEN; OLSEN, 2005; PAWLOWSKA et al., 2009; ROTH et al., 2011).
O espectro de RMN de 1H apresentou sinais característicos de agliconas de flavonoides
entre 7,36 e 6,22 ppm. Nesta região foram observados cinco sinais, cada um com integração
para um hidrogênio. O sinal que se encontra no campo mais alto, situado em 6,22 ppm, é do
tipo singleto e foi atribuído ao H-6 (anel A). O segundo sinal mais protegido nessa região
também é um singleto e está situado em 6,38 ppm, atribuído ao H-8 (anel A). Sinais na região
de 6,20-6,40 ppm são compatíveis com os hidrogênios do anel A da aglicona flavonoídica e
estão acoplados em posição meta. Em flavonoides 5, 7 di-hidroxilados, o H-6 (anel A) ocorre
em campo mais alto (mais blindado), enquanto o H-8 (anel A) é observado em campo mais
baixo (mais desblindado) (MABRY; MARKRAM; THOMAS, 1970). Em relação o anel B, em
6,94 ppm é possível observar um dubleto com constante de acoplamento 3J igual a 8,30 Hz.
Esse sinal foi atribuído ao H-5’. Em um campo um pouco mais baixo, 7,32 ppm, observa-se um
duplo-dubleto que apresenta 3J de 8,30 Hz, atribuído ao H-6’. O quinto sinal observado, um
singleto situado em 7,38 ppm refere-se ao H-2’. Esses sinais são compatíveis com um
acoplamento orto. Dessa forma, o padrão de sinais e multiplicidade observadas são compatíveis
com um anel 3’,4’-di-hidroxilado. Assim, com base no espectro RMN de 1H foi possível
identificar a aglicona como sendo o flavonol quercetina (3,5,7,3’,4’-pentaidroxiflavonol)
(figura 21).
O espectro de RMN de 1H sugeriu a presença de duas unidades de açúcar para o
flavonoide Bp1, devido a presença de dois singletos em 5,40 e 4,24 ppm, característicos de

99
hidrogênios anoméricos, respectivamente, H-1” e H-1”’. Além disso, foi possível sugerir que
uma dessas unidades de açúcar é a ramnose, uma vez que foi observada a presença de um
dubleto em 1,04 ppm (3J = 6,2 Hz) relativo a uma metila. Técnicas de RMN bidimensionais de
HMBC e HMQC comprovaram a presença de uma unidade de α-arabinose.
Essas técnicas bidimensionais são importantes para conseguir se estabelecer correlações
2-3
entre hidrogênios que estão acoplados JH-H (COSY); correlação direta entre os núcelos de
carbono e hidrogênio (HMQC) e correlação a longa distância entre os núcleos de carbono e
hidrogênio (HMBC). Nas técnicas de HMQC e HMBC, o eixo horizontal corresponde aos δH e
o eixo vertical aos deslocamentos δC (PAVIA et al., 2012; SILVERSTEIN; WEBSTER;
KIEMLE, 2012).
A atribuição dos sinais de todos os hidrogênios dos açúcares foi feita por meio da técnica
de COSY (figura 22) pois permitiu encontrar todas as correlações entre os hidrogênios vizinhos,
os valores são descritos na tabela 10. Ao final dessa análise, juntamente com os dados obtidos
por HSQC, que relaciona C e H ligados, foi possível determinar todos os valores para
deslocamentos de carbono da aglicona e dos açúcares que possuíam hidrogênio ligado a eles,
sendo possível sugerir que o outro açúcar se trata de uma arabinose (figura 23).
A presença de e uma 3-O-glicosilação no anel C do flavonoide Bp1 pode ser confirmada
por meio do espectro de HMBC (figura 24), por meio da correlação entre o C-3 (134,78 ppm)
e o H-1” da ramnose (5,40 ppm), uma vez que este espectro permite correlação entre os núcleos
de 1H com os núcleos de 13
C com duas ou mais ligações de distância, sendo possível definir
deslocamentos de alguns carbonos que não possuem hidrogênio ligado. Além disso, concluiu-
se que a unidade de arabinose está ligada ao carbono 2 (C-2”) da ramnose (81,79 ppm), devido
ao H-2” da ramnose (4,22 ppm) estar correlacionado ao C-1’” da arabinose (105,87 ppm),
indicando uma ligação interglicosídica do tipo (1→2) (MUZITANO et al., 2006ª; FLAMINI et
al., 2002; MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970).
O flavonoide Bp1 apresentou como dados do EM para o modo negativo [M–H]- m/z
579,1 e para o positivo [M+Na]+ m/z 603,1, deduzindo a fórmula molecular de C26H28O15, a
partir do íon pseudomolecular. Essa massa é condizente com aquela apresenta por Muzitano e
cols (2006) e Jou e cols (2004) para esse flavonoide. Diante do exposto, foi possível concluir
que Bp1 é a quercetina 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-α-L-ramnopiranosídeo (figura 25).
A tabela 9 descreve as atribuições para cada hidrogênio de Bp1 e o comparação com os
dados encontrados por Muzitano e cols (2006).

100
Figura 21 - Espectro de RMN de 1H do flavonoide Bp1 (MeOD, 400 MHz).
Fonte: Adaptado de Resultados experimentais.

101
Figura 22 - Espectro de RMN COSY do flavonoide Bp1 (MeOD, 400 MHz).

102
Figura 23 - Espectro de RMN HSQC do flavonoide Bp1 (MeOD, 400 MHz e 100 MHz).

103
Figura 24 - Espectro de RMN HMBC do flavonoide Bp1 (MeOD, 400 MHz e 100 MHz).

104
Tabela 9 - Dados espectroscópicos de RMN de 1H (400 MHz) para o flavonoide Bp1 de B. pinnatum em MeOD.
H Bp1 - δH Mult. (J Hz) QAR - δH Mult. (J Hz)
Aglicona
2 - -
3 - -
4 - -
5 - -
6 6,21 s 6,19 d (2,00)
7 - -
8 6,37 s 6,37 d (2,00)
9 - -
10 - -
1’ - -
2’ 7,38 d (2,0) 7,36 d (2,07)
3’ - -
4’ - -
5’ 6,94 d (8,3) 6,93 d (8,32)
6’ 7,32 dd (8,3; 2,0) 7,29 dd (2,07; 8,32)
Ramnose
1” 5,40 s 5,37 d (0,93)
2” 4,22 m 4,19 m*
3” 3,91 dd (9,7; 3,2) 3,89 dd (3,70; 9,70)
4” 3,38 d (9,6) 3,35 dd* (9,70; 9,70)
5” 3,90 m 3,87 dq* (9,70; 6,20)
6” 1,04 d (6,2) 1,10 d (6,20)
Arabinose
1’” 4,24 s 4,20 d (7,10)
2’” 3,53 m 3,54 dd (7,10; 9,28)
3’” 3,50 dd (9,2; 2,9) 3,47 dd (3,25; 9,28)
4’” 3,75 m 3,72 m*
5’” 3,68 m 3,65 dd* (12,45; 2,27)
3,40 (12,3) 3,37 br d* (12,45)
Legenda: QAR: quercetina 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-ramnopiranosídeo isolado por Muzitano e
cols (2006). *Sinais não bem definidos. Fonte: Resultados experimentais em MeOD a 400 MHz e Muzitano e cols
(2006a) em MeOD a 500 MHz.
Figura 25 – Estrutura química de Bp1.

105
A quercetina 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-ramnopiranosídeo foi isolada

pela primeira vez para a espécie por Ichikawa e cols, em 1986 (apud MUZITANO et al., 2006),
e apesar de ser um derivado de uma aglicona bem comum como a quercetina, a sua ligação 3-
O diglicosídica é bastante peculiar, pois trata-se de um dímero ramnose-arabinose não muito
comum, não tendo sido reportado para folhas de outras espécies do gênero Kalanchoe
(NASCIMENTO et al., 2015). A ligação da arabinose não é muito comum, uma vez que a
presença de enzimas transportadoras dessa molécula de açúcar (3-O-arabinosil transferase) é
menos frequente em relação as 3-O-glicosil transferase e 3-O-ramnosil transferase na
glicosilação dos flavonoides em Arabdposis thaliana (YIN et al., 2012). A seguir, é descrita
uma sugestão de rota de biossíntese para esse flavonoide (figuras 26 e 27).
Esse flavonoide Bp1, após análise qualitativa e quantitativa por CLUE-DAD (como será
visto mais adiante nesse capítulo), é o composto majoritário para B. pinnatum, o que pode torná-
lo um marcador específico para diferenciação de outras espécies em análises de controle de
qualidade. Estudo realizado por Nascimento e cols (2018), reforçaram que esse flavonoide
incomum pode ser usado como marcador para K. pinnata através de um estudo de otimização
da metodologia de extração do extrato aquoso para obter um maior teor dessa substância,
reduzindo os custos do processo extrativo, provando que esse flavonoide é realmente
majoritário e sua obtenção pode ser melhorada aumentando a temperatura do método extrativo
para 40 ºC e reduzindo o tempo de extração (NASCIMENTO et al., 2018). Somado a isso, esse
componente majoritário tem apresentado atividade anti-inflamatória (DE ARAÚJO et al., 2019;
FERREIRA et al., 2014) e leishimanicida (MUZITANO et al., 2006a), apresentando-se como
forte candidato a marcador ativo para esta espécie.
Esta molécula foi descrita para poucas espécies de outras famílias botânicas, mas não
como substância majoritária (JOU et al., 2004; MUZITANO et al., 2006a; NIELSEN; OLSEN,
2005; PAWLOWSKA et al., 2009; ROTH et al., 2011). No entanto, apesar de ter sua estrutura
química bem estabelecida e totalmente elucidada por trabalhos anteriores, nenhum deles aborda
o isolamento rápido, eficiente e otimizado dessa molécula a fim de se obter grandes
quantidades, principalmente, utilizando uma metodologia que gere pouco resíduos químicos e
bons resultados de rendimento de substância pura. Poucos trabalhos trazem a avaliação da
atividade desse flavonoide isolado, e muito raro ainda é o uso desse flavonoide em estudos de
controle de qualidade para essa espécie. O objetivo de estudar a atividade do comosto isolado,
nesse caso, seria a sugestão de mecanismo de ação, para compreender melhor como B. pinnatum
age como anti-inflamatório, antiúlcera (DE ARAÚJO et al., 2018, 2019) e antibotrópica

106
(FERNANDES et al., 2016), objetivos de estudo do nosso grupo de pesquisa e que ainda não
foram abordados na literatura.
• Biossíntese de Bp1:
A etapa inicial da via consiste na formação do núcleo flavilium, o esqueleto de base de
todos os flavonóides, a partir de três moléculas de malonil-CoA, originados da via do
acetato/malonato sendo responsáveis pela formação do anel A, e uma de 4-cumaril-CoA,
originada via do chiquimato, responsável pela formação do anel B e a ponte de 3 carbonos (que
dará origem ao anel C) (DIXON, STEELE, 1999; DEWICK, 2002; PRETUSSA et al., 2013).O
cumaril-CoA origina-se a partir da fenilalanina através da via do ácido chiquímico (DEWICK,
2002; FERREYRA et al., 2012) como ilustrado na figura 26.
A chalconasintase (CHS) é a enzima envolvida na condensação das três moléculas de
malonil-CoA e uma de 4-cumaril-CoA, produzindo a tetrahidrochalcona, que posteriormente
sofre ação da chalconaisomerase (CHI) para transformar-se na flavanona chamada narigenina
(LIPINIEC et al., 2006; PETRUSSA et al., 2013). A oxidação na posição 3 desta pela enzima
flavanona 3-hidroxilase (F3H) produz o dihidrocanferol, um dihidroflavonol, que é hidroxilado
na posição 3' do anel B, pela enzima flavanona 3'-hidroxilase (F3'H) (PETRUSSA et al., 2013).
Esta por sua vez se transforma em quercetina por ação da enzima flavonol sintase (FLS) que
cataliza a formação da dupla ligação entre os carbono 2 e 3 (WINKEL-SHIRLEY, 2001;
SAITO et al., 2012). Por fim, sugere-se que por ação das glicosiltransferases, enzimas que
catalizam a transferência de açúcar para uma larga escala de moléculas aceptoras, adicionem
unidades de ramnose e arabinose ao núcleo quercetina na posição 3 (CHEYNIER et al., 2013).
De acordo com a literatura, em flavonols a 3-O-glicosilação ocorre primeiro, sendo adicionados
nessa posição glicose, ramnose ou arabinose (SAITO et al., 2012). A figura 27 ilustra a rota
biossintética de Bp1.

107
Figura 26 - Esquema da via do ácido chiquímico.
Fonte: Autoria própria. Adaptado de Dewick (2002)

108
Figura 27 - Esquema da rota biosintética de Bp1.
Legenda: PAL: fenilalanina amônia-liase; C4H: cinamato-4-hidroxilase; 4CL: 4-cumaril:CoA-ligase; CHS:

chalconasintase; CHI:chalconaisomerase; F3H: flavanona 3-hidroxilase; F3’H: flavanona 3’-hidroxilase; FLS:
flavonol sintase. Fonte: Autoria própria. Adaptado de Winkel-Shirley, 2001; Dewick, 2002 e Pretussa et al., 2013

109
5.3.1.2 Identificação do Flavonoide Bp2

O segundo flavonoide identificado foi denominado Bp2 e seus dados de RMN foram
comparados com dados da literatura de isolamentos anteriores (MUZITANO et al., 2006a).
Como esse composto foi isolado e identificado apenas por Muzitano e cols. (2006), outros
artigos que mostram estruturas quimicamente relacionadas foram utilizados para confirmação
de sua identidade (XUE et al., 2015; MOK; LEE, 2013; FLAMINI et al., 2002; SLOWING et
al., 1994).
O espectro de RMN de 1H do flavonoide Bp2 apresentou sinais característicos de
agliconas de flavonoides entre 7,79 e 6,21 ppm. Nesta região foram observados quatro sinais,
os mais desblindados com integração para dois hidrogênios, e os mais blindados com integração
para um hidrogênio. O sinal que se encontra no campo mais alto, situado em 6,21 ppm, é do
tipo singleto e foi atribuído ao H-6 (anel A). O segundo sinal mais protegido nessa região
também é um singleto e está situado em 6,38 ppm, atribuído ao H-8 (anel A). Em relação o anel
B, em 6,96 ppm é possível observar um dubleto com constante de acoplamento 3J igual a 8,80
Hz e integração para dois hidrogênios, sinal atribuído ao H-5’ e H-3’ que possuem a mesma
vizinhança química. Em um campo um pouco mais baixo, o sinal em 7,79 ppm apresenta-se um
dubleto de 3J igual 8,80 Hz e integração para dois hidrogênios, atribuído aos hidrogênios H-6’
e H-2”. Dessa forma, o padrão de sinais e multiplicidade observadas são compatíveis com um
anel 4’-mono-hidroxilado. Assim, com base no espectro RMN de 1H foi possível identificar a
aglicona como sendo o flavonol canferol (3,5,7,4’-tetraidroxiflavonol) (figura 28).
O espectro de RMN de 1H sugeriu a presença de duas unidades de açúcar para o
flavonoide 3, devido a presença de dois sinais em 5,40 ppm (singleto) e 4,28 ppm (dubleto com
3
J = 7,20 Hz), característicos de hidrogênios anoméricos, respectivamente, H-1” e H-1”’. Além
disso, foi possível sugerir que uma dessas unidades de açúcar é a ramnose, uma vez que foi
observada a presença de um dubleto em 1,00 ppm (3J = 6,2 Hz) relativo a uma metila. A
atribuição dos sinais de todos os hidrogênios dos açúcares foi feita por meio da técnica de
COSY e os valores são descritos na tabela 10. Ao final dessa análise, juntamente com os dados
obtidos por HSQC, foi sugerido que o outro açúcar se trata de uma arabinose. A presença de
uma 3-O-glicosilação pode ser confirmada por meio da correlação entre o C-3 (134,78 ppm) e
o H-1” da ramnose (5,40 ppm) visualizada no espectro de HMBC. Além disso, concluiu-se que
a unidade de arabinose está ligada ao carbono 2 (C-2”) da ramnose (80,99 ppm), devido ao H-
2” da ramnose (dubleto em 4,28 ppm com 3J = 7,2 Hz) estar correlacionado ao C-1’” da
arabinose (106,63 ppm), indicando uma ligação interglicosídica do tipo (1→2) (MUZITANO
et al., 2006ª; FLAMINI et al., 2002; MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970).

110
Capítulo 2 - Estudo Químico de Bryophyllum pinnatum

111
Tabela 10 - Dados espectroscópicos de RMN 1H (400 MHz) para o flavonoide Bp2 de B. pinnatum em MeOD.
H Bp2 - δH Mult. (J Hz) CAR - δH Mult. (J Hz)
Aglicona
2 - -
3 - -
4 - -
5 - -
6 6,21 d (2,0) 6,20 d (1,87)
7 - -
8 6,38 d (2,0) 6,38 d (1,87)
9 - -
10 - -
1’ - -
2’ 7,79 d (8,8) 7,78 d (8,68)
3’ 6,96 d (8,8) 6,94 d (8,70)
4’ - -
5’ 6,96 d (8,8) 6,94 d (8,70)
6’ 7,79 d (8,8) 7,78 d (8,68)
Ramnose
1” 5,50 s 5,47 d (1,37)
2” 4,23 d (1,2) 4,20 m*
3” 3,85 dd (9,7; 3,5) 3,82 dd (3,42; 9,66)
4” 3,36 dd (9,8; 5,0) 3,32 dd* (9,62; 9,62)
5” 3,73 m 3,73 m*
6” 1,00 d (6,2) 0,98 d (6,17)
Arabinose
1’” 4,28 d (7,2) 4,25 d (7,15)
2’” 3,57 d (7,3) 3,55 dd (7,38; 9,56)
3’” 3,51 dd (9,3; 3,3) 3,47 dd (3,25; 9,15)
4’” 3,73 m 3,73 m*
5’” 3,66 m 3,68 m*
3,42 d (11,9) 3,42 br d* (12,65)
Legenda: CAR: canferol 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-ramnopiranosídeo isolado por Muzitano e cols
(2006). *Sinais não bem definidos. Fonte: Resultados experimentais em MeOD a 400 MHz e Muzitano e cols
(2006a) em MeOD a 500 MHz.
Os dados do EM para o modo negativo [M–H]- m/z 563,1 e para o positivo [M+Na]+
m/z 587,1, sugerem a fórmula molecular de C26H28O14. O fragmento de m/z 455,2 confirma a
presença de uma arabinose terminal, pela perda de 132 unidades do íon molecular por meio de
uma reação de eliminação. Esses achados corroboram com os dados apresentado por Muzitano
e cols. (2006a).
Assim, Bp2 foi caracterizado como canferol 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-α-L-
ramnopiranosídeo (figura 29) ou kapinatosídeo, sendo descrito até o momento somente em B.
pinnatum (MUZITANO et al., 2006).
Esse flavonoide Bp2, após análise qualitativa por CLUE-DAD não se apresenta como
um composto majoritário do extrato hidroetanólico B. pinnatum, no entanto, devido a sua
exclusividade para a espécie até o momento, pode vir a se tornar um marcador analítico

112
específico para diferenciação de outras espécies em análises de controle de qualidade. Além

disso, é importante salientar que este flavonoide apresentou atividade leishimanicida moderada
contra formas amastigotas de Leishmania amazonensis (MUZITANO et al., 2006a).
5.3.1.3 Identificação do flavonoide Bp3

Para a elucidação desse flavonoide foram utilizados dados da literatura (ZHU et al.,
2016; CHEN; CHEN; GAO, 2014; SHEN et al., 2010; MUZITANO et al., 2006b; SLOWING
et al., 1994) para comparação com os espectros realizados e atribuição dos sinais, culminando
com a elucidação estrutural completa dessa substância.
O flavonoide Bp3 mostrou os mesmos sinais (com ligeiras diferenças) encontrados para
Bp1 na região mais desblindada do espectro como mostrado na tabela 11 e figura 30 (espectro
de RMN de 1H de Bp3), sugerindo que os flavonoides Bp1 e Bp3 são derivados da mesma
aglicona flavonoídica, a quercetina, como é possível visualizar no espectro de RMN de 1H
(figura 30). No entanto, com a presença de apenas um H-1” anomérico, um dubleto em 5,37
com 3J igual a 1,4 Hz e integração para um hidrogêncio. Além disso, foi possível sugerir que o
açúcar é a ramnose, uma vez que foi observada a presença de um dubleto em 0,96 ppm (3J =
6,1 Hz) relativo a uma metila no espectro de RMN de 1H. A atribuição dos sinais de todos os
hidrogênios da ramnose foi feita por meio da técnica de COSY e os valores são descritos na
tabela 11 e os sinais ilustrados na figura 30. Espectros adicionais para interpretação podem ser
encontrados no Apêncide 1.
Em relação aos dados por EM, o flavonoide 2 apresentou para o modo negativo [M–H]-
m/z 448,1 e para o positivo [M+Na]+ m/z 471.1, deduzindo a fórmula molecular de C21H20O11.
Esses achados corroboram com os dados apresentado por Muzitano e cols. (2006b) e Mok e
Lee (2013).

113

114
A partir desses dados foi possível concluir que o flavonoide 2 é a quercetina 3-O-α-L-
ramnopiranosídeo (quercitrina) (figura 31). Como é uma substância extremamente descrita para
plantas ricas em flavonoides, há uma ampla gama de referências que podem ser usadas para
elucidação e por isso, os dados de RMN de 1H e COSY foram suficientes para comparação e
identificação da substância.
H Bp3 - δH [Mult., J (Hz)] (A) Quercitrina - δH Mult. (J Hz) (B) Quercitrina - δH Mult. (J Hz)
Aglicona
2 - - -
3 - - -
4 - - -
5 - - -
6 6,22 d (2,0) 6,28 d (2,1) 6,19 s
7 - - -
8 6,39 d (1,9) 6,45 d (2,1) 6,36 s
9 - - -
10 - - -
1’ - - -
2’ 7,36 d (2,0) 7,41 d (2,1) 7,33 d (2,0)
3’ - - -
4’ - - -
5’ 6,93 d (8,3) 7,0 d (8,1) 6,91 d (8,30)
6’ 7,32 dd (8,3; 2,0) 7,39 dd (8,1;2,1) 7,30 dd (8,30;2,10)
Ramnose
1” 5,37 d (1,4) 5,43 d (1,5) 5,34 d (1,40)
2” 4,24 dd (3,2; 1,7) 4,30 dd (3,3; 1,5) 4,22 m
3” 3,77 dd (9,3; 3,3) 3,82 dd (9,0; 3,3) 3,75 dd (9,35; 3,30)
4” 3,37 m 3,45 m* 3,42 m*
5” 3,44 dq (12,2; 6,1) 3,50 m* 3,35 d (2,0)
6” 0,96 d (6,1) 1,03 d (5,9) 0,94 d (6,10)
Legenda: Quercitrina: quercetina 3-O-α-L-ramnopiranosídeo. *Sinais não bem definidos. Fonte: Resultados
experimentais em MeOD a 400 MHz, (A) Slowing e cols (1994) em MeOD a 200 MHz e (B) e Zhu e cols (2016)
em MeOD a 500 MHz.

115
5.3.1.3 Identificação do flavonoide Bp4

Para a elucidação desse flavonoide foram utilizados dados da literatura (LEE et al.,
2014; MOK; LEE, 2013; XUE et al., 2015) para comparação com os espectros realizados e
atribuição dos sinais, culminando com a elucidação estrutural completa dessa substância.
O flavonoide Bp4 apresentou os mesmos sinais (com ligeiras diferença) encontrados
para Bp2 na região mais desblindada do espectro como mostrado na tabela 12 e figura 32
(espectro de RMN de 1H de Bp3), sugerindo que os flavonoides Bp2 e Bp4 são derivados da
mesma aglicona flavonoídica, o canferol, como é possível visualizar no espectro de RMN de
1
H (figura 32). No entanto, com a presença de apenas um H-1” anoméricos, um singleto em
5,39 ppm. A ramnose é o açúcar sugerido devido a presença de um dubleto em 0,94 ppm (3J =
5,6 Hz) relativo a uma metila. Assim como para todos os outros flavonoides, a atribuição dos
sinais dos hidrogênios da ramnose foi feita por meio da técnica de COSY e os valores são
descritos na tabela 12 e os sinais ilustrados na figura 32. Espectros adicionais para interpretação
podem ser encontrados no Apêncide 1.
Os dados do EM para o modo negativo [M–H]- m/z 421,1 e para o positivo [M+Na]+
m/z 455,1 sugerem a fórmula molecular de C21H20O10. Esses achados corroboram com os dados
apresentado por Mok e Lee (2013).
Assim, foi possível concluir que o flavonoide Bp4 é o canferol 3-O-α-L-
ramnopiranosídeo (afzelina) (figura 33). Esse flavonoide foi isolado pela primeira vez na
espécie, por Tatsimo e cols. (2012), no qual essa substância mostrou moderada atividade
antimicrobiana, no entanto, neste artigo não aborda nenhum dado de RMN ou EM. Como é
uma substância extremamente descrita para plantas ricas em flavonoides, há uma ampla gama
de referências que podem ser usadas para elucidação e por isso, os dados de RMN de 1H e
COSY foram suficientes para comparação e identificação da substância.

116

117
H Bp3 - δH [Mult., J (Hz)] (A) Afzelina - δH Mult. (J Hz) (B) Afzelina - δH Mult. (J Hz)
Aglicona
2 - - -
3 - - -
4 - - -
5 - - -
6 6,20 d (2,0) 6,19 d (2,44) 6,22 d (2,0)
7 - - -
8 6,87 d (2,0) 6,36 d (2,2) 6,42 d (2,0)
9 - - -
10 - - -
1’ - - -
2’ 7,79 d (8,8) 7,76 dd (8,76) 7,76 d (9,0)
3’ 6,95 d (8,8) 6,93 d (8,88) 6,91 d (9,0)
4’ - - -
5’ 6,95 d (8,8) 6,93 d (8,88) 7,76 d (9,0)
6’ 7,79 d (8,8) 7,76 dd (8,76) 6,91 d (9,0)
Ramnose
1” 5,39 s 5,36 d (2,2) 5,30 d (1,7)
2” 4,24 m 4,21 dd (3,42; 1,7) 4,63 dd (3,2; 1,7)
3” 3,72 m 3,71 m 3,98 dd (9,3; 3,2)
4” 3,40 m 3,60 m 3,08 – 3,18 m
5” 3,35 m 3,47 m 3,08 – 3,18 m
6” 0,94 d (5,6) 0,91 d (5,6) 0,80 d (6,0)
Legenda: Afzelina: canferol 3-O-α-L-ramnopiranosídeo. *Sinais não bem definidos. Fonte: Resultados
experimentais em MeOD a 400 MHz, (A) Lee e cols (2014) em MeOD a 400 MHz e (B) e Mok e Lee (2013) em
DMSO-d6 a 500 MHz.
Na figura 34, segue uma breve comparação entre as estruturas químicas dos flavonoides
isolados de B. pinnatum.

