INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL; ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS QUIMICO BACTERIOLOGO PARASITOOGO.

Aguilar Zamora Emmanuel 5QM1 SEPARACION E IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS DE JUSGOA DE FRUTA POR CROMATOGRAFIA BIDIMENSIONAL EN CAPA FINA
La cromatografa fue inventada por el botnico ruso Mikhail Tswett a principios del siglo XX, empleando esta tcnica para separar algunos pigmentos de las plantas, el nombre de este mtodo viene del griego choma (color) y graphein (escritura); el cual es un mtodo de separacin, identificacin y determinacin de los componentes qumicos de mezclas complejas ocupando dos fases inmiscibles entre ellas. En la cromatografa en capa fina, se utiliza una placa (generalmente de aluminio) que se recubre con fase estacionaria que puede ser almina o silica gel, en la cual se presentara un fenmeno de adsorcin selectiva. La fase mvil ascender por capilaridad por la placa arrastrando a su paso los componentes de la mezcla (o tambin llamados solutos) logrando separarlos; las fases involucradas en este tipo de cromatografa son: solido-liquido, las separaciones estn basadas en las diferencias en la velocidad de migracin entre los componentes de la fase mvil, polaridad (generalmente la fase estacionaria ser ms polar que la fase mvil, de forma que los componentes menos polares se desplazaran con una mayor velocidad) , tamao de la partcula, temperatura, pureza de los disolventes, entre otros. La cromatografa bidimensional, se basa en desarrollar un cromatograma con dos fases mviles distintas en diferentes direcciones. El Rf, se entiende como:

El valor de este depender de las condiciones en las cuales se corre la muestra como la fase mvil o estacionaria usada, las condiciones de la placa, entre otros. Los aminocidos son derivados aminados de cidos carboxlicos, en los 20 aminocidos comunes, los grupos amino y carboxilo estn unidos al mismo tomo de carbono (Carbono adems que en este se unen sustituyentes diferentes. ), Los aminocidos los podemos clasificar de diferentes maneras; una de las ms comunes es separarlos en base al sustituyente que tenga en la cadena lateral. FUNDAMENTO En la cromatografa , en general se fundamentan en las velocidades de migracin de las distintas sustancias que se quieren separar , que estn gobernadas por su solubilidades relativas en la fase estacionaria polar y la fase mvil no polar . En un solo paso de separacin cada soluto se distribuye entre ambas fases de acuerdo con su coeficiente de particin ( es una constante de equilibrio definido) .Para n sistema de solventes y un tipo de papel determinado , cada sustancia tiene un valor de Rf caracterstico. Una mezcla compleja que no se separa por completo en un solo cromatograma en papel usa la cromatografa bidimensional en papel. Basada en el principio anterior , con la diferencia en la tcnica , la muestra se aplica en una esquina y el cromatograma se corre en forma paralela a uno de los bordes del papel, al terminar el primer cromatograma la hoja se rota 90 y se realiza una cromatografa paralela al segundo borde utilizando otro sistema de solventes. Dado que cada compuesto migra a una velocidad caracterstica en un sistema de solventes determinado, la segunda cromatografa debera incrementar en grado sustancial la separacin de la mezcla de componentes

OBJETIVOS: Separar los aminocidos presentes en el jugo de frutos para la cromatografa bidimensional. Identificara los aminocidos separados por comparacin de sus valores de Rf con la solucin de aminocidos. Comparar el grado de resolucin de la cromatografa bidimensional , con el de la unidimensional.

RESULTADOS:

Fig 1. Cromatograma I unidimensional. Fase mvil: cloroformo-metanol-amoniaco. Se observa de izquierda a derecha los aminocidos tipo (Tyr, Trp, Pro,Phe, Met, Lys, His, Glu, Gly, Arg, y Problema)

Fig 2. Cromatograma II unidimensional. Fase mvil: metanol-etanol-agua-urea. Se observa de izquierda a derecha los aminocidos tipo (Tyr, Trp, Pro,Phe, Met, Lys, His, Glu, Gly, Arg, y Problema)

Fig 3. Cromatograma III bidimensional de aminocidos tipo. Fase mvil I: cloroformo-metanol-amoniaco. Fase mvil II: metano-etanol-agua-urea. Se observa que fase mvil I corre en direccin vertical y la fase mvil II corre en direccin

Fig 4. Cromatograma IV bidimensional del problema. Fase mvil I: cloroformo-metanol-amoniaco. Fase mvil II: metano-etanol-agua-urea. Se observa que fase mvil I corre en direccin vertical y la fase mvil II corre en direccin horizontal.

Resultados obtenidos a partir del cromatograma I y II unidimensionales, reportando los Rf de cada uno de estos aminocidos

1ra fase mvil Aminocido Frente del Frente del soluto solvente arginina 1.2 7.8 lisina 1.8 7.8 acido glutmico 3.3 7.8 prolina 4 7.8 glicina 4.1 7.8 histidina 4.3 7.8 triptfano 4.5 7.8 tirosina 5 7.8 metionina 7 7.8 fenilalanina 7.2 7.8

Rf 0.1538 0.2307 0.423 0.5128 0.5264 0.5512 0.5769 0.641 0.8974 0.923

2da fase mvil Frente del Frente del soluto solvente 0 7.6 0 7.6 4.6 2.6 1.8 0 2 4.5 4.5 4.8 7.6 7.6 7.6 7.6 7.6 7.6 7.6 7.6

Rf 0 0 0.6052 0.3421 0.2368 0 0.2631 0.5921 0.5921 0.6315

Resultados obtenidos a partir del cromatograma III bidimensional, reportando los Rf de cada uno de los aminocidos en las dos fases mviles utilizadas
no de mancha 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1ra Fase mvil Frente del soluto 1.4 2 3.1 3.6 3.8 4.3 4.4 4.6 5.7 6.4 Frente del disolvente 8.2 8.2 8.2 8.2 8.2 8.2 8.2 8.2 8.2 8.2 2da Fase mvil Rf (orden Frente del creciente) soluto 0.17073171 0 0.24390244 0.37804878 0.43902439 0.46341463 0.52439024 0.53658537 0.56097561 0.69512195 0.7804878 0 5 1.5 2.2 2.4 0.6 5.2 4.3 4.8 Frente del disolvente 8.1 8.1 8.1 8.1 8.1 8.1 8.1 8.1 8.1 8.1 Rf 0 0 0.6172 8 0.1851 8 0.2716 0 0.2962 9 0.0740 7 0.6419 7 0.5308 6 0.5925 9259 aminocido correspondiente arginina lisina acido glutmico prolina glicina triptfano histidina tirosina metionina fenilalanina

Resultados obtenidos a partir del cromatograma IV bidimensional, reportando los Rf de cada una de las manchas de la muestra problema.

no de mancha 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Frente del soluto 1.5 2.5 3.4 3.8 4.4 4.9 5.8 6.5 6.9

1ra fase mvil Frente del Rf (orden disolvente creciente) 8.2 8.2 8.2 8.2 8.2 8.2 8.2 8.2 8.2 0.18292683 0.30487805 0.41463415 0.46341463 0.53658537 0.59756098 0.70731707 0.79268293 0.84146341

Frente del soluto 0 0.7 1.3 1.7 2 2.8 4 4.4 4.5

2da fase mvil Frente del disolvente 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9

Rf

0 0.08860759 0.16455696 0.21518987 0.25316456 0.35443038 0.50632911 0.55696203 0.56962025

Resultados recopilados a partir de los datos anteriores (tabla 1.3) para la identificacin de aminocidos en nuestro problema analizado.

no de mancha 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Discuciones:

Rf creciente en la Rf en la 2da fase 1ra fase mvil mvil 0.1829 0 0.3048 0.0886 0.4146 0.2151 0.4634 0.1645 0.5365 0.2531 0.5975 0.3544 0.7075 0.5063 0.7926 0.5569 0.8414 0.5696

aminocido correspondiente arginina lisina prolina glicina triptfano metionina fenilalanina -

En base a los resultados obtenidos, se puede observar que en el cromatograma I unidimensional, se obtuvieron un total de 10 manchas que correspondan cada uno de los aminocidos estudiados; sin embargo, se observaron tambin manchas pequeas., posiblemente impurezas de los reactivos En el caso del cromatograma II, se obtuvieron de igual manera un total de 10 manchas que correspondan a los aminocidos tipo, esto debido a alguna cualidad que presentan en su estructura qumica, las diferencias que presenta con la cromatografa unidireccional, es que en este caso, la lisina, histidina y arginina se quedaron en el sitio de aplicacin, posiblemente debido a que no eran solubles en la mezcla de solventes. En el caso del cromatograma III bidimensional, se observan un total de 9 manchas; al clasificarlas dependiendo de su Rf obtenido y comparando este con los dos cromatogramas unidimensionales anteriores, se pueden identificar los aminocidos que estn presentes. Una de las cuestiones que tuvimos que observar fue que la prolina y glicina presentan un color diferente cuando se les revela con ninhidrina, (color amarillo, debido a que no produce amonio al reaccionar con esta) o la glicina (color naranja), esta propiedad nos permiti identificarlos fcilmente, sin la necesidad de comparar su Rf. Para el cromatograma IV bidimensional en donde se aplico el problema, se observaron un total de 9 manchas, de estas se pudieron identificar 7 aminocidos, esto en base a la comparacin de los Rf de los aminocidos tipo. Obtenindose los aminocidos: arginina, lisina, glicina, prolina, triptfano, acido glutmico, tirosina, fenilalanina, metionina y tres aminocidos que no fueron identificados, pues no se contaba con muestras tipo de todos los aminocidos.

Conclusiones:

Los aminocidos obtenidos e identificados a partir de la cromatografa en capa fina bidimensional de nuestra muestra problema (meln), fueron: arginina, lisina, glicina, prolina, triptfano, acido glutmico, tirosina, fenilalanina y metionina

La ventaja de la cromatografa bidimensional en capa fina es que nos da una mejor resolucin y separacin de los compuestos; hablando econmicamente, nos reduce costos al usar la misma placa para hacer dos cromatogramas.

Las ventajas de la cromatografa unidimensional en capa fina es que es fcil y se ocupa un menor tiempo para la determinacin; pero la desventaja es que la resolucin de esta es menor, adems que en las manchas puede haber una mezcla de componentes que no se lograron separar.

1.-Investiga en la literatura los aminocidos que contiene el jugo empleado como problema y compare con sus resultados: Acido asprtico, acido glutmico, alanina, arginina, cistena, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, lisina, prolina, serina, tirosina, treonina, triptfano, valina 2.-Escriba la reaccin completa y con nombres, de la ninhidrina con un aminocido

3.- Es posible cambiar el orden de las fases mviles? Explique por que.

No. Para la cromatografa bidimensional el primer solvente contiene amoniaco para aumentar la motilidad de los aminoacidos de cadena lateral bsica; y el segundo incrementa la motilidad de los aminoacidos de cadena lateral acida

4- Por qu la prolina e hidroxiprolina dan una coloracin amarilla al reaccionar con ninhidrina? La razn por la cual la prolina e hidroxiprolina no da una coloracin morada o magenta similar al reaccionar con la ninhidrina y da tono amarillo al reaccionar con esta, es debido a que no produce amonio al reaccionar con ella, mientras que los otros aminocidos si presentan esta reaccin.