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Data de recebimento: 09-dez-2015

Data de revisão: 26 de julho de 2016

Data de aceitação: 21 de setembro de 2016

Tipo de artigo : Artigo original

Efeito inibitório do LED de 660 nm na síntese de melanina in vitro e in vivo

2*
Chang Taek OH1, , Tae Rin Kwon1* , Eun Ja Choi1 , Em breve Re Kim1, Joon Seok1 , Seo Kyun

Mun3 , Kwang Ho Yoo4 , Yeon Shik Choi5 , Sun Young Choi1† , Beom Joon Kim1, 2†

1Departamento de Dermatologia, Faculdade de Medicina da Universidade Chung-Ang, Seul, Coréia

2Department of Medicine, Graduate School, Chung-Ang University, Seul, Coréia

3Departamento de Otorrinolaringologia, Faculdade de Medicina da Universidade Chung-Ang, Seul,

Coréia

4Departamento de Dermatologia, Faculdade de Medicina, Universidade Católica de Kwandong,

Hospital Internacional St.Mary, Incheon, Coréia

5Centro de Pesquisa de Convergência de TI Médica, Instituto de Tecnologia Eletrônica da Coréia,

Gyeonggi-do, Coreia

* Esses autores contribuíram igualmente como primeiros autores

Este artigo foi aceito para publicação e passou por revisão completa por pares, mas não passou
pelo processo de edição, tipografia, paginação e revisão, o que pode levar a diferenças entre esta
versão e a Versão de Registro. Por favor, cite este artigo como
doi: 10.1111/phpp.12276

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† Esses autores contribuíram igualmente como autores correspondentes

Título curto: Efeito inibitório do LED de 660 nm na melanogênese

†Autor correspondente:

Prof. Beom Joon Kim, MD, PhD.

Departamento de Dermatologia, Hospital Universitário Chung-Ang, 102 Heukseokro, Dongjak-gu,

Seul 156-755, Coreia do Sul

E-mail: beomjoon@unitel.co.kr

Telefone: 82-2-6299-1525, Fax: 82-2-811-1159

Prof. Sun Young Choi, MD, PhD

Departamento de Dermatologia, Hospital Universitário Chung-Ang, 102 Heukseokro, Dongjak-gu,

Seul 156-755, Coreia do Sul

E-mail: sun02ya@naver.com

Telefone: 82-2-6299-1525, Fax: 82-2-811-1159

RESUMO

Introdução : Distúrbios hiperpigmentares da pele, incluindo pós-inflamatórios

hiperpigmentação, melasma, lentigos solares e condições como sardas são comuns. o

diodos emissores de luz (LEDs) são a mais recente categoria de não-térmicos e não invasivos

fototerapia a ser considerada no tratamento de distúrbios de pigmentação da pele.

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Objetivo: O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do LED de 660 nm em

inibição da melanogênese. Investigamos se um LED de 660 nm afetou a melanina

síntese em modelos in vitro e in vivo , e exploramos os mecanismos envolvidos.

Métodos: O efeito inibitório do LED de 660 nm na síntese de melanina foi avaliado em

Células B16F10 e camundongos sem pêlos possuindo melanina HRM-2 foram usados para avaliar a

efeitos antimelanogenicos do LED de 660 nm.

Resultados: Curiosamente, o LED de 660 nm inibiu a atividade da tirosinase induzida por ÿ-MSH em B16F10

células. Também descobrimos que o LED de 660 nm diminuiu a expressão de MITF e tirosinase e

induziu a ativação de ERK. Esses achados sugerem que os efeitos despigmentantes do 660-

nm LED resultam da regulação negativa da expressão de MITF e tirosinase devido ao aumento

Atividade ERK. O LED de 660 nm reduziu a melanogênese induzida por UVB na pele de HRM-2

via downregulation de tirosinase e MITF.

Conclusão: Esses achados sugerem que o LED de 660 nm é uma estratégia potencialmente despigmentação.