118
Figura 34 - Identificação estrutural dos flavonoides isolados de B. pinnatum
Fonte: Autoria própria baseada em resultados experimentais.
A tabela 13 informa os dados de rendimento, massa molecular a partir de EM, os

espectros UV, os tempos de retenção por CLAE-DAD, a fórmula molecular e o nome químico
desses 4 flavonoides.
Tabela 13 – Dados químicos e rendimentos dos quatro flavonoides isolados de B. pinnatum.

Massa
TR UV Fórmula Rendimento
Identificação molecular Nome químico
(min) (nm) química mg (%)
(g/mol)
Flavonoide 263, Canferol-3-O- 9,2 mg

Bp4
48,06
343
432 C21H20O10 ramnopiranosídeo (0,0092 %)
Flavonoide 264, Quercetina-3-O- 61,3 mg
Bp3
44,34
341
448 C21H20O11 ramnopiranosídeo (0,063 %)
Canferol 3-O-α-L-
Flavonoide 256, 19,9 mg
38,78 564 C26H28O14 arabinopiranosil (1→2)
Bp2 349 (0,0199 %)
α-L-ramnopiranosídeo
Quercetina 3-O-α-L-
Flavonoide 256, 575,0 mg
36,74 580 C26H28O15 arabinopiranosil (1→2)
Bp1 349 (0,575 %)
α-L-ramnopiranosídeo
Legenda: O rendimento percentual foi calculado a partir da quantidade de EHEL liofilizado utilizado (100 g).
5.3.2 Identificação dos compostos Bp5 e Bp6

O composto Bp6 foi identificado como um mistura. Bp6 foi analisado por CCD
(parâmetros na tabela 1) após o processo de fracionamento por CPC, e pode-se observar a
presença de apenas uma banda cromatográfica de coloração violácea após revelação com

119
vanilina sulfúrica (dados não mostrados). O mesmo aconteceu para o composto Bp5, foi
observado somente uma banda cromatográfica violácea na análise por CCD. Essas duas
amostras foram analisadas por RMN de 1H e 13
C, COSY, HSQC e HMBC utilizando como
solvente deuterado D2O. Os dados de deslocamento químico, multiplicidade e constante de
acoplamento estão na tabela 14 em comparação com a literatura (COSTA et al., 2006), bem
como são descritos nos próximos parágrafos.
Para Bp6, os dados de RMN de 1H foram analisados conjuntamente com a análise do
experimento de COSY para compreender melhor a estrutura daquela amostra ainda
desconhecida (espectros nas figuras 35 e 36, respectivamente). Os primeiros sinais a serem
descritos são os duplo-dubletos em 2,61 ppm (J = 17,2 e 5,3 Hz) e em 2,75 ppm (J = 16,4 e
7,0), cada um com integração para 2 hidrogênios, característicos de prótons metilenos geminais
(H-2 e H-7, respectivamente). A alta constante de acoplamento sugere um sistema ABX e o
valor de deslocamento químico sugere a proximidade com uma carbonila. A parte X do sistema
é caracterizada por um sinal duplo-dubleto em 3,39 ppm (J = 9,0 e 5,5 Hz), com integração
para 2 hidrogênios, característico de um próton metina (H-3 e H-6), que correla com o outro
dubleto de próton metina em 4,42 ppm (J = 3,4 Hz; i = 2 H) (H-4 e H-5). Esses sinais foram
confirmados por meio do espectro de 13C e dos experimentos de HSQC e HMBC (figura 37, 38
e 39, respectivamente), provando a existência do grupo metileno em 32,33 ppm (C-7) e dos
dois grupos metinas em 44,50 (C-3) e 70,31 ppm (C-4). Também é possível visualizar a
presença de um sinal carboxila com integração para 2 carbonos em 175,84 (C-1 e C-8). Esses
foram os sinais característicos da primeira molécula dessa mistura.
Outro sistema ABX, referente a outra parte da mistura, foi encontrado em 2,75 ppm (dd;
J = 16,4 e 7,0 Hz; i = 1 H) (Ha-2’) e 2,82 ppm (dd; J = 16,6; 4,6 Hz, i = 1 H) (Hb-2’), e a parte
X em 4,50 ppm (dd; J = 6,7; 4,6; i = 1 H) (H-3’), com correspondência para os sinais no espectro
de 13C em 38,31 ppm (C-2’) e 66,38 ppm (C-3’), respectivamente. Além disso é possível ver a
presença de 2 grupos carboxilas (C-1’ e C-4’, respectivamente) em 176,41 e 174,41 ppm no
espectro de RMN de 13C. Esses dados foram comparados com a literatura (COSTA et al., 2006),
e o composto sugerido trata-se de uma mistura denominada dimalato de kalanchosina (222,1
mg).

120
Figura 35 - Espectro de RMN de 1H do flavonoide Bp6 (D2O, 400 MHz).
Kalanchosina (1)

121
Figura 36 - Espectro de RMN COSY do flavonoide Bp6 (D2O, 400 MHz).
Kalanchosina (1)

122
Figura 37 - Espectro de RMN de 13C do flavonoide Bp6 (D2O, 400 MHz).
Kalanchosina (1)

123
Figura 38 - Espectro de RMN HSQC do flavonoide Bp6 (D2O, 400 MHz).

124
Figura 39 - Espectro de RMN HMBC do flavonoide Bp6 (D2O, 400 MHz).

125
Figura 40 - Espectro de RMN de 1H do flavonoide Bp5 (D2O, 400 MHz).

126
Os dados estão descritos na tabela 14 e a figura 41 ilustram a sua estrutura. Costa e cols.
(2006) relataram pela primeira vez o dimalato de kalanchosina (KMC) para K. laciniata (K.
brasiliensis), um sal formado a partir de um complexo entre kalanchosina e ácido málico (1:2).
A proporção é sugerida por meio das integrações dos sinais de hidrogênio no espectro de RMN
de 1H. Esta é a primeira vez que este complexo é descrito e isolado para B. pinnatum.
Após a elucidação do KMC foi fácil descobrir que o composto Bp5 (figura 41) tratava-
se do ácido málico (86 mg). Os dados de RMN de 1H e 13C para essa substância também estão
descritos na tabela 14 e, foram comparados com os sinais apresentados por Costa e cols. (2006).
O espectro de hidrogênio está ilustrado na figura 40.
Tabela 14 - Dados espectroscópicos de RMN de 1H (400 MHz) para KMC e Ácido Málico em D2O.
Composto 1 Mistura 1 KMC (Costa et al., 2006)

δH [Mult., J (Hz)] δC δH [Mult., J (Hz)] δC δH [Mult., J (Hz)] δC
Kalanchosina
1 - - - 175,84 - 178,64
2 - - 2,61 dd (17,2; 5,3) 32,33 2,56 dd (17,2; 5,5) 35,2
- - 2,75 dd (16,4; 7,0) - 2,73 dd (17,2; 9,0) -
3 - - 3,39 dd (9,0; 55) 44,50 3,34 ddd (9,0; 5,5; 3,3) 47,7
4 - - 4,42 d (3,4) 70,31 4,39 d (3,3) 73,1
5 - - 4,42 d (3,4) 70,31 4,39 d (3,3) 73,1
6 - - 3,39 dd (9,0; 55) 44,50 3,34 ddd (9,0; 5,5; 3,3) 47,7
7 - - 2,61 dd (17,2; 5,3) 32,33 2,56 dd (17,2; 5,5) 35,2
- - 2,75 dd (16,4; 7,0) - 2,73 dd (17,2; 9,0) -
8 - - - 175,73 - 178,57
Ácido Málico
1’ - 176,54 - 176,41 - 179,5
2’ 2,66 dd (16,1; 7,8) 38,57 2,75 dd (16,4; 7,0) 38,31 2,70 dd (17,4; 6,1) 41,2
2,82 dd (16,1; 4,3) - 2,82 dd (16,6; 4,6) - 2,79 dd (17,4; 5,0) -
3’ 4,50 dd (7,8; 4,4) 66,88 4,50 dd (6,7; 4,6) 66,38 4,46 dd (6,1; 5,0) 69,5
4’ - 174,67 - 174,41 - 177,2
Fonte: Resultados experimentais em D2O a 400 MHz e Costa e cols (2006).
Figura 41 - Identificação estrutural KMC e ácido málico.
5.3.2 Identificação do composto Bp7

Outra substância isolada a partir de uma fração da CPC foi o composto Bp7, um
glicosídeo hidroxinitrila, isolado pela primeira vez para o gênero. Para a obtenção desse
127
composto, frações da extrusão das CPCs realizadas, foram submetidas a CLMP, utilizando um
gradiente de solventes composto por AcOEt e MeOH. Ao final de todos os processos, foi
possível obter 61 mg dessa substância.
Essas duas amostras foram analisadas por RMN de 1H e 13C, COSY, HSQC, HMBC e
quando necessário NOESY utilizando como solvente deuterado MeOD. Os dados de
deslocamento químico, multiplicidade e constante de acoplamento estão na tabela 15 em
comparação com a literatura (CHEN et al., 2016; NAHRSTEDT; WALTHER; WRAY, 1982;
NISHIDA; ROTHSCHILD, 1995; NISHIDA; ROTHSCHILD; MUMMERYT, 1994), bem
como são descritos nos próximos parágrafos. Os dados foram confirmados por espectros
bidimensionais de COSY, HSQC, HMBC e NOESY.
Os dados de RMN de 1H (figura 42) foram analisados conjuntamente com a análise do
experimento de COSY para compreender melhor a estrutura daquela doe Bp7. Os primeiros
sinais a serem descritos são os duplo-dubleto-tripletos em 4,52 ppm (J = 14,0; 6,7; 1,1 Hz) (Hb-
1) e em 4,64 ppm (J = 14,0; 6,2; 1,3 Hz) (Ha-1), característicos de hidrogênios metilenos
geminais, com integração para 1 hidrogênio cada. O valor da constante de acoplamento sugere
um sistema ABX e o deslocamento químico sugere a proximidade com uma insaturação. A
parte X do sistema é caracterizada por um sinal triplo-tripleto em 6,70 ppm (J = 6,3; 1,5 Hz),
característico de hidrogênio vinílico (H-2), como integração para 1 hidrogênio. O último sinal
da aglicona fica em 4,18 ppm, um quarteto de 3J igual a 1,2 Hz característico de um CH2
próximo a uma hidroxila (H-4). O sinal em 4,35 ppm (d; 7,8 Hz) deixa claro a presença de uma
molécula de açúcar. Foi possível sugerir ainda a presença de um carboidrato através do sinal de
hidrogênio ligado a carbono anomérico em 4,35 ppp (d, J = 7,8 Hz), com integração para 1
13
hidrogênio (H-1’). Com o auxílio dos experimentos de RMN de C (figura 43), e os
bidimensionais COSY (figura 44) e HSQC (figura 45) foi possível atribuir todos os hidrogênios
e carbonos, caracterizando esse açúcar como a β-D-glicose. O experimento de HMBC (figura
46) ajudou a descobrir em qual carbono da aglicona estava ligada a glicose, através da
correlação entre os sinais dos hidrogênios anoméricos em 4,35 ppm (d; J = 7,8 Hz) e o carbono
1 da cadeia alifática em 66,82 ppm. Os dados estão todos descritos na tabela 16.

128
Figura 42 - Espectro de RMN de 1H do composto Bp7 (MeOD, 400 MHz).

129
Figura 43 - Espectro de RMN de 13C do composto Bp7 (MeOD, 400 MHz).

130
Figura 44 - Espectro de RMN COSY do composto Bp7 (MeOD, 400 MHz).

131
Figura 45 - Espectro de RMN HSQC do composto Bp7 (MeOD, 400 MHz).

132
Figura 46 - Espectro de RMN HMBC do composto Bp7 (MeOD, 400 MHz).

133
Tabela 15 - Dados espectroscópicos de RMN de 1H (400 MHz) para sarmentosina em CD3OD.

Bp7 Sarmentosina (Chen et al., 2016)
δH [Mult., J (Hz)] δC δH [Mult., J (Hz)] δC
Aglicona
1 4,52 ddt (14,0; 6,7; 1,1) 66,82 4,49 ddq (13,6; 6,4; 1,2) 68,5
4,64 ddt (14,0; 6,2; 1,3) - 4,60 ddt (13,6; 6,4; 1,2) -
2 6,70 tt (6,3; 1,5) 143,26 6,67 tt (6,4; 1,6) 144,7
3 - 115,16 - 116,8
4 4,18 q (1,2) 61,76 4,15 q (1,2) 63,2
5 - 116,70 - 118,1
β-D-Glicose
1’ 4,35 d (7,8) 102,77 4,32 d (8,0) 104,2
2’ 3,22 dt (10,4;5,2) 73,57 3,20 – 3,37 m 75,0
3’ 3,37 m 76,70 3,20 – 3,37 m 78,0
4’ 3,33 m 70,06 3,20 – 3,37 m 78,0
5’ 3,33 m 76,78 3,20 – 3,37 m 71,4
6’ 3,90 m 61,20 3,67 dd (12,0; 5,6) 62,6
3,70 m - 3,87 dd (12,0; 1,2) -
Fonte: Resultados experimentais em MeOD a 400 MHz e Chen e cols (2016) em MeOD a 400 MHz.
Para melhor caracterização e confirmação dessa substância foi realizada análise por EM,
obtendo [M + Na]+ m/z 298.1, confirmando a fórmula molecular como C11H17NO7,
corroborando com dados da literatura descritos por Chen e cols. (2016).
Todos os dados em conjunto sugerem que esse composto trata-se da sarmentosina, um
glicosídeo hidroxinitrila, isolada primeira vez isolada para plantas do gênero Kalanchoe. A
figura 47 ilustra a estrutura de sarmentosina.
Figura 47 - Identificação estrutural da sarmentosina.
Fonte: Autoria Própria.
A partir de frações purificadas da extrusão, foi identificado uma substância quase pura,
a sarmentosina, um glicosídeo hidroxinitrila descrito pela primeira vez para o gênero. Essas
frações foram submetidas a técnica de CLMP para se obter a sarmentosina isolada.
A respeito da sarmentosina, é importante salientar que não era um composto esperado,
pois não se tinha conhecimento desse tipo substância para plantas do gênero Kalanchoe ou

134
Bryophyllum. Trata-se de um glicosídeo γ-hidroxinitrila insaturado (γ-HNG) encontrado em

plantas cianogênicas, especialmente da família Crassulaceae, como também em borboletas e
traças (BJARNHOLT et al., 2012). Essa substância foi descrita pela primeira vez para a espécie
Sedum sarmentosum, em 1978, por Fang e cols (NISHIDA; ROTHSCHILD; MUMMERYT,
1994), e posteriormente em Sedum cepaea, em 1982 (NAHRSTEDT; WALTHER; WRAY,
1982), mas também já foi descrito para espécies de Rhodiola (YOSHIKAWA et al., 1996),
ambas pertencentes a família Crassulaceae, apresentando-se como um possível candidato a
marcador quimiotaxonômico para esta família, embora essa informação ainda não tenha sido
abordada na literatura até o momento.
Em relação a sua rota biossintética, constitui um derivado do aminoácido isoleucina,
sendo frequentemente encontrado com outros derivados HNG desse aminoácido como
rodocianosídeo A. Diferentemente dos α-HNGs, também conhecidos como glicosídeos
cianogênicos, não são tóxicos, pois não liberam o cianeto de hidrogênio a partir da hidrólise da
ligação glicosídica. Esse tipo de metabólito é importante na defesa contra insetos predadores e
também para estocagem de nitrogênio (BJARNHOLT et al., 2012; BJARNHOLT; MØLLER,
2008; NISHIDA; ROTHSCHILD, 1995; NISHIDA; ROTHSCHILD; MUMMERYT, 1994).
Em relação a sua atividade biológica, existem poucos relatos (BJARNHOLT et al., 2008).
Yoshikawa e cols (1996) mostraram que a sarmentosina e outros γ-HNG são responsáveis pela
inibição da liberação de histamina das células peritoneais de ratos em resposta alérgica,
podendo explicar a atividade anti-inflamatória de antiasmática de plantas do gênero Rhodiola.
5.3.2 Identificação do composto Bp8

O fracionamento conduzido por CPC, além de compostos isolados, ainda permitiu a
obtenção de frações purificadas que foram submetidas a outros processos de purificação para
obtenção de compostos isolados. Um composto vinílico foi obtido a partir da fração 97-131 da
4ª CPC. Esse composto foi descrito pela primeira vez para a família Crassulaceae por Almeida
e cols (2006) para a espécie Kalanchoe pinnata. Abaixo, segue a descrição da elucidação
estrutural do composto Bp8, realizada por meio dos espectros de RMN de 1H e 13
C, COSY,
HSQC e HMBC em MeOD.
No espectro de RMN de 1H (figura 48), o primeiro sinal a chamar atenção é novamente
referente a um sistema ABX. Os sinais são os duplo-dubletos em 5,23 ppm (J = 17,2 Hz) (Ha-
1) e 5,12 ppm (J = 10,2 Hz) (Hb-1), característicos de hidrogênios metilenos geminais, cada
um com integração para 1 hidrogênio. A constante de acoplamento sugere um sistema ABX e
o valor de deslocamento químico sugere a proximidade com uma insaturação. A parte X do

135
sistema é um sinal duplo-dubleto-dubleto em 5,88 ppm (J = 17,4; 10,5; 7,0 Hz) (H-2),
característico de hidrogênio vinílico, como integração de 1 hidrogênio. A aglicona dessa
substância é uma cadeia alifática com oito carbonos com um grupo vinílico na porção terminal.
Todos os hidrogênios e carbonos dessa cadeia estão descritos na tabela 16 e foram
atribuídos a partir dos experimentos de COSY e HSQC. Também é possível observar a presença
de dois açúcares devido a presença dos sinais de hidrogênios anoméricos H-1’ em 4,34 ppm
(dd; 7,1 e 4,5 Hz; i = 1) e H-1” em 4,34 ppm (dd; J = 7,1 e 4,5 Hz; i = 1). Todos os hidrogênios
dos dois açúcares foram atribuídos por meio dos dados de correlações de COSY e HSQC, na
qual foi possível identificar o primeiro açúcar como glicose e o segundo como arabinose. A
partir dos espectros de HMBC foi possível concluir que o primeiro açúcar está ligado ao C-3
pela presença da correlação entre este carbono 81,44 ppm e o hidrogênio anomérico H-1’ em
4,34 ppm (dd; 7,1 e 4,5 Hz) da glicose. Também é possível observar que os dois açúcares
estavam ligados na forma de dímeros por meio da correlação entre o hidrogênio anomérico H-
1” em 4,34 ppm (dd; 7,1 e 4,5 Hz) e o C-6 da molécula de glicose em 67,92 ppm. Após
comparação com os dados da literatura (ALMEIDA; MUZITANO; COSTA, 2006), a
substância foi identificada como 1-octen-3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→6)-β-glicopiranosideo
(figura 49).

136
Figura 48 - Espectro de RMN de 1H do Bp8 (MeOD, 400 MHz).

137
Tabela 16 - Dados espectroscópicos de RMN de 1H (400 MHz) para Bp8 em CD3OD.

Bp8 Almeida et al., 2006
δH [Mult., J (Hz)] δC δH [Mult., J (Hz)] δC
Aglicona
1 5,23 d (17,2) 114,75 5,16 dd (17,0. 1,1) 115,0
5,12 d (10,2) - 5,04 dd (10,3; 1,1) -
2 5,88 ddd (17,4; 10,5; 7,0) 139,51 5,80 ddd (17,0; 10,3; 6,2) 139,7
3 4,14 dd (12,8; 6,7) 81,44 4,04 d (6,2) 79,4
4 1,68 m 34,35 1,46 m 33,9
5 1,52 m 24,25 1,15 - 1,33 m 23,8
6 1,41 m 31,64 1,15 - 1,33 m 31,3
7 1,34 m 22,25 1,15 - 1,33 m 22,0
8 0,92 t (6,8) 12,98 0,85 t (6,2) 13,3
Glicose
1’ 4,34 dd (7,1; 4,5) 101,95 4,15 d (7,7) 101,7
2’ 3,22 d (7,8) 73,87 2,95 dd (7,8;7,7) 73,6
3’ 3,35 dd (5,3; 2,5) 76,64 3,08 m 76,7
4’ 3,63 m 70,92 3,02 m 70,1
5’ 3,38 m 75,41 3,26 m 75,6
6’ 4,06 s 67,92 3,85 dd (10,1; 3,1) 67,8
4,06 s - 3,64 dd (11,0; 6,0) -
Arabinose
1’ 4,34 dd (7,1; 4,5) 103,45 4,25 d (6,13) 103,0
2’ 3,61 m 70,21 3,32 m 70,5
3’ 3,55 m 72,70 3,26 m 72,3
4’ 3,74 d (4,5) 67,75 3,60 m 67,0
5’ 3,85 d (3,5) 65,04 3,65 m 64,4
3,56 m - 3,25 m -
Fonte: Resultados experimentais MeOD a 400 MHz.e Almeida e cols (2006) em DMSO-d6 a 200 MHz.
Figura 49 - Identificação estrutural do 1-octen-3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→6)-β-glicopiranosideo.

138

CLUE-DAD PARA QUANTIFICAÇÃO DOS FLAVONOIDES MAJORITÁRIOS DE B.
pinnatum
O desenvolvimento do método partiu de uma condição já desenvolvida por CLAE-DAD
para B. pinnata (FERNANDES et al., 2016), que foi otimizada para o CLUE. A transferência
de método foi realizada pelo software da Supelco® Analytical® HPLC Method Transfer
Calculator (Sigma-Aldrich®) (https://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/hplc/
method-transfer-calculator.html), e baseada na literatura (LANÇAS, 2009; MALDANER;
CRISTINA; FONTES, 2012; MALDANER; JARDIM, 2009). Adaptações foram realizadas
para se obter um método capaz de separar e avaliar os componentes do extrato hidroetanólico
de B. pinnatum.
Como descrito no tem 4.8 da metodologia deste capítulo, o método desenvolvido para a
análise dos flavonoides do EHEL utilizou uma coluna C18 Phenomenex® Kinetex (150 x 4,6
mm, 2,6 µm) equipada com uma coluna guarda C-18 Phenomenex® (4.0 × 2.0 mm i.d.). Como
fase móvel, foi desenvolvido um gradiente de ACN (solvente A) e TFA 0,3 % (B), com 7–15%
B, 0–3 min; 15–20% B, 3–12 min; 20–22% B, 12–30 min. O fluxo foi mantido constante em
0,7 mL/min, o volume de injeção de 12 µL e a detecção realizada a 254 e 340 nm com a
aquisição de espectros UV na faixa de 190 a 450 nm.
O método desenvolvido foi validado seguindo os parâmetros estabelecidos pela RDC nº
166 de 24 de julho de 2017, a saber: linearidade, precisão, exatidão, seletividade, robustez,
limite de detecção (LOD) e quantificação (LOQ). Como descrito na metodologia, a
quantificação foi realizada pelo método do padrão externo (BRASIL, 2017a). A metodologia
foi validada para a quantificação de três flavonoides: quercetina 3-O-α-L-arabinopiranosil-
(1→2)-O-α-L-ramnopiranosídeo (Bp1), canferol 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-
ramnopiranosídeo (kapinatosídeo) (Bp2) e quercetina 3-O-α-L- ramnopiranosídeo (quercitrina)
(Bp3). Nas figuras 13 e 20 deste capítulo, é possível encontrar os cromatogramas desenvolvidos
para análise dos flavonoides do EHEL de B. pinnatum.
A respeito da literatura, não foram encontrados trabalhos que tenham desenvolvido uma
metodologia validada para a quantificação dos flavonoides de B. pinnatum. Foram encontrados
trabalhos que quantificaram os flavonoides majoritários no extrato aquoso da espécie,
especialmente o Bp1 (quercetina 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-ramnopiranosídeo) e
o Bp3 (quercitrina ) por CLAE, no entanto, apenas foi realizada uma curva de calibração da
rutina e a quantificação dos flavonoides, expressos em termos de rutina, foi corrigida utilizando
uma fator de correção de massa molecular (fator de correção = MMflavonoide/MMrutina)

139
(MUZITANO et al., 2011; NASCIMENTO et al., 2013, 2018). Nesse contexto, esse trabalho
foi o primeiro a validar uma metodologia analítica por CLUE-DAD para a quantificação dos
flavonoides majoritários no EHEL de B. pinnatum, isto é, uma metodologia que seja além de
linear, também sensível, precisa, exata e robusta. A validação desses parâmetros é fundamental
para avaliação de qualidade no desenvolvimento de fitoterápicos.
Previamente ao início da validação, foi realizada o system suitability (verificação da
adequabilidade do sistema) do método desenvolvido para o EHEL de B. pinnatum de acordo
com os parâmetros estabelecidos na United States Pharmacopeia (USP) para garantir resolução
(r > 1,5), pratos teóricos, (P > 2000), fator de calda (T ≤ 2,0) e fator de capacidade (k’ ≥ 2,0)
para cada pico a ser validado e subsequentemente quantificado (USP, 2003). As análises foram
realizadas em triplicata com três replicatas para cada injeção e a média e o desvio padrão
relativo (DPR) foram calculados. Os valores obtidos estão descritos na tabela 17. O sistema
apresentou conformidade de acordo com a literatura.
Tabela 17 - Parâmetros de System Suitability

Flavonoide R t N k'
Bp1 1,767 ± 0,037 1,426 ± 0,602 51218,33 ± 429,712 7,520 ± 0,278
Bp2 2,114 ± 0,032 1,213 ± 0,035 39904,33 ± 304,733 7,869 ± 0,288
Bp3 2,820 ± 0,041 1,057 ± 0,005 48178 ± 356,215 10,545 ± 0,378
Legenda: R: resolução; t: fator de calda; N: número de pratos teóricos; k’: fator de capacidade. Dados expressos
como Média ± desvio padrão. Fonte: Resultados experimentais
Para validação da metodologia, o primeiro parâmetro analisado foi a seletividade. Foi

determinada por análise e comparação dos dados cromatográficos (tempo de retenção e pureza
de pico) e não visualização de co-eluições no EHEL das folhas de B. pinnatum com os
compostos isolados Bp1, Bp2 e Bp3 em triplicata. Os dados obtidos estão na tabela 10 abaixo.
É importante salientar também que o espectro UV foi também avaliado, mostrando-se
inalterado para os três picos avaliados. Dessa forma, o método foi capaz de distinguir os analitos
da matriz. Alguns estudos recentes seguem esse mesma metodologia para demonstrar a
seletividade de um método (DA SILVA et al., 2017; MOTTA; DA COSTA; BASTOS, 2017;
NGUYEN NGOC et al., 2018).
Tabela 18 - Parâmetros de seletividade avaliados.
Flavonoide Pureza de pico Tempo de retenção (tR)
Bp1 0,98 ± 0,01 19,20 ± 0,26
Bp2 0,95 ± 0,005 19,87 ± 0,28
Bp3 Não calculado 25,58 ± 0,20
Fonte: Resultados experimentais

140
Posteriormente, foi realizada a linearidade para os três flavonoides (Bp1, Bp2 e Bp3).
Neste trabalho, para construir a curva de calibração, a área do pico foi a resposta analítica
utilizada em função da concentração do analito. Foi calculado o coeficiente de correlação de
Pearson (r), que representa o grau de associação linear entre as variáveis. Quanto maior o valor
de r, mais forte é a correlação entre as duas variáveis e mais realista é o modelo (equação)
proposto (BRASIL, 2017b). O valor mínimo aceito para r é de 0,990, conforme disposto no §
3º do art. 27 da RDC 166/2017 (BRASIL, 2017a). Quanto mais próximo de 1,0, menor a
incerteza dos coeficientes angulares e lineares obtidos pelas curvas dos compostos, ou seja,
mais próximos os resultados são da realidade. Os gráficos gerados para cada flavonoides
individual, bem como seus valores de r, podem ser visualizados na figura 50.
Através das retas obtida (figura 50), os pontos testados podem ser observados,
confirmando assim a área do picos do cromatograma proporcionalmente crescente à medida
que a concentração dos flavonoides Bb1, Bp2 e Bp3 é aumentada. O coeficiente de correlação
para cada composto isolado foi maior que 0,99 como está descrito na RDC Nº 166/2017, com
DPR (desvio padrão relativo) menor que 5 % para todos os pontos.
A regressão linear também foi aplicada para soluções do EHL de B. pinnatum em 5
concentrações diferentes como descrito por Costa e cols (2016). A análise gerou uma reta para
cada tempo de retenção correspondente ao composto isolado, cujas equações foram originadas
e o coeficiente de regressão (r2) obtido, conforme apresenta do na figura 51. Nessa análise,
foram analisados Bp1, Bp2, Bp3 e também Bp4. O coeficiente r2 demonstrou-se satisfatório,
com DPR menor que 5 % para todos os pontos, para cada pico avaliado de acordo com os
critérios estabelecidos pela Anvisa (BRASIL, 2017a).
Essa estratégia de linearidade do extrato, como a realizada por Costa e cols (2016), não
é comum na literatura, mesmo artigos mais recentes, abordam uma linearidade com padrões
isolados ou mistura de padrões (NGUYEN NGOC et al., 2018; MESQUITA; MONTEIRO,
2018; MOTTA; DA COSTA; BASTOS, 2017; NGUYEN NGOC et al., 2018; DA SILVA et
al., 2017; CHU et al., 2012), que não reproduz a complexidade de uma matriz.
O parâmetro seguinte analisado foi a precisão, tanto a intra-dia (repetibilidade), quanto
a inter-dia (precisão intermediária), como descrito no item 3.8 da metodologia. Conforme
descrito na RDC 166/2017, o valor máximo aceitável de desvio padrão relativo para
repetibilidade e precisão intermediária deve ser definido de acordo com a metodologia
empregada, a concentração do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do método
(BRASIL, 2017a). Neste trabalho, a precisão foi realizada em três níveis de concentração
(média, alta e baixa) no mesmo dia (repetibilidade) e em três dias diferentes com analistas

141
diferentes (precisão intermediária), como descrito em Silva e cols (2017) e Mesquita e cols
(2018). Outros autores trabalharam com a mesma concentração e múltiplas injeções,
normalmente um n = 6, e utilizando dois dias diferentes de análise na avaliação da precisão
intermediária (MOTTA; DA COSTA; BASTOS, 2017; RAJAURIA, 2018). Ambos os métodos
são aceitos pela legislação brasileira (BRASIL, 2017a). A precisão foi expressa como desvio
padrão relativo (DPR) e apresentou uma variação adequada para o método dentro do
estabelecido pela RDC Nº 166/2017, para cada composto analisado (Bp1, Bp2 e Bp3), como
mostrado nas tabelas 19, 20 e 21. Adicionalmente, foi realizada a repetibilidade também para o
EHEL de B. pinnatum, como mostrado na tabela 22, que apresentou DPR menor que 5 % nas 3
concentrações do extrato, 1, 3 e 5 mg/mL, indicando a precisão das análises.
Figura 50 - Curva analítica da linearidade para cada flavonoide individual.

