(Livro) Biologia Do Desenvolvimento - Scott Gilbert - 5 Ed

Biologia do Desenvolvimento
QUINTA EDIO
Biologia do Desenvolvimento
QUINTA EDIO
Scott F. Gilbert
Swarthmore College
Traduo e Reviso
Adolfo Max Rothschild Zuleika Rothschild Francisco A. de Moura Duarte Maria Helena Corra Marques
A capa
FOTOGRAFIA DA CAPA: O mRNA para o Fator 8 de Crescimento
Fibroblstico pode ser detectado pela hibridizao in situ da montagem total usando RNA marcado quimicamente que complementar a essa mensagem. No embrio de pinto de 3 dias, a mensagem do Fgf8 encontrada no ectoderma mais distal dos brotos dos membros, no limite entre o crebro posterior e o crebro intermedirio, nos somitos, nos arcos branquiais do pescoo e na cauda em desenvolvimento. O FGF8 importante para diversos processos desenvolvimentais e desempenha papis crticos no crescimento dos membros e na padronizao do desenvolvimento do crebro. Captulos 3, 7 e 18. (Fotografia cortesia de E. Laufer, C.-Y. Yeo e C. Tabin.)
FOTOGRAFIA DA CONTRACAPA: Fotografia de um embrio de pinto
Do original: Developmental biology, Fifth Edition Copyrigth 1997 by Sinauer Associates, Inc. Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP) (Cmara Brasileira do livro, SP, Brasil) _____________________________________ Gilbert, Scott F., 1949Biologia do desenvolvimento / Scott F. Gilbert. -5. ed. -- Ribeiro Preto, SP : FUNPEC Editora, 2003. Ttulo original : Developmental biology Vrios tradutores e revisores. Bibliografia. ISBN 85-87528-61-0 1. Biologia do desenvolvimento I. Ttulo. 03-4459 CDD-571.8 _____________________________________ ndices para catlogo sitemtico: 1. Bilogia do Desenvolvimento: Cincias da vida 571.8 Direitos para a lngua portuguesa cedidos pela Sinauer Associates, Inc. para a Fundao de Pesquisas Cientficas de Ribeiro Preto que se reserva a propriedade desta traduo. Proibida a reproduo dos textos originais, mesmo parcial e por qualquer processo, sem autorizao da editora.
de 20-21 dias nos estgios de pipping (bicando a casca internamente) e pr-ecloso. Note o revestimento peridrmico proeminente na extremidade do bico (dente do ovo), usado pelo pinto para fazer buracos na casca do ovo, a qual se tornou mais fina e mais quebradia, como uma conseqncia da utilizao de minerais pelo embrio para seu crescimento esqueltico. Esse estgio desenvolvimental marca a transio do embrio em um pinto que respira ar. Captulos 1 e 5. (Fotografia do International Poultry Journal, cortesia de R. Tuan.)
As pginas de ttulo
PGINA ESQUERDA: A expresso gnica gera limites nos discos imagi-
nais da Drosophila. Os discos grandes e pequenos dentro da larva da mosca formam as asas e os halteres, respectivamente, no adulto. Nesse estgio, a protena Apterous (vermelho) expressa somente nos compartimentos dorsais; a protena Cubitus interruptus (azul) marca os compartimentos anteriores (mas no os posteriores) (uma linha formando esse limite pode ser observada). A colorao verde (originria da protena Vestigial) no interior demarca o limite entre o membro livre e a articulao ligando-o parede torcica. Captulo 19. (Fotografia cortesia de J. Williams, S. Paddock e S. Carroll.)
PGINA DIREITA: Expresso do gene paraxis no embrio de pinto no
estgio de 6 somitos. Hibridizao in situ da montagem total usando RNA marcado com digoxygenin complementar a uma poro da mensagem paraxis do pinto mostra a expresso desse gene durante a formao do somito. A protena Paraxis importante no estabelecimento da estrutura desses grupos mesodrmicos. Captulos 2 e 9. (Montagem fotogrfica cortesia de R. Tuan.)
Para Daniel, Sarah, e David
Tabela de Contedos
PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Introduo ao desenvolvimento animal 1
O objetivo da biologia do desenvolvimento 1 Os problemas da biologia do desenvolvimento 2 Os estgios do desenvolvimento animal 3 Nossa herana eucaritica 5 Desenvolvimento entre eucariotos unicelulares 6
Controle da Morfognese no Desenvolvimento em Acetabulria 6 Diferenciao em Ameboflagelados Naegleria 10 As Origens da Reproduo Sexual 12
Genes e desenvolvimento: Introduo e tcnicas 35

As origens embriolgicas da teoria dos genes 35
Ncleo ou Citoplasma: Qual Controla a Hereditariedade? 35 O Cromossomo X como uma Ponte Entre Genes e Desenvolvimento 37
A ciso entre a embriologia e a gentica 38 Primeiras tentativas da gentica do desenvolvimento Evidncia para a equivalncia genmica 40
39
Eucariotos coloniais: A evoluo da diferenciao

As Volvocaceanas 16
16
Informaes adicionais & Especulaes

Sexo e Individualidade em Volvox 18 Diferenciao e Morfognese em Dictyostelium 21
Metaplasia 40 Clonagem de Anfibios: A Restrio da Potncia Nuclear 42 Clonagem de Anfbios: A Pluripotncia de Clulas Somticas 43

Clonando Mamferos por Prazer e Lucro 45

Evidncia e Anticorpos 25 27

Como o Grex Sabe Qual Lado Est Para Cima
Sobre E.coli e elefantes: O modelo operon Sntese diferencial de RNA 49
47
Hibridizao de cido nuclico Seqenciamento de DNA 59
54
58
Padres desenvolvimentais entre metazorios

Os Porferos 29 Protostomatas e Deuterostomatas 30
28
Clonagem de DNA genmico 55 Hibridizao de DNA: entre e intra espcies
Anlise de mRNA atravs de bibliotecas de cDNA 61 Tcnicas de localizao de RNA 63

Hibridizao In Situ 63 Transferncias Northern 64
Tabela dos Contedos
vii
Encontrando mensagens raras pela reao da polimerase em cadeia 66 Determinando a funo do gene: clulas e organismos transgnicos 69
Tcnicas de insero de DNA novo em uma clula 69 Camundongos quimricos 70 Experimentos com genes com endereamento (Gene targeting ou Knockout) 70
Identificando molculas de adeso celular e seu papel no desenvolvimento 92 Caderinas 92 CAMs da superfamlia de imunoglobulinas 95
Molculas da juno celular: protenas da juno em fenda 97 A base molecular da afinidade clula-substrato 99
Afinidade diferencial a substrato 99 A matriz extracelular 99 Receptores celulares para molculas da matriz extracelular 104 Adeso diferencial resultante de sistemas de adeso mltipla 106
Determinando a funo de uma mensagem: RNA antisense 73 Reinvestigao de velhos problemas com novos mtodos 73 Uma concluso e um alerta 75
Base celular da morfognese: Afinidade celular diferencial 79

Afinidade celular diferencial 80
O modelo termodinmico de interaes celulares
3
84
Molculas de receptores e vias de transduo de sinais 107

A via JAK-STAT 107 A via RTK-Ras 108

Evidncia para o modelo termodinmico 87
88

Mutaes negativas dominantes em receptores 110 A via do inositol fosfato 111 Cruzamentos entre vias 112 A matriz extracelular e a superfcie da clula como fontes de sinais crticos para o desenvolvimento 112 Interaes recprocas na superfcie celular 113
A base molecular das adeses clula-clula Informaes adicionais & Especulaes
88
As classes de molculas de adeso celular
Anticorpos monoclonais e gentica reversa
89
Molculas de adeso celular
92
PARTE II Padres de Desenvolvimento

Fertilizao: Iniciando um novo organismo 121
Estrutura dos gametas
Espermatozide O vulo 125
Preveno da Polispermia
140

A Ativao do Metabolismo dos Gametas 147
121
121
Ativao do metabolismo do vulo

Respostas precoces 149 Respostas tardias 151 Fuso do material gentico
149
Reconhecimento do vulo e do espermatozide: Ao distncia 128

Atrao do Espermatozide 128 Ativao Espermtica: A Reao Acrossmica no Ourio-do-Mar 129
152

A No-Equivalncia dos Proncleos de Mamferos 154
Rearranjo do citoplasma do vulo

Preparao para a Clivagem
156
158

Ao Distncia: Gametas de Mamferos 131
Reconhecimento do vulo e espermatozide: Contato de gametas 132 Reconhecimento Espcie-Especfico em Ouriosdo-Mar 132 Ligao de Gametas e Reconhecimento em Mamferos 135
Clivagem: Criando multicelularidade 167

PADRES DE CLIVAGEM EMBRIONRIA 168 Clivagem holoblstica radial 169
A holotria, Synapta Ourio-do-Mar 170 Anfbios 173 169
Fuso de gametas e a preveno da polispermia

Fuso entre as membranas do vulo e do espermatozide 139
139
Clivagem holoblstica espiral
175
viii
Tabela dos Contedos

Adaptao pela modificao da clivagem embrionria 178 Clivagem Holoblstica Bilateral 179
Mecanismos de gastrulao em aves
238
Gastrulao em mamferos
242
Clivagem holoblstica rotacional

Compactao 181
180
Modificaes para desenvolvimento dentro de outro organismo 242 Formao de membranas extra-embrionrias 245

A Superfcie da Clula e o Mecanismo de Compactao 184 Formao da massa celular interna 185 Fuga da Zona Pelcida 185
Incio do desenvolvimento vertebrado: Neurulao e ectoderma 253

FORMAO DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL Neurulao: aspectos gerais 254
186
254

Gmeos e clulas embrionrias precursoras
Clivagem Meroblstica
188
Clivagem discoidal 189 Clivagem Superficial 192

Excees, Generalizaes, e Clivagem Parastica da Vespa 195
Neurulao primria 255 A mecnica da neurulao primria 257 A formao da placa neural 257 Formao do assoalho da placa neural 258 A modelagem e dobramento da placa neural 259 Fechamento do tubo neural 260

A modelagem dorsoventral do sistema nervoso 264
MECANISMO DE CLIVAGEM 196 Regulando o ciclo da clivagem
196
197
Neurulao secundria 264 Diferenciao do tubo neural
265
265
Fator promotor de maturao
Formao das regies do crebro

MPF e Seus Reguladores 198

Determinando as regies do crebro anterior e crebro mdio 268 Arquitetura de Tecido no Sistema Nervoso Central 270 Organizao do cerebelo 272 Organizao cerebral 274
O mecanismo citoesqueltico da mitose 201 A formao de novas membranas 203
Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias 209

Gastrulao em ourio-do-mar 210
Tipos de neurnios 276 Desenvolvimento do olho em vertebrados
279
Ingresso do Mesnquima Primrio 210 Primeiro estgio da invaginao do arquntero 215 Segundo e terceiro estgios da invaginao do arquntero 217
Dinmica do desenvolvimento tico 279 Diferenciao da retina neural 280

Porque os bebs no enxergam bem Diferenciao do cristalino e da crnea 282 283
Gastrulao em peixes
218
A transio da blstula intermediria e a aquisio de motilidade celular 218 Formao das camadas germinais 220
A CRISTA NEURAL 284 A crista neural e seus derivados A crista neural do tronco 285
284
Gastrulao de anfbios
221
Movimentos celulares durante a gastrulao de anfbios 221 Posicionando o blastporo 224 Movimentos celulares e a construo do arquntero 226 Migrao do mesoderma involutivo 229
Vias de migrao das clulas da crista neural do tronco 285 A matriz extracelular e a migrao da crista neural do tronco 287

Anlise das mutaes que afetam o desenvolvimento das clulas da crista neural 290

Reguladores moleculares do desenvolvimento: Fibronectinas e as vias da migrao mesodrmica 230 Epibolia do ectoderma 232
A potncia do desenvolvimento das clulas da crista neural do tronco 291

Diferenciao final das clulas da crista neural 292
A crista neural ceflica
293
Gastrulao em aves
233
233
Generalidades sobre gastrulao em aves
Vias migratrias das clulas da crista neural ceflica 293 Potncia de desenvolvimento das clulas da crista neural ceflica 295
Tabela dos Contedos
ix
A crista neural cardaca 296 A EPIDERME E A ORIGEM DAS ESTRUTURAS CUTNEAS

A origem das clulas epidrmicas Apndices cutneos 299 297
297
Concluses
300
Incio do desenvolvimento vertebrado: Mesoderma e endoderma 341
Especificidade axnica 307

A gerao da diversidade neuronial 307
Especificao do Neurnio Motor de Vertebrado Especificao dos Neurnios Motores em Drosophila 310
8
308
MESODERMA 341 Mesoderma dorsal: A notocorda e a diferenciao dos somitos 341

Mesoderma Paraxial 341 Somitmeros e a Iniciao da Formao do Somito 343 Gerao de Tipos de Clulas Somticas 344 Miognese: Diferenciao do Msculo Esqueltico 347
Formao de padres no sistema nervoso 312 Seleo de trajetrias: Orientao pela matriz extracelular 313
Orientao pelo Terreno Fsico: Orientao por Contato 313 Orientao para Gradientes de Adeso: Haptotaxia 314 Conduo por Sinais Migratrios especficos do Axnio: A Hiptese das Trajetrias Marcadas 315 Orientao pela Repulso Especfica de Cones de Crescimento 317

Construo Muscular e a Famlia MyoD de Reguladores Transcricionais 349 Osteognese: O Desenvolvimento dos Ossos 351

Controle da Condrognese na Placa de Crescimento 357
Mesoderma da Placa Lateral
358

Sexo,Odor e Adeso Especfica 319
Seleo de trajetria: Orientao por molculas difusveis 320 Sinais para conduo mltipla 323
Neurnios Motores Vertebrados Axnios da Retina 325 323
Formao das Membranas Extra-Embrionrias 359 O Corao 361 Formao dos vasos sangneos
366

Redirecionando o Fluxo Sangneo no Mamfero Recm-nascido 372
O Desenvolvimento de clulas sangneas
373
Selees de alvos
326
Especificidades Adesivas em Diferentes Regies do Tectum 328
Seleo de endereo: Desenvolvimento dependente de atividade 331 Sobrevivncia diferencial aps a inervao: Fatores neurotrficos 331 Informaes adicionais & Especulaes
Neurnios Fetais em Hospedeiros Adultos 334
O Conceito de Clula-tronco 373 Clulas-tronco Pluripotenciais e Microambientes Hematopoticos 374 Desenvolvimento Osteoclstico 377 Locais de Hematopoiese 378
ENDODERMA 380 Faringe 380 O tubo digestivo e seus derivados
382
382
O desenvolvimento de comportamentos: constncia e plasticidade 334
Fgado, Pncreas e Vescula Biliar O Tubo Respiratrio 383
Tabela dos Contedos
PARTE III Mecanismo da Diferenciao Celular

Regulao transcricional da expresso gnica: Fatores de transcrio e a ativao de promotores especficos 391
xons e ntrons 392 Estrutura e funo do promotor
Estrutura do promotor 396 Funo do promotor 397
10
Ruptura e reorganizao de nucleossomos: o papel dos complexos de ruptura 436 Ruptura e reorganizao de nucleossomos: o papel da competio de histonas 437
Regies de controle de loco: transcrio do gene da globina 437 Informaes adicionais & Especulaes
Trocas no gene de globina 440
394
Metilao de DNA e atividade gnica
442

RNA polimerase e os fatores trans-reguladores no promotor 399
Correlaes entre metilao do promotor e inatividade gnica 442 Metilao e a manuteno dos padres de transcrio 443
Estrutura e funo dos intensificadores
402

Metilao e impresso gnica 444
Necessidade de intensificadores 402 Funo do intensificador: Modelos temporais e espaciais de transcrio 403
Fatores de transcrio: Os trans-reguladores dos promotores e dos intensificadores 404

Protenas de homeodomnio 405 Os fatores de transcrio POU 406
Compensao de dosagem do cromossomo X de mamferos 446 Informaes adicionais & Especulaes

O mecanismo de inativao do cromossomo X 449
Associao do DNA ativo com a matriz nuclear
451

Regulao da transcrio dos genes de cadeia leve das imunoglobulinas 409 Fatores de transcrio bsicos do tipo hlice-alahlice 415
Ligao da cromatina ativa a uma matriz nuclear 451 Topoisomerases e a transcrio gnica 453 Isoladores e domnios 454 Resumo 455

Regulando as protenas bHLH miognicas: Governando a troca entre proliferao e diferenciao de clulas musculares 416 Fatores de transcrio do zper bsico da leucina 416
Controle do desenvolvimento pelo processamento e traduo diferencial do RNA 461
12

Armadilhas do intensificador: natural e experimental 418 Fatores de Transcrio Dedo de Zinco 420 Receptores Nucleares de Hormnios e Seus Elementos Responsivos a Hormnios 420
CONTROLE DO DESENVOLVIMENTO PELO PROCESSAMENTO DIFERENCIAL DE RNA 461 Controle do desenvolvimento precoce pela seleo de RNA nuclear 462 Os mecanismos de emenda de RNA: Spliceosomes 465 Emenda alternativa do RNA: Criando protenas alternativas a partir do mesmo gene 466
Um gene, Muitas Protenas Relacionadas 466 Processamento Alternativo de RNA e Determinao Sexual em Drosophila 468 Uso Disseminado do Processamento de RNA para o Controle da Expresso Gnica 471
Protenas que dobram o DNA 423 Ativao dependente de contexto ou silenciamento 423 Regulao da atividade do fator de transcrio 425
Regulao transcricional da expresso gnica: A ativao da cromatina 431

Acessibilidade a fatores trans-reguladores Stios hipersensveis DNAase I 434
11
431
432
Nucleossomos e a ativao da cromatina reprimida
REGULAO DA TRADUO DOS PROCESSOS DESENVOLVIMENTAIS 471 Mecanismos da traduo eucaritica 472 Controle da sntese protica pela longevidade diferencial do mRNA 474
Degradao Seletiva de mRNAs 475
Controle da traduo de mensagens do ocito
476
Tabela dos Contedos
xi
Caracterizao de RNAs Mensageiros Armazenados em Ocitos 477

A Ativao do Genoma Embrionrio 488

Determinando o Destino Celular por Meio do mRNA Localizado do Ocito 480
Regulao dos genes da traduo em larvas e adultos 490

Determinao de Gametas em C. elegans 490 RNA Antisenso Natural 491 Disjuntores do Controle da Traduo 492 Editorao do RNA 493
Mecanismos para a regulao da traduo das mensagens dos ocitos 481

A Hiptese da Mensagem Materna Mascarada 482 A Hiptese da Cauda Poli(A) 483 A Hiptese da Eficincia da Traduo 486 Outros sistemas de ativao do mRNA: Mensagens sem Cap e Mensagens Seqestradas 486
Controle da traduo e sntese protica coordenada: Produo de Hemoglobina 494 Eplogo: Regulao Ps-traduo 497
PARTE IV Especificao do Destino Celular e os

Eixos Embrionrios
Especificao celular autnoma por determinantes citoplasmticos 505
Comprometimento celular e diferenciao Pr-formao e epignese 507
Os Teratologistas Franceses 509
13
510
A gentica da especificao axial em Drosophila 543
14
505
Especificaes autnomas em embries de tunicados
Resumo do desenvolvimento de Drosophila 543 AS ORIGENS DA POLARIDADE NTERO-POSTERIOR 545 Viso Panormica 545 Os genes de efeito materno 546
Evidncia Embriolgica da Regulao da Polaridade pelo Citoplasma do Ocito 546 O Modelo Molecular: Gradientes Proticos no Embrio Precoce 547
O determinante formador de msculos do crescente amarelo 511 Especificao citoplasmtica das linhagens endodrmicas e epidrmicas e o eixo nteroposterior 514

Modelos de Gradientes da Informao Posicional 551 Evidncia que o Gradiente da Protena Bicoid Constitui o Centro de Organizao Anterior 552 O Centro de Organizao Posterior: Localizando e Ativando o Produto de nanos 556 O Grupo Gene Terminal 557
Localizao citoplasmtica em embries de moluscos 515

O lbulo polar 517
Especificao celular no nematdeo Caenorhabditis elegans 521

Controle maternal da identidade do blastmero: O controle gentico das clulas progenitoras farngeas de C. elegans 524 Regulao em C. elegans 527
Os genes da segmentao
559

Ser ou No Ser: Esse o Fentipo 529
Divises celulares assimtricas no desenvolvimento tardio 530 Localizao citoplasmtica de determinantes de clulas germinativas 531
Determinao de clulas germinativas em nematdeos 531 Determinao da clula germinativa em insetos Componentes do plasma polar da Drosophila Determinao de clulas germinativas em anfbios 536
Uma Viso Panormica 559 Os Genes de gap 561 Os Genes pair-rule 563 Os Genes de Polaridade Segmentar
565
Os genes de Seleo hometica
569
532 534
Padres de Expresso dos Genes Hometicos 569 Iniciando os Padres da Expresso dos genes Hometicos 572 Mantendo os Padres de Expresso dos genes Hometicos 572 Os Elementos Cis-Reguladores e o Complexo Bithorax 574
Resumo
538
xii
Tabela dos Contedos

Regulao Molecular do Desenvolvimento: As Protenas do Homeodomnio 576
Induo de especificidade mesodrmica ventral e lateral 612
A criao da atividade do organizador
613
613
A GERAO DA POLARIDADE DORSOVENTRAL EM DROSOPHILA 577 A protena Dorsal: Morfgeno para a polaridade dorsoventral 577
Translocao da Protena Dorsal 577
Protenas secretadas do organizador

BMP4 e a lagosta de Geoffroy 616 Fatores de transcrio induzidos no organizador 619
Provendo o sinal assimtrico para a translocao da protena Dorsal 578

Sinal do Ncleo do Ocito para as Clulas Foliculares 578 Sinalizao das Clulas Foliculares para o Citoplasma do Ocito 580 O Estabelecimento do Gradiente da Protena Dorsal 581

Como o Organizador Neuraliza o Ectoderma? 621
A especificidade regional de induo
621
621
A determinao das diferenas regionais O modelo do duplo gradiente 623 Correlatos moleculares da caudalizao neural 624
PRIMRDIOS DE RGOS E EIXOS 585 O modelo de coordenadas cartesianas e a especificao dos primrdios dos rgos 585 Resumo: Alguns princpios do desenvolvimento da Drosophila 586

Sinais verticais e horizontais do organizador 626 Genes homeobox na especificao neural 628
Competncia e cascatas indutivas 628
Especificao do destino celular por interaes clula-clula progressivas 591

Desenvolvimento regulativo 591 Testando a teoria do plasma germinativo 592
15
Estabelecimento dos eixos corporais em mamferos e aves 635

Iniciando o eixo ntero-posterior 635
16
August Weismann: A teoria do plasma germinativo 592 Wilhelm Roux: Desenvolvimento em mosaico 593 Hans Driesch: Desenvolvimento Regulativo 594 Sven Hrstadius: Potncia e gradientes em ocitos 597 Formao de um organismo integrado: Restringindo a potncia das clulas vizinhas 598
Estabelecendo um Centro de Nieuwkoop 635 Expresso Gnica em Tecidos Organizadores 636
Especificando o eixo ntero-posterior de mamfero: A hiptese do cdigo Hox 637

Homologia dos Complexos de Genes Hometicos entre Drosophila e Mamferos 637 Expresso de Genes Hox no Sistema Nervoso Central e seus Derivados 638 Anlise Experimental de um Cdigo Hox: Gene Alvo 640 Transformao Parcial de Segmentos por Eliminao de Genes Hox Expressos no Tronco 642 Anlise Experimental do Cdigo Hox: Teratognese do cido Retinico 643 Evidncia para um Cdigo Hox da Anatomia Comparada 645
Regulao durante o desenvolvimento de anfbios
600
Hans Spemann: Determinao progressiva das clulas embrionrias 600 Hans Spemann e Hilde Mangold: Induo embrionria primria 603
O centro de Nieuwkoop
606
A formao do centro de Nieuwkoop e a polaridade mesodrmica 606 A especificao da polaridade dorsoventral na fertilizao 607

Animais como Variaes sobre o Mesmo Tema Desenvolvimental 646
A base molecular da induo mesodrmica
609
Estabelecendo a regionalizao dorsal: o possvel papel da -catenina 609 O funcionamento do centro de Nieuwkoop: funes para Vg1 e Noggin 610
Eixos dorsoventral e esquerdo-direito em mamferos e aves 647
Tabela dos Contedos
xiii
PARTE V Interaes Celulares Durante a

Formao do rgo
Interaes proximais de tecidos: Induo secundria 655
Interaes instrutivas e permissivas Competncia e receptores 656 Fatores parcrinos 657 655
17
658
de crescimento dos fibroblastos como indutores do broto do membro 704 Induo da crista ectodrmica apical 704
Produo do eixo prximo-distal dos membros
706
Os Fatores de Crescimento Fibroblstico A famlia hedgehog 659 A famlia Wnt 660 A superfamlia TGF- 661 Sinalizao Justcrina 662
A crista ectodrmica apical: O componente ectodrmico 706 A zona progressiva: O componente mesodrmico 708 Genes Hox e a especificao do eixo prximodistal do membro 709 Interaes entre a AER e a zona progressiva 711 Mutaes nas interaes entre a zona progressiva e a AER 711
Interaes epitlio-mesnquima
663
663 666 667 668

A regenerao dos membros da salamandra e a reteno do eixo prximo-distal 714
Especificidade Regional da Induo Especificidade Gentica da Induo
Cascatas de induo embrionria: Induo do cristalino 667

Os Fenmenos da Induo do Cristalino A Base Celular da Induo do Cristalino Formao da Crnea 672
Especificao do eixo ntero-posterior dos membros 716

A zona de atividade polarizante 716 Sonic hedgehog como definidor da ZPA 717 Interaes entre a AER e a ZPA para integrar crescimento e padro 718 Especificando a ZPA 721
Formao de rgos parenquimatosos 672

Morfognese do Rim de Mamfero 673 Os Mecanismos da Organognese Renal 676

Diferenciao Coordenada e Morfognese no Dente 682
A produo do eixo dorsoventral 721 Distinguindo o membro anterior do membro posterior 722 Informaes adicionais & Especulaes
Lies de limbless 724
Mecanismos de ramificao na formao de rgos parenquimatosos 683

A Matriz Extracelular como um Elemento Crtico na Ramificao 684 Fatores Parcrinos Efetuando Padres de Ramificao 686
Morte celular e a formao de dgitos 724 Informaes adicionais & Especulaes

Evoluo do membro tetrpode 726
Induo ao nvel de uma nica clula
687
Induo Vulvar no Nematide Caenorhabditis elegans 690
Interaes celulares distncia: Hormnios como mediadores do desenvolvimento 733

Metamorfose: o direcionamento hormonal do desenvolvimento 733 Metamorfose anfbia 734
19

Interaes Clula-Clula e Possibilidade na Determinao de Tipos Celulares 692
Desenvolvimento do membro de tetrpode 701

Padronizao no membro 701 Formao do broto do membro 702
18
Controle hormonal da metamorfose de anfbios 735 Respostas Moleculares aos Hormnios da Tireide Durante a Metamorfose 740

Heterocronia 743
Metamorfose em insetos
746
746
O campo do membro 702 Especificao dos campos do membro: Genes Hox e cido retinico 703 Crescimento do broto de membro precoce: fatores
Everso e Diferenciao dos Discos Imaginais

A determinao dos discos imaginais da perna e da asa 750 Remodelao do sistema nervoso 753
xiv
Tabela dos Contedos
Controle Hormonal da Metamorfose de Insetos

A biologia Molecular da Atividade da Hidroxiecdisona 757
754
Hermafroditismo
795
795
Hermafroditismo no Nematide C. elegans Hermafroditismo em Peixes 797

Controle ambiental sobre a forma e a funo da larva 761
Determinao ambiental do sexo
798
Interaes hormonais mltiplas no desenvolvimento da glndula mamria 762

Estgio embrionrio Adolescncia 765 Gravidez e lactao 762 765
Determinao Sexual Dependente de Temperatura em Reptis 798 Determinao Sexual Dependente da Localizao em Bonellia viridis e Crepidula fornicata 799
Resumo
800
Determinao do sexo 773

Determinao Sexual Primria 774 Determinao Secundria do Sexo 774 As Gnadas em Desenvolvimento 775
20
Regulao ambiental do desenvolvimento animal 805
21
806
Determinao cromossmica do sexo em mamferos 774
REGULAO AMBIENTAL DO DESENVOLVIMENTO NORMAL Sugestes ambientais usadas pelos organismos para completar seus desenvolvimentos 806
A colonizao larval 806 Refeies de sangue 808 Simbiose no desenvolvimento
Determinao sexual primria dos mamferos: Genes cromossmicos Y para a determinao dos testculos 777
SRY: O Determinante Sexual do Cromossomo Y 778
808
Diferenas ambientais previsveis como sugestes para o desenvolvimento 810

Sazonalidade e sexo: Afdios e Volvox Diapausa 812 810
Determinao sexual primria em mamferos: Genes autossmicos na determinao de testculos 780

SOX9: Reverso Autossmica na Displasia Campomlica 780 SF1: A Ligao Entre SRY e as Trajetrias Desenvolvimentais Masculinas 780
Plasticidade fenotpica: Polifenismo e regras de reao 813

Polifenismo sazonal em borboletas 814 Polifenismo nutricional 816 Determinao sexual dependente do ambiente
Determinao sexual primria em mamferos: Desenvolvimento ovariano 781

DAX1: Um Potencial Gene Determinante de Ovrio no Cromossomo X 781 Wnt4a: Um Potencial Gene Determinante de Ovrio em um Autossomo 781
817
Fatores ambientais imprevisveis controlando o desenvolvimento animal 818

Defesas induzveis contra a predao 819 Plasticidade fenotpica e mudanas no ambiente 820

Assimilao Gentica 821
Determinao sexual secundria em mamferos

Regulao Hormonal do Fentipo Sexual Testosterona e Diidrotestosterona 783 Hormnio Anti-Mlleriano 784 O Sistema Nervoso Central 785
782
782
A contnua plasticidade do desenvolvimento
822
O sistema imune: Desenvolvimento no adulto 822 Aprendizado: Um sistema nervoso adaptvel ao ambiente 823

O Desenvolvimento de Comportamentos Sexuais 787
DISTRBIOS AMBIENTAIS DO DESENVOLVIMENTO NORMAL Malformaes e distrbios 827 Agentes teratognicos 828
cido retinico como um teratognico 829 Talidomida como um teratognico 830 lcool como um teratognico 833 Outros agentes teratognicos 835
827
Determinao sexual cromossmica em Drosophila 788

A Via do Desenvolvimento Sexual 788 O Gene Sex-lethal como o Piv para a Determinao do Sexo 790 Os Genes transformer 793 doublesex: O Gene Comutador da Determinao Sexual 793 Genes-alvo para a Cascata de Determinao Sexual 794

Estrgenos Ambientais 836
Interaes gentica-ambiental Resumo 837
837
Tabela dos Contedos
xv
A saga da linhagem germinativa 843

Migrao das clulas germinativas 843
Migrao das Clulas Germinativas em Anfbios 843 Migrao das Clulas Germinativas em Mamferos 844
22
Mecanismos desenvolvimentais da mudana evolucionria 883

Unidade de Tipo e Condies de Existncia
A Sntese de Charles Darwin 883 E. B.Wilson e F. R. Lillie 885
23
883
A evoluo do desenvolvimento precoce: E. Pluribis Unum 885

A emergncia dos embries 885 Formao de um Novo Filo: Modificando os Caminhos do Desenvolvimento 887

Teratocarcinomas e Clulas-Tronco Embrionrias 847 Migrao de Clulas Germinativas em Aves e Rpteis 848 Migrao de Clulas Germinativas Primordiais em Drosophila 849
Modularidade: O pr-requisito para mudana evolutiva atravs do desenvolvimento 891

Modularidade 891 Dissociao: Heterocronia e Alometria Duplicao e Divergncia 893 Co-opo 894 Progresso correlacionada 896 891
Meiose 850 Informaes adicionais & Especulaes

Grandes Decises: Mitose ou Meiose? Espermatozide ou vulo? 853
Restries ao desenvolvimento
898
Espermatognese
855
857
Espermiognese

Expresso Gnica Durante o Desenvolvimento do Espermatozide 858
Restries Fsicas 898 Restries Morfogenticas 898 Restries Filticas 899 Evoluo Conjunta do Ligante e Receptor: Isolamento Reprodutivo 901
Oognese
860
Meiose oognica 860 Maturao do Ocito em Anfibios 861 Concluso da meiose: Progesterona e Fecundao 864 Transcrio Gnica em Ocitos 865 Oognese Merostica em Insetos 867
O mecanismo gentico do desenvolvimento da mudana evolucionria: Genes reguladores homlogos 902

Pax6 e o desenvolvimento do olho 902 BMP4 e a Morfognese dos Membros 904 Genes Hox e a Evoluo dos Vertebrados 905 Genes Hox e a Evoluo dos Artrpodes 907 Caminhos homlogos do desenvolvimento 909

A Origem dos Eixos Embrionrios de Drosophila Durante a Oognese 869 Oognese em Mamferos 870
Criando novos tipos de clulas: O mistrio evolucionrio bsico 911 Uma nova sntese evolucionria 912

O Reincio da Meiose nos Ocitos de Mamferos 875
Fontes Para as Citaes das Aberturas dos Captulos C-1 ndice de Autores IA-1 ndice de Assuntos IA-2 ndice de Abreviaturas IA-3
Prefcio
s ltimos anos do sculo 20 encontram a biologia do desenvolvimento retornando posio que ela ocupou no incio do sculo: a disciplina que unifica os estudos da hereditariedade, evoluo e fisiologia. Em 1896, a primeira edio de B. Wilson do The Cell in Development and Inheritance anunciou a verdade maravilhosa que uma nica clula pode conter em seu interior sua extenso microscpica da soma-total da herana das espcies. Hoje, a biologia do desenvolvimento est na vanguarda desse estudo de nossa herana natural. Nos seus aspectos moleculares, ela toca a qumica fsica na sua investigao dos mecanismos bioqumicos pelos quais protenas diferentes so produzidas em clulas diferentes do mesmo genoma. Ela tambm est na liderana dos estudos evolucionrios que procuram entender como mudanas macroevolucionrias ocorreram. Ela abriu recentemente uma rea nova da biologia do desenvolvimento ecolgico, onde mudanas ambientais so vistas criando alteraes no desenvolvimento do organismo. Durante os ltimos 3 anos, a biologia do desenvolvimento tambm expandiu para a medicina, fundindo-se com a gentica clnica para criar uma cincia revitalizada da embriologia humana, uma cincia que j se tornou importante na explanao das malformaes congnitas. A quinta edio do Biologia do Desenvolvimento foi revisada e reescrita para refletir essas revolues que esto acontecendo. Aconteceram quatro mudanas importantes na estrutura do livro desde sua ltima edio. Primeiro, tornou-se impossvel discutir os princpios fundamentais da embriologia sem o conhecimento da atividade gnica ou vias da transduo de sinais. Portanto, essa informao foi trazida dentro da seo introdutria do livro de modo que interaes celulares, tais como fertilizao e induo, podem ser apreciadas tanto no mbito molecular quanto no morfolgico. Segundo, novo interesse nos efeitos do ambiente no desenvolvimento normal e anormal conduziu a um novo captulo. O Captulo 21, Regulao Ambiental do Desenvolvimento Animal, diz respeito s vias pelas quais o meio ambiente afeta o fentipo do organismo. Interesse na proteo ambiental e em controvrsias envolvendo a possibilidade de poluentes teratognicos foraram uma nova percepo das influncias que o meio ambiente representa no desenvolvimento normal e anormal. Na verdade, os biologistas do desenvolvimento podem rapidamente encontrar-se frente dos movimentos da conservao ecolgica. As primeiras quatro edies deste livro buscaram integrar abordagens molecular, celular e orgnica biologia do desenvolvimento; esta edio adiciona a dimenso ecolgica. Terceiro, esta edio introduz novas nfases nos papis dos fatores parcrinos no desenvolvimento. No somente os estudos da transduo de sinais esto colocados na seo introdutria deste livro, como a Parte V
Prefcio
xvii
da Quinta Edio inicia com uma viso geral das famlias do fator de crescimento fibroblstico, TGF-, Wnt e Hedgehog dos fatores de crescimento e diferenciao. Quarto, este livro est conectado a um website onde estudantes e professores podem encontrar mais material em muitos tpicos selecionados. Tal material inclui (1) detalhes de experimentos que so extremamente especializados para serem colocados no texto, (2) informao histrica sobre reas particulares da biologia do desenvolvimento e personalidades envolvidas, (3) implicaes mdicas de fenmenos particulares do desenvolvimento, (4) debates ou comentrios em questes relevantes para o campo, e (5) atualizaes do material do texto nessa rea da biologia de crescimento cada vez mais rpido. Filmes e entrevistas gravadas esto includas e esses artigos de destaque podero ser expandidos medida que a tecnologia os tornar mais fceis para serem usados. Esse website est conectado tambm a outros websites e podem ser usados para enriquecer a perspectiva de algum sobre o que est acontecendo no desenvolvimento animal. A presena de um website nos permite manter o direcionamento deste livro s pessoas para as quais isso foi originalmente pretendido: estudantes dos ltimos anos da graduao e do incio da ps-graduao. Ele tambm me ajudou a no deixar o livro tornar-se um substituto para peso de papel. A viso de Roux foi que a biologia do desenvolvimento algum dia constituiria a base de todas as outras disciplinas biolgicas e, em continuada simbiose com essas disciplinas, desempenharia uma parte proeminente nas solues dos problemas da vida. Essas foram palavras audaciosas, at mesmo arrogantes h cem anos atrs; hoje, elas expressam uma aceitao amplamente sustentada. O desenvolvimento integra todas as reas da biologia e desempenha um papel crucial em relacionar o gentipo ao fentipo. O desenvolvimento pode ser estudado usando qualquer organismo e em qualquer nvel de organizao, de molculas a filos. medida que o campo continuar a se expandir e se aprofundar , uma palavra de advertncia requerida: a biologia do desenvolvimento no pode ser aprendida ou ensinada em um nico semestre. Este texto uma tentativa para prover cada pessoa com material suficiente para seu curso, mas um instrutor no necessita se sentir culpado por no determinar todos os captulos, e os estudantes no necessitam se sentir privados se eles no lerem todos os captulos. Isto o comeo do caminho, no sua concluso.
Como usar o website

Qualquer pessoa pode entrar no website atravs de sua homepage [http://zygote.swarthmore.edu/index.html] ou atravs da sua lista de arquivos de captulos localizada no [http://zygote.swarthmore.edu/info.html]. Alternativamente, ns colocamos acessos especficos endereados em todo o livro onde quer que exista uma entrada relevante no momento da publicao. Todos esses endereos comeam com [http://zygote.swarthmore.edu/] e so seguidos por um cdigo dado no livro texto. Assim, a localizao especificada na pgina 20 do livro : http://zygote.swarthmore.edu/intro2.html Mais localizaes esto sendo adicionadas no website, e essas podem ser acessadas entrando nos arquivos do captulo. Em adio, clicando no boto Outros Arquivos abaixo de cada captulo, as conexes para outros websites sero facilitadas. Divirta-se.
xviii
Prefcio
Agradecimentos
Esta edio, como suas precursoras, deve muito s sugestes e crticas dos estudantes em minhas classes de biologia do desenvolvimento e gentica do desenvolvimento. O grupo de funcionrios e docentes extremamente corporativo da Universidade Swarthmore tambm desempenharam papis importantes na produo deste livro, e os bibliotecrios da rea de cincia E. Horikawa e M. Spencer merecem agradecimentos especiais por terem segurado volumes recentes na biblioteca enquanto eu estava escrevendo o livro. Os cientistas que revisaram estes captulos forneceram enorme ajuda tanto na preciso tcnica dos captulos quanto nas sugestes para trabalho futuro. Esses investigadores incluem: S. Carroll, J. CebraThomas, E. M. De Robertis, S. DiNardo, E. Eicher, C. Emerson, G. Grunwald, D. J. Grunwald, M. Hollyday, L. A. Jaffe, W. Katz, R. Keller, K. Kemphues, D. Kirk, G. Martin, H. F. Nijhout, D. Page, R. Raff, R. Schultz, C. Stern, S. Tilghman, R. Tuan e M. Wickens. Eu tambm quero agradecer aos muitos cientistas que desviaram do seu caminho para ajudar a tornar esta edio melhor lendo pores especficas dos captulos. Eles incluem: M. BronnerFraser, J. Fallon, N. M. Le Douarin, E. McCloud, J. Opitz, K. Sainio, H. Sariola, I. Thesleff e T. Valente. Se eu deixei algum fora, por favor me desculpem. desnecessrio dizer que os julgamentos editoriais finais foram de minha responsabilidade. Meus agradecimentos especiais a Judy Cebra-Thomas que no somente me aconselhou em certos captulos mas quem deu excelente ajuda durante meu perodo sabtico permitindo-me terminar este livro. Agradecimentos tambm aos cientistas e filsofos, especialmente: C. van der Weele, R. Amundson, L. Nyhart, R. Burian, H. F. Nijhout, A. F. Sterling, K. Smith e A. I. Tauber, que participaram nos workshops de biologia do desenvolvimento da Sociedade Internacional para a Histria, Filosofia e Estudos Sociais da Biologia. Algumas das melhores crticas construtivas deste livro-texto vieram dessas pessoas. Andy Sinauer uma vez mais conseguiu reunir as mesmas e extraordinrias pessoas neste projeto, e foi um privilgio trabalhar com eles. Meus agradecimentos a ele e aos editores Nan Sinauer e Carol Wigg, coordenador de produo Chris Small, artistas John Woolsey e Gary Welch, designer Susan Schmidler, editor de texto Janet Greenblatt, e artista de layout Janice Holabird. As habilidades editoriais de Tinsley Davis so extremamente reconhecidas. Devido ao fato de que os prazos finais devem ser cumpridos e outro trabalho posto de lado, eu tenho que agradecer minha famlia por mais uma vez me permitir prosseguir com isso. Em particular, este livro nunca poderia ter sido completado se no fosse pelo encorajamento de minha esposa, Anne Raunio, que, como uma obstetra, gosta do lado mais prtico da biologia do desenvolvimento. Meus agradecimentos a todos vocs.
SCOTT F. GILBERT 1 DE MARO DE 1997
Introduo Biologia do Desenvolvimento

1 Introduo ao desenvolvimento animal 1 35 79 2 Genes e desenvolvimento: Introduo e tcnicas 3 Base celular da morfognese: Afinidade celular diferencial
CAPTULO 1 Introduo ao Desenvolvimento Animal
Introduo ao desenvolvimento animal
A natureza parece nunca mudar, ainda que sua aparncia esteja sempre mudando. nosso dever como artistas transmitir juntamente com todos os seus elementos a emoo dessa permanente transformao. Paul Cezanne (ca. 1900) Feliz a pessoa que consegue discernir as causas das coisas. Virglio (37 A.C.)
CONCEITO DE EMBRIO assombroso, e a formao de um embrio a
tarefa mais rdua que algum haver de realizar. Para se tornar um embrio, voc teve que construir a si mesmo a partir de uma nica clula. Teve que respirar antes que tivesse pulmes, digerir alimentos antes que seus rgos estivessem formados, construir ossos a partir de uma massa e ordenar os neurnios antes mesmo de adquirir a capacidade de pensar. Uma diferena marcante entre voc e a mquina que a mquina nunca requisitada para uma funo antes que esteja terminada. Todo animal tem que estar em funcionamento enquanto se auto-constri.
O objetivo da biologia do desenvolvimento

Para plantas e animais, o nico caminho para o desenvolvimento a partir de uma clula, desenvolvendo um embrio. O embrio o intermedirio entre o gentipo e o fentipo, ou seja, entre os genes herdados e o organismo adulto. Enquanto a maior parte da biologia estuda a estrutura adulta e funo, a biologia do desenvolvimento encontra maior interesse nos estgios mais transitrios. Biologia do desenvolvimento a cincia do vir a ser, a cincia do processo. Dizer que um inseto efmero vive apenas um dia no significa nada para um biologista do desenvolvimento, porque o inseto pode ser adulto apenas por um dia, mas passou outros 364 dias como um embrio e larva. As questes levantadas por um biologista do desenvolvimento so freqentemente questes mais ligadas ao vir a ser do que ao ser propriamente dito. Dizer que mamferos XX so geralmente fmeas e mamferos XY so geralmente machos, no explica a determinao sexual para um biologista do desenvolvimento. Esse quer saber como o gentipo XX produz um ser feminino e como o gentipo XY produz um ser masculino. Da mesma maneira, um geneticista gostaria de saber como os genes globina so transmitidos de uma gerao outra, e um fisiologista pode fazer perguntas sobre a funo da globina no corpo. Porm, o biologista do desenvolvimento pergunta porque os genes globina se expressam somente nas hemcias e como essas se tornam ativas apenas em certas fases do desenvolvimento (ainda no sabemos as respostas). Biologia do desenvolvimento uma cincia excelente para pessoas que querem integrar diferentes nveis da biologia. Diante de um problema, podemos estud-lo a 1
nveis molecular e qumico (p. ex., Como os genes globina so transcritos, e como os fatores que ativam sua transcrio interagem uns com os outros e com o DNA?), a nveis celular e tissular (p. ex., Quais so as clulas capazes de produzir globina, e como o mRNA da globina deixa o ncleo?), a nvel de rgos ou sistema de rgos (p. ex., Como vasos capilares so formados em cada tecido, e como so instrudos a se conectarem e ramificarem?) e, at mesmo, a nveis ecolgicos e evolucionrios (p. ex., Como diferenas na ativao do gene globina permitem o fluxo de oxignio da me para o feto, e como fatores ambientais acionam a diferenciao de mais hemcias?). Biologistas do desenvolvimento podem estudar qualquer organismo e todo tipo de clula. Biologia do desenvolvimento um dos campos que mais tem crescido e tambm um dos mais emocionantes da biologia. Parte dessa emoo vem dos assuntos estudados, porque estamos apenas comeando a entender o mecanismo molecular do desenvolvimento animal. Outra parte da emoo vem do papel unificador que a biologia do desenvolvimento assume nas cincias biolgicas. A biologia do desenvolvimento est criando uma estrutura que integra a biologia molecular, fisiologia, biologia celular, anatomia, pesquisa do cncer, neurobiologia, imunologia, ecologia, e biologia evolucionria. O estudo do desenvolvimento tornou-se essencial para a compreenso de qualquer rea da biologia.
Os problemas da biologia do desenvolvimento

O desenvolvimento realizado por duas funes principais: gera diversidade e ordem celular dentro de cada gerao, o que assegura a continuidade da vida que passa de uma gerao outra. Assim, existem duas questes fundamentais para a biologia do desenvolvimento: Como um ovo fertilizado origina um ser adulto, e como esse ser adulto produz um outro ser? Cada espcie tem suas prprias respostas, mas algumas generalizaes podem ser feitas. Tradicionalmente, essas questes tm sido subdivididas em quatro problemas gerais da biologia do desenvolvimento: O problema da diferenciao. Uma nica clula, o ovo fertilizado, se desenvolve e gera centenas de clulas de diferentes tipos - clulas musculares, clulas epidrmicas, neurnios, linfcitos, clulas do sangue, clulas gordurosas, e assim por diante. Essa gerao de diversidade celular chamada diferenciao. Desde que cada clula do corpo contm o mesmo conjunto de genes, precisamos entender como esse mesmo conjunto de instrues genticas pode produzir diferentes tipos de clulas. O problema da morfognese. Nossas clulas diferenciadas no so distribudas aleatoriamente; pelo contrrio, so organizadas em intrincados tecidos e rgos. Esses rgos esto dispostos de tal maneira que: dedos esto nas pontas e no no meio de nossas mos, os olhos esto na nossa cabea e no nos ps ou intestinos. Essa criao de forma ordenada, chamada morfognese. Como as clulas se auto-organizam e formam um arranjo correto? O problema do crescimento. Somos maiores do que um ovo, mas como as clulas sabem quando devem parar de se dividir? Se cada clula de nossa face realizasse mais uma diviso celular, seramos considerados horrivelmente mal formados. Se cada clula de nossos braos tivesse realizado apenas mais uma srie de divises, poderamos amarrar nossos sapatos sem nos abaixar. O problema da reproduo. O espermatozide e o vulo so clulas muito especializadas. Somente eles podem transmitir instrues para produzir um organismo de uma gerao para outra. Como essas clulas so separadas para formar a prxima gerao, e quais as informaes no ncleo e no citoplasma que permitem tal funcionamento? Recentemente, tem-se dado grande nfase a um quinto problema: O problema da evoluo. A evoluo envolve mudanas herdadas durante o desenvolvimento. Quando dizemos que o cavalo de um dedo s de hoje, teve um ancestral de cinco dedos, estamos dizendo que mudanas no desenvolvi-
mento da cartilagem e dos msculos ocorreram ao longo de muitas geraes de embries nos ancestrais do cavalo. Como mudanas no desenvolvimento criam novas formas de corpo? Quais modificaes hereditrias so possveis, dadas as restries impostas pela necessidade do organismo sobreviver enquanto se desenvolve?
Os estgios do desenvolvimento animal

De acordo com Aristteles, o primeiro grande embriologista da histria, a cincia comea com a curiosidade: graas a curiosidade que as pessoas comearam a filosofar, e a curiosidade permanece desde o incio do conhecimento. O desenvolvimento de um ser a partir do ovo tem sido motivo de admirao atravs da histria da humanidade. O simples procedimento de se abrir um ovo de galinha a cada dia do seu perodo de incubao de trs semanas proporciona uma notvel experincia quando se observa desde uma fina camada de clulas at o total desenvolvimento da ave. Aristteles realizou esse procedimento e observou a formao dos principais rgos. Qualquer um pode se admirar com esse fenmeno, ainda que ordinrio, mas cientistas so os que procuram descobrir como o desenvolvimento realmente ocorre. E ainda mais do que dissipar essa admirao, novo conhecimento s faz aument-la. Organismos pluricelulares no se formam de imediato, ao contrrio, so formados por um processo relativamente lento de mudana progressiva, o qual chamamos de desenvolvimento. Em quase todos os casos, o desenvolvimento de um organismo pluricelular comea com uma nica clula - ovo fertilizado ou zigoto, que dividido atravs da mitose, produz todas as clulas do corpo. O estudo do desenvolvimento animal tem sido tradicionalmente chamado de embriologia, se referindo ao fato de que entre a fertilizao e o nascimento, o organismo em desenvolvimento conhecido como embrio. Mas o desenvolvimento no cessa no nascimento, ou mesmo na vida adulta, porque a maioria dos organismos nunca pra de se desenvolver. A cada dia ns repomos mais de um grama de clulas de pele (fazendo com que as clulas mais velhas se desprendam assim que nos movemos), e nossa medula ssea sustenta o desenvolvimento de milhes de novos eritrcitos a cada minuto de nossas vidas. Portanto, nos ltimos anos tem sido comum se falar em biologia do desenvolvimento, como a disciplina que estuda processos embrionrios e outros do desenvolvimento. As principais caractersticas do desenvolvimento animal esto ilustrados na Figura 1.1. A vida de um novo indivduo iniciada pela fuso do material gentico de dois gametas, o espermatozide e o vulo. Essa fuso, chamada fertilizao, estimula o ovo a iniciar o desenvolvimento. Os estgios subseqentes do desenvolvimento so coletivamente chamados de embriognese. Por todo reino animal existe uma incrvel variedade de tipos embrionrios, mas a maioria dos padres de embriognese compreende variaes em quatro temas: 1. Ocorrncia de clivagem imediatamente aps a fertilizao. Clivagem uma srie de divises mitticas extremamente rpidas, onde o enorme volume citoplasmtico do zigoto dividido em numerosas clulas menores. Essas clulas so chamadas blastmeros e, ao fim da clivagem, eles geralmente formam uma esfera conhecida como blstula. 2. Aps a reduo na taxa de diviso mittica, os blastmeros passam por mudanas dramticas quanto s suas posies, um em relao ao outro. Essa srie de redistribuio de clulas chamada de gastrulao. Como resultado da gastrulao, o embrio tpico contm trs regies celulares chamadas camadas germinativas*. O ectoderma, a camada exterior, produz as clulas da epiderme e do sistema nervoso; o endoderma, camada interior, produz o
*Do Latim germen, significa broto ou rebento (a mesma raiz da palavra germinao). Os nomes das trs camadas germinativas so do Grego: ectoderma de ektos (fora) mais derma (pele); mesoderma de mesos (meio) e endoderma de endon (dentro).
Espermatozide Mrula Blstula Ocito Clula germinativa (Germ plasm) Ocito (gameta feminino) GAMETOGNESE Adulto sexualmente maduro Blastporo Gnada Ectoderma Mesoderma Estgios larvais imaturos Endoderma Local das clulas embrionrias Blastocele
Espermatozide (gameta masculino)
INCUBAO (NASCIMENTO)
Figura 1.1
Histrico do desenvolvimento de um representante animal, um sapo. Estgios que vo da fertilizao at o nascimento so coletivamente conhecidos como embriognese. As regies responsveis por produzir clulas embrionrias so mostradas em cores. Gametognese, que completa no adulto sexualmente maduro, comea em pocas diferentes, dependendo da espcie.
revestimento do tubo digestivo e rgos associados (pncreas, fgado, pulmes, etc.); e o mesoderma, camada do meio, d origem a diversos rgos (corao, rins, gnadas), tecidos conjuntivos (ossos, msculos, tendes, vasos sangneos) e clulas sangneas. 3. Uma vez que as trs camadas embrionrias esto estabelecidas, as clulas interagem umas com as outras e se reorganizam para produzir tecidos e rgos. Esse processo chamado organognese. (Nos vertebrados, a organognese iniciada quando uma srie de interaes celulares induzem as clulas ectodrmicas da poro mediana do dorso a formar o tubo neural. Esse tubo originar o crebro e a coluna vertebral). Muitos rgos contm clulas de mais de uma camada embrionria, e no incomum o exterior de um rgo ser derivado de uma determinada camada e o interior de outra. Tambm durante a organognese,
algumas clulas sofrem longas migraes do seu lugar de origem at sua localizao final. Essas clulas migrantes incluem os precursores das clulas sangneas, clulas linfticas, clulas pigmentadas e gametas. A maior parte dos ossos de nossa face so provenientes de clulas que migraram ventralmente da regio dorsal da nossa cabea. 4. Como observado na Figura 1.1, em muitas espcies, uma parte especializada do citoplasma do ovo d origem s clulas que so precursoras dos gametas. Essas clulas so chamadas de clulas germinativas, sendo destinadas funo reprodutiva. Todas as outras clulas do corpo so chamadas clulas somticas. Essa separao entre clulas somticas (que do origem a um corpo individual) e clulas germinativas (que contribuem para a formao de uma nova gerao) freqentemente uma das primeiras diferenciaes que ocorrem durante o desenvolvimento animal. As clulas germinativas finalmente migram para as gnadas, onde se diferenciam em gametas. O desenvolvimento de gametas, chamado de gametognese, normalmente no completado at que o organismo tenha se tornado fisicamente maduro. Na maturidade, os gametas podem ser liberados e participar de uma fertilizao dando incio a um novo embrio. O organismo adulto finalmente sofre envelhecimento e morre.
Nossa herana eucaritica

Os organismos esto divididos em dois grupos principais, dependendo apenas se as clulas possuem um envoltrio nuclear ou no. Os procariotos (do grego karion, significa ncleo), onde esto includas as arqueobactrias e as eubactrias, no possuem um ncleo verdadeiro. Os eucariotos que incluem os protistas, animais, plantas e fungos, possuem um tegumento nuclear bem formado circundando os seus cromossomos. Essa diferena fundamental entre os eucariotos e procariotos influencia a maneira como esses grupos organizam e utilizam seu material gentico. Em ambos os grupos, a informao herdada necessria para o seu desenvolvimento e metabolismo se encontra codificada nas sequncias de cido desoxirribonuclico (DNA) dos cromossomos. Os cromossomos procariticos normalmente so hlices duplas de DNA, pequenas e circulares consistindo de aproximadamente 1 milho de pares de bases. As clulas eucariticas geralmente possuem diversos cromossomos, e um simples protista eucaritico possui 10 vezes, ou mais, a quantidade de DNA encontrada na maioria dos procariotos complexos. Alm disso, a estrutura de um gene eucaritico mais complexa do que a de um gene procaritico. A seqncia de aminocidos de uma protena procaritica a reflexo direta da seqncia de DNA do cromossomo. O DNA de um gene eucaritico que codifica uma protena, geralmente, dividido de tal forma que a seqncia completa de aminocidos da protena derivada de segmentos descontnuos de DNA (Figura 1.2). O DNA entre os segmentos freqentemente contm seqncias que esto envolvidas na regulao do momento e lugar em que o gene ativado. Cromossomos eucariticos tambm so muito diferentes dos cromossomos procariticos. O DNA eucaritico reveste complexos proticos especficos, chamados nucleossomos, compostos por protenas histonas. Os nucleossomos organizam o DNA em estruturas compactas e so importantes na designao de qual gene ir se expressar em qual clula. Nas bactrias no existem histonas. Mais ainda, clulas eucariticas sofrem mitose, na qual o tegumento nuclear se parte e os cromossomos replicados so igualmente divididos entre as clulas filhas (Figura 1.3). Nos procariotos, a diviso celular no mittica; no se desenvolve o fuso mittico e, tambm, no existe tegumento celular para se partir. Ao invs disso, os cromossomos filhos permanecem ligados a pontos adjacentes na membrana celular. Esses pontos de ligao so separados entre si pelo crescimento da membrana celular, e finalmente colocam os cromossomos em diferentes clulas filhas.
Figura 1.2
(A) CLULA PROCARITICA
(B) CLULA EUCARITICA Envoltrio nuclear
Resumo dos passos pelos quais as protenas so sintetizadas a partir do DNA. (A) Expresso procaritica (bacteriana) do gene. Regies codificadoras do DNA so colineares com o produto protico. (B) Expresso de genes eucariticos. Os genes so descontnuos e um envoltrio nuclear separa o DNA do citoplasma.
Gene DNA xon 1
ntron 1 xon 2
ntron 2 xon 3 Ncleo
Transcrio Transcrio RNA nuclear
mRNA Traduo Citoplasma mRNA
Processamento de RNA mRNA Traduo mRNA
Protena
Protena
Procariotos e eucariotos tm mecanismos diferentes de regulao do gene. Em ambos, o DNA transcrito por enzimas chamadas RNA polimerases para produzir RNA. Quando o RNA mensageiro (mRNA) produzido nos procariotos, ele imediatamente traduzido em uma protena enquanto o seu outro terminal est sendo transcrito do DNA (Figura 1.4). Sendo assim, nos procariotos, transcrio e traduo so eventos simultneos e coordenados. Mas a existncia de envoltrio nuclear em eucariotos proporciona a oportunidade de se obter um tipo de regulao celular totalmente novo. Os ribossomos, que so responsveis pela traduo, esto de um lado do envoltrio nuclear, e o DNA e a RNA polimerase necessria para a transcrio esto do outro. Entre a transcrio e a traduo, o RNA transcrito deve ser processado para que possa passar atravs do envoltrio nuclear. A regulao pela qual o mRNA pode passar para o citoplasma, torna a clula capaz de selecionar quais das mensagens recm-sintetizadas sero traduzidas. Assim, um novo nvel de complexidade foi adicionado, que extremamente importante para o organismo em desenvolvimento.
Desenvolvimento entre eucariotos unicelulares

Todos os organismos eucariticos pluricelulares se desenvolveram de protistas unicelulares. nesses protistas que as caractersticas bsicas do desenvolvimento apareceram primeiro. Eucariotos simples nos deram os primeiros exemplos da morfognese direcionada pelo ncleo, o uso da superfcie da clula para mediar cooperao entre clulas individuais e as primeiras ocorrncias de reproduo sexual. Controle da Morfognese no Desenvolvimento em Acetabulria H um sculo, ainda no havia sido provado se o ncleo continha alguma informao hereditria ou de desenvolvimento. Algumas das melhores evidncias para essa teoria vieram de estudos onde organismos unicelulares foram fragmentados em pedaos
Prfase: O envoltrio nuclear quebra e um fuso se forma entre dois centrolos.
Interfase: DNA duplicado em preparao para a diviso celular. Cromatdeos do cromossomo Cromatina Nuclolo Regio do centrmero Fuso em desenvolvimento Centrolos ster Envoltrio nuclear Nuclolo Envoltrio nuclear rompe
Prometfase: Os cromossomos se ligam s fibras dos fusos.
Ncleo
Cromossomos filhos Metfase: Os cromossomos se alinham no equador da clula. Telfase: Os cromossomos atingem os plos mitticos e a clula comea a invaginar. Anfase: Os cromossomos duplicados (chamados cromatdeos) so separados.
Figura 1.3
nucleados e anucleados (reviso por Wilson, 1986). Quando vrios protistas foram fragmentados, quase todas as partes morreram. No entanto, os fragmentos que continham ncleo foram capazes de sobreviver, regenerando todo a complexa estrutura celular (Figura 1.5) O controle nuclear da morfognese celular e a interao do ncleo e citoplasma esto muito bem demonstrados nos estudos da Acetabulria. Essa enorme clula individual (2 a 4 cm de comprimento) consiste de trs partes: o disco reprodutivo, o pednculo e o rizide (Figura 1.6A). O rizide est localizado na base da clula onde essa presa ao substrato. O ncleo individual da clula se localiza dentro do rizide. O tamanho da Acetabulria e a localizao do seu ncleo permitiram que pesquisadores
Diagrama de mitose em clulas animais. Durante a interfase o DNA duplicado em preparao para a diviso celular. Durante a prfase, o envoltrio nuclear quebra e forma-se um fuso entre os dois centrolos. Na metfase, os cromosssomos se alinham no equador da clula e se inicia a anfase, os cromossomos duplicados (cada duplicata de cromossomo um cromatdeo) so separados. Na telfase os cromossomos atingem os plos mitticos e a clula comea a invaginar. Cada plo contm o mesmo nmero e tipos de cromossomos que continha a clula antes da diviso.
DNA
Ribossomos
RNA
Figura 1.4
Transcrio e traduo simultnea em procariotos. Uma poro de DNA de Escherichia coli se estende horizontalmente por essa microfotografia eletrnica. Transcries de RNA mensageiro podem ser vistas dos dois lados. Ribossomos se juntaram ao mRNA e esto sintetizando protenas (que no podem ser vistas). O mRNA pode ser visto aumentando de tamanho, da esquerda para a direita, indicando a direo da transcrio. (Cortesia de O. L. Miller, Jr.)
removessem o ncleo de uma clula e o substitusse por outro, de outra clula. Nos anos 30, J. Hmmerling tirou proveito dessa singular caracterstica e trocou ncleos entre duas espcies morfologicamente distintas, A. mediterranea e A. crenulata. Como mostrado na fotografia, essas duas espcies tm discos reprodutivos muito diferentes. Hmmerling descobriu que quando um ncleo de uma determinada espcie era transplantado para o pednculo de outra, o novo disco em formao finalmente assumia a forma associada com o ncleo do doador (Figura 1.6B). Assim, foi considerado que o ncleo era o controlador do desenvolvimento da Acetabulria. A formao de um disco reprodutivo um evento morfognico complexo, envolvendo a sntese de um grande nmero de protenas, que devem ser acumuladas em certa poro da clula e ento organizadas em estruturas complexas especficas da espcie. O ncleo transplantado da clula realmente direciona a sntese de seu disco reprodutivo espcie-especfico, mas uma tarefa que pode levar semanas para ser realizada. Alm disso, se o ncleo for removido da clula de Acetabulria em estgio inicial do desenvolvimento, antes de formar o disco reprodutivo, um disco normal se formar semanas depois, ainda que o organismo ir morrer. Esses estudos sugerem que (1) o ncleo contm informao especfica sobre o tipo de disco reprodutivo produzido (isto , contm informao gentica que especifica as protenas necessrias para a produo de um certo tipo de disco reprodutivo), e (2) o material contendo essa informao entra no citoplasma muito antes dessa produo ocorrer. A informao no citoplasma no ser usada por vrias semanas.
Fragmento anucleado morre Corte Ncleo Fragmento nucleado se regenera
Corte
Figura 1.5
Regenerao do fragmento nucleado do protista unicelular Stylonychia. Os fragmentos anucleados sobrevivem por algum tempo, mas finalmente morrem.
Fragmento anucleado morre
(B) Disco reprodutivo
(A) Disco reprodutivo
Pednculo A. crenulata Pednculo A. mediterranea Ncleos transplantados
Ncleo
Ncleo
Rizide Rizide 1 cm Rizide 1 cm A estrutura do disco reprodutivo a do ncleo doador
Figura 1.6
(A) Acetabulria mediterranea (esquerda) e A. crenulata (direita). Cada unidade uma clula singular. O rizide contm o ncleo. (B) Efeitos da troca de ncleos entre duas espcies de Acetabulria. Ncleos foram transplantados para fragmentos de rizides anucleados. Estruturas de A. crenulata esto sombreadas; estruturas de A. mediterranea no esto sombreadas. (Fotografias cortesia de H. Harris.)
Uma hiptese atual, proposta para explicar essas observaes, que o ncleo sintetiza um mRNA estvel, posicionado em estado dormente no citoplasma at a formao do disco reprodutivo. Essa hiptese amparada por uma observao publicada por Hmmerling em 1934. Hmmerling fracionou uma Acetabulria jovem em diversas partes (Figura 1.7). A poro com o ncleo finalmente formou um novo disco, conforme esperado; da mesma forma o fez a extremidade apical do pednculo. No entanto, a parte intermediria do pednculo no formou o disco reprodutivo. Por isso, Hmmerling postulou (aproximadamente 30 anos antes de sabermos da existncia do mRNA), que as instrues para a formao do disco reprodutivo se originavam no ncleo, sendo de alguma forma guardadas dormentes prximo extremidade do pednculo. Muitos anos mais tarde, Kloppstech e Schweiger (1975) estabeleceram que o mRNA derivado do ncleo se acumula nessa regio. Ribonuclease, uma enzima que cliva RNA, inibe completamente a formao do disco reprodutivo quando adicionada gua marinha na qual cresce a Acetabulria. Em clulas anucleadas, esse efeito permanente; uma vez que o RNA destrudo, no pode mais haver a formao do disco reprodutivo. Em clulas nucleadas, no entanto, um novo disco pode ser formado aps a eliminao da ribonuclease, presumivelmente porque um novo mRNA ento produzido pelo ncleo. Garcia e Dazy (1986) tambm demonstraram que a sntese da protena especialmente ativa no pice da Acetabulria. Fica claro pela discusso anterior, que a transcrio nuclear tem um papel importante na formao do disco reprodutivo da Acetabulria. Mas deve ser notado que o
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Disco reprodutivo e pednculo regenerados Extremidade apical do pednculo
Poro central do pednculo
Sem regenerao
Rizide e ncleo
Regenerao total
Figura 1.7
Habilidade regenerativa de diferentes fragmentos da A. mediterranea
citoplasma tambm cumpre uma parte essencial na formao desse disco. O mRNA no traduzido durante semanas, mesmo estando no citoplasma. Algo no citoplasma controla quando as mensagens devem ou no ser utilizadas. Portanto, a expresso do disco reprodutivo controlada no somente pela transcrio nuclear como tambm pelo controle de traduo do RNA citoplasmtico. Nesse organismo unicelular, o desenvolvimento controlado em ambos estgios de transcrio e de traduo. Diferenciao em Ameboflagelados Naegleria Um dos casos mais marcantes de diferenciao em protistas, aquele de Naegleria gruberi. Esse organismo ocupa um lugar especial na taxonomia protista porque pode mudar sua forma, de uma ameba para a de um flagelado (Figura 1.8). Durante a maior parte do seu ciclo de vida, a N. gruberi uma ameba tpica, alimentando-se de bactrias do solo e dividindo-se por ciso. No entanto, quando as bactrias so diludas (tanto pela gua da chuva quanto pela gua nos experimentos), cada N. gruberi desenvolve rapidamente uma forma aerodinmica e dois longos flagelos anteriores, que so usados para encontrar regies mais abundantes em bactrias. Nessas condies, ao invs de existirem diversos tipos de clulas diferenciadas em um nico organismo, essa clula nica tem estruturas celular e bioqumica diferentes nos diferentes estgios de sua vida. Diferenciao para a forma de flagelado ocorre aproximadamente em uma hora (Figura 1.9). Durante esse perodo, a ameba tem que criar centrolos para servir como corpos basais do flagelo (centros organizadores de microtbulos), assim como criar o prprio flagelo. Os corpos basais e os flagelos so compostos de diversas protenas, das quais a mais abundante a tubulina. As molculas de tubulina so organizadas em microtbulos; esses so posteriormente arranjados para permitir o movimento flagelar. Fulton e Walsh (1980) mostraram que a tubulina dos flagelos de Naegleria no existe
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(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 1.8
em seu estgio de ameba. produzida de novo (desde o comeo), comeando com uma nova transcrio no ncleo. Para mostrar isso, os pesquisadores manipularam transcries em vrios estgios com actinomicina D, uma droga antibitica que seletivamente inibe a sntese do RNA. Quando adicionada anteriormente diluio do alimento, esse antibitico previne a sntese da tubulina. No entanto, se a actinomicina D adicionada 20 minutos aps a diluio, a tubulina ainda produzida em tempo normal (aproximadamente 30 minutos mais tarde). Portanto, parece que o mRNA para a tubulina foi produzido durante os primeiros vinte minutos aps a diluio e usado logo em seguida. Essa interpretao foi confirmada quando foi demonstrado que o mRNA extrado da ameba no continha mensagem alguma, detectvel para tubulina flagelar, ao passo que mRNA extrado de clulas diferenciadas continha muitas mensagens desse tipo (Walsh, 1984). Ento, temos aqui um excelente exemplo de controle transcricional de um processo de desenvolvimento: O ncleo da Naegleria responde a mudanas ambientais sintetizando o mRNA para tubulina flagelar. Notamos tambm um outro processo que permanece extremamente importante no desenvolvimento de todos os outros animais e plantas, que o agrupamento de molculas de tubulina para a produo do flagelo. Esse arranjo, pelo qual a tubulina polimerizada em microtbulos, e esses por sua vez agrupados de forma ordenada, visto em toda a natureza. Em mamferos, est evidente no flagelo do espermatozide e nos clios da medula espinhal e do trato respiratrio. Mais ainda, no somente a tubulina que produz o flagelo. Existem em torno de 300 outras protenas em cada flagelo, e o movimento flagelar depende da orientao adequada dessas protenas uma em relao a outra. At mesmo processos celulares tm a sua prpria morfognese baseada em interaes moleculares entre os fragmentos de protena. Tal controle ps-traduo, onde uma protena no funcional at que esteja ligada a outras molculas, ser discutido melhor mais tarde. Vimos ento, que o desenvolvimento em eucariotos unicelulares pode ser controlado nos estgios de transcrio, traduo e ps-traduo.
Transformao de Naegleria gruberi da forma amebide ao estado flagelado. Linha superior corada com Iodo/Lugol; linha inferior corada com um anticorpo fluorescente protena tubulina dos microtbulos. A transformao iniciada pela eliminao do alimento (bactrias) da colnia de Naegleria. (A) 0 minutos; (B) 25 minutos, mostrando sntese de nova tubulina; (C) 70 minutos, emergncia de flagelos visveis (D) 120 minutos, mostrando flagelos maduros e forma aerodinmica do corpo (de Walsh, 1984, cortesia de C. Walsh.)
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Figura 1.9
Diferenciao do fentipo flagelado em Naegleria. Amebas que vinham crescendo em um meio enriquecido com bactria so lavadas afim de se eliminar as bactrias no tempo 0. Aos 80 minutos, praticamente toda a populao desenvolveu flagelo. (Segundo Fulton, 1977.)
a lin bu a tu e da m e co es r nt l a S a g e fl
am o de rp r n to s co ela ca o en al n t is de lag m ula m ve os e pa cl nda is o a f el r i m u v a m ag gr s, o m or os A asai rred Fl o m p l el or f c ta b a F m ag se to Fl co
co
rp
os
100
Porcentagem da populao com flagelo
80 Clulas de corpo com forma flagelar
60
40
20
0 0 20 40 60 Tempo aps suspenso (minutos) 80 100
Figura 1.10
Sexo em bactrias. Algumas clulas de bactrias esto cobertas de numerosos apndices (pilos) sendo capazes de transmitir genes para uma clula recipiente (sem pilos) atravs de um pilus sexual. Nessa figura, o pilus sexual est realado por partculas virais que se ligam especificamente quele estrutura. (Cortesia de C. C. Brinton, Jr. e J. Carnahan.)
As Origens da Reproduo Sexual A reproduo sexual outra inveno dos protistas que teve um profundo efeito em organismos mais complexos. Deve-se notar que sexo e reproduo so dois processos separveis e distintos. A reproduo envolve a criao de novos indivduos. Sexo envolve a combinao de genes de dois indivduos distintos em um novo arranjo. Reproduo na ausncia de sexo uma caracterstica de organismos que se reproduzem por ciso; no h discriminao nos genes quando uma ameba se divide ou quando uma hidra brota clulas para formar uma nova colnia. Sexo sem reproduo tambm comum entre os organismos unicelulares. As bactrias so capazes de transmitir genes de um indivduo para o outro por meio dos pilos sexuais (Figura 1.10). Essa transmisso independente da reproduo. Protistas so tambm capazes de reorganizar genes sem reproduo. Os paramcios, por exemplo, se reproduzem por ciso, mas o sexo realizado atravs de conjugao. Quando dois paramcios se juntam, eles se unem atravs de seus aparelhos orais formando uma conexo citoplasmtica atravs da qual podem trocar material gentico (Figura 1.11). Cada macroncleo (que controla o metabolismo do organismo) degenera enquanto o microncleo passa por meiose para produzir oito microncleos haplides, dos quais todos, exceto um, degeneram. O microncleo remanescente divide-se mais uma vez para formar um microncleo estacionrio e um microncleo migratrio. Cada microncleo migratrio atravessa a ponte citoplasmtica e se funde com o microncleo estacionrio (fertilizante), criando um novo ncleo diplide em cada clula. Esse ncleo diplide se divide mitoticamente fazendo surgir um novo microncleo e um novo macroncleo quando os dois parceiros se separam. Ainda que no tenha ocorrido reproduo, houve sexo.
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Microncleo Macroncleo
Fuso meitico
Ponte citoplasmtica Dois paramcios formam ponte citoplasmtica Microncleos passam por meiose, formando 8 ncleos haplides por clula; macroncleos degeneram Todos menos um dos microncleos de cada parceiro degeneram
Microncleo estacionrio Microncleo migratrio Microncleo restante se divide para formar um microncleo estacionrio e um migratrio Microncleos migratrios atravessam a ponte citoplasmtica e fertilizam os microncleos estacionrios do parceiro Ncleo diplide se forma e sofre divises mitticas para gerar um novo macroncleo e dois microncleos quando os paramcios se separam
Figura 1.11
Unio de paramcios atravs da ponte citoplasmtica, onde dois paramcios podem trocar material gentico, deixando cada um com genes que diferem daqueles com os quais iniciaram o processo. (Strickberger, 1985.)
A unio desses dois processos distintos, sexo e reproduo, em reproduo sexual, visto em eucariotos unicelulares. A Figura 1.12 mostra o ciclo de vida da Chlamydomonas. Esse organismo geralmente haplide, portando apenas uma cpia de cada cromossomo (como os gametas dos mamferos). Os indivduos de cada espcie, no entanto, esto divididos em dois grupos de parceiros: mais e menos. Quando se encontram, juntam-se os citoplasmas e seus ncleos se fundem para formar um zigoto diplide. Esse zigoto a nica clula diplide do ciclo de vida e passar por meiose para formar quatro novas clulas de Chlamydomonas. Aqui est uma reproduo sexual, pois cromossomos so realinhados durante as divises meiticas onde mais indivduos so formados. Note que nesse tipo de reproduo sexual protista, os gametas so morfologicamente idnticos e a distino entre espermatozide e vulo ainda no aconteceu. Com a evoluo da reproduo sexual, dois importantes avanos foram alcanados. O primeiro o mecanismo da meiose (Figura 1.13), pelo qual o complemento diplide dos cromossomos reduzido ao estado haplide (discutido em detalhe no Captulo 22). O outro avano o mecanismo pelo qual os parceiros reprodutivos diferentes se reconhecem um ao outro. Em Chlamydomonas, o reconhecimento ocorre primeiro nas membranas flagelares (Figura 1.14; Bergman et al., 1975; Goodenough e Weiss, 1975). A aglutinao dos flagelos permite que regies especficas das membranas celulares se juntem. Esses setores especializados contm componentes reprodutivos especficos que permitem a fuso dos citoplasmas. Seguindo-se aglutinao, os indivduos mais iniciam a fuso estendendo um tubo de fertilizao.
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Figura 1.12
Reproduo assexual (mittica) Parceiro tipo mais (haplide) Parceiro tipo menos (haplide)
Reproduo sexual em Chlamydomonas. Duas linhagens, ambas haplides, podem se reproduzir assexuadamente quando separadas. Respeitando certas condies, os dois cordes podem se unir para produzir uma clula diplide que pode sofrer meiose para formar quatro novos organismos haplides. (Segundo Strickberger, 1985.)
Reproduo sexual Acasalamento
Fuso citoplasmtica
Zigoto (diplide)
Maturao (meiose)
Germinao Dois parceiros tipo mais e tipo menos
Figura 1.13
Sumrio da meiose. O DNA e as protenas associadas replicam durante a interfase. Durante a prfase, o envoltrio nuclear se rompe e os cromossomos homlogos (cada cromossomo duplicado, com os cromatdeos juntos no centrmero) se alinham em pares. Reagrupamentos cromossmicos podem ocorrer entre quatro cromatdeos homlogos nesse estgio. Aps a primeira metfase, os dois cromossomos homlogos originais so segregados em clulas diferentes. Durante a segunda diviso, o centrmero se divide, deixando cada nova clula com uma cpia de cada cromossomo.
MEIOSE I Envoltrio nuclear Ncleo Cromossomos homlogos Cromatdeos homlogos
Cromatina
Interfase
Prfase I precoce
Meia prfase I
Prfase I tardia
Metfase I
O envoltrio nuclear se rompe e cromossomos homlogos (cada cromossomo sendo duplo, com os cromatdeos ligados no centrmero) se alinham aos pares. Rearranjos cromossmicos podem ocorrer entre os quatro cromatdeos homlogos neste momento.
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(A)
(B)
Figura 1.14
Microfilamentos
Duas etapas do reconhecimento no acasalamento de Chlamydomonas. (A) Varredura por micrografia eletrnica (7000x) de par em acasalamento. Os flagelos que interagem, torcemse um em torno do outro, aderindo nas pontas (flexas). (B) Microfotografia eletrnica de transmisso (20.000x) de uma ponte citoplasmtica conectando os dois organismos. Os microfilamentos se estendem da clula doadora (abaixo) para a clula recipiente (acima). (de Goodenough e Weiss, 1975 e Bergman et al., 1975; com permisso de U. Goodenough.)
Esse tubo conecta e se funde com um local especfico no indivduo menos. interessante que o mecanismo usado para estender esse tubo - polimerizao da protena actina - tambm usado para estender processos do espermatozide e vulo do ourio-do-mar. No Captulo 4, veremos que o reconhecimento e fuso de espermatozide e vulo ocorrem de uma maneira espantosamente semelhante a desses protistas. Eucariotos unicelulares parecem ter os elementos bsicos do processo de desenvolvimento que caracterizam os organismos mais complexos: a sntese celular controlada pela regulao transcricional, por traduo e ps-traduo; existe um mecanismo para processar o RNA atravs da membrana nuclear; as estruturas de genes individuais e cromossomos so como sero atravs da evoluo eucaritica; mitose e meiose so aperfeioadas; e a reproduo sexual existe, envolvendo a cooperao entre clulas individuais.Tal cooperao intercelular se torna ainda mais importante com a evoluo de organismos multicelulares.
MEIOSE II
Anfase I
Telfase I Os dois cromossomos homlogos originais so segregados em clulas diferentes
Metfase II
Anfase II O centrmero se divide
Telfase II Cada nova clula tem uma cpia de cada cromossomo
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Eucariotos coloniais: A evoluo da diferenciao

Um dos mais importantes experimentos da evoluo foi a criao de organismos pluricelulares. Parece ter havido diversos caminhos pelo qual uma nica clula evoluiu para uma disposio pluricelular; discutiremos apenas dois deles (veja o Captulo 23 para uma discusso mais completa). O primeiro caminho envolve a diviso ordenada da clula reprodutiva e a subseqente diferenciao da sua prognie em diferentes tipos de clulas. Esse caminho para a multicelularidade pode ser visto em uma notvel srie de organismos pluricelulares, coletivamente referidos como a famlia das Volvocaceas ou volvocaceanas. As Volvocaceanas Os organismos mais simples entre as volvocaceanas so reunies ordenadas de numerosas clulas, cada uma parecida ao protista unicelular Chlamydomonas. Um nico organismo de volvocacea do gnero Gonium (Figura 1.15), por exemplo, consiste de uma placa plana contendo de 4 a 16 clulas, cada uma com seu prprio flagelo. Em um gnero relacionado, Pandorina, 16 clulas formam uma esfera; e no Eudorina, a esfera contm 32 ou 64 clulas organizadas em um padro regular. Nesses organismos, um princpio muito importante tem-se desenvolvido: a diviso ordenada de uma clula para gerar um nmero de clulas que so organizadas de uma maneira previsvel. Como ocorre na maioria dos embries animais, as divises celulares pelo qual uma nica clula de volvocacea produz um organismo de 4 a 64 clulas ocorrem em uma seqncia muito rpida e com ausncia de crescimento celular. Os dois prximos gneros da srie volvocacea exibem um outro princpio importante do desenvolvimento: a diferenciao de tipos celulares em organismo individual. As clulas reprodutivas se diferenciam das clulas somticas. Em todos os gneros j mencionados, toda a clula pode, e normalmente o faz, produzir um organismo novo completo por mitose (Figura 1.16 A,B). Nos gneros Pleodorina e Volvox, porm, relativamente poucas clulas podem se reproduzir. Na Pleodorina californica, as clulas da regio anterior so restritas uma funo somtica; somente aquelas
Figura 1.15
Representante da ordem dos Volvocales. (A) o protista unicelular Chlamydomonas reinhardtii. (B) Gonium pectorale com oito clulas Chlamydomonas-smiles em um disco convexo. (C) Pandorina morum. (D) Eudorina elegans. (E) Pleodorina californica. Aqui todas as 64 clulas so originalmente similares, mas as posteriores desdiferenciam e rediferenciam como clulas assexuadas reprodutivas chamadas gondios, enquanto as clulas anteriores permanecem pequenas e biflageladas, como o Chlamydomonas. (F) Volvox carteri. Aqui, clulas destinadas a se tornarem gondios so separadas no comeo do desenvolvimento e nunca desenvolvem caractersticas somticas. As clulas menores, somticas, lembram Chlamydomonas. Todas, menos o Chlamydomonas, so membros da famlia das Volvocaceas. A complexidade aumenta do Chlamydomonas unicelular ao Volvox pluricelular. Barra em A de 5m; BD, 25m; E, F, 50m (Cortesia de D. Kirk.)
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
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Figura 1.16
(A)
(B)
(C)
Reproduo assexuada nas volvocaceanas. (A) Colnia madura de Eudorina elegans. (B) Cada uma das clulas de E. elegans se divide e produz uma nova colnia. (C) Volvox carteri maduro. A maioria das clulas so incapazes de se reproduzir. Clulas germinativas (gondia) comearam a se dividir em novos organismos. (A e B segundo Hartmann,1921; C de Kirk et al., 1982, cortesia de D. Kirk.)
clulas do lado posterior podem se reproduzir. Em P. californica, a colnia normalmente tem 128 ou 64 clulas, e a relao do nmero de clulas somticas para o nmero de clulas reprodutivas normalmente 3:5. Dessa maneira, uma tpica colnia de 128 clulas tem 48 clulas somticas e uma colnia de 64 clulas tem 24 clulas somticas. Nos Volvox, quase todas clulas so somticas, e muito poucas clulas so capazes de produzir novos indivduos. Em algumas espcies de Volvox, clulas reprodutivas como as da Pleodorina, so derivadas de clulas que originalmente parecem e funcionam como clulas somticas antes de crescer e se dividir para formarem uma nova prognie. No entanto, em outros membros do gnero, como o V. carteri, existe uma diviso do trabalho completa: as clulas reprodutivas que vo criar a nova gerao so colocadas de lado durante a diviso das clulas reprodutivas que esto formando um novo indivduo. As clulas reprodutivas nunca desenvolvem um flagelo funcional e nunca contribuem para motilidade e outras funes somticas do indivduo; so inteiramente especializadas para reproduo. Ainda que as volvocaceas mais simples sejam consideradas organismos coloniais (porque cada clula capaz de existncia independente e perpetuao da espcie), no V. carteri temos um organismo verdadeiramente celular com dois tipos de clulas independentes e distintos (somtico e reprodutivo), ambos requeridos para a perpetuao da espcie (Figura 1.16C). Embora nem todos os animais separem suas clulas reprodutivas das clulas somticas (e as plantas raramente o fazem), essa separao de clulas germinativas das clulas somticas no incio do desenvolvimento caracterstica de muitos filos animais e ser discutida em maior detalhe no Captulo 13. Embora todas as volvocaceas, incluindo seu parente unicelular Chlamydomonas, se reproduzam predominantemente por meios assexuados, tambm so capazes de reproduo sexual. Isso envolve a produo e fuso de gametas haplides. Em muitas espcies de Chlamydomonas, incluindo a ilustrada na Figura 1.12, a reproduo sexual isogmica, j que os gametas haplides que se encontram so similares em tamanho, estrutura e motilidade. No entanto, em outras espcies de Chlamydomonas - assim como as vrias espcies de volvocaceas coloniais - gametas nadadores de diversos tamanhos so produzidos por parceiros de acasalamentos diferentes. Isso chamado heterogamia. Mas as volvocaceas maiores desenvolveram uma forma especializada de heterogamia, chamada oogamia, que envolve a produo de vulos grandes e relativamente imveis por um parceiro do acasalamento e espermatozides pequenos e mveis pelo outro parceiro (veja Vises Colaterais & Especulaes). Aqui vemos um gameta especializado para reteno de recursos nutricionais e de desenvolvimento e outro gameta especializado para transporte de ncleos. Assim, as volvocaceas incluem os organismos mais simples que tm macho e fmea distinguveis, e possuem caminhos diferentes para desenvolver o vulo ou o espermatozide. Em todas as volvocaceas, a reao da fertilizao se assemelha do Chlamydomonas porque resulta na produo de um zigoto diplide dormente, inativo, capaz de sobreviver a condies ambientais severas. Quando as condies permitem aos zigotos germinar, eles primeiro sofrem meiose para produzir herdeiros haplides dos dois parceiros em nmeros iguais. [other.html#intro1]
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Informaes adicionais
&
Especulaes
Sexo e Individulidade em Volvox
imples como , o Volvox compartilha muitos traos que caracterizam o ciclo de vida e histrico de desenvolvimento de organismos muito mais complexos, incluindo ns mesmos. Como j foi mencionado, o Volvox est entre os organismos mais simples a exibir a diviso de trabalho entre dois tipos de clulas diferentes. Como conseqncia disso, est entre os organismos mais simples a incluir a morte como uma parte regular, geneticamente programada, da sua histria de vida.
Morte e Diferenciao Organismos unicelulares que se reproduzem atravs de uma simples diviso celular, tais como as amebas, so potencialmente imortais. A ameba que vemos sob um microscpio no tem ancestrais mortos! Quando uma ameba se divide, nenhuma das duas clulas resultantes pode ser considerada ancestral ou prognie; elas
so parentes. A morte chega para uma ameba apenas se ela ingerida ou sofre um acidente fatal; quando isso acontece, a clula morta no deixa prole. Porm, a morte se torna uma parte essencial da vida para qualquer organismo pluricelular que estabelece diviso de trabalho entre clulas somticas e clulas germinativas (reprodutivas). Considere o histrico de vida do Volvox carteri quando se reproduz assexuadamente (Figura 1.17). Cada adulto assexuado um esferide contendo aproximadamente 2000 pequenas clulas somticas biflageladas ao longo de sua periferia e por volta de 16 grandes clulas reprodutivas assexuadas, chamadas gondios, dispostas em umas das extremidades do interior. Quando maduro, cada gondio divide-se rapidamente 11 ou 12 vezes. Parte dessa diviso assimtrica e produz as 16 clulas grandes que iro se tornar um novo
conjunto de gondios. No fim da clivagem, todas as clulas que estaro presentes no adulto, foram produzidas de cada um dos gondios. Mas o embrio est virado de dentro para fora: seus gondios esto do lado de fora e os flagelos de suas clulas somticas esto apontando para o interior da esfera oca de clulas. Essa condio adversa corrigida por um processo chamado inverso, pelo qual o embrio se vira com o lado certo para fora atravs de movimentos celulares que fazem lembrar movimentos de gastrulao no embrio animal (Figura 1.18). Um agrupamento de
Figura 1.17
Embriognese Adulto com juvenis Adulto com gondios maduros
Expanso de adultos e juvenis
Reproduo assexual em V. carteri. Quando as clulas reprodutivas (gondios) esto maduras, entram em um estado semelhante clivagem do desenvolvimento embrionrio para produzir seres juvenis dentro do adulto. Atravs de uma srie de movimentos celulares semelhantes gastrulao, o volvox embrionrio se inverte e finalmente liberado do progenitor. As clulas somticas do progenitor, sem gondios, passam por senescncia e morrem, enquanto a colnia juvenil amadurece. O ciclo sexual total dura dois dias. (Segundo Kirk, 1988.)
Maturao dos gondios
Expanso continuada da matriz extracelular
Expanso continuada de juvenis Liberao de juvenis
Morte de clulas somticas - progenitores
19
(A)
(F)
Figura 1.18
(B)
(G)
Inverso dos embries V. carteri produzidos assexuadamente. A-E so micrografias eletrnicas de varredura de embries completos. FJ so cortes sagitais atravs do centro do embrio, visualizado por microscopia diferencial de interferncia. Antes da inverso, o embrio uma esfera cncava de clulas conectadas. Quando as clulas mudam a sua forma, um buraco (o fialoporo) abre-se no topo do embrio (A,B,F,G). As clulas se curvam e se renem em um dos plos (C-E, H-J). (Kirk et al., 1982, cortesia de D. Kirk.)
(C)
(H)
das clulas que as produzem (Pommerville e Kochert, 1982). Alm do mais, nessa morte, as clulas liberam para o uso de outras, incluindo sua prpria cria, todo o nutriente acumulado durante toda a vida. Dessa maneira emerge, como assinala David Kirk, um dos grandes temas da vida no planeta Terra: Alguns morrem para que outros possam viver. Em V. carteri, foi identificado um gene* especfico que tem um papel importante regulando a morte das clulas (Kirk, 1988). Em linhagens laboratoriais possuindo mutaes desse gene, as clulas somticas abandonam suas tendncias suicidas, ganham a habilidade de se reproduzirem
* Esse gene (regA) foi clonado e mostrou codificar uma protena que age para reprimir (direta ou indiretamente) todos os genes cujos produtos so requeridos pela clula para se desenvolver como gondio. Mutaes de perda da funo impediro a protena de agir, e as clulas sero capazes de se tornarem gondios (D. Kirk, comunicao pessoal).
(D)
(I)
(E)
(J)
clulas em forma de garrafa abre um buraco em um dos lados do embrio produzindo tenso sobre a camada de clulas interconectadas (Figura 1.19). O embrio se utiliza desse buraco para fazer a inverso e depois o fecha. Posteriormente, as colnias juvenis so enzimaticamente soltas do progenitor e nadam livres.
O que acontece s clulas somticas do progenitor Volvox agora que as jovens deixaram o lar? Tendo produzido uma cria e sendo incapazes de uma nova reproduo, essas clulas somticas morrem. Para ser mais exato, elas cometem suicdio, sintetizando um conjunto de protenas que causam a morte e a dissoluo
Figura 1.19
Clulas garrafas prximas abertura do fialoporo. Essas clulas permanecem estreitamente conectadas atravs de pontes citoplasmticas prximas a seus pices alongados, desse modo criando a tenso que causa a curvatura da lmina celular interconectada. ( Kirk et al., 1982, cortesia de D. Kirk.)
20
(A)
assexuadamente e se tornam potencialmente imortais (Figura 1.20). O fato desses mutantes nunca terem sido encontrados na natureza, indica que a morte das clulas tem um papel importante na sobrevivncia do V. carteri sob condies naturais. [intro2.html] Entra o sexo Mesmo o V. carteri se reproduzindo assexuadamente a maior parte do tempo, na natureza se reproduzem sexualmente uma vez por ano. Quando o faz, uma gerao de indivduos morre, e uma nova gerao geneticamente diferente produzida. O naturalista Joseph Wood Krutch (1956) colocou isso de uma forma mais potica: A ameba e o paramcio so potencialmente imortais...Mas para o Volvox a morte parece inevitvel, assim como o para um camundongo ou o homem. Volvox deve morrer, como Leeuwenkoek observou, porque teve filhos e no mais necessrio. Quando sua hora chegar, tomba em silncio, vai para o fundo juntar-se a seus ancestrais. Como Hegner, o zoologista de Johns Hopkins, escreveu, Esse o primeiro
Figura 1.21
advento da inevitvel morte natural no reino animal, e tudo em nome do sexo. E pergunta: Vale a pena? Para Volvox carteri, certamente que sim. V. carteri vive em pequenas poas rasas que temporariamente se enchem com as guas das chuvas da primavera e secam no calor do vero. Durante a maior parte desse tempo, V. carteri nada livremente, reproduzindo-se assexuadamente. Esses volvox morreriam em minutos se a poa secasse, mas o V. carteri capaz de sobreviver se tornando sexual pouco antes da secagem das poas, produzindo zigotos inativos que sobrevivem ao calor e seca do alto vero e ao frio do inverno. Quando a chuva enche esses pequenos reservatrios na primavera, os zigotos interrompem a sua dormncia e criam uma nova gerao para reproduzirem-se assexuadamente at que as guas ameacem secar novamente. Como esses organismos to simples prevem a chegada de condies adversas com acuidade suficiente para produzir uma gerao sexual no tempo certo, ano aps ano? O estmulo para mudana do modo assexual para o modo sexual de reproduo em V. carteri devido a uma protena
(B)
Figura 1.20
Mutao de um nico gene (chamado regenerador somtico A) elimina a programao de morte em clulas V. carteri. Volvox recmeclodido carregando essa mutao (A) indistinguvel do esferide tipo-selvagem. No entanto, momentos antes das clulas somticas do esferide tipo-selvagem comearem a morrer, as clulas somticas desse mutante se rediferenciam como gondios (B). Finalmente, cada clula do mutante ir se dividir para formar ( regenerar) um novo esferide que ir repetir esse ciclo do desenvolvimento potencialmente imortal.
Reproduo sexual em V. carteri. Machos e fmeas so indistiguveis na sua fase assexuada. Quando a protena indutora sexual est presente, os gondios de ambos parceiros passam por uma embriognese modificada que leva formao de vulos nas fmeas e espermatozides nos machos. Quando os gametas esto maduros, pacotes de espermatozide (contendo 64 ou 128 espermatozides cada), so liberados e nadam para as fmeas. Ao alcanar a fmea o pacote se rompe em espermatozides individuais, que podem fertilizar os vulos. O zigoto resultante tem paredes duras que podem resistir seca, calor e frio. Quando as chuvas da primavera fazem o zigoto germinar, sofrendo meiose para produzir machos e fmeas haplides que se reproduzem assexuadamente at o calor induzir novamente o ciclo sexual.
Desenvolvimento sexual de gondios Pacotes de espermatozide
Indutor sexual Espermatozide Macho assexuado Gondio Desenvolvimento embrionrio modificado dos gondios resultando em produo de gametas Macho sexuado
vulos Indutor sexual vulo Fmea assexuada Meiose e germinao Fmea sexuada
Zigotos
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sexual indutiva de 30-kDa. Essa protena to poderosa que concentraes menores que 6x10-17 fazem com que os gondios sofram um padro modificado de desenvolvimento embrionrio que resulta na produo de vulos ou espermatozides, dependendo do sexo gentico do indivduo (Sumper et al.,1993). Os espermatozides so liberados para nadar para a fmea onde fertilizam os vulos para produzir zigotos dormentes (Figura 1.21). Qual a fonte dessa protena indutora sexual? Kirk e Kirk (1986), descobriram que o ciclo sexual poderia ser iniciado esquen-
tando placas com V. carteri temperaturas que poderiam ser encontradas em um reservatrio raso durante o fim do vero. Quando isso era feito, as clulas somticas dos volvox assexuados produziam a protena sexual indutora. Sendo a quantidade da protena secretada por um indivduo suficiente para iniciar o desenvolvimento sexual em mais de 500 milhes de volvox assexuados, um nico volvox indutor pode converter um reservatrio inteiro para a sexualidade. Essa descoberta explica uma observao feita h quase 90 anos, de que na intensa radiao solar do vero de Nebraska, Volvox capaz
de aparecer, multiplicar-se, realizando uma orgia sexual reprodutiva em poas de gua da chuva de apenas duas semanas (Powers, 1908). Ainda que reservatrios temporrios formados pela gua das chuvas sequem sob o calor do vero, Volvox encontrou um meio de sobrevivncia: usa o calor para induzir a formao de indivduos sexuados cujo acasalamento produz zigotos capazes de sobreviver sob condies que matam o organismo adulto. Observamos, tambm, que o desenvolvimento est criticamente ligado ao ecossistema ao qual o organismo se adaptou para sobreviver.
Diferenciao e Morfognese em Dictyostelium