Palavras-chave: Diodo emissor de luz, comprimento de onda de 660 nm, melanogênese, célula B16F10, HRM-2

INTRODUÇÃO

Os comprimentos de onda ultravioleta (UV) da luz solar são divididos em três grupos: UVC (200-

280 nm), UVB (280-320 nm) e UVA (320-400 nm) (1). UV é um importante fator ambiental

fator que afeta a melanogênese, a atividade essencial dos melanócitos na pele humana. UV

A exposição à luz pode resultar em distúrbios hiperpigmentares, como melasma, lentigo e

condições como sardas (2). A melanina é sintetizada pelo melanócito na camada basal do

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epiderme e é estimulado por vários fatores, incluindo alfa-melanócitos estimulantes

hormônio (ÿ-MSH), UV e agentes de elevação de monofosfato de adenosina cíclico, incluindo

isobutilmetilxantina, forscolina e glicirrizina (3-6). Existem três principais melanogênicos

enzimas, tirosinase, proteína-1 relacionada à tirosinase (TRP-1) e proteína-2 relacionada à tirosinase

(TRP-2) (7). A ativação ou regulação positiva de enzimas melanogênicas aumenta

melanogênese e pigmentação.

Nos últimos anos, a fototerapia tem sido usada para tratar uma ampla gama de doenças dermatológicas.

condições. A fototerapia permite a seleção de um comprimento de onda adequado a partir de uma variedade de luz

fontes de energia, oferecendo uma terapia personalizável, eficiente e valiosa para uma ampla gama de

condições médicas (8, 9). Com o reconhecimento dos potenciais benefícios da

fotobioestimulação (10) e o desenvolvimento e refinamento de diodos emissores de luz

(LEDs), os lasers agora são usados para tratar várias condições médicas (11). Fototerapia com

dispositivos médicos LED tem sido estudado durante a última década, fornecendo recentemente evidências

resultados baseados em fotobiomodulação (12). Vários estudos clínicos forneceram

evidência da eficácia da fototerapia LED em condições dermatológicas usando uma variedade de

Comprimentos de onda do LED (13). O processo ideal de fototerapia deve limitar o dano térmico ou

fotodano. Os efeitos úteis da fototerapia LED também foram relatados para

aplicações como cicatrização de feridas, anti-inflamação, fotorejuvenescimento, queimaduras solares

prevenção, resolução da acne vulgar (14-17). Curiosamente, a luz LED de 660 nm foi

relatados para reparar condições da pele induzidas por UV, como inflamação e fotoenvelhecimento,

sugerindo que os mecanismos de ação do LED de 660 nm e da radiação UV são diferentes

(18). No entanto, o efeito inibitório do LED de 660 nm na melanogênese foi estabelecido

na literatura (19).

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Portanto, examinamos se o LED de 660 nm afetou a melanogênese. Em ordem de

entender o mecanismo e avaliar os benefícios da fototerapia com LED de 660 nm,

avaliaram a melanogênese induzida por ÿ-MSH em células B16F10. Também avaliamos um teste in vivo

modelo de hiperpigmentação induzida por UVB usando camundongos sem pêlos possuidores de melanina.

MATERIAIS E MÉTODOS

Fontes de luz e irradiação

O dispositivo LED usado (Korea Electronics Technology Institute, Gyeonggi-do, Coréia)

produziu luz em um comprimento de onda de 660 nm. Para minimizar a geração de calor, as matrizes de LED foram

equipados com sistemas de refrigeração elétrica na parte traseira das lâmpadas dispostas. Todas as culturas celulares

foram irradiados com um LED de 660 nm (7,8 mJ/cm2 ). Para evitar a absorção pela cultura colorida

mídia, as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato e irradiadas a 5 cm de

o dispositivo LED (20).