142
Figura 51 - Curva analítica da linearidade para cada flavonoide dentro do extrato.
Fonte: Resultados experimentais
A exatidão foi realizada pelo método da recuperação, no qual quantidades crescentes de

padrão são adicionadas ao extrato, como descrito previamente na metodologia, item 3.8,
baseado na RDC Nº 166/2017, para o caso de determinação da exatidão para matrizes
complexas. Nesse caso, utilizados três níveis de concentração diferentes (baixa, média e alta),
como visto na literatura (DA SILVA et al., 2017; MESQUITA; MONTEIRO, 2018). Outros
trabalhos utilizam o mesmo método da adição de padrão à matriz, mas em um mesmo nível de
concentração e realizando 6 leituras (CHU et al., 2012; RAJAURIA, 2018) , o que não é mais
aceito pela resolução vigente, que exige, no mínimos, nove determinações, dentro do intervalo
linear do método analítico. Outra forma de determinar a exatidão, é a adição de padrão à matriz,
após eliminação de todos os interferentes, ou seja, é como se todos os metabólitos fossem
retirados por uma extração prévia, e os padrões fossem adicionados, como metodologia descrita
por Mota, da Costa e Bastos (2017). Essa metodologia é descrita na RDC Nº 166/2017, mas
para produto terminado, e não para um IFAV (insumo farmacêutico ativo), que é o produto
deste trabalho. Logo, a metodologia escolhida para determinação da exatidão foi a mais
adequada segundo a Anvisa. A Anvisa não determina valor ou faixa de referência para

143
exatidão/recuperação, contudo, os resultados obtidos para cada flavonoide isolado, calculados

de acordo com a metodologia deste trabalho, item 3.8, estão em concordância com as diversas
metodologia descritas para quantificação de flavonoides (NGUYEN NGOC et al., 2018;
MESQUITA; MONTEIRO, 2018; MOTTA; DA COSTA; BASTOS, 2017; NGUYEN NGOC
et al., 2018; DA SILVA et al., 2017; CHU et al., 2012). As tabelas 19, 20 e 21 ilustram os
resultados da exatidão para cada flavonoide. É importante ressaltar também que para cada nível
de concentração avaliado em triplicata, foi obtido um DPR menor que 5 %.
Os limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) foram analisados por um dos
métodos que a RDC Nª 166/2017 recomenda, que é utilizando os parâmetros da curva de
calibração, e para isso, são utilizadas as fórmulas descritas nessa legislação para cada um dos
limites, como descrito na metodologia, item 4.8, utilizando os valores de δ (desvio padrão do
intercepto, representado por a na equação de regressão linear, de três curvas de calibração) de
e IC (representado por b na equação de regressão linear). Grande parte dos trabalhos recentes
em validação, utiliza os parâmetros da curva de calibração para determinação de LOD e LOQ
(DA SILVA et al., 2017; MESQUITA; MONTEIRO, 2018; MOTTA; DA COSTA; BASTOS,
2017; NGUYEN NGOC et al., 2018). Os dados de LOD e LOQ obtidos estão descritos nas
tabelas 19, 20 e 21.
Tabela 19 - Parâmetros de validação do método analítico para o Bp1.

Linearidade
Equação da Regressão Coeficiente de correlação
y = 463320x - 11163 0,9997
Precisão
b
Intermediária Repetibilidadea
DPR 50 % 100 % 150 % DPR 50 % 100 % 150 %
(%) 3,581 3,342 0,558 (%) 0,985 0,199 0,477
Exatidão
50 % 100 % 150 %
Recuperação (%)
102,387 98,443 83,131
LOD LOQ
0,0000087 µg/mL 0,0000263 µg/mL
Nota: a DPR da média das amostras analisadas no mesmo dia (n=3); b DPR da média das amostras analisadas em
3 dias diferentes (n=3). Fonte: Resultados experimentais.

144
Tabela 20 - Parâmetros de validação do método analítico para o Bp2

Linearidade
y = 91121x – 789,67 0,9996
Precisão
Intermediáriab Repetibilidadea
DPR 50 % 100 % 150 % DPR 50 % 100 % 150 %
(%) 1,742 1,090 1,024 (%) 1,109 2,253 0,382
Exatidão
50 % 100 % 150 %
Recuperação (%)
109,186 110,595 80,757
LOD LOQ
0,0007442 µg/mL 0,0022553 µg/mL
Tabela 21 - Parâmetros de validação do método analítico para o Bp3.

Linearidade
y = 21351x + 199,57 0,9997
Precisão
Intermediáriab Repetibilidadea
DPR 50 % 100 % 150 % DPR 50 % 100 % 150 %
(%) 3,465 3,314 1,445 (%) 2,224 2,628 1,707
Exatidão
50 % 100 % 150 %
Recuperação (%)
99,344 110,847 134,985
LOD LOQ
0,0019840 µg/mL 0,0060120 µg/mL
Tabela 22 - Parâmetros de validação do método analítico para EHEL de B. pinnatum.

Repetibilidadea
1 mg/mL 3 mg/mL 5 mg/mL
Bp1
0,159 0,160 0,138
Bp2
1,192 1,610 0,038
Bp3
1,097 0,131 0,384
Bp4
1,054 1,127 0,629
Nota: a DPR da média das amostras analisadas no mesmo dia (n=3). Fonte: Resultados experimentais.
A robustez do método analítico foi avaliada por injeções em triplicata do extrato com
variações de fluxo de fase móvel e temperatura do forno da coluna. Apesar de haver uma

145
pequena variação de tempo de retenção dos compostos, não houve alteração dos parâmetros de
system suitability (figura 52). Além disso, é importante destacar aqui que a diminuição do fluxo,
praticamente, não alterou o tempo de retenção do pico majoritário, mas causou um retardamento
na eluição dos demais picos. As alterações de tempo de retenção causadas pela mudança de
temperatura são esperadas devido a essa variável interferir na viscosidade da fase móvel e na
solubilidade dos compostos (LANÇAS, 2009).
Figura 52 – Cromatogramas obtidos do EHEL de B. pinnatum na análise da robustez.
Após a validação total do método desenvolvido, foram quantificados os flavonoides

Bp1, Bp2 e Bp3 a partir das curvas de calibração individuais determinadas para cada composto,
como pode ser visualizado na tabela 23.
Neste trabalho, o extrato foi avaliado em 5 concentrações diferentes (1, 2, 3, 4 e 5
mg/mL) em triplicata. A partir da média das áreas referente a cada pico, foi substituído o valor
de y da equação, para achar a concentração em µg/mL da substância dentro do extrato nas 5
concentrações testadas, e, finalmente, calculado a concentração de substância em mg/g de
extrato. Esse valor de mg/g de extrato foi transformado em porcentagem, ou seja, o percentual
de cada flavonoide podemos encontrar em 1 g de extrato. Vale salientar que o DPR para as
diversas concentrações dos extratos analisados se deteve abaixo de 5% indicando um
coeficiente de variância mínimo em relação à média obtida. Quanto ao aspecto da linearidade
da metodologia analítica desenvolvida, é visível pelos resultados obtidos que o método
encontra-se de acordo com as especificações da legislação nacional vigente (BRASIL, 2017a),
uma vez que é possível perceber que a concentração dos compostos isolados em relação a
concentração do EHEL de B. pinnatum é linear (figura 53).

146
Tabela 23 - Concentração dos compostos Bp1, Bp2 e Bp3 nas amostras do EHEL de B. pinnatum
Bp1 Bp2 Bp3
Conc. Conc. Conc.
mg/mL Conc. DPR Conc. Conc. DPR Conc. Conc. DPR Conc.
a (mg/g de (mg/g de (mg/g de
(µg/mL) (%) (%) (µg/mL)a (%) (%) (µg/mL)a (%) (%)
extrato) extrato) extrato)
1 25,100 0,153 25,100 2,510 2,485 1,171 2,485 0,249 3,318 1,106 3,318 0,332
2 48,950 0,083 24,475 2,448 4,939 1,654 2,470 0,247 6,605 0,489 3,303 0,330
3 73,813 0,158 24,604 2,460 7,593 1,601 2,531 0,253 10,065 0,132 3,355 0,336
4 94,951 0,208 23,738 2,374 9,914 0,095 2,479 0,248 13,046 0,241 3,262 0,326
5 118,731 0,137 23,746 2,375 12,406 0,038 2,481 0,248 16,342 0,385 3,268 0,327
Média 2,433 Média 0,249 Média 0,330
DP 0,059 DP 0,002 DP 0,004
DPR (%) 2,415 DPR (%) 0,970 DPR (%) 1,157
NOTA: a Média das amostras analisadas (n=3). Fonte: Resultados experimentais.
Figura 53 - Concentração (%) de cada flavonoide isolado no EHEL de B. pinnatum.

147
Os valores obtidos na quantificação desses flavonoides (figura 53) foram comparados

com outros trabalhos na literatura (MUZITANO et al., 2011; NASCIMENTO et al., 2013, 2015,
2018). Ambos foram quantificados no extrato aquoso de B. pinnatum coletado em diferentes
épocas do ano (primavera, verão, outono e inverno) por Muzitano e cols (2011), obtendo
resultados semelhantes para a época do verão, que segundo o artigo, é a época em que os
flavonoides estão em maior concentração na planta. Eles obtiveram, para essa estação do ano,
Bp1 a 2,02 %, Bp2 a 0,068 % e Bp3 a 0,241 % (MUZITANO et al., 2011). Apesar de bastante
semelhantes, ainda há uma diferença em termos de concentração, sobretudo, na concentração
do Bp2, em relação ao presente trabalho. Vários fatores podem interferir nos teores de
metabólitos em uma espécie vegetal (ALAERTS et al., 2010; TISTAERT; DEJAEGHER;
HEYDEN, 2011), nesse caso, pode-se citar a época e o local da coleta, além do método de
extração e solvente empregado (Muzitano trabalhou com extrato aquoso 1:4 p/v e nesse trabalho
trabalhamos com o extrato hidroetanólico a 50 % 1:1 p/v).
Outro trabalho bastante interessante que trata sobre a quantificação desses flavonoides,
foi o desenvolvido por Nascimento e cols (2018). Nesse estudo, eles otimizaram a metodologia
extrativa para a obtenção do flavonoide majoritário de B. pinnatum, o Bp1, no artigo chamado
de QAR (quercetina 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-ramnopiranosídeo), por meio da
alteração de temperatura e tempo de extração (líquido extrator: água). Para extração, foi
utilizada turbólise seguida de maceração com aquecimento. Na melhor condição, aquela cuja
temperatura utilizada foi 50 ºC (fator que aumenta a capacidade extrativa desse metabólito) e
18 min de tempo de extração, eles obtiveram 23,4 mg/g de extrato para Bp1, enquanto neste
trabalho, uma turbólise simples com EtOH 50 % durante 5 min sem alteração de temperatura,
foi possível obter 24,3 mg/g para a mesma substância. E mesmo como todas as alterações
testadas, nenhuma delas a chegou a ultrapassar a quantidade de Bp1 doseada no EHEL 50 %
produzido por nosso grupo de pesquisa para o desenvolvimento dessa tese, sugerindo que o
extrato obtido com uma diluição hidroetanólica a 50 % seja mais adequado para a obtenção dos
flavonoides de B. pinnatum, corroborando com os resultados obtidos por Matos (2010) em sua
dissertação de mestrado.
Outro fato interessante desse trabalho de Nascimento e cols (2018), é que a folha foi
seca por liofilização previamente a preparação do extrato, e o rendimento calculado a partir do
peso da matéria-prima vegetal seca e não fresca, o que pode aumentar bastante a massa pesada
para atingir a mesma proporção estabelecida. Assim, a proporção de 20 % p/v (20 g de folhas
secas para 100 mL de água destilada) pode sugerir um rendimento menor do que o mostrado se
tivesse sido realizado com as folhas frescas, devido à sua suculência. No presente trabalho foi

148
usado a proporção de 1:1 p/v, as folhas utilizadas eram frescas, portanto, foi usada uma
quantidade menor de planta para obter a mesma massa.
Por fim, considerando Bp1 como um flavonoide bioativo incomum e importante, nossos
achados são relevantes, especialmente porque as folhas de B. pinnatum constituem uma fonte
dessa substância (MUZITANO et al., 2011; NASCIMENTO et al., 2015, 2018). Alguns
trabalhos como o de Muzitano e cols (2011) e Nascimento e cols (2015 e 2018) investigaram
as influências do método extrativo, da época do ano e da suplementação de radiação UV no teor
desse composto no extrato aquoso de B. pinnatum, sugerindo que esse possa ser um marcador
específico para essa espécie.
5.5 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANLÍTICA POR RMN

PARA A QUANTIFICAÇÃO DE SARMENTOSINA
O objetivo dessa parte do trabalho foi desenvolver um método não destrutivo de rotina
para quantificar um glicosídeo hidroxinitrila isolado de B. pinnatum por espectroscopia de
RMN. Essa metodologia, apesar de ser bem utilizada na literatura científica e já constar em
compêndios internacionais como a USP 23 para quantificação de compostos e padronização
por fingerprint, ainda não é muito utilizada em empresas. No entanto, vem sendo bastante
difundida. Recentemente, a última revisão dos métodos gerais da Farmacopeia Brasileira 5ª
edição, segundo suplemento publicado em 2017, adicionou a técnica de RMN como ferramenta
tanto para análise quali como quantitativa, esta última sendo realizada pelos métodos absoluto
e relativo.
Além disso, essa ferramenta vem se mostrando um método rápido e de alto desempenho
para quantificar esse tipo de metabólito secundário, como no trabalho realizado por Pimenta e
cols (2014), no qual foi desenvolvido um método para quantificar prunasina e amigdalina,
glicosídeos cianogênios. Posteriormente, esse método validado poderá ser utilizado para a
quantificação dos flavonoides totais derivados de quercetina e canferol, bem como
quantificação desses compostos nos extratos do estudo metabolômico obtidos sob diferentes
condições de cultivo.
Para o desenvolvimento do método, os parâmetros tanto de aquisição como de
processamento foram cuidadosamente estudados e otimizados para obter um espectro
reprodutível para as análises como é descrito no item 3.9 da Metodologia. Esses parâmetros vão
garantir a reprodutibilidade das análises espectrais baseada na integração dos sinais de interesse.
(PAULI et al., 2005; SIMMLER et al., 2014).

149
Após a etapa de desenvolvimento e otimização do método de análise utilizando os

parâmetros de aquisição e processamento descritos no tópico 3.9, etapa necessária para obter
precisão e reprodutibilidade dos espectros para quantificação, foi realizada a validação do
método analítico por padronização interna. Isso pode ocorrer na ausência de materiais de
referência, podendo ser utilizados padrões internos produzidos de acordo com guias e registros
bibliográficos (BRASIL, 2017a). Um bom padrão interno tem que apresentar um pico de
ressonância de referência, preferencialmente singleto, em uma posição do campo distinta de
todos os picos da amostra; ser solúvel no solvente usado; sem peso equivalente protônico
(quando o peso dividido entre o número de hidrogênios que gera um pico de referência é baixo)
e não interagir com o composto em análise. A escolha do padrão interno será ditada pelo
espectro da amostra (BRASIL, 2017c).
Assim como para a quantificação dos flavonoides por CLUE-DAD, o método
desenvolvido por RMN foi validado seguindo os parâmetros estabelecidos pela RDC nº 166 de
24 de julho de 2017. Essa legislação não exclui a possibilidade de ser aplicada ao RMN, pois
no artigo 2º é dito que a resolução é aplicável a métodos analíticos empregados em insumos
farmacêuticos, medicamentos e produtos biológicos em todas as suas fases de produção, porém,
no 1º parágrafo desse artigo, é recomendado que os parâmetros de validação e seus respectivos
critérios de aceitação devem ser definidos de acordo com as características do analito e da
natureza do método (BRASIL, 2017a). Na figura 54 são mostrados os espectros do EHEL de
B. pinnatum (A), do sarmentosina (B) e do padrão interno cafeína (C).
O primeiro parâmetro avaliado foi a linearidade do método, apresentando um r2 de
0,9934, e equação da reta y = -1,3775 + 2,6068 (figura 55). A precisão intermediária e a
repetibilidade, expressas como desvio padrão relativo (DPR), apresentaram uma variação
adequada para o método, como mostrado na tabela 24. Os valores de LOD e LOQ foram
calculados pela fórmula, com δ (desvio padrão do intercepto, representado por a na equação de
regressão linear, de três curvas de calibração) de 0,169 e IC de 2,606 (representado por b na
equação de regressão linear), também estão descritos na tabela 24. A seletividade foi
determinada pela ausência de sobreposições entre os sinais a serem quantificados no espectro
de RMN de 1H (figura 56).
O método para quantificação da sarmentosina mostrou-se linear, seletivo e preciso, além
de ter-se revelado como uma metodologia rápida e confiável que permite a quantificação
simultânea de diferentes substâncias na mesma análise por meio da utilização de um padrão
interno.

150
Figura 54 - Espectros de RMN de 1H 400 MHz do extrato de B. pinnatum (A), da sarmentosina (B) e do padrão
interno cafeína (C) em MeOD:D2O (3:2, v/v).
Fonte: Resultados Experimentais.

151
Figura 55 - Curva analítica da linearidade para a sarmentosina.
Tabela 24 - Parâmetros de validação do método analítico para o sarmentosina.

Linearidade
y = -1,3775 + 2,6068 0,9934
Precisão
Intermediária Repetibilidade
DPR 50 % 100 % 150 % DPR 50 % 100 % 150 %
(%) 8,905 8,001 9,533 (%) 0,701 3,741 1,808
LOD LOQ
0,214 mg/mL 4,404 mg/mL
Figura 56 - Espectro de RMN de 1H 400 MHz do EHEL de B. pinnatum com o padrão interno
cafeína em MeOD:D2O (3:2, v/v).
Sarmentosina
Legenda: Parte ampliada → região entre 6,0 e 8,0 ppm; sinal singleto da cafeína (A); sinal triplo-tripleto da
sarmentosina (B). Fonte: Resultados experimentais

152
A quantificação por RMN foi realizada conforme Karkoula e cols (2012), sendo baseada
na razão da integração entre o sinal do próton vinílico do sarmentosina em 6,7 ppm e o sinal do
próton da cafeína em 7,9 ppm (situado estruturalmente entre dois nitrogênios). Devido aos
valores de deslocamentos químicos dos sinais escolhidos, a região trabalhada no espectro foi
entre 6,0 e 8,0 ppm a qual mostrou-se bem resolvida tornando-se viável a integração do sinal
sarmentosina e sua comparação com o pico do padrão interno. A cafeína foi escolhida como
padrão interno, pois não apresenta sobreposição do sinal usado como referência para
quantificação com o sinal do sarmentosina. E a mistura MeOD:D2O (3:2, v/v) foi usada por
obter o melhor espectro comparado as diluições em i. MeOD, ii. D2O e iii. MeOD:D2O (5:5,
v/v).
Por fim, o EHEL 50 % das folhas de B. pinnatum utilizado para desenvolvimento e
validação do método analítico, apresentou um teor de sarmentosina de 20,7 mg/g extrato, ou
2,07 % de sarmentosina. Essa quantificação foi realizada, substituindo o valor da integração
relativa do sinal do sarmentosina (0,895) na equação da regressão linear (figura 56 e tabela 24)
no valor do y, achando-se a concentração do sarmentosina (x) de 1,243 mg/mL em 60 mg/mL
de extrato. E por fim fazendo uma regra de três para encontrar a quantidade de sarmentosina
em mg/g de extrato.
É possível sugerir a sarmentosina como uma das substâncias majoritárias para B.
pinnatum, também podendo se tornar um marcador para a espécie. No entanto, por estar
presente também em K. laciniata, não pode ser usada como substância de diferenciação. Essa
mesma metodologia foi utilizada para dosear a sarmentosina nos extratos obtidos sob estresse
salino como será discutido mais adiante.

153
6 CONCLUSÕES
• Quatro flavonoides foram isolados simultaneamente por CPC, sobretudo a substância

majoritária da espécie (Bp1) com rendimento aproximado de 1,8 % a partir da fração aquosa e
de 17,5 % a partir de uma fração enriquecida em flavonoides, ambas obtidas do fracionamento
do EHEL das folhas de B. pinnatum utilizando como adsorvente o XAD-4;
• Os quatro flavonoides também foram isolados diretamente do EHEL das folhas de B.
pinnatum por CPC, com rendimento aproximado para Bp1 de 1,3 %, mostrando-se uma
metodologia eficiente para a obtenção de flavonoides diretamente do extrato bruto sem
fracionamento prévio;
• Os flavonoides isolados, quercetina 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-
ramnopiranosídeo (Bp1), canferol 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-ramnopiranosídeo
(Bp2) e quercitrina (Bp3), foram quantificados por CLUE-DAD no EHEL 50 % das folhas de
B. pinnatum a partir de metodologia desenvolvida e validada seguindo os parâmetros
estabelecidos na RDC Nº166/2017;
• O método desenvolvido por CLUE-DAD mostrou-se seletivo, linear, preciso, exato e
robusto, além de sensível devido aos limites de detecção e quantificação para os quatro
flavonoides apresentarem-se com valores baixos;
• O composto quercetina 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-ramnopiranosídeo (Bp1)
apresenta alto teor no EHEL após a quantificação por CLUE-DAD, sendo um candidato a
marcador específico da espécie;
• A sarmentosina, um glicosídeo hidroxinitrila, foi identificado por CLUE-EM/EM, pela
primeira vez para o gênero Kalanchoe ou Bryophyllum;
• A sarmentosina foi isolada pela primeira vez para a espécie através de fracionamento por
CLMP após enriquecimento de uma fração da extrusão por CPC, obtendo um rendimento de
0,061 %;
• O método desenvolvido por RMN para quantificação de sarmentosina no EHEL 50 % das
folhas de B. pinnatum foi validado obedecendo a RDC Nº 166/2017, e mostrou-se, seletivo,
linear, preciso e sensível;
• A sarmentosina foi quantificada por RMN, e seu teor no EHEL 50 % das folhas de B.
pinnatum, foi semelhante à de Bp1 determinada por CLUE-DAD.

