NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4132
1997-05-28

MICROBIOLOGA. GUA GENERAL PARA EL RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS. TCNICA DE RECUENTO DE COLONIAS A 25 C

E:

MICROBIOLOGY. GENERAL GUIDANCE FOR ENUMERATION OF YEASTS AND MOULDS. COLONY COUNT TECHNIQUE AT 25 DEGREES C.

CORRESPONDENCIA:

esta norma es equivalente a la norma ISO 7954, con desviaciones tcnicas menores anlisis microbiolgico, anlisis bacteriolgico, producto alimenticio, ensayo biolgico.

DESCRIPTORES:

I.C.S.: 07.100.30
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC) Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435

Prohibida su reproduccin

PRLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo caracterizado por la participacin del pblico en general. La NTC 4132 fue ratificada por el Consejo Directivo de 1997-05-28. Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a travs de su participacin en el Comit Tcnico 000031 Microbiologa.

A.D. CONTROL ACEGRASAS ALPINA S.A. AQUALAB LTDA. ASINAL LTDA. BIOQUILAB CALIDAD MICROBIOLGICA CARULLA Y CA S.A. CASA LUCKER CICOLAC COLSUBSIDIO COMPAA NACIONAL DE CHOCOLATES CONGELAGRO CREPES Y WAFFLES DISA-MAIZENA EMPRESA DE ACUEDUCTO Y ALCANTARILLADO DE BOGOT FBRICA DE ESPECIAS Y PRODUCTOS EL REY

GASEOSAS COLOMBIANAS CENTRO S.A. GASEOSAS LUX INDUSTRIAL DE GASEOSAS S.A. INGENIO RIOPAILA INVIMA LLOREDA GRASAS S.A. MANANTIAL S.A. MEALS DE COLOMBIA NESTL DE COLOMBIA NULAB LTDA. POSTOBN PROLECHE SUIZO - NOEL - ZEN UNIVERSIDAD DE LA SALLE UNIVERSIDAD DE LOS ANDES UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

Adems de las anteriores, en Consulta Pblica el Proyecto se puso a consideracin de las siguientes empresas: CERVECERA LEONA CERVUNIN COLOMBIANA S.A. COLSUBSIDIO INGENIO PROVIDENCIA INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO INSTITUTO NACIONAL DE SALUD MERCK (L-PRO) SUCROMILES S.A.

ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales. DIRECCIN DE NORMALIZACIN

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NTC 4132

MICROBIOLOGA. GUA GENERAL PARA EL RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS. TCNICA DEL RECUENTO DE COLONIAS A 25 C

0.

INTRODUCCIN

Esta norma proporciona una gua general para el anlisis microbiolgico de productos alimenticios no incluidos en otras normas y para ser tomada en cuenta en la preparacin de mtodos de ensayo microbiolgicos aplicados en alimentos y en alimentos para animales. Debido a la gran variedad de productos dentro de este campo de aplicacin, esta gua puede no ser apropiada para algunos productos en algunos detalles y para otros productos puede ser necesario usar mtodos diferentes. Sin embargo, se espera que en todos los casos se intentar aplicar la presente gua hasta donde sea posible y aquellas desviaciones que se presenten sern nicamente hechas, si es absolutamente necesario, por razones tcnicas. La armonizacin de mtodos de ensayo no puede ser inmediata, y para ciertos grupos de productos pueden existir Normas Internacionales y/o Normas Nacionales que no estn de acuerdo con esta norma. En el caso en que la Norma Internacional ya exista para el producto que se va a analizar, sta debe seguirse, pero se espera que cuando esa norma se revise, sea modificada para que cumpla con la presente norma, de modo que cualquier desviacin que permanezca sea la necesaria y por razones tcnicas bien establecidas.

1.

ALCANCE Y CAMPO DE APLICACIN

Esta norma establece una gua general para el recuento de mohos y levaduras viables en productos elaborados para consumo humano o animal por medio de la tcnica de recuento de colonias a 25 C.
Nota. Debido a la naturaleza de los mohos y levaduras , el recuento est sujeto a ciertas imprecisiones.

