15

AULA 3. RELAÇÃO ENTRE PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS E TOXICIDADE E

ANÁLISE DE RESÍDUOS

LEITURA SUGERIDA: Seu velho livro de química geral, química orgânica e/ou bioquímica.
Revise os tipos de ligações químicas.
I. PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE TOXINAS AMBIENTAIS

A. Definindo propriedades físicas e químicas.

1. Propriedades físicas (solubilidade e partição) responsável por carrear a toxina para

o sítio de ação e/ou enzimas metabólicas.

2. Propriedades químicas (ligação e reatividade) governa ação no sítio e estabilidade

metabólica.

3. Propriedades físicas e químicas estão muito relacionadas e dependem uma da

outra.

B. Propriedades físicas e químicas importantes.

1. Adsorção – concentração de uma substância reversível em uma superfície, como

por exemplo, a combinação de uma toxina com seu receptor. Incluem-se ligações
de van der Waals, pontes de hidrogênio e ligações iônicas.

a) aumenta a oportunidade para reação;

b) proteínas de soro como carreadoras de toxinas;

c) enorme área específica disponível, ex. 1 ml de soro humano contém 100 m2 de

superfície de proteína.

2. Ionização – importante por que muitas substâncias biologicamente ativas são

capazes de ionizar. Íons e suas moléculas neutras correspondentes comportam-se
diferentemente em consideração a:

- diferentes reações

- diferentes propriedades de penetração (carga repele ou atrai e liga-se)

- diferentes superfícies que absorvem

a) HA H+ + A-

molécula não ionizada cátion + anion

b) Constante de ionização = conc. de ânion x conc. de cátion

conc. de molécula neutra
 16

[ H+ ] [ A- ]
Ka = ________
[HA]

c) pKa = -log Ka = logaritmo negativo da constante de ionização

= O pH em que metade da substância está ionizada e
a outra metade não.

d) exemplo: o ácido fraco nitrofenol com pKa = 7

% ionizado = 100
1 + antilog (pKa - pH)

pKa - pH pH % ionizado
-2 9 99.01
-1 8 90.91
0 7 50.00
1 6 9.09
2 5 0.99

e) Ácidos fortes tem baixo pKa's - ex) tricloroacético 1.7

Ácidos fracos tem pKa's maiores - ex) acético 4.7

f) A decomposição ou reação de uns poucos íons leva a formação de mais íons

por ação de massa HA H+ + A- (remove íons e mais se formam)

g) Ionização de tóxicos pode afetar a toxicidade dependendo de qual forma está

ativa.

3. Solubilidade

a) Semelhante dissolve semelhante, mas o que determina se duas testemunhas

são miscíveis é:

i. Polaridade – grau de simetria eletrônica (um termo relativo). Uma molécula

que está eletronicamente desbalanceada, diz-se que esta é polar

- sal iônico Na+Cl- ----> polar devido a separação de cargas

- CH4 – não polar (simétrica)

CH3 - mais polar (menos simétrica)

- efeito de ligação (benzeno levemente mais polar que ciclohexano)

- efeito do tamanho da cadeia (pentano mais polar que hexano,

metanol mais polar que isobutanol)
 17

ii. Afinidade eletrônica

Eletrofílico (aceita elétrons) F> Cl > Br > I

Nucleofílico (doa elétrons) O- > S-

iii. Momento dipolo – grau de polaridade, determinado pelo produto da carga em

qualquer dos finais da molécula vezes a distância separando as duas cargas.
Aumenta com o aumento da quantidade de carga que está separada ou com
o aumento da distância entre as cargas.

4. Coeficiente de Partição (P) – a razão da concentração de um soluto em duas fases

imiscíveis em equilíbrio em uma dada temperatura. Frequentemente medida entre
octanol e água (medida do caráter lipofílico de uma molécula). Usualmente
expressado como log P.

D. As propriedades físicas e químicas discutidas acima determinam muito se um dado

composto terá propriedades tóxicas. Numerosos processos contribuem para a
atividade biológica de um dado composto e todos eles são determinados em grande
extensão pelas propriedades físico-químicas dos compostos.

- Penetração
- Distribuição
- Metabolismo
- Excreção
- Interação sítio alvo

Cada um destes conceitos será discutido em detalhes ao longo das várias aulas a
seguir.

II. ANÁLISE DE RESÍDUO (TOXICOLOGIA ANALÍTICA)

A. Ainda com relação às propriedades físico-químicas de uma toxina está o conceito de

análise de resíduo, já que as propriedades de um inseticida determinarão as técnicas
que podem ser usadas para detectá-lo.