154
Capítulo 3 - Estudo Fitoquímico de Kalanchoe laciniata

155
CAPÍTULO 3 - ESTUDO FITOQUÍMICO DE Kalanchoe laciniata
1 INTRODUÇÃO
Kalanchoe laciniata (L.) DC. é naturalizada do Brasil, e não endêmica, pois pode ser
encontrada em diversos biomas ou regiões brasileiras, especialmente nas regiões nordeste e
sudeste (GIUFFRE; GOEBEL; CADDAH, [s.d.]). Assim como B. pinnatum, é conhecida
popularmente como saião ou coirama, e usada largamente na medicina tradicional, na forma de
suco das folhas, por sua ação anti-inflamatória (AMARAL; SIMÕES; FERREIRA, 2005). O
nome da espécie aceito no Tropicos.org é Kalanchoe laciniata (L.) DC., além desse, também é
aceito no Flora do Brasil 2020 e no The Plant List o nome Kalanchoe crenata (Andrews) Haw.
Como sinônimo heterotípico, foi encontrado Kalanchoe brasiliensis Larrañaga (GIUFFRE;
GOEBEL; CADDAH, [s.d.]) e Kalanchoe brasiliensis Cambess (TROPICOS.ORG, [s.d.]).
Pela pesquisa nos site botânicos de referência, é possível perceber que ainda existe uma
discordância entre nomes aceitos e sinonímias para esta espécie.
Através de uma busca na literatura realizada com os dois nomes aceitos e o sinônimo
mais utilizado (K. brasiliensis), é possível constatar que, embora seja extenso o uso popular,
seus constituintes químicos ainda não foram totalmente esclarecidos. Além disso, há uma
escassez de estudos voltados para isolamento e elucidação de compostos, sendo a grande
maioria dos trabalhos relataram a presença de flavonoides (COSTA et al., 2015, 1994; DE
ARAÚJO et al., 2018; FERNANDES et al., 2016).
Os flavonoides de K. laciniata são particulares pois são agliconas metoxiladas
(patuletina e eupafolina) e substituídas nas posições 3 (anel C) e/ou 7 (anel A) por ramnoses,
na maioria das vezes, acetiladas em diversas posições (COSTA et al., 2015, 1994; DE ARAÚJO
et al., 2018; FERNANDES et al., 2016). Dentre os trabalhos encontrados, dois se destacam, o
primeiro realizado por Costa e cols. (1994), no qual sete substâncias provenientes do suco das
folhas frescas de K. brasiliensis, todos derivados glicosilados da patuletina (3,3’,4’,5,7-
pentahidroxi-6-metoxiflavona), foram isoladas e identificadas. O outro, é um artigo mais
recente no qual Costa e cols (2015) descreveram o isolamento de um metabólito secundário
majoritário derivado da patuletina e o quantificaram por CLAE-DAD no extrato hidroetanólico
das folhas da espécie.
A aglicona metoxilada patuletina (6-metóxiquercetagenina) é um flavonoide raro com
poucas fontes conhecidas no reino vegetal (BAICEANU et al., 2015). A partir da uma busca
rápida em um dos bancos de dados mais conhecidos, o Pubmed, com a palavra-chave
(patuletin), foi possível encontrar apenas 65 resultados, e quando se utiliza a estratégia de busca

156
(patuletin) AND (isolation), esse número foi reduzido para 28, dentre os quais, a maioria aborda
a patuletina conjugada com diversos outros açúcares, com exceção da ramnose. Apenas o artigo
de Costa e cols (1994) reporta derivados glicosilados da patuletina com ramnoses acetiladas
derivadas de K. brasiliensis (ou K. laciniata). Resultado similar ocorre com a eupafolina (6-
metoxiluteolina), quando a procura foi pela chave de busca (eupafolin) foram encontrados
apenas 38 resultados, e com a estratégia de busca (eupafolin) AND (isolation), apenas 13 artigos
foram encontrados e nenhum deles aborda ramnoses acetiladas. Apenas um artigo encontrado
(contudo não por meio dessas pesquisas), o de Liu e cols (1989), relata isolamento de
flavonoides ramnose acetilados derivados de patuletina e da eupafolina para K. gracilis. Essa
espécie apresenta distribuição restrita e, até o momento, relatada na China segundo
Tropicos.org. Não foram encontrados registros de K. gracilis no Flora no Brasil 2010.
Flavonoides derivados da patuletina já foram descritos para outra espécie do gênero, a
K. spathulata (GAIND; SINGLA; WALLACE, 1981). Flavonoides ramnose acetilados têm
sido descritos para B. pinnatum, no entanto, derivados da aglicona canferol e reportados como
minoritários (TATSIMO et al., 2012). A literatura relata que ramnoses acetiladas derivadas da
patuletina só foram descritas até o momento para K. laciniata e K. gracilis, respectivamente,
por Costa e cols (1994) e Liu e cols (1989).
Dessa forma, os flavonoides de K. laciniata podem ser candidatos adequados para se
tornarem marcadores da espécie, visto que, não são comuns a outras espécies do gênero
Kalanchoe, especialmente B. pinnatum. É importante ressaltar que apenas um estudo, realizado
por Costa e cols (2015) no nosso grupo de pesquisa, mostrou que essa substância pode ser usada
como marcador do extrato hidroetanólico 50 % das folhas de K. laciniata.
Assim como para a espécie B. pinnatum, para K. laciniata também não tem estudos
voltados para o controle de qualidade do IFAV (insumo farmacêutico ativo vegetal). Estudos
prévios do nosso grupo de pesquisa (DE ARAÚJO et al., 2018, 2019; FERNANDES et al.,
2016) tem demonstrando um importante potencial farmacológico dessa espécie.
Nesse contexto, foi utilizada a Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC) para obter
os compostos majoritários de K. laciniata de uma forma rápida e com um bom rendimento. Por
fim, é importante ressaltar que, além de conhecer melhor a constituição química de K. laciniata,
o objetivo desse fracionamento foi a obtenção em quantidades suficientes dos compostos
majoritários para serem usados como substâncias de referência para a quantificação do extrato,
para o estudo metabolômico e, também, para investigação da atividade biológica. Uma breve
revisão sobre a CPC pode ser encontrada na Fundamentação Teórica do Capítulo 1 desta tese.

157
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL

Isolar e caracterizar o (s) marcador (es) do extrato hidroetanólico a 50 % das folhas
frescas da espécie Kalanchoe laciniata.

• Isolar, por técnicas cromatográficas, especialmente a CPC, os flavonoides e outros
compostos do extrato hidroetanólico 50 % das folhas de K. lacioniata, e obtê-los em grande
quantidade;
• Identificar os compostos isolados do extrato hidroetanólico 50 % das folhas de K. lacioniata
por técnicas espectroscópicas como UV, EM e RMN.

158
3 METODOLOGIA
Essa parte do trabalho foi realizada em parceria com o Laboratoire de Pharmacognosie
(UMR CNRS 8638) da Université Paris Descartes – Paris V, sobre a supervisão do MCF-HDR
Professor Dr. Raphael Grougnet, em estágio doutoral realizado no período de um ano. As
análises por CLUE-EM/EM foram realizadas em parceria com a pesquisadora Dra. Aikaterini
Termentzi do Benaki Phytoptological Institute em Atenas, Grécia.

As folhas de Kalanchoe laciniata (L.) DC. foram obtidas em local de cultivo da Escola
Agrícola de Jundiaí (EAJ-UFRN), na cidade de Macaíba, possuindo como coordenadas
geográficas latitude: 5º 51’ 30” S e longitude: 5º 51’ 30” W. O Cultivo foi realizado no horto
de Plantas Medicinais da EAJ, com solo adubado com esterco bovino e rega diária. A coleta foi
realizada antes do florescimento. Para recuperação rápida da planta após o florescimento, as
partes mais secas e amareladas eram podadas, para que novos brotos surgissem mais rápido.
A coleta foi realizada em outubro de 2017. O material vegetal foi catalogado e
identificado pela botânica Profa. Dra. Maria Iracema Bezerra Loyola do Departamento de
Biologia da UFRN, onde foi depositada uma exsicata sob registro 5468. A autorização de coleta
foi obtida no Sistema de Autorização e informação em Biodiversidade (SISBIO), sob número
35017. Já a autorização do Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do
Conhecimento Tradicional Associado está sob número A7EA798 obtida 25 de março de 2018.
3.2 PREPARAÇÃO DO EXTRATO HIDROETANÓLICO DAS FOLHAS DE K. laciniata

A solução extrativa das folhas de K. laciniata foi obtida por meio do método
previamente padronizado por Matos (2009). A matéria-prima vegetal (folhas sem talos a fresco)
foi processada por turboextração em liquidificador industrial por 5 minutos com álcool etílico
PA 50%, na proporção 1:1, p/v (droga vegetal: solvente).
O extrato processado foi filtrado a vácuo, obtendo-se então o extrato hidroetanólico 50%
das folhas (EHE) K. laciniata (KL). O extrato foi submetido à evaporação da fase alcoólica sob
pressão reduzida com o auxílio de um evaporador rotatório (Buchi®) a temperatura não superior
a 45 ºC. O EH reduzido foi liofilizado obtendo-se o extrato liofilizado de K. laciniata (EHEL).
No processo de liofilização, as amostras foram previamente congeladas em freezer a -80 oC.
Para esta coleta, a partir de 4,8 kg de folhas frescas, foi obtido 70 g de EHEL (1,45 % de
rendimento).

159
3.3 ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

Antes de começar os processos de fracionamento, os extratos de K. laciniata foram
analisados preliminarmente por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) para investigação
do perfil fitoquímico, utilizando duas condições principais descritas na tabela 1 do item 4.3 do
capítulo 2. Após todos os processos cromatográficos para purificação e isolamento, os extratos,
frações e compostos obtidos também foram analisados por CCD para o acompanhamento das
análises.
4.4 ANÁLISES POR CLUE-EM/EM

O EHEL de K. laciniata foi analisado para investigação do perfil fitoquímico por
CLUE-EM/EM. No item 4.4 do capítulo 2 estão descritas todas as especificações do
equipamento, reagentes, fase estacionária e fase móvel utilizada, bem como o preparo das
amostras para solubilização e injeção no equipamento.
3.5 FRACIONAMENTO E ISOLAMENTO DOS COMPOSTOS
3.5.1 Isolamento por Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC)

Assim como descrito para B. pinnatum, os procedimentos por CPC foram realizados em
Cromatógrafo de Partição Centrífuga da marca Gilson® Armen® Spot equipado com duas
colunas (rotores) com volumes 250 mL (rotor 2) e 1 L (rotor 1), injeção manual com loop
variando até o volume de 50 mL.
Antes de iniciar o procedimento propriamente dito no equipamento, foi realizado um
pequeno teste em pequena escala em tudo de ensaio objetivando encontrar o melhor sistema
bifásico para separação desses compostos, ou seja, aquele que apresentasse uma melhor
separação dos compostos e tivesse o menor tempo de separação de fases. Os sistemas testados
foram os mesmos para B. pinnatum e estão descritos na tabela 2, item 4.5.2.1 do capítulo 2. De
maneira análoga a B. pinnatum, o melhor sistema foi a condição VII com pequena modificação
para grande escala, sendo 0,5 mL de ciclohexano (CHex) adicionado para acelerar a separação
de fases. Logo, a composição de AcOEt: EtOH: H2O:CHex (9:3:5,5:0,5, v/v/v/v) foi o sistema
escolhido (sistema VII).
O processo de separação por CPC para a espécie K. laciniata está descrito na tabela 25.
O sistema solvente utilizado foi o VII e o equipamento operado em modo ascendente. A fase
estacionária (fase inferior) foi carregada usando uma rotação de 500 rpm e fluxo de até 100
mL/min, sendo o rotor preenchido com 1,5 volume de coluna. A fase móvel (fase superior) foi

160
carregada com rotação de 1200 rpm e fluxo de até 20 mL/min até atingir o equilíbrio entre as
duas fases. As amostras utilizadas para separação por CPC foram dissolvidas no sistema
solvente compostos por 80 % de fase inferior e 20 % de fase móvel. Após coletar todas as
frações com a fase móvel, foi realizada extrusão da fase estacionária e as frações também foram
coletadas. Após uso, a limpeza do rotor foi sempre realizada com MeOH:H2O (1:1), e os
primeiros 300 mL coletados separadamente para verificar se não havia nenhuma substância
retida.
Tabela 25 - Procedimentos realizados por CPC para a espécie K. laciniata.
Massa Vol. Fluxo FE Vol. Fr.
Amostra Fluxo FM
Código Rotor da Fr. N Ext. Ext. n
utilizada (mL/min)
amostra (mL) (mL/min) (mL)
1ª CPC KL 1 Ex. HE KL 10 g 13 20 121 60 30 50
Legenda: CPC – Cromatografia de Partição Centrífuga; Vol. – volume; Fr. – Frações; N – número de
frações coletadas; FM – Fase móvel; FE – Fase Estacionária; Ext. – Extrusão; Ex. HE KL – extrato hidroetanólico
de K. laciniata. Fonte: Autoria própria.
3.5.2 Isolamento por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Preparativa (CLAE prep)
Foram selecionadas três frações ricas em flavonoides da 1ª CPC KL para o isolamento
por CLAE em escala preparativa. Para obter sucesso nessa técnica, é necessário previamente
desenvolver o método de separação por CLAE analítica, e posteriormente realizar um scale-up
para maiores proporções.
Assim, as três frações foram analisadas em CLAE-DAD, utilizando o Cromatógrafo
Líquido de Alta Eficiência da marca Merck-Hitachi®, modelo Prostar, com bomba quaternária,
detector de arranjos de fotodiodo (DAD) e autoinjetor. Para a análise dos flavonoides das
frações foi utilizado o método com coluna C18 Phenomenex® (250 x 4,6 mm, 5 μm), com um
gradiente de fase móvel de acetonitrila (solvente A) e ácido acético 0,3 % (B), com 7-15 %, de
0-5 min; 15-24 %, de 5-35 min; 24-25 %, de 35-43 min; 25-30 %, de 43-60 min (FERNANDES
et al., 2016). O fluxo foi mantido constante em 0,7 mL/min e a detecção realizada a 254 e 340
nm com a aquisição de espectros UV na faixa de 200 a 800 nm. O volume de injeção foi de 20
μL. O método de eluição (ou sistema solvente/fase móvel) foi otimizado para obter uma melhor
separação dos compostos. As frações analisadas foram solubilizadas em MeOH:H2O (1:1, v/v)
na concentração de 100 μg/mL e filtradas em membranas de 0,45 μm (MillexTM, Merck®).
As condições de cada procedimento por CLAE em escala preparativa estão descritas
nas tabelas 26 e27. O Cromatógrafo líquido preparativo utilizado foi um sistema composto por
uma bomba binária Armen-Gilson®, com injetor manual, detector UV-Vis Buchi® e coletor de
frações Buchi® C-660. As amostras para isolamento em escala preparativa foram solubilizadas

161
em MeOH:H2O (1:1, v/v) para atingir a concentração máxima de 1 mg/mL, e então filtradas em
membranas de 0,45 μm (MillexTM, Merck®).
Tabela 26 - Procedimentos realizados por CLAE prep para a espécie K. laciniata.
Amostra Massa da Fase estacionária Fase móvel Fluxo Vol
Código Injeções n
utilizada amostra FE FM FM Fr.
1ª CLAE Fr 11-19/
149,1 mg Coluna preparativa 3 13
prep KL 1ª CPC KL
C18 Macherey-
2ª CLAE Fr 20-24/ 45 20
98,5 mg Nagel®, Modelo Tabela 27 2 13
prep KL 1ª CPC KL mL/min mL
Nucleoder, 250 x
2ª CLAE Fr 25-32/
99,3 mg 32 mn, 5 µm 1 9
prep KL 1ª CPC KL
Legenda: CLAE prep – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Preparativa; KL – Kalanchoe laciniata; CPC –
Cromatografia de Partição Centrífuga; Vol. – volume; Fr. – Frações; N – número de frações coletadas; FM – Fase
móvel; FE – Fase Estacionária. Fonte: Autoria própria.
Tabela 27 - Fases móveis utilizadas para cada procedimento de CLAE em escala preparativa para K. laciniata.
Fase Móvel
Código
A (%) B (%) Tempo (min)
93 7 0
82 18 5
1ª CLAE prep KL
78 22 20
76 24 50
84 16 0
82 18 10
81 19 30
2ª CLAE prep KL
78 22 50
78 22 60
75 25 70
93 7 0
82 18 5
2ª CLAE prep KL
80 20 35
78 24 50
Legenda: CLAE prep – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Preparativa; KL – Kalanchoe laciniata; A –
Água Milli-Q®; B – Acetonitrila (ACN); min - minuto. Fonte: Autoria própria.
3.5.3 Isolamento por Cromatografia Líquida de Média Pressão (CLMP)

Assim como para B. pinnatum, o isolamento por CLMP foi realizado com o objetivo de
obter a substância sarmentosina, um glicosídeo nitrila descrito pela primeira vez para o gênero.
Para esse objetivo um processo de separação foi realizado com uma fração da 1ª CPC KL, como
descrito na tabela 28.
As amostras foram solubilizadas em 40 mL de MeOH e levada a secura total com sílica
gel 60 (70-200 mesh) na proporção 1:1 (p/p – amostra:sílica) utilizando evaporador rotatório
Buchi® a temperatura não superior a 40 ºC. As condições de fase móvel e especificações da
coleta de frações estão descritas na tabela 29.

162
Tabela 28 - Procedimento realizado por CLMP para a espécie K. laciniata.

Amostra Massa da Dimensões da Fase Fluxo Volume
Código Adsorvente N
utilizada amostra coluna (suporte) móvel (mL/min) (mL)
Fr 35-36 sílica gel 60
Tabela
1ª CLMP BP Ext/ 1ª CPC 701,3 mg cartucho de 40 g (20-45 µm) 15 à 20 15 195
12
KL
Legenda: CMPLC – Cromatografia Líquida de Média Pressão. BP – Kalanchoe pinnata.
Tabela 29 - Especificações de fase móvel e amostras da 1ª CLMP de K. laciniata.

II AcOEt: MeOH (98:2) 100 mL
III AcOEt: MeOH (95:5) 100 mL
IV AcOEt: MeOH (90:10) 100 mL
V AcOEt: MeOH (85:15) 400 mL
VI AcOEt: MeOH (80:20) 200 mL
VII AcOEt: MeOH (75:25) 100 mL
VIII AcOEt: MeOH (70:30) 100 mL
IX AcOEt: MeOH (60:40) 100 mL
X AcOEt: MeOH (50:50) 100 mL
XI AcOEt: MeOH (40:60) 100 mL
XII AcOEt: MeOH (20:80) 100 mL
XII MeOH 100 % 100 mL
Legenda: AcOEt: Acetato de Etila; MeOH: metanol.
As frações foram analisadas por CCD com as condições descritas na tabela 1 do capítulo
2, e quando necessário foi realizada análise por RMN, possibilitando a identificação do
isolamento de sarmentosina também das folhas de K. laciniata.
3.6 ANÁLISE POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN)

As frações e compostos isolados foram analisadas por Ressonância Magnética Nuclear
(RMN) em um equipamento Bruker® de 400 MHz. Todas as especificações de análise estão
descritas no item 4.6 do capítulo 2.
3.7 ANÁLISE POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS (EM)

Frações e compostos isolados também foram analisados em Espectrômetro de Massas
(EM) por injeção direta em um equipamento Waters® Micromass® LCT Premier™ TOF Mass
Spectrometer. A massa de alta resolução foi obtida em um espectrômetro de massas Q-TOF1
ESI (Waters®). Todas as especificações de análise estão descritas no item 4.7 do capítulo 2.

163
4.1 ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS

A partir dos cromatogramas obtidos por CCD do EHEL, revelados com vanilina
sulfúrica (figura 57) e por meio de comparação com a literatura (WAGNER; BLADT, 1996),
foi observada também a presença marcante de flavonoides. Além disso, foi possível visualizar
a presença de outros tipos metabólitos que parecem ser taninos, devido a coloração rosa no
ponto de aplicação. Essa análise foi realizada para caracterização do perfil fitoquímico
previamente aos processos de fracionamento e isolamento de compostos, e serviu como base
para a escolha dos métodos de purificação.
Figura 57 - CCDs dos extratos hidroetanólicos de K. laciniata.
Legenda: Fase móvel: (A) acetato de etila: ácido fórmico: MeOH: H2O (10:0,5:0,6:0,2, v/v/v); (B) acetato de etila:
ácido fórmico: MeOH: H2O (10:0,5:0,6:0,2, v/v/v); Adsorvente: gel de sílica 60 F254; Revelador: (a) vanilina
sulfúrica + aquecimento e (b) UV 254 nm. BP – B. pinnatum. Fonte: Resultados Experimentais
Na análise por CLUE-EM/EM (figura 58) foi possível confirmar a presença dos
flavonoides sugeridos pela literatura (COSTA et al., 2015, 1994; DE ARAÚJO et al., 2018;
FERNANDES et al., 2016). No fragmentograma, todos os compostos que eluem após 8 min de
tempo de retenção foram identificados como fenóis, principalmente flavonoides do tipo O-
glicosídicos, como descrito por Fernandes e cols (2016). Foi possível isolar os íons das
agliconas m/z 333 e 317, relativa à estrutura da patuletina e da eupafolina, respectivamente. Os
açúcares conjugados com essas estruturas são hexoses (como a glicose), pentose (como

164
arabinose) e desóxi-hexoses (como a ramnose). Os compostos foram identificados com base no

seu espectro de massas dos íons precursores e íons produtos nos modos MS1, MS2 e MS3.
Figura 58 - Cromatograma CLUE-EMAR/EM do EHEL de K. laciniata (A) modo negativo e (B) modo
positivo.
Legenda: FE: coluna C18 Hypersil Gold UPLC (100 x 1,9 mm, 2,1 µm); FM: gradiente ACN: ácido fórmico 0,1%;
fluxo: 0,22 mL/min; eluição acompanhada nos modos negativo (A) e positivo (B) (item 3.4). Fonte: Resultados
experimentais.
Nesse fragmentograma, tanto no modo positivo quando no negativo, foram observados

dois picos majoritários no tempo de retenção de 2,37 e 1,83 min, , assim como observado para
B. pinnatum. Para esses dois picos a massa do íon molecular é 320.0989 [M-H]- para o modo
negativo, sugerindo uma fórmula molecular de C12H18O8N, e 276.1079 [M+H]+para o modo
positivo, o que sugere uma fórmula molecular de C11H18O7N. O estudo do mecanismo de
fragmentação desses dois picos permitiu confirmar que se trata também da sarmentosina. É a
primeira vez que esse composto é detectado no EHEL das folhas frescas de K. laciniata, embora
já descrito para outras espécies da família Crassulaceae (BJARNHOLT et al., 2012;
NAHRSTEDT; WALTHER; WRAY, 1982; NISHIDA; ROTHSCHILD; MUMMERYT,
1994). Além disso, estudos que investiguem a composição química de K. laciniata são escassos
na literatura científica. Esse fato foi importante para determinar o interesse no seu isolamento.

165
4.2 FRACIONAMENTO E ISOLAMENTO

Em estudos prévios realizado por nosso grupo de pesquisa, alguns flavonoides foram
isolados em pequenas quantidades por meio de técnicas cromatográficas clássicas. Por
conseguinte, uma marcha de isolamento foi desenvolvida para obter quantidades suficientes
dessas substâncias para serem caracterizadas e utilizadas como marcadores das espécies, e,
também para avaliar a atividade biológica com o intuito de caracterizar o(s) marcador(es)
ativo(s).
Ao contrário do processo realizado para B. pinnatum, para K. laciniata, o processo de
fracionamento foi realizado diretamente por CPC a partir do EHEL das folhas da espécie. A
partir de 10 g de EHEL de K. laciniata, foi realizada uma CPC cujas condições de análise estão
descritas no item 3.5.1 deste capítulo, obtendo-se 14 subfrações, dentre as quais, após análise
por CCD e RMN, três frações (5, 6 e 7) apresentaram perfil químico enriquecido em
flavonoides. Essas três frações foram submetidas a isolamento por CLAE preparativa de acordo
com as condições descritas 3.5.2 deste capítulo. Foram isoladas 11 substâncias de K. laciniata,
nomeadas de Kl1 a Kl11, como descrito na figura 59.
Assim como para B. pinnatum, a partir de frações purificadas da extrusão também foi
identificada uma outra substância, denominada Kl11, um glicosídeo hidroxinitrila descrito pela
primeira vez para o gênero Kalanchoe. Para a obtenção dessa substância pura, foi utilizada a
técnica de CLMP a partir da fração 35-36 da extrusão da 1ª CPC KL utilizando as condições
anteriormente descritas.

166
Figura 59 - Resumo do processo de isolamento conduzido para K. brasiliensis.
Legenda: Composto Kl1 à Kl11. Fase móvel para análise das CCDs: AcOEt: HCOOH: MeOH: H2O
(10:1,5:1,6:0,5, v/v/v/v) e revelação com Vanilina sulfúrica + aquecimento. Fonte: Autoria própria baseada em
resultados experimentais.

DE K. laciniata
As frações e substâncias isoladas procedentes dos processos cromatográficos foram
analisadas por RMN em um equipamento Bruker® de 400 MHz, como descrito no item 3.9
deste Capítulo. Dentre as 11 substâncias isoladas, sete (Kl1 a Kl6 e Kl11) foram analisadas por
RMN de 1H e EM/EM, e para alguns compostos já foram obtidos os espectros de RMN de 13C
e bidimensionais, no entanto, ainda não foi realizada interpretação e elucidação completa de
todos e comparação com a literatura. Apenas o composto Kl2 foi elucidado.
A partir da análise preliminar dos espectros realizadas até a agora, pelos dados de RMN
de 1H e EM/EM e comparação com a literatura (MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970;
COSTA et al., 1994) é possível observar que as substâncias Kl1 a Kl7 tratam-se de flavonoides
glicosilados derivados da aglicona metoxilada patuletina (figura 60), nos quais, a molécula de
açúcar é a ramnose, e, na maioria dos casos está acetilada em posições diferentes. Dentro deste
contexto, no que diz respeito a variedade estrutural, é possível afirmar que são compostos
bastante semelhantes entre si, com pequenas modificações estruturais, apenas por um H

167
(hidrogênio) ou uma OH (hidroxila), ou até mesmo por posições diferentes da acetilação na

molécula de ramnose, apresentando-se muitas vezes como isômeros de posição.
Figura 60 - Estrutura da patuletina.
Fonte: Autoria própria
A patuletina é resultante da metoxilação na posição 6 da quercetagenina, um flavonoide

trihidroxilado no anel A. As hidroxilas em 5 e 7 do anel A são formadas durante a biossíntese
inicial do flavonoide, no entanto, embora sejam pouco comuns as hidroxilas em 6 e 8, também
podem ser encontradas (FORKMANN, 1991). Enzimas como a O-metiltransferase transferem
o grupo metil da S-adenosilmetionina para grupos hidroxílicos dos flavonoides (EBEL;
GRISEBACH, 1988; AGUIAR et al., 2007), no caso, para a formação da patuletina, a enzima
catalizadora seria a flavonol 6-O-metiltransferase ou metilquercetagetina 6-O-metiltransferase
(KEEG). Além disso ramnoses acetiladas também são incomuns na literatura. A acetilação
ocorre no final da rota biossintética dos flavonoides para aumentar a solubilidade, normalmente
esterificações com as hidroxilas dos açúcares ligados aos flavonoides (AGUIAR et al., 2007).
Para os flavonoides de K. laciniata, as acetilações mais comuns são nas posições 3 e 4 das
ramnoses (COSTA et al., 1994).
Flavonoides derivados da patuletina já foram descritos para outra espécie do gênero, K.
spathulata (GAIND; SINGLA; WALLACE, 1981). Flavonoides ramnose acetilados têm sido
descritos para B. pinnatum, mas derivados da aglicona canferol e reportados como minoritários
(TATSIMO et al., 2012). No entanto, uma busca rápida na literatura mostrou que ramnoses
acetiladas da patuletina só foram descritas até o momento para K. brasiliensis e K. gracilis,
respectivamente por Costa e cols (1994) e Liu e cols (1989), dessa forma, tornando-se como
bons candidatos a marcadores para a espécie, mas apresentando-se como diferenciadores em
relação a maioria das outras espécies, especialmente B. pinnatum. As características peculiares

168
desses flavonoides são importantes para atribuir um perfil característico a essa espécie e,
também para serem utilizados como marcadores, ajudando no controle de qualidade do IFAV
de K. laciniata.
A substância Kl2 foi elucidada a partir da técnica de RMN. Para a elucidação desta
molécula os dados obtidos por RMN foram comparados com dados da literatura: Mabry;
Markram; Thomas (1970), Breitmaier e Voelter (1984), Costa, Jossang e Bodo (1994), Trevisan
e cols (2002).
A análise de RMN de 1H de Kl2 foi realizada em 400 MHz, utilizando MeOD como
solvente (figura 61). O espectro de RMN de 13C de Kl2 foi realizado em 400 MHz, utilizando
MeOD como solvente (figura 2).
O espectro de RMN de 1H mostrou a presença de 29 hidrogênios e apresentou sinais
característicos de agliconas de flavonoides entre 7,5 e 6,6 ppm. Nesta região foram observados
quatro sinais, cada um com integração relativa a um hidrogênio. No espectro de RMN de 13C
foram observados 32 sinais, 16 atribuídos à aglicona e 16 atribuídos aos carbonos das duas
unidades de ramnose. Os sinais observados em 178,98 ppm, entre 158,58 e 106,06 ppm, em
98,60 e 61,00 ppm correspondem aos deslocamentos químicos para os carbonos da aglicona.
O espectro de RMN de 1H apresentou sinais característicos de agliconas de flavonoides
entre 7,36 e 6,22 ppm. Foi possível observar um sinal em 6,96 ppm que trata-se de um dubleto
com constante de acoplamento J igual a 8,24 Hz, que foi atribuída ao H-5’ (anel B). Em um
campo um pouco mais desprotegido, 7,36 ppm, observa-se um dubleto (H-6’), que apresenta J
de 8,27 Hz. O quarto sinal observado é um singleto situado em 7,41 ppm (H-2’). Esses sinais
são compatíveis com um acoplamento orto. Dessa forma, o padrão de sinais e multiplicidade
observadas são compatíveis com um anel B 3’,4’-di-hidroxilado. O dubleto referente ao H-5’ é
observado em um campo mais blindado que o dubleto de H-6’ e o singleto de H-2’, devido ao
efeito mesomérico da hidroxila livre em C-4 e da influência da desblindagem do anel C sobre
os H-2’ e H-6’. Em relação ao anel A, o sinal que se encontra no campo mais protegido, situado
em 6,66 ppm é do tipo singleto e foi atribuído ao H-8, sugerindo um anel A pentassubistituído.
Foi encontrado também um sinal sugestivo de uma metoxila na posição 6 em uma região mais
protegida, um singleto em 3,93 ppm com integração para três hidrogênios, caracterizando uma
posição meta em relação ao H-8. Assim, com base no espectro RMN de 1H foi possível sugerir
a aglicona como sendo o flavonol patuletina (6-metoxiquercetina ou quercetagetina 6-metill
éter) (figura 61).

