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Avaliaes

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Introduo ao laboratrio e Mtodos de contagem de microrganismos em alimentos

Contedo programtico das aulas prticas ainda em preparao 2 provas prticas no horrio da aula (15% cada) Relatrios (5% extra, 5% a menos para quem no entregar) cada relatrio dever ser entregue no prazo mximo de uma semana aps a aula.

Uelinton M. Pinto

Normas de segurana no laboratrio


No comer, beber ou fumar dentro do laboratrio; Usar sempre o jaleco; No pipetar material txico ou infeccioso com a boca. Usar pipetadores; As placas de contagem de bactrias no podem ser consideradas inofensivas. Muitos patognicos desenvolvem-se bem nos meios de cultura comumente utilizados no laboratrio. No cheirar os meios de cultura inoculados

Normas de segurana
As lminas e lamnulas usadas devem ser colocadas em recipiente com desinfetante; Lavar as mos com freqncia, usando soluo desinfetante, com gua corrente e sabo, especialmente antes e aps o trabalho laboratorial; Limpar a mesa de trabalho, antes e depois de cada sesso de trabalho, usando desinfetante;

Normas para coleta de amostras


As amostras para exame microbiolgico devero ser enviadas separadamente das destinadas aos exames fsico-qumicos; As amostras devem estar em sua embalagem original. Quando no for possvel, aceita-se o fracionamento em condies asspticas; As amostras devero ser acondicionadas em recipientes limpos, estreis e sem perfuraes, rachaduras, etc. Quantidade mnima de 500 g de amostra ou colher vrias amostras para atingir o mnimo. Cuidados especiais com respeito ao lote, data de fabricao. Enlatados - ~mnimo de duas latas.

Normas para armazenamento e transporte de amostras


Alguns produtos podem ser transportados a temperatura ambiente outros devem ser refrigerados (recipientes isotrmicos com gelo). Cuidado para no haver contato entre a amostra e a gua de degelo. Produtos congelados no podem descongelar at a chegada ao laboratrio. Tempo entre coleta e chegada ao laboratrio deve ser o menor possvel. Ex.: leite pasteurizado menos que 24 horas, respeitando-se o prazo de validade do produto. Amostras em embalagens lacradas. Necessrio para evitar a substituio ou adulterao da amostra entre o ponto de colheita e o laboratrio.

Normas para armazenamento e transporte de amostras


Aps o recebimento: Amostras refrigeradas perecveis devero ser analisadas em um perodo mximo de 12 horas; amostras congeladas devero ser mantidas a no mnimo -18C, por perodo mximo de 7 dias. Amostras no perecveis devero ser estocadas em lugar fresco e protegidas da umidade, e analisadas em um prazo mximo de 3 dias. Manter registros de recebimento, nmeros de protocolo, datas de liberao e outros registros que se fizerem necessrios.

O cotidiano no laboratrio
Organizao! Tempo mximo entre diluio e inoculao 20 min Limpar e desinfetar a superfcie de trabalho antes e depois do trabalho dirio; Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado, antes de iniciar a anlise.

O cotidiano no laboratrio
O material utilizado deve receber a seguinte seqncia de tratamento: esterilizao, lavagem, secagem, embalagem; esterilizao e armazenamento; Os cultivos aps a leitura devem ser esterilizados;

O cotidiano no laboratrio
Normas de higiene e ordem pessoais Manter no laboratrio exclusivamente os materiais necessrios aos trabalhos de anlise; Se for portador de algum ferimento nas mos, no participar dos trabalhos de anlise. No caso de necessidade extrema, utilizar luvas, procedendo tambm a sanificao das mesmas; Lavar e usar sanificantes nas mos ao entrar, sempre que for necessrio e ao sair do laboratrio;

O cotidiano no laboratrio
Normas de higiene e ordem pessoais Evitar tocar o corpo e especialmente os olhos, boca, nariz com as mos durante os trabalhos no laboratrio; No umedecer etiquetas ou outro material do laboratrio com a lngua; Em casos de acidente com ferimentos e cortes, proceder imediatamente a lavagem e a desinfeco;

O cotidiano no laboratrio
Resumo das condies de esterilizao:
a) Via seca: 170 C por 2 a 3 horas (estufa de esterilizao): placas de Petri, pipetas, vidraria em geral. b) Via mida: 121 C por 15 min. (autoclave): soluo de diluio, meios de cultura, etc. c) Antibiticos, vitaminas: filtrao

Mtodos de contagem e deteco de microrganismos em alimentos

Que tipos de organismos so comumente enumerados em alimentos?