Reagentes

ÿ-MSH, 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA) e PD98059 foram adquiridos

da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA). O Kit de Contagem de Células-8 (CCK-8) foi adquirido

da Dojindo Molecular Technologies, Inc. (Kumamoto, Japão). Dulbecco modificado

meio de Eagle (DMEM), ácido tripsina-etilenodiamina-tetraacético (EDTA), DPBS e

penicilina/estreptomicina foram adquiridos de Welgene Biopharmaceuticals (Daegu, Coréia).

O soro bovino fetal (FBS) foi adquirido da Life Technologies Co. (Gibco, Life

Technologies, NY, EUA). Anticorpos específicos para fosfo-ERK1/2 (Thr202/Tyr204, #9101),

ERK1/2 (#9102), fosfo-p38 MAPK (Thr180/Tyr182, #4511), p38 MAPK (#9212),

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fosfo-JNK (Thr183/Tyr185, #9251), JNK (#9252) e ÿ-actina (#4967) foram adquiridos

da Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA). Anticorpos específicos para tirosinase (M

19, sc-7834), TRP-1 (H-90, sc-25543) e TRP-2 (H-150, sc-25544) foram adquiridos de

Santa Cruz Biotecnologia, Inc. (Santa Cruz, CA, EUA). MITF Ab-1 (C5, MS-771-P0) foi

adquirido da Thermo Scientific (Fremont, CA, EUA). Anticorpos secundários para anti-cabra

IgG (PI-9500), IgG anti-camundongo (PI-2000) e IgG anti-coelho (PI-1000) foram adquiridos de

Vector Laboratories (Burlingame, CA, EUA).

Cultura de células

As células B16F10 (CRL-6475) foram adquiridas da American Type Culture

Coleção (Rockville, MD, EUA). As células foram cultivadas em DMEM suplementado com 10%

FBS e 1% de penicilina/estreptomicina (Welgene, Daegu, Coréia) e incubados a 37ÿ em um

atmosfera umidificada de 5% CO2.

Ensaio de viabilidade celular

A viabilidade das células irradiadas foi estabelecida usando CCK-8, conforme explicado pela

fabricante. As células foram irradiadas com LED de 660 nm em diferentes valores de intensidade. Depois

24 h, o meio contendo células irradiadas foi substituído por meio contendo 10% de CCK-8

solução. As células foram então incubadas a 37 ÿ por 30 min, e a absorbância foi medida em

450 nm usando um espectrofotômetro (VersaMax; Molecular Devices, CA, EUA).

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Medição do teor de melanina

As células foram irradiadas com LED de 660 nm a 2,5 – 10 J/cm2 e depois incubadas em

DMEM sem vermelho de fenol para FBS a 10% por 72 h. A densidade óptica de cada sobrenadante

mídia foi medida a 405 nm usando um espectrofotômetro.

Ensaio de atividade de tirosinase

A atividade da tirosinase em células B16F10 foi determinada usando um método da literatura com

ligeira modificação (21). As células foram irradiadas com LED de 660 nm a 2,5 – 10 J/cm2 e

em seguida, incubado em DMEM para 10% de FBS por 72 h. As células foram lisadas em 150 ÿl de fosfato

tampão (0,1 M), pH 6,8, contendo 1% de Triton X-100. O extrato celular foi clarificado por

centrifugação a 13.000 rpm por 10 min. Após a quantificação do nível de proteína e a

ajuste de concentração usando tampão de lise, cada extrato (180 ÿl) foi adicionado a um poço de 96

placa, e o ensaio enzimático foi iniciado pela adição de 20 ÿl de solução de L-DOPA a 37ÿ. o

A absorbância a 475 nm e 37 ÿ foi lida a cada 10 min por pelo menos 30 min usando um

espectrofotômetro.

