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Sensibilidade da linhagem de células Aedes albopictus C6/36 para detecção e titulação da infectividade do

vírus da dengue

Artigo em Biomedicina Tropical · Janeiro 2006

Fonte: PubMed

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10 414

4 autores, incluindo:

Zamree Ismail Rohani Ahmad

ministério da saúde Instituto de Pesquisa Médica - Malásia

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Lee Hanlim

Instituto de Pesquisa Médica - Malásia

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Tropical Biomedicine 22(2): 217–219 (2005)

Sensibilidade da linhagem de células Aedes albopictus C6/36 para

detecção e titulação da infectividade do vírus da dengue

Zamree, I., Drakes, N.*, Rohani, A. e Lee, HL

Unidade de Entomologia Médica, Centro de Pesquisa de Doenças Infecciosas, Instituto de Pesquisa Médica, Kuala Lumpur.
*Hospital Queen Elizabeth, Martindale Road, St. Michael, Barbados.

Abstrato. O procedimento de ensaio de placa foi realizado para determinar a titulação da infecciosidade
do vírus da dengue usando a linha celular do mosquito Aedes albopictus C6/36. As células foram
semeadas em placas de 6 poços e incubadas até que linhas celulares C6/36 monocamada fossem
formadas. Cada poço foi exposto a uma diluição diferente de fluido de cultura infectado com dengue,
seguido pela adição do primeiro e do segundo meio de sobreposição. As células foram observadas sob
um microscópio invertido e a coloração da placa foi realizada. Os resultados mostraram que placas
contáveis não foram alcançadas e as placas formadas ficaram restritas à seção central devido à
significativa lise parcial das células C6/36 nas placas. No entanto, a técnica de ensaio de placa usando a
linha celular C6/36 relatada aqui parece ser promissora e merece estudos mais detalhados.

INTRODUÇÃO Nessas placas, um pesquisador pode avaliar a atividade

Um dos procedimentos importantes na pesquisa, que
envolve a infecção viral, é a medição da concentração
do vírus em uma amostra. A inoculação de diluições
seriadas de vírus em culturas de células hospedeiras e
o monitoramento de evidências de replicação viral
determinam esse parâmetro.
Existem vários ensaios que podem ser usados para
determinar o número de partículas virais infecciosas em
uma preparação. O ensaio de placa é um dos métodos
bem conhecidos para determinar a titulação da
infecciosidade de certos vírus. Nos ensaios de placas
virais, estruturas visíveis são formadas em uma cultura
celular contida em meio nutriente.
Ao se propagar dentro das culturas de células, os vírus
geram zonas de destruição celular conhecidas como
placas. As placas são áreas claras, lisas, que se
desenvolvem à medida que as partículas virais são
liberadas das células infectadas durante a incubação.
Uma das principais vantagens do ensaio de placa na
quantificação é que ele dá um número em vez de uma
diluição recíproca para um título, como fazem outros
ensaios infecciosos (Manning & Collins, 1979). Ao
detectar e avaliar
e a eficácia do vírus, bem como enumerar os vírus
eficazes.
Linhagens de células de mamíferos, como células
LLC-MK2 e BHK, são ideais para a propagação de vírus
para a técnica de ensaio de placa (Rosen & Gubler,
1974; Rudd et al., 1980).
No entanto, a capacidade de manter a cultura de células
de mosquito, como C6/36, à temperatura ambiente em
estado quiescente por até 14 dias sem fornecer CO2,
fornece acesso para isolamento viral e titulação.
Isso evita a necessidade de tripsinização diária da
monocamada celular, o que reduz a carga de trabalho e
garante rapidez nos testes de infecção de cultura de
tecidos do vírus.
No entanto, não há relatos de sucesso sobre o uso de
células C6/36 para a técnica de ensaio de placa. Neste
estudo, foram feitos esforços para usar a linhagem de
células C6/36 para ensaio de placa para determinar o
título de infectividade do vírus da dengue.
MATERIAL E MÉTODOS
A linhagem celular de Aedes albopictus C6/36 foi mantida
no Serviço de Entomologia Médica