2.

REFERENCIAS NORMATIVAS

Las siguientes normas contienen disposiciones que, mediante su referencia en este texto constituyen disposiciones del mismo. En el momento de la publicacin eran vlidas las indicadas. Todas las normas estn sujetas a actualizacin. Se recomienda a las partes que realizan acuerdos con base en esta norma, a que investiguen la posibilidad de aplicar las ediciones ms recientes de las siguientes normas: 1

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NTC 4132

NTC 4092:1997, Microbiologa de alimentos para animales. Reglas generales para los anlisis microbiolgicos. ISO 6887, Microbiology. General Guidance for the Preparation of Dilutions for Microbiological Examination.

3.

DEFINICIN

Para el propsito de esta norma se aplica la siguiente definicin: Mohos y levaduras: microorganismos que a 25 C forman colonias en un medio selectivo, de acuerdo con el mtodo especificado en esta norma.

4.

PRINCIPIO

4.1 Se preparan placas usando un medio selectivo y una cantidad especificada de la muestra a analizar, si el producto es lquido, de una suspensin inicial en el caso de otros productos. Se preparan otras placas, bajo las mismas condiciones, usando diluciones decimales de la misma muestra o de la suspensin inicial. 4.2 Incubacin aerbica de las placas a 25 C por 3 d, 4 d o 5 d.

4.3 Clculo del nmero de mohos y de levaduras por gramo o por mililitro de muestra a partir del nmero de colonias obtenidas en las placas escogidas, a los niveles de dilucin que den resultados significativos.

5. 5.1

DILUYENTE Y MEDIO DE CULTIVO MATERIALES BSICOS

Para mejorar la reproducibilidad de los resultados, se recomienda que se use para la preparacin del medio de cultivo, los componentes bsicos del medio o un medio completamente deshidratado. Se deben seguir rigurosamente las instrucciones del fabricante. Los productos qumicos usados deben ser de calidad analtica reconocida. El agua utilizada debe ser agua destilada o agua desionizada libre de sustancias que puedan inhibir el crecimiento de mohos y levaduras bajo las condiciones de ensayo. La medida de pH debe hacerse usando un medidor de pH con compensacin de temperatura (vase el numeral 6.4). Si no se usan inmediatamente el diluyente y el medio preparados, deben almacenarse, a no ser que se disponga algo diferente, en un lugar oscuro a una temperatura entre 0 C y 5 C y por un tiempo no mayor a un mes, en condiciones bajo las cuales no haya cambios en su composicin. 5.2 DILUYENTE

Vase la norma ISO 6887 y cualquier otra Norma Internacional que trate del producto que se va a examinar. 2

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5.3

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MEDIO AGAR-EXTRACTO DE LEVADURA-DEXTROSA-CLORANFENICOL

Nota. Puede utilizarse cualquier otro medio similar siguiendo las instrucciones del fabricante.

Tabla 1. Composicin del medio Componente Extracto de levadura Dextrosa (C6 H12 O6) Cloranfenicol (C11 H12 Cl2 N2 O5 ) Agar Agua 5g 20 g 0,1 g 1 12 g a 15 g 2 1 000 ml Cantidad

Nota 1. Para obtener una concentracin final de 100 g/ml del medio. Nota 2. De acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se disuelven los componentes en agua, mediante ebullicin. Si es necesario se ajusta el pH despus de la esterilizacin a 6,6. Se distribuye el medio agar en recipientes adecuados (vase el numeral 6.5). Se esteriliza el medio de acuerdo con las instrucciones del fabricante a 121 C 1 C (245 kPa) por 15 min.
Nota. El cloranfenicol se puede reeemplazar por oxitetraciclina ( C22 H30 N2 O11 ). En este caso, se prepara el medio bsico como se describi anteriormente omitiendo el cloranfenicol, se distribuye en cantidades de 100 ml y se esteriliza. Se prepara tambin una solucin de hidrocloruro de oxitetraciclina al 0,1 %, en agua y se esteriliza por filtracin. Slo antes del uso, se adicionan aspticamente 10 ml de esta solucin a 100 ml del medio bsico, el cual se ha fundido previamente y se mantiene a 45 C.