O CICLO DE VIDA DO DICTYOSTELIUM. Um outro tipo de organizao multicelular
derivada de organismos unicelulares encontrada no Dictyostelium discoideum.* O ciclo de vida desse organismo fascinante ilustrado na Figura 1.22. Em seu ciclo vegetativo, uma solitria ameba haplide (chamada myxamoebae ou ameba social para distingui-las de espcies de amebas que sempre permanecem solitrias) vive em troncos cados, se alimentando de bactrias e se reproduz por ciso binria. Quando tiver esgotado seu suprimento de comida, dezenas de milhares dessas amebas se juntam para formar um fluxo corrente de clulas que convergem em um ponto central. Aqui se amontoam uma sobre a outra sob forma de um cone chamado de agregado apertado ou justo. Subseqentemente, uma ponta surge no topo desse monte, que se dobra formando uma lesma migratria (com a ponta na frente). A lesma (geralmente lhe dado um ttulo mais dignificado de pseudoplasmdio ou grex) mede normalmente de 2 a 4 mm de comprimento e envolvida por uma bainha viscosa. O grex comea a migrar (se o ambiente est escuro e mido) com sua ponta anterior um pouco levantada; quando atinge uma rea iluminada, a migrao cessa, e o grex se diferencia em um corpo de frutificao composto de clulas esporos e pednculo. As clulas anteriores, representando 15 a 20 porcento de toda populao celular, formam o pednculo tubular. O pednculo comea na parte centro-anterior da clula, enquanto as clulas prpedunculares comeam a secretar um revestimento extracelular estendendo um tubo atravs do grex. medida que as clulas pr-pedunculares se diferenciam, formam vacolos e aumentam de tamanho levando a massa de clulas pr-pednculo que havia ficado nos quatro-quintos posteriores do grex (Jermyn e Williams, 1991). As clulas do pednculo morrem, mas as clulas posteriores, elevadas acima do pednculo, transformam-se em clulas-esporo. Essas se dispersam, cada uma tornando-se uma nova mixameba. Em adio a esse ciclo sexual, existe a possibilidade para sexo em Dictyostelium. Duas amebas podem fundir-se para criar uma clula gigante, que digere todas as outra clulas do agregado. Quando tiver ingerido todos seus vizinhos, se enquista em uma parede grossa e sofre divises meitica e mittica; e por fim, novas mixamebas so liberadas. Dictyostelium tem sido um maravilhoso organismo experimental para biologistas do desenvolvimento, porque clulas inicialmente iguais so diferenciadas em dois tipos alternativos de clulas, esporo e pednculo. tambm um organismo onde clulas individuais se juntam para formar uma estrutura coesa composta por tipos de clulas diferenciadas, parecido com a formao de tecidos em organismos
* Embora chamado coloquialmente um fungo celular pegajoso, Dictyostelium no um fungo (como Neurospora), nem consistentemente pegajoso. melhor consider-lo como uma ameba social.
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Lesma (Pseudoplasmdio; grex)
15 h 14 h
16 h 17 h
MIGRAO
CULMINAO
20 h
12 h
Esporos
23 h
10 h AGREGAO Mixamebas 9 h Corpo de frutificao 6 h Fluxos celulares maduro
24h
Figura 1.22
Ciclo vital de Dictyostelium discoideum. Esporos haplides originam mixamebas, que podem reproduzir-se assexualmente para formar mais mixamebas haplides. A medida que diminui o suprimento alimentar, ocorre agregao em pontos centrais, e forma-se um agregado de pseudoplasmdio. Finalmente, esse pra de se movimentar e forma um corpo de frutificao que libera mais esporos. Os nmeros referem-se s horas decorridas desde que a diluio nutricional iniciou a seqncia desenvolvimental.
mais complexos. A agregao de milhares de amebas em um nico organismo um feito incrvel de organizao e convida experimentao para resolver perguntas sobre os mecanismos envolvidos.
AGREGAO DE CLULAS DE DICTYOSTELIUM. A primeira pergunta : O que induz a ameba a se agregar? Microcinematografia de espaamento temporal mostrou que no ocorre movimento direcionado durante as primeiras 4-5 horas aps carncia nutricional. Durante as 5 horas seguintes, porm, as clulas so vistas mover-se por aproximadamente 20m / min durante 100 segundos. Esse movimento cessa aps aproximadamente 4 minutos, e em seguida recomea. Embora o movimento seja direcionado para um ponto central, no um simples movimento radial. Antes, as clulas se juntam umas s outras para formar correntes; essas convergem em correntes maiores, e finalmente todas se juntam no centro. Bonner (1947) e Shaffer (1953) mostraram que esse movimento devido quimiotaxia: as clulas so guiadas para os centros de agregao por uma substncia solvel. Essa substncia foi posteriormente identificada como adenosina 3,5 monofosfato cclico (cAMP) (Konijn et al., 1967; Bonner et al., 1969), cuja estrutura qumica est mostrada na Figura 1.23A. A agregao iniciada medida que cada clula comea a sintetizar o cAMP. No h clulas dominantes que comeam a secreo ou controlam as outras. Antes, os locais de agregao so determinados pela distribuio das amebas (Keller e Segal, 1970; Tyson e Murray, 1989). Clulas vizinhas respondem ao cAMP de duas maneiras: ou iniciando sua movimentao de acordo com as pulsaes de cAMP, ou acompanhando a liberao de seu cAMP prprio (Robertson et al., 1972; Shaffer, 1975). Em seguida, a clulas no respondem mais aos pulsos de cAMP por vrios minutos. O
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(A)
Adenina
(B)
(C)
(D)
Figura 1.23
resultado uma onda giratria em espiral de cAMP, que se propaga atravs da populao de clulas (Figura 1.23B-D). medida que chega cada onda, as clulas do mais um passo para o centro.* A diferenciao de amebas individuais em clulas pedunculares (somticas) ou esporos (reprodutivas) uma questo complexa. Raper (1940) e Bonner (1957) demonstraram que as clulas anteriores normalmente formam pednculo, enquanto as clulas remanescentes, posteriores, em geral esto destinadas a formar esporos. No entanto, a remoo cirrgica da parte anterior da lesma no elimina a capacidade do grex formar um pednculo. Em vez disso, as clulas que agora se encontram no final anterior aps a cirurgia (e que originalmente estavam destinadas a formar esporos), agora formam o pednculo (Raper, 1940). De alguma maneira, tomada uma deciso de modo tal, que clulas anteriores virem clulas pedunculares e clulas posteriores virem esporos. Essa habilidade de clulas mudarem seus destinos desenvolvimentais,
* A bioqumica dessa reao envolve um receptor que liga o cAMP. Quando essa ligao ocorre, realiza-se transcrio especfica de genes, iniciada movimentao em direo fonte de cAMP, e enzimas adenilciclases (que sintetizam cAMP a partir de ATP) so ativadas. O cAMP recm-formado ativa seus receptores prprios, assim como aqueles de seus vizinhos. As clulas na rea permanecem insensveis s novas ondas de cAMP at que o cAMP ligado seja removido dos receptores por outra enzima da superfcie celular, a fosfodiesterase (Johnson et al., 1989). A matemtica de tais reaes de oscilao prev que a difuso de cAMP seria inicialmente circular. Porm, medida que o cAMP interage com as clulas que recebem e propagam o sinal, as clulas que recebem a parte frontal da onda comeam a migrar com uma velocidade diferente daquela das clulas atrs delas. O resultado a espiral rotatria de cAMP e a migrao vistas na Figura 1.23. interessante que as mesmas frmulas matemticas predizem o comportamento de certas reaes qumicas e a formao de novas estrelas em galxias espirais rotatrias (Tyson e Murray, 1989).
Quimiotaxia de amebas de Dictyostelium devida ondas espirais de cAMP. (A) estrutura qumica do cAMP. (B) Visualizao de vrias ondas de cAMP no meio. Clulas centrais secretam cAMP em intervalos regulares, e cada secreo difunde para fora como um onda concntrica. As ondas so mapeadas saturando-se papel de filtro com cAMP radioativo e colocando-o sobre uma colnia em agregao. O cAMP das clulas secretoras dilui o cAMP radiativo. Quando a radioatividade no papel registada (colocando-o sobre filme de raiosX), as regies de alta concentrao de cAMP na cultura aparecem mais claras que aquelas de baixa concentrao de cAMP. (C,D) Ondas espirais de amebas movendo-se em direo fonte inicial de cAMP. (C) Essa microfotografia em campo escuro processada digitalmente mostra cerca de 107 clulas. Como clulas mveis e imveis dispersam a luz diferentemente, a fotografia reflete movimento celular. As bandas claras so compostas de clulas migratrias alongadas; as bandas escuras so clulas que pararam de se mover e se arredondaram. (D) As clulas formam correntes, a espiral de movimento ainda pode ser vista movendo-se em direo ao centro. (B de Tomchick e Devreotes, 1981, cortesia de P. Devreotes; C e D de Siegert e Weijer, 1989, cortesia de F. Siegert.)
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Figura 1.24
Clulas de Dictyostelium sintetizam um adesivo, glicoprotena 24-kDa, pouco aps a inanio nutricional. Clulas de Dictyostelium foram coradas com um anticorpo fluorescente que se liga glicoprotena 24-kDa e foram em seguida observada sob luz ultravioleta. Essa protena no foi vista em amebas que tinham apenas parado de se dividir. No entanto, como mostrado aqui 10 horas aps o fim da diviso celular amebas individuais so vistas apresentando essa protena em suas membranas celulares e so capazes de aderir umas s outras.
de acordo com sua localizao dentro do organismo inteiro, e assim compensar por partes faltantes, chamada regulao. Veremos esse fenmeno em muitos embries, inclusive naqueles dos mamiferos.
MOLCULAS DE ADESO CELULAR EM DICTYOSTELIUM. Como essas clulas
individuais aderem entre si para formar um organismo coeso? Este o mesmo problema que enfrentam as clulas embrionrias, e a soluo que evoluiu para os protistas a mesma que aquela usada pelos embries: molculas de adeso celular reguladas pelo desenvolvimento. Enquanto esto crescendo mitoticamente em bactrias, clulas de Dictyostelium no aderem umas s outras. Porm, uma vez que a diviso celular cessa, as clulas se tornam progressivamente mais adesivas, alcanando um patamar de coesividade mxima aproximadamente aps 8 horas de inanio. A adeso clula-clula mediada por uma glicoprotena de 24.0000 Da (24-kDa) que est ausente em clulas em crescimento mas pode ser vista pouco depois dessa fase (Figura 1.24; Knecht et al., 1987; Loomis, 1988). Essa protena sintetizada a partir de mRNA recm-transcrito e fica localizada nas membranas celulares das mixamebas. Se essas clulas so tratadas com anticorpos que se ligam a essa protena e a mascaram, as clulas no iro aderir umas s outras e todo desenvolvimento subseqente cessa. Uma vez que essa agregao inicial tiver ocorrido, estabilizada por uma segunda molcula de adeso celular. Essa glicoprotena de 80-kDa tambm sintetizada durante a fase de agregao. Se apresentar defeitos ou estiver ausente nas clulas, lesmas pequenas se formaro, e seus corpos de frutificao s atingiro aproximadamente um tero de seu tamanho normal. Assim, o segundo sistema de adeso celular, parece ser necessrio para a reteno de um nmero de clulas suficientemente grande para a formao de grandes corpos de frutificao (Mller e Gerisch, 1978; Loomis, 1988). Um terceiro sistema de adeso ativado tardiamente no desenvolvimento, quando a lesma estiver migrando. A protena ou grupo de protenas que intervem no terceiro sistema pode existir somente em clulas pr-esporo e pode ser responsvel pela separao de clulas pr-esporo de clulas pr-pednculo (Loomis, comunicao pessoal). Assim, Dictyostelium evoluiu para trs sistemas de adeso clula-clula regulados pelo desenvolvimento, e que so necessrios para a morfognese de clulas individuais para formar um organismo coerente. Como veremos em captulos subseqentes, clulas de metazorios tambm usam molculas de adeso celular para formar os tecidos e rgos do embrio. Dictyostelium um organismo multicelular em tempo parcial que no forma muitos tipos de clulas (Kay et al., 1989), e os organismos multicelulares mais complexos no se formam pela agregao de clulas anteriormente independentes. No entanto, muitos dos princpios do desenvolvimento demonstrados por esse simples or-
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ganismo tambm aparecem em embries de filos mais complexos. A habilidade de clulas individuais sentir um gradiente qumico (como a resposta da ameba ao cAMP) muito importante para a migrao celular e morfognese durante o desenvolvimento animal. Ainda mais, o papel das protenas da superfcie celular para a coesividade celular pode ser visto atravs do reino animal, e molculas indutoras da diferenciao esto agora comeando a ser isoladas de organismos metazorios.
&
Especulaes
Evidncia e Anticorpos
Biologia, tal como qualquer outra cincia, no trata de fatos; antes, trata de evidncias. Vrios tipos de evidncia sero apresentados neste livro; no so todos de equivalente vigor. Como exemplo, vamos usar a anlise da adeso celular em Dictyostelium. O primeiro e mais fraco tipo de evidncia a evidncia correlativa. Aqui, so feitas correlaes entre dois ou mais eventos, e infere-se que um evento estimule o outro. Como vimos, anticorpos marcados com fluorescncia para uma certa glicoprotena de 24 kDa, no marcam clulas vegetativas em diviso; porm, esses mesmos anticorpos acham a protena em membranas celulares de mixameba logo que as clulas param de se dividir e tornam-se competentes para agregar (veja Figura 1.24). Assim, existe uma correlao entre a presena dessa glicoprotena da membrana celular e a capacidade de agregao. Evidncia correlativa d um ponto de partida para investigaes, mas no se pode afirmar com certeza que um evento estimula outro somente baseado em correlaes. Embora se possa inferir que a sntese dessa protena causa a adeso das clulas, tambm possvel que adeso celular leve as clulas a sintetizar essa nova glicoprotena, ou que a adeso celular e a sntese da glicoprotena 24-kDa sejam eventos separados, iniciados pela mesma causa subjacente. A ocorrncia simultnea dos dois eventos pode mesmo ser coincidncia e os eventos no terem relao um com o outro.*
Como ento ir para alm da mera correlao? No estudo da adeso celular em Dictyostelium, o prximo passo foi usar aqueles mesmos anticorpos para bloquear a adeso de mixamebas. Usando uma tcnica introduzida pelo laboratrio de Gerisch (Beug et al., 1970), Knecht e colaboradores (1987) tomaram os anticorpos que ligam essa glicoprotena 24-kDa e isolaram seus stios ligantes de antgeno (as partes da molcula do anticorpo que reconhecem o antgeno). Isso foi necessrio porque o todo da molcula de anticorpo contm dois stios ligantes de antgeno que iriam ligar-se artificialmente de maneira cruzada e aglutinar as mixamebas. Quando esses fragmentos ligantes de antgeno (chamados Fragmentos Fab) foram adicionados s clulas competentes para agregao, as clulas no puderam se agregar. Os fragmentos de anticorpo impediram as clulas de aderir entre si, presu mivelmente por ligarse a glicoprotena 24-kDa, bloqueando sua funo. Esse tipo de evidncia chamado evidncia-deperda-de-funo. Se bem que mais forte que a evidncia correlativa, ela ainda no exclui outras inferncias. Por exemplo, possvel que os anticorpos tenham matado a clula (o que poderia acontecer se a glicoprotena 24-kDa for um crtico canal de transporte). Isso tambm impediria a adeso celular. Ou talvez, a glicoprotena 24-kDa nada tinha a ver com a adeso propriamente, mas necessria para o funcionamento da verdadeira molcula adesiva (como atravs da estabilizao de pro-
* Em uma carta irnica, caoando de tais inferncias correlativas, Sies (1988) demonstrou uma notvel boa correlao entre o nmero de cegonhas vistas na Alemanha Ocidental de 1965 at 1980 e o nmero de bebs nascidos durante esses mesmos anos.
tenas de membrana em geral). Nesse caso, bloquear a glicoprotena tambm causaria a inibio da agregao celular. Assim, a evidncia perda-defuno precisa ser amparada por muitos controles demonstrando que agentes causadores de perda de funo derrubam especificamente aquela funo em particular, e nada mais. O tipo mais forte de evidncia evidncia-de-ganho-de-funo. Aqui, o incio do primeiro evento estimula um segundo e mesmo em situaes onde nenhum desses eventos ocorre usualmente. Recentemente, da Silva e Klein (1990) e Faix e colaboradores (1990) obtiveram tal evidncia para mostrar que a glicoprotena 80-kDa uma molcula adesiva. Isolaram o gene para essa protena e o modificaram de uma maneira a motiv-lo ser expresso continuamente. Em seguida, recolocaram-no em mixameba bem-alimentada, crescendo vegetativamente, que usualmente no expressa essa protena e no tem capacidade de adeso. A presena dessa protena na membrana celular dessas clulas em diviso foi confirmada por marcao com anticorpos. Tais clulas agora aderiram umas s outras mesmo nos estados vegetativos, o que normalmente no fazem. Assim, elas tinham ganho uma funo adesiva somente por expressar essa glicoprotena em particular nas suas superfcies celulares. Essa evidncia de ganho-de-funo mais convincente que outros tipos de anlise. Experimentos semelhantes foram recentemente realizados em clulas de mamferos (veja captulo 3), para demonstrar a presena de determinadas molculas adesivas celulares no embrio em desenvolvimento.
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DIFERENCIAO EM DICTYOSTELIUM. A diferenciao em uma clula-pedncu-
lo ou em uma clula-esporo reflete um dos principais fenmenos da embriognese: a seleo pela clula de uma trajetria desenvolvimental. As clulas freqentemente selecionam um determinado destino desenvolvimental quando alternativas esto disponveis. Uma determinada clula num embrio de vertebrado por exemplo, pode tornar-se uma clula da epiderme ou um neurnio. Em Dictyostelium, vemos uma deciso dicotmica simples, porque somente dois tipos celulares so possveis. Como uma clula torna-se uma clula de pednculo ou uma clula de esporo? Embora os detalhes no sejam totalmente conhecidos o destino de uma clula parece ser regulado por certas molculas difusivas. Os dois principais candidatos so o fator indutor de diferenciao (DIF) e o cAMP. DIF parece ser necessrio para a diferenciao da clula peduncular. Esse fator, tal como o fator indutor de sexo em Volvox, eficaz em concentraes muito baixas (10-10M); e, como a protena de Volvox, parece induzir a diferenciao de um determinado tipo de clula. Quando adicionado s amebas isoladas ou mesmo s clulas pr-esporo (posteriores), induz a formao de clulas pedunculares. A sntese desse lipdeo de baixo peso molecular regulada geneticamente, pois h cepas mutantes de Dictyostelium que formam somente o precursor de clulas-esporo e no de clulas pedunculares. Quando DIF adicionado a essas culturas de mutantes, clulas penduculares conseguem se diferenciar (Kay e Jermyn, 1983; Morris et al., 1987), e novos mRNAs especficos pr-pednculo so encontrados no citoplasma celular (Williams et al., 1987). O mecanismo pelo qual DIF induz 20 porcento das clulas do plasmdio (grex) a tornar-se tecido peduncular ainda controverso (veja Early et al., 1995). DIF pode agir atravs da liberao de ons de clcio de compartimentos intracelulares no interior da clula (Schaulsky e Loomis, 1995). [other.html#intro3] Embora DIF estimule amebas a tornarem-se clulas pr-pednculo, a diferenciao de clulas pr-esporo mais provavelmente controlada por pulsos contnuos de cAMP. Altas concentraes de cAMP iniciam a expresso de mRNA pr-esporo especfico, em amebas agregadas. Alm disso, quando lesmas so colocadas em um meio contendo uma enzima que destri cAMP extracelular, as clulas pr-esporo perdem suas caractersticas de diferenciao (Figura 1.25; Schaap e van Driel, 1985; Wang et al., 1988a,b).
(A)
(B)
Figura 1.25
Substncias qumicas que controlam a diferenciao em Dictyostelium. (A) e (C) (B) mostram os efeitos de se colocar lesmas Dictyostelium em um meio contendo enzimas que destroem cAMP extracelular. (A) Grex (pseudoplasmdio) corado para presena de uma protena pr-esporo especfica (regies claras). (B) Grex semelhante corado aps tratamento com enzimas que degradam cAMP. No visto produto pr-esporo especfico. (C) Amplificao maior de uma lesma tratada com DIF (na ausncia de amnia). O corante usado liga-se parede de celulose das clulas pedunculares. Todas as clulas do grex tornaram-se clulas pedunculares. (A e B de Wang et al., 1988a; C de Wang e Schaap, 1989; cortesia dos autores.)
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&
Especulaes
Como o Grex Sabe Qual Lado Est Para Cima
E TODAS AS AMEBAS do grex comearem no mesmo nvel, como podem clulas nos quatro-quintos posteriores da lesma se diferenciar em clulas-esporo, enquanto clulas equivalentes do quinto anterior se tornam clulas pedunculares? A resposta pode estar na observao de que as clulas originais no so todas iguais. Amebas sujeitas inanio durante a parte precoce de seu ciclo celular tendem a se mover para a poro anterior do pseudoplasmdio, enquanto amebas expostas inanio durante o fim do ciclo, tendem a permanecer na poro posterior (McDonald e Durston, 1984; Weijer et al., 1984). Esse trabalho foi confirmado e ampliado por Ohmori e Maeda (1987), que mostraram que clulas no-alimentadas durante a parte tardia do ciclo celular, respondem de maneira diferente ao cAMP e mostram adesividade muito mais alta que clulas jejuadas imediatamente aps a mitose. Williams e colaboradores (1989) acharam que clulas pr-esporo e pr-pednculo podem ser diferenciadas em agregados precoces e que esto distribudas de modo aleatrio atravs desses montes hemisfricos. Assim, as tendncias para certos destinos foram estabelecidas at mesmo antes do grex comear a migrar. Dentro de cada agregado, a maioria das clulas pr-pednculo, migram ativamente para o anterior, enquanto clulas pr-esporo permanecem no que se tornar a regio posterior do grex. Essa migrao provavelmente devida a repetidos pulsos de cAMP que ain-
da esto emanando da ponta apical do agregado. Esses pulsos so quimiotcticos para clulas pr-pednculo, mas no para clulas pr-esporo, de modo que atraem as clulas pr-pednculo para a ponta da agregado (Matsukuma e Durston, 1979; Mee et al., 1986; Siegert e Weijer, 1991; Takeuchi, 1991).Portanto, o AMP cclico parece ter vrias funes no desenvolvimento de Dictyostelium. Agrega as clulas umas s outras, induz diferenciao de clulas pr-esporo e dirige a migrao de clulas pr-pednculo para a parte anterior do agregado. Uma vez completo, o agregado tomba sobre um dos lados e forma o grex migratrio. A maioria das clulas pr-pednculo esto nos 20 porcento anteriores do grex, porm, h tambm algumas clulas pr-pednculo espalhadas atravs da parte posterior. Clulas pr-pednculo podem ser distinguidas pela sua secreo de protena A da matriz extracelular para espaos intercelulares. No centro da poro anterior do grex, um outro grupo de clulas pr-pednculo comea a secretar uma segunda nova protena (protena B), para sua matriz extracelular. Essas clulas so chamadas clulas pr-pednculo B (pstB), enquanto a maioria das clulas pr-pednculo so conhecidas como clulas prpednculo A (pstA) (Figura 1.26). Outro grupo de clulas pr-pednculo, as clulas pstO, esto espalhadas de maneira esparsa atravs das clulas pr-esporo, e migram mais lentamente em direo ao anterior. Quando o grex se encontra na
luz solar, cessa de migrar e sofre a diferenciao final em esporos e pednculo. Durante esse processo (chamado culminao), o grex se apia em um dos terminais fazendo com que as clulas traseiras se tornem sua base. Algumas clulas pstA migram para o tubo central de clulas pstB, e quando entram em contato com o tubo central, diferenciam-se em clulas pstB, sintetizando componentes de uma nova matriz extracelular. As clulas novas so adicionadas regio anterior do tubo, forando-o mais para dentro da estrutura culminativa. Esse tubo se diferencia para tornar-se o pednculo. Ao mesmo tempo, as clulas pstA que tinham ficado na regio posterior do
Figura 1.26
Regulao da diferenciao de clulas pedunculares durante a fase de culminao do crescimento de Dictyostelium. Representao esquemtica mostrando que clulas pr-esporo e pr-pednculo esto em geral misturadas no estgio precoce da agregao, mas se separam de modo que a maioria das clulas prpednculo se encontrem na parte anterior do grex. As clulas pr-pednculo A constituem a maior parte do anterior do grex, com alguma clulas similares no posterior. Clulas prpednculo B so vistas na parte central da poro anterior do grex. Nos estgios precoces da culminao, as clulas pr-pednculo do posterior migram para formar o disco basal e os clices do saco de esporos; as clulas prpednculo A do anterior migram para o centro e se tornam clulas pr-pednculo B. Isso estende o pednculo at que esse eleve a caixa de esporos acima da superfcie. (Segundo Harwood et al., 1992).
Clice superior
Clulas pr-pednculo A Clulas pr-pednculo B Clulas pr-pednculo AB Direo do movimento celular Clulas pr-esporo Pr-pednculo AB Guarda da retaguarda Pr-pednculo A
Clulas pr-esporo Pr-pednculo AB Pr-pednculo B Disco basal interior Disco basal exterior Clice Inferior Pr-pednculo AB
Pr-pednculo B Agregado Grex Culminante precoce Culminante mdio
Pr-pednculo B Culminante tardio
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grex migram para as bordas da regio presporo e diferenciam-se no invlucro dos esporos e disco basal (Williams e Jermyn, 1991; Harwood et al., 1992). Finalmente, os esporos so levantados 2 mm acima do solo, de onde podem ser dispersos pelo vento ou um animal que passa. O gatilho para a culminao parece ser a luz solar ou a baixa umidade. Experimentos recentes sugerem que esses dois fatores causam a difuso de amnia da lesma. A amnia produzida copiosamente por lesmas migratrias e reprime a culminao. Sempre que a amnia estiver exaurida (quer naturalmente ou experimentalmente), a culminao comea (Schindler e Sussman, 1977; Newell e Ross, 1982; Bonner et al., 1985). A amnia inibe a converso de clulas pstA em pstB e probe a continuao da formao do pednculo
cAMP
(Gross et al., 1983; Wang et al., 1990). Bonner e colaboradores (1985), sugeriram que como a luz causa difuso mais rpida da amnia, remove o inibidor permitindo assim, o progresso da culminao. A amnia parece inibir a produo do pednculo pelos menos de duas maneiras. Inibe a ao de DIF (Wang e Schaap, 1989), e inibe a produo de cAMP nas clulas pr-pednculo (Schindler e Sussman, 1977; Harwood et al., 1992). Esse cAMP necessrio para ativar a protena quinase cAMP-dependente (PKA). Clulas pr-pednculo contendo PKA nofuncional, no fosforilam certas protenas. Essas clulas no migram para a regio central anterior, nem se diferenciam em clulas do pednculo (Firtel e Chapman, 1990; Harwood et al., 1992). Os dados sugerem que quando PKA ativada,
passa a fosforilar um repressor que estava inibindo a expresso dos genes de diferenciao do pednculo. No estado fosforilado, o inibidor inativo. Portanto, uma vez que os nveis de cAMP se elevam (pela remoo da amnia), a PKA pode inativar o inibidor dos genes formadores do pednculo (Figura 1.27). [intro.4html]
Figura 1.27
Uma hiptese para a iniciao coordenada da culminao e diferenciao de clulas pedunculares em Dictyostelium. A luz solar dissipa a amnia na parte anterior do grex, permitindo maior produo de cAMP nas clulas pr-pednculo. A concentrao mais alta de cAMP ativa a PKA, que fosforila um inibidor da expresso gnica do pednculo. O inibidor fosforilado no pode mais inibir os genes pednculo-especficos. A seqncia pela qual a formao de esporos inibida, no est clara. (Baseado em modelos de Bonner et al., 1985, e Harwood et al., 1992)
Amnia
Repressor ativo da diferenciao e de genes de migrao peduncular PKA inativa cAMP PKA ativa
Migrao continuada do grex
Luz solar
Repressor inativo (fosforilado)
Transcrio do gene da protena B da matriz extracelular; migrao de clulas pr-pednculo; diferenciao e culminao peduncular
Padres desenvolvimentais entre metazorios

Como o restante deste livro se ocupa do desenvolvimento de metazorios - animais multicelulares que atravessam estgios embrionrios de desenvolvimento - apresentaremos um viso panormica dos seus padres desenvolvimentais.* A Figura 1.28 ilustra os principais rumos evolutivos do desenvolvimento metazorio. A observao mais impressionante que a vida no evoluiu segundo uma linha reta; apresenta diversos caminhos evolutivos ramificados. Podemos ver que a maioria das espcies de metazorios pertence a um de dois principais ramos de animais: protostomatas e deuterostomatas.
*Plantas passam por padres igualmente complexos e fascinantes de desenvolvimento embrionrio e ps-embrionrio. No entanto, o desenvolvimento das plantas difere significativamente daquele dos animais; a incluso de um tratamento abrangente do seu desenvolvimento teria dobrado a extenso deste livro. Por isso, foi tomada a deciso de enfocar neste texto, o desenvolvimento dos animais. Para uma reviso, veja Singer, 1997.
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BILATERIA DEUTEROSTOMATAS PROTOSTOMATAS
RADIATA
PARAZOA
Vertebrados
Ascdios (Tunicados)
Moluscos Equinodermos
Artrpodos Aneldeos
Nematelmintos
Platelmintos
Cnidrios (Celenterados)
Porferos (Esponjas)
Segmentados
No-segmentados
Larva trocfora Clivagem em espiral gastrulao protostosomal
da
ma
lo
qu
es
ag
em
Li
nh
ag
Clivagem radial gastrulao deuterostomal
nh
Li
SIMETRIA BILATERAL
Platelmintos primitivos (acelomados)
SIM
ET
RA RIA
DIA
Larvas planulides
Protozorios coloniais primitivos
Protistas flagelados
Figura 1.28
Principiais divergncias evolucionrias em animais existentes. (Outros modelos so possveis, porm, os esquemas em geral so todos semelhantes ao mostrado aqui.)
Os Porferos Considera-se que os protistas coloniais deram origem, ao menos, a dois grupos de metazorios, ambos passando por estgios embrionrios. Um desses grupos o Porfero (esponjas). Esses animais desenvolvem-se de um modo to diferente daquele de qualquer outro grupo de animais, que alguns taxonomistas sequer consideram-nos metazorios (chamando-os, parazorios). Uma esponja tem trs tipos principais de clulas somticas, mas um deles, o arquecito, pode se diferenciar em todos os outros
Li
nh
ag
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elo
Larva dipleura (tornria)
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ps
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tipos. As clulas de uma esponja quando passadas por uma peneira, podem regenerar novas esponjas a partir de clulas individuais. Ainda mais, em alguns casos, tal reagregao espcie-especfica: se clulas individuais de esponja de duas espcies diferentes forem misturadas, cada uma que se re-forma contm somente clulas de uma espcie (Wilson, 1907). Nesses casos, admite-se que os arquecitos mveis colecionam clulas de sua espcie, mas no das outras (Turner, 1978). Esponjas no contm mesoderma, no havendo portanto verdadeiros sistemas de rgos em Porfero; esses seres no tm tubo digestivo, sistema circulatrio, nervos ou msculos. Assim, apesar de passarem por estgios embrionrios e larvais, esponjas so muito pouco parecidos com a maioria dos metazorios (veja Fell, 1997). Protostomatas e Deuterostomatas O outro grupo de metazorios emergindo dos protistas coloniais caracterizado pela presena de trs camadas germinativas durante o desenvolvimento. Alguns membros do grupo constituem os Radiatas, assim chamados porque tm simetria radial tal como um tubo ou uma roda. Os Radiatas incluem os cnidrios (medusas, corais e hidras) e ctenforos (medusas de crista). Nesses animais, o mesoderma rudimentar, consistindo de clulas escassamente disseminadas em uma matriz gelatinosa. Porm, a maioria dos metazorios tem simetria bilateral, constituindo assim, os Bilaterias. Esses filos bilaterais so classificados como platelmintos, protostomatas ou deuterostomatas. Pensa-se que todos os Bilateria descendam de um tipo primitivo de platelminto. Esses platelmintos foram os primeiros a ter mesoderma verdadeiro (embora no tivessem ficado ocos para formar uma cavidade corprea), e foram considerados parecidos com as larvas de certos celenterados contemporneos. Enquanto os platelmintos so desprovidos de celoma (cavidade corprea), os nematelmintos (e rotiferas) tm uma cavidade corprea diferente daquela de todos os outros animais, por ser desprovida de revestimento mesodrmico. A maioria dos filos so celomados, isto , possuem uma cavidade corporal revestida por mesoderma. As diferenas entre as duas divises de Bilateria esto ilustradas na Figura 1.29. Protostomatas (do Grego, boca primeiro), incluem os filos dos moluscos, artrpodos e vermes; so assim chamados porque a boca formada em primeiro lugar, junto ou prximo da abertura intestinal, produzida durante a gastrulao. O nus se forma mais tarde em outro local. A cavidade corprea desses animais se forma a partir de uma previamente slida corda de clulas mesodrmicas, tornadas ocas. A outra grande diviso dos Bilateria a linhagem dos deuterostomatas. Os filos nessa diviso incluem os chordatas e os equinodermos. Embora possa parecer estranho classificar seres humanos e cavalos no mesmo grupo que estrelas-do-mar e ourios-do-mar, alguns traos embriolgicos acentuam esse parentesco. Em primeiro lugar, nos deuterostomatas (do Grego significando boca depois), a abertura bucal formada depois da abertura anal. Tambm, enquanto prostostomatas em geral formam suas cavidades corpreas tornando oco um bloco slido de mesoderma (formao esquizelide), a maioria dos deuterostomatas formam suas cavidades corpreas a partir de bolsas mesodrmicas estendendo-se do intestino (formao enteroclica). Porm, deve-se mencionar que h muitas excees a essas generalizaes. Protostomatas e deuterostomatas diferem na maneira pela qual so clivados. Na maioria dos deuterostomatas, os blastmeros so perpendiculares ou paralelos uns aos outros. Isso chamado clivagem radial. Protostomatas ao contrrio, tm uma extensa variedade de tipos de clivagem. Muitas espcies formam blstulas compostas por clulas que esto em ngulos agudos relativamente ao eixo polar do embrio. So por isso considerados sofrer clivagem espiral. Alm disso, os blastmeros em estgio de clivagem, na maioria dos deuterostomatas, tm maior capacidade de regular seu desenvolvimento do que os prostostomatas. Se um nico blastmero removido de um embrio quadricelular de ourio-do-mar ou camundongo, tal blastmero ir desenvolver-se em um organismo inteiro, e os trs-quartos restantes do embrio tambm iro se desenvolver
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(A) PROTOSTOMATAS 1. Clivagem espiral
(B) DEUTEROSTOMATAS 1. Clivagem radial
2. Desenvolvimento esquizoclico Celoma Blastocele Mesoderma se divide Mesoderma
2. Desenvolvimento enteroclico Celoma
Blastocele
Bolsa Intestinal Bolsas se destacam Mesoderma
Intestino 3. Tendncia a no regulao
Intestino
Intestino 3. Tendncia regulao
Intestino
Embrio de de 4 clulas
Um blastmero excludo
Desenvolvimento interrompido
Embrio de de 4 clulas
Um blastmero excludo
Duas larvas normais se desenvolvem
Figura 1.29
normalmente. Porm, se a mesma operao fosse realizada em um embrio de lesma ou de verme, tanto o blastmero isolado como os restantes se desenvolveriam em embries parciais cada um carente daquilo que foi formado a partir dos outros. A evoluo dos organismos depende de alteraes herdadas em seu desenvolvimento. Um dos maiores avanos evolucionrios o ovo amnitico ocorreu entre os deuterostomatas. Esse tipo de ovo, exemplificado pelo da galinha (Figura 1.30), considerado ter-se originado dos ancestrais anfbios dos rpteis, h cerca de 255 milhes de anos. O ovo amnitico permitiu aos vertebrados vagar pela terra longe de suprimentos de gua existentes. Ao passo que a maioria dos anfbios obrigada a voltar para a gua para procriar e permitir o desenvolvimento de seus ovos, o ovo amnitico carrega seu prprio suprimento de gua e nutrientes. O ovo fertilizado internamente e contm a gema para nutrir o embrio em desenvolvimento. Ainda, contm quatro bolsas: o saco vitelnico, que armazena protenas nutrientes, o mnio, que contm fluido banhando o embrio, a alantide, na qual restos do metabolismo embrionrio so coletados, e o crio, que interage com o ambiente externo, seletivamente permitindo materiais chegar ao embrio. O todo dessa estrutura est contido em uma casca que permite a difuso de oxignio, ao mesmo tempo sendo suficientemente dura para proteger o embrio de agresses ambientais. Desenvolvimento semelhante de protees do ovo permitiram aos artrpodes serem os primeiros invertebrados sobre a terra. Assim, a travessia final dos limites entre gua e terra ocorreu com a modificao do estgio mais precoce do desenvolvimento o ovo.
Tendncias principais dos prostostomatas e deuterostomatas. Excees todas essas tendncias gerais evoluram secundariamente em certos membros de cada grupo. (A maioria dos vertebrados por exemplo, no tem uma formao estritamente enteroclica da cavidade corporal; e os embries de certos deuterostomatas, como os tunicados, no sofrem regulao se os blastmeros so deles removidos.)
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Figura 1.30
Embrio Intestino mnio Cavidade amnitica Alantide Crio Gema Saco vitelino (A) (B)
Diagrama do ovo amnitico do pinto, mostrando o desenvolvimento das membranas envolvendo o embrio. (A) Incubao de trs dias. O mesoderma extra-embrionrio se estende do embrio para prover vasos sangneos para e de vrias regies fora do embrio. (B) Incubao de sete dias. A origem das membranas ser detalhada no captulo 9. A gema ser finalmente rodeada pelo saco vitelnico que permite a entrada de nutrientes nos vasos sangneos. O crio derivado em parte do ectoderma e estende-se do embrio at a casca (onde ir trocar oxignio e gs carbnico e obter clcio da casca). O mnio prove o meio fluido no qual cresce o embrio, e a alantide coleta resduos nitrogenados que seriam perigosos para o embrio. Finalmente, o endoderma se transforma no intestino e envolve a gema. A evoluo do mnio e das outras membranas extra-embrionrias constituiu uma grande linha divisria entre aqueles vertebrados cuja reproduo est ligada gua (anamniotas) e aqueles que podem se reproduzir em reas secas (amniotas).
Alantide
A biologia do desenvolvimento proporciona um sortimento infinito de fascinantes problemas e animais. No presente livro, encontraremos apenas uma pequenssima amostra deles, servindo para ilustrar os princpios mais importantes do desenvolvimento animal (para uma cobertura mais completa da diversidade do desenvolvimento animal atravs dos filos, veja Gilbert e Raunio,1997). Estamos apenas observando o conjunto das mars ao nosso alcance, enquanto todo o oceano do desenvolvimento se estende nossa frente. Aps uma breve viso dos princpios genticos e celulares relevantes para a biologia do desenvolvimento, investigaremos os estgios precoces da embriognese animal: fertilizao, clivagem, gastrulao e construo do plano do corpo vertebrado. Captulos posteriores se concentraro nos mecanismos genticos e celulares pelos quais ele elaborado. Embora uma tentativa de cobrir as variaes importantes que ocorreram no reino animal tivesse sido feita, um certo chauvinismo deuterostossmico pode ter ficado aparente.
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Genes e desenvolvimento: Introduo e tcnicas
O que gostaramos de saber se a estrutura determinada diretamente pela informao codificada no DNA, gravada no ovo... na extenso em que estrutura pode ser expressa por informao. JONATHAN BARD (1990) Os segredos que me enlaam e cativam so em geral segredos da hereditariedade: como uma semente de pra vira uma pereira em vez de um urso polar. CYNTHIA OZICK (1989)
NTRE OS CARACTERES que fornecem os dados para a teoria, e os genes postulados, aos quais os caracteres se referem, est todo o campo do desenvolvimento embrionrio. Aqui Thomas Hunt Morgan (1926) estava verificando que o nico caminho de gentipo para fentipo, passava atravs de processos desenvolvimentais. No comeo do sculo vinte, embriologia e gentica no eram consideradas cincias separadas. Divergiram na dcada de 1920, quando Morgan redefiniu a gentica como a cincia que estuda a transmisso dos traos em oposio embriologia, a cincia que estuda a expresso desses traos. Durante a ltima dcada, porm, as tcnicas da biologia molecular realizaram uma reaproximao entre embriologia e gentica. Na realidade, os dois campos se ligaram novamente a tal ponto que se torna necessrio uma discusso prvia da gentica molecular neste texto. Questes do desenvolvimento animal que no poderiam ser consideradas h uma dcada, esto sendo agora resolvidas por um conjunto de tcnicas envolvendo sntese de cidos nuclico e hibridizao. Este captulo procura situar essas novas tcnicas dentro do contexto do dilogo, ora em curso, entre gentica e embriologia.
As origens embriolgicas da teoria dos genes

Ncleo ou Citoplasma: Qual Controla a Hereditariedade? Mendel chamou-os Formbildungelementen, elementos construtores de formas; ns os chamamos de genes. Porm, na terminologia de Mendel que vemos como no sculo dezenove os conceitos de herana e desenvolvimento estavam intimamente entrelaados. Entretanto, as observaes de Mendel no indicaram onde na clula ficavam esses elementos hereditrios, nem como eram levados a se expressarem. A teoria dos genes, que viria a ser a pedra angular da gentica moderna, teve origem em uma controvrsia no campo da embriologia. Em fins sculo XIX, um grupo de cientistas comeou a estudar, por seu valor intrnseco, como ovos fertilizados davam origem a organismos adultos. Dois jovens embriologistas americanos, Edmund Beecher Wilson e Thomas Hunt Morgan (Figura 2.1), tornaram-se parte desse grupo de embriologistas fisiolgicos, cada um tornando-se partidrio na controvrsia sobre qual dos dois compartimentos do ovo fertilizado - o ncleo ou o citoplasma - controla a herana. 35
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(B)
Figura 2.1
(A)
(A) E. B. Wilson (1856-1939; mostrado aqui em aproximadamente 1899), um embriologista cujo trabalho, na fase precoce da embriologia e da determinao sexual, muito avanou as hipteses cromossmicas do desenvolvimento. (Wilson era tambm reconhecido como um dos melhores violoncelistas amadores do pas.) (B) Thomas Hunt Morgan (1866-1945), que desenvolveu a teoria dos genes a partir da embriologia. Essa fotografia - tomada em 1915, quando os elementos bsicos da teoria dos genes estavam se encontrando mostra Morgan usando uma lente manual para identificar moscas. (A) cortesia de W. N. Timmins; (B) cortesia de G. Allen.)
Quando Morgan e Wilson entraram nesse debate, a disputa j estava bem ativa. Uma escola associada a Oskar Hertwig, Wilhelm Roux e Theodor Boveri, propunha que os cromossomos do ncleo continham os elementos construtores de formas. Esse grupo era desafiado por Eduard Pflger, T. L. W. Bischoff, Wilhelm His e seus colegas, que acreditavam que estruturas pr-formadas no poderiam causar to enormes mudanas durante o desenvolvimento; ao contrrio, eles acreditavam que os padres herdados de desenvolvimento eram causados pela criao de novas molculas do gameta interativo, citoplasmas. Morgan aliou-se a esse ltimo grupo e obteve dados que interpretou com sendo consistentes com o modelo citoplasmtico da herana. Em seu experimento mais crucial, ele removeu citoplasma do rcem-fertilizado ovo ctenforo (gelia de crista). Em 1897 Morgan relatou: Aqui, embora todo o ncleo de segmentao esteja presente, devido perda de parte do citoplasma, produz-se embries com defeito... Parece no haver escape da concluso que no citoplasma, e no no ncleo, est o poder de diferenciao dos estgios precoces do desenvolvimento.
CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento
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Wilson, nesse nterim, tornou-se o maior proponente do ponto de vista de que os elementos formadores se encontravam nos cromossomos nucleares. Defendeu vigorosamente essa idia em seu livro A Clula no Desenvolvimento e na Herana (1896), salientando a necessidade da presena do ncleo para regenerao dos protozorios (veja captulo 1): Esse fato presume que o ncleo , se no o local da formao de energia, ao menos, o fator controlador dessa energia e, por isso, o fator controlador da herana. Essa conjectura transforma-se em certeza quando nos voltamos para os fatos da maturao (meiose), fertilizao e diviso celular. Todos convergem em direo da concluso de que a cromatina o elemento essencial para o desenvolvimento. Wilson (1895) no se esquivou das conseqncias dessa concluso* Agora, a cromatina sabida ser intimamente semelhante, se no idntica, substncia conhecida como nuclena...que a anlise demonstra ser um composto qumico toleravelmente bem definido, composto de cido nuclico (um complexo cido orgnico rico em fsforo) e albumina. E assim, chegamos notvel concluso que a herana pode, talvez, ser efetuada pela transmisso fsica de um dado composto qumico do progenitor para a descendncia. Wilson pensou que o material formador de rgos que Morgan havia removido do citoplasma de ovos de ctenforo, j havia sido para ali secretado pelos cromossomos nucleares (Wilson, 1894, 1904). Para Wilson (1905) Os materiais citoplasmticos parecem ser apenas o meio imediato ou a causa eficiente da diferenciao, e ainda procuramos sua determinao primria nas causas que residem mais profundamente. Parte do maior apoio para a hiptese cromossmica da herana estava vindo dos estudos embriolgicos de Theodor Boveri (Figura 2.2 A), um pesquisador na Estao Biolgica de Npoles. Boveri fertilizou vulos de ourio-do-mar com altas concentraes de seu espermatozide e obteve ovos que haviam sido fertilizados por dois espermatozides. Na primeira clivagem, esses ovos formaram quatro plos mitticos e dividiram o ovo em quatro, em vez de duas clulas (veja captulo 4). Boveri ento separou os blastmeros e demonstrou que cada clula se desenvolvia anormalmente e de maneiras diferentes por ter cada clula diferentes tipos de cromossomos. Assim, Boveri declarou que cada cromossomo tinha uma natureza individual e o controle de diferentes processos vitais. O Cromossomo X como uma Ponte Entre Genes e Desenvolvimento Em adio evidncia de Boveri, E. B. Wilson (1905) e Nettie Stevens (1905a,b) demonstraram uma correlao crtica entre cromossomos nucleares e o desenvolvimento organizacional. Stevens (Figura 2.2B), uma ex- estudante de Morgan, mostrou que em 92 espcies de insetos (e um cordato primitivo), as fmeas tinham dois cromossomos sexo-especficos em cada ncleo (XX), enquanto machos tinham somente um cromossomo X (XY ou XO). Parecia que uma estrutura nuclear, o cromossomo X, estava controlando o desenvolvimento sexual** . Morgan discordou da interpretao de que
*Note-se que Wilson est escrevendo sobre unidades construtoras de forma na cromatina em 1896 antes da redescoberta do trabalhos de Mendel ou do estabelecimento da teoria dos genes. Para uma anlise mais detalhada das interaes entre Morgan e Wilson que levaram teoria dos genes, veja Gilbert (1978, 1987) e Allen (1986).
** Wilson era um dos amigos mais ntimos de Morgan, que considerava Stevens sua melhor estudante de ps-graduao. Ambos estavam contra Morgan nessa questo. Mesmo assim, Morgan apoiou inteiramente o pedido de Stevens para fundos de pesquisa, confirmando suas qualidades como as melhores possveis. Wilson escreveu uma elogiosa carta de recomendao, apesar de saber que ela seria uma rival na pesquisa (veja Brush, 1978).
(A)
(B)
Figura 2.2
O carter singular do cromossomo foi mostrado por Boveri e Stevens. (A) Theodor Boveri (1862-1915) cujo trabalho Wilson (1918) comentou: conseguiu a verdadeira fuso de citologia, embriologia e gentica um feito biolgico que... no fica atrs de qualquer outro de nosso tempo. Fotografia tirada em 1908, quando os estudos cromossmicos e embriolgicos de Boveri estavam no seu apogeu. (B) Nettie M. Stevens (1861-1912), que treinou tanto com Boveri como com Morgan, vista aqui em 1904 quando era estudante de psdoutorado, realizando a pesquisa que correlacionou o nmero de cromossomos X com o desenvolvimento sexual. [(A) cortesia de Baltzer, 1967; (B) cortesia do Instituto Carnegie de Washington.]
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os cromossomos determinavam o sexo. Ao contrrio, ele considerou o conjunto de cromossomos como uma caracterstica sexual secundria, controlada por alguma substncia citoplasmtica determinadora do sexo. A converso de Morgan para a hiptese cromossmica ocorreu depois de obter dados contrrios s suas teorias (veja Allen, 1978; Gilbert, 1978; Lederman, 1989). Enquanto criava Drosophila para uma srie de experimentos sobre evoluo, Morgan comeou a obter vrias mutaes correlacionadas com o sexo. (Como ele logo iria mostrar, mutaes ligadas ao X apareciam antes de mutaes em outros cromossomos, porque defeitos no cromossomo X no so mascarados pelo cromossomo homlogo no macho.) Em 1910, Morgan mostrou que os traos para ambos sexos e cor branca dos olhos esto correlacionados de alguma maneira com a presena de um dado cromossomo X; entretanto, evitou consider-los ligados fisicamente. Porm, em 1911mostrou que fatores reguladores da cor dos olhos, cor do corpo, forma das asas e sexo segregavam-se juntos com o cromossomo X, o que o levou a comear a visualizar os genes como fisicamente ligados um ao outro no cromossomo. O embriologista Morgan tinha demonstrado que cromossomos nucleares eram responsveis pelo desenvolvimento de caracteres herdados. [gene1.html]
A ciso entre a embriologia e a gentica

A evidncia de Morgan proporcionou uma base material para o conceito do gene. A gentica havia sido, em geral, uma cincia emprica sobre procriao de animais e plantas; Morgan deu-lhe um fundamento cientfico. Movida pelo desejo de progredir no conhecimento da reproduo de animais e plantas (e seres humanos), e na capacidade dos geneticistas de obter rapidamente resultados concretos e matematicamente verificveis, a gentica logo se tornou a cincia biolgica predominante nos Estados Unidos (veja Allen, 1986; Sapp, 1987; Paul e Kimmelman, 1988). Na dcada de 1930, tornou-se disciplina autnoma, desenvolvendo seu vocabulrio prprio, revistas, sociedades, organismos favorecidos, professorados e regras de evidncia. Hostilidade entre embriologia e gentica tambm emergiu. Os geneticistas acreditavam que os embriologistas eram antiquados e que o desenvolvimento viria a ser inteiramente explicado como o resultado da expresso gnica. Conforme proclamado por Richard Goldschmidt (1938), O desenvolvimento, obviamente, a produo ordenada de um padro e assim, em ltima anlise, os genes controlam o padro. Se os embriologistas no olharem para a embriognese em termos da atividade dos genes, os geneticistas o faro. Reciprocamente, os embriologistas consideraram os geneticistas como irrelevantes e mal-informados. Embriologistas como Frank Lillie (1927), Ross Granville Harrison (1937), Hans Spemann (1938) e Ernest E. Just (1939) (Figura 2.3), argumentaram que no poderia haver uma teoria gentica do desenvolvimento at que ao menos trs principais desafios fossem resolvidos: 1. Os geneticistas teriam que explicar como cromossomos que eram considerados idnticos em cada clula do organismo direcionam tipos diferentes e variveis de citoplasmas celulares. 2. Quase todos genes conhecidos na poca afetavam a modelagem das etapas finais (cor dos olhos, forma das cerdas, vascularizao alar). Os geneticistas teriam que produzir evidncia que os genes controlam os estgios precoces da embriognese. Conforme enunciado por Just (citado por Harrison, 1937), os embriologistas estavam interessados em saber como uma mosca forma o seu dorso e no no nmero de cerdas no seu dorso. 3. Os geneticistas teriam que explicar fenmenos como a determinao do sexo em certos invertebrados (e vertebrados, como rpteis), nos quais o ambiente determina o fentipo sexual.
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(A)
(B)
Figura 2.3
(C)
Embriologistas tentaram impedir a gentica de conquistar seu territrio na dcada de 1930. (A) Frank Lillie encabeou o Laboratrio de Biologia Marinha em Woods Hole e foi um lder na pesquisa sobre fertilizao e endocrinologia reprodutiva. (B) Hans Spemann ( esquerda) e Ross Harrison ( direita) aperfeioaram operaes de transplante para descobrir quando eram determinados os eixos do corpo e dos membros. Argumentaram que os geneticistas no possuam um mecanismo para explicar como os mesmos genes nucleares podiam criar tipos celulares diferentes durante o desenvolvimento. (C) Ernest E. Just fez descobertas cruciais sobre fertilizao. Rejeitou a gentica e enfatizou o papel da membrana celular na determinao dos destinos das clulas. (A cortesia de V. Hamburger; B cortesia de T. Horder; C cortesia do Laboratrio de Biologia Marinha, Woods Hole.)
O debate tornou-se deveras veemente. Numa retrica, refletindo as ansiedades polticas do fim da dcada de 1930, Harrison (1937) alertou: Agora que a necessidade de relacionar os dados da gentica com a embriologia est sendo usualmente reconhecida e a sede de conhecimento dos geneticistas comea a impeli-los em nossa direo, no pareceria imprprio apontar para um perigo dessa ameaada invaso. O prestgio do sucesso desfrutado pela teoria dos genes poderia facilmente tornar-se um obstculo para a compreenso do desenvolvimento, por dirigir nossa ateno exclusivamente para o genoma, enquanto movimentos celulares, diferenciao e todos os processos desenvolvimentais so de fato realizados pelo citoplasma. J temos teorias que referem os processos do desenvolvimento ao dos genes e consideram toda performance como nada mais que a consecuo dos potenciais dos genes. Tais teorias so totais e demasiadamente unilaterais. At que os geneticistas puderam demonstrar a existncia de variantes herdadas durante a fase precoce do desenvolvimento e at que os geneticistas tiveram uma bemdocumentada teoria sobre como os mesmos cromossomos podiam produzir diferentes tipos de clulas, os embriologistas em geral no sentiram a necessidade de basear sua embriologia na ao dos genes. [gene2.html]
Primeiras tentativas da gentica do desenvolvimento

Porm, alguns cientistas acharam que nem a embriologia nem a gentica estavam completas uma sem a outra. Vrias tentativas foram feitas para sintetizar as duas disciplinas, mas sua primeira integrao bem-sucedida veio no fim da dcada de
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1930, por parte de dois embriologistas, Salome Gluecksohn-Schoenheimer (agora S. Gluecksohn Waelsch) e Conrad Hal Waddington. Ambos haviam sido treinados em embriologia na Europa e tinham aprendido gentica nos Estados Unidos com estudantes de Morgan. Gluecksohn-Schoenheimer e Waddington, tentaram achar mutaes que afetassem o desenvolvimento precoce e processos afetados por esses genes. Gluecksohn-Schoenheimer (1938, 1940) mostrou que mutaes nos genes de Brachyury do camundongo, causavam desenvolvimento aberrante da poro posterior do embrio, e atribuiu os efeitos desses genes mutantes a defeitos no mesoderma axial que normalmente teriam ajudado a induzir o eixo dorsal.* Alm disso, Gluecksohn-Schoenheimer (1938) considerou que no trabalho com camundongos no era possvel fazer o que os embriologistas experimentais deveriam estar fazendo - alterando a estrutura durante seu desenvolvimento e observando quais eram as conseqncias dessa operao. Em vez disso, um novo tipo de cientista era necessrio, o geneticista do desenvolvimento: Enquanto o embriologista experimental desenvolve um dado experimento e em seguida estuda seus resultados, o geneticista do desenvolvimento tem que estudar primeiro o desenrolar do desenvolvimento (isto , os resultados da perturbao do desenvolvimento) para depois, s vezes, chegar a concluses sobre a natureza do experimento realizado pelo gene. Ao mesmo tempo, Waddington (1939) isolava diversos genes que causavam malformaes alares na mosca das frutas, Drosophila. Tambm analisava como esses genes podiam afetar os primrdios que do origem a essas estruturas. A asa da Drosophila, conforme proclamou corretamente, parecia favorvel para pesquisas sobre a ao desenvolvimental dos genes. Assim, uma das principais objees ao modelo gentico do desenvolvimento levantadas pelos embriologistas - que os genes atuam somente sobre a modelagem final do embrio e no sobre seus principais esquemas de construo foi contrariada. [gene3.html]
Evidncia para a equivalncia genmica

Ainda permanecia uma outra grande objeo para uma embriologia baseada na gentica: Como poderiam genes nucleares dirigir o desenvolvimento se os genes eram os mesmos em cada tipo celular? Essa equivalncia genmica no estava provada mas era assumida (porque cada clula o descendente mittico do ovo fertilizado) e um dos primeiros problemas da gentica do desenvolvimento era o de determinar se cada clula de um organismo tinha o mesmo genoma que outra. Metaplasia A primeira evidncia para equivalncia genmica veio aps a 2a Guerra Mundial, por parte de embriologistas que estavam estudando a regenerao de tecidos excisados. O estudo da regenerao do olho da salamandra demonstrou que mesmo clulas adultas diferenciadas podem reter o seu potencial de produzir outros tipos celulares. Portanto, os genes para os produtos desses outros tipos de clulas devem ainda estar presentes, embora normalmente no expressos. Na salamandra, a remoo da retina
*As observaes de Gluecksohn-Schoenheimer levaram 60 anos para ser confirmadas atravs da hibridizao do DNA. No entanto, quando o gene do T-locus foi clonado e sua expresso detectada pela tcnica da hibridizao in situ (discutida mais adiante neste captulo), Wilkinson e colaboradores (1990) acharam que a expresso do gene T tem um papel direto nos eventos precoces da formao do mesoderma e na morfognese da notocorda. Embora uma histria completa do desenvolvimento precoce da gentica do desenvolvimento ainda permanea por ser escrita, mais informaes sobre suas turbulentas origens podem ser encontradas em Oppenheimer, 1981; Sander, 1986; Gilbert, 1988, 1991, 1996; Burian et al., 1991; Harwood, 1993; Keller, 1995; e Morange, 1996.
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neural promove sua regenerao a partir da retina pigmentada, e uma nova lente pode ser formada a partir das clulas da ris dorsal. A regenerao do tecido lenticular da ris (a assim chamada regenerao Wolffiana a partir da pessoa que primeiro a observou em 1894) foi intensamente estudada. Yamada e seus colegas (Yamada, 1966, Dumont e Yamada, 1972) acharam que aps a remoo de uma lente, uma srie de acontecimentos leva produo de uma nova lente a partir da ris (Figura 2.4). Os ncleos do lado dorsal da ris comeam a sintetizar quantidades enormes de ribossomos, seu DNA se replica, e divises mitticas se sucedem. As clulas da ris pigmentada comeam, em seguida, a se desdiferenciar expelindo seus melanossomos (os grnulos pigmentados que do ao olho a sua cor; esses melanossomos so ingeridos por macrfagos que entram no local da ferida). A ris dorsal continua a se dividir, formando um globo de tecido desdiferenciado na regio da lente removida. Essas clulas comeam ento a sintetizar os produtos diferenciados de clulas lenticulares, as protenas do cristalino. Essas protenas so fabricadas na mesma ordem que no desenvolvimento normal da lente. Uma vez formada uma nova lente, as clulas do lado dorsal da ris cessam sua atividade mittica. Esses eventos no so a via normal pela qual a lente dos vertebrados formada. Como ser visto em detalhe mais tarde, a lente normalmente se desenvolve a partir de uma camada de clulas epiteliais da cabea, induzida pelas clulas retinais precursoras subjacentes. A formao da lente por clulas diferenciadas da ris representa metaplasia (ou transdiferenciao), a transformao de um tipo celular diferenciado em outro (Okada, 1991). A ris da salamandra, portanto, no havia perdido gene algum daqueles usados na diferenciao das clulas da lente.
Retina pigmentada
Retina neural ris dorsal
Lente
Figura 2.4
ris ventral
Regenerao Wolffiana da lente da salamandra a partir da margem dorsal da ris. (A) Olho normal, no-operado no estgio larval da salamandra Notophtalmus viridiscens. (B-G) Regenerao da lente, vista respectivamente nos dias 5, 7, 9, 16, 18 e 30. A nova lente estar completa no dia 30. (de Reyer, 1954, cortesia de R. W. Reyer.)
(B) (C)
(A)
(D)
(E)
(F)
(G)
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Clonagem de Anfbios: A Restrio da Potncia Nuclear O teste definitivo sobre se, ou no, o ncleo de uma clula diferenciada sofreu qualquer restrio funcional irreversvel, seria o de conseguir que esse ncleo gerasse todo outro tipo de clula diferenciada no organismo. Se cada ncleo fosse idntico ao ncleo do zigoto, o ncleo de cada clula deveria ser capaz de direcionar todo o desenvolvimento do organismo, quando transplantado para um ovo ativado enucleado. Porm, antes que tal experimento pudesse ser feito, trs tcnicas tiveram que ser aperfeioadas: (1) um mtodo para enuclear ovos do hospedeiro sem destru-los; (2) um mtodo para isolar ncleos doadores intactos; (3) um mtodo para transferir tais ncleos para dentro do ovo sem danificar o ncleo ou o ocito. Essas tcnicas foram desenvolvidas na dcada de 1950, em primeiro lugar por Robert Briggs e Thomas King que combinaram a enucleao com a ativao do ovo. Quando um ocito de r-leopardo (Rana pipiens) perfurado com uma agulha limpa de vidro, o ovo sofre todas as mudanas citolgicas e bioqumicas associadas fertilizao. Ocorre rearranjo citoplasmtico interno e a finalizao da meiose perto do plo animal da clula. Esse fuso meitico pode ser facilmente localizado quando empurra os grnulos pigmentados do plo animal; a puno do ocito nesse local induz o fuso e seus cromossomos a fluir para fora do ovo (Figura 2.5). O ovo hospedeiro agora considerado estar ativado (as reaes de fertilizao necessrias para iniciar o desenvolvimento foram completadas) e enucleado. A passagem de um ncleo para o ovo conseguida pela ruptura de uma clula doadora e transferncia do ncleo liberado para o ocito por meio de uma micropipeta. Algum citoplasma acompanha o ncleo para seu novo lar, mas a razo do citoplasma doador para o receptor somente de 1:105, e o citoplasma do doador no parece afetar o resultado dos experimentos. Em 1952, Briggs e King demonstraram que ncleos da clula da blstula podiam direcionar o desenvolvimento de girinos completos quando transferidos para o citoplasma do ocito. O que acontece quando ncleos de estgios mais avanados so transferidos para ocitos ativados e enucleados? Os resultados de King e Briggs (1956) esto delineados na Figura 2.6. Enquanto a maioria dos ncleos da blstula podiam produzir girinos completos, houve um dramtico decrscimo da capacidade dos ncleos derivados de estgios mais tardios direcionar o desenvolvimento direto at o estgio de
Plo animal Agulha de vidro
Fuso meitico isolado
Micropipeta
Fuso meitico
Grnulos pigmentados
Remoo dos cromossomos e do fuso da clula
Ovo ativado enucleado
Extrao e lise da clula doadora
Ncleo doador inserido na clula enucleada
Figura 2.5
Procedimento para o transplante de ncleos da blstula para ovos ativados enucleados de Rana pipiens. As dimenses relativas do fuso meitico foram exageradas para demonstrar a tcnica. A bela R. pipiens na fotografia foi derivada dessa maneira. (Segundo King, 1966; fotografia cortesia de M. DiBerardino e N. Hoffner.)
Membrana cicatriza
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Estgio desenvolvimental dos embries e girinos dos quais foram retirados os ncleos
to ca a ud l a co
Figura 2.6
Porcentagem de embries de transplantes nucleares que se desenvolvem normalmente
Bl
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Grfico de transplantes nucleares bem sucedidos, em funo da idade do desenvolvimento nuclear. A abscissa representa o estgio no qual o ncleo doador (de R. pipiens) foi isolado e inserido no ocito ativado e enucleado. A ordenada mostra a porcentagem desses transplantes capazes de produzir blstulas que podiam em seguida direcionar o desenvolvimento para o estgio do girino nadador (Segundo McKinnell, 1978.)
Girinos (Rana pipiens) nadando normalmente
Horas a 18oC
girino. Quando ncleos de clulas somticas de girinos no estgio de broto caudal foram usados como doadores, no ocorreu desenvolvimento normal. Porm, ncleos de clulas germinativas de girinos do estgio de broto caudal (que iro finalmente dar origem a um organismo completo aps a fertilizao), foram capazes de direcionar desenvolvimento completo em 40 porcento das blstulas que se desenvolveram (Smith, 1956). Assim, clulas somticas parecem perder sua capacidade de direcionar desenvolvimento completo medida que se tornam definidas e diferenciadas, e a progressiva restrio da potncia nuclear durante o desenvolvimento parece ser uma regra geral. Porm, possvel que alguns ncleos celulares diferenciados sejam diferentes de outros. Clonagem de Anfbios: A Pluripotncia de Clulas Somticas John Gurdon e seus colegas, usando mtodos ligeiramente diferentes de transplante nuclear na r Xenopus, obtiveram resultados sugerindo que os ncleos de algumas clulas diferenciadas podem permanecer totipotentes. Gurdon tambm achou uma progressiva perda de potncia no decorrer do desenvolvimento, embora clulas de Xenopus tenham retido suas potncias por um perodo de desenvolvimento mais longo (Prancha 1). As excees a essa regra mostraram ser muito interessantes. Gurdon havia transferido ncleos do endoderma intestinal de girinos Xenopus que se alimentavam, para ovos ativados enucleados. Esses ncleos doadores continham um marcador gentico (um nuclolo por clula, em lugar dos dois usuais), que os distinguia dos ncleos do hospedeiro. Entre 276 ncleos transferidos, somente 10 (1.4 porcento) promoveram o desenvolvimento at o estgio do girino que se alimentava. Transplantes seriados (que requeriam colocar um ncleo intestinal em um ovo e quando o ovo tinha se transformado em blstula, transferia-se o ncleo da blstula para vrios outros ovos), aumentavam o rendimento para 7 porcento (Gurdon, 1962). Em alguns casos, ncleos das clulas intestinais dos girinos foram capazes de gerar todas linhagens de clulas neurnios, clulas do sangue, nervos e assim por diante de um girino vivente. Alm disso, sete desses girinos (de dois ncleos originais) se metamorfosearam em rs adultas frteis (Gurdon e Uehlinger, 1966); esses ncleos eram totipotentes (Figura 2.7). King e seus colegas criticaram esses experimentos assinalando que: (1) no haviam sido tomadas suficientes precaues para ter certeza que clulas germinativas primordiais, que podem migrar at o intestino, no foram usadas como fontes de ncleos, e (2) as clulas intestinais de um girino to jovem poderiam no se qualificarem
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Figura 2.7
EXPERIMENTO Ovo no-fertilizado (cepa 2 nu) Girino (cepa 1 nu)
Procedimento empregado para obter rs maduras de ncleos intestinais de girinos de Xenopus. O ovo de tipo selvagem (2 nuclolos por ncleo; 2-nu) irradiado para destruir os cromossomos maternos, e um ncleo intestinal de um girino marcado (1-nu) inserido. Em alguns casos no ocorre diviso; em alguns casos o desenvolvimento do embrio sustado; porm, em outros casos, uma r inteiramente nova formada tendo um gentipo 1-nu. (Segundo Gurdon, 1968, 1977.)
Irradiao UV destri comossomos do ovo
Ncleo intestinal epitelial inserido no ovo irradiado
Micropipeta Ncleo intestinal
Ovo receptor irradiado RESULTADOS
Blstula
Blstula
Blstula
Sem diviso
Girino
Girino (morre)
Embrio anormal
R adulta (Cepa 1 nu)
como um tipo de clula verdadeiramente diferenciada porque clulas de girinos que se alimentam ainda contm plaquetas de gema (DiBerardino e King, 1967; McKinnell, 1978; Briggs, 1979). Para responder a essas crticas, Gurdon e seus colegas cultivaram clulas epiteliais da membrana natatria de rs adultas. Essas clulas mostraram estar diferenciadas; cada uma continha queratina, a protena caracterstica de clulas adultas da pele. Quando ncleos dessas clulas foram transferidos para ocitos ativados e enucleados de Xenopus, nenhum dos transferidos de primeira gerao progrediu alm da formao do tubo neural, pouco aps a gastrulao. Por transplantes seriados, porm, numerosos girinos foram gerados (Gurdon et al., 1975). Embora esses girinos tivessem morrido antes de atingir o estado alimentar, um nico ncleo celular diferenciado ainda retinha potncias incrveis. Um nico ncleo derivado de uma hemcia de uma r adulta (que nem se replica e nem sintetiza RNA) pode sofrer mais de 100 divises aps ser transplantado para um ocito ativado e, ainda, reter a habilidade
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de gerar girinos natatrios (Orr et al., 1986; DiBerardino, 1989). Embora DiBerardino (1987) tenha observado que at o presente, ncleo algum de uma clula documentadamente especializada, nem de uma clula adulta tenha mostrado ser totipotente, tal ncleo pode no entanto instruir a formao de todos os rgos do girino natatrio. Algumas das diferenas entre os resultados dos laboratrios de Briggs e de Gurdon, podem envolver diferenas na fisiologia do desenvolvimento das rs Rana e Xenopus. Quando se transfere um ncleo de uma clula diferenciada para o citoplasma do ocito, se est pedindo ao ncleo para reverter para condies fisiolgicas s quais ele no est acostumado. Os ncleos da clivagem das rs dividem-se rapidamente, enquanto alguns ncleos de clulas diferenciadas dividem-se raramente, se tanto. Falhas em replicar DNA rapidamente podem levar a quebras cromossmicas: tais anormalidades foram vistas em muitas clulas de girinos clonados. Sally Hennen (1970) mostrou que o sucesso desenvolvimental de ncleos doadores pode ser ampliado tratando-se esses ncleos com espermina e resfriando os ovos para dar tempo ao ncleo de se adaptar ao citoplasma do ovo. Acredita-se que a espermina remova histonas da cromatina podendo re-acertar a atividade dos ncleos. Quando ncleos do endoderma de girinos de Rana pipiens, no estgio de broto caudal, foram tratados dessa maneira, 62 porcento daqueles ncleos que iniciaram desenvolvimento normal, prosseguiram at a gerao de girinos normais. Em animais controle, nenhum dos ncleos conseguiu gerar tais girinos. Assim, os genes para o desenvolvimento do girino completo no pareceram ter sido perdidos pelas clulas do endoderma. Podemos olhar para esses experimentos de clonagem de anfbios de duas maneiras. Primeiro, reconhecer uma restrio geral de potncia concomitante ao desenvolvimento. Segundo, facilmente ver que o genoma da clula diferenciada notavelmente potente em sua habilidade de produzir todos os tipos celulares do girino anfbio. Em outras palavras, mesmo existindo um debate sobre a totipotncia de tais ncleos, existe pouca dvida de que eles so extremamente pluripotentes. Certamente, muitos genes no usados na pele ou em clulas sangneas, podem ser reativados para produzir os nervos, o estmago, ou o corao de um girino natatrio. Assim, cada ncleo no corpo contm a maioria (se no todos) dos mesmos genes.
&
Especulaes
Clonando Mamferos por Prazer e Lucro
LONAR SERES HUMANOS a partir de clulas previamente diferenciadas parece ser o objetivo de editores de jornais e novelistas. Deve ter ficado bvio da discusso precedente que clonar um indivduo totalmente desenvolvido, a partir de clulas diferenciadas, uma formidvel tarefa. Mesmo em anfbios, os ncleos das clulas diferenciadas no foram capazes de gerar animais adultos quando colocados em clulas ativadas e enucleadas. Alm disso, mesmo se rs adultas pu-
dessem ser geradas de ncleos diferenciados, essa habilidade no poderia ser extrapolada para clulas humanas. Alm das dificuldades ticas e tcnicas do trabalho com o organismo humano, o citoplasma do ocito humano pode no responder a sinais emitidos por um ncleo de uma clula em estgio avanado. Transplante nuclear foi conseguido em camundongos, pela remoo de proncleos (haplides) de espermatozide e vulo de um zigoto, e substituio por proncleos de outro (Figura 2.8; McGrath e Solter,
1983). Esses zigotos reconstrudos comeam a se dividir e so ento implantados no tero. Os camundongos resultantes exibem o fentipo do ncleo doador. Enquanto mais de 90 porcento dos zigotos enucleados do camundongo, recebendo proncleos de outros zigotos, se desenvolvem at o blastcito (blstula), nem um nico embrio (de 81), desenvolveu-se at esse estgio quando ncleos de embries de 4 clulas foram transferidos para zigotos enucleados (McGrath e Solter, 1984). Similarmente, ncleos de embries de 8 clulas
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(A)
(C)
(B)
(D)
Figura 2.8
Procedimento para transferir ncleos para o ovo ativado enucleado de mamifero. Um embrio de clula nica, incubado em colcemida e citocalasina para relaxar o citoesqueleto, seguro com uma pipeta de suco. Os ncleos haplides derivados do espermatozide e do vulo, no se juntaram ainda. A pipeta de enucleao perfura a zona pelcida (a protena que envolve o ovo) e aspira a membrana celular adjacente e a rea da clula contendo os proncleos. (A) A pipeta de enucleao retirada e o citoplasma contendo os proncleos removido do ovo. A membrana celular no est rompida; a continuidade do citoplasma limitado pela membrana est indicada pela flexa. (B) A membrana celular forma uma vescula ao redor dos proncleos no interior da pipeta de enucleao. (C) Essa vescula misturada com vrus Sendai (que induz a fuso de membranas nucleares) e inserida no espao entre a zona pelcida e o outro ovo enucleado. (D) O vrus Sendai proporciona a fuso do ovo enucleado e os proncleos envoltos pela membrana, permitindo que os proncleos (flexa) penetrem na clula. (Segundo McGrath e Solter, 1983; cortesia dos autores.)
po de ativao e implantao uterina. Usando modificaes tcnicas, Willadsen (1986) produziu carneiros de termo completo a partir de ncleos transplantados de blastmeros do estgio de 8 clulas; ncleos de embries pr-implantados de gado, porcos e coelhos foram capazes de direcionar o desenvolvimento completo quando transplantados para ocitos ativados e enucleados (Prather et al., 1987; Stice e Robl, 1988; Prather et al., 1989; Willadsen, 1989). Porm, em todos esses casos, os ncleos vieram de embries pr-implantados. Recentemente, Wilmut e colaboradores (1997) mostraram que possvel clonar um carneiro a partir de um ncleo de clula de glndula mamria adulta. Esse resultado poder ter importantes conseqncias agrcolas e legais (Prather, 1991). [gene4.html] Clonagem de Plantas Somente nas plantas os ncleos de clulas diferenciadas de organismos adultos podem ser facilmente vistos como capazes de direcionar o desenvolvimento de outro organismo adulto. Essa habilidade foi dramaticamente demonstrada em clulas de cenouras ou tabaco. Em 1958, F. C. Steward e seus colegas estabeleceram um processo pelo qual os tecidos diferenciados de razes de cenouras podiam dar origem a toda uma nova planta (Figura 2.9). Pequenos pedaos de floema so isolados da cenoura e rodados em grandes frascos contendo leite de coco. Esse fluido ( realmente o endosperma da semente do coco) contm os fatores e nutrientes necessrios para o crescimento da planta e os hormnios exigidos para a diferenciao. Sob essas condies, os tecidos proliferam e formam uma massa
e massa celular interna (os blastmeros que formam o embrio, mas no a placenta*) tambm no puderam apoiar o desenvolvimento. Em contraste com ncleos de ourios-do-mar ou anfbios, os ncleos dos blastmeros precoces do camundongo
*Cada blastmero da massa celular interna totipotente no sentido de reter sua capacidade de formar clulas de qualquer tipo no organismo. Essa capacidade permite o aparecimento de gmeos.
(cujas clulas so totipotentes) no do suporte para o desenvolvimento total. Tais experimentos provavelmente fracassam porque ncleos de blastmeros no funcionam de maneira normal no citoplasma zigtico. Por isso, a clonagem de Elvis Presley a partir de clulas diferenciadas no algo com que possamos contar. Nem todos blastmeros mamferos so os mesmos, todavia, as espcies mamferas diferem muito em termos de temFigura 2.9
Experimento de Steward demonstrando a totipotncia de clulas do floema da cenoura. Clulas livre do calo continuam a se desenvolver em suspenso Floema de raiz Corte transversal da raiz Planta jovem Planta embrionria transferida para meio de cultura de agar Planta de cenoura madura no agar
Planta de cenoura madura
Proliferao de massa celular (calo) em meio de cultura de leite de coco
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desorganizada chamada calo. A continuao da rotao leva ao desbastamento de clulas individuais do calo para o meio de suspenso. Essas clulas do origem a ndulos celulares semelhantes a razes que continuam a crescer enquanto permanecem em suspenso. A partir desses ndulos, colocados em um meio solidificado com agar, o resto da planta capaz de se desenvolver, formando uma planta
de cenoura completa e frtil (Steward et al., 1964; Steward, 1970). Porm, plantas e animais se desenvolvem de maneira diferente; a propagao vegetativa de plantas por corte (i.e, pores de plantas que quando nutridas, regeneram as partes faltantes) uma prtica agrcola comum. Alm disso, em contraste com anfbios e mamferos (nos quais as clulas germinativas
so destacadas como uma linhagem distinta de clulas no incio do desenvolvimento), as plantas normalmente derivam seus gametas de clulas somticas. Portanto, no to surpreendente que uma nica clula de uma planta possa se diferenciar em outros tipos de clulas e formar um clone geneticamente idntico (clone, do grego klon, significando ramo).
Sobre E. coli e elefantes: O modelo operon

Na maioria dos casos estudados, o genoma o mesmo de clula para clula no organismo. Os genes para a protena globina podem ser encontrados em clulas da pele, e os genes para as queratinas da pele podem ser encontrados em neurnios cerebrais. Porm, isso ainda deixa sem resposta outra grande questo levantada pelos embriologistas: Se o ncleo de cada clula no organismo tem os mesmos genes, como podem esses genes fazer com que essas clulas se tornem diferentes? *Pouco tempo aps a 2a Guerra Mundial, muitos biologistas concordaram que: a maior lacuna, ainda para ser preenchida, entre dois campos da pesquisa em biologia provavelmente aquela entre a gentica e a embriologia. o problema repetidas vezes declarado, porm, at agora no resolvido, de como clulas com genomas idnticos podem se tornar diferenciadas, adquirir a propriedade de confeccionar molculas com novos, ou no mnimo, diferentes padres ou configuraes especficos. Curiosamente, essa citao vem de Jacques Monod (1947), um geneticista microbiano trabalhando na sntese de enzimas adaptativas, que so protenas que embora no sejam usualmente sintetizadas por bactrias ou levedos, sero sintetizadas se os microorganismos encontrarem um novo substrato. Por exemplo, a bactria Escherichia coli s sintetiza -galactosidase e outras enzimas digestoras de lactose, quando encontram a lactose. Se a lactose est ausente do citoplasma, essas enzimas no so sintetizadas. Mas, com a introduo de lactose no citoplasma, esse grupo de novas enzimas aparecem. Em micrbios, ao menos, o mesmo genoma pode produzir dois estados citoplasmticos funcionalmente diferentes, dependendo da presena ou no de determinado composto (no caso, a lactose). Monod lanou a hiptese que o fenmeno da adaptao enzimtica podia oferecer a soluo para o problema de como genomas idnticos podem sintetizar diferentes molculas especficas.
*A grande exceo a essa regra da constncia dos genes os genes das imunoglobulinas discutida no Captulo 10. Cada clula tem todas as subunidades gnicas das imunoglobulinas, mas em linfcitos, algumas dessas subunidades esto rearranjadas ou mesmo suprimidas do genoma. O terceiro desafio - a explicao de como o ambiente pode direcionar o desenvolvimento foi prontamente compreendida, uma vez que a explicao geral para a expresso diferencial da expresso gnica foi estabelecida. Conforme veremos, o modelo do operon demonstrou como uma substncia do ambiente podia efetuar a expreso gnica diferenciada.
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Monod no foi o nico cientista a achar que micrbios unicelulares poderiam explicar a diferenciao multicelular. O microbiologista Sol Spiegelman (1947) declarou que a embriologia estava sendo prejudicada por sua prpria terminologia. O problema da diferenciao no podia mais ser visto como uma propriedade estrutural dos tecidos, mas passar a ser considerado uma propriedade bioqumica de clulas individuais. A diferenciao deveria ser vista no em termos anatmicos, mas como produo controlada de padres enzimticos nicos. Essa redefinio focaliza a ateno para a relao entre os genes do ncleo e as propriedades do citoplasma. Alm disso, a sntese de uma enzima adaptativa em presena do seu substrato deveria ser discutida como uma induo. Esse o termo tcnico usado em embriologia para descrever a habilidade de uma clula produzir uma substncia capaz de influenciar a diferenciao de outra. O agente molecular responsvel deveria ser chamado o indutor. Spiegelman via uma semelhana fundamental entre a induo de novos tipos celulares no embrio e a induo de novas enzimas em microorganismos. [gene5.html] No fim da dcada de 1950, um grupo de pesquisadores acreditava que micrbios eram um excelente (e facilmente estudado) modelo para diferenciao embrionria. Muitos geneticistas microbianos explicitamente ligaram enzimas indutivas a conceitos embriolgicos. Julgavam ser vlida a extrapolao, e apelaram para a unidade da natureza e, em ltima anlise, as regras simples que esperavam encontrar. Como sugerido por Monod (veja Judson, 1979), se algum entender a bactria, entender o elefante. Muitos embriologistas, porm, permaneceram cpticos a respeito da extrapolao de bactrias a embries, enfatizando a complexidade do desenvolvimento e a diversidade da performance embriolgica. Em 1961, Jacob e Monod sintetizaram dados sobre a induo da -galactosidase levando construo do modelo do operon. Esse modelo postula que a pequena molcula do indutor causava a transcrio de diferentes genes em E. coli (Figura 2.10). Em sistemas indutivos, uma protena repressora codificada por genes liga-se ao stio operador adjacente aos genes estruturais, impedindo a ligao da RNA polimerase ao stio promotor que inciaria a transcrio. Estando presente, o indutor liga-se protena repressora alterando sua conformao de forma a impedir a ligao ao operador. Com isso, o gene torna-se capaz de transcrever mRNA, que pode ser traduzido formando protena. Dessa maneira, o mesmo genoma pode sintetizar diferentes enzimas, dependendo da presena ou no do respectivo indutor. Em um importante trabalho de 1961, Jacob e Monod enfatizaram que o mecanismo de controle do operon-smile pode ser parte da regulao gnica universal. Eles conectaram seus resultados ao problema fundamental da embriologia qumica que a compreenso do porqu clulas dos tecidos no expressam constantemente todos os potenciais contidos em seu genoma. O modelo do operon foi imediatamente introduzido nos textos de embriologia por cientistas que procuravam a sntese da gentica com a embriologia. O livro de Waddington (1962), Novos Padres na Gentica e no Desenvolvimento, comea com um captulo relacionando o modelo do operon de Jacob e Monod com o controle da expresso gnica no desenvovimento dos anfbios. Waddington aprovou especialmente esse modelo porque significava que os genes no so apenas ativos, mas reativos, respondendo s mudanas no citoplasma. Waddington considerou genes e citoplasma como mutuamente interativos. Essa perspectiva foi tambm salientada em Hereditariedade e Desenvolvimento (1963), sntese de embriologia com gentica por John Moore, que conclui: Na gerao anterior, poucos embriologistas ou geneticistas teriam previsto que a sntese dos seus campos de trabalho teria se tornado possvel por estudos com a bactria Escherichia coli. No entanto, essa criatura microscpica, sem embrio prprio, mostrou um caminho. Na prxima dcada, poder ser difcil perceber a diferena entre um geneticista e um embriologista, medida que eles avanam em sua cincia para alm daquilo que cada um poderia ter conseguido isoladamente.
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(A) O operon lac
Figura 2.10
Gene indutor
Promotor Operador
Genes estruturais para utilizao da lactose
(B) Quando no h lactose disponvel Genes estruturais
Protena repressora produzidas por i liga-se a o (C ) Quando a lactose est disponvel
No h transcrio de genes estruturais
Regulao diferencial de genes em E. coli. (A-C) No estado induzvel de tipo-selvagem, no h transcrio de RNA de -galactosidase a no ser que a lactose esteja presente. (B) Quando a lactose no est disponvel, uma protena repressora produzida pelo gene i liga-se ao stio repressor (o), inibindo a transcrio pela RNA polimerase do promotor (p). (C) Quando o indutor lactose est presente, combina com a protena repressora, alterando sua forma, o que faz com que a protena no possa mais se ligar ao DNA operador , fazendo comear a transcrio. (D) A solubilidade dessa protena demonstrada em estudos com o mutante de E. coli. Quando clulas bacterianas haplides com um gene indutor nofuncional (i-) so tornadas parcialmente diplides com o gene tiposelvagem (i+), forma-se repressor tipo-selvagem capaz de tornar indutvel o gene original da -galactosidase.
Genes estruturais
Lactose mRNA
RNA polimerase -galactosidase mRNA transcrito
Lactose combinando com o repressor, previne ligao a o
(D) O repressor da lactose solvel Genes estruturais
O gene i do tipo selvagem pode produzir repressor para ambos cromossomos que se ligam a o na ausncia de lactose Genes estruturais
Sntese diferencial de RNA

A desejada unificao no ocorreu to rapidamente como esperado por Moore. Porm, baseado na evidncia embriolgica a favor da equivalncia genmica e do modelo do operon de E. coli, emergiu na dcada de 1960 um consenso de que as clulas regulam seu desenvolvimento atravs da expresso gnica diferencial. Como bactrias eram os modelos para tal atividade, expresso em geral significava transcrio de mRNA. Os trs postulados da expresso gnica diferencial eram os seguintes:
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1. Cada ncleo celular contm o genoma completo estabelecido no ovo fertilizado. Em termos moleculares, os DNAs de todas as clulas diferenciadas so idnticos. 2. Os genes no-usados das clulas diferenciadas no so destrudos ou mutados, retendo o potencial de serem expressos. 3. S uma pequena porcentagem do genoma est sendo expressa em cada clula, e uma poro do RNA sintetizado especfica para aquele tipo de clula. Os dois primeiros postulados j foram discutidos. O terceiro que s uma pequena parte do genoma est ativo produzindo produtos especficos dos tecidos foi primeiro testado em larvas de insetos. Aps a ecloso, uma larva de inseto tem duas populaes celulares diferentes, formadas por cerca de 10.000 clulas. A maior parte tem cromossomos politnicos. Tais cromossomos sofrem replicao de DNA na ausncia de mitose, contendo portanto 512 (29), 1024 (210), ou mesmo mais hlices duplas paralelas de DNA em lugar de somente uma (Figura 2.11; Prancha 31). Essas clulas no sofrem mitose, e crescem expandindo seu volume at 150 vezes. Durante a metamorfose, tais clulas morrem sendo substitudas por clulas diplides no politnicas agrupadas em certas regies da larva (veja Captulo 19). Beermann (1952) mostrou que o padro de distribuio das bandas de cromossomos politnicos era idntico ao longo da larva e que no se notavam perdas ou adies de qualquer regio cromossmica quando diferentes tipos de clulas eram comparados (Figura 2.12). Porm, Beermann estudando o mosquito Chironomus e Becker (1959) estudando Drosophila, acharam regies cromossmicas que estavam estufadas. Esses tufos apareciam em lugares diferentes nos cromossomos em cada tecido; seu aparecimento mudava com o desenvolvimento dessas clulas (Figura 2.13). Ainda mais, alguns tufos podiam ser
Figura 2.11
Cromossomos politnicos. (A) Cromossomos politnicos de clulas da glndula salivar de Drosophila melanogaster. Os quatro cromossomos esto conectados em seus centrmeros, formando um denso cromocentro. Os genes estruturais para a lcool desidrogenase (ADH), aldedo oxidase (Aldox) e octanol desidrogenase (ODH) foram mapeados nas posies designadas nesses cromossomos. (B) Fotografia ao microscpio eletrnico de uma pequena regio de um cromossomo politnico de Drosophila. As bandas escuras esto altamente condensadas comparadas com as regies interbandas. (A de Ursprung et al., 1968, cortesia de H. Ursprung; B de Burkholder, 1976, cortesia de G. D. Burkholder.)
Aldox
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estimulados ou inibidos por certas mudanas fisiolgicas causadas pelo calor ou por hormnios (Clever, 1966; Ashburner, 1972; Ashburner e Berondes, 1978). Beermann (1961) apresentou evidncias que esses tufos representam um afrouxamento localizado de cromossomos politnicos (Figura 2.14) e que so stios de sntese ativa de RNA. Duas espcies intercruzadas diferentes de Chiromonus foram encontradas: uma produzindo grande quantidade de protena salivar e a outra no (Figura 2.15). Os produtores tinham uma tufo grande (anel de Balbiani) em determinada banda; esse tufo no existia nos no-produtores. O cruzamento de produtor com no-produtor resultou em larvas produzindo quantias intermedirias de protena salivar. Cruzando duas moscas hbridas, a capacidade de produzir protena salivar segregou-se de forma Mendeliana: 1 alto produtor: 2 intermedirios:1 no-produtor. Altos produtores tinham dois tufos (um em cada cromossomo homlogo), produtores intermedirios tinham apenas um, e no-produtores nenhum tufo. Beermann concluiu que a informao gentica necessria para a sntese dessa protena salivar est presente nessa banda distal do cromossomo e que sua produo dependia de transformao em uma regio estufada.
(A)
Glndula salivar (B)
Tbulos de Malpighi
Tecido retal
Intestino
Figura 2.12
Identidade genmica em cromossomos politnicos. (A) Uma regio do conjunto cromossmico da mosca Chiromonus tentans. Notar a constncia do nmero de bandas nos diferentes tecidos. (B) Hibridizao do RNA de uma protena da gema com um cromossomo da glndula salivar larval de Drosophila. Os gros escuros (flexa) mostram onde a mensagem da protena radioativa da gema se ligou aos cromossomos. Notar que o gene para a protena est presente no cromossomo da glndula salivar, apesar da protena no ser a sintetizada. (A) Segundo Beermann, 1952; (B) De Barnett et al., 1980; fotografia cortesia de P. C. Wensink.
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Figura 2.13
Seqncia de estufamentos de uma poro do cromossomo 3 da glndula salivar de Drosophila melanogaster. (A,B) larva de 110 horas; (C) larva de 115 horas; (D,E) estgio pr-pupa (aps 4 horas). Notar o estufamento e a regresso das bandas 74EF e 75B. Outras bandas (71DE, 78D) estufam mais tarde, porm, a maioria no estufa de modo algum durante o perodo. (Cortesia de M. Ashburner.)
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
Prova adicional de que tufos cromossmicos produzem mRNA vem de estudos sobre tufos do anel de Balbiani (BR2) em Chironomus tentans. O BR2 pode ser isolado por microdisseco devido seu tamanho excepcional, e seus produtos podem ser analisados por autoradiografia (Lambert e Daneholt, 1975). A Figura 2.16 A, B mostra o isolamento de BR2 do cromossomo 4 de C. tentans. Transcrio de BR2 foi demonstrada incubando glndulas salivares isoladas com precursores de RNA
(A)
(B)
Figura 2.14
Terminao proximal do cromossomo 4 da glndula salivar de Chiromonus pallidivitatus, mostrando o enorme tufo BR2. (A) Fotomicrografia em contraste de fase, de preparaes coradas, mostrando o extenso tufo no cromossomo politnico. (B) Diagrama da regio passando por estufamento. (A de Grossbach, 1973, cortesia de U. Grossbach; B segundo Beermann, 1963)
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BR4(SZ)
Alto produtor No-produtor
BR2
Todos produtos intermedirios
BR1
BR3
Alto produtor (A) (B) (C) Produtores Intermedirios No-produtor
Figura 2.15
radioativos. O RNA radioativo pde, em seguida, ser extrado da poro BR2 do cromossomo dissecado (Lambert, 1972). Esse RNA era excepcionalmente grande cerca de 50.000 bases. O grande segmento de RNA radioativo, especificamente hibridizado para a regio BR2 do cromossomo, mostrou que o DNA estufado (Puff de DNA) - e nenhum outro local - tinha-o transcrito ativamente (Figura 2.16C). Esse mesmo RNA pde ser isolado de polissomos sintetizadores de protenas, indicando que ativo na sntese protica (Wieslander e Daneholt, 1977). Assim, um RNA transcrito de uma banda especfica de DNA, que estufa na glndula salivar larval, pode posteriormente ser visto produzindo protenas em ribossomos citoplasmticos.
Correlao de padres de estufamento com funes especializadas nas clulas das glndulas salivares de Chironomus pallidivitatus. (A) Cromossomo de uma clula produzindo uma secreo granular e mostrando um anel de Balbiani adicional [BR4(SZ)]. (B) Cromossomo 4 de uma clula salivar, mostrando somente anis de Balbiani 1, 2 e 3 (BR1, BR2, BR3). (C) Evidncia gentica que a sntese de uma importante protena salivar depende da formao de tufos BR4(SZ). Larvas com altos nveis de secrees granulares tm clulas salivares glandulares com tufos BR4(SZ) em ambos cromossomos 4 (coloridos), enquanto larvas sem essas secrees no tm tais tufos. Produtores intermedirios tm somente um cromossomo 4 com uma regio estufada BR4(SZ) em cada clula salivar realizando a secreo. (A e B segundo Beermann, 1961, cortesia de W. Beermann.)
(A)
(B) BR 2
Figura 2.16
(C)
(A,B) Isolamento da regio BR2 de Chironomus tentans por micromanipulao. O cromossomo intacto 4 pode ser dividido em trs regies, uma contendo BR2. (C) Transcrio da regio BR2 mostrado por uma auto-radiografia in situ aps hibridizao do BR2 RNA com a preparao cromossmica. (A e B de Lambert e Daneholt, 1975; C de Lambert, 1972; fotografias cortesia de B. Lambert.)
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Portanto, os tufos nos cromossomos salivares esto produzindo mRNA ativamente. Em clulas que sintetizam essa protena, o gene est ativado; em clulas que no usam essa protena, o gene permanece reprimido.
Hibridizao de cido nuclico

Poucos genes puderam ser analisados como aqueles nos tufos politnicos de Chiromonus. E embora esses genes dos tufos eram ativos em clulas que j se haviam diferenciado (como aquelas da glndula salivar), no eram os genes causadores da diferenciao celular. Para encontrar e analisar os genes que so responsveis pelo desenvolvimento embrionrio, novas tcnicas tiveram que ser aperfeioadas. A maioria das tcnicas para anlise de genes eucariotos baseia-se na hibridizao de cidos nuclicos. Essa tcnica envolve fortalecimento de pedaos de fitas simples de RNA e DNA, para permitir a formao de hbridos de fitas duplas. Por exemplo, se o DNA cortado em pequenos pedaos e cada pedao dissociado em duas fitas simples desnaturado cada fita na soluo dever achar e reunir-se com seu parceiro complementar, quando lhe dado tempo suficiente para isso. As condies de renaturao devem ser tais que ligao especfica entre fitas complementares seja mantida e combinaes no especficas sejam dissociadas. Isso , em geral, conseguido variando a temperatura ou as condies inicas da soluo em que ocorre a renaturao (Wetmur e Davidson, 1968). De maneira semelhante, RNA sintetizado a partir de uma regio particular do DNA poderia ser esperado ligar-se fita do qual foi transcrito (Figura 2.17). Assim, RNA pode ser esperado hibridizar especificamente com o gene que o codifica. Para medir essa hibridizao, uma das fitas de cido nuclico (a sonda) em geral marcada pela incorporao de nucleotdeos radioativos. Um problema tcnico que inicialmente atormentou os estudos de hibridizao de cidos nuclicos foi a dificuldade em conseguir colocar quantidades suficientes de radioatividade na molcula de RNA. Esse problema foi superado isolando o RNA e fazendo uma cpia complementar de DNA (cDNA) na presena de precursores radiativos. Isso pode ser feito em tubo de ensaio contendo o RNA, uma extenso curta de DNA (chamado de iniciador ou primer), precursores radioativos de DNA e a enzima viral transcriptase reversa. Essa enzima pode produzir DNA de um molde de RNA (Figura 2.18). O DNA sintetizado in vitro, no sendo necessrio preocupar-se com a diluio
(A)
Condies de desnaturao (calor, lcali)
Condies de re-anelamento
Figura 2.17
Hibridizao de cidos nuclicos. (A) Se a hlice de DNA for separada em duas fitas, essas devem se re-anelar sob condies adequadas de fora inica e tempo. De maneira semelhante, se o DNA for separado em suas duas fitas, o RNA deve ficar capacitado a se ligar a genes que o codificam. Se presente em quantidades suficientemente grandes em comparao com o DNA, o RNA ir substituir uma das fitas de DNA nessa regio.
(B)
RNA
Desnaturar; adicionar RNA (em grande quantidade em comparao com DNA)
RNA hibridiza com uma fita de DNA
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dos precursores radiativos. Alm disso, o DNA pode hibridizar tanto com o gene que produziu o RNA (embora a outra fita) e com o prprio RNA, tornando-o extremamente til para a deteco de pequenas quantidades de RNAs especficos.[other.html#gene6]
mRNA Anelar iniciador mRNA
Clonagem de DNA genmico

J em 1904 Theodor Boveri desesperava-se, considerando que as tcnicas de sua poca nunca seriam suficientes para permitir-lhe estudar como os genes criam embries. Havia necessidade de uma tcnica especial de amplificao gnica: Porque no somente o ncleo, nem mesmo cromossomos individuais, mas certas partes de certos cromossomos de certas clulas que precisam ser isolados e coletados em quantidades enormes para anlise; essa seria uma pr-condio para colocar o qumico em uma posio a qual lhe permitiria analisar (o material hereditrio) com mais mincias que o morfologista. Entretanto, desde a dcada de 1970 a hibridizao de cido nuclico permitiu aos biologistas do desenvolvimento realizar o que Boveri aspirava: isolar e amplificar regies especficas do cromossomo. A tcnica principal para isolar e amplificar genes individuais chamada clonagem de genes. A primeira fase desse processo consiste no corte de DNA nuclear em pedaos distintos, por incubao de DNA com uma endonuclease de restrio (geralmente chamada de enzima de restrio). De modo geral, essas endonucleases so enzimas bacterianas que reconhecem seqncias especficas do DNA e o clivam nesses stios (Tabela 2.1; Nathans e Smith, 1975). Por exemplo, quando DNA humano incubado com a enzima BamHI (de Bacillus amyloliquifaciens, cepa H), o DNA clivado em cada stio onde aparece a seqncia GGATCC. Os produtos so fragmentos de DNA de vrios tamanhos, todos terminando com G em um dos lados e GATCC no outro (Figura 2.19). Esses pedaos so freqentemente chamados de fragmentos de restrio.
Transcriptase reversa mRNA cDNA lcali
cDNA
Figura 2.18
Mtodo para preparar DNA complementar (cDNA). A maioria dos mRNA possui uma longa cadeia de resduos de adenosina (AAAn) no terminal 3 da mensagem (a ser discutida no Captulo 12); por isso, o pesquisador anela um iniciador consistindo de 15 resduos de desoxitimidina (dT15) ao final 3' da mensagem. Transcriptase reversa em seguida, transcreve uma fita de DNA complementar, comeando no iniciador dT15. O cDNA pode ser separado aumentando o pH da soluo, dessa maneira, desnaturando o hbrido de dupla fita e clivando o RNA.
Tabela 2.1 Stio enzimtico*
Enzimas de restrio comumente usadas Derivao Reconhecimento e clivagem
EcoRI BamHi HindIII SalI SmaI HhaI HaeIII AluI
Escherichia coli Bacillus amyloliquifaciens Haemophilus influenzae Streptomyces albus Serratia marcescens Haemophilus haemolyticus Haemophilus aegyptius Arthrobacter luteus
G AA T T C C T TAA G G G AT C C C C TAG G A AG CTT TTC GA A G TC GAC CAG C T G CCC GGG GGG CCC GCG C C GCG GG CC CC GG AGCT T C GA
* Todos os stios de reconhecimento de enzimas de restrio tm um centro de simetria. A seqncia de dupla fita lida em uma direo idntica seqncia lida da frente para trs na outra direo.
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O prximo procedimento na clonagem do gene incorporar esses fragmentos de restrio em vetores de clonagem. Usualmente esses vetores so molculas circulares de DNA, replicadas em clulas bacterianas, independentemente do cromossomo bacteriano. So usados plasmdeos resistentes a drogas ou vrus especialmente modificados (que so muito teis na clonagem de grandes fragmentos de DNA). Por exemplo, um vetor pode ser construdo contendo apenas um stio sensvel BamHI. Esse vetor pode ser aberto por incubao com essa enzima de restrio. Aps a abertura, ele pode ser misturado com os fragmentos de DNA humano, produzidos tambm por BamHI. Em muitos casos, os pedaos do DNA cortado sero incorporados a esses vetores (porque seus terminais so complementares aos terminais abertos do vetor) e ligados covalentemente, colocando-os em uma soluo contendo a enzima DNA ligase. O processo total fornece plasmdeos bacterianos, cada um contendo um nico pedao de DNA humano. Esses so chamados plasmdeos recombinantes ou, geralmente, DNA recombinante (Cohen et al.,1973; Blattner et al., 1978). O plasmdeo ilustrado na Figura 2.19 pUC18, um vetor freqentemente usado por biologistas moleculares (Vierra e Messing,1982). Ele contm (1) um gene resistente a drogas, AmpR, que torna a bactria imune ampicilina e permite ao pesquisador selecionar aquelas bactrias que incorporaram um plasmdeo; (2) uma origem para a replicao de DNA, permitindo ao plasmdeo replicar centenas de vezes em cada bactria; e (3) um poli-ligante, um pedao curto de DNA artificial que contm os stios enzimticos de restrio para vrias dessas endonucleases. O poli-ligante se situa dentro de um gene lacZ que codifica a -galactosidase de E. coli. O poli-ligante suficientemente curto (e tem o nmero correto de pares de bases) de modo a no interferir com a atividade enzimtica da -galactosidase. O processo de clonagem comea quando os fragmentos de restrio do DNA nuclear so misturados aos plasmdeos abertos pUC18 e a eles so ligados, ocasionando o fechamento do plasmdeo. Os plasmdeos recombinantes putativos assim formados so ento incubados com clulas de E. coli sensveis ampicilina e sem o gene da -galactosidase. Mesmo que as bactrias e os plasmdeos sejam misturados em condies que encorajam as bactrias a incorporar os plasmdeos, nem todas as bactrias incorporam um plasmdeo. Para evidenciar aquelas bactrias que incorporaram plasmdeos, as clulas tratadas de E. coli so cultivadas em gar contendo ampicilina. Somente aquelas bactrias que incorporaram um plasmdeo (com seu gene dominante, ampicilina-resistente) sobrevivem. Mas nem todos plasmdeos incorporaram um gene estranho, porque possvel que os terminais adesivos do stio da enzima de restrio sofram uma renaturao entre si mesmos. Para distinguir entre colnias bacterianas que incorporaram DNA estranho e aquelas que no o fizeram, o gar tambm contm um corante chamado Xgal. Esse composto incolor, mas quando transformado pela -galactosidase forma um precipitado azul *.Assim, se um plasmdeo no incorporou um fragmento de restrio ao stio de enzima de restrio no poli-ligante, o gene da -galactosidase (lacZ) est funcional e a -galactosidase resultante torna o corante azul. O resultado o aparecimento de colnias azuis. Entretanto, se o plasmdeo incorporou um fragmento de DNA, o gene da -galactosidase destrudo pela insero. Essas bactrias no vo produzir a cor azul do corante; produzem colnias incolores no gar. Colnias incolores so ento selecionadas quanto a presena de um gene especfico. Clulas de cada uma dessas colnias so colocadas em um finssimo filtro de nitrocelulose ou nylon. Quando essas clulas so lisadas, seu DNA adere aos filtros. Em seguida, as fitas de DNA so separadas por aquecimento, e os filtros incubados em uma soluo contendo o RNA radioativo (ou sua cpia de cDNA) do gene que se
*O corante 5-bromo-4-cloroindol, e azul a no ser quando est complexado com uma molcula como galactose. A -galactosidase codificada pelo gene do plasmdeo cliva a galactose do corante permitindo que adquira a conformao azul.
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Stio Hind III
Stio BamHI
Stio Eco RI Poli-ligante
Plasmdeo cortado no gene lacZ Quebra endonucleoltica por BamHI
Fragmentos de gene humano incubados e ligados em um plasmdeo
Plasmdeo recombinante com gene lacZ interrompido
DNA humano Quebra endonucleoltica por BamHI Mistura com bactrias (lacZ, sensvel amp.)
Figura 2.19
Um protocolo geral para clonar DNA, usando como exemplo a insero de uma seqncia de DNA humano em um plasmdeo com um stio sensvel BamHI.
Colnias incolores
quer clonar. Em alguns casos, a seqncia do mRNA ou gene no conhecida, devendo-se ento estimar a seqncia a partir da seqncia de aminocidos da protena). Se o plasmdeo contm aquele gene, seu DNA deve estar no filtro, e somente aquele DNA dever ser capaz de ligar o RNA radioativo ou a sonda de cDNA. Portanto, somente aquelas reas sero radioativas. A radioatividade nessas regies determinada por auto-radiografia. Filme sensvel a raios-X colocado sobre o papel tratado. Os eltrons de alta energia, emitidos pelo RNA radioativo, sensibilizam os gros de prata no filme, tornando-os escuros quando o filme revelado. Finalmente, uma mancha escura produzida sobre cada colnia contendo o plasmdeo recombinante que carrega o gene especfico (veja Figura 2.19). Essa colnia ento isolada e cultivada, produzindo bilhes de bactrias, cada uma contendo centenas de plasmdeos recombinantes idnticos. Os plasmdeos recombinantes podem ser separados do cromossomo da E. coli por centrifugao, e incubando o DNA do plasmdeo com BamHI libera-se o fragmento de DNA extranho que contm o gene. Esse fragmento pode ser separado do DNA plasmdico, permitindo ao pesquisador possuir microgramas de seqncias de DNA purificado contendo o gene especfico. Apesar desse procedimento parecer muito lgico e fcil, freqentemente o nmero de colnias a serem selecionadas astronmico. O nmero de fragmentos aleatrios que devem ser clonados para a obteno do gene desejado, aumenta com a crescente complexidade do genoma do organismo*. Para detectar um gene especfico de um genoma de mamfero, milhes de clones individuais devem ser selecionados.
*Complexidade se refere ao nmero de diferentes tipos de genes no ncleo. Apesar que milhes de clones precisam ser selecionados, aproximadamente 100.000 colnias podem, agora, ser selecionadas em uma nica placa. Outra maneira comum de selecionar os clones usar um plasmdeo que tem seu stio da enzima de restrio prximo a um vigoroso promotor bacteriano (tal como aquele para -galactosidase). As bactrias transcrevero o cDNA e o traduziro em protena. Aps a lise das colnias bacterianas no papel de filtro, as protenas aderem ao papel e podem ser identificadas por anticorpos dirigidos contra quela protena. Isso chamado clonagem de expresso, e os plasmdeos referidos como vetores de expresso.
Meio contendo ampicilina Colnias azuis Aplicao das colnias incolores nos crculos do papel de filtro; lisar para expor o DNA
mRNA radioativo Papel de filtro incubado com mRNA radioativo do gene a ser clonado
Preparao de auto-radiografia para indicar os clones bacterianos com fragmento de DNA que formou um hbrido com o DNA radioativo
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Hibridizao de DNA: entre e intra espcies