Análise de Western Blot

Os extratos de proteína foram lisados usando tampão RIPA frio (50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 150

mM NaCl, 1% NP40, 0,1% SDS, 0,5% DOC, 1 mM PMSF, 25 mM MgCl2 e fosfatase

coquetel inibidor). A quantidade de proteína nos extratos celulares foi quantificada usando um BCA Protein

Kit de ensaio. Quantidades iguais de proteína por poço foram resolvidas em 10% SDS-PAGE e blotted

em membranas de PVDF (Millipore, Billerica, MA, EUA), que foram então bloqueadas com 5%

leite desnatado em solução salina tamponada com Tris contendo 0,5% de Tween 20 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis,

MO, EUA). A membrana foi sondada com anticorpos específicos e incubada com HRP-

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anticorpos secundários conjugados. Os anticorpos foram detectados usando

reagentes de quimioluminescência (Amersham Pharmacia, Piscataway, Reino Unido)

Imunocitoquímica

As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 15 minutos em temperatura ambiente. o

as células foram tratadas com 0,01% de Triton X-100 em PBS por 15 min à temperatura ambiente e depois

bloqueado com albumina de soro bovino a 2% em PBS por 60 min em temperatura ambiente. Os slides

foram incubados durante a noite com anticorpos de tirosinase (ab180753, Abcam) a 4ÿ. Os slides

foram incubados com IgG anti-coelho de cabra conjugado com FITC (1:1000, NB730-F, Novus

Biologicals, CO, EUA) e montado usando DAPI (Golden Bridge International, Inc., WA,

EUA).

Hiperpigmentação induzida por UVB em HRM-2

Camundongos sem pêlo HRM-2 machos de seis semanas de idade (total = 24) foram

obtidos de Hoshino Laboratory Animals (Saitama, Japão) e alojados em

sala climatizada mantida a 24ÿ±2ÿ e 55%±15% de umidade com 12 h claro-escuro

ciclo. Todos os procedimentos envolvendo animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes da

o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Chung-Ang na Coréia

(Número IACUC: 14-0054). Os camundongos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (n = 6 por grupo.

Os camundongos foram anestesiados com Zoletil 50 (50 mg/kg) e Xilazina (10 mg/kg). O dorso

a pele de cada camundongo foi irradiada com LED de 660 nm antes da exposição UVB (BIO-SPECTRA;

Vilber Lourmat, França). O cronograma experimental é detalhado na Figura 5A. A cor de

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cada local da pele foi medido usando um espectrofotômetro (CR-10, Konica Minolta Sensing Inc.,

Osaka, Japão).

Análise histopatológica

Amostras de pele dorsal foram fixadas em paraformaldeído a 4%, incluídas em parafina e

cortado em seções de 5 ÿm. Os cortes de pele foram corados com H&E e Fontana-Masson para

melanina. Seções de pele adicionais foram coradas para marcadores imuno-histoquímicos usando

anticorpos monoclonais contra tirosinase (1:500, ab180753, Abcam), MITF (1:200, NBP1-

61363, Novus) e Melan-A (1:200, NBP1-30151, Novus).

Análise estatística

Toda a análise dos dados foi realizada pelo menos três vezes, e os resultados são expressos como

média ± desvio padrão. Os dados foram analisados usando ANOVA de uma via (software SPSS,

SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Valores de p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), ep < 0,001 (***)

foram considerados significativamente diferentes.

RESULTADOS

Efeito do LED de 660 nm na melanogênese das células B16F10

Para investigar se o LED de 660 nm tem viabilidade celular nas células, irradiamos o LED

faixa de 0 – 20 J/cm2 . Conforme mostrado na Figura 1a, o tratamento com LED de 660 nm reduziu a viabilidade celular

para menos de 20% (p=0,001929) a 15 J/cm2 . Para determinar se o LED de 660 nm inibiu

síntese de melanina, medimos o conteúdo de melanina das células B16F10. Usamos PTU como

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controle positivo nesses experimentos porque o PTU tem efeitos inibitórios conhecidos sobre a melanina

síntese. Os teores de melanina foram significativamente reduzidos de maneira dose-dependente em 660-

nm de irradiação LED em células B16F10 (Figura 1b). Além disso, LED de 660 nm na mesma dose

também diminuiu a atividade da tirosinase em células B16F10 (Figura 1c).