217
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Unidade, Instituto de Pesquisa Médica, Kuala Lumpur.
Meio Essencial Mínimo (MEM) com 10% de soro bovino
foi usado como meio de manutenção celular e 2% de
soro bovino foi usado como meio de crescimento
celular. Placas de seis poços foram semeadas com
1x106 células/ml de C6/36 por poço e mantidas por 1-2
dias em temperatura ambiente (25ºC – 28ºC).
Depois que as células formaram uma monocamada,
elas foram expostas a um fluido de cultura contendo os
vírus da Dengue II. O fluido de cultura não infectado foi
usado como controle negativo. O ICF foi diluído e
diluições seriadas do vírus da dengue foram então
introduzidas nas culturas C6/36. Após duas horas de
período de incubação, o inóculo foi aspirado de cada
poço. A cultura foi a seguir coberta com 2,5ml do
primeiro meio de cobertura consistindo em 0,35g de
ágar Difco Bacto derretido e resfriado abaixo de 42oC.
O meio de cobertura foi deixado solidificar à temperatura
ambiente durante 10-15 minutos. Um segundo meio de
cobertura contendo 0,33% de vermelho neutro foi
adicionado às culturas após 4 dias. As células foram
então observadas sob um microscópio invertido. O
estudo foi repetido de acordo alterando o tempo de
incubação, o volume do inóculo e a temperatura.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O maior problema encontrado que afetou a formação de
Placa 1. Demonstração de placa pelo método padrão.
218
placas foi o da lise parcial significativa das células C6/36
na placa de seis poços, conforme observado durante
certos intervalos da pesquisa do estudo. As variáveis
que parecem ter tido impacto na lise das células C6/36
incluem: período de incubação, volume do inóculo e
temperatura.
Os resultados do ensaio de placa pelo método do
protocolo padrão mostraram uma lise de 50-55% das
células C6/36, com a periferia sendo totalmente
desprovida de células.
Placas contáveis não foram alcançadas e quaisquer
placas formadas foram restritas ao centro da placa de
cultura (Placa 1).
A visualização da placa pelo método de coloração foi
pobre e as células coradas não foram bem demonstradas.
O volume do inóculo, que foi utilizado no estudo,
parece ter contribuído para o efeito primário da lise.
Acredita-se que a lise observada se deva à retenção da
suspensão na periferia de cada poço em decorrência
do pequeno volume utilizado. Portanto, havia uma
aparente necessidade de aumentar o volume do inóculo,
de modo a cobrir adequadamente a superfície de cada
um dos seis poços, sem retenção ao redor da
circunferência. Assim, o volume inicial de inóculo de
100 µl foi aumentado para 500 µl.
Usando este método, 75-80% das células na placa de
cultura de células foram destacadas após um
descascamento subsequente do meio de ágar de
cobertura. No entanto, placas contáveis novamente não
foram alcançadas, e placas,
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que se desenvolveram, foram demonstrados nas áreas
intactas remanescentes da cultura.
Consequentemente, o período de incubação foi
alterado das primeiras duas horas para uma hora.
Resultados semelhantes foram gerados usando este
método em comparação com o uso da técnica de ensaio
de placa padrão, mas uma porcentagem mais favorável
de células estruturalmente, viáveis e intactas foi
demonstrada com 60-65% das células parecendo “livres
de lise”. As placas formadas estavam agora restritas ao
centro do poço de cultura, mas ainda não foram obtidas
placas contáveis.
Os resultados dos testes mostraram que, usando
linhagens de células C6/36, 42ºC pode não ser uma
temperatura adequada para aplicar o meio de cobertura
do Plaque Assay. A partir daí, foi mantido o período de
incubação recomendado de duas horas para a inoculação
do vírus nas monocamadas de células C6/36 conforme
o protocolo, mas a temperatura para aplicação do meio
overlay foi alterada.
Subsequentemente, foram tentadas diferentes
temperaturas variando de 32oC a 39oC , cada uma
resultando na lise das células após um intervalo de
tempo entre cinco minutos a 1-2 dias. O resultado
mostrou que 35ºC pode ser a melhor temperatura para
aplicar o overlay medium durante a realização do ensaio.
A esta temperatura, 50% das células que restaram
apresentaram formação de placas.
Uma vez que uma quantidade considerável de
células infectadas permaneceu intacta e não lisada, a
aplicação do meio overlay também parece ter contribuído
para a lise, bem como para o desprendimento das
células da placa de cultura de seis poços. Outra medida
usada para neutralizar o problema da lise celular foi
liberar o meio de cobertura com muita delicadeza e
cuidado. Esta técnica mostrou uma diferença apreciável
na estrutura das células após a solidificação imediata do
ágar, com menos lise, mas no dia 3 do período de
incubação, todas as células haviam lisado.
Neste estudo, os problemas se deram principalmente
pela característica específica
219
Ver estatísticas de publicação
propriedades da linha celular C6/36, uma vez que a
natureza, o tipo e a origem da linhagem celular C6/36
são conhecidos por terem alguma influência em sua
bionomia. Ao contrário das linhas de células de
mamíferos, as linhas de células de insetos parecem ser
mais sensíveis e menos rigorosas a certas condições
realizadas durante a análise da técnica de ensaio de
placa (Paul et al., 1969 ). No entanto, a técnica de
ensaio de placa usando a linha celular C6/36 relatada
aqui parece ser promissora e merece estudos mais
detalhados. A formação de placas na linha celular do
inseto abrirá a possibilidade de estudar os arbovírus in
vitro, de forma tão próxima do ambiente natural quanto
facilitada na estrutura do hospedeiro do mosquito.
Esse fenômeno tem grande implicação no
desenvolvimento de teorias e princípios em torno do
conceito de doenças, decorrentes da infecção por
arbovírus.
Reconhecimento. Os autores desejam agradecer ao
Diretor do Instituto de Pesquisa Médica de Kuala Lumpur
pela permissão para publicar este artigo. Agradecimentos
também são devidos a SEAMEO TROPMED, Malásia,
por financiar esta pesquisa.
REFERÊNCIAS
Manning, JS & Collins, JK (1979).
Efeitos da cultura de células e condições de
laboratório na infectividade do vírus da dengue tipo
2. Journal of Clinical Microbiology 10: 235-239.
Paul, SD, Singh, KRP & Bhat, UKM
(1969). Estudo do efeito citopático de arbovírus em
culturas da linhagem celular de Aedes albopictus .
Indian Journal Medical Research 57: 339-348
Rosen, L. & Gubler, D. (1974). O uso do mosquito
para detectar e propagar os vírus da dengue. The
American Journal of Tropical Medicine and Hygiene
23(6): 1153-1160.
Rudd, RJ, Trimarchi, CV & Abelseth, MK
(1980). Técnica de cultura de tecidos para
isolamento de rotina do Street Strain Rabies Virus.
Journal of Clinical Microbiology 12: 590-593.