Processamento de RNA .

Em procariotos, a transcrição e a
tradução estão acopladas. O RNA
bacteriano necessita de muito pouco ou
nenhum processamento para ser
traduzido.
Em eucariotos, a transcrição e a tradução
estão desacoplados. A transcrição ocorre
no núcleo e a tradução ocorre no
citoplasma. Após a transcrição, o RNA tem
que sofrer processamento no núcleo para
se tornar um RNA maduro. Somente após esse processo, esse mRNA maduro
vai ser transportado para o citoplasma, onde vai ser traduzido.
Se houver problemas no processamento, o RNA não vai ser reconhecido pela
maquinaria de transporte como RNA maduro e vai ser degradado dentro do
núcleo.

Etapas do Processamento:
1- Síntese do
transcrito
primário - núcleo:
transcrito
primário vai
conter tanto
éxons quanto
íntrons.
Ainda no núcleo
primário, o
transcrito vai
sofrer 3 tipos de
processamento.

2- Adição de uma CAP na extremidade 5’

3- Splicing - remoção dos íntrons
4- Poliadenilação na extremidade 3’ do RNA → cauda de adeninas.

O processamento do RNA acontece durante a transcrição, durante a etapa de

elongação e é mediado por complexos proteicos que estão associados a RNA
Polimerase, em sua cauda.

No início da elongação, quando a

RNA Polimerase passa na
iniciação pra elongação, ela sofre
fosforilação do resíduo de serina
5 do heptapeptídeo da cauda.
Processamento de RNA .

Quando a RNAP II está na fase de iniciação a cauda não tem fosforilação e é

fosforilada pelo TFII H, e isso está correlacionado com escape do promotor e
a entrada na fase de elongação. Ao mesmo tempo, essa transição da
iniciação para elongação está associada com o recrutamento para cauda do
RNA polimerase do complexo de proteínas que faz a adição do CAP no RNA, de
tal forma que assim que o RNA começa a ser transcrito e começa a sair pelo
canal de saída da RNA polimerase, já vai sofrer adição do CAP.
Em seguida, a padrão de fosforilação da cauda muda, existem fatores de
elongação que são recrutados que vão promover fosforilação, por exemplo,
do resíduo serina 2 do heptapeptídeo, que vai recrutar para cauda fatores
que vão promover o splicing, a remoção dos íntrons, que vai acontecendo à
medida que o RNA está sendo transcrito.
No final da transcrição, existe a remoção da fosforilação da serina 5 e o
recrutamento para cauda da RNAP de um complexo de proteínas que
promovem a clivagem do transcrito e a poliadenilação.

Adição de CAP na
extremidade 5’:
CAP é a adição de uma
guanosina à base terminal do
transcrito, através de uma
ligação trifosfato 5’-5’.
O último nucleotídeo é sempre
trifosfatado. Geralmente é uma
purina (adenina ou guanina) e
vai ser ligado a uma guanosina
(uma 7-metilguanosina) por uma
ligação 5’-5’ trifosfato. Uma coisa importante é a orientação dessa guanosina,
ela é invertida em relação ao último nucleotídeo do transcrito.
Essa Ligação 5'-5' trifosfato é resistente a ação de exonucleases, portanto a
presença de 7-metilguanosina protege esse transcrito da degradação.
A estrutura CAP também tem outras funções, pois é reconhecida por
complexos proteicos que vão ter diferentes funçõoes.

Síntese do CAP:
Acontece à medida que o transcrito está
sendo feito.
A RNAP vai transcrevendo o transcrito e já vai
se associar a um complexo de síntese do CAP,
que tem duas subunidade importantes:
● Guaniil transferase: é quem de fato faz
a formação da ligação 5’-5’ trifosfato entre a
guanosina e o nucleotídeo terminal
Processamento de RNA .

● Metil transferase: adiciona um grupo metil na posição N7 da guanina

que faz parte do CAP.