Efeito do LED de 660 nm nos níveis de expressão de proteínas relacionadas à melanogênese

Para determinar se o efeito da luz LED de 660 nm estava relacionado à melanogênese,

avaliou a expressão nos níveis de tirosinase, TRP-1, TRP-2 e MITF em um curso diurno

experimento 24 a 72 h após as células serem irradiadas com LED de 660 nm a 10 J/cm2 e antes

à estimulação na presença de ÿ-MSH (Figura 2a). Além disso, o efeito do LED de 660 nm

o nível de expressão da tirosinase foi avaliado por imunocitoquímica (Figura 2b). o

os resultados mostraram que o nível de expressão da tirosinase nas células foi diminuído pelo LED de 660 nm

após 72 h na presença de ÿ-MSH.

Efeito do LED de 660 nm na fosforilação de ERK em células B16F10

Elucidar os mecanismos subjacentes ao efeito inibitório do LED de 660 nm sobre

melanogênese, caracterizamos as mudanças nos sinais relacionados à melanogênese usando

análise de manchas em um experimento de curso de tempo. Como a fosforilação de ERK foi

relatado para desencadear a degradação do MITF, examinamos se o LED de 660 nm influenciou o ERK

ativação. Conforme mostrado na Figura 3a, a fosforilação de ERK em células B16F10 foi induzida

por LED de 660 nm em 120 min após a irradiação. Como a fosforilação de ERK foi

relataram diminuir a síntese de melanina, confirmamos se o LED de 660 nm induziu

As vias de sinalização ERK fosforiladas estão envolvidas na síntese de melanina celular em

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Células B16F10 irradiadas com LED de 660 nm por 30 min na presença ou ausência de PD98059

(inibidor de ERK). Conforme mostrado na Figura 3b, o conteúdo de melanina em células B16F10 co-cultivadas

com ÿ-MSH e PD98059 foram maiores do que aquelas em células cultivadas apenas com ÿ-MSH.

Além disso, esses efeitos sinérgicos de ÿ-MSH e PD98059 no conteúdo de melanina foram

compensado por irradiação de LED de 660 nm. Avaliamos se PD98059 inibe a fosforilação

da via ERK em células B16F10 e descobriu que PD98059 bloqueia ERK

fosforilação (Figura 3c).

Efeito do LED de 660 nm na melanogênese induzida por UVB em HRM-2

Os efeitos do LED de 660 nm na melanogênese foram avaliados em camundongos HRM-2. o

a cor da pele dorsal de camundongos HRM-2 foi fotografada usando uma câmera digital (5200D; Canon

Inc., Tóquio, Japão). Esses resultados mostraram que o LED de 660 nm é eficaz em diminuir

síntese de melanina em uma hiperpigmentação induzida por UVB (Figura 4b). Os ratos foram

irradiados com ou sem LED de 660 nm e irradiação UVB repetida levaram à melanogênese.

A cor das áreas dorsais da pele foi medida usando um espectrofotômetro CR-10. Nós

observaram um aumento dependente da dose no valor L de camundongos irradiados com LED de 660 nm em comparação com

Grupo irradiado com UVB. As alterações totais dos valores L foram calculadas subtraindo o primeiro dia L

valores dos valores L do último dia . Os grupos irradiados por LED de 660 nm mostraram um

efeito de inibição em comparação com o grupo irradiado com UVB (Figura 4c).