Clones podem ser selecionados por qualquer segmento de nucleotdeos radioativos. Portanto, os genes clonados de um organismo podem ser sondados com cDNAs radioativos derivados do mRNA de outras espcies. Uma das descobertas mais excitantes da moderna biologia do desenvolvimento foi verificar que genes usados para processos especficos de desenvolvimento em um organismo, podem ser usados para processos similares em outro organismo. Drosophila teve uma importncia crtica na descoberta desses genes. Iniciando com Morgan, esses genes foram mapeados e, nos anos 60, E. B. Lewis confirmou que alguns desses genes so responsveis pela formao de partes bsicas do corpo (veja Captulo 14). Um deles, Antennapedia, um gene cujo produto protico essencial para inibir a formao de estruturas da cabea no trax. Se o gene no est presente, antenas crescem onde deveriam estar as pernas. Se o gene expresso na cabea (como sucede em um mutante especfico), a mosca desenvolve um conjunto extra de pernas saindo das cavidades orbitais (veja Figura 14.28). Poderia tal gene existir em vertebrados? Evidncias desses genes em vertebrados apareceram em transferncias de DNA, algumas vezes chamadas de transferncias Southern devido a seu inventor, E. M. Southern (1975). DNA de numerosos organismos vertebrados e invertebrados, foram tratados com uma enzima de restrio, e os fragmentos de DNA resultantes foram separados em uma eletroforese em gel. As misturas de fragmentos foram colocadas em fendas em um dos lados do gel, que foi em seguida submetido uma corrente eltrica. Os fragmentos de DNA carregados negativamente migraram em direo ao plo positivo, os fragmentos menores movendo-se mais rapidamente do que os maiores. * Como a hibridizao no pode ser feita dentro do gel; o DNA deve ser colocado em uma superfcie plana, e isso feito por transferncia. Aps a desnaturao das fitas de DNA em lcali, os pesquisadores retornaram o gel a um pH neutro e em seguida o colocaram sobre um papel de filtro mido suportado por uma estrutura de plstico (Figura 2.20; Mc Ginnis et al., 1984; Holland e Hogan, 1986). Papel de nitrocelulose (capaz de ligar DNA de fita nica) foi colocado diretamente sobre o gel e coberto com mltiplas camadas de papel-toalha secas. O papel de filtro abaixo do gel estava em comunicao com o interior de uma cuba contendo tampo de alta fora inica. O tampo caminhou para cima atravs do gel e do filtro de nitrocelulose para as toalhas de papel. O DNA tambm foi levado por esse fluxo de tampo, mas foi detido pelo filtro de nitrocelulose; assim, o DNA foi transferido do gel ao papel de nitrocelulose. Aps fixar pelo calor os fragmentos de DNA no papel de nitrocelulose (de outra forma eles
*Considerando a mesma relao carga/massa, fragmentos menores adquirem uma maior velocidade que os maiores quando impulsionados pela mesma energia. Isso uma funo da equao de energia cintica, E=1/2 mv2. Resolvendo para velocidade, encontramos que ela inversamente proporcional raiz quadrada da massa. Filtro de nitrocelulose ou nylon Espaadores Desnaturar fragmentos de DNA fitas simples em lcali Papel-toalha Contatos de papel de filtro Peso
Figura 2.20
Transferncia Southern. DNA tratado com enzimas de restrio e os fragmentos resultantes so colocados em um gel e separados por eletroforese. Aps a separao, o DNA desnaturado em fitas nicas. O gel , em seguida, colocado sobre um papel de filtro saturado com tampo de alta fora inica. Papel de nitrocelulose ou um filtro de nylon colocado sobre o gel e o conjunto coberto com toalhas de papel. O tampo de transferncia atravessa o gel, o papel de nitrocelulose e as toalhas por ao capilar, levando junto o DNA. O DNA de fita nica retido pelo papel de nitrocelulose. As posies do DNA no papel diretamente refletem a posio dos fragmentos de DNA no gel.
Suporte Cuba com soluo tampo Gel Colocar filtro de nitrocelulose ou membrana de nylon sobre gel: colocar papel-toalha e peso
Digesto com restrio e eletroforese em gel de agarose
Colocar gel no papel de filtro mido entre 2 espaadores
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Figura 2.21
Transferncia Southern do DNA de vrios organismos usando uma sonda radioativa do gene Antennapedia de Drosophila melanogaster. No se espera que as seqncias de espcies to diversas sejam perfeitamente idnticas e por essa razo o rigor da hibridizao diminudo trocando as solues salinas. (Coloquialmente esse baixo rigor das transferncias ao longo dos filos chamado transferncias de zoolgico, por razes bvias). Autoradiografia mostra que os genes de Drosophila contm vrias pores que so como as do gene Antennapedia em termos de estrutura; tambm, muitos organismos contm vrios genes que formaro hbridos com esse fragmento gnico radioativo, sugerindo que genes similares a Antennapedia existem nesses organismos. Os nmeros ao lado das transferncias indicam os tamanhos das bandas, em quilobases. (de McGinnis et al.,1984, cortesia de W. McGinnis.)
Drosophila Besouro melanogaster 10 10
Galinha Camundongo
Ubx ftz
10
10
3 3
Antp 1 1 1 1
se desprenderiam), o conjunto foi incubado com cDNA radioativo de uma poro do gene Antennapedia de Drosophila. Um autoradiograma do papel de nitrocelulose mostrou onde o DNA radioativo encontrou seu semelhante. Os resultados desses experimentos (Figura 2.21) mostraram que mesmo vertebrados (camundongos, humanos e pintos) tm genes que hibridizam com essas seqncias. Essa seco radioativa do gene Antennapedia foi usada para selecionar uma biblioteca genmica de clones de DNA derivados do genoma dessas diferentes espcies. Como veremos no Captulo 16, pesquisadores encontraram clones contendo genes que se parecem com o Antennapedia; esses genes se mostraram extremamente importantes na formao do eixo do corpo dos vertebrados.
Seqenciamento de DNA
Dados de seqncia podem dar informaes sobre a estrutura da protena codificada e podem identificar seqncias regulatrias de DNA que certos genes tm em comum. A simplicidade da tcnica de seqenciamento didesoxi de Sanger (Sanger et al.,1977) tornou-a um procedimento padro em muitos laboratrios de biologia molecular. No incio, usa-se um vetor contendo o gene clonado e se isola uma fita nica do DNA circular (Figura 2.22). Funde-se (anela-se) ento um iniciador (primer) radioativo de DNA (aproximadamente 20 pares de bases) complementar ao DNA do vetor imediatamente 3' ao gene clonado. (Porque essas seqncias dos vetores so conhecidas, iniciadores oligonucleotdicos podem ser facilmente sintetizados ou adquiridos comercialmente). O iniciador tem uma ponta 3' livre qual mais nucleotdeos podem ser adicionados. Coloca-se o DNA alvo e o iniciador juntamente com todos os quatro desoxirribonucleosdeos trifosfatos em quatro tubos de ensaio. Cada um dos tubos contm a subunidade polimerizante da DNA polimerase e um diferente didesoxinucleosdeo trifosfato: um tubo contm didesoxi-G, outro didesoxi-A e assim por diante. As estruturas dos desoxinucleotdeos e dos didesoxinucleotdeos esto representadas na Figura 2.23. Enquanto o desoxirribonucleotdeo no tem um grupo hidroxila (OH) no carbono 2' do seu acar, o didesoxirribonucleotdeo no tem grupos hidroxila em ambos os carbonos, 2' e 3'. Assim, mesmo que um didesoxirribonucleotdeo possa ser ligado a uma crescente cadeia de DNA pela DNA polimerase, ele interrompe o crescimento da cadeia por no ter um grupamento 3' ao qual se ligaria um novo nucleotdeo. Assim, quando a DNA polimerase est sintetizando DNA do iniciador, o novo DNA ser complementar ao gene clonado. No tubo com didesoxi-A, entretanto, sempre que a polimerase coloca um A na cadeia crescente, existe a possibilidade de que um didesoxi-A seja colocado em lugar do desoxi-A. Se isso acontecer, a cadeia pra. Similarmente, no tubo com didesoxi-G, a cadeia tem o potencial de parar toda vez que um G inserido. (O processo foi comparado uma dana folclrica grega na qual uma pequena porcentagem dos danarinos em potencial tem um brao em uma tipia).
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Fita nica desnaturada de DNA de plasmdeo recombinante
Iniciador
Subunidade polimerizante de DNA polimerase I de E. coli + dATP, dGTP, dCTP e dTTP
Seqncia da fita do iniciador Seqncia complementar Fragmentos maiores
Fragmentos menores
Figura 2.22
O mtodo didesoxi de seqenciar DNA. A fotografia contm a regio da auto-radiografia que mostra essa seqncia (Cortesia de G. Guild).
Adenina
Adenina
Base 1
Base 2 Adenina Desoxiadenosina trifosfato (acar desoxirribose) (A) Didesoxiadenosina trifosfato (acar didesoxirribose)
(B)
Figura 2.23
Comparao entre desoxinucleotdeos e didesoxinucleotdeos. (A) Estruturas dos dois tipos de nucleotdeos. A diferena evidenciada em cores. (B) O terminal 3' de uma cadeia que terminou pela incorporao de um didesoxinucleotdeo no tem um grupo hidroxila 3' terminal para continuar a polimerizao do DNA.
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Em cada tubo esto sendo feitas milhes de cadeias e por essa razo eles contero uma populao de cadeias, algumas interrompidas no primeiro stio possvel, outras no ltimo e algumas em stios intermedirios. O tubo com didesoxi-A, por exemplo, conter cadeias com diferentes e distintos comprimentos, cada uma terminando com o resduo A. Os fragmentos de DNA radioativo resultantes sero separados por eletroforese. O resultado uma escada de fragmentos onde cada degrau uma seqncia de nucleotdeos de comprimento diferente. Lendo escada acima, obtem-se a seqncia do DNA complementar quela do gene clonado.
Anlise de mRNA atravs de bibliotecas de cDNA

Agora podemos retornar especificidade da transcrio de mRNA: possvel isolar populaes de mRNA que caracterizam certos tipos de clulas e esto ausentes em todas as outras? Para encontrar esses RNAs, podemos clonar os mRNA de diferentes tipos de clulas e compar-los. Como mostra a Figura 2.24A, isso feito tomando os RNAs mensageiros de uma clula ou tecido e convertendo-os em fitas de DNA complementar. Levando esse procedimento um passo frente (com o auxlio de DNA polimerase e S1 nuclease), podemos transformar essa populao de cDNA de fita nica em outra contendo pedaos de cDNA com fitas duplas. Essas fitas de DNA podem ser inseridas em plasmdeos, adicionando-lhes finais apropriados com DNA ligase. Acoplando um fragmento GATCC/ G aos terminais rombudos desse pedao de DNA cria-se um corte artificial de restrio BamHI, o que permite a insero em um vrus ou plasmdeo clivado por essa enzima (Figura 2.24B). Tais colees de clones derivados de mRNAs so freqentemente chamadas de bibliotecas. Assim, podemos ter uma biblioteca de fgado de embrio de camundongo de 16 dias, representando todos os genes ativos produzindo protenas hepticas embrionrias. Podemos ter tambm uma biblioteca de ocitos vegetais de Xenopus, representando mensagens presentes somente em uma parte especfica daquela clula. Genes clonados dessa maneira so muito importantes porque eles no tm ntrons. Quando adicionados s clulas bacterianas, esses genes podem ser transcritos e em seguida traduzidos nas protenas que codificam. Bibliotecas tm sido extremamente teis no estudo de desenvolvimento como demonstram os esforos de Wessel e colaboradores (1989) em verificar diferenas nos RNAs de diferentes partes do embrio, em gastrulao, do ourio-do-mar. Para encontrar mRNAs especficos do endoderma em ourio-do-mar, Wessel e colaboradores prepararam uma biblioteca de cDNA de embries gastrulantes. O mRNA dessas amostras (a maior parte do RNA de clulas eucariticas ribossmico) foi isolado por passagem em esferas com oligo-dT, as quais capturam as caudas de poli(A) das mensagens (veja legenda da Figura 2.19). A populao de mRNA foi, ento, convertida em uma de cDNA pelo uso da transcriptase reversa (veja Figura 2.24A). Usando polimerase I de E. coli o cDNA de fita nica foi transformado em fita dupla. No prximo passo, os cDNAs de fita dupla foram ligados a finais de EcoRI que esto disponveis no comrcio. Isso os tornou clonveis em vetores que foram abertos com a enzima de restrio EcoRI. O DNA foi misturado com os braos de um fago geneticamente modificado (veja Figura 2.24B). Esse fago construdo de tal maneira que ao ser cultivado em uma placa de Petri, os fagos que incorporaram o DNA (e assim destruram o gene da galactosidase) produzem placas incolores (Figura 2.24C). Dessa forma, foram gerados aproximadamente 4 milhes de fagos recombinantes, cada um contendo um cDNA representando uma molcula de mRNA. O prximo passo envolvia selecionar os fagos recombinantes. Quais deles representariam mRNAs encontrados no endoderma e no em outras camadas celulares? Wessel e seus colegas isolaram populaes de mRNAs do mesoderma, ectoderma e endoderma. Depois prepararam cDNAs marcados de cada uma das populaes de mRNA, usando precursores radioativos. Agora, possuam trs colees de molculas
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(A)
Preparao de cDNA clonvel Regio codificadora mRNA Anela iniciador oligo (dT)
(B)
Insero de cDNA de dupla fita no vetor viral (bacterifago )
DNA de fago
BamHI Regio codificadora mRNA Transcriptase reversa Brao esquerdo Brao direito
cDNA mRNA Hidrlise alcalina cDNA de dupla fita preparado como descrito em (A) Inserir cDNA nos terminais do DNA do fago ; ligar No necessrio para a replicao do fago Braos contm todos os genes necessrios para a replicao, mas muito pequeno para o empacotamento
cDNA
DNA polimerase I Regio codificadora cDNA
S1 nuclease Regio codificadora Fita dupla cDNA Adicionar finais Bam HI
cDNA do mRNA, agora clonado em vetores virais
de cDNA radioativos, cada uma representando a populao de mRNA de uma das trs camadas germinativas. Os fagos recombinantes representando os mRNAs do embrio, em gastrulao, do ourio-do-mar foram cultivados e amostras de numerosas colnias cada uma contendo milhares de fagos colocadas em dois filtros de nitrocelulose (Figura 2.24D). O conjunto foi colocado em soluo de lcali para a lise dos fagos e obteno de DNA de fita nica. Um desses papis de filtro foi incubado com cDNA radioativo feito a partir do mRNA total do endoderma; o outro papel incubado com sondas radioativas para ambos, mesoderma e ectoderma. Os filtros foram lavados para a remoo de cDNA radioativo no hibridizado, secos e expostos em filmes para raios-X. Se um mRNA estivesse presente no endoderma, mas no no ectoderma ou mesoderma, o DNA recombinante produzido daquela mensagem deveria ligar cDNA radioativo do endoderma e no deveria encontrar um mRNA em qualquer outro lugar. Como resultado, aquela mancha de DNA recombinante do endoderma deveria ser radioativa (pois foi ligado ao cDNA radioativo do endoderma), mas o mesmo clone no deveria ser radioativo quando exposto a mRNA ectodrmico ou mesodrmico; isso foi confirmado. Um fago recombinante, em particular, ligou somente cDNA radioativo produzido
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(C) Preparao da biblioteca de clones do fago
(D) Seleo da biblioteca de fagos clonados Transferir alguns fagos para filtros de nitrocelulose
Fago hbrido Adicionar camada de clulas de E. coli
Filtros de nitrocelulose
Infeco de E. coli pelo fago
Lise Placa Zona de lise indicando clones do fago
Tratar filtros com soluo alcalina para lisar os fagos e desnaturar o DNA liberado
Camada de bactrias E. coli
Incubar com sonda radioativa para endoderma
Incubar com sonda radioativa para mesoderma e ectoderma
Figura 2.24
Protocolo usado para organizar bibliotecas de cDNA. (A) RNA mensageiro isolado e feito seu cDNA, que em seguida transformado em dupla fita e adicionado de fragmentos finais de restrio. (B) Os genes cDNA so inseridos em vetores especialmente modificados, nesse caso, bacterifagos. (C) Os fagos contendo o DNA recombinante lisaro E. coli formando placas. Tcnicas bioqumicas podem distinguir placas de fagos recombinantes daquelas que no tm o gene inserido. (D) As placas so transferidas para papel de nitrocelulose e tratadas com lcali para lisar os fagos e desnaturar DNA localmente. Esses filtros so ento incubados com sondas radioativas (usualmente cDNA) de um tecido. Para a seleo da biblioteca diferencial de cDNA, discutida no texto, a mesma biblioteca de fagos foi selecionada com sondas radioativas de dois tecidos diferentes, permitindo ao pesquisador procurar por um mRNA encontrado em um tipo de tecido mas no em outro.
Sonda radioativa DNA de fago de fita nica ligado ao filtro Preparao dos autoradiogramas
Clone de DNA representando o mRNA encontrado no endoderma mas no no mesoderma ou ectoderma
de mRNA do endoderma; portanto, representava um mRNA encontrado no endoderma e no no mesoderma ou ectoderma. O fago contendo esse gene pode agora ser cultivado em grandes quantidades e caracterizado.
Tcnicas de localizao de RNA

Hibridizao In Situ O processo de hibridizao in situ, desenvolvido por Mary Lou Pardue e Joseph Gall (1970), permite ao pesquisador visualizar as posies de cidos nuclicos especficos dentro de clulas e tecidos. Se um clone especfico considerado interessante (por exemplo, o clone endoderma-especfico que foi mencionado) ele cultivado em
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grandes quantidades, e o gene clonado isolado tratando o vetor recombinante com enzimas de restrio. Esse transformado em fita nica e tornado radioativo. Quando o cDNA radioativo adicionado s clulas fixadas apropriadamente em lminas de microscpio, o cDNA radioativo se liga unicamente onde est presente o mRNA complementar. Aps eliminao do cDNA no fixado, a lmina coberta com uma emulso fotogrfica transparente para auto-radiografia. As manchas resultantes, diretamente acima de onde o cDNA radioativo foi ligado, parecem escuras quando visualizadas diretamente, ou brancas quando vistas com iluminao em campo escuro. Assim, pode-se visualizar aquelas clulas (ou mesmo regies dentro das clulas) que acumularam um tipo especfico de mRNA. A Figura 2.25A,B mostra hibridizao in situ usando o cDNA especfico para clulas endodrmicas. O cDNA encontra mRNAs somente no endoderma da gstrula precoce do ourio-do-mar. Continuando a gastrulao, o cDNA (e portanto o mRNA) se localiza de forma ainda mais precisa entre a regio do intestino posterior e o intestino mdio no tubo endodrmico. Trabalhando com sondas radioativas e emulses, torna-se necessrio o uso de seces microscpicas extremamente finas. Uma tcnica mais recente para hibridizao in situ utiliza sondas que ligam reagentes coloridos. Dessa maneira, cientistas podem observar rgos inteiros (e organismos) sem seccion-los, e com uma viso de amplas regies de expresso gnica. A Figura 2.25C mostra uma hibridizao in situ, realizada em montagem integral, em um embrio de camundongo com 10.5 dias. A sonda reconhece o mRNA codificado pelo gene Brachyury (discutido na pgina 40), que sintetiza uma protena necessria para a produo de clulas mesodrmicas na parte posterior do embrio de camundongo. Transferncias Northern Podemos tambm determinar a expresso temporal e espacial de RNAs executando uma transferncia de RNA (freqentemente chamada transferncia Northern). Enquanto transferncias Southern transferem fragmentos de DNA do gel para o papel, transferncias Northern (nome no se relaciona com o inventor) transferem RNA entre os mesmos suportes e da mesma maneira. O pesquisador pode extrair RNAs mensageiros do embrio em vrios estgios de desenvolvimento e submet-los eletroforese lado a lado, em um gel. Aps transferncia dos RNAs separados para o papel de nitrocelulose ou membrana de nylon, o conjunto incubado em uma soluo contendo um fragmento radioativo, mono-fita, de DNA de um determinado gene. Esse DNA adere somente s regies onde est localizado o RNA complementar. Assim, se o mRNA para aquele gene est presente em um determinado estgio embrionrio, o DNA radioativo se liga a ele e pode ser detectado por auto-radiografia. Autoradiogramas desse tipo, onde vrios estgios so comparados simultaneamente, so denominados transferncias Northern de desenvolvimento. A Figura 2.26A mostra uma transferncia Northern de desenvolvimento para a expresso de um gene endoderma-especfico durante o desenvolvimento do ourio-do-mar. Podemos ver que o mRNA para essa protena endodrmica inicialmente sintetizado durante o estgio de blstula mesenquimatosa e continuamente durante todo o resto do desenvolvimento. A transferncia Northern na Figura 2.26B mostra que a acumulao desse mRNA no estgio de prisma restrita ao endoderma (Wessel et al.,1989). Hibridizao in situ e transferncias Northern fornecem as melhores evidncias em favor da transcrio diferencial de RNA, no espao e no tempo. A transcrio de certos genes pode ser especfica para tecidos ou tempo. A distribuio temporal na transcrio de vrios genes pode ser visualizada por transferncia de mancha. Por exemplo, Sargent e Dawid (1983) isolaram da gstrula de Xenopus um mRNA que no estava presente no ovo. Para isso eles extraram o mRNA da gstrula e fizeram cpias cDNA dessas mensagens. Os cDNAs da gstrula foram misturados com grandes quantidades de mRNA de ocitos. Se houvesse hibridizao entre o mRNA dos ocitos e o cDNA da gstrula, significaria que o cDNA era derivado
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(B) (A)
(C)
Figura 2.25
Enzima fosfatase alcalina
Corante (precipitado azul escuro) Ncleo Corante
Anticorpo para biotina Biotina
(incolor) Sonda complementar a mRNA de Brachyury tendo resduos de biotina em suas uridinas
mRNA de Brachyury
Hibridao in situ. (A,B) Fotomicrografias, em fundo escuro, de hibridao in situ, mostrando a localizao de mRNA endodermaespecfico em embrio de ourio-do-mar. O cDNA radioativo usado como sonda foi preparado do gene clonado, feito a partir de mRNA endoderma-especfico (veja Figura 2.24). Esse cDNA radioativo se liga ao mRNA do endoderma da gstrula precoce do ouriodo-mar (A) e ao endoderma do intestino mdio e posterior da gstrula tardia do ouriodo-mar (B). (C) Hibridizao in situ, em montagem integral, de um embrio de camundongo de 9.5-10.5 dias corado para mRNA de Brachyury. Essa mensagem transcrita em clulas formando novo mesoderma, e nesse estgio encontrada na poro posterior do embrio. Embries fixados foram incubados em uma sonda para mRNA de Brachyury (a fita antisense complementar ao mRNA) que foi sintetizada usando uridina biotinilada. Aps eliminar a parte da sonda que no se ligou ao mRNA de Brachyury (e inativar qualquer atividade endgena de fosfatase alcalina do embrio), o embrio foi tratado com anticorpos para biotina. Esses anticorpos foram ligados s enzimas do tipo fosfatase alcalina. Colorir para a presena de fosfatase alcalina permite que se determine a localizao de um mRNA especfico. Fotografias coloridas da hibridizao in situ, em montagem integral, esto nas Pranchas 22, 23 e 25. (A e B de Wessel et al.,1989, cortesia de G. Wessel; C do laboratrio do autor.)
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(A)
Ovo Clivagem Blstula Blstula Mesenquimatosa Blstula precoce Blstula tardia Prisma Plteo
(B)
Ectoderma / mesoderma Endoderma
Figura 2.26
Transferncia Northern para um gene especfico no endoderma do ourio-do-mar, Lytechinus variegatus. (A) Transferncia Northern de desenvolvimento, mostrando acumulao de mRNA de acordo com o estgio especfico desse gene. mRNA total (10 g por estgio) foi submetido eletroforese em gel de agarose. O gel foi transferido para papel tratado e os mRNAs aderidos ao papel, que foi em seguida incubado com cDNA radioativo de um clone endoderma-especfico. Mostrou-se que esse mRNA sintetizado durante o estgio de blstula do mesnquima e aumentado ao longo do desenvolvimento. (B) Transferncia Northern no estgio de prisma, mostrando que o mRNA est presente no endoderma (com algum mesoderma aderido) mas no no ectoderma. RNA total do endoderma foi eletroforisado (pista 2) prximo ao mRNA do resto do ourio-do-mar (pista1). Ligao com cDNA radioativo detectou mRNA somente no endoderma. (de Wessel et al., 1989, cortesia de G. Wessel.)
de um mRNA presente em ambos os estgios, ocito e gstrula. Essas molculas hbridas com dupla fita foram removidas por filtrao, deixando uma populao de cDNAs gstrula-especfico. Os cDNAs foram transformados na forma de dupla fita (pela DNA polimerase) e inseridos em veculos de clonagem. Essa tcnica denominada de clonagem de subtrao. Como a seleo dupla de bibliotecas de cDNA, a clonagem de subtrao gera um conjunto de clones estgio-especficos cujo mRNA encontrado em alguns estgios, mas no em outros, ou em alguns tecidos mas no em outros (Figura 2.27). Sargent e Dawid usaram embries, dos estgios de zigoto a broto caudal do girino e, separadamente, isolaram seus RNAs. Os RNAs foram aplicados diretamente (sem prvia eletroforese em gel) a filtros de nitrocelulose de modo que cada filtro tinha RNAs de todos os estgios. Aps a fixao (calor) dos RNAs no filtro, DNA de fita nica derivado de um especfico clone gastrular, foi marcado radioativamente e incubado com os filtros. Se um gene estava sendo transcrito em um determinado estgio, o cDNA radioativo daquele gene encontraria seu complemento nos mRNAs daquele estgio, no filtro. Aps eliminaco do cDNA no ligado, a ligao do cDNA radioativo foi observado por auto-radiografia. A transferncia de manchas na Figura 2.28 mostra o esquema temporal de expresso para 17 genes que so ativos em vrios estgios da gastrulao. Nenhum deles expresso antes da transio da blstula mediana em 7 horas. Alguns genes (DG64, DG39) so expressos imediatamente depois, enquanto outros (DG72, DG81) comeam a ser transcritos na gstrula mediana, aps aproximadamente 7 horas. Alguns genes (DG76, DG81) so mantidos aps a ativao, enquanto a atividade de outros (DG56, DG21) muito mais transitria.
Encontrando mensagens raras pela reao da polimerase em cadeia

A reao da polimerase em cadeia (PCR) um mtodo de clonagem in vitro que pode produzir enormes quantidades de um fragmento especfico de DNA a partir de uma pequena quantidade de material de partida (Saiki et al.,1985). Esse mtodo pode ser usado para clonar um gene especfico ou para determinar se um gene especfico est ativamente transcrevendo RNA em um determinado rgo ou tipo de clula. O mtodo padro de clonagem usa microorganismos vivos para amplificar o DNA recombinante. PCR, no entanto, pode amplificar uma nica molcula de DNA por um fator de vrios milhes em poucas horas e o faz em um tubo de ensaio. Essa tcnica tem sido extremamente til em casos onde a quantidade de cido nuclico para estudo muito pequena. Embries de camundongos, por exemplo, na fase de pr-implantao tm muito pouco mRNA e no se pode obter milhes desses embries para estudo. Se fosse necessrio saber se o embrio de camundongo na fase de pr-implantao contm o mRNA para uma protena determinada, seria muito difcil descobrir usando os mtodos padro de clonagem. Entretanto, a tcnica do PCR permite encontrar essa mensagem com poucos embries, por amplificar especificamente somente aquela mensagem, um milho de vezes (Rappolee et al., 1988). O uso de PCR para encontrar mRNAs raros est ilustrado na Figura 2.29. Os mRNAs de um grupo de clulas so purificados e convertidos a cDNA por transcriptase reversa. Usando DNA polimerase e S1 nuclease, a populao de DNAs de fita nica transformada em uma populao de fita dupla. Em seguida, escolhe-se um DNA para ser amplificado. Para isso, separam-se as duplas hlices do DNA, s quais so adicionados dois pequenos oligonucleotdeos iniciadores que so complementares a uma poro da mensagem procurada. Se os oligonucleotdeos reconhecem seqncias no DNA, ento o mRNA estava presente originalmente. Os oligonucleotdeos foram preparados de forma a permitir uma hibridizao com fitas opostas e lados opostos da seqncia alvo. (Se a tentativa isolar o gene ou mRNA para uma protena especfica de seqncia conhecida, essas regies laterais podem ser preparadas,
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Extrair mRNA Ocito mRNA total de ocito Hibridizar
cDNA de gstrula que encontra mensagem complementar em mRNA de ocito
cDNA de gstrula sem seqncia complementar a mRNA de ocitos
Extrair mRNA Gstrula mRNA total de gstrula
Fazer cDNA de mRNA cDNA de gstrula
DNA polimerase S1 nuclease
Figura 2.27
cDNA de dupla fita especfico de gstrula Adicionar ligantes
Clonagem de subtrao de genes de gstrula expressos diferencialmente em Xenopus laevis. cDNA foi produzido para mensagens isoladas de gstrula e hibridizado com mRNA de ocitos. Os cDNA de gstrula que no encontraram seqncias complementares nos mRNAs de ocitos, eram produtos de genes ativos na gstrula mas no nos ocitos. Esses genes foram clonados fazendo o cDNA de fita dupla e adicionando ligantes para permitir sua insero em veculos de clonagem.
Figura 2.28
Colocar em veculo de clonagem
Transferncias de mancha no desenvolvimento mostram os tempos em que 17 genes de Xenopus esto transcrevendo ativamente. Acumulao especfica de mRNA no citoplasma registrada embebendo mRNA total, de genes em estgios embrionrios, em papel de nitrocelulose e incubando a tira de papel com DNA radioativo derivado de um clone de cDNA especfico de gstrula. Justapondo essas tiras, obtem-se um esquema temporal para a atividade de genes especficos. A linha r5 representa um controle de RNA ribossmico que deve estar sempre presente. (de Jamrich et al., 1985, cortesia de I. Dawid e M. Sargent.)
Blstula Estgio Clone Gstrula Nurula
Plasmdeo recombinante contendo DNA para mRNA especfico para gstrula
Broto de cauda
Horas aps a fertilizao
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Finais da seqncia do polipeptdeo
RNAs que codificam o amino terminal (iniciador 1)
RNAs que codificam o carboxi terminal (iniciador 2) RNA iniciador 1 DNA alvo RNA iniciador 2
1 cpia
Primeiro ciclo
Aquecer a 95oC para desnaturar DNA. Esfriar a 37oC para permitir hibridizao dos iniciadores a DNA
Quando aquecido a 72o C, taq polimerase estende fitas complementares a partir dos iniciadores 2 cpias Primeiro ciclo de snteses resulta em duas cpias da seqncia alvo de DNA Desnatura DNA Hibridiza iniciadores
Segundo ciclo
Estende novas fitas de DNA
4 cpias
Segundo ciclo de snteses resulta em quatro cpias da seqncia alvo de DNA
Figura 2.29
Protocolo para a reao de polimerase em cadeia (PCR). Para determinar se um tipo particular de mRNA est presente, todo mRNA convertido a DNA de dupla fita pela transcriptase reversa e DNA polimerase. Esse DNA desnaturado e dois conjuntos de iniciadores so adicionados. Se a seqncia especfica estiver presente, os iniciadores se hibridizaro aos seus terminais opostos. (Iniciadores especficos so produzidos com base na seqncia que se procura. Se conhecida apenas a seqncia da protena codificada pela mensagem, prepara-se um conjunto de diferentes iniciadores, cada um possivelmente complementar ao DNA.) Usando DNA polimerase termoestvel de T. aquaticus, cada fita de DNA sintetiza seu complemento. Essas fitas so, por sua vez, desnaturadas e os iniciadores so hibridizados a elas, iniciando o ciclo novamente. Dessa maneira, o nmero de fitas novas com a sequncia entre os dois iniciadores aumenta exponencialmente.
sintetizando oligonucleotdeos que codificam o amino terminal da protena e oligonucleotdeos complementares aqueles que codificam o carboxi terminal da protena). Os finais 3' desses iniciadores esto face a face de modo que a replicao atravs do DNA alvo. Uma vez hibridizado o primeiro iniciador, a DNA polimerase pode sintetizar uma nova fita.
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Essa enzima no a DNA polimerase normal de E. coli; uma polimerase de bactrias como Thermus aquaticus ou Thermococcus litoralis. Essas bactrias vivem em fontes de gua quente (como aquelas do Yellowstone National Park) ou nos respiradouros trmicos de submarinos, onde a temperatura atinge valores prximos de 900C. Essas DNA polimerases podem suportar temperaturas prximas ebulio e o PCR se utiliza dessa adaptao evolucionria. Uma vez sintetizada a segunda fita, ela separada de seu complemento por desnaturao em alta temperatura. O segundo iniciador adicionado e agora ambas as fitas podem sintetizar novo DNA. Sucessivos ciclos de desnaturao e sntese amplificaro essa regio do DNA de forma geomtrica. Aps vinte turnos, aquela regio especfica estar amplificada 220 vezes (um pouco mais de um milho). Quando submetido eletroforese esse fragmento amplificado facilmente detectado. Isso mostra que o mRNA original com essa seqncia estava presente na amostra. (A confirmao poderia ser feita por transferncia Southern, como na Figura 2.30). Alm disso, pode-se usar essas cpias amplificadas para clonagem, colocando-as em vetores de clonagem.
Figura 2.30
Ovrio de rato
Adulto
Ovrio de camundongo Rim de camundongo Rim de camundongo Salivares de camundongo Pncreas de camundongo Pulmo de camundongo
Embrio de 14 dias
Sem adio de DNA
Determinando a funo do gene: clulas e organismos transgnicos

Tcnicas de insero de DNA novo em uma clula Apesar de ser importante conhecer a seqncia de um gene e seu esquema temporoespacial de expresso, o que realmente crucial conhecer a funo daquele gene no desenvolvimento. Tcnicas recentes permitem estudar a funo do gene, tirando e repondo certos genes de clulas embrionrias. Pedaos de DNA clonados podem ser modificados (se desejado), e colocados em clulas por vrios meios. Uma tcnica muito direta a microinjeo, na qual uma soluo contendo o gene clonado cuidadosamente injetada no ncleo da clula (Capecchi, 1980). Essa uma tcnica especialmente til para injetar genes em ovos recentemente fertilizados, pois os ncleo haplides do espermatozide e do vulo so relativamente grandes (Figura 2.31). Em transfeco, o DNA incorporado diretamente na clula por incubao em uma soluo determinada onde a clula o incorpora. A probabilidade de incorporao de tal fragmento de DNA no cromossomo relativamente pequena, sendo necessrio misturar o DNA com outro gene que permite a sobrevivncia das raras clulas que o incorporaram, em condies de cultura onde as outras clulas so destrudas (Perucho et al.,1980; Robins et al.,1981). Outra tcnica a eletroporao, onde pulsos de alta voltagem empurram o DNA para dentro da clula. Um mtodo mais natural para introduzir genes na clula colocar o gene clonado em um elemento transponvel ou vetor retroviral. Esses so regies mveis de DNA, de ocorrncia natural, que podem ser integrados no genoma. Retrovrus so vrus contendo RNA. Dentro da clula hospedeira eles produzem uma cpia de seu DNA (usando sua prpria transcriptase reversa); a cpia se transforma em dupla fita e se integra em um cromossomo do hospedeiro. A integrao consumada devido s duas seqncias idnticas (longas repeties terminais) nos terminais do DNA retroviral. Vetores retrovirais so produzidos removendo os genes do empacotamento viral (necessrios para a sada dos vrus da clula) do centro de um retrovrus de camundongo. Essa extrao cria um stio vazio onde outros genes podem ser colocados. Usando enzimas de restrio apropriadas, o pesquisador pode remover genes de um fago ou plasmdeo clonado e reinserir o gene em vetores retrovirais. Retrovetores virais infectam clulas de camundongo com eficincia prxima de 100%. Em Drosophila, novos genes podem ser introduzidos na mosca, via elementos P. Essas seqncias de DNA, so elementos transponveis de ocorrncia natural que podem ser integrados como vrus em qualquer regio do genoma da Drosophila. Ainda mais, eles podem ser isolados, e genes clonados inseridos no centro do elemento P. Quando o elemento P recombinado injetado em um ocito de Drosophila, ele pode se integrar ao DNA e prover o embrio de um novo gene (Spradling e Rubin, 1982).
Evidncia fornecida por PCR, para a sntese de um fator de crescimento, activina, de rgos embrionrios de camundongo. O mRNA desses rgos foi convertido em DNA e amplificado atravs de 20 ciclos de replicao. O DNA foi submetido sucessivamente eletroforese e transferncia Southern usando uma sonda radioativa para uma parte do gene de activina. mRNA de activina foi encontrado no ovrio do camundongo adulto (como esperado) e tambm em vrios rgos embrionrios. A possvel funo de activina nesses orgos ser discutida no Captulo 17. (Cortesia de O. Ritvos.)
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Figura 2.31
Injeo de DNA (de genes clonados) em um ncleo (neste caso, um proncleo de um ovo de camundongo). (de Wagner et al.,1981, cortesia de T. E. Wagner.)
Camundongos quimricos As tcnicas descritas tm sido usadas recentemente para transferir genes para todas as clulas do embrio de camundongo (Figura 2.32). Durante o desenvolvimento do camundongo existe um estgio onde somente esto presentes dois tipos de clulas: as clulas externas, que formaro a poro fetal da placenta, e as clulas internas, que daro origem ao prprio embrio. Essas clulas internas so chamadas clulas embrionrias precursoras (clulas tronco), porque cada uma delas pode, se isolada, gerar todas as clulas do embrio (Gardner, 1968; Moustafa e Brinster, 1972). Essas clulas podem ser isoladas do embrio de um camundongo e cultivadas. Uma vez em cultura, elas podem ser tratadas como descrito, de modo a incorporar novo DNA. A nova clula embrionria precursora (no somente o DNA, mas a clula inteira) pode ser injetada em outro embrio de camundongo em fase precoce. Assim, a clula precursora tratada estar integrada no embrio do hospedeiro. O resultado um camundongo quimrico*. Algumas de suas clulas so derivadas das clulas embrionrias precursoras do hospedeiro, mas outra poro de clulas derivada tambm das clulas precursoras tratadas. Se as clulas tratadas se tornaram parte da linha germinal do camundongo, alguns dos seus gametas sero derivados da clula doadora. Quando cruzado com um camundongo do tipo selvagem, alguns de seus descendentes levaro, portanto, uma cpia do gene inserido. Os descendentes heterozigotos, no acasalamento produziro 25% de embries carregando duas cpias do gene inserido em cada clula de seu corpo (Gossler et al.,1986). Assim, em trs geraes o camundongo quimrico, o camundongo heterozigoto e o camundongo homozigoto um gene que foi clonado de um outro indivduo, est agora presente em ambas as cpias dos cromossomos dentro do genoma do camundongo. Camundongos com genes estveis de outros indivduos so chamados camundongos transgnicos. Essas linhagens tm sido particularmente teis na determinao das funes de regies reguladoras que ladeiam os genes. Experimentos com genes com endereamento (Gene targeting ou Knockout) A anlise de embries precoces de mamferos foi durante muito tempo prejudicada pela dificuldade em criar e selecionar mutaes que afetam a fase inicial do desenvolvimento embrionrio. Esse problema foi superado pela tcnica chamada de endereamento de genes (s vezes, chamada de Knockout). As tcnicas so similares quelas que produzem camundongos transgnicos, mas em lugar de adicionar genes, enderear genes significa trocar alelos do tipo selvagem por outros mutados. Chisaka e Capecchi (1991) usaram essa tcnica para estudar a funo do gene Hoxa3 no desenvolvimento do camundongo. Hoxa-3 semelhante a vrios genes de Drosophila que so conhecidos como controladores da expresso gnica de segmentos especficos no embrio precoce; a protena codificada por Hoxa-3 liga-se ao DNA, exatamente como sua correspondente na Drosophila. Seria possvel que Hoxa3 de maneira similar estaria regulando a expresso gnica espao-especfica nos mamferos? Chisaka e Capecchi isolaram o gene Hoxa-3, cortaram-no com uma enzima de restrio e inseriram nesse stio um gene para resistncia neomicina (Figura 2.33). Em outras palavras, eles mutaram o gene Hoxa-3 pela insero de um grande pedao de DNA que continha um gene resistente neomicina, destruindo a habilidade da protena Hoxa-3 em se ligar a DNA. Esses genes mutantes Hoxa-3 foram eletroporados em clulas embrionrias precursoras que eram sensveis neomicina.
* crtico notar a diferena entre uma quimera e um hbrido. Um hbrido resulta da unio de dois genomas diferentes dentro da mesma clula: o descendente de um genitor de gentipo AA e outro de gentipo aa um hbrido Aa. Uma quimera resulta quando clulas de constituio gentica diferente aparecem no mesmo organismo. O termo apto: refere-se a um monstro mitolgico com cabea de leo, corpo de bode e cauda de serpente.
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Clulas embrionrias precursoras
Trofoblasto
Cultura de clulas embrionrias precursoras
Gene clonado no vetor Mistura de clulas embrionrias precursoras com o gene clonado Seleo de clulas embrionrias precursoras que incorporaram o transgene
Microinjetar clulas precursoras transgnicas no embrio hospedeiro
Integrao das clulas no hospedeiro
Injetar no tero Camundongos quimricos
Figura 2.32
Camundongos transgnicos heterozigotos
Camundongos transgnicos homozigotos
Uma vez dentro do ncleo dessas clulas, o gene Hoxa-3 mutado substituiu um alelo normal desse gene por um processo chamado recombinao homloga. Aqui, as enzimas envolvidas no reparo de DNA e replicao incorporam o gene mutante em lugar da cpia normal. Esse um evento raro, mas tais clulas podem ser selecionadas cultivando as clulas precursoras em neomicina. A maioria das clulas morre com a droga, mas aquelas que adquiriram resistncia pelo gene incorporado sobrevivem. As clulas resultantes tm um gene Hoxa-3 normal e um Hoxa-3 mutado. As clulas precursoras heterozigotas so microinjetadas em um blastcito de camundongo e se integram nas clulas do embrio. O camundongo resultante uma quimera composta de clulas do tipo selvagem do embrio hospedeiro e de clulas heterozigotas Hoxa-3, das clulas precursoras. As quimeras so acasaladas com camundongos do tipo selvagem e se algumas das clulas doadoras se integraram linhagem das clulas germinativas, alguns dos descendentes sero heterozigotos
Produo de camundongos transgnicos. Clulas embrionrias precursoras de um camundongo so cultivadas e o genoma alterado pela adio de um gene clonado. As clulas transgnicas so selecionadas e injetadas em um embrio hospedeiro de camundongo na sua fase precoce. Aqui, as clulas embrionrias precursoras transgnicas se integram s celulas precursoras do hospedeiro. Esse embrio colocado no tero de um camundongo fmea grvida e se desenvolve em um camundongo quimrico. Se as clulas precursoras doadoras contriburam para a linha germinativa, e o camundongo quimrico cruzado com um do tipo selvagem, parte dos descendentes sero heterozigotos ao alelo adicionado. Cruzando heterozigotos, pode ser gerada uma linhagem de camundongos que homozigota ao alelo adicionado. Essa seria uma linhagem transgnica. O gene adicionado (o transgene) pode ser de qualquer fonte eucaritica.
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(A) Massa celular interna Blastcito neo r Cultura de clulas embrionrias precursoras (ES)
Eletroporao
Recombinao homloga Clula precursora embrionria
(B) gene Hoxa-3 Endonucleases de restrio gene neor gene Hoxa-3 mutado com o gene neor inserido Hoxa-3
Figura 2.33
Tcnica de endereamento de genes (gene targeting). Nesse caso o gene alvo o Hoxa-3. (A) Clulas embrionrias precursoras (ES) so cultivadas a partir de uma massa celular interna. (B) Os genes Hoxa-3 clonados so cortados com uma enzima de restrio, e um gene neomicina-resistente inserido na regio que codifica o stio de ligao da protena ao DNA. Esses genes Hoxa-3 mutantes so eletroporados em clulas ES, onde recombinao homloga troca o gene do tipo selvagem pela cpia mutada. As clulas so selecionadas pela sua resistncia neomicina. (C) As clulas ES heterozigotas selecionadas so inseridas na massa interna de clulas de um embrio do tipo selvagem, e o blastcito retornado ao tero. O camundongo resultante uma quimera composta de tecidos Hoxa-3 heterozigotos e tecidos Hoxa-3 do tipo selvagem. Cruzando os animais quimricos com camundongos do tipo selvagem produz-se descendentes Hoxa-3 heterozigotos se as clulas ES contriburam na linhagem germinativa. Os animais heterozigotos podem ser cruzados entre si, e aproximadamente 25% de sua cria deve ser de homozigotos mutantes de Hoxa-3.
Seleo de clulas ES heterozigotas por sua resistncia neomicna
(C)
Injeo de clulas ES heterozigotas no blastcito
Injeo dos blastcitos no tero
Produo de camundongos quimricos
Heterozigotos
Cruzamento de quimricos com tipo selvagem Cruzamento de camundongos heterozigotos Hoxa-3/ Hoxa-3+ Heterozigotos Hoxa-3/ Hoxa-3
Homozigoto
para o gene Hoxa-3. Os animais heterozigotos podem ser cruzados entre si, e aproximadamente 25% de seus descendentes devem levar duas cpias do gene mutado Hoxa-3. Esses camundongos mutantes homozigotos no possuem as glndulas tireide, paratireide e timo! Dessa maneira, endereando genes pode-se analisar as funes de determinados genes durante o desenvolvimento de mamferos. [gene7.html]
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Determinando a funo de uma mensagem: RNA antisense

Outro mtodo para determinar a funo de um gene fazer cpias antisense de sua mensagem. Mensagens antisense podem ser produzidas usando cDNA clonado e fazendo sua reclonagem em reverso, prximo a um vigoroso promotor bacteriano, em outro vetor. O promotor bacteriano iniciar a transcrio da mensagem na direo errada quando for incubado com RNA polimerase e nucleosdeos trifosfato. Dessa maneira, sintetizado um transcrito que complementar aquele natural (Figura 2.34A). O transcrito complementar chamado RNA antisense porque o reverso da mensagem original. Quando grandes quantidades de RNA antisense so injetadas ou transfectadas em clulas contendo o mRNA normal desse gene, o RNA antisense se liga mensagem normal; o cido nuclico dupla-fita resultante degradado (enzimas do citoplasma das clulas digerem cidos nuclicos de fita dupla). Isso causa uma depleo funcional da mensagem, como se houvesse uma mutao eliminatria para aquele gene. Esses resultados foram confirmados quando RNA antisense foi produzido a partir do gene Krppel de Drosophila. Krppel crtico para a formao do trax e do abdmen da mosca. Se esse gene est ausente, as larvas da mosca morrem pela falta dos segmentos torcico e abdominal anterior (Figura 2.34B); uma situao semelhante criada quando grandes quantidades de RNA antisense contra a mensagem Krppel so injetados em embries precoces da mosca (Rosenberg et al.,1985). RNA antisense permite ao biologista do desenvolvimento determinar a funo dos genes durante o desenvolvimento e analisar a ao dos genes em animais; de outra forma isso seria inacessvel anlise gentica.
Figura 2.34
Reinvestigao de velhos problemas com novos mtodos

A unio da embriologia com a biologia molecular est permitindo ao biologista do desenvolvimento uma nova apreciao de como trabalham os genes na construo de um organismo. Estamos em meio uma revoluo nos nossos conhecimentos sobre desenvolvimento, e um dos maiores sucessos resultantes de clonagens e seqenciamentos a nova anatomia do gene eucarioto. Descreveremos a estrutura do gene com mais detalhe no Captulo 10, mas importante ressaltar que os genes eucariotos que codificam protenas tm vrios stios regulatrios (Figura 2.35). Um stio, o promotor, est localizado diretamente a montante do gene (antes do incio) e
(A) mRNA de consenso (sense) Krppel (B) Embrio mutante Krppel
Produco de RNA antisense para examinar a funo dos genes no desenvolvimento. (A) Produo da mensagem antisense (neste caso, ao gene Krppel da Drosophila) colocando o fragmento de cDNA clonado para a mensagem Krppel entre dois vigorosos promotores. Os promotores esto em orientao oposta com respeito ao cDNA do Krppel. Nesse caso, o promotor T3 est em orientao normal e o promotor T7 est revertido. Os promotores reconhecem RNA polimerases diferentes (dos bacterifagos T3 e T7, respectivamente). T3 polimerase permite a transcrio de mRNA de consenso, ao passo que T7 polimerase produz transcritos antisense. (B) Resultado da injeo da mensagem Krppel antisense em um embrio precoce (estgio blastodrmico sincicial) de Drosophila antes que a mensagem Krppel seja produzida. A figura central um embrio do tipo selvagem pouco antes de eclodir. Acima est o mutante causado pela falta do genes Krppel. Abaixo est o embrio do tipo selvagem, injetado com a mensagem Krppel antisense no estgio embrionrio precoce. Ambos os embries, mutante e o tratado com antisense, no possuem os segmentos torcico e abdominal anterior. (B, de acordo com Rosenberg et al., 1985.)
mRNA antisense Krppel
T7 RNA polimerase
T3 promotor
T3 RNA polimerase
T7 promotor
Embrio normal
Embrio normal infectado com RNA antisense Krppel
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o stio onde se liga a RNA polimerase. Localizada em algum lugar dentro do gene (a jusante ou a montante, ou ainda em um ntron dentro do gene), est uma segunda regio chamada intensificadora. Fatores proticos que se ligam ao intensificador permitem sua interao com o promotor e, conseqentemente, com a transcrio do gene pela RNA polimerase. Alguns promotores (como aqueles usados por produtos relacionados ao metabolismo geral da clula) no precisam ser ativados por intensificadores, mas a maioria dos genes ligados ao desenvolvimento so ativados em tempos e clulas especficos. Esses genes precisam ser ativados por fatores que se ligam ao intensificador e ao promotor. Como veremos no Captulo 10, a ligao de diferentes fatores de transcrio aos promotores e intensificadores de genes especficos um dos mecanismos que controlam a produo de protenas diferentes a partir de genomas idnticos. Um exemplo a ativao do gene para ZP3. Como detalharemos no Captulo 4, ZP3 a principal protena ligante de espermatozide na superfcie do vulo de camundongo. uma glicoprotena sintetisada pelo ocito durante sua maturao em vulo (Roller et al.,1989). Uma transferncia Northern mostra que o mRNA para essa protena sintetizado somente em ocitos em crescimento e no pode ser detectado em nenhum outro tipo de clula (Figura 2.36). O que permite a esse gene ser ativado somente nos ocitos? Lira e colaboradores (1990) isolaram o gene para ZP3, determinaram sua seqncia e encontraram um stio promotor, 28 pares de bases a montante do stio onde a transcrio do gene iniciada. Como hiptese, consideraram que seqncias responsveis por ativao ocito-especfica podem existir at mais longe, a montante do gene. Eles usaram enzimas de restrio para isolar o DNA da regio 5', a montante, (com 150 pares de bases) e o fundiram ao gene para a luciferinase de vaga-lume. (No necessrio dizer que essa enzima produtora de luz no encontrada em camundongos. Est sendo usada aqui como um gene reprter para monitorar onde o DNA a montante pode causar sua expresso.) O gene recm-construdo, contendo a regio a montante do gene ZP3 ligada ao gene estrutural para luciferinase, foi injetado em zigotos de camundongo para criar animais transgnicos, levando em cada ncleo o gene luciferinase com a regio regulatria ZP3. Em camundongos transgnicos fmeas, a hibridizao in situ localizou mRNA de luciferinase em um nico tipo de clula, o ocito (Figura 2.37). Assim, a seqncia de DNA com 150 pares de bases foi necessria e suficiente para ativar o gene (qualquer gene!) no ocito. Dentro dessa regio de 150 pares de bases (de 99 a 86 pares de bases a montante do gene estrutural ZP3) existe a seqncia 5-GATAA-3' que liga uma protena chamada OSP-1. OSP-1 encontrada somente em ocitos em maturao; ela ativa o gene ZP3 ligando-se a essa sequncia de DNA no promotor. Parece, ento, que ZP3 sintetizado em ocitos porque eles tm a protena OSP-1 que se liga a certas seqncias de DNA que so parte de seu promotor (Schickler et al.,1992). No momento, est sendo investigado como regulado o gene codificador de OSP-1.
Figura 2.35
Estrutura bsica de um gene regulado pelo desenvolvimento. O promotor da maioria dos genes codificadores de protenas encontrado no terminal 5' (a montante) do gene. O intensificador freqentemente est mais acima, a montante, mas pode ser encontrado dentro de um ntron ou no terminal 3'. Protenas que se ligam ao promotor e aos intensificadores interagem para regular a transcrio do gene. (No exemplo ZP3, o stio OSP-1, GATAA, est localizado no promotor, aproximadamente 95 pares de bases a montante do stio de incio da transcrio. Um stio intensificador sensvel a estrognios encontrado no primeiro ntron do gene ZP3.)
Intensificador Promotor xon ntron xon ntron xon
Intensificador a montante do gene
Intensificador a jusante do gene
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Figura 2.36
Transferncia Northern de RNA de ZP3 acumulado no camundongo. RNA de vrios tecidos (10g por pista) e ocitos (125ng) foram submetidos eletroforese e transferidos para papel de nitrocelulose. Um fragmento radioativamente marcado do gene ZP3 foi usado como sonda do mRNA. A mensagem ZP3 foi encontrada somente no ovrio, especialmente dentro dos ocitos. (de Roller et al.,1989, cortesia de P. Wassarman).
Ocito Ovrio Crebro Embrio de 13 dias Corao Intestino
Uma concluso e um alerta

Depois de quase um sculo, estamos comeando a entender como as clulas regulam a expresso diferenciada de seus genes, permitindo que genes diferentes possam se tornar ativos em diferentes clulas. Esse conhecimento est ajudando a explicar como a informao herdada utilizada para construir os planos bsicos do corpo e os tipos especficos de clulas do organismo em desenvolvimento. Entretanto, uma palavra de alerta. Caso o tom celebratrio deste captulo deixou a impresso de que desenvolvimento somente uma funo da atividade gnica necessrio relembrar do Captulo 1, que a distino entre talo e esporo (Dictyostelium), estado amebide e flagelado (Naegleria) e gondios sexual e assexual (Volvox) determinada pelo ambiente. Em captulos posteriores (especialmente Captulo 21), veremos outros exemplos do controle ambiental do desenvolvimento: determinao de sexo temperatura-dependente em rpteis, desenvolvimento em insetos dependente da dieta, e a diferenciao, dependente de experincia, dos neurnios e linfcitos em mamferos. Nesses casos o organismo herda a habilidade para responder aos sinais do ambiente, mas no possvel predizer o fentipo a partir do gentipo.
Rim Fgado Msculo Testculos tero
(A)
(B)
Figura 2.37
Hibridizao in situ da expresso do gene reprter luciferinase, quando luciferinase foi ligado ao promotor do gene ZP3. A sonda radioativa era dirigida mensagem luciferinase, a qual apareceu onde foi expressa sob a direo do promotor de ZP3. (A) Viso do ovrio inteiro (60x). (B) Magnificao (160x) de dois folculos ovarianos contendo ocitos em maturao. (de Lira et al., 1990, cortesia de P. Wassarman.)
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LITERATURA CITADA
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A base celular da morfognese: Afinidade celular diferencial
Mas a natureza no atomizada. Sua padronizao inerente e primria, e a ordem subjacente beleza nela demonstrada; mais ainda, a natureza s pode ser percebida pela mente humana, porque ela mesmo parte integrante e majoritria daquela ordem. Paul Weiss (1960) Eu fui criado terrivelmente e maravilhosamente. Salmo 139 (ca. 500 a.c).
m corpo no meramente uma coleo de tipos de clulas distribudas ao acaso. Desenvolvimento envolve no s a diferenciao celular, mas tambm sua morfognese em arranjos multicelulares tais como tecidos e rgos. Quando observamos a anatomia detalhada de um tecido como a retina neural, vemos um arranjo preciso e intrincado de muitos tipos diferentes de clulas. Neste Captulo, introduziremos as vias de mudana pelas quais as clulas do embrio em desenvolvimento criam rgos funcionais do corpo. Existem quatro questes majoritrias participando do arcabouo de discusses sobre morfognese: Como se formam tecidos a partir de clulas? De que modo clulas da retina neural aderem a outras clulas da retina neural e no se associam s celulas da retina pigmentada ou da ris que esto prximas a elas? De que modo, os vrios tipos de clulas presentes na retina neural (as trs camadas distintas de fotoreceptores, neurnios bipolares e clulas ganglionares) esto organizados para permitir que a retina seja funcional? Como so os rgos construdos a partir de tecidos? As clulas retinais do olho esto situadas atrs da crnea e da lente a uma distncia exata. A retina seria intil se estivesse situada atrs de um osso ou outro lugar qualquer, onde a lente no pudesse nela focalizar os raios de luz. Alm disso, os neurnios da retina devem penetrar no crebro para inervar as regies do crtex cerebral que analisam a informao visual. Todas essas conexes devem estar precisamente ordenadas. Como clulas migrantes atingem seu destino, e como se formam rgos em determinados locais? Olhos se desenvolvem na cabea, mas em nenhum outro lugar. O que impede a formao de um olho em outras partes do corpo, se todas as clulas tm o mesmo potencial gentico? Em alguns casos, como o de precursores de nossas clulas pigmentadas, clulas germinativas e glndula supra-renal, as clulas devem percorrer longas distncias para alcanar seu destino final. Como as clulas so instrudas para percorrer certas rotas e parar quando atingem uma regio especfica do corpo? Como crescem rgos e suas clulas, e como esse crescimento coordenado ao longo do desenvolvimento? As clulas do olho devem crescer juntas, e as clulas da retina raramente dividem-se aps o nascimento. Nosso intestino, entretanto, est constantemente descartando clulas e regenerando outras, e 79
80
ainda assim, sua velocidade mittica cuidadosamente controlada. Se mais clulas fossem regeneradas do que aquelas descartadas, seriam produzidos crescimentos cancerosos. Se o nmero de clulas regeneradas fosse menor, o intestino no poderia digerir o alimento. O que controla essas diferenas na velocidade de crescimento? Todas essas perguntas se referem a aspectos do comportamento celular. Existem dois grupos principais de clulas no embrio: clulas epiteliais, fortemente ligadas umas s outras em camadas ou tubos, e as clulas mesenquimatosas, isoladas e funcionando como unidades individuais. A morfognese nessas duas classes de clulas se d atravs de um limitado repertrio de processos celulares: (1) direo e nmero de divises celulares; (2) mudanas na forma das clulas; (3) movimento celular; (4) crescimento celular; (5) morte celular; e (6) mudanas na composio da membrana celular e da matriz extracelular. A maneira pela qual esses processos se completam pode diferenciar entre clulas epiteliais e mesenquimatosas (Figura 3.1). Parecem existir duas vias principais pelas quais clulas se comunicam umas com as outras para que se efetue a morfognese. A primeira atravs de substncias difusveis que so sintetizadas por um tipo de clula e que mudam o comportamento de outros tipos celulares. Essas substncias incluem hormnios, fatores de crescimento e morfgenos; cada um ser detalhado em captulos subseqentes. O segundo mtodo involve contato entre superfcies de clulas adjacentes. Clulas podem seletivamente reconhecer outras, aderindo a algumas clulas ou migrando sobre outras. Os eventos moleculares que intermediam o reconhecimento seletivo de clulas e sua transformao em tecidos e rgos, ocorrem na superfcie celular. Enquanto o paradigma dominante na gentica do desenvolvimento a expresso diferencial do gene, o paradigma dominante na morfognese envolve afinidade celular diferencial. Essas afinidades podem ser para superfcies de outras clulas ou para molculas da matriz extracelular secretadas pelas clulas. Neste captulo veremos como superfcies de clulas adjacentes interagem durante o desenvolvimento, visando localizar as clulas em stios apropriados dentro de tecidos e rgos.
Afinidade celular diferencial

Assim como a demonstrao da importncia dos genes no desenvolvimento gerou desentendimentos entre pesquisadores, tambm se desenvolveu um debate sobre o papel da superfcie celular na formao do embrio. A superfcie celular parece a mesma em todos tipos de clulas, e muitos pesquisadores mais antigos pensavam at que a superfcie celular no era uma parte vital da clula. Observaes sobre fecundao e desenvolvimento embrionrio precoce feitas por E. E. Just (1939) sugeriam que a superfcie celular diferia em tipos diferentes de clulas, mas a anlise moderna da morfognese se inicia com os experimentos de Townes e Holtfreter em 1955. Considerando a descoberta de que tecidos de anfbios se dissociavam em clulas isoladas quando colocados em solues alcalinas, eles prepararam suspenses de clulas isoladas provenientes de cada uma das trs camadas germinativas dos anfbios, logo aps a formao do tubo neural. Duas ou mais dessas suspenses de clulas isoladas poderiam ser combinadas de vrias maneiras, e quando o pH era normalizado, as clulas aderiam umas s outras, formando agregados em placas de Petri cobertas com agr. Usando embries de espcies que tinham clulas de diferentes tamanhos e cores, Townes e Holtfreter conseguiram observar o comportamento das clulas recombinadas (Figura 3.2).
Figura 3.1
Sumrio dos principais processos morfogenticos em clulas mesenquimatosas e epiteliais
PROCESSO CLULAS MESENQUIMATOSAS
AO
MORFOLOGIA
EXEMPLO
Condensao cartilagem
Mesnquima se torna epitlio
Mesquina da cartilagem
Diviso celular
Mitose para produzir mais clulas (hiperplasia)
Mesnquima dos membros
Morte celular
Clula morre
Mesnquima interdigital
Migrao
Clula se move em tempos e lugares determinados
Mesnquima do corao
Secreo de matriz e degradao
Sntese ou remoo da camada extracelular
Mesnquima da cartilagem
Crescimento
Clulas ficam maiores (hipertrofia)
Clulas gordurosas
CLULAS EPITELIAIS Disperso Epitlio mesnquima (estrutura inteira) Degenerao do ducto Mlleriano
Delaminao
Epitlio mesnquima (parte da estrutura)
Hipoblastos de de galinha
Mudana de forma ou crescimento
Clulas permanecem ligadas com alterao da morfologia
Neurulao
Migrao celular (intercalao)
Linhas do epitlio se fundem para formar menos linhas
Gastrulao de vertebrados
Diviso celular
Mitose dentro da linha ou outra direo
Gastrulao de vertebrados
Secreo de matriz e degradao
Sntese ou remoo da camada extracelular
Formao de rgos vertebrados
Migrao
Formao de bordas livres
Ectoderma de galinha
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Clulas epidrmicas presuntivas Segregao de tipos de clulas
Dissociao de clulas
Reagregao espontnea
Clulas da placa neural Seo atravs da bola de clulas segregadas
Figura 3.2
Reagregao de clulas da nurula de anfbios. Clulas epidrmicas presuntivas de embries pigmentados e clulas da placa neural de embries no pigmentados so dissociadas e misturadas entre si. As clulas reagrupamse de tal forma que um tipo (aqui, a epiderme presuntiva) cobre o outro. (Modificado de Townes e Holtfreter, 1955.)
Os resultados de seus experimentos foram surpreendentes. Em primeiro lugar, verificaram que clulas reagregadas se tornavam espacialmente segregadas. Ou seja, em lugar de permanecerem misturadas, cada tipo de clula se posicionava em sua prpria regio. Assim, quando clulas epidrmicas (ectodrmicas) e mesodrmicas foram ajuntadas para formar um agregado misto, as clulas epidrmicas foram encontradas na periferia do agregado e as clulas mesodrmicas no seu interior. Em nenhum caso as clulas permaneceram misturadas ao acaso, e na maioria dos casos, um tipo de tecido envolvia o outro completamente. Em segundo lugar, os pesquisadores observaram que as posies finais das clulas reagregadas refletiam suas posies embrinicas. O mesoderma migra centralmente epiderme, aderindo sua superfcie interna (Figura 3.3A). O mesoderma tambm migra centralmente em relao ao intestino ou endoderma (Figura 3.3B). Entretanto, quando as trs camadas germinativas so misturadas entre si, o endoderma se separa do ectoderma e mesoderma e ento envolvido por eles (Figura 3.3C). Na sua configurao final, o ectoderma est na periferia, o endoderma interno e o mesoderma se situa na regio entre eles. Holtfreter interpretou esse fato em termos de afinidade seletiva. A superfcie interna do ectoderma tem uma afinidade positiva pelas clulas mesodrmicas e uma afinidade negativa para o endoderma, enquanto o mesoderma tem afinidades positivas para ambas as clulas, ectodrmicas e endodrmicas. A mimetizao da estrutura embrionria normal por agregados celulares tambm pode ser vista na recombinao de clulas da epiderme e da placa neural (Figura 3.3D). As clulas epidrmicas presuntivas migram para a periferia, como antes; as clulas da placa neural migram para o centro, formando uma estrutura reminescente do tubo neural. Quando clulas axiais mesodrmicas (notocorda) so adicionadas suspenso de clulas presuntivas, epidrmicas e neurais, a segregao celular resulta em uma camada epidrmica externa, um tecido neural localizado centralmente, e uma camada de tecido mesodrmico entre eles (Figura 3.3E). De alguma maneira, as clulas tm a capacidade de distribuirem-se em suas prprias posies embriolgicas. Tais afinidades preferenciais foram tambm observadas por Boucaut (1974), que injetou clulas individuais de especficas camadas germinativas de volta na cavidade gastrular de anfbio. Ele verificou que essas clulas migram para sua camada germinativa apropriada. Clulas endodrmicas encontram posies no endoderma do hospedeiro, enquanto que clulas ectodrmicas se localizam em seu
CAPTULO 3 A base celular da morfognese
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Epiderme + mesoderma
Mesoderma + endoderma
Epiderme + Mesoderma + endoderma
Placa neural + epiderme
Placa neural + Mesoderma axial + epiderme
Epiderme
Endoderma
Mesoderma
Epiderme
Epiderme
Mesoderma
Mesoderma (A)
Mesoderma (B)
Endoderma (C)
Placa neural (D)
Epiderme (E)
Placa neural
Figura 3.3
ectoderma. Assim, afinidade seletiva parece ser importante para fornecer informao posicional s clulas embrionrias. A terceira concluso de Holtfreter e seus colegas foi que afinidades seletivas mudam durante o desenvolvimento. Isso deveria ser esperado, pois clulas embrionrias no mantm uma nica relao estvel com outras clulas. Para que ocorra o desenvolvimento, clulas precisam interagir de forma diferente com outras populaes celulares em tempos especficos. Essas mudanas na afinidade celular foram dramaticamente confirmadas por Trinkaus (1963), que mostrou uma clara correlao entre mudanas de adeso in vitro e o comportamento da clula embrionria. Mais recentemente, os experimentos de Fink e McClay (1985) demonstraram esse comportamento no ourio-do-mar, durante seu desenvolvimento. Na blstula, todas as clulas parecem ter a mesma afinidade umas pelas outras. Cada clula tem tambm uma alta afinidade para a matriz extracelular (camada hialina) que cobre o embrio, e uma baixa afinidade para as protenas dentro da cavidade embrionria (blastocele). Entretanto, ao iniciar-se a gastrulao, um grupo especfico de clulas, no plo vegetal da blstula, perde sua afinidade pelas clulas vizinhas e pela matriz extracelular externa, enquanto adquire simultaneamente afinidade pelas fibrilas proticas que forram a blastocele (Figura 3.4). Essas mudanas de afinidade causam a perda de contato das clulas
Distribuio e reorganizao de relacionamentos embrionrios espaciais em agregados de clulas embrionrias de anfbios. (Modificado de Townes e Holtfreter, 1955.)
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Figura 3.4
(A) Camada hialina Clulas da blstula
(B)
Sumrio das modificaes na adeso celular de clulas precursoras do esqueleto (encaixadas). (A) Na blstula do ourio-do-mar, cada clula tem alta afinidade por suas vizinhas e por seu substrato, a camada hialina. (B) Enquanto progride o desenvolvimento, mudanas na superfcie celular produzem um enfraquecimento das afinidades pelas clulas vizinhas e camada hialina e um aumento de afinidade pelas protenas da cavidade interna da blastocele. O resultado que essas clulas migram para a blastocele (flechas) e formaro o esqueleto.
Fibrilas da blastocele
Alta afinidade por clulas vizinhas e camada hialina
Decrscimo de afinidade por clulas vizinhas e camada hialina. Aumento de afinidade por fibrilas da bastocele.
com suas vizinhas e a migrao para dentro da blastocele, onde elas formaro o esqueleto da larva. Quando elas comeam a formar esse esqueleto, suas propriedades adesivas tero que mudar novamente. Essas clulas, que tinham sido antisociais entre si desde seu ingresso na blastocele, devem agora aderir para formar os rudimentos do anel esqueltico. Essas mudanas na adeso so especficas temporalmente e tambm especficas para as clulas precursoras esquelticas (McClay e Ettensohn, 1987). Tais mudanas na afinidade celular so extremamente importantes nos processos da morfognese. A reconstruo de agregados de embries tardios de aves e mamferos foi obtida pelo uso da protease tripsina para dissociar as clulas entre si (Moscona, 1952). Quando as clulas isoladas resultantes foram misturadas em um frasco e agitadas de modo que a fora de cisalhamento destrusse adeses no especficas, as clulas se distriburam de acordo com seu tipo celular. Dessa maneira, elas reconstruram a organizao do tecido original (Moscona, 1961; Giudice, 1962). A Figura 3.5 mostra a reconstruo do tecido da pele de um embrio de camundongo de 15 dias. As clulas da pele so separadas por enzimas proteolticas e depois agregadas em uma cultura rotatria. As clulas epidrmicas migram para a periferia, e as drmicas migram para o centro. Em 72 horas, a epiderme foi reconstituda, formou-se uma camada de queratina e folculos de plo so vistos na regio dermal. Essa reconstruo de tecidos complexos a partir de clulas nicas chamada de agregao histotpica. O modelo termodinmico de interaes celulares A clulas, ento, no se distribuem ao acaso, mas se movem ativamente para criar organizao tissular. Quais foras dirigem o movimento celular durante a morfognese? Em 1964, Malcolm Steinberg props um modelo que explicava o direcionamento da
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Figura 3.5
Epiderme
Derme
Reconstruo da pele a partir de uma suspenso de clulas de pele de um embrio de camundongo de 15 dias. (A) Seo atravs da pele embrionria, mostrando a epiderme, derme e folculos pilosos primrios. (B) Suspenso de clulas isoladas de pele tanto da derme como da epiderme. (C) Agregados aps 24 horas. (D) Seo atravs de um agregado mostrando migrao de clulas epidrmicas para a periferia. (E) Nova diferenciao dos agregados (72 horas), mostrando epiderme e derme reconstitudas, completa com folculos de plo e camada queratinizada. (de Monroy e Moscona, 1979, cortesia de A. Moscona.)
Folculo piloso primrio
distribuio celular baseado em princpios termodinmicos. Usando clulas derivadas de tecidos embrionrios tripsinisados, Steinberg mostrou que certos tipos de clulas sempre migram para o centro quando combinadas com determinados tipos de clulas, mas migram perifericamente quando combinadas com outras. A Figura 3.6 ilustra as interaes entre culturas de clulas pigmentadas e clulas neurais da retina. Quando suspenses de clulas isoladas desses dois tipos so misturadas, elas formam agregados de clulas organizadas ao acaso. Entretanto, aps algumas horas, j no se observa clulas pigmentadas da retina na periferia dos agregados; em dois dias, duas distintas camadas so vistas, com as clulas pigmentadas localizadas internamente s clulas neurais da retina. Os mesmos tipos de interaes podem ser observados quando agregados esfricos de tecidos so colocados em contato, uns com os outros. Um dos tecidos finalmente envolve o outro, e a topografia final independente das posies de partida (Figura 3.7). Alm disso, tais interaes obedecem a uma hierarquia (Steinberg, 1970). Se a posio final de um tipo de clula, A, interna em relao a um segundo tipo, B, e a posio final de B interna a um terceiro tipo, C, ento a posio final de A ser sempre interna a C. Por exemplo, clulas pigmentadas da retina migram internamente s clulas neurais da retina, e clulas do corao migram centralmente em relao retina pigmentada. Portanto, clulas do corao migram internamente s clulas neurais da retina. Essa observao levou Steinberg a propor que as clulas misturadas, interagem para formar um agregado com a menor energia livre interfacial (Figura 3.8). Em outras
(A)
(B)
(C)
(D) Derme
Derme Epiderme Camada queratinizada
(A)
(B)
(C)
Figura 3.6
Agregados formados pela mistura de clulas da retina neural (no pigmentada) de um embrio de galinha de 7 dias com clulas pigmentadas da retina (escuras). (A) Cinco horas aps a mistura das suspenses de clulas isoladas, so vistos agregados de clulas distribudas ao acaso. (B) Em 19 horas, as clulas pigmentadas da retina no so mais vistas na periferia. (C) Aps dois dias, a maioria das clulas pigmentadas da retina esto localizadas em uma massa central interna rodeadas pelas clulas da retina neural. (As clulas pigmentadas espalhadas so provavelmente clulas mortas). (de Armstrong, 1989, cortesia de P. B. Armstrong.)
(E) Folculos de plo
86
Figura 3.7
Tecido A
Tecido B
Espalhamento de um tipo de clula sobre outro tipo. A posio final de agregados compostos de dois tipos de tecidos independente de sua posio inicial. Uma condio final idntica obtida, se os tecidos so transformados em suspenses de clulas isoladas e, ento, reagregadas ou os tecidos so mantidos intactos e colocados em contato. (De acordo com Armstrong, 1989.)
Colocar tecidos juntos, bem encaixados
Dissociar os tecidos e reagregar
Movimento do tecido B para envolver o tecido A
Movimento das clulas A para dentro, distante da periferia
palavras, as clulas se rearranjam na forma termodinamicamente mais estvel. Se as clulas dos tipos A e B tm diferentes foras de adeso, e se a fora da conexo A-A maior do que aquela entre A-B ou B-B, vai haver distribuio com centralizao das clulas do tipo A. Se a fora da conexo A-A menor ou igual a da conexo A-B, o agregado permanecer com uma mistura de clulas ao acaso. Finalmente, se a conexo A-A tiver uma fora muito maior do que a conexo A-B em outras palavras, as clulas A e B no mostram basicamente nenhuma adesividade entre si ento as clulas A e B formaro agregados separados. Para que as clulas sejam distribudas, o essencial que tenham diferenas em suas foras de adeso. Na forma mais simples desse modelo, todas as clulas poderiam ter o mesmo tipo de cola distribuda na sua superfcie. A quantidade desse produto da superfcie celular, ou a arquitetura celular que permite substncia ser concentrada diferencialmente, originar diferentes nmeros de contatos estveis entre tipos de clulas. Alternativamente, as diferenas termodinmicas poderiam ser causadas por vrios tipos de molculas de adeso. Esse modelo termodinmico chamado hiptese da adeso diferencial. Nessa hiptese, o embrio precoce pode ser considerado como existindo em um estado de equilbrio at que alguma mudana na atividade gnica altere as molculas na superfcie celular. Os movimentos que ocorrem visam restaurar uma nova configurao de equilbrio para as clulas.
Clulas A localizadas centralmente s clulas B (A) DISTRIBUIO
(B) AO ACASO
(C) SEPARAO
Figura 3.8
Distribuio como um processo tendendo estabilidade termodinmica mxima. (A) Distribuio ocorre quando a fora adesiva mdia entre diferentes tipos de clulas (ab) menor que a fora adesiva mdia homotpica (A-A ou B-B) (aa, bb). As clulas mais adesivas se localizam centralmente. (B) Se a fora das adeses A-B maior ou igual mdia das adeses homotpicas, no vai haver distribuio, porque o sistema j atingiu o equilbrio termodinmico, e a mistura dos tipos de clulas ser ao acaso. (C) Se as ligaes A-B so muito mais fracas que a mdia das adeses homotpicas, haver uma completa separao, como caracterstico para leo e gua.
87
&
Especulaes
Evidncia para o modelo termodinmico
Blastema no marcado
vidncias recentes para a hiptese da adeso diferencial surgiram em pesquisa com o objetivo de responder duas questes: (1) pode o fenmeno da distribuio ser explicado pela tenso superficial gerada pela adeso celular?, e (2) essa distribuio realmente ocorre durante o desenvolvimento? Foty e colegas no laboratrio de Steinberg (1994) analisaram a tenso superficial interfacial em vrios tecidos embrionrios. Eles comprimiram amostras de tecido entre as placas de vidro de um tensimetro, e mediram a tenso superficial dos tecidos em termos da habilidade desses em retornar forma esferide original. Dessa maneira, a tenso superficial de cada tecido poderia ser calculada em dines por centmetro. Foty e seus colaboradores encontraram uma completa correlao entre a tenso superficial do tecido e sua tendncia de distribuir-se no centro ou na periferia de um agregado misto. Tecidos com uma maior tenso superficial sempre se localizavam internamente quando misturados com outros de menor tenso superficial. Parece que a distribuio pode ser explicada unicamente pelas tenses superficiais das clulas justapostas. [cell1.html] At recentemente, era muito difcil planejar experimentos para testar, in vivo, esse modelo de distribuio celular; entretanto, esto surgindo evidncias para essa hiptese em estudos de regenerao de membros na salamandra. Aqui, o tecido mais proximal (perto do corpo) envolver o mais distal (Nardi e Stocum, 1983).
Membros de salamandra tm alguns atributos surpreendentes. Quando um membro anterior amputado no antebrao, o toco remanescente forma na sua ponta, uma massa de clulas desdiferenciadas (blastema regenerativo), que se divide e diferencia formando um novo membro. O novo tecido do membro se inicia no local da amputao, nesse caso, formando o resto do membro, do antebrao para baixo. Quando o membro amputado no pulso, forma-se um blastema regenerativo parecido. Entretanto, no reformado o tecido do antebrao, cotovelo e cbito; em lugar disso, o local sendo conhecido regenera somente o pulso e os dgitos. Como armazenada essa memria posicional? Nardi e Stocum (1983) demonstraram que colocando junto dois blastemas de membros de salamandra com o mesmo nvel de origem eles se fundem, mas nenhum envolve o outro (Figura 3.9). Entretanto, quando os blastemas so de nveis diferentes, o mais proximal (perto do corpo) envolve o mais distal. Parece, ento, que as propriedades adesivas des-
sas clulas formam um gradiente ao longo do eixo proximodistal; essas propriedades so maiores no pulso e menores no antebrao. Crawford e Stocum (1988) conseguiram relacionar essa distribuio de clulas in vitro ao processo de regenerao de membro ao vivo. Blastemas do pulso, cotovelo ou antebrao foram enxertados na juno blastema-toco de um membro posterior regenerando a partir da meia coxa. Os blastemas de membro anterior migraram distalmente at o nivel correspondente do membro posterior do hospedeiro e regeneraram uma nova estrutura (Figura 3.10). O blastema do antebrao imediatamente regenerou um membro completo a partir do nvel da meia coxa; o blastema do cotovelo se moveu ao nvel do joelho e formou o resto do brao a partir desse ponto; o blastema do pulso foi deslocado at o fim do membro posterior em regenerao, onde formou um pulso ao nvel do tarso do p. Esses dados sugerem que as hierarquias da distribuio celular, vistas in vitro, refletem diferenas que so usadas pelo corpo, in vivo, na construo de novos rgos.
Blastema marcado Pulso Cotovelo Antebrao
Figura 3.9
Distribuio quando blastemas de nveis iguais ou diferentes, de membros anteriores, so colocados juntos em cultura. (Um membro de cada par foi marcado com tritio para distingulo do outro). Depois de trs dias em cultura, os agregados foram fixados e secionados. Blastemas do mesmo nvel fundiram em uma linha reta. Quando os blastemas eram de diferentes nveis, o blastema proximal parecia tentar envolver as clulas mais distais. (de Nardi e Stocum, 1983, cortesia de D. Stocum.)
Antebrao
Cotovelo
Pulso
88
Figura 3.10
Distribuio in vivo, onde blastemas de membros anteriores em regenerao (em cores) enxertados em blastemas da coxa mediana (cinza) so deslocados para a regio correspondente do membro posterior em regenerao (pulso ao tarso; cotovelo ao joelho; antebrao coxa mediana) onde iniciam a formao do membro anterior, distalmente daquele ponto. (de Crawford e Stocum, 1988.)
Blastema de pulso
Blastema de cotovelo
Blastema de antebrao
Blastema de coxa mediana
Enxertar blastema no blastema em regenerao da coxa mediana
Permitir crescimento externo dos enxertos
A base molecular das adeses clula-clula

As classes de molculas de adeso celular A formao de tecidos e rgos mediada por eventos que ocorrem na superfcie de clulas adjacentes. A superfcie celular inclui a membrana plasmtica, as molculas diretamente abaixo dela e a ela associadas, e as molculas encontradas no espaos extracelulares. Clulas eucariticas so envolvidas por uma complexa borda molecular chamada membrana plasmtica (ou celular). A membrana plasmtica uma bicamada fluida lipdica que contm protenas capazes de interagir com o ambiente externo. Certas protenas tm seus stios ativos apontando para fora, em direo a outras clulas; existem trs classes de molculas da membrana celular (principalmente protenas) que esto particularmente envolvidas no controle de interaes especficas com outras clulas (Edelman e Thiery, 1985): Molculas de adeso celular. Essas protenas participam da adeso clulaclula. Elas podem unir clulas em lminas epiteliais e condensar clulas mesenquimatosas em agregados coesos. Elas tm um papel crtico na separao de diferentes tecidos entre si. Molculas da juno celular. Essas molculas fornecem vias de comunicao entre o citoplasma de clulas adjacentes e fornecem barreiras de permeabilidade e fora mecnica s lminas epiteliais. Molculas de adeso a substrato. Essas molculas permitem ligao das clulas s suas matrizes extracelulares. Elas incluem componentes da matriz extracelular e seus receptores situados na superfcie da clula. Molculas de adeso a substrato permitem o movimento de clulas do mesnquima e neurnios, e permitem a separao espacial das lminas epiteliais. Os padres locais de expresso dessas molculas da superfcie celular, propiciam uma conexo importante entre o cdigo gentico unidimensional e o organismo tridimensional. Modulando o aparecimento dessas molculas, o potencial gentico pode se manifestar no processo mecnico da morfognese.
89
Anticorpos monoclonais e gentica reversa

Monitoramento de modificaes da membrana celular atravs de anticorpos monoclonais.
A expresso de componentes da membrana muda no espao e no tempo. Diferentes tipos de clulas possuem componentes da superfcie celular que so diversos, e que mudam enquanto a clula se desenvolve. Esses componentes da membrana, tecido-especficos, so freqentemente reconhecidos por antisoros e, por essa razo, denominados antgenos de diferenciao (Boyse e Old, 1969). Antgenos de diferenciao especficos podem atualmente ser identificados por anticorpos monoclonais (Figura 3.11). Geralmente, esses anticorpos so produzidos injetando celulas estranhas em camundongos (ou clulas de camundongos de uma linhagem em animais de outra linhagem). Os linfcitos B do camundongo comearo a produzir anticorpos contra cada um dos componentes estranhos dessas clulas, sendo que cada linfcito B produz um nico tipo de anticorpo. Esses linfcitos so tornados imortais pela fuso com clulas cultivadas de linfcito B de tumores (mielomas), que foram mutados de modo a: (1) no sintetizar seus prprios anticorpos e (2) no ter a enzima de recuperao de purinas, hipoxantina fosforribosiltransferase (HPRT). Devido a essa ltima alterao, as clulas do mieloma s podem produzir nucleotdeos de purina de novo, no podendo usar as purinas do meio de cultura. Aps a fuso, as clulas so cultivadas em um meio contendo aminopterina, uma droga que inibe a via de sntese de novo da purina. Assim, clulas do mieloma no fundidas morrem por fome de purinas. Elas no podem produzir nucleotdeos de purina usando a via de recuperao mediada por HPRT e a aminopterina bloqueia tambm a via de novo. Linfcitos B normais tambm no dividem-se em cultura, de modo que eles morrem igualmente. O produto da fuso do linfcito B e da clula do mieloma o hibridoma prolifera, porque possui a enzima de recuperao de purina do linfcito B e as propriedades de crescimento do tumor. Mais ainda, cada um
Imunizao Clulas mutantes de mieloma, sem enzima HPRT
&
Especulaes
Clulas de bao de camundongo
Clulas de mieloma
Fuso
Seleo em meio HAT; selecionar anticorpos
Cultivar clones de hibridomas individuais de poos positivos
Secionar e cultivar clones cujos sobrenadantes testam positivo
Figura 3.11
Protocolo para preparar anticorpos monoclonais. Clulas do bao de um camundongo imunizado so fundidas com clulas mutadas de mieloma, sem a enzima HPRT. Clulas so cultivadas em um meio contendo hipoxantina, aminopterina e timidina (HAT). Clulas de mieloma no fundidas no podem crescer nesse meio porque a aminopterina bloqueia a nica via para sintetizar nucleotdeos purnicos. Clulas B morrem nesse meio, mesmo contendo a enzima (HPRT) que lhes permitiria utilizar a hipoxantina do meio. As clulas fundidas (hibridomas) crescem e se dividem. Os poos nos quais crescem os hibridomas so selecionados quanto presena do anticorpo efetivo, e as clulas de poos positivos so semeadas em densidade suficientemente baixa para permitir que clulas individuais originem clones discretos. Esses clones so isolados e selecionados para o anticorpo efetivo. Tal anticorpo monoclonal. Os hibridomas produzindo esse anticorpo podem ser cultivados e congelados. (de Yelton e Scharff, 1980.)
90
Segmentos externos de fotorreceptores Somas de fotorreceptores (camada nuclear externa) Camada sinptica externa Camada nuclear interna (soma interneuronal) Camada sinptica interna
Soma das clulas ganglionrias Axnios das clulas ganglionrias (A) (B) (C) (D)
Mas logo em seguida, a clula comea a expressar outra molcula da membrana, o antgeno 24B10. Essa molcula encontrada somente nos neurnios que se transformaro em fotorreceptores. Nos estgios seguintes (aproximadamente 80 horas mais tarde), o antgeno 21A6 expresso em certas regies de fotorreceptores em maturao, e outro antgeno, 28H9, caracterstico de fotorreceptores retinais terminalmente diferenciados (Zipursky et al.,1984). Assim, membranas celulares de diferentes tipos de clulas contm molculas diferentes, e essas podem mudar durante a maturao da clula.
Da protena ao gene
Como antgenos de diferenciao so protenas cuja expresso regulada no tempo e no espao, e como essas mudanas so freqentemente correlacionadas com mudanas morfolgicas especficas (como mostra a Figura 3.13), seria interessante saber como seus genes so regulados. Por exemplo, o conhecimento de como a protena 24B10 se expressa poderia dar indicaces sobre os mecanismos genticos da diversidade neuronal. Como podemos realizar essa gentica reversa indo da protena para o gene? Em primeiro lugar, ligamos anticorpos monoclonais s particulas de resinas e passamos homogenatos de retina em colunas contendo esse material (Figura 3.14). (Essa uma coluna de imunoafinidade.) O anticorpo se liga somente ao antgeno reconhecido originalmente, e a protena ligada resina eluda (por solues salinas) e submetida eletroforese em gel para separ-la de um possvel
Fotorreceptor maduro
Figura 3.12
Especificidade da superficie celular da retina neural de galinha. (A) Fotografia de contraste de fase de uma seo da retina neural de um pinto recm-eclodido. (B) Seo de retina marcada com um anticorpo monoclonal fluorescente que reconhece clulas retinais (mas no outras neuronais). (C) Seo retinal marcada com anticorpo monoclonal fluorescente que reconhece processos neuronais mas no corpos celulares na retina. (D) Seo retinal marcada com anticorpo monoclonal fluorescente que reconhece antgeno em um subconjunto de processos em clulas nervosas nas camadas sinpticas externas e internas. (Cortesia de G. Grunwald.)
desses hibridomas secreta o anticorpo especfico do linfcito B. O meio no qual esto crescendo os hibridomas testado quanto presena de anticorpos que se ligam populao original das clulas estranhas. Tais anticorpos, tendo um nico linfcito B como sua fonte original, denominado anticorpo monoclonal. Anticorpos monoclonais podem ser produzidos em grandes quantidades e podem reconhecer antgenos (protenas, lipdeos e carboidratos) que so fracamente expressos (Khler e Milstein, 1975). Anticorpos monoclonais dirigidos contra tipos especficos de clulas, demonstraram numerosos antgenos de diferenciao aparecendo em diferentes tempos e lugares durante o desenvolvimento. A Figura 3.12 mostra diferentes molculas da superfcie celular, em diferentes camadas espaciais da retina neural de um pinto recm-eclodido. Cada um dos anticorpos monoclonais reconhece uma molcula diferente na membrana celular. Como est evidente nesta fotografia composta, as membranas de todas as clulas da retina neural no so iguais. Na verdade, regies da mesma membrana celular podem ser diferentes; as membranas dos axnios e da soma do nervo, por exemplo, contm molculas diferentes. A Figura 3.13 mostra mudanas temporais na membrana
celular de uma nica clula epitelial de Drosophila enquanto ela se desenvolve em um fotorreceptor retinal. Anticorpos monoclonais foram obtidos aps injetar camundongos com homogenatos de tecido da cabea de Drosophila, e um painel de anticorpos foi testado em clulas do disco imaginal do olho larval que se diferenciavam em estruturas do olho. Assim que as clulas epiteliais, no diferenciadas, do disco mostram propriedades neuronais, elas expressam o antgeno 22C10. Esse antgeno tambm encontrado em outros tipos de clulas neuronais.
Clula epitelial no diferenciada
Fotorreceptor
Neurnio
Neurnio sensorial fotorreceptor
Vrios antgenos no especficos
22C10 antgeno 24B10 antgeno 21A6 antgeno 28H9 antgeno
Figura 3.13
Mudanas temporais na membrana celular correlacionadas com a morfognese de uma clula retinal fotorreceptora da Drosophila. Enquanto se procede a diferenciao, diferentes antgenos se expressam na membrana celular. (de Venkatesh et al., 1885.)
91
Anticorpo monoclonal ao antgeno 24B10
Juntar anticorpo marcado ao antgeno 24B10, na seo retinal
1 Cobrir partculas de resina com anticorpo monoclonal
Localizao de 24B10 por anticorpo monoclonal marcado com fluorescena 2 Preparar coluna de imunoafinidade com partculas cobertas
Figura 3.14
3 Adicionar homogenato de retina contendo antgeno 24B10 ( ) e outros antgenos ( )
Homogenato retinal
Protocolo para encontrar o gene que codifica a protena identificada por um anticorpo monoclonal. O oligonucleotdeo decodificado pela estrutura da protena no precisa ser um par perfeito com a verdadeira seqncia. (de Venkatesh et al., 1985; fotografia cortesia de S. Benzer.)
4 Depois que outros antgenos ( ) passam atravs da coluna, eluir material ( ) remanescente nas partculas, separar por eletroforese em gel e corar gel para protena
Protena purificada, antgeno 24B10
5 Eluir protena purificada 24B10 do gel e seqenciar o amino terminal
Met-Glu-Glu-Thr-His-Tyr-Pro 6 Gerar uma seqncia mensageira possvel e sintetizar uma seqncia complementar radioativa
AUG - GAA - GAA - AGG - CAG - AAC - CC TAC - C T T - C T T - TCC - GTC - T T G - GG
contaminante. A regio do gel contendo a protena separada, a protena eluda da matriz do gel parcialmente seqenciada. necessrio sintetizar oligonucleotdeos radioativos que se ligariam a uma seqncia de DNA capaz de codificar tal protena. No caso da 24B10, essas sondas radioativas foram usadas para selecionar uma biblioteca de clones de DNA recombinante contendo regies do genoma de Drosophila. O DNA de Drosophila de cada clone positivo foi seqenciado para verificar se esse complementava a seqncia da protena original isolada pelo anticorpo monoclonal. Por essa via, podemos ir de uma rara protena identificada por um anticorpo monoclonal a um pedao especfico do DNA genmico. (Zipursky et al.,1984; Venkatesh et al., 1985.)
7 Usar essa sonda para selecionar a biblioteca de fago do genoma da Drosophila; seqenciar o clone positivo TCC ATG T T C GAT CGC GAG ATG GAG GAG ACG CAT TAC CCG CCC TGC ACC TAC AAC GTG ATG TGC Ser Met Phe Asp Arg Glu Met Glu Glu T h r His Ty r P r o P r o Cys T h r Ty r Asn Val Met Cys Seqncia esperada 8 Isolar e caracterizar gene
92
Molculas de adeso celular

Identificando molculas de adeso celular e seu papel no desenvolvimento Os estudos de distribuio de Holtfreter e Steinberg no identificaram as molculas envolvidas na adeso celular diferenciada. Roth (1968; Roth et al., 1971) demonstrou que diferentes tipos de clulas mostram uma adeso celular seletiva independente da distribuio das clulas. Ele modificou o ensaio de agregao rotatrio, incubando clulas de cartilagem marcadas com 3H e hepatcitos marcados com 14C em uma soluo em rotao, contendo pequenos agregados de clulas de cartilagem no marcadas. Medindo as clulas marcadas com 14C e 3H nesses agregados, ele demonstrou que os agregados de cartilagem escolheram especificamente clulas de cartilagem. Experimentos similares estenderam essas concluses s clulas do msculo e do fgado (Figura 3.15). Esses estudos indicaram que tipos diferentes de clulas podiam usar diferentes molculas de adeso. A tarefa seguinte identificar as molculas mediadoras da adeso celular e descobrir como conseguem realizar esse feito. Vrias molculas de adeso celular (CAMs), foram identificadas e agrupadas em duas categorias gerais: as caderinas, cujas propriedades de adeso celular dependem de ons clcio e as CAMs da superfamlia de imunoglobulinas, cujos domnios de ligao s clulas se parecem aqueles de molculas de anticorpos. A Tabela 3.1 lista algumas CAMs recentemente descobertas. Caderinas ons de clcio so freqentemente necessrios para a adeso celular. Os ons estabilizam as conformaes adesivas de certas protenas da superfcie celular chamadas caderinas. Caderinas tm um papel crtico no estabelecimento e manuteno de conexes intercelulares, e parecem ser cruciais para a segregao espacial de clulas e para a organizao da forma animal (Takeichi, 1987). Caderinas interagem com outras caderinas de clulas adjacentes e so ancoradas na clula por complexos de protenas chamados cateninas (Figura 3.16). O complexo caderina-catenina forma a clssica juno aderente que liga as clulas epiteliais entre si. Mais ainda, como as cateninas se ligam ao citoesqueleto de actina, elas integram as clulas epiteliais em uma unidade mecnica. Em embries de vertebrados, quatro classes principais de caderinas foram identificadas:
Figura 3.15
Especificidade da associao clula-clula. Agregados coletores, cada um consistindo de um tipo de clula, so colocados em um frasco de cultura giratrio contendo clulas isoladas do mesmo tipo (isotpico) e de tipos diferentes (heterotpico). As clulas isoladas, isotpicas e heterotpicas, foram previamente marcadas com diferentes radioistopos. Aps seis horas, os agregados foram colhidos, lavados e determinados os nmeros de clulas isotpicas e heterotpicas que aderiram ao agregado, como mostra a tabela abaixo. (Dados de Roth, 1968.)
Contagem das clulas radioativas que aderiram ao agregado
Clula isotpica marcada com 3 H (cartilagem) Clula heterotpica marcada com 14 C (fgado) Agregado (cartilagem) Rotao por seis horas
Clulas isoladas marcadas em suspenso* Tipo de agregado Cartilagem Fgado Msculo peitoral Cartilagem 100 10 38 Fgado 6 100 49 Msculo peitoral 48 0 100
* Porcentagem do nmero mdio de clulas coletadas pelos agregados isotpicos.
Contar clulas radioativas que aderiram ao agregado
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Tabela 3.1 Classificao geral das principais molculas de adeso celular (CAMs)
Classe Caderinas (clcio-dependente) CAM N-caderina (a.k.a. A-CAM) P-caderina E-caderina (a.k.a. L-CAM, uvomorulina) N-CAM Ng-CAM (a.k.a. L1, NILE) Neurofascina CAM-celular LFA-1 CD4 glicoprotena (HIV receptor) Tipo celular Nervos, rins, lentes, corao Placenta, epitlio Epitlio, blstula de camundongo
CAMs da super famlia de imunoglobulinas (clcio-independente)
Msculos, nervos, rins Glia, neurnios Neurnios de Drosophila Hepatcitos Linfcitos Indutor de clulas T
E-caderina (caderina epitelial, tambm chamada uvomorulina e L-CAM) expressa em todas as clulas embrionrias precoces de mamferos, mesmo no estgio de uma clula. Mais tarde, essa molcula restrita a tecidos epiteliais de embries e adultos. P-caderina (caderina de placenta) parece ser expressa primariamente em clulas placentrias do embrio de mamfero, que fazem contato com a parede uterina (as clulas trofoblsticas) e o prprio epitlio da parede uterina (Nose e Takeichi, 1986). possvel que a P-caderina facilita a conexo do trofoblasto com o tero, pois a P-caderina nas clulas uterinas visualizada em contato com a P-caderina das clulas trofoblsticas de embries de camundongos (Kadokawa et al., 1989).
Stios de fosforilao Reconhecimento do stio de adeso
Figura 3.16
Stio de ligao de clcio
Membrana celular
Cateninas Actina
Representao esquemtica da adeso celular mediada por caderina. Caderinas esto associadas com trs tipos de cateninas. As cateninas podem se associar com o sistema de microfilamentos de actina. A importncia dessas interaes para o desenvolvimento normal vista na Figura 3.18; caderinas que no tm o domnio extracelular podem interferir com o desenvolvimento. Presumivelmente, elas competem com as caderinas normais, ligando as cateninas disponveis com seus domnios citoplasmticos. (de Takeichi, 1991).
Caderina Ligao caderina-caderina
Caderina
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(A)
(B) Ectoderma Crista Neural
Clulas migratrias Tubo neural E-caderina N-caderina
(C)
Figura 3.17
Localizao de duas diferentes caderinas durante a formao do tubo neural no camundongo. Foi usada marcao imunofluorescente dupla para localizar E-caderina (A) e Ncaderina (B) na mesma seo transversal do crebro posterior de um embrio de camundongo de 8.5 dias. Anticorpos para E-caderina foram marcados com um tipo de corante fluorescente (o qual fluoresce em um intervalo de comprimento de onda), enquanto anticorpos para N-caderina foram marcados com um segundo tipo de corante (que emite sua cor em outros comprimentos de onda). Fotografias obtidas em diferentes comprimentos de onda. mostram que o ectoderma externo expressa E-caderina predominantemente, ao passo que a invaginante placa neural cessa a expresso de E-caderina, mas passa a expressar N-caderina. (C) quando se forma o tubo neural, ele expressa N-caderina, a epiderme expressa E-caderina e as clulas da crista neural nenhuma das duas. (Fotografias de K. Shimamura e H. Matsunami, cortesia de M. Takeichi; C de Rutishauser, 1988.)
N-caderina (caderina neural) vista inicialmente nas clulas mesodrmicas no embrio em gastrulao enquanto elas perdem sua expresso de E-caderina. intensamente expressa nas clulas do sistema nervoso central em desenvolvimento (Figura 3.17; Hatta e Takeichi, 1986). EP-caderina (C-caderina) crtica na manuteno da adeso celular entre os blastmeros da blstula de Xenopus e necessria para os movimentos normais de gastrulao (Figura 3.18; Heasman et al., 1994; Lee e Gumbiner, 1995). Caderinas promovem a aderncia celular, ligando-se ao mesmo tipo de caderina em outra clula. Assim, clulas com E-caderina grudam em outras clulas que tm Ecaderina, e se separaro de outras clulas contendo N-caderinas em suas membranas. Essa ligao chamada ligao homoflica. Clulas expressando N-caderinas rapidamente se isolam de clulas N-caderina-negativas in vitro, e anticorpos univalentes contra caderinas convertero um agregado de clulas tridimensional histotpico, em uma camada nica (Takeichi et al., 1979). Mais ainda, quando genes ativados de Ecaderina so transfectados em fibroblastos de camundongo cultivados e neles expressos (usualmente eles no expressam essa protena), E-caderina vista em suas superfcies celulares, e os fibroblastos tratados passam a se ligar fortemente uns aos outros (Nagafuchi et al.,1987). Na verdade essas clulas comeam a se portar como clulas epiteliais. Expresso de caderinas freqentemente correlacionada com agregao e disperso. Clulas da crista neural (que esto na poro mais dorsal do tubo neural), inicialmente expressam N-caderina. Em seguida, enquanto deixam o tubo neural, migrando como clulas individuais (para formar clulas pigmentadas, neurnios sensoriais e outros tipos de clulas), elas perdem a expresso de N-caderina (veja Figura 3.17; veja tambm Captulo 7). Entretanto, quando as clulas migrantes chegam ao seu destino e comeam a se agregar entre si para formar gnglios nervosos, elas tornam a expressar N-caderina (Hatta et al.,1987). Expresso diferencial de caderina pode tambm explicar os dados de distribuio homotpica discutida anteriormente. Como foi discutido, Roth e colaboradores demonstraram que clulas de fgado tendem a coletar clulas de fgado e que clulas retinais coletam outras clulas retinais. Takeichi (1987) demonstrou que clulas retinais expressam N-caderina e clulas hepticas expressam E-caderina, e que a distribuio seria a esperada devido a essa diferena na expresso de caderinas. Ele tambm sugeriu que as observaes de Townes e Holtfreter poderiam ser, da mesma forma, explicadas por expresso diferencial de caderinas. Suporte para essa idia veio de estudos nos quais diferentes genes de caderina foram transfectados em fibroblastos de camundongo, que no expressam habitualmente qualquer tipo de caderina. Fibroblastos expressando E-caderina aderiram a outros contendo E-caderina, enquanto fibroblastos de P-caderina se ligavam a outros que expressavam P-caderina. Tambm, quando tecido pulmonar embrionrio foi dissociado e sua recombinao permitida na presena de fibroblastos levando E-caderina ou de fibroblastos sem tratamento, os fibroblastos expressando E-caderina foram integrados nos tbulos epiteliais pulmonares (que expressam E-caderina), enquanto que os fibroblastos no tratados se associaram s clulas mesenquimatosas (que no expressam caderinas) (Nose et al.,1988). Todos esses experimentos foram realizados com clulas cultivadas. Recentemente, estudos in vivo mostraram que caderinas podem ter um papel crtico nos fenmenos de distribuio ocorrendo dentro do embrio. Quando o mRNA para N-caderina de galinha injetado em um dos dois blastmeros da primeira clivagem em embrio da r Xenopus, N-caderina freqentemente expressa em clulas que normalmente no a possuem. Os embries que expressam N-caderina extra so muitas vezes caracterizados por amontoados de clulas e camadas tissulares engrossadas. Normalmente, o tubo neural (que expressa N-caderina) se separa das clulas que se transformaro em epiderme (a qual expressa E-caderina). Em embries nos quais a epiderme e o tubo neural expressam a N-caderina extra, o tubo neural no se separa da epiderme (Detrick
95
(A)
(B)
Figura 3.18
Importncia de caderinas em manter a coeso entre clulas em desenvolvimento. (A) Quando ocitos so injetados com oligonucleotdeos antisense contra uma mensagem de caderina herdada maternalmente, as clulas centrais dispersam quando o hemisfrio animal removido. Em embries controle (direita), as clulas internas permanecem juntas. (B) No estgio de quatro clulas, os blastmeros que formam o lado esquerdo do sapo so injetados com um mRNA para N-caderina que no tem a regio extracelular da caderina. Durante a neurulao as clulas com a protena mutante no formam uma camada coerente. (de Heasman et al., 1994; B de acordo com Kintner et al, 1992; fotografias cortesia de J. Heasman e C. Kintner.)
et al., 1990; Fujimori et al., 1990). Assim, as caderinas esto, provavelmente, tendo um papel principal na organizao das clulas em tecidos. [cell2.html] CAMs da superfamlia de imunoglobulinas Como discutimos no Captulo 1, anticorpos foram usados inicialmente para identificar molculas de adeso celular em Dictyostelium. Gerisch e colegas (Beug et al.,1970), prepararam anticorpos contra Dictyostelium e os quebraram quimicamente de modo que somente suas regies monovalentes ligantes de antgeno permanecessem os fragmentos Fab. (Os anticorpos bivalentes tiveram que ser quebrados, porque de outra maneira eles poderiam artificialmente agrupar clulas e o efeito no poderia ser medido). Isso levou descoberta de uma glicoprotena de 80-kDa que mediadora da adeso clula-clula durante a agregao no fungo pegajoso. A mesma estratgia foi usada por Edelman e seus colaboradores (Brackenbury et al., 1977) que levou ao isolamento de uma molcula de adeso de clulas neurais (N-CAM). [cell3.html] N-CAM um membro de uma classe de CAMs que no necessitam ons de clcio e que tm uma estrutura semelhante (Figura 3.19). Essa estrutura extracelular com seus domnios globulares imobilizados por pontes dissulfeto, se assemelha molcula de imunoglobulina, e mesmo possvel que as imunoglobulinas sejam derivadas desse grupo de CAMs (Williams e Barclay, 1988; Lander, 1989). Assim, essas glicoprotenas so chamadas CAMs da superfamlia de imunoglobulinas*. As CAMs da superfamlia de imunoglobulinas podem ter um papel importante no desenvolvimento do sistema nervoso. N-CAM necessria para uma ligao adequada de axnios s clulas musculares alvos (Covault e Sanes, 1986; Tosney et al.,1986). Alm disso, N-CAM parece ser crtica para o empacotamento (fasciculao) de axnios para que se movimentem como uma unidade. Anticorpos N-CAM podem quebrar essas ligaes, permitindo que os axnios se dispersem (Fraser et al., 1988; Landmesser et al.,1988). Uma situao similar parece ocorrer em insetos, onde
* A designao superfamlia freqentemente usada porque as diferentes classes de molculas de imunoglobulinas tambm constituem, elas mesmas, uma famlia. Esses outros membros da superfamlia tm estruturas semelhantes s imunoglobulinas, mas no so exatamente famlia prxima.
96
Figura 3.19
(B)
Molculas de adeso da superfamlia de imunoglobulinas. (A) Trs membros da superfamlia de imunoglobulinas. A forma da molcula de IgM ligada membrana tem duas cadeias pesadas, cada uma com cinco domnios, e duas cadeias leves, cada uma com dois domnios. N-CAM um polipeptdeo com cinco domnios. Sua ncora na membrana pode ser a seqncia de aminocidos de uma protena transmembrana ou um lipdeo. L1 uma protena transmembrana com seis domnios globulares. Fasciclina II, a molcula de adeso celular de insetos, e neurogliana se assemelham a N-CAM e L1, respectivamente. (B) Modelo para a adeso das CAMs da superfamlia de imunoglobulinas.
(A) N N N N N N
ou
Domnios semelhantes imunoglobulina
Domnios semelhantes fibronectina Extracelular ou Citoplasma CC IgM C N-CAM ou fasciclina II C L1 ou neurogliana
ou C Interaes de N-CAM clula-clula
Figura 3.20
as CAMs da superfamlia de imunoglobulinas, chamadas fasciclinas (Figura 3.20) ajudam a migrao de axnios (Harrelson e Goodman, 1988). L1 necessria para a produo de certos axnios (Lemmon et al., 1989), e mutaes de L1 no homem causam um espectro de anomalias caracterizada por hidrocefalia, retardamento mental e inabilidade em controlar movimentos dos membros (Vits et al., 1994). Expresso diferencial de CAM crtica nos limites entre dois grupos de clulas. Nesses lugares, o corpo segrega diferentes clulas em diferentes regies. Clulas da notocorda no entram no tubo neural e nem clulas dermais trespassam para a epiderme.
Expresso de fasciclina no sistema nervoso do gafanhoto em desenvolvimento. (A) Estrutura em andaime dos axnios fasciculados em um embrio de gafanhoto como visto em um microscpio de Nomarski. A com e P com so as comissuras anterior e posterior cujos axnios atravessam o segmento; ISN um neurnio intersegmental e con um neurnio conectivo. (B,C) Sistema nervoso embrinico como em (A), mas marcado com anticorpos monoclonais feitos para as glicoprotenas fasciclinas da superfcie celular. O anticorpo em (B) reconhece um subconjunto de axnios nas comissuras anterior e posterior, enquanto o anticorpo em (C) se liga a uma glicoprotena de membrana dos mais longitudinais fascculos de axnios. As flechas mostram os mesmos locais em (B) e (C). Note que o anticorpo marca somente uma poro de cada axnio. (de Bastiani et al., 1987, cortesia de C. Goodman.)
(A)
(B)
(C)
97
Figura 3.21
Distribuio de diferentes CAMs em bordas tissulares. Enquanto as clulas mesodrmicas se renem para induzir o broto das penas no ectoderma, as clulas mesenquimatosas recmagregadas expressam N-CAM (A) e as clulas ectodrmicas expressam E-caderinas (B) nas suas respectivas membranas celulares. (de Chuong e Edelman, 1985a, cortesia de G. Edelman).
Essa segregagao pode ser conseqncia da diferena de CAMs nas populaes adjacentes. Por exemplo, penas so induzidas quando clulas mesenquimatosas derivadas do mesoderma se agrupam para formar uma bola de clulas imediatamente abaixo da epiderme da pele da galinha. As clulas ectodrmicas esto ligadas entre si por E-caderina, enquanto as clulas mesenquimatosas, CAM-negativas anteriormente, comeam a expressar N-CAM e se juntam para formar um agregado (Figura 3.21). Atravs do desenvolvimento da pena, diferentes grupos de clulas se separam umas das outras, como resultado de sua habilidade para expressar N-CAM, E-caderina, ou ambas as protenas (Chuong e Edelman, 1985a,b).
(A)
Molculas da juno celular: protenas da juno em fenda