169
Figura 61 - Espectro de RMN de 1H do flavonoide Kl2 (MeOD, 400 MHz).

170
13
No espectro de RMN de C (figura 62), os carbonos anoméricos, ou seja, o C-1 do
açúcar, em flavonoides O-glicosilados aparece na região entre 112 e 98 ppm, que pode não ser
facilmente definido devido aos sinais de C-6 e C-8 da aglicona em flavonoides 5,7-hidroxilados
(AGRAWAL; BANSAL, 1989). Os sinais em 98,88 ppm e em 16,08 ppm atribuídos aos
carbonos anoméricos C-1” e metila C-6”, respectivamente, confirmaram a presença de uma O-
glicosilação, sugerindo a presença de uma unidade de ramnose, que foi confirmada por
experimentos bidimensionais. O restante dos sinais das moléculas de açúcar aparece entre 60 e
85 ppm (AGRAWAL; BANSAL, 1989). É importante ressaltar que o sinal de C-5 da ramnose
próximo a 69 ppm, indica que trata-se de uma α-ramnose (AGRAWAL; BANSAL, 1989). O
C-5” está em 68,15 ppm indicando que a primeira unidade de ramnose se trata de uma α-
ramnose. A segunda unidade de ramnose foi observada pela presença de um sinal metila em C-
6’” com deslocamento químico em 16,67 ppm e do carbono anomérico está situado em 101,21
ppm. Adicionalmente, há dois sinais em 171,24 e 171,14 ppm referentes aos carbonos das
carbonilas dos grupos acetil que estão ligados aos açúcares. Técnicas de RMN bidimensionais
de HSQC e HMBC comprovaram a presença de uma segunda unidade de uma α-ramnose.
A tabela 30 mostra os deslocamentos químicos de RMN de 1H e de 13C em MeOD, para
o flavonoide Kl2.
As técnicas de RMN bidimensionais são muito importantes para conseguir se
estabelecer correlações entre hidrogênios que estão acoplados 2-3JH-H (COSY); correlação direta
entre os núcleos de carbono e hidrogênio (HMQC) e correlação a longa distância entre os
núcleos de carbono e hidrogênio (HMBC). Nas técnicas de HSQC e HMBC, o eixo horizontal
corresponde aos δH e o eixo vertical aos deslocamentos δC (PAVIA et al., 2012;
SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2012). Os dados de COSY, HSQC e HMBC serão
apresentados nas figuras 3, 4 e 5.

171
Figura 62 - Espectro de RMN de 13C do composto Bp7 (MeOD, 400 MHz).

172
Pela observação do espectro de correlação de COSY e HSQC, foi possível caracterizar,

a partir dos hidrogênios anoméricos, a sequência dos hidrogênios e carbonos referentes às
unidades de açúcar e confirmar os sinais (figuras 63 e 64). Também foi possível visualizar sinais
de hidrogênio que também estavam sobrepostos como os de H-2” e H-2’”, dubleto, 4,27 ppm,
J1=13,6), os sinais de H-4”’ (dubleto, 3,78 ppm, J1=5,9 Hz) e H-5’” (dubleto de dubleto, 3,74
ppm, J1=6,5 Hz), e o sinal de H-4” (dubleto, 4,84 ppm, J1=9,9 Hz) que estava sobreposto ao
sinal do solvente (4,87 ppm). Para entender melhor o espectro de HSQC, na figura 4 foi feita
uma ampliação na região das unidades de açúcar.
Pelos dados que foram possíveis retirar do espectro de HMBC (figura 65), sugere-se que
o sinal do hidrogênio anomérico (H-1”) em 5,53 ppm esteja correlacionado com C-3 (134,39
ppm) da aglicona patuletina, sendo esta uma ligação O-glicosilada. É possível observar ainda
que a posição C-7 (154,81 ppm) do anel C da aglicona está correlacionada com um hidrogênio
anomérico, o H-1’’’ (5,62 ppm), sugerindo uma glicosilação também nessa posição. Dessa
forma, espectro de HMBC sugere a presença de glicosilações em diferentes lugares da
molécula, em C-3 e C-7. Além disso, com a análise do espectro de HMBC, ainda é possível
sugerir que a unidade de ramnose ligada ao C-3 esteja acetilada em C-4”, uma vez que o H-4”
(4,86 ppm) está correlacionado com o carbono da carbonila deste grupo (171,14 ppm). E por
fim, que a unidade de ramnose ligada ao C-7 esteja acetilada na posição C-3”’, devido a
correlação encontrada entre a carbonila deste grupo (174,24 ppm) e o H-3”’ (5,22 ppm). Essas
correlações podem ser visualizadas na figura 65.

173
Figura 63 - Espectro de RMN Cosy do flavonoide Kl2 (MeOD, 400 MHz e 100 MHz).

174
Figura 64 - Espectro de RMN HSQC do flavonoide Kl2 (MeOD, 400 MHz e 100 MHz).

175
Figura 65 - Espectro de RMN HSQC do flavonoide Kl2 (MeOD, 400 MHz e 100 MHz).

176
Capítulo 3 - Estudo Químico de Kalanchoe laciniata
A análise do conjunto de espectros foi suficiente para elucidação estrutural completa de

Kl2. Os dados obtidos pelos espectros de RMN foram comparados com a literatura (COSTA et
al., 1994; ROSSI-BERGMANN et al, 1997; TREVISAN et al., 2006), e os sinais observados
nos espectros sugerem se tratar de uma das substâncias isoladas para esta espécie por Costa e
cols (1994), o composto 2, identificado patuletina 3-O-(4”-O-acetil-α-L-ramnosil)-7-O-(3”’-O-
α-L-ramnopiranosídeo). A figura 66 mostra a estrutura proposta até o momento para Kl2. É a
segunda vez que esse composto é relatado na literatura para esta espécie, e até o momento não
foi encontrado em outra planta, podendo vir a se tornar um marcador específico para a espécie.
Tabela 30 - Dados espectroscópicos de RMN de 1H (400 MHz) para Kl2 em MeOD.

Kl2 Composto 2 (Costa et al., 1994)
H δH [Mult., J (Hz)] δC δH [Mult., J (Hz)] δC
Patuletina
2 - 158,58 - 159,7
3 - 134,39 - 135,7
4 - 178,98 - 179,4
5 - 148,75 - 149,8
6 - 129,74 - 130,8
7 - 154,81 - 155,9
8 6,66 s 98,58 6,66 s 99,7
9 - 156,42 - 157,4
10 - 106,06 - 107,2
1’ - 121,30 - 122,6
2’ 7,41 s 115,50 7,39 d (2,3) 116,9
3’ - 145,29 - 146,4
4’ - 148,75 - 149,8
5’ 6,96 d (8,2) 114,98 6,94 d (8,2) 116,2
6’ 7,36 d (8,2) 121,62 7,35 dd (8,2; 2,3) 123,1
6-OCH3 3,94 s 61,00 3,93 s 62,3
3-O-Ramnosídeo
1” 5,53 s 101,21 5,51 br s 102,5
2” 4,27 d (13,6) 70,21 4,23 br s 71,6
3” 3,93 m 68,66 3,92 dd (9,0; 3,0) 69,9
4” 4,84 d (9,9) 73,58 4,86 m 74,9
5” 3,38 dd (11,0; 4,8) 68,15 3,34 m 69,4
6” 0,82 d (6,2) 16,18 0,80 d (6,1) 17,5
4”-OAc(CH3) 2,07 s 19,67 2,05 s 21,1
4”-OAc(CO) - 171,24 - 172,7
7-O-Ramnosídeo
1” 5,61 s 98,88 5,59 br s 100,0
2” 4,27 d (13,6) 68,28 4,27 br s 69,4
3” 5,52 dd (9,5; 3,0) 73,87 5,20 dd (9,5; 3,5) 75,2
4” 3,78 d (5,9) 70,21 3,71 d (9,5; 9,5) 70,7
5” 3,74 d (9,5) 69,39 3,75 m 71,4
6” 1,31 d (5,8) 16,67 1,29 d (5,5) 18,0
3”’-OAc(CH3) 2,18 s 19,60 2,16 s 21,0
3”’-OAc(CO) - 171,14 - 172,6
Fonte: Resultados experimentais em MeOD a 400 MHz e Costa e cols (1994) em MeOD a 300 MHz.

177
Costa e cols (2004) mostraram em seu trabalho que os flavonoides diacetilados de K.

laciniata podem ter um alta atividade antiproliferativa em doses até 80 vezes menor que o
extrato bruto desta espécie, como é o caso da patuletina 3-O-(4”-O-acetil-α-L-ramnosil)-7-O-
(3”’-O-α-L-ramnopiranosídeo). Além disso, nesse mesmo trabalho, mostraram que flavonoides
diacetilados são mais ativos que os monoacetilados, e que a posição espacial do grupo acetil
desempenha um papel importante na atividade inibitória linfoproliferativa.
Figura 66 - Estrutura química de Kl2
Em relação à Kl11, foi identificada como sarmentosina (figura 47), sua identificação e
elucidação estrutural já foram descritas anteriormente no tópico 5.2.2 do Capítulo 2, após ser
isolado da espécie de B. pinnatum. Após comparação cuidadosa dos espectros de ambas as
substâncias e confirmação com dados da literatura, foi comprovada sua identidade estrutural.
Essa substância foi descrita pela primeira vez para a espécie Sedum sarmentosum, em
1978, por Fang e cols (NISHIDA; ROTHSCHILD; MUMMERYT, 1994), e posteriormente em
Sedum cepaea, em 1982 (NAHRSTEDT; WALTHER; WRAY, 1982), mas também já foi
descrito para espécies de Rhodiola (YOSHIKAWA et al., 1996), ambas pertencentes a família
Crassulaceae, apresentando-se como um possível candidato a marcador quimiotaxonômico para
esta família.
Apesar de não ter sido realizada a quantificação desse composto para K. laciniata, é
possível sugerir que a sarmentosina é um dos compostos majoritários para a espécie, no entanto,
seu uso como marcador pode ser questionado, pois não é uma substância de distribuição restrita
para essa espécie, uma vez que já foi encontrada em B. pinnatum e não poderia ser usada com
substância diferenciadora entre esses espécies em caso de verificação de autenticidade do
material vegetal.

178
5 CONCLUSÕES
• A técnica de CPC mostrou-se eficiente para a obtenção de frações enriquecidas nos

flavonoides majoritários a partir do EHEL 50 % das folhas de K. laciniata;
• A partir das frações purificadas por CPC, 10 flavonoides foram isolados utilizando a técnica
de CLAE preparativa;
• A identificação preliminar por RMN sugere que todos sejam flavonoides glicosilados
derivados da aglicona metoxilada patuletina;
• A CLAE preparativa permitiu isolar, simultaneamente, pelo menos três flavonoides de K.
laciniata a cada injeção;
• A sarmentosina foi também foi isolada de K. laciniata por MPLC após enriquecimento de
uma fração por CPC;
• A substância Kl2, caracterizada estruturalmente por RMN, foi identificada como patuletina
3-O-(4”-O-acetil-α-L-ramnosil)-7-O-(3”’-O-α-L-ramnopiranosídeo);
• A substância Kl1, caracterizada estruturalmente por RMN, foi identificada como a
sarmentosina.

179
Capítulo 4 - Estudo Metabolômico de extratos de

Bryophyllum pinnatum e Kalanchoe laciniata obtidos sob
diferentes condições de cultivo

180
Capítulo 4 - Estudo Metabolômico de Bryophyllum pinnatum e Kalanchoe laciniata
CAPÍTULO 4 – ESTUDO METABOLÔMICO DE EXTRATOS DE Bryophyllum

pinnatum E Kalanchoe laciniata OBTIDOS SOB DIFERENTES CONDIÇÕES DE
CULTIVO
1 INTRODUÇÃO
A metabolômica é uma das mais recentes técnicas “ômicas”, na qual os metabólitos na
amostra são quali e/ou quantitativamente analisados, tornando-se uma ferramenta bastante útil
na investigação metabólica do controle de qualidade de produtos naturais para consumo
humano, como os fitoterápicos (CHOI et al., 2014; FUNARI et al., 2013; WOLFENDER et al.,
2013; VERPOORTE et al., 2007), podendo contribuir na padronização de extratos, etapa
importante para o desenvolvimento dos mesmos, assim como para a solicitação do registro
(BRASIL, 2014a), garantindo segurança no uso de produtos fitoterápicos pela população.
A abordagem metabolômica tem sido muito utilizada para caracterizar as respostas
metabólicas frente a estresses abióticos, como hídrico e salino que são os maiores fatores
ambientais adversos que diminuem o crescimento e a qualidade da planta (COLQUHOUN,
2007; SHULAEV et al. 2008; FUNARI et al., 2013; GIESSER et al., 2015; RIZWAN et al.,
2015), alterando o teor de substâncias e desenvolvendo respostas adaptativas para minimizar os
efeitos dos estresses. O controle de qualidade dos produtos naturais depende das concentrações
de substâncias ativas e diversos fatores podem afetar o seu teor, como clima, condições de
cultivo ou método de extração, colocando em risco a saúde e a segurança do paciente
(ALAERTS et al., 2010; TIRSTAERT; DEJAEGHER; HEYDEN, 2011).
Em relação a estudos abióticos relacionados a espécie B. pinnatum, foram encontrados
trabalhos que avaliaram a influência da radiação ultravioleta bem como solar na biossíntese dos
flavonoides da espécie (CRUZ et al., 2012; MUZITANO et al., 2011; NASCIMENTO et al.,
2015), já para a espécie K. laciniata, só foi encontrado um estudo realizado por Cruz e cols
(2012), que avaliou o perfil de antocianinas frente a radiação ultravioleta. No entanto, não foram
encontrados trabalhos que mostrem como a salinidade e a suspensão de rega podem influenciar
na alteração desses metabólitos. Isso se torna ainda mais importante, se tratando de cultivo em
regiões semiáridas, castigadas pelo longo período de estiagem, como é o caso do estado do Rio
Grande do Norte. Assim, esse trabalho constitui uma abordagem inédita para essas espécies.
Por fim, é importante destacar ainda que a abordagem metabolômica se torna
particularmente útil para análise de plantas medicinais devido ao programa criado pelo
Ministério da Saúde (MS) para viabilizar o uso de fitoterápicos pelo Sistema Único de Saúde

181
(SUS) (BRASIL, 2009) e atender aos regulamentos da Anvisa para o seu uso seguro. Ainda,
constitui uma estratégia que vai de encontro a Política Nacional de Plantas Medicinais e
Fitoterápicos (decreto presidencial no. 5.813, de 22 de junho de 2006). Os princípios
norteadores do referido decreto enfatizam a necessidade do uso sustentável da biodiversidade
brasileira, já que plantas medicinais de uso tradicional selecionadas, com procedimentos de
controle de qualidade bem estabelecidos e executados, poderiam ampliar o leque de opções
terapêuticas e contribuir para a ampliação e melhoria do SUS (FUNARI et al., 2013).
É importante destacar que K. pinnata (B. pinnatum) está na Relação Nacional de Plantas
Medicinais de Interesse do SUS (RENISUS), publicada pelo MS em fevereiro de 2009. Nesse
contexto, esse trabalho poderá contribuir na comprovação do uso seguro e eficaz de
Bryophyllum pinnatum e Kalanchoe laciniata, fornecendo subsídios para a inclusão desta
última na RENISUS, uma vez que é uma planta medicinal nativa do Brasil. Esses esforços
poderão ainda fortalecer a cadeia de produção de um possível fitoterápico que possa ser
desenvolvido com essas espécies.
Dentro desse contexto, a abordagem metabolômica será utilizada na investigação de
alterações de metabólitos secundários nos extratos de B. pinnatum e Kalanchoe laciniata em
resposta ao cultivo submetido aos estresses hídrico e salino, para caracterizar as diferenças
obtidas nas condições ecofisiológicas estabelecidas. Assim, pretende-se correlacionar as
condições de cultivo com o resultado farmacológico, em busca de encontrar uma estratégia útil
na obtenção de extratos ativos quantificados.

182
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 METABOLÔMICA E ESTRESSES ABIÓTICOS

A nova era da bioquímica vegetal é marcada pelo advento da metabolômica, ou seja, da
investigação quali e quantitativa do metaboloma (HONG et al., 2016; JORGE et al., 2015;
TUGIZIMANA et al., 2018). Segundo originalmente definido por Oliver e cols (1998),
metaboloma “é a coleção quantitativa de todos os compostos de baixo peso molecular presente
nas células ou organismo em um estado fisiológico ou de desenvolvimento específico”
(OLIVER et al., 1998). Esses compostos de baixo peso molecular (≤ 1500 Da) podem ser
descritos como produtos final da expressão gênica e definem o fenótipo de uma célula ou tecido
sob condições fisiológicas definidas em um nível bioquímico (TUGIZIMANA et al., 2018).
Assim, a metabolômica permite a caracterização de múltiplas entidades químicas
individuais (EQI) em organismos complexos, recolocando a atividade biológica numa
perspectiva experimental mais holística e promovendo o reconhecimento de novas atividades
biológicas em potencial, além de permitir a predição de propriedades físico-químicas e
espectrais associadas usando estratégias reducionistas como insumo (ALLARD et al., 2018).
A metabolômica também é bastante utilizada para melhorar o comportamento da plantas
sobre condições normais e de estresse (HONG et al., 2016; JORGE et al., 2015; TUGIZIMANA
et al., 2018), que são as utilizadas nesse trabalho. Nesse contexto, a abordagem metabolômica
tem sido muito utilizada para caracterizar as respostas metabólicas frente a estresses abióticos,
como hídrico e salino que são os maiores fatores ambientais adversos que diminuem o
crescimento e a qualidade da planta (COLQUHOUN, 2007; SHULAEV et al. 2008; FUNARI
et al., 2013; SUN et al., 2014; GIESSER et al., 2015; RIZWAN et al., 2015), alterando o teor
de substâncias presente e desenvolvendo respostas adaptativas para minimizar os efeitos dos
estresses. Por exemplo, durante o estresse hídrico, as plantas fecham seus estômatos para manter
um baixo potencial de água e evitar a desidratação, dessa maneira reduzindo o crescimento
rapidamente (WANG et al. 2014; ZHANG et al. 2014; ARBONA et al., 2013; GEISSER et al.,
2015). Já a salinização diminui a capacidade de captação de água pela planta, o que reduz
também o seu crescimento. Espécies resistentes aos estresses salino e hídrico são importantes
para a melhorar a produtividade em regiões áridas e semiáridas (SREENIVASULU et al., 2000;
RIZWAN et al., 2015; ARBONA et al., 2013).
As principais abordagens usadas atualmente na pesquisa metabolômica de plantas
incluem metabolic fingerprinting (“impressão digital” metabólica), metabolic profile (perfil do

183
metabólito) e targeted analysis (análise direcionada ou análise alvo) (SHULAEV et al., 2008).
As duas primeiras também são chamadas de untargeted ou non-targeted analysis, ou seja,
análises não direcionadas ou não-alvo, quando não se objetiva um grupo específico de
metabólitos, e sim uma análise global (SHULAEV, 2006).
No fingerprinting metabólico é realizada a detecção de todos os metabólitos dentro de
uma amostra geralmente associada a resposta de um estresse, sem levar em conta a identificação
e quantificação precisa de todos os diferentes metabólitos na amostra, nesse caso há o
estabelecimento de um padrão de reconhecimento do extrato. Em contrapartida, no perfil
metabólico há a detecção e identificação e, quando possível, análise semi-quantitativa de
metabólitos (todos ou um conjunto deles) dentro de um extrato. Por fim, a análise direcionada,
ou targeted analysis, é a abordagem analítica mais desenvolvida na metabolômica, utilizada
para medir com precisão a concentração de um número limitado de metabolitos conhecidos,
sendo necessário conhecer a estrutura do metabólito alvo e desenvolver um método analítico
para medir adequadamente sua concentração na amostra (ALAERTS et al., 2010; ALLWOOD;
ELLIS; GOODACRE, 2008; GOODACRE et al., 2003; HONG et al., 2016; JORGE et al.,
2015; SHULAEV, 2006; SHULAEV et al., 2008).
É importante salientar que o uso fingerprintings, ou seja, a impressão digital
espectroscópica e/ou cromatográfica, vem emergindo como ferramenta alternativa para garantir
a qualidade dos materiais e preparações à base de plantas. No caso de fingerprintings
metabólicos, as técnicas de RMN e EM por injeção direta são bastante utilizadas (ALAERTS
et al., 2010; ALLWOOD; ELLIS; GOODACRE, 2008; SHULAEV, 2006).
Por fim, é importante deixar claro que diversos métodos espectroscópicos vêm sendo
utilizados para as análises metabolômicas (HONG et al., 2016), especialmente cromatografia
líquida acoplada a EM (ALLWOOD; GOODACRE, 2010), mas também a RMN vem
emergindo como ferramenta importante para essas análises (EMWAS et al., 2019). Assim,
metabolômica envolve uma larga quantidade de amostras e os espectros resultantes são
geralmente complexos com sobreposições de sinais, o que requer uma análise multivariada de
dados, supervisionada ou não (por exemplo, PLS – Partial Least Squares – e PCA – Principal
Component Analysis – , respectivamente). Dessa forma, métodos quimiométricos são utilizados
para extrair a maior quantidade de informações relevantes para a interpretação dos espectros
(ALLARD et al., 2018; SIMMLER et al., 2014; BARTHI; ROY, 2012; IZQUIERDO-GARCIA
et al., 2011).

184
3 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL

Realizar uma abordagem metabolômica dos extratos hidroetanólicos a 50 % das folhas
frescas das espécies Bryophyllum pinnatum e Kalanchoe laciniata obtidos a partir de diferentes
condições de cultivo.

• Cultivar as espécies B. pinnatum e K. laciniata sob diferentes condições de estresse salino e
estresse hídrico;
• Caracterizar o perfil metabólico dos extratos obtidos de diferentes condições de cultivo por
Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (CLUE) acoplada a um detector de massas (EM), a
fim de observar a influência dessas condições sobre o efeito perfil fitoquímico e o sobre o efeito
antiofídico (este último, abordado no capítulo 5);
• Quantificar o teor dos flavonoides majoritários de B. pinnatum nos extratos submetidos a
diferentes condições de cultivo por CLUE-DAD;
• Quantificar o teor de sarmentosina obtida de B. pinnatum nos extratos submetidos a
diferentes condições de cultivo por RMN.

185
4 METODOLOGIA
Essa parte do trabalho foi realizada em parceria com a Escola Agrícola de Jundiaí (EAJ-
UFRN) e com o Instituto de Química da UFRN sob colaboração com o Prof. Dr. Edgar Perin
Moraes. Análises de RMN e CLUE-EM/EM foram realizadas, respectivamente, no Laboratoire
de Pharmacognosie (UMR CNRS 8638) da Université Paris Descartes – Paris V, com
colaboração do MCF-HDR Professor Dr. Raphael Grougnet, e no Benaki
Phytopharmacological Institute (BPI), com a colaboração da Dra Katerina Termentzi para as
análises do perfil metabólico de B. pinnatum. A quantificação dos flavonoides de B. pinnatum
por CLUE-DAD foi realizada no Instituto de Química da UFRN. A análise do perfil metabólico
de K. laciniata ainda não foi realizada, apenas as análises morfológicas e de rendimento.

