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Bioquímica I

2010/2011

Estudo cinético da invertase da levedura

Bioquímica I 2010/2011 Estudo cinético da invertase da levedura Alunas: Andreia Sousa n.º 40261 Alexandra Salvado

Alunas:

Andreia Sousa n.º 40261 Alexandra Salvado n.º 40267

17 de Maio de 2011

1.º Ano - 2.º Semestre

2
2

Estudo cinético da invertase da levedura

Resumo

2 Estudo cinético da invertase da levedura Resumo

Este trabalho laboratorial teve como objectivos estudar a cinética do enzima invertase (beta-fructofuranosidase) na reacção de hidrólise da sacarose e a determinação dos parâmetros cinéticos K m e V máx . Pretendeu-se também comparar a velocidade da reacção de hidrólise da sacarose num ensaio com actividade enzimática e outro sem actividade enzimática.

No estudo cinético do invertase utilizou-se uma solução de enzima de concentração 1,0 U/mL, a qual foi preparada por diluição de uma solução stock 1mg/mL, usando tampão Tris-HCl (pH 7,5) 0,01 M. Após a sua preparação, a solução de enzima foi mantida a uma temperatura próxima de 0ºC.

No

ensaio

com actividade enzimática,

o reagente

de

Nelson foi

adicionado 10 minutos após a adição do invertase; como desactivador da acção enzimática; aos tubos do segundo ensaio, o reagente de Nelson foi adicionado antes da adição do enzima.

Os parâmetros cinéticos, V máx e K m , foram obtidos a partir da construção de um gráfico das velocidades iniciais em função da concentração de sacarose. Para a obtenção dos valores das velocidades iniciais determinaram-se as diferentes concentrações de oses redutores produzidas durante um intervalo de 10 minutos. Estes parâmetros foram calculados por 4 métodos diferentes e no final foi eleito o mais eficiente. Para a obtenção dos valores e dos gráficos destes parâmetros cinéticos, foi utilizado um programa de computador, Hyper.

Os valores obtidos de K m e V máx não correspondem ao esperado, sendo que o valor de Km desta enzima se situa entre os 25 e os 30 mM e se obteve um valor de K m = 9,482 ± 4,903. A velocidade máxima, ao contrário da constante de Michaelis obtida, é maior do que o esperado, Vmáx = 3,93 ± 9,722. Este facto é devido às altas absorvâncias medidas para a hidrólise total e a sua diferença para as absorvâncias medidas para a hidrólise não

17 de Maio de 2011

Estudo cinético da invertase da levedura 3 enzimática, uma vez que a correspondem a velocidades anteriormente:

Estudo cinético da invertase da levedura

3

enzimática,

uma

vez

que

a

correspondem

a

velocidades

anteriormente:

Segundo

a

apresentação

diferença

inicias

é

altas

grande,

pela

altas

absorvâncias

equação

deduzida

 

K m

e

V máx ,

o

destes gráficos e valores de

método mais rigoroso foi o método directo, uma vez que por todos apresentarem um valor negativo, o mais próximo do valor da literatura foi o

calculado por este método. O menos rigoroso será sempre o método de Lineweaver-Burk, uma vez que os parâmetros utilizados na construção do gráfico são o inverso dos valores obtidos, assim, os valores de erro reduzido são apresentados com erro grande e os valores de erro maior são apresentados com erro diminuído.

Aferiu-se que estes resultados obtidos resultaram de erros experimentais que podiam estar relacionados com a preparação da solução de enzima, com a preparação do reagente de Nelson, com o período de incubação, com os valores de absorvância e com as condições do meio pH e temperatura, principalmente.

17 de Maio de 2011

4
4

Estudo cinético da invertase da levedura

4 Estudo cinético da invertase da levedura Registo e discussão dos resultados

Registo e discussão dos resultados

Cálculo

da

concentração

exacta

invertase preparadas

Preparação das soluções

das

várias

soluções

de

Solução de invertase 1,0 U/mL

Deve retirar-se à solução anterior (à de 50 mL):

E perfazer-se a solução até aos 25 mL com tampão Tris-HCl (pH 7,5) 0,01M, obtendo então a concentração de:

Solução de invertase 2,5 U/mL

Deve retirar-se à solução anterior (à de 50 mL):

E perfazer-se a solução até aos 25 mL com tampão Tris-HCl (pH7,5) 0,01M, obtendo então a concentração de:

17 de Maio de 2011

Medições Estudo cinético da invertase da levedura 5 Cada grupo ficou com uma dada concentração de

Medições

Estudo cinético da invertase da levedura

5

Cada

grupo

ficou

com uma

dada concentração de invertase para

preparar (1,0 ou 2,5 U/mL). O nosso grupo preparou a solução de 1,0U/mL.

Concentração teórica da solução de invertase 1,0 U/mL

Concentração exacta da solução de invertase preparada

Para determinar a concentração exacta da solução de enzima preparada utilizou-se a fórmula correspondente à lei de Beer-Lambert ( ). Sendo a absorvância, o coeficiente de absorção molar ao comprimento de onda utilizado e o percurso óptico, ou seja, a largura da cuvette. Para esta medição da absorvência da solução preparada utilizou-se a cuvette de quartzo devido ao comprimento de onda utilizado, uma vez que a 280 nm é a cuvette que menos absorve, como é visível no quadro abaixo

(Quadro 1).

Quadro 1. Gama de aplicação das cuvettes de acordo com o seu tipo de material.

Gama Espectral

Material

Gama de Aplicação

Visível

Plástico

340-800 nm

Vidro

334-2500 nm

UV

Quartzo

170-2600 nm

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  • 6 Estudo cinético da invertase da levedura

Concentração exacta:

Concentração esperada:

Estudo cinético da invertase da levedura Concentração exacta: Concentração esperada: A concentração exacta foi bastante

A concentração exacta foi bastante mais elevada do que a concentração esperada. Isto vai resultar em absorvâncias altas, como se verá mais à frente no relatório.