Junes em fenda so regies intercelulares especializadas onde clulas adjacentes se encontram entre 15-40 nm de distncia. Finas conexes servem como canais de comunicao entre clulas adjacentes (Figura 3.22A,B). Clulas assim ligadas so chamadas acopladas, e pequenas molculas (MW<1500) e ons podem passar livremente de uma clula para outra. Na maioria dos embries, pelo menos alguns
(B)
(B)
(D)
Figura 3.22
Espao intracelular (15-40 nm)
Canais de comunicao
Membranas celulares Conexes (A) (D)
Protenas das junes em fenda. (A) Micrografia eletrnica de uma fileira de junes em fenda ligando duas clulas justapostas. (B) Micrografia fluorescente de junes em fenda em tbulo renal de embrio de camundongo de 17 dias. (C) Compartimento formado por protenas da juno de fenda entre clulas que se comunicam umas com as outras. Esse compartimento na gstrula de camundongo pode ser visto injetando o corante Lucifer Yellow em um clula e observando sua transferncia a um pequeno grupo de clulas. (D) Estrutura da subunidade da juno em fenda. (A de Peracchia e Dulhunty, 1976, cortesia de C. Peracchia; B de Sainio et al., 1992, cortesia de K. Sainio; C de Kalimi e Lo, 1988, cortesia de C. Lo; D conforme Darnell et al., 1986.)
98
(A)
dos blastmeros precoces esto ligados por junes em fenda, dessa forma permitindo que ons e pequenas molculas solveis passem livremente entre eles. A habilidade de clulas em formar junes em fenda com algumas clulas, e no com outras, cria compartimentos fisiolgicos dentro do embrio em desenvolvimento (Figura 3.22 C). A importncia de junes em fenda no desenvolvimento foi demonstrada em embries de anfbios e mamferos (Warner et al., 1984). Quando anticorpos contra protenas da juno em fenda foram microinjetados em uma clula especfica de uma blstula de Xenopus de oito clulas, a prognie daquela clula que usualmente est ligada por junes de fenda, agora no podia permitir a passagem de ons ou molculas pequenas de uma clula outra. Ainda mais, os girinos que resultaram das blstulas tratadas mostraram defeitos especificamente relacionados ao destino desenvolvimental da clula injetada (Figura 3.23). A prognie de tal clula no morreu, mas foi incapaz de se desenvolver de maneira normal (Warner et al., 1984). No embrio de camundongo, os oito primeiros blastmeros so conectados entre si por junes em fenda. Apesar de frouxamente associadas entre si, essas oito clulas se movem juntas para formar um embrio compacto. Se a compactao for inibida por anticorpos contra protenas da juno em fenda, o desenvolvimento posterior cessa. Os blastmeros tratados continuam a dividir-se, mas a compactao no ocorre (Lo e Gilula, 1979; Lee et al., 1987). Se RNA antisense contra as mensagens da juno em fenda injetado em um dos blastmeros de um embrio normal de camundongo, aquela clula no formar junes em fenda e no ser includa no embrio (Bevilacqua et al., 1989). Os canais da juno em fenda so feitos de protenas chamadas conexinas. Em cada clula, seis conexinas idnticas da membrana se agrupam para formar um canal transmembrana contendo um poro central. O complexo de juno em fenda de uma clula se conecta ao complexo de juno em fenda de outra clula, permitindo que se juntem os citoplasmas de ambas as clulas (Figura 3.22D). Existem aproximadamente doze tipos de conexinas, e algumas podem ser reguladas por caderinas. Jongen e colaboradores (1991) observaram que em clulas acopladas por E-caderina, a comunicao entre clulas, mediada por junes em fenda, depende da funo de caderinas. Evidncias sugerem que caderinas permitem no s o contato entre as clulas como tambm modificam as protenas tipo conexina. Os diferentes tipos de protena conexina tm papis separados, mas parcialmente sobrepostos, no desenvolvimento normal. Por exemplo, a protena de juno em fenda conexina-43 encontrada em quase todos os tecidos do embrio do camundongo em desenvolvimento. Entretanto, se os genes da conexina-43 forem derrubados por endereamento de genes, o embrio ainda se desenvolver. Parece que a funo da protena conexina-43 pode ser assumida por outras conexinas. Mas, logo aps o nascimento, esses camundongos tm respirao convulsiva, se tornam cianticos e morrem. Autpsia desses animais mostra que o ventrculo direito a cmara que bombeia sangue aos pulmes atravs da artria pulmonar est cheio de tecido que fecha a cmara e impede o fluxo de sangue (Reaume et al.,1995). Mesmo que a perda da protena conexina-43 possa ser compensada em muitos tecidos, parece que ela crtica para o desenvolvimento normal do corao. [cell4.html] A membrana celular tem, ento, vrios mecanismos pelos quais pode fazer ligaes com membranas de outras clulas. Podem ser usadas CAMs da superfamlia de
Figura 3.23
(B)
Efeitos da juno em fenda no desenvolvimento. Seo de um girino de Xenopus no qual um dos blastmeros, no estgio de oito clulas, foi injetado com (A) um anticorpo controle ou (B) um anticorpo contra a protena da juno em fenda. O lado formado pelo blastmero injetado no tem o olho e tem uma morfologia cerebral anormal. (de Warner et al., 1984, cortesia de A. E. Warner.)
99
imunoglobulinas, CAMs dependentes de clcio e protenas de juno. Mas isso no esgota seu repertrio. Como j mencionado, a clula tambm pode se ligar a componentes especficos da matriz extracelular. Agora voltamos nossa ateno para esses componentes.
A base molecular da afinidade clula-substrato

Afinidade diferencial a substrato A migrao de clulas, como a migrao de pssaros e borboletas monarca, depende da percepo de quando comear a migrao, quando cessar a migrao e qual rota tomar. Existem muitos sinais que o ambiente pode dar s clulas, mas os principais parecem envolver substncias na matriz extracelular. A hiptese da afinidade diferencial a substrato postula que diferentes clulas reconhecem diferentes molculas em vrias matrizes extracelulares. Cada tipo de clula migratria prefere certas combinaes de molculas da matriz a outras combinaes, e essas molculas orientam a clula para quando e onde migrar. Weiss (1945) e Tyler (1946) sugeriram que a clula, por vezes, pode interagir com seus substratos atravs do sistema chave-fechadura, ou seja, entre a membrana celular e a matriz extracelular. O relacionamento entre a protena da membrana celular e a molcula da matriz seria semelhante aquele entre enzima e substrato ou anticorpo e antgeno. Durante a ltima dcada foi demonstrado que esse tipo de interao muito importante para a migrao celular. [cell5.html] A matriz extracelular A matriz extracelular consiste de macromolculas secretadas pelas clulas no seu ambiente imediato. Essas molculas interagem de modo a formar uma estrutura insolvel que pode ter vrias funes no desenvolvimento. Em algumas situaes, ela pode separar dois grupos adjacentes de clulas e prevenir qualquer interao. Em outros casos, a matriz extracelular pode servir como o substrato no qual as clulas migram, ou pode at induzir diferenciao em certos tipos celulares. Um tipo de matriz mostrado na Figura 3.24. Aqui, uma lmina de clulas epiteliais est adjacente a uma camada de tecido mesenquimatoso frouxo. As clulas epiteliais formaram uma apertada camada extracelular chamada lmina basal; as clulas mesenquimatosas secretam uma frouxa lmina reticular. Juntas, essas camadas constituem a membrana basal da lmina de clulas epiteliais. Existem trs componentes principais na maioria de matrizes extracelulares: colgeno, proteoglicanos e glicoprotenas grandes que so chamadas molculas de adeso a substrato (Tabela 3.2).
Epitlio
Figura 3.24
Lmina basal
Colgeno
Localizao e formao da matriz extracelular no embrio de galinha. A micrografia eletrnica de varredura mostra a matriz extracelular na juno das clulas epiteliais (acima) e mesenquimatosas (abaixo). As clulas epiteliais sintetizam uma lmina densa com base de glicoprotena, enquanto as clulas mesenquimatosas secretam a lmina reticular feita primariamente de colgeno. (Cortesia de R. L. Trelsted.)
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Tabela 3.2 Principais constituintes da matriz extracelular

Matriz extracelular mesenquimatosa Lmina basal das clulas epiteliais
COLGENOS Molculas longas e delgadas (Tipo I o mais comum; Tipos II, III, e V-XIII so tambm encontradas) que se organizam para formar fibrilas, usualmente com 60-70 nm de dimetro. Colgenos proporcionam fora e estabilidade aos tecidos. PROTEOGLICANOS DA MATRIZ Compostos de protenas e dissacardeos repetitivos (glicosaminoglicanos). Glicosaminoglicanos incluem cido hialurnico, uma enorme molcula (108 Da) que liga grandes quantidades de gua. Proteoglicanos sulfatados compreendem uma protena linear interna qual esto ligadas cadeias de um ou mais glicosaminoglicanos sulfatados (condroitina, heparan, queratan e dermatan sulfato). Proteoglicanos estimulam e modulam movimentos celulares; sua disponibilidade sugere que podem ter outras propriedades no conhecidas. MOLCULAS DE ADESO DE SUBSTRATO Molculas s quais clulas aderem permitindo-lhes que se movam. Elas incluem fibronectina, condronectina e tenascina. Fonte: Adaptado de Bard, 1990.
COLGENO IV Os componentes estruturais majoritrios da lmina basal. Ao contrrio de outros colgenos, suas fibrilas so como um fino arame de galinheiro e se organizam em um substrato semelhante a feltro. PROTEOGLICANOS DA MATRIZ cido hialurnico e proteoglicanos sulfatados so freqentes na lmina basal. Sua presena pode facilitar a passagem de produtos secretados pela lmina. MOLCULAS DE ADESO DE SUBSTRATO Laminina, o componente funcional majoritrio da lmina basal. Um trmero de glicoprotena com stios de adeso para a membrana celular, colgeno IV e glicosaminoglicanos. Lmina basal pode conter fibronectina, tenascina, nidogen e outras glicoprotenas adesivas.
COLGENO. Colgeno uma famlia de glicoprotenas contendo altas porcenta-
gens de resduos de glicina e prolina. Quase metade das protenas do corpo so constitudas de colgeno, que o principal suporte estrutural de quase todos os rgos dos animais. Existem numerosos tipos de colgeno servindo funes especiais. Colgeno Tipo I, encontrado nas matrizes extracelulares da pele, tendes e ossos, perfaz quase 90 porcento do colgeno do corpo. Colgeno Tipo II mais evidente como secreo das clulas cartilaginosas, mas tambm encontrado na notocorda e no corpo vtreo do olho. Vasos sangneos apresentam colgeno Tipo III, e o Tipo IV encontrado na lmina basal produzida por clulas epiteliais (Vuorio, 1986). Outros tipos de colgeno so encontrados ao longo do corpo, especialmente em cartilagem. Colgeno importante para a formao da lmina basal, e tambm est implicado na ramificao dos tbulos epiteliais nas glndulas salivares, pulmes e outros rgos. [cell6.html]
PROTEOGLICANOS. So tipos especficos de glicoprotenas nas quais: (1) o peso dos resduos de carboidratos muito maior do que o da protena; (2) os carboidratos so cadeias lineares compostas de dissacardeos repetitivos. Usualmente, um dos acares do dissacardeo tem um grupo amino e a unidade repetitiva chamada glicosaminoglicano (GAG). A Tabela 3.3 lista os glicosaminoglicanos mais comuns; a estrutura bsica dos proteoglicanos mostrada na Figura 3.25. A interconexo de protena e carboidrato forma uma matriz semelhante a uma rede, e em muitos tipos de clulas mveis, o proteoglicano envolve as clulas impedindo que elas se juntem (Figura 3.26). A consistncia da matriz extracelular depende da relao entre colgeno e proteoglicanos. Cartilagem, que tem uma alta porcentagem de proteoglicanos, macia, enquanto tendes, que contm predominantemente fibras de colgeno, so rgidos. Na lmina basal predominam os proteoglicanos que formam uma peneira molecular alm de propiciar suporte estrutural.
101
Monmeros de proteoglicanos Pequenos glicosaminoglicanos (tal como condroitina sulfato) Protena esqueleto
cido D-glucurnico
N-acetil-D-glucosamina
cido hialurnico cido hialurnico Glicosaminoglicano
Figura 3.25
Glicoprotenas ligantes Agregados de proteoglicanos
A estrutura da subunidade e a montagem de um proteoglicano complexo. O dissacardeo repetitivo do glicosaminoglicano (tal como condroitina sulfato; veja Tabela 3.3) se liga a um esqueleto protico relativamente pequeno (colorido), para produzir as cadeias de proteoglicanos. Essas cadeias podem ser conectadas por glicosamino-glicanos mais longos (mostrado aqui como cido hialurnico) para produzir redes complexas. Glicoprotenas ligantes estabilizam essas ltimas associaes. (Modificado de Cheney e Lash, 1981.)
Tabela 3.3
Unidades dissacardicas repetitivas de glicosaminoglicanos mais comuns encontradas em proteoglicanos da matriz

Unidade dissacardica repetitivaa Distribuio
Glicosaminoglicano
cido hialurnico Condroitina sulfato Dermatan sulfato Queratan sulfato Heparan sulfato
cido glucurnico-Nacetilglucosamina cido glucurnico-Nacetigalactosamina sulfato [cido glucurnico ou idurnico] N-acetilgalactosamina sulfato Galactose-N-acetilglucosamina sulfato [cido glucurnico ou idurnico] N-acetilglucosamina sulfato
Tecidos conjuntivos, osso, corpo vtreo Cartilagem, crnea, artrias Pele, corao, vasos sangneos Cartilagem, crnea Pulmo, artrias, superfcie celular
a Essas so unidades repetitivas tpicas desses glicosaminoglicanos. Entretanto, algumas regies de cada GAG podem ter sacardeos ligeiramente modificados.
102
(A)
(B)
(D)
(C)
Figura 3.26
Capa de proteoglicanos envolvendo clulas mveis. (A) Capa de hialuronidato envolve mioblastos de galinha. Mioblastos em cultura excluem pequenas partculas (nesse caso, hemcias fixadas) em distncia significante da borda celular. (B) quando os mioblastos so tratados com hialuronidase (a qual dissolve cido hialurnico), essa capa extracelular desaparece. (C) A capa tambm desaparece quando os mioblastos cessam a diviso e se juntam enquanto se diferenciam. (D) Micrografia eletrnica de hialuronidato em soluo aquosa mostra uma rede fibrilar ramificada. (A-C de Orkin et al., 1985, cortesia de B. Toole; D de Hadler et al., 1982, cortesia de N. M. Hadler.)
Proteoglicanos tambm so importantes como mediadores de conexes entre tecidos adjacentes em um rgo. No rgo, eles renem clulas soltas para formar uma lmina epitelial* (San Antonio et al.,1987; Thesleff et al., 1989; Vainio et al., 1989; Bernfield e Sanderson, 1990). Em alguns casos, proteoglicanos secretados por um tipo de clula so essenciais para o crescimento de clulas vizinhas. Axnios dos gnglios da raiz dorsal tm proteoglicanos de heparan sulfato entre suas protenas da superfcie celular; a remoo desses proteoglicanos impede a proliferao ao seu redor, das clulas de Schwann associadas (Ratner et al.,1985). Uma maneira pela qual cadeias de glicosaminoglicanos, de proteoglicanos, podem funcionar reter e apresentar fatores de crescimento para receptores celulares. Fatores de crescimento so protenas semelhantes a hormnios que regulam mitose ou diferenciao quando se ligam a determinadas clulas. Entretanto, o receptor celular para o fator de crescimento freqentemente no liga o fator com grande afinidade. Na verdade, o fator inicialmente ligado pelos carboidratos do proteoglicano, e isso concentra o fator de crescimento localmente, de modo a ser possvel a ligao com o receptor (Massagu, 1991; Yayon et al.,1991).
GLICOPROTENAS EXTRACELULARES. Matrizes extracelulares contm uma va-
riedade de outras molculas especializadas, tais como: fibronectina, laminina e tenascina. Essas glicoprotenas grandes provavelmente so responsveis pela organizao de colgeno, proteoglicanos e clulas em uma estrutura ordenada. Fibronectina um dmero de glicoprotena, muito grande (460-kDa), sintetizada por fibroblastos, condrcitos, clulas endoteliais, macrfagos e certas clulas epiteliais (como hepatcitos e amnicitos). Uma funo da fibronectina servir como adesivo
*Proteoglicanos de heparan sulfato so considerados como agregadores de condrcitos, as clulas produtoras de cartilagem. Nveis excessivos de glicose inibem a sntese do esqueleto de protena do proteoglicano, inibindo a formao da cartilagem. Leonard e colaboradores (1989) propuseram esse como um possvel mecanismo para explicar problemas esquelticos em crianas nascidas de mes severamente diabticas.
103
molecular em geral, ligando clulas a substratos, tais como: colgeno e proteoglicanos. Fibronectina tambm organiza a matriz extracelular por ter vrios pontos de ligao distintos, que interagindo com as molculas apropriadas produz um alinhamento adequado de clulas e sua matriz extracelular (Figura 3.27). Como ser visto em captulos posteriores, fibronectina tem tambm um papel importante na migrao celular. As rodovias pelas quais se movem certas clulas migratrias so pavimentadas com essa protena. A migrao de clulas mesodrmicas na gastrulao vista na superfcie de fibronectina em muitas espcies, e o movimento dessas clulas cessa quando a fibronectina localmente removida. Em embries de galinha, os precursores do corao, as clulas precardacas, migram na fibronectina para se mover das laterais do embrio para a linha mediana. Se embries de galinhas so injetados com anticorpos fibronectina, as clulas precardacas no migram para a linha mediana e desenvolvem dois coraes separados. Anticorpos fluorescentes fibronectina demonstraram um gradiente da protena no caminho de migrao entre o endoderma e o mesoderma. Se essa regio for cortada e sofrer uma rotao, as clulas do corao seguem o gradiente para novas posies se afastando da linha mediana (Linask e Lash, 1988a,b). Assim, a fibronectina parece ter um papel principal na migrao das clulas precardacas para a linha mediana do embrio. Outros tipos de clulas, como as clulas germinativas, precursoras de embries do sapo, tambm migram sobre clulas que secretam fibronectina em suas superfcies (Heasman et al.,1981). Laminina um componente principal da lmina basal. composta de trs cadeias peptdicas, e, como fibronectina, pode se ligar ao colgeno, glicosaminoglicanos e clulas. O colgeno ligado por laminina do Tipo IV (especfico para lmina basal), e a regio ligante de clulas da laminina reconhece principalmente clulas epiteliais e neurnios. A adeso de clulas epiteliais laminina (na qual elas se assentam e usam) muito maior do que a afinidade de clulas mesenquimatosas pela fibronectina ( qual elas devem se ligar e liberar se dever haver migrao). Como a fibronectina, a laminina tem um papel na montagem da matriz extracelular, promovendo adeso celular e crescimento, mudando a forma da clula e permitindo a migrao celular (Hakomori et al.,1984). Nem todas grandes glicoprotenas celulares promovem adeso celular. Tenascina (tambm chamada citotactina) se assemelha a fibronectina em mais ou menos metade
Figura 3.27
(A)
(B) H 2N Domnio ligante de fibrina e heparina Domnio ligante de colgeno
Stio de alta afinidade
Domnios para ligao de clulas da crista neural de aves RGDS CS1 COOH
Fibronectina no embrio de galinha em desenvolvimento. (A) Anticorpos fluorescentes para fibronectina mostram que a deposio de protena no embrio de 24 horas se situa ao longo da lmina basal de muitos rgos. (B) Estrutura e domnios de ligao na fibronectina. Os retngulos representam domnios resistentes a proteases. O domnio para a ligao de fibroblastos compreende duas unidades, o stio RGD e o stio de alta afinidade; ambos so essenciais para ligao da clula. Clulas da crista neural de aves tm outro stio necessrio para sua mobilidade em um substrato de fibronectina. Outras regies na fibronectina permitem ligaes com colgeno, heparina* e outras molculas da matriz extracelular. (A cortesia de J. Lash; B conforme Dufour et al., 1988.)
*Heparina uma poro de um proteoglicano de heparina secretada por mastcitos e basfilos. Heparan e heparan sulfato so nomes dados a glicosaminoglicanos similares encontrados na matriz extracelular ou na superfcie da clula. Presume-se que os stios de ligao para heparina sejam os mesmos que os para heparan sulfato (Bernfield e Sanderson, 1990).
Domnios ligantes de clulas para fibroblastos
Stio II ligante de heparina
Stio II ligante de fibrina
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do comprimento da molcula, e encontrada transitoriamente em vrias matrizes extracelulares durante o desenvolvimento embrionrio. Entretanto, diferentes clulas reagem de maneira diferente tenascina. Algumas clulas aderem a ela, outras so arrebanhadas e se desligam da tenascina (Figura 3.28; Spring et al., 1989). Diferentes quantidades relativas de fibronectina e tenascina podem gerar substratos de vrios graus de adesividade. Alm disso, tenascinas parecem aumentar a sntese e secreo de proteases das clulas que nela se localizam (Werb et al., 1990). Ambas as caractersticas podem ser importantes na gerao de vias para a migrao celular, e na remodelao da matriz extracelular durante o desenvolvimento (Tan et al., 1987; BronnerFraser, 1988; Wehrle e Chiquet, 1990). Receptores celulares para molculas da matriz extracelular INTEGRINAS. A habilidade de uma clula em ligar essas glicoprotenas adesivas depende da sua capacidade em expressar um receptor da membrana, que se torna o lugar de ligao na clula para essas grandes molculas. Os principais receptores de fibronectina foram purificados usando anticorpos monoclonais que bloqueiam a ligao das clulas fibronectina (Chen et al.,1985; Knudsen et al., 1985). Foi observado que o complexo receptor de fibronectina capaz no s de ligar fibronectina no exterior da clula, como tambm protenas do citoesqueleto dentro da clula. Ento, parece que o complexo receptor de fibronectina atravessa a membrana celular e une dois tipos de matrizes. Dentro da clula, serve como um stio de ancoragem para os microfilamentos de actina que movimentam a clula; fora da clula, se liga fibronectina da matriz extracelular (Figura 3.29). Horwitz e colaboradores (1986; Tamkun et al., 1986) denominaram essa famlia de receptores proticos como integrinas porque elas integram as plataformas intra e extracelulares permitindo que funcionem conjuntamente. Protenas integrinas foram encontradas atravessando a membrana de numerosos tipos de clulas. No lado extracelular, integrina se liga seqncia arginina-glicina-aspartato (RGD) de vrias protenas adesivas em matrizes extracelulares, inclundo vitronectina (encontrada na lmina basal do olho), fibronectina e laminina (Ruoslahti e Pierschbacher, 1987). No lado citoplasmtico, a integrina se liga talina e -actinina, duas protenas que se ligam aos microfilamentos de actina. Essa ligao dupla permite o movimento da clula pela contrao dos microfilamentos de actina contra a matriz extracelular fixa (veja Wang et al., 1993). Tipos diferentes de clulas podem ter diferentes molculas de integrinas com diferentes afinidades por molculas da matriz extracelular (Hemler et al., 1987; Hemler,1990). Cada molcula de integrina tem duas subunidades distintas, e , e diferentes combinaes binrias das subunidades e permitem que a integrina se ligue a determinadas molculas extracelulares. Por exemplo, 21 se liga ao colgeno e laminina, enquanto 41 se liga somente fibronectina. Ambas as unidades e so necessrias para a ligao com fibronectina ou laminina, mas somente a unidade conecta com o citoesqueleto interno. Durante a migrao, as ligaes unindo a unidade da integrina ao citoesqueleto, podem ser continuamente quebradas e refeitas por uma protease que cliva talina e est especificamente localizada em stios da membrana celular onde a integrina se liga ao substrato. possvel que essa protease quebre a ponte entre o receptor de fibronectina e o citoesqueleto (Beckerle et al., 1987). A importncia de integrinas dramaticamente ilustrada durante a embriognese de Drosophila. Como as integrinas de vertebrados, as integrinas de Drosophila so compostas de subunidades e que atravessam a membrana celular. Nas duas integrinas de Drosophila que so conhecidas, as subunidades so idnticas, mas as subunidades so diferentes. Essas duas integrinas freqentemente funcionam em conjunto efetuando adeso tissular e celular durante o desenvolvimento. No desenvolvimento da asa da Drosophila, duas lminas epiteliais so aproximadas. A integrina PS1 est situada na superfcie basal do epitlio na asa presuntiva dorsal, enquanto a integrina PS2 est na superfcie superior do epitlio na asa presuntiva
Figura 3.28
Inibio de adeso celular por tenascina. Fibronectina e tenascina foram colocadas em placas de cultura de tecidos, dispostas em forma de letras. Fibroblastos foram adicionados s placas podendo aderir e migrar. O resultado mostra que fibronectina foi o substrato preferido no plstico da cultura de tecidos, enquanto que as clulas no aderiram ou migraram bem sobre a tenascina. (Cortesia de M. Chiquet.)
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(A) Fibronectina
RGD
Stio de ligao de RGD Subunidade de integrina Extracelular Subunidade de integrina
Stios de ligao de clcio Subunidade de integrina
Citoplasma
Actinina
Vinculina
Talina
ventral. Durante a metamorfose, esses dois epitlios se encontram e aderem para formar a lmina de duas camadas da asa. Mutaes nas integrinas produzem asas com regies onde os dois epitlios se separam, como evidenciado por bolhas entre as duas lminas (Brower e Jaffe, 1989; Wilcox et al.,1989). Algumas mutaes de integrinas em Drosophila so letais, porque integrina necessria para anexar msculos epiderme e parede do intestino. Na mutao letal (1) myospheroid, existe uma deficincia nos genes codificando a subunidade das integrinas de Drosophila. Na ausncia dessa subunidade, nenhuma integrina se forma, e os msculos somticos se contraem em esferas sem ligantes para a parede do corpo e do intestino (Leptin et al.,1989). Integrinas no so as nicas molculas capazes de se ligar laminina e fibronectina. Enquanto o receptor integrina se liga a uma seqncia RGD na cadeia A de laminina, outro receptor protico de laminina na membrana celular se liga a uma seqncia diferente (Y1GSR) na cadeia B1 (Graf et al.,1987; Yow et al., 1988). Os receptores tm afinidade diferente por laminina, e essas podem ser importantes para sua funo (Horwitz et al., 1985). A integrina a31 de fibroblastos, por exemplo, tem uma afinidade relativamente baixa por laminina (Kd = 10-6 M), enquanto a afinidade por laminina de seu receptor epitelial muito mais alta (Kd=2 x10-9 M). O receptor usado pode ser importante em permitir que as clulas usem laminina ou como membrana basal (nesse caso a afinidade do receptor seria alta) ou como um substrato para a migrao (na qual receptores de afinidade menor seriam usados).
GLICOSILTRANSFERASES. Outro grupo de protenas que pode aderir clulas a protenas da matriz extracelular so as glicosiltransferases da superfcie celular. Essas enzimas ligadas membrana so rotineiramente encontradas no retculo endoplasmtico e nas vesculas de Golgi, onde elas so responsveis por adicionar resduos de acar a peptdeos para produzir glicoprotenas. Existem numerosas glicosiltransferases, cada uma especfica para um dado acar e algumas mostrando tambm especificidade de substrato. Assim, galactosiltransferase uma enzima capaz de transferir galactose de um molcula doadora ativada (UDP-galactose) a uma unidade aceptora. Devem existir muitas galactosiltransferases com afinidades para diferentes molculas aceptoras. Galactosiltransferases so enzimas funcionais da membrana celular, e sua adeso matriz extracelular representa uma catlise frustrada (Figura 3.30). A enzima necessita de dois substratos para completar a catlise, o carboidrato aceptor e o acar ativado. As glicosiltransferases de membrana reconhecem o carboidrato receptor nas
Actinina
Microfilamento de actina
Figura 3.29
Dupla funo de integrinas ao se ligar com matrizes extracelulares e com o citoesqueleto interno. (A) Imunofluorescncia indireta corando os microfilamentos de actina de uma clula extendendo um lamelapdio. As fibras de actina irradiam da grade ordenada do citoesqueleto para o lamelapdio. (B) Diagrama especulativo relacionando a ligao do citoesqueleto matriz extracelular atravs da molcula de integrina. (A de Lazarides, 1976, cortesia de E. Lazarides; B conforme Luna e Hitt, 1992.)
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(A) (B) Enzima glicosiltransferase
NDP-acar + aceptor
Glicosil transferase
NDP + acar-aceptor
Doador de acar ativado (NDP-acar) Aceptor insolvel
(C)
Ligao
Ligao de NDP-acar glicosiltransferase
Figura 3.30
Catlise cliva acar de NDP e o adiciona ao aceptor
Interaes da superfcie celular atravs de glicosiltransferases. (A) A reao padro de glicosiltransferase, na qual um acar transferido de um carregador nucleosdeo difosfato a um receptor. (B) Interao entre glicosiltransferases e o grupo carboidrato (aceptor) na glicoprotena da matriz extracelular. Se o acar ativado est ausente, ocorre a adeso (considera-se que isso ocorra durante a fertilizao). Se o acar ativado est presente em pequenas quantidades, a migrao permitida. (C) Marcao da glicosiltransferase da superfcie celular, incubando sees microscpicas de um embrio de galinha de 10-somitos, com UDP-[3H] galactose. Radioatividade insolvel vista por radioautografia mostra que esse acar radioativo foi transferido s superfcies celulares, especialmente das clulas mesodrmicas migratrias. (A e B modificado de Pierce et al., 1980; C de Shur, 1977a, cortesia de B. Shur.)
protenas da matriz extracelular tal como a laminina. Isso causa adeso. Quando o segundo substrato aparece, essas adeses podem ser quebradas pela catlise. Em algumas instncias (como fertilizao no camundongo, onde a galactosiltransferase na membrana celular do espermatozide interage com componentes carboidrato da matriz extracelular secretada pelo vulo), a adeso crtica e a catlise no ocorre. Em clulas migratrias, tanto adeso como catlise so observadas (Toole, 1976; Shur, 1977a,b; Turley e Roth, 1979; Eckstein e Shur, 1989). Adeso diferencial resultante de sistemas de adeso mltipla Apesar de estarmos discutindo sistemas de adeso como unidades separadas, os processos morfogenticos de interao clula-clula so provavelmente realizados por combinaes de molculas de adeso celular. Por exemplo, a fixao inicial do embrio de camundongo parede uterina parece ser mediada por vrios sistemas de adeso. Primeiro, as clulas de fora do embrio (as clulas trofoblsticas) tm receptores para o colgeno e os proteoglicanos de heparan sulfato do endomtrio uterino, e interferncia com essa ligao pode impedir a implantao (Farach et al.,1987; Carson et al., 1988, 1993). Segundo, Dutt e colaboradores (1987) mostraram que as clulas trofoblsticas podem tambm aderir s clulas uterinas atravs das glicosiltransferases da superfcie celular. Terceiro, Kadokawa e colaboradores (1989) mostraram que Pe E-caderinas esto presentes tanto no tecido uterino como no trofoblstico no local da implantao. Assim, clulas podem ter muitos sistemas adesivos que lhes permitem ligar e/ou migrar em substratos especficos. As clulas tambm usam sistemas mltiplos para remodelar tecidos por digesto. Por exemplo, quando embries de mamferos se embebem no tero, eles digerem seu caminho atravs do epitlio do tero e atravs de sua membrana basal de laminina, fibronectina e colgeno Tipo IV (Behrendtsen et al., 1992). Crescimento do osso, regresso da cauda do girino e formao de rgos ramificados (tais como: glndulas salivares, rins e pulmes) tambm requerem quebra da membrana basal. Essa degradao controlada de molculas da matriz extracelular completada por um conjunto de enzimas coletivamente chamadas de Metaloproteinases degradativas de matrizes (Matrisian, 1992; Sato et al., 1994). Algumas dessas enzimas esto ligadas membrana celular, enquanto outras so secretadas diretamente pelas clulas para dentro da matriz que ser dissolvida. Essas metaloproteinases incluem: (1) colagenases que digerem colgenos dos Tipo I, II e III; (2) gelatinases que digerem elastina e colgenos IV e V; e (3) estromelisinas que digerem proteoglicanos, fibronectina e laminina. A ativao dos genes das metaloproteinases realizada coordenativamente, e vrias dessas enzimas interagem para amplificar a intensidade das enzimas digestivas (Figura 3.31). Logo aps a ativao das metaloproteinases, as clulas ativam os genes para os inibidores dessas protenas. A produo e degradao controlada da matriz extracelular parte essencial do desenvolvimento normal.
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Procolagenase Plasminognio Ativao transcricional Uroquinase Plasmina
Colagenase Ativa Estromelisina Colagenase muito ativa
Prostromelisina
Figura 3.31
Cascata de ativao de metaloproteinases de membrana. Uroquinase um ativador de plasminognio, que cliva o plasminognio dando plasmina. Plasmina ativa as formas precursoras de estromelisinas e colagenases produzindo uma mistura de enzimas muito ativa capaz de digerir matrizes extracelulares. (Conforme Matrisian, 1992.)
Molculas de receptores e vias de transduo de sinais

Os destinos das clulas so freqentemente determinados pelas interaes em suas superfcies, onde uma molcula de receptor encontra seu ligante complementar. Mas como que certas interaes na superfcie da clula causam a transcrio de genes especficos dentro do ncleo? As vias entre a membrana celular e o genoma so chamadas vias de transduo de sinais. Vrias vias foram descobertas, aqui sero mencionadas as principais. Como veremos, elas parecem ser variaes de um mesmo tema. O tema deveras elegante: cada receptor se estende atravs da membrana tendo uma regio extracelular, uma regio transmembrana e uma regio citoplasmtica. Quando um ligante acoplado na regio extracelular, sua forma muda e a poro citoplasmtica passa a ter atividade enzimtica. Essa atividade usualmente a de uma quinase, que pode usar ATP para fosforilar protenas, inclusive a si mesmo. O receptor ativo pode agora catalizar reaes que fosforilam outras protenas, e finalmente, a fosforilao ativa um fator de transcrio, antes dormente. Esse fator de transcrio pode agora ativar (ou reprimir) um novo conjunto de genes. O ligante iniciador da reao pode estar ligado a uma clula ou matriz extracelular ou, ainda, ser uma molcula difusvel. Quando a molcula difusvel vem do sangue considerada um sinal endcrino. Se o sinal vem de clulas vizinhas difundindo-se de uma para outra chamado parcrino. JAK-STA A via JAK-STAT No Captulo 2 discutimos um conjunto de fatores de transcrio inativos at que um sinal de outra clula produz sua fosforilao. Esses fatores de transcrio so as protenas STAT (transdutores de sinais e ativadores de transcrio) (Ihle,1995, 1996). As STATs so fosforiladas pela forma ativa da uma famlia de quinases, a JAK. A via JAK-STAT muito importante na diferenciao de clulas sangneas e na ativao do gene de casena na produo de leite (Briscoe et al., 1994; Groner e Gouilleux, 1995). Nesses casos, um certo fator de diferenciao se liga a seus receptores membrana-abrangente, fazendo com que esse se dimerize (que forme dmeros) (Figura 3.32). Protenas JAK esto ligadas a cada um dos receptores (em suas respectivas regies citoplasmticas), e agora ao serem aproximadas fosforilam o receptor em vrios stios. Os receptores ativados tm agora sua prpria atividade quinsica e podem fosforilar certos STATs inativos, induzindo sua dimerizao. Os dmeros so a forma ativa dos STAT que so translocados para o ncleo onde se ligam s regies especficas do DNA.
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Figura 3.32
Receptores de prolactina
Prolactina
A via JAK-STAT nesse caso, a via de ativao do gene de casena por prolactina. O gene de casena ativado durante a ltima fase do desenvolvimento da glndula mamria (lactognica) e seu sinal a secreo de prolactina, um peptdeo de 9 aminocidos da glndula pituitria anterior. Prolactina causa a dimerizao dos receptores de prolactina nas clulas epiteliais do ducto mamrio. Uma protena JAK especfica (Jak2) est atrelada nesses receptores. Quando os receptores so dimerizados, as protenas JAK fosforilam umas as outras e os receptores vizinhos, ativando a quinase dormente desses receptores. Esses adicionam um grupo fosfato a um resduo de tirosina (Y) de uma protena STAT especfica (nesse caso Stat5). Isso permite que a protena se dimerize e seja translocada para o ncleo onde se liga a regies especficas de DNA. Em combinaes com outros fatores de transcrio (que presumivelmente esperavam sua chegada), a protena STAT ativa a transcrio do gene de casena. GR o glucocorticide receptor, OCT1 um fator de transcrio geral, e TBP o conjunto de protenas responsvel pela ligao de RNA polimerase. (Para detalhes, veja Groner e Gouilleux, 1995.)
Receptores dimerizados ativos
Extracelular
Citoplasma
Envoltrio nuclear
Ncleo
Inicio da transcrio
Promotor do gene de casena
-Ras RTK-R A via RTK-Ras A via de transduo de sinais RTK-Ras foi uma das primeiras vias a unir as vrias reas da biologia do desenvolvimento. Pesquisadores estudando olhos de Drosophila, vulvas de nematdeos e cnceres humanos chegaram concluso que estudavam o mesmo gene. A via RTK-Ras comea na superfcie celular, onde o receptor tirosina quinase liga seu ligante especfico. Ligantes que se ligam a RTKs incluem fatores de crescimento fibroblsticos, fatores de crescimento epidrmico e fatores de crescimento derivados de plaquetas. O receptor tirosina quinase abrange a membrana e, quando conectado com seu ligante, sofre uma mudana conformacional que permite sua dimerizao. Esses dmeros tm uma atividade quinsica latente, ativada por mudana conformacional fazendo com que os receptores se fosforilem um ao outro em resduos particulares de tirosina. Assim, a introduo de um ligante no receptor causa uma autofosforilao no domnio citoplasmtico do receptor. A tirosina fosforilada no receptor reconhecida por uma protena adaptiva (Figura 3.33)especificamente, as tirosinas fosforiladas so reconhecidas por uma poro da protena adaptativa chamada domnio SH2. As protenas adptativas servem como uma ponte que liga a quinase fosforilada do receptor a um poderoso sistema intracelular de sinalizao. Enquanto ligada ao receptor fosforilado pelo seu domnio SH2, a protena adaptativa usa seu domnio SH3 para regular o ativador de uma protena Ras G. Normalmente, a protena de tipo selvagem Ras est na sua forma inativa e ligante de GDP. Quando ativada pelo receptor ligante-acoplado, ela troca um fosfato de outro GTP para transformar o GDP ligado em GTP. Essa catlise ajudada pelo fator de troca guanina nucleotdeo. A Ras ligada a GTP a forma ativa da protena que transmite o sinal. Aps a transmisso, o GTP hidrolizado a GDP. Essa catlise muito estimulada
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Ligante Extracelular Citoplasma
Receptor
Figura 3.33
Ativao de eventos dependentes de clcio e PKC Fator de transcrio ativo Fator de transcrio inativo
A via RTK-Ras amplamente usada. O receptor tirosina quinase dimerizado pelo ligante. Isso causa a autofosforilao do receptor. A protena SH3 reconhece as fosfotirosinas e ativa as protenas intermedirias (GRB2 e SOS), as quais ativam a protena Ras G por permitir a fosforilao da poro GDP da Ras. Ao mesmo tempo, as protenas GAP estimulam a hidrlise dessa ligao fosfato. A Ras ativa capaz de ativar a protena quinase C (PKC), que ao seu turno fosforila uma srie de quinases. Por fim, a MAP quinase altera a expresso gnica, fosforilando certos fatores de transcrio (que podem penetrar no ncleo para mudar os tipos de genes transcritos) e certos fatores de traduo (que alteram o nvel de sntese de protenas). Em muitos casos, essa via reforada pela liberao de ons clcio.
Ncleo
Modulao da transcrio
pela complexao normal da protena Ras protena ativadora de GTP-ase (GAP). Essa protena de 120-kDa aumenta a atividade hidrolizante de GTP mais de 100 vezes, e retorna a Ras sua forma inativa (Trahey e McCormick, 1987; Gibbs et al., 1988). Realmente, mutaes no gene RAS esto relacionadas com uma grande proporo de tumores humanos (Shih e Weinberg, 1982), e as mutaes que tornam o gene oncognico inibem a ligao da protena GAP. Sem a protena GAP, a protena Ras no catalisa eficientemente a hidrlise de GTP permanecendo em sua configurao ativa (Cales et al., 1988; McCormick,1989). A protena Ras ativa associa-se com uma quinase chamada Raf. A protena Ras coloca a protena inativa Raf na membrana celular onde ela se torna ativa (Leevers et al.,1994; Stokoe et al., 1994). A protena Raf chamada MAP-quinase-quinase-quinase (MAPKKK). (MAP quer dizer protena associada mitose, mas atualmente considerada como um conjunto maior de fatores de transcrio). A MAPKKK fosforila a MAPKK que, por sua vez, pode fosforilar a MAP quinase. Essa ltima quinase fosforila os fatores de transcrio que especificam o destino da clula ou a proliferao. Em olhos de Drosophila, por exemplo, considera-se que a cascata ativa o fator de transcrio Sina (Sevenless-in-Absentia), cuja presena necessria para a diferenciao do fotorreceptor 7 (Carthew e Rubin, 1990; Dickson et al., 1992). Como veremos mais tarde neste livro, essa via crtica em numerosos processos desenvolvimentais. Em humanos, mutaes nessa via do origem s formas mais comuns de nanismo, incluindo acondroplasia, que ocorre em 1 entre 50.000 nascimentos. Aqui, o trax e a cabea crescem normalmente, mas os braos e as pernas so encurtados proximalmente. A deficincia reside na proliferao mnima da cartilagem da placa de crescimento dos ossos longos. A leso gentica parece estar no gene que
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codifica o receptor 3 do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR3) (Figura 9.19; Rousseau et al., 1994; Shiang et al., 1994). Esse gene expresso nas clulas da cartilagem em desenvolvimento na placa de crescimento dos ossos longos. Quando ativado por um FGF, o FGFR3 sinaliza o condrcito para parar de dividir e comear a diferenciao. As mutaes nesse gene causam um fentipo de ganho de funo onde o mutante FGFR3 ativo constitutivamente (isto , sem a necessidade de ser ativado por um FGF)* (Deng et al., 1996; Webster e Donoghue, 1996). [cell7.html]
* Nomes podem ser perigosamente ilusivos. Muitos compostos tm mais de uma funo na clula, e o que fazem depende do contexto da clula. Certos fatores de crescimento podem inibir o crescimento, e alguns fatores de transcrio podem ser utilizados para inibir a transcrio. Realmente, alguns fatores de transcrio podem ser usados para regular a traduo. Aqui vemos que molculas de adeso celular podem ser usadas para transduo de sinais. Protenas celulares no respeitam nossas fronteiras disciplinares.
&
(A) FGF
Especulaes
Mutaes negativas dominantes em receptores
significado funcional de uma molcula ligante pode ser verificado eliminando seu receptor. Uma maneira de fazer isso criando mutaes dominantes negativas de receptores. Esse tipo de experimento ser bem sucedido se a dimerizao for crtica para a funo do receptor. Os receptores FGF ativos, em um caso, so dmeros de duas molculas idnticas embebidas na membrana celular. O mutante dominante negativo no formar um dmero ativo, mesmo com um parceiro do tipo selvagem. Portanto, quando presente em concentraes suficientemente altas, o receptor mutante compete com receptores FGF normais impedindo que suas protenas sejam ativadas. Isso pode ocorrer em mutaes naturais ou provocadas. Amaya e colaboradores (1991) injetaram mRNA de uma forma mutante de um receptor FGF em embries de duas clulas de Xenopus. Essas blstulas no conseguem responder ao FGF (Figura 3.34). Nesse experimento, embries que no tinham receptores FGF funcionais tinham mesoderma posterior e lateral dramaticamente reduzido (Prancha 3).
FGFR normal: FGF se liga causando dimerizao do receptor de FGF
(B)
FGFR dominante negativo
Receptor de FGF
FGFR normal
FGFR mutante
Domnio da tirosina quinase
Sinal
Receptores sem domnios intracelulares so inativos Sem sinal
Excesso do receptor mutante pode seqestrar o receptor normal do fator de crescimento. Esse heterodmero inativo. Sem sinal
Figura 3.34
Ensaio para receptor dominante negativo para a importncia de um determinado receptor. O receptor de FGF (FGFR) uma RTK transmembrana. (A) Quando dmeros de FGF se ligam poro extracelular desses receptores, esses se dimerizam e seus dois domnios de protena quinase se fosforilam mutuamente. Quando fosforilados, acionam um sinal atravs do citoplasma. (B) O receptor dominante negativo no tem o domnio da protena quinase. Quando liga FGF, produz um dmero inativo, mesmo se o outro parceiro do tipo selvagem. Assim, o efeito de FGF no transmitido clula.
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A via do inositol fosfato Algumas vezes, a transduo de um sinal da superfcie celular causa tantas mudanas, que alteraes na expresso do gene constituem somente um pequeno subconjunto do que faz o sinal. A ativao da via do inositol fosfato promove mudanas drsticas na fisiologia da clula pela liberao de ons clcio do retculo endoplasmtico. Essa via extremamente importante na ativao do espermatozide e do vulo, ambos necessitando de um aumento na concentrao intracelular de ons clcio.
Figura 3.35
(A) Extracelular Fosfolipase C
Citoplasma
A via do inositol fosfato. (A) A reao de fosfolipase C, transformando PIP2 em DAG e IP3. (B) Essa reao pode ser iniciada em dois pontos principais na membrana celular. Primeiro, a via iniciada quando o receptor transmembrana ligado protena G ativado pela introduo do ligante. Essa ativao resulta na ligao de GTP protena heteromrica G e sua dissociao em subunidades ativas. Essas subunidades ativam enzimas fosfolipase C (PLC) que podem catalizar a formao de DAG e IP3. Em segundo lugar, a via pode ser ativada pela via RTK. IP3 pode se ligar a um receptor para liberar ons clcio do retculo endoplasmtico. Neste nterim, DAG (em presena dos ons clcio liberados) ativa a protena quinase C. A protena quinase estimula o transportador sdio/hidrognio a trocar ons hidrognio celulares por ons sdio extracelulares, assim levando a um aumento do pH.
(B) RECEPTORES LIGADOS PROTENA G RECEPTORES LIGADOS TIROSINA QUINASE (PDGF, EGF, etc). Ligante Ligante Extracelular
Citoplasma
Protena G
Via IP 3 PATHWAY PKC Atividade celular e mitognese MAP quinase
Receptor IP 3
Retculo endoplasmtico
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A via pode ter dois pontos iniciais (Figura 3.35; Berridge, 1993; Shilling et al., 1994). Um ponto de iniciao o receptor tirosina quinase, mencionado anteriormente. Alm de ativar a protena Ras G, as tirosina quinases ativadas podem interagir com um tipo de enzima, fosfolipase C (PLC1-y1, que tambm tem um domnio SH2 que reconhece as tirosinas autofosforiladas). Fosfolipase C pode catalisar a hidrlise de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) em dois segundos mensageiros: inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). IP3 capaz de abrir canais de clcio do retculo endoplasmtico, liberando uma grande quantidade de ons clcio no citoplasma. DAG ativa a protena quinase C, que por sua vez ativa a bomba de protena que troca ons sdio por ons hidrognio (Swann e Whitaker, 1986; Nishizuka, 1986). O resultado a elevao de ons intracelulares de clcio e um aumento no pH intracelular. Um segundo ponto de iniciao outra classe de receptores, algumas vezes chamado de receptores serpentina, porque tm sete domnios transmembrana e serpenteiam atravs da membrana. Esses receptores esto relacionados com outro tipo de protena G, a protena G heteromrica. Quando o ligante liga-se ao seu receptor, esse ativa a protena G. Essa ativao dissocia a protena G em suas subunidades, as quais ativam outro conjunto de fosfolipase C, ou seja, PLC-1 e PLC-2. Esses dois tipos de fosfolipase C podem clivar PIP2 em inositol 1,4,5-trifosfato e diacilglicerol. Como veremos em captulos posteriores, as mudanas nos ons hidrognio e clcio, efetuadas por essa via, alteram no somente a transcrio de genes, mas tambm a traduo de mRNA e a replicao de DNA. Cruzamentos entre vias Representamos as vias principais como se fossem cadeias lineares, onde a informao flui em condutes nicos. Na verdade, essas vias so apenas as principais estradas pelas quais se escoa a informao, pois entre elas existem ruas e avenidas que fazem as conexes entre elas. (Essa pode ser a razo da existncia de tantos passos entre a superfcie da clula e o ncleo. Cada passo um ponto de regulao em potencial e um potencial ponto de interseo). Essa comunicao cruzada pode ser vista na Figura 3.35, onde duas vias reforam uma a outra. Deve-se lembrar tambm que a clula tem numerosos receptores e est constantemente recebendo muitos sinais simultaneamente. Em alguns casos, a transcrio de genes requer dois sinais. Isso visto durante o desenvolvimento de linfcitos, onde dois sinais so necessrios, cada um produzindo um dos dois peptdeos de um fator de transcrio envolvido na produo de interleucina 2 (IL-2, tambm conhecida como fator de crescimento da clula T). Um fator, c-Fos, produzido pela ligao do receptor da clula T ao antgeno (Figura 3.36). Isso ativa a cascata Ras, criando um fator de transcrio, Elk-1, ativador do gene c-fos que sintetiza c-Fos. O segundo sinal vem da glicoprotena B7 na superfcie da clula que apresenta o antgeno. Esse sinal ativa uma segunda cascata de quinases, finalmente produzindo c-Jun. Os dois peptdeos, c-Fos e c-Jun, podem produzir a protena AP-1, um fator de transcrio que se liga ao intensificador de IL-2 e ativa sua expresso (Liet al., 1996). A matriz extracelular e a superfcie da clula como fontes de sinais crticos para o desenvolvimento Bissell e colegas (1982; Martins-Green e Bissell, 1995) propuseram que a matriz extracelular capaz de induzir expresso gnica especfica em tecidos em desenvolvimento, especialmente aqueles do fgado e da glndula mamria, onde a induo de fatores de transcrio especficos dependem da ligao clula-substrato (Liu et al., 1991; Streuli et al., 1991; Notenboom et al.1996). Muitas vezes, a presena de integrina ligada previne a ativao de genes que especificam a morte celular (Brooks et al., 1994; Montgomery et al., 1994). Portanto, a matriz extracelular uma fonte importante de sinais que podem ser transduzidos para o ncleo para dar expresso gnica especfica. Estudos recentes mostraram que a ligao de integrinas matriz extracelular
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CLULA APRESENTADORA DO ANTGENO
SINAL 1 Citoplasma
SINAL 2
MHC II Antgeno Receptor da clula T B7 CD28
Extracelular
Citoplasma RAF
T-LINFCITO
ELK-1 ativa transcrio de c-fos Intensificador de interleucina 2 Fator de transcrio AP-1
Ncleo Transcrio de IL-2
Figura 3.36
Dois sinais so necessrios para efetuar a diferenciao de linfcitos T. O primeiro sinal vem de receptores que ligam o antgeno apresentado na superfcie das clulas B ou macrfagos. O segundo sinal vem da ligao da protena CD28 protena B7 que est na superfcie da clula apresentante do antgeno. O primeiro sinal dirige a sntese de uma subunidade do fator de transcrio AP-1. A outra subunidade sintetizada sob direo do segundo sinal. As duas subunidades, c-fos e c-jun, formam o fator de transcrio AP-1 que pode ativar intensificadores especficos para a clula T como os que regulam a produo de interleucina 2.
pode estimular a via RTK-Ras, como tambm pode estimular a interao da clula com o L1, N-CAM e caderinas de uma clula vizinha (Bixby et al., 1994; Williams et al., 1994a; Clark e Brugge, 1995). Caderinas (mesmo as solveis) podem dimerizar receptores FGF exatamente como os ligantes normais de FGF, causando a liberao de ons clcio, ativao transcricional e fenmenos de desenvolvimento caractersticos das respostas do FGF celular (Figura 3.37; Williams et al., 1994b; Doherty et al., 1995). Comunicao cruzada quase certa acontecer quando as molculas de adeso celular so tambm transdutores de sinais. Interaes recprocas na superfcie celular Quando duas clulas interagem durante o desenvolvimento, ambas so modificadas na maioria das vezes. Essa induo recproca mediada por interaes na membrana
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Citoplasma
Molcula de adeso celular
Receptor FGF
Extracelular
Citoplasma
Sinal
Figura 3.37
Possveis interaes de molculas de adeso celular com receptores de FGF. Os receptores FGF podem ser seqestrados pelas molculas de adeso e colocados juntos. Isso pode ser feito pela interao de molculas de adeso opostas, ou ligaes cruzadas de receptores de FGF das membranas celulares opostas podem ativar seus domnios quinase.
celular. Uma via intensamente usada o sistema Wingless-Hedgehog. Nessa via, duas clulas (ou grupo de clulas) so adjacentes; uma delas produz a protena Hedgehog e a secreta. O peptdeo age na clula vizinha ocasionando a produo da protena Wingless (Wnt). A protena Wingless, por sua vez, tambm secretada e se liga clula vizinha, estimulando-a a continuar a sntese de Hedgehog. O resultado a estabilizao de uma borda onde o tecido em um lado secreta protena Hedgehog, enquanto o tecido no outro lado produz Wingless. Essa borda crtica na produo de segmentos e apndices em Drosophila, como tambm, subdivises cerebrais e membros em mamferos (Figura 3.38; Ingham, 1994; Niswander et al., 1994; Wilder e Perrimon, 1995). [cell8.html] A superfcie celular um lugar extremamente importante para interaes desenvolvimentais. Essas incluem adeso diferencial de uma clula a outras, a adeso diferencial de um tipo de clula a uma matriz extracelular e a comunicao de sinais para a diferenciao e diviso celulares. Em 1782, o ensaista francs Denis Diderot ps a questo da morfognese no sonho febril de um fsico. Esse elemento podia imaginar que o corpo era formado por uma mirade de pequenos corpos sensveis que se juntavam para formar um agregado, mas ele no podia imaginar como esse agregado poderia se tornar um animal. Estudos recentes mostraram que essa ordenao devida s molculas na superfcie dessas clulas. Em captulos subseqentes, veremos com mais detalhes essas interaes morfogenticas. Estamos agora no estgio onde podemos iniciar o estudo da embriognese precoce e ver a integrao entre os processos orgnicos, genticos e celulares no desenvolvimento animal.
115
Receptor Frizzled
Wingless / protena Wnt
Protena DPP
Figura 3.38
Prot. Dishevelled Quinase Zw3 Prot. Armadillo (-catenina)
wingless patched decapentaplegic
engrailed hedgehog Protena engrailed
Protena Smoothened
Ci ativo Ci inativo Protena G
Interaes recprocas entre clulas na via wingless-hedgehog em Drosophila. A protena Wingless secretada por uma clula e se difunde a uma curta distncia. A clula vizinha liga a protena Wingless originando a ativao da protena, que bloqueia a ao inibidora da quinase Zeste-white-3 sobre a protena Armadillo (uma catenina). A protena Armadillo ativada induz a clula a transcrever o gene hedgehog (hh). Essa protena secretada e ligada pela clula vizinha. Ligando a protena Hedgehog faz com que a clula transcreva o gene wingless e secrete a protena.
Receptor Patched Protena Hedgehog
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Padres de Desenvolvimento
4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo 5 Clivagem: Criando multicelularidade 121 167 209
II
253 341
6 Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias
7 Incio do desenvolvimento vertebrado: Neurulao e ectoderma 8 Especificidade axnica 307
9 Incio do desenvolvimento vertebrado: Mesoderma e endoderma
CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo
121
Fertilizao: Iniciando um novo organismo
Desejo e desejo e desejo Sempre o desejo procriativo do mundo. Saindo da obscuridade iguais opostos avanam, Sempre substncia e aumento, sempre sexo, Sempre uma tessitura de identidade, sempre distino, Sempre uma criao de vida.
WALT WHITMAN (1855)
ERTILIZAO (FECUNDAO) o processo pelo qual duas clulas sexuais
O objetivo final de todas as intrigas amorosas, sejam elas cmicas ou trgicas, na realidade mais importante que todas as outras finalidades na vida humana. Ele se volta para nada menos que a composio da prxima gerao.
A SCHOPENHAUER (CITADO POR C. DARWIN, 1871)
(gametas) se fundem para criar um novo indivduo com potenciais genticos derivados dos dois genitores. A fecundao, portanto, realiza duas atividades separadas: sexo (a combinao de genes derivados dos dois pais) e a reproduo (criao de novos organismos). Assim, a primeira funo da fecundao a de transmitir genes dos pais para a prole, e a segunda a de iniciar no citoplasma do ovo aquelas reaes que permitem o desenvolvimento. Embora os detalhes da fecundao variem de espcie para espcie, os eventos da concepo consistem, em geral, de quatro atividades principais: Contato e reconhecimento entre espermatozide e vulo. Na maioria dos casos, isso assegura que o espermatozide e o vulo sejam da mesma espcie. Regulao da entrada do espermatozide para o interior do vulo. Somente um espermatozide pode, em ltima anlise, fecundar um vulo. Isso geralmente conseguido com a permisso de somente um espermatozide entrar no vulo e a inibio da entrada de qualquer outro. Fuso do material gentico do espermatozide e do vulo. Ativao do metabolismo do ovo para comear o desenvolvimento.
Estrutura dos gametas

Existe um dilogo complexo entre vulo e espermatozide. O vulo ativa o metabolismo do espermatozide que essencial para a fecundao, e o espermatozide retorna a mensagem ativando o metabolismo do vulo necessrio para o incio do desenvolvimento. Porm, antes de investigar esses aspectos da fecundao, temos que considerar as estruturas do espermatozide e do vulo dois tipos de clulas especializadas para a fertilizao. Espermatozide Foi somente no sculo XIX que o papel do espermatozide na fertilizao tornou-se conhecido. Anton van Leeuwenhoek, o microbiologista holands que co-descobriu o espermatozide em 1678, acreditou inicialmente que ele continha animais parasitas vivendo em seu interior (da o termo espermatozides, significando animais do esperma). Assumiu originalmente que esses nada tinham a haver com a reproduo do organismo onde se encontravam, porm, posteriormente chegou a acreditar que cada espermatozide continha um embrio pr-formado. Leeuwenhoek (1685) escreveu que 121
122
Figura 4.1
A criana humana pr-formada no espermatozide, conforme representada por Nicolas Hartsoeker (1964).
espermatozides eram sementes (tanto sperma como smen significam semente), e que a fmea meramente proporcionava o solo nutriente no qual as sementes eram plantadas. Sob esse aspecto, ele estava voltando a uma noo da procriao enunciada por Aristteles 2000 anos antes. Por mais que tentasse, Leeuwenhoek era continuamente desapontado em suas tentativas de achar um embrio pr-formado nos espermatozides. Nicolas Hartsoeker, o outro co-descobridor do espermatozide, desenhou uma figura do que pretendia encontrar: um ser humano pr-formado (homnculo) dentro do espermatozide (Figura 4.1). Essa crena de que o espermatozide continha um organismo embrionrio inteiro, nunca recebeu muita aceitao, porque implicava num enorme desperdcio de vida em potencial. A maioria dos investigadores consideravam o espermatozide como sem importncia (Veja Pinto-Correia, 1997, para detalhes sobre essa extraordinria histria). [fert1.html] A primeira evidncia sugerindo a importncia do espermatozide na reproduo veio de uma srie de experimentos realizados por Lazzaro Spallannzani em fins de 1700. Spallanzani demonstrou que smen filtrado de r, livre de espermatozide, no fecundava vulos. Concluiu, porm, que o fluido viscoso retido pelo papel de filtro, e no o espermatozide, era o agente da fertilizao. Ele acreditava, tambm, que os animais espermticos eram parasitas. A combinao das melhores lentes de microscpio e da teoria celular, levaram a uma reapreciao da funo espermtica. Em 1924, J. L. Prevost e J. B. Dumas afirmaram que os espermatozides no eram parasitas, mas sim os agentes ativos da fertilizao. Notaram a existncia universal de espermatozides em machos sexualmente maduros e sua ausncia em indivduos imaturos ou idosos. Essas observaes, acopladas conhecida ausncia de espermatozides na mula estril, os convenceram que existe uma ntima relao entre sua presena nos rgos e a capacidade fecundadora do animal. Eles propuseram que o espermatozide penetra o vulo e contribui materialmente para a gerao seguinte. Essas assertivas no foram em geral levadas em considerao at a dcada de 1840, quando A. von Kolliker descreveu a formao do espermatozide a partir de clulas contidas em testculos adultos. Kolliker ridicularizou a idia que o smen poderia ser normal e ainda assim tolerar a presena de um nmero enorme de parasitas. Mas ainda assim, negou que haveria qualquer contato fsico entre espermatozide e vulo. Acreditava que o espermatozide excitava o desenvolvimento do vulo de maneira semelhante aquela pela qual o m comunica sua presena ao ferro. Somente em 1876, Oscar Hertwig e Hermann Fol, independentemente, demonstraram a entrada do espermatozide no vulo e a unio de seus ncleos. Hertwig procurou um organismo adequado para observaes microscpicas detalhadas e descobriu que o ourio-do-mar Mediterrneo, Toxopneustes lividus, era perfeito para isso. No somente era freqente na regio e sexualmente maduro a maior parte do ano, como seus vulos eram abundantes e transparentes, mesmo sob alto aumento. Aps misturar espermatozide e vulo em suspenses, Hertwig repetidas vezes observou o espermatozide entrando no vulo e viu a unio dos ncleos dessas clulas. Notou tambm que apenas um espermatozide era visto penetrar em cada vulo e que todos os ncleos do embrio derivavam dos ncleos fundidos por ocasio da fertilizao. Fol fez observaes semelhantes e detalhou o mecanismo de penetrao do espermatozide. A fertilizao estava finalmente reconhecida como a unio de espermatozide e vulo, e a unio dos gametas do ourio-do-mar permanece como um dos exemplos de fertilizao melhor estudado. [fert2.html] Cada espermatozide consiste de um ncleo haplide, um sistema de propulso para movimentar o ncleo, e um saco de enzimas que permitem a entrada do ncleo no vulo. A maior parte do citoplasma do espermatozide eliminada durante o amadurecimento, deixando somente certas organelas modificadas para exercer a funo espermtica (Figura 4.2). Durante o transcorrer do amadurecimento, o ncleo haplide se torna muito aerodinmico e seu DNA altamente comprimido. Na parte frontal desse ncleo haplide comprimido est a vescula acrossmica, derivada do aparelho de Golgi, contendo enzimas que digerem protenas e acares complexos; por isso, pode
123
ser considerado como uma vescula secretria modificada. Essas enzimas armazenadas so usadas para lisar os invlucros externos do vulo. Em muitas espcies, tais como os ourios-do-mar, existe uma regio de molculas globulares de actina entre o ncleo e a vescula acrossmica. Essas protenas so usadas para estender um processo de forma semelhante a um dedo durante os estgios precoces da fertilizao. Em ourios-do-mar e vrias outras espcies, o reconhecimento mtuo entre espermatozide e vulo envolve molculas desse processo acrossmico. Juntos, o acrossomo e o ncleo constituem a cabea do espermatozide. Os meios pelos quais o espermatozide impulsionado variam de acordo com o modo pelo qual a espcie se adaptou s condies ambientais. Em algumas espcies (como o nematelminto parasitrio Ascaris), o espermatozide viaja por movimentao amebide de extenses lamelipodiais da membrana celular. Na maioria das espcies, porm, um espermatozide capaz de viajar por longas distncias agitando o seu flagelo. Os flagelos so estruturas complexas. A sua principal poro motora chamada axonema. Um axonema formado pelos microtbulos que emanam do centrolo na base do ncleo do espermatozide (Figuras 4.2 e 4.3). O centro do axonema consiste de dois tbulos centrais rodeados por uma fileira de nove duplas de microtbulos. Realmente, s um microtbulo est completo, contendo 13 protofilamentos; o outro tem forma de C e tem apenas 11 protofilamentos (Figura 4.3B). Um modelo tridimensional de um microtbulo completo est apresentado na Figura 4.3C. Aqui vemos os 13 protofilamentos interligados; os quais consistem exclusivamente da protena dimrica, a tubulina. Embora a tubulina seja a base da estrutura do flagelo, outras protenas tambm so crticas para a funo do flagelo. A fora para a propulso do espermatozide proporcionada pela dinena, uma protena apensa aos microtbulos (Figura 4.3B). A dinena hidrolisa molculas de ATP e pode converter a energia qumica liberada em
Golgi remanescente
Centrolo Flagelo Centrolo Flagelo Vescula acrossmica e grnulo Ncleo Mitocndrias Cauda Microtbulos Poro final
Aparelho de Golgi Mitocndrias
Figura 4.2
Axonema Mitocndrias Centrolo Ncleo Membrana plasmtica Vescula acrossmica Poro mediana Pescoo Cabea do espermatozide
A modificao de uma clula germinativa para formar um espermatozide de mamfero. O centrolo produz um longo flagelo na parte que vir a ser a extremidade posterior do espermatozide, e o aparelho de Golgi forma a vescula acrossmica na futura extremidade anterior. As mitocndrias (pontos abertos) agrupam-se ao redor do flagelo perto da base do ncleo haplide e so incorporadas na parte mediana do espermatozide. O citoplasma remanescente descartado e o ncleo se condensa. O tamanho do espermatozide maduro foi aumentado em relao s outras figuras. (Segundo Clermont e Leblond, 1955.)
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Figura 4.3 O aparelho de movimentao do espermatozide. (A) Seo transversal do flagelo de um espermatozide mamfero, mostrando o axonema central e as fibras externas. (B) Diagrama interpretativo do axonema, mostrando o arranjo 9 + 2 dos microtbulos e outros componentes flagelares. O diagrama esquemtico mostra a associao de protofilamentos de tubulina em um microtbulo duplo. A primeira (A) poro do par duplo um microtbulo normal compreendendo 13 protofilamentos. A segunda (B) poro da dupla contm somente 11 (ocasionalmente 10) protofilamentos. (C) Um modelo tridimensional do microtbulo A. As subunidades -tubulina e -tubulina so semelhantes, porm, no idnticas, e o microtbulo pode mudar de tamanho polimerizando e despolimerizando subunidades de tubulina em qualquer um dos lados. (A cortesia de D. M. Phillips; B segundo De Robertis et al., 1975, e Tilney et al., 1973; C de Amos e Klug, 1974, cortesia dos autores.)
(A)
(C)
(B) Membrana plasmtica Trave radial Cabea da trave Nexina Subfibra A Subfibra B Microtbulo central MICROTBULO DUPLO
Brao interno de dinena Brao externo de dinena AXONEMA
energia mecnica que propulsiona o espermatozide. Essa energia pemite o deslizamento ativo das duplas externas de microtbulos, levando o flagelo a se curvar (Ogawa et al., 1977; Asai, 1996). A importncia da dinena pode ser avaliada em indivduos com a sndrome gentica chamada de trade de Kartagener. Esses indivduos no tm dinena em suas clulas ciliadas e flageladas, o que as torna estruturas imveis. Machos com essa doena so estreis (espermatozide imvel), susceptveis infees brnquicas (clios respiratrios imveis), e tm 50 porcento de probabilidade de ter o corao do lado direito de seu corpo (Afzelius, 1976). Outra importante protena flagelar parece ser a histona H1. Essa protena geralmente vista dentro do ncleo, onde dobra e aperta a cromatina em agregados. No entanto, Multigner e colaboradores (1992), mostraram que essa mesma protena estabiliza os microtbulos flagelados impedindo seu espalhamento. O arranjo 9 + 2 dos microtbulos com os braos de dinena foi conservado nos axonemas em todo o reino eucarioto, sugerindo que extremamente adequado na transmisso de energia para a movimentao. A energia para mover o flagelo e assim impulsionar o espermatozide vem dos anis de mitocndrias localizadas na regio do pescoo do espermatozide (veja Figura 4.2). Em muitas espcies (notavelmente mamferos) uma densa camada de fibras se interps entre a bainha mitocondrial e o axonema. Essa camada fibrosa enrijece a cauda do espermatozide. Como sua espessura diminui na direo apical, as fibras provavelmente previnem que a cabea
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do espermatozide balance abruptamente. Assim, o espermatozide sofreu extensa modificao para assegurar a passagem de seu ncleo para o vulo. Entretanto, a diferenciao do espermatozide no se completa nos testculos. Aps sua expulso para a luz dos tbulos seminferos, os espermatozides so armazenados no epiddimo, onde adquirem a capacidade de se mover. Essa mobilidade conseguida atravs de mudanas no sistema gerador de ATP (possivelmente atravs da modificao da dinena), assim como de alteraes da membrana plasmtica que permitem que ela se torne mais fluida (Yanagimachi, 1994). Os espermatozides liberados durante a ejaculao podem se mover, mas ainda no tm a capacidade de se ligar ao vulo e fertiliz-lo. Esses estgios finais do amadurecimento espermtico (chamado capacitao) no ocorrem antes do espermatozide ter permanecido no interior do trato reprodutivo feminino durante um certo tempo. O vulo Todo o material necessrio para o comeo do crescimento e desenvolvimento tem que estar armazenado no vulo maduro. Enquanto o espermatozide eliminou a maior parte do seu citoplasma, o vulo em desenvolvimento (chamado de ocito antes de tornar-se haplide) no somente conserva seu material, mas continua a acumul-lo ativamente. Sintetiza ou absorve protenas, como a gema, que atuam como reservatrios de alimento para o embrio em desenvolvimento. Assim, gametas femininos das aves so enormes clulas singulares que se tornaram entumecidas pela acumulao de gema. Mesmo vulos com gema relativamente esparsa so comparativamente grandes. O volume do vulo do ourio-do-mar de aproximadamente 2 x 10-4 m3, mais de 10.000 vezes aquele do espermatozide. A representao do vulo do ourio-do-mar e do espermatozide na Figura 4.4 mostra seus tamanhos relativos, assim como os vrios componentes do vulo maduro. Assim, enquanto o espermatozide e o vulo tm componentes nucleares haplides iguais, o vulo tem ainda um notvel reservatrio citoplasmtico acumulado durante seu amadurecimento. Esse armazm citoplasmtico inclui protenas, RNAs, substncias qumicas protetoras e fatores morfogenticos:* Protenas. Ser longo o perodo a transcorrer antes do embrio ser capaz de se alimentar ou obter alimento de sua me. As clulas embrionrias precoces precisam de um certo suprimento armazenvel de energia e aminocidos. Em muitas espcies isso conseguido pelo acmulo de protenas na gema do ovo. Muitas protenas da gema so sintetizadas em outros rgos (fgado, corpo gorduroso) e viajam atravs do sangue materno para o ovo. Ribossomos e tRNA. O embrio precoce precisa produzir muitas de suas prprias protenas; em algumas espcies, ocorre um surto de sntese protica pouco aps a fecundao. A sntese protica conseguida pelos ribossomos e tRNA, preexistentes no vulo. O vulo em desenvolvimento tem mecanismos especiais para sintetizar ribossomos, e certos ocitos de anfbios produzem at 1012 ribossomos durante a prfase meitica. RNA mensageiro. Na maioria dos organismos, as mensagens para protenas sintetizadas durante o desenvolvimento inicial j esto acondicionadas no ocito. Estima-se que os vulos do ourio-do-mar contm de 25.000 a 50.000 tipos diferentes de mRNA. Porm, esse mRNA permanece dormente at aps a fertilizao (veja Captulo 12). Fatores morfogenticos. Essas molculas dirigem a diferenciao celular em certos tipos de clulas. Parecem estar localizadas em diferentes regies do vulo e se segregam em clulas diferentes durante a clivagem (veja Captulo 13).
* Os contedos do vulo variam muito de espcie para espcie. A sntese e a colocao desses materiais ser tratada no Captulo 22, quando discutirmos a diferenciao das clulas germinativas.
126
Figura 4.4
Estrutura do vulo do ourio-do-mar durante a fertilizao. (Segundo Epel, 1977.)
Envoltrio vitelnico Camada gelatinosa Espermatozide
Membrana plasmtica Grnulo de gema Grnulo cortical
Mitocndria
Ncleo
Substncias qumicas protetoras. O embrio no pode fugir de predadores ou movimentar-se para um ambiente mais seguro, necessitando, por isso, estar equipado para enfrentar esses fatores. Muitos vulos contm filtros ultravioleta e enzimas de reparos de DNA que os protegem da luz solar; alguns vulos contm molculas que predadores potenciais acham desagradveis; a gema de vulos de aves contm at mesmo anticorpos. [fert3.html] Dentro desse enorme volume de citoplasma reside um grande ncleo. Em algumas espcies (por exemplo, ourios-do-mar), o ncleo j haplide no momento da fertilizao. Em outras espcies (incluindo muitos vermes e a maioria dos mamferos), o ncleo do vulo ainda diplide, e o espermatozide penetra antes das divises meiticas estarem completas. O estgio do ncleo do vulo no momento da entrada do espermatozide est ilustrado na Figura 4.5. Envolvendo o citoplasma est a membrana plasmtica do vulo. Essa membrana deve regular o fluxo de certos ons durante a fertilizao e deve ser capaz de se fundir com a membrana plasmtica do espermatozide. Acima da membrana plasmtica est o envoltrio vitelnico (Figura 4.6). O componente principal desse envoltrio forma uma esteira fibrosa sobre o vulo. Essa esteira suplementada por extenses de glicoprotenas da membrana plasmtica e pontes proteinceas vitelnicas que aderem a esteira membrana (Mozingo e Chandler, 1991). O envoltrio vitelnico essencial para a ligao espcie-especfica do espermatozide. Nos mamferos, o envoltrio vitelnico uma matriz extracelular separada e grossa chamada zona pelcida. O vulo do mamfero tambm rodeado por uma camada de clulas, as clulas do cumulus (Figura 4.7). A camada cumular representa clulas foliculares ovarianas que estavam alimentando o vulo quando da sua liberao do ovrio. O espermatozide dos mamferos tem que passar por essas clulas para fertilizar o vulo*. Imediatamente abaixo da membrana plasmtica do vulo est uma fina casca (de aproximadamente 5m) de um citoplasma gel-smile chamado de crtex. O citoplasma nessa regio mais duro que o citoplasma interno e contm altas concentraes de molculas globulares de actina. Durante a fertilizao, essas molculas polimerizam-se
*Em mamferos, as coberturas extracelulares do vulo esto divididas em duas regies: A zona pelcida e o cumulus. O termo corona radiata refere-se quelas clulas foliculares imediatamente adjacentes zona pelcida; so as clulas mais internas do cumulus.
127
Vescula germinal
Corpos polares
Proncleo feminino
Ocito primrio jovem Os vermes aneldeos Dinophilus e Sacocirrrus O verme poliqueta Histriobdella O platelminto Otomesostoma O onicforo Peripatopsis
Ocito primrio totalmente crescido O nematelminto Ascaris O mesozorio Dicyema A esponja Grantia O verme poliqueta Myzostoma O verme concha Nereis O molusco Spisula O verme equiuride Urechis Ces e raposas
Primeira metfase
Segunda metfase
Meiose completa
O verme nemerteano Cerebratulus O verme poliqueta Chaetopterus O molusco Dentalium O verme central Pectinaria Muitos insetos Estrela-do-mar
O anfioxo Branchiostoma Anfbios Mamferos (maioria) Peixes
Cnidrios (e.g., anmonas) Ourios-do-mar
Figura 4.5
para formar longos fios de actina conhecidos como microfilamentos. Microfilamentos so necessrios para a diviso celular, e so tambm usados para estender a superfcie do vulo para o interior das microvilosidades, que ajudam a entrada do espermatozide para dentro da clula (veja Figura 4.6; veja tambm a Figura 4.19). Ainda, dentro desse crtex esto os grnulos corticais (veja Figuras 4.4 e 4.6). Essas estruturas
Estgios de maturao do vulo no momento da entrada do espermatozide em diferentes animais. (Segundo Austin, 1965.)
Microvilosidades
Envoltrio vitelnico
(A)
(B)
Grnulo cortical
Figura 4.6
A superfcie do vulo do ourio-do-mar. (A) Micrografia eletrnica de varredura de um vulo antes da fertilizao. A membrana plasmtica est exposta onde o envoltrio vitelnico foi retirado. (B) Microfotografia eletrnica de transmisso de um ovo no-fertilizado, mostrando microvilosidades e a membrana plasmtica, que esto estreitamente cobertas pelo envoltrio vitelnico. Um grnulo cortical aparece diretamente abaixo da membrana plasmtica do vulo. (de Schroeder, 1979, cortesisa de T. E. Schroeder.)
128
Cumulus
vulo
Zona pelcida
(A)
(B)
Figura 4.7
vulos de hamster imediatamente antes da fecundao. (A) O ovo do hamster, ou vulo, est encaixado na zona pelcida. Essa, por sua vez, est envolvida por clulas do cumulus. Uma clula do corpo polar, produzida durante a meiose, tambm est dentro da zona pelcida. (B) Em menor aumento, um ocito de camundongo mostrado em relao ao cumulus. Partculas de carbono coloidal (tinta Nanquim) so excludas pela matriz de hialuronidase. (Cortesia de R. Yanagimachi.)
ligadas membrana so homlogas vescula acrossmica do espermatozide, sendo organelas derivadas do Golgi contendo enzimas proteolticas. No entanto, enquanto cada espermatozide contm uma vescula acrossmica, cada vulo do ourio-do-mar contm aproximadamente 15.000 grnulos corticais. Alm das enzimas digestivas, os grnulos corticais tambm contm mucopolissacardeos, glicoprotenas adesivas e protena hialina. As enzimas e os mucopolissacardeos atuam na preveno da entrada de outros espermatozides no vulo aps a entrada do primeiro, e as protenas hialinas e adesivas envolvem o embrio precoce providenciando apoio aos blastmeros do estgio de clivagem. Muitos tipos de vulos tm uma gelia no exterior do seu envoltrio vitelnico (Figura 4.4). Essa rede de glicoprotenas pode ter numerosas funes, mas principalmente usada para atrair ou ativar o espermatozide. O vulo, portanto, uma clula especializada para receber o espermatozide iniciando o desenvolvimento.
Reconhecimento do vulo e do espermatozide: Ao distncia

Muitos organismos marinhos liberam seus gametas para o ambiente. Esse ambiente pode ser to pequeno quanto uma poa de mar ou to grande como o oceano. Alm disso, esse ambiente compartilhado com outras espcies que podem liberar suas clulas sexuais no mesmo perodo. Esses organismos enfrentam dois problemas: 1) Como podem espermatozides e vulos se encontrarem quando em concentraes to diludas, e 2) que mecanismo inibe o espermatozide da estrelado-mar tentar fertilizar os vulos do ourio-do-mar? Dois mecanismos principais evoluram para resolver essas dificuldades: atrao e ativao espcie-especfica do espermatozide. Atrao do Espermatozide A atrao espcie-especfica do espermatozide (um tipo de quimiotaxia) foi documentada em numerosas espcies, incluindo cnidrios, moluscos, equinodermos e urocordados (Miller, 1985; Yoshida et al., 1993). Em 1978, Miller demonstrou que os vulos do cnidrio Orthopyxis caliculata no somente secretam um fator quimiottico mas tambm regulam o perodo de sua liberao. Ocitos em desenvolvimento, em
129
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 4.8
vrios estgios de amadurecimento, foram fixados sobre lminas microscpicas, e espermatozides foram adicionados a uma certa distncia dos vulos. Miller encontrou que quando o espermatozide era adicionado a ocitos que ainda no haviam completado sua segunda diviso meitica, no havia atrao de espermatozide pelos vulos. Porm, aps o trmino da segunda diviso meitica e os vulos estarem prontos para ser fertilizados, o espermatozide migrava em sua direo. Assim, esses ocitos no controlam somente o tipo de espermatozide que atraem, mas tambm o momento em que o atraem. Os mecanismos de quimiotaxia so diferentes em outras espcies (veja Metz, 1978; Ward e Kopf, 1993). Uma dessas molculas quimiotticas, um peptdio de 14 aminocidos chamado resact foi isolado da gelia do vulo do ourio-do-mar Arbacia punctulata (Ward et al., 1985). Resact difunde facilmente na gua do mar e tem um profundo efeito quando adicionado a uma suspenso de espermatozide de Arbacia, mesmo em concentrao muito baixa (Figura 4.8). Quando uma gota de gua do mar, contendo espermatozide de Arbacia, colocada em uma lmina de microscpio, o espermatozide geralmente nada em crculos de aproximadamente 50 m de dimetro. Se uma quantidade mnima de resact for introduzida na gota, em segundos o esperma migra para a regio da injeo e ali se congrega. medida que o resact continua a difundir-se, mais espermatozide recrutado para dentro do crescente agrupamento. Resact especfico para A. punctulata e no atrai espermatozide de outras espcies. Espermatozide de A. punctulata liga resact a receptores na sua membrana celular (Ramarao e Garbers, 1985; Bentley et al., 1986) e pode nadar atravs de um gradiente crescente de concentrao desse composto at alcanar o vulo. Resact tambm age como um peptdio ativador de espermatozide. Esses peptdios (mais de 70 foram isolados de diferentes espcies de ourios-do-mar) causam aumentos dramticos e imediatos da motilidade espermtica e do consumo de oxignio (Hardy et al., 1994). O receptor para resact uma protena transmembrana. Quando ela liga o resact ao lado externo da clula, resact causa uma mudana conformacional que ativa a atividade de guanidil ciclase no lado citoplasmtico. Isso aumenta a concentrao de GMP cclico do vulo (Shimomura et al., 1986), que parece ativar a ATPase da dinena estimulando a agitao da cauda no espermatozide (Cook e Babcock, 1993). Ativao Espermtica: A Reao Acrossmica no Ourio-do-Mar Uma segunda interao entre espermatozide e vulo envolve a ativao do espermatozide pela gelia do vulo. Na maioria dos invertebrados marinhos, essa reao acrossmica tem dois componentes: a fuso da vescula acrossmica com a membrana plasmtica do espermatozide (uma exocitose que resulta na liberao dos componentes da vescula acrossmica) e a extenso do processo acrossmico (Figura 4.9; Colwin e Colwin, 1963). A reao acrossmica pode ser iniciada pela gelia do vulo solubilizada, pela gelia que envolve o vulo, ou mesmo em certas espcies, pelo contato com o prprio vulo. Tambm pode ser ativada artificialmente pelo aumento da concentrao de clcio na gua do mar.
Quimiotaxia do espermatozide em Arbacia. Um nanolitro de uma soluo 10-nM de resact injetado em uma gota de 20ml de suspenso de espermatozide. A posio da micropipeta est indicada em (A). (A) Uma fotografia de 1 segundo, mostrando espermatozide nadando em crculos estreitos antes da adio de resact. (B-D) Exposies semelhantes de 1 segundo mostrando a migrao do espermatozide para o centro do gradiente de resact 20, 40 e 90 segundos aps a injeo. (de Ward et al., 1985, cortesia de V. D. Vacquier.)
130
Membrana acrossmica Enzimas acrossmicas Membrana do espermatozide Actina globular Bindina
Microfilamentos de actina
Ncleos
Figura 4.9
Reao acrossmica em espermatozide de equinoderma. (A-C) A poro da membrana acrossmica diretamente abaixo da membrana do espermatozide funde-se com essa liberando o contedo da vescula acrossmica. (D) Enquanto as molculas de actina se agregam para produzir microfilamentos, o processo acrossmico se estende para fora. Fotografias reais da reao acrossmica no espermatozide do ourio-do-mar so mostradas em seguida. (Segundo Summers e Hylander, 1974; fotografias por cortesia de G. L. Decker e W. J. Lennarz.)
Em ourios-do-mar, o contato com a gelia do vulo causa a exocitose da vescula acrossmica e a liberao de enzimas digestoras de protenas que podem digerir um caminho atravs da gelia de revestimento at a superfcie do vulo (Dan, 1967; Franklin, 1970; Levine et al., 1978). A seqncia desses eventos est esquematizada na Figura 4.9. A reao acrossmica considerada ser iniciada por um oligossacardeo ligado a uma protena na gelia do vulo que permite a entrada de clcio na cabea do espermatozide (SeGall e Lennarz, 1979; Schackmann e Shapiro, 1981; Keller e Vacquier, 1994 a,b). A exocitose da vescula acrossmica causada por uma fuso, mediada pelo clcio, da membrana acrossmica com a membrana plasmtica adjacente do espermatozide (Figuras 4.9 e 4.10). Essa exocitose permite que a vescula acrossmica libere seu contedo na cabea do espermatozide*. A segunda parte da reao acrossmica envolve a extenso do processo acrossmico (veja Figura 4.9). Essa protruso se origina da polimerizao de molculas globulares de actina em filamentos de actina (Tilney et al., 1978). A exposio do espermatozide do ourio-do-mar gelia do vulo tambm ocasiona a rpida utilizao de ATP e um aumento de 50% da respirao mitocondrial. A energia gerada usada primordialmente para motilidade flagelar (Tombes e Shapiro, 1985). Os fatores da gelia do vulo que iniciam a reao acrossmica em ourios-do-mar so muitas vezes muito especficos. Os espermatozides dos ourios-do-mar Arbacia punctulata e Strongylocentrotus drobachiensis reagem somente com a gelia de seus prprios vulos. No entanto, o espermatozide de S. purpuratus tambm pode ser ativado pela gelia de Lytechinus variegatus (mas no de A. punctulata) (Summers e Hylander, 1975). Portanto, a gelia do vulo pode prover reconhecimento espcieespecfico em algumas espcies, mas no em outras.
* Tais reaes exocitticas podem ser vistas na liberao de insulina das clulas pancreticas e na liberao de neurotransmissores de terminais sinpticos. Em todos os casos, h uma fuso mediada pelo clcio entre a vescula secretria e a membrana celular. Realmente, a semelhana entre a exocitose da vescula acrossmica e a exocitose da vescula sinptica pode ser bastante profunda. Estudos recentes de reaes acrossmicas em ourios-do-mar e mamferos (Florman et al., 1992; Gonzlez-Martnez et al., 1992) sugerem que quando os receptores para os ligantes ativadores do espermatozide ligam essas molculas, causam a despolarizao da membrana que poderia abrir canais de clcio voltagem-dependentes de maneira reminescente transmisso sinptica. As protenas que atracam os grnulos corticais membrana celular tambm parecem ser homlogas quelas usadas na ponta do axnio (Bi et al., 1995).
131
Membrana celular do espermatozide Membrana acrossmica Fuso entre a membrana celular do espermatozide e a membrana acrossmica adjacente
Ncleo
Centrolo
Figura 4.10
Reao acrossmica em espermatozide de hamster. (A) Micrografia de transmisso eletrnica de um espermatozide de hamster passando pela reao acrossmica. A membrana acrossmica pode ser vista formando vesculas. (B) Diagrama interpretativo de micrografias eletrnicas mostrando a fuso de membranas acrossmica e celular na cabea do espermatozide. (A de Meizel, 1948, cortesia de S. Meizel; B, segundo Yanagimachi e Noda, 1970.)
&
Especulaes
Ao Distncia: Gametas de Mamferos

MUITO DIFCIL estudar as interaes que podem estar ocorrendo entre gametas de mamferos antes do contato espermatozide-vulo. Um motivo bvio para isso que a fertilizao ocorre dentro dos ovidutos femininos. Embora seja relativamente fcil mimetizar as condies rodeando a fertilizao do ourio-do-mar (usando gua do mar natural ou artificial), ainda no conhecemos os componentes dos vrios ambientes naturais encontrados pelo espermatozide dos mamferos em sua viajem ao encontro do vulo. Um segundo motivo para essa dificuldade que a populao de espermatozide ejaculada para o interior da fmea provavelmente muito heterognea, contendo espermatozides em diferentes estgios de amadurecimento. Dos 280 x 106 espermatozides humanos normalmente ejaculados para o interior da vagina, somente 200 atingem a regio ampolar do oviduto, onde ocorre a fecundao (Ralt et al., 1991). Como menos de 1 em 10.000 espermatozides chegam perto do vulo, difcil analisar aquelas mol-
culas que permitem aos espermatozides nadar em direo ao vulo e serem ativados. H muita controvrsia em relao ao deslocamento do espermatozide mamfero at o oviduto, a capacitao e as reaes de hiperativao que parecem ser necessrias em algumas espcies para lig-lo ao vulo, e a possibilidade que o vulo possa estar atraindo o espermatozide por quimiotaxia. Translocao e Capacitao O trato reprodutivo de mamferos femininos exerce um papel muito ativo no processo de fertilizao. Enquanto a motilidade espermtica necessria para que o espermatozide do camundongo, uma vez no oviduto encontre o ovo, a motilidade espermtica provavelmente um fator de menor importncia para entrar no oviduto. O espermatozide encontrado no oviduto de camundongos, hamsters, cobaia, vacas e seres humanos dentro de 30 minutos aps a deposio, um perodo demasiadamente curto para ser atingido at mesmo pelo espermatozide mais olm-
pico, se confiar somente no poder de seus flagelos (Storey, 1995). mais provvel que o espermatozide seja transportado para o oviduto por meio da atividade muscular do tero. Espermatozide mamfero recm-ejaculado incapaz de sofrer a reao acrossmica sem ter residido por algum tempo no trato reprodutivo feminino (Chang, 1951; Austin, 1952). Esse requisito para capacitao varia de espcie para espcie (Gwatkin, 1976) e pode ser mimetizado in vitro pela incubao de espermatozide em meios de cultura de tecidos (contendo ons de clcio, bicarbonato e soroalbumina) ou em fluido dos ovidutos. Os espermatozides que no foram capacitados so segurados na matriz cumular, no atingindo assim o vulo (Austin, 1960; Corselli e Talbot, 1987). As alteraes moleculares que explicam a capacitao ainda so desconhecidas (veja Yanigamachi, 1994), mas existem quatro conjuntos de alteraess moleculares que podem ser importantes. Primeiro, a membrana da clula espermtica
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pode se alterar, mudando sua composio de lipdios. A concentrao de colesterol no espermatozide diminuda durante a capacitao do espermatozide em vrias espcies (Davis, 1981), e duas protenas encontradas tanto no soro como no trato reprodutivo feminino (albumina e protena 1 de transferncia lipdica), foram verificadas remover colesterol do espermatozide humano (Langlais et al., 1988; Ravnik et al., 1992). Em segundo lugar, certas protenas ou carboidratos na superfcie do espermaozide so perdidos durante a capacitao (Poirier e Jackson, 1981; Lopez et al., 1985; Wilson e Oliphant, 1987). possvel que essas entidades perdidas durante a capacitao estivessem bloqueando locais de reconhecimento para as protenas que se ligam zona pelcida. Em terceiro lugar, certas protenas so fosforiladas por um caminho cAMP-dependente. O AMP cclico pode induzir artificialmente a competncia atravs da protena quinase cAMP-dependente (PKA), que necessria tanto para a aquisio de competncia como para a fosforilao de tirosino-quinases. possvel que o trato reprodutivo feminino estimule a adenilciclase do espermatozide a produzir mais cAMP e que esse ative a protena quinase que inicia a cascata de fosforilao, terminando na fosforilao e ativao das protenas envolvidas na ligao do espermatozide zona pelcida e mediando a exocitose da vescula acrossmica (Leyton e Saling, 1989a; Visconti et al., 1995a,b). Em quarto lugar, o potencial da membrana do espermatozide dramaticamente reduzido (de cerca de 30 para 50 mV; Zeng et al., 1995). Porm, ainda incerto se esses eventos so independentes um do outro e at que ponto cada um deles produz capacitao do espermatozide.
Hiperativao e Quimiotaxia As diferentes regies do trato reprodutivo feminino podem secretar fatores diferentes, regionalmente especficos. Esses fatores podem influenciar a motilidade espermtica assim como a capacitao. Por exemplo, quando os espermatozides de certos mamferos (especialmente hamsters, cobaias e algumas variedades de camundongos) passam do tero para os ovidutos, ficam hiperativados, passando a nadar com maior velocidade e gerando maior fora. Suarez e colaboradores (1991) mostraram que enquanto essas reaes no so conducentes a viagens em fluidos de baixa viscosidade, parecem ser muito adequadas para o movimento linear do espermatozide no fluido viscoso que poder encontrar no oviduto. Alm de aumentar a atividade do espermatozide, fatores solveis no oviduto tambm podem prover o componente direcional do movimento do espermatozide. Especulou-se que o vulo (ou, mais provavelmente, o folculo ovariano no qual o vulo se desenvolve) pode estar secretando substncias quimiotticas que poderiam atrair o espermatozide em direo ao vulo durante os ltimos estgios da migrao (veja Hunter, 1989). Ralt e colaboradores (1991) testaram essa hiptese usando fluido de folculos humanos cujos vulos estavam sendo usados para fertilizao in vitro. Realizando um experimento semelhante aquele descrito anteriormente com ourios-do-mar, os autores microinjetaram uma gota do fluido folicular em uma gota maior da suspenso de espermatozides. Feito isso, observaram que parte do espermatozide mudou sua direo de movimentao, passando a migrar ao encontro da fonte de fluido folicular. A microinjeo de outras solues no teve esse efeito. Esses estudos no eliminam a
possibilidade de que o efeito fosse devido a uma estimulao geral do movimento ou do metabolismo do espermatozide. No entanto, essas investigaes revelaram uma correlao fascinante: o fluido de somente a metade dos folculos testados mostrou um efeito quimiottico, e em quase todos os casos, o vulo s era fertilizvel se, e somente se, o fluido demonstrasse habilidade quimiottica (P < 0,0001). possvel, portanto, que tal como certos vulos de invertebrados, o vulo humano secrete um fator quimiottico somente quando estiver capacitado para a fertilizao. Deve-se notar que o prmio da corrida no vai sempre para o mais rpido. Embora algum espermatozide possa alcanar a regio ampolar do oviduto (onde ocorre a fertilizao) dentro de meia hora aps a relao sexual, aquele espermatozide pode ter poucas chances de fertilizar o vulo. Wilcox e colaboradores (1995) acharam que quase todas os engravidamentos humanos resultam de relacionamento sexual durante um perodo de seis dias, terminando no dia da ovulao. Isso significa que o espermatozide fertilizador poderia demorar at seis dias para fazer a jornada. Eisenbach (1995) props a hiptese pela qual a capacitao um acontecimento transitrio, e que dada ao espermatozide uma janela de competncia relativamente breve, durante a qual pode ter sucesso na fertilizao do vulo. Quando os espermatozides atingem a ampola, adquirem competncia, mas se a ficam por um perodo demasiadamente longo, perdem-na. O espermatozide pode tambm ter diferentes prazos de sobrevivncia, dependendo da sua localizao dentro do trato reprodutivo; isso pode permitir que algum espermatozide chegue mais tarde, porm com uma melhor probabilidade de sucesso do que aquele que chegou dias antes.
Reconhecimento do vulo e espermatozide: Contato de gametas