Mudas autenticadas de Bryophyllum pinnatum (Lam) Pers. e Kalanchoe laciniata (L.)
DC. foram obtidas do Horto de Plantas Medicinais da Universidade Federal do Ceará (UFC)
em 2015. As mudas obtidas no horto da UFC foram utilizadas para iniciar o cultivo das espécies
por propagação vegetativa a partir das folhas.
A autorização do Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do
Conhecimento Tradicional Associado está sob número A7EA798 obtida 25 de março de 2018.
4.2 CULTIVO DAS ESPÉCIES

Mudas das espécies B. pinnatum foram cultivadas a partir de uma única folha, por
propagação vegetativa, em sacos de polietileno furados (18 cm de diâmetro, 24 cm de altura e
0,5 mm de espessura) contendo como substrato esterco de vaca e areia (1:3, p/p). Já para K.
laciniata, as mudas foram cultivadas a partir de um pequeno broto, por propagação vegetativa,
em sacos de polietileno furados (18 cm de diâmetro, 24 cm de altura e 0,5 mm de espessura)
contendo como substrato esterco de vaca e areia (1:3, p/p). Essa semeadura foi um pouco
diferente das mudas de B. pinnatum, uma vez que o uso de apenas uma folha para cultivo de K.
laciniata, não obteve sucesso como esperado, devido a isso, foram usados brotos.
Desde a semeadura até o início dos tratamentos, foi realizada irrigação diária apenas 1
vez ao dia no horário das 10:00 em todos os sacos, utilizando aproximadamente 2 L de água
para cada grupo de 10 indivíduos, com fotoperíodo natural. As mudas foram cultivadas em casa
de vegetação com telas que permitem a passagem de vento e radiação solar. Com 90 dias de

186
idade (após 3 meses de cultivo) e tendo em média aproximadamente 60 cm de altura, as mudas

foram transferidas para casa de vegetação com cobertura de plástico transparente que permite
a passagem de luz, mas que protege o experimento em caso de chuvas, e nas laterais com telas
que permitem a passagem de vento e luz, e então acondicionadas e submetidas aos tratamentos
de estresses. A padronização das condições de cultivo foi adaptada de Nascimento e cols.
(NASCIMENTO et al., 2015) e baseada nas informações obtidas dos artigos de Muzitano e
cols. (MUZITANO et al., 2011), Soares e cols (SOARES et al., 2015) e Liu, Zhu e Zeng (LIU;
ZHU; ZENG, 2016).
As plantas foram submetidas a dois tratamentos: estresse hídrico e estresse salino, e para
cada tratamento houve um grupo controle, que foi regado uma vez ao dia normalmente.
Para B. pinnatum, foram cultivadas 100 mudas para o estresse hídrico, durante o período
de outubro de 2015 a janeiro de 2016, e 60 para o salino, durante o período de setembro a
dezembro de 2016. O tempo de experimentação do estresse hídrico foi de setembro de 2015 a
janeiro 2016, e o salinidade foi de outubro de 2016 a fevereiro 2017.
Para K. laciniata, foram cultivadas 100 mudas para o estresse hídrico, durante o período
de final de agosto a início de novembro de 2018, e 60 para o salino, durante o de início de
agosto a final de novembro de 2018. O tempo de experimentação tanto do estresse hídrico
quanto do salino foi de agosto a dezembro de 2018
4.2.1 Indução de estresse hídrico

Ao atingirem a idade, as plantas foram submetidas ao estresse hídrico, no qual foi
suspensa a rega diária durante 0, 5, 10, 20, 30 dias e 10 dias cíclicos, no qual as plantas não
receberam água por 10 dias e nos 10 dias subsequentes foram regadas normalmente, para
promover a recuperação (T0, T5, T10, T20, T30 e T10c, respectivamente). Para cada tratamento
de estresse hídrico (n = 10), haviam plantas controle (n = 10), que foram regadas diariamente.
A coleta foi realizada sempre no horário das 10 h. A figura 67 ilustra o processo de indução de
estresse hídrico. Essa metodologia foi baseada nas informações agronômicas sobre plantas
suculentas e fundamentado no trabalho realizado por Winter, Garcia e Holtum (WINTER;
GARCIA; HOLTUM, 2008).

187
Figura 67 - Ilustração esquematizada do estudo de estresse hídrico.
4.2.2 Indução de estresse salino

Ao atingirem a idade, as plantas foram submetidas ao estresse salino, no qual foi
realizada irrigação diária com água salinizada com NaCl (cloreto de sódio) nas concentrações:
50 mM, 100 mM e 200 mM (grupos G1, G2 e G3, respectivamente) durante 30 dias. Para esse
estudo, foram coletados dois grupos controle que receberam irrigação de água não salinizada,
o primeiro ao iniciar o experimento, e o segundo após 30 dias para servir de referência para os
grupos tratados. Foi realizada irrigação diária apenas 1 vez ao dia no horário das 10:00 em todos
os sacos utilizando aproximadamente 2 L de água para cada grupo de 10 indivíduos, com
fotoperíodo natural. Para cada grupo havia dez indivíduos (n = 10). A figura 68 ilustra o
processo de indução de estresse salino. Essa metodologia foi baseada nas informações
agronômicas sobre plantas suculentas e fundamentado nos trabalhos realizado por Bloom
(BLOOM, 2008), Cushman e cols. (CUSHMAN et al., 2008a, 2008b) e Silva-Ortega e cols.
(SILVA-ORTEGA et al., 2008), no entanto, essa é a primeira vez que a metodologia é descrita
dessa forma.

188
Figura 68 - Ilustração esquematizada do estudo de estresse salino.
Para cálculo da concentração de NaCl foi necessário a informação da condutividade

elétrica. Dessa forma, antes do início do estudo, foi realizada análise da água de irrigação (água
do açude da EAJ) na Emparn-RN, e os resultados estão na tabela 31.
Tabela 31 – Análise da água de irrigação.

Teste Resultado
Condutividade elétrica 137,65 µS/cm
Sódio (Na+) 21,90 mg/mL
Cálcio (Ca2+) 1,42 mg/mL
Cloreto (Cl-) 35,45 mg/mL
Magnésio (Mg2+) 0,99 mg/mL
Potássio (K+) 8,24 mg/mL
Carbonato (CO32-) 0 mg/mL
Bicarbonato (HCO3-) 8,68 mg/mL
Fonte: Autoria Própria com resultados experimentais da Embrapa-RN.
Para o cálculo da quantidade de NaCl desejada para obter as concentrações de 50, 100 e 200
mM, foi utilizada a seguinte fórmula:
TSD (ppm) = 640 x CE (dS/m)
Onde TSD é a concentração total de sólidos dissolvidos (Total concentration dissolved).

A concentração de sais é dada em ppm que equivale a mg/mL, e então convertida em g a

189
quantidade necessária para cada concentração. Dessa forma, as quantidades utilizadas para
preparar um litro de água salinizada foram:
i. 50 mM = 0,96 g/L NaCl

ii. 100 mM = 1,92 g/L NaCl
iii. 200 mM = 2,88 g/L NaCl
4.3 PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS E ANÁLISES

Após os tratamentos de estresse, as plantas tratadas e as plantas controles de cada estudo
foram fotografadas. Amostras das folhas de cada indivíduo foram coletadas separadamente e
rapidamente armazenadas em sacos plásticos zipados identificados que foram conservados em
nitrogênio líquido até o momento da preparação dos extratos, para preservar ao máximo a
constituição metabólica da planta no momento da coleta, através do quenching metabólico1. A
amostra coletada de cada indivíduo (replicatas biológicas) foi composta 10 folhas de tamanhos
semelhantes, medindo aproximadamente entre 5 e 10 cm de comprimento da base ao ápice.
Os extratos foram preparados conforme descrito anteriormente no item 3.2 do Capítulo
2 e posteriormente reduzidos em evaporador rotatório Buchi®, congelados em freezer a - 80 oC
e liofilizados. As amostras foram analisadas por técnicas cromatográficas, como será descrito
mais adiante nessa metodologia, e os dados tratados estatisticamente com auxílio do software
livre R® versão 3.15. Além das coletas dos indivíduos (replicatas biológicas), um pool2 dos 10
indivíduos de cada grupo (1 folha por indivíduo) foi coletado em triplicada para avalição
farmacológica antiofídica in vitro (capítulo 5).
4.4 ANÁLISE MORFOLÓGICA MACROSCÓPICA E DE RENDIMENTO

Análise morfológica macroscópica da folha foi realizada visualmente, por meio da
análise e registro de alterações características de aspecto, cor, textura e tamanho.
A análise do Rendimento (R) foi realizada com base na razão entre as massas (m) da
material prima vegetal (MPV) utilizado (folhas frescas coletadas em nitrogênio líquido) e do
extrato liofilizado (EHEL) obtido para cada indivíduo, respeitando a fórmula:
1
Quenching metabólico: interrupção imediata da atividade enzimática.
2
O pool de indivíduos para avaliação farmacológica foi preparado a partir de um extrato que continha duas folhas
de cada indivíduo de um mesmo grupo (2 folhas coletadas de cada indivíduo N=10, para cada tratamento).

190
R = mEHEL x 100
mMPV
4.4.1 Análise estatística

Os testes de hipóteses (análise de variância, Anova, seguido de teste de Tukey) para
comparação das médias nos ensaios foram realizados através do software estatístico GraphPad
Prism® versão 5.00. Os p-valores menores que 0,05 foram considerados significativos.
4.5 METABOLÔMICA GLOBAL DE B. pinnatum – METABOLISMO SECUNDÁRIO POR

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ULTRA EFICIÊNCIA (CLUE-EM/EM)
Essa análise foi realizada objetivando a compreensão abrangente da composição de
metabolismo secundário global de B. pinnatum através da técnica de Cromatografia Líquida de
Ultra Eficiência acoplada a espectrometria de massas (CLUE-EM/EM) para análise do perfil
metabólico.
4.5.1 Instrumentação e parâmetros de análise

As análises de CLUE-EM/EM foram realizadas em Cromatógrafo Líquido de Ultra
Eficiência acoplado (Dionex Ultimate 3000 UHPLC, Thermo Scientific®) a Espectrômetro de
Massas de Alta Resolução (EMAR/MS) Orbitrap Q-Exactive (Thermo Scientific®) Os
reagentes utilizados foram: Acetonitrila grau UPLC-MS (Merck®), Ácido grau UPLC-MS
(Merck®) e água Milli-Q®. Uma coluna Hypersil Gold UPLC C18 (2.1 × 100 mm, 1.9 μm;
Thermo Scientific®) foi utilizada. Após otimização do método, o gradiente de eluição
desenvolvido foi composto de (A) ácido fórmico 0,1 % (v/v) e (B) acetonitrila. O programa de
eluição foi: 5% B, de 0-3 min; 5-95 % de B, de 5-21 min; 95% de B, de 21-13 min; 95-5% de
B, de 23-24 min; 5 % de B, de 24-30 min. O fluxo foi de 0,220 mL/min e o volume de injeção
de 5 μL. A temperatura da coluna foi mantida em 40 ºC, enquanto a temperatura do amostrador
foi mantida a 10 ºC.
A ionização foi realizada por IES (Ionização por Eletro Spray) nos modos positivo e
negativo. As condições do EMAR para ambos os modos foram: temperatura capilar de 350 ºC,
voltagem do spray de 2,7 kV; nível de radiofrequência S-lens de 50 V; fluxo do gás de 40
unidades arbitrárias; fluxo do gás auxiliar de 5 unidades arbitrárias; temperatura do gás auxiliar
de 50 ºC. As análises foram realizadas utilizando o modo transformada de Fourrier (TF) do

191
LTQ orbritap (EMFT) no modo full scan, aplicando uma resolução de 70000, enquanto a
aquisição dos espectros de massas foi realizada sempre usando o modo centroide. Foi usada
uma resolução de 35000 para a aquisição dos dados, permitindo um fragmentação EM/EM dos
três íons mais intensos de cada pico excedendo o limiar predefinido, aplicando uma exclusão
dinâmica de 10s. A energia de colisão normalizada foi estabelecida em 40,60 e 100. A aquisição
e a análise de dados foram concluídas empregando o software Xcalibur® 2.1.
4.5.2 Preparação das amostras:

As amostras foram solubilizadas em uma mistura de MeOH:H2O (1:1, v/v). A
concentração final dos extratos de B. pinnatum foi de 1 mg/mL. Após a total dissolução e
previamente às análises, as amostras foram filtradas em membranas de 0,22 μm (MillexTM,
Merck®).
4.5.3 Tratamento de dados

Todo tratamento dos dados metabolômicos foi realizado utilizando o software livre R®
3.15, da The R® Foundation for Statistical Computing 2013, pois apresenta uma ótima
capacidade de cálculo e alta qualidade gráfica, além de contar com muitos usuários do mundo
todo alimentando o sistema com diversos pacotes em todas as subáreas da estatística.
Os arquivos dos conjuntos de dados obtidos relacionando três variáveis (tempo, m/z+ e
intensidade) foram pré-processados, removendo-se o ruído de fundo da linha de base usando a
função baseline.corr do pacote ptw. Durante o alinhamento, foi realizada uma comparação entre
os métodos Warping, Parametric Time Warping (pacote ptw) e Dynamic Time Warping (pacote
dtw). Os dados foram normalizados e escalonados para a análise multivariada (WEHRENS,
2011). A análise exploratória foi realizada usando Análise por Componentes Principais (pacote
ChemometricswithR). Posteriormente, para a classificação, diversos métodos multivariados
serão utilizados tais como PLS (pacote pls), OPLS (pacote OPLSinR) e SVM (Pacote
ChemometricswithR).
A identificação dos compostos foi realizada usando os valores de m/z+ em bancos de
dados disponíveis (Metabolite and Tandem MS Database - METLIN). Quando vários
compostos apresentaram a mesma massa, a seleção foi feita através do padrão isotópico, e,
finalmente, os compostos foram selecionados devido à sua estrutura química e tempo de

192
migração. Rotas metabólicas específicas de maior expressão foram investigadas e apontados

possíveis distúrbios.
4.6 METABOLÔMICA ALVO DE B. pinnatum – QUANTIFICAÇÃO DE FLAVONOIDES

E SARMENTOSINA
A técnica de Cromatografia Líquida de Ultra Velocidade acoplada a detector de arranjo
de diodos (CLUE-DAD) foi realizada para análise quantitativa dos flavonoides de B. pinnatum
submetida a estresses hídrico e salino, bem como a técnica de Ressonância Magnética Nuclear
de Hidrogênio (RMN de H¹) para quantificação de sarmentosina nas amostras do estresse Salino
de B. pinnatum.
4.6.1 Análise dos extratos e quantificação dos flavonoides por CLUE-DAD

O método desenvolvido para quantificação dos flavonoides majoritários do EHEL das
folhas de B. pinnatum por CLUE-DAD foi validado de acordo as exigências da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária – Anvisa, seguindo os parâmetros estabelecidos pela RDC nº
166 de 24 de julho de 2017 (BRASIL, 2017a), como está descrito no item 4.8 do Capítulo 2
dessa tese. A quantificação se baseou na equação da reta obtida para cada flavonoide isolado, a
saber Bp1, Bp2 e Bp3. Esses flavonoides foram quantificados a partir de extratos produzidos
diretamente pool de indivíduos em triplicata como descrito no item 4.3 deste capítulo.
Foi utilizado um Cromatógrafo Líquido de Ultra Velocidade acoplado a detector de
arranjo de diodo (CLUE-DAD) da Shimadzu®. No item 4.4.1 do capítulo 2 desta tese está
descrito todas as especificações do equipamento, reagentes, fase estacionária e fase móvel
utilizada, bem como o preparo das amostras para solubilização e injeção no equipamento. Todas
as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software Microsoft® Excel®.
4.6.2 Análise dos extratos e quantificação de sarmentosina por RMN de H1 do estresse

salino
Foi realizada a técnica de RMN para análise de fingerprinting metabólico e análise
quantitativa de sarmentosina como descrito no item 4.9 do Capítulo 2 (assim como todas as
especificações de equipamento e reagentes, parâmetros de aquisição e processamento). Essa
análise só foi feita para os grupos do cultivo com estresse salino.

193
Para a quantificação, uma quantidade exata do extrato liofilizado de B. pinnatum (30

mg) e de cafeína (PI) (1 mg) foi pesada, utilizando balança analítica de alta precisão, em um
eppendorf e solubilizada em 500 µL de uma mistura MeOD:D2O (3:2, v/v). A solução foi
homogeneizada em banho de ultrassom por 15 min, centrifugada por 2 min a uma rotação de
1400 Xg, e o sobrenadante transferido para tudo de RMN de 5 mm, conforme descrito de forma
detalhada no item 5.2.3. O sinal em 6,7 ppm foi integrado em todas as amostras e os valores da
integração relativa foram substituídos pelo valor de y na equação de regressão linear
determinada conforme Capítulo 2, item 4.9.5.1 da Linearidade, como descrito por Karkoula e
cols (KARKOULA et al., 2012).

194
Neste trabalho foram avaliados como os estresses hídrico e o salino podem influenciar
no desenvolvimento e na alteração no conteúdo de metabólitos secundários nas espécies B.
pinnatum e K. laciniata. Essa avaliação torna-se bastante interessante, uma vez que espécies
resistentes aos estresses salino e hídrico são importantes para a melhorar a produtividade em
regiões áridas e semiáridas (RIZWAN et al., 2015; ARBONA et al., 2013; SREENIVASULU
et al., 2000).
4.1 INDUÇÃO DE ESTRESSE HÍDRICO PARA A ESPÉCIE B. pinnatum

O primeiro efeito visível decorrente desse estresse é a diminuição do crescimento da
planta, refletindo diretamente no rendimento de biomassa do extrato após a coleta. A literatura
mostra que durante o estresse hídrico, as plantas fecham seus estômatos para manter um baixo
potencial de água e evitar a desidratação, dessa maneira reduzindo o crescimento (WANG et
al., 2018; GREISSER et al., 2015).
Na figura 69, é possível ver alteração morfológica das mudas durantes os dias de
tratamento. Comparando com o indivíduo controle, é observada uma alteração marcante da
coloração, com a perda da coloração verde intenso quando as plantas estavam sendo tratadas
com rega diária. A folha apresentou coloração verde mais escura e sem brilho, além de uma
espessura mais fina e uma consistência menos rígida em relação ao controle.
Na figura 70 é ilustrado a alteração de rendimento do extrato em porcentagem (% em g
extrato liofilizado/g folhas coletadas) durante o tempo do tratamento. Após a análise das médias
± DP (n = 10 indivíduos) é possível perceber que a o rendimento diminuiu conforme aumentam
os dias de suspensão de rega. Isso pode ser confirmado após a análise estatística, na qual o T20T
e o T30T apresentaram-se significativamente diferentes do T0 (condição inicial antes de
começar o estresse hídrico) a um P<0,05. Além disso, tanto T20T quanto T30T diminuíram seu
tamanho em relação aos tratamento anteriores de T5T e T10T (P<0,05), sugerindo que aumento
dos dias de suspensão de rega acarretam a diminuição do rendimento dos extratos de B.
pinnatum. É salutar destacar também que não houve diferença estatística (P<0,05) entre o T20T
e o T30T, mostrando que não há alterações entre esses grupos. E por fim, apenas T20T e T30T
mostraram-se diferentes em relação aos seus respectivos controles T20C e T30C (P<0,05).
Essas significâncias não foram mostradas no gráfico para não confundir a interpretação.

195
Figura 69 - Registo da evolução morfológica macroscópica das mudas de B. pinnatum durante o estudo de estresse hídrico.
Fonte: Resultados experimentais. Créditos das fotos à autora.
Figura 70 - Gráfico que ilustra a média em % (±DP) o rendimento do EHEL do estresse hídrico de B. pinnatum.
Legenda: Dias de tratamento (suspensão de rega) - T0, T5, T10, T20, T10c e T30; C - Controle; T - Tratamento. Valores expressos como média ± EPM (n = 10/ grupo). *P<0,005
quando comparado ao grupo T0 após ANOVA de uma via seguido de teste de Tukey. Fonte: Resultados experimentais.

196
Um dado importante a acrescentar nesse estudo hídrico foi a recuperação do T10c, que
apresentou um maior rendimento em relação a todos grupos (grupos tratados e controle), apesar
de que, estatisticamente, ele só foi significativamente diferente do seu respectivo controle T20C
e dos tratamentos T20T e T30T. Esse dado do T10cT é bastante interessante, pois vai de
encontro ao trabalho recente publicado por Wang e cols (2018), no qual mostrou que a presença
de um gene em Kalanchoe daigremontiana, após uma re-irrigação, estimula uma floração mais
precoce das folhas do tabaco. Estudos adicionais devem ser realizados para confirmar a possível
presença desse gene em B. pinnatum, e se ele poderia também influenciar nesse caso.
No estresse hídrico, um dos parâmetros fisiológicos mais importantes alterados é a
fotossíntese, o que provoca uma severa e progressiva redução da capacidade de assimilação de
CO2. Esta diminuição na taxa fotossintética é primeiramente associada a um fechamento
estomático induzido por um declínio no turgor das células foliares que limita a difusão de CO2
para a câmara subestomática. Ainda é possível induzir a fotorrespiração e a produção de H2O2
(peróxido de hidrogênio), e consequentemente, após o declínio da fotossíntese, a produção de
espécies reativas do oxigênio (ROS) é a primeira resposta, causando dano celular, mas também
um sinal a ser transmitido. Nesse contexto, a planta pode responder ao estresse com a
superprodução de metabólitos antioxidantes como os polifenóis. Além disso, o estresse hídrico
induz, como resposta geral, o acúmulo de vários aminoácidos, como valina, leucina, isoleucina
e agmatina (como precursor de poliaminas) juntamente com carboidratos que, em combinação
com prolina podem exercer papel osmoprotetor (ARBONA et al., 2013; CATTIVELLI et al.,
2008; CHAVES; FLEXAS; PINHEIRO, 2009).
A análise dos dados de rendimento sugere provável resistência a escassez de água pelo
metabolismo dessa planta. Essa resistência pode ser justificada por essa espécie pertencer a
família Crassulaceae, que tem o metabolismo do ácido crassuláceo (CAM), o que lhe confere
adaptação a regiões áridas (BORLAND et al., 2014, 2015; DAVIS; LEBAUER; LONG, 2014).
O CAM é definido a partir de uma flutuação diurna de acidez devido à produção de
ácido málico. A flutuação desse ácido orgânico resulta da fixação noturna de CO2, catalisada
pela PEP carboxilase usando fosfoenolpiruvato (PEP) para produzir oxalacetato, que é
rapidamente reduzido a malato catalisado pela malato desidrogenase. O malato é transportado
até os vacúolos e armazenado na forma de ácido málico que, durante o dia, inunda o vacúolo e
é descarboxilado para produzir CO2 e um fragmento de 3 carbonos, tal como piruvato ou PEP.
Na planta CAM típica, os estômatos são fechados durante a fase de descarboxilação, ou seja,

197
durante o dia, diminuindo a perda de água, e, o CO2 liberado nos tecidos é fixado
fotossinteticamente pelo ciclo de pentose redutora. Os estômatos abrem a noite, quando a perda
de água transpiracional é baixa. Assim, a maior parte das trocas gasosas em plantas de CAM é
à noite e não durante o dia (CUSHMAN, 2001; DAVIS; LEBAUER; LONG, 2014; GARCIA
et al., 2014; TING, 2003). Isso fornece plasticidade às plantas CAM para otimizar o ganho de
carbono e o uso da água, estendendo ou reduzindo o período de absorção líquida de CO2 em
qualquer período de 24 horas. A plasticidade fotossintética sustenta a diversidade ecológica das
espécies de CAM e contribui para o potencial de alta produção de biomassa em habitats
limitados pela água (BORLAND et al., 2011)
O CAM é tão importante para plantas de regiões áridas, que técnicas de engenharia
genética são utilizadas para introduzi-lo em culturas de plantas C3, para tentar conferir
resistência a escassez de água, inclusive devido ao aumento da temperatura do planeta em
decorrência do aquecimento global (BORLAND et al., 2014, 2015). Além disso, recentemente,
foi identificado por Wang e cols (2018) na espécie Kalanchoe daigremontiana, um gene que
confere resistência a condições de seca. Segundo o estudo, o gene KdNOVEL41, além de
conferir resistência a estresse hídrico, poderia afetar o desenvolvimento da planta (WANG et
al., 2018).
Para análise do metaboloma das mudas submetidas a estresse hídrico, foi realizada a
análise do perfil metabólico por CLUE-EM/EM. Após obtenção dos dados, as análise
quimiométricas foram realizadas no programa R® correlacionando as variáveis tempo de
retenção (min) x m/z de todos os picos do cromatograma como explicado anteriormente na
metodologia deste capítulo. Os resultados das análises de PCA e PLS estão ilustrados nas
figuras 71, 72, 73, 74, 75 e 76.
O primeiro teste realizado foi a análise de PCA, este teste trata-se de uma análise não
supervisionada, ou seja, o software é alimentado com os dados, mas não é especificado a que
grupo cada dado pertence. É utilizado para se obter uma visão geral dos dados e como está a
variabilidade dentro dos grupos e entre os grupos (WEHRENS, 2011). Nas figuras 71 e 72 estão
ilustradas as análises de PCA realizadas com todos os dados do modo positivo e negativo,
respectivamente, mostrando que apenas os grupos tratamento T20 e T30 conseguem se
distanciar dos demais grupos em relação a alteração de metabólitos, pois estão mais
correlacionados com as componentes principais (PC1 e PC2), sugerindo que os indivíduos de
B. pinnatum mostram alterações de metabólitos após a 20 dias de suspensão de rega. Esses

198
achados podem corroborar com os resultados de rendimento, no qual apenas T20T e T30T
(figura 66) apresentam diferenças em termos de biomassa em relação ao controle.
Figura 71 - PCA realizado com todos os indivíduos submetidos ao estresse hídrico de B. pinnatum. Dados no
modo positivo.
Figura 72 - PCA realizado com todos os indivíduos submetidos ao estresse hídrico de B. pinnatum. Dados no
modo negativo.
Nas figuras 73 e 74, temos a análise por PCA direcionada apenas aos grupos T20 e T30.
Nesse caso, é possível perceber cada indivíduo dos grupos tratamentos, tanto T20 quanto T30,
em posições diferentes do gráfico quando comparada com os grupos controles, reforçando a

199
possível alteração metabólica após os 20 dias de suspensão de rega. Quando há comparação

entre os grupos tratados, também há diferença entre eles no tocante a localização no gráfico,
sugerindo que a produção de metabólitos pode ser diferente entre 20 e 30 dias de suspensão de
rega.
Figura 73 - PCA realizado com todos os grupos T20 e T30 versus Grupos controles. Dados no modo positivo.
Figura 74 - PCA realizado com todos os grupos T20 e T30 versus Grupos controles. Dados no modo negativo.

Nas figuras 75 e 76 estão representadas as análises supervisionadas de PLS para
confirmar a interpretação que os dados de PCA forneceram. A análise de PLS trata-se de uma
análise supervisionada dos dados, ou seja, no momento que o programa é alimentado com os
dados, já é dada a informação a qual grupo eles pertencem (WEHRENS, 2011).