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Efeito do LED de 660 nm na análise histopatológica induzida por UVB em HRM-2

Os tecidos da pele dorsal corados com H&E foram obtidos após 17 dias, e o status do

epiderme foi observada por microscopia óptica. O LED de 660 nm teve efeitos inibitórios sobre

Condição epidérmica e dérmica induzida por UVB (Figura 5a) e diminuiu significativamente

espessura da epiderme em relação ao grupo irradiado com UVB (Figura 5b). Esses resultados indicam

que o LED de 660 nm protege a hiperqueratose induzida por UVB. Para visualizar o conteúdo de melanina de

camada basal da epiderme, o tecido cutâneo dorsal foi corado com coloração de Fontana-Masson e

observado. Conforme mostrado na Figura 5c, os grupos de LED de 660 nm tiveram

diminui em comparação com o grupo irradiado com UVB. Além disso, realizamos

imuno-histoquímica para confirmar as alterações de expressão na proteína do tecido cutâneo dorsal

expressão usando os marcadores de melanogênese S100, Melan-A, tirosinase e MITF

anticorpos. O grupo irradiado com luz LED de 660 nm demonstrou ser significativo e dependente da dose

diminui na expressão da proteína em comparação com o grupo irradiado com UVB.

DISCUSSÃO

A melanogênese é o principal mecanismo de proteção contra lesões relacionadas ao sol em

pele humana e é responsável pela cor da pele (22). Síntese incomum de melanina em

melanócitos é responsável por distúrbios pigmentares da pele, como hiperpigmentação,

melasma e lentigos senis e condições da pele como sardas após a exposição aos raios UV (23). UMA

grande número de dispositivos médicos, lasers e agentes químicos e biológicos têm sido

desenvolvido. Apenas alguns desses esforços demonstraram eficácia terapêutica e

utilidade, principalmente devido a efeitos colaterais indesejados e citotoxicidade. Portanto, é necessário

entender melhor o mecanismo fundamental por trás da pigmentação e desenvolver

dispositivos e agentes de tratamento mais eficazes.

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Examinamos se o LED de 660 nm representa uma despigmentação eficaz

tratamento. Confirmamos nenhuma citotoxicidade em uma faixa de intensidade de 2,5 a 10 J/cm2 (Figura

1a). Além disso, os teores de melanina foram significativamente diminuídos de forma dose-dependente com

LED de 660 nm de 5 a 10 J/cm2 (Figura 1b). Esses resultados sugerem que o LED de 660 nm inibe

síntese de melanina. Para uma melhor compreensão do efeito inibitório do LED 660-nm em

tirosinase, confirmamos que a expressão da proteína tirosinase, TPR-1, TPR-2 e MITF foi

diminuída por LED de 660 nm de maneira dependente do dia (Figura 2a) e induzida por LED de 660 nm

a despigmentação foi associada à diminuição da atividade da tirosinase (Figura 1c). Além disso, o

efeito do LED de 660 nm na expressão da tirosinase foi confirmado por imunofluorescência

(Figura 2b). Esses resultados indicam que o LED de 660 nm inibe os níveis de expressão de

tirosinase, TRP-1, TRP-2 e MITF, que desempenham papéis reguladores na melanogênese em

expressão translacional e transcricional.

Para investigar o mecanismo subjacente ao efeito de despigmentação do LED de 660 nm,

alterações nas vias de transdução relacionadas à melanogênese induzidas pelo LED de 660 nm foram

confirmado por análise de Western blot em um experimento de curso de tempo (Figura 3a). Tem sido

relataram que a ERK é um regulador significativo da melanogênese porque a ERK fosforilada

induz a fosforilação e degradação de MITF e, assim, reduz a síntese de melanina (24).

