Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoqumicas de Alimentos

FUNDAMENTOSDELAREACCIONENCADENADEPOLIMERASA`PCR FUNDAMENTOSDELAREACCIONENCADENADEPOLIMERASA`PCR YSUAPLICACINENALIMENTOS

MnicaPatriciaOsorioTangarife 30deAbrilde2009 IbaguTolima Ibagu Tolima

Universidad del Tolima

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Es un tipo de cido nucleico una macromolcula que forma parte de nucleico, todas las clulas. Contiene la informacin gentica usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos, siendo el responsable de la herencia de las caractersticas genotpicas.

ADN

el ADN es un polinucletido constituidos por dAMP, dGMP, dCMP, dTMP. Esta formado por un nucletido y a su vez, est formado por p , p un azcar, una base nitrogenada y un grupo fosfato que acta como enganche de cada nucletido con el siguiente.

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cidosnucledos cidos nucledos

3

Fosfato

Moni Di Tri Ribosa Desoxiribosa

5`

Composicin estructural

Azucares

Basesnitrogenadas

Purinas:A G Pirimidinas:U T C

Adenina Purinas

Guanina

Timina (ADN)

Citosina

Uracilo (RNA)

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Pirimidinas

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ADN

PolinucletidosconstituidospordAMP,dGMP, dCMP,dTMP.

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Estructura primaria

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ARN

Polinucletidos constituidos Ribosa. A diferencia de ADN reemplaza la Timina por Uracilo. No forma dobles cadenas.

Constituido por nica cadena sin estructura superior. Masa molecular elevada. RNAm Contiene informacin gentica del ADN, para utilizarla en la sntesis de protenas. Determina el orden en que se unirn los aminocidos. Se sintetiza en el ncleo celular y pasa al i i l l l l l citoplasma.

Griffiths, A.; Gelbart, W.; Miller, J.; Lewontin, R. 2000. Universidad del Tolima

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Reaccin en Cadena de la Polimerasa ReaccinenCadenadelaPolimerasa Tcnica de biologa molecular descrita en 1985 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, g p g p , partiendo de un mnimo

Amplifica un fragmento de ADN; su utilidad es que, tras la amplificacin, resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta probabilidad microorganismos en alimentos alimentos.
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FundamentosdePCR F d d PCR Tcnica que permite la copia In vitro de secuencias especificas de ADN ADN. Consiste en la separacin por calor de las dos cadenas de ADN que se desea amplificar y su copia simultanea a partir de un punto determinado por un fragmento de ADN artificial llamada cebador, mediante la accin de la ADN Polimerasa. Resultado es la duplicacin del nmero de molculas de una secuencia concreta de ADN. El proceso se repite un nmero determinado de veces (30), consiguiendo un aumento o amplificacin exponencial de copias del fragmento de ADN molde. Si se parte de una molcula nica de ADN en la muestra inicial y en cada ciclo se duplica el numero de molculas, al final de los 30 ciclos, se obtendr 230 molculas idnticas (1`073.741.824 molculas).
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FundamentosdePCR
Desarrollada por Kally Mullis en 1985, utilizando ADN polimerasa del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli.

Altasensibilidad Alta sensibilidad Altaespecificidad

Amplifica nicamente el fragmento de ADN que se desea aunque est en bajas cantidades o en presencia de altas cantidades de ADN semejantes La reaccin es eficaz si se parte de una muestra poco purificada, en presencia de otros componentes

FragmentoKlenow
PM:68KDa

El mayor de los dos fragmentos que se produce en la ruptura proteoltica con subtilisina (serina endopeptidasa) de la DNA polimerasa I de E coli Retiene la E. coli. actividad de 5 3 polimerasa, posee actividad 3 5' exonucleasa, pero carece de la actividad 5 3' exonucleasa que se encuentra normalmente en la DNA polimerasa I de E. coli. 53DNApolimerasa 53DNA 5 3 DNA polimerasa 35exonucleasa 35exonucleasa