Base de actuação do reagente de Nelson

O cobre presente no reagente de Nelson é reduzido pelos glícidos redutores (glicose e frutose) em meio alcalino e quente. A forma reduzida do sal de cobre actua sobre o reactivo arsenomolibdato determinando o aparecimento de cor azul, cuja intensidade é proporcional ao teor de glícidos redutores da solução. Sob a acção do calor os glícidos redutores decompõem- se parcialmente em fragmentos oxidáveis pelo hidróxido cuproso existente no reagente de Nelson, resultando em ácido etanodióico, ácido propanodióico, entre outros. Nesta reacção o hidróxido de cobre (azul) reduz-se a hidróxido cuproso (amarelo). Continuando o aquecimento, o hidróxido cuproso perde uma molécula de água, transformando em óxido cuproso (vermelho). O óxido cuproso assim formado, vai reduzir o reagente de arsenomolibdato dando o óxido de molibdénio (MO 3 O 8 ) de coloração azul, cuja intensidade é proporcional a quantidade de glícidos redutores existentes na amostra, que pode ser determinada espectrofotometricamente a 510 nm.

O invertase, como todos os enzimas, apresenta um pH óptimo de actuação, onde apresenta uma actividade elevada, o seu intervalo de actuação

17 de Maio de 2011

Estudo cinético da invertase da levedura 7 de pH é entre 3,5-5,5, sendo o pH óptimo

Estudo cinético da invertase da levedura

7

de pH é entre 3,5-5,5, sendo o pH óptimo 4,5, a 55ºC. Se o enzima não se encontrar em solução, a hidrólise da sacarose ocorre facilmente se o meio for ácido.

Tendo por base estes factores, podemos deduzir que o reagente de Nelson altera o pH da solução, basificando-o, inibindo a actuação do enzima. Este facto deve-se à alteração do estado de ionização de um grupo funcional do enzima, independentemente da existência do tampão de acetato de sódio, pois este não tem capacidades de neutralizar uma base tão forte. A alteração dos estados iónicos dos grupos dos resíduos dos aminoácidos, principalmente do centro activo, conduz a uma alteração da sua configuração pelo que a ligação com o substrato é impossibilitada, levando a uma perda da sua actividade catalítica e consequente paragem da reacção catalisada pela enzima.

Este facto em conjunto com o posterior aumento de temperatura, leva à desnaturação do enzima, impedindo-o de voltar a reagir, sendo a reacção de hidrólise da sacarose dada por terminada.

Resultados obtidos nos controlos efectuados

Ao longo de toda a actividade laboratorial foram utilizados tubos de controlo para cada quadro preparado.

No quadro 1, em que foi estudado a influência da concentração de substrato na actividade enzimática do invertase da levedura, foi utilizado para o zero do espectrofotómetro o tubo 1, pois não havendo sacarose no meio reaccional não foi formado nenhum produto (glucose e frutose) e consequentemente a concentração de glícidos redutores o que é identificado pelo método de Nelson é nula.

O tubo 10 foi utilizado para controlar o efeito do reagente de Nelson na actividade enzimática. Este reagente foi adicionado neste tubo antes do enzima, ao contrário do sucedido nos outros tubos. Assim, visto que este inibe

17 de Maio de 2011

  • 8 Estudo cinético da invertase da levedura

Estudo cinético da invertase da levedura a actuação do enzima, obteve-se uma menor concentração de

a actuação do enzima, obteve-se uma menor concentração de glícidos redutores glucose e frutose - pois a hidrólise do diósido não foi catalisada por um enzima.

O tubo 11 permitiu seguir a dissociação da sacarose sem a acção do enzima. Ao comparar este tubo com o tubo anterior (tubo 10) é possível concluir que a dissociação ocorrida no tubo 10 se deve a uma dissociação química “natural” da sacarose – sem enzima, pois uma vez que as absorvâncias medidas foram idênticas, as concentrações de glícidos redutores foram idênticas.

No quadro

2,

em que

foi

controlada a hidrólise não enzimática da

sacarose, foi utilizado para o zero do espectrofotómetro o tubo 1, pelos mesmos motivos que no quadro 1.

Quanto a este quadro todos os tubos de ensaio podem ser considerados tubos de controlo, uma vez que é em relação a estes que se vai comparar a reacção com enzima.

Dados obtidos no estudo da hidrólise total e não enzimática Gráfico Absorvância VS concentração de sacarose

Concentração teórica da sacarose em cada solução (V T =10 mL)

Tubo 1

[

]

Tubo 2

17 de Maio de 2011

Estudo cinético da invertase da levedura 9 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo

Estudo cinético da invertase da levedura

9

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

Tubo 6

Tubo 7

Tubo 8

Tubo 9

Registo dos resultados

Solução 1,0 U/mL de invertase

Quadro

2. .

Concentração de sacarose (substrato) e respectivas absorvâncias a 510 nm em cada quadro,

utilizando a solução de invertase 1,0 U/mL.