Estudos anteriores demonstraram que a ERK fosforilada está relacionada com a indução de cAMP

melanogênese (25). No entanto, estudos anteriores também confirmaram que mutantes constitutivos

de Ras e MEK suprimem a transcrição da tirosinase (26). Fosforilado-ERK é conhecido por

fosforilar o MITF na serina 409. Além disso, o MITF fosforilado foi relatado como

um marcador de proteólise através da via do proteassoma dependente de ubiquitina (27). Nós

avaliou um inibidor ERK específico, PD98059, e confirmou que 660 nm induzida por LED

a despigmentação foi restaurada pelo tratamento com PD98059 (Figura 3b). Também mostramos que 660-

nm LED fosforilou ERK e inibiu a expressão da proteína tirosinase. Para nosso

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conhecimento, esta é a primeira demonstração da fosforilação de ERK por LED de 660 nm. Para

examinar a relação entre a fosforilação de ERK e a regulação negativa da tirosinase, nós

células pré-tratadas com PD98059 antes da irradiação de LED de 660 nm, fosforilação reavaliada

nível de expressão da proteína ERK e confirmou que a fosforilação de ERK inibiu

melanogênese (Figura 3c).

Os efeitos inibitórios do LED de 660 nm na melanogênese também foram avaliados usando um

Modelo de camundongos HRM-2, que é o modelo animal típico neste tipo de estudo (28). Nisso

modelo, o LED de 660 nm mostrou um efeito inibitório significativo na melanogênese induzida por UVB

(Figuras 4b e 4c). Esses resultados sugerem que o efeito despigmentação do LED de 660 nm em

A melanogênese induzida por UVB atua através da prevenção da síntese de melanina em

melanócitos. Também avaliamos a pele dorsal de camundongos HRM-2 usando H&E e Fontana

Manchas de Masson para caracterizar a condição da pele e o conteúdo de melanina. Como mostrado

Figura 5, confirmamos que o LED de 660 nm diminuiu significativamente a espessura da epiderme e

redução do conteúdo de melanina de forma dose-dependente. Para entender melhor o

mecanismo de despigmentação, investigamos os níveis de expressão de S100, Melan-A,

tirosinase e MITF usando um ensaio imuno-histoquímico. A tirosinase e o MITF regulam

efeitos biológicos significativos na pele, incluindo pigmentação, formação de dendritos e

proliferação de melanócitos. Além disso, S100 e Melan-A demonstram status de pigmentação

na epiderme ou camada basal da epiderme (29). O LED de 660 nm diminuiu os níveis de proteína

de S100, Melan-A, tirosinase e MITF. Esses resultados demonstram o efeito inibitório de

LED de 660 nm na hiperpigmentação induzida por UVB.

Em conclusão, o LED de 660 nm pode revelar-se uma terapia útil para o tratamento

pacientes com hiperpigmentação. No entanto, estudos adicionais, incluindo estudos clínicos e

avaliações de eficiência e segurança, são necessárias para confirmar esses efeitos devido aos nossos resultados

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realizaram células de melanoma B16F10 não humanas. Então devemos realizar um estudo sobre o mecanismo

em humano.

RECONHECIMENTOS

Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Infraestrutura para Novas Indústrias em Crescimento

(10044186, Desenvolvimento de Tecnologia de Dispositivos de Beleza Inteligentes e Estabelecimento de

Centro de Apoio à Comercialização) financiado pelo Ministério do Comércio, Indústria e Energia (MI,

Coréia)

Referências

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ultravioleta e os benefícios da proteção solar diária. Terapia dermatológica. 2004: 17 Supl
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Legendas de figuras

Figura 1. Efeito do LED de 660 nm na melanogênese das células B16F10. (a) A viabilidade celular foi

então medido usando ensaios CCK-8. Cada resultado representa a média ± SD de triplicado

experimentos. (b) e (c). As células foram irradiadas com LED de 660 nm a 2,5 – 10 J/cm2 no

presença de hormônio estimulante de ÿ-melanócitos (ÿ-MSH : 1 ÿM) por 72 h. 50 ÿM

feniltioureia (PTU) foi usada como controle positivo. Teor de melanina (b) e tirosinase

atividade (c) foram medidos conforme descrito nos Materiais e Métodos. Cada resultado representa

a média ± SD de experiências em triplicado. **P <0,01, ***P <0,005 em comparação com ÿ-MSH

controlos tratados (b e c).

