PRCTICA 4 TINCIN DIFERENCIAL DE ENDOSPORAS Y CPSULA INTRODUCCIN Existen diversos tipos de esporas microbianas, pero la espora bacteriana tiene

especial importancia ya que son organelos de gran resistencia que se producen en el interior de la clula, por lo que reciben el nombre de endosporas. Es una estructura compuesta, de dipicolinato de calcio en el centro, dentro de su compleja cubierta que consta de siete capas que contienen murena. Son muy resistentes y refractarias a la desecacin, a los agentes qumicos y sobre todo a temperaturas elevadas, ya que pueden sobrevivir expuestas a altas temperaturas durante largos perodos. Pocos gneros de bacterias son capaces de formar endosporas, siendo los principales: Bacillus y Clostridium. La esporulacin de una bacteria se forman en cierto perodo del desarrollo de la clula. Su funcin no es la reproduccin, ya que de un bacilo que forma una espora solo surge una bacteria por germinacin. Tanto el tamao, como la forma y posicin de la espora en la clula bacteriana son caracteres relativamente constantes de cada especie, ya que poseen cierto valor para distinguir entre s los diferentes tipos de bacterias esporuladas. La posicin de la espora en la clula puede ser central, sub-terminal o terminal y de forma redonda u ovalada y puede ser ms grande o ms pequea que el dimetro de la bacteria. OBJETIVO Aprender a realizar tinciones diferenciales para evidenciar estructuras bacterianas especiales (endosporas y cpsula) CONOCIMIENTOS PREVIOS _Preparacin de frotis a partir de medios lquidos y de medios slidos. _Tcnicas de tincin _ Estructura celular bacteriana _ Uso, manejo y cuidado del microscopio compuesto.
MATERIAL

Cultivo bacteriano de Klebsiella pneumoniae en 1 mL de caldo nutritivo Cultivo bacteriano de Bacillus subtilis en 1 mL de caldo nutritivo Cultivo bacteriano de Klebsiella pneumoniae en agar Mac Conkey Cultivo bacteriano de Bacillus subtilis en en agar nutritivo Portaobjetos Cubreobjetos Pipeta de transferencia

Asa bacteriolgica recta, Mecheros de Bunsen redonda con manguera de ltex Vaso de precipitado de 1000 mL Algodn plisado Contenedor para RPBI Gasa Guantes Papel china blanco

Soporte universal con arillo metlico Contenedor RPBI para punzocortantes Pinzas Aceite de inmersin Safranina al 0.5% en agua destilada. Frasco tinta china Pelikan Atomizador con fenol al 5%

Papel estraza para envolver.

Verde de malaquita al 5% en agua. destilada Frasco gotero con 25 mL de safranina Pizetas con agua destilada Frasco con 10 mL de aceite de inmersin EQUIPO Microscopio PROCEDIMIENTO Para tincin de endosporas Autoclave

1. Preparar una extensin a partir del cultivo bacteriano. 2. Colocar la extensin sobre un soporte universal con arillo metlico y agregar suficiente solucin de verde de malaquita al 5%. Durante 5 min. 3. Flamear la extensin pasando por debajo de sta el mechero Bunsen hasta observar una ligera emisin de vapores por espacio de un minuto y medio, evitando que se evapore totalmente el colorante. 4. Lavar enrgicamente al chorro del agua, hasta eliminar exceso de colorante. 5. Cubrir la preparacin con solucin de contraste, Safranina al 5%, y dejar actuar el colorante durante un minuto y medio. 6. Lavar al chorro del agua hasta eliminar el exceso de colorante. 7. Secar al aire o utilizando papel absorbente. 8. Observar al microscopio con objetivo de inmersin en aceite. INTERPRETACION: Las esporas debern estar teidas de color verde y los cuerpos bacilares en rojo.

NOTA:Cuando termine de utilizar el microscopio asegrese de limpiarlo correctamente.

REPORTE: dibuje lo observado e identifique las endosporas y especifque el tipo de medio de cultivo de dnde realizo el frote, las caractersticas de la colonia (en medio slido) CUESTIONARIO 1. Investigue el nombre que recibe el mtodo de tincin empleado para endosporas y. mencione otros mtodos de coloracin de esporas. 2. A qu se debe la resistencia trmica de la endospora? 3. Qu importancia tienen las endosporas? 4. Explicar cmo pueden ser destruidas las endosporas? 5.Mencionar las principales caractersticas del gnero 6.-Explique el fundamento de la tincin de esporas.

Bacillus

RESULTADOS Reportar morfologa colonial observada Morfologa al microscopio de las bacterias observadas. Diferencias observadas en las tinciones realizadas en muestras lquidas y solidas

Tincin negativa
Este procedimiento consiste en la tincin de fondo con un colorante cido para dejar las clulas incoloras en contraste. Comnmente se utiliza el colorante negro llamado nigrusna. El mtodo sirve para observar bacterias o estructuras que difcilmente se tien con las tcnicas directas La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas. Algunas bacterias presentan una capa externa a la pared denominada cpsula. Est compuesta de azcares y protenas. No es una estructura vital para la bacteria, de modo que es posible que bajo determinadas condiciones ambientales o del propio desarrollo genere cpsula y bajo otras no lo haga. Se ha comprobado que la presencia de cpsula dificulta de algn modo la fagocitosis de las bacterias, es decir las cpsulas constituyen un factor de virulencia de los microorganismos. La deteccin de cpsulas en las bacterias tambin puede orientarnos en el diagnstico de laboratorio, y es especialmente importante en el diagnstico. La tincin de cpsula se denomina tincin negativa porque tie el fondo de la

preparacin y no el microorganismo. Desde el punto de vista formal no es una tincin propiamente dicha, porque no fija los microorganismos. Se parece ms a una preparacin en fresco. Su realizacin es sencilla, consiste en colocar la muestra hmeda sobre el porta objetos y mezclarla con tinta china. La tinta cubre toda la preparacin a excepcin de las cpsulas. PROCEDIMIENTO 1. Preparar una extensin o frote a partir del cultivo bacteriano. PERO SECAR NI FIJAR. (PREPARACIN EN FRESCO). 2. ADICIONAR UNA GOTA DE Tinta China encima de la muestra 3. Cubrir la preparacin con un cubreobjetos NO PRESIONAR. 6. OBSERVAR INMEDIATAMENTE al microscopio con el objetivo de 40 y 100x INTERPRETACIN: En el microscopio se observa el fondo negro y los microorganismos con cpsula sin color. Rodeadas de un halo brillante y claro. NOTA:Cuando termine de utilizar el microscopio asegrese de limpiarlo correctamente. REPORTE: dibuje lo observado e identifique las endosporas y especifque el tipo de medio de cultivo de dnde realizo el frote, las caractersticas de la colonia (en medio slido) CUESTIONARIO: 1.Qu importancia tienen la presencia de cpsula en las bacterias? 2.Qu sustancias componen la cpsula? 5. Mencione las principales caractersticas del gnero Klebsiella y que otras bacterias poseen cpsula. 6.-Explque el fundamento de la tincin de cpsula.