Tubos

[Sacarose]

Abs 510nm

Abs 510nm

Abs 510nm

(mM)

Hidrólise total

Hidrólise não

Hidrólise

 

(enzimática e não enzimática)

enzimática

enzimática

  • 1 0,0

0,000

0,000

0,000

  • 2 0,5

1,984

0,287

1,697

  • 3 1,0

1,544

0,397

1,147

17 de Maio de 2011

  • 10 Estudo cinético da invertase da levedura

Estudo cinético da invertase da levedura 4 1,755 1,5 0,343 1,412 5 1,875 2,5 0,413
  • 4 1,755

1,5

0,343

1,412

  • 5 1,875

2,5

0,413

1,462

  • 6 1,917

3,5

0,489

1,428

  • 7 2,232

5,0

0,390

1,842

  • 8 1,892

10,0

0,548

1,344

  • 9 1,979

15,0

1,044

0,935

Absorvância VS concentração de sacarose

0,450 8,0 6,0 0,0 2,0 4,0 10,0 12,0 14,0 16,0 Absorvância a 510 nm 0,000 0,150
0,450
8,0
6,0
0,0
2,0
4,0
10,0
12,0
14,0 16,0
Absorvância a 510 nm
0,000
0,150
0,300
2,400
0,600
0,750
0,900
1,050
1,200
1,350
1,500
1,650
1,800
1,950
2,100
2,250

Concentração de Sacarose (mM)

  • Hidrólise total (enzimática e não enzimática)

  • Hidrólise não enzimática

  • Hidrólise enzimática (diferença entre a hidrólise total e a hidrólise não enzimática)

Gráfico 1. Representação do estudo da hidrólise enzimática total (enzimática e não enzimática), hidrólise enzimática e hidrólise não enzimática, utilizando a solução de invertase 1,0 U/mL.

Solução 2,5 U/mL de invertase

Quadro 3. Concentração de sacarose (substrato) e respectivas absorvâncias a 510 nm em cada quadro, utilizando a solução de invertase 2,5 U/mL.

Tubos

[Sacarose]

Abs 510nm

Abs 510nm

Abs 510nm

(mM)

Hidrólise total

Hidrólise não

Hidrólise

 

(enzimática e não

enzimática

enzimática

enzimática)

  • 1 0

0,0

0

0

  • 2 0,5

1,560

1,333

0,000

  • 3 1,0

1,670

1,349

0,227

  • 4 1,5

2,120

1,421

0,321

17 de Maio de 2011

Estudo cinético da invertase da levedura 11 5 2,540 2,5 1,492 0,699 6 2,757 3,5 1,503

Estudo cinético da invertase da levedura

11

  • 5 2,540

2,5

1,492

0,699

  • 6 2,757

3,5

1,503

1,048

  • 7 2,777

5,0

1,539

1,254

  • 8 2,777

10,0

1,589

1,238

  • 9 2,777

15,0

1,603

1,188

Absorvância VS concentração de

sacarose

3,000 2,850 2,700 2,550 2,400 2,250 2,100 1,950 1,800 1,650 1,500 1,350 1,200 1,050 0,900 0,750
3,000
2,850
2,700
2,550
2,400
2,250
2,100
1,950
1,800
1,650
1,500
1,350
1,200
1,050
0,900
0,750
0,600
0,450
0,300
0,150
0,000
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0 12,0
14,0 16,0
Absorvância a 510 nm

Concentração de Sacarose (mM)

  • Hidrólise total (enzimática e não enzimática)

  • Hidrólise não enzimática

  • Hidrólise enzimática (diferença entre a hidrólise total e a hidrólise não enzimática)

Gráfico 2. Representação do estudo da hidrólise enzimática total (enzimática e não enzimática), hidrólise enzimática e hidrólise não enzimática, utilizando a solução de invertase 2,5 U/mL.

Discussão dos gráficos obtidos

A reacção de hidrólise da sacarose tanto pode ocorrer “naturalmente” como pode ocorrer na presença de enzima.

Estudo cinético da invertase da levedura 11 5 2,540 2,5 1,492 0,699 6 2,757 3,5 1,503

Imagem 1. Reacção de hidrólise da sacarose.

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  • 12 Estudo cinético da invertase da levedura

Estudo cinético da invertase da levedura Os enzimas, sendo proteínas com funções catalíticas, aumentam a

Os enzimas, sendo proteínas com funções catalíticas, aumentam a velocidade com que se atinge o estado de equilíbrio da reacção. Assim, duas soluções que contenham a mesma concentração de substrato (neste caso, sacarose), se uma tiver na presença de enzima (neste caso, invertase da levedura) e outra não, a solução que estiver na presença do enzima irá obter uma maior concentração de produto (glícidos redutores frutose e glucose) no mesmo intervalo de tempo.

Tanto no Gráfico 1 como no Gráfico 2 as absorvâncias mais altas correspondem à hidrólise total, como era esperado. Uma vez que na hidrólise total tanto ocorre hidrólise enzimática como não enzimática, levando a uma obtenção maior de glícidos redutores. Estes dados correspondem aos obtidos através da aplicação do quadro 1 do procedimento.

O conjunto de pontos que se referem à absorvância medida para a actividade não enzimática deveria corresponder aos menores valores de todos, uma vez que não enzimaticamente a reacção de hidrólise da sacarose é mais lenta (obtém-se uma menor quantidade de glícidos redutores). O facto descrito anteriormente deveria ser independente da concentração do enzima no meio reaccional. No entanto, isso só aconteceu quando a concentração da solução de invertase era 1,0 U/mL. Estes dados correspondem aos obtidos através da aplicação do quadro 2 do procedimento.

Quanto à hidrólise enzimática, as absorvâncias deviam estar compreendidas entre as absorvâncias da hidrólise total e da hidrólise não enzimática e deveriam aumentar até uma dada concentração de sacarose e depois manter-se estável, uma vez que para concentrações de enzima muito menores que concentrações de substrato chega a um ponto em que todos os centros activos dos enzimas estão ocupados, não sendo possível aumentar mais a velocidade de reacção. Como todos os enzimas estiveram nas soluções o mesmo tempo e na mesma quantidade, a partir de uma dada concentração, a absorvância medida deve ser igual para todos.