200
Figura 75 - PLS realizado com todos os grupos T20 e T30 versus Grupos controles. Dados no modo positivo.
Figura 76 - PLS realizado com todos os grupos T20 e T30 versus Grupos controles. Dados no modo positivo.
Nessas figuras, é possível visualizar claramente a diferença entre os grupos controle e

tratamento. Nesse caso, para facilitar o entendimento do resultado, tanto os controles quanto os
grupos tratamento (T20 e T30), foram abordados como se pertencentes a um único grupo que
possui controle e tratamento, assim ficando bem evidente a diferença de produção de
metabólitos existente após 20 dias de suspensão de rega, em relação a todos os outros grupos.
Apesar de terem sido tratados como um único grupo nessa análise, não significa que
necessariamente, que as alterações metabólicas entre T20 e T30 são iguais. Os resultados da
análise por PCA sugere que haja diferenças entre esses grupos tratamentos. Devido a isso,

201
análises adicionais de PLS estão sendo conduzidas para uma análise comparativa melhor entre
esses grupos.
Para análise do metaboloma global, as razões m/z dos compostos que são os marcadores
diferenciais entre os grupos estão em identificação e provavelmente serão utilizados para
sugestão de rotas biossintética. Na figura 14 do capítulo 2, é possível visualizar o fingerprint
cromatográfico de B. pinnatum por CLUE-EM/EM. A análise do metaboloma alvo (target
analysis), no qual é quantificado o teor de flavonoides em cada grupo, está fase de
experimentação por CLUE-DAD.
4.3 INDUÇÃO DE ESTRESSE HÍDRICO PARA A ESPÉCIE K. laciniata

Para o estresse hídrico de K. laciniata só foram realizados até o momento as análises de
morfológicas macroscópicas e o ganho de biomassa.
tratamento. Comparando com o indivíduo controle, é observada uma alteração marcante da
coloração, com a perda da coloração verde forte quando as plantas estavam sendo tratadas com
rega diária. A folha apresentou coloração verde mais escura e sem brilho, além de uma
espessura mais fina e uma consistência menos rígida em relação ao controle, especialmente nos
tratamentos T20T e T30T. Vale destacar a recuperação visual do grupo T10cT em relação ao
controle T0.

202
Figura 77 - Registo da evolução morfológica macroscópica das mudas de K. laciniata durante o estudo de estresse hídrico.
Figura 78 - Gráfico que ilustra a média em % (±DP) o rendimento do EHEL do estresse hídrico para K. laciniata
Legenda: Dias de tratamento (suspensão de rega) - T0, T5, T10, T20, T10c e T30; C - Controle; T - Tratamento. Valores expressos como média ± EPM (n = 10/ grupo). *P<0,005
quando comparado ao grupo T0C e **P<0,001, quando comparado ao grupo T10T após ANOVA de uma via seguido de teste de Tukey. Fonte: Resultados experimentais.

203
A análise de rendimento do estresse hídrico de K. laciniata apresentou resultados

diferentes quando comparados com os dados de B. pinnatum. Na figura 78 é ilustrado a
alteração de rendimento em porcentagem (% em g extrato liofilizado/g folhas coletadas durante
o tempo do tratamento. Após a análise das médias ± DP (n = 10 indivíduos) é possível perceber
que o rendimento não diminuiu conforme aumentam os dias de suspensão de rega. Ao contrário
do que ocorre em B. pinnatum, nenhum grupo tratamento de K. laciniata apresentou-se
estatisticamente diferente do controle T0 (P<0,05). Além disso, não houve diferenças
significativas entre os grupos controle e tratamento dentro de uma mesma condição de
suspensão de rega (P<0,05). Ainda é importante destacar que o T20T apresenta-se como a
melhor condição, uma vez que após análise de ANOVA seguida de teste de Turkey (P<0,05),
apresentou maior rendimento em relação ao T10T. E por fim, outro dado contrastante com os
achados para B. pinnatum, o T10cT não apresentou-se diferente em termos de rendimento em
relação ao seu respectivo controle T20C ou ao grupo tratamento T20T.
Esses achados para K. laciniata podem sugerir que essa espécie possa ter uma
resistência ao aporte hídrico maior que B. pinnatum. A correlação com os dados químicos
poderá fornecer evidências maiores.
4.3 INDUÇÃO DE ESTRESSE SALINO EM B. pinnatum

O estresse salino afeta todos os principais processos da planta, como germinação,
crescimento, pigmentos fotossintéticos e fotossíntese, relação de água, desequilíbrio de
nutrientes, estresse oxidativo e produtividade (PARIHAR et al., 2015). O primeiro efeito visível
decorrente desses estresses é a diminuição do crescimento da planta, refletindo diretamente no
rendimento de biomassa do extrato após a coleta. A literatura mostra que a salinização diminui
a capacidade de captação de água pela planta, reduzindo ou parando o crescimento e o
desenvolvimento reprodutivo, e, se as condições salinas persistirem, possível morte da planta
(ARBONA et al., 2013; RIZWAN et al., 2015; SREENIVASULU et al., 2000).
tratamento. Quando comparado com o indivíduo controle, pode ser observada uma alteração
marcante da coloração, com a perda da coloração verde forte quando as plantas estavam sendo
tratadas com rega sem adição de NaCl. A folha apresentou coloração verde mais amarelada e
um tamanho menor que o normalmente encontrado nas mudas, no entanto, nem a espessura
nem o consistência das folhas foram alteradas.

204
Figura 79 - Registo da evolução morfológica macroscópica das mudas de B. pinnatum durante o estudo de estresse salino.
Figura 80 - Gráfico que ilustra a média em % (±DP) o rendimento do estresse salino para B. pinnatum.
Legenda: G0 - controle após 30 dias, G1- 50 mM, G2 - 100 mM e G3 - 200 mM; C - Controle; T - Tratamento. Valores expressos como média ± EPM (n = 10/ grupo).
***P<0,0001, quando comparado ao grupo T0G0 após ANOVA de uma via seguido de teste de Tukey. Fonte: Resultados experimentais.

205
Na figura 80 é ilustrada a alteração de rendimento em porcentagem (% em g extrato

liofilizado/g folhas coletadas) durante o tempo do tratamento. Após a análise das médias ± DP
(n = 10 indivíduos) é possível perceber que a o rendimento dos grupos tratamento diminui em
relação ao grupo controle coletado no T0 (T0G0), mas que não há diferenças estatísticas em
relação ao grupo controle T30G0 (ou seja, aquele regado normalmente sem salinidade durante
os 30 dias de estudo), sugerindo que após 30 dias, a rega com solução concentrada de NaCl não
altere o rendimento em relação ao grupo que recebeu rega normalmente durante esses 30 dias.
Além disso, não houve diferença estatística entre os grupos submetidos a salinidade (figura 73),
o que pode inferir que não há diferenças entre a maior e a menor concentração de NaCl.
O estresse salino pode inibir o crescimento da planta de duas formas, chamadas de i.
efeito osmótico ou déficit hídrico de salinidade e ii. efeito sal-específico ou excesso iônico da
salinidade. No primeiro deles (i), a presença de sal na solução do solo reduz a capacidade da
planta de absorver água e isso leva a reduções na taxa de crescimento. Já no segundo (ii), se
quantidades excessivas de sal entrarem na planta na corrente de transpiração, haverá danos às
células nas folhas transpirantes e isso pode causar reduções adicionais no crescimento. Estes
efeitos de salinidade reduzem o potencial hídrico e causa desequilíbrio iônico ou distúrbios na
homeostase e toxicidade dos íons. A alteração do potencial hídrico leva à redução inicial do
crescimento e à limitação da produtividade da planta (PARIHAR et al., 2015).
Alguns fitohormônios desempenham papel fundamental na resistência a salinidade,
como o ácido abscísico (ABA) que possui um papel regulador na expressão de genes sal-
responsivos sob condição de salinidade, e, pode acarretar o aumento da concentração interna
de Ca2+ e na produção de H2O2 no citoplasma, induzindo o fechamento estomático, reduzindo
a assimilação de CO2 e impondo penalidades ao rendimento (CABOT; SIBOLE; BARCELO,
2009; FAHAD et al., 2015; HEDRICH; SHABALA, 2018; NARUSAKA et al., 2003).
Para análise do metaboloma dos indivíduos submetidos a estresse salino, foi realizada a
análise por CLUE-EM/EM. Após obtenção dos dados, as análises quimiométricas foram
realizadas no programa R® para correlacionar as variáveis tempo de retenção (min) x m/z de
todos os picos do cromatograma como explicado anteriormente na metodologia deste capítulo.
Os resultados das análises de PCA e PLS estão ilustrados nas figuras 81, 82, 83 e 84.
Nas figuras 81 e 82 estão ilustradas as análises de PCA realizada com todos os dados do
modo positivo e negativo, respectivamente, mostrando que não há diferenças entre os grupos

206
salino, em contrapartida, é possível visualizar que a menor concentração de sal consegue alterar
significativamente a composição de metabólitos de B. pinnatum.
Figura 81 - PCA realizado com todos os grupos tratados versus grupos controles do estresse salino. Dados no
modo positivo.
Figura 82 - PCA realizado com todos os grupos tratados versus grupos controles do estresse salino. Dados no
modo negativo.

207
Nas figuras 83 e 84, é possível visualizar a análise supervisionada de PLS para confirmar
a interpretação que os dados de PCA nos forneceram. É possível verificar a diferença entre os
grupos controle e tratamento. No gráfico, todos os grupos que foram submetidos a salinidade
foram tratados como saline stress.
Figura 83 - PLS realizado com todos os grupos tratados versus grupos controles do estresse salino. Dados no
modo positivo.
Figura 84 - PLS realizado com todos os grupos tratados versus grupos controles do estresse salino. Dados no
modo negativo.

208
Para análise do perfil metabólico, as razões m/z dos compostos que são os marcadores
diferenciais entre os grupos estão em identificação e provavelmente serão utilizados para
sugestão de rotas biossintética. Na figura 14 do capítulo 2, é possível visualizar o fingerprint
cromatográfico de B. pinnatum por CLUE-EM/EM. No entanto, é importante fazer algumas
considerações acerca de como a salinidade pode influenciar na produção de metabólitos pelas
plantas.
O estresse salino pode levar a um desbalanço osmótico na célula vegetal, levando ao
aumento da produção dos aminoácidos prolina e glicina betaína (GB) (PARIHAR et al., 2015),
mas também outros como a alanina, arginina, leucina, valina, serina e ornitina (ASHRAF;
HARRIS, 2004). É interessante notar também que em plantas submetidas a condições de
estresse salino, há um aumento da produção de espécies restivas do oxigênio (ROS) induzido
pelo ABA, o que desencadeia a produção e a acumulação de flavonoides em células-guarda
(HEDRICH; SHABALA, 2018; WATKINS; CHAPMAN; MUDAY, 2017). A análise do
metaboloma alvo, no qual é quantificado o teor de flavonoides em cada grupo, está fase de
experimentação no CLUE-DAD.
Os efeitos do estudo de estresse salino de B. pinnatum também foi avaliado por RMNq
de 1H para análise do metaboloma alvo. Nesse caso, foi analisada a concentração de
sarmentosina em mg/g de extrato conforme descrito anteriormente, no item 5.4 do capítulo 2,
através da equação da reta determinada pela linearidade (y = -1,3775 + 2,6068), de maneira
análoga à realizada para determinação de sarmentosina no EHEL de B. pinnatum. Até o
momento, somente o sinal da sarmentosina foi estudado, mas outros sinais, especialmente
aqueles relativos a flavonoides, também serão inclusos nas análises futuras, bem como a
interpretação do fingerprint metabólico obtido pelo RMN. Na figura 54 A está ilustrado o
fingerprint por RMN para o EHEL de B. pinnatum. Na figura 85 são ilustrados os valores de
concentração de sarmentosina em mg/g de extrato de B. pinnatum.

209
Figura 85 - Gráfico que ilustra a média da concentração de sarmentosina em mg/g do extrato de B. pinnatum
obtido do estudo de estresse hídrico.
mg sarmentosina/g de extrato
30
*
20
10
0
0
3
0
0G
0G
0G
0G
G
T0
T3
T3
T3
T3
Legenda: G0 - controle após 30 dias, G1- 50 mM, G2 - 100 mM e G3 - 200 mM; C - Controle; T - Tratamento.
Valores expressos como média ± EPM (n = 10/ grupo). ***P<0,005, quando comparado ao grupo T0G0 após
ANOVA de uma via seguido de teste de Tukey. Fonte: Resultados experimentais.
A partir dos resultados expostos é possível notar que não há alteração da concentração
de sarmentosina com o tratamento salino durante 30 dias. Essa ausência de diferença é sugerida,
pois o grupo T0G0, que é o controle da coleta no primeiro dia de tratamento de estresse salino,
apresenta uma concentração de sarmentosina praticamente igual aos demais grupos tratados
com a solução (G1, G2 e G3, respectivamente, 50, 100 e 200 nM) em diferentes concentrações.
Apesar de haver diferença estatística do grupo T30G3 em relação ao T0G0 a um P<0,05, essa
diferença não é visível no gráfico. Além disso, com exceção do T30G1 que possui uma leve
diferença em relação ao T30G0 (P<0,05), essa diferença não é vista para os grupos T30G2 e
T30G3. Entre os grupos é possível perceber que não há diferenças estatísticas na concentração
de sarmentosina à medida que se aumenta a concentração de NaCl na solução de rega.
Ou seja, é possível sugerir que a alteração da rega com diferentes concentração de NaCl
não altera a produção de sarmentosina em B. pinnatum. Não foram encontrados dados na
literatura que relacionem o teor de γ-HNG com o aumento da salinidade na solução de rega.
Isso pode estar associado à isoleucina, aminoácido precursor na biossíntese de sarmentosina,
uma vez que não foi encontrado na literatura que o estresse salino possa alterar o conteúdo
desse aminoácido, o que talvez possa justificar a não interferência no seu teor nas mudas de B.
pinnatum submetidas ao estresse salino.

210
Capítulo 4 - Estudo de Cultivo e Metabolômico de Bryophyllum pinnatum e Kalanchoe laciniata
4.4 INDUÇÃO DE ESTRESSE SALINO EM K. laciniata

Para o estresse salino de K. laciniata só foram realizados até o momento as análises
morfológicas macroscópicas e o rendimento.
tratamento. Quando comparado com o indivíduo controle, pode ser observada uma alteração
marcante da coloração, com a perda da coloração verde forte quando as plantas estavam sendo
tratadas com rega sem adição de NaCl. A folha apresentou coloração verde mais amarelada e
um tamanho menor que o normalmente encontrado nas mudas, no entanto, nem a espessura
nem o consistência das folhas foram alteradas.
A análise de rendimento dos extratos do estresse hídrico de K. laciniata apresentou
resultados diferentes quando comparados com os dados de B. pinnatum. Na figura 87 é ilustrado
a alteração de em porcentagem (% em g extrato liofilizado/g folhas coletadas) durante o tempo
de traamento. Após a análise das médias ± DP (n = 10 indivíduos) é possível perceber que
rendimento não diminuiu com a salinidade, ao contrário do que ocorre em B. pinnatum. Na
análise estatística, os grupos tratamento T30G1 e T30G2 apresentaram-se estatisticamente
diferente do controle T0G0 (P<0,05). No entanto, não houve diferenças significativas entre os
grupos controle T30G0 e tratamento T30G1, T30G2 e T30G3 (P<0,05). Esses achados para K.
laciniata podem sugerir que essa espécie possa ter uma condição de resistência ao estresse
salino maior que B. pinnatum. A correlação com os dados químicos pode fornecer evidências
maiores.

211
Figura 86 - Registo da evolução morfológica macroscópica das mudas de B. pinnatum durante o estudo de estresse salino.
Fonte: Resultados experimentais. Créditos das fotos à autora

Figura 87 - Gráfico que ilustra a média da concentração de sarmentosina em mg/g do extrato de B. pinnatum obtido do estudo de estresse hídrico.
Legenda: G0 - controle após 30 dias, G1- 50 mM, G2 - 100 mM e G3 - 200 mM; C - Controle; T - Tratamento. Valores expressos como média ± EPM (n = 10/ grupo). **P<0,001
e ***P<0,0001, quando comparado ao grupo T0G0 após ANOVA de uma via seguido de teste de Tukey. Fonte: Resultados experimentai

212
6 CONCLUSÕES
• Um método de cultivo foi padronizado para as espécies B. pinnatum e K. laciniata sob

diferentes condições de estresse salino e estresse hídrico;
• Ambos os cultivos seguidos de estresse foram capazes de alterar as características
morfológicas da folhas e o rendimento em biomassa para ambas espécies;
• A espécie B. pinnatum, tem um determinado nível de resistência ao estresse hídrico, tomando
como base a análise morfológica macroscópica, o rendimentos dos extratos e o perfil
metabólico apresentado, sendo capaz de resistir até pelo menos 20 dias suspensão de rega sem
alterar a produção dos metabólitos;
• Em relação ao estresse salino de B. pinnatum, é possível inferir que na menor concentração
de NaCl na água utilizada para rega, já há uma alteração de metabólitos em relação ao grupo
controle, no entanto, entre os grupos grupos salino (50, 100 e 200 mM), não há alteração na
produção de metabólitos;
• K. laciniata consegue resistir mais ao estresse hídrico e salino que B. pinnatum em termos
rendimento de extrato obtido a partir das mudas;
• O perfil metabólico dos extratos de B. pinnatum obtidos de diferentes condições de cultivo
foi caracterizado por Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência acoplada a um detector de
massas utilizando a ferramenta;
• A sarmentosina foi quantificado por RMN nos extratos de B. pinnatum submetidos a estresse
salino, na qual não é possível visualizar diferença entre os grupos tratrados com água salinizada
e os controles.

213
Capítulo 5 - Estudo de Cultivo e Metabolômico de Kalanchoe laciniata
7 PERSPECTIVAS
• Concluir a quantificação dos flavonoides majoritários de B. pinnatum nos extratos

submetidos a diferentes condições de cultivo por CLUE-DAD;
• Realizar a interpretação dos resultados por CLUE-EM/EM de B. pinnatum obtidos após as
análises quimiométricas;
• Quantificar a sarmentosina nos extratos de B. pinnatum submetidos a estresse hídrico;
• Realizar as análises por CLUE-EM/EM para os extratos de K. laciniata obtidos sob
diferentes condições de cultivo, realizar as análises quimiométricas e interpretar os resultados.

214
Capítulo 5 – Avaliação da inibição da atividade

fosfolipásica da peçonha de Bothrops Erythromelas por
extratos de Bryophyllum Pinnatum e Kalanchoe Laciniata
obtidos sob diferentes condições de cultivo

215
Capítulo 5 - Avaliação da inibição da atividade fosfolipásica da peçonha de Bothrops Erythromelas
CAPÍTULO 5 – AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO DA ATIVIDADE FOSFOLIPÁSICA DA

PEÇONHA DE Bothrops erythromelas POR EXTRATOS DE Bryophyllum pinnatum E
Kalanchoe laciniata OBTIDOS SOB DIFERENTES CONDIÇÕES DE CULTIVO
1 INTRODUÇÃO
Os acidentes causados por serpentes são considerados um problema de saúde pública,
não somente pela sua alta magnitude, mas também pela gravidade e sequelas marcantes, geradas
por cada um dos seus gêneros (BRASIL, 2010). A fauna ofídica brasileira de interesse médico
está representada pelos gêneros Bothrops, Crotalus, Lachesis e Micrurus, que tem como
principais representantes as serpentes popularmente conhecidas como, “jararaca”, “cascavel”,
“surucucu” e “coral-verdadeira”, respectivamente (BRASIL, 2001). Dentre eles, o gênero
Bothrops representa o grupo mais importante das serpentes peçonhentas, com mais de 60
espécies encontradas em todo o território brasileiro (BRASIL, 2005). Segundo o Ministério da
Saúde, esse gênero é responsável por cerca de 90% dos casos no Brasil (BRASIL, 2009b;
PINHO; PEREIRA, 2001). As principais espécies deste gênero são: B. atrox (acidente mais
frequente na Amazônia); B. erythromelas (regiões litorâneas e úmidas da região Nordeste); B.
jararaca (tem grande capacidade adaptativa, e comumente encontrada na região Sudeste); B.
jararacassu (predominante no Sul e Sudeste); B. moojeni (principal espécie do cerrado) e B.
alternatus (região Centro-Oeste a Sul) (BRASIL, 2005).
O tratamento específico do envenenamento consiste na administração o mais
precocemente possível, por via endovenosa do soro antibotrópico (SAB) e, na falta deste, das
associações antibotrópico-crotálico (SABC) ou antibotrópico-laquético (SABL), em ambiente
hospitalar (PINHO; PEREIRA, 2001). No entanto, o soro antiofídico, geralmente, não é capaz
de reverter com eficiência os efeitos locais teciduais causados pelo envenenamento, devido a
isso, o uso de anti-inflamatórios esteroidais ou não-esteroidais é comum para o alívio da dor e
de alguns sintomas locais, como edema e hemorragia (ARAÚJO et al., 2007; BRASIL, 2001;
GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1989).
Dentro deste contexto, plantas com potencial antiofídico tem despertado crescente
interesse, visando ao tratamento adjuvante à soroterapia e à fisiopatologia do envenenamento,
especialmente no tratamento de efeitos locais, visto que são fonte de inibidores naturais e de
substâncias farmacologicamente ativas (FÉLIX-SILVA et al., 2017; GUTIÉRREZ; LEÓN;
BURNOUF, 2011; GUTIÉRREZ, 2002; HOUGHTON; OSIBOGUN, 1993).

216
Nesse âmbito, outra proposta do presente trabalho foi avaliar e comparar os efeitos
inibitórios locais dessas espécies no envenenamento induzido por Bothrops erythromelas, tendo
em vista seu amplo uso popular para tratar problemas inflamatórios, e que os acidentes causados
por serpentes são um grave problema de saúde pública, e figuram na Lista de Doenças Tropicais
Negligenciadas da OMS desde 2009 (GUTIÉRREZ et al., 2013).
A literatura popular relata o uso das folhas da espécie B. pinnatum no uso de picadas de
serpentes e escorpiões (BAHEKAR; KALE; NAGPURE, 2013; SARKHEL, 2014; FÉLIX-
SILVA et al., 2017b). Estudos que avaliem a atividade antiofídica das espécies do gênero
Kalanchoe não são comuns na literatura. Foram encontrados apenas dois trabalhos com a
espécie K. laciniata que mostram a antagonização dos efeitos inflamatórios locais como
diminuição do grau de edema e do halo hemorrágico in vivo (FONSECA et al., 2004; MOURA
et al., 2015), no entanto, são resultados preliminares. No primeiro estudo, realizado por Fonseca
e cols (2004), foi realizada avaliação da atividade anti-hemorrágica in vivo do extrato por via
tópica, tanto administrado isoladamente quando incorporado ao creme lanete. No segundo,
Moura e cols (2015), a avaliação dos efeitos anti-hemorrágicos foi realizada por via
intradérmica, com a peçonha e o extrato administrados conjuntamente após pré-incubação nas
proporções 1:12 e 1:48 (veneno:extrato, p/p).
Nosso grupo de pesquisa trabalha com B. pinnatum e K. laciniata no envenenamento
botrópico desde 2013, e em estudo prévio, foi observada atividade inibitória dos extratos de
ambas espécies contra os efeitos locais induzidos pelo veneno de B. jararaca por via i.p. nas
doses de 125, 250 e 500 mg/kg (FERNANDES et al., 2016). Nesse estudo, realizamos uma
comparação entre essas espécies, e avaliamos as atividades anti-hemorrágica e
antiedematogênica no pré- e no pós-tratamento, bem como a inibição da ação fosfolipásica in
vitro. Esse foi o primeiro trabalho publicado na literatura com avaliação da espécie B. pinnatum,
além de ser o primeiro que aborda uma avaliação mais completa do potencial das espécies frente
a antagonização dos efeitos locais induzidos pelo envenenamento causado por B. jararaca.
Dentro desse contexto, há a necessidade de continuar investigando as espécies também com
outras serpentes do gênero Bothrops, como a B. erythromelas, sobretudo com os extratos
obtidos a partir das diferentes condições de cultivo empregadas no presente trabalho, bem como
encontrar os compostos responsáveis pela atividade.
O envenenamento botrópico causa hemorragia, incoagulabilidade sanguínea, choque
hipovolêmico, alterações cardiovasculares e renais, e um intenso processo inflamatório, com
lesão endotelial, dor, rubor e hemorragia, o que pode causar necrose no local de injeção do

217
veneno, que é geralmente atribuído à ação conjunta de diversas substâncias presentes no veneno
(GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1989; PINHO; PEREIRA, 2001; BRASIL, 2005).
Os venenos ofídicos são constituídos por uma mistura complexa de proteínas e
polipeptídeos farmacologicamente ativos, algumas com atividades enzimáticas, responsáveis
pelos efeitos locais e sistêmicos. As principais toxinas encontradas em venenos ofídicos são
fosfolipases A2 (PLA2), serinoproteases (SVSPs), metalloproteases (SVMPs),
acetilcolinesterases (AChEs), L-aminoacido-oxidases (LAAOs), nucleotidases e hialuronidases
(GUTIÉRREZ, 2002; PINHO; PEREIRA, 2001; KANG et al., 2011).
As PLA2s do veneno de serpentes são enzimas que possuem similaridade estrutural e
função catalítica semelhante à de mamíferos, no entanto são muito tóxicas e induzem um largo
espectro de efeitos farmacológicos. Hidrolisam especificamente a ligação éster sn-2-acil de
fosfolipídios, de foma cálcio dependente, liberando ácidos graxos livres e lisofosfolipídeos
(KINI, 2003; KINI, 2005; KANG et al., 2011). Essas enzimas podem conter um resíduo de
aspartato ou arginina na posição 49, sendo a presença de Asp49 essencial para a ligação do
cálcio (co-fator enzimático) a essas enzimas, assim, classificadas em PLA2 Asp49 ou Lys49
(LOMONTE; ANGULO; CALDERÓN, 2003; LOMONTE; RANGEL, 2012). As PLA2 com
Asp49 são enzimaticamente ativas, enquanto PLA2 com Lys49 apresentam pouca ou nenhuma
atividade enzimática, embora biologicamente os dois tipos sejam ativos (GUTIÉRREZ;
LOMONTE, 1995; ARNI; WARD, 1996; LOMONTE; RANGEL, 2012).
Sua atividade catalítica resulta na liberação do ácido araquidônico, desencadeando a
reação inflamatória. Frequentemente apresentam atividade hemorrágica, miotóxica, hemolítica,
formação do edema, hipotensiva, neurotóxica pré e pós-sináptica, cardiotóxica, de agregação
plaquetária e convulsivante, o que confere lhe um caráter altamente tóxico. Diversos estudos
demosntram que as PLA2s de venenos botrópicos estão envolvidos em respostas inflamatórias
tais como edema, dor, migração leucocitária, necrose e miotoxicidade (GUTIÉRREZ;
LOMONTE, 2013; 1995; 1989; ARNI; WARD, 1996).
Nesse contexto, os extratos obtidos dos estudos de cultivo submetidos aos estresses
abióticos de salinidade e suspensão de rega foram comparados farmacologicamente a partir da
avaliação da inibição in vitro da PLA2, a fim de comparar de que forma esses estresses podem
estar relacionados com aumento ou diminuição da inibição dessa enzima pelos extratos.

218
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar e comparar a inibição da atividade fosfolipásica da peçonha de B. erythromelas
pelo extratos de B. pinnatum e K. laciniata obtidos dos estudo de cultivo e estresse abióticos de
salinidade e suspensão de rega.