Figura 2. Efeito do LED de 660 nm na expressão de proteínas relacionadas à melanina

síntese. (a) Os lisados de células inteiras foram analisados por análise de Western blot com anticorpos

contra tirosinase, proteína 1 relacionada à tirosinase (TRP-1), proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP-2),

e fator de transcrição associado à microftalmia (MITF). Carregamentos iguais de proteína foram

verificado usando anticorpos ÿ-actina. (b) A tirosinase foi avaliada por imunofluorescência

coloração usando anticorpos específicos de tirosinase (verde). 4,6-diamino-2- correspondente

fenilidol (DAPI) coloração nuclear (azul) e imagens mescladas são mostradas. A fluorescência foi

detectada ao microscópio de fluorescência. Os espécimes foram fotografados usando DP

Software do controlador (ampliação x400).

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Figura 3. Efeito do LED de 660 nm na fosforilação de ERK em células B16F10. (um ocidental

análise de mancha usando anticorpos contra ERK específico de fosfo (p-ERK), JNK específico de fosfo

(p-JNK) e p38 específico de fosfo (p-p38). O carregamento igual de proteína foi verificado usando ÿ-actina,

anticorpos ERK, JNK e p38 independentes de fosforilação. (b) As células foram pré-tratadas

com 20 µM de PD98059 por 30 min e depois irradiado com LED de 660 nm a 10 J/cm2 e

cultivadas por 72 h. 50 ÿM de feniltioureia (PTU) foi usado como controle positivo. Melanina

o conteúdo foi medido conforme descrito nos Materiais e Métodos. Cada resultado representa o

média ± SD de experiências em triplicado. ***P < 0,005 comparado com o LED de 660 nm

grupo irradiado. (c) Os lisados de células inteiras foram preparados e submetidos à análise de Western blot

usando anticorpos contra tirosinase e ERK fosfo-específica. Carregamentos iguais de proteína foram

verificado usando anticorpos ÿ-actina.

Figura 4. Efeito do LED de 660 nm na hiperpigmentação induzida por UVB em HRM-2. (uma)

Projeto de cronograma experimental. Camundongos HRM-2 foram irradiados com luz LED de 660 nm (10

J/cm2 e 20 J/cm2 ) e expostos a UVB (150 mJ/cm2 ) nos tempos indicados (seta). (b)

Fotografias representativas mostrando os efeitos de iluminação da luz LED de 660 nm em UVB

melanogênese induzida. Todas as fotografias são dos mesmos grupos. (c) Para estatísticas

análise, a mudança no valor L de cada animal foi calculada como valores médios da pele dorsal

de camundongos HRM-2. O ÿL-Value antes e 17 dias após a irradiação com LED de 660 nm e

A UVB foi medida usando um cromômetro CR-10. Grupos de seis animais foram utilizados neste

experimentar. Cada resultado representa a média ± SD de ÿL-Value. ***P < 0,005 comparado

com o grupo irradiado com UVB.

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Figura 5. Efeito do LED de 660 nm na histopatologia induzida por UVB em HRM-2. (em causa

morfologia do tecido cutâneo induzido por UVB corado com hematoxilina-eosina (H&E). (b)

A espessura epidérmica da pele dorsal foi medida sob um microscópio óptico. Cada resultado

representa a média ± DP da espessura da epiderme (n = 6). ***P < 0,005 comparado com o

Grupo irradiado com UVB. (c) A melanina é corada de preto com a coloração de Fontana e Masson (FM).

Corados imunohistoquimicamente com anticorpos S100, Melan-A, tirosinase e MITF são

mostrando. Os cortes foram corados com diaminobenzidina (DAB) e contracoloração de hematoxilina

para visualização dos núcleos. Pontos marrons significam células coradas positivamente. As imagens são

exemplos representativos de cada grupo (ampliação x400).

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