UNIVERSIDADI iDERAL DE GOIAS FACULDADE DE NUTRICAO LABORATORIO DE NUTRIGAO E ANALISE DE ALIMENTOS DETERMINACAO DO TEOR DE FENOLICOS TOTAIS (FOLIN-CIOCALTEU) - ESPECTROFOTOMETRIA MATERIAIS Reagentes * Carbonato de sédio P.A. (PM= 106) Reagente Folin Ciocalteu Padrao de dcido gélico anidro (PM= 170,2) - pureza 99% Solventes usados na extragéio das amostras Agua destilada ou 4gua Mili-Q Extratos das amostras Equipamentos e Vidrarias Balanga analitis Balio volumétrico Papel aluminio Pipeta automética (100-1000 iL e 1000-5000 HL) Tubos de ensaio Agitador de tubos de ensaio (vortex) Cubetas de vidro Espectrofotémetro PREPARO DAS SOLUCOES A. Solugiio de carbonato de sédio (NazCOs) a 10% - Volume: 100 mL Pesar 10,06 ¢ de Na2CO3 e diluir com dgua destilada para 100 mL, em balao volumétrico. Agitar bem, até a diluigao completa da amostra. Armazenar em frasco de vidro dmbar. B. Solugdo de Folin Ciocalteu 3% - Calcular o volume necessario antes do preparo Para preparar 100 mL, dilua 3 ml. do reagente Folin Ciocalteu, com dgua, para um volume final de 100 mL em um balao volumétrico, Misturar bem a solucao e armazenar em frasco de vidro dmbar, 2 Solugdo mac de dcido gilico (200 mg/L) — Volume: 50 mL Diluir 0,0101 g de dcido giilico 99% para um volume final de 50 mL com 0 solvente usado na extragao da amostra, homogeneizar ¢ transferir para wm frasco de vidro dmbar. Armazenar na geladeira por até 5 dias. Método | Deserigio Versio | Elaboragio | Data Pagina (001 | Fendlicos Totals - Folin Giocaltew 2__| Tiago Dias [257052016 | Pagina 1 de6UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIAS. FACULDADE DE NUTRICAO LABORATORIO DE NUTRIGAO E ANALISE DE ALIME! CURVA DE CALIBRAGAO 1 Em cinco bales volumétricos de 10 mL, pipetar os volumes listados abaixo da solugao mae ¢ completar com o solvente usado na extragdo da amostra, Solusio mie Completar para* Padriio mL) (mL) (mg AG/L) PT 1.0 10 20 P2 20 10 P3 3,0 10 Pa 40 10 PS 5,0 10 ‘ompletar com o solvente que serd usado para extralr as 2 Em 15 tubos de ensaio de 5 a 10 mL cor ambar ou envolvidos em papel aluminio, adicionar (em triplicata): * 0,25 mL das solugdes de dcido gélico (P1 a PS) * 2,75 mL da solugdo de Folin-Ciocalteu a 3% Fazer dois tubos em branco contendo © 0,25 mL do solvente usado na extragio * 2,75 mL da solugao de Folin-Ciocalteu a 3% 4 Agitar por 10 s no vortex; 5 Repousar por 5 minutos; 6 Actescentar 0,25 mL da solugdo de carbonato de sédio a 10% 7 Agitar por 10 segundos no vortex; 8 Repousar por 60 minutos, 4 temperatura ambiente (na auséncia de luz); 9 Ligar o espectrofotémetro 30 minutos antes da leitura, no comprimento de onda adequado (765 nm); 10 Zerar o espectrofotémetro (auto zero) ¢ colocar os brancos nas duas cubetas. Deixar a cubeta de referéncia (R) com o branco durante a leitura. 11 Realizar leitura em espectrofot6metro a 765 nm, colocando a cubeta com solugdo para leitura na posigdo das amostras (S) do espectrofotémetro. Método | Deserigio Versio (001 | Fendlicos Totals - Folin Ciocaltew 2 Data Pagina 25705/2016 | Pagina 2 de 6UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIAS. FACULDADE DE NUTRICAO LABORATORIO DE NUTRIGAO E ANALISE DE ALIME! 12 A partir dos valores de concentragao ¢ absorbancia das solugSes padro, construir a curva de calibragdo e obter os parametros a (coeficiente angular), b (coeficiente linear) e 1 (coeficiente de correlagao) da reta de regressio, conforme exemplo abaixo. Tabo | Cone tng Ppa ots Curva Padréo 2 20 | 0.1571 Folin Ciocalteu/Acido Galico 3 20 | 0,1567 10 4 40 | 0,3106 0.9 | y=0,0072«+ 0,0163, 5 40 | 0.3126 08 Megssa 6 40 osu go? 7 60 | 0,4493 g°6 8 60 | 04ai4 Soe 9 60 | 0.4529 Zo3 10 80 | 0.5931 o2 ue 80 0,6005 o1 12 80 | 0,596 00 3 100 | 0,7153 ° 20 40 60 80 100 4 100 | 0.7476 Concentragio de Acido Gélico (mg/l) 15 | 100 |o.7304_ Figura 1, Curva padrao de écido galico (20-100 mg/L) (Os valores sao ficticios, apenas para ilustrago) * Acurva de calibragdo é obtida no Excel apés inserir um grafico de dispersio e adicionar linha de tendéncia. Os pardmetros da curva sio calculados usando as seguintes fungdes do Excel: NCLINAGKO (“Ab i NTERCEPGAO (“Abs”; “Cone”) (ORREL (“Abs”; “Conc”) ) * i "Con. ‘* “Abs” foi definide como o nome das células contendo os valores