Reconhecimento Espcie-Especfico em Ourios-do-Mar Uma vez que o espermatozide do ourio-do-mar tiver penetrado na gelia do vulo, o processo acrossmico do espermatozide faz contato com o envoltrio vitelnico do vulo (Figura 4.11). Um importante passo do reconhecimento espcie-especfico ocorre nesse ponto. A protena acrossmica mediando esse reconhecimento chamada bindina. Em 1977, Vacquier e colaboradores isolaram essa protena insolvel, de 30.500Da, do acrossomo de Strongylocentrotus purpuratus. Essa protena capaz de se
133
Figura 4.11
Contato do processo acrossmico do espermatozide do ourio-do-mar com uma microvilosidade do vulo. (de Epel, 1977, cortesia de F. D. Collins e D. Epel.)
Figura 4.12
ligar a vulos desgeleificados de S. purpuratus (Figura 4.12; Vacquier e Moy, 1977). Ainda mais, sua interao com vulos relativamente espcie-especfica (Glabe e Vacquier, 1977; Glabe e Lennarz, 1979); a bindina isolada dos acrossomos de S. Purpurata aglutina seus prprios vulos desgeleificados, mas no aqueles de Arbacia puctulata. Usando tcnicas imunolgicas, Moy e Vacquier (1979) demonstraram que a bindina est especificamente localizada no processo acrossmico, exatamente onde deve estar para o reconhecimento espermatozide-vulo (Figura 4.13). Estudos bioqumicos mostraram que as bindinas de espcies proximamente relacionadas de ourio-do-mar so mesmo diferentes. Esse achado implica na existncia de
(A)
BINDINA DO ESPERMATOZIDE S. purpuratus S. fransciscanus
(B)
Aglutinao espcie-especfica por bindina de vulos desgeleificados . (A) aglutinao promovida pela adio de 212 g de bindina em um recipiente plstico contendo 0.25 ml de suspenso a 2% (volume/ volume) de vulos. Aps 2-5 min de agitao branda, os recipientes foram fotografados. Cada bindina somente se ligou a seus prprios vulos. (B) Fotomicrografia de fluorescncia de vulos de S. purpuratus ligados entre si por partculas de bindina de S. purpuratus marcadas por fluorescncia. As partculas de bindina estavam invariavelmente nos lugares onde dois vulos se encontravam. (A baseado em fotografias de Glabe e Vacquier, 1977; B de Glabe e Lennarz, 1979, cortesia dos autores.)
S. purpuratus
OVOS DESGELEIFICADOS
Partculas de bindina
Aglutinao
Sem aglutinao vulos
S. fransciscanus
Sem aglutinao
Aglutinao
134
(A)
DAB + H2O2 Precipitado denso Anti-bindina de coelho
(B) Precipitado DAB
Imunoglobulina porcina anti-coelho conjugada com a enzima peroxidase
(C) Membrana vitelnica do vulo
Acrossomo
Ncleo
Processo acrossmico
Bindina Espermatozide
Figura 4.13
Localizao de bindina no processo acrossmico. (A) a tcnica de localizao imunoqumica coloca um anticorpo de coelho nos lugares onde a bindina est exposta. Os anticorpos do coelho foram produzidos contra a protena bindina, e esses anticorpos foram incubados com espermatozide que tinha sofrido a reao acrossmica. Quando a bindina estava presente, os anticorpos do coelho permaneciam ligados ao espermatozide. Depois de todo anticorpo no-ligado ser removido por lavagem, o espermatozide foi tratado com anticorpos de porco capazes de ligar-se a anticorpos de coelho. Esses anticorpos de porco haviam sido ligados covalentemente enzima peroxidase. Dessa maneira, molculas de peroxidase foram colocadas em todos os lugares onde havia bindina. Peroxidase catalisa a formao de um precipitado escuro de diaminobenzidina (DAB) e gua oxigenada. O precipitado s se forma onde h bindina. (B) Localizao de bindina no processo acrossmico aps a reao acrossmica (33.200x). (C) Localizao de bindina no processo acrossmico na juno do espermatozide com o vulo. (B e C de Moy e Vacquier, 1979, cortesia de V. D. Vacquier.)
receptores espcie-especficos de bindina no envoltrio vitelnico. Tais receptores tambm foram sugeridos pelos experimentos de Vacquier e Payne (1973), que saturaram vulos de ourio-do-mar com espermatozide. Como pode ser visto na Figura 4.14 A, a ligao do espermatozide no se d sobre a superfcie inteira do vulo. Mesmo
(A)
Figura Figura 4.14
Receptores de bindina no vulo. (A) Micrografia eletrnica de varredura do espermatozide do ourio-do-mar ligado ao envoltrio vitelnico de um vulo. (B) ligao do espermatozide de S. purpuratus a partculas de polistireno que foram cobertas com a protena purificada do receptor de bindina. (A cortesia de C. Glabe, L. Perez e W. J. Lennarz; B de Foltz et al., 1993.)
(B)
135
a nveis saturantes de espermatozide (aproximadamente 1500), parece haver espao no vulo para mais cabeas de espermatozide, indicando haver um nmero limitante de locais ligantes de espermatozide. Um grande complexo de glicoprotenas dos envoltrios vitelnicos de vulos de ourio-do-mar foi isolado e mostrou ligar bindina radioativa de maneira espcie-especfica (Glabe e Vacquier, 1978; Rossignol et al., 1984). Essa glicoprotena tambm capaz de competir com vulos pelo espermatozide da mesma espcie. Isto , se espermatozide de S. purpuratus misturado com o receptor de bindina de envoltrios vitelnicos de S. purpuratus, o espermatozide se liga a ele e no ir fertilizar os vulos. O receptor isolado de S. purpuratus, porm, no ir interferir com a fertilizao de outros ourios-do-mar relacionados. Esse receptor de bindina uma glicoprotena transmembrana com quase 1300 aminocidos (Foltz et al., 1993). A regio ligante de bindina se estende para o espao extracelular e provavelmente se torna um componente do envoltrio vitelnico. Esses receptores de bindina se agregam em complexos, e centenas deles so provavelmente necessrios para amarrar o espermatozide no vulo (Figura 4.14B). Assim, reconhecimento espcieespecfico dos gametas do ourio-do-mar ocorrem ao nvel da atrao, ativao e adeso do espermatozide superficie do vulo. [fert4.html] Ligao de Gametas e Reconhecimento em Mamferos
ZP3: A PROTENA LIGANTE DA ZONA PELCIDA DO CAMUNDONGO. A zona pelcida tem nos mamferos um papel anlogo aquele do envoltrio vitelnico nos invertebrados. Essa matriz de glicoprotenas sintetizada e secretada pelo ocito em crescimento, e tem dois papis importantes durante a fertilizao: liga o espermatozide, e inicia a reao acrossmica aps essa ligao (Saling et al., 1979; Florman e Storey, 1982; Cherr et al., 1986). A ligao de espermatozide zona relativamente, porm no absolutamente, espcie-especfica (especificidade por espcie no deveria ser um grande problema quando a fertilizao ocorre internamente), e a ligao do espermatozide do camundongo zona dessa espcie pode ser inibida pela incubao prvia de espermatozide com glicoprotenas da zona. Bleil e Wassarman (1980, 1986, 1988) isolaram da zona pelcida do camundongo uma glicoprotena ZP3, de 83-kDa, que o competidor ativo nesse ensaio de inibio. As outras duas protenas da zona, ZP1 e ZP2, no puderam competir pela ligao do espermatozide (Figura 4.15). Ainda mais, ZP3 radiativamente marcada ligou-se s cabeas do espermatozide do camundongo que tinha acrossomos intactos. Assim, ZP3 a protena especfica na zona pelcida qual se liga o espermatozide do camundongo. ZP3 tambm inicia a reao acrossmica aps os espermatozides terem se ligado a ela. O espermatozide do camundongo pode, dessa forma, concentrar suas enzimas proteolticas diretamente no ponto de fixao zona pelcida.
Figura 4.15
Ligao do espermatozide zona pelcida. (A) ensaio de inibio mostrando a diminuio especfica da ligao do espermatozide do camundongo s zonas pelcidas quando espermatozide e zonas so incubados com aumentos crescentes da poro carboidrato da glicoprotena ZP3. A importncia da poro carboidrato de ZP3 tambm, indicada por essa figura. (B) Ligao de ZP3 marcada radioativamente a espermatozide capacitado do camundongo. (A segundo Bleil e Wassarman, 1980, e Florman e Wassarman, 1985; B de Bleil e Wassarman, 1986, cortesia dos autores.)
Ligao do espermatozide (%)
ZP3 sem carboidratos
(A)
Equivalentes da zona pelcida por l
(B)
136
O mecanismo molecular pelo qual a zona pelcida e o espermatozide do mamfero se reconhecem mutuamente est sendo estudado. A hiptese corrente sobre a ligao dos gametas de mamferos postula um conjunto de protenas do espermatozide capazes de reconhecer regies especficas de carboidratos na zona ZP3 do vulo (Florman et al., 1984; Florman e Wassarman, 1985; Wassarman, 1987; Saling, 1989). A remoo desses grupos de carboidratos ligados por treonina ou serina suprime a habilidade de ligar o espermatozide.
PROTENAS DE ADESO ESPERMATOZIDE-ZONA. O espermatozide do camun-
dongo no fura para chegar ao interior da zona. Na realidade, os espermatozides se aproximam paralelamente ao plano da superfcie da zona e a so ativamente fixados (Baltz et al., 1988). Como a zona capaz de ligar e conservar esses espermatozides contorcedores? Parece que ZP3 pode ligar-se a pelo menos trs protenas adesivas na membrana do espermatozide, e milhares desses stios podem ser necessrios para prevenir que essas duas clulas se separem. H uma controvrsia significativa sobre a questo de se todas as trs protenas no espermatozide so necessrias para ligao zona, e quais as suas respectivas funes (veja Figura 4.16: Snell e White, 1996). Parece que cada uma delas tem papis especficos, mas um tanto sobrepostos na adeso do espermatozide e na reao acrossmica. Essas trs protenas so: a protena ligante de galactose, a galactosil-transferase e a quinase do receptor da zona.
A PROTENA LIGANTE DE GALACTOSE 56-KDA (SP56). Uma protena crtica
ligante da zona do espermatozide parece ser a protena que especificamente se liga aos resduos de galactose de ZP3. Bleil e Wassarman (1980) mostraram que um dos carboidratos crticos da glicoprotena ZP3 o grupo galactose terminal. Se essa galactose terminal for removida ou modificada quimicamente, a atividade ligante de espermatozide perdida. Esses pesquisadores posteriormente isolaram essa protena, ligando
Zona pelcida vulo
Espermatozide
ZP3 (protena ligante de espermatozide) na Zona
ZP3 Protenas candidatas a ligao zona no acrossomo N-acetil glicosamina Galactose Membrana celular do espermatozide
GALACTOSILTRANSFERASE Ligao cruzada ativa protenas G Ativao de sntese de IP3 na membrana acrossmica
SP 56 (protena perifrica da membrana)
P95 Ativao de tirosinoquinase Regulao de canais inicos ou sntese de IP3
Figura 4.16
Liberao de Ca++
Reao acrossmica
Ligao de espermatozide zona pelcida do camundongo: alguns possveis participantes. A protena ZP3 da zona pelcida liga espermatozide. H evidncia da ligao de trs protenas espermticas a galactosiltransferase da superfcie, sp56 e P95 ZP3. Essa ligao induz a reao acrossmica atravs da ativao do fluxo de clcio. Os detalhes ainda tero que ser elucidados. (Segundo Snell e White, 1996.)
137
Figura 4.17
ZP3 uma coluna de afinidade, passando em seguida, por essa coluna, as protenas isoladas da membrana de espermatozides de camundongo (Bleil e Wassarman, 1990). A maioria das protenas passou pela coluna; porm um peptdio de 56kDa, ligou-se s partculas recobertas com ZP3, mas no se ligou a partculas recobertas com ZP2 em experimento semelhante. Essa protena foi encontrada exposta na membrana espermtica; ligava-se a resduos de galactose, sugerindo fortemente ser um receptor de espermatozide ligante entidade terminal de galactose na glicoprotena ZP3. A protena sp56 liga-se zona pelcida de ovos no-fertilizados (porm no dos fertilizados), bloqueando a ligao espermatozide-vulo (Figura 4.17; Bookbinder et al., 1995).
GALCTOSILTRANSFERASE. A Segunda protena do espermatozide que parece
Sp56 purificada liga-se zona pelcida e inibe a ligao de espermatozide a vulos de camundongo. (A) Ligao de sp56 zona pelcida de ovos no-fertilizados. A pista 1 o resultado da lise de ovos no-fertilizados, fazendo migrar as protenas extradas em um gel, transferindo o gel, e sondando para a presena de sp56 com anticorpo marcado. No se v sp56. A pista 2 mostra o resultado positivo obtido quando o ovo no-fertilizado pr-incubado com sp56, indicando que sp56 se liga aos vulos. A pista 3 mostra os resultados negativos obtidos quando sp56 foi adicionada a embries bicelulares. A pista 4 mostra o controle quando sp56 purificada feita migrar no gel. (O anticorpo reconhece a forma no-reduzida de sp56, que migra em 40 kDa). (B) Espermatozide ligando-se normalmente a ovos no-fertilizados de camundongo (aproximadamente 76 espermatozides por vulo). Os embries bicelulares (aqui marcados por asteriscos) so controles internos mostrando no ocorrer ligao. (C ) Na presena de sp56, o espermatozide foi impedido de se ligar zona. (de Bookbinder et al., 1995; cortesia de J.D. Bleil.)
ser importante para ligao espermatozides-zona a enzima da membrana celular do espermatozide, glicosiltransferase. No laboratrio de Shur foi demonstrado que esse receptor para a zona uma enzima que reconhece o acar N-acetilglicosamina na ZP3 (Shur e Hall, 1982a,b; Lopez et al., 1985; Miller et al., 1992). Essa enzima, Nacetilglicosamina:galactosiltransferase, est embebida na membrana plasmtica do espermatozide, diretamentre acima do acrossomo, com seu stio ativo apontando para fora. A funo enzimtica dessa enzima de 60-kDa seria a de catalisar a adio de um acar galactose (de UDP-galactose) para uma cadeia de carboidrato terminando em um acar N-acetilglicosamina (veja Captulo 3). No entanto, no h resduos de UDP-galactose no trato reprodutivo feminino. Embora a enzima possa se ligar aos resduos de protenas da zona, exatamente como qualquer enzima se ligaria a um substrato, ela no pode catalisar a reao porque o segundo reagente est faltando. Portanto, as enzimas (no espermatozide) ficam ligadas a seus substratos (na zona). Se essa hiptese estiver correta, poderamos esperar que a ligao vulo-espermatozide seria inibida ou pela inibio da enzima, ou pela adio do segundo reagente, UDP-galactose. Isso exatamente o que Shur e colaboradores acharam ser o caso. A ligao espermatozide-zona foi bloqueada por: (1) adio de UDPgalactose, (2) remoo de resduos de N-acetilglicosamina de ZP3, (3) adio de anticorpos que bloqueiam a atividade da galactosiltransferase, e (4) colocao de um excesso de galactosiltransferase no meio (a enzima em excesso iria ligar-se zona e inibir o espermatozide de se ligar) (Lopez et al., 1985; Shur e Neely, 1988). Alm disso, membranas de espermatozide de camundongo iro transferir um acar de UDP-galactose especificamente para ZP3 (Miller et al., 1992). Assim, a galactosiltransferase da superfcie do espermatozide parece reconhecer um grupo carboidrato na protena ZP3 da zona pelcida do camundongo. A agregao dessas galactosiltransferases ocasiona a ativao de uma protena G que pode ser importante na iniciao da reao acrossmica (Gong et al., 1995).
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RECEPTOR DE QUINASE DA ZONA (ZRK). Uma terceira protena espermtica que se liga zona pelcida do camundongo parece ser uma protena transmembrana de 95-kDa com dois stios funcionais. O stio extracelular liga especificamente ZP3, enquanto o stio intracelular tem atividade enzimtica de tirosina quinase (Leyton et al., 1992). Essa atividade estimulada quando a protena liga ZP3. Isso implica que a protena de 95-kDa uma tirosina quinase de receptor, e que pode iniciar a reao acrossmica atravs da fosforilao das suas protenas alvo (veja Captulo 3). O espermatozide humano tem uma protena semelhante, e a ZP3 humana estimula a atividade da quinase. Alm disso, peptdios sintticos que mimetizam o domnio extracelular (que liga ZP3) dessa protena, inibem a ligao do espermatozide zona pelcida humana, sugerindo possvel uso como contraceptivo (Burks et al., 1995). INDUO DA REAO ACROSSMICA EM MAMFEROS POR ZP3. Uma vez que o espermatozide capacitado ligou-se zona pelcida, como ocorre a reao acrossmica nos mamferos? A reao induzida pela poro protica de ZP3 (Endo et al., 1987; Leyton e Saling,1989a), e ZP3 parece atuar perfazendo ligao cruzada com seus receptores na membrana espermtica. Esse tipo de ligao abre os canais de clcio, aumentando a concentrao do on no espermatozide (Leyton e Saling, 1992b). O mecanismo pelo qual age o ZP3 e a subseqente exocitose do acrossomo permanece controversa, mas pode envolver a trajetria IP3 (Florman, 1994; Suarez e Dai, 1995). [fert5.html] LIGAO SECUNDRIA DO ESPERMATOZIDE ZONA PELCIDA. Durante a reao acrossmica, a parte anterior da membrana plasmtica do espermatozide solta (veja Figura 4.10). ali que esto localizadas as protenas ligantes de ZP3 e, ainda assim, o espermatozide deve permanecer ligado zona para abrir, por lise, um caminho atravs dela. Em camundongos, parece que uma ligao secundria zona conseguida por protenas na membrana acrossmica interna que se ligam especificamente a ZP2 (Bleil et al., 1988). Enquanto espermatozide com acrossomo intacto no ir se ligar ZP2 glicoprotena, o espermatozide cujo acrossomo reagiu o far. Alm disso, anticorpos contra a protena ZP2 no iro impedir a ligao do espermatozide com acrossomo intacto zona, mas iro inibir a fixao do espermatozide que j tenha reagido. A estrutura da zona consiste de unidades repetitivas de ZP3 e ZP2, ocasionalmente ainda ligadas por ZP1 (Figura 4.18). Parece que os espermatozides com acrossomo que reagiram, transferem sua ligao com ZP3 para as molculas adjacentes de ZP2. Aps a entrada de espermatozide de camundongo no vulo, os grnulos corticais do ovo liberam seu contedo. Uma das protenas liberadas a protease que especificamente altera ZP2 (Moller e Wassarman, 1989). Isso inibe outros espermatozides, cujo acrossomo j reagiu, de mover-se mais para perto do vulo. No conhecido quais das protenas do espermatozide do camundongo se ligam ZP2. No espermatozide porcino, ligao secundria zona parece ser mediada por proacrosina. Proacrosina torna-se a protease acrosina, h muito tempo conhecida por estar envolvida na digesto da zona pelcida. No entanto, proacrosina tambm uma protena ligante da fucose que mantm a conexo entre espermatozide que reagiu com acrosina e a zona pelcida (Jones et al., 1988). possvel que a proacrosina se ligue zona, sendo depois convertida na enzima ativa que digere localmente a zona pelcida. Na cobaia, ligao secundria zona considerada ser mediada pela protena PH-20. Quando essa protena da membrana acrossmica interna foi injetada em cobaias macho ou fmea, 100% desses animais tornaram-se estreis por vrios meses (Primakoffet al., 1988). O soro sangneo dessas cobaias estreis tinha uma concentrao extremamente alta de anticorpos para PH-20. O anti-soro de cobaias esterilizadas por injees de PH-20 no s se ligou especificamente a essa protena, como tambm bloqueou a adeso espermatozide-zona in vitro. O efeito
ZP1
ZP2
ZP3
Resduos de carboidratos
Figura 4.18
Diagrama da estrutura fibrilar da zona pelcida do camundongo. Filamentos principais da zona pelcida so compostos por dmeros repetitivos das protenas ZP2 e ZP3. Esses filamentos esto ocasionalmente ligados por ZP1, formando uma esteira de malhas. (Segundo Wassarman, 1989.)
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contraceptivo perdurou por vrios meses, aps os quais a fertilidade foi restabelecida. Os animais foram temporariamente esterilizados por esses anticorpos. O anlogo humano da protena PH-20 no ainda conhecido, porm, certos antgenos do espermatozide apresentam um padro semelhante de localizao no espermatozide. As protenas da zona pelcida humana e suas funes ainda no foram estabelecidas to claramente como no camundongo. Ainda assim, esses experimentos mostram que o princpio da contracepo imunolgica est bem fundamentado.
Fuso de gametas e a preveno da polispermia

Fuso entre as membranas do vulo e do espermatozide O reconhecimento do espermatozide pelo envoltrio vitelnico ou zona seguido pela lise da poro do envoltrio ou zona na regio da cabea do espermatozide (Colwin e Colwin, 1960; Epel, 1980). Essa lise seguida pela fuso da membrana espermtica com a membrana do vulo. A entrada do espermatozide no vulo do ourio-do-mar est ilustrada na Figura 4.19. A superfcie do vulo est coberta de pequenas microvilosidades; a fuso espermatozide-vulo parece causar a polimerizao da actina e a extenso de vrias microvilosidades para formar o cone de fertilizao (Summers et al., 1975; Schatten e Schatten, 1980, 1983). A homologia entre vulo e espermatozide novamente
(A)
(B)
Figura 4.19
Varredura ao microscpio eletrnico da entrada do espermatozide em vulo de ourio-do-mar. (A) Contato da cabea do espermatozide com microvilosidades do vulo atravs do processo acrossmico. (B) Formao do cone de fertilizao. (C) Internalizao do espermatozide no vulo. (D) Micrografia de transmisso ao microscpio eletrnico da internalizao do espermatozide atravs do cone de fertilizao. (A-C de Schatten e Mazia, 1976, cortesia de G. Schatten; D cortesia de F. J. Longo.)
(C) (D)
140
demonstrada, porque o cone de fertilizao transitrio, tal como o processo acrossmico, parece se prolongar pela polimerizao da actina. Aps a juno, podese encontrar material do espermatozide na membrana do vulo (Gundersen et al., 1970). O ncleo e a cauda do espermatozide passam pela ponte citoplasmtica, que alargada pela polimerizao da actina. Yanagimachi e Noda (1970) mostraram que processo semelhante ocorre na fuso de gametas de mamferos (Figura 4.20). No ourio-do-mar, todas as regies do vulo so capazes de se fundir com o espermatozide; em vrias outras espcies, existem regies especializadas na membrana para o reconhecimento e fuso com o espermatozide (Vacquier, 1979). A fuso um processo ativo, freqentemente mediado por protenas fusognicas especficas. Protenas como a HA do vrus da influenza e a protena F do vrus Sendai promovem a fuso celular, sendo possvel que a bindina tambm seja uma dessas protenas. Glabe (1985) mostrou que a bindina do ourio-do-mar promove a fuso de vesculas fosfolipdicas e que, tal como as protenas fusognicas virais, a bindina contm uma longa regio de aminocidos hidrofbicos perto do terminal amino. Em abalones, a lisina que dissolve o envoltrio vitelnico tambm demonstrou ter atividade fusognica (Hong e Vacquier, 1986). As protenas fertilinas da membrana do espermatozide dos mamferos so essenciais para fuso espermatozide-vulo (Primakoff et al., 1987; Blobel et al., 1992; Myles et al., 1994). A fertilina do camundongo tem regies hidrofbicas semelhantes s das protenas fusognicas virais, alm de uma seqncia que sugere ligao com uma integrina da membrana do vulo. Evidncia atual sugere que a fertilina do camundongo liga-se integrina 61 da membrana assumindo-se que a regio hidrofbica da fertilina pode, em seguida, mediar a unio das duas membranas (Almeida et al., 1995). Quando as membranas se fundem, o ncleo, mitocndrias, centrolo e flagelo podem penetrar no ovo. Preveno da Polispermia Assim que um espermatozide tiver penetrado o vulo, a capacidade de fuso da membrana do vulo, que fora to necessria para conseguir a penetrao, torna-se um risco. No ourio-do-mar, como na maioria dos animais estudados, qualquer espermatozide que penetra o vulo, pode prover um ncleo haplide e um centrolo para o vulo. Na monospermia normal, na qual somente um espermatozide penetra o vulo, um ncleo haplide do espermatozide e um do vulo se combinam para formar o ncleo diplide do ovo fertilizado (zigoto), restaurando o nmero de cromossomos apropriado para a espcie. O centrolo, provindo do espermatozide, se dividir para formar os dois plos do fuso mittico durante a clivagem. A entrada de mltiplos espermatozides polispermia conduz conseqncias desastrosas na maioria dos organismos. No ourio-do-mar, a fertilizao por dois espermatozides resulta em um ncleo triplide, no qual cada cromossomo est representado no duas, mas trs vezes. Pior ainda, como o centrolo se divide para formar os dois plos do aparelho mittico, aqui, em vez de um fuso mittico bipolar separar os cromossomos em duas clulas, os cromossomos triplides se dividiriam em quatro clulas. Como no h mecanismos para assegurar que cada uma das quatro clulas receba o nmero e o tipo apropriado de cromossomos, esses sero distribudos de maneira desigual. Algumas clulas receberiam cpias extra de certos cromossomos e outras clulas no os teriam. Theodor Boveri demonstrou em 1902 que tais clulas ou morreriam ou se desenvolveriam anormalmente (Figura 4.21). [fert6.html] As espcies desenvolveram maneiras de prevenir a unio de mais de dois ncleos haplides. A mais comum a de impedir a entrada de mais de um espermatozide no vulo. O vulo do ourio-do-mar tem dois mecanismos que evitam a polispermia: uma reao rpida, efetivada por uma mudana eltrica na membrana plasmtica do vulo, e uma reao mais lenta, causada pela exocitose dos grnulos corticais.
141
(A)
(B)
(C)
Zona
(E) Membrana acrossmica interna
Ncleo
Segmento equatorial do acrossomo
Figura 4.20
Entrada de espermatozide no vulo do hamster dourado. (A) Micrografia eletrnica de varredura do ato da fuso. O ponto calvo (sem microvilosidades) o local abandonado pelo corpo polar. (B) Vista prxima da ligao espermatozide-zona. (C ) Micrografia eletrnica de transmisso mostrando a cabea do espermatozide atravessando a zona. (D) Micrografia eletrnica de transmisso, do espermatozide fundindo em paralelo a membrana do plasma do vulo. (E) Diagrama da fuso do acrossomo do espermatozide e membranas plasmticas com as microvilosidades do vulo. (Segundo Yanagimachi e Noda, 1970; Yanagimachi, 1994; fotografias cortesia de R. Yanagimachi.)
O BLOQUEIO RPIDO DA POLISPERMIA. A membrana celular do vulo notvel
no somente por sua habilidade de se fundir com a membrana espermtica, mas tambm por sua capacidade de resistir a uma ulterior fuso imediatamente aps a entrada de um espermatozide (Just, 1919). O bloqueio rpido polispermia, conseguido pela mudana do potencial eltrico da membrana do vulo. Essa prov uma barreira seletiva entre o citoplasma e o ambiente exterior; a concentrao inica do vulo difere muito daquela do ambiente, uma diferena especialmente pronunciada para os ons de sdio e potssio. A gua do mar tem uma alta concentrao do on sdio, ao passo que o citoplasma do vulo tem relativamente pouco sdio. O oposto acontece com os ons potssio. Essa condio mantida pela membrana celular, que constantemente inibe a entrada de sdio no
142
(A) Ocito Proncleos do espermatozide
Centrossomo do espermatozide
Figura 4.21
Proncleos do ocito
Desenvolvimento aberrante de um vulo de ourio-do-mar fecundado por dois espermatozides. (A) Fuso de trs ncleos haplides, cada um contendo 18 cromossomos, e diviso dos dois centrolos espermticos para formar quatro plos mitticos. (B, C) Os 54 cromossomos se distribuem aleatoriamente nos quatro fusos. (D) Na anfase da primeira diviso, os cromossomos duplicados so arrastados para os quatro plos. (E) Quatro clulas contendo nmeros e tipos diferentes de cromossomos so formadas, causando a morte prematura do embrio (F). (Segundo Boveri, 1907.)
Fuso pronuclear (B)
1a clivagem (C)
(D)
(E)
(F)
ocito e impede o escoamento de ons de potssio para o ambiente. Quando inserimos um eletrodo no vulo e colocamos um outro fora do ocito, podemos medir a constante diferena potencial da membrana plasmtica do vulo. Esse potencial de repouso da membrana geralmente cerca de 70 mV, e usualmente expresso como 70 mV porque o interior da clula est carregado negativamente em relao ao exterior. [fert7.html] Dentro de 1-3 segundos aps a ligao do primeiro espermatozide, o potencial da membrana muda para um nvel positivo (Longo et al., 1986). Um pequeno influxo de ons de sdio no vulo permitido, trazendo a diferena de potencial para +20 mV (Figura 4.22 A). Embora o espermatozide possa se fundir com membranas tendo um potencial de 70 mV, no pode se fundir com membranas com um potencial de repouso positivo. No conhecido como a ligao ou a entrada do espermatozide sinaliza a abertura dos canais de sdio; porm, Gould e Stephano (1987, 1991) forneceram o que poder ser uma pista importante para a compreenso desse processo. Os autores isolaram do espermatozide de Urechis (um verme equiuride marinho) uma protena cromossmica capaz de abrir canais de sdio de vulos de Urechis. Quando tais vulos so expostos a essa protena, a mudana da velocidade do influxo de sdio e do potencial de membrana resultante so muito parecidos com aqueles produzidos pelo espermatozide vivo. A abertura dos canais de sdio no vulo, parece ser causada pela ligao do espermatozide ao vulo. Jaffe e seus colaboradores mostraram que a polispermia podia ser induzida quando vulos foram supridos artificialmente com uma corrente eltrica que mantinha negativo o seu potencial de membrana. Reciprocamente, a fertilizao podia ser inteiramente prevenida conservando tal potencial positivo (Jaffe, 1976). O bloqueio rpido da polispermia podia tambm ser evitado baixando-se a concentrao do sdio da gua (Figura 4.22B-D). Se os ons de sdio no forem suficientes para ocasionar um deslocamento positivo do potencial de membrana, ocorre a polispermia (Gould-Somero et al., 1979; Jaffe, 1980). No conhecido como diferenas no potencial de membrana atuam sobre o espermatozide bloqueando a segunda fecundao. Muito provavelmente, o espermatozide conduz um componente (possivelmente uma protena fusognica carregada positivamente), sendo a insero desse componente na membrana do vulo, provavelmente, regulada pela carga eltrica transmembrana (Iwao e Jaffe, 1989). Um bloqueio eltrico polispermia tambm ocorre em rs (Dross e Elinson, 1980), mas provavelmente no na maioria dos mamferos (Jaffe e Cross, 1983).
O BLOQUEIO LENTO DA POLISPERMIA. vulos do ourio-do-mar (e muitos ou-
Clulas em desintegrao; morte do embrio
tros) tm um segundo mecanismo para assegurar que mltiplos espermatozides no penetrem no citoplasma do vulo (Just, 1919). O bloqueio rpido transitrio, o potencial de membrana do vulo do ourio-do-mar somente permanece positivo por cerca de um minuto. Essa curta mudana de potencial no suficiente para prevenir a polispermia de maneira permanente. Carroll e Epel (1975) demonstraram que a
143
Figura 4.22
Adio de espermatozide (A) Segundos
Potencial de membrana de vulos de ourio-do-mar antes e aps a fertilizao. (A) antes da adio do espermatozide, a diferena de potencial atravs da membrana celular do vulo de aproximadamente 70 mV. De 1 a 3 segundos aps o espermatozide fertilizante ter entrado em contato com o vulo, o potencial se desloca na direo positiva. (B) Ovos controle desenvolvendo-se em Na+ 490 mM. (C) Polispermia em ovos fertilizados em Na+ 120 mM (colina foi substituda por sdio). Os ovos de Lytechinus foram fotografados durante a primeira clivagem. (D) Tabela mostrando a elevao da polispermia com o decrscimo da concentrao do on sdio. (de Jaffe, 1980, fotografias cortesia de L. A. Jaffe.)
[Na+] (mM)
Porcentagem de ovos polisprmicos
(B)
(C)
(D)
polispermia ainda pode ocorrer se os espermatozides ligados ao envoltrio vitelnico no forem removidos de alguma maneira. Essa remoo conseguida pela reao dos grnulos corticais, um bloqueio mecnico mais lento da polispermia que se torna ativo cerca de 1 minuto aps a primeira ligao bem sucedida espermatozide-vulo. Diretamente abaixo da membrana do vulo do ourio-do-mar existem 15.000 grnulos corticais, cada um com 1 um de dimetro (veja Figura 4.6B). Com a entrada do espermatozide, esses grnulos se fundem com a membrana plasmtica do vulo, liberando seu contedo para o espao entre a membrana e a esteira fibrosa das protenas do envoltrio vitelnico. H vrias protenas associadas com esse processo de exocitose de grnulos corticais. As primeiras so proteases. Essas enzimas dissolvem os postos vitelnicos que conectam as protenas do envoltrio vitelnico membrana celular, secionando o receptor de bindina e todo espermatozide a ele ligado (Vacquier et al., 1973; Glabe e Vacquier, 1978). Outras protenas, mucopolissacardeos liberados dos grnulos, produzem um gradiente osmtico que permite a entrada da gua no espao entre a membrana celular e o envoltrio e, dessa forma, o envoltrio vitelnico se expande e passa a ser chamado de envoltrio de fertilizao (Figuras 4.23 e 4.24). Uma terceira protena, produto dos grnulos corticais, uma peroxidase, enrijece o envoltrio de fertilizao atravs de ligaes cruzadas entre resduos de tirosina em protenas adjacentes (Foerder e Shapiro, 1977; Mozingo e Chandler, 1991). Como mostra a Figura 4.23, o envoltrio de fertilizao comea a se formar no local da entrada do espermatozide e continua sua expanso ao redor do vulo. medida que esse envoltrio se forma, os espermatozides so liberados. O processo se inicia cerca de 20 segundos aps a fixao do espermatozide e se completa ao fim do primeiro minuto da fertilizao. Finalmente, uma quarta protena granular, a hialina, forma uma capa em volta do vulo (Hylander e Summers, 1982). A clula estende microvilosidades alongadas cujas extremidades se ligam a essa camada hialina, que fornece apoio para os blastmeros durante a clivagem. Em mamferos, a reao granular no cria um envoltrio de fertilizao, porm, o efeito o mesmo. Enzimas liberadas modificam os receptores de espermatozide da
144
Figura 4.23
(A)
(B)
Formao do envoltrio de fertilizao e remoo do excesso de espermatozide. Espermatozide foi adicionado a vulos de ourio-do-mar, e a suspenso foi fixada em formaldedo para evitar futuras reaes. (A) Dez segundos aps a adio de espermatozide, esses foram vistos rodeando o vulo. (B,C) 25 e 35 segundos aps a inseminao, um envoltrio de fertilizao se forma em volta do vulo, iniciado no ponto de entrada do espermatozide. (D) O envoltrio de fertilizao est completo, e o excesso de espermatozide removido. (de Vacquier e Payne, 1973, cortesia de V. D. Vacquier.)
(C)
(D)
zona pelcida de maneira que esses no mais podem ligar-se a espermatozide (Bleil e Wassarman, 1980). Essa modificao chamada reao da zona. Durante essa reao, tanto ZP3 como ZP2 so modificadas. Florman e Wassarman (1985), propuseram que os grnulos corticais do vulo do camundongo contm uma enzima que corta os resduos terminais de acares de ZP3, com isso liberando espermatozide ligado zona e evitando a fixao de mais espermatozide. Esses grnulos corticais contm N-acetilglicosaminidases capazes de clivar N-acetilglicosamina de cadeias de carboidrato de ZP3. Miller e colaboradores (1992, 1993) demonstraram que aps a fertilizao, o resduo de N-acetilglicosamina removido, ZP3 no serve como substrato para a ligao de galactosiltransferase. ZP2 cortada pelas proteases granulares perdendo tambm sua habilidade de ligar espermatozide (Moller e Wassarman, 1989). Assim, o espermatozide no pode mais iniciar ou manter sua ligao zona pelcida e rapidamente descartado.
CLCIO COMO O INICIADOR DA REAO GRANULAR CORTICAL . O meca-
nismo da reao dos grnulos corticais semelhante aquele da reao acrossmica. Aps a fertilizao, a concentrao intracelular de clcio do ovo aumenta muito. Nessas concentraes, as membranas corticais se fundem com aquelas do ovo, causando exocitose de seu contedo (veja Figura 4.24). Aps a fuso dos grnulos corticais ao redor do ponto de entrada do espermatozide, uma onda de exocitose se propaga ao redor do corte at o lado oposto do ovo. A liberao de clcio armazenado na regio intracelular, pode ser monitorada visualmente pelo uso de corantes luminescentes (isolados da gua-viva luminescente) como a aequorina ativado pelo clcio, ou de corantes como fura-2. Esses corantes emitem luz quando ligam ons livres de clcio. Os vulos so injetados com o corante e fecundados. A Prancha 12 mostra a notvel onda de liberao de clcio que se propaga atravs do vulo do ourio-do-mar; comeando no ponto de entrada do
145
Membrana plasmtica (i) do vulo Microvilosidade Envoltrio vitelnico
Figura 4.24
Grnulo cortical (ii) Espermatozide supranumerrio no envoltrio vitelnico
(B)
Enzimas proteolticas e mucopolissacardeos so liberados (iii)
(C)
Exocitose de grnulos corticais. (A) Diagrama esquemtico mostrando os eventos levando formao do envoltrio de fertilizao e a camada hialina. medida que os grnulos corticais sofrem exocitose, liberam proteases que cortam as protenas que ligam o envoltrio vitelnico membrana celular. Mucopolissacardeos liberados pelos grnulos formam um gradiente osmtico, causando a entrada de gua e tumefao do espao entre o envoltrio vitelnico e a membrana celular. Outras enzimas liberadas dos grnulos corticais endurecem o envoltrio vitelnico (agora o envoltrio de fertilizao) e liberam espermatozide a ele ligado. (B,C) Micrografias eletrnicas de transmisso e de varredura do crtex de um ovo no fertilizado de ourio-do-mar. (D, E) Micrografias eletrnicas de transmisso e varredura da mesma regio de um ovo recm-fertilizado, mostrando a elevao do envoltrio de fertilizao e os pontos nos quais os grnulos corticais fundiram com a membrana plasmtica do ovo (flechas em D). (A segundo Austin, 1965; B-E de Chandler e Heuser, 1979, cortesia de D. E. Chandler.)
Microfilamentos Hialina (D) Espermatozide liberado
(iv)
Envoltrio de fertilizao
Camada hialina (A)
Membrana celular (E)
espermatozide um feixe de luz atravessa a clula (Steinhardt et al., 1977; Gilkey et al., 1978; Hafner et al., 1988). Como documentado pelas fotografias, os ons de clcio no se difundem simplesmente atravs do vulo a partir do ponto da entrada do espermatozide. Ao contrrio, a liberao de clcio inicia-se de um lado da clula e termina do outro. O mecanismo dessa onda ser discutido logo adiante (veja Informaes adicionais & Especulaes, pgina 147). A total liberao de ons de clcio completada, a grosso modo, em 30 segundos no ovo do ourio-do-mar; os ons livres de clcio so re-seqestrados pouco aps sua liberao. Quando dois espermatozides entram no citoplasma do vulo, a liberao de clcio pode ser vista comeando em dois pontos separados da superfcie celular (Hafner et al., 1988). Vrios experimentos demonstraram que ons de clcio so responsveis diretos pela propagao da reao cortical e que so armazenados dentro do prprio vulo. A droga A23187 um ionforo que transporta ons de clcio atravs de membranas, permitindo a esses ctions atravessar barreiras antes impermeveis. A colocao de
146
ovos no-fertilizados de ourio-do-mar em gua do mar contendo A23187, leva reao granular cortical e elevao do envoltrio de fertilizao, mesmo na ausncia de ons de clcio na gua do mar. Portanto, A23187 provoca a liberao de ons de clcio j seqestrados em organelas dentro do vulo (Chambers et al., 1974; Steinhardt e Epel, 1974). Estudos posteriores (Hollinger e Schuetz, 1976; Fulton e Whittingham, 1978; Hamaguchi e Hiramoto, 1981; Kline, 1988) mostraram que o on de clcio inicia reaes granulares corticais quando injetado em ovos de ourio-domar, camundongo e r. Os ons de clcio internos so armazenados no retculo endoplasmtico do vulo (Eisen e Reynolds, 1985; Terasaki e Sardet, 1991). No ourio-do-mar e na r, cujos vulos sofrem uma reao granular cortical, esse retculo pronunciado no crtex e rodeia os grnulos (Figura 4.25; Gardiner e Grey, 1983; Luttmer e Longo, 1985). Na r Xenopus, o retculo endoplasmtico cortical fica 10 vezes mais abundante durante o amadurecimento do vulo e desaparece localmente dentro de um minuto aps a ocorrncia da onda de exocitose em qualquer regio do crtex. Jaffe (1983) compara esse retculo endoplasmtico seqestrador de clcio, ao retculo sarcoplasmtico do msculo esqueltico ou cardaco. Uma vez iniciada, a liberao de clcio autopropagada. Clcio livre capaz de liberar clcio seqestrado de seus locais de armazenamento, causando assim uma onda libertadora do on clcio e exocitose granular cortical. Variaes em estratgias preventivas da polispermia existem em toda a natureza. Nos mamferos, a polispermia minimizada pelo pequeno nmero de espermatozides que atingem o local da fecundao (Braden e Austin, 1954). O bloqueio polispermia em hamsters parece ser controlado somente pela liberao de stios que ligam o espermatozide na zona pelcida (Miyazaki e Igusa, 1981; Jaffe e Gould, 1985). Coelhos, no entanto, se apoiam num bloqueio da polispermia a nvel da membrana, e ningum iria disputar o seu grau de sucesso. Finalmente, certos mamferos tm defesas para a polispermia sobre as quais pouco sabemos. Nos vulos ricos em gema de certas aves, rpteis e salamandras, vrios espermatozides realmente penetram o citoplasma do vulo. De uma maneira desconhecida, todos menos um so induzidos a se desintegrar no citoplasma aps a fuso do proncleo do vulo com um dos proncleos do espermatozide (Ginzburg, 1985; Elinson, 1986). Qualquer que seja o mecanismo, somente um ncleo haplide de espermatozide pode fundir-se com o ncleo haplide do vulo.
Figura 4.25
Retculo endoplasmtico rodeando grnulo cortical no vulo de ourio-do-mar. (A) O retculo foi corado com smio-iodeto de zinco para permitir a visualizao por micrografia de transmisso eletrnica. O grnulo visto rodeado pelo retculo. (B) Retrato de um vulo inteiro corado por anticorpos fluorescentes para os canais de liberao de clcio. Os anticorpos mostram esses canais no retculo endoplasmtico cortical. (A de Luttmer e Longo, 1985, cortesia de S. Luttmer; B de McPherson et al., 1992, cortesia de F. J. Longo.)
(A)
(B)
147
&
Especulaes
A Ativao do Metabolismo dos Gametas
e a liberao do on clcio necessria para ativao do ocito, como o espermatozide motiva essa liberao? Realmente no se sabe. Como se pronunciou um investigador (Berridge, 1993): Exatamente como o espermatozide dispara o processo explosivo da liberao do clcio no vulo, ainda permanece algo misterioso. Dados recentes sugerem que produo do inositol 1,4,5, trifosfato (IP3) o evento primrio para a liberao de ons clcio do seu local de armazenamento intracelular. IP3 injetado pode liberar ons clcio seqestrados no vulo e muitos outros tipos de clulas (Swann e Whitaker, 1986; Berridge, 1993); o aumento na concentrao de IP 3 intracelular visto ocorrer dentro de 10 segundos aps a fecundao de ovos do ourio-do-mar (Ciapa e Whitaker, 1986). A libertao de ons clcio e a reao dos grnulos corticais rapidamente seguem a formao ou injeo de IP3 (Whitaker e Irvine, 1984; Busa et al., 1985). Os efeitos mediados por IP3 podem ser abortados pela pr-injeo de agentes quelantes de clcio no vulo (Turner et al., 1986), confirmando que IP3 estimula a liberao de clcio armazenado. Canais de clcio respondendo ao IP3 foram encontrados no retculo endoplasmtico do vulo. O IP3 formado no local da entrada do espermatozide considerado ligar-se a esses receptores de IP3 no retculo endoplasmtico, ocasionando uma liberao local de clcio (Ferris et al., 1989; Furuichi et al., 1989; Terasaki e Sardet, 1991). Uma vez liberados, os ons de clcio podem difundir diretamente, ou facilitar a liberao de mais ons de clcio de receptores sensveis ao clcio localizados no retculo endoplasmtico (McPherson et al., 1992). A ligao de ons de clcio a esses receptores libera mais clcio, e esse pode continuar a onda, ligando-se a mais receptores e assim por diante. Mohri e colaboradores (1995) mostraram que o clcio liberado por IP3 necessrio e suficiente para liberao de clcio. Essa onda de ons de clcio propagada por
toda clula, comeando no ponto da entrada do espermatozide; os grnulos corticais se fundem com a membrana celular na presena de concentraes altas de clcio, respondem com uma onda de exocitose que segue os ons de clcio. IP 3 tambm capaz de liberar ons de clcio em vulos de vertebrados, e o bloqueio do seu receptor em vulos de hamster impede a liberao de clcio no ato da fertilizao. Como em ourio-domar IP3 tambm parece mediar a liberao de clcio de stios no retculo endoplasmtico (Lechleiter e Clapham, 1992; Miyazaki et al., 1992; Ayabe et al., 1995). Xu e colaboradores (1994) mostraram que o bloqueio da mediao por IP3 da sada de clcio, impede todos os aspectos da ativao do vulo pelo espermatozide incluindo exocitose granular, recrutamento de mRNA e recomeo do ciclo celular. A questo ento : o que inicia a produo de IP3? H dois caminhos que parecem estimular a liberao de clcio: aquele do receptor ligado protena G, largamente conhecido como liberadora de ons de clcio na contrao muscular, crescimento celular, secreo hormonal, percepo sensorial e liberao de neurotransmissores (Berridge, 1993). O outro caminho o do receptor da tirosinoquinase em cascata, que tambm usado na proliferao e diferenciao celular. Conforme apresentado no Captulo 3, o primeiro caminho se inicia pela ligao de um ligante extracelular (como a acetilcolina ou a serotonina) uma protena receptora transmembrana. No interior da membrana plasmtica esse receptor ligado protena trimrica G. Esse receptor ativa a protena G (veja Figuras 3.33 e 3.35), levando sua dissociao em subunidades, capazes de ativar um conjunto de enzimas chamadas de fosfolipase C. Essa cataliza a hidrlise de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) em dois segundos mensageiros: inositol 1,4,5 trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). O primeiro capaz de abrir canais de clcio. DAG estimula a troca de prtons que permite o efluxo de ons de hidrog-
nio das clulas. O resultado disso a elevao de clcio e do pH intracelulares. O outro segundo mensageiro, DAG, considerado ativar a protena quinase C (PKC) da membrana, que transferida do citosol para a membrana plasmtica do ovo pouco aps a fecundao, e pode ser responsvel pela ativao da protena que troca ons de sdio por ons de hidrognio (Swann e Whitaker, 1986; Nishizuka, 1986; Shen e Burgart, 1986; Olds et al., 1995). O bloqueio da PKC em vulos de ourios-do-mar inibe a alcalinizao do citosol observada durante a fertilizao normal (Shen e Buck, 1990). A protena que faz a troca Na + /H+, tambm necessita de ons clcio para sua atividade. Assim, tanto DAG como IP 3 esto envolvidos nas ativao do vulo. A etapa regulatria chave a ativao da fosfolipase C, que produz esses dois compostos. Jaffe e seus colaboradores encontraram a protena G em vulos de ourio-do-mar e r; e quando injetaram ativadores da protena G nesses vulos, causaram exocitose granular na ausncia de espermatozide (Turner et al., 1986; Kline et al., 1991). Tal ativao foi inibida por quelantes de clcio, como o EGTA. [fert8.html] Parece, portanto, que uma protena G pode estar envolvida na regulao de ons seqestrados de clcio, e na exocitose de grnulos corticais. Existem vrias maneiras pelas quais isso pode acontecer. Em primeiro lugar, a ligao do espermatozide a um receptor na membrana celular do vulo pode mudar a sua conformao de modo a ativar a protena G e iniciar a cascata (Figura 4.26A), conforme demonstrado por Kline e colaboradores (1988, 1991). Eles levantaram a hiptese que se essa protena mediar a fertilizao por ser ativada por um receptor ligante de espermatozide, ento a mesma protena G poderia ser ativada por um neurotransmissor se o ovo contiver um receptor para neurotransmissor capaz de ativar a protena G. Eles injetaram mRNA para o receptor de serotonina ou de acetilcolina em vulos de r. Esses receptores da superfcie
148
celular foram sintetizados e foram detectados na membrana celular do vulo. Os vulos puderam ser fertilizados por serotonina e acetilcolina e foi observado a reao cortical. Experimentos semelhantes mostraram que quando neurotransmissores ativam o caminho da protena GIP3 em ocitos de camundongo, so induzidos os eventos da fertilizao (Williams et al., 1992; Moore et al., 1993).
Entretanto, a cascata ligada protena-G no o nico caminho capaz de gerar IP3 (veja Captulo 3). Evidncias recentes (Moore et al., 1994; Shilling et al., 1994; Yim et al., 1994) demonstram que a ativao do receptor da tirosinoquinase tambm produz IP3 e ativa a onda de clcio e a reao granular cortical (Figura 4.26b). Quando o mRNA para o receptor dessa quinase (o receptor para o fator de crescimento derivado das plaquetas,
Figura 4.26
PDGF) foi injetado em ocitos de estrela-do-mar, o receptor PDGF foi sintetizado e incorporado nas membranas celulares desse organismo. Quando, aps a maturao dos ocitos, PDGF foi adicionado gua banhando os vulos, esses apresentaram aumento de clcio intracelular livre, exocitose de grnulos corticais e sntese de DNA. Alguns se desenvolveram em larvas. Quando o mRNA continha um ponto de mutao que impedia
Mecanismos possveis da ativao do vulo. (A) Trajetria do fosfatidilinositol mediado pela G-protena. (B) Trajetria do receptor da tirosinoquinase (RTK). (C) Trajetria da tirosinoquinase citoplasmtica. (D) Trajetria na qual a G protena ou tirosinoquinase ativadas na membrana espermtica ativam trajetrias no vulo. (E) Trajetrias de ativadores solveis.
CAMINHOS ANTERIORES FUSO DO ESPERMATOZIDE (A) Espermatozide (B) (C)
Fosfolipase C (PLC)
Receptor G-protena Receptor de Tirosinoquinase Receptor de IP3 Tirosinoquinase
Retculo endoplasmtico APS A FUSO DO ESPERMATOZIDE (D)
Fator solvel do vulo
Fatores solveis do Espermatozide
G-protena
Receptor de IP3
Retculo endoplasmtico
149
o receptor interagir com a fosfolipase C, nenhuma dessas reaes ocorreu (Shilling et al., 1994). Assim, tanto o caminho ligado ao receptor protena-G como aquele do receptor da tirosinoquinase, parecem ser capazes de ativar essa fosfolipase, criar IP3 e induzir o fluxo de clcio no vulo. O receptor da bindina no oferece pistas para explicar como ocorre essa ativao, por no ter semelhante em outras protenas transmembrana. No entanto, 5 segundos aps ligar a bindina, fica fosforilado em um dos seus resduos tirosina citoplasmticos (Abassi e Foltz, 1994). Isso sugere que o receptor de bindina ligado, pode interagir com a tirosinoquinase plasmtica tal como aqueles que medeiam a liberao de clcio durante a ativao de clulas T (Figura 4.26 C; Hall et al., 1993).
Outra possibilidade que a ativao do caminho do IP3 no devida ligao do espermatozide e vulo, mas fuso das membranas do vulo e do espermatozide. Mc Culloch e Chambers (1992) obtiveram evidncia eletrofisiolgica que a ativao dos vulos do ourio-do-mar no ocorre at depois da juno do espermatozide com o vulo. Eles sugerem que os componentes ativadores do vulo se localizam na membrana ou no citoplasma do espermatozide. at mesmo possvel que por ocasio da fuso das membranas, as protenas G da membrana espermtica ou as tirosinoquinases (ativadas pela gelia do vulo para iniciar a reao acrossmica) ativem a cascata polifosfoinositdica para liberao de clcio do vulo. (No cenrio apresentado na Fi-
gura 4.26 D, a bindina meramente liga o vulo ou, talvez, motive a fosforilao de protenas necessrias em fases mais avanadas do desenvolvimento.) Ainda outra possibilidade que o agente ativo na liberao de clcio ligado venha do citosol do espermatozide. Parrington e colaboradores (1996) isolaram uma protena de 33-kDA, chamada oscilina, localizada no escasso citoplasma da cabea do espermatozide (Figura 4.26 E). A microinjeo dessa protena em vulos de camundongo pode iniciar liberao de clcio, porm, os outros parmetros da ativao do vulo (exocitose dos grnulos, recrutamento de mRNA e retomada do ciclo celular) no so observados. No conhecido qual o papel que essa protena pode ter na fisiologia da ativao do vulo.
Ativao do metabolismo do vulo

Embora a fertilizao seja freqentemente descrita como mero meio de juno de dois ncleos haplides, ela tem um papel igualmente importante na iniciao de processos que iniciam o desenvolvimento. Esses eventos acontecem no citoplasma e ocorrem sem o envolvimento dos ncleos.* O vulo do ourio-do-mar maduro uma clula metabolicamente lenta, reativada pelo espermatozide. Essa ativao apenas o estmulo; aciona um conjunto de eventos metablicos pr-programados. As respostas do vulo ao espermatozide podem ser divididas em precoces que ocorrem em poucos segundos aps a reao cortical e tardias que acontecem vrios minutos aps o inicio da fertilizao (Tabela 4.1). Respostas precoces O contato entre o espermatozide do ourio-do-mar ativa dois principais bloqueios polispermia: o bloqueio rpido, iniciado pelo influxo de sdio na clula, e o bloqueio lento, iniciado pela liberao intracelular de ons de clcio. A ativao de todos os vulos parece depender do aumento da concentrao de ons livres de clcio dentro do vulo. Em protostomatas, como lesmas e vermes, ao menos parte do clcio geralmente entra no vulo vindo de fora. Em deuterostomatas, tais como: peixes, rs, ourios-do-mar e mamferos, a ativao acompanhada pela liberao de ons de clcio do retculo endoplasmtico, resultando na onda de clcio varrendo o vulo (Jaffe, 1983; Terasaki e Sardet, 1991).
*Em certas salamandras, essa funo desenvolvimental da fertilizao est totalmente divorciada da funo gentica. A salamandra prateada (Ambystoma platineum) uma espcie hbrida que consiste somente de fmeas. Cada uma produz um ovo com um nmero no-reduzido de cromossomos. Esse ovo, porm, no pode se desenvolver sozinho; assim, a salamandra prateada copula com o macho da salamandra Jefferson (A. jeffersonianum). O espermatozide desse macho somente estimula o desenvolvimento do ovo; no contribui com material gentico (Uzzell, 1964). Para detalhes desse complexo mecanismo de procriao veja Bogart et al., 1989.
150
Tabela 4.1
Evento
Eventos da fertilizao do ourio-do-mar

aproximado Tempo aproximado aps a inseminaoa
Ligao espermatozide-vulo Elevao do potencial de fertilizao (bloqueio rpido da polispermia) Fuso das membranas espermatozide-vulo Primeira deteco de aumento de clcio Exocitose das vesculas corticais (bloqueio lento da polispermia) Ativao da NAD quinase Aumento de NADH e NADPH Aumento do consumo de O2 Entrada do espermatozide Efluxo de cido Aumento de pH (permanece alto) Descondensao da cromatina do espermatozide Migrao do ncleo do espermatozide para o centro do vulo Migrao do ncleo do vulo para o ncleo do espermatozide Ativao da sntese protica Ativao do transporte de aminocidos Iniciao da sntese de DNA Mitose Primeira clivagem
O segundos dentro de 1 sec dentro de 6 sec 6 sec 15-60 sec comea em 1 min comea em 1 min comea em 1 min 1-2 min 1-5 min 1- 5 min 2-12 min 2-12 min 5-10 min comea em 5-10 min comea em 5-10 min 20-40 min 60-80 min 85- 95 min
Principais fontes: Whitaker e Steinhardt, 1985; Mohri et al., 1995. a Tempos aproximados baseados em dados de S. purpuratus (15-17oC), L. pictus (16-18oC), A . punctulata (18-20oC) e L. variegatus (22-24oC). A contagem de tempo para os eventos dentro do primeiro minuto melhor conhecida para Lytechinius variegatus, assim os tempos apresentados referem-se essa espcie.
Essa liberao de clcio essencial para a ativao do desenvolvimento do embrio. Se o quelante de clcio EGTA for injetado no vulo do ourio-do-mar, no ocorre exocitose dos grnulos corticais, mudana do potencial da fertilizao, descondensao do espermatozide, nem reincio da diviso celular (Kline, 1988). Reciprocamente, vulos podem ser ativados artificialmente na ausncia de espermatozide por procedimentos que liberam clcio livre no ocito. Steinhardt e Epel (1974) acharam que quantidades micromolares do ionforo A23187 induzem no vulo a maioria das respostas caractersticas de um ovo fertilizado normalmente. A elevao do envoltrio de fertilizao, o aumento do pH intracelular, o surto de utilizao de oxignio e o aumento da sntese de protena e DNA so todos gerados com sua seqncia prpria. Essa ativao acontece na ausncia total de ons de clcio na gua do mar. Na maioria desses casos, o desenvolvimento cessa antes da primeira mitose porque os ovos ainda so haplides e desprovidos do centrolo espermtico necessrio para a diviso. Essa liberao de clcio ativa uma srie de reaes metablicas (Figura 4.27). Uma delas a ativao da enzima NAD+ quinase, que converte o NAD+ em NADP+ (Epel et al., 1981). Essa mudana pode ter importantes conseqncias para o metabolismo lipdico, pois NADP+ (mas no o NAD+) pode ser utilizado como coenzima para biossntese lipdica. Assim, a mudana de NAD+ em NADP+ pode ser importante na construo de novas membranas exigidas durante a clivagem. Outro efeito dessa mudana se refere ao consumo de oxignio. Um surto de reduo de oxignio visto ocorrer durante a fertilizao, e muito desse surto respiratrio usado para cruzamento ligado da membrana de fertilizao. A enzima responsvel por essa reduo do oxignio (para gua oxigenada) tambm dependente de NADPH (Heinecke e Shapiro, 1989). Por ltimo, o NADPH ajuda na regenerao da glutationa e de ovotiois (ovothiols) que podem ser cruciais para remoo de radicais livres que poderiam de outra maneira prejudicar o DNA do ovo e do embrio precoce (Mead e Epel, 1995).
151
Influxo de Na+
Alterao do potencial da membrana
Bloqueio rpido da polispermia
Ativao da NAD+ quinase Ligao e/ou fuso de espermatozide membrana celular do vulo
Converso de NAD+ em NADP+ Bloqueio lento da polispermia Formao da camada hialina
Produo de IP3 Ativao de fosfolipase C
Liberao de Ca2+
Exocitose de grnulos corticais
Estimulao de protena G ou de tirosinoquinase?
Produo de diacil-glicerol
Ativao de proteno-quinase C
Estimulao de sntese protica, replicao de DNA, e movimentos citoplasmticos de material morfogentico
Figura 4.27
Troca Na+/H+
Modelo de um possvel mecanismo de ativao do vulo do ourio-do-mar. (Segundo Epel, 1980 e L. A. Jaffe, comunicao pessoal.)
Aumento do pH intracelular
Respostas tardias Pouco tempo aps o aumento dos nveis de ons clcio, o pH intracelular tambm aumenta. Acredita-se que essas duas condies inicas (> [Ca2+], < [H+] ajam em conjunto para fornecer o espectro completo dos eventos da fertilizao, incluindo a sntese de protenas e de DNA (Winkler et al., 1980; Whitaker e Steinhardt, 1982). O aumento do pH intracelular comea com o segundo influxo de ons de sdio, causando uma troca 1:1 entre ons de sdio da gua do mar e os ons hidrognio do vulo*. Essa perda de hidrognio faz o pH elevar-se de 6.8 a 7.2, ocasionando enormes mudanas na fisiologia do ovo (Shen e Steinhardt, 1978). As respostas tardias da fertilizao produzidas por essas alteraes inicas, incluem a ativao da sntese de DNA e da protena. O surto de sntese de protena ocorre vrios minutos aps a entrada do espermatozide e no depende da sntese de novo RNA mensageiro (Figura 4.28). Em seu lugar, a sntese de protena nova utiliza mRNAs j presentes no citoplasma do ocito (muito mais sobre isso ser mencionado no Captulo 12). Esses RNAs incluem aqueles que codificam protenas como histonas, tubulinas, actinas e fatores morfogenticos que so utilizados durante o desenvolvimento precoce. Tal surto de sntese protica pode ser induzido pelo aumento artificial do pH citoplasmtico por ons amnio (Winkler et al., 1980). Reciprocamente, agentes que bloqueiam o aumento do pH inibem eventos da fertilizao tardia como a sntese de DNA e protena. Quando ovos recm-fertilizados so colocados em solues contendo baixas concentraes de ons de sdio e amiloride (uma droga que inibe a troca Na+/H+), a sntese protica falha, os movimentos dos proncleos do vulo e do espermatozide so prevenidos, e a diviso celular no ocorre (Dube et al., 1985).
*Novamente, a variao espcie-para-espcie est solta. No vulo muito menor do camundongo, no h elevao do pH aps a fertilizao. Similarmente no camundongo, no h um aumento dramtico na sntese protica imediatamente em seguida fertilizao.
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Figura 4.28
Surto de sntese protica na fertilizao emprega mRNA armazenado no citoplasma do ocito. (A) Sntese protica em vulos do ourio-do-mar Arbacia punctulata fertilizada na presena ou ausncia de actinomicina D, um inibidor da transcrio. Durante as primeiras horas, a sntese protica ocorre sem nova transcrio dos ncleos do zigoto ou embrio. Um segundo surto de sntese protica ocorre durante os estgios medianos de blstula, e isso representa traduo de mensagens recm-transcritas (e, portanto, no visto em embries crescendo em actinomicina). (B) Aumento na porcentagem de ribossomos recrutados para polissomos durante as primeiras horas do desenvolvimento do ourio-do-mar, especialmente durante o primeiro ciclo celular. (A segundo Gross et al., 1964; B segundo Humphreys, 1971.)
Incorporao de valina[14C] na protena/mg protena (cpm x 10-3)
gua do mar normal
gua do mar tratada por actinomicina
Horas aps a fertilizao
Porcentagem de ribossomos em polissomos
Tempo de desenvolvimento (horas)
Fuso do material gentico

Em ourios-do-mar, o ncleo do espermatozide penetra o vulo perpendicularmente superficie do vulo. Aps a fuso das membranas do espermatozide e do vulo, o ncleo do espermatozide e seu centrolo se separam das mitocndrias e do flagelo. A mitocndria e o flagelo se desintegram dentro do vulo; assim, poucas, se tanto, mitocndrias derivadas do espermatozide so encontradas em organismos em desenvolvimento ou em adultos (Dawid e Blackler, 1972; Giles et al., 1980). Em camundongos estima-se que 1 em cada 10.000 mitocndrias so derivadas do espermatozide (Gyllensten et al., 1991). Assim, embora cada gameta contribua para o zigoto com um genoma haplide, o genoma mitocondrial transmitido principalmente pelo parente materno. Reciprocamente, em quase todos os animais estudados (o camundongo sendo a principal exceo), o centrossomo necessrio para a produo do fuso mittico das divises subseqentes derivado do centrolo espermtico (Sluder et al., 1989, 1993). O ncleo do vulo sendo haplide chamado de proncleo feminino. Dentro do citoplasma do vulo, o ncleo do espermatozide descondensa para formar o proncleo masculino. Uma vez dentro do vulo, o proncleo masculino sofre uma dramtica transformao. O envoltrio pronuclear forma vesculas com pequenos pacotes, expondo, com isso, a compacta cromatina do espermatozide ao citoplasma do vulo (Longo e Kunkle, 1978). As protenas que prendem a cromatina no seu estado condensado, inativa, so trocadas por protenas derivadas do citoplasma do vulo. Essa troca permite a descondensao da cromatina do espermatozide. Em ourios-do-mar, a descondensao parece ser iniciada pela fosforilao de duas
153
(A)
(B)
Proncleo do vulo
Ponte internuclear
Tempo (seg)
Proncleo do espermatozide
Figura 4.29
histonas espermatozide-especficas, que se ligam fortemente ao DNA. Esse processo comea quando o espermatozide entra em contato com uma glicoprotena na gelia do vulo que eleva o nvel da atividade proteinoquinase cAMP-dependente. (Tais proteino-quinases cAMP-dependentes foram mencionadas no Captulo 1.) Essas quinases fosforilam vrios resduos bsicos das histonas espermatozideespecficas interferindo, desse modo, com sua ligao ao DNA (Garbers et al., 1980, 1983; Porter e Vacquier, 1986). Esse afrouxamento considerado facilitar a substituio das histonas espermatozide-especficas por outras histonas que haviam sido estocadas no citoplasma do ocito (Poccia et al., 1981; Green e Poccia, 1985). Uma vez descondensado, o DNA pode iniciar a transcrio e a replicao. [fert9.html] Depois que o espermatozide do ourio-do-mar entra no citoplasma do vulo, o proncleo masculino gira 180o fazendo com que o centrolo fique entre o proncleo do espermatozide e o proncleo do vulo. Em seguida, o centrolo espermtico age como um centro organizador de microtbulos, estendendo seus prprios microtbulos e integrando-os com os microtbulos do vulo formando um ster*. Esses microtbulos se estendem atravs de todo o vulo, contatam o proncleo feminino, e trazem os dois proncleos um para perto do outro (Hamaguchi e Hiramoto, 1980; Bestor e Schatten, 1981). A fuso forma o ncleo zigtico diplide (Figura 4.19). A iniciao da sntese de DNA pode ocorrer no estgio pronuclear (durante a migrao) ou depois da formao do ncleo zigtico. Em mamferos, o processo da migrao pronuclear dura aproximadamente 12 horas, comparado com menos de uma hora no ourio-do-mar. O espermatozide do mamfero entra quase tangencialmente superfcie do vulo em vez de aproxim-la perpendicularmente, e funde com numerosas microvilosidades (veja Figura 4.20). O ncleo do espermatozide mamfero tambm se parte quando sua cromatina descondensa, sendo depois reconstrudo por vesculas coalescentes. O DNA do ncleo espermtico ligado por protenas bsicas chamadas protaminas; essas protenas nucleares esto firmemente compactadas atravs de ligaes dissulfeto. Uma vez no vulo, a glutationa reduz essas ligaes de dissulfeto, permitindo o desdobramento da cromatina do espermatozide (Calvin e Bedford, 1971; Kvist et
Eventos nucleares na fertilizao do ouriodo-mar. (A) Migrao dos proncleos do vulo e do espermatozide em um ovo de Clypeaster japonicus. O proncleo do espermatozide est rodeado por microtbulos do seu ster. (B) Fuso de proncleos no ovo do ourio-do-mar. (A de Hamaguchi e Hiramoto, 1980, cortesia dos autores; B cortesia de F. J. Longo.)
*Quando Oskar Hertwig observou esse arranjo radial de steres de espermatozide no seu recm-fertilizado ovo de ourio-do-mar, chamou-o de sol dentro do ovo, e considerou-o feliz indicao de uma fertilizao bem-sucedida (Hertwig, 1877). Mais recentemente, Simerly e colaboradores (1994) descobriram que certos tipos de infertilidade em homens eram devidos a defeitos na capacidade do centrossoma formar esses steres microtubulares. Essa deficincia causa a falncia da migrao pronuclear e a interrupo do desenvolvimento.
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(A)
(B)
(C)
Figura 4.30
Movimento pronuclear em hamster. (A) Entrada de espermatozide na clula e tumefao do proncleo do espermatozide. (B) Aposio dos proncleos do espermatozide e do vulo. (C ) Estgio bicelular mostrando duas clulas de tamanhos iguais com ncleos bem definidos. Entulho no espao perivitelnico so os corpos polares em degenerao. (de Bavister, 1980, cortesia de B. D. Bavister.)
al., 1980). O proncleo masculino dos mamferos aumenta enquanto o ncleo do ocito completa sua segunda diviso meitica (Figura 4.30 A). O centrossomo que acompanha o proncleo masculino produz seus steres (principalmente a partir de protenas armazenadas no ocito) e contata o proncleo feminino. Ento, cada proncleo migra ao encontro do outro, replicando seu DNA ao longo do trajeto. No encontro, os dois envoltrios nucleares se desintegram (Figura 4.30B). No entanto, em lugar de produzir um ncleo zigtico comum (como acontece na fertilizao do ourio-do-mar), a cromatina condensa-se para formar cromossomos que se orientam num fuso mittico comum. Assim, um ncleo zigtico verdadeiro em mamferos visto primeiro no no zigoto, mas no estgio bicelular (Figura 4.30 C). [fert10.html]
&
Especulaes
A No-Equivalncia dos Proncleos de Mamferos
ERALMENTE ASSUME-SE que machos e fmeas portam genomas haplides equivalentes. Um dos princpios fundamentais da gentica Mendeliana que os genes derivados do espermatozide so funcionalmente equivalentes aqueles derivados do vulo. No entanto, estudos recentes mostram que em mamferos o genoma derivado do vulo pode ser funcionalmente diferente e ter papel complementar durante certos estgios do desenvolvimento. A primeira evidncia dessa no-equivalncia veio de estudos de um tumor humano chamado mola hidatidiforme. Esses tumores parecem tecido placentrio. A maioria dessas molas se desenvolve de um espermatozide haplide ferti-
lizando um vulo no qual o proncleo feminino est ausente. Aps penetrar no vulo, os cromossomos do espermatozide se duplicam restaurando seu nmero diplide. Assim, todo o genoma derivado do espermatozide (Jacobs et al., 1980; Ohama et al., 1981). Aqui vemos uma situao em que as clulas sobrevivem, se dividem e tm um nmero normal de cromossomos, porm, apresentam um desenvolvimento anormal. Em vez de formar um embrio, o ovo se transforma numa massa de clulas placentosmiles. No h desenvolvimento normal quando o genoma inteiro vem do parente masculino. Evidncia para a no-equivalncia dos proncleos mamferos vem tambm de tentativas de conseguir que
vulos se desenvolvam na ausncia de espermatozide. A habilidade de desenvolver um embrio sem contribuio espermtica chamada partenognese (do grego, significando nascimento virgem). Os vulos de muitos invertebrados e de alguns vertebrados so capazes de se desenvolver normalmente na ausncia do espermatozide se o vulo for ativado artificialmente. Nessas situaes, a contribuio do espermatozide para o desenvolvimento parece dispensvel. Os mamferos, no entanto, no apresentam a partenognese. A colocao de ocitos de camundongo em um meio de cultura que artificialmente ativa o ocito, ao mesmo tempo suprimindo a formao do segundo corpo polar, produz
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ovos diplides de camundongo cuja herana deriva somente do vulo (Kaufman et al., 1977). Essas clulas se dividem para formar embries com medula espinhal, msculos, esqueleto e rgos, incluindo coraes latejantes. Porm, o desenvolvimento no continua e no dia 10 ou 11 (metade do tempo da gestao), observam-se profundas diferenas entre os embries normais e os partenogenticos, esses deteriorando e ficando grosseiramente desorganizados (Figura 4.31). Nem no homem nem no camundongo o desenvolvimento pode ser completado com cromossomos derivados somente do vulo. A hiptese que proncleos masculinos e femininos so diferentes, tambm ganha apoio de experimentos de transplante pronuclear (Surani e Barton, 1983; Surani et al., 1986; McGrath e Solter, 1984). Proncleos recm-fertilizados de machos ou fmeas podem ser removidos e adicionados a outros ovos recm-fertilizados. (Os dois proncleos podem ser diferenciados nesse estgio, porque o feminino fica debaixo dos corpos polares.) Assim, podem ser construdos zigotos com dois proncleos masculinos ou dois femininos. Embora ocorra a clivagem embrionria, nenhum desse tipos de ovos
Tabela 4.2 Experimentos de transplantes pronucleares

Classe de zigotos reconstrudos Operao Nmero de transplantes bem-sucedidos Nmero de sobrevivente
Bimaternal Bipaternal Controles Fonte: McGrath e Solter, 1984.
339 328 348
0 0 18
se desenvolvem at o nascimento, ao passo que alguns ovos controle (contendo um proncleo masculino e um feminino de zigotos diferentes) que sofreram tal transplante se desenvolvem normalmente (Tabela 4.20). Ainda mais, os embries bimaternos ou bipaternos cessam o desenvolvimento ao mesmo tempo que camundongos partenogenticos. Portanto, embora os dois proncleos sejam equivalentes em muitos animais, nos mamferos existem importantes diferenas funcionais entre eles. A razo para essas mortes embrionrias que em algumas clulas somente o alelo de certos genes derivado da me ativo, enquanto em outras clu-
Figura 4.31 (A) Embries controle e (B) partenogenticos (dois proncleos femininos) de camundongos no 11 o dia de gestao. Os camundongos estavam se desenvolvendo na mesma fmea. Alm de serem menores e em deteriorao, os embries partenogenticos tambm tinham placentas muito menores. (de Surani e Barton, 1983, cortesia dos autores.)
las somente o alelo de genes derivado paternalmente funcional. (Na maioria dos genes, naturalmente, os alelos derivados do macho e da fmea so equivalentes e so ativados no mesmo grau em cada clula. Aqui estamos tratando de excees a essa regra Mendeliana.) Por exemplo, o fator de crescimento insulina-smile II (IGF-II) promove o crescimento de rgos embrionrios e fetais. Em embries de camundongos, o alelo de IGF-II derivado paternalmente ativo em todo o embrio, ao passo que o alelo derivado maternalmente em geral inativo (exceto em algumas clulas neurais). Assim, se um camundongo herda um alelo mutante IGF-II de sua me, ir se desenvolver at o tamanho normal (j que o alelo derivado maternalmente no expresso); porm, se o mesmo alelo mutante for herdado do pai, o camundongo ter crescimento prejudicado (DeChiara et al., 1991). O padro oposto de expresso allica se encontra para um dos receptores de IGF-II. Aqui, o gene paterno para o receptor mal transcrito, enquanto o alelo materno ativo (Barlow et al., 1991). As diferenas entre os alelos ativos e inativos so consideradas ser causadas por modificaes do DNA que ocorrem de maneira diferente nos ncleos do vulo e do espermatozide (sero discutidos posteriormente no Captulo 11). Como certos genes importantes para o desenvolvimento somente so ativos quando provindos do espermatozide e outros tais genes s so ativos quando vm do vulo, tanto proncleos maternos como paternos so necessrios para o desenvolvimento completo dos mamferos.
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Rearranjo do citoplasma do vulo

A fertilizao pode iniciar deslocamentos radicais nos materiais citoplasmticos do vulo. Esses rearranjos do citoplasma do ocito so muitas vezes cruciais para a diferenciao nas etapas seguintes do desenvolvimento. Como veremos nos captulos 13 e 14, o citoplasma do vulo freqentemente contm determinantes morfogenticos que ficam segregados em clulas especficas durante a clivagem. Esse determinantes, em ltima anlise, conduzem ativao ou represso de genes especficos conferindo, dessa maneira, certas propriedades s clulas que os incorporam. O arranjo espacial correto desses determinantes crucial para o desenvolvimento adequado. Em algumas espcies, esse rearranjo na orientao pode ser visualizado pela presena de grnulos pigmentados citoplasmticos. Um exemplo o vulo do tunicado Styela partita (Conklin, 1905). O ovo no-fertilizado desse animal est apresentado na Figura 4.32A. Um citoplasma cinzento central est envolvido por uma camada cortical contendo incluses lipdicas amarelas. Durante a meiose, a desintegrao nuclear libera uma substncia clara que se acumula no hemisfrio animal (superior) do vulo. Dentro de 5 minutos aps a entrada do espermatozide, o citoplasma interno claro e o cortical amarelo migram para o hemisfrio vegetal (inferior) do vulo. Quando o proncleo masculino migra do plo vegetal para o equador da clula, ao longo do futuro lado posterior do embrio, as incluses lipdicas migram com ele. Essa migrao forma um crescente amarelo, que se estende do plo vegetal ao equador (Figura 4.32B), trazendo o citoplasma amarelo para a rea onde mais tarde clulas musculares iro se formar na larva tunicada. O movimento dessas regies citoplasmticas depende de microtbulos que so gerados pelo centrolo e por uma onda de ons de clcio que contraem o citoplasma do plo animal (Sawada e Schatten, 1989; Speksnijder et al., 1990; Roegiers et al., 1995). Movimento citoplasmtico tambm visto em vulos de anfbios. Na r, um nico espermatozide pode entrar em qualquer lugar do hemisfrio animal; quando o faz, altera o padro citoplasmtico do vulo. Originalmente, o vulo radialmente simtrico em torno do eixo animal-vegetal. Aps a entrada do espermatozide, porm, o citoplasma cortical (externo) se desloca cerca de 30 relativos ao citoplasma interno, em direo ao ponto de entrada do espermatozide (Manes e Elinson, 1980; Vincent et al., 1986). Em algumas rs (como Rana), uma regio do vulo que antes estava coberta pelo citoplasma cortical escuro do hemisfrio animal fica agora exposta (Figura 4.33). Esse citoplasma subjacente, localizado perto do equador, no lado oposto do ponto de entrada do espermatozide, contm grnulos pigmentados difusos e, por isso, tem aparncia cinzenta. Essa regio tem sido referida como o crescente cinzento (Roux, 1987; Ancel e Vintenberger, 1948). Como veremos em captulos subseqentes, o crescente cinzento demarca a regio onde se iniciar a gastrulao em embries de anfbios.
Figura 4.32
Rearranjo citoplasmtico no vulo do tunicado Styela partita. (A) Antes da fertilizao, citoplasma cortical amarelo rodeia citoplasma cinzento, tipo gema. (B) Aps a entrada do espermatozide, o citoplasma cortical amarelo e o citoplasma claro derivado da degradao do ncleo do ocito escorrem vegetativamente em direo ao espermatozide. (C) medida que o proncleo do espermatozide migra para o plo animal em direo ao proncleo do vulo, os citoplasmas amarelo e claro os acompanham. (D) A posio final dos citoplasmas amarelo e claro, marcam os locais onde as clulas do origem ao mesnquima e aos msculos, respectivamente. (Segundo Conklin, 1905.)
Plo animal Citoplasma Cortical amarelo Ncleo do ocito
Material do ncleo do ocito
Gema cinzenta
Citoplasma claro
(A) Crio Plo vegetal
(B) Proncleo do Citoplasma espermatozide amarelo
(C) Proncleo do espermatozide Citoplasma amarelo
(D) Crescente amarelo Material da gema
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(A) Ponto de entrada do espermatozide
(B) Crescente cinzento
Crtex
Citoplasma interno
Zona de deslizamento
Figura 4.33
Reorganizao do citoplasma no ovo recm-fertilizado da r. (A) Corte transversal esquemtico de um ovo na metade do primeiro ciclo de clivagem. O ovo tem simetria radial em torno do seu eixo animal-vegetal. O espermatozide entrou por um lado e seu ncleo est migrando para o interior. O crtex est representado como o de Rana, com um hemisfrio animal altamente pigmentado e um hemisfrio vegetal transparente. (B) Quando est aproximadamente em 80% de seu caminho na primeira clivagem, o citoplasma cortical gira cerca de 30 o em relao ao citoplasma interno. Essa rotao importante porque a gastrulao ir comear na regio oposta ao ponto de entrada do espermatozide onde ocorre o maior deslocamento do citoplasma. (Segundo Gerhart et al., 1989.)
Em rs como Xenopus, nas quais no se v um crescente cinzento, podemos assim mesmo, observar a rotao do citoplasma cortical em relao camada interna, subcortical. Esse movimento foi demonstrado por Vincent e seus colaboradores (1986). Esses investigadores imprimiram uma grade hexagonal de corante (Azul Nilo) sobre o citoplasma abaixo do crtex enquanto aplicavam outro tipo de corante (uma lectina ligada fluorescena) superfcie do ovo. Quando o ovo foi mantido em sua posio por incluso em gelatina, os pontos de Azul Nilo puderam ser vistos rodar de 30 em relao s manchas da lectina fluorescente (Figura 4.34). Em ovos normais, no inclusos, a superfcie do ovo considerada girar enquanto o citoplasma subcortical, tornado pesado pelas plaquetas de gema, permanece estabilizado por gravidade. O motor para esses movimentos citoplasmticos em ovos de anfbios parece ser um conjunto de microtbulos paralelos que ficam entre os citoplasmas interno e cortical do hemisfrio vegetal, na direo da rotao citoplasmtica. Os rastros dos microtbulos so primeiramente vistos imediatamente antes do comeo da rotao, e desaparecem quando esse movimento cessa (Figura 4.35; Elinson e Rowning, 1988). Tratamento do ovo com colchicina ou radiao ultravioleta interrompe a formao desses microtbulos, com isso parando as rotaes citoplasmticas. Usando anticorpos ligantes desses microtbulos, Houliston e Elinson (1991a) acharam que esses rastros eram formados por microtbulos derivados do espermatozide e do vulo, e que o centrolo espermtico direciona sua polimerizao, fazendo com que cresam para o interior da regio vegetal do ovo. Ao atingir o crtex vegetal, esses microtbulos se desviam do ponto de entrada do espermatozide, em direo ao plo vegetal. A posio descentralizada do centrolo espermtico quando esse inicia a polimerizao microtubular, proporciona direo rotao. A fora motriz para a rotao possivelmente, fornecida pela ATPase cinesina. Tal como a dinena e a miosina, a cinesina pode fixar-se s fibras e produzir energia pela hidrlise de ATP. Essa ATPase est localizada nos microtbulos vegetais e nas membranas do retculo endoplasmtico cortical (Houliston e Elinson, 1991b). O movimento do citoplasma cortical relativo ao citoplasma interno causa profunda movimentao nesse ltimo. Danilchik e Denegre 1991) marcaram plaquetas da gema
158
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 4.34
Rotao do citoplasma subcortical relativa ao citoplasma de superfcie da clula. (A) Um ovo recentemente fertilizado foi marcado com uma grade hexagonal de corante Azul Nilo (que cora os lpidios nas plaquetas de gema). O ovo foi embebido em gelatina, e as posies originais de alguns dos pontos marcados na superfcie celular com fluorescena (crculos em A). O ponto de entrada do espermatozide est marcado com um S. (B,C) Com o progredir do primeiro ciclo, os pontos do citoplasma subcortical mudaram de aproximadamente 30 o em relao superfcie externa imobilizada do ovo. O local no ovo designando a futura superfcie dorsal do embrio est marcado com um D. (D) Sumrio desses movimentos na regio vegetal (inferior) do ovo. (de Vincent et al., 1986, fotografias cortesia de J. C. Gerhart.)
com Azul Nilo e observaram seu movimento por microscopia fluorescente (o corante ligado emite fluorescncia vermelha). Durante a parte intermediria do primeiro ciclo celular, a massa do citoplasma central do ovo flui do presumvel lado ventral (abdome), para o futuro lado dorsal (posterior) do embrio (Prancha 7). Ao fim da primeira diviso, o citoplasma presumivelmente do lado dorsal do embrio, distintamente diferente daquele do provvel lado ventral. O que havia sido um embrio radialmente simtrico, agora um embrio bilateralmente simtrico. Como veremos nos Captulos 6 e 15, esses movimentos citoplasmticos iniciam uma cascata de eventos que determina o eixo dorso-ventral da r. Realmente, os microtbulos paralelos que permitem esses rearranjos parecem estender-se ao longo do futuro eixo dorso-ventral (Klag e Ubbels, 1975; Gerhart et al., 1983). Preparao para a Clivagem O aumento dos nveis de ons livres de clcio intracelular tambm inicia a movimentao de aparelhagem para a diviso celular. O mecanismo iniciador da clivagem provavelmente difere entre espcies, dependendo do estgio de meiose em que
159
Figura 4.35
(B)
Arranjo paralelo de microtbulos se estendem ao longo do hemisfrio vegetal, ao longo do futuro eixo dorso-ventral. (A) Arranjo paralelo de microtbulos vistos na segunda parte do primeiro ciclo celular por anticorpos fluorescente tubulina. (B) Antes da rotao citoplasmtica (cerca de metade do ciclo) nenhum arranjo pode ser visto. (C) No trmino da rotao do citoplasma, os microtbulos despolimerizam. (de Elinson e Rowning, 1988, cortesia de R. Elinson.)
(A)
(C)
ocorre a fecundao. No entanto, em todas as espcies estudadas, o ritmo das divises celulares regulado pela sntese e degradao de ciclina. A ciclina mantm as clulas em metfase, e a sua degradao permite s clulas voltarem para interfase. Alm de suas outras atividades, os ons de clcio tambm parecem iniciar a degradao da ciclina (Watanabe et al., 1991). Uma vez degradada a ciclina, os ciclos de diviso celular podem se reiniciar. A clivagem tem uma relao especial com essas regies citoplasmticas. Em embries tunicados, a primeira clivagem secciona o ovo em imagens duplicadas em um espelho. Desse estgio em diante, cada diviso em um lado do sulco de clivagem tem uma imagem em espelho do lado oposto. De maneira semelhante, o crescente cinzento seccionado pelo sulco da primeira clivagem em ovos de anfbios. Assim, a posio da primeira clivagem no aleatria, mas tende a ser especificada pelo ponto de entrada do espermatozide e a subseqente rotao do citoplasma do ovo. A coordenao do plano de clivagem e dos rearranjos citoplasmticos provavelmente mediada pelos microtbulos do ster do espermatozide (Manes et al., 1978; Gerhart et al., 1981; Elinson, 1985). Portanto, perto do fim do primeiro ciclo celular , o citoplasma se rearranja, os proncleos se encontram, o DNA est se replicando e novas protenas esto sendo sintetizadas. O palco est preparado para o desenvolvimento de um organismo multicelular. [fert11.html], [other.html#fert13]
LITERATURA CITADA
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CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade
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Clivagem: Criando multicelularidade
Para nossa limitada inteligncia, pode parecer simples dividir um ncleo em partes iguais. A clula, manifestadamente, abriga uma opinio muito diferente. E. B. WILSON, (1923) Deve-se mostrar o mximo respeito por tudo que cresce exponencialmente, no importa o seu tamanho. GARRETT HARDIN, (1968)
mento. O zigoto, com o seu novo potencial gentico e com sua nova disposio do citoplasma, inicia agora a produo de um novo organismo multicelular. Em todas as espcies de animais conhecidas, isso comea por um processo chamado clivagem, uma srie de divises mitticas pelo qual o enorme volume do citoplasma do ovo dividido em numerosas pequenas clulas nucleadas. Essas clulas em estado de clivagem so chamadas de blastmeros. Na maioria das espcies (mamferos sendo a principal exceo) a velocidade da diviso celular e a colocao dos blastmeros um em relao ao outro esto completamente sob controle das protenas e dos mRNAs armazenados no ocito pela me. O genoma zigtico transmitido por mitose para todas as outras clulas, no funciona em embries com clivagem precoce. Poucos, se alguns, mRNAs so produzidos mais tarde durante a clivagem, o embrio pode dividir-se apropriadamente at mesmo quando produtos qumicos so usados para inibir a transcrio. Tambm em muitas espcies, no h aumento do volume embrionrio durante a clivagem. Isso difere da maioria dos casos de proliferao de clulas, do qual existe um perodo de crescimento celular entre as mitoses: a clula se expande para quase o dobro de seu volume, da se divide. Esse crescimento produz um aumento total de clulas enquanto mantm uma razo relativamente constante entre volume nuclear e volume citoplasmtico. Durante a clivagem embrionria, no entanto, o volume citoplasmtico no aumenta. Antes, o enorme volume do citoplasma zigtico dividido cada vez mais em clulas menores. O primeiro ovo dividido ao meio, em seguida em quartos, em oitavos, e assim por diante. Essa diviso do citoplasma do ovo, sem o aumento do seu volume, acompanhada pela abolio do perodo de crescimento entre as divises, enquanto a clivagem dos ncleos ocorre numa razo to rpida nunca vista antes (nem mesmo em clulas de tumor). Um ovo de r, por exemplo, pode ser dividido em 37.000 clulas em apenas 43 horas. A mitose na Drosophila, em estgio de clivagem, ocorre a cada dez minutos por mais de duas horas, e em apenas 12 horas forma algo em torno de 50.000 clulas. Esse aumento em nmero de clulas pode ser apreciado comparando a clivagem com outras fases do desenvolvimento. A Figura 5.1 mostra o logaritmo de nmeros celulares em um embrio de r representado graficamente em funo do tempo de desenvolvimento (Sze, 1953). Ela ilustra uma evidente descontinuidade entre clivagem e gastrulao. Uma conseqncia dessa diviso rpida a razo do volume citoplasmtico/nuclear se tornar cada vez menor assim que a clivagem progride. Em muitos tipos de embries, a diminuio da razo entre os volumes citoplasmtico e nuclear crucial na
OTVEL COMO S ELA , a fertilizao o passo inicial do desenvolvi-
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Figura 5.1
Log10 do nmero de clulas por embrio
Formao de novas clulas durante o desenvolvimento precoce da r Rana pipiens. (Segundo Sze, 1953.)
Clivagem
Gastrulao
Horas a 150C
regulagem do tempo da ativao de certos genes. Por exemplo, na r Xenopus laevis, a transcrio de novas mensagens s ativada aps 12 divises. A essa altura, a razo da clivagem diminui, os blastmeros tornam-se mveis e os genes nucleares comeam a ser transcritos. sabido que algo no ovo est sendo titulado pela recm-produzida cromatina, porque o tempo dessa transio pode ser mudado experimentalmente alterando na clula a razo da cromatina para o citoplasma (Newport and Kirschner, 1982a,b), ainda que a clivagem comece logo aps a fertilizao e termine assim que o embrio atinja um novo equilbrio entre o ncleo e o citoplasma.
PADRES DE CLIVAGEM EMBRIONRIA

Clivagem um processo muito bem coordenado e regulado pelas leis genticas. O padro da clivagem embrionria de uma dada espcie determinado por dois parmetros principais: (1) a quantidade e a distribuio de protena do vitelo dentro do citoplasma e (2) aqueles fatores no citoplasma do ovo que influenciam no ngulo do fuso mittico e na determinao do tempo de sua formao. A quantidade e distribuio de vitelo determina onde a clivagem pode ocorrer e o tamanho relativo dos blastmeros. Quando um plo do ovo relativamente livre de vitelo, a diviso celular ocorre nesse plo de uma forma mais rpida do que a do plo oposto. O plo rico em vitelo chamado de plo vegetal; a concentrao de vitelo no
Tabela 5.1 Classsificao dos tipos de clivagem Padro de clivagem Holoblstica (clivagem completa) Posio do vitelo Isolcito (oligolcito) (vitelo escasso, distribudo por igual) Simetria de clivagem Radial Espiral Bilateral Rotacional Radial Bilateral Discoidal Superficial Animais representativos Equinodermos, Amphioxus Maioria dos moluscos, aneldeos, nematelmintos, platelmintos Ascdios Mamferos Anfbios Moluscos cefalpodos Rpteis, peixes, aves Maioria dos artrpodos
Meroblstica (clivagem incompleta)
Mesolcito (moderadamente telolcito) Telolcito (vitelo denso, concentrado em uma extremidade do ovo) Centrolcito (vitelo concentrado no centro do ovo)
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plo animal relativamente baixa. O ncleo do zigoto freqentemente deslocado em direo ao plo animal. No geral, o vitelo inibe a clivagem. A Tabela 5.1 fornece a classificao dos tipos de clivagem e mostra a influncia do vitelo no padro e na simetria da clivagem. Em zigotos com relativamente pouco vitelo (ovos isolcitos e mesolcitos) a clivagem holoblstica, significando que o sulco da clivagem se extende por todo o ovo. Zigotos contendo grande acmulo de protena vitelnica sofrem clivagem meroblstica, onde somente uma poro do citoplasma clivado. O sulco da clivagem no chega a penetrar na poro de vitelo do citoplasma. Clivagem meroblstica pode ser discoidal, como nos ovos das aves, ou superficial, como em zigotos de insetos, dependendo onde o depsito de vitelo estiver localizado, de um lado (telolcito) ou no centro do citoplasma (centrolcito), respectivamente. O vitelo uma extraordinria adaptao que permite ao embrio se desenvolver na ausncia de uma fonte externa de alimentao. Animais desenvolvidos sem grandes concentraes de vitelo, como os ourios-do-mar, normalmente formam o estgio larval muito rapidamente. Esse estgio larval pode se alimentar por si s, o desenvolvimento continua com a larva nadando livre. Embries de mamferos, que tambm no possuem uma grande quantidade de vitelo, adotam uma outra estratgia: a placenta, como veremos adiante, se torna a primeira diferenciao do embrio mamfero separando as clulas que iro formar a placenta. Esse rgo fornece alimento e oxignio para o embrio durante sua longa gestao. No outro extremo esto os ovos dos insetos, peixes, rpteis e aves. A maior parte do seu volume celular vitelo. O vitelo deve ser o suficiente para nutrir esses animais, sendo que eles se desenvolvem sem um estgio larval ou placentrio. A correlao entre grandes concentraes de vitelo e a falta do estado larval conhecida em algumas espcies de rs. Algumas rs tropicais, tais como as Eleutherodactylus e a Arthroleptella no passam pelo estgio de girino. Ao contrrio, eles provm seus ovos com quantidades enormes de concentrao de vitelo (Lutz, 1947). Os ovos no necessitam ser colocados na gua porque o estgio de girino foi eliminado. (Isso ser discutido mais adiante no Captulo 19.) No entanto, o vitelo somente um fator influenciando o padro de clivagem em uma espcie. Existem tambm padres herdados de divises celulares que so adicionados s restries do vitelo. Isso pode ser prontamente observado em ovos isolcitos, nos quais muito pouco vitelo est presente. Na ausncia de grandes quantidades de vitelo, quatro tipos principais de clivagem podem ser observados: holoblstica radial, holoblstica espiral, holoblstica bilateral e clivagem holoblstica rotacional.
Clivagem holoblstica radial

Clivagem holoblstica radial a forma mais simples de clivagem de se entender. Nesse tipo de clivagem os sulcos tm orientao paralela e perpendicular ao eixo animalvegetal do ovo. Esse tipo de clivagem caracterstico de equinodermos e do protocordato Amphioxus, assim como de rs e salamandras. A holotria, Synapta A clivagem padro da holotria, Synapta digita, ilustrada na Figura 5.2. Aps a unio dos proncleos, o eixo da primeira haste mittica formado perpendicularmente ao eixo animal-vegetal do ovo. Para esse fim, o primeiro sulco da clivagem passa diretamente atravs dos plos animal e vegetal, criando duas clulas filhas do mesmo tamanho. Essa clivagem conhecida como meridional porque passa pelos dois plos como um meridiano no globo. Os sulcos da segunda clivagem esto no ngulo reto dos sulcos da primeira clivagem, mas continuam perpendiculares ao eixo animal-vegetal do ovo. Os dois sulcos da clivagem aparecem simultaneamente em ambos blastmeros e tambm passam pelos dois plos. Dessa maneira, as primeiras duas divises so, ao mesmo tempo, meridional e perpendicular uma com a outra. A terceira diviso equatorial: as hastes mitticas de cada blastmero esto agora em posio
170
Figura 5.2
Plo animal
Clivagem holoblstica no equinodermo Synapta digita, levando formao de uma blstula oca, conforme mostrado no corte (ltimo painel). (Segundo Saunders, 1982.)
Plano de clivagem meridional
Plano de clivagem equatorial
Plo vegetal
Metade Animal
Plo animal
Metade Vegetal
Blstula oca (aberta por corte)
Plo vegetal
paralela ao eixo animal-vegetal, e o sulco resultante da clivagem separa os dois plos um do outro, dividindo o embrio em oito blastmeros iguais. Cada blastmero na metade animal do embrio est agora diretamente acima do blastmero da metade vegetal. A quarta diviso meridional novamente, produzindo duas fileiras de 8 clulas cada, enquanto a quinta diviso equatorial, produzindo quatro fileiras de 8 clulas cada. Sucessivas divises produzem embries de 64,128 e 256 clulas, com divises meridionais alternando com divises equatoriais. Os embries resultantes consistem de blastmeros dispostos em fileiras horizontais ao longo de uma cavidade central. Em ambos os plos do embrio, os blastmeros se movem, uns em direo aos outros, para criar uma esfera oca composta de uma nica camada de clulas. Essa esfera oca chamada de blstula, e a cavidade central referida como blastocele. A qualquer momento durante a clivagem da Synapta, um embrio seccionado atravs de qualquer meridiano produz a imagem refletida de duas metades. Esse tipo de simetria caracterstico de uma esfera ou cilindro e chamada de simetria radial. Dessa maneira, Synapta tem clivagem holoblstica radial. Ourio-do-Mar Ourio -do-Mar O ourio-do-mar tambm apresenta clivagem holoblstica radial, mas com algumas importantes modificaes. A primeira e a segunda clivagem so similares as da Synapta; ambas so meridionais e perpendiculares em relao a outra. Similarmente, a terceira clivagem equatorial, separando os dois plos um do outro (Figura 5.3). Na quarta clivagem, no entanto, os eventos so bem diferentes. As quatro clulas da camada animal se dividem meridionalmente em oito blastmeros, cada qual com o mesmo volume. Essas clulas so chamadas mesmeros. A camada vegetal, no entanto, sofre uma clivagem equatorial desigual para produzir no plo vegetal quatro clulas grandes, os macrmeros, e quatro pequenas, os micrmeros (Figura 5.4; Summers et al., 1993). Assim que a clula com 16 embries clivar, os oito mesmeros se dividem para formar duas camadas animais, an1 e an2, uma se equilibrando em cima da outra. Os macrmeros se dividem meridionalmente, formando uma camada de oito clulas abaixo de an2. Os micrmeros tambm se dividem, produzindo um pequeno grupo abaixo da camada maior. Todos os sulcos de clivagem da sexta diviso so equatoriais; a stima clivagem meridional, produzindo uma blstula com 128 clulas.
171
(A)
Plo animal
Figura 5.3
Plo vegetal Mesmeros
Metade animal
an 1 an 2
derivados derivados veg1 veg2
Clivagem no ourio-do-mar. (A) Planos de clivagem nas primeiras trs divises e formao de camadas particulares de clulas nas divises 3-6. (B-D) Fotomicrografias de embries vivos do ourio-do-mar Lytechinus pictus, viso de cima para baixo do plo animal. (B) O estgio de 2 clulas. (C) O estgio de 4 clulas. (D) O estgio de 32 clulas, mostrado sem a membrana de fertilizao para permitir a visualizao dos mesmeros do plo animal, os macrmeros centrais e dos micrmeros vegetais em ngulo para o centro. (Fotografia cortesia de G. Watchmaker.)
Metade vegetal (B)
Micrmeros
Macrmeros (C) (D)
Em 1939, Sven Hrstadius realizou um experimento simples demonstrando que o controle do tempo e colocao de cada clivagem de ourio-do-mar independente de clivagens preexistentes. Ele demonstrou que se inibisse a primeira, a segunda e terceira clivagens, sacudindo os ovos, ou colocando-os em gua do mar hipotnica, a clivagem desigual (quarta) que forma os micrmeros, ainda ocorreria no tempo apropriado. Sendo assim, Hrstadius concluiu que existem trs fatores que determinam a clivagem em um embrio de 8 clulas: (1) existem mudanas progressivas no citoplasma,
Figura 5.4
(A)
(B)
Formao de micrmeros durante a quarta diviso de embries de ourios-do-mar. Os plos vegetais dos embries so visualizados por baixo. (A) A localizao e orientao do fuso mittico na parte baixa das clulas vegetais so visualizadas com luz polarizada no embrio vivo. (B) A clivagem atravs desses fusos, colocados assimetricamente, produziu micrmeros e macrmeros. (de Inou, 1982, cortesia de S. Inou.)
172
Clio
Blastocele
(A) Blstula jovem
(B) Blstula mais velha com placa vegetal achatada e tufo ciliar
(C)
Figura 5.5
Blstulas de ourio-do-mar. (A) Esquema de um corte controle atravs de uma blstula precoce de ourio-do-mar, mostrando uma camada nica de clulas arredondadas rodeando uma grande blastocele. (B) Com a contnua diviso, as clulas da blstula tardia mostram diferenas de forma medida que as clulas da placa vegetal se alongam, (C) Junes apertadas (flecha) formando se entre clulas de uma blstula de equinodermo com 1024 clulas. (A e B segundo Giudice, 1973; C de Dan-Sohkawa e Fujisawa, 1980, cortesia dos autores.)
algum tempo aps a fertilizao, que direcionam os fusos formados para uma certa direo; (2) deve haver material formador de micrmero no citoplasma vegetal; e (3) deve haver algum mecanismo pelo qual o material formador de micrmeros seja ativado no tempo correto (Hrstadius,1973). No desenvolvimento do ourio-do-mar, o estgio de blstula comea na fase de 128 clulas. Nesse estgio, as clulas formam uma esfera oca circundando a blastocele central (Figura 5.5A,B). Nessa altura, todas as clulas so do mesmo tamanho, os micrmeros tendo diminuda sua diviso celular e clivando menos freqentemente. Toda a clula est em contato com o fluido proteinceo da blastocele e com a camada hialina dentro do envoltrio de fertilizao. Durante esse tempo, os contatos entre as clulas so estreitados. Dan-Sohkawa a Fujisawa (1980) analisaram esse mtodo em embries de estrela-do-mar e mostraram que o fechamento da cavidade esfrica contempornea com a formao de junes apertadas entre os blastmeros. Essas junes unem as clulas frouxamente conectadas num tecido epitelial onde a blastocele isolada do ambiente externo (Figura 5.5C). Dando prosseguimento a sua diviso, a camada celular expandida e se afina. Durante esse perodo, a blstula permanece como uma camada unicelular grossa. Duas teorias surgiram para explicar a concomitante proliferao de clulas e formao da blastocele. Dan (1960) conjeturou que o motivo maior dessa expanso o influxo de gua na cavidade da blastocele. J que o blastmero secreta protena na blastocele, seu fluido torna-se espesso. Esse fluido absorve grandes quantidades de gua por osmose, exercendo presso nos blastmeros para se expandirem. Essa presso tambm alinha o longo eixo de cada clula para que a diviso nunca seja para dentro da blastocele. Isso criaria uma expanso adicional fazendo com que a populao fosse orientada somente para um plano. Wolpert e Gustafson (1961) e Wolpert e Mercer (1963) propuseram que a presso da blastocele no necessria para se conseguir esse efeito. Eles enfatizaram o papel de adesividade das clulas entre si e a camada hialina. Eles mostraram que enquanto permanecessem fortemente atracadas na camada hialina, as clulas no tm alternativa a no ser a de se expandir. Essa expanso cria a blstula ao invs do contrrio. Certamente, a camada hialina vital para expanso da blastocele, e se a adeso de clulas da camada hialina inibida por anticorpos para a hialina, ento a expanso da blastocele cessa (Adelson e Humphreys, 1988). Em um trabalho recente (Ettensohn e Ingersoll, 1992) concluram que provvel que ambos
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mecanismos expandem a blastocele. Durante a clivagem precoce, a adeso camada hialina parece ser o fator mais importante, enquanto que em estgios mais tardios, a presso osmtica tambm parece exercer o seu papel. A clulas da blstula desenvolvem clios em sua superfcie externa (Figura 5.6), desse modo, causando a rotao da blstula dentro do envoltrio de fertilizao. Logo aps, as clulas da parte animal do embrio sintetizam e secretam uma enzima de ecloso que lhes permite digerir a membrana fertilizante (Lepage et al., 1992), o embrio se torna uma blstula eclodida livre para nadar. Anfbios Clivagem na maioria dos embries de rs e salamandras radialmente simtrica e holoblstica, como na clivagem do equinodermo. O ovo do anfbio, no entanto, contm muito mais vitelo. Esse vitelo, que concentrado no hemisfrio vegetal, um impedimento clivagem. Sendo assim, a primeira diviso comea no plo animal e vagarosamente se estende at a regio vegetal (Figura 5.7). Na salamandra axolotle, o sulco da clivagem se estende atravs do hemisfrio animal a uma velocidade prxima de 1mm/min. O sulco da clivagem seciona o crescente cinzento e depois diminui para menos de 0.02-0.03mm/min ao se aproximar do plo vegetal (Hara, 1977). A Figura 5.8A uma varredura no microscpio eletrnico, mostrando a primeira clivagem em um ovo de r. Podemos notar as dobras nos sulcos da clivagem e a diferena entre os sulcos nos hemisfrios animal e vegetal. A Figura 5.8B mostra que enquanto o sulco da primeira clivagem ainda est tentando clivar o vitelo citoplasmtico do hemisfrio vegetal, a segunda clivagem j comeou prxima ao plo animal. Essa clivagem est em ngulos retos em relao primeira, e tambm meridional. A terceira clivagem, como era de se esperar, equatorial. No entanto, por causa do vitelo vegetalmente colocado, esse sulco da clivagem em ovos anfbios muito mais prximo do plo animal. Ele divide o embrio de r em quatro blastmeros animais pequenos (micrmeros) e quatro grandes blastmeros (macrmeros) na regio vegetal. Essa clivagem holoblstica desigual estabelece duas regies embrionrias principais: uma de diviso rpida de micrmeros, prxima ao plo animal, e outra de macrmeros, mais lenta (Figura 5.8C). Assim que a clivagem progride, a regio animal se torna abarrotada com numerosas clulas pequenas, enquanto a regio vegetal contm uma pequena quantidade de grandes macrmeros carregados de vitelo (ver Figura 5.7). Embries anfbios contendo de 16 a 64 clulas so freqentemente chamados mrulas (do Latim amora, da qual sua forma vagamente reminiscente). No estgio de 128 clulas a blastocele se torna aparente e o embrio considerado uma blstula.
Figura 5.6
Clulas ciliadas da blstula. Cada clula desenvolve um nico clio. (Cortesia de W. J. Humphreys.)
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 5.7
Crescente Cinzento (E) (F) (G) (H) Blastocele
Clivagem de um ovo de r. Sulcos de clivagem, designados por nmeros romanos, esto enumerados por ordem de aparecimento. (A, B) O vitelo vegetal impede a clivagem fazendo com que a segunda diviso comece na regio animal do ovo, antes da primeira diviso ter dividido o citoplasma vegetal. (C) A terceira diviso deslocada em direo ao plo animal. (D-H) No final, o hemisfrio vegetal contm blastmeros mais longos e mais escassos que os da metade animal. (Segundo Carlson, 1981.)
174
(A)
Figura 5.8
Pregas Sulco de clivagem
Micrografias ao microscpio eletrnico da clivagem de um ovo de r. (A) Primeira clivagem. (B) Segunda clivagem (4 clulas). (C) Quarta clivagem (16 clulas), mostrando a discrepncia de tamanho entre as clulas animais e vegetais aparecendo aps a terceira diviso. (A de Beams e Kessel, 1976, cortesia dos autores; B e C cortesia de L. Biedler.)
(B)
(C)
Na realidade, a formao da blastocele foi traada desde o primeiro sulco de clivagem. Kalt (1971) demonstrou que na r Xenopus laevis o primeiro sulco da clivagem se alarga no hemisfrio animal para criar uma pequena cavidade intercelular que isolada do ambiente externo por junes intercelulares muito apertadas (Figura 5.9). Essa cavidade se expande durante clivagens subseqentes para se tornar uma blastocele. A blastocele provavelmente presta duas principais funes no embrio das rs: (1) uma cavidade que permite migrao celular durante a gastrulao, e (2) previne clulas que esto abaixo interagir prematuramente com as clulas de cima. Quando Nieuwkoop (1973) tirou clulas do topo da blastocele de um embrio de salamandra aqutica e colocou-as junto a clulas do vitelo vegetal na base da blastocele, essas clulas animais se tornaram mesoderma ao invs de ectoderma. Como o tecido mesodrmico normalmente formado dessas clulas animais, que so adjacentes aos precursores do endoderma, parece plausvel que clulas vegetais influenciam clulas adjacentes para se diferenciar em tecidos mesodrmicos. Sendo assim, a blastocele aparece para prevenir o contato do endoderma com clulas destinadas para dar origem pele e aos nervos. Enquanto essas clulas esto dividindo-se, numerosas clulas com molculas de adeso mantm as clulas juntas. Uma das mais importantes dessas molculas a EPcaderina. O mRNA para essa protena fornecido no citoplasma do ocito, e se essa mensagem destruda (injetando no ocito oligonucleotdeos antisense complementares para esse mRNA), a EP-caderina no produzida e a adeso entre os blastmeros dramaticamente reduzida (Heasman et al., 1994). Isso resulta na obliterao da blastocele (Figura 5.10).
Figura 5.9
Formao da blastocele num ovo de r. (A) Primeiro plano de clivagem mostrando uma pequena fenda, que posteriormente se desenvolve na blastocele. (B) embrio de oito clulas mostrando uma pequena blastocele (flecha) na juno de trs planos de clivagem. (de Kalt, 1971, cortesia de M. R. Kalt.)
(A)
(B)
175
(A)
(B)
Figura 5.10
Depleo de EP-caderina mRNA no ocito de Xenopus, resultando na perda de adeso entre os blastmeros e na obliterao da blastocele. Oligonucleotdeos antisense complementares mensagem da EP-caderina foram injetados no embrio unicelular, prevenindo a expresso da EPcaderina. A blastocele obliterada em embries depletados de EP-caderina, mas (B) no pelos controles. (de Heasman et al., 1994; fotografia, cortesia de J. Heasman.)
Clivagem holoblstica espiral