Adição da cauda Poli-A na extremidade 3’:

Esse processo está relacionado com o processo de terminação da
transcrição.
A cauda poli-A:
● Dá estabilidade ao mRNA
● Auxilia na transferência para o citoplasma
● Importante para tradução

A clivagem do transcrito é mediada por

complexos que estão associados à
cauda c terminal da RNAP e que são
transferidos para o transcrito quanto
um sinal de poliadenilação aparece no
RNA. Esses complexos de estímulo de
clivagem (CstF) e o CPSF estão na
cauda C terminal da RNAP e são
transferidos para o transcrito quanto a
sequência de poliadenilação é
transcrita.

CPSF interage com a sequência consenso

do sinal de poli adenilação, enquanto o
CstF interagem com a outra sequência
conservada, rica em guanina e uracila, que
fica mais a jusante.Ao fazer isso esses dois
complexos interagem entre si, se aproximam e uma das subunidades do CPFS
vai clivar o transcrito.
Quando ocorre essa clivagem, a extremidade 3’ vai ser processada e uma das
coisas que vai acontecer é o recrutamento da PoliAPolimerase pelo CPSF para
ocorrer a formação da cauda poli-adenilada.

A PAP adiciona
nucleotídeos de
adenina nessa cauda,
por uma química de
síntese essencialmente
idêntica das RAPs →
quebra ATP para
formar ligação
fosfodiéster com
Processamento de RNA .

hidroxila 3’ disponível, liberando pirofosfato. Ao contrário da RNAP II ou RNAP

bacteriana, a PAP não precisa de molde → faz isso até ter 200 adeninas.

O CPSF recrutou a PAP, que começa a

sintetizar a cauda poli adenilada e
outras proteínas, as Poli-A-binding
Proteins, que vão se associar a cauda e
regular a atividade da PAP, estimulando
sua processividade ou reduzindo-a,
causando o término da poli adenilação

Splicing: remoção dos íntrons do transcrito primário.

Introns são prevalentes em genes codificadores de proteínas de eucariotos

superiores. Encontrados em leveduras e ocasionalmente até em bactérias e
viroses (muito raros em procariotos.
Também presentes em genes de tRNA e rRNA.
Processamento de RNA .

Os éxons e íntrons são incluídos no pre-mRNA, mas íntrons não são

encontrados no RNA maduro.
Existe mais de um mecanismo de splicing em eucariotos, existem 3 classes
encontradas, o mais comum e mais abundante é o nuclear pre-mRNA

Os íntrons do grupo i e iI tem coisas em comum: ambos são auto catalíticos

(self-splicing) → são excisados autonomamente na ausência de outros fatores
acessórios ou proteínas.

Splicing é um processo que requer grande precisão,pois se a junção de dois

éxons for errada por apenas um nucleotídeo, a sequência codificadora terá
quadro de leitura alterado.

Mutações podem alterar

sítios de splicing e causar
doenças genéticas:

No exemplo é mostrado o
gene da beta-globina. Se
acontece um splicing
aberrante e o éxon 2, por
exemplo, não seja incluido
no RNA sendo feito, vai ter
o RNA maduro com 2 éxons
ao invés de 3, vai levar a produção de uma proteína não funcional.

Aqui é mostrado o gene

abca’b, composto por 46
éxons.
É mostrado a exclusão do
éxon 34 e a mudança de
frame. A junçã entre o
éxon 34 e 35 ocorre no
meio de uma trinca, isso
faz com que quando
ocorre a deleção do exon
34, o A que está na terceira posição dessa trinca, que codifica uma glicina,
passa a fazer parte da primeira posição de uma trinca.

Química e maquinaria de splicing:

● O splicing é governado por sequências conservadas nas junções
exon-intron e por um nucleotídeo chamado ponto de ramificação A.
Processamento de RNA .

● O splicing é mediado por uma maquinaria denominada spliceossomo

● O spliceossomo é composto por ribonucleoproteínas chamadas snRNPs
- small nuclear ribonuclear proteins
A sequência consenso de nucleotídeos em uma molécula de RNA que sinaliza
o começo e fim da maior parte dos introns.