Uma vez que as concentrações de sacarose em cada um dos casos

anteriores

foi

a

mesma

para

cada

tubo

de

ensaio, concluiu-se que as

17 de Maio de 2011

Estudo cinético da invertase da levedura 13 concentrações de frutose e glucose obtidas não enzimaticamente seriam

Estudo cinético da invertase da levedura

13

concentrações de frutose e glucose obtidas não enzimaticamente seriam as mesmas que na situação onde ocorreu a hidrólise total. Assim, para se obter as absorvâncias e consequentemente as concentrações dos glícidos redutores obtidos enzimaticamente procedeu-se ao seguinte cálculo:

No Gráfico 1 aconteceu o esperado quanto ao intervalo de valores em que devia estar a absorvância (entre as absorvâncias da hidrólise total e a hidrólise não enzimática) mas quanto aos valores de absorvância manterem-se aproximadamente iguais após uma dada concentração, não aconteceu o esperado pois obtiveram-se valores muito dispersos, não seguindo qualquer tendência. No Gráfico 2 ocorreu exactamente o contrário do descrito para o

Gráfico 1.

Cinética de Michaelis-Menten

Cálculo

da

velocidade

inicial

da

reacção

de

hidrólise da

sacarose

na

mistura

reaccional

(v T =

1mL)

devido

à

acção

enzimática

(µM/min)

para

cada

concentração

de

substrato

utilizada

Sabendo que na hidrólise total existem dois tipos de reacção, a enzimática e a não enzimática, pode considerar-se que a concentração da solução não enzimática na hidrólise total é igual à concentração obtida nos outros tubos de ensaio correspondentes à hidrólise não enzimática, sendo que as soluções, teoricamente, continham a mesma concentração de sacarose.

Assim, subtraindo o valor da absorvância da hidrólise não enzimática à hidrólise total da sacarose obtém-se apenas a concentração dos glícidos redutores originados pela reacção enzimática, como explicado anteriormente. A partir desta variação de absorvância e sabendo que o coeficiente de absorção molar dos produtos da reacção da glucose no método de Nelson a 510 nm é igual a Ɛ 510nm = 7,1 mM -1 cm -1 , pode-se calcular a concentração de glícidos

17 de Maio de 2011

  • 14 Estudo cinético da invertase da levedura

Estudo cinético da invertase da levedura catalisados enzimaticamente. No entanto, apesar do método de Nelson

catalisados enzimaticamente. No entanto, apesar do método de Nelson reagir com os dois glícidos redutores obtidos (glucose e frutose), vai-se considerar para o cálculo da velocidade que só identifica a glucose, pois só para este glícido é que se sabe o valor do coeficiente de absorção molar. Assim, o valor desta concentração por unidade de tempo corresponde à velocidade inicial que se pode determinar através da seguinte fórmula:

[

]

Quadro 4. Registo das variações das absorvâncias - hidrólise enzimática - para as várias concentrações de sacarose nos diferentes tubos

Tubo

Abs 510 Hidrólise enzimática

  • 1 0,000

  • 2 1,697

  • 3 1,147

  • 4 1,412

  • 5 1,462

  • 6 1,428

  • 7 1,842

  • 8 1,344

  • 9 0,935

Para determinar a velocidade inicial para cada tubo de ensaio deduziu- se uma fórmula que permitiu calcular a velocidade inicial através da absorvância registada e da fórmula da própria velocidade.

[

[

]

]

Velocidade inicial

17 de Maio de 2011

Estudo cinético da invertase da levedura 15 Concentração da sacarose na mistura reaccional Tubo 1 Tubo

Estudo cinético da invertase da levedura

15

Concentração da sacarose na mistura reaccional

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

Tubo 6

17 de Maio de 2011

  • 16 Estudo cinético da invertase da levedura

Estudo cinético da invertase da levedura Tubo 7 Tubo 8 Tubo 9  Representação gráfica

Tubo 7

Tubo 8

Tubo 9

Representação gráfica de v o em função da concentração de sacarose na mistura reaccional (v T = 1 mL). Determinação dos parâmetros cinéticos K m e V máx usando um método gráfico adequado. Justificação da escolha do método efectuado. Comparação do valor obtido para Km com valores da literatura.

Quadro 5. Concentração de sacarose na mistura reaccional (1mL) e velocidade inicial correspondente.

Tubos

[Sacarose]

Velocidade inicial (

)

(mM)

(µM min -1 )

  • 1 0

0

  • 2 5

23,9

  • 3 10

16,2

  • 4 15

19,9

  • 5 25

20,6

  • 6 35

20,1

  • 7 50

25,9

  • 8 100

18,9

  • 9 150

13,2

17 de Maio de 2011

Estudo cinético da invertase da levedura 17 Gráfico 3. Representação da velocidade inicial (  M

Estudo cinético da invertase da levedura

17

Estudo cinético da invertase da levedura 17 Gráfico 3. Representação da velocidade inicial (  M

Gráfico 3. Representação da velocidade inicial (M min -1 ) em função da concentração de substrato, neste caso, sacarose (mM) na mistura reaccional.

Pela observação do gráfico obtido, podemos notar que deve ter ocorrido algum tipo de erro experimental, pois era esperado que se observasse um gráfico onde fosse possível identificar facilmente que a velocidade de reacção aumenta com o aumento da concentração se substrato. Para além disso era também esperado que fosse perceptível ver como a velocidade da reacção tende para um valor limite onde todos os enzimas têm os seus centros activos ocupados, encontram-se saturados - sendo esta a velocidade máxima.

Os parâmetros cinéticos que se podem retirar do gráfico obtido, K m e V máx não correspondem, portanto, ao esperado, sendo que o valor de K m desta enzima se situa entre os 25 e os 30 mM e se obteve um valor de K m = 9,482 ± 4,903. A velocidade máxima, ao contrário da constante de Michaelis obtida, é maior do que o esperado, V máx = 3,93 ± 9,722. Este facto é devido às altas absorvâncias medidas para a hidrólise total e a sua diferença para as absorvâncias medidas para a hidrólise não enzimática, uma vez que a diferença é grande, altas absorvâncias correspondem a velocidades inicias altas pela equação deduzida anteriormente:

17 de Maio de 2011

  • 18 Estudo cinético da invertase da levedura

Estudo cinético da invertase da levedura Como as velocidades iniciais têm um valor elevado, a

Como

as velocidades iniciais

têm

um

valor

elevado, a velocidade

máxima também o terá.