B. Após a introdução de uma toxina no meio ambiente, os depósitos destes compostos e

seus possíveis produtos de degradação são combinados com substâncias comestíveis,
sistemas biológicos, água, solo, ar e nomeados de “resíduos tóxicos”. “Análise de
resíduo” é a qualificação e quantificação destes resíduos. Produtos de degradação são
moléculas de toxinas alteradas resultantes das intempéries por processos químicos no
meio ambiente tais como hidrólise, ação fotoquímica (luz solar), e oxidação.
Metabólitos são toxinas alteradas resultantes de processos bioquímicos dentro de um
organismo após exposição à toxina. Ambos os produtos paralelos são importantes,
uma vez que podem ser tão tóxico ou mais tóxico quanto os compostos iniciais ou mais
persistentes, e desta forma deveriam ser incluídos na análise de resíduo.

Quase toda fase da proteção ambiental e controle de poluição depende da habilidade

de identificar e precisamente medir poluentes específicos no meio ambiente. Avaliação
 18

dos efeitos na saúde, desenvolvimento de tecnologias de controle de poluição,

decisões legislativas são todas grandemente afetadas por nossa habilidade de
precisamente medir poluentes, e por causa das implicações financeiras, políticas e
legais do uso de toxinas, resultados aproximados ou incorretos podem ser piores do
que nenhum de fato.

C. Por causa da complexidade de análises de resíduos, existem dois tipos principais de

incertezas analíticas derivadas delas.

1. Verdadeira identidade do contaminante – Após varias tentativas de identificação

serem feitas, uma variedade de identificações químicas, cromatográficas e
espectrofotométricas ainda é requerida.

2. Quantidade real do contaminante analisado – controle de qualidade: a mais

importante e essencial ferramenta para assegurar a confiabilidade do dado
analítico. QC = procedimentos tomados para assegurar a acuracidade e precisão
dos resultados analíticos.

D. Seqüência geral para a análise de resíduos

1. SAMPLING, HANDLING,
PRESERVATION, STORAGE

2. SAMPLE PREPARATION

3. liquid sample: liquid-liquid partitioning

EXTRACTION solid sample: soxhlet, blending, ultrasonic

adsorption chromatography
4. TLC
CLEANUP chemical: acid, base
sulfur removal: mercury, activated copper

GLC/HPLC with selective/specific detectors

GC/MS
5. DETERMINATION spectrophotometric methods
TLC
Radiochemical techniques

chemical derivatization
6. CONFIRMATION specific detectors
OF IDENTITY GC/MS
other chromatographic techniques

intralaboratory quality control programs

7. CONFIRMATION interlaboratory quality control programs
OF QUANTITY use of standard reference materials

Figure 1. Passos básicos para a análise de resíduos.

1. Amostragem, transporte, armazenamento e preservação

a) Amostragem é uma atividade crítica para a geração de dados válidos e deveria

envolver um conjunto padrão de regras gerais e procedimentos baseados em
um esquema de amostragem válido estatisticamente.
 19

b) Uma vez que as amostras são coletadas em recipientes adequados, elas devem
ser imediatamente transportadas ao laboratório para análises. Os
procedimentos de transporte devem ser concebidos para assegurar a
integridade da amostra tal que os dados gerados dela reflitam as condições
reais da amostra no momento da coleta.

c) Usualmente é necessário armazenar amostras por períodos prolongados antes

de analisar e nestes casos preservativos ou congelamento podem ser
necessários para manter a integridade da amostra.

2. Preparo da amostra: antes da análise, a amostra pode requerer algum

processamento para torná-la adequada para a extração (ex. material vegetal ou
animal é usualmente picado, moído ou misturado; e solo é usualmente misturado,
peneirado, seco e moído).

3. Extração: uma vez que a maioria das amostras não pode ser diretamente analisada
para resíduos de tóxicos, extração é então requerida para isolar a contaminação
alvo da amostra matriz. A extração resulta em solução de resíduos e amostras co-
extrativas. Não existe método único ou sistema de solvente que seja bom para
todos os tipos de substratos de amostras e toxinas. Algumas considerações gerais
incluem:

a) pureza dos solventes (impurezas < 1 ppb)

b) seleção do sistema de solvente – deve extrair eficientemente a molécula alvo e

minimizar co-extrativos. Usualmente determinado por corrida de testes de picos
de recuperação para determinar qual sistema de solventes produz ótima
recuperação da molécula.

c) seleção do procedimento – é ditado pelo tipo de amostra e eficiência de

extração. Inclui técnicas tais como misturar, agitação e ultrasonicação.

4. Limpeza – isolamento da toxina alvo dos co-extratos interferentes. Dependente do

tipo de amostra e seletividade do método de detecção.

a) Partição líquido-líquido – dependente do coeficiente de partição. Conduzido em

dois líquidos imiscíveis.

b) Cromatografia de partição – efetiva na remoção de pigmentos interferentes,

ceras, pequenas quantidades de gorduras e outras impurezas de amostras de
resíduos.