As duas barras indicam que as duas duas sequências amarelas estão muito
distantes entre si. Existem dois sítios de splicing que vão definir esse intron,
um na região 5’ e outro na região 3’ do intron. O sitio de splicing é sempre
definido em função da orientação do intro. As sequências conservadas estão
na froteira exon-intron da região 5’, cobrindo uma parte do exon e uma parte
do inton e a mesma coisa na região 3’.
A porcentagem de conservação desses nucleotídeos varia um pouco, mas os
nucleotídeos que são mais conservados estão nos íntrons; GU no sítio de
splicing 5’, AG no sítio 3’ e a Adenina no ponto de ramificação, que fica de 20 a
50 pares de base de distância dos sítios de splicing 3’.
Essas sequências irão interagir com a maquinaria de splicing de uma maneira
específica para promover as reações de transesterificação que vai promover a
remoção desse íntron.

● O splicing ocorre através de duas reações de transesterificação,

resultando na formação de uma estrutura de laço. Reações de
transesterificação envolvem a quebra de uma ligação fosfodiéster,
concomitantemente com a formação de uma nova ligação fosfodiéster.

Primeira reação de transesterificação:

Envolve a adenina no ponro
de ramificação, mais
especificamente o grupo OH
na posição 2’ do açúcar.
O OH atua como nucleófilo e
vai atacar a ligação
fosfodiéster na extremidade
5’ do intron, a guanina,
atacando a ligação na
fronteira exon intron.
Processamento de RNA .

Isso vai causar a quebra dessa ligação fosfodiéster com a concomitante

formação de uma ligação fosfodiéster entre a guanina final do intron e essa
Adenina, formando a estrutura de laço

Estrutura do laço mostrada de uma maneira mais

detalhada.
Adenina tem 3 ligações fosfodiéster: uma 2’5’,uma 3’5’ com
o nucleotídeo subsequente na direção 3’ e uma 5’3’ com o
nucleotídeo na direção 5’

Segunda reação de transesterificação:

A hidroxila livre que foi gerada
com a primeira reação se torna
um nucleófilo, que vai atacar a
guanina do sítio de splicing 3’ no
final do intron → ataca ligação
fosfodiéster entre guanina na
extremidade 3’ e a primeira
guanina na extremidade 5’ do
éxon.
Isso leva formação de uma
ligação fosfodiéster entre os
éxons, unindo-os e o íntron é
liberado na forma de um laço.

Spliceossomo:
Além das snRNPs, o spliceossomo
tem outras proteínas com
funçoẽs acessórias, como fatores
de splicing, ou em outras etapas
de processamento e ou
transporte
Os RNAs presentes nessas
partículas ribonucleoroteicas
nesses snRNPs são uito
importantes para o processo de
splicing e atuam por pareamento
de bases entre o pequeno RNA e
o pre-mRNA ou entre dois snRNAs de snRNPs diferentes.
Processamento de RNA .

Pareamento dos snRNAs com regiões do pré-mRNA:

O RNA do snRNP U1 é
complementar ao sítio de
splicing 5’, pareando.
O U2 é complementar ao sítio
conservado que flanqueia o
ponto de ramificação, com a
excessão da adenina, que
constitui o ponto de ramificação,
therefore não pareia com U2, o
que faz com que esse
nucleotídeo fique exposto e sua
posição na hidroxila 2’ do açúcar
que vai participar do mecanismo catalítico.
O primeiro passo par que o splicing aconteça é o reconhecimento desses
spitios por esses componentes do spliceossomo.

Primeiro Passo: U1 reconhece o sítio

de splicing 5’, depois o U2 vai
reconhecer o sítio de ramificação.
Em seguida, os outros três
componentes do spliceossomo, U4,
U5 e U6.