ADNPolimerasaI Holoenzima Protelisis

ADNPolimerasa 5 3

FragmentoKlenow Fragmento Klenow

Exonucleasa 3 5

Exonucleasa 5 3 Universidad del Tolima

5 3 Exonucleasa

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FundamentosdePCR Quesenecesita Mg++ Primers Pi ADNpolimerasa CadenadeADNmolde Nucletidos:dNTPs(A,G,C,T) Bufferdelareaccin:TRISHCl,TWEEN20,KCl

Termociclador: Permite realizar ciclos de temperatura necesarios para l amplificacin d la lifi i de ADN

Existen otras tecnologas menos populares utilizando distribucin de aire caliente en tubos suspendidos, logrando el mismo objetivo de transferir calor p q p eficientemente a la reaccin para que cambien los ciclos de temperaturas
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Eleccindelosprimers Eleccin de los primers

SI 5 3 1.GTATGTAACAGACGGCCAGT 1 GTATGTAACAGACGGCCAGT 2.ACCAGCTATGACCATGATGA NO 5 5 3 3 1.ACCTCGCGGGGGATCGCGAA 2.TTCGCCCCATCGCCTTCGC

ContenganCyG Contengan C y G 50% Concentracinde0.1a0.5M Tamaorecomendadode20a30pb Tamao recomendado de 20 a 30 pb EvitarCyGenelextremo3 Nolargassecuenciasdeunasolabase Evitarcomplementariedadentrecadaunoyentrevarios

Extensindelprimer

LaADNpolimerasarealizaextensindelprimer usandolacadenacomplementariacomomolde

ADNPolimerasa ADN Polimerasa 3 5

dNTPs
5
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+Mg ++
3

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ADNpolimerasas Termolbiles
Temp.ptimadeactuacina42C ADN polimerasa I de E coli ADNpolimerasaIdeE.coli FragmentoKlenowdeADNpolimerasa T4ADNpolimerasa Actividadexonuclesica 35

Termoestables
Temp.ptimadeactuacina7274C Taq ADN polimerasa ADNpolimerasa Tth polimerasa Noposeenactividadexonuclesica

Taq polimerasa Aumentalafidelidad: p Noposeeactividadexonuclesicas. NoseaadencantidadesexcesivasdeMg++. SeaadeigualcantidadparadNTPsenlamnimaconcentracinposible.

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dNTPs dNTP
dATP,dGTP,dCTP,dTTP. Se recomienda una concentracin de 20 a 200 M de cada uno Serecomiendaunaconcentracinde20a200Mdecadauno La concentracin debe ser similar entre cada uno de ellos y se debe relacionar con la Mg++.

Bufferdelareaccin
Composicindistinta,dependiendodelascasascomerciales: Composicin distinta, dependiendo de las casas comerciales: KCl .TRISHCl. Gelatina.DMSO.Detergentes:Tritn. BSA.PEG

Mg++
Laconcentracinesfundamentalparalaoptimizacindelareaccin. La concentracin es fundamental para la optimizacin de la reaccin. Contribuyeaaumentarlatemperaturadehibridacin [Mg++]:Disminuyelaespecificidad
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El termociclador Perkin Elmer Cetus: Permite la programacin flexible de la temperatura Rpido calentamiento y enfriamiento paso a paso para resultados consistentes. Rango de temperatura de 099C Bloque de aluminio para 48 tubos de reaccin de 0 5 ml 0.5 ml.
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Desnaturacin

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dATP,dCTP,dGTP ydTTF 10 20pmol deprimer

(cadauno0.2mM)

0.625a1.25unidades deTaq polimerasa

Reaccindelamezcla R i d l l 1XbufferdePCR
(50mM KCl,10mM TRISHCl,3mM MgCl2,pH9a25C) MgCl2 pH 9 a 25C)

CadenadeADNmoldeo plantilla l ill Volumenfinalde 25lo50l Superponeconuna gotadeaceitemineral

CadaciclodePCRconsiste
Denaturacion a 94C por 30 Hibridacin a 60C (para H1 y H2 55C) por 30 Amplificacina72Cpor1

Muestrasdetamaonormal:35ciclos Muestrasdetamaodebiopsia:40ciclos Universidad del Tolima

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Los mtodos tradicionales de Control de calidad en las empresas alimentarias se basan en dos nicos procesos, La inspeccin visual y el anlisis microbiolgico del Producto final. Esto lleva a una serie de DESVENTAJAS:

No detectar en que fase de la cadena de recepcin y/o produccin se produce la contaminacin microbiolgica o fisicoqumica del alimentos Se requiere un muestreo estadsticamente significativo lo que supone la recogida de un importante numero de muestras con limitaciones econmicas y temporales que ello supone. ll En el caso de detectarse una anomala, debe desecharse T d el L t con l consiguiente d h Todo l Lote, la i i t Universidad del Tolima prdida financiera

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En muchos casos la industria tiene conocimiento de los problemas cuando el producto ya se halla en el mercado, lo que supone una mala imagen para la empresa y el peligro potencial de que el consumidor desconfe de esa casa comercial en el futuro.

Las tcnicas de PCR son rpidas para la deteccin de microorganismos en alimentos. Se caracterizan por su: Especificidad Sensibilidad ibilid d Corto tiempo de anlisis Capacidad de inclusin en sistemas integrados Sencillez S ill Universidad del Tolima Integracin en sistemas HACCP

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REFERENCIAS

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Wan, J. H.; Trainor, k. J. ; Brisco, M. J.; Morley, A. A. 1990. Monoclonality in B cell lymphoma detectec in paraffin wax embedded sections using the polimerase chain reaction. Clin Pathol; 43: 888890. Redondo, G. O. 2007, Abril. Conceptos generales de biologia molecular . Extraccin de DNA y reaccin en cadena de polimerasa (PCR). Tomado de http://www.aebm.org/jornadas/guadalajara/EXTRACCI%D3N%20DE%20DNA%20Y%20 PCR.pdf PCR pdf Shibata, d. K.; Arnheim. N.; Martin, W. J. 1988. Detection of human papilloma virus in paraffinembedded tissue using the polymerase chain reaction. Exp. Med. 167: 225230. Ramasamy. I.; Brisco. M.; Morley. A. 1992. Improved PCR method for detecting monoclonal inmunoglobulin heavy chain rearrangement in B cell neoplasm. Clin Pathol. 45:770775. Jackson, D. P.; Lewis, F. A.; Taylor, G. R.; Boylston, A. W.; Quirke. P. 1990. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reactions. 43: 499 504. Chen. B.; Clejan. S. 1993. Rapid preparation of tissue DNA from paraffinembedded blocks and analysis by polymerase chain reactions. Journal Histochemistry and cytochemistry. cytochemistry Vol 41 No 5 41. No. 5.
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Referencias

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J.I. Taylor,; C.D. Hurst.; M.J. Davies.; N. Sachsinger.; I.J. Bruce. 2000. Application of magnetite and silicamagnetite composites to the isolation of genomic DNA, J. Chromatogr. A 890 159166. B. Yoza.; M. Matsumoto.; T. Matsunaga. 2002. DNA extraction using modified bacterial magnetic particles in the presence of amino silane compound, J. Biotechnol. Biotechnol 94 2002) 217 224 217224. C.L. Chiang.; C.S. Sung.; T.F. Wu.; C.Y. Chen.; C.Y. Hsu. 2005. Application of super paramagnetic nanoparticles in purification of plasmid DNA from bacterial cells J cells, J. Chromatogr. B 822 5460. J Sambrook ; D W Russell 2001 Molecular Cloning: a Laboratory Manual third J. Sambrook.; D.W. Russell. 2001. Manual, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. K.H. Wilson.; R.B. Blitchington.; R.C. Greene. 1990. Amplification of bacterial 16S ; g ; p ribosomal DNA with polymerase chain reaction, J. Clin. Microbiol. 28 19421946. J.Struthers.;R.Westran.2001.Bacteriologaclnica.Ed.Masson.Premiodela g BritishMedicalAssociation. Universidad del Tolima