Para obter valores credíveis de K m e V máx o gráfico deveria apresentar uma curva hiperbólica rectangular, isto é, uma curva onde à medida que a concentração de substrato aumenta, a velocidade da reacção também aumenta, sendo que inicialmente aumenta muito rapidamente, passando progressivamente a tender para um determinado valor, correspondente à velocidade máxima. Assim, seria de esperar que se observasse que o gráfico obedecia a uma cinética de Michaelis-Menten. A constante de Michaelis, K m , seria igual à concentração de substrato para a qual a velocidade inicial da reacção é metade da sua velocidade máxima.

De seguida está apresentado o gráfico esperado para uma cinética de Michaelis.

Estudo cinético da invertase da levedura Como as velocidades iniciais têm um valor elevado, a
Estudo cinético da invertase da levedura Como as velocidades iniciais têm um valor elevado, a

Imagem 2. Equação de Michaelis-Menten e representação da curva de saturação para um enzima mostrando a relação entre a concentração do substrato (eixo das abcissas) e a velocidade de reacção (eixo das ordenadas).

Apesar

dos

resultados

obtidos,

a

equação

de

Michaelis-Menten

apresenta alguns problemas que dificultam os cálculos dos parâmetros cinéticos, tais como:

17 de Maio de 2011

Estudo cinético da invertase da levedura 1. V é uma assímptota da hipérbole 19 2. Os

Estudo cinético da invertase da levedura

  • 1. V máx é uma assímptota da hipérbole

Estudo cinético da invertase da levedura 1. V é uma assímptota da hipérbole 19 2. Os

19

  • 2. Os dois parâmetros cinéticos estão extremamente correlacionados

Estudo cinético da invertase da levedura 1. V é uma assímptota da hipérbole 19 2. Os
  • 3. Erros experimentais

Para uma melhor determinação dos parâmetros cinéticos, a equação de Michaelis-Menten pode ser algebricamente rearranjada em formas que são mais úteis no tratamento gráfico dos dados experimentais. São conhecidos três métodos (transformações lineares) distintos para a determinação dos parâmetros cinéticos (V máx e K m ):

Método de Lineweaver-Burk;

Método de Hanes;

Método de Eadie-Hofstee.

Método de Lineweaver-Burk

O gráfico de Lineweaver-Burk ou representação de duplo recíproco é a forma mais comum e simples de mostrar os dados cinéticos, apesar de não ser a mais fiável.

Neste método, tomam-se os valores inversos de ambos os lados da equação de Michaelis-Menten:

Estudo cinético da invertase da levedura 1. V é uma assímptota da hipérbole 19 2. Os

17 de Maio de 2011

  • 20 Estudo cinético da invertase da levedura

Estudo cinético da invertase da levedura Como se pode observar na figura, o resultado deste
 

Como

 

se

pode

observar

na

figura,

o

resultado

deste

tipo

de

representação é uma linha recta cuja equação é do tipo y = mx + b, sendo o

ponto

de intersecção

entre

a recta

e

o

eixo

das ordenadas equivalente

a

,

e

o

ponto de intersecção

entre

a

recta

e

o

eixo

de abcissas

equivalente a

.

Estudo cinético da invertase da levedura Como se pode observar na figura, o resultado deste

Imagem 3. Representação do gráfico de Lineweaver-Burk.

Geralmente, os gráficos de Lineweaver-Burk distorcem as medidas realizadas a baixas concentrações de substrato e isto pode dar lugar a estimativas não muito exactas de V máx e de K m . A principal desvantagem deste método é a de que, ao calcular-se os inversos, altera-se por completo a distribuição dos erros experimentais um pequeno erro experimental passa a ser um grande erro após a inversão da equação de Michaelis-Menten. No entanto também apresenta a sua vantagem permite uma determinação de V máx precisa.

O

gráfico

obtido

neste

trabalho

experimental

Lineweaver-Burk é o que se ilustra a seguir.

para

o

método

de

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Estudo cinético da invertase da levedura 21 Imagem 4. Gráfico obtido no método de Lineweaver-Burk. Para

Estudo cinético da invertase da levedura

21

Imagem 4. Gráfico obtido no método de Lineweaver-Burk.

Para este método obteve-se os seguintes parâmetros cinéticos:

V máx = 17,93 M/ min

Km = -1,018 mM

Método de Hanes

Neste método multiplica-se por [S] na expressão do duplo recíproco, vista anteriormente. Esta representação não causa alteração do desvio experimental ao longo da escala de [S], daí ser o mais indicado para a estimativa por transformação linear e/ou gráfica.

Estudo cinético da invertase da levedura 21 Imagem 4. Gráfico obtido no método de Lineweaver-Burk. Para
Estudo cinético da invertase da levedura 21 Imagem 4. Gráfico obtido no método de Lineweaver-Burk. Para

Imagem 5. Equação do método de Hanes e respectiva representação gráfica.

Neste método [ ]

varia linearmente com [S]. O declive da recta é igual

a

. A intersecção da recta com o eixo das ordenadas é numericamente

17 de Maio de 2011

  • 22 Estudo cinético da invertase da levedura

Estudo cinético da invertase da levedura igual a e a intersecção da recta com o

igual

a

e

a intersecção

da recta

com

o

eixo

das abcissas é

numericamente igual a Km.

Estudo cinético da invertase da levedura igual a e a intersecção da recta com o

Imagem 6. Gráfico obtido no método Hanes.

Para este método obteve-se os seguintes parâmetros cinéticos:

V máx = 13,85 M/ min

Km = -8,714 mM

Método de Eadie-Hofstee

Este método consiste na multiplicação por V na expressão do duplo recíproco e no seu rearranjo.

Estudo cinético da invertase da levedura igual a e a intersecção da recta com o
Estudo cinético da invertase da levedura igual a e a intersecção da recta com o

Imagem 7. Equação do método de Eadie-Hofstee e respectiva representação gráfica.

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Estudo cinético da invertase da levedura 23 O declive desta recta é numericamente igual a -

Estudo cinético da invertase da levedura

23

O declive desta recta é numericamente igual a - K m . A intersecção da recta com o eixo das ordenadas é numericamente igual à V máx e com o eixo das

abcissas é numericamente igual a

.

Este é um bom método para testar desvios à equação de Michaelis- Menten.

Estudo cinético da invertase da levedura 23 O declive desta recta é numericamente igual a -

Imagem 8. Gráfico obtido no método de Eadie-Hofstee.

Para este método obteve-se os seguintes parâmetros cinéticos:

V máx = 18,56 M/ min

Km = -1,032 mM

Método de Eisenthal e Cornish-Bowden

Existe ainda um método (linear) directo. É um método não paramétrico e é denominado método de Eisenthal e Cornish-Bowden. Neste método K m e V máx podem ser determinados pelo uso da forma integrada da equação de velocidade:

17 de Maio de 2011

  • 24 Estudo cinético da invertase da levedura

Estudo cinético da invertase da levedura Ordenada na origem  V = V Abcissa na
Estudo cinético da invertase da levedura Ordenada na origem  V = V Abcissa na

Ordenada na origem V = V 0

Abcissa na origem K m = - [S]

Imagem 9. Equação usada no método de Eisenthal e Cornish-Bowden.

[S] i , V 0i

Após a sua determinação experimental, cada par de valores de [S] i e V 0i passa a ser constante;

V e K m

Para cada experiência, a incógnita é determinar qual o par de parâmetros cinéticos que satisfaz simultaneamente todos os valores experimentais de [S] e V 0 .

 Após a sua determinação experimental, cada par de valores de [S] e V passa a

Imagem 10. Representação gráfica pelo método de Eisenthal e Cornish-Bowden.

Para cada [S] i traça-se uma recta que une os pontos (- [S] i , 0) e (0, V 0i ); Cada recta traçada inclui todos os pares de valores de K m e V que satisfazem os valores experimentais de [S] i e V 0i ;

17 de Maio de 2011

Estudo cinético da invertase da levedura  O ponto de intersecção das duas rectas corresponde ao

Estudo cinético da invertase da levedura

O ponto de intersecção das duas rectas corresponde ao único par de valores de Km e V que satisfaz simultaneamente os dois pares de valores experimentais de [S] e V 0 K m * e V*.

25

A estimativa dos parâmetros cinéticos é feita através da mediana das n.(n- 1)/2 intersecções obtidas onde n é o número de pontos experimentais.

As vantagens deste método são as seguintes:

Não requer cálculos,

Com dois ou três [S] obtêm-se uma estimativa de K m e do

desenho experimental, Insensível a outliers.

Estudo cinético da invertase da levedura  O ponto de intersecção das duas rectas corresponde ao
Estudo cinético da invertase da levedura  O ponto de intersecção das duas rectas corresponde ao

Imagem 11. Resultados ideias do cálculo dos parâmetros cinéticos pelo método de Eisenthal e Cornish- Bowden.

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  • 26 Estudo cinético da invertase da levedura

Estudo cinético da invertase da levedura Imagem 12 Gráfico obtido no método de Eisenthal e
Estudo cinético da invertase da levedura Imagem 12 Gráfico obtido no método de Eisenthal e

Imagem 12 Gráfico obtido no método de Eisenthal e Cornish-Bowden.

Para este método obteve-se os seguintes parâmetros cinéticos:

V máx = 18,84 M/ min

Km = -0,9963 mM

Como é visível em todos os métodos que resultam do rearranjo da equação de Michaelis-Menten, os dados experimentais obtidos não correspondem, nem aproximadamente, aos valores esperados, uma vez que seria de esperar um K m entre 25 e 30 mM e se obteve valores negativos de K m . Sendo K m o valor de uma concentração é impossível ter um valor negativo. Quanto à V máx seria de esperar uma menor velocidade. Segundo a apresentação destes gráficos e valores de K m e V máx , o método mais rigoroso foi o método directo, uma vez que por todos apresentarem um valor negativo, o mais próximo do valor da literatura foi o calculado por este método. O menos rigoroso será sempre o método de Lineweaver-Burk, uma vez que os parâmetros utilizados na construção do gráfico são o inverso dos valores obtidos, assim, os valores de erro reduzido são apresentados com erro grande e os valores de erro maior são apresentados com erro diminuído.

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Estudo cinético da invertase da levedura 27 O facto de se obter valores tão distantes dos

Estudo cinético da invertase da levedura

27

O facto de se obter valores tão distantes dos esperados leva a considerar que ocorreram uma série de erros na realização do procedimento que afectaram os resultados. Esses erros podem começar, por exemplo, na preparação da solução de invertase e continuar na preparação do reagente de Nelson. Uma má preparação deste reagente pode ter como consequência a não paragem da actividade enzimática, levando a uma maior produção de glícidos redutores e consequentemente a uma absorvância maior. Uma adição tardia deste reagente a cada tubo conduziria a um aumento do tempo de incubação e como tal a uma maior concentração de produto formado.

Além da preparação de soluções podem também ter ocorrido erros na medição das absorvâncias nos diferentes tubos, uma vez que a linearidade entre a absorvância e concentração é limitada por diversos factores químicos e instrumentais, tais como: dispersão da radiação devido à presença de partículas na solução ou desvios nos coeficientes de absorção molar devido a interacções intermoleculares entre moléculas “muito próximas”, a utilização radiação não totalmente monocromática e possibilidade de fluorescência da amostra, assim como alterações do índice de refracção das cuvvetes e alterações no equilíbrio das soluções analisadas. Ao obter absorvâncias muito altas, irá obter-se concentrações de produto formado muito altas, o que vai influenciar a velocidade inicial obtida em cada tubo de ensaio e consequentemente os parâmetros cinéticos. A obtenção de valores de K m muito baixos pode dever-se à alta afinidade entre enzima e substrato. Cada enzima apresenta um valor característico de K m e de V máx . Para a maioria das enzimas, o valor de K m está entre 10 -1 e 10 -7 M. Esse valor depende do substrato em particular e também das condições no sistema de reacção, tais como pH, temperatura e força iónica. K m corresponde à concentração de substrato em que metade dos centros activos da enzima está preenchida e mostra a afinidade pela enzima ao substrato; um Km baixo implica uma grande concentração do complexo enzima substrato em solução, portanto, muito substrato em solução, isto é, pequeno K m implica velocidade maior.

Existem outros factores que podem influenciar a actividade enzimática, como o pH e a temperatura do meio:

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  • 28 Estudo cinético da invertase da levedura

pH

Estudo cinético da invertase da levedura  pH As proteínas como já foi visto, são

As proteínas como já foi visto, são construídas a partir de aminoácidos. Estas unidades bioquímicas possuem grupos básicos,

neutros e ácidos. Consequentemente, a enzima intacta pode conter ambos os grupos carregados positiva ou negativamente
neutros
e
ácidos.
Consequentemente, a enzima intacta
pode
conter
ambos
os
grupos
carregados
positiva
ou
negativamente a um dado pH. Deste
modo,
grupos
ionizáveis
são,
Imagem
13.
Efeito
do
pH
na
actividade
aparentemente, muitas vezes parte
enzimática.
do centro activo visto
que
a acção
catalítica
de
ácidos
e
bases
está
ligada
a
vários
mecanismos

enzimáticos. Além disso, variações do pH podem alterar a estrutura tridimensional das enzimas. Por essas razões, as enzimas são activas somente dentro de uma certa faixa de pH. O pH do meio pode afectar a

velocidade máxima da reacção, Km, e a estabilidade da enzima. Em alguns casos, o substrato pode conter grupos iónicos, e o pH do meio influi na afinidade do substrato com a enzima.

Temperatura

A velocidade das reacções catalisadas por enzimas cresce até

um certo limite. Acima de uma determinada temperatura, a actividade da enzima diminui devido à sua desnaturação. A velocidade de uma reacção química é afectada pela temperatura isso pode ser explicado pela teoria de Arrhenius que se baseia na hipótese de que duas partículas devem se colidir na orientação correcta e com energia cinética suficiente para que os reagentes sejam transformados em produtos. Pode-se dizer que o mesmo acontece com as reacções catalisadas por enzimas, lembrando que a variação de temperatura afecta as constantes cinéticas (Km e

  • V máx ).

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Estudo cinético da invertase da levedura 29 Em baixas temperaturas, as reacções são mais lentas devido

Estudo cinético da invertase da levedura

29

Em baixas temperaturas, as reacções são mais lentas devido à queda da energia cinética do sistema. Porém, como as enzimas são

proteínas, o aumento da temperatura não causa apenas o aumento da velocidade de reação, mas, sim, dois efeitos opostos:

  • Até determinada temperatura, ocorre um aumento da

velocidade de reação;

  • A partir de determinada temperatura, há uma diminuição na

velocidade de reação. A actividade enzimática da invertase atinge um máximo aos 55ºC, a temperatura ambiente do

laboratório era 29ºC.

À medida que a temperatura aumenta, a actividade catalítica aumenta também, até atingir um determinado valor - Temperatura Óptima. A partir desta temperatura, que corresponde ao valor máximo de

Estudo cinético da invertase da levedura 29 Em baixas temperaturas, as reacções são mais lentas devido

Imagem 14. Efeito da temperatura na actividade enzimática.

actividade enzimática, a actividade catalítica começa a diminuir, pois, a temperaturas elevadas inicia-se a desnaturação térmica das proteínas.

17 de Maio de 2011

30
30

Estudo cinético da invertase da levedura

Bibliografia

30 Estudo cinético da invertase da levedura Bibliografia

Alexander, R.R., Griffiths, J.M., e Wilkinson, M.L. (1984) Basic Biochemical Methods, John Wiley & Sons: New York, pp. 56-67. Boyer, R.F. (1986) Modern Experimental Biochemistry, Addison-Wesley:

Reading, MA, pp.299-321. Cornish-Bowden, A. (1995) Fundamentals of Enzyme Kinetics, Portland Press: London. Holme, D.J. e Peck, H. (1998) Analytical Biochemistry, Cap. 8, Addison Wesley Longman: New York. Ninfa, A.J. e Ballou, D.P. (1998) Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology, Fitzgerald Science Press: Bethesda, MA, pp.

199-206.

Questionário

  • 1. Porque é que a solução de invertase foi preparada em tampão

Tris-HCl (pH 7,5) 0,01 M e os ensaios foram realizados usando-se tampão acetato de sódio (pH 4,5) 0,2 M?

O enzima invertase catalisa a hidrólise da ligação glicosídica α(1→2) do dióxido não redutor, sacarose, originando glucose e frutose na proporção de 1:2 - por cada molécula de sacarose hidrolisada, formam-se duas moléculas de oses redutoras.

30 Estudo cinético da invertase da levedura Bibliografia  Alexander, R.R., Griffiths, J.M., e Wilkinson, M.L.

A invertase apresenta uma actividade elevada num intervalo alargado de valores de pH (3,5 5,5), apresentando um valor de pH óptimo igual a 4,5.

O pH tem uma grande influência na actividade enzimática. Os enzimas sofrem os mesmos efeitos estruturais observados nas proteínas globulares

17 de Maio de 2011

Estudo cinético da invertase da levedura 31 pela variação de pH - mudanças extremas de pH

Estudo cinético da invertase da levedura

31

pela variação de pH - mudanças extremas de pH podem alterar a estrutura da enzima devido a uma repulsão de cargas.

Assim, a solução de enzima foi preparada a valor de pH igual a 7,5 pois para este valor de pH, o enzima é bastante estável. Nesta fase o importante foi preparar uma solução diluída assegurando que o enzima estaria presente na sua forma estável para que mais tarde fosse possível estudar a sua actividade.

Os ensaios foram realizados usando-se tampão acetato de sódio (pH 4,5) 0,2 M pois este é o valor de pH óptimo do enzima, ou seja, é o valor de pH para o qual o enzima tem máxima potência e eficiência.

Caso a preparação da solução fosse realizada para outros valores de pH, o enzima poderia não ser estável e, mais tarde, ao realizar os ensaios, poderia ocorrer o caso extremo de não se encontrar enzima em solução para catalisar a reacção, sendo impossível de atingir o objectivo do trabalho.

  • 2. Como comprovaria que a ocorrência de uma reacção num

homogenato ou extracto celular era devida à acção catalítica de um enzima, presente nesse homogenato, sobre o substrato utilizado?

Para comprovar que a ocorrência de uma reacção num homogenato ou extracto celular era devida à acção catalítica de um enzima realizar-se-ia um estudo cinético, traçando-se o gráfico da velocidade inicial em função da concentração de substrato. Se nesse gráfico se obtivesse uma hipérbole rectangular, concluir-se-ia que a reacção era devida à acção catalítica de um enzima que obedece a uma cinética de Michaelis-Menten.

No entanto, existem vários enzimas que não possuem um comportamento Michaeliano e, por isso, seria necessário recorrer a outra forma de confirmar a existência de actividade catalítica. Poder-se-ia, então, efectuar um ensaio com um agente interferente, causando, por exemplo, uma variação significativa de pH e/ou temperatura. Caso se obtivesse um gráfico de velocidades iniciais em função da concentração de substrato em que a velocidade inicial da reacção tivesse diminuído ou mesmo desaparecido em

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  • 32 Estudo cinético da invertase da levedura

Estudo cinético da invertase da levedura relação ao ensaio cinético sem agentes interferentes, saber-se-ia que

relação ao ensaio cinético sem agentes interferentes, saber-se-ia que o enzima era responsável pela actividade catalítica. Os agentes interferentes actuariam como agentes desnaturantes dos enzimas catalíticos da reacção, de natureza proteica, perdendo assim a sua actividade devido a alteração das condições experimentais do meio.

  • 3. Um enzima que apresenta um pH óptimo a 6,8, tem uma

actividade muito reduzida a pH 4,2. Como poderia determinar se esta redução na actividade resulta de uma ionização reversível do substrato e/ou enzima ou é causada por uma desnaturação irreversível do enzima?

O pH determina o estado de ionização dos diferentes grupos constituintes dos diversos componentes do vaso reaccional, nomeadamente dos enzimas e do substrato. Variações acentuadas deste, poderão levar à impossibilidade de estabelecer ligações enzima-substrato, devido à modificação do centro activo do enzima. Estas modificações poderão ser de tal modo significativas que alteram a estrutura da proteína, pois as alterações das forças electroestáticas de diferentes grupos ionizáveis levam a um aumento da instabilidade do enzima, levando à sua desnaturação e consequente perda da actividade catalítica.

Para verificar experimentalmente se ocorreu desnaturação irreversível do enzima ou ionização reversível do substrato e/ou enzima, realizar-se-ia um ensaio cinético para um pH óptimo de 6,8. De seguida realizar-se-ia um outro ensaio adicionando um ácido, de modo a diminuir o pH até ao valor de 4,2. Analisando a velocidade da reacção, verificar-se-ia que no último ensaio ocorreria uma diminuição da mesma. Se, ao voltarmos ao pH 6,8, adicionando base, se verificasse um aumento da velocidade da reacção, significaria que tinha ocorrido uma ionização reversível do substrato e/ou enzima. Caso contrário, se a velocidade se mantivesse inalterável, significaria que tinha ocorrido uma desnaturação irreversível.

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Estudo cinético da invertase da levedura 33 4. Qual é a forma geral da curva que

Estudo cinético da invertase da levedura

33

  • 4. Qual é a forma geral da curva que representa a dependência

da velocidade de uma reacção enzimática com a temperatura do meio?

Justifique sucintamente.

A temperatura apresenta uma grande influência na catálise enzimática. Existe uma temperatura para a qual a actividade do enzima é máxima temperatura óptima diferente de enzima para enzima (Imagem 14. Efeito da temperatura na actividade enzimática.)

Esta influência sobre a cinética da reacção enzimática deve ser entendida em duas fases distintas: no princípio, aumentos de temperatura levam a aumentos da velocidade de reacção, por aumentar a energia cinética das moléculas componentes do sistema este efeito é observado num intervalo de temperatura compatível com a manutenção da estrutura espacial do enzima.

No entanto, temperaturas muito mais elevadas levam à desnaturação do enzima por alterarem as ligações químicas que mantêm a sua estrutura tridimensional. A temperatura que provoca a desnaturação está, geralmente, pouco acima da sua temperatura óptima. Deste modo, verifica-se uma diminuição da actividade enzimática à medida que a temperatura aumenta a partir da temperatura óptima.

Por outro lado, a temperaturas inferiores à temperatura óptima, a velocidade da reacção é pequena devido à existência de menor energia envolvida nas colisões entre o enzima e o substrato, originando uma menor actividade enzimática.

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