U4 e U6 geralmente andam juntos pois o

U4 pareia com U6. U5 se associa ao U4 e
U6 por interações proteína-proteína.

Segundo passo: complexo trimerico U5=

U4-U6 se associa U1 e U2, por interações
proteína-proteína, unindo o sítio de
splicing 5’ ao ponto de ramificação.

Terceiro passo: ocorre uma reorganização do splicesossomo, na qual U1 é

deslocado para fora do complexo,permitindo com que o U6 pareie com o sítio
de splicing 5’, região que antes era ocupado pelo U1.

U5 interage tanto com a

sequência do exon 5’
quanto com a sequência
do exon 3’. A imagem da
direita demonstra melhor
Processamento de RNA .

a organização espacial do complexo ativo.

Esse processo requer ATP para mudanças conformacionais, mas não para
catálise. O sítio catalítico só contém RNAs e um íon Mg2+, não contpem
proteínas.

Coordenação do splicing com a transcição:

Assim como os fatores que vão promover o CAP estão ligados
na cauda da RNAP, as subunidades do spliceossomos também
estão associados com a cauda da RNAP e isso permite com
que o splicing aconteça de uma maneira específica, pois
qualquer sítio 5’ de qualquer intro é capaz de reagir com
qualquer sítio 31 de qualquer outro intro. Para que as
extremidades do intron sejam reconhecidas e reajam entre sí
de uma maneira correta, isso é auxiliado pela coordenação
do splicing oma transcrição, que faz com que à medida que o
RNA é transcrito, as suas extremidades já sejam reconhecidas
em uma ordem cronológica e acoplada a transcrição, para
que o íntron seja removido e os síitiossubsequentes.

Splicing Alternativo:
● Processo em que um gene dá origem a mais de 1 RNA. Os diferentes
RNAs gerados são chamados de isoformas.
● Nem todos os transcritos primários são processados de maneira a
capturar todos os exons ou excluir todos os introns.
● Muitos são processados de diversas formas alternativas,gerando
diferentes mRNAs maduros ( cada um consistindo de uma diferente
combinação de exons)

Pode ter:
● Retenção de um intron ou não
→ pode ou não ser removido,gerando
isoformas alternativas
● Exons que tem 2 sítios de
splicing alternativos na fronteira exon
intron no sítio 5’. Dependendo do sítio
de splicing 5’ que for utilizado terão
isoformas diferentes.
● O mesmo pode acontecer para
o sítio de splicing 3’, fazendo com que
um exon seja maior ou menor
dependendo do sítio de splicing que
é utlizado
Processamento de RNA .

● Inclusão ou não de um exon no transcrito

● Presença de exons mutuamente exclusivos: ou um é incluído no trancrito
ou o outro
● Genes que tem uma quantidade de éxons enorme, o que pode levar a
uma seleção combinatória de exons, nas quais alguns podem ser
incluídos ou não
● Exons que vão conter promotores diferentes → dependendo do
promotor que é usado, que vão iniciar a transcrição em pontos
diferentes, vai ter uma isoforma alternativa
● Exons com sítios de poliadenilação distintos, de tal forma que o
transcrito pode sofrer uma terminação alternativa dependendo do
éxon que é incluído no processo de splicing.

A diversidade de isoformas é muito grande, inclusive podem ter combinações

desses processos em um mesmo gene.

Exemplo: gene da troponina

Splicing alternativo que envolve a

inclusão de exons que são
mutuamente exclusivos. Em uma
isoforma tem a inclusão do exon 3
e na outra isoforma vai ter a
inclusão do exon 4, mas nunca
vão ser incluídos juntos, formando
respectivamente a isoforma alfa-troponina e beta-troponina, que
desempenham funções diferentes na célula.

Splicing alternativo tem importância funcional, é um processo fisiológico

regulado e conservado evolutivamente.
● Mecanismo combinatório que aumenta a diversidade d genome
● Uma das soluções para explicar como apenas 20-25k genes podem
gerar um ser humano.