6.

APARATOS Y MATERIAL DE LABORATORIO

Nota. Los materiales desechables son una alternativa al material de vidrio reutilizable si tienen las especificaciones adecuadas.

El equipo usual de laboratorio y en particular: 6.1 Aparatos para la esterilizacin por calor seco (horno) o la esterilizacin por calor hmedo (autoclave) (el autoclave puede ser un equipo que se opera separadamente o como parte de un equipo general para la preparacin y distribucin de medios de cultivo). Se esteriliza el material que estuvo en contacto con el diluyente, el medio de cultivo o la muestra, particularmente los materiales plsticos y excepto los materiales que se suministran estriles, mediante uno de los siguientes mtodos:

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a)

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en el horno (vase el numeral 6.1) manteniendo la temperatura de 170 C a 175 C por no menos de una hora. en un autoclave (vase el numeral 6.1) mantenindolo a 121 C 1 C por no menos de 20 min.

b)

6.2 6.3

Incubadora, capaz de mantener una temperatura a 25 C 1 C. Bao de Mara, capaz de mantener una temperatura de 45 C 1 C.

6.4 Medidor de pH con compensacin de temperatura, con una precisin de calibracin de 0,1 unidades de pH a 25 C. 6.5 Frascos o Erlenmeyer

Nota. Se pueden usar frascos o Erlenmeyer con tapa rosca metlica no txica.

6.6 Pipetas graduadas, calibradas, para uso bacteriolgico nicamente, de capacidades nominales de 10 ml y 1 ml, graduadas en divisiones de 0,5 ml y 0,1 ml respectivamente y con una abertura de salida de 2 mm a 3 mm. 6.7 Cajas de Petri, de 90 mm a 100 mm de dimetro.

7.

MUESTREO

El muestreo se debe llevar a cabo con la norma especfica para el producto que se va a analizar. Si no existe una norma especfica se recomienda llegar a un acuerdo sobre esta materia, entre las partes.

8.

PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO

Para la preparacin de la muestra de ensayo debe verse la norma especfica del producto que se va a analizar. Si no hay una norma especfica se recomienda llegar a un acuerdo sobre esta materia, entre las partes.

9. 9.1

PROCEDIMIENTO PORCIN DE ANLISIS, SUSPENSIN INICIAL Y DILUCIONES

Se deben seguir la norma ISO 6887 y la norma especfica de producto que se va a analizar. Si no hay una norma especfica se recomienda llegar a un acuerdo sobre esta materia, entre las partes.

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9.2 INOCULACIN E INCUBACIN

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9.2.1 Se toman dos cajas de Petri estriles (vase el numeral 6.7). Se transfiere a cada caja de Petri, con una pipeta estril (vase el numeral 6.6) 1 ml de la muestra si es lquida o 1 ml de la suspensin inicial en el caso de otros productos. 9.2.2 Se toman otras dos cajas de Petri. Se transfiere por medio de otra pipeta estril, 1 ml de la dilucin 10-1 (producto lquido), o 1 ml de la dilucin 10-2 (otro producto). Se repite el procedimiento anterior usando mayores diluciones si es necesario. 9.2.3 Se transfieren desde uno de los frascos de cultivo (vase el numeral 6.5), a cada caja de Petri, aproximadamente 20 ml del medio agar-extracto de levadura-dextrosa-cloranfenicol (vase el numeral 5.3), previamente fundido y mantenido a una temperatura de 45 C 1 C, en bao de Mara (vase el numeral 6.3). El tiempo transcurrido entre el final de la preparacin de la suspensin inicial (o de la dilucin 10-1 si el producto es lquido) y el momento en que el medio se transfiere a las cajas de Petri no debe exceder los 20 min. Cuidadosamente, se mezcla el inculo con el medio y se permite que la mezcla solidifique, dejando que las cajas de Petri permanezcan en una superficie horizontal fra. Se debe preparar una caja de Petri de control, con 15 ml del medio para verificar su esterilidad. 9.2.4 Se invierten las cajas de Petri y se llevan a la incubadora (vase el numeral 6.2) a una temperatura de 25 C 1 C. 9.3 INTERPRETACIN