Através de eluição graduada (eluição de uma coluna de adsorvente tal como

sílica ou alumina com um solvente menos polar primeiro, seguido de eluição
com um ou vários solventes mais polares, de modo a aumentar a polaridade) o
fracionamento de tóxicos é efetivado.

Princípios similares aplicam-se para cromatografia de camada fina exceto que o

adsorvente é usado como uma fina camada sobre um suporte rígido como, por
exemplo, uma placa de vidro.
 20

c) Limpeza química – a amostra extraída é tratada com base ou ácido forte para
destruir ou remover materiais interferentes. Uma vez que muitos resíduos
alteram sob estas condições, não é amplamente aplicável.

E. Métodos de quantificação de resíduos

1. Cromatografia Gás - líquido

a) A cromatografia de gás é o instrumento mais importante e amplamente usado

na rotina de análise de resíduos.

Figura 2. Componentes básicos de um equipamento GLC.

b) GLC é um tipo de cromatografia de partição no qual o composto de interesse é

particionado entre a fase móvel (gás) e a fase estacionária (líquida) que está
ligada a um suporte sólido inerte. Em colunas empacotadas, o suporte sólido
usualmente consiste de terras diatomáceas, teflon ou pelotas de vidro puro. Em
colunas capilares, a fase liquida está ligada no interior de uma coluna de
diâmetro muito estreito composta de vidro borosilicato.

A fase estacionária é um material que permanece estacionário em uma coluna

de GC enquanto o soluto injetado particiona entre ela e a fase móvel ou gasosa.
A fase estacionaria é um líquido na temperatura de operação e, portanto,
referido como a fase líquida. A escolha da fase estacionária é grandemente
determinada pela resolução e requerimentos de temperatura e concluída por
tentativa e erro.

2. Detectores: dois requerimentos básicos de detectores GLC incluem seletividade e

sensibilidade. Devem ser sensíveis a quantidades traços de inseticidas e
seletivos suficientes tal que amostras co-extrato não interfiram na quantificação.

a) Captura de elétrons – extremamente sensível para compostos halogenados.

 21

Operação: uma fonte radioativa (63Ni ou 3H) produz raio de elétrons que migra
em direção ao anodo criando uma corrente. Se uma amostra que pode absorver
elétrons é eluída através do detector, a corrente diminuirá. O decréscimo na
corrente resulta em um pico no registrador por meio de amplificação no
eletrômetro.

b) Detector de Nitrogênio-Fósforo (ionização de chama alcalina ou detector termo-

iônico) – maioria dos inseticidas organofosforados, carbamatos e piretróides
bem como alguns herbicidas.

Operação: baseia-se na resposta amplificada de compostos de nitrogênio e

fósforo em uma chama de hidrogênio contendo átomos de metais alcalinos.
(usualmente na forma de sais de cloro, bromo e sulfatos de sódio, potássio,
césio e rubídio).

2. Cromatografia liquida de alta pressão: variação da cromatografia de partição líquida

previamente descrita. Modificado para incluir bombas de alta pressão e detectores
sensíveis e de baixo volume morto.

a) Vantagens:
- condições amenas (usualmente temperaturas ambientes com solventes
ordinários) minimiza rearranjos ou degradações da molécula de toxina.
- versatilidade (podem usar de 4-6 modos diferentes de cromatografia incluindo
troca iônica, filtração gélica, afinidade e outras).
- rápida e econômica.

b) Desvantagens:
- principal desvantagem é com sensibilidade e versatilidade dos detectores (i.é.
detecção dependente de propriedades químicas específicas que não são
comuns a todos os tóxicos). Mesmo quando o método de detecção é
apropriado, os limites de sensibilidade usualmente ficam na faixa de µg ou ng.

c) métodos de detecção: absorbância UV, fluorescência, radiométrico.

3. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assays)(ensaio de imunosorvente ligado a

enzima). Teoria: baseado no uso de anticorpos que reconhecem ambos a toxina e
o conjugado toxina-enzima. A toxina na mesma amostra compete com o conjugado
da toxina por um numero limitado de sítios de ligação do anticorpo.

F. Métodos de identificação

1. Cromatografia com padrões de identidades conhecidas. Com GC e HPLC, os

tempos de retenção em tipo particular de coluna usualmente característica de uma
dada molécula. Desta forma, os tempos de retenção são comparados entre
desconhecido e padrões em vários sistemas diferentes. Para CCF, a distância
relativa movida sobre a placa é usada para comparar desconhecido e padrões.
 22

Mais útil quando há informações disponíveis sobre a natureza do composto

desconhecido.

2. Espectrometria de massa e NMR (Ressonância Magnética Nuclear). Técnicas

criadas para elucidar a estrutura química de moléculas. Útil na identificação de
metabólitos ou produtos de degradação.