de absorbincia, ¢ one” foi definido como o nome das células contendo valores de concentragdo (mg/L) co Para definir o nome para um intervalo de células no Excel, selecione o intervalo, clique em “Férmulas” > “Definir nome”, insira o nome do intervalo e clique em SOK". * Caso r seja menor que 0,99, deve-se refazer a curva de calibragao. Método | Deserigio Versio (001 [ Fendlicos Totals - Folin Giocaltew 2 Data Pagina 25705/2016 | Pagina 3 de 6UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIAS. FACULDADE DE NUTRICAO LABORATORIO DE NUTRIGAO E ANALISE DE ALIME! ANALISE DAS AMOSTRAS 1 Realize a extragio da amostra de acordo com um procedimento conveniente 2 Em tubos de ensaio de 5 a 10 mL cor Ambar ou envolvidos em papel aluminio, adicionar (em triplicata): + 0,25 mL do extrato obtido da amostra * 2,75 mL da solugdo de Folin-Ciocalteu a 3% 3. Fazer dois tubos em branco contendo © 0,25 mL do solvente usado na extragio * 2,75 mL da solugdo de Folin-Ciocalteu a 3% 4 Agitar por 10 s no vortex; 5 Repousar por $ minutos; 6 Acrescentar 0,25 mL da solugdo de carbonato de sédio a 10%; 7 Agitar por 10 segundos no vortex; 8 Repousar por 60 minutos, 4 temperatura ambiente (na auséncia de luz); 9 Ligar o espectrofotdmetro 30 minutos antes da leitura, no comprimento de onda adequado (725 nm); 10 Zerar o espectrofotdmetro (auto zero) ¢ colocar os brancos nas duas cubetas. Deixar a cubeta de referéncia (R) com o branco durante a leitura, 11 Realizar leitura em espectrofotémetro a 765 nm, colocando a cubeta com solugio para leitura na posigdo das amostras (S) do espectrofotémetro. 12 Anotar os valores de absorbancia (Abs) para cada amostra ¢ realizar os céleulos para determinar a concentrago de acido galico equivalente (AGE) no extrato e o teor de AGE no alimento Método | Deserigio Versio (001 | Fendlicos Totals - Folin Ciocaltew 2 Data Pagina 25/05/2016 | Pagina 4 de 6UNIVERSIDADI iDERAL DE GOIAS FACULDADE DE NUTRICAO LABORATORIO DE NUTRIGAO E ANALISE DE ALIMENTOS CALCULOS Concentragiio de acido gélico equivalente no extrato da amostra (C) ysaxtb Sendo y = Abs, x = Concentrago (C): Abs = a°C +b «C= (Abs — b)/a Teor de acido gilico equivalente no alimento © Em base imida = CXVE)/1000 | AGE (mg/100 g b.u.) mm (Eq. 1) Em base seca AGE(b.u) r GI ———— (Eq. 2) AGE (mg/100 g b.s.) = T>5— vo * 100 (Eq. 2) Sendo: Cc Concentragdo (mg/L) de acido galico equivalente no extrato Ve Volume do extrato (mL) Massa (g) de amostra usada na extragio (g) M Massa (g) obtida a partir da liofilizago de 100 g de amostra timida, para amostra analisada sem liofilizar (ou desidratar por outros métodos), M = 100; %U | Teor de umidade do alimento tmido, Observagao 1, A absorbancia lida para as amostras deve estar compreendida entre 0 menor ¢ o maior valor de absorbincias da curva de calibragio (preferencialmente no meio) caso esteja fora dessa faixa, devera ser feita uma nova extragao, reduzindo ou aumentando a massa da amostra para que os valores lidos fiquem dentro da curva de calibrago Método | Deserigio Versio | Elaboragio | Data Pagina (001 | Fendlicos Totals - Folin Ciocaltew 2__| Tiago Dias [257052016 | Pagina $ de 6UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIAS FACULDADE DE NUTRICAO LABORATORIO DE NUTRICAO E ANALISE DE ALIMENTOS EXEMPLO 100 g de tomate foram liofilizados resultando em 10,25 g de produto liofilizado, Trés porgdes de 0,5 g desse produto foram extraidos resultando em trés extratos com 50 mL cada, Os extratos foram analisados pelo método de Folin-Ciocalteu, onde se obteve Abs(1) = 0,5741; Abs(2) = 0,5595 e Abs(3) = 0,5661, ja descontado o valor do branco. Qual o teor de fendlicos totais (em base ‘imida e base seca) desse tomate, sabendo que: a = 0,0072; b = 0,0163 e Umidade = 92 %, Expresse o resultado como média + desvio padrio. CAleulos no Excel ‘Amostra__Secagem Amostra liofilizada completa: ™) sélidos 100g Eefilin i925 2 802 1 ig e AGE AGE m(@ Ve (mL) Abs. C (mg/L) (mg/100g(mg/100g . bs) 05 30 0S741 ~<7747~~«79,A1~~—~—«O92,61 08 50 0,5595 75,44 77,33 966,63 05 500.5661 76,36 ——78,27__978,38 Média 783 —*979.21 DP 1,04 13,01 CV(%) 133 1,33% Método | Deserigio Versio | laboragio | Data Pigina (001 [ Fendlicos Totals - Folin Ciocaltew 2 | Tiago Di 25705/2016 | Pagina 6 de 6