Se cuentan las colonias de cada caja despus de 3 d, 4 d y 5 d de incubacin. Despus de 5 d, se cuentan las cajas que contengan menos de 150 colonias. Si en alguna parte de la caja hay sobrecrecimiento con mohos o si es difcil contar colonias bien aisladas, se emplean los conteos realizados a los 4 d o 3 d de incubacin. En este caso se refiere el periodo de incubacin como de 3 d o 4 d en el reporte de ensayo. Si es necesario, se llevan al microscopio para distinguir las colonias de mohos y levaduras de las bacterias, de acuerdo con su morfologa.

10. 10.1

EXPRESIN DE RESULTADOS CLCULO

10.1.1 Se usan para el recuento, los platos que contengan menos de 150 colonias. 10.1.2 El nmero de levaduras y de mohos por gramo o por mililitro es igual a : C -----------------(n1 + 0,1 n2 ) d Donde: C n1 es la suma de colonias contadas en todas las cajas; es el nmero de cajas contadas de la primera dilucin; 5

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n2 d

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es el nmero de cajas contadas de la segunda dilucin; es el factor de dilucin con que se obtuvo el primer recuento (por ejemplo, 102).

10.1.3 Se debe redondear el resultado obtenido en el numeral 10.1.2 a dos cifras significativas. Cuando el nmero que se redondea es 5 y no hay otras cifras significativas, se redondea el nmero para dar una cifra par inmediatamente a la izquierda, por ejemplo 28 500 se redondea a 28 000; 11 500 se redondea a 12 000. 10.1.4 El resultado se expresar como un nmero entre 1,0 y 9,9 multiplicado por 10x , donde x es la potencia apropiada de 10. Si no hay colonias en las cajas de la suspensin inicial (vase el numeral 9.1), y si el producto inicial era slido, el nmero de levaduras y mohos por gramo del producto se debe reportar como < 10 (menor de 10). Si no hay colonias en las cajas de la muestra de ensayo y si el producto inicial es lquido (vase el numeral 9.1), el nmero de mohos y levaduras por mililitro de producto debe reportarse como < 1 (menor de 1). 10.2 EJEMPLO DE CLCULO

Un recuento de mohos y levaduras dio el siguiente resultado (se incubaron dos cajas de Petri por dilucin): dilucin 10-2 : 83 y 97 colonias dilucin 10-3 : 33 y 28 colonias C 83 + 97 + 33 + 28 241 -------------------- = -------------------------------------- = --------------- = 10 954 (n1 + 0,1 n2 ) d [ 2 + (0,1 x 2) ] x 10-2 0,022 Redondeando el resultado como se indic en 10.1.3 da 11 000. El nmero estimado de mohos y levaduras es por lo tanto: 1,1 x 10 4 expresados /g o /ml. 10.3 PRECISIN

Por razones estadsticas, en el 95 % de los casos los niveles de confianza por este mtodo varan de 16 % a 52 %. En la prctica, se han observado variaciones mucho mayores, en particular entre los resultados obtenidos por diferentes microbilogos.

11.

REPORTE DEL ENSAYO

En el reporte del ensayo se debe registrar el mtodo usado, el tiempo de incubacin y los resultados obtenidos, indicando claramente el mtodo de expresin usado. Tambin debe mencionarse cualquier detalle de operacin no especificado en la presente norma, o considerado como opcional, junto con los detalles de cualquier incidente que haya influenciado los resultados. 6

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El reporte del ensayo incluir toda la informacin necesaria para la identificacin completa de la muestra.

12.

DOCUMENTO DE REFERENCIA

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology. General Guidance for the Enumeration of Yeasts and Moulds. Colony Count Technique at 25 degrees C. Geneva, 1987. 3 p. (ISO 7954).