• Avaliar a influência do estresse hídrico (suspensão de rega) sobre a inibição da atividade
fosfolipásica in vitro dos extratos de B. pinnatum e K. laciniata;
• Avaliar a influência do estresse salino (salinidade) sobre a inibição da atividade fosfolipásica
in vitro dos extratos de B. pinnatum e K. laciniata;
• Verificar qual a melhor condição de suspensão de rega e salinidade na qual os extratos de B.
pinnatum e K. laciniata apresentam maior atividade inibitória.

219
3 METODOLOGIA
Para avaliação das atividades in vitro, seria inviável testar cada indivíduo
separadamente, uma vez que cada grupo possui um n de 10 indivíduos. Devido a isso, foram
coletados três pools (1 folha por indivíduo de cada grupo controle ou tratamento, totalizando
um pool com 10 folhas para a produção do EHEL) para cada grupo de cada estresse, salino e
hídrico, como descrito no item 3.3 deste capítulo. Dessa forma, buscando reduzir o número de
indivíduos mas garantindo a homogeneidade de cada grupo.
3.1 MATERIAL VEGETAL E EXTRATOS

Mudas autenticadas de Bryophyllum pinnatum (Lam) Pers. e Kalanchoe laciniata (L.)
DC. foram obtidas do Horto de Plantas Medicinais da Universidade Federal do Ceará (UFC)
em 2015. As mudas obtidas no horto da UFC foram utilizadas para iniciar o cultivo das espécies
por propagação vegetativa a partir das folhas como descrito no item 4.2 do capítulo 4. A
autorização do Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento
Tradicional Associado está sob número A7EA798 obtida 25 de março de 2018.
Os extratos foram preparados de acordo com metodologia descrita no item 4.3, do
capítulo 4 deste trabalho, a partir de um pool de indivíduos para avalição farmacológica
antiofídica in vitro.
3.2 VENENO OFÍDICO

A peçonha da serpente Bothrops erythromelas foi obtida por extração manual de
espécimes adultos provenientes do Museu Vivo de Répteis da Caatinga (São José da Mata, João
Pessoa, Paraíba) e então liofilizado e mantido a -20ºC até o uso. O uso científico do material
foi realizado mediante Autorização de Acesso e de Remessa de Componente do Patrimônio
Genético (Processo 010844/2013-9). A peçonha foi dissolvida em tampão fosfato-salino (PBS)
e sua concentração expressa em conteúdo de proteínas totais, determinado pelo método de
Bradford, utilizando soroalbumina bovina (BSA) como padrão (BRADFORD, 1976).
3.3 INIBIÇÃO DA ATIVIDADE FOSFOLIPÁSICA

A atividade fosfolipásica da peçonha foi determinada turbidimetricamente utilizando
suspensão de gema de ovo como substrato, conforme descrito previamente na literatura, com
pequenas modificações (FÉLIX-SILVA et al., 2017).

220
Primeiramente, gema de ovo foi misturada com PBS na proporção 1:3 (v/v, gema de ovo:
PBS) e centrifugada a 400 rpm por 2 min a temperatura ambiente, para a partir do sobrenadante
obter-se a suspensão estoque de gema de ovo. A concentração de substrato a ser utilizada nos
ensaios foi determinada como aquela com absorbância de 0,6 a 925 nm, que foi uma diluição
de 10% da suspensão estoque de gema de ovo em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,4 contendo
NaCl 200 mM e CaCl2 5 mM.
Para o ensaio, diferentes concentrações de peçonha foram pré-incubadas por 30 min a
37ºC em um volume final de 100 μL. Em seguida, 100 μL de substrato foram adicionados e
incubados por 30 min a 37ºC. Passado o período de incubação, a absorbância foi lida a 925 nm,
utilizando uma leitora de microplacas (Epoch-BioTek, Winooski, VT, EUA). Brancos foram
preparados da mesma forma, substituindo o substrato por igual volume de tampão. Uma
concentração mínima fosfolipásica foi definida como a menor quantidade de peçonha capaz de
produzir um decréscimo de 50% da turbidez em relação ao controle em que se incubou apenas
substrato (ausência de peçonha).
Para os ensaios de inibição, a concentração mínima fosfolipásica (5 µg) foi pré-incubada
com todos os EHEL, provenientes dos pools de indivíduos, a 1 mg/mL, a 37ºC por 30 min, e
em seguida o ensaio realizado conforme descrito anteriormente. Os resultados foram expressos
como porcentagem de atividade fosfolipásica em relação ao controle em que apenas peçonha
foi incubada (considerado 100% de atividade fosfolipásica), com n = 3.
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os testes de hipóteses (análise de variância, Anova, seguido de teste de Tukey) para
comparação das médias nos ensaios foram realizados através do software estatístico GraphPad
Prism® versão 5.00. P-valores menores que 0,05 foram considerados significativos.

221
As fosfolipases A2 (PLA2s) representam uma superfamília de enzimas lipolíticas que
catalisam, especificamente, a hidrólise da ligação éster na posição sn-2 de glicerofosfolipídeos,
resultando na geração de ácidos graxos (araquidonato) e lisofosfolipídeos (DE PAULA et al.,
2009). Além de sua função catalítica, PLA2s de venenos ofídicos também possuem atividades
farmacológicas adicionais que podem ser dependentes ou independentes de sua atividade
catalítica. Atividades hemorrágica, miotóxica, hemolítica, edematogênica e neurotóxica são
exemplos de atividades descritas para PLA2s, implicando a participação dessas toxinas em
diversos efeitos tóxicos e/ou farmacológicos observados em envenenamentos ofídicos (ARNI;
WARD, 1996).
A atividade fosfolipásica in vitro testada dos extratos obtidos do cultivo de indivíduos de
B. pinnata e K. laciniata submetidas aos estresse hídrico e salino, neste estudo, avaliou, apenas
as Asp49 PLA2s, ou seja, as enzimaticamente ativas. Nas Figuras 88, 89, 90 e 91, podem ser
visualizados os valores de concentração inibitória em porcentagem dos extratos a 1 mg/mL para
cada grupo controle e tratado dos estresses de salinidade e suspensão de rega, tanto para B.
pinnata quanto para K. laciniata. Seguindo a mesma tendência do que obtivemos em estudo
anteriores (FERNANDES et al., 2016), os extratos de B. pinnatum demonstraram uma maior
atividade em relação aos de K. laciniata, especialmente nas condições de estresse hídrico.
Como pode visualizado na figura 88, há diferenças estatisticamente significativas
(P<0,05) entre os grupos tratamento T10T, T20T, T10cT e T30T em relação ao grupo controle
T0 (ou seja, aquele que reflete as condições da planta antes de começarem os tratamentos).
Outro dado importante a se notar é que houve um aumento da inibição da atividade fosfolipásica
da peçonha, se compararmos o T5T em relação aos demais grupos tratamento T10T, T20T e
T30T, com exceção do T10cT no qual não houve diferenças estatísticas em relação ao T5T
(P<0,05). Ainda seguindo esse raciocínio, uma dado interessante a se discutir é que a inibição
da atividade fosfolipásica da peçonha no T20T é maior que no T30T, sugerindo que até 20 dias
de suspensão de rega, temos o aumento da inibição, ou seja, temos o extrato mais ativo, no
entanto, após um período mais prolongado de 30 dias de suspensão de rega começa a haver uma
diminuição da eficácia do extrato frente a PLA2. Comparando com os dados obtidos das
análises quimiométricas, figuras de 71 a 76 (Capítulo 4), há ligeiras diferenças entre esses dois
grupos em relação a correlação as componentes principais. Isso sugere que talvez uma alteração
no rendimento não influencie na atividade do extrato, mas apenas a produção de compostos
relacionados.

222
É importante discutir o resultado de inibição obtido para o T10cT quando comparado

ao seu controle (T20C), mostra uma atividade inibitória mais discreta, semelhante aos demais
grupos controle e tratamento de estresse hídrico com menos tempo de suspensão de rega (T5 e
T10). Isso corrobora com dados dos testes quimiométricos, que não mostra diferenças na
composição química até 20 dias de tratamento.
Por último, ainda discutindo a figura 88, vale salientar que não existe diferenças
estatisticamente significativas entre os grupos controle e tratamento na maioria das condições
de estresse hídrico, a saber T5 (5 dias de suspensão de rega), T10 (10 dias de suspensão de
rega), T30 (30 dias de suspensão de rega) e T10c (10 dias de suspensão de rega, seguido de 10
dias de rega normal em relação ao controle T20C), com exceção do tratamento de 20 dias de
suspensão de rega, no qual controle e tratamento foram significativamente diferentes (P<0,05).
Diante do que foi discutido, o grupo T20T apresentou melhor atividade inibitória da
ação fosfolipásica da peçonha de B. erythromelas, apresentando uma condição cultivo
importante para aumento da atividade de B. pinnatum, assim corroborando com o que foi
encontrados nas análises de biomassa para as mudas dessa espécie.
Figura 88 - Inibição da atividade fosfolipásica da peçonha de B. erythromelas para os extratos de cada grupo
controle e tratamento de estresse hídrico de B. pinnatum.
Legenda: Dias de tratamento (suspensão de rega) - T0, T5, T10, T20, T10c e T30; C - Controle; T - Tratamento.
Valores expressos como média ± EPM (n = 5/ grupo). ***P<0,001, quando comparado ao T5T após ANOVA de
uma via seguido de teste de Tukey. Fonte: Resultados experimentais.
Na indução do estresse salino de B. pinnatum (figura 89), temos outro resultado bastante
interessante em relação a atividade fosfolipásica que contrasta com as observação da

223
composição química após a análise quimiométrica (figuras de 81 a 84 do capítulo 4). Nos testes
de PCA e PLS, não houve diferenças entre as constituições químicas entre os grupos salino, no
entanto, na avaliação da inibição da atividade fosfolipásica, é possível sugerir que o grupo
T30G3 apresentou menor ou nenhuma inibição dessa enzima. Além disso, é possível perceber
que atividade do extrato no grupo T30G1 não é diferente do T0G0 (P<0,05), sugerindo que
uma salinidade mínima pode favorecer a inibição da atividade da fosfolipase pelo extrato de B.
pinnatum. Assim, pode-se afirmar que, no estudo de estresse salino, as condição de salinidade
a 50 e 100 mM (G1 e G2, respectivamente) são importantes para a manutenção da atividade do
extrato de B. pinnatum frente a ação fosfolipásica da peçonha de B. erythromelas.
controle e tratamento de estresse salino de B. pinnatum.
Valores expressos como média ± EPM (n = 3/ grupo). **P<0,01, quando comparado aos grupos T30G1 e T30G2
após ANOVA de uma via seguido de teste de Tukey. Fonte: Resultados experimentais.
Em relação a K. laciniata, os resultados ainda não podem ser correlacionados com os

dados químicos, uma vez que a análise CLUE-EM ainda não foi realizada. A partir do gráfico
da figura 90, não há muitas diferenças entre os grupos controle e tratamento (P<0,05), apenas
os grupos T5C e T5T apresentam diferenças em relação ao controle T0. A um P<0,05, todos os
grupos tratamento em diferentes tempos de suspensão de rega (T10T, T20T, T10cT e T30T),
são estatisticamente diferentes de T5T, mostrando uma diminuição da inibição da atividade da
fosfolipase pelo extrato. Esse último achado é bastante interessante, uma vez que ocorre
justamente o contrário com B. pinnatum, isto é, para essa espécie, há um aumento da atividade

224
do extrato frente a PLA2 até 20 dias de suspensão de rega, voltando a diminuir com 30 dias,
mas não na mesma intensidade que se visualiza do T30T de K. laciniata.
Ainda na figura 90, vale salientar que não existe diferenças estatisticamente
significativas entre os grupos controle e tratamento de cada condição de estresse hídrico, a saber
T5 (5 dias de suspensão de rega), T10 (10 dias de suspensão de rega), T20 (20 dias de suspensão
de rega), T30 (30 dias de suspensão de rega) e T10c (10 dias de suspensão de rega, seguido de
10 dias de rega normal).
Por fim, ao contrário do que aconteceu na avaliação do estresse hídrico de B. pinnatum,
na qual grupo T20T apresentou melhor atividade inibitória, para K. laciniata, a melhor condição
foi o T5T, apresentando-se como uma condição cultivo importante para aumento da atividade
frente a ação da PLA2 de B. erythromelas para essa espécie. No entanto, é necessário que essa
avaliação seja realizada novamente, uma vez que há também a diminuição da atividade dos
grupos controles, o que significa um possível viés para esse resultado.
controle e tratamento de estresse hídrico de K. laciniata.
Legenda: Dias de tratamento (suspensão de rega) - T0, T5, T10, T20, T10c e T30; C - Controle; T - Tratamento.
Valores expressos como média ± EPM (n = 3/ grupo). ***P<0,001, quando comparado ao T5T após ANOVA de
uma via seguido de teste de Tukey. Fonte: Resultados experimentais.
Em relação ao estresse salino de K. laciniata (figura 91), os grupos T30G1 e T30G2,

mostraram significativamente diferentes em relação ao controle T0G0, assim como em relação
ao T30G0 (P<0,05). Quando comparados os grupos tratamento, após 30 dias de estresse salino
(a saber: G1 - 50 mM NaCl, G2 - 100 mM NaCl e G3 - 50 mM NaCl), não houve diferenças de
inibição significativas entre os grupos T30G1 e T30G2, no entanto, é possível notar que após

225
comparação entre esses grupos e o grupo T30G3, há uma marcante diminuição da atividade,
assim como em B. pinnatum. Há um fato bastante curioso no estresse salino de K. laciniata
quando comparado ao de B. pinnatum em relação a inibição da PLA2 da peçonha, pois nesta
última apesar de nos T30G1 e T30G2 haver maior atividade quando comparados aos mesmos
grupos de K. laciniata, o T30G3 é mais ativo que o T30G3 de B. pinnatum. Diante do exposto,
e corroborando com os resultados de B. pinnatum, pode-se afirmar que, no estudo de estresse
salino, as condição de salinidade a 50 e 100 mM (G1 e G2, respectivamente) são importantes
para a manutenção da atividade do extrato de K. laciniata frente a ação fosfolipásica da peçonha
de B. erythromelas.
controle e tratamento de estresse salino de K. laciniata.
30
% de inibição
20
10 **
0
0
3
0
G
0G
0G
0G
0G
T0
T3
T3
T3
T3
Valores expressos como média ± EPM (n = 3/ grupo). **P<0,001, quando comparado aos grupos T30G1 e T30
G2 após ANOVA de uma via seguido de teste de Tukey. Fonte: Resultados experimentais.
Em relação ao mecanismo de inibição da PLA2, todos as substâncias naturais que

apresentam atividade estudados até agora, demostram que o encaixe no sítio ativo da PLA 2, é
realizado por meio de ligações de hidrogênio entre os grupos hidroxila ou átomos de oxigênio
com os resíduo de histidina 48 (His48) e aspartato 49 (Asp49) de forma direta ou por meio de
uma molécula de água (KANG et al., 2011). Os flavonoides identificados para K. laciniata
(derivados glicosilados de patuletina) possuem pelo menos três hidroxilas na aglicona, portanto,
se forem os compostos ativos, a ligação ao sítio ativo pode ser via hidroxilas fenólicas. Não há
estudo que descreva a atividade de derivados de patuletina como inibidores das enzimas PLA2s,
assim, faz-se necessário avaliar a atividade dos flavonoides isolados. Já os flavonoides

226
identificados para B. pinnatum (quercetina, canferol, luteolina e seus derivados glicosilados)

possuem pelo menos três hidroxilas na aglicona, portanto, se forem os compostos ativos, a
ligação ao sítio ativo pode ser também via hidroxilas fenólicas. Sabe-se que rutina, quercetina,
canferol e luteolina inibem enzimas pró-inflamatórias, especificamente iNOS, PLA2, COX e
LOX (GARCÍA- MEDIAVILLA et al., 2007; NIJVELDT et al., 2012).

227
5 CONCLUSÕES
• Há um aumento da atividade do extrato de B. pinnatum frente a atividade da PLA2 da

peçonha de B. erythromelas com o aumento do tempo de suspensão de rega até o T20, sendo a
melhor condição de estresse para essa espécies;
• Ocorre justamente o contrário para K. laciniata, ou seja, há uma diminuição da atividade do
extrato frente a atividade da PLA2 da peçonha de B. erythromelas com o aumento do tempo de
suspensão de rega, sendo a condição T5 dias de suspensão de rega, a melhor para a espécies;
• No estresse salino, ambas as espécies apresentaram boa inibição da PLA2 nos grupos T30G1
e T30G2, mas diminuindo a atividade dos extratos na maior concentração de NaCl no T30G3
(200 mM), dessa forma, os tratamentos 50 e 100 mM de NaCl foram os melhores para a
atividade dos extratos;
• Por fim, independente dos tipos de estresse que as espécies sejam submetidas, B. pinnatum
sempre se apresenta como mais ativa na inibição da PLA2.

228
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244
Apêndices

245
ARTIGOS PUBLICADOS DURANTE O PERÍODO DA TESE
1. FERNANDES, J. M.; CUNHA, L. M. ; AZEVEDO, E. P.; LOURENÇO, E. M. G.;

FERNANDES-PEDROSA, M. F.; ZUCOLOTTO, S. M. Kalanchoe laciniata and Bryophyllum
pinnatum: an updated review about ethnopharmacology, phytochemistry, pharmacology and
toxicology. Revista Brasileira de Farmacognosia-Brazilian Journal of Pharmacognosy, v.
29, p. 529-558, 2019.
2. DE ARAÚJO, E. R. D.; FÉLIX-SILVA, J.; XAVIER-SANTOS, J. B.; FERNANDES, J.

M.; GUERRA, G. C. B.; DE ARAÚJO, A. A.; ARAÚJO. D. F. S.; DE SANTIS FERREIRA,
L.; SILVA-JÚNIOR, A. A.; FERNANDES-PEDROSA, M. F.; ZUCOLOTTO, S. M. Local
anti-inflammatory activity: Topical formulation containing Kalanchoe brasiliensis and
Kalanchoe pinnata leaf aqueous extract. Biomedicine & Pharmacotherapy, v. 113, p. 108721,
2019.
3. FÉLIX-SILVA, J.; GOMES, J. A. S.; FERNANDES, J. M.; MOURA, A. K. C.; MENEZES,

Y. A. S.; SANTOS, E. C. G.; TAMBOURGI, D. V.; SILVA-JUNIOR, A. A.; ZUCOLOTTO,
S. M.; FERNANDES-PEDROSA, M. F. Comparison of two Jatropha species (Euphorbiaceae)
used popularly to treat snakebites in Northeastern Brazil: Chemical profile, inhibitory activity
against Bothrops erythromelas venom and antibacterial activity. Journal of
Ethnopharmacology, v. 213, p. 12-20, 2018.
4. FONSECA, A. G.; RIBEIRO DANTAS, L. L. S. F.; FERNANDES, J. M.; ZUCOLOTTO,

S. M.; LIMA, A. A. N.; SOARES, L. A. L.; ROCHA, H. A. O.; LEMOS, T. M. A. M. In Vivo
and In Vitro Toxicity Evaluation of Hydroethanolic Extract of Kalanchoe brasiliensis
(Crassulaceae) Leaves. Journal of Toxicology, v. 2018, p. 1-8, 2018.
5. DE ARAÚJO, E.; GUERRA, G.; ARAÚJO, D.; DE ARAÚJO, A.; FERNANDES, J.; DE
ARAÚJO JÚNIOR, R.; DA SILVA, V.; DE CARVALHO, T.; FERREIRA, L.; ZUCOLOTTO,
S. Gastroprotective and Antioxidant Activity of Kalanchoe brasiliensis and Kalanchoe pinnata
Leaf Juices against Indomethacin and Ethanol-Induced Gastric Lesions in Rats. International
Journal of Molecular Sciences, v. 19, p. 1265, 2018.

246
6. XAVIER-SANTOS, J. B. ; FÉLIX-SILVA, J.; PASSOS, J. G. R. ; GOMES, J. A. S. ;

FERNANDES, J. M. ; GARCIA, V. B.; DE ARAUJO-JUNIOR, R. F.; ZUCOLOTTO, S. M. ;
SILVA-JUNIOR, A. A. ; FERNANDES-PEDROSA, M. F. Development of an effective and
safe topical anti-inflammatory gel containing Jatropha gossypiifolia leaf extract: Results from
a pre-clinical trial in mice. Journal of Ethnopharmacology, v. 227, p. 268-278, 2018.
7. RODRIGUES, R. O.; DAMASCENO, G. A. B.; BARRETO, S. M. A. G.; FERNANDES,

J. M.; TELAPROLU, K. C.; ROCHA-FILHO, P. A.; SOARES, L. A. L.; OSTROSKY, E. A.;
SALES, V. S. F.; LANGASSNER, S. M. Z.; FERRARI, M. Vegetable moisturizing raw
material from -Caatinga- Brazilian biome: safety and efficacy evaluations of O/W cosmetic
emulsions containing Kalanchoe brasiliensis extract. Brazilian Journal of Pharmaceutical
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8. DE SOUZA MARINHO DO NASCIMENTO, D.; OLIVEIRA, R.; CAMARA, R.; GOMES,

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Baccharis trimera (Less.) DC Exhibits an Anti-Adipogenic Effect by Inhibiting the Expression
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9. DE ARAÚJO, D. R. C.; DA SILVA, L. C. N.; HARAND, W.; FERNANDES, J. M.;

SOARES, T. C.; LANGASSNER, S. M. Z.; GIORDANI, R. B.; XIMENES, R. M.; DA SILVA,
A. G.; DA SILVA, M. V.; DOS SANTOS CORREIA, M. T. Effects of Rainfall on the
Antimicrobial Activity and Secondary Metabolites Contents of Leaves and Fruits of
Anadenanthera colubrina from Caatinga Area. Pharmacognosy Journal, v. 9, p. 435-440,
2017.
10. DA SILVA SIQUEIRA, E. M.; FÉLIX-SILVA, J.; DE ARAÚJO, L. M. L.; FERNANDES,

J. M.; CABRAL, B.; GOMES, J. A. S.; DE ARAÚJO ROQUE, A.; TOMAZ, J. C.; LOPES,
N. P.; FERNANDES-PEDROSA, M. F.; GIORDANI, R. B.; ZUCOLOTTO, S. M. Spondias
tuberosa (Anacardiaceae) leaves: profiling phenolic compounds by HPLC-DAD and LC-
MS/MS and anti-inflammatory activity. BMC. Biomedical Chromatography, v. 30, p.
1656?1665, 2016.

247
11. GOMES, J. A. S.; FÉLIX-SILVA, J.; FERNANDES, J. M.; GERALDO AMARAL, J.;
LOPES, N. P. ; TABOSA DO EGITO, E. S.; DA SILVA-JÚNIOR, A. A.; ZUCOLOTTO, S. ;
FERNANDES-PEDROSA, M.ATHEUS F. Aqueous Leaf Extract of Jathropha mollissima
(Pohl) Bail Decreases Local Effects Induced by Bothropic Venom. BioMed Research
International, v. 2016, p. 1-13, 2016.
Citações:1
12. FERNANDES, J. M.; FÉLIX-SILVA, J. ; DA CUNHA, L. M.; GOMES, J. A. S.;

SIQUEIRA, E. M. S.; GIMENES, L. P.; LOPES, N. P. ; SOARES, L. A. L.; FERNANDES-
PEDROSA, M. F.; ZUCOLOTTO, S. M. Inhibitory Effects of Hydroethanolic Leaf Extracts of
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by Bothrops jararaca Snake Venom. Plos One, v. 11, p. e0168658, 2016.
13. MATOS, L. L.; FERNANDES, J. M.; FERREIRA, M. R. A. ; LANGASSNER, S. M. Z.;

SOARES, L. A. L. . Avaliação de metodologia analítica espectrofotométrica para quantificação
de flavonoides totais nas folhas de Kalanchoe brasiliensis Camb. (Crassulaceae). Boletim
Informativo Geum, v. 7, p. 7-15, 2016.
14. DAMASCENO, G. A. B.; SILVA, R. M. A. C.; FERNANDES, J. M.; OSTROSKY, E.

A.; LANGASSNER, S. M. Z.; FERRARI, M.. Use of Opuntia ficus-indica (L.) Mill extracts
from Brazilian Caatinga as an alternative of natural moisturizer in cosmetic formulations.
Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences (Online), v. 52, p. 459-470, 2016.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

JÚLIA MORAIS FERNANDES

Bryophyllum pinnatum E Kalanchoe laciniata: ESTUDO FITOQUÍMICO,

Bryophyllum pinnatum E Kalanchoe laciniata: ESTUDO FITOQUÍMICO,

Tese de Doutorado apresentada à Coordenação do

Fernandes, Júlia Morais.

Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade

1. Crassulaceae - Tese. 2. Metabolômica - Tese. 3. Marcadores

RN/UF/BS-CCS CDU 582.6/.9

Elaborado por ANA CRISTINA DA SILVA LOPES - CRB-15/263

À minha orientadora, Silvana Zucolotto, por toda a dedicação, apoio e paciência

Júlia Morais Fernandes

Júlia Morais Fernandes

Júlia Morais Fernandes

Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas por todo

Júlia Morais Fernandes

Aos colegas do Laboratoire de Farmacognosie da Université Paris Descartes. À

Júlia Morais Fernandes

Júlia Morais Fernandes

“Os que confiam no Senhor são como

“Para tudo há um tempo, para cada coisa

“Deus te vê, Deus te entende... Basta

“A imaginação é mais importante que a

“Talvez não tenha conseguido fazer o

“Seja a mudança que você quer ver no

“A alegria está na luta, na tentativa, no

Júlia Morais Fernandes

As espécies Kalanchoe laciniata (L.) DC. e Bryophyllum pinnatum (Lam) Pers.

PALAVRAS-CHAVE: Crassulaceae; metabolômica; marcadores químicos; fitoterápico.

Júlia Morais Fernandes

KEY-WORDS: Crassulaceae; metabolomic; chemical markers; herbal medicine.

Júlia Morais Fernandes

Figura 1 – Estrutura do rotor. .................................................................................................. 61

Júlia Morais Fernandes

Figura 29 – Estrutura química de Bp2. .................................................................................. 112

Júlia Morais Fernandes

Figura 59 - Resumo do processo de isolamento conduzido para K. brasiliensis. ................. 166

Júlia Morais Fernandes

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Tabela 1 - Condições cromatográficas para análise por CCD. ................................................ 72

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AcOEt Acetato de Etila

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CAPÍTULO 1 – REVISÃO DE LITERATURA – Artigo publicado na revista Brasileira

CAPÍTULO 2 - ESTUDO QUÍMICO DE Bryophyllum pinnatum .................................... 59

Júlia Morais Fernandes

5.2.1 Identificação dos flavonoides ........................................................................................ 97

CAPÍTULO 3 - ESTUDO QUÍMICO DE Kalanchoe laciniata........................................ 155

CAPÍTULO 4 – ESTUDO DE CULTIVO E METABOLÔMICO DE Bryophyllum

Júlia Morais Fernandes

4.3 PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS E ANÁLISES ......................................................... 189

CAPÍTULO 5 – ESTUDO ANTIOFÍDICO IN VITRO de Bryophyllum pinnatum e

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 229

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Capítulo 1 – Revisão de Literatura:

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