Clivagem espiral caracterstica de vermes aneldeos, platelmintos turbelrios, vermes nemertinos e todos os moluscos, exceto cefalpodos. Difere da clivagem radial em muitas maneiras. Primeiro, os ovos no se dividem em paralelo ou em orientaes perpendiculares ao eixo animal-vegetal do ovo; de preferncia, a clivagem se d em ngulos oblquos, formando a disposio espiral de blastmeros filhos. Segundo, as clulas se tocam entre si em mais lugares do que em embries clivados radialmente. Na realidade, elas assumem o empacotamento com a orientao termodinamicamente mais estvel, parecido com o de bolhas de sabo adjacentes (Figura 5.11). Terceiro, embries de clivagem espiral normalmente realizam menos divises antes de comear a gastrulao, tornando possvel saber o destino de cada clula da blstula. Quando os destinos das clulas individuais em embries de aneldeos, platelmintos turbelrios e moluscos foram comparados, as mesmas clulas foram vistas no mesmo lugar e o seus destinos, de uma maneira geral, foram idnticos (Wilson, 1898). As blstulas ento produzidas no tm blastocele e so chamadas de estereoblstulas. As Figuras 5.12 e 5.13 retratam a clivagem de embries de moluscos. As duas primeiras clivagens so quase meridionais, produzindo quatro grandes macrmeros (marcados A, B, C e D). Em muitas espcies, os blastmeros so de tamanhos diferentes (D sendo o maior), uma caracterstica que permite serem individualmente identificados. Em cada sucessiva clivagem, cada macrmero origina um pequeno micrmero no seu plo animal. Cada quarteto sucessivo de micrmeros deslocado para a direita ou para a esquerda de seu macrmero irmo, criando um relacionamento espiral caracterstico da clivagem. Observando o embrio pelo plo animal, as partes superiores do eixo mittico parecem alternar entre o sentido horrio e o anti-horrio. Isso faz com que micrmeros alternados se formem obliquamente para a esquerda e para a direita do seu macrmero. Na terceira clivagem, o macrmero A dar origem a duas clulas filhas, macrmero 1A e micrmero 1a. As clulas B, C e D se comportam similarmente, produzindo o primeiro quarteto de micrmeros. Na maioria das espcies, os micrmeros esto direita do seu macrmero (olhando para o plo animal), uma disposio indicando uma espiral dextra (oposta sinistra). Na quarta clivagem,
Figura 5.11
Diagrama mostrando o arranjo de quatro e oito bolhas de sabo num prato ligeiramente cncavo. O arranjo termodinmico maximiza o contato e muito reminiscente daquele de embries que se clivam em espiral. (Segundo Morgan, 1927.)
176
(A)
Vista do plo animal
(B)
Vista lateral
Figura 5.12
Clivagem em espiral do molusco Trochus vista do plo animal (A) e de um lado (B). Em B, as clulas derivadas do blastmero A esto coloridas. Os fusos mitticos, esquematizados nos estgios precoces, dividem as clulas desigualmente e em ngulo aos eixos vertical e horizontal.
o macrmero 1A se divide para formar o macrmero 2A e o micrmero 2a; e o micrmero 1a se divide para formar mais dois micrmeros, 1a1 e 1a2. Mais clivagens iro produzir blastmeros 3A e 3a a partir do macrmero 2A; e micrmeros, como por exemplo o 1a2, se dividem para produzir clulas tais como as 1a21 e 1a22. A orientao da clivagem plana para a esquerda ou para a direita controlada por fatores citoplasmticos dentro do ocito. Isso foi descoberto analisando mutaes da espiral do caracol. Alguns caracis tm sua espiral aberta direita da concha, enquanto outros tm sua abertura para esquerda. Normalmente, a rotao da espiral a mesma para todos os membros de uma determinada espcie. Todavia, ocasionalmente, ainda so encontrados mutantes. Exemplificando, em espcies em que a espiral abre para a direita, sero encontrados alguns indivduos com a abertura espiral para a esquerda. Crampton (1984) analisou os embries desses caracis aberrantes e observou que sua clivagem precoce difere da normal.
Figura 5.13
Clivagem espiral do caracol Ilyanassa. O blastmero D maior que os outros, permitindo a identificao de cada clula. A clivagem dextra. (A) estgio de 8 clulas. PB o corpo polar. (B) Metade da quarta clivagem; os macrmeros j se dividiram em clulas grandes e pequenas orientadas espiralmente. (de Craig e Morrill, 1986, cortesia dos autores.)
177
(A)
Enrolamento sinistrogiro
(B)
Enrolamento dextrogiro
Figura 5.14
Olhando do plo animal de caracis enrolados para a direita e para a esquerda. A origem do enrolamento para direita e para a esquerda do caracol pode ser reconhecida pela orientao do fuso mittico na segunda clivagem. Os caracis sinistrogiros e dextrogiros se desenvolvem como imagens espelhares uma da outra. (Segundo Morgan, 1927.)
A orientao das clulas aps a segunda clivagem estava diferente (Figura 5.14), graas a uma orientao diferente do aparelho mittico nos caracis com enrolamento sinistrogiro. Todas as subseqentes divises em embries de espiral para a esquerda so imagens espelhares daqueles embries com espirais dextras. Na Figura 5.14, podemos notar que a posio do blastmero 4d (o qual muito importante, j que sua prognie ir formar os rgos mesodrmicos) diferente nos dois tipos de espirais dos embries. Geralmente, os dois caracis so formados com seus corpos em lados diferentes da abertura da espiral. A direo da abertura na espiral da concha do caracol controlada por um nico par de genes (Sturtevant, 1923; Boycott et al., 1930). No caracol Limnaea peregra a maioria dos indivduos so espiralados para a direita. Raros mutantes, exibindo abertura esquerda, foram encontrados e acasalados com caracis tipo-selvagem. Esses acasalamentos mostraram que existe um alelo D dextrogiro que dominante em relao ao alelo d sinistrogiro. No entanto, a direo da clivagem no determinada pelo gentipo do caracol em desenvolvimento, mas pelo gentipo da me do caramujo. Caramujo fmea do tipo dd pode produzir somente herdeiros de espiral sinistra, mesmo quando o gentipo dos herdeiros Dd. Um indivduo Dd ir se espiralar tanto para a direita quanto para a esquerda dependendo do genoma de sua me. Esses cruzamentos produzem o seguinte quadro:
178
Os fatores genticos envolvidos no enrolamento do caracol so trazidos ao embrio no citoplasma do ocito. o gentipo do ovrio, no qual o fentipo se desenvolve, que determina em que direo a clivagem vai ocorrer. Quando Freeman e Lundelius (1982) injetaram no ovo de mes dd, uma pequena quantidade de citoplasma proveniente de caracis com espirais dextras, os embries resultantes apresentaram espirais para a direita. Citoplasmas de caracis com espiral esquerda no afetaram os embries com a espiral direita. Isso confirma a observao que mes do tipo selvagem estavam colocando um fator em seus ovos que estava ausente ou defeituoso nas mes dd. [cleave1.html] Outra descoberta emocionante com relao a clivagem dos moluscos est na comunicao entre os blastmeros. Nos moluscos de blastmeros de igual tamanho no estgio de quatro clulas*, a determinao de que a clula que originar a clula precursora mesodrmica ser alcanada entre a quinta e a sexta clivagem. Nessa altura, o macrmero 3D se estende para dentro entrando em contato com os micrmeros do plo animal. Sem esse contato, a clula 4d produzida pelos macrmeros 3D no produz mesoderma (van den Biggelaar e Guerrier, 1979). Injetando corantes de baixo peso molecular, de Laat e colegas (1980) demonstraram que na hora do contato (e no antes), pequenas molculas so capazes de difundirem-se entre os macrmeros 3D e os micrmeros centrais. Imagens ao microscpio eletrnico mostram que nesse momento, aparecem junes de fenda na superfcie dessas clulas.
*No se preocupe, daremos no Captulo 16 mais informaes sobre embries de moluscos com blastmeros de tamanhos desiguais.
&
Especulaes
Adaptao pela modificao da clivagem embrionria
VOLUO causada pela alterao hereditria do desenvolvimento embrionrio. s vezes, somos capazes de identificar uma modificao da embriognese que impediu o organismo de sobreviver diferentemente em ambientes hostis. Uma dessas modificaes, descoberta por Frank Lillie em 1898, causada pela alterao do padro tpico da clivagem espiral na famlia uniondeo das ostras. Ao contrrio da maioria das ostras, Unio e seus aparentados vivem em locais de gua corrente. As correntes criam um problema para a disperso das larvas, porque os adul-
tos so sedentrios e as larvas que nadam livremente seriam sempre carregadas correnteza abaixo. Essas ostras, no entanto, resolveram esse problema efetuando duas modificaes no seu desenvolvimento. A primeira altera a clivagem embrionria. Na tpica clivagem dos moluscos, ou todos os macrmeros so iguais em tamanho, ou o blastmero 2D a maior clula no estgio embrionrio. No entanto, a diviso desse Unio tal que o blastmero 2d fica com a maior parte do citoplasma (Figura 5.15). Essa clula se divide para produzir a maior parte das estruturas larvais, incluindo uma gln-
dula capaz de produzir uma concha macia. Essas larvas (chamadas gloqudias) assemelham-se a pequenas armadilhas para urso; possuem plos sensveis que permitem as vlvulas da concha fecharem-se abruptamente quando tocadas pelas guelFigura 5.15
Formao de larvas de gloqudia pela modificao da clivagem em espiral. Aps formao do embrio de 8 clulas (A), a disposio do fuso mittico motiva a maioria do citoplasma D penetrar no blastmero 2d (B). Esse blastmero grande 2d se divide (C), para finalmente originar a grande concha armadilha de urso da larva (D). (Segundo Raff e Kaufman, 1983.)
(A)
(B)
(C)
(D)
179
ras ou barbatanas dos peixes que por ali estiverem passando. Elas pegam uma carona com o peixe at estarem prontas para cair e, atravs de metamorfose, transformarse em moluscos adultos. Dessa maneira, podem se espalhar correnteza acima. Em algumas espcies, as gloqudias so liberadas da bolsa de criao da fmea e meramente aguardam um peixe passar. Outras espcies, tal como a Lampsilis ventricosa, aumentaram as chances de suas larvas encontrarem um peixe realizando outra modificao no seu desenvolvimento (Welsh, 1969). Muitos moluscos desenvolvem um manto fino e saliente em volta da concha circundando a bolsa de criao. Em alguns uniondeos, a forma da bolsa de criao (marspio) e as ondulaes do manto
Figura 5.16
Peixe falso sobre o molusco uniondeo lampsilis ventricosa. O peixe , na verdade, a bolsa da cria e o manto do molusco. (Fotografia, cortesia de J. H. Welsh.)
imitam o comportamento e a forma de pequenos peixes nadando. Para tornar a iluso mais completa, desenvolveram uma mancha preta em forma de olho (ocelo) de um lado e uma nadadeira do outro. O peixe visto na Figura 5.16 no um peixe real, mas sim a bolsa de criao e o manto abaixo dela. Quando o peixe que estiver ao alcance for atrado, o molusco despeja as gloqudias da bolsa de criao. Dessa maneira, a modificao de padres de comportamentos j existentes permitiram moluscos uniondeos sobreviver em ambientes hostis.
Clivagem Holoblstica Bilateral Clivagem holoblstica bilateral encontrada primariamente nos ascdios (tunicados). A Figura 5.17 mostra a clivagem padro de um tunicado, Styela partita. O fenmeno mais admirvel nesse tipo de clivagem que o primeiro plano de clivagem estabelece o nico plano de simetria no embrio, separando o embrio do que ser o seu futuro lado direito e esquerdo. Cada diviso sucessiva orienta-se em relao a esse plano de simetria, e o meio embrio formado de um lado da primeira clivagem a imagem espelhar do meio embrio do outro lado. A segunda clivagem meridional, como a primeira diviso; mas ao contrrio da primeira diviso, no passa atravs do centro do ovo. Em vez disso, ela cria duas grandes clulas anteriores (blastmeros A e D) e duas pequenas clulas posteriores (blastmeros B e C). Cada lado tem agora um blastmero grande e um pequeno. Durante as trs prximas divises, as diferenas no tamanho e na forma destacam a simetria bilateral desses embries. No estgio de 32 clulas, uma pequena blastocele se forma e comea a gastrulao. Como foi mencionado no captulo 4, certos tunicados (incluindo S. partita) contm regies citoplasmticas coloridas. Durante a clivagem, essas se tornam fracionadas em clulas diferentes. Alm do mais, o tipo de citoplasma que a clula recebe determina seu destino. Clulas recebendo citoplasmas claros se tornam ectoderma; aquelas contendo citoplasma amarelo se transformam em clulas mesodrmicas; as clulas
Figura 5.16
Simetria bilateral em um ovo de tunicado. (A) Ovo no-clivado, mostrando os destinos das vrias regies citoplasmticas. (B) embrio de oito clulas, mostrando os blastmeros e os destinos das vrias clulas. Pode ser visualizado como duas metades de 4 clulas; daqui em diante, cada diviso no lado direito do embrio tem uma diviso espelhar do lado esquerdo. (C, D) Vistas de embries mais tardios do plo vegetal. (As regies do citoplasma destinadas a formar determinados rgos esto marcadas em A e so codificadas por cor em todo o diagrama.) (Segundo Balinsky, 1981.)
(D)
(A
(B)
(C)
Ectoderma
Ectoderma neural Msculo Mesnquima Plo vegetal Notocorda Endoderma Plo vegetal Vista do plo vegetal
180
que incorporam incluses ardsia se tornam endoderma e as clulas cinza claro, o tubo neural e a notocorda. Esses plasmas coloridos esto localizados bilateralmente em volta do plano de simetria e, assim, eles sero divididos pelo sulco da primeira clivagem em metades direita e esquerda do embrio. A segunda clivagem motiva o provvel mesoderma se posicionar nas duas clulas posteriores, enquanto o provvel tubo neural e cordomesoderma sero formados pelas duas clulas anteriores. Mais adiante, a terceira diviso ir repartir essas regies citoplasmticas, de modo que as clulas formadoras do mesoderma so confinadas aos dois blastmeros vegetais posteriores, e as clulas do cordomesoderma so restritas as duas clulas vegetais anteriores. O destino de cada clula do embrio precoce de Styela tem sido acompanhado e ser discutido em detalhe no Captulo 13.
Clivagem holoblstica rotacional

No surpresa alguma que o estudo da clivagem em mamferos tenha-se tornado um desafio. Os ovos de mamferos esto entre os menores do reino animal, tornando difcil seu manuseio experimental. O zigoto humano, por exemplo, tem somente 100 m de dimetro, praticamente invisvel, sendo seu volume menor de um milsimo do ovo de Xenopus. Tambm, zigotos de mamferos no so produzidos em nmeros comparveis aos embries do ourio-do-mar ou de rs. Normalmente, menos de 10 ovos so ovulados por uma fmea em um determinado tempo, tornando difcil a obteno de material para estudos bioqumicos. E como uma barreira final, o desenvolvimento dos embries dos mamferos se completa dentro de outro organismo ao invs de um ambiente externo. S recentemente foi possvel a duplicao de algumas dessas condies internas e observar o desenvolvimento in vitro. Com todas essas dificuldades, valeu a pena esperar o conhecimento da clivagem de mamferos, j que a clivagem nos mamferos completamente diferente de outros padres de diviso celular embrionria. O ocito dos mamferos liberado pelo ovrio e varrido pelas fmbrias at o oviduto (Figura 5.18). A fertilizao ocorre na ampola do oviduto, regio prxima ao ovrio. A meiose ento completada, e a primeira clivagem comea um dia depois. A clivagem nos mamferos est entre as mais lentas do reino animal de 12 a 24 horas de separao. Enquanto isso, os clios no oviduto empurram o embrio em direo ao tero; a primeira clivagem ocorre durante essa jornada. Existem vrias caractersticas da clivagem dos mamferos que as distinguem de outros tipos de clivagem. A primeira relativa a lentido das divises. A segunda diferena fundamental a singular orientao dos blastmeros dos mamferos um em relao ao outro. A primeira clivagem uma diviso meridional normal; no entanto, na
Estgio de 2 clulas tero Primeira clivagem
Zona pelcida
Figura 5.18
Desenvolvimento de um embrio humano desde a fertilizao at a implantao. A compactao em embries humanos ocorre no dia 4, quando ele est no estgio de 10 clulas. O ovo eclode da zona quando alcana o tero, e provvel que a zona evite a adeso das clulas em clivagem de se colarem ao oviduto, em lugar de viajar para o tero. (Segundo TuchmannDuplessis et al., 1972.)
Oviduto Mrula Blastocisto Ovrio Estgio precoce da implantao Fertilizao Ovulao
181
Plano de clivagem II
Plano de clivagem I
Plano de clivagem IIA
Plano de clivagem I
Figura 5.19
Comparao da clivagem precoce (A) em equinodermos (clivagem radial) e (B) em mamferos (clivagem rotacional). Nematides tambm tm uma forma rotacional de clivagem, porm, no formam a estrutura blastocstica caracterstica dos mamferos. Detalhes sobre a clivagem dos nematides sero fornecidos no Captulo 13. (Segundo Gulyas, 1975.)
Plano de clivagem IIB
(A) EQUINODERMO (Ourio-do-mar)
(B) MAMFERO (Coelho)
segunda clivagem um dos dois blastmeros se divide meridionalmente e o outro se divide equatorialmente (Figura 5.19). Esse tipo de clivagem chamada de clivagem rotacional (Gulyas, 1975). A terceira principal diferena entre a clivagem nos mamferos e a da maioria dos outros embries marcada pela falta de sincronizao das divises precoces. Os blastmeros de mamferos no se dividem ao mesmo tempo. Dessa maneira, embries de mamferos no aumentam por igual do estgio de 2 para 4 e para 8 clulas, mas freqentemente contm nmeros mpares de clulas. Tambm, diferente dos outros genomas animais, o genoma mamfero ativado durante a clivagem precoce, sendo o responsvel pela produo de protena necessria para a clivagem. No camundongo e na cabra, a mudana do controle maternal para o zigtico ocorre no estgio de duas clulas (Piko e Clegg, 1982; Prather 1989). [cleave2.html] Compactao Talvez a diferena mais crucial entre a clivagem de mamfero e todos os outros tipos envolva o fenmeno da compactao. Como mostra a Figura 5.20, blastmeros mamferos, atravessando o estgio de 8 clulas, formam um arranjo solto com espao suficiente entre eles. Seguindo a terceira clivagem, no entanto, os blastmeros passam
(A)
(B)
(C )
Figura 5.20
(D)
(E)
(F)
Clivagem de um nico embrio de camundongo in vitro. (A) estgio de 2 clulas. (B) estgio de 4 clulas. (C) incio do estgio de 8 clulas. (D) Estgio de 8 clulas compactado. (E) Mrula. (F) Blastocisto. (de Mulnard, 1967, cortesia de J. G. Mulnard.)
182
(A)
(B)
Figura 5.21
Micrografia ao microscpio eletrnico de embries de camundongos de 8 clulas. (A) nocompactados e (B) compactados. (Cortesia de C. Ziomek.)
por uma mudana espetacular em seu comportamento. De repente, se amontoam, maximizando seu contato com outros blastmeros, formando uma bola compacta de clulas (Figuras 5.20C,D e 5.21). Esse pacote estabilizado por junes apertadas que se formam entre as clulas, selando o interior da esfera (Figura 5.22). As clulas no interior da esfera formam junes com espaos, desse modo, permitindo pequenas molculas e ons passarem entre elas. As clulas do embrio compactado se dividem para produzir uma mrula de 16 clulas. Essa mrula consiste de um pequeno grupo de clulas internas rodeadas por um grupo maior de clulas externas (Barlow et al.,1972). A maior parte dos descendentes das clulas externas se tornam clulas do trofoblasto (trofectoderma). Esse grupo de clulas no produz estruturas embrionrias. Ao invs disso, formam o tecido do crio, a parte embrionria da placenta. O crio permite ao feto conseguir oxignio e nutrientes da me. Tambm secreta hormnios para que o tero da me retenha o feto e produza reguladores de resposta imune, fazendo com que a me no rejeite o embrio como faria com um rgo transplantado. No entanto, clulas do trofoblasto no so capazes de produzir clulas do prprio embrio. Elas so necessrias para implantar clulas do embrio na parede uterina (Figura 5.23). O embrio do camundongo derivado dos descendentes das clulas internas do estgio de 16 clulas, suplementada por clulas divididas do trofoblasto durante a transio para o estgio de 32 clulas (Pedersen et al., 1986; Fleming, 1987). Essas clulas geram a massa celular interna que dar origem ao embrio, acompanhada da bolsa com vitelo, alantide e mnio. Essas clulas no aparentam ser somente diferentes das clulas do trofoblasto, mas tambm sintetizam protenas diferentes nesse estgio do desenvolvimento precoce. Durante o estgio de 64 clulas, a massa celular interna (aproximadamente 13 clulas) e as clulas do trofoblasto se tornam camadas de clulas separadas, nenhuma delas contribuindo para clulas do outro grupo (Dyce et al., 1987; Fleming, 1987). Dessa forma, a distino entre os blastmeros do trofoblasto e da massa celular interna representa o primeiro evento diferenciado no desenvolvimento dos mamferos. Inicialmente, a mrula no tem uma cavidade interna. No entanto, durante um processo chamado cavitao, a clula do trofoblasto secreta um fluido para dentro da mrula para criar a blastocele. A massa celular interna fica posicionada de um lado do anel de clulas do trofoblasto (veja Figuras 5.20, 5.22 e 5.23). Essa estrutura chamada blastocisto e outro marco da clivagem de mamferos.
183
(A) Estgio precoce de 8 clulas: no-polar, porm com efeitos de contato local
Figura 5.22
Compactao e formao do blastocisto de camundongo. (A,B) embrio de 8 clulas, (C) mrula de 16 clulas, (D) blastocisto de 32 clulas. O lado esquerdo representa o organismo inteiro ou sua viso em corte. O lado direito detalha as mudanas associadas com o amadurecimento do trofoblasto. (Figuras direita segundo Fleming, 1992.)
(B) Compacto de 8 clulas: polar, correntes inicas. Basolateral: adeso de E-caderina; junes de fendas, ZO-1. Microtbulos acetilados. Apical: microvilosidades, actina cortical, endossomos, actina citoplasmtica, microtbulos Apical
Junes apertadas Lateral
Basal (C) 16 clulas: Adeso basolateral intensificada, laminina, cingulina, mitocndria, vesculas lipdicas. Basal: lisossomos, Golgi Junes apertadas entre clulas exteriores
Junes de fendas entre clulas interiores
(D) 32 clulas: transporte vetorial de fluido. Basolateral: desmossomos. Basal: Na+, K+ - ATPase. Apical: transportadores e canais Microvilosidades
Massa celular interna (ICM) Blastocele
Trofoblasto
E-caderinaDesmossomos Direo da corrente inica Na+, K+ - ATPase Junes de fendas Protenas da membrana apical
Desmossomos Lisossomos secundrios Golgi Filamentos de citoqueratina Microtbulos e actina citoplasmtica
Junes apertadas (ZO-1) (ZO-1) + cingulina Actina cortical Microvilosidades Mitocndrias
184
Figura 5.23
Implantao de blastocistos de mamferos no tero. (A) Blastocistos de camundongo entrando no tero. (B) Implantao inicial do blastocisto no tero de um macaco Rhesus. (A de Rugh, 1967; B cortesia da Carnegie Institution of Washington, Chester Reather, fotgrafo.)
(A)
(B)
&
Especulaes
A Superfcie da Clula e o Mecanismo de Compactao
OMPACTAO CRIA AS circunstncias que trazem tona a primeira diferenciao no desenvolvimento de mamferos: a separao do trofoblasto da massa celular interna. Como isso feito? Existe uma crescente evidncia que a compactao realizada por intermdio de eventos que ocorrem na superfcie das clulas dos blastmeros adjacentes. No primeiro estgio da compactao, cada um dos oito blastmeros interage com os seus vizinhos para sofrer polarizao da membrana. Componentes diferentes da superfcie das clulas migram para regies diferentes da clula (veja Figura 5.22; Ziomek e Johnson, 1980). Isso pode ser observado, marcando certas molculas da superfcie celular com corantes fluorescentes. Uma dessas marcaes, que reconhece a classe das glicoprotenas, mostra que no estgio de 4 clulas, essas glicoprotenas so aleatoriamente distribudas por toda a membrana (Figura 5.24A). No entanto, na metade do estgio de 8 clulas, essas molculas so encontradas predominantemente nos plos mais distantes do centro do agregado (Figura 5.24B). A polarizao da membrana influenciada por interaes clula a clula porque acontece somente quando a clula est em contato, no mnimo, com um outro blastmero. Se um blastmero for separado do resto do embrio perde sua polarizao. Protenas especficas da superfcie celular cumprem o seu papel na compactao. Uma dessas molculas, E-caderina (tam-
(A)
(B)
Figura 5.24
Polarizao de componentes da membrana em blastmeros de camundongo durante o estgio de 8 clulas. (A) Distribuio homognea, no-polar, de componentes da membrana marcados com concanavalina A fluorescente no estgio de 4 clulas. (B) Distribuio heterognea, polar, desses componentes no estgio de 8 clulas. (A de Fleming et al., 1986; B de Levy et al., 1986. Fotografias cortesia dos autores.)
bm conhecida como uvomorulina), uma glicoprotena adesiva de 120-kDa, sintetizada no estgio de 2 clulas distribuda uniformemente por toda a membrana celular. No entanto, com a ocorrncia da compactao, a E-caderina se torna restrita aqueles stios da membrana celular que esto em contato com os blastmeros adjacentes. Anticorpos para essa molcula causam a descompactao da mrula (Figura 5.25; Peyrieras et al., 1983; Johnson et al., 1986). A poro de carboidrato dessa glicoprotena pode ser essencial para o seu funcionamento, sendo a tunicamicina (droga que inibe a glicosilao das protenas) tambm capaz de prevenir a compactao. Experimentos recentes mostraram que a via do fosfatidilinositol tambm pode ser importante para inicializar a compactao. Se embries de 4 clulas de camundongo forem colocados em um meio contendo drogas que ativam a protena quinase C, ocorre compactao prematura. Similarmente diacilglicerdeos podem momentaneamente provocar a compactao de embries de 4 clulas. Quando isso ocorre, a E-caderina acumula-se especificamente nas junes entre os blastmeros (Winkel et al., 1990). Esses resultados sugerem que a ativao da protena quinase C pode iniciar a compactao mudando a localizao da E-caderina. E finalmente, a membrana celular pode tambm ser modificada durante a compactao, por meio de reorganizao do citoesqueleto. As microvilosidades, extendidas
185
por actino-filamentos, aparecem na superfcie de clulas adjacentes, unindo uma clula outra. Essas microvilosidades podem ser os stios onde a E-caderina est funcionando para mediar adeso intercelular. O achatamento dos blastmeros um contra o outro pode, portanto, ter acontecido em virtude do encolhimento do blastmero atravs da despolimerizao da actina (Pratt et al., 1982; Sutherland e Calarco-Gillam, 1983). Dessa maneira, existem evidncias crescentes de que a compactao causada por mudanas na arquitetura da superfcie celular dos blastmeros. No entanto, no est totalmente certo como esses eventos se relacionam um com o outro, ou como so coordenados e integrados na cadeia de eventos que causa a compactao.
(A)
(B)
Figura 5.25
Preveno da compactao por anti-soro contra a glicoprotena da superfcie celular, E-caderina, promotora da adeso. (A) Compactao normal ocorrendo em ausncia do anti-soro. (B) Proliferao sem compactao ocorrendo na presena de anticorpos contra a E-caderina. (Fotografias cortesia de C. Ziomek.)
Formao da massa celular interna O processo crucial para o precoce desenvolvimento dos mamferos a criao da massa celular interna distinta do trofoblasto. Como a clula direcionada para um ou outro desses caminhos? Como a clula informada que dar origem a uma poro do mamfero adulto ou que dar origem a um singular tecido de sustentao que ser descartado no nascimento? As observaes de embries vivos sugerem que essa importante deciso est meramente no fato de a clula estar no lugar certo na hora certa. At o estgio de 8 clulas, no existem diferenas bvias na bioqumica, morfologia ou potncia de qualquer um dos blastmeros. No entanto, a compactao forma clulas internas ou externas com propriedades muito diferentes. Marcando os vrios blastmeros, muitos investigadores descobriram que as clulas que estavam do lado de fora formariam o trofoblasto, enquanto que as clulas do lado de dentro formariam o embrio (Tarkowski e Wrblewska,1967; Sutherland et al.,1990).*Hillman e colegas (1972) mostraram que quando cada blastmero de um embrio de camundongo de 4 clulas colocado na superfcie externa de uma massa de blastmeros agregados, as clulas externas transplantadas somente daro origem ao tecido trofoblasto. Portanto, a opo da clula transformar-se em trofoblasto ou embrio depende se essa clula era externa ou interna aps a compactao. Pelcida Fuga da Zona Pelcida Enquanto o embrio est se movendo atravs do oviduto, rumo ao tero, o blastocisto se expande dentro da zona pelcida (a matriz extracelular do vulo foi essencial para a ligao do espermatozide durante a fertilizao). As membranas celulares das clulas trofectodrmicas contm uma bomba para o sdio (a Na+/K+-ATPase) de frente para a blastocele; as protenas bombeiam sdio para a cavidade central. Essa acumulao de ons de sdio permite que a gua entre por osmose, dessa maneira, dilatando a blastocele (veja Figura 5.22; Borland, 1977; Wiley, 1984). Durante esse perodo, essencial que a zona pelcida previna o blastocisto de aderir s paredes do oviduto. Quando tal aderncia acontece em humanos, chamada de ectpica ou
* As clulas internas mostraram virem mais freqentemente da primeira clula a se dividir no estgio de 2 clulas. Essa clula normalmente produz o primeiro par de blastmeros a alcanar o estgio de 8 clulas, e essas clulas se dividem de tal modo que elas esto soltas dentro dos blastmeros agregados (Graham e Kelly, 1977).
186
Figure 5.26
Blastocisto de camundongo eclodindo da zona pelcida. (Fotografia de Mark et al., 1985, cortesia de E. Lacy.)
gravidez tubria. Essa condio especialmente grave, porque a implantao do embrio no oviduto pode causar uma hemorragia com perigo de morte. Quando o embrio alcana o tero, no entanto, ele deve livrar-se da zona pelcida para que possa aderir parede uterina. O blastocisto do camundongo se livra da zona pelcida perfurando um pequeno buraco e se espremendo atravs dele enquanto se expande (Figura 5.26). Uma protease semelhante tripsina, a estripsina, localizada na membrana celular lisa a matriz fibrilar da zona pelcida (Perona e Wassarman, 1986; Yamazaki e Kato, 1989). Uma vez fora, o blastocisto pode fazer contato direto com o tero. O epitlio uterino agarra o blastocisto em uma matriz extracelular contendo colgeno, laminina, fibronectina, cido hialurnico e receptores heparan sulfato. As clulas do trofoblasto contm os elementos que iro se juntar ao colgeno uterino, fibronectina e laminina; eles sintetizam o proteoglicano heparan sulfato dramaticamente no momento anterior implantao (veja Carson etal., 1983). Uma vez na clula epitelial uterina, o trofoblasto secreta outro conjunto de proteases, incluindo colagenase, estromelisina e ativador de plasminognio. Essas enzimas digestoras de protenas digerem a matriz extracelular do tecido uterino, impedindo o blastocisto de cobrir a si mesmo com a parede uterina (Strikland et al., 1976; Brenner et al.,1989).
&
Especulaes
Gmeos e clulas embrionrias precursoras
S CLULAS PRECOCES do embrio podem substituir uma outra e compensar uma clula ausente. Isso foi primeiramente demonstrado em 1952, quando Seidel destruiu uma clula de um embrio de coelho e demonstrou que a clula remanescente poderia produzir o embrio por inteiro. Uma vez que a massa celular interna (ICM) se separou do trofoblasto, as clulas da ICM constituem um grupo de equivalncia onde cada clula da ICM tem a mesma potncia (nesse caso, cada clula pode originar todos os tipos de clulas do embrio, menos o trofoblasto), e seus respectivos destinos sero determinados por interaes entre os seus descendentes. Gardiner e Rossant (1976) tambm mostraram que se as clulas da massa celular interna (mas no clulas do trofoblasto) so injetadas no blastocisto, tambm contribuem para um novo embrio. J que seus blastmeros podem gerar qualquer tipo de clula no corpo, a massa celular interna tem sido referida, s vezes, como pluriblasto (Johnson e Selwood, 1996).
Gmeos humanos so classificados em dois grandes grupos: gmeos monozigticos (um ovo ou idnticos) e gmeos dizigticos (dois ovos ou fraternos). Gmeos fraternos so o resultado de dois eventos separados de fertilizao, ao passo que, gmeos idnticos so formados de um nico embrio cujas clulas, de alguma forma, dissociam uma da outra. Gmeos idnticos so provavelmente produzidos pela separao de blastmeros precoces ou mesmo pela separao da massa celular interna em duas regies no mesmo blastocisto. [cleave3.html] Casos de gmeos idnticos ocorrem em aproximadamente 25% dos nascimentos humanos. Cerca de 33 % dos gmeos idnticos tm dois crios completos e separados, indicando que a separao ocorreu antes da formao do tecido trofoblasto, no quinto dia (Figura 5.27A). O restante dos gmeos idnticos compartilham do mesmo crio, sugerindo que a separao ocorreu dentro da massa celular interna, aps a formao do trofoblasto. No nono dia, o embrio humano j completou a construo de uma outra camada extra-embrio-
nria, o mnio. Esse tecido forma a bolsa amnitica (ou bolsa de gua), envolvendo o embrio com fluido amnitico, protegendo-o da dessecao e movimentos bruscos (veja Captulo 6). Se a separao do embrio acontecesse aps a formao do crio, no quinto dia, mas antes da formao do mnio, no nono dia, os embries resultantes deveriam ter um crio e dois mnios (Figura 5.27B). Isso acontece em aproximadamente dois teros dos casos de gmeos humanos idnticos. Uma pequena porcentagem de gmeos idnticos nascem com um nico crio e mnio (Figura 5.27C). Isso significa que a diviso do embrio aconteceu aps o nono dia, e tais recmnascidos correm o risco de serem gmeos ligados (Siameses). [cleave4.html] A habilidade de produzir um embrio completo, a partir de clulas que normalmente iriam produzir somente uma poro, chamada de regulao e discutida no Captulo 15. Regulao tambm vista na habilidade que dois ou mais embries precoces tm para formar um camundongo quimrico ao invs de gmeos, trigmeos ou um monstro de mltiplas cabeas. Camun-
187
Embrio
Saco vitelnico mnio
2 Crios
(A)
2 mnios Massa celular interna 1 Crio
(B)
Embrio bicelular Blastocele
2 mnios
1 Crio
(C)
1 mnio Crio
Figura 5.27
Diagrama mostrando a relao entre a formao de gmeos monozigticos humanos e as membranas extra-embrionrias. (A) A ciso ocorre antes da formao da trofectoderma, de modo que cada gmeo tem o seu prprio crio e mnio. (B) A ciso ocorre aps a formao da trofectoderma, porm, antes da formao do mnio, resultando em gmeos que tm sacos amniticos individuais, porm, compartilhando um crio. (C) Ciso aps a formao do mnio conduz a gmeos em um saco amnitico, e um nico crio. (Segundo Langman, 1981.)
dongos quimricos so o resultado de duas ou mais clivagens precoces (normalmente 4- ou 8-clulas) de embries que foram agregados artificialmente para formar um embrio composto. Como mostrado na Figura 5.28A, as zonas pelcidas de dois embries geneticamente diferentes so removidas e os embries so unidos para formar um blastocisto em comum. Esses blastocistos preparados so implantados no tero da me adotiva. Quando nascem, os descendentes quimricos tm algumas clulas de cada embrio. Isso prontamente observado quando os blastmeros agregados vm de uma linhagem que difere na cor da pelugem. Quando blastmeros de linhagem preta e branca so agregados o resultado normalmente um camundongo malhado (Figura 5.28B). Existe at evidncia que embries
humanos podem formar quimeras (de la Chappelle et al.,1974; Mayr et al.,1979). Esses indivduos tm dois tipos de clulas diferentes (XX e XY) dentro do mesmo corpo, cada uma com o seu conjunto de caractersticas genticas. A explicao mais simples para tal fenmeno que esses indivduos resultaram da agregao de dois embries, um macho e outro fmea, que estavam se desenvolvendo ao mesmo tempo. Se essa explicao estiver correta, ento dois gmeos fraternos se fundem para criar um nico indivduo composto. Markert e Petters (1978) mostraram que embries precoces de 8-clulas podem se unir para formar uma mrula compactada comum (Figura 5.29) e que o camundongo resultante pode ter a cor da pelugem de trs linhagens diferentes (prancha 21).
Alm disso, eles mostraram que cada um dos trs embries deram origem a precursores dos gametas. Quando um quimrico (preto/marrom/branco) fmea de camundongo acasalava com um macho de pelugem de cor branca (recessivo), a ninhada era um de cada cor. De acordo com nossas observaes sobre formao de gmeos e camundongos quimricos, cada blastmero da massa celular interna deve ser capaz de produzir qualquer clula do corpo. Essa hiptese tem sido confirmada, e ter importantes conseqncias no estudo do desenvolvimento dos mamferos. Quando as massas celulares internas so isoladas e crescem sob certas condies, permanecem indiferentes e continuam a se dividir em cultura (Evans e Kaufman,
188
(A)
Figura 5.28
Pronase
Zona pelcida
Blastmeros
Produo de camundongos quimricos. (A) Procedimento experimental para a produo de camundongos quimricos. Embries de camundongos geneticamente distintos (aqui aqueles com diferentes cores do plo) no incio do estgio de 8 clulas so isolados dos ovidutos dos camundongos e reunidos aps remoo de suas zonas pelcidas por ao de enzimas proteolticas. As clulas formam um blastocisto composto, que implantado no tero de uma me de criao. (B) Um camundongo adulto quimrico mostrando contribuies dos embries pigmentados (pretos) e no-pigmentados (brancos). (Fotografia cortesia de B. Mintz.)
(A)
Blastocisto Blastocistos implantados na me de criao
1981; Martin, 1981). Essas clulas so chamadas de clulas-tronco embrionrias (clulas ES). Como foi mostrado no captulo 2, essas clulas podem ser alteradas na placa de Petri. Genes clonados podem ser inseridos dentro de seu ncleo, ou genes existentes podem ser mutados. Quando essas clulas ES so injetadas nos blastocistos de um outro gene de camundongo, elas podem integrar a sua massa celular interna hospedeira. O embrio resultante tem clulas vindas de ambos tecidos, hospedeiro e doador. Essa tcnica se tornou extremamente importante para determinar a funo dos genes durante o desenvolvimento de mamfero.
(B)
(B) (C )
Figura 5.29
Agregao e compactao de trs embries de camundongo, no estgio de 8 clulas, para formar um nica mrula compactada. Clulas de trs diferentes embries (A) so agregadas para formar uma mrula (B) que sofre compactao para formar um blastocisto nico (C). O camundongo quimrico resultante mostrado na Prancha 21. (de Markert e Petters, 1978, cortesia de C. Markert.)
Clivagem Meroblstica
Como j foi mencionado anteriormente, concentraes de vitelo cumprem um papel importante na clivagem celular. Em parte alguma isso est to aparente como nos tipos de clivagem meroblstica. Aqui, as grandes concentraes de vitelo probem a clivagem no seu todo, exceto em uma pequena poro do citoplasma do ovo. Na clivagem
189
discoidal, a diviso celular limitada a um pequeno disco de citoplasma sem vitelo no topo de um monte formado por vitelo. Na clivagem superficial, o vitelo centralizado permite a clivagem somente na borda perifrica do ovo. Clivagem discoidal Clivagem discoidal uma caracterstica de aves, peixes e rpteis.
AVES. A Figura 5.30 mostra a clivagem de um ovo de ave. A massa do ocito
Sulcos de clivagem
tomada pelo vitelo, permitindo que a clivagem ocorra somente no blastodisco, uma regio de citoplasma ativo de aproximadamente 2-3mm de dimetro no plo animal do ovo. Porque essas clivagens no se estendem para o vitelo citoplasmtico, as clulas da clivagem precoce so, na realidade, contnuas nas suas bases. O primeiro sulco de clivagem aparece centralizado no blastodisco, e outras clivagens se seguem para criar um blastoderma de camada nica. Num primeiro instante, essa camada celular est incompleta, j que as clulas permanecem contnuas ao vitelo subjacente. Da por diante, clivagens equatoriais e verticais dividem o blastoderma em um tecido de cinco a seis camadas celulares. Essas clulas permanecem ligadas com junes apertadas (Bellairs et al.,1975; Eyal-Giladi, 1991). Entre o blastoderma e o vitelo existe um espao chamado cavidade subgerminal, criado quando uma clula blastodrmica absorve fluido da albumina (branco do ovo) e secreta-o entre si e o vitelo (New, 1956). Nesse estgio, as clulas mais profundas do centro do blastoderma so descartadas para criar uma zona pelcida unicelular (as clulas descartadas parecem morrer). O anel perifrico das clulas blastodrmicas que no so descartadas constituem a zona opaca. Quando uma galinha se considera pronta para botar um ovo, o blastoderma j contm 60.000 clulas. Algumas dessas clulas so delaminadas em cavidades subgerminais para formar uma segunda camada (Figura 5.31). Dessa maneira, logo aps a galinha ter botado o ovo, esse contm duas camadas de clulas: a superior epiblasto e a inferior hipoblasto. Entre elas est a blastocele. Detalharemos a formao do hipoblasto no prximo captulo.
PEIXES. Nos ltimos anos, o peixe zebra, Danio rerio, se tornou o organismo favorito para quem deseja estudar o desenvolvimento dos vertebrados. Esses peixes tm grandes crias, procriam o ano inteiro, so facilmente mantidos, tm embrio transparente que se desenvolve fora da me (uma caracterstica importante para a microscopia), e pode ser criado para que mutantes possam ser protegidos e propagados. Ademais, eles se desenvolvem rapidamente, para que 24 horas aps a fertilizao, o embrio j tenha formado a maior parte de seus tecidos e rgos primordiais, apresentando como caracterstica a forma semelhante ao girino (veja Granato e Nsslein-Volhard, 1996; Langeland e Kimmel, 1997). Os ovos de peixes com muito vitelo desenvolvem-se similarmente aos das aves, com a diviso celular ocorrendo somente no blastodisco do plo animal. Observaes da clivagem de ovos de peixe atravs de micrografia ao microscpio eletrnico
Blastoderma
Figura 5.30
Clivagem discoidal em um ovo de galinha, vista do plo animal. Os sulcos de clivagem no penetram no vitelo, e produzido um blastoderma formado por uma nica camada de clulas.
Figura 5.31
Formao de um embrio do pinto com duas camadas. Essa seo sagital prxima margem posterior, mostra uma camada superior consistindo de um epiblasto central que ir entrar nas clulas da foice de Koller (ks) e na zona marginal posterior (mz). Certas clulas do epiblasto caem (delaminam) da camada superior para formar ilhas de polinvaginao (pi) com 5 a 20 clulas cada. Essas clulas sero acrescidas por aquelas clulas hipoblsticas (hyp) que migraram anteriormente da foice de Koller para formar a camada inferior (hipoblstica). (Sc a cavidade subgerminal; gwm a margem da parede germinal). (de Eyal-Giladi et al., 1992, cortesia de H. Eyal-Giladi.)
190
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 5.32
Clivagem discoidal em um peixe-zebra, criando uma regio celular acima do vitelo denso. Em (A), BD significa a regio do blastodisco. (de Beams e Kessel, 1976, cortesia dos autores.)
(E)
(F)
de varredura mostram, de uma bela maneira, a natureza incompleta da clivagem discoidal (Figura 5.32). Como nos embries de anfbios e de ourios-do-mar, divises com clivagens precoce seguem um padro altamente reprodutvel de clivagem meridional e equatorial. Essas divises so rpidas, com periodicidade de aproximadamente 15 minutos cada. As primeiras 12 divises ocorrem sincronicamente, formando um monte celular situado no plo animal de uma grande clula de vitelo. Inicialmente, todas as clulas mantm conexes abertas umas com as outras e com a clula de vitelo subjacente para que clulas de tamanho moderado (17-kDa) passem livremente de um blastmero ao outro (Kimmel e Law, 1985). Comeando por volta da dcima diviso, pode ser detectado o incio da transio da blstula intermediria: comea a transcrio do gene zigtico, desacelerao das divises celulares e o movimento celular evidente (Kane e Kimmel, 1993). Neste ponto, duas populaes de clulas podem ser distinguidas. A primeira a camada de vitelo sincicial (YSL). A YSL formada no nono ou dcimo ciclo, quando as clulas da parte vegetal do blastoderma se fundem com a clula do vitelo adjacente. Isso produz um anel de ncleos com essa parte do citoplasma da clula do vitelo localizado bem embaixo do blastoderma. Expandindo vegetalmente, o blastoderma envolve a clula do vitelo, parte do vitelo sincicial se mover para baixo do blastoderma, para formar a YSL interna e parte dos ncleos se mover vegetalmente, ficando frente da margem do blastoderma, para formar a YSL externa (Figura 5.33A,B). A funo da YSL ainda no foi esclarecida. A segunda populao celular distinguida na transio da blstula intermediria a camada envolvente (EVL; veja Figura 5.33A). Essas so as clulas mais superficiais do
191
(A) Blastoderma Camada envolvente (EVL) Clulas profundas
(B)
YSL interna Ncleos sinciciais do vitelo YSL externa Microtbulos
Clula do vitelo
Figura 5.33
(C) Plo animal Nariz, olho Epiderme Crista neural Ventral Somito do msculo Prnefron Intestino Crebro Medula espinhal Mesoderma Cabea Dorsal
Notocorda Sangue Nadadeiras Corao Msculo
Ectoderma
Faringe Fgado Margem do blastoderma Clula do vitelo
Endoderma
A blstula do peixezebra. (A) antes da gastrulao, clulas profundas esto rodeadas pelo EVL. A superfcie animal do vitelo achatada e contm os ncleos do YSL. Microtbulos se estendem atravs do citoplasma vitelnico e da regio externa do YSL. (B) Estgio tardio de blstula, mostrando a YSL. Os ncleos dessas clulas so derivados de clulas da margem do blastoderma, que liberou seus ncleos para o citoplasma vitelnico. (C) Mapa do destino das clulas profundas depois que a mistura de clulas cessou. A vista lateral mostrada, e no todos os destinos dos rgos esto identificados (para clareza). O mapa gerado injetando clulas com corante de alto peso molecular, determinando em seguida, quais rgos as clulas carregadas de corante geraram. (A e C segundo Langeland e Kimmel, 1996; B de Trinkaus, 1993, cortesia do autor.)
Plo vegetal
blastoderma, e a EVL uma cobertura epitelial fina composta apenas de uma camada de clulas. A EVL finalmente forma a periderme, uma proteo extra-embrionria cobrindo o que se pensa ser descartado mais tarde durante o desenvolvimento. Entre a EVL externa e a YSL interna esto as clulas profundas, das quais surgir o embrio propriamente dito. Os destinos das clulas blastodrmicas precoces no esto determinados, e os estudos de linhagem celular (onde um corante fluorescente no difusvel injetado em uma das clulas e os descendentes daquela clula podem ser seguidos) mostram que existe muita mistura de clulas durante a clivagem. Alm do mais, qualquer clula pode dar origem a uma variedade imprevisvel de descendentes de tecido (Kimmel e Warga, 1987; Helde et al., 1994). O destino da clula blastodrmica parece ser fixado pouco antes do comeo da gastrulao. Nesse perodo, clulas em regies especficas do embrio originam certos tecidos de uma maneira altamente previsvel, permitindo que um mapa do destino possa ser traado (Figura 5.33C; Kimmel et al., 1990). O processo pelo qual a clula contribui para o tecido envolve uma narrativa progressiva de possveis destinos para o desenvolvimento de uma determinada clula. Esse comportamento pode ser observado em algumas das primeiras clulas a terem seu destino estabelecido - as clulas precursoras do corao (Stainer et al., 1993; Lee et al., 1994).
192
Figura 5.34
(A)
(B)
Mapa do destino das clulas profundas da blstula do peixe-zebra. Injeo de um nico blastmero na blstula precoce (estgio de 256-512 clulas) com rodamino-dextrano. Se a clula estiver perto da margem, a meio caminho entre os plos dorsal e ventral, a prognie da clula est restrita a formar parte do corao. Nesse estgio, as clulas marcadas formam descendentes que podem popular tanto a aurcula como o ventrculo. Se a injeo em tais clulas for feita em um estgio mais tardio da blstula, seus descendentes iro popular uma cmara somente. (Segundo Stainier et al., 1993.)
Ventral
Dorsal
Clula do vitelo
Saco vitelnico
Figura 5.35
Clulas individuais que margeiam na metade do caminho as futuras superfcies dorsal e ventral de um embrio em estgio de meia clivagem, podem dar origem s clulas que povoam ambos, o endocrdio e o miocrdio (Figura 5.34A,B). Um pouco mais tarde, os descendentes de qualquer clula podem povoar somente o miocrdio ou o endocrdio. Mais tarde ainda, os descendentes de uma clula somente sero capazes de povoar subcompartimentos especficos de tecido. Por exemplo, clulas da blstula intermediria podem contribuir para a prognie de ambos, trio e ventrculo do corao. Clivagem Superficial A maior parte dos ovos dos insetos passa por clivagem superficial, onde uma grande quantidade de vitelo centralizada confina a clivagem para a borda citoplasmtica do ovo. Um dos detalhes fascinantes desse tipo de clivagem que as clulas no se formam at que os ncleos tenham se dividido. A clivagem de um ovo de inseto mostrada na Figura 5.35. O ncleo do zigoto sofre vrias divises mitticas dentro da parte central do ovo. Na Drosophila, 256 ncleos so produzidos por uma srie de divises nucleares durando, em mdia, 8 minutos cada. Depois o ncleo migra para a periferia do ovo, onde as mitoses continuam, embora com uma velocidade diminuda. O em-
Clivagem superficial em embrio de Drosophila. O numeral acima de cada embrio corresponde ao nmero de minutos decorrido aps a deposio do ovo; o numeral abaixo de cada embrio indica o nmero de ncleos presentes. Clulas polares (que formaro as clulas germinativas) so vistas no estgio de 512 ncleos, embora o blastoderma celular se forme 3 horas mais tarde. Os tempos so representativos, j que a durao de cada ciclo de diviso depende, em parte, da temperatura em que o ovo est sendo incubado.
Ncleos (enrgides)
Enrgides migram para a periferia
Clulas polares
Blastoderma celular
Clulas polares
193
brio chamado agora de blastoderma sincicial, significando que todas clivagens nucleares esto contidas em um nico citoplasma. Nenhuma membrana celular existe a no ser a do prprio ovo. Aqueles ncleos migrando para o plo posterior do ovo logo ficam envolvidos pelas novas membranas celulares para formar o plo de clulas do embrio. Essas clulas do origem s clulas germinativas dos adultos. Dessa maneira, um dos primeiros eventos do desenvolvimento dos insetos a separao das futuras clulas germinativas do resto do embrio. Aps as clulas polares terem sido formadas, a membrana do ocito dobra-se para dentro, entre os ncleos, conseqentemente, separando cada ncleo somtico para uma nica clula (Figura 5.36). Isso forma o blastoderma celular, com todas as clulas arranjadas como uma cobertura de camada nica envolvendo o ncleo do ovo. Como qualquer outra formao celular, a criao do blastoderma celular envolve uma interao delicada entre microtbulos e microfilamentos. A primeira fase da celularizao do blastoderma caracterizada pela invaginao das membranas celulares e sua rede de actina subjacente nas regies entre o ncleo. Esse processo inibido por drogas que bloqueiam os microtbulos. Aps as membranas e sua actina terem passado o nvel do ncleo, a segunda fase da celularizao ocorre. Aqui a velocidade da invaginao aumenta, e o complexo de actino-membranas comea a apertar o que ser o terminal basal da clula (Schejter e Wieschaus, 1993; Foe et al., 1994). Na Drosophila, essa camada composta por aproximadamente 6000 clulas e formada 4 horas aps a fertilizao. [cleave5.html] Embora os ncleos se dividam originalmente dentro de um citoplasma em comum, isso no significa que o citoplasma seja uniforme. Karr e Alberts (1986) mostraram que cada ncleo dentro do blastoderma sincicial est contido dentro de seu prprio pequeno territrio de protenas citoesquelticas. Quando o ncleo alcana a periferia durante o dcimo ciclo da clivagem, cada ncleo fica cercado por microtbulos e
Superfcie do ovo
Fuso mittico Sulco de clivagem ster Ncleo
Canal do sulco Microtbulos
Figura 5.36
Membrana vitelnica
Alongamento nuclear e celularizao do blastoderma de Drosophila. (Segundo Fullilove e Jacobson, 1971.)
194
(A)
(B)
(C)
Prfase 12
Ncleos
Microfilamentos
Microtbulos
Figura 5.37
Localizao do citoesqueleto em volta de ncleos no blastoderma sincicial de Drosophila. Um embrio de Drosophila entrando na prfase da dcima-segunda diviso mittica, foi secionado e corado triplamente. (A) Os ncleos foram localizados por um corante que se liga ao DNA. (B) Microfilamentos foram identificados usando anticorpo fluorescente para actina. (C) Microtbulos foram reconhecidos por um anticorpo fluorescente para tubulina. Domnios do citoesqueleto podem ser vistos em volta de cada ncleo. (de Karr e Alberts, 1986, cortesias de T. L. Karr.)
microfilamentos. O ncleo e suas ilhas citoplasmticas associadas so chamados enrgides. A Figura 5.37 mostra o ncleo e seu microfilamento essencial e os domnios do microtbulo na prfase da dcima segunda diviso mittica. Aps o ncleo alcanar a periferia, o tempo necessrio para completar cada uma das prximas quatro divises se torna gradualmente maior. Enquanto os ciclos de 1 a 10 duram 8 minutos cada, o ciclo 13, o ltimo ciclo no blastoderma sincicial, leva 25 minutos para se completar. O embrio de Drosophila forma clulas no ciclo 14 (i.e. aps 13 divises), e o ciclo 14 assincrnico. Alguns grupos de clulas completam esse ciclo em 75 minutos, enquanto outro grupo leva 175 minutos (Foe, 1989). A transcrio desses ncleos (que comea por volta do dcimo primeiro ciclo) muito intensificada. A desacelerao da diviso celular da Drosophila e o aumento concomitante na transcrio do RNA freqentemente referido como transio da blstula intermediria (midblastula transition). Tais transies tambm so vistas nos embries de inmeros vertebrados e de filos invertebrados. O controle dessa desacelerao mittica (em embries de Xenopus, ourio-do-mar, estrela-do-mar e Drosophila) aparenta sofrer efeito da razo da cromatina para o citoplasma (Newport e Kirshner, 1982a; Edgard et al., 1986). Edgard e seus colegas compararam o desenvolvimento inicial de embries de Drosophila do tipo selvagem com os do mutante haplide. Os embries haplides de Drosophila tm a metade da cromatina a cada diviso celular, em comparao com os do tipo selvagem. Daqui para frente, um embrio haplide no oitavo ciclo celular tem a mesma quantidade de cromatina quanto um embrio do tipo selvagem no stimo ciclo. Esses investigadores descobriram que enquanto embries do tipo selvagem formam sua camada celular imediatamente aps a dcima terceira diviso, os embries haplides passaram por uma diviso extra, a dcima quarta, antes da celularizao. Alm do mais, a durao dos ciclos 11 a 14 em embries do tipo selvagem, corresponde aos ciclos 12 ao 15 em embries haplides. Dessa maneira, os embries haplides seguem um padro similar aos embries do tipo selvagem, porm, com defasagem de uma diviso celular. Se essa defasagem fosse devida ao fato dos mutantes haplides terem uma razo de cromatina para o citoplasma de metade, em relao a do tipo selvagem, em um determinado ciclo, ento seria possvel acelerar a celularizao amarrando (ligando) algum citoplasma, fazendo com que os ncleos se dividam em um volume menor. Quando essa ligao foi realizada, o padro mittico do embrio foi acelerado. A diviso final do blastoderma, sinalizando o fim do perodo de clivagem,
CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade alcanada quando existe um ncleo para cada 61 m3 de citoplasma. Em Xenopus, uma desacelerao similar na taxa mittica observada aps a dcima segunda diviso celular. Aqui tambm, as divises daqui para frente se tornam assincrnicas. Experimentos de ligao sugerem que o tempo de durao da transio dessa blstula intermediria tambm funo da razo volumes cromatina/ citoplasma (Newport e Kirschner, 1982a,b). Em ambos, Drosophila e Xenopus, a iniciao da transcrio pode ser induzida prematuramente aumentando artificialmente a durao do ciclo celular. Quando cicloheximida (um inibidor da sntese protica) atrasa a diviso celular, a transio da blstula intermediria induzida precocemente em Xenopus, e uma exploso de transcries ocorre em Drosophila (Edgard et al., 1986; Kimelman et al., 1987).
195
&
Especulaes
Excees, Generalizaes, e Clivagem Parastica da Vespa
QUE CONSIDERAMOS normal e o que marginalizamos como excees, freqentemente reflete quais animais so mais acessveis para o estudo e mais facilmente domesticados para o laboratrio. No necessrio dizer, que isso no reflete necessariamente as condies do mundo natural. Pelo contrrio, nossas discusses de desenvolvimento animal so freqentemente dificultadas por certos organismos em particular. O desenvolvimento de anfbios geralmente representado pelo Xenopus laevis, e o camundongo e o homem so os nicos mamferos cujos desenvolvimentos so usualmente estudados. Similarmente, embora haja mais de 800.000 espcies de insetos conhecidas, a maior parte dos biologistas do desen-
volvimento conhecem apenas o desenvolvimento de uma espcie: Drosophila melanogaster. A Drosophila ganhou proeminncia somente depois que se fez necessrio relacionar fenmenos embriolgicos com genes particulares. Em 1941, o maior compndio do desenvolvimento de insetos (Embriologia dos insetos e Miripodes, Johannsen e Butt) sequer mencionava essa espcie em seu ndice. Insetos so um excepcionalmente bemsucedido e espalhado subfilo, no sendo surpreendente encontrar uma grande variabilidade no seu desenvolvimento. O desenvolvimento da vespa parasita Copidosomopsis tanytmemus difere marcadamente daquele da Drosophila cannica. Como muitas outras espcies parasitrias, a fmea C. tanytmemus deposita seu ovo den-
tro do ovo de uma outra espcie. Com o desenvolvimento do ovo hospedeiro (normalmente de uma mariposa), o mesmo acontece com o ovo do parasita. No entanto, enquanto o ovo do hospedeiro comea o seu desenvolvimento no padro superficial usual, o ovo da vespa divide holoblasticamente. Ademais, ao invs de diferenciar o eixo do corpo, as clulas do embrio parasita dividem-se repetidamente para se tornar uma massa de clulas no diferenciadas chamadas poligerme. Em duas semanas, a poligerme em crescimento fica suspensa no hospedeiro, permanecendo frouxamente atada ao crebro e traquia larvais (Figura 5.38A; Cruz, 1986a).
Figura 5.38
Olho/cabea da lagarta hospedeira
Desenvolvimento de vespas parasitrias (Encyrtidae). (A) Clivagem holoblstica do ovo de Copidosomopsis tanytmenus produz uma poligerme de clulas no-diferenciadas. (B) Larvas precoces de um gnero relacionado, Pentalitomastix, atacam a larva de Trathala dentro do mesmo hospedeiro. A fotografia de um hospedeiro recmaberto. (A segundo Cruz, 1986a; B de Cruz, 1981, cortesia de Y. Cruz.)
Mrula de 4 dias Ovo (A) Poligerme precoce
Esfago Corpo gorduroso do hospedeiro
Poligerme
(B) Poligerme em expanso
196
Com o crescimento, a poligerme se divide em dzias (s vezes milhares, dependendo da espcie) de discretos grupos de clulas. Cada um desses grupos se torna um embrio! A vespa poliembrionria Copidosoma floridanum produz at 2000 indivduos de um nico ovo fertilizado (Grbic et al., 1996). Essa habilidade que um ovo tem para se transformar em uma massa de clulas, que rotineiramente forma numerosos embries, chamada de poliembrionia. (Poliembrionia caracterstica de certos grupos de insetos e certas espcies de mamferos, tais como o tatu de nove bandas, cujos ovos formam qudruplos idnticos.) A maior parte desses embries de vespa parasita se desenvolvem em larvas normais que levam aproximadamente 30 dias para se desenvolver. Um grupo menor, de cerca de 10 porcento do nmero total de embries, se tornam larvas precoces (Figura 5.38B), que se desenvolvem em uma semana. Elas no s se desenvolvem precocemente, como tm muito pouca estrutura e no sofrem metamorfose. So essencialmente um conjunto de mandbulas mveis. Essas larvas no se
reproduzem, morrendo assim que as larvas normais se formam. Enquanto elas vivem, no entanto, vo at o embrio hospedeiro matando as larvas parasitas de outros indivduos (de espcies diferentes e de outros clones da mesma espcie). Em outras palavras, as larvas precoces so formas predatrias que eliminam possveis competidores (Cruz, 1981, 1986b; Grbic and Strand, 1992). Com a morte das larvas precoces (e suas presas), a larva normal emerge da sua primeira mudana de pele, comea a se alimentar vorazmente dos rgos da larva hospedeira. Em 40 dias, a criao parasita j se alimentou dos msculos do hospedeiro, gordura corporal, gnadas, glndulas de seda, intestinos, cordes nervoso e hemolinfa, e o hospedeiro um pouco mais do que um saco de pele segurando cerca de 70 larvas pupantes de vespa. Aps outros 5 ou 6 dias, os novos adultos perfuram o tegumento do hospedeiro e, em uma cena recordando o filme Alien, provocam a abertura e a sada do hospedeiro, literalmente por comer o seu corpo. Esses adultos freqentemente co-
pulam (a maioria das vezes sobre o corpo do hospedeiro morto), acham um novo hospedeiro para depositar os seus ovos e morrem logo em seguida. Tal ciclo de vida incomodava Charles Darwin, fazendo-o questionar o conceito de uma divindade benigna conhecida por todos. Em 1860 ele escreveu ao biologista americano Asa Gray: Eu no consigo me convencer de que o benevolente e onipotente Deus tenha planejado e criado a Ichneumonidae com a expressa inteno delas se alimentarem dentro dos corpos vivos de lagartas. No entanto, alm de sua utilidade de provocar noes de desconforto no que se refere a ordem natural e natureza da individualidade, as vespas parasitas podem ter conseqncias econmicas importantes. Macrocentrus grandii uma vespa poliembrionria que parasita a broca Europia do milho. A habilidade de um inseto se formar de um embrio por clivagem holoblstica, deve tambm nos encorajar a apreciar a plasticidade da natureza, desencorajando generalizaes precipitadas sobre um completo subfilo de organismos.
I MECANISMO
DE
CLIVAGEM
Regulando o ciclo da clivagem

O ciclo celular das clulas somticas funcionalmente dividido em quatro estgios (Figura 5.39A). Aps a mitose (M), temos o intervalo da pr-replicao (G1), em seguida acontecendo a sntese do DNA (S). Aps o perodo da sntese, temos o intervalo pr-mittico (G2), seguido pela mitose. A progresso dessas fases regulada por fatores de crescimento. Em blastmeros de clivagem precoce, no entanto, a diviso celular pode ser muito simples. Blastmeros precoces de ourio-do-mar no tm G1 replicando o seu DNA durante a ltima parte (telfase) da mitose prvia (Hinegardner et al., 1964). Os ncleos de Xenopus e Drosophila eliminaram as fases G1 e G2 durante a clivagem precoce. (Embries de Xenopus adicionam essas fases ao ciclo celular, algum tempo aps a dcima segunda clivagem. Drosophila adiciona G2 durante o ciclo 14 e G1 durante o ciclo 17.) Nas primeiras 12 divises, Xenopus divide-se sincronicamente em um ciclo celular bifsico: S para M e M para S (Figura 5.39B; Laskey et al., 1977; Newport e Kirschner, 1982a). Os fatores que regulam esse ciclo bifsico esto localizados no citoplasma. Ocitos normais de Xenopus, quando aumentam, so detidos na primeira prfase meitica. So incapazes de se dividirem. Se os ncleos de clulas divididas forem transplantados para esses ocitos, tambm param a diviso. Quando ocitos normais so estimulados por progesterona, retomam sua diviso meitica e param na metfase da segunda meiose. Se o ncleo de clulas no divididas (como neurnios) so colocados no citoplasma de ocitos tratados com progesterona, tambm iniciam a diviso e param
197
(A)
Ciclina B
(B)
Ciclina D Ciclina A
Ciclina E Ciclina A
Figura 5.39
Ciclos celulares de clulas somticas e blastmeros precoces. (A) Ciclo celular de uma clula somtica tpica. A Mitose (M) seguida por uma condio de interfase. Esse ltimo perodo subdividido em fases G1, S (sntese) e G2. Clulas que esto se diferenciando so geralmente removidas do ciclo celular e esto numa fase G1 estendida chamada G0. As ciclinas e suas respectivas quinases, responsveis para progresso atravs do ciclo celular, so mostradas no seu ponto de regulao do ciclo celular. (B) Ciclo celular bifsico mais simples dos blastmeros precoces de anfbios, tendo somente dois estados, S e M. (A segundo Nigg, 1995.)
na metfase (Gurdon, 1968). O citoplasma de ocitos estimulados com progesterona ainda passam por contraes corticais peridicas (caracterstica da diviso), mesmo na ausncia de ncleos ou centrolos. Se fragmentos clonados de DNA so injetados nesses embries anucleados, sua replicao sofre o controle desse ciclo (Hara et al., 1980; Harland e Laskey, 1980; Karsentiket al.,1984). Dessa maneira, a capacidade de diviso celular regulada pelo citoplasma. Fator promotor de maturao Alguns dos fatores que governam a sntese do DNA e a diviso celular foram identificados. O fator induzido por progesterona que permite o ncleo do ocito retomar suas divises uma fosfoprotena de duas subunidades chamada de fator de promoo da maturao (MPF, tambm conhecida como fator promotor da mitose. O MPF foi primeiro descoberto como o principal fator responsvel pela retomada das divises celulares meiticas no ovo ovulado de r (Smith e Ecker, 1969; Masui e Markert, 1971). Esse mesmo fator continua realizando o seu papel aps a fertilizao, regulando o ciclo bifsico dos blastmeros precoces de Xenopus. Gerhart e colegas (1984) mostraram que o MPF sofre mudanas cclicas nos nveis de atividade nas clulas mitticas. A atividade do MPF de blastmeros precoces de rs maior durante M e no detectvel durante S. Durante essa fase S, o MPF existe em estado inativo. Essa ciclicidade tambm observada em blastmeros anucleados. Newport e Kirschner (1984) demonstraram que a replicao do DNA (S) e mitose (M) so dirigidas somente pelo ganho ou perda de atividade do MPF, mesmo na ausncia de sntese protica. As clulas em clivagem pode ficar presas na fase S, incubando-as com um inibidor de sntese protica. Quando o MPF microinjetado nessas clulas, elas entram em M. Seus envoltrios nucleares se partem e suas cromatinas condensam-se em cromossomos. Aps uma hora, o MPF degradado e os cromossomos retornam fase S.
198
&
Especulaes
MPF e Seus Reguladores

A pequena subunidade do MPF: A cdc2 Quinase (QuinaseCiclina-dependente, CDK)
MPF tem uma subunidade grande e outra pequena. A pequena subunidade de MPF uma protena quinase que, quando ativada, pode fosforilar uma variedade de protenas. Dessa forma, MPF funciona adicionando grupos fosfatos s protenas especficas. Um desses alvos a histona H1, que se liga ao DNA. A fosforilao dessa protena pode levar condensao cromossmica. Outro alvo o envoltrio nuclear. Quinze minutos aps a adio do MPF, as trs protenas principais (as lminas) do envoltrio nuclear se tornam hiperfosforiladas, e nos prximos 15 minutos, o envoltrio se despolimerizou e est se desfazendo (Miake-Lye e Kirschner, 1985; Arion et al., 1988). A MPF quinase purificada j foi mostrada fosforilar esses envoltrios nucleares de protenas, e realizar sua despolimerizao in vitro (Peter et al., 1990; Ward e Kirschner, 1990). Um terceiro alvo parece ser a RNA polimerase (Cisek e Corden, 1989), e a fosforilao da RNA polimerase pode ser a responsvel pela inibio da transcrio durante a mitose. Um quarto alvo da quinase parece ser a subunidade reguladora de miosina citoplasmtica. Quando essa protena fosforilada, ela se torna inativa e incapaz de funcionar como uma ATPase dirigindo os filamentos de actina envolvidos na diviso celular (Satterwhite et al., 1992). A inibio dessa miosina durante os estgios iniciais da mitose, pode prevenir divises da clula at depois dos cromossomos terem-se separado. A pequena subunidade de MPF tem sido notavelmente conservada atravs da evoluo e quase idntica quela da fosfoprotena indutora de mitose, p34, sintetizada pelo gene cdc2 da levedura (Dunphy et al., 1988; Gautier et al., 1988). De fato, o gene humano que codifica a protena correspondente pequena subunidade do MPF de Xenopus pode ser inserido no genoma da levedura e causar diviso nos mutantes de levedura deficientes em cdc2 (Lee e Nurse, 1987). A protena p34 pode existir em formas fosforiladas e desfosforilada. A forma ativa parece ser fosforilada
Figura 5.40 O desenvolvimento da regulao do ciclo celular na embriognese de Drosophila.
(A) Ciclina e protena cdc25 (cordo) so abundantes antes da fertilizao. Portanto, durante os primeiros sete ciclos celulares, a atividade da MPF quinase permanece constante e as divises celulares prosseguem to rapidamente quanto funcionam as enzimas e os substratos. medida que a ciclina degradada, sua sntese (de mRNA estocado no citoplasma) torna-se limitante no ciclo 8. No ciclo 14, o mRNA materno para ciclina desapareceu, e deve ser sintetizado de genes nucleares. Alm disso, a degradao das protenas do cordo comanda nova sntese a partir do ncleo. Pr-MPF acumula mas no ativado at que a fosfatase cordo cliva os fosfatos T-14 e Y-15 da cdc2 quinase. O mecanismo que relaciona a atividade do MPF com o trmino da sntese de DNA e a iniciao da citocinese esto sendo investigados. (Segundo Edgar et al., 1994.)
Regulado zigoticamente
Regulado maternalmente Ciclina maternal e protenas de cordo presentes MPF ativo Protena Ciclina Ciclina Ciclina Protena maternal de cordo presente Ciclina Ciclina mRNA Ciclina Degradao
Pr-MPF Ciclina Sntese de ciclina (zigtica) Desfosforilao cdc 25/cordo fosfatase (zigtica)
MPF ativo Ciclina
Sntese de ciclina
MPF ativo Ciclina Degradao da ciclina
Mitose Quinase ativa de protenas maternas (limita substrato) Ciclo Divises nucleares
Mitose Ciclo dirigido pela traduo de nova ciclina de mRNA materno
Mitose Ciclo dirigido pela cdc25/fosfatase de cordo
Mitose
199
em treonina-161 (T-161) e desfosforilada em tirosina-15 (Y-15). Ambas condies so importantes para a atividade da quinase (Gould e Nurse, 1989; Solomon, 1993).
A maior subunidade do MPF: Ciclina

Ento, como regulado o MPF? Desde que a clivagem de Xenopus parecia ser regulada por uma protena similar quela que regula a diviso celular da levedura, pensou-se que qualquer regulador da protena da levedura teria contrapartida no embrio animal. Um dos principais reguladores da protena MPF de levedura o produto do gene cdc13, uma protena 56-kDa chamada p56cdc13. Esse gene foi clonado, e a seqncia de sua protena codificada foi considerada muito semelhante s protenas ciclina B encontradas em numerosos animais (Goebl e Byers, 1988; Solomon et al., 1988). As protenas ciclina B em clulas em estgio de clivagem mostram um comportamento peridico, acumulando durante a fase S e sendo degradada durante a mitose (Evans et al., 1983; Swenson et al., 1986). Ciclinas so freqentemente codificadas pelo mRNA armazenado no citoplasma do ocito, e se sua transformao em protenas seletivamente inibida, a clula no entrar em mitose (Minshull et al., 1989). A protena ciclina B combina com a quinase cdc2 do MPF para criar o comple-
xo MPF. A ciclina permite a subunidade quinase cdc2 tornar-se fosforilada nos resduos treonina-14 (T14), tirosina-15 (Y15) e treonina-161 (Figura 5.40). A fosforilao no T-161 necessria para a atividade do MPF, mas fosforilaes nos T-14 e Y-15 a inibem. Dessa forma, quando fosforilada nessas posies a quinase permanece inativa, porm, potencialmente funcional. O suprimento de molculas MPF potencialmente funcionais (pr-MPF) acumula durante o perodo tardio de S.
A Fosfatase cdc25: Iniciadora de Mitose

A mitose se inicia com uma abrupta desfosforilao de todas essas subunidades MPF quinase na posio 15. Isso conseguido pelo aparecimento da fosfatase cdc25 (Edgar e OFarrell, 1989; Gautier et al., 1991; Jessus e Beach, 1992; Lee et al., 1992). Dessa maneira, a acumulao gradual do MPF convertida em uma breve exploso de atividade quinase que inicia a mitose. Essa fosfatase (que tem sido encontrada em inmeros organismos) ela prpria regulada pelo desenvolvimento. Na Drosophila, a fosfatase cdc25 (produto do gene string, de cordo) inicialmente sintetizada pelo mRNA armazenado no ocito durante os 13 primeiros ciclos celulares. No entanto, durante o pr-
ximo ciclo, o cordo mRNA materno degradado; se o ncleo no transcrever seu prprio cordo mRNA, as clulas no se dividiro. Edgard e OFarrel (1989) mostraram que aquelas clulas que se dividem esto sintetizando a sua prpria fosfatase cdc25, enquanto aquelas que no so capazes de se juntar a esse ciclo, no realizaro a diviso (Figura 5.41). Essa degradao e a necessidade de re-sintetizar essa protena explicariam a mudana de controle citoplasmtico para controle nuclear da diviso como visto no ciclo 14. Em Drosophila, existe uma maturao desenvolvimental da regulao da quinase MPF ativa (veja Figura 5.40; Edgard et al., 1994). Na ovulao, o complexo pr-MPF armazenado no ovo desfosforilado em T14 e Y-15 pelo recm-traduzido cordo (cdc25) da protena. Durante os primeiros sete ciclos nucleares, o MPF ativo permanece em nveis altos, e o ncleo divide-se to rapidamente quanto as enzimas sintetizadoras de DNA permitem. Durante os ciclos 8-13, a ciclina comea a ser degradada na metfase, levando a flutuaes peridicas de atividade MPF-quinase. A sntese da ciclina do mRNA armazenado no ocito armazenado se torna o passo limitante para a mitose. A degradao do cordo da ocito-protena leva parada do ciclo celular na interfase do ciclo 14.
(A)
Figura 5.41 Correlao da expresso do gene string (cordo) com a diviso celular em embries de Drosophila. (A) Nesse exemplo, um embrio de estgio tardio 14 corado com uma seqncia nucleotdica radioativa que especificamente reconhece e liga o mRNA cordo (visto aqui como pontos brancos na auto-radiografia). (B) Um embrio ligeiramente mais velho corado com anticorpos fluorescentes para tubulina para mostrar os microtbulos dos fusos mitticos. Uma comparao da microfotografia de fluorescncia com a auto-radiografia obtida da ligao da sonda radioativa mostra que somente aquelas clulas capazes de se dividirem, sintetizam mRNA string. (C) Anticorpos para a protena ciclina A mostram que ela degradada aps a mitose e no vista nas regies que contm a protena de cordo. (de Edgar e OFarrell, 1989, cortesia de B. A. Edgar.)
(B)
(C)
200
Grandes concentraes de pr-MPF se acumulam. As mitoses para as divises 14, 15 e 16 so iniciadas somente quando essa pr-MPF desfosforilada nas posies T14 e Y-15 pela protena cordo. Essa protena derivada de transcrio nuclear ao final de cada perodo G2. A mitose passou do controle citoplasmtico para o nuclear.
Outras ciclinas e quinases ciclinadependentes

MPF o primeiro membro descoberto de uma famlia de protenas dimricas que tm estruturas muito similares. Cada uma dessas protenas contm uma ciclina e uma quinase ciclina-dependente, que quando dependente do MPF chamada cdk1. Pelo menos outras sete quinases ciclina-dependentes esto envolvidas em clulas maduras de vertebrados, e mais de uma dzia de ciclinas foram identificadas. Os papis de algumas dessas quinases foram determinados (como mostra a Figura 5.39). Entre essas enzimas, uma das mais crticas a ciclina E/cdk2. Enquanto MPF (ciclina B/cdk1) crtica para a entrada na mitose (M), ciclina E/cdk2 crtica para a habilidade da clula entrar na fase S, permitindo a ocorrncia de sntese do DNA. A regulamentao do desenvolvimento dessa protena uma fase crtica no desenvolvimento da Drosophila. Embries de Drosophila adicionam um estgio G2 antes da mitose, quando a protena de cordo se torna limitante no ciclo 14. A fase G1 adicionada ao ciclo 17 quando ciclina E se torna o fator limitante para a replicao do DNA. Em embries precoces, ciclina E e cdk2 esto sempre presentes, seus mRNA sendo fornecidos pelo ocito e traduzidos atravs de todos os primeiros 15 ciclos de diviso. A mensagem para ciclina degradada durante o ciclo 16, levando deficincia dessa protena no ciclo 17. Dessa forma, a maioria das clulas param no G1 desse ciclo, no entrando no perodo de sntese do DNA. A comeam a diferenciar-se. (As excees so as clulas precursoras dos nervos que continuam a proliferar, e as clulas do intestino, que continuam a produzir DNA na ausncia de diviso celular. Nesses casos, a ciclina E derivada dos genes zigticos.) Se ciclina E induzida ectopicamente, as clulas retidas sofrem uma nova rodada de sntese de DNA (Knoblich et al., 1994). Pensa-se que a ciclina E controla a sntese do DNA, fosforilando certos fatores de transcrio que regulam as transcries das protenas necessrias para a
replicao do DNA (Duronio e OFarrell, 1994). Certamente, quando as clulas saem normalmente do ciclo para comear a se diferenciarem, expressam a protena Dacapo, um inibidor de ciclina E/cdk2 (Lane et al., 1996; de Nooij et al., 1996). A regulao das ciclinas uma funo crtica no desenvolvimento. Primeiro, imagine as clulas da cartilagem de nossas pernas sofrendo mais uma diviso celular; seramos muito maiores do que agora. Pior, imagine que essa desregulao ocorresse em somente uma de nossas pernas. Ainda pior, imagine se a diviso da cartilagem no fosse coordenada com a diviso da pele e dos vasos sangneos. A regulao desses eventos coordenada atravs de hormnios e fatores de crescimento que, por fim, regulam as ciclinas que controlam a passagem atravs dos ciclos das clulas. Segundo, quando a ciclina se torna ativa sem regulao externa ou quando ciclinas se tornam estimuladas por protenas mutantes, o crescimento das clulas continua sem controle externo, e se desenvolve um tumor. Em clulas maduras de vertebrados, as ciclinoenzimas D/cdk4,6 cumprem um papel crucial no desenvolvimento. Em diversos tipos de clulas, controlam a dicotomia entre a diviso e a diferenciao celular. [cleave6.html]
comeo da mitose; mas a prpria montagem do fuso necessria para o funcionamento apropriado da ciclina B (Minshull et al., 1994). Se os fusos so formados incorretamente, a ciclina B cessa seu funcionamento, e a mitose pra. Tambm parece haver retroalimentao entre a cromatina replicante e as quinases ciclina-dependentes, fazendo com que a mitose no comece at que o DNA tenha comeado a replicarse, e somente uma rodada de replicao normalmente permitida durante a diviso celular (Chong et al., 1995; Madine et al., 1995). As molculas que mediam essas trocas esto agora sendo estudadas.
Fator Citosttico
A sntese e a degradao do MPF leva a ciclagem das clulas. No entanto, se a degradao da ciclina for prevenida, o MPF permanece ativo e a clula travada na metfase (Murray et al., 1989). Isso o que acontece, aparentemente, durante o desenvolvimento do ocito da r. O ocito maduro da r cessa a diviso celular produzindo uma protena chamada fator citosttico (CSF), que mantm o ocito preso na metfase da segunda diviso meitica (Figura 5.42). Essa protena contm os produtos dos genes c-mos e cdk-2, e parece agir bloqueando a degradao da ciclina (veja o Captulo 22). Uma vez que a ciclina no degradada, MPF permanece ativo, e
Pontos de Controle para Diviso Celular: DNA e Fusos

O ciclo celular exige uma excepcional intricada coreografia da citocinese, replicao de DNA, montagem de fusos e metabolismo celular. Nesse conjunto, ciclinas e quinases ciclina-dependentes so alvos e causadores da regulao. O sistema ciclinaquinase parece coordenar esses eventos. Por exemplo, a fibra do fuso mittico no pode formar at a ciclina B/cdk1 sinalizar o
Figura 5.42
Nveis do fator promotor de amadurecimento (MPF) durante o desenvolvimento precoce da r Xenopus laevis. O sinal normal de maturao o hormnio progesterona, que estimula a ovulao dos ocitos e o incio da meiose. (Segundo Murray e Kirschner, 1989.)
Entrada de espermatozide, aumento de Ca2+ livre, inativao de CSF
Estmulo para amadurecimento (progesterona ou MPF) Alta Atividade de MPF Baixa
CSF estabiliza MPF
Ocito Imaturo
Meiose I
Meiose II
Ocito maduro
Primeira clivagem
Segunda clivagem
201
o ocito permanece na metfase. A liberao de ons de clcio durante a fertilizao ativa a protease que especificamente inativa o CSF (Watanabe et al., 1991). Quando o CSF degradado, a ciclina pode ento ser degradada, e a clula pode retornar fase S. Dessa maneira, um dos efeitos da
liberao de ons de clcio na fertilizao de iniciar a degradao da ciclina e permitir que a clula comece a replicao do DNA. Em seguida, os ritmos da diviso celular so controlados pela atividade do MPF, que por sua vez baseada nos ritmos cclicos da sntese e degradao da ciclina.
Enquanto os ons de clcio esto ocupados desligando a mitose, os sinais da fertilizao que ativam a protena quinase C esto estabelecendo condies de interfase: descondensao da cromatina e reforma do envoltrio nuclear (Bement e Capco, 1991).
O mecanismo citoesqueltico da mitose

Clivagem na verdade o resultado de dois processos coordenados. O primeiro desses processos cclicos a cariocinese, a diviso mittica do ncleo, cujo agente mecnico o fuso mittico, com seus microtbulos compostos de tubulina (o mesmo tipo de protena componente do flagelo do espermatozide). O segundo processo a citocinese, a diviso da clula. O agente mecnico da citocinese o anel contrtil de microfilamentos feitos de actina (o mesmo tipo de protena que alonga os microvilos do vulo e o processo acrossmico do espermatozide). A Tabela 5.2 apresenta uma comparao desses sistemas de diviso. O relacionamento e coordenao entre os dois sistemas durante a clivagem representado na Figura 5.43A, onde o ovo do ourio-do-mar mostrado passando pela primeira clivagem. O fuso mittico e o anel contrtil esto perpendiculares um com o outro, e o fuso interno ao anel contrtil. O sulco da clivagem finalmente seciona o plano da mitose criando, portanto, dois blastmeros geneticamente equivalentes. Os microfilamentos de actina so encontrados no crtex do ovo ao invs do citoplasma central. Sob o microscpio eletrnico, o anel de microfilamentos pode ser visto formando uma banda cortical distinta de 8-10 m de espessura (Figura 5.43B). Esse anel contrtil existe somente durante a clivagem e se estende por 0.1m para o centro do ovo. responsvel por exercer a fora que separa o zigoto em blastmeros; se interrompido, a citocinese pra. Schroeder (1973) props um modelo de clivagem em que o anel contrtil parte o ovo como um fecho de bolsa apertando o ovo, enquanto a clivagem continua. Esse aperto dos anis de microfilamentos cria o sulco da clivagem. Embora a cariocinese e a citocinese sejam normalmente coordenadas, elas so, s vezes, separadas por condies naturais ou experimentais. Nos ovos dos insetos, a cariocinese ocorre diversas vezes antes da citocinese. Outra maneira de induzir esse estado tratar os embries com a droga citocalasina B, que inibe a formao e a organizao de microfilamentos no anel contrtil, assim, interrompendo a clivagem sem parar a cariocinese (Schroeder, 1972). Em alguns momentos, o ncleo continua a se dividir e expressar protenas reguladoras do desenvolvimento, mesmo quando a clivagem bloqueada (Lillie, 1902; Whittaker, 1979).
Tabela 5.2
Cariocinese e citocinese Principal composio protica Microtbulos de tubulina Microfilamentos de actina Principal droga disruptora Colchicina, nocodazola Citocalasina B
Processo Cariocinese Citocinese
Agente mecnico Fuso mittico Anel contrtil
Localizao Citoplasma central Citoplasma cortical
Como foi verificado que a colchicina inibe independentemente vrias funes da membrana, incluindo a osmorregulao e o transporte de ons e nucleosdeos, nocodazol tornou-se a principal droga usada para inibir processos mediados por microtbulos (veja Hardin, 1987).
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Figura 5.43
(A) Microfilamentos (anel contrtil)
(B)
Papel dos microtbulos e microfilamentos na diviso celular. (A) Diagrama da telfase da primeira clivagem. Os cromossomos esto sendo arrastados para os centrolos por microtbulos, enquanto o citoplasma est sendo apertado pela contrao dos microfilamentos. (B) Localizao de microfilamentos da actina no sulco de clivagem. Marcao fluorescente dos microfilamentos de actina mostra o anel contrtil no sulco da primeira clivagem (flecha) de um ovo de ourio-do-mar na telfase. (C) marcao fluorescente da tubulina mostra os steres microtubulares de um ovo de ourio-do-mar durante a telfase da primeira clivagem. (B de Bonder et al., 1988; C de White et. al., 1987.)
Centrolo Cromossomo (C)
Microtbulos
Um dos mais intrigantes problemas no resolvidos da clivagem embrionria, como a citocinese e a cariocinese so coordenadas entre si. Pesquisas in vitro sugerem que a replicao do DNA pode controlar a fosforilao da subunidade quinase cdc2 do MPF e que essa fosforilao pode controlar a habilidade da actina de se contrair (Smythe e Newport, 1992). No entanto, essas observaes podem no ser consistentes com as observaes feitas em clulas embrionrias precoces (Ferrell et al., 1991). O nmero e o local desses sulcos de clivagem parecem ser controlados pelos steres dos microtbulos. Esses steres (Figura 5.43C) so raios microtubulares que se estendem dos plos do fuso mittico para a periferia da clula. Clivagem normal ocorre somente se um par de steres est presente (Wilson, 1901), e ovos polisprmicos (obtendo centrolos de cada espermatozide) formam sulcos de clivagem mltiplos no mesmo ovo (veja Figura 4.20). Em estudos mais recentes, Raff e Glover (1989) mostraram que no embrio de Drosophila, se os centrolos migram ao plo posterior, eles podem formar clulas polares, mesmo na ausncia de ncleo. Dessa maneira, parece que os steres so elementos sine qua non da clivagem. O segundo tipo de evidncia ligando os steres com a formao do sulco de clivagem vem de experimentos nos quais a direo de clivagem mudada pela colocao do ovo sob presso. Pflger (1884) descobriu que quando um zigoto de rs levemente comprimido entre duas placas de vidro, as direes das primeiras trs clivagens so todas perpendiculares ao plano das placas. Ambos, Driesch e Morgan (revisto por Morgan, 1927) fizeram observaes semelhantes com embries de ourio-
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Zigotos (A) (B)
Sulco de clivagem normal (C)
Sulco extra de clivagem extra (D)
Bola de vidro deslocando o aparelho mittico
steres
Interrupo do sulco de clivagem
Fuso
Figura 5.44
do-mar. Em ambos os casos, o plano da terceira clivagem (que normalmente paralelo ao equador do ocito) foi deslocado em 90o. Dessa maneira, com a mudana do local do fuso mittico, pode-se alterar a direo do sulco de clivagem. Rappaport (1961) estendeu esse tipo de experimento, deslocando os fusos mitticos para os lados das clulas. Na Figura 5.44, uma bola de vidro foi usada para deslocar os steres do centro da clula em direo periferia. O sulco de clivagem resultante se estende somente enquanto a bola no aparece do outro lado. Dessa maneira, formada uma clula binucleada, em forma de ferradura. Na prxima diviso, dois aparelhos de fuso se formam entre quatro steres, mas so gerados trs sulco de clivagem! Cada brao da ferradura tem o seu prprio fuso mittico e sulcos de clivagem como esperado, mas um terceiro sulco aparece entre os dois steres no topo da ferradura (Figura 5.44C). Isso demonstra claramente que se os dois steres estiverem prximos um do outro, suas interaes causam a formao de um sulco de clivagem, mesmo na ausncia de um fuso mittico entre eles. Novamente ns observamos que a diviso celular pode ocorrer sem diviso nuclear enquanto os steres estiverem presentes.
Criao de um novo sulco de clivagem pelo deslocamento dos steres. (A,B) Pela interrupo de um sulco de clivagem com uma bola de vidro, cria-se uma clula com forma de ferradura. Na prxima diviso (C,D), cria-se um novo sulco de clivagem, apesar de no haver fuso mittico que o atravessa. (de Rappaport, 1961, cortesia de R. Rappaport.)
A formao de novas membranas

