Resumo do artigo: Correção da variância da equação de

Michaelis-Menten que prevê taxas transitórias de reações

de uma única enzima e tempos de respostas na regulação
gênica em bactérias
Autores: Otto Pulkkinen & Ralf Metzler

Discente: João Victor Piloto

Prof. Dr. Marinonio Lopes Cornélio
Data: 27/08/2020
Resumo
O artigo apresentado ele irá propor uma correção da variância da equação
de Michaelis-Menten que prevê taxas transitórias em reações químicas. Isso foi
proposto pois, algumas reações que acontecem dentro do ambiente celular não
necessariamente constituem de várias moléculas, e sim depende de poucas
moléculas. Com essa nova correção e com os resultados obtidos por meio de
simulação computacional é possível aplicar esses novos conceitos à parte
experimental.
Os princípios básicos da enzimologia consiste na taxa de uma
determinada reação, no qual há um substrato S que na presença de uma enzima
E ocorra uma reação e há transformação desse substrato mais a enzima em um
produto P, e isso pode ser escrito da seguinte forma.
𝑆 + 𝐸 ⇋ 𝑆𝐸 → 𝑃 + 𝐸 (1)
E com a equação apresentada (1), conhecendo as constantes de
associação e dissociação da reação podemos obter a velocidade da reação
nesse processo. E com isso obtém-se a equação de Michaelis-Menten (2). Que
descreve a taxa de reações enzimáticas, relacionando taxa de reação e a
concentração de um substrato.
𝜈 𝜌
𝜈(𝜌) = 𝐾𝑚𝑎𝑥 (2)
+𝜌 𝑀
Para determinar a equação (2) é levada em conta as concentrações do
substrato e da enzima relacionando isso em uma equação diferencial ordinária.
O artigo irá apresentar uma variação da equação (2) considerando que as
flutuações da concentração devido a produção de substrato em um método
estocástico irá afetar drasticamente a taxa de reação.
Quando há uma transcrição de algo, ou seja, uma tradução que está
sendo realizada para a transformação de uma outra moléculas a partir de outras
moléculas, a transcrição ocasiona um aumento do produto, e isso acontece na
regulação gênica de bactérias, neste momento a equação (2) não irá mais se
tornar uma aproximação mais exata do que acontece nos experimentos, e dessa
forma haverá uma correção da mesma para que se tenha uma aproximação mais
correta da taxa de reação para esse meio celular.
Para obter uma correção da equação de Michaelis-Menten foi
considerado que havia uma média da taxa de reação <ν> por causa das
flutuações de concentração que iriam ocorrer por conta do aumento do produto
na regulação gênica. E obteve a equação (3)

𝜌(𝑡) 𝜌(𝑡)
< 𝜈0 (𝜌(𝑡)) > = < > ≤ = 𝜈0 (𝜌(𝑡)) (3)
𝐾𝑀 +𝜌(𝑡) 𝐾𝑀 +𝜌(𝑡)

Através da equação (3), colocando ela através de uma série de Taylor,

obteve a seguinte equação (4)

<𝜌(𝑡)> 𝐾𝑀
< 𝜈0 (𝜌(𝑡)) > ≈ 𝐾 − var ρ(t) (4)
𝑀 +<𝜌(𝑡)> (𝐾𝑀 +<𝜌(𝑡)>) 3

No qual o segundo termo da equação (4) pode ser escrito através de uma
série de potencias, e assim obtém-se a correção da variância da equação de
Michaelis-Menten como mostra a equação (5).
 (5)
Como ela é uma série de potencias alternada, então eu posso analisar os
dados dela através da minha variação com o número n.
Aplicando métodos computacionais, posso dizer especificamente o
método de Monte Carlo que calcula o caminho mais rápido, ou seja, para o caso
de reação enzimática, dado um valor de enzimas, ele irá calcular numericamente
a taxa de reação delas, mesmo acontecendo uma flutuação do valor do produto
e do substrato recorrente.
Com os dados obtidos da simulação, observou que os dados mediante a
variância deram muito próximos para um número determinado de enzimas e da
concentração do substrato, os dados obtidos variaram entre si, todavia temos
uma variância e como foi calculada por simulação os valores deram dentro do
esperado e com isso a equação (5) é uma correção da variância da equação de
Michaelis-Menten.
Outro problema que pode ser aplicado com a equação de Michaelis-
Menten é do problema de regulação gênica. A regulação gênica pode ser
compreendida como o controle de quais genes serão ativados dependendo do
meio celular em que eles estão. Isso pode ser aplicado aos fatores de
transcrição, que percorrem a fita de DNA transcrevendo quais genes serão
ativados, e esse processo, é semelhante a um tipo de ligação enzima-substrato
já que o operon liga-se a fita de DNA.
Neste caso, têm-se uma grande semelhança com enzima-substrato e
pode-se aplicar a equação de Michaelis-Menten. Assim, obteve-se equações
semelhantes às equações (1), (2) e (3), porém houve mudanças, no lugar da
enzima foi o fator de transcrição TF e no lugar do substrato foi o DNA,
ocasionando um produto, um gene transcrito. Foi utilizado transformada de
Laplace, expansão em série de Taylor e houve a operação integral para
determinar uma nova correção na EMM(equação de Michaelis-Menten), obtendo
uma equação para a variância e para ρ(t) e <ρ(t)>, com as equações obtidas por
métodos analíticos, foi comparado essas equações com simulações
computacionais, e com isso obteve os resultados que serão explicados logo a
seguir.
Para os valores utilizando método de Monte Carlo, valores analíticos da
EMM, valores para uma correção estocásticas e valores para a correção da
variância da equação de Michaelis-Menten, na diferença entre as flutuações para
os respectivos valores de ρ0(<ρ(t)>) - < ρ0(<ρ(t)>) > no eixo das ordenadas, no
começo de 200 segundos de simulação todos os métodos foram muito próximos,
porém quando houve em torno de 500 segundos de simulação os métodos
divergiram brevemente porém essa divergência diminuiu com a passar do
tempo, e damos total atenção a EMM que sempre divergiu dos outros métodos.
Outra analise que pode ser feita é para a relação 〈 p0(ρ(t))〉 /p0(〈 ρ(t)〉 ).
Observou que nesses dados o tempo antes de 200 segundos houve muita
divergência entre o método computacional (simulação por Monte Carlo) em
relação aos outros utilizados e também nos primeiros 200 segundos o EMM não
se mostrou muito correta, todavia a partir dos 400 segundos houve uma
convergência dos métodos, mesmo que haja uma leve diferença entre os
valores, pode considerar que o método analítico e o método computacional se
mostraram muito eficaz para a aplicação na regulação gênica em bactérias.
 Entretanto houve diferenças em alguns pontos e isso pode ser explicado
da seguinte forma que as flutuações das concentrações do fator de transcrição
foi crucial para a diferença de probabilidades de ocupação determinísticas e
estocásticas, significando que o equilíbrio rápido de TF-DNA teve pouco ou
nenhum efeito em relação a diferença de probabilidades, isso foi confirmado pela
partida acirrada dos métodos analíticos, assim associa o desvio observado a
quebra do equilíbrio do estado intermediário.
Agora haverá uma discussão dos resultados obtidos, sendo o enfoque nas
discussões logo a seguir.
No artigo apresentado, foi demonstrado que as flutuações da
concentração estocásticas levam a uma correção da equação de Michaelis-
Menten da cinética da reação e isso foi bem simples conceitualmente, pois só
levou em consideração uma variância do conjunto molecular da flutuação da
concentração. No entanto, a correção de variância para a equação de Michaelis-
Menten pode ser usada para interligar outras fontes de estocasticidade que pode
ser em particular as flutuações a montante, e não é restrito a pequenas
flutuações e, portanto, representa um conceito mais geral e flexível.
Na literatura há estudos de que as flutuações de concentrações de
metabólitos intermediários na rede de estruturas que consistem em múltiplos
complexos enzimáticos não correlacionados, garantindo que as flutuações
espontaneas não se espalham na rede. Para se ter uma perspectiva mais correta
sobre esse caso e expandir para redes maiores, é necessário utilizar cálculos
matemáticos incrivelmente estocásticos relacionando com a expansão em série
de Taylor para ordens mais superiores.
Como foi visto e apresentado que flutuações na concentração pode
acarretar uma variância na cinética da reação por complexos enzimáticos,
todavia não é apenas que as flutuações mude a cinética da reação, a mudança
conformacional da enzima pode acarretar essa mudança, assim como também
a mudança conformacional quando há a ligação entre a enzima e o substrato,
nessa mudança conformacional temos uma mudança na taxa de reação
enzimática, alguns estudos sugerem que esse desacoplamento entre enzima e
substrato é sensível à taxa de uma reação enzimática, mostrando que com o
acréscimo da concentração do substrato tenho uma diminuição nessa taxa de
reação, e com o decréscimo da concentração do substrato tenho um aumento
da taxa de reação.
Com esses estudos apresentados sobre a taxa de reação enzimática é
necessário que haja novas experiências em ambientes celulares ou até mesmo
em ambientes vivos. Estudando isso é possível que obtenha novos mecanismos
para o processo de reação enzimática.
Portanto, utilizando os métodos mostrados no artigo é possível que haja
novas experiências para técnicas experimentais em sistemas celulares in vivo
observando a taxa de reação enzimática e também melhores computadores para
que realizem mais iterações possíveis utilizando o método de Monte Carlo. Foi
mostrado que a equação de Michaelis-Menten corrigida se tornou muito próxima
das simulações numéricas e também das simulações utilizando métodos
estocásticos, isso evidencia que a correção está correta, sendo que o próximo
passo é sempre o progresso, sendo assim devemos passar isso adiante para
que a cada dia mais, novos estudos de reações enzimáticas possam ocorrer e
que sempre há novas descobertas nessa imensa área de Biofísica Molecular.
Referências
-Pulkkinen, O. and Metzler, R. Variance-corrected Michaelis-Menten equation
predicts transient rates of single-enzyme reactions and response times in
bacterial gene-regulation. Sci. Rep. 5, 17820; doi: 10.1038/srep17820 (2015).
- Henri, V. Theorie generale de l’action de quelques diastases. C. R. Acad. Sci.
Paris 135, 916–919 (1902).
- Henri, V. Lois générales de l’action des diastases 1–129 (Hermann, Paris,
1903).
- Thattai, M. & van Oudenaarden, A. Intrinsic noise in gene regulatory networks.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 8614–8619 (2001).
- Paulsson, J. Models of stochastic gene expression. Phys. Life Rev. 2, 157–175
(2005).
- Popova, S. V. & Sel’kov, E. E. Generalization of the model of Monod, Wyman
and Changeux for the case of reversible monosubstrate reactions. FEBS Lett. 53,
270–273 (1975).
- Kolesov, G., Wunderlich, Z., Laikova, O. N., Gelfand, M. S. & Mirny, L. A. How
gene order is influenced by the biophysics of transcription regulation. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 104, 13948–13953 (2007).
- Hammar, P. et al. Direct measurement of transcription factor dissociation
excludes a simple operator occupancy model for gene regulation. Nature Genet.
46, 405–408 (2014).
- Di Rienzo, C., Piazza, V., Gratton, E., Beltram, F. & Cardarelli, F. Probing short-
range protein Brownian motion in the cytoplasm
of living cells. Nature Comm. 5, 5891 (2014).
- van den Broek, B., Lomholt, M. A., Kalisch, S. M. J., Metzler, R. & Wuite, G. J.
L. How DNA coiling enhances target localization by proteins. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 105, 15738–15742 (2008).
- Reverey, J. F. et al. Superdiffusion dominates intracellular particle motion in the
supercrowded space of pathogenic Acanthamoeba castellanii. Sci. Rep. 5, 11690
(2015).
- Pirone, J. R. & Elston, T. C. Fluctuations in transcription factor binding can
explain the graded and binary responses observed in inducible gene expression.
J. Theor. Biol. 226, 111–121 (2004).
- Gillespie, D. T. Exact Stochastic Simulation of Coupled Chemical Reactions. J.
Phys. Chem. 81, 2340–2361 (1977).
-Min, W. et al. When Does the Michaelis-Menten Equation Hold for Fluctuating
Enzymes? J. Phys. Chem. B 110, 20093–20097 (2006).