Bactrias totais aerbias Bactrias psicrotrficas Bactrias anaerbias Staphylococcus aureus Fungos e leverduras Coliformes totais e termotolerantes

Qual a importncia de se determinar o nmero de microrganismos em um alimento?


1. Qualidade e segurana alimentar 2. Avaliao dos processos de produo 3. Alimentos funcionais (probiticos)

Uma outra maneira de classificar estes mtodos

Como estes microrganismos so enumerados?


Totais

Diretos
Indiretos

Contagens Microscpicas Contagens eletrnicas Mtodos turbidimtricos Determinao de biomassa

Mtodos convencionais (culturais, clssicos)

Mtodos de contagem de bactrias

Contagem em placas

Diretos Viveis

Cont. em membrana filtrante Determinao do NMP


Luminescncia dos genes lux

Mtodos rpidos

Indiretos

Radiometria
Determinao de impedncia

Atividade metablica

Contagens Microscpicas Contagens eletrnicas

Contagem em placas

Mtodos turbidimtricos Determinao de biomassa

Contagem em placas
Cont. em membrana filtrante Determinao do NMP
Luminescncia dos genes lux

Como recuperar microrganismos dos alimentos?

Radiometria
Determinao de impedncia

Atividade metablica

Stomacher

Contagem em placas Anlises Microbiolgicas Preparo da amostra


+
Amostra Diluente

Contagem em placas
Diluio seriada Dilui

25g

225mL
Homogenato

Diluente

Plaqueamento

Plaqueamento

Contagem das colnias aps incubao


10
-2

Mtodos de plaqueamento

UFC= Num. colonias X (1/dil) Alquota 10


-3

Entre 30 e 300

10

-4

Contagem em placas Modificaes para fazer o processo mais rpido

Spiral plater

Spiral plater

UFC/mL

Tcnica de microcotas

20 l

UFC/mL

Contagens Microscpicas

Petrifilm(3M)
1 ml de diluente contendo a amostra

Contagens eletrnicas

Mtodos turbidimtricos Determinao de biomassa

Contagem em placas Cont. em membrana filtrante Determinao do NMP Luminescncia dos genes lux

Reidratao

Radiometria
Determinao de impedncia

Incubao

Atividade metablica

Mtodo do nmero mais provvel (NMP)


metodologia: teste presuntivo teste confirmativo teste completo

Teste Presuntivo Caldo Lactosado LST

10 ml por tubo

1 ml por tubo

Amostra de alimento 0,1 ml por tubo

incubao a 35C/24-48 h: formao de gs: NMP

Anlises Microbiolgicas Nmero Mais Provvel


Presuntivo
Tubo contendo caldo lactosado resultado positivo

Confirmativo

Tubo contendo caldo lactosado resultado negativo

TESTE PRESUNTIVO PARA A PRESENA DE COLIFORMES

Coliformes Caldo o LST 35.5 C/48 h

Coliformes Totais Caldo BVB o 35.5 C/48 h

Nmero Mais Provvel


Confirmativo de Coliforme Termotolerante

Coliformes Caldo EC o 45 C/48 h

Contagens Microscpicas Contagens eletrnicas

Contagem em membrana filtrante


Filtrao para concentrar a amostra
Membrana transferida para meio de cultura

Mtodos turbidimtricos Determinao de biomassa

Amostra a ser filtrada


Contagem em placas Cont. em membrana filtrante Determinao do NMP Luminescncia dos genes lux

Membrana filtrante que retm clulas Sada para vcuo Incubao Colnias

Radiometria Determinao de impedncia Atividade metablica

Contagem de colnias em placas Filtrao (concentrao da amostra)

Colnias coliformes em uma membrana filtrante

Contagens Microscpicas Contagens eletrnicas

Contagens Microscpicas Contagem do nmero de clulas totais n c

Mtodos turbidimtricos Determinao de biomassa

Cmara de Neubauer: lmina escavada

Contagem em placas Cont. em membrana filtrante Determinao do NMP Luminescncia dos genes lux Radiometria Determinao de impedncia Atividade metablica

Detalhe da regio central da lmina

Contagens Microscpicas com membrana

Contagem do nmero de clulas totais n c

Mtodo rpido que permite detectar baixas populaes r popula


Alimento
Homogenato Filtrao TritonX, Tripsina

Secagem

Laranja de acridina

Membrana

Contagem em microscpio de epi-fluorescncia

No clulas/g= No mdio X No de campos X fator do microscpio

Contagens Microscpicas Contagens eletrnicas

Contagens eletrnica CITOMETRIA DE MASSA

Mtodos turbidimtricos Determinao de biomassa

Contagem em placas Cont. em membrana filtrante Determinao do NMP Luminescncia dos genes lux Radiometria Determinao de impedncia Atividade metablica

Contagens eletrnica CITOMETRIA DE MASSA

Contagens Microscpicas Contagens eletrnicas

Mtodos turbidimtricos Determinao de biomassa

Contagem em placas Cont. em membrana filtrante Determinao do NMP Luminescncia dos genes lux Radiometria Determinao de impedncia Atividade metablica

IMPEDNCIA mtodo rpido, porm envolve cultivo


Impedncia= atual resistncia eltrica corrente direta
Meio de cultura estril produtos de baixa condutibilidade Inocula alquota de amostra de alimento (diluio apropriada) Crescimento microbiano

IMPEDNCIA mtodo rpido, porm envolve cultivo


Quanto mais rpido for a deteco de mudanas de impedncia do meio, maior a contaminao do produto. Maior contaminao deteco rpida Menor contaminao deteco lenta

A deteco acontece quando h 107 clulas/g Impedncia diminui deteco automtica Vrios sistemas comerciais disponveis deteco de diversos tipos de microrganismos

Produtos de alta condutibilidade

IMPEDNCIA mtodo rpido, porm envolve cultivo


Rapid Automated Bacterial lmpedance Technique (RABIT)

Deteco indireta do crescimento microbiano por impedncia

BacTrac 4300 MICROBIOLOGICAL ANALYZER

RAPID

Ribeiro et al., 2003

Contagens Microscpicas Contagens eletrnicas

Mtodos turbidimtricos Determinao de biomassa

Contagem em placas Cont. em membrana filtrante Determinao do NMP Luminescncia dos genes lux Mtodo indireto deteco de CO2 radioativo por exemplo. Radiometria Determinao de impedncia Atividade metablica

Ribeiro et al., 2003

Luminescncia dos genes lux de Vibrio fisheri

Contagens Microscpicas Contagens eletrnicas

lux genes
Engenharia gentica do fago especfico

Mtodos turbidimtricos Determinao de biomassa

Contagem em placas

Infecta o fago no homogenado (alimento) para detectar a bactria de interesse

Cont. em membrana filtrante Determinao do NMP Luminescncia dos genes lux

Fago multiplica

LUZ

Radiometria Determinao de impedncia Atividade metablica

Atividade metablica

Nossas futuras aulas prticas

Reduo de corante - Azul de metileno/resazurina em leite


Mtodo muito simples quanto mais rpido a reduo dos corantes, maior a contaminao do produto No um mtodo preciso, mas determina de forma muito rpida, simples e barata a qualidade microbiolgica de um produto

Determinar o efeito de diversos fatores, encontrados pelos micro-organismos nos alimentos, no crescimento microbiano. Contagem de microrganismos em alimentos. Contagem total de aerbios em placa (spread plate e microgotas); Contagem de psicrotrficos; Determinao de coliformes totais e termotolerantes; Isolamento de patgenos de alimentos

Avaliao
Responder s seguintes perguntas para a prxima aula: 1 Por que enumerar micro-organismos em alimentos? 2 Que tipo de micro-organismos seriam enumerados de um alimento refrigerado? 3 Qual a principal desvantagem de se enumerar microorganismos pelos mtodos tradicionais? 4 Qual o objetivo de se utilizar membranas para as contagens de micro-organismos em microscpio?

Material para consulta

1. Jay, J.M. Microbiologia de Alimentos/ James M. Jay; trad. Eduardo Cesar Tondo [et al.] 6.ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. 2. FRANCO, B.D.G.M.; LANDGRAF, M. Microbiologia de Alimentos. So Paulo, Atheneu, 2008. 3. APHA. Compendium of Methods for the Microbiologica Examination of Foods. 2001.