Nossa ltima considerao sobre clivagem embrionria envolve a formao de novas membranas celulares. Sero essas membranas recm-sintetizadas ou so meras extenses da membrana celular do ocito? A resposta que provavelmente ambos mecanismos contribuem para as membranas celulares internas. Embries de anfbios fornecem evidncias que novos componentes da membrana esto sendo sintetizados durante a clivagem precoce. A Figura 5.45A mostra o primeiro sulco da clivagem de um zigoto pigmentado de r. Ao passo que a membrana original tem uma regio cortical pigmentada associada a ela, a nova membrana branca. Essa nova membrana tem tambm propriedades de condutividade eltrica diferentes daquelas da membrana original. Byers e Armstrong (1986) radiorotularam componentes de membrana de ovos de Xenopus recm-fertilizados e seguiram a redistribuio dessas molculas atravs da clivagem, por auto-radiografia. Durante a primeira clivagem, a membrana da superfcie externa do embrio e a membrana da borda principal do sulco de clivagem so altamente marcadas (mostrando serem as regies originais da membrana). Entre elas h uma grande regio desprovida de rtulo radioativo (Figura 5.45B). Dessa maneira, a membrana do sulco um mosaico de diferentes partes. A membrana da parte onde o sulco termina derivada de uma superfcie externa preexistente do ovo, marcada, mas a maior parte da membrana do sulco derivada de regies que so inacessveis aos marcadores de superfcie. Byers e Armstrong especulam que o domnio da membrana intensamente marcada, na borda do sulco, contm as membranas ncoras para o anel subjacente de microfilamentos corticais. A borda do
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(A)
Nova membrana no-pigmentada
(B)
Figura 5.45
Formao de novas membranas na primeira clivagem do ovo de Xenopus. (A) A membrana antiga tem grnulos de pigmento. A nova membrana aparece clara porque no tem esses grnulos. (B) Auto-radiografia de protenas de membrana no sulco da primeira clivagem. A superfcie celular foi radiativamente marcada antes da diviso. (A de Laat e Bluemink, 1974; B de Byers e Armstrong, 1986, cortesia dos autores.)
sulco em embries precoces de Xenopus, tambm contm microtbulos curtos, dispostos radialmente. Pensa-se que esses microtbulos poderiam fornecer um caminho para o movimento de vesculas das membranas em direo ao lugar onde so inseridos na membrana (Danilchik e Funk, 1996). Esses processos de clivagem dividem o citoplasma do zigoto em numerosas clulas. Cada clula pode ter os mesmos genes nucleares, mas seus respectivos citoplasmas podem diferir significativamente. No prximo captulo veremos como esses blastmeros se locomovem e interagem um com o outro para iniciar a estrutura do corpo.
LITERATURA CITADA
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Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias
Meu querido amigo..... a vida infinitamente mais complexa do que qualquer coisa que a mente humana possa imaginar. No ousaramos sequer conceber as coisas que so meros detalhes da existncia. A. CONAN DOYLE (1891) No o nascimento, o casamento ou a morte, mas a gastrulao que verdadeiramente a parte mais importante de nossa vida. LEWIS WOLPERT (1986)
ASTRULAO o processo pelo qual movimentos altamente integrados
de clulas e tecidos, dramaticamente, reorganizam as clulas da blstula. A blstula consiste de numerosas clulas, cujas posies foram estabelecidas durante a clivagem. Durante a gastrulao, essas clulas recebem novas posies e novos vizinhos, e estabelecido o multifacetado plano do corpo do organismo. As clulas que formaro os rgos endodrmicos e mesodrmicos so trazidas para dentro do embrio, ao passo que as precursoras da pele e do sistema nervoso so distribudas na superfcie externa. Assim, as trs camadas germinativas ectoderma externo, endoderma interno e mesoderma intersticial so produzidas inicialmente durante a gastrulao. Ainda, o palco est montado para as interaes desses tecidos recmposicionados. Os movimentos da gastrulao envolvem o embrio inteiro, e migraes celulares em uma parte do organismo gastrulante devem estar intimamente coordenadas com outros movimentos ocorrendo simultaneamente. Mesmo que o padro de gastrulao seja extremamente variado em todo o reino animal, relativamente poucos mecanismos esto envolvidos. A gastrulao, geralmente, envolve os seguintes tipos de movimentos: Epibolia. O movimento de camadas epiteliais (usualmente de clulas ectodrmicas) que se espalham como uma unidade e no individualmente, para envolver as camadas mais profundas do embrio. Invaginao. O dobrar para dentro de uma regio de clulas, de maneira semelhante cavidade formada quando se empurra com o dedo a superfcie de uma bola de borracha macia. Involuo. A internao ou movimento de interiorizaro de uma camada externa em expanso, de modo a se espalhar na superfcie interna das clulas externas remanescentes. Ingresso de clulas. A migrao de clulas individuais da camada superficial para o interior do embrio. Delaminao. A separao de uma camada celular em duas ou mais camadas mais ou menos paralelas. Ao considerarmos gastrulao em diferentes tipos de embrio, devemos levar em conta as seguintes questes (Trinkaus, 1984a): Qual a unidade da atividade migratria? a migrao dependente do movimento de clulas individuais, ou so as clulas parte de uma camada migrante? Por mais extraordinrio que possa parecer, propriedades migratrias regionais podem ser totalmente controladas por fatores citoplasmticos que 209
210
so independentes da celularizao. F. R. Lillie (1902) conseguiu ativar, partenogeneticamente, vulos do aneldeo Chaetopterus e suprimir sua clivagem. Muitos eventos do desenvolvimento precoce ocorreram mesmo na ausncia de clulas. O citoplasma do zigoto se separou em regies definidas, e os clios se diferenciaram nas partes apropriadas do ovo. Ainda mais, o citoplasma claro externo migrou para baixo em direo regio vegetativa, de uma maneira muito parecida epibolia das clulas do hemisfrio animal durante o desenvolvimento normal. Isso ocorreu precisamente no momento em que ocorreria a epibolia durante a gastrulao. Assim, a epibolia pode ser (pelo menos em alguns aspectos) independente das clulas que formam a regio migratria. A expanso ou dobramento de uma camada celular deve-se a fatores intrnsecos prprios, ou s foras extrnsecas que a estendem ou a distorcem? essencial conhecer a resposta a essa pergunta se queremos entender como os vrios movimentos celulares da gastrulao so integrados. Por exemplo, esto as clulas involutivas puxando as clulas epibolizantes para baixo em sua direo, ou so os dois movimentos independentes? Existe uma expanso ativa do tecido total, ou a margem limitante que se expande e arrasta o resto da camada celular, passivamente? So as mudanas na forma e na motilidade celular, durante a gastrulao, conseqncias de mudanas nas propriedades da superfcie celular, tais como adesividade ao substrato ou a outras clulas? Considerando essas questes, observaremos os vrios padres de gastrulao encontrados em equinodermos, anfbios, peixes, aves e mamferos*.
Gastrulao em ourio-do-mar
A blstula do ourio-do-mar consiste de uma nica camada de mais ou menos 1000 clulas. Essas clulas derivadas de diferentes regies do zigoto tm tamanhos e propriedades diferentes. As Figuras 6.1 e 6.2 mostram o destino das vrias regies do zigoto enquanto ele se desenvolve atravs da clivagem e da gastrulao na larva pluteus, caracterstica dos ourios-do-mar. O destino de cada camada pode ser visto atravs de seus movimentos durante a gastrulao. Ingresso do Mesnquima Primrio
FUNO DAS CLULAS PRIMRIAS DO MESNQUIMA. Logo aps a ecloso
da blstula da membrana de fecundao, o seu hemisfrio vegetal comea a se espessar e achatar (Figura 6.2, 9 horas). No centro dessa placa vegetativa achatada, um aglomerado de pequenas clulas comea a se modificar. Essas clulas apresentam movimentos de vibrao em suas superfcies internas, estendendo e contraindo longos e finos processos (30x5 m) chamados filopdios. As clulas ento se dissociam da monocamada epitelial e ingressam na blastocele (Figura 6.2, 9-10 horas). Essas clulas so chamadas de mesnquima primrio e so derivadas dos micrmeros. As 64 ou mais clulas mesenquimatosas primrias do ourio-do-mar so as descendentes dos quatro blastmeros que se formaram pela quarta clivagem assimtrica. Gustafson e Wolpert (1961) usaram filmes com exposio contnua para seguir os movimentos microscpicos das clulas mesenquimatosas dentro da blastocele. No
*A discusso da gastrulao de Drosophila ser transferida para o Captulo 14, quando ela ocorre no contexto da formao do eixo. Lembre-se do alerta feito pelo pesquisador de gastrulao, Ray Keller (comunicao pessoal) Estudantes NO deveriam ler esse material apressadamente, ao contrrio uma cena tpica aquela em que um pobre coitado est debruado sobre este texto s 2.30 horas da madrugada com uma xcara de caf, examinando desesperadamente as figuras para ver se ele ou ela podem entender o que est se passando. Gastrulao (como diz Wolpert na citao no comeo deste captulo) a poca mais importante da sua vida. Vale a pena examin-la criticamente e apreci-la vagarosamente.
CAPTULO 6 Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias
211
Animal (A)
(B)
(C) Mesmeros
(D)
(E)
(F)
(G)
Macrmeros Vegetal Tufo ciliar (I) Mesnquima secundrio Mesnquima primrio Endoderma invaginante Micrmetros veg1 veg2 (K) Estomodeu (boca) Envoltrio ectodrmico Bastonetes esquelticos (mesoderma) Intestino (endoderma) (L) (Vista lateral)
(H)
(J)
(M)
Figura 6.1
Desenvolvimento normal do ourio-do-mar, seguindo o destino das camadas celulares da blstula. (A-F) Clivagem at o estgio de 60 clulas (omitindo o estgio de 2-clulas). (G) Blstula precoce com clios. (H) Blstula tardia com tufo ciliar e placa vegetal achatada. (I) Blstula com mesnquima primrio. (J) Gstrula com mesnquima secundrio. (K) Larva em estgio prismtico. (L,M) Larva pluteus. Os destinos do citoplasma zigtico podem ser seguidos pelas variaes no sombreamento. (N) Fotomicrografia de uma larva pluteus viva de ourio-do-mar. (A-M segundo Hrstadius, 1939; N cortesia de G. Watchmaker.)
(Vista ventral) (N) Boca
Bastonetes esquelticos
nus
9 hs.
9.5 hs.
10 hs.
10.5 hs.
11 hs.
11.5 hs.
12 hs.
13 hs.
Figura 6.2
15 hs. 13.5 hs. 17 hs. 18 hs.
Seqncia completa da gastrulao em Lytechinus variegatus. O tempo mostra a durao do desenvolvimento a 25oC. (Cortesia de J. Morrill.)
212
(A) (B)
Figura 6.3
Formao dos cordes sinciciais por clulas mesenquimatosas do ourio-do-mar. (A) Clulas mesenquimatosas primrias da gstrula precoce se alinham e se fundem para depositar a matriz da espcula de carbonato de clcio. (B) microfotografia eletrnica de varredura de espculas formadas pela fuso das clulas mesenquimatosas primrias para formar os cordes sinciciais. (C) Anel de clulas mesenquimatosas em volta do arquntero (intestino primitivo). A metade animal e todo o arquntero foram removidos. (D) Colocao das clulas mesenquimatosas primrias na larva precoce de Lytechinus variegatus. (A e D de Ettensohn, 1990; B e C de Morrill e Santos, 1985; todas as fotografias, cortesia dos autores.)
(C) Agregados Ventrolaterais
comeo, as clulas parecem se movimentar ao acaso, ao longo da superfcie interna da blastocele, ativamente produzindo e quebrando conexes filopdicas com a parede da blastocele. Finalmente, essas clulas tornam-se localizadas dentro da provvel regio ventrolateral da blastocele, onde considera-se que sua aderncia seja maior. Aqui, as clulas mesenquimatosas primrias se fundem em cordes sinciciais, que formaro o eixo das espculas de carbonato de clcio do esqueleto larval (Figura 6.3). Estudos mais recentes (Cherr et al., 1992) sugerem que a migrao inicial das clulas mesenquimatosas primrias dirigida pela parede da blastocele e pelas fibrilas paralelas do material da matriz extracelular que invadem a blastocele. As clulas mesenquimatosas primrias parecem migrar ao longo da superfcie da blastocele e so envolvidas no emaranhado dessas fibrilas (Figura 6.4).
IMPORTNCIA DA LMINA EXTRACELULAR NO INTERIOR DA BLASTOCELE.
Cadeia dorsal (D)
Cadeia ventral
Espcula
Os eventos que se do no citoplasma e na superfcie celular so fundamentais para o ingresso e a migrao das clulas mesenquimatosas primrias. Gustafson e Wolpert (1967) propuseram um modelo no qual o ingresso dos micrmeros se d atravs de modificaes de sua adeso a outras clulas e s matrizes extracelulares que os rodeiam. Em 1985, Fink e McClay confirmaram as especulaes de Gustafson e Wolpert, medindo as foras de adeso dos blastmeros de ourio-do-mar, em relao camada hialina, lmina basal e a outras clulas. Originalmente todas as clulas da blstula esto ligadas pela sua superfcie externa camada hialina e sua superfcie interna ligada lmina basal secretada pelas clulas (veja Captulo 3). Na sua lateral, cada clula tem outra clula como vizinha. Fink e McClay verificaram que os futuros ectoderma e endoderma (descendentes dos macrmeros e mesmeros, respectivamente) se ligam fortemente entre si e camada hialina, mas aderem fracamente lmina basal (Tabela 6.1). Os micrmeros da blstula mostram, originalmente, um padro similar de ligao. Entretanto, o padro de ligao dos micrmeros muda na gastrulao.
213
(A) (B)
Figure 6.4
Fotografias ao estreo-microscpio eletrnico de varredura de clulas mesenquimatosas primrias dentro da matriz extracelular de fibrilas da blastocele. (A) Clulas mesenquimatosas primrias enredadas na matriz extracelular da gstrula precoce de Strongylus centrotus. (B,C) migrao de clulas mesenquimatosas em estgio de gstrula. As fibrilas da matriz extracelular da blastocele ficaram paralelas ao eixo animal-vegetal e esto intimamente associadas com as clulas mesenquimatosas primrias. (de Cherr et al., 1992; cortesia de G. Cherr.)
(C)
Enquanto outras clulas mantm sua forte ligao camada hialina e s clulas vizinhas, as precursoras do mesnquima primrio perdem sua afinidade a essas estruturas (para aproximadamente 2% do valor original), enquanto que sua afinidade aos componentes da lmina basal e matriz extracelular aumenta 100 vezes. Essa mudana na afinidade faz com que os micrmeros percam suas ligaes com a camada hialina externa e com as clulas circundantes e, atrados pela lmina basal, migram para o interior da blastocele (Figura 6.5). As modificaes na afinidade celular foram
Tabela 6.1 Afinidades de clulas mesenquimatosas e no-mesenquimatosas aos componentesa celulares e extracelulares Fora de deslocamento (em dinas) Tipo celular Micrmeros em estgio de 16 clulas Clulas mesenquimatosas em estgio migratrio Ectoderma e endoderma gastrular Hialino Monocamadas de clulas gastrulares 6.8 x 10-5 1.2 x 10-7 5.0 x 10-5 Lmina basal
5.8 x 10-5 1.2 x 10-7 5.0 x 10-5
4.8 x 10-7 1.5 x 10-5 5.0 x 10-7
Fonte: Segundo Fink e McClay, 1985.
a Clulas testadas foram colocadas em placas contendo hialino, lmina basal extracelular, ou monocamadas celulares. As placas foram invertidas e centrifugadas a vrias foras para deslocar as clulas. A fora de deslocamento calculada pela fora centrfuga necessria para remover as clulas teste do substrato.
214
Matriz extracelular fibrilar Blastocele Lmina basal
Clulas Mesenquimatosas primrias
(A)
Camada hialina
Clios
(B)
(C)
(D)
(E)
Figure 6.5
Ingresso de clulas mesenquimatosas primrias. (A-E) Diagramas interpretativos descrevendo alteraes nas interaes adesivas nas presumidas clulas mesenquimatosas primrias (cor). Essas clulas perdem suas afinidades pelo hialino e por seus blastmeros vizinhos enquanto adquirem afinidade pela lmina basal. Blastmeros no-mesenquimatosos retm suas originais afinidades pelo hialino e clulas vicinais. (F) Montagem de micrografia eletrnica de varredura mostrando o ingresso de clulas primrias de Lytechinus variegatus. (F cortesia de J. B. Morrill e D. Flaherty.)
(F)
correlacionadas com modificaes nas molculas da superfcie celular que ocorreram durante esse perodo (Wessel e McClay, 1985). Como mostra a Figura 6.4, h uma alta concentrao de material da lmina extracelular ao redor das clulas mesenquimatosas primrias ingressantes (Galileo e Morrill, 1985; Cherr et al., 1992). Alm disso, uma vez dentro da blastocele, as clulas mesenquimatosas primrias parecem migrar ao longo da matriz extracelular da parede da blastocele, extendendo seus filopdios a sua frente (Galileo e Morrill, 1985; Karp e Solursh, 1985). A orientao das fibrilas, ao longo do eixo animal-vegetal, pode estar guiando as clulas em sua migrao. Trs protenas parecem ser importantes nessa migrao. Uma a fibronectina, uma grande glicoprotena (400-kDa), que um componente comum das lminas basais, incluindo aquela da blastocele do ourio-do-mar (Wessel et al., 1984). Fink e McClay mostraram que durante a gastrulao, a afinidade dos micrmeros por essa molcula especfica aumenta dramaticamente. O segundo grupo de molculas consiste de proteoglicanos sulfatados encontrados na superfcie das clulas mesenquimatosas ingressantes (veja Captulo 3; Sugiyama, 1972; Lane e Solursh, 1991). Se a sntese (ou sulfatao) desses proteoglicanos inibida, as clulas mesenquimatosas entram na blastocele, mas no continuam a migrar* (Figura 6.6; Karp e Solursh, 1974; Anstrom et al., 1987). A terceira protena, ECM18, encontrada nas matrizes extracelulares das clulas da blastocele e expressa somente durante a gastrulao. Bloquear ECM18 com anticorpos previne tanto a migrao mesenquimatosa primria quanto a invaginao secundria do endoderma (Berg et al., 1996). Porm, esses sinais de orientao no so suficientes, pois os micrmeros sabem quando parar seu movimento e formar espculas perto do equador da blastocele. As clulas mesenquimatosas primrias se organizam em forma de anel em uma posio especfica ao longo do eixo animal-vegetal. Em dois stios perto do futuro lado ventral da larva, muitas dessas clulas mesenquimatosas primrias se agrupam para iniciar a formao de espculas (Figura 6.3). Se um micrmero marcado de outro embrio injetado na blastocele em gastrulao de um embrio de ourio-do-mar, ele migra para o local correto
*Em um dos primeiros experimentos em embriologia qumica, Curt Herbst (1904) observou que embries de ourio-do-mar no gastrulavam adequadamente quando colocados em gua do mar que no continha ons sulfato. Na poca, ele no podia entender o porqu.
215
(A)
(B)
Figura 6.6
Efeito da privao de sulfato no movimento do mesnquima primrio do ourio-do-mar Lytechinus. (A) Gstrula normal. (B) Gstrula anormal formada quando embries so cultivados em gua do mar livre de sulfato. (de Karp e Solursh, 1974, cortesia de M. Solursh.)
e contribui para a formao das espculas embrionrias (Prancha 35). Se clulas mesenquimatosas primrias de embries mais velhos so injetadas em gstrulas mais jovens, elas atrasaro sua diferenciao, migraro como as clulas mais jovens e sero incorporadas normalmente no mesnquima do hospedeiro. Alm disso, se todas as clulas mesenquimatosas do hospedeiro so removidas antes da injeo de clulas mesenquimatosas mais velhas, essas repetiro os estgios iniciais de sua migrao, formando um anel mesenquimatoso e o esqueleto, normalmente (Ettensohn, 1990). Considera-se que essa informao posicional fornecida pelas futuras clulas ectodrmicas e suas lminas basais (von bisch, 1939; Harkey e Whiteley, 1980). Somente clulas mesenquimatosas primrias (e no outros tipos de clulas ou partculas de ltex) so capazes de responder a esses sinais modeladores (Ettensohn e McClay, 1986). Miller e colegas (1995) observaram a existncia de filopdios extremamente delgados (0.3 m de dimetro) no mesnquima esqueletognico (skeletonogenic); esses parecem explorar e sentir a parede da blastocele (Figura 6.7). Esses filopdios contm actina e no so considerados como locomotores. Em lugar disso, so considerados como sensores do ambiente, da mesma maneira que os filopdios nas pontas dos cones de crescimento axonal. Essas extenses delgadas podem ser responsveis pela captao de sinais modeladores dorsoventral e animal-vegetal, a partir do ectoderma (Malinda et al., 1995). Primeiro estgio da invaginao do arquntero Enquanto se forma o anel de clulas mesenquimatosas primrias no plo vegetal da blastocele, mudanas importantes esto ocorrendo nas clulas que permanecem na
Figura 6.7
Videomicrografia de Nomarski mostrando um filopdio longo e fino estendendo-se de uma clula mesenquimatosa primria at a parede ectodrmica da gstrula, assim como um filopdio mais curto estendendo-se para dentro do ectoderma. Os filopdios mesenquimatosos estendem-se atravs da matriz extracelular e contatam diretamente a membrana celular das clulas ectodrmicas. (de Miller et al., 1995; fotografia cortesia de D. McClay.)
216
placa vegetativa. Essas clulas permanecem ligadas umas s outras e camada hialina do ovo, e se movem para ocupar os vazios deixados pelo ingresso do mesnquima; portanto, a placa vegetal se achata ainda mais. Verifica-se, tambm, que a placa vegetal se dobra para dentro e se estende por um quarto ou at a metade do seu caminho para a blastocele (veja Figura 6.2, 10.5-11.5 horas; Figura 6.8A). Ento, repentinamente, a invaginao cessa. A regio invaginada chamada de arquntero (intestino primitivo) e sua abertura no plo vegetal chamada de blastporo. Quais foras atuam para invaginar essas clulas? Lane e colaboradores (1993) mostraram que o envergamento semelhante aquele produzido pelo aquecimento de uma faixa bimetlica. A camada hialina , na verdade, formada de duas lminas: uma externa, formada primariamente de protena hialina, e uma interna, composta de protenas fibropelinas* (Hall e Vacquier. 1982; Bisgrove et al., 1991). As clulas da placa vegetal (e somente essas clulas) secretam um proteoglicano de condroitina sulfato na lmina interna da camada hialina, diretamente abaixo delas. Essa molcula higroscpica (absorvente de gua) incha a lmina interna mas no a externa. Isso causa o envergamento da camada hialina (Figura 6.8B,C). Um pouco mais tarde, uma
*Fibropelinas so armazenadas em grnulos secretores dentro dos ocitos. So secretadas desses grnulos aps a liberao da protena hialina pela exocitose granular cortical. No estgio de blstula, as fibropelinas j formaram um envoltrio, tipo rede, sobre a superfcie do embrio. (A)
Figura 6.8
Invaginao da placa vegetal. (A) Invaginao da placa vegetal de Lytechinus variegatus vista por micrografia eletrnica de varredura da superfcie externa da gstrula precoce. O blastporo est claramente visvel. (B) a camada hialina consiste de lminas internas e externas. Microvilosidades da placa vegetal estendem-se atravs da camada hialina e seu citoplasma contm vesculas secretoras que armazenam um proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG). (C) Os grnulos de armazenamento secretam o proteoglicano para dentro da lmina interna da camada hialina. O proteoglicano absorve gua e entumece a lmina interna, enquanto a lmina externa, ao qual est fixado, no entumece. Isso ocasiona a curvatura para dentro do envoltrio hialino e do epitlio a ele ligado. (A de Morrill e Santos, 1985, cortesia de J. B. Morrill e C segundo Lane et al., 1993.)
(B) (C) Clulas da placa vegetal empurradas para cima
Blastocele interior
Clulas de placa vegetal
Camada hialina
Lmina interna Lmina externa
Microvilosidades
Vesculas secretoras com proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG)
CSPG secretado para a lmina interna absorve gua, causando tumefao
217
Gastrulao precoce
Gastrulao tardia
Figura 6.9
blastporo
Rearranjo celular durante a extenso do arquntero em embries de ourio-do-mar. Nessa espcie, o arquntero precoce tem 20 a 30 clulas ao redor de sua circunferncia. Mais tardiamente na gastrulao, o arquntero tem uma circunferncia constituda de somente 6 a 8 clulas. Clones marcados fluorescentemente podem ser vistos estendendo-se apicalmente. (Segundo Hardin, 1990.)
segunda fora resultante dos movimentos das clulas epiteliais adjacentes placa vegetal, pode facilitar essa invaginao puxando para dentro a camada envergada (Burke et al., 1991). Segundo e terceiro estgios da invaginao do arquntero A invaginao das clulas vegetais ocorre em trs estgios discretos. Aps uma breve pausa, comea a segunda fase da formao do arquntero. Durante essa fase, o arquntero se estende dramaticamente, algumas vezes triplicando seu comprimento. No processo de extenso, o largo e curto intestino rudimentar transformado em um tubo longo e delgado; mas no so formadas novas clulas (veja Figura 6.2, 12 horas; Figura 6.9). Para produzir essa extenso, as clulas do arquntero se reorganizam migrando umas sobre as outras e sofrendo um achatamento (Ettensohn, 1985; Hardin e Cheng, 1986). Esse fenmeno, onde clulas se intercalam para estreitar o tecido e, ao mesmo tempo, lev-lo adiante chamado extenso convergente. Em pelo menos algumas espcies de ourio-do-mar, ocorre um terceiro estgio no alongamento do arquntero. Essa ltima fase iniciada pela tenso propiciada pelas clulas mesenquimatosas secundrias, que se formam na ponta do arquntero e l permanecem (veja Figura 6.2, 13 horas; Figura 6.10). Os filopdios se estendem dessas clulas atravs do fluido da blastocele e fazem o contacto com a superfcie interna da
Figura 6.10
(A)
(B)
Estgio de gstrula intermediria do ouriodo-mar Lytechinus pictus, mostrando extenses de filopdios do mesnquima secundrio estendendo-se da ponta do arquntero at a parede da blastocele. (A) Clulas mesenquimatosas estendendo filopdios da ponta do arquntero. (B) Cabos de filopdios conectando a parede da blastocele ponta do arquntero. A tenso nos cabos pode ser avaliada pela trao exercida sobre a parede da blastocele no ponto de fixao. (Fotografias cortesia de C. Ettensohn.)
218
parede da blastocele (Dan e Okazaki, 1956; Schroeder, 1981). Os filopdios se ligam parede nas junes entre as clulas do blastoderma e, em seguida, se contraem, arrastando o arquntero para cima. Hardin (1988) removeu as clulas mesenquimatosas secundrias com um laser, e como conseqncia o arquntero s pode se alongar aproximadamente em dois teros do seu comprimento total. Quando algumas clulas mesenquimatosas secundrias foram deixadas, o alongamento continuou, embora em velocidade menor do que nos controles. As clulas mesenquimatosas secundrias tm, ento, um papel essencial em elevar o arquntero at a parede da blastocele durante a ltima fase da invaginao. Mas, podem os filopdios mesenquimatosos secundrios se ligar a qualquer parte da parede da blastocele, ou existe um alvo especfico no hemisfrio animal que precisa estar presente para que a ligao ocorra? Existe alguma regio da parede da blastocele que predestinada a se tornar o lado ventral da larva? Estudos de Hardin e McClay (1990) mostram que existe um alvo especfico para os filopdios do hemisfrio animal, que difere de outras regies. Os filopdios das clulas mesenquimatosas secundrias se estendem, tocam a parede da blastocele ao acaso e, em seguida, se retraem. Entretanto, quando os filopdios atingem uma regio especfica da parede, eles permanecem ligados naquele local, se achatam contra essa regio e puxam o arquntero em direo a ela. Quando Hardin e McClay comprimiram o outro lado da parede da blastocele, de modo que o contato com a regio se tornou mais eficiente, os filopdios continuaram a se estenderem e a se contrarem ao tocar a parede daquela regio. Somente quando os filopdios encontraram o alvo que cessaram os movimentos. Com a gstrula contrada de modo a impedir que os filopdios jamais atingissem a rea alvo, as clulas secundrias mesenquimatosas continuaram sua explorao at que finalmente se afastaram do arquntero e encontraram o tecido alvo, como clulas migratrias livres. Parece ento, que existe uma regio alvo destinada a se transformar na regio ventral da larva, que reconhecida pelas clulas mesenquimatosas secundrias e que posiciona o arquntero na regio onde se formar a boca. Quando o topo do arquntero encontra a parede da blastocele nessa regio, as clulas mesenquimatosas secundrias se dispersam no interior da blastocele, onde proliferam para formar os rgos mesodrmicos (veja Figura 6.2, 13.5 horas). Onde o arquntero contata a parede se formar, finalmente, uma boca que se fundir a ele formando um tubo digestivo contnuo. Assim, como caracterstico para os deuterostomatas, o blastporo marca a posio do nus.
Gastrulao em peixes
A transio da blstula intermediria e a aquisio de motilidade celular Durante o dcimo ciclo de clivagem do peixe-zebra, as divises celulares perdem sua sincronia, novos genes so expressos e as clulas se tornam mveis. Essa transio da blstula intermediria (MBT) tambm evidente em rs e em Drosophila. Como discutido no Captulo 5, a MBT parece ser regulada pela relao entre cromatina e citoplasma. Peixes haplides entram na MBT um ciclo mais tarde; peixes tetraplides entram um ciclo antes (Kane e Kimmel, 1993). Parece que alguma coisa na cromatina est removendo por titulao alguma substncia (at agora desconhecida) do citoplasma. O primeiro movimento celular a epibolia das clulas blastodrmicas sobre o vitelo. Na fase inicial, as clulas blastodrmicas internas se movem para o exterior e se intercalam com as clulas mais superficiais (Warga e Kimmel, 1990). Mais tarde, as clulas se movem sobre a superfcie do vitelo envolvendo-o completamente (Figura 6.11). Esse movimento no devido a um arrasto ativo dos blastmeros. Pelo contrrio, o movimento propiciado pela expanso autnoma da camada sincicial do vitelo (YSL) dentro do citoplasma do hemisfrio animal. A camada envolvente (EVL) est
219
(A) 30% DE EPIBOLIA (4.7 HS) Camada envolvente Camada profunda Camada sincicial do vitelo Ventral Dorsal Plo animal
Figura 6.11
Movimentos celulares durante a gastrulao do telesteo Danio rerio. (A) O blastoderma com epibolia 30 porcento completa. (B) Formao do hipoblasto, por involuo de clulas na margem do blastoderma em epibolizao ou por delaminao de clulas do epiblasto. (C) Detalhe da regio marginal. (D) Com 90 porcento de epibolia, o mesoderma pode ser visto rodeando o vitelo, entre o ectoderma e o endoderma. (E) Trmino da gastrulao. (Segundo Driever, 1995, e Langeland e Kimmel, 1997.)
Clula do vitelo Ncleo do vitelo Plo vegetal
(B) ESCUDO (6.0 HS.)
(C) Plo animal Ingresso celular Epiblasto Hipoblasto Escudo Hipoblasto Camada envolvente Epiblasto Dorsal Clulas em involuo Clulas em noinvoluo Sinais indutores mesodrmicos e dorsais Camada sincicial do vitelo Grnulo do vitelo
Ventral
Sinal indutor mesodrmico Plo Vegetal
(D)
Plo animal Mesoderma dorsal Camada envolvente
(E) Anterior
Plo animal Regio ceflica
Camada envolvente Somito #1
Ventral
Dorsal Ventral Dorsal
Mesoderma Ectoderma, neuroectoderma Plo vegetal Mesendoderma: precursores para mesoderma e endoderma Endoderma (90% EPIBOLIA (9 HS) Coto caudal Posterior Plo animal 1 SOMITO (10.3 HS) Regio do tronco
fortemente ligada YSL e arrastada junto com ela. As clulas mais profundas do blastoderma enchem o espao entre a YSL e a EVL enquanto a epibolia se desenvolve. Isso pode ser demonstrado cortando a ligao entre YSL e EVL. Quando isso feito, as clulas blastodrmicas retornam ao topo do vitelo enquanto YSL continua sua expanso ao redor da clula do vitelo (Trinkaus, 1984b, 1992). A expanso de YSL tem como base uma rede de microtbulos em sua estrutura, e radiao ou drogas que
220
impedem a polimerizao de tubulina inibem a epibolia (Strahle e Jesuthasan, 1993; Solnica-krezel e Driever, 1994). Durante a migrao, um dos lados do blastoderma se torna visivelmente mais grosso do que o outro. Experimentos com marcao de clulas indicam que o lado mais delgado marca o stio da futura superfcie dorsal do embrio (Schmidt e CamposOrtega, 1995). Formao das camadas germinais Depois que as clulas blastodrmicas cobrem aproximadamente a metade da clula do vitelo do peixe-zebra (e mais cedo em ovos de peixes com vitelos maiores) um espessamento ocorre ao longo de toda a margem. Esse espessamento chamado de anel germinativo, e composto de uma camada superficial, o epiblasto, e uma camada interna, o hipoblasto. No entendemos como produzido o hipoblasto. Alguns laboratrios alegam que o hipoblasto formado pela involuo das clulas superficiais abaixo da margem, seguida por sua migrao para o plo animal (veja Figura 6.11). A involuo comea na futura poro dorsal do embrio, mas ocorre na margem inteira. Outros laboratrios alegam que essas clulas hipoblsticas ingressam para formar o hipoblasto (veja Trinkaus, 1996). ( possvel que ambos os mecanismos ocorram com diferentes maneiras de formar o hipoblasto predominando em espcies diferentes.) Uma vez formado o anel, as clulas profundas de ambos, epiblasto e hipoblasto, se intercalam no futuro lado dorsal do embrio, para formar um espessamento localizado, o escudo embrionrio (Figura 6.12). Esse escudo funcionalmente equivalente ao lbio dorsal do blastporo de anfbios, pois ele pode organizar um eixo embrionrio secundrio quando transplantado a um embrio hospedeiro (Oppenheimer, 1936; Ho, 1992; veja discusso de gastrulao em anfbios). Assim, enquanto as clulas realizam a epibolia em torno do vitelo, elas tambm esto involuindo nas margens e convergindo anteriormente e dorsalmente em direo
(A)
Plo animal Extenso Escudo embrionrio
Figura 6.12
Convergncia Involuo Epibolia Clula do vitelo
Convergncia e extenso no peixe-zebra. (A) Vista dorsal de movimentos de convergncia e extenso durante a gastrulao do peixe-zebra. A epibolia estende o blastoderma sobre o vitelo; a involuo ou o ingresso geram o hipoblasto; convergncia e extenso trazem clulas do hipoblasto e epiblasto para o lado dorsal para formar o escudo embrionrio. Dentro do escudo, a intercalao estende o cordomesoderma em direo ao plo animal. (B,C) Extenso convergente do cordomesoderma mostrada por aquelas clulas exprimindo o gene no tail (sem cauda), um gene que expresso pelas clulas da notocorda. (D,E) Extenso convergente de clulas mesodrmicais adaxiais (marcadas pela sua expresso de gene snail para flanquear a notocorda. (de Langeland e Kimmel, 1997.)
(B)
(C)
(D)
(E)
221
(A) Vidro para segurar o embrio
(B) Manchas de corante no embrio
(C)
Discos de gar com corante
Lbio dorsal do blastporo
Embrio
Figura 6.13
Colorao vital de embries de anfbios. (A) Mtodo de Vogt para marcao de clulas especficas da superfcie embrionria com corantes vitais. (B-D) Vistas da superfcie do corante em embries sucessivos. (E) Embrio de trito dissecado no plano mediano para mostrar clulas coradas no interior. (Segundo Vogt, 1929.)
Seco em plano de viso (E) (D)
ao escudo embrionrio (Trinkaus, 1992). As clulas hipoblsticas do escudo embrionrio convergem e se estendem anteriormente, finalmente estreitando-se ao longo da linha dorsal mdia do hipoblasto. Esse o cordomesoderma, o primrdio da notocorda (Figura 6.12B,C). As clulas adjacentes ao cordomesoderma, as clulas adaxiais, so as precursoras dos somitos mesodrmicos (Figura 6.12D,E). A convergncia e a extenso no epiblasto traz as clulas presuntivas do crebro de todo o epiblasto para a linha mdia dorsal onde formam a quilha neural. O resto do epiblasto se torna a pele do peixe. O mapa de destino do peixe-zebra, ento, no to diferente daquele da r ou outros vertebrados (como logo veremos). Se abrirmos, conceitualmente, uma blstula de Xenopus no plo vegetal e esticarmos a abertura em um anel marginal, o mapa de destino resultante se parece muito com aquele do embrio do peixe-zebra quando metade do vitelo estava coberto pelo blastoderma (Langeland e Kimmel, 1997).
(E)
Gastrulao de anfbios
O estudo da gastrulao em anfbios ao mesmo tempo uma das mais antigas e uma das mais novas reas da embriologia experimental; mesmo considerando que gastrulao de anfbios foi estudada extensamente no sculo passado, a maior parte de nossas teorias relacionadas aos mecanismos do movimento no desenvolvimento, foram revisadas na dcada passada. O estudo da gastrulao em anfbios foi complicado pelo fato de existir mais de um tipo de gastrulao nos anfbios. Espcies diferentes empregam diferentes maneiras para atingir o mesmo objetivo (Smith e Malacinski, 1983; Lundmark, 1986). Nos ltimos anos, a pesquisa mais intensa se concentrou em Xenopus, portanto, daremos nfase ao seu processo de gastrulao. Movimentos celulares durante a gastrulao de anfbios As blstulas de anfbios tm as mesmas tarefas que seus companheiros, equinodermos e peixes, ou seja, trazer para dentro aquelas reas destinadas a formar os rgos endodrmicos, envolver o embrio com clulas capazes de formar o ectoderma e colocar as clulas mesodrmicas no lugar apropriado entre elas. Os movimentos pelos quais isso conseguido podem ser visualizados pela tcnica de colorao vital. Vogt (1929) saturou fragmentos de gar com corante, como vermelho neutro ou sulfato de azul do Nilo, os quais coram mas no danificam as clulas embrionrias. Esses fragmentos corados de gar foram pressionados contra a superfcie da blstula e uma parte do corante foi transferida para as clulas contatadas (Figura 6.13). Os movimentos de cada grupo de clulas coradas foram acompanhados atravs da gastrulao, e
222
Figura 6.14
Epiderme Placa neural Endoderma acima do blastporo Endoderma abaixo do blastporo (A) EXTERIOR
Mapas do destino da blstula da r Xenopus laevis. Mapas de destino (A) de clulas exteriores e (B) interiores indicam que a maioria dos derivados mesodrmicos so formados de clulas interiores. Nessa vista lateral, o ponto em que se forma o lbio dorsal do blastporo est indicado por uma flecha. (Segundo Keller, 1976.)
Mesoderma lateral Blastporo Somitos (B) INTERIOR
Notocorda
Blastporo
os resultados sumariados em mapas de destino. Esses mapas foram recentemente confirmados e ampliados por tcnicas de microscopia eletrnica de varredura e de injeo de corantes (Smith e Malacinski, 1983; Lundmark, 1986). Estudos com corantes vitais de Lvtrup (1975; Landstrom Lvtrup, 1979) e de Keller (1975, 1976) mostraram que as clulas da blstula de Xenopus tm diferentes destinos, conforme se encontrem nas camadas profundas ou superficiais do embrio (Figura 6.14). Em Xenopus, os precursores mesodrmicos existem somente na camada profunda, enquanto que o ectoderma e endoderma se originam da camada superficial do embrio. Os precursores da notocorda e outros tecidos mesodrmicos esto localizados abaixo da superfcie, na regio equatorial (marginal) do embrio. Em urodelos (salamandras, tais como: Triturus e Ambystoma) e em algumas rs sem ser o Xenopus, os precursores da notocorda e do mesoderma so encontrados em ambas, nas clulas da superfcie e nas clulas marginais profundas (Purcell e Keller, 1993). A gastrulao em embries de r iniciada no futuro lado dorsal do embrio, logo abaixo do equador na regio do crescente cinzento (Figura 6.15). Nesse ponto, as futuras clulas endodrmicas locais invaginam dando lugar formao de um blastporo em forma de fenda. Essas clulas modificam sua forma dramaticamente. O corpo principal de cada clula deslocado na direo interna do embrio, mas o contacto com a superfcie externa mantido por um delgado filamento semelhante a um pescoo (Figura 6.16). Essas clulas garrafa revestem o arquntero inicial. Assim, como na gastrulao do ourio-do-mar, uma invaginao de clulas inicia a formao do arquntero. Entretanto, ao contrrio da gastrulao em ourio-do-mar, a gastrulao na r no comea no plo vegetativo, mas na zona marginal prxima ao equador da blstula, onde se encontram os hemisfrios animal e vegetal. Aqui, as clulas endodrmicas no so to grandes e nem to ricas em vitelo como os blastmeros do plo vegetativo. A prxima fase da gastrulao envolve a involuo das clulas da zona marginal, enquanto as clulas do plo animal sofrem epibolia e convergem no blastporo. Quando as clulas marginais migratrias chegam ao lbio dorsal do blastporo, elas se dirigem para dentro e migram ao longo da superfcie interna das lminas celulares externas. Dessa forma, as clulas que constituem o lbio do blastporo esto constantemente mudando. As primeiras clulas que compem o lbio dorsal so as clulas garrafa que invaginam para formar a borda anterior do arquntero. Essas clulas, mais tarde, se tornam as clulas farngeas do intestino anterior. Enquanto essas primeiras clulas passam para o interior do embrio, o lbio do blastporo passa a ser composto de clulas que involuem para dentro do embrio, tornando-se os precursores do mesoderma da cabea. As prximas clulas involuindo para o embrio, atravs do lbio dorsal do blastporo, so as clulas cordomesodrmicas. Essas clulas formaro a notocorda, uma espinha dorsal mesodrmica transitria que essencial para o incio da diferenciao do sistema nervoso. medida que as novas clulas migram para dentro do embrio, a blastocele deslocada para o lado oposto ao lbio dorsal do blastporo. Enquanto isso, o lbio do blastporo se expande lateral e ventralmente, bem como os processos de formao das clulas garrafa e involuo continuam no blastporo. O blastporo em expanso
223
Plo animal (AP) Arquntero Blastocele Clulas superficiais Clulas profundas Plo vegetal Lbio dorsal do blastporo Blastocele deslocada (B) (C) Mesoderma
Endoderma
(A)
Mesoderma dorsal
Ectoderma Arquntero Notocorda
Mesnquima
Ectoderma Notocorda Lbio lateral do blastporo
Lbio dorsal do blastporo Lbio lateral do blastporo
Endoderma (D) Ectoderma Endomesoderma anterior (E)
Tampo do vitelo Lbio ventral do blastporo
(F) Mesoderma ventral
Figura 6.15
Movimentos celulares durante a gastrulao da r. As sees so cortadas atravs da metade do embrio, e so posicionadas de modo que o plo vegetal seja inclinado na direo do observador e ligeiramente para a esquerda. Os principais movimentos celulares esto indicados por flechas, e as clulas superficiais do hemisfrio animal esto coloridas para permitir o seguimento de sua movimentao. (A,B) Gastrulao precoce. Clulas de garrafa da margem movem-se para o interior para formar o lbio do blastporo, e precursores mesodrmicos involuem sob o teto da blastocele. AP marca a posio do plo animal, que ir mudar medida que a gastrulao prossegue. (C,D) Gastrulao intermediria. O arquntero se forma e desloca a blastocele, e as clulas migram dos lbios lateral e ventral do blastporo para dentro do embrio. As clulas do hemisfrio animal migram em direo da regio vegetal, movendo o blastporo para regio prxima do plo vegetal. (E,F) Perto do fim da gastrulao, a blastocele obliterada, o embrio fica envolvido pelo ectoderma, o endoderma foi internalizado, e as clulas mesodrmicas se posicionaram entre o ectoderma e o endoderma. (Segundo Keller, 1986.)
Figura 6.16
(A)
(B)
Estrutura do lbio do blastporo. (A) Diagrama de clulas de uma seo da gastrulao do embrio da salamandra, mostrando a extenso das clulas-garrafa do blastporo. (B) Viso de superfcie de um lbio dorsal precoce do blastporo de Xenopus. A diferena de tamanho entre os blastmeros animais e vegetais est claramente aparente. (C) Detalhe da regio onde as clulas do hemisfrio animal esto involuindo atravs do lbio do blastporo. (A segundo Holtfreter, 1943; B e C, micrografias de varredura eletrnica cortesia de C. Phillips.)
(C)
Clulasgarrafa
Blastporo
224
(A)
(B) i
Lbio dorsal ii iii
Obturador do vitelo Lbio do blastporo
Lbio lateral
iv
Lbio ventral
Obturador do vitelo
Figura 6.17
Epibolia do ectoderma. (A) Movimentos morfogenticos de clulas migrando para o interior do blastporo e em seguida sob a superfcie. (B) Mudanas na regio ao redor do blastporo quando se formam sucessivamente os lbios dorsal, lateral e ventral. Quando o lbio ventral completa o crculo, o endoderma torna-se progressivamente internalizado. Nmeros ii-v correspondem s Figuras 6.15B-E, respectivamente. (B de Balinsky, 1975, cortesia de B. I. Balinsky.)
como um crescente, desenvolve lbios laterais e, finalmente, um lbio ventral sobre o qual passam clulas precursoras adicionais, mesodrmicas e endodrmicas. Com a formao do lbio ventral, o blastporo forma uma anel ao redor das grandes clulas endodrmicas que permanecem expostas na superfcie do plo vegetativo. Esse pedao remanescente de endoderma chamado de rolha ou obturador do vitelo; ele tambm finalmente internalizado (Figura 6.17). Naquele ponto, todos os precursores endodrmicos foram trazidos para o interior do embrio, o ectoderma envolveu a superfcie e o mesoderma foi colocado entre eles. Posicionando o blastporo Tendo visto os aspectos gerais da gastrulao em anfbios, podemos agora nos ocupar de cada passo em detalhe. A gastrulao no existe como um processo independente na vida do animal. Na verdade, a preparao para a gastrulao j pode ser visualizada no preciso momento da fuso vulo-espermatozide. O vulo tem uma polaridade ao longo do eixo animal-vegetal. O destino geral dessas regies pode ser previsto antes da fecundao. A superfcie do hemisfrio animal se transformar nas clulas do ectoderma (pele e nervos), o hemisfrio vegetal formar as clulas do intestino e rgos associados (endoderma), e as clulas mesodrmicas sero formadas a partir do citoplasma interno, ao redor do equador. Assim, as camadas germinativas podem ser mapeadas no vulo; porm, isso nada diz sobre qual parte do ovo formar a frente e qual as costas. Os eixos dorsoventral (dorso-frente), ntero-posterior e direito-esquerdo ainda no foram determinados. Os eixos dorsoventral e ntero-posterior so especificados pelo deslocamento do citoplasma do zigoto durante a fecundao. No Captulo 4 discutimos a rotao do citoplasma cortical relativo ao citoplasma interno no ovo da r. O citoplasma interno permanece orientado em relao gravidade devido a sua densa acumulao de vitelo, enquanto o citoplasma cortical gira 30o na direo do hemisfrio animal (para cima) em direo ao ponto de entrada do espermatozide (veja Figura 4.34).
225
Essa rotao faz com que o eixo animal-vegetal da superfcie do ovo se desloque 30o relativo ao eixo animal-vegetal do citoplasma interno. Dessa maneira, um novo estado de simetria adquirido. Enquanto que o vulo era radialmente simtrico em relao ao eixo animal-vegetal, o ovo fecundado agora tem um eixo dorsoventral e bilateralmente simtrico (tem lados direito e esquerdo). O citoplasma interno tambm se move, e microscopia de fluorescncia de embries precoces mostrou que os padres citoplasmticos das clulas presuntivas dorsais so diferentes daqueles das clulas presuntivas ventrais (Prancha 7). Esses movimentos citoplasmticos ativam o citoplasma oposto ao ponto de entrada do espermatozide, a iniciar a gastrulao (Figura 6.18). O lado pelo qual entra o espermatozide marca a futura superfcie ventral do embrio; o lado oposto, onde se inicia a gastrulao, marca o futuro dorso (costas) do embrio (Gerhart et al., 1981; Vincent et al., 1986). Mesmo que o espermatozide no seja necessrio para induzir esses movimentos no citoplasma do ovo, ele importante na determinao da direo dessa rotao. Se um ovo artificialmente estimulado anucleado, a rotao cortical ainda se d no tempo correto. Entretanto, a direo desse movimento imprevisvel. (De fato, em ovos disprmicos existe uma nica direo de rotao.) O espermatozide parece fornecer um sinal espacial que orienta a rotao autnoma do citoplasma, mas a rotao citoplasmtica que essencial para o futuro desenvolvimento. Alm disso, se essa rotao cortical bloqueada, no h o desenvolvimento dorsal, e o embrio morre como uma massa de clulas ventrais (primariamente intestinais) (Vincent e Gerhart, 1987). A direo do movimento citoplasmtico determina qual lado ser o dorsal e qual ser o ventral. A direo preferencial fornecida pelo ponto de entrada do espermatozide pode ser sobrepujada por um redirecionamento mecnico da relao espacial entre os citoplasmas cortical e subcortical. Quando se impede a rotao do ovo (por imerso em um polissacardeo que provoca o colapso do espao perivitelino entre o ovo e o envoltrio de fertilizao) ele pode sofrer uma rotao de 90o de modo que o eixo animal-vegetal fique horizontal e no vertical e o ponto de entrada do espermatozide voltado para cima (Gerhart et al., 1981; Kirschner e Gerhart, 1981; Cooke, 1986). Quando ovos fecundados so inclinados dessa maneira por trinta minutos, partindo da metade do primeiro ciclo de clivagem, o citoplasma gira de tal maneira que quase todos os embries iniciam a gastrulao no mesmo lado da entrada do espermatozide (veja Figura 6.18). A discusso precedente sugere que deve ser possvel ter dois stios de iniciao de gastrulao se houver a combinao de rotao orientada pelo espermatozide com uma rotao do ovo artificialmente induzida. Black e Gerhart (1985) permitiram a rotao inicial orientada pelo espermatozide, mas em seguida imobilizaram os ovos em gelatina e os centrifugaram levemente, de modo que o citoplasma interno se movesse para o ponto de entrada do espermatozide. Quando foi permitido que os ovos centrifugados se desenvolvessem em gua normal, apareceram dois stios de gastrulao, levando ao aparecimento de larvas gmeas ligadas (Figura 6.19). A hiptese de Black e Gerhart (1986) que tal produo de gmeos causada pela formao de duas reas de interao: um eixo se forma onde a rotao cortical normal deu origem s interaes citoplasmticas no plo vegetal da clula; o outro eixo se forma onde o citoplasma dirigido pela centrifugao interage com os componentes do plo vegetal. Gmeos tambm podem ser produzidos em gravidade normal, colocando o lado do ovo onde penetra o espermatozide voltado para cima, aps remover o envoltrio de fertilizao (Gerhart et al., 1981). A possibilidade de se obter dois lbios funcionais dos blastporos tambm sugere que no h nada especial a respeito do crescente cinzento, onde se observa pela primeira vez o incio da gastrulao. Na verdade, os fatores indutores da gastrulao parecem ser criados pelas interaes dos citoplasmas animal e vegetal, interaes essas que, provavelmente, ativam algum componente do citoplasma vegetal. Gimlich e Gerhart (1984) realizaram uma srie de experimentos de transplante que confirmaram
Normal
Porcentagem de embries
Girada
ngulo do lbio do blastporo do ponto de entrada de espermatozide
Figura 6.18
Relao entre o ponto da entrada do espermatozide e o lbio dorsal do blastporo em ovos de r normais e naqueles que sofreram rotao. Ovos de Xenopus foram fertilizados, desgeleificados e colocados em Ficoll para desidratar o espao perivitelino. A entrada do espermatozide foi marcada com corante. Os ovos sofreram rotao, foram inclinados em 900, com o ponto de entrada do espermatozide virado para cima, 50-80 minutos aps a fertilizao. (Segundo Gerhart et al., 1981.)
226
(A)
(B)
Figura 6.19
Blastporos gmeos produzidos pela rotao de ovos desgeleificados de Xenopus com o lado ventral para cima (ponto de entrada do espermatozide), no momento da primeira clivagem. (A) Dois blastporos so instrudos para formar: o original (oposto ao ponto de entrada do espermatozide) e o novo, criado pelo deslocamento de material citoplasmtico. (B) Esses ovos desenvolvem dois eixos completos, que formam girinos gmeos, ligados ventralmente. (Cortesia de J. Gerhart.)
a hiptese de que os fatores que iniciam a gastrulao originalmente esto no citoplasma profundo das clulas vegetativas dorsais, e no no crescente cinzento. Eles demonstraram que em um embrio de Xenopus, no estgio de 64 clulas, os trs blastmeros vegetais mais dorsais so capazes de induzir a formao do lbio dorsal do blastporo e de um eixo dorsal completo em embries hospedeiros irradiados com luz ultravioleta (que, de outra maneira, no seriam capazes de iniciar a gastrulao; Figura 6.20A). Alm disso, esses trs blastmeros, situados abaixo da regio do prospectivo lbio dorsal, podem tambm induzir uma invaginao secundria e um eixo quando transplantados para o lado ventral de um embrio normal, no estgio de 64 clulas, no irradiado (Figura 6.20B). Esse pequeno grupo de blastmeros vegetais permite a invaginao de clulas marginais adjacentes e a formao do eixo mesodrmico dorsal do embrio. Holowacz e Elinson (1993) observaram que o citoplasma cortical, das clulas vegetativas dorsais do embrio de Xenopus, no estgio de 64 clulas, era capaz de induzir a formao de eixos secundrios quando injetado em clulas vegetativas ventrais. Nem o citoplasma cortical de clulas animais e nem o citoplasma profundo das clulas ventrais puderam induzir esses eixos. Parece, ento, que os rearranjos internos do citoplasma, provavelmente orientados pela entrada do espermatozide, so responsveis pela distribuio assimtrica de fatores subcelulares. Essa assimetria cria uma distino dorsoventral no ovo que, em ltima instncia, dirige o posicionamento do blastporo acima de um conjunto de blastmeros vegetais e oposto ao ponto de entrada do espermatozide. As molculas que podem estar envolvidas na formao do stio vegetal de iniciao da gastrulao (o centro de Nieuwkoop) sero discutidas no Captulo 15. Movimentos celulares e a construo do arquntero
O INCIO DA GASTRULAO. A gastrulao em anfbios iniciada quando um
grupo de clulas endodrmicas marginais, na superfcie dorsal da blstula, penetra no interior do embrio. As superfcies externas (apicais) dessas clulas se contraem dramaticamente, enquanto seus terminais internos (basais) se expandem. O comprimento apical-basal dessas clulas aumenta bastante, originando a forma caracterstica de garrafa. Na salamandra, essas clulas parecem ter um papel ativo nos movimentos iniciais da gastrulao. Johannes Holtfreter (1943, 1944) observou que as clulas garrafa de gstrulas precoces de salamandra poderiam aderir s lamnulas de vidro e guiar o movimento das clulas ligadas a elas. At mais convincentes foram os experimentos
227
(A) Ponto de entrada do espermatozide DOADOR NORMAL RECEPTOR IRRADIADO POR UV DOADOR NORMAL
(B) RECEPTOR NORMAL Ponto de entrada do espermatozide
Ponto de entrada do espermatozide
UV Sem transplante
Transplante
Pea embrionria ventral carente de eixo corporal
Novo local de gastrulao e forma de eixo corporal
Figura 6.20
de recombinao de Holtfreter, nos quais clulas da zona marginal dorsal (que dariam origem ao lbio dorsal do blastporo) foram combinadas com o tecido endodrmico interno. Quando as clulas da zona marginal dorsal foram removidas e colocadas no prospectivo tecido endodrmico interno, as clulas precursoras do blastporo formaram clulas garrafas e se aprofundaram abaixo da superfcie do endoderma interno (Figura 6.21). Mais ainda, ao se aprofundarem, criaram uma depresso reminiscente do blastporo precoce. Sendo assim, Holtfreter sugeriu que a habilidade de invaginar com profundidade para dentro do endoderma uma propriedade inata das clulas da zona marginal dorsal.
Experimentos de transplante demonstrando que as clulas vegetativas, abaixo das regies do futuro lbio dorsal do blastporo, so responsveis pelo incio da gastrulao. (A) Salvamento de embries irradiados pelo transplante de blastmeros do segmento mais dorsal (cor) de um embrio, no estgio de 64 clulas, para uma cavidade criada pela remoo de um nmero semelhante de clulas vegetais. Um zigoto irradiado sem tal transplante no sofre gastrulao normal. (B) Formao de um novo local para gastrulao e eixo corporal pelo transplante das clulas vegetativas, mais dorsais, de um embrio de 64 clulas, para regio vegetal mais ventral, de outro embrio de 64 clulas. (Segundo Gimlich e Gerhart, 1984.)
Implante
Clulas endodrmicas
Sulco no blastporo
Figura 6.21
Um implante de clulas de anfbios da regio do lbio dorsal do blastporo submerge para dentro de uma camada de clulas endodrmicas e forma um sulco do blastporo. (Segundo Holtfreter, 1944.)
228
A situao no embrio da r um pouco diferente. R. E. Keller e seus orientados (Keller, 1981; Hardin e Keller, 1988) mostraram que apesar das clulas garrafa terem um papel na iniciao da involuo da zona marginal ao adquirem a forma de garrafa, elas no so essenciais para a continuao da gastrulao. A forma peculiar de garrafa dessas clulas necessria para iniciar a gastrulao; a constrio das clulas que puxa a zona marginal na direo vegetativa, enquanto empurra as clulas vegetativas para dentro (Figura 6.22 A,B). O estiramento da zona marginal permite a expanso do ectoderma em direo ao plo vegetal e o envolvimento do embrio; empurrar as clulas vegetais permite a esses precursores da mesoderme anterior contatar o lado de
(A) Endoderma Intercalao radial de clulas profundas Clulas marginais superficiais Clulasgarrafa Futuro mesoderma anterior Lbio dorsal do blastporo Blastporo Morfologia de mudanas das clulas profundas Clulas garrafa (E) Precursores do mesoderma ceflico do endoderma da faringe Clulas garrafa re-espalhadas IMZ superficial movendo-se em direo do plo animal Endoderma Intercalao medianolateral (F) Ectoderma Precursores do mesoderma ceflico do endoderma da faringe Plo animal Blastocele O lbio se extende lateral e vegetalmente (B) (C) (D) Clulas marginais profundas Clulas garrafa
Futuro mesoderma posterior
IMZ profunda
Figure 6.22
Modelo integrativo dos movimentos celulares durante a gastrulao precoce de Xenopus. (A) Estrutura da zona marginal involutiva (IMZ) antes da gastrulao. A IMZ profunda consiste do futuro mesoderma anterior e do futuro mesoderma posterior. (B) Constrio das clulas garrafa arrasta o futuro mesoderma anterior para cima e gira a IMZ para fora. (C) Os precursores do mesoderma anterior conduzem o movimento do mesoderma para dentro da blastocele. (D) Ocorre intercalao radial (interdigitao) das clulas profundas da IMZ. O mesoderma move-se na direo ao plo animal, arrastando as clulas superficiais e as clulas garrafa por involuo. (E) medida que continua a gastrulao, as clulas marginais profundas se achatam, e as clulas previamente superficiais formam a parede do arquntero. (F) Intercalao como em (D), olhando da superfcie dorsal para baixo em direo do lbio dorsal do blastporo. Na NIMZ (zona marginal no involutiva) e parte superior da IMZ, clulas profundas (mesodrmicas) esto se intercalando radialmente, configurando uma fita estreita de clulas achatadas. Esse estreitamento de vrias camadas em poucas outras causa extenso na direo lbio do blastporo. Imediatamente acima do lbio, intercalao medianolateral das clulas produz tenses que arrastam a IMZ por cima do lbio, a intercalao medianolateral continua, alongando e estreitando o mesoderma axial. (Segundo Hardin e Keller, 1988; Wilson e Keller, 1991.)
229
baixo dos precursores mesodrmicos posteriores e comear a migrar no teto da blastocele (Hardin e Keller, 1988). Entretanto, aps comear esses movimentos, as clulas garrafa do Xenopus no so mais necessrias. Quando as clulas garrafa so removidas aps sua formao, a involuo, a formao do blastporo e o fechamento continuam. O fator principal no movimento das clulas para dentro do embrio parece ser a involuo das clulas marginais subsuperficiais mais do que as superficiais. Parece que essas clulas subsuperficiais ou clulas da zona marginal involutiva profunda se viram para dentro e migram em direo ao plo animal, ao longo das superfcies internas das clulas profundas remanescentes (Figura 6.22C-E), e que a camada superficial forma o revestimento do arquntero unicamente porque ela est ligada s clulas profundas, que esto migrando ativamente. O movimento das clulas garrafa mais profundamente dentro do embrio depende da sua ligao s clulas profundas subjacentes. A remoo das clulas garrafa no afeta a involuo das clulas profundas ou das clulas superficiais da zona marginal para dentro do embrio, mas a remoo das clulas marginais dorsais profundas e sua substituio por clulas do hemisfrio animal (que normalmente no sofrem involuo) interrompe a formao do arquntero.
A FORMAO DO MESODERMA DURANTE A GASTRULAO DE XENOPUS
A Figura 6.22 (D-F) esboa o comportamento dessas clulas da zona marginal involutiva (IMZ) em sucessivos estgios da gastrulao em Xenopus (Keller e Schoenwolf, 1977; Keller, 1980, 1981; Hardin e Keller, 1988). Pouco antes de sua involuo atravs do lbio do blastporo, as vrias camadas de clulas IMZ profundas se intercalam radialmente para formar uma fina e larga camada. Essa intercalao estende ainda mais a IMZ vegetalmente. Ao mesmo tempo, as clulas superficiais se espalham se dividindo e achatando. Quando as clulas profundas atingem o lbio do blastporo, elas involuem para dentro do embrio e iniciam um segundo tipo de intercalao. Essa intercalao causa uma extenso convergente ao longo do eixo mediolateral (Figura 6.22F) que integra vrias correntes mesodrmicas para formar um longa e estreita banda. A parte anterior dessa banda migra em direo ao hemisfrio animal. Assim a corrente mesodrmica continua a migrar em direo ao plo animal e a camada superposta de clulas superficiais (incluindo as clulas garrafa) so passivamente puxadas em direo ao hemisfrio animal, formando o teto do arquntero (Figuras 6.15 e 6.22E). Portanto, ainda que as clulas garrafa possam ser responsveis pela indentao inicial, a fora motivadora para essa involuo parece vir da camada profunda de clulas marginais. Mais ainda, a intercalao radial e mediolateral da camada de clulas profundas parece ser responsvel pelo movimento contnuo do mesoderma para dentro do embrio. Migrao do mesoderma involutivo Com o progresso dos movimentos mesodrmicos, a expanso convergente tambm continua a estreitar e encompridar a zona marginal involutiva. A IMZ contm o prospectivo teto endodrmico do arquntero na sua camada superficial (IMZS) e as prospectivas clulas mesodrmicas, incluindo aquelas da notocorda na sua regio profunda (IMZD). Durante o tero mdio da gastrulao, a lmina em expanso do mesoderma converge em direo linha mediana do embrio. Esse processo dirigido pela contnua intercalao mediolateral de clulas ao longo do eixo ntero-posterior, estreitando ainda mais a banda. No fim da gastrulao, a notocorda localizada centralmente se separa do mesoderma somtico em ambos os lados, e as clulas sofrem elongao separadamente (Wilson e Keller, 1991). Essa extenso convergente do mesoderma parece ser autnoma, porque os movimentos dessas clulas ocorrem mesmo se essa regio do embrio isolada do resto (Keller, 1986). Durante a gastrulao, o plo animal e as clulas da zona marginal no-involutiva (NIMZ) expandem-se por epibolia cobrindo todo o embrio. A poro dorsal das clulas marginais no-involutivas expande-se mais rapidamente que a poro ventral,
230
assim, causando o movimento dos lbios do blastporo em direo ao lado ventral. Enquanto essas clulas mesodrmicas, entrando atravs do lbio dorsal do blastporo, do origem ao mesoderma dorsal axial, o resto do mesoderma do corpo (o qual forma o corao, os rins, sangue, ossos e partes de vrios outros rgos) entra atravs dos lbios ventral e lateral para criar o manto mesodrmico. O endoderma derivado das clulas da IMZS que formam o revestimento do teto do arquntero e das clulas vegetativas sub-blastoporais que se tornam o assoalho do arquntero (Keller, 1986).
&
Especulaes
Reguladores moleculares do desenvolvimento: Fibronectinas e as vias da migrao mesodrmica
omo que as clulas involutivas so informadas para aonde ir, uma vez que se encontram no interior do embrio? Na salamandra, parece que os precursores mesodrmicos involutivos migram em direo ao plo animal em uma rede de fibronectina secretada pelas clulas do teto da blastocele. Pouco antes da gastrulao, o ectoderma presuntivo do teto da blastocele secreta uma matriz extracelular que contm fibrilas de fibronec-
Figura 6.23
Fibronectinas e gastrulao de anfbio. (A) Imunofluorescncia revela uma rede fibrilar de fibronectina na superfcie basal de prospectivas clulas ectodrmicas forrando o teto da blastocele do embrio da salamandra. (B-E) Micrografias ao microscpio eletrnico de varredura de gastrulao normal (B,C) e anormal (D,E) da salamandra. A blastocele em (D) e (E) foi injetada com o fragmento ligante clula de fibronectina, enquanto a blstula gastrulando normalmente foi injetada com a soluo controle. (B) Seo durante gastrulao intermediria. (C) O obturador do vitelo ao fim da gastrulao. (D,E) Os estgios finais da gastrulao detida, onde os precursores mesodrmicos, tendo fixado fibronectina sinttica, no conseguem reconhecer a via de migrao normal forrada de fibronectina. O arquntero no se forma, e os precursores noinvoludos do mesoderma permanecem na superfcie. (ar, arquntero; bc, blastocele; bl, blastporo; ec, ectoderma; en, endoderma; mes, mesoderma; yp, obturador do vitelo.) (A de Boucaut et al., 1985; B-E de Boucaut et al., 1984, cortesia de J. C. Boucaut e J.-P. Thiery.)
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
231
tina (Figura 6.23A; Boucaut et al., 1984; Nakatsuji et al., 1985). O mesoderma involutivo parece migrar nessas fibras de fibronectina. Isso foi confirmado pela sntese qumica de uma falsa fibronectina que pode competir com a genuna da matriz extracelular. Clulas se ligam a uma certa regio da protena fibronectina que contm uma seqncia de trs aminocidos (Arg-Gly-Asp; RGD). Boucaut e colaboradores injetaram grandes quantidades de um pequeno peptdio contendo essa seqncia na blastocele de embries de salamandra, pouco antes do incio da gastrulao. Se a fibronectina fosse essencial para a migrao celular, ento as clulas ligadas a esse fragmento solvel de peptdio, em lugar da fibronectina real ligante de clulas, deveriam parar. Impossibilitadas de encontrar sua estrada, as clulas mesodrmicas deveriam cessar sua involuo. Isso precisamente o que ocorreu (Figura 6.23B-E). No foram vistas clulas migratrias ao longo do lado de baixo do ectoderma. Em vez disso, os precursores mesodrmicos permaneceram fora do embrio, formando uma massa celular convoluta. Outros pequenos peptdios sintticos (incluindo outros fragmentos da molcula de fibronectina) no impediram a migrao. Considera-se que as clulas mesodrmicas aderem fibronectina atravs da v1 protena integrina (Alfandari et al., 1995). A migrao mesodrmica pode ser tambm interrompida pela microinjeo de anticorpos contra fibronectina ou contra a subunidade 1 de integrina que funciona como parte do receptor de fibronectina (DArribre et al., 1988, 1990). Alfandari e colegas (1995) mostraram que logo aps a fecundao, a subunidade v da integrina progressivamente perdida das membranas das clulas do blastmero. Entretanto, pouco antes e durante a gastrulao, a subunidade v expressa na superfcie das clulas mesodrmicas migratrias. Parece ento, que a sntese desse receptor de fibronectina pode sinalizar o tempo para o mesoderma comear e continuar a migrao. A matriz extracelular contendo fibronectina, permite a ligao das clulas mesodrmicas rede de fibronectina e, alm disso, parece fornecer sinais para a direo da migrao celular. Shi e colegas (1989) removeram os tetos da blasto-
cele de gstrulas precoces de salamandra e os depositaram em recipientes de plstico com suas matrizes extracelulares tocando o plstico (Figura 6.24A). O eixo do blastporo ao plo animal foi marcado e, aps 2 horas, o explante foi removido, deixando sua matriz extracelular. Um explante menor da zona marginal dorsal foi removido de outra gstrula precoce e colocado sobre a matriz com seu prprio eixo blastporo-plo animal, perpendicular quele da matriz. Seria possvel s clulas desse explante migrarem na matriz, e se migrassem o fariam em uma direo particular? Foi verificado que as clulas migraram, e que a migrao podia ser inibida por anticorpos que impedem que a clula
(A) Plo animal
reconhea a fibronectina. Alm disso, as clulas das DMZ no migraram ao acaso, mas migraram em direo ao plo animal da matriz extracelular que havia sido absorvida no plstico (Figura 6.24B). Em Xenopus, a extenso convergente empurra as clulas migratrias para cima, em direo ao plo animal. Entretanto, a fibronectina parece delinear os limites dentro dos quais esses movimentos podem ocorrer. A fibronectina das gstrulas de Xenopus no forma grades complexas, mas se organiza em pequenos aglomerados fibrilares. Se a fibronectina for sintetizada mas no organizada nessas fibrilas, as clulas mesodrmicas dorsais vo aderir superfcie basal do ectoderma presuntivo, mas no migraro (Winklbauer e Nagel, 1991). As fibrilas de fibronectina so necessrias para que as clulas mesodrmicas da cabea se achatem e estendam largos processos (lameliformes) na direo da migrao (Winklbauer et al., 1991; Winklbauer e Keller, 1996). A importncia dessas fibrilas de fibronectina tambm vista em hbridos interespecficos que se detm na gastrulao. Delarue e colegas (1985) mostraram que certos hbridos inviveis, entre duas espcies de sapos, morrem durante a gastrulao porque no secretam essas fibrilas de fibronectina. Parece ento, que a matriz extracelular do teto da blastocele, e particularmente seu componente fibronectina, importante na migrao das clulas mesodrmicas durante a gastrulao em anfbios.
Figura 6.24
(B)
AP
A direo da migrao das clulas da zona marginal dorsal (DMZ) depende da orientao da matriz extracelular do teto da blastocele. (A) Explantes do teto da blastocele do blastforo (BP) para o plo animal (AP) foram dissecados de embries de salamandra em estgio precoce de gastrulao e colocados em placas plsticas. A matriz extracelular aderiu placa, e o tecido foi ento removido. Um explante menor de uma gstrula precoce, contendo clulas da DMZ, foi ento colocado sobre essa matriz, com o seu prprio eixo perpendicular aquele da matriz. (B) Clulas da DMZ do explante migraram para o plo animal da matriz. A linha pontilhada indica a borda original do explante, e a flecha branca representa seu eixo blastporo-plo animal. (de Shi et al., 1989, fotografia cortesia dos autores.)
232
Epibolia do ectoderma Enquanto a involuo est ocorrendo no lbios do blastporo, os precursores ectodrmicos esto se expandindo sobre todo o embrio. Keller (1980) e Keller e Schoenwolf (1977) usaram microscopia eletrnica de varredura para observar as modificaes tanto nas clulas superficiais como nas clulas profundas das regies animal e marginal. O mecanismo principal de epibolia na gastrulao do Xenopus parece ser um aumento no nmero de clulas (atravs de diviso), acoplado a uma concomitante integrao de vrias camadas profundas em uma s (Figura 6.25). Durante a gastrulao precoce, trs rodadas de diviso celular aumentam o nmero de camadas de clulas profundas no hemisfrio animal. Ao mesmo tempo, completa integrao de numerosas clulas profundas em uma camada tambm ocorre. A camada mais superficial se expande por diviso e achatamento celular. O espalhamento de clulas nas zonas marginais dorsal e ventral, se d provavelmente pelo mesmo mecanismo, ainda que mudanas na forma celular parecem ter um papel mais importante do que no hemisfrio animal. O resultado dessas expanses a epibolia das clulas superficiais e profundas do plo animal e regies marginais no involutivas sobre a superfcie do embrio (Keller e Danilchik, 1988). A maior parte das clulas da regio marginal, como mencionado anteriormente, involuem para se juntar corrente de clulas mesodrmicas dentro do embrio. Gastrulao no Xenopus uma orquestrao de vrios eventos distintos. A primeira indicao de gastrulao envolve a invaginao local das clulas garrafa do endoderma na zona marginal, em tempo e lugar precisamente definidos. Em seguida, a involuo das clulas marginais atravs do lbio do blastporo, comea a formao do arquntero. Essas clulas involutivas, na margem anterior do manto mesodrmico, migram ao longo da superfcie interna do teto do blastporo, e o prospectivo cordomesoderma atrs delas, se estreita e se alonga posteriormente, por extenso convergente, na poro dorsal do embrio. Ao mesmo tempo, as clulas precursoras ectodrmicas epibolizam vegetalmente por diviso celular e pela integrao de camadas celulares previamente independentes. O resultado desses movimentos celulares o posicionamento adequado das trs camadas germinativas em preparao para sua diferenciao em rgos do corpo. Estudos moleculares (a serem discutidos no Captulo 15) esto comeando a nos dar pistas relacionadas a mecanismos pelos quais as clulas so informadas de como comear e finalizar essas migraes
Estgio
Figura 6.25
Micrografias eletrnicas de varredura do teto da blastocele de Xenopus, mostrando as mudanas na forma e arranjo das clulas. Os estgios 8 e 9 so de blstula; estgios 10-11.5 representam gstrulas progressivamente mais avanadas. (de Keller, 1980, cortesias de R. E. Keller.)
233
Gastrulao em aves
Generalidades sobre gastrulao em aves A clivagem em embrio de aves cria um blastodisco acima de um enorme volume de vitelo. Essa massa subjacente e inerte de vitelo impe vrias restries aos movimentos celulares, e a gastrulao em aves parece, primeira vista, ser muito diferente daquela do ourio-do-mar ou da r. Realmente, logo veremos que existem numerosas similaridades entre a gastrulao em aves e as gastrulaes que j estudamos. Alm disso, veremos que embries de mamferos - que no tem vitelo- retm movimentos de gastrulao muito parecidos com aqueles dos embries de aves e rpteis.
FORMAO DO HIPOBLASTO E EPIBLASTO. As clulas centrais do blastodisco das aves so separadas do vitelo por uma cavidade subgerminativa e parecem mais claras - por isso, o centro do blastodisco chamado de rea pelcida. Em contraste, as clulas da margem da rea pelcida parecem opacas, devido a seu contato com o vitelo, formam a rea opaca (Figura 6.26). Enquanto a maioria das clulas permanece na superfcie formando o epiblasto, certas clulas migram individualmente para a cavidade subgerminativa, para formar as ilhas de polinvaginao (hipoblasto primrio), um arquiplago de aglomerados desconectados contendo cada um de 5 a 20 clulas (veja Figuras 6.26 e 5.33). Pouco tempo depois, uma lmina de clulas da margem posterior do blastoderma (crescente de Koller e a zona marginal atrs dele) migra em direo anterior para se juntar s ilhas de polinvaginao e formar o hipoblasto secundrio (Eyal-Giladi et al.,1992). O blastoderma de duas camadas (epiblasto e hipoblasto) tem as camadas unidas na margem da rea opaca, e o espao entre as camadas uma blastocele. Assim, a estrutura do blastodisco das aves no diferente da blstula de anfbios ou equinodermos.
Blastoderma Epiblasto
Anterior
Zona marginal posterior
rea opaca Espao subgerminativo Vitelo Clulas do hipoblasto delaminando-se do epiblasto rea pelcida
Figura 6.26
rea opaca
rea opaca
Epiblasto
Blastocele
Clulas do hipoblasto migrando de clulas profundas da regio posterior
Formao do blastoderma de duas camadas do embrio da galinha. As primeiras clulas hipoblsticas delaminam individualmente, para formar ilhas de clulas sob o epiblasto. Clulas da margem posterior (clulas de foice de Koller e clulas marginais posteriores) produzem uma populao de clulas que migra abaixo do blastodisco e incorpora as ilhas poli-invaginadas. Essa camada inferior tornase o hipoblasto. A camada superior o epiblasto. medida que o hipoblasto se move no sentido anterior, clulas do epiblasto se agregam na regio anterior foice de Koller para formar a linha primitiva.
234
O mapa de destino para o embrio de aves restrito ao epiblasto. Ou seja, o hipoblasto no contribui com clulas para o embrio em desenvolvimento (Rosenquist, 1966, 1972). Em lugar disso, as clulas do hipoblasto formam pores da membrana externa, especialmente o saco vitelnico e o pednculo, que liga a massa do vitelo ao tubo digestivo endodrmico. Todas as trs camadas germinativas do embrio propriamente dito (mais uma quantidade considervel de membrana extra-embrionria) so formadas das clulas epiblsticas. Mapas de destino de epiblasto de galinha esto representados na Figura 6.27. Esses mapas integram vrios tipos de mapeamento. Corantes vitais e transplantes de clulas radioativas foram teis no mapeamento de tendncias prioritrias, pois com esses mtodos se marcam grupos de clulas que se difundem ao prosseguir o desenvolvimento. Transplantar clulas marcadas geneticamente, tais como clulas de codorna colocadas em embries de galinha, contornou o problema de difuso, mas ainda assim marcava aglomerados relativamente grandes de clulas. Recentemente, o uso de vrus ou corantes fluorescentes permitiu aos pesquisadores acompanhar clulas individuais atravs do desenvolvimento (Schoenwolf, 1991). Como pode ser visto nessas figuras, existe uma significante extenso convergente enquanto a linha primitiva progride anteriormente. Mesmo que clulas em uma regio especfica da gstrula tendam a se transformarem em tipos especficos de clulas, elas ainda podem produzir diferentes tipos celulares se transplantadas a uma outra regio do embrio.
FORMAO DA LINHA PRIMITIVA. A estrutura majoritria caracterstica da gas-
trulao em aves, rpteis e mamferos a linha primitiva. Essa linha visvel inicialmente como um espessamento de uma camada de clulas do epiblasto, na regio posterior do embrio, imediatamente anterior ao crescente de Koller (Figura 6.27A). Esse espessamento causado pelo ingresso de clulas mesodrmicas do epiblasto para dentro da blastocele, e pela migrao de clulas da regio lateral do epiblasto posterior em direo ao centro (Figura 6.27B; Vakaet, 1984; Bellairs, 1986; Eyal-Giladi et al., 1992). medida que a rea espessada se estreita, ela se move anteriormente e se contrai para formar a linha primitiva definitiva. Essa linha se estende em 60-75% do comprimento da rea pelcida e marca o eixo ntero-posterior do embrio (Figura 6.27C-E). Enquanto as clulas convergem para formar a linha primitiva, se forma uma depresso na linha. Essa depresso chamada fenda primitiva, e serve como um blastporo, atravs do qual as clulas migratrias passam para a blastocele. Assim, a fenda primitiva anloga ao blastporo de anfbios. Na ponta anterior da linha primitiva h um espessamento regional de clulas chamado ndulo primitivo ou ndulo de Hensen. O centro desse ndulo contm uma depresso em forma de funil (algumas vezes chamada cova primitiva), atravs da qual as clulas passam para a blastocele. O ndulo de Hensen o equivalente funcional do lbio dorsal do blastporo de anfbios. [gast1.html] To logo se forma a linha primitiva, as clulas do epiblasto comeam a migrar sobre os lbios dessa e para dentro da blastocele (Figura 6.28). De maneira similar ao blastporo de anfbios, a linha primitiva tem uma populao celular se modificando constantemente. Clulas migrando atravs do ndulo de Hensen passam para dentro da blastocele, migram anteriormente formando o intestino anterior, o mesoderma da cabea e a notocorda; clulas passando atravs das pores laterais da linha primitiva do origem maioria dos tecidos endodrmicos e mesodrmicos (Schoenwolf et al., 1992). Em contraste com o mesoderma de Xenopus, o qual migra como lminas de clulas para a blastocele, clulas entrando no embrio de aves o fazem individualmente. Em lugar de formar uma lmina de clulas fortemente organizadas, a populao ingressante cria um mesnquima fracamente conectado. Alm disso, no se forma um verdadeiro arquntero na gstrula de aves. Enquanto as clulas entram na linha primitiva, essa se estende na direo da futura regio da cabea. Ao mesmo tempo, as clulas do hipoblasto secundrio esto continuando a migrar da margem posterior do blastoderma, na direo anterior. A elongao
235
(A)
Anterior
(B) rea opaca
(I) Ectoderma
Endoderma Mesoderma Axial Paraxial (vrtebras, rins, musculatura) Placa lateral (incluindo o corao) Extra-embrionria
rea pelcida rea de engrossamento do blastoderma rea opaca rea pelcida
Posterior (C)
(D) (J)
Linha primitiva tomando forma (E) Ndulo de Hensen rea pelcida rea opaca Anterior Processo ceflico (F) (K)
Figura 6.27
Ndulo de Hensen Sulco primitivo
(G)
Borda anterior do mesoderma
Ectoderma da dobra ceflica Dobra neural Somito Notocorda
(H)
Dobra ceflica Intestino anterior
Movimentos celulares da linha primitiva do embrio de galinha. (A-E) Viso dorsal da formao e alongamento da linha primitiva. O blastoderma visto em (A) 3-4 horas, (B) 5-6 horas, (C) 7-8 horas, (D) 10-12 horas e (E) 1516 horas. O movimento precoce das clulas epiblsticas HNK-1+ mostrado por flechas. (F-H) A formao da notocorda e somitos mesodrmicos medida que a linha primitiva regride mostrada em (F) 19-22 horas, (G) 23-24 horas e (H) no estgio de quatro somitos. (I-K) Mapas do destino do epiblasto em dois estgios da gastrulao. Extenso convergente mostrada na linha mediana, e as clulas precursoras endodrmicas ingressam mais rapidamente que as clulas precursoras mesodrmicas. (Adaptado de vrias fontes, especialmente Spratt, 1946, e Balinsky, 1975; I-K segundo Vakaet, 1985.)
Ndulo de Hensen
Placa segmental Linha primitiva
da linha primitiva parece ser coincidente com a migrao em direo anterior dessas clulas do hipoblasto secundrio.
MIGRAO ATRAVS DA LINHA PRIMITIVA: FORMAO DO ENDODERMA E MESODERMA. As primeiras clulas a migrarem atravs da linha primitiva so
aquelas destinadas a se transformarem no intestino anterior. Essa situao, novamente, similar quela vista nos anfbios. Uma vez dentro da blastocele, essas clulas migram anteriormente e finalmente deslocam as clulas do hipoblasto na poro anterior do embrio. As clulas hipoblsticas esto confinadas a uma regio na poro anterior da rea pelcida. Essa regio, o crescente germinativo, no forma estruturas
236
Figura 6.28
(A)
Migrao de clulas endodrmicas e mesodrmicas atravs da linha primitiva. (A) Micrografia eletrnica de varredura mostra clulas epiblsticas passando para a blastocele, estendendo seus terminais apicais para transformarem em clulas garrafa. (B) Estereograma de um embrio gastrulante de galinha, mostrando a relao da linha primitiva, das clulas migratrias e das duas camadas originais do blastoderma. A camada inferior se transforma em um mosaico de clulas hipoblsticas e endodrmicas; porm, as clulas hipoblsticas finalmente se separam para formar uma camada abaixo daquela do endoderma e contribuem para o saco vitelnico. (A de Solursh e Revel, 1978, cortesia de M. Solursh; B segundo Balinsky, 1975.)
(B) Ndulo de Hensen
Linha primitiva
Epiblasto
Blastocele Hipoblasto Endoderma Clulas migratrias (mesnquima)
embrionrias, mas contm os precursores das clulas germinativas, que mais tarde migram atravs dos vasos sangneos at as gnadas. As prximas clulas que entram na blastocele atravs do ndulo de Hensen (e o primeiro quarto anterior da linha primitiva) tambm se movem anteriormente, mas no se movem to ventralmente como as clulas presuntivas endodrmicas do intestino anterior. Essas clulas permanecem entre o endoderma e o epiblasto para formar as clulas do mesoderma da cabea e do cordomesoderma (notocorda) (veja Psychoyos e Stern, 1996). Essas clulas de ingresso precoce se moveram todas anteriormente, empurrando para cima a regio medianoanterior do hipoblasto, a fim de formar o processo ceflico (Figura 6.29). Enquanto isso, as clulas continuam a migrar para dentro, atravs da poro lateral da linha primitiva. Quando entram na blastocele, essas clulas se separam em duas correntes. Uma corrente se move mais profundamente e encontra o hipoblasto em sua regio mediana, deslocando as clulas hipoblsticas para os lados. Essas clulas de movimento profundo do origem a todos os rgos endodrmicos do embrio, assim como a maioria das membranas extra-embrionrias (o hipoblasto forma o restante). A segunda corrente migratria se espalha atravs da blastocele como uma camada frouxa, mais ou menos a meio caminho entre o hipoblasto e o epiblasto. Essa camada origina as pores mesodrmicas do embrio e das membranas extra-embrionrias. Aps 22 horas de incubao, a maior parte das clulas presuntivas endodrmicas esto no interior do embrio, apesar das clulas presuntivas mesodrmicas continuarem a migrar para o interior por um tempo mais longo.
237
Endoderma farngeo Processo ceflico (notocorda anterior)
Ilhas de sangue
Dobra ceflica
Intestino anterior Sulco neural
Ndulo de Hensen Linha primitiva rea pelcida
Somito
Linha primitiva rea opaca (A) (B) (C)
Linha de referncia
Regr es da li s o p r i m nha itiva
Borda posterior da rea pelcida
Horas (D) (E)
Figura 6.29
Agora comea uma nova fase da gastrulao. Enquanto continua o ingresso do mesoderma, a linha primitiva comea a regredir, movendo o ndulo de Hensen de uma posio prxima do centro da rea pelcida, para uma posio mais posterior (veja Figura 6.29). Ela deixa em seu lugar o eixo dorsal do embrio e o processo ceflico. Ao mesmo tempo que o ndulo avana posteriormente, a poro remanescente (posterior) da notocorda estabelecida. Finalmente, o ndulo regride para sua posio mais posterior, formando a regio anal. Nesse ponto, o epiblasto composto inteiramente de clulas ectodrmicas presuntivas. Como uma conseqncia desse processo de gastrulao em duas etapas, os embries de aves (e mamferos) exibem um distinto gradiente de maturidade de desenvolvimento ntero-posterior. Enquanto clulas das pores posteriores do embrio esto gastrulando, clulas da poro anterior j esto comeando a formar rgos. Pelos prximos dias, a ponta anterior estar mais avanada no seu desenvolvimento (podese dizer que teve uma vantagem inicial) do que a poro posterior. Enquanto as clulas presuntivas do mesoderma e do endoderma se moviam para dentro, os precursores ectodrmicos proliferavam para se tornar a nica populao de clulas remanescente na camada superior. Ainda mais, clulas ectodrmicas migraram para fora do blastodisco para envolver o vitelo por epibolia. O enclausuramento do vitelo (novamente reminiscente da epibolia do ectoderma de anfbios) uma tarefa de Hrcules, que dura 4 dias para ser completada e envolve a produo contnua de novo
Gastrulao do embrio de galinha de aproximadamente 24 at perto de 28 horas. (A) A linha primitiva totalmente estendida (24 horas). O processo ceflico (notocorda anterior) pode ser visto estendendo-se a partir do ndulo de Hensen. (B) Estgio de dois somitos (25 horas). Anteriormente v-se o endoderma farngeo, enquanto a notocorda anterior empurra para cima o processo ceflico que estava embaixo. A linha primitiva est regredindo. (C) Estgio de quatro somitos (27 horas). (D) Aps 28 horas, a linha primitiva regrediu at a poro caudal do embrio. (E) Regresso da linha primitiva, deixando a notocorda em seu rastro. Vrios pontos da linha foram acompanhados aps atingir seu comprimento mximo. O tempo representa as horas decorridas aps atingir o comprimento mximo em aproximadamente 18 horas. (Fotografias cortesia de K. Linask; E segundo Spratt, 1947.)
Alongamento da notocorda
238
material celular e a migrao das clulas ectodrmicas presuntivas ao longo da superfcie inferior do envoltrio vitelnico. Assim, chegando ao fim da gastrulao em aves, o ectoderma envolveu o vitelo, o endoderma substituiu o hipoblasto e o mesoderma se posicionou entre essas duas regies. Mecanismos de gastrulao em aves
O PAPEL DO HIPOBLASTO E A FORMAO DOS EIXOS EMBRIONRIOS. O eixo dorso-ventral (costa-frente) crtico para a formao do hipoblasto e para o contnuo desenvolvimento do embrio. Esse eixo estabelecido quando as clulas em clivagem do blastoderma, produzem uma barreira entre a albumina bsica (pH 9.5) acima do blastodisco e o espao subgerminativo cido (pH 6.5), abaixo do disco. gua e ons de sdio so transportados da albumina atravs das clulas para dentro do espao subgerminativo criando uma diferena de potencial de membrana de 25 mV atravs da camada de clulas (positivo no lado ventral das clulas). Isso cria dois lados para as clulas: um lado frente albumina negativa e bsica, e outro lado frente ao fluido do espao subgerminativo positivo e cido. O lado frente albumina se torna o dorsal, e aquele frente ao espao subgerminativo se torna o ventral. Isso pode ser revertido ou invertendo o gradiente de pH ou invertendo a diferena de potencial atravs da camada de clulas (reviso em Stern e Canning, 1988). A converso de um blastoderma radialmente simtrico em uma estrutura simtrica bilateral determinada pela gravidade. Enquanto o vulo rola oviduto abaixo, ele gira a uma velocidade de 10 a 15 revolues por hora. O citoplasma que dever se tornar a camada celular est sempre girando para baixo, mas deslocado para cima pelo vitelo mais denso. Portanto, no est em cima do vitelo, mas um pouco deslocado para o lado. A poro mais alta do blastodisco se transforma na ponta caudal (rabo) do blastoderma, a parte onde comea a gastrulao (Kochav e Eyal-Giladi, 1971). Assim, os eixos ntero-posterior e dorsolateral so determinados antes da gastrulao, enquanto o vulo est lentamente rolando oviduto abaixo. O blastoderma do embrio de galinha age como um sistema nico integrado para formar um nico embrio; se o blastoderma separado em partes, cada uma tendo sua zona marginal, cada parte vai formar seu prprio embrio (Spratt e Haas, 1960). O controle desse campo parece residir na zona marginal posterior, a regio onde comea a formao do hipoblasto. Essas clulas marginais posteriores no s contribuem com as clulas indutoras do hipoblasto, como tambm impedem que outras regies marginais induzam seus hipoblastos. Khaner e Eyal-Giladi (1989) verificaram que na transposio da zona marginal posterior para uma rea marginal lateral (Figura 6.30A), o rasgo posterior cicatriza e duas linhas primitivas aparecem. Similarmente, se uma regio posterior reciprocamente transposta com uma regio lateral (Figura 6.30B), somente se forma uma linha primitiva e ela provm da regio posterior original. Entretanto, se uma zona marginal posterior colocada em um embrio que retm sua margem posterior original (Figura 6.30C), somente a margem posterior original do hospedeiro forma o hipoblasto que est subjacente linha primitiva. Khaner e Eyal-Giladi sugerem que as clulas da zona marginal formam um gradiente de atividade cujo pico est na ponta posterior. As clulas posteriores formaro o hipoblasto e, ao mesmo tempo, evitaro que qualquer clula, com menos atividade, forme hipoblastos prprios.*
*Pesquisadores anteriores (Waddington, 1932; Azar e Eyal-Giladi, 1981) consideravam que o hipoblasto induzia formao da linha primitiva e a contemplava com uma polaridade nteroposterior. Entretanto, Khaner (1995) girou o epiblasto com relao ao hipoblasto, em diferentes estgios do desenvolvimento da galinha, e mostrou que o epiblasto inicia a formao da linha primitiva e mantm sua polaridade independentemente da orientao do hipoblasto.
239
EXPERIMENTO (A) Anterior Zona marginal rea opaca Epiblasto
RESULTADOS
INTERPRETAO
Posterior (B)
Cicatriz
Linhas primitivas
(C)
Figura 6.30
ACUMULAO CELULAR NA LINHA PRIMITIVA. Evidncias dos estudos de Stern e Canning (1990) sugerem que o epiblasto no um tecido homogneo, nodiferenciado, como foi assumido por muito tempo. Pelo contrrio, parece haver diferenciao nas clulas epiblsticas mesmo antes que a formao da linha primitiva se inicie. Esses estudos mostram que certas clulas, dispersas ao acaso no epiblasto, podem ser distinguidas por uma molcula especfica na superfcie celular (HNK-1, uma forma sulfatada do cido glucurnico). As clulas expressando HNK-1 ingressam individualmente na blastocele e migram para a regio posterior. provvel que o tecido marginal posterior secrete uma substncia que atrai as clulas que expressam HNK-1, enquanto o tecido marginal anterior secreta uma molcula repelente (Jephcott e Stern, citado em Stern, 1991). As clulas expressando HNK-1, que se juntam na margem posterior, produziro o endoderma e o mesoderma, e nenhuma clula expressando HNK-1 formar derivados ectodrmicos. Se as clulas HNK-1 so seletivamente destrudas (por anticorpos), enquanto ainda esto no epiblasto, o embrio no formar mesoderma nem endoderma. Essas clulas HNK-1 positivas interagem com as clulas do epiblasto acima delas, para formar o rudimento inicial da linha primitiva. Esse rudimento de linha sofre um processo de extenso convergente que o estreita e alonga. Quando a linha chega ao seu comprimento quase total, as
Experimentos de Khaner e Eyal-Giladi demonstrando que a poro posterior da zona marginal (PMZ) contribui para as clulas indutoras da linha primitiva do hipoblasto e impedem outras regies marginais de criarem seus prprios hipoblastos. (Segundo Khaner e Eyal-Giladi, 1989.)
240
clulas HNK-1 positivas dissolvem a lmina basal do epiblasto central para formar uma canal atravs da linha primitiva. Isso permite que clulas do epiblasto (que nunca expressaram HNK-1) sejam recrutadas para a linha que est se estendendo anteriomente e, assim, contribuir (junto com as clulas HNK-1 positivas) para os mesoderma e endoderma embrionrios. Movimento dentro da blastocele amniota feito por clulas individuais, e no por uma camada epitelial. Mas, como na gastrulao de anfbios, clulas de aves passando pelo blastporo sofrem uma constrio no seu terminal apical e se tornam clulas garrafa (Figura 6.28). Na ponta anterior do canal, ndulo de Hensen, a destruio da lmina basal e a liberao dessas clulas do epiblasto pode ser realizada por uma protena de 190-kDa chamada fator de espalhamento (Stern et al., 1990). O fator de espalhamento secretado somente no ndulo de Hensen, e tem sido implicado na dissociao de clulas nessa regio e na induo do tecido neural a partir do epiblasto, na vizinhana do ndulo (Streit et al., 1995). Quando se implantam resinas contendo o fator de espalhamento abaixo do epiblasto de embries de galinha, em gastrulao precoce, novas regies da linha primitiva podem ser induzidas. O fator de espalhamento se liga a receptores tirosina quinase em clulas adjacentes, e agindo atravs da cascata da protena G, fosforila as -cateninas que ancoram as E-caderinas membrana celular (Hartmann et al., 1994). Na ausncia de E-caderina funcional, a lmina epitelial se desmonta naquela regio e as clulas se tornam mesnquima. As clulas, uma vez liberadas da linha primitiva, entram na blastocele, so achatadas e passam a fazer parte de uma corrente de clulas migratrias independentes. Polissacardeos extracelulares podem tambm ter um papel importante nessa migrao. Um desses complexos polissacardeos o cido hialurnico, um polmero linear de cido glucurnico e N-acetilglicosamina (veja Figura 3.35). Esse composto produzido pelas clulas ectodrmicas e se acumula na blastocele, onde reveste a superfcie das clulas que esto chegando. Fisher e Solursh (1977) mostraram que quando esse material digerido (injetando a enzima hialuronidase na blastocele), as clulas mesenquimatosas se aglomeram e no conseguem migrar adequadamente. Muito estudos tm mostrado que o cido hialurnico importante para manter as clulas mesenquimatosas migratrias separadas umas das outras. Alm disso, o cido hialurnico comea a se acumular precisamente no momento em que as primeiras clulas entram na blastocele. O cido hialurnico capaz de manter as clulas separadas, provavelmente devido a sua capacidade de se expandir em gua. Em ambiente aquoso, esse polmero pode expandir em at 1000 vezes o seu volume original. Portanto, o cido hialurnico pode ser um fator importante para manter as clulas mesenquimatosas dispersas durante sua migrao, assegurando que a migrao continue. cido hialurnico e outros polissacardeos facilitam a migrao de clulas individuais (veja Captulo 3), mas no parecem dirigir o movimento dessas clulas (Fisher e Solursh, 1979). Na verdade, o movimento dessas clulas est ligado, mais uma vez, presena de uma rede de fibronectina na lmina basal extracelular das clulas do epiblasto. Essa camada rica em fibronectina aparece na superfcie inferior das clulas da camada de cima, pouco antes da formao da linha primitiva e desaparece na regio da linha. Dentro da linha, as clulas se separam e migram lateralmente ao longo da membrana basal do epiblasto, rica em fibronectina (Duband e Thiery, 1982). No existe evidncia clara de que essa fibronectina essencial para o direcionamento do movimento celular que afasta as clulas lateralmente da linha primitiva.
FORMAO SECUNDRIA DA NOTOCORDA. Enquanto a poro anterior da
notocorda formada pelo ingresso de clulas atravs do ndulo de Hensen e a subseqente migrao anterior, a notocorda posterior formada de maneira diferente. Aps o somito 17 (da galinha), a notocorda se forma pela condensao de tecido mesodrmico que ingressou atravs da linha primitiva (isto , no atravs do ndulo de Hensen). Isso se estende posteriormente para o broto da cauda do embrio (incluindo os somitos 28-50) (Le Douarin et al., 1996).
241
EPIBOLIA DO ECTODERMA. Durante a gastrulao, as clulas precursoras do ecto-
derma se expandem externamente para envolver o vitelo. Essas clulas esto ligadas entre si por ligaes firmes e migram como uma unidade, mas no individualmente. Nas aves, a superfcie superior da rea opaca adere fortemente superfcie inferior do envoltrio vitelnico e se espalha ao longo dessa superfcie interna. O mesmo comportamento visto em cultura de clulas. New (1959) demonstrou que o blastoderma isolado se estende normalmente sobre o envoltrio vitelnico isolado, e Spratt (1963) demostrou que esse espalhamento no ocorre com outros substratos. Essas observaes sugerem que o envoltrio vitelnico essencial para a extenso da lmina celular. interessante observar que somente as clulas marginais (isto , as clulas da rea opaca) se ligam firmemente superfcie vitelnica. A maioria das clulas blastodrmicas aderem frouxamente, quando o fazem. As clulas marginais so inerentemente diferentes das outras clulas blastodrmicas, pois podem estender longos processos citoplasmticos (500m) em direo ao envoltrio vitelnico. Esses filopdios alongados so considerados o aparelho locomotor das clulas marginais. Existem vrias linhas de evidncia indicando que as clulas marginais da rea opaca so os agentes da epibolia ectodrmica. Em primeiro lugar, o blastoderma se espalha somente quando as margens esto se expandindo. Se as clulas marginais so removidas, a epibolia do ectoderma cessa. Segundo, quando as clulas marginais so isoladas do resto do blastoderma, elas continuam a migrar sozinhas. Assim, parece que as clulas precursoras do ectoderma so levadas junto com as clulas ativamente migratrias da rea opaca (Schlesinger, 1958). Existe tambm uma relao especfica entre as membranas celulares das clulas marginais e a superfcie inferior da membrana vitelnica. New (1959) mostrou que quando o blastoderma colocado sobre o envoltrio vitelnico de forma invertida (camada profunda em contato com o envoltrio vitelnico), as bordas do blastoderma se curvam para dentro de modo que as clulas marginais da camada superior esto, mais uma vez, em contato com a superfcie vitelnica (Figura 6.31). Lash e seus colaboradores (1990) expandiram esses resultados mostrando que a fibronectina est presente na superfcie interna do envoltrio vitelnico. Ento, como no experimento discutido anteriormente, no qual Boucaut e colaboradores injetaram o composto sinttico contendo a seqncia do stio de ligao fibronectina (RGD), na blastocele de salamandra, Lash e colegas aplicaram a seqncia RGD ao envoltrio vitelnico enquanto as clulas migravam sobre ele. Esse tratamento quebrou especificamente o contato entre as clulas marginais e o envoltrio vitelnico, causou retrao dos filopdios das clulas marginais e parou a migrao do blastoderma. Identificamos muitos dos processos envolvidos na gastrulao de aves, mas ignoramos como esses processos so realizados; no sabemos ainda como se forma a cavidade subgerminativa, como certas clulas so destinadas a se tornarem clulas do hipoblasto, como certas clulas expressam HNK-1, enquanto suas vizinhas no o fazem, como clulas expressando HNK-1 migram para a margem posterior e como l interagem com as clulas do epiblasto, como a linha primitiva se estende e se retrai, ou como as clulas so designadas aos seus respectivos destinos. Recentemente, Gary
Figura 6.31
Endoderma Presuntivo (camada profundas) (A)
Ectoderma Presuntivo Envoltrio Vitelnico
(B)
Propriedades migratrias dos precursores ectodrmicos de galinha. (A) Quando um blastoderma de galinha colocado no envoltrio vitelnico, com os precursores em contato com a superfcie vitelnica, as clulas marginais migram e cobrem o envoltrio vitelnico com ectoderma. (B) Quando as camadas profundas so colocadas em contato com o envoltrio vitelnico, a camada blastodrmica se enrola para permitir que as clulas da camada superficial possam aderir e migrar sobre a camada vitelnica. O resultado uma vescula fechada. (Segundo New, 1959.)
242
Schoenwolf (1991) comentou: A despeito de tudo que foi escrito, certo dizer que o que sabemos sobre gastrulao e neurulao em aves consideravelmente menos do que ainda resta conhecer.
Gastrulao em mamferos
Aves e mamferos so descendentes de espcies de rpteis. Portanto, no surpreendente que o desenvolvimento de mamferos se d paralelamente ao dos rpteis e aves. O que surpreendente que os movimentos de gastrulao de embries de rpteis e aves, que evoluram como uma adaptao a ovos com vitelo, so mantidos mesmo na ausncia de grandes quantidades de vitelo no embrio mamfero. A massa celular interna nos mamferos pode ser visualizada como assentada sobre uma bola imaginria de vitelo, seguindo instrues que parecem mais apropriadas a seus ancestrais. Modificaes para desenvolvimento dentro de outro organismo Em lugar de desenvolver-se isoladamente dentro do ovo, a maioria dos mamferos evoluiu para uma admirvel estratgia de desenvolvimento dentro da prpria me. O embrio mamfero obtm seus nutrientes diretamente da me e no depende de vitelo armazenado. Essa evoluo ensejou uma dramtica reestruturao da anatomia materna (tal como a expanso do oviduto para formar o tero) como tambm o desenvolvimento de um rgo fetal capaz de absorver os nutrientes maternos. Esse rgo fetal -a placenta- derivado primariamente de clulas trofoblsticas embrionrias, suplementado por clulas mesodrmicas derivadas da massa celular interna.
TECIDOS EMBRIONRIOS Ectoderma embrionrio
Epiblasto embrionrio
Mesoderma embrionrio
Epiblasto
Linha primitiva
Massa celular interna
Ectoderma amnitico
Endoderma amnitico
Hipoblasto Blastocisto
Endoderma extra-embrionrio
Envoltrio vitelnico
Mesoderma extra-embrionrio TECIDOS EXTRA-EMBRIONRIOS
Trofoblasto
Citrofoblasto
Sinciciotrofoblasto
Figura 6.32
Diagrama esquemtico mostrando a derivao de tecidos de embries humanos e do macaco rhesus. (Segundo Luckett, 1978, e Bianchi et al., 1993.)
243
(A)
Blastocisto, 7 dias Revestimento uterino Capilar maternal Epitlio uterino (endomtrio) Massa celular interna Blastocele Trofoblasto
(B)
8 dias
Sinciciotrofoblasto proliferando no tecido uterino
Epiblasto Cavidade amnitica Blastocele Trofoblasto (C) 9 dias Lacunas trofoblsticas (D) 10-11 dias
Cavidade amnitica Lacunas trofoblsticas (suprimento de sangue materno)
Epiblasto Hipoblasto Trofoblasto Cavidade Amnitica Blastocele
Sinciciotrofoblasto
Formao de mesoderma extraembrionrio
Retculo extra-embrionrio
Figura 6.33
Formao de tecido no embrio humano entre 7 e 12 dias. (A,B) Blastocisto humano imediatamente antes da gastrulao. A massa celular interna delaminam clulas hipoblsticas que forram o trofoblasto, formando, com isso, o envoltrio vitelnico primitivo e um blastodisco de duas camadas (epiblasto e hipoblasto), semelhante aquele visto em embries de aves. O trofoblasto em alguns mamferos pode ser dividido em trofoblasto polar, que cobre a massa de clulas internas, e o trofoblasto mural, que no o faz. O trofoblasto se divide no citotrofoblasto que forma as vilosidades, e o sinciciotrofoblasto que ir ingressar no tecido uterino. (C) Ao mesmo tempo o epiblasto se divide em ectoderma amnitico (que rodeia a cavidade amnitica) e epiblasto embrionrio. O mamfero adulto se forma das clulas do epiblasto embrionrio. (D) O endoderma extra-embrionrio forma o saco vitelnico. (Segundo Gilbert, 1989, e Larsen, 1993.)
As origens dos tecidos mamferos precoces esto sumariadas na Figura 6.32. A primeira segregao de clulas dentro da massa celular interna envolve a formao do hipoblasto (algumas vezes chamado endoderma primitivo) (Figura 6.33). Essas clulas se separam da massa celular interna para revestir a cavidade da blastocele onde elas originam a endoderme do saco vitelnico. Como em embries de aves, essas clulas no produzem partes do organismo neonato. O tecido da massa celular interna remanescente, acima do hipoblasto, agora chamado de epiblasto. As clulas do epiblasto so separadas por pequenas fendas que coalescem para separar o epiblasto embrionrio das outras clulas do epiblasto, as quais formam o revestimento do mnio (Figuras 6.33C e 6.34). Uma
244
Figura 6.34
(A) Sinciciotrofoblasto Mesoderma Extra-embrionrio
Estrutura do mnio e movimentos celulares durante a gastrulao humana. (A) Embrio humano e conexes uterinas aps 15 dias de gestao. Na representao superior, o embrio foi cortado sagitalmente atravs da linha mediana; a representao inferior olha de cima para baixo sobre a superfcie dorsal do embrio. (B) Os movimentos das clulas epiblsticas para dentro da linha primitiva e o ndulo de Hensen, e por baixo do epiblasto esto sobrepostas na viso da superfcie dorsal. Aos dias 14 e 15, o epiblasto ingressante considerado substituir as clulas hipoblsticas (que contribuem ao forro do saco vitelnico), enquanto no dia 16, as clulas ingressantes se espalham como um leque para formar a camada mesodrmica. (Segundo Larsen, 1993.).
Disco germinativo bilaminar
Cavidade amnitica Epiblasto Sulco primitivo Saco vitelnico Hipoblasto
(B) 14-15 dias Cavidade amnitica Sulco primitivo Ndulo de Hensen Epiblasto Sulco Primitivo
Hipoblasto 16 dias Saco vitelnico
Endoderma
Mesoderma Mesoderma extra-embrionrio
Endoderma
vez completado o revestimento do mnio, ele se enche com uma secreo chamada fluido amnitico, que serve como absorvente de choques para o embrio em desenvolvimento, enquanto impede a sua dessecao. O epiblasto embrionrio parece conter todas as clulas que vo dar origem ao prprio embrio e , de muitas maneiras, semelhante ao epiblasto de ave. Kirstie Lawson e seus colegas (1991) marcaram clulas individuais do epiblasto com peroxidase de rabanete (horseradish) o que lhes permitiu construir um detalhado mapa de destino do epiblasto de camundongo (Figura 6.35). Como as clulas do epiblasto de galinha, o mesoderma e o endoderma de mamfero migram atravs da linha primitiva. Enquanto penetram a linha, as clulas do epiblasto deixam de expressar E-caderina, que mantm as clulas unidas, e elas migram como clulas individuais (Burdsal et al., 1993). As clulas migrando atravs do ndulo de Hensen do origem notocorda. Na formao da notocorda do camundongo, as clulas devem se integrar no endoderma do intestino primitivo, portanto, de maneira diferente da formao da notocorda da galinha (Jurand, 1974; Sulik et al., 1994). Essas clulas podem ser vistas como uma banda de clulas pequenas e ciliadas se estendendo para cima do ndulo de Hensen (Figura 6.36). Elas formam a notocorda convergindo mediamente e se dobrando em uma direo dorsal com afastamento do teto do intestino.
245
Figura 6.35
(A)
Mapa do destino do embrio do camundongo. (A) O estgio do ovo cilndrico, 6 dias aps a fertilizao. Notar que ao contrrio dos epiblastos da galinha e humano, o epiblasto do camundongo firmemente curvado. Os endodermas parietal e visceral so derivados do hipoblasto, no do trofectoderma. (B) Mapa do destino de um epiblasto de 7 dias na gastrulao precoce. (O mapa do destino do camundongo foi achatado e deve ser visto como enrolado para cima com a linha primitiva nas bordas.) (Segundo Lawson et al., 1991.)
Cone ectoplacentrio do trofoblasto Cavidade amnitica
Epiblasto tero Endoderma visceral Endoderma parietal Saco vitelnico Trofoblasto
Os precursores ectodrmicos esto localizados anteriormente linha primitiva completamente estendida, posio similar que ocupam no epiblasto de galinha; mas enquanto o mesoderma de galinha se forma de clulas posteriores ao fim da linha, o mesoderma de camundongos se forma de clulas anteriores linha primitiva. Em alguns casos, clones de clulas do origem a descendentes em mais de uma camada embrionria ou para ambos os derivados, embrionrio e extra-embrionrio. Assim, no estgio de epiblasto, as linhagens no se separaram umas das outras. Como nos embries de aves, as clulas migrando entre as camadas de hipoblasto e epiblasto parecem estar envolvidas em cido hialurnico cuja sntese se inicia durante a formao da linha primitiva (Solursh e Morriss, 1977). Considera-se (Larsen, 1993) que a substituio das clulas hipoblsticas pelos precursores endodrmicos ocorre nos dias 14-15 da gestao, enquanto que a migrao de clulas formando o mesoderma no comea antes do dia 16. Formao de membranas extra-embrionrias Enquanto o epiblasto embrionrio est apresentando movimentos celulares reminiscentes daqueles vistos na gastrulao de rpteis e aves, as clulas extra-embrionrias esto produzindo os tecidos distintivos dos mamferos que permitem ao feto sobreviver dentro do tero materno. Apesar da aparncia normal das clulas trofoblsticas iniciais no camundongo e no homem, elas do origem a uma populao de clulas onde a diviso nuclear se d em ausncia de citocinese. O tipo inicial de clula trofoblstica constitui uma camada chamada citotrofoblasto, enquanto que o tipo de clula multinucleada forma o sinciciotrofoblasto. O citotrofoblasto adere parede uterina (endomtrio) atravs de uma srie de molculas de adeso que foram discutidas no Captulo 3. As clulas citotrofoblsticas humanas tambm contm enzimas proteolticas que lhes permitem entrar no tero e remodelar os vasos sangneos uterinos, de modo que o sangue materno possa banhar os vasos sangneos fetais. O
(B)
Anterior
mnio Ectoderma Mesoderma Endoderma Notocorda Mesoderma extra-embrionrio Linha primitiva
Posterior
Tubo neural presuntivo Mesnquima Endoderma Notocorda presuntiva
Figura 6.36
Tubo neural
Notocorda
(A)
(B)
Formao da notocorda no camundongo. (A) A superfcie ventral do embrio de 7.5 dias vista pelo microscpio eletrnico de varredura. As clulas presuntivas da notocorda so pequenas clulas ciliadas na linha mediana, flanqueadas pelas clulas endodrmicas maiores do intestino primitivo. (B) Formao da notocorda pela dobra dorsal das pequenas clulas ciliadas. (de Sulik et al., 1994, cortesia de K. Sulik e G. C. Schoewolf.)
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tecido do sinciciotrofoblasto parece promover a progresso do embrio para dentro do tero. A atividade proteoltica cessa aps a dcima segunda semana de gestao (Fisher et al., 1989). O tero, por sua vez, supre essa rea com vasos sangneos que, por fim, entram em contato com o sinciciotrofoblasto. Pouco depois, o tecido mesodrmico se estende para fora do embrio em gastrulao (veja Figura 6.33). Estudos recentes com embries humanos e de macaco rhesus sugerem que o saco vitelnico (e portanto o hipoblasto) a fonte desse mesoderma extra-embrionrio (Bianchi et al., 1993), que se junta s extenses trofoblsticas e d origem aos vasos sangneos que levam nutrientes da me para o embrio. O estreito pednculo de conexo do mesoderma extra-embrionrio que liga o embrio ao trofoblasto forma os vasos do cordo umbilical. O rgo completamente desenvolvido, consistindo de tecido trofoblstico e mesoderma contendo vasos sangneos, chamado crio e esse se funde com a parede uterina para formar a placenta. Assim, a placenta tem uma poro materna (o endomtrio uterino que modificado durante a gravidez) e um componente fetal, o crio. Esse pode estar fortemente justaposto ao tecido materno, mas ainda passvel de separao (como na placenta de contato no porco), ou to intimamente integrado que os dois tecidos no podem ser separados sem causar dano para a me e para o feto em desenvolvimento (como na placenta decdua da maioria dos mamferos, incluindo o homem).* [gast2.html] A Figura 6.37 mostra as relaes entre os tecidos embrionrios e extra-embrionrios de embrio humano de 6 semanas. O embrio encontra-se envolvido pelo mnio e protegido pelo crio. Os vasos sangneos se estendendo do crio ao embrio e desse ao crio so facilmente observados, como tambm as vilosidades que se projetam da superfcie externa do crio. Essas vilosidades contm os vasos sangneos e
*Existem numerosos tipos de placenta, e as membranas extra-embrionrias se formam de maneira diferente nas diferentes ordens de mamferos (veja Cruz e Pedersen, 1991). Mesmo que o camundongo e o homem gastrulam e implantam da mesma maneira, suas estruturas extra-embrionrias so distintas. muito arriscado extrapolar fenmenos de desenvolvimento de um grupo de mamferos para outro. At Leonardo da Vinci errou (Renfree, 1982). Seu extraordinrio desenho do feto humano dentro da placenta excelente arte, mas pobre cincia: a placenta de vaca.
Figura 6.37
Embrio humano e placenta aps 40 dias de gestao. O embrio est deitado dentro do mnio, e seus vasos sangneos podem ser vistos estendendo-se para dentro das vilosidades corinicas. A esfera direita do embrio o saco vitelnico. (Instituto Carnegie de Washington, cortesia de C. F. Reather.)
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Para o feto Do feto Do feto
Figura 6.38
Relao entre as vilosidades corinicas e o sangue materno no tero.
Artrias umbilicais Veia umbilical mnio
Vilosidades corinicas Crio (poro fetal da placenta)
Clulas trofoblsticas
Poro maternal da placenta (clulas deciduais)
Para a me Da me
Veia maternal Artria maternal
permitem ao crio ampliar a rea exposta ao sangue materno. Assim, apesar de no haver fuso dos sistemas circulatrios materno e fetal, a difuso de substncias solveis pode ocorrer atravs das vilosidades (Figura 6.38). Dessa maneira, a me proporciona nutrientes e oxignio ao feto, e o feto envia seus produtos descartveis (principalmente dixido de carbono e uria) para a circulao materna. Os vasos sangneos das vilosidades corinicas so formados do mesoderma extra-embrionrio que penetra nos pequenos montes de tecido citotrofoblstico chamados vilosidades primrias (Figura 6.39). As estruturas resultantes, as vilosidades secundrias, se formam na segunda semana de gestao. No fim da terceira semana, uma parte desse mesoderma extra-embrionrio produziu vasos sangneos, e essas vilosidades tercirias esto aptas a trazer nutrientes e oxignio da me para o embrio. [other.html#gast4] O trofoblasto necessrio para a aderncia e entrada do embrio nos tecidos uterinos, e o crio permite troca de gases e nutrientes entre a me e o feto. Mas o crio tem uma importncia at maior; tambm um rgo endcrino. A poro sinciciotrofoblstica do crio produz trs hormnios essenciais para o desenvolvimento dos mamferos. Primeiro, ele produz a gonadotrofina corinica, um hormnio peptdico que capaz de induzir outras clulas da placenta (e do ovrio materno) a produzir progesterona. A progesterona o hormnio esteride que mantm a parede uterina espessada e cheia de vasos sangneos. Nos primatas, os ovrios podem ser removidos depois do primeiro tero da gravidez, sem danos para o desenvolvimento do feto, porque o crio tem capacidade para produzir os esterides necessrios para manter a gestao (Zander e von Mnstermann, 1956). A progesterona placentria tambm usada pela glndula supra-renal fetal como um substrato para a produo de hormnios corticosterides biologicamente
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(A) Vilosidade primria Endomtrio Espao entre vilosidades Sinciciotrofoblasto Citotrofoblasto Mesoderma extraembrionrio
(B)
Vilosidade secundria Endomtrio Casca citotrofoblstica Sinciciotrofoblasto Espao entre vilosidades Citotrofoblasto Capilares das vilosidades
(C)
Vilosidade terciria
Figura 6.39
Desenvolvimento das vilosidades corinicas em humanos. (A) Vilosidade primria composta de tecido citotrofoblstico encaixado no sinciciotrofoblasto. (B) Vilosidade secundria formada quando o mesoderma extra-embrionrio subjacente penetra na vilosidade primria. Tais vilosidades secundrias juntam-se s vilosidades adjacentes para formar a casca citotrofoblstica que ir ancorar as vilosidades ao endomtrio. (C) dentro do mesoderma extra-embrionrio, formam-se capilares que iro se conectar aos ramos da artria e veia umbilicais. (Segundo Gilbert, 1989.)
Mesoderma extra-embrionrio
importantes. O terceiro hormnio produzido pelo crio a somatomamotropina corinica (freqentemente chamada lactognio placentrio). Esse hormnio responsvel pelo desenvolvimento do seio materno durante a gestao, assim, permitindo a produo de leite mais tarde. Estudos recentes indicam que o crio pode ter ainda outra funo, que a de proteger o feto da resposta imune da me. Uma pessoa com um sistema imune normal reconhece e rejeita clulas estranhas dentro do seu corpo; esse fato demonstrado pela rejeio a transplantes de pele e de rgos de indivduos geneticamente diferentes. As glicoprotenas responsveis por essa rejeio so chamadas de antgenos de histocompatibilidade principais e, provavelmente, diferem de indivduo a indivduo. Uma criana expressa antgenos de histocompatibilidade principais de ambos, o pai e a me, e o corpo da me rejeitar a pele ou rgos de seus descendentes porque eles contm antgenos derivados do pai. Como ento, pode o feto humano permanecer 9 meses dentro do corpo da me? Porque a me no rejeita imunologicamente o seu feto, como ela rejeitaria um rgo daquela criana? Parece que o crio desenvolveu vrios mecanismos pelos quais ele pode inibir a resposta imune contra o feto (Chaouat, 1990). Ele pode secretar protenas solveis que bloqueiam a produo de anticorpos, e pode promover a produo de certos tipos de linfcitos que impedem a resposta imune normal dentro do tero. As clulas citotrofoblsticas tambm contm uma forma de antgeno de histocompatibilidade principal, especfico da placenta, que parece proteger o embrio de ser reconhecido pelo sistema imune da me (Carosella et al., 1996; Pazmany et al., 1996). Assim, as funes da placenta incluem no s suporte fsico e troca nutricional, mas tambm a regulao das relaes endcrinas e imunolgicas entre a me e o feto. [gast3.html] Na gastrulao, observamos uma srie incrivelmente bem coordenada de movimentos celulares pelos quais os blastmeros do estgio de clivagem so rearranjados e comeam a interagir com seus vizinhos. Alm disso, apesar de haver diferenas entre os movimentos na gastrulao de embries de ourio-do-mar, anfbios, aves e mamferos, certos mecanismos so comuns a todos. Cada grupo tem o problema de trazer as clulas precursoras do mesoderma e do endoderma para dentro do corpo, e envolver o embrio com precursores ectodrmicos. Dadas as diferentes quantidades e distribuies de vitelo, como tambm outras consideraes ambientais, cada tipo de organismo foi capaz de desenvolver uma maneira de conseguir esse objetivo. O palco est, agora, pronto para a formao dos primeiros rgos.
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CAPTULO 7 Neurulao e o Ectoderma
253
Incio do desenvolvimento vertebrado: Neurulao e ectoderma
Porque a verdadeira maravilha, se voc quiser se maravilhar, este processo. Voc inicia como uma nica clula derivada da unio entre um espermatozide e um vulo; essa se divide em duas, depois quatro, depois oito e assim por diante e, em um certo estgio aparece uma nica clula, cuja descendncia total o crebro humano. A mera existncia de tal clula deveria ser uma das coisas assombrosas da Terra. As pessoas deveriam vagar o dia inteiro, enquanto acordadas, chamando umas s outras, maravilhadas, falando de nada exceto da clula.
LEWIS THOMAS (1979)
M 1828 KARL ERNST VON BAER, o mais eminente embriologista de sua
poca*, anunciou: Eu tenho dois pequenos embries preservados em lcool, que esqueci de identificar. No momento, no consigo determinar o gnero ao qual pertencem. Eles podem ser lagartos, pequenas aves ou mesmo mamferos. A Figura 7.1 permite-nos apreciar seu dilema e ilustra as quatro leis gerais da embriologia propostas por von Baer. De seu estudo detalhado sobre o desenvolvimento da galinha e da comparao de tais embries com embries de outros vetebrados, von Baer estabeleceu quatro generalizaes, ilustradas aqui com alguns exemplos de vertebrados. 1. As caractersticas gerais de um grande grupo de animais aparecem no embrio mais cedo do que os aspectos especializados. Todos os vertebrados em desenvolvimento (peixes, rpteis, anfbios, aves e mamferos) so muito semelhantes logo aps a gastrulao. Somente mais tarde no desenvolvimento que as caractersticas especiais da classe, ordem e, finalmente, espcie aparecem (veja Figura 7.1). Todos os embries de vertebrados tm arcos de guelras, notocordas, medulas espinhais e rins pronfricos. 2. Caracteres menos gerais so desenvolvidos a partir dos mais gerais, at finalmente aparecerem os caracteres mais especializados. Inicialmente todos os vertebrados tm o mesmo tipo de pele. Somente mais tarde se desenvolvem as escamas de peixes, as escamas de rpteis, as penas das aves, ou o plo, garras e unhas dos mamferos. Da mesma maneira, o desenvolvimento precoce de membros essencialmente o mesmo em todos os vertebrados. Somente mais tarde que diferenas entre pernas, asas e braos se tornam evidentes. 3. Cada embrio de uma dada espcie, em lugar de passar atravs de todos os estgios adultos de outros animais, se afasta mais e mais deles. As fendas viscerais em embries de aves e mamferos no se parecem em detalhe s fendas das guelras de peixes adultos. Ao contrrio, elas se parecem s fendas viscerais de peixes embrionrios e outros vertebrados embrionrios. Enquanto peixes preservam e elaboram essas fendas tornando-as verdadeiras guelras, os mamferos as convertem em estruturas tais como os tubos de Eustquio (entre o ouvido e a boca). 4. Assim, o embrio precoce de um animal superior nunca como um animal inferior, mas somente como seu embrio precoce. Von Baer verificou que diferentes
Ainda mais atraente do que a mata virgem, era a floresta que se estendia a minha frente naquele momento: o sistema nervoso central.
RITA LEVI-MONTALCINI (1988)
* K. E. von Baer descobriu a notocorda, o ovo de mamfero e o ovo humano, alm de contribuir para o progresso conceitual aqui descrito. Seu trabalho ser mais discutido no Captulo 23.
253
254
Figura 7.1
Ilustrao das leis de von Baer. Embries precoces de vertebrados mostram aspectos comuns ao subfilo inteiro. Com o progresso do desenvolvimento, os embries se tornam reconhecveis como membros de sua classe, sua ordem, sua famlia e, finalmente, sua espcie. (de acordo com Romanes, 1901).
II
III
Peixe
Salamandra Tartaruga
Galinha
Porco
Boi
Coelho
Homem
grupos de animais compartilham aspectos comuns durante o desenvolvimento embrionrio precoce e que esses aspectos se tornam mais e mais caractersticos da espcie medida que progride o desenvolvimento. Embries humanos nunca passam por estgios equivalentes a um peixe ou uma ave adultos; realmente, embries humanos inicialmente compartilham caractersticas comuns com embries de peixes e aves. Mais tarde, os embries de mamferos e outros divergem, nenhum deles passando pelos estgios dos outros. Von Baer tambm reconheceu que existe um modelo comum para todo o desenvolvimento de vertebrados: as trs camadas germinativas originam diferentes rgos, e essa derivao dos rgos constante se o organismo um peixe, uma r ou uma galinha. O ectoderma forma a pele e os nervos; o endoderma forma os sistemas respiratrios e digestivos; e o mesoderma forma o tecido conjuntivo, as clulas do sangue, o corao, o sistema urogenital e partes da maioria dos rgos internos. Neste captulo acompanharemos o desenvolvimento precoce do ectoderma; este, e o captulo seguinte enfocam a formao do sistema nervoso nos vertebrados. O Captulo 9 acompanhar o desenvolvimento precoce dos rgos endodrmicos e mesodrmicos.
FORMAO DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL Neurulao: aspectos gerais

Talvez a mais intrigante de todas as perguntas se o crebro suficientemente poderoso para resolver o problema da sua prpria criao. Assim Gregor Eichele (1992) terminou, recentemente, uma reviso de pesquisa sobre desenvolvimento do crebro de mamferos. A construo de um rgo que reconhece, pensa, ama, odeia, lembra, troca, engana a si mesmo, e coordena nossos processos corporais conscientes ou inconscientes indubitavelmente o mais desafiante dos enigmas do desenvolvimento. Uma combinao de abordagens genticas, celulares e orgnicas est fornecendo uma compreenso preliminar de como a anatomia bsica do crebro se torna ordenada.
255
O processo pelo qual o embrio forma o tubo neural, o rudimento do sistema nervoso central, chamado neurulao, e um embrio sofrendo essas transformaes chamado nurula. Existem dois caminhos principais para a formao do tubo neural. Em neurulao primria, o cordomesoderma estimula o ectoderma, que o recobre, a se proliferar, invaginar e a se destacar da superfcie formando um tubo oco. Na neurulao secundria, o tubo neural se origina de um slido cordo de clulas que se embebe no embrio e subseqentemente se torna oco (forma uma cavidade) para formar o tubo neural (veja Schoenwolf, 1991b). O quanto essas formas de construo so usadas depende da classe de vertebrados. A neurulao em peixes exclusivamente secundria. Em aves, as pores anteriores do tubo neural so construdas por neurulao primria, ao passo que o tubo neural, caudal ao par somito 27 (isto , tudo posterior aos membros posteriores), construdo por neurulao secundria (Pasteels, 1937; Catala et al., 1996). Em anfbios, como o Xenopus, a maior parte do tubo neural do girino produzida por neurulao primria, mas o tubo neural caudal derivado de neurulao secundria (Gont et al., 1993). Em camundongo (provavelmente no homem, tambm), a neurulao secundria comea aproximadamente ao nvel do somito 35 (Schoenwolf, 1984; Nievelstein et al., 1993).
Neurulao primria
Em vertebrados, a gastrulao cria um embrio com uma camada endodrmica interna, uma camada mesodrmica intermediria e um ectoderma externo. A interao entre o mesoderma dorsal e o ectoderma que a ele se sobrepem uma das interaes mais importantes em todo o desenvolvimento de tetrpodes, porque ela inicia a organognese, a criao de tecidos e rgos especficos. Nessa interao, o cordomesoderma estimula o ectoderma acima dele a formar o tubo neural oco, que se diferenciar em crebro e medula espinhal. Os eventos da neurulao primria esto no
(A)
Placa neural
Prega neural
(B)
(C)
Crista neural
Figura 7.2
Neurulao em anfbios e amniotas. (A) Diagrama representativo da formao do tubo neural. As clulas ectodrmicas esto representadas como precursoras da crista neural (preto) ou como precursoras da epiderme (cor). O ectoderma se dobra no ponto mais dorsal, formando a epiderme externa e um tubo neural interno conectados pelas clulas da crista neural. (B) Fotomicrografias de neurulao em um embrio de galinha de 2 dias. (C) Formao do tubo neural vista em sees transversais do embrio de galinha na regio do futuro mesencfalo (setas em B). Cada fotografia em C corresponde outra acima dela. (HF, prega ceflica; HP, processo ceflico; HN, ndulo de Hensen; M, mesencfalo; NP, placa neural.) (Fotomicrografias, cortesia de R. Nagele.)
Epiderme
Tubo neural
256
Figura 7.3
Quatro vistas da neurulao em um embrio de anfbio, mostrando em cada caso nurulas precoce (esquerda), mdia (centro) e tardia (direita). (A) Seo transversal no centro do embrio. (B) A mesma seqncia olhando a superfcie dorsal do embrio inteiro, de cima para baixo. (C) Seo sagital pelo plano mediano do embrio. (D) Simulao computadorizada em trs dimenses da constrio, extenso e levantamento da placa neural. (A-C de acordo com Balinsky, 1975; D de acordo com Jacobson e Gordon, 1976.)
Placa neural Prega neural (A) SEO TRANSVERSAL
diagrama da Figura 7.2. Durante a neurulao primria, o ectoderma original dividido em trs conjuntos de clulas: (1) o tubo neural posicionado internamente, que formar o crebro e a medula espinhal, (2) a epiderme da pele posicionada externamente, e (3) as clulas da crista neural, as quais migram da regio de conexo entre o tubo neural e a epiderme, e iro gerar os neurnios perifricos e a glia, as clulas pigmentadas da pele e vrios outros tipos de clulas. O fenmeno de induo embrionria, que inicia a neurulao na regio dorsal do embrio, ser detalhada no Captulo 15. Neste captulo estamos considerando a resposta dos variados tecidos ectodrmicos.
Placa neural Notocorda Notocorda Arquntero Mesoderma Notocorda Mesoderma Cavidade do intestino
Tubo neural Cavidade do intestino
Endoderma Mesoderma Epiderme
Endoderma Endoderma Epiderme Epiderme
Notocorda Prega neural Epiderme (B) SEO SAGITAL Arquntero Resto da blastocele Placa neural
Notocorda Prega neural Placa neural Prega neural Blastporo Blastporo Cavidade do intestino
Tubo neural
Cavidade do intestino Mesoderma Endoderma Epiderme Mesoderma Endoderma
Mesoderma Epiderme Endoderma Divertculo do fgado Tubo neural
Placa neural (C) VISTA DA SUPERFCIE DORSAL
Prega neural
Placa neural
Prega neural Pregas neurais fundidas
Blastporo
Blastporo
(D) SIMULAO COMPUTADORIZADA DA DEFORMAO DA LMINA DE ECTODERMA (LINHA C)
257
(A) Formao das pregas neurais
(B) Elevao das pregas neurais
(C)
Epiderme presuntiva Placa neural presuntiva Zona de transio Placa neural
Notocorda Formao de cunha Formao de sulco
Epiderme Notocorda
Ancoragem
Figura 7.4
O processo de neurulao primria em embries de r est descrito na Figura 7.3 e parece ser similar em anfbios, rpteis, aves e mamferos (Galera, 1971). A primeira indicao que uma regio do ectoderma est destinada a se tornar tecido neural uma mudana na forma celular (Figura 7.4). As clulas ectodrmicas da linha mdia tornamse alongadas, enquanto as clulas destinadas a formar a epiderme se tornam mais achatadas. O alongamento das clulas ectodrmicas dorsais causa a elevao dessas regies neurais presuntivas acima do ectoderma circundante, criando assim, a placa neural. At 50% do ectoderma est includo nessa placa. Logo aps, as bordas da placa neural se engrossam e se movem para cima formando as pregas neurais, enquanto um sulco neural, em forma de -U- aparece no centro da placa, dividindo os futuros lados direito e esquerdo do embrio (veja Figuras 7.3 e 7.4). As pregas neurais migram em direo linha mdia do embrio, finalmente se fundindo para formar o tubo neural abaixo do ectoderma sobreposto. As clulas da poro mais dorsal do tubo neural se tornam as clulas da crista neural. A mecnica da neurulao primria A neurulao ocorre com algumas variaes em diferentes regies do corpo. A cabea, o tronco e a cauda formam, cada um, sua regio do tubo neural de maneira a refletir a relao da notocorda com o ectoderma que a ela se sobrepe. Tanto as regies da cabea como as do tronco, sofrem variantes da neurulao primria, e esse processo pode ser dividido em cinco estgios distintos, mas espacialmente e temporalmente se superpondo estgios (Schoenwolf, 1991a; Catala et al., 1996): (1) a formao da placa neural, (2) a formao do assoalho da placa neural, (3) a modelagem da placa neural, (4) o dobramento da placa neural para formar o sulco neural, e (5) o fechamento do sulco neural para formar o tubo neural. A formao da placa neural A formao da placa neural como uma regio distinta de outras clulas ectodrmicas ser discutida em detalhe nos Captulos 8 e 15. Em geral, considera-se que o mesoderma dorsal subjacente (em colaborao com outras regies do embrio) sinaliza s clulas ectodrmicas acima dela para se desenvolverem em clulas colunares da placa neural (Smith e Schoenwolf, 1989; Keller et al., 1992; discusso posterior neste captulo). Como resultado dessa induo neural, as clulas da placa neural presuntiva se distinguem do ectoderma circundante, a qual se transformar em epiderme. As clulas da placa neural e as clulas da epiderme possuem seus prprios movimentos intrnsecos (Moury and Schoenwolf, 1995). Se a epiderme ao redor da placa neural isolada,
Representao esquemtica do dobramento do epitlio durante a neurulao na galinha. (A) Formao das pregas neurais ocorre quando as clulas epidrmicas presuntivas se movem para dentro, na direo da linha mdia do embrio. Essa epiderme presuntiva empurra a placa neural abaixo dela, enquanto se move. (B) Enquanto as clulas da linha mdia da placa neural (clulas da placa do assoalho) so ancoradas notocorda, as pregas neurais so elevadas. Esses movimentos parecem continuar enquanto a epiderme, se movendo para o meio, puxa com ela a placa neural, resultando na justaposio das pregas neurais. (C) Nas trs regies de articulao (no ponto de articulao mediano MHP e nos dois pontos de articulao dorsolateral a -DLHP), as clulas da placa neural mudam seu comprimento e sofrem uma constrio nos seus pices. (De acordo com Moury e Schoenwolf, 1995.)
258
as clulas se movem em direo ao centro (ou seja, em direo rea onde estava a placa neural). Se a placa neural isolada, suas clulas convergem e se estendem para formar uma placa mais delgada, mas no se fundem para formar um tubo neural. Esses movimentos da placa neural e da epiderme originam as pregas neurais. Inicialmente, o ectoderma torcido e logo a epiderme presuntiva comea a recobrir a placa neural. (Realmente, se a regio de transio contendo os dois tecidos isolada, ela formar pequenas pregas neurais em cultura). Esses movimentos coordenados finalmente causaro a elevao e o dobramento do tubo neural (veja Figura 7.4; Jacobson e Moury, 1995; Moury e Schoenwolf, 1995). Formao do assoalho da placa neural Anteriormente, considerava-se que somente as clulas da linha mdia da placa neural formavam a placa do assoalho do tubo neural. Ou seja, no fechamento da placa para formar o tubo neural, suas clulas mais centrais se localizariam no fundo do tubo. As partes mais perifricas, as pregas neurais, se tornariam as pores mais dorsais do tubo neural. Provavelmente assim que se forma a regio da cabea. Evidncia recente, entretanto, sugere que o assoalho do tubo neural do tronco tem uma outra origem - que se origina em parte do ndulo de Hensen e inserido no centro da placa neural. Esse modelo foi proposto por Catala e colaboradores (1995) baseado nos seus dados e em estudos anteriores de vrios laboratrios. Para acompanhar as clulas embrionrias individuais do ndulo eles usaram o sistema de quimera galinha-codorna. Embries de galinha e codorna se desenvolvem de maneira muito semelhante (especialmente no desenvolvimento precoce), e quando pores do embrio de codorna so enxertadas em uma regio equivalente do embrio de galinha, as clulas se integram no embrio e participam da construo dos rgos adequados. O enxerto pode ser feito enquanto o embrio ainda est dentro do ovo, e o pinto que eclode uma quimera, tendo uma poro do seu corpo composta de clulas de codorna (Figura 7.5; Le Douarin, 1969; Le Douarin e Teillet, 1973). As clulas de galinha e codorna, entretanto, tm duas diferenas crticas. Primeiro, na codorna a heterocromatina do ncleo est concentrada ao redor dos nuclolos. Isso cria uma grande massa que se cora intensamente e facilmente distinta da heterocromatina difusa da galinha. Segundo, existem alguns antgenos que so especficos para a
(A)
Figura 7.5
Uma quimera galinha-codorna. (A) Duas quimeras galinha-codorna e uma galinha controle 4 dias aps a ecloso. Nas quimeras, o tubo neural dorsal anterior da codorna substituiu uma regio equivalente da galinha no embrio de 12-somitos. Melancitos de codorna, originrios da crista neural, migram para as penas da cabea, ao nvel do enxerto. (B) Uma regio do embrio contendo tanto clulas de codorna (com sua cromatina altamente condensada) como clulas de galinha (com sua cromatina mais difusa). (de Le Douarin et al., 1996; fotografias, cortesia de N. M. Le Douarin.)
(B)
Clula de galinha Clula de codorna
259
(A)
Somito 6
(B)
Tubo neural Somito
Ndulo de Hensen Codorna Galinha
codorna e no so encontrados em clulas da galinha. Os dois fenmenos permitem distinguir clulas individuais de codorna, mesmo quando a populao celular , na sua maioria, de galinha. Esses pesquisadores removeram o ndulo de Hensen e o trmino caudal da notocorda em alongao de embries de galinha com 6-somitos (1.5 dias) e os substituiram com seus equivalentes de codorna. Daquele nvel at a cauda, tanto a notocorda como a placa do assoalho foram compostas de clulas de codorna. As paredes do tubo neural foram produzidas da placa neural da galinha (Figura 7.6). interessante notar que (como previsto pela regresso do ndulo, discutida no Captulo 6) a placa do assoalho e as clulas da notocorda, associadas com a placa neural, se localizavam mais em direo cauda do que o prprio ndulo. Portanto, o ndulo de Hensen contm as clulas necessrias para a formao da placa do assoalho caudal e da notocorda. As clulas da placa do assoalho se inserem na parte central do ectoderma dorsal e somente mais tarde que a notocorda se separa da placa do assoalho pela formao de uma membrana basal entre elas (Figura 7.7).* O tubo neural tem duas fontes distintas - uma ectodrmica e uma do ndulo de Hensen. A modelagem e dobramento da placa neural Foras intrnsecas placa neural esto envolvidas na sua modelagem. Ao se tornarem mais colunares, as clulas provocam um estreitamento da placa neural, mas a modelagem mais importante da placa produzida pelas suas clulas da linha mediana que se situam diretamente acima da notocorda. Em aves e mamferos, essas clulas da linha mediana da placa neural so chamadas clulas do ponto de articulao mediano (MHP) e so derivadas da placa neural imediatamente anterior ao ndulo de Hensen e da sua linha mdia anterior (do ndulo de Hensen) (Schoenwolf, 1991a,b; Catala et al., 1996). Tanto em anfbios como amniotas, as clulas da placa neural sofrem uma extenso convergente pela intercalao de vrias camadas de clulas no meio de poucas camadas (Jacobson e Sater, 1988; Schoenwolf e Alvarez, 1989). Dessa maneira, elas alongam e estreitam a placa neural (veja Figura 7.3c). O dobramento da placa neural conseqncia de foras intrnsecas e extrnsecas s suas clulas. Na galinha, a placa neural comea a dobrar-se mesmo quando ainda est sendo modelada. As clulas MHP ficam ancoradas notocorda, abaixo delas,
* A idia de que a notocorda e a placa do assoalho so derivadas da mesma populao de clulas de apreciao recente, mas esse fenmeno j havia sido documentado em um famoso livro de embriologia. O livro Induo embrionria e desenvolvimento de Hans Spemann em 1938 tem uma ilustrao do famoso experimento de enxerto de Spemann e Mangold. Nas pginas 144 e 146 daquele livro (e reproduzido aqui na Figura 15.12), o enxerto do lbio dorsal do blastporo mostrado como dando origem ao mesoderma dorsal (notocorda e somitos) e placa do assoalho do tubo neural.
Endoderma dorsal
Figura 7.6
A placa do assoalho do tubo neural do tronco da galinha derivado do ndulo de Hensen. (A) Esquema da operao pela qual o ndulo de um embrio de galinha de 6-somitos substitudo pelo seu correspondente de codorna. (B) Anlise do eixo quimrico (marcado com antgeno especfico para a codorna) mostrando clulas de codorna na notocorda (flecha) e placa do assoalho (cabeas de flecha). (B de Catala et al., 1996; fotografia, cortesia de N. M. Le Douarin.)
260
Placa neural Poo do ndulo de Hensen
Articulao cordoneural
Figura 7.7
O ndulo de Hensen contribui tanto para a notocorda como para a placa do assoalho neural. Seo atravs do ndulo de Hensen no estgio do somito-6, mostrando que esse contribui para a camada superior das clulas embrionrias. (de Catala et al., 1996; fotografia, cortesia de N. M. Le Douarin.)
originando uma articulao em forma de sulco na linha mdia dorsal. Essas clulas so induzidas pela notocorda a diminuir sua altura e adquirir a forma de cunha (van Straaten et al., 1988; Smith e Schoenwolf, 1989). As clulas laterais MHP no sofrem essas mudanas (Figuras 7.4 e 7.8). Logo aps, duas outras regies de articulaes formam sulcos prximos conexo da placa neural ao restante do ectoderma. Essas regies so chamadas pontos de articulao dorsolateral (DLHPs), e esto ancoradas ao ectoderma da superfcie da prega neural. Essas clulas aumentam sua altura e adquirem a forma de cunha. Essa transformao (modelagem como cunha) est intimamente ligada s modificaes da forma celular. Nos pontos de articulao dorsolateral, tanto microtbulos como microfilamentos esto envolvidos nessas transformaes. A colchicina, um inibidor de polimerizao de microtbulos, inibe o alongamento dessas clulas, enquanto citocalasina B, um inibidor da formao de microfilamentos, impede a constrio apical dessas clulas impedindo, assim, a formao de cunha (Burnside, 1971, 1973; Karfunkel, 1972; Nagele e Lee, 1980, 1987). Depois da formao inicial de sulcos, a placa neural se dobra ao redor dessas regies com articulaes. Cada uma delas age como um eixo que dirige a rotao das clulas ao seu redor (Smith e Schoenwolf, 1991). Enquanto isso, foras extrnsecas tambm esto em ao. O ectoderma superfcial do embrio de galinha empurra na direo central do embrio, fornecendo mais uma fora motora para o dobramento da placa neural (veja Figura 7.4 B,C; Alvarez e Schoenwolf, 1992). Esse movimento da epiderme presuntiva e a ancoragem da placa neural ao mesoderma subjacente deve ser tambm importante para assegurar que o tubo neural se dobre para dentro do embrio e no para fora. Se pequenos pedaos da placa neural so isolados do resto do embrio (incluindo o mesoderma) eles tendem a se enrolar para fora (Schoenwolf, 1991a). Fechamento do tubo neural O tubo neural se fecha ao se aproximarem os pares de dobras neurais na linha mdia dorsal; as dobras aderem umas s outras e as clulas das duas partes se renem. Em algumas espcies, as clulas nessa juno formam as clulas da crista neural. Mas em aves, as clulas da crista neural no migram da regio dorsal at que o tubo neural tenha sido fechado naquele local. Em mamferos, entretanto, as clulas da crista neural cranial (que formam as estruturas da face e do pescoo) migram enquanto as dobras neurais esto se elevando (ou seja, antes do fechamento do tubo), enquanto que na regio da medula espinhal, as clulas da crista esperam at que o fechamento ocorra (Nichols, 1981; Erickson e Weston, 1983).
261
(A)
(B)
(C)
Figura 7.8
Micrografia eletrnica de varredura da formao do tubo neural no embrio de galinha. (A) Sulco neural rodeado por clulas mesenquimatosas. (B) Clulas neuroepiteliais alongadas formam um tubo, enquanto as clulas epidrmicas achatadas so trazidas linha mdia do embrio. As clulas MHP formam uma articulao no fundo do tubo, enquanto as clulas da placa neural, ligadas rea basal do ectoderma da superfcie formam as regies de articulaes dorsolaterais. Essas trs articulaes podem ser vistas como sulcos. (C) A formao do tubo neural completada. As clulas que eram a placa neural esto agora dentro do embrio. A epiderme presuntiva se localiza acima do tubo, e o tubo neural ladeado pelos somitos mesodrmicos e no fundo limitado pela notocorda. (Fotografias, cortesia de K. W. Tosney.)
A formao do tubo neural no ocorre simultaneamente ao longo do ectoderma. Isso pode ser melhor observado naqueles vertebrados (como aves e mamferos) cujo eixo corporal se alonga antes da neurulao. A Figura 7.9 detalha a neurulao em um embrio de galinha com 24 horas. A neurulao na regio ceflica (cabea) est bastante adiantada, enquanto a regio caudal (rabo) do embrio est ainda gastrulando. A regionalizao do tubo neural tambm ocorre como resultado de mudanas na forma
262
Figura 7.9
Ectoderma da cabea Mesnquima
Anterior
Ectoderma do blastoderma
Estereograma de um embrio de galinha de 24 horas. As pores ceflicas esto terminando a neurulao enquanto as pores caudais esto ainda gastrulando. (de Patten, 1971; de acordo com Huettner, 1949.)
Prega neural Notocorda Espao subceflico Celoma extraembrionrio Prega lateral do corpo Regio pericrdica do celoma Vitelo aderente ao endoderma Sulco neural Prega neural Placa neural Endoderma do intestino mdio Somito Divergncia das pregas neurais Sulco neural Intestino Mesoderma extraembrionrio Vitelo Prega neural Placa neural Endoderma Porta intestinal anterior Somito Mesoderma intermedirio Mesoderma somtico Celoma Mesoderma esplncnico
N de Hensen Poo primitivo
Ilhota sagnea
Mesoderma
Linha primitiva
Sulco primitivo Margem primitiva
Posterior
do tubo. Na ponta ceflica (onde se formar o crebro) a parede do tubo larga e grossa. Aqui, uma srie de inchaos e constries definiro os vrios compartimentos do crebro. Na parte caudal regio da cabea, entretanto, o tubo neural permanece um simples tubo que se afina em direo cauda. As duas pontas abertas do tubo neural so chamadas neurporo anterior e neurporo posterior. O fechamento do tubo neural nos mamferos, diversamente da galinha, se inicia em vrios locais ao longo do eixo ntero-posterior (Golden e Chernoff, 1993; Van Allen et al., 1993). Vrios defeitos no tubo neural so causados pelo no fechamento em alguns segmentos (Figura 7.10). Falha no fechamento na regio posterior do tubo neural humano aos 27 dias (ou a ruptura subseqente do neurporo posterior logo em seguida) resulta na condio denominada espinha bfida, cuja severidade depende de quanto da medula espinhal permanece aberta. Falha no fechamento do
263
(A) Prega neural Intumescncia pericardaca Placdio tico Somitos Ectoderma da superfcie Crista neural
(B)
Neurporo anterior Intumescncia pericardaca
(C)
(D)
(E)
Tubo neural
Somitos
Borda cortada do mnio 22 dias
Sulco neural 23 dias
Neurporo posterior Normal Anencefalia Espinha bfida
Figura 7.10
Neurulao em embries humanos. (A) Sees dorsal e transversal de um embrio humano de 22 dias, iniciando a neurulao. Ambos neurporos, anterior e posterior, esto abertos ao lquido amnitico. (B) Vista dorsal de um embrio humano em neurulao, um dia depois. A regio do neurporo anterior est se fechando, enquanto o neurporo posterior permanece aberto. (C) Regies de fechamento do tubo neural postulado por evidncia gentica (superimposta ao corpo do recm-nascido). (D) Anencefalia devido a falta de fuso da placa neural na regio 2. (E) Espinha bfida devida a falta de fuso na regio 5 (ou pela falta de fechamento do neurporo mais posterior). (C-E de acordo com Van Allen et al., 1993.)
tubo neural anterior resulta em uma condio letal, anencefalia. Aqui, o crebro anterior permanece em contato com o lquido amnitico e em seguida degenera. O desenvolvimento do crebro anterior fetal cessa, e a abboda do crnio no se forma. Essas anormalidades no so raras em humanos, pois esto presentes em aproximadamente um em cada quinhentos nascimentos viveis. Defeitos de fechamento do tubo neural podem freqentemente ser identificados durante a gravidez por vrios testes fsicos e qumicos. O fechamento do tubo neural humano envolve uma complexa interao entre fatores genticos e ambientais. Certos genes, Pax3, sonic hedgehog e openbrain, so essenciais para a formao do tubo neural de mamferos, mas fatores da dieta como colesterol e cido flico parecem ser crticos.* Foi estimado que aproximadamente 50% dos defeitos do tubo neural poderiam ser evitados se as mulheres grvidas tomassem suplementos de cido flico (vitamina B12), e o Servio de Sade Pblica dos Estados Unidos da Amrica recomendam que todas as mulheres em idade frtil tomem 0.4mg dirios de folato para reduzir o risco de defeitos do tubo neural durante a gravidez (Milunsky et al., 1989; Czeizel e Dudas, 1992; CDC, 1992). [ecto1.html] O tubo neural finalmente forma um cilindro fechado que se separa do ectoderma da superfcie. Considera-se que essa separao mediada pela expresso de diferentes molculas de adeso celular. As clulas que se tornaro o tubo neural, originalmente expressam E-caderina, mas elas param de expressar essa protena ao se formar o tubo e, em vez disso, sintetizam N-caderina e N-CAM (veja Figura 3.17). Como resultado, os dois tecidos no aderem mais um ao outro. Se o ectoderma da superfcie passar a expressar N-caderina (injetando mRNA de N-caderina em uma das clulas do embrio de Xenopus de duas cabeas), a separao do tubo neural da epiderme presuntiva dramaticamente impedida (Detrick et al., 1990; Fujimori et al., 1990).
*Colesterol parece ser necessrio para a autoclivagem da protena Sonic hedgehog. Mutaes da Sonic hedgehog podem impedir o fechamento do tubo neural em camundongos e no homem (Chiang et al., 1996; Roessler et al., 1996); a poro ativa da Sonic hedgehog sua regio N-terminal. Essa regio clivada da molcula precursora em uma reao que requer colesterol como um cofator (Porter et al., 1996). No homem, certas sndromes envolvendo falhas no fechamento do tubo neural foram relacionadas s mutaes na sntese de colesterol (Kelley et al., 1996).
264
&
Especulaes
A modelagem dorsoventral do sistema nervoso
NQUANTO O TUBO NEURAL est sendo formado, ele est recebendo sinais de dois outros conjuntos de tecidos. Esses sinais so instrues para que o tubo neural tenha uma determinada polaridade dorsoventral. O tubo neural ventral parece ser modelado pela protena Sonic hedgehog originria da notocorda e das clulas da placa do assoalho (veja Figura 7.7B; Ericson et al., 1996). Essa protena induz certas clulas do lado ventrolateral do tubo neural a expressar genes que as transformam em neurnios motores (Figura 7.11A; Prancha 32). Sonic hedgehog tambm funciona reprimindo a expresso de genes como dorsalin, Pax3 e msx1 da poro ventral do embrio. Esses genes seriam expressos normalmente ao longo do tubo neural mas so inibidos pelo sinal, ventralmente produzido pela
Sonic hedgehog. O destino dorsal do tubo neural determinado pelas protenas morfogenticas do osso, provavelmente BMP4 e BMP7. Essas protenas so expressas na epiderme dorsal presuntiva (Figura 7.11B,C) e foi demonstrado que elas contrariam o efeito da Sonic hedgehog (permitindo a expresso de genes como
(B)
msx1 e Pax3 na poro dorsal do tubo neural), alm de promover a expresso de outros genes dorsalmente especficos (Figura 7.11D). O papel dessas protenas foi confirmado por experincias in vitro nas quais tubos neurais isolados foram expostos a produtores desses sinais (Yamada et al., 1993; Liem et al., 1995).
Figura 7.11
(C)
A modelagem dorsoventral do tubo neural. (A) Diferenciao de neurnios motores vista nos neurnios ventrolaterais; se as clulas da placa do assoalho ou as clulas que expressam o Sonic hedgehog so transferidas para uma posio lateral, neurnios motores tambm sero formados. (B) BMP4 expresso na epiderme dorsal presuntiva durante a formao do tubo neural. (C) Expresso de BMP7 enquanto o tubo neural se fecha. (E) Resumo das interaes pela quais Sonic hedgehog promove o desenvolvimento de neurnios motores e inibe sinais de dorsalizao. (de Yamada et al., 1993; Liem et al., 1995; fotografias, cortesia de K.Liem.)
(E)
(A)
Conjunto secundrio de neurnios motores Placa do assoalho ventral doada por outro embrio
Sinais dorsais
(D) Inibio dos sinais dorsais por Sonic hedgehog
Neurnios motores Induo de neurnios motores ventrolaterais Placa do assoalho ventral
Neurulao secundria
A neurulao secundria envolve a formao do cordo medular e seu subseqente esvaziamento interno formando o tubo neural. Na r e na galinha, esse tipo de neurulao geralmente identificado na formao das vrtebras lombar e da cauda. Em ambos os casos, a neurulao secundria pode ser vista como continuao da gastrulao. Entretanto, as clulas do lbio dorsal do blastporo continuam a crescer
265
Notocorda Blastocele Placa neural presuntiva Movimentos de extenso posterior
Medula espinhal Canal ependimrio Intestino Assoalho Te t o Notocorda Articulao cordoneural Parede posterior
Movimentos involutivos
Ectoderma (A) (B)
Lbio dorsal tardio (articulao cordoneural)
(C)
nus
Canal neurentrico
Figura 7.12
Movimentos celulares durante a neurulao secundria em Xenopus. (A) Involuo da mesoderma no estgio de gstrula mdia.(B) Movimentos do lbio dorsal do blastporo nos estgios de gstrula tardia/ gstrula precoce. A involuo cessou e ambos, o ectoderma e o mesoderma do lbio tardio do blastporo se movem posteriormente. (C) Estgio de girino precoce, onde as clulas revestindo o blastporo formam o canal neurentrico, parte do qual se torna o lmen do tubo neural secundrio. (de Gont et al., 1993.)
ventralmente, em lugar de involuir para o embrio (Figura 7.12A,B). A regio em crescimento, na ponta do lbio, chamada articulao cordoneural (Pasteels, 1937), e contm precursores da poro mais posterior da placa neural e a poro posterior da notocorda. O crescimento dessa regio converte a gstrula aproximadamente esfrica, 1.2mm de dimetro, em um girino linear com 9mm de comprimento. A ponta da cauda um descendente direto do lbio dorsal do blastporo, e as clulas que revestem o blastporo formam o canal neurentrico. A parte proximal do canal neurentrico, funde com o nus, enquanto que a poro distal se torna o canal ependimrio (isto , o lmen do tubo neural) (Figura 7.12C; Gont et al., 1993). Na galinha, os tecidos localizados posteriomente ao neurporo recentemente fechado so chamados de broto da cauda. Como o broto da cauda da r, essa estrutura no uma massa no diferenciada de clulas. Enxertando pequenas regies do broto da cauda da codorna no broto da cauda da galinha, Catala e colaboradores (1995) mostraram que o broto de cauda precoce, j tem clulas com um destino determinado. Exatamente como no Xenopus, existe uma articulao cordoneural, e essa regio contm as clulas que dividem-se para formar ambas, a notocorda e a corda medular. Como se d na r, essas clulas se movem posteriomente. O tubo neural se forma medida que a corda medular produz pequenas cavidades, que se fundem umas s outras (Figura 7.13).
Diferenciao do tubo neural

A diferenciao do tubo neural nas vrias regies do sistema nervoso central ocorre simultaneamente de trs maneiras diferentes. Em nvel anatmico macro, o tubo neural e seu lmen se expandem e se contraem para formar as cmaras do crebro e a medula espinhal. A nvel de tecido, a populao celular da parede do tubo neural se rearranja para formar as regies funcionalmente diferentes do crebro e da medula espinhal. Finalmente, no nvel celular, as prprias clulas neuroepiteliais se diferenciam em numerosos tipos de neurnios e clulas de suporte (gliais) presentes no corpo. Formao das regies do crebro O desenvolvimento precoce da maioria dos crebros de vertebrados parecido, mas como o crebro humano provavelmente a matria mais organizada do sistema solar e o rgo mais interessante do reino animal, nos concentraremos no desenvolvimento daquele que supostamente faz o Homo sbio.
266
(A)
Figura 7.13
Formao do tubo neural secundrio no embrio de galinha de 25-somitos. (A) A formao do cordo medular na ponta mais caudal do broto da cauda da galinha. (B) Cordo medular pouco mais anterior no broto da cauda. (C) Formao de cavidades do tubo neural e formao da notocorda. (D) Lumens coalescem para formar o canal central do tubo neural. (de Catala et al., 1995; fotografias, cortesia de N. M. Le Douarin.)
(B)
(C)
Notocorda
O tubo neural precoce de mamferos uma estrutura reta. Entretanto, mesmo antes que a poro posterior do tubo se forme, a poro mais anterior est sofrendo mudanas drsticas. Nessa regio anterior, o tubo neural se expande em trs vesculas primrias (Figura 7.14): crebro anterior (prosencfalo), crebro mdio (mesencfalo) e crebro posterior (rombencfalo). Quando se fecha a ponta posterior do tubo neural, dilataes secundrias -as vesculas pticas- se estendem lateralmente de cada lado do crebro anterior em desenvolvimento. O crebro anterior se subdivide no telencfalo anterior e o diencfalo mais caudal. O telencfalo formar os hemisfrios cerebrais, e o diencfalo formar o tlamo e o hipotlamo e tambm a regio que recebe os impulsos neurais da retina. Na verdade, a prpria retina uma derivao do diencfalo. O mesencfalo no se subdivide e seu lmen se tornar o aqueduto cerebral. O rombencfalo se subdividir em um mielencfalo posterior e um metencfalo mais anterior. O mielencfalo vai dar origem medula oblongata (Bulbo), cujos neurnios do origem aos nervos que regulam os movimentos respiratrios, gastrointestinais e cardiovasculares. O metencfalo d origem ao cerebelo, a parte do crebro responsvel pela coordenao dos movimentos, postura e equilbrio. O crebro posterior (rombencfalo) desenvolve um modelo segmentado que especifica os lugares de onde se originam certos nervos. Alargamentos peridicos chamados rombmeros dividem o
(D)
Figura 7.14
Desenvolvimento precoce do crebro humano. As trs vesculas cerebrais primrias so subdivididas enquanto o desenvolvimento continua. A direita esto os derivados em adultos, formados pelas paredes e cavidades do crebro. (De acordo com Moore e Persaud, 1993.)
Derivados Adultos Lobos olfativos - Cheiro 3 vesculas primrias Parede Cavidade Telencfalo Crebro anterior (Prosencfalo) Crebro mdio (Mesencfalo) Diencfalo Retina Epitlamo Tlamo Hipotlamo Mesencfalo Crebro mdio - Fibras nervosas entre os crebro anterior e posterior, lobos pticos e tectum. Cerebelo Mielencfalo Ponte - Coordenao de movimentos musculares complexos - Fibras nervosas entre o crebro e o cerebelo (somente mamferos) - Centro reflexo de atividades involuntrias - Viso - Glndula pineal - Centro de retransmisso para neurnios pticos e auditivos - Temperatura, sono e regulao respiratria 5 vesculas primrias Hipocampo Crebro - Armazenamento de memria - Associao
Metencfalo Crebro posterior (Rombencfalo)
Medula espinhal
Medula
267
rombencfalo em compartimentos menores. Os rombmeros representam territrios separados de desenvolvimento onde clulas de cada rombmero podem se misturar livremente dentro dele, mas no com clulas de rombmeros adjacentes (Guthrie e Lumsden, 1991). Alm disso, cada rombmero tem um destino de desenvolvimento diferente. Isso foi extensivamente estudado na galinha, onde os primeiros neurnios aparecem nos rombmeros de nmero par, r2, r4 e r6 (Figura 7.15; Lumsden e Keynes, 1989). Neurnios dos gnglios r2 formam o quinto nervo cranial (trigmeo); aqueles do r4 formam o stimo nervo cranial (facial) e o oitavo (vestibuloacstico); o nono nervo cranial (glossofarngeo) nasce do r6. [ecto2.html] A expanso do crebro embrionrio precoce notvel em sua velocidade, extenso e no fato de que isso resulta primariamente em um aumento de tamanho de cavidade e no de crescimento de tecido. Em embries de galinha, o volume do crebro expande 30 vezes entre os dias 3 e 5 do desenvolvimento. Considera-se que essa rpida expanso causada por uma presso fluida positiva, exercida contra as paredes do tubo neural pelo fluido no seu interior. Seria de se esperar que essa presso do fluido fosse dissipada pela medula espinhal, mas isso parece no acontecer. Na verdade, enquanto as pregas neurais vo fechando a regio entre o crebro presuntivo e a medula espinhal, o tecido dorsal circundante empurra para dentro, produzindo uma constrio no tubo, na base do crebro (Figura 7.16; Schoenwolf e Desmond, 1984; Desmond e Schoenwolf, 1986; Desmond e Field, 1992). Essa ocluso (que tambm ocorre no embrio humano) efetivamente separa a regio cerebral presuntiva da futura medula espinhal (Desmond, 1982). Se for removida a presso do fluido na poro anterior de um tubo neural assim ocludo, o crebro da galinha aumenta a uma velocidade muito menor e contm um nmero menor de clulas, quando comparado com embries controles, normais. A regio ocluda do tubo neural abre novamente aps a expanso inicial, rpida, dos ventrculos cerebrais.
Figura 7.15
O crebro posterior (Rombencfalo) de um embrio de galinha de 2 dias, aberto para mostrar as paredes laterais. Neurnios foram visualizados pela marcao com anticorpo para protenas de neurofilamentos. Rombmeros 2, 4 e 6 podem ser identificados pela alta densidade de axnios nesse estgio precoce do desenvolvimento. (de Lumsden e Keynes, 1989, cortesia de A. keynes.)
(A)
(B)
(D)
Figura 7.16
Ocluso do tubo neural para permitir a expanso da futura regio do crebro. (A) Corante injetado na poro anterior do tubo neural de galinha de 3 dias, enche a regio do crebro mas no passa para a regio espinhal. (B,C) Seo do tubo neural da galinha na base do crebro (B) antes da ocluso e (C) durante a ocluso. (D) A reabertura da ocluso, aps aumento inicial do crebro, permite a passagem do corante da regio do crebro para a da medula espinhal. (Cortesia de M. Desmond.)
268
&
Especulaes
Determinando as regies do crebro anterior e crebro mdio
identidade ntero-posterior de cada vescula do crebro de mamferos especificada durante a gastrulao pelo mesoderma precordal e pela notocorda. Essa especificao parece ser estabilizada no estgio de placa neural, por interaes a nvel do ectoderma. Somente as molculas principais envolvidas na especificao dos crebros anterior e mdio sero aqui discutidas; os detalhes da especificao do crebro posterior e da medula espinhal pelo gene Hox sero discutidos no Captulo 16. As regies dos crebros anterior e mdio so definidas pelo mesoderma subjacente e pela notocorda anterior. Os genes Lim1 e Otx2 so expressos por esses tecidos mesodrmicos anteriores. Se um deles no est presente, o embrio no forma o crebro anterior ou o mdio. Na parte caudal, em relao ao rombmero 2, os embries parecem normais (Figura 7.17; Acampora et al., 1995; Shawlot e Behringer, 1995). Rubenstein e Puelles (1994) propuseram que o crebro anterior composto por seis regies neuromricas chamadas prosmeros. Os prosmeros p1-p3 correspondem ao diencfalo e os prosmeros p4-p6 ao hipotlamo (ventralmente) e ao telencfalo (dorsalmente). Os limites prosomricos coincidem com os limites de expresso de vrios genes que so considerados importantes na especificao neural. Eles tambm so considerados como limitantes de respostas a certos estmulos externos. A interface p2/p3
pode ser crtica na modelagem da regio do crebro anterior. Essa interface corresponde a uma zona limitans e tambm a fonte de Sonic hedgehog, uma protena difusvel considerada indutora de modelagem durante a gastrulao e formao de membros (Figura 7.18; Rubenstein e Puelles, 1994). Uma das regies crticas para o desenvolvimento do crebro mdio a borda entre o metencfalo/mesencfalo que normalmente dar origem aos tecidos do istmo. Aqui no se verifica uma fronteira morfolgica, mas ela marcada pela poro mais posterior, onde se expressa o gene Otx2. Quando tecido da juno mesencfalo mdio e anterior transplantado ao diencfalo ou rombencfalo, ele induz as clulas que o rodeiam a desenvolver destinos mesenceflicos (no diencfalo) ou cerebelares (no rombencfalo) (Figura 7.19A; Bally-Cuif e Wassef,
Prosencfalo
Mesencfalo Mes/Met limite
Metencfalo
Rombencfalo
Medula espinhal En (Engrailed) Wnt1 Fgf8 (Fator de crescimento do fibroblasto) shh (Sonic hedgehog)
Figura 7.18
Estrutura neuromrica do crebro com superposio dos hipotticos eventos indutivos. A rea limite mesencfalo/metencfalo positiva para a expresso dos genes Fgf8 e Wnt1. A borda p2/p3 considerada a fonte da protena Sonic hedgehog. (de acordo com Bally-Cuif e Wassef, 1995.)
Figura 7.17
Fentipo sem cabea de camundongo deficiente em Lim1. Dois camundongos com knockout de Lim1 esto na parte de baixo da figura; um filhote do tipo selvagem est na parte de cima. A maioria dos mutantes Lim1 morrem antes do nascimento. As pinas do ouvido (flechas) so as estruturas mais anteriores nesses mutantes. (de Shawlot e Behringer, 1995; cortesia dos autores.)
1994; Marin e Puelles, 1994). Se a juno for girada pode se dar uma triplicao, pois tecidos em ambos os lados do enxerto so induzidos (Figura 7.19B). Essa regio indutora mes/met parece ser controlada pelo fator de crescimento de fibroblasto 8 (FGF8). Crossley e colegas (1996) verificaram que esse tecido formador de istmo secreta FGF8. Mais ainda, quando transplantaram partculas contendo FGF8 para o diencfalo ou o rombencfalo, eles obtiveram duplicadas as mesmas estruturas do crebro mdio. Partculas controle embebidas em salina no mostraram essa duplicao. As partculas
269
com FGF8 tambm induziram a expresso de trs genes nos tecidos circundantes Wnt1, Engrailed-2 e o prprio Fgf8. Esses trs genes so normalmente expressos na regio do istmo. Wnt1 e Engrailed so considerados importantes na formao do cerebelo. Mesmo que o cerebelo no expresse genes Wnt1, camundongos
deficientes em Wnt1 no possuem a regio do crebro mdio e nem o cerebelo (McMahon e Bradley, 1990; Thomas e Cappecchi, 1990). Wnt1 parece manter a expresso do gene Engrailed nas clulas precursoras cerebelares, permitindo a sua proliferao (Dickinson et al., 1994; Danielian e McMahon, 1996). [ecto3.html]
Figura 7.19
(A) Mesencfalo Diencfalo Mes/Met limite Crebro mdio e cerebelo Tectum
A regio da juno mesencfalo/metencfalo (mes/met) pode agir como um indutor do desenvolvimento do crebro mdio e da expresso engrailed quando rodada ou transplantada a outras regies do crebro. (A) O transplante da juno mes/met induz a expresso do gene engrailed e das estruturas do crebro mdio e cerebelo em posies ectpicas. (B) Rotao da juno mes/met causa triplicao de certas estruturas, como o tectum ptico. Abreviaes: gt, griseum tectale; TS, torus semicircularis: P1, segmento pre-tectal; P2, segmento talmico dorsal; cb, cerebelo; ot, tectum ptico; ist, istmo; III, terceiro nervo cranial ou oculomotor; IV, quarto nervo cranial ou troclear. A polaridade postulada representada por flechas. (B de acordo com Rubenstein e Puelles, 1994.)
Regio expressando En Telencfalo En (Engrailed) Wnt1 Fgf8 (Fator de crescimento do fibroblasto) Crebro posterior (B) Diencfalo Mesencfalo ist/cb istmo/ cerebelo Rombencfalo Metencfalo Crebro mdio Rombencfalo Cerebelo
Pea invertida
Induo da estrutura mesenceflica
Duplicao e polarizao relativa ao tecido cerebelar En mais prximo
Mesencfalo Diencfalo Diencfalo
Mesencfalo
Eixo longo Rombencfalo Rombencfalo
270
Tecido Arquitetura de Tecido no Sistema Nervoso Central Os neurnios do crtex cerebral esto organizados em camadas, cada uma tendo diferentes funes e conexes. O tubo neural original composto de um neuroepitlio embrionrio, formado por uma nica camada de clulas. Essa populao de clulas divide-se rapidamente. Sauer (1935) e outros mostraram que essas clulas esto presentes na parede do tubo neural continuamente, da borda luminal at a borda externa, mas como seus ncleos esto em diferentes alturas, tem-se a impresso que a parede do tubo neural composta por diversas camadas de clulas. A sntese de DNA (fase S) ocorre quando o ncleo est na borda externa do tubo, e o ncleo migra luminalmente enquanto a mitose continua (Figura 7.20). A mitose ocorre no lado luminal da camada celular. Durante o desenvolvimento precoce de mamferos, 100% das clulas do tubo neural incorporam timidina radioativa ao DNA (Fujita, 1964). Logo em seguida, certas clulas no mais incorporam esses precursores de DNA, indicando que no esto mais participando da sntese de DNA e da mitose. Essas clulas neurnicas e da glia podem, agora, se diferenciar na periferia do tubo neural (Fujita, 1966; Jacobson, 1968). Se clulas em diviso so marcadas com timidina radioativa em um nico estgio de seu desenvolvimento e seus descendentes so identificados no crtex externo do crebro adulto, isso significa que os neurnios tiveram que migrar para sua posio cortical a partir do neuroepitlio embrionrio. Isso acontece quando a clula se divide verticalmente em lugar de horizontalmente. Nesses casos, a clula adjacente ao lmen fica ligada superfcie ventricular, enquanto a outra clula filha se afasta (Chenn McConnell, 1995). Essa diviso a ultima do neurnio e chamada de aniversrio do neurnio. Diferentes neurnios e clulas gliais tm seus aniversrios em tempos diferentes. Marcao em diferentes pontos do desenvolvimento mostra que clulas com aniversrios mais precoces migram distncias mais curtas. Clulas com aniversrios mais tardios, migram atravs dessas camadas para formar as regies superficiais do crtex. A diferenciao que se segue depende da posio que esses neurnios ocupam uma vez fora da regio de clulas em diviso (Letourneau, 1977; Jacbson, 1991).
Figura 7.20
Seo esquemtica do tubo neural de um embrio de galinha, mostrando a posio do ncleo de uma clula neuroepitelial como funo do ciclo celular. Clulas mitticas so encontradas prximo ao centro do tubo neural, adjacente ao lmen. (B) Micrografia eletrnica de varredura de um tubo neural de galinha, recm-formado, mostrando clulas em diferentes estgios do ciclo celular. (A de acordo com Sauer, 1935; B, cortesia de K. Tosney.)
(A) Estgio do ciclo celular
(B)
Lmen do tubo neural
271
Placa cortical (CP) Zona intermediria (I) Medula espinhal Camada ependimria (E) Zona ventricular germinal (V) Camada granular externa (EG)
Lmina dissecans (L) Zona marginal (M) Camada granular (GL) Zona subventricular (S) Camada das clulas de Purkinje (P)
Camada molecular de axnios das clulas granulares
Cerebelo
Tubo neural Camada molecular
Neocrtex Crtex cerebral Massa branca
Enquanto as clulas adjacentes ao lmen continuam a se dividirem, as clulas migratrias formam uma segunda camada ao redor do tubo neural original. Essa camada se torna progressivamente mais espessa medida que mais clulas do neuroepitlio embrionrio so adicionadas. Essa nova camada chamada zona do manto (ou intermediria) e o epitlio embrionrio agora chamado de zona ventricular (e, mais tarde, epndima) (Figura 7.21). As clulas da zona do manto se diferenciam em neurnios e clulas gliais. Os neurnios fazem conexes entre si e emitem axnios se afastando do lmen, criando portanto uma zona marginal pobre em clulas. Clulas gliais cobrem muitos desses axnios da zona marginal com bainhas de mielina, dando-lhes uma aparncia esbranquiada. Assim, a zona do manto, contendo os corpos celulares, freqentemente referida como massa cinzenta, e a camada marginal, axonal, como massa branca. O esquema bsico de trs camadas: a ependimria, a do manto e a marginal mantido durante todo o desenvolvimento, tanto na medula espinhal como no bulbo. A massa cinzenta (manto) gradualmente adquire uma estrutura com forma de borboleta rodeada pela massa branca; ambas so envolvidas por tecido conjuntivo. medida que o tubo neural amadurece, um sulco longitudinal -sulcus limitans- aparece para dividi-lo em duas partes, dorsal e ventral. A poro dorsal recebe estmulos dos
Figura 7.21
Diferenciao das paredes do tubo neural. Seo de um tubo neural humano de 5 semanas, contendo 3 zonas: ependimria, manto e marginal. Na medula espinhal e no bulbo (linha superior), o epndima a nica fonte de neurnios e clulas gliais. No cerebelo (linha do meio) uma segunda camada mittica, a camada granular externa, se forma na regio mais remota do epndima. Neuroblastos dessa camada migram de volta para a zona intermediria para formar as clulas do grnulo. No crtex cerebral (linha inferior), os neuroblastos ou glioblastos em migrao formam uma placa cortical contendo seis camadas. (De acordo com Jacobson, 1991.)
272
(A)
(B)
(C)
(D) Epiderme
Regio presuntiva basal
Regio presuntiva alar
Sulcus limitans
(E)
Gnglio da raiz dorsal Nervo espinhal Neurnio sensorial Neurnio somtico motor
Figura 7.22
Neurnio de associao Raiz dorsal
Desenvolvimento da medula espinhal humana. (A-D) O tubo neural funcionalmente dividido nas regies dorsal (alar, A) e ventral (basal, B), separadas pelo sulcus limitans. Enquanto os condroblastos da regio esclertoma do somito formam as vrtebras espinhais, o tubo neural se diferencia nas zonas ependimria, do manto e marginal, e o teto e o assoalho se tornam distintos. (E) Um segmento da medula espinhal com suas razes sensoriais (alar) e motoras (basal). (De acordo com Larsen, 1993.)
Camada marginal
Camada do manto
Camada ependimria (ventricular)
neurnios sensoriais, enquanto a poro ventral est envolvida na realizao de vrias funes motoras (Figura 7.22). Organizao do cerebelo No encfalo, a migrao celular, o crescimento diferencial e a morte celular seletiva produzem modificaes no modelo de trs camadas, especialmente no cerebelo e no crebro. Alguns neurnios penetram a massa branca para diferenciarem-se em aglomerados de neurnios chamados ncleos. Cada ncleo desempenha o papel de uma unidade funcional, servindo como uma estao de retransmisso entre as camadas externas do cerebelo e outras partes do encfalo. Alm disso, as clulas neurnicas precursoras, em diviso, neuroblastos, migram para a superfcie externa do cerebelo em desenvolvimento, formando uma nova zona embrionria, camada embrionria externa, prxima ao limite externo do tubo neural. No limite externo da camada embrionria externa (na espessura de uma ou duas clulas), os neuroblastos proliferam. Na parte interna da camada esto os neuroblastos ps-mitticos que so os precursores dos neurnios mais importantes do crtex do cerebelo, as clulas granulares. Essas clulas neuronais pr-granulares migram de volta para a massa branca do cerebelo em desenvolvimento para produzir clulas neurnicas granulares em uma regio chamada camada granular interna. Enquanto isso, a camada ependimria original do cerebelo origina uma grande variedade de neurnios e clulas gliais, incluindo os notveis e grandes neurnios de Purkinje. Cada um deles tem um enorme aparelho dendrtico, que se espalha como um leque sobre o corpo celular em forma de bulbo. Uma clula de Purkinje tpica pode formar at 100.000 sinapses com outros neurnios, mais do que qualquer outro neurnio estudado. Cada neurnio de Purkinje tambm emite um axnio delgado que se comunica com outras clulas nos ncleos cerebelares profundos. O desenvolvimento de uma organizao espacial crtico para o funcionamento correto do cerebelo. Todos os impulsos regularo a atividade da clulas de Purkinje, que so os nicos neurnios que liberam impulsos para fora do crtex cerebelar. Para
273
que isso acontea, as clulas adequadas devem se diferenciar no tempo e local adequados. Como isso acontece? Um mecanismo considerado importante para posicionar neurnios jovens dentro de encfalo de mamferos em desenvolvimento o direcionamento glial (Rakic, 1972; Hatten, 1990). Atravs do crtex, os neurnios parecem caminhar no monotrilho da glia para seu respectivo destino. No cerebelo, os precursores das clulas granulares caminham nos longos prolongamentos da glia de Bergmann (Figura 7.23; Rakic e Sidman, 1973; Rakic, 1975). A interao neuroglial consiste em uma complexa e fascinante srie de eventos, envolvendo reconhecimento recproco entre a glia e o neuroblasto (Hatten, 1990; Komuro e Rakic, 1992). O neurnio mantm sua adeso clula da glia atravs de vrias protenas, a mais importante sendo uma protena de adeso chamada astrotactina. Se a astrotactina na clula nervosa mascarada pelo seu respectivo anticorpo, a clula nervosa no adere ao prolongamento da glia (Edmondson et al., 1988; Fishell e Hatten, 1991). A anlise de mutaes neurolgicas no camundongo poder, em breve, fornecer conhecimentos novos sobre os mecanismos de ordenao espacial. Mais de 30 mutaes conhecidas afetam o arranjo de neurnios cerebelares. Muitos dos mutantes cerebelares foram encontrados porque o fentipo de tais mutantes - principalmente a inabilidade de manter o equilbrio ao andar - pode ser facilmente reconhecido. Por razes bvias essas mutaes so identificadas na lngua inglesa com nomes como weaver, reeler, staggerer e waltzer. [ecto4.html], [ecto5.html]
Figura 7.23
Migrao neurnica em prolongamentos gliais. (A) Diagrama com um neurnio cortical migrando em um prolongamento da clula glial. (B) Micrografia eletrnica da regio onde a soma do neurnio adere ao prolongamento glial. (C) Fotografias seqenciais de um neurnio migrando em um prolongamento de glia cerebelar. A extremidade anterior do neurnio apresenta vrias extenses filopdicas. Ela atinge velocidades de 60 m/hora em sua migrao nos prolongamentos gliais. (A de acordo com Rakic, 1975; B de Gregory et al., 1988; C de Hatten, 1990, cortesia de M. Hatten.)
(B)
(A)
Processo condutor do neurnio
(C)
Neurnio em migrao
Processo da clula glial
274
Organizao cerebral A disposio em trs zonas tambm modificada no crebro, que organizado de duas maneiras distintas. Primeiro, de maneira anloga ao cerebelo, a organizao vertical feita em camadas que interagem entre si (veja Figura 7.21). Certos neuroblastos da zona do manto migram na glia atravs da massa branca para dar origem a uma segunda zona de neurnios. Essa nova zona de manto chamada crtex do neopleo. Esse crtex se estratifica em seis camadas de corpos celulares e a forma adulta desses neurnios do neopleo s se completa na metade da infncia. Cada camada do crtex cerebral diferente da outra em relao s suas propriedades funcionais, os seus tipos de neurnios e os conjuntos de conexes que produzem. Por exemplo, neurnios da camada 4 recebem seu principal estmulo do tlamo (a regio que se forma do diencfalo), enquanto os neurnios na camada 6 enviam sua maior produo de volta para o tlamo. Segundo, horizontalmente o crtex cerebral est organizado em mais de 40 regies que regulam, anatomica e funcionalmente, processos distintos. Por exemplo, neurnios da camada cortical 6 do crtex visual projetam axnios para o ncleo lateral geniculado do tlamo, enquanto neurnios da camada 6 do crtex auditivo (localizado mais anteriormente que o crtex visual) projetam axnios ao ncleo mdio geniculado do tlamo. Nem a organizao vertical e nem a horizontal so especificamente clonadas. Na verdade, existe um grande nmero de movimentos celulares que misturam a descendncia de vrias clulas precursoras. Aps sua mitose final, a maioria dos neurnios recm- gerados migram radialmente, ao longo dos prolongamentos da glia, para fora da zona ventricular (ependimria) e formam a placa cortical abaixo da pia-mater do crebro. Assim como no crtex cerebelar, os neurnios com os aniversrios mais cedo formam a camada mais prxima do ventrculo. Os neurnios subseqentes caminham distncias maiores para formar as camadas mais superficiais do crtex. Isso forma um gradiente de desenvolvimento ao avesso (ou invertido) (Figura 7.24; Rakic, 1974). Uma nica clula germinativa pode produzir neurnios (e clulas gliais)
Figura 7.24
Gradiente invertido na formao do crtex cerebral no macaco rhesus. Os aniversrios dos neurnios corticais foram determinados injetando [3H]-timidina endovenosamente nos animais em determinados tempos de gestao. Aps o nascimento dos animais, verificou-se que as clulas mais fortemente marcadas eram aquelas que estavam na fase S do seu ltimo ciclo de diviso. Essas clulas migraram para vrias regies e foram detectadas por autoradiografia de cortes microscpicos. A figura representa a posio desses neurnios indicados no crtex visual. O tempo de gestao no macaco rhesus de 165 dias. Os neurnios mais jovens esto na periferia do tubo neural (De acordo com Rakic, 1974.)
Injees de [3H] - timidina Camadas corticais
Massa branca Camada ventricular
Dias de gestao
Nascimento
275
(A)
[3H]-timidina no dia embrionrio 29
(C)
(D)
Migrao neural do hospedeiro Migrao neural do hospedeiro

Camadas corticais
Porcentagem de neurnios marcados com [3H]-timidina
Camada intermediria
Massa branca Camadas corticais [3H]-timidina no dia ps-natal 1
Camada ventricular
Clula glial Destino condicionado ao hospedeiro quando transplantado na fase S.
Destino independente da clula quando transplantada aps ltima fase S.
Figura 7.25
Massa branca Camadas corticais
Determinao de identidade laminar em crebro de doninha. (A) Precursores neuronais precoces (aniversrios no dia embrionrio 29) migram para a camada 6. (B) Precursores neuronais tardios (aniversrios no dia ps-natal 1) migram mais adiante para as camadas 2 e 3. (C) Quando os precursores precoces (vermelho) so transplantados em zonas ventriculares mais velhas, aps sua ltima fase S mittica, os neurnios que eles formam migram para a camada 6. (D) Se esses precursores so transplantados antes ou durante sua ltima fase S, seus neurnios migram (com os neurnios do hospedeiro) para a camada 2. (De acordo com McConnell e Kaznowski,1991.)
em qualquer das camadas corticais (Walsh e Cepko, 1988). Mas, como que a clula reconhece a camada na qual deve entrar? McConnell e Kaznowski (1991) mostraram que a determinao da identidade laminar (isto , para qual camada a clula migrar) feita durante a diviso celular final. Clulas transplantadas de crebros jovens (onde elas formariam a camada 6) para crebros mais velhos, cujos neurnios migratrios esto formando a camada 2 aps sua ltima diviso, mantm seu destino e migram somente para a camada 6. Entretanto, se as clulas so transplantadas antes de sua diviso final (na metade da fase S), elas no tm destino fixo e podem migrar para a camada 2 (Figura 7.25). Os destinos de clulas progenitoras mais velhas so mais determinados. As clulas cerebrais corticais progenitoras precoces tm o potencial para transformarem-se em qualquer neurnio (nas camada 2 ou 6, por exemplo), mas as clulas corticais progenitoras tardias do origem somente a neurnios da camada superior (camada 2) (Frantz e McConnell, 1996). Ainda no conhecemos a natureza da informao transmitida clula ao ser fixado o seu destino. Nem todos os neurnios migram radialmente. ORourke e seus colegas (1992) marcaram neurnios jovens com corante fluorescente e seguiram sua migrao atravs do crebro. Enquanto mais ou menos 80% dos jovens neurnios migraram radialmente em processos gliais, da zona ventricular para a placa cortical, aproximadamente 12% deles migraram lateralmente de uma regio funcional do crtex para outra. Essas observaes esto de acordo com aquelas de Walsh e Cepko (1992), que infectaram clulas ventriculares com um retrovrus e conseguiram corar essas clulas e seus descendentes aps o nascimento. Eles descobriram que os descendentes neurais de
276
uma nica clula ventricular estavam dispersos atravs das regies funcionais do crtex. Quando neurnios do crtex do crebro anterior foram transplantados para a regio que formaria o corpo estriado, essas clulas adquiriram a morfologia do estriado (Fishell, 1995). Portanto, a especificao de funes determinadas pelas reas corticais ocorre aps a neurognese. Considera-se que chegando a seu destino final, as clulas produzem molculas adesivas especficas que as organizam e as agrupam como ncleos cerebrais (Matsunami e Takeichi, 1995). O crebro bastante plstico e o desenvolvimento do crtex neopleo humano particularmente notvel a esse respeito. O crebro humano continua a se desenvolver na velocidade do desenvolvimento fetal, mesmo aps o nascimento (Holt et al., 1975). Baseado em critrios morfolgicos e de comportamento, Portmann (1941, 1945) sugeriu que, comparada com outros primatas, a gestao humana deveria durar 21 meses em lugar de 9. Entretanto, nenhuma mulher poderia dar luz um feto de 21 meses, pois sua cabea no passaria pelo canal do parto; assim a espcie humana d luz aps 9 meses. Montagu (1962) e Gould (1977) sugeriram que durante o primeiro ano de vida, somos essencialmente fetos extra-uterinos, e eles especulam que a inteligncia humana vem da estimulao do sistema nervoso que est se formando durante aquele primeiro ano.*
Tipos de neurnios
O crebro humano consiste de mais de 1011 clulas nervosas (neurnios) associadas com mais de 1012 clulas gliais. Aquelas clulas que permanecem como componentes integrais do revestimento do tubo neural se transformam em clulas ependimrias. Essas clulas podem dar origem a precursores de neurnios e clulas gliais. Considera-se que a diferenciao dessas clulas precursoras principalmente determinada pelo ambiente no qual elas entram (Rakic e Goldman, 1982) e que, em pelo menos alguns casos, uma determinada clula precursora pode formar ambos, neurnios e clulas gliais (Turner e Cepko, 1987). Existe uma grande variedade de tipos de neurnios e clulas gliais (como fica evidente pela comparao entre uma clula granular relativamente pequena e o enorme neurnio de Purkinje). As delgadas extenses das clulas, usadas para captar impulsos eltricos so chamadas dendritos (Figura 7.26). Alguns neurnios desenvolvem somente alguns dendritos, enquanto outras clulas (como os neurnios de Purkinje) desenvolvem extensas reas para interaes celulares. Muito poucos dendritos so encontrados em neurnios corticais no nascimento, mas uma das coisas maravilhosas, a respeito do primeiro ano de vida do ser humano, o aumento do nmero dessas regies receptivas nos neurnios corticais. Durante esse ano, cada neurnio cortical desenvolve um nmero suficiente de dendritos (ou superfcie dendrtica) para acomodar at 100.000 conexes com outros neurnios. O neurnio cortical, em mdia, se conecta com 10.000 outros neurnios. Esse padro de conexes neurais (sinapses) permite ao crtex humano funcionar como o centro para o aprendizado, raciocnio e memria, e a desenvolver a capacidade de expresso simblica, bem como a produo de respostas a estmulos interpretados. Outra caracterstica importante de um neurnio em desenvolvimento seu axnio (s vezes chamado um neurito). Enquanto os dendritos so freqentemente numerosos e no se extendem muito alm do corpo da clula nervosa, ou soma, os axnios podem se alongar por vrios centmetros. Os receptores da dor no dedo grande (hlux) do p, por exemplo, precisam transmitir suas mensagens por um longo caminho at a
* Ao contrrio do que afirma um filme antiaborto, amplamente divulgado, o crtex cerebral humano no tem conexes neurnicas na 12a semana de gestao (e, portanto, no pode se mover em resposta a um pensamento, nem mostrar conscincia ou medo). A atividade eltrica mensurvel, caracterstica de clulas neurais (o padro do eletroencefalograma, ou EEG) verificada inicialmente aos 7 meses de gestao. Morowitz e Trefil (1992) sugeriram provocativamente que tendo a sociedade, nos Estados Unidos, aceito que a definio de morte a perda do padro de EEG, talvez ela devesse aceitar a aquisio do padro de EEG como o comeo da vida humana.
277
Dendritos
Figura 7.26
RECEPTOR
Diagrama de um neurnio motor. Impulsos recebidos pelos dendritos e o neurnio estimulado podem transmitir impulsos eltricos atravs do axnio (que podem ter 60 a 90 cm de comprimento) para o tecido alvo. A bainha de mielina que promove o isolamento do axnio formada pelas clulas de Schwann adjacentes. (De acordo com Bloom e Fawcett, 1975.)
Cone do axnio Segmento inicial do axnio
Chegada de impulsos via axnios de outros neurnios
CONDUTOR
N de Ranvier Impulso nervoso Clula de Schwann Bainha de mielina
EFETOR
Msculo esqueltico
medula espinhal. Um dos conceitos fundamentais da neurobiologia que o axnio uma extenso contnua do corpo da clula nervosa. Na virada do sculo vinte, vrias teorias competiam para explicar a formao de axnios. Schwann, um dos fundadores da teoria celular, acreditava que numerosas clulas neurais se ligavam umas s outras, em forma de cadeia, para formar um axnio. Hensen, o descobridor do ndulo embrionrio, admitia que o axnio se formava ao redor de fibras citoplasmticas pr-existentes entre as clulas. Wilhelm His (1886) e Santiago Ramn y Cajal (1890) postularam que o axnio era, na verdade, uma projeo (apesar de extremamente grande) do corpo celular (soma). Em 1907, Ross Harrison demonstrou a validade da teoria da projeo com um elegante experimento que foi a pedra fundamental tanto da cincia do desenvolvimento neurobiolgico como da tcnica de cultura de tecidos. Harrison isolou uma poro de um tubo neural de um girino de r de 3mm; nesse estgio, logo aps o fechamento do tubo neural, no h uma diferenciao visvel dos axnios. Ele colocou esses neuroblastos em uma gota de linfa de r sobre uma lamnula e a inverteu sobre outra lmina com depresso, de modo a poder observar o que se passava nessa gota pendente. O que Harrison viu foi a emergncia de axnios como projees dos neuroblastos, alongando a 56 m/hora. Esse prolongamento do nervo liderado pela ponta do axnio, chamada de cone de crescimento (Figura 7.27). Esse cone no progride em linha reta, mas vai abrindo caminho ao longo do substrato. O cone de crescimento se move por elongao e contrao de filopdios afilados, chamados microespculas. Essas microespculas contm microfilamentos, orientados paralelamente ao eixo longo do axnio (essa uma situao similar quela dos microfilamentos filopdicos das clulas mesenquimatosas secundrias em equinodermos). Tratando os neurnios com citocalasina B, as microespculas de actina so destrudas, inibindo seu avano ulterior (Yamada et al., 1971; Forscher e Smith, 1988). Dentro do prprio axnio, o suporte estrutural
278
Microespculas
(A)
Cone de crescimento
(B)
(C)
Figura 7.27
Microespculas de actina em cones de crescimento de axnios como vistos por (A) microscopia eletrnica de transmisso, (B) microscopia de contraste da interface diferencial e (C) microscopia de fluorescncia com anticorpos fluorescentes actina. (A de Letourneau,1979; B e C de Forscher e Smith, 1988. Todas fotografias, cortesia dos autores.)
fornecido por microtbulos, e o axnio se retrair se for colocado em uma soluo de colchicina. Assim, o neurnio em desenvolvimento retm as mesmas cartactersticas que foram observadas nas regies de articulao dorsolateral do tubo neural, a saber, alongamento por microtbulos e modificaes da forma apical pelos microfilamentos. Como na maioria das clulas migratrias, os filopdios exploratrios do axnio aderem ao substrato e exercem uma fora que puxa o resto da clula para frente. Os axnios no crescero se o cone de crescimento no conseguir avanar (Lamoureux et al., 1989). Alm da funo estrutural na migrao de axnios, os filopdios tm tambm uma funo sensorial. Explorando o ambiente frente do cone de crescimento, cada filopdio faz a amostragem dos microambientes e manda sinais de volta para o corpo da clula (Davenport et al., 1993). Como veremos no Captulo 8, os filopdios so as organelas fundamentais envolvidas na determinao do caminho do neurnio. Neurnios transmitem impulsos eltricos de uma regio a outra. Usualmente esses impulsos vo dos dendritos soma do nervo, de onde so focalizados nos axnios. Para impedir a disperso do sinal eltrico e facilitar a sua conduo, o axnio, no sistema nervoso central isolado em intervalos por processos que se originam de um tipo de clula glial chamada oligodendrcito. Um oligodendrcito se enrola ao redor do axnio em desenvolvimento; produz, ento, uma membrana especializada que rica em protena bsica mielina e se espirala ao redor do axnio central (Figura 7.28). Essa membrana especializada chamada bainha de mielina. (No sistema nervoso perifrico, uma clula glia chamada clula de Schwann realiza essa mielinizao.) A bainha de mielina essencial para uma adequada funo neural, e a desmielinizao das fibras nervosas est associada convulses, paralisia e vrios outros problemas de sade, debilitantes ou mortais. No mutante trembler do camundongo, as clulas de Schwann no conseguem produzir um determinado componente protico da bainha de mielina, fazendo com que a mielinizao do sistema nervoso perifrico seja deficiente, mas normal no sistema nervoso central. Ao contrrio, em outro mutante de camundongo, jimpy, o sistema nervoso central deficiente em mielina, enquanto o perifrico no afetado (Sidman et al., 1964; Henry e Sidman, 1988). O axnio tambm precisa ser especializado na secreo de neurotransmissores especficos nos pequenos espaos (fendas sinpticas) que separam o axnio da superfcie da clula alvo (soma, dendritos, ou o axnio de um neurnio receptor ou um
279
Figura 7.28
Clula oligodendroglial
Axnio
MIELINIZAO NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
Mielinao nos sistemas nervosos central e perifrico. (A) No sistema nervoso perifrico, as clulas de Schwann se enrolam ao redor do axnio; no sistema nervoso central, a mielinao realizada por prolongamentos de oligodendrcitos. (B) O mecanismo desse enrolamento leva produo de um enorme complexo de membrana. (C) Micrografia de um axnio envolvido pela membrana de mielina de uma clula de Schwann. (Fotografia cortesia de C. S. Raine.)
N de Ranvier
Axnio
MIELINIZAO NO SISTEMA NERVOSO PERIFRICO Clula de Schwann
(A)
(B)
Clula de Schwann
Axnio
(C)
stio receptor em um rgo perifrico). Alguns neurnios so capazes de sintetizar e secretar acetilcolina, enquanto outros desenvolvem vias enzimticas para sintetizar e secretar epinefrina, norepinefrina, octopamina, serotonina, cido aminobutrico, dopamina, ou algum outro neurotransmissor. Cada neurnio precisa ativar aqueles genes responsveis pela produo de enzimas capazes de sintetizar seus neurotransmissores. Portanto, o desenvolvimento neurnico envolve diferenciao tanto estrutural como molecular.
Desenvolvimento do olho em vertebrados

O indivduo conhece seu ambiente pelos seus rgos sensoriais. Os principais rgos do sentido da cabea se desenvolvem a partir das interaes do tubo neural com uma srie de espessamentos epidrmicos chamados de placdios ectodrmicos cranianos. Os placdios mais anteriores so os dois placdios olfativos que formam os gnglios dos nervos olfativos, responsveis pelo sentido do olfato. Os placdios auditivos, da mesma maneira, se invaginam para formar o labirinto do ouvido interno, cujos neurnios formam o gnglio acstico que nos permite ouvir. Nessa parte, focalizaremos o olho porque esse rgo, mais que qualquer outro do corpo, precisa se desenvolver com uma coordenao exata. Dinmica do desenvolvimento tico A histria do desenvolvimento tico comea na gastrulao, quando o endoderma involutivo e o mesoderma interagem com o adjacente, prospectivo ectoderma da cabea. Essa interao induz o ectoderma da cabea formao de lentes (cristalino) (Saha et al., 1989). *Mas, nem todas as partes do ectoderma da cabea formam os cristalinos, e o cristalino deve ter uma relao precisa com a retina. A ativao dessa habilidade
* As indues que permitem a formao do olho sero detalhadas no Captulo 17.
280
Ectoderma da cabea Vescula ptica primria
Parede do crebro anterior
Camada pigmentada Camada neural Cristalino Vescula do cristalino
Vescula ptica
Placdio do cristalino
(A) Embrio de 4-mm
(B) Embrio de 4.5-mm
(C) Embrio de 5-mm
(D) Embrio de 7-mm
Figura 7.29
Desenvolvimento do olho de vertebrado. (A) A vescula ptica evagina do crebro e contata o ectoderma sobreposto. (B,C) O ectoderma sobreposto diferencia-se em clulas do cristalino enquanto as vesculas pticas se dobram sobre si mesmas e os placdios do cristalino se tornam vesculas do cristalino. (C) A vescula ptica se torna a retina neural e pigmentada, enquanto o cristalino internalizado. (D) A vescula do cristalino induz o ectoderma sobreposto a se tornar crnea. (Ilustraes superiores de acordo com Mann, 1964; micrografias A-C de Hilfer e Yang, 1980, cortesia de S. R. Hilfer; D, cortesia de K. Tosney.)
latente na formao do cristalino e o posicionamento do cristalino em relao retina realizado pela vescula ptica. No homem, as vesculas pticas tm incio como duas protuberncias nas paredes laterais do diencfalo em embries de 22 dias (Figura 7.29). Essas protuberncias continuam a crescer lateralmente ao tubo neural e esto ligadas ao diencfalo por pednculos pticos. Subseqentemente, quando essas vesculas atingem o ectoderma da cabea, essa se espessa formando o placdio do cristalino. A necessidade de um contato ntimo entre as vesculas pticas e o ectoderma superficial comprovada experimentalmente e em certos mutantes. Por exemplo, no mutante de camundongo, eyeless, as vesculas pticas no fazem contato com a superfcie e a formao do olho cessa (Webster et al., 1984). Uma vez formado, o placdio do cristalino causa, de maneira recproca, modificaes na vescula ptica que sofre uma invaginao formando um clice ptico de parede dupla (veja Figura 7.29C). medida que a invaginao continua, a conexo entre o clice ptico e o crebro reduzida, tornando-se alongada e estreita. Ao mesmo tempo, as duas camadas do clice ptico comeam a se diferenciar em direes diferentes. As clulas da camada externa produzem pigmentos e finalmente se transformam na retina pigmentada (um dos poucos tecidos, alm das clulas da crista neural, que podem sintetizar sua prpria melanina). As clulas da camada interna proliferam rapidamente e do origem a uma variedade de glia, neurnios ganglionrios, interneurnios e neurnios fotorreceptores sensveis luz. Coletivamente, essas constituem a retina neural. Os axnios das clulas ganglionares da retina neural se encontram na base do olho e se dirigem para baixo, pelo pednculo ptico. O pednculo ento chamado nervo ptico. Diferenciao da retina neural Como os crtices cerebral e cerebelar, a retina neural se desenvolve em uma sucesso de camadas com diferentes tipos de neurnios (Figura 7.30). Essas camadas incluem as clulas fotorreceptoras sensveis luz e cor (bastonetes e cones), os corpos celulares das clulas ganglionrias e os interneurnios bipolares que transmitem o
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Bastonetes e cones dos fotorreceptores
Camada neuroblstica externa
Corpos celulares dos fotorreceptores Camada plexiforme externa Camada dos nervos bipolares
Camada neuroblstica interna
Camada plexiforme interna

Camada de clulas ganglionares
(A)
Clulas ganglionares (B)
Fibras do nervo ptico (C) (D) Luz
estmulo eltrico dos bastonetes e cones s clulas ganglionrias. Alm disso, existem numerosas clulas gliais de Mller que mantm a integridade da retina, bem como neurnios amcrinos (sem grandes axnios) e neurnios horizontais que transmitem impulsos eltricos no plano da retina. Nos estgios iniciais do desenvolvimento da retina, a diviso celular de uma camada embrionria e a migrao e morte diferencial das clulas resultantes formam o padro laminar, estriado, da retina neural. A formao desse tecido altamente estruturado um dos problemas mais intensamente estudado em neurobiologia do desenvolvimento. Mostrou-se que (Turner e Cepko, 1987) uma nica clula precursora do neuroblasto retinal pode dar origem a pelo menos trs tipos de neurnios ou dois tipos de neurnios e uma clula glia. Essa anlise foi feita usando uma tcnica engenhosa para marcar as clulas geradas por uma clula precursora especfica. Ratos recm-nascidos (cujas retinas ainda esto se desenvolvendo) foram injetados, no fundo do olho, com um vrus que se integra ao seu DNA. Esse vrus continha um gene da -galactosidase (no presente na retina do rato) que seria expresso somente nas clulas infectadas. Um ms aps a infeco dos ratos, as retinas foram removidas e coradas para detectar a presena de -galactosidase. Somente os descendentes das clulas infectadas deveriam ser coradas de azul. A Figura 7.31 mostra uma fita de clulas derivadas de uma clula precursora infectada. A colorao pode ser vista em cinco bastonetes, um neurnio bipolar e uma clula glia (Mller).
(A)
Figura 7.30
Desenvolvimento da retina humana. Neurnios da retina se distribuem em camadas funcionais durante o desenvolvimento. (A,B) Separao inicial de neuroblastos dentro da retina. (C) As trs camadas de neurnios na retina adulta e as camadas sinpticas entre elas. (D) Uma apresentao funcional dos principais caminhos dos neurnios na retina. A luz atravessa as camadas at ser recebida pelos fotorreceptores. Os axnios dos fotorreceptores fazem sinapse com neurnios bipolares que transmitem a despolarizao para os neurnios ganglionares. Os axnios das clulas ganglionares se renem para formar o nervo ptico que entra no crebro. (A e B segundo Mann, 1964; fotografia cortesia de G. Grunwald.)
(B)
Figura 7.31
Cristalino
4-6 semanas
Remova a retina, fixe e core e analise os clones
Retina Epitlio pigmentado
Determinao da linhagem de uma clula precursora na retina do rato. (A) Tcnica pela qual um vrus contendo um gene de galactosidase funcional injetado na parte dorsal do olho para infectar algumas das clulas precursoras da retina. Aps um ms ou 6 semanas, o olho removido e a retina corada para -galactosidase. (B) Clulas coradas formando uma banda atravs da retina neural, incluindo 5 bastonetes (r), um neurnio bipolar (bp), um neurnio terminal (t) e clulas gliais de Mller (mg). As identidades dessas clulas foram confirmadas por microscopia de contraste Nomarski. (Barra de escala, 20 m). (de Turner e Cepko, 1987, fotografia cortesia de D. Turner.)
282
Muitas clulas do crebro anterior expressam um fator de transcrico chamado Pax6. Essa protena parece ser especialmente importante para o desenvolvimento da retina. Na verdade, pode ser um denominador comum para clulas fotorreceptoras em todos os filos. O gene Pax6 tem provavelmente muitos papis, e um deles determinar tecidos a se tornarem olhos. Se o gene Pax6 do camundongo inserido no genoma da Drosophila e ativado casualmente, olhos se formam nas clulas onde o Pax6 do camundongo est sendo expresso (Halder et al., 1995)! Apesar do gene ser tambm expresso no crebro anterior e posterior e em placdios nasais murinos, os olhos parecem ser os mais sensveis sua falta. No homem e no camundongo, heterozigotos Pax6 tm olhos pequenos, enquanto homozigotos nas mesmas espcies (e na Drosophila) no tm olhos (Jordan et al., 1992; Glaser et al., 1994; Quiring et al., 1994). Esse gene ser mais discutido no Captulo 23.
&
Especulaes
Porque os bebs no enxergam bem

ecm-nascidos humanos no tm boa viso. Devem existir vrias razes para isso, mas a que mais chama a ateno a imaturidade dos fotorreceptores da retina. Estudos anatmicos realizados por Yuodelis e Hendrickson (1986) e estudos fsicos por Banks e Bennett (1988) mostraram que os cones fotorreceptores da retina central do recmnascido tm mais de 7.5m de dimetro, que diminui at o valor adulto normal de 2m em cerca de 3 anos. Durante esse tempo, a densidade em cones nessa regio aumenta de 18 fotorreceptores para 42 por 100 m, e os fotorreceptores desenvolvem tanto seus segmentos externos (que captam a luz) quanto os seus axonais
Figura 7.32
basais. A Figura 7.32 destaca as diferenas entre os fotorreceptores em retinas neonatal e adulta. A retina neonatal tem receptores fracamente diferenciados, e aqueles que existem so to largos que poucos cabem em uma dada rea. Banks e Bennett calcularam que isso causa um decrscimo de absoro de luz na regio central da retina do recm-nascido que 350 vezes pior do que a absoro de uma mesma rea no adulto. Esse pequeno n-
mero de fotorreceptores por rea da retina tambm impede bebs de discriminar dois pontos distncia. Essa pode ser a razo pela qual os bebs apenas respondem a estmulos visuais quando esses so trazidos prximo s suas faces. O desenvolvimento dos fotorreceptores da retina no homem um excelente exemplo de diferenciao que comea cedo no desenvolvimento, mas que no se completa at anos aps o nascimento.
Desenvolvimento de cones fotorreceptores na regio central da retina humana. Sees de microscopia de luz foram fotografadas e um cone em cada retina delineado para clareza. O epitlio pigmentado (PE), a camada plexiforme externa (OPL), a glia de Mller (M), e os segmentos externos do fotorreceptor (OS) foram marcados. (A) Feto de gestao de 22 semanas. (B) Neonato 5 dias aps o nascimento. (C) Pessoa de 72 anos. A flecha aponta para a membrana limitante externa, que originalmente serviu como borda para os axnios da retina. O axnio delineado em (C) na realidade mais curto que o normal, permitindo que a sinapse com o neurnio bipolar possa ser mostrada na figura. A sinapse formada no pedculo sinptico do cone (CP). (de Yuodelis e Hendrickson, 1986, cortesia de A. Hendrickson.)
(A) (B)
(C)
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Diferenciao do cristalino e da crnea Durante o seu desenvolvimento progressivo em cristalino, o placdio do cristalino se arredonda e contata o novo ectoderma que o recobre (veja Figura 7.29D). O ectoderma ento induzido pela vescula do cristalino a formar a crnea transparente. Aqui, parmetros fsicos tm um papel importante no desenvolvimento do olho. Presso de fluido intraocular necessria para uma correta curvatura da crnea, de modo que a luz possa ser focalizada na retina. A importncia dessa presso ocular pode ser demonstrada experimentalmente; a crnea no desenvolver sua curvatura caracterstica quando um pequeno tubo de vidro for inserido atravs da parede do olho da galinha em desenvolvimento, para drenar os fluidos intraoculares (Coulombre, 1956, 1965). A presso intraocular sustentada por um anel de ossos esclerais (provavelmente derivados da crista neural), que funciona como uma restrio sem elasticidade. A diferenciao do tecido do cristalino em uma membrana transparente capaz de dirigir a luz na retina envolve modificaes na estrutura e forma celulares, assim como a sntese de protenas especficas do cristalino chamadas cristalinas (Figura 7.33). As cristalinas so sintetizadas enquanto a clula muda de forma, assim, fazendo com que a vescula do cristalino se torne o cristalino definitivo. As clulas da poro interna da vescula do cristalino se alongam, e sob a influncia da retina neural, produzem as fibras do cristalino (Piatigorski, 1981). Enquanto as fibras continuam a crescer, elas sintetizam cristalinas, as quais acabam enchendo a clula, causando a extruso do ncleo. As fibras sintetizadoras de cristalinas continuando a crescer e preenchem o espao entre as duas camadas da vescula do cristalino. As clulas anteriores da vescula do cristalino constituem um epitlio embrionrio que continua a se dividir. Essas clulas em diviso se movem em direo ao equador da vescula, e ao passar pela regio equatorial elas tambm comeam a se alongar (Figura 7.33D). Assim, o cristalino contm trs regies: uma zona anterior com clulas epiteliais em diviso, uma zona equatorial de elongao celular e uma zona posterior e central de clulas fibrosas contendo cristalinas. Esse arranjo persiste ao longo da vida do animal, pois as fibras so continuamente depositadas. Na galinha adulta, a diferenciao de uma clula epitelial em uma fibra do cristalino leva 2 anos (Papaconstantinou, 1967).
Figura 7.33
Cavidade oca da vescula do cristalino
Epitlio do cristalino (A) (B) Fibras primrias se alongando
Diferenciao das clulas do cristalino. (A) Vescula do cristalino conforme mostrada na Figura 7.29. (B) Alongamento das clulas interiores, produzindo fibras do cristalino. (C) Cristalino cheio de clulas sintetizando o cristalino. (D) Novas clulas do cristalino derivadas do epitlio anterior do cristalino. (E) medida que o cristalino cresce, novas fibras se diferenciam e os ncleos degeneram. (Segundo Paton e Craig, 1974.)
Cpsula anterior do cristalino
Epitlio anterior do cristalino
Regio equatorial Fibras primrias do cristalino Fibras secundrias do cristalino (D) Fibras secundrias do cristalino Cpsula posterior do cristalino (E) Fibras primrias do cristalino
(C)
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Diretamente frente do cristalino, est um tecido muscular pigmentado chamado ris. Esses msculos controlam o tamanho da pupila (e d ao indivduo a cor caracterstica de seus olhos). Parte da ris derivada da camada ectodrmica, o que diferente de outros msculos do corpo (que so derivados do mesoderma). Especificamente, essa regio da ris se desenvolve de uma poro do clice ptico que contnua com a retina neural, mas no produz fotorreceptores.
A CRISTA NEURAL A crista neural e seus derivados

Embora derivada do ectoderma, a crista neural algumas vezes considerada a quarta camada germinativa devido sua importncia. Tem sido dito, talvez hiperbolicamente, que a nica coisa interessante a respeito dos vertebrados a crista neural (citado em Thorogood, 1989). As clulas da crista neural se originam na regio mais dorsal do tubo neural. Experimentos com transplantes, onde uma placa neural de codorna enxertada no ectoderma no-neural de galinha, mostram que justapondo esses tecidos se induz a formao de clulas da crista neural e que ambas, as prospectivas placa neural e a epiderme, contribuem para a crista neural (Selleck e Bronner-Fraser, 1995; Mancilla e Mayor, 1996). As clulas da crista migram extensivamente dando origem a um incrvel nmero de tipos de clulas diferenciadas. Esses incluem (1) os neurnios e clulas gliais dos sistemas nervosos sensorial, simptico e parassimptico, (2) as clulas produtoras de epinefrina (medula) da glndula supra-renal, (3) as clulas pigmentares da epiderme, e (4) muitos dos componentes dos tecidos esquelticos e conjuntivos da cabea. O destino das clulas da crista neural depende, na sua maioria, do lugar para onde elas migram e onde se instalam. A crista neural pode ser dividida em quatro principais (mas parcialmente sobrepostos) domnios: A crista neural ceflica (cabea), cujas clulas migram dorsolateralmente para produzir o mesnquima craniofacial que se diferencia em cartilagem, osso, neurnios cranianos, glia e tecidos conjuntivos da face. Essas clulas tambm entram nas bolsas farngeas para originar as clulas do timo, odontoblastos dos primrdios dos dentes e a cartilagem do ouvido interno e o queixo. A crista neural do tronco, cujas clulas tomam um de dois caminhos principais. Clulas da crista neural, que se tornam os melancitos sintetizadores de pigmentos, migram dorsolateralmente para o ectoderma, e continuam em seu caminho em direo linha mdia ventral do abdmen. Entretanto, a maioria da clulas da crista neural do tronco passa ventrolateralmente atravs da metade anterior de cada esclertomo. (Esclertomos so blocos de clulas mesodrmicas que cercam o tubo neural e diferenciam-se na cartilagem vertebral da espinha.) Essas clulas da crista neural do tronco que permanecem nos esclertomos formam os gnglios dorsais da raiz. As clulas que continuam mais ventralmente formam os gnglios simpticos, a medula da supra-renal e o agrupamento de nervos circundando a aorta. A crista neural cervical e sacral, cujas clulas do origem aos gnglios parassimpticos (entricos) do intestino (Le Douarin e Teillet, 1973; Pomeranz et al., 1991). A crista cervical tem posio oposta aos somitos 1-7 da galinha, enquanto que a crista neural sacral posterior ao somito 28. A ausncia de migrao da clula da crista neural para o clon resulta na falta de gnglios entricos e, portanto, a ausncia de movimento peristltico nessa regio. Isso resulta na obstruo funcional, dilatao e aumento da regio acima do clon (megaclon).
285
Tabela 7.1 Derivado
Alguns derivados da crista neural Tipo de clula ou estrutura derivados Neurnios, incluindo gnglios sensoriais gnglios simpticos e parassimpticos, e plexos Clulas neurogliais Clulas de Schwann Medula supra-renal Clulas secretoras de calcitonina Clulas do tipo I do corpo carotdeo Clulas epidrmicas pigmentadas Cartilagem facial e ventral anterior do crnio e ossos
Sistema nervoso perifrico (PNS)
Derivados endcrinos e paraendcrinos
Clulas pigmentadas Cartilagem facial e ossos
Tecido conjuntivo
Endotlio e estroma corneano Papilas dentais Derme, msculo liso e tecido adiposo da pele da cabea e do pescoo Tecido conjuntivo das glndulas salivares, lacrimais, do timo, tireide e pituitria Tecido conjuntivo e msculo liso nas artrias originadas do arco artico
Fonte: Segundo Jacobson, 1991, baseado em mltiplas fontes.
A crista neural cardaca pode estar localizada entre as cristas ceflica e do tronco. Existem evidncias de que essas clulas da crista neural esto situadas desde o primeiro at o terceiro somito de embries de galinha, sobrepondo-se poro vagal anterior da crista neural que se estende do primeiro ao stimo somito (Kirby, 1987; Kirby e Waldo, 1990). Essas clulas da crista neural podem se desenvolver em melancitos, neurnios, cartilagem e tecido conjuntivo (do terceiro, quarto e sexto arcos farngeos). Alm disso, essa regio da crista neural produz a parede total do tecido muscular conjuntivo das grandes artrias ao se originarem do corao, como tambm contribui para o septo que separa a circulao pulmonar da aorta (Le Livre e Le Douarin, 1975). A Tabela 7.1 sumariza alguns tipos de clulas derivadas da crista neural.
A crista neural do tronco

Vias de migrao das clulas da crista neural do tronco Como mostra a Figura 7.2, a crista neural do tronco uma estrutura transitria, pois suas clulas se dispersam logo aps o fechamento do tubo neural. Existem duas vias principais seguidas pelas clulas migratrias da crista neural (Figura 7.34).
A VIA DORSOLATERAL. Uma via possvel para migrao das clulas da crista neural do tronco a via dorsolateral, pela qual os precursores dos melancitos se movem pela periferia do embrio atravs do mesoderma subjacente derme. Elas penetram no ectoderma atravs de minsculos orifcios na membrana basal (as quais elas podem produzir) e colonizam a pele e os folculos, onde elas se diferenciam em melancitos
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Epiderme Tubo neural Dermomitomo Esclertomo Notocorda Aorta Ant. Rostral Clulas da Via 1 viajam ventralmente atravs do mitomo anterior Post. Somito Clulas da Via 2 tomam um rota dorsolateral entre a epiderme e o dermomitomo Caudal
Figura 7.34
Migrao das clulas da crista neural no tronco do embrio do pinto. Via 1: As clulas viajam ventralmente atravs do esclertomo anterior (aquela poro do somito que gera a cartilagem vertebral). Aquelas clulas inicialmente opostas s pores posteriores dos esclertomos migram ao longo do tubo neural at alcanar uma regio anterior. Essas clulas contribuem para os gnglios simpticos e parassimpticos assim como para as clulas da medula supra-renal e os gnglios da raiz dorsal. Via 2: Algum tempo depois, clulas penetram na rota dorsolateral abaixo do ectoderma. Essas clulas se tornam melancitos produtores de pigmento.
(Mayer, 1973; Erickson et al., 1992). Essa via foi demonstrada em uma srie de experimentos clssicos por Mary Rawles e outros (1948), que transplantaram o tubo neural e a crista de uma linhagem pigmentada de galinha para o tubo neural de um embrio de galinha albina. O resultado foi uma galinha branca com penas coloridas em uma regio especfica (Figura 7.35A). A crista neural responsvel pela produo de todas as clulas contendo melanina no organismo (com exceo de certos derivados neurais como a retina pigmentada).
A VIA VENTRAL. Enxertando uma parte do tubo neural e a crista associada de embri-
es de galinha, radioativos ou geneticamente marcados, em outros embries, foi possvel identificar outra rota principal de migrao das clulas da crista neural do tronco (Weston, 1963; Le Douarin e Teillet, 1974), investigadores foram capazes de traar uma outra rota maior de migrao das clulas da crista neural (Figura 7.35B,C). Estudos mais recentes estenderam essas pesquisas usando anticorpos fluorescentes, corantes vitais, ou clulas transformadas por vrus para marcar e seguir clulas individuais da crista neural at seu destino. As clulas saindo pela via ventral se tornam neurnios sensoriais (raiz dorsal) e simpticos, clulas adrenomedulares e clulas de Schwann. Como pode ser visto na Figura 7.36 e Prancha 19, essas clulas da crista neural do tronco migram ventralmente atravs da poro anterior, mas no da poro posterior dos esclertomos (Rickmann et al., 1985; Bronner-Fraser, 1986; Loring e Erickson, 1987; Teillet et al. 1987). Teillet e colaboradores associaram o procedimento com anticorpos a um transplante de clