Os medicamentos fitoterápicos tradicionais aumentaram o interesse no desenvolvimento de

medicamentos a partir de fontes naturais

um agente quimioterapêutico natural que é um componente do rizoma da cúrcuma Curcuma

longa atraiu recentemente a atenção considerável dos pesquisadores

espectro notavelmente amplo de efeitos corretivos na saúde humana, como antitumoral [3],
antioxidante e antibacteriano atividades

é relatado que possui notáveis propriedades antiinflamatórias, antidiabéticas,

quimiopreventivas e antiangiogênicas, tornando-o um potencial candidato para o tratamento
da maioria das doenças conhecidas

principal desvantagem da curcumina é sua insolubilidade em água e a baixa biodisponibilidade

resulta em baixa bioatividade, baixo direcionamento e rápida eliminação do corpo

droga com baixa solubilidade em água requer uma dose alta para alcançar a eficácia
terapêutica que pode ser superada com o uso da nanociência

a quimioprevenção e o potencial terapêutico da curcumina ainda não são bem explorados. N

O campo de nanocompósitos poliméricos sustentáveis e biocompatíveis ganhou atenção dos

pesquisadores, pois pode encapsular uma pequena porção de moléculas de drogas em sua
rede reticulada e atuar como um transportador para entregar drogas diretamente ao local alvo
[9,10] . A encapsulação de um fármaco hidrofóbico nesses nanocarreadores aumenta a
biodisponibilidade e a eficácia terapêutica do fármaco, bem como evita a eliminação rápida do
fármaco do corpo [11].

A curcumina foi encapsulada em numerosos transportadores de base inorgânica, como NPs de

sílica [12] ou transportadores de base orgânica, como a ciclodextrina [13], micelas [14,15] e
NPs de lipossomas [16], para melhorar a dispersibilidade e a bioatividade da curcumina

. A plataforma de entrega de drogas mediada por nanopartículas de ZnO tem vários benefícios
em relação aos sistemas de entrega de drogas padrão. As nanopartículas de ZnO são estáveis,
podem ser sintetizadas facilmente, têm baixa toxicidade e têm uma taxa de dissolução mais
alta em pH baixo, tornando-as ideais para uso em aplicações médicas

estudo, sintetizamos nanopartículas de ZnO (ZnO NP) como nanocarreadores para sistemas de
entrega de drogasmmmmmmmmmmmm

curcumina foi usada como droga modelo para este estudo e carregada na nanopartícula de
ZnO revestida com quitosana para formar o nanocompósito ZnO-Curcumina revestido com
quitosana (ZnCurNC) pelo método de co-precipitação. Assumimos que este ZnCurNC contendo
ZnO NP poderia facilmente se dissolver em pH ácido que se assemelha ao pH do
microambiente do tumor (pH = <6,4), e liberar lentamente a curcumina no local do tumor.

Quando há uma grande quantidade de curcumina no local do tumor, as células cancerígenas

podem ser facilmente alvejadas e mortas com a ação da curcumina

provar nossa suposição, diferentes ensaios celulares foram realizados, onde ZnCurNC mostrou
natureza mais biocompatível com células normais de mamíferos, juntamente com sua maior
capacidade de direcionamento para células cancerígenas de melanoma. Para verificar sua
possível toxicidade para células normais, estudos de genotoxicidade foram realizados em
modelos in vitro e in vivo .

Métodos (procedimentos experimentais)

 Síntese de nanopartículas de ZnO: Essas nanopartículas secas foram posteriormente

utilizadas para caracterização e atividades biológicas
 Síntese de nanocompósito ZnO-curcumina funcionalizado revestido com quitosana:
Este ZnCurNC seco foi usado para posterior caracterização e ensaios biológicos.
 Caracterização estrutural e morfológica de nanopartículas nuas e nanopartículas
funcionalizadas:
 Conteúdo de carregamento de drogas e eficiência de encapsulamento:
 Estudo de liberação de curcumina
 O estudo da liberação de curcumina de ZnCurNC sintetizado foi realizado em tampão
fosfato salino pelo método de diálise

Estudos anticancerígenos e de toxicidade in vitro e in vivo

Linhagens celulares: As células CHO–K1 (Ovário de Hamster Chinês-K1) e B16F10 (Células

cancerígenas de melanoma de camundongo) foram utilizadas para estudos in vitro .

Animais: Camundongos machos pretos C57BL/6 foram usados para regressão tumoral in vivo e
estudo de sobrevivência e os camundongos albinos suíços machos foram usados para estudos
de genotoxicidade

Estudos in vitro

ensaio de brometo de 3

As células CHO–K1 e B16F10 foram semeadas em placas de 96 poços 2.000 células/poço em

triplicata e incubadas a 37 ÿC em uma incubadora de 5% de CO2 por 24 h. Após a incubação, as
células foram tratadas com ZnO NP e ZnCurNC (1–100 ÿg/mL) por 24 horas. A curcumina pura
em DMSO foi usada para estimar a potência do nanocompósito, a concentração de curcumina
foi de 1 a 10 ÿg/mL. Após 24 h de incubação, as células foram tratadas com 100 ÿL de meio
fresco contendo reagente MTT (0,5 mg/mL) e posteriormente incubadas por 4 h. O meio
contendo o reagente MTT foi descartado e 100 ÿL de DMSO foram adicionados a cada poço e a
absorbância foi medida a 570 nm em um leitor de placas. A absorbância das células sem
nenhum tratamento foi considerada como controle. Para apenas a curcumina, as células
tratadas com DMSO foram usadas como controle de veículo. O valor de IC50 (50% de
concentração inibitória) foi obtido por meio da fórmula de regressão linear.

Estudo de captação celular por microscopia confocal : Para confirmar a absorção intracelular
de ZnO NP e ZnCurNC sintetizados, realizamos um estudo de absorção celular usando corante
Rodamina B e microscopia confocal

Estudos do ciclo celular por análise de citometria de fluxo Realizamos uma análise do ciclo
celular para determinar se o ZnCurNC sintetizado alterou a distribuição do ciclo celular em
diferentes fases.
Ensaio de apoptose Para entender o mecanismo da atividade anticancerígena de ZnCurNC em
células B16F10, realizamos o ensaio de coloração Anexina V –FITC/PI.

Determinação de ROS intracelular por análise FACS

A formação do radical ânion superóxido em linhas celulares CHO-K1 e B16F10 após tratamento
com curcumina pura, ZnO NP e ZnCurNC foi determinada usando corante fluorescente DCFDA

Estudos in vivo

Estudo de regressão tumora

base em vários ensaios in vitro , confirmamos que ZnCurNC é um potente agente

anticancerígeno contra B16F10 (células de câncer de melanoma). Estes resultados
anticancerígenos in vitro de ZnCurNC foram ainda extrapolados in vivo modelo de camundongo
com tumor de melanoma.

imuno-histoquímica ensaio TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end

labeling) é amplamente utilizado para detectar apoptose na seção de tecido tumoral.

Ensaio de coloração do Ki-67 O Ki-67 é um marcador de proliferação utilizado na imuno-

histoquímica de cortes teciduais e está fortemente associado à proliferação celular e ao
crescimento dos tumores.

estudos de genotoxicidade

Para entender os possíveis efeitos genotóxicos (clastogênicos e aneugênicos) da curcumina

pura, ZnO NP e ZnCurNC, foram realizados ensaios citogenéticos de toxicidade como
aberrações cromossômicas (alterações estruturais e numéricas), micronúcleo e alteração na
taxa de mitose celular

Para estudos de genotoxicidade in vitro , células CHO-K1 foram usadas [26] e para confirmação
adicional de sua toxicidade no modelo in vivo , estudos de genotoxicidade foram realizados
usando camundongos albinos suíços de acordo com nosso trabalho publicado anteriormente
[25]. As propriedades de toxicidade gênica dos camundongos portadores de tumor que foram
tratados com ZnCurNC e ZnO NP com sete doses também foram avaliadas. As metodologias
detalhadas para genotoxicidade in vitro e in vivo são fornecidas no arquivo suplementar na
seção de materiais e métodos

Análise estatística min. O ensaio de túnel foi realizado de acordo com o protocolo fornecido
pelo fabricante. As seções foram montadas com 4-6-diamidino-2-fenilidona (DAPI) e as
imagens foram capturadas usando microscópio confocal Nikon com ampliação de 10X [29]. em
ZnCurNC. Outro deslocamento da banda em 3383 cmÿ 4.2.2. Ensaio de coloração do Ki-67 O Ki-
67 é um marcador de proliferação utilizado na imuno-histoquímica de cortes teciduais e está
fortemente associado à proliferação celular e ao crescimento dos tumores. As mesmas seções
de tecido tumoral do ensaio TUNEL foram preparadas por um criostato. As lâminas seccionadas
de tecido foram lavadas duas vezes com 1X PBS por 5 min. O tampão de ácido cítrico 10 mM foi
preparado e a seção de tecido foi mantida nele por 30 min. As lâminas foram então lavadas 2 a
3 vezes com água. O bloqueio da secção tecidual à temperatura ambiente por 1 h foi realizado
com o uso de tampão de bloqueio BSA a 5%. O tampão TBST foi preparado e a seção de tecido
foi lavada com TBST por 5 min, depois disso as seções de tecido foram incubadas com
anticorpo anti-coelho Ki-67 de camundongo durante a noite e após a incubação, as lâminas
foram lavadas com tampão de lavagem e depois incubadas com anticorpo secundário Alexa555
para 30 min em RT. As seções de tecido Ki-67 coradas foram lavadas com tampão TBST e
montadas com DAPI, observadas sob microscópio confocal Nikon com ampliação de 10X [29].
Cada dado experimental independente de vários estudos foi analisado estatisticamente com o
teste t de Student não pareado, seguido por 'One-way ANOVA' (pós-teste de Dunnett realizado
usando Graph Pad Prism versão 6.04), Graph Pad Software, San Diego, CA.

Resultados e discussão

Síntese e caracterização de ZnCurNC: confirmou que a curcumina foi carregada com sucesso

Ensaio de viabilidade celular (ensaio MTT)

Testamos a capacidade de citotoxicidade da curcumina pura, ZnO NP e ZnCurNC na linha

celular de câncer, B16F10 (câncer melanoma) e CHO-K1 (linhagem celular normal), usando
ensaios MTT, e os dados são apresentados em (Fig. 2 A & B ). Verificou-se que a curcumina
tinha efeitos citotóxicos iguais em células normais e cancerígenas, mas descobriu-se que ZnO
NP e ZnCurNC eram mais biocompatível com células normais e forte efeito inibitório sobre o
crescimento de células B16F10 com valor de IC50 de 23,69 e 8,79 ÿg/mL, respectivamente A
concentração de curcumina em ZnCurNC foi quantificada em 1,6 ÿg/10 ÿL. A partir dos
resultados de citotoxicidade, pode-se supor que após o carregamento da curcumina no ZnO NP,
houve um aumento na propriedade tóxica do ZnCurNC em relação às células cancerígenas. O
aumento da citotoxicidade pode ser devido ao transportador de ZnO, que supera a
hidrofobicidade da curcumina e acumula maiores concentrações de curcumina dentro das
células [28] isso pode ser atribuído à endocitose efetiva de ZnCurNC por células B16F10.
Portanto, para verificar a porcentagem de absorção do conteúdo de metal por células normais
e cancerígenas, foi realizada a análise ICP-OES (Fig. 2C) que sugeriu que, após 4 h de
tratamento com ZnCurNC e ZnO NP, a absorção do conteúdo de metal foi encontrada ser mais
em células cancerígenas B16F10 em comparação com as células CHO-K1. Além disso, a
internalização celular de ZnCurNC e liberação intracelular de curcumina foi confirmado por
microscopia confocal de varredura a laser (Fig. 2E), que provou que após 6 h de incubação com
ZnCurNC, a curcumina máxima é internalizada nas células B16F10 em comparação com as
células CHO-K1, pois a intensidade fluorescente média é mais forte nas células B16F10 do que
nas células CHO- Células K1 incubadas com ZnCurNC. ZnCurNC carregado com rodamina
mostrou vermelho fluorescência, fluorescência de cor azul para núcleo enquanto ZnCurNC sem
qualquer corante mostrou fluorescência verde FITC em microscopia confocal como a própria
curcumina verde fluorescente.

Agora está confirmado que a curcumina é capaz de matar as células, dependendo da

quantidade de curcumina disponível para as células que foram transportadas dentro das
células através do ZnO NP como transportador. Portanto, estimamos ainda mais a eficiência de
encapsulamento da curcumina em ZnO NP que foram internalizados pelas células normais e
cancerígenas.

Carga de drogas, eficiência de aprisionamento e estudos de liberação de drogas

A quantidade de curcumina encapsulada em ZnCurNC foi confirmada por um
espectrofotômetro UV-visível. Quantificamos que a eficiência de encapsulamento do fármaco
foi de 79% e o teor de carga do fármaco foi de 15,8% em ZnCurNC. A partir do estudo de
citotoxicidade, notamos que as células cancerígenas eram mais suscetíveis a ZnCurNC do que
as células CHO-K1, o que indica que uma maior quantidade de nanomateriais pode ter sido
transportada dentro das células cancerígenas. Como o microambiente do câncer é comumente
de natureza ácida [31] , portanto, assumimos que a liberação de curcumina do ZnCurNC
poderia ser maior nas células cancerígenas. Portanto, para confirmar essa suposição,
realizamos a eficiência de liberação da droga da curcumina do ZnCurNC em três diferentes
condições de pH 5,0, 6,0 (pH dos endossomos e microambiente do tumor) e 7,4 (pH
fisiológico). Os perfis de liberação da curcumina revelaram uma liberação dependente do pH
pelo método de diálise. Após 10 h de incubação, encontramos 56% e 48% de curcumina
liberada em pH 5,0 e pH 6,0, respectivamente, enquanto a curcumina liberada em pH 7,4 foi
muito baixa (29%). Assim, a partir deste estudo, é confirmado que o ZnCurNC diminui a
liberação do fármaco em pH 7,4, que é o pH da circulação sanguínea, mas aumenta a
curcumina liberada do complexo ZnCurNC no pH ácido do microambiente do câncer [22], que
pode exercer efeitos tóxicos mais elevados para células cancerígenas em comparação com
células normais, pois é crucial para a inibição do tumor in vivo (Fig. 2D). Assim, para descobrir o
modo de ação do ZnCurNC em células normais e cancerígenas, vários bioensaios foram
realizados.

luorescência, fluorescência de cor azul para núcleo enquanto ZnCurNC sem qualquer corante
mostrou fluorescência verde FITC em microscopia confocal

Assim, a partir de estudos gerais de genotoxicidade de camundongos portadores de tumor in

vitro, in vivo e in vivo, é confirmado que o ZnCurNC aumentou a eficácia terapêutica da
curcumina, solubilidade aquosa e biodisponibilidade sem qualquer toxicidade significativa para
células normais.

Conclusão

Neste trabalho, sintetizamos nanopartículas de ZnO e nanocompósitos de ZnO-curcumina

revestidos com quitosana que possuem boa eficiência de encapsulamento de drogas,
biocompatibilidade com células CHO-K1 e atividade anticancerígena em relação à linha celular
de câncer de melanoma B16F10. (2005) 1955–1968. Além disso, os camundongos C57BL/6 que
receberam sete doses de ZnCurNC para o tratamento do modelo de melanoma, onde o volume
do tumor foi reduzido significativamente, também utilizamos esses camundongos para a
análise de todos os endpoints de genotoxicidade. Os resultados mostraram que, as aberrações
cromossômicas (Fig. 6G, H, I e Tabela- S9), alterações no índice mitótico e micronúcleo (Fig. 6J,
K, L e Tabela S10, S11 e S12) da dose terapêutica de 40 mg /kg para o estudo de regressão
tumoral não mostrou nenhuma toxicidade significativa mesmo após sete doses e a toxicidade
foi menor do que a dose única de toxicidade ZnCurNC, bem como ZnO NP e 0,9% NaCl.
Declaração de interesse concorrente Apêndice A. Dados suplementares Este trabalho é
financiado pelo Conselho Indiano de Pesquisa Médica (controle negativo) foram usados para
comparação. Os resultados mostraram que houve aumento dependente da dose nas
aberrações cromossômicas (Fig. 6 A, B, C e Tabela S5). As duas doses mais altas de
camundongos tratados com 40 e 80 mg/kg mostraram um aumento dependente da dose na
toxicidade quando comparados ao controle negativo. A porcentagem de aberração excluindo
lacunas mostrou toxicidade altamente significativa (Pÿ0,001) quando comparada a
camundongos tratados com ZnO NP de 80 mg/kg (Pÿ0,001). A porcentagem de metáfase
aberrante e aberração percentual incluindo lacunas em todas as três doses não foram
significativamente tóxicas quando comparadas com a concentração mais alta de ZnO NP (80
mg/kg), enquanto a porcentagem de aberração excluindo lacunas, exceto a dose mais baixa,
todas mostraram toxicidade altamente significativa quando comparadas ZnO NP e 0,9% NaCl.
Hari krishnareddy Rachamalla: estudo baseado em células. investigação, escrita. Os autores
agradecem ao Conselho Diretor de Pesquisa Científica e Industrial do Instituto Indiano de
Tecnologia Química (CSIR IICT), Hyderabad, por seu encorajamento e apoio. Shruti S. Desh
pande reconhece o Conselho Indiano de Pesquisa Médica. Governo da Índia por fornecer
financiamento para realizar pesquisas para seu doutorado (arquivo nº: 45/16/2018-
PHA/TOXI/BMS/OL, IRIS Cell nº 2017–3181). Os financiadores não têm nenhum papel no
desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do
Manuscrito. Agradecemos ao Dr. Rajkumar Banerjee, cientista principal sênior por fornecer a
instalação de microscopia confocal. Dr. K. Muralidharan, divisão de Biologia Aplicada do
Cientista por fornecer instalações para animais. Int. 51 (1) (2013) 370–377. Declaração do autor
Verificou-se que o ZnCurNC aumenta a eficácia terapêutica e a capacidade de
biodisponibilidade da curcumina, resultando na inibição do crescimento de tumores em
comparação com camundongos não tratados no modelo de camundongos in vivo . Este estudo
mostra que os nanocarreadores podem facilitar a entrega de curcumina em formulações
aquosas para exercer um efeito terapêutico e evitar a toxicidade associada a um solvente
orgânico. Os nanomateriais, no entanto, podem estar associados a riscos desconhecidos de
longo prazo para a saúde humana e perigos ao meio ambiente. Nesse contexto, também
realizamos a avaliação toxicológica desses potenciais ZnCurNC e ZnO NP em modelos in vitro e
in vivo para entender os perfis de segurança para uso como medicamento no tratamento do
câncer de pele
FIG1: Caracterização de ZnO NP e ZnCurNC sintetizados (A) Distribuição de tamanho de
ZnCurNC e ZnO NP, (B) Potencial Zeta de ZnCurNC e ZnO NP determinado por espalhamento
dinâmico de luz (DLS), (C) Padrão de difração de raios X de ZnCurNC e ZnO NP, (D) Imagens de
microscopia eletrônica de transmissão de ZnO NP e ZnCurNC, (E) Espectros FTIR de ZnO NP e
ZnCurNC, (F) Absorvância UV-Visível de ZnCurNC e ZnO NP.

Fig. 2. Ensaio de biocompatibilidade in vitro (A) viabilidade celular da linha celular CHO- K1
após 24 h de tratamento com ZnO NP e ZnCurNC, (B) viabilidade celular da linha celular B16F10
após 24 h de tratamento com curcumina, ZnO NP e ZnCurNC , (C) Estudo de absorção celular
por análise ICP-OES, (D) Estudos de liberação de curcumina em pH 5, 6 e 7,4 pelo método de
diálise e calculado usando espectrofotômetro UV-Visível em comparação com curcumina
padrão, (E) Internalização celular de estudo de nanopartículas por microscopia confocal com
corante Rodamina nas linhagens celulares CHO–K1 e B16F10 e sem corante nas células B16F10.
Atividades anticancerígenas in vitro (A) Análise do ciclo celular das linhagens celulares CHO-K1
após incubação com ZnO NP (8,8 ÿg/mL), curcumina (1,6 ÿg/mL) com base no teor de carga de
droga e ZnCurNC (8,8 ÿg/mL) mL de concentração de IC50 na linha celular B16F10) por 12 h, (B)
Estudos do ciclo celular das linhagens celulares B16F10, (C) Coloração com anexina V para
avaliar a apoptose na linhagem celular CHO– K1, (D) Apoptose na linha celular B16F10 após
incubação com ZnO NP, curcumina e ZnCurNC e coloração com anexina V e células PI são
submetidas a análise de citometria de fluxo Q1-Células pré-necróticas, Q2- Apoptose tardia,
Q3- Células vivas, Q4- Apoptose precoce, (E) Efeito de geração de ROS de ZnO NP, curcumina e
ZnCurNC na linha celular CHO-K1 após 12 h de tratamento, (F) estudos de ROS na linha celular
B16F10; a indução da geração de ROS foi medida por corante fluorescente DCFDA por
citometria de fluxo.
Fig. 5. Toxicidade citogenética in vitro na linha celular CHO-K1 após 24 h de tratamento (A)
porcentagem de metáfases aberrantes, (B) porcentagem de aberrações incluindo lacunas, (C)
porcentagem total de anormalidades excluindo lacunas não foi significativa na linha celular
CHO-K1 após 24 h de tratamento, (D) Estudos de índice mitótico após 24 h de tratamento com
curcumina (2 ÿg/ mL), ZnCurNC (5,10 e 25 ÿg/mL) e ZnO NP (25 ÿg/mL), (E) Estudos de
micronúcleos após 24 h de tratamento mostraram a formação de porcentagem de
micronúcleos aumentando a concentração de forma dependente. ZC = nanocompósito de
curcumina ZnO (ZnCurNC); Curcumina como controle de veículos; ZnO = nanopartícula de
óxido de zinco; Significativo ao nível * = P < 0,05; = P < 0,001 (Teste de Comparação Múltipla de
Dunnett comparado ao controle do veículo); ± = SEM (Média do Erro Padrão); ns = não
significativo.
Genotoxicidade in vivo de ZnCurNC e ZnO NP em camundongos albinos Swiss e camundongos
portadores de tumor C57BL/6, (A) Percentual total de metáfase aberrante, (B) Percentual total
de aberrações incluindo lacunas, (C) Percentual total de aberração excluindo lacunas, (D) Fig. 5.
Toxicidade citogenética in vitro na linha celular CHO-K1 após 24 h de tratamento (A)
porcentagem de metáfases aberrantes, (B) porcentagem de aberrações incluindo lacunas, (C)
porcentagem total de anormalidades excluindo lacunas não foi significativa na linha celular
CHO-K1 após 24 h de tratamento, (D) Estudos de índice mitótico após 24 h de tratamento com
curcumina (2 ÿg/ mL), ZnCurNC (5,10 e 25 ÿg/mL) e ZnO NP (25 ÿg/mL), (E) Estudos de
micronúcleos após 24 h de tratamento mostraram a formação de porcentagem de
micronúcleos aumentando a concentração de forma dependente. ZC = nanocompósito de
curcumina ZnO (ZnCurNC); Curcumina como controle de veículos; ZnO = nanopartícula de
óxido de zinco; Significativo ao nível * = P < 0,05; = P < 0,001 (Teste de Comparação Múltipla de
Dunnett comparado ao controle do veículo); ± = SEM (Média do Erro Padrão); ns = não
significativo. *** *** ** = P < 0,01; Micronúcleo do sangue periférico. Significativo ao nível * =
P < 0,05; = P < 0,01; = P < 0,00; 1 ns= não significativo ao nível (Teste de Comparação Múltipla
de Dunnett comparado com NaCl a 0,9%); ± = SEM (Média de Erro Padrão). ZnO NP (80 mg/kg)
= Controle positivo para dose única; ZnO NP (40 mg/kg) por sete doses. Alterações na divisão
celular após o tratamento foram calculadas por estudos de índice mitótico. Teste de
micronúcleo em medula óssea e sangue periférico, (E) Micronúcleo de medula óssea, (F)
Micronúcleo de sangue periférico após tratamento com dose única de ZnCurNC, ZnO NP e NaCl
0,9% em camundongos albinos Swiss. Em camundongos com tumor C57BL/6, alterações na
aberração cromossômica após tratamento com sete doses de ZnCurNC e ZnO NP em
comparação com o grupo controle (0,9%) (G) Percentual total de metáfase aberrante (H)
Percentual total de aberrações incluindo lacunas , (I) Percentual total de anormalidades
excluindo lacunas, (J) Alterações no índice mitótico, (K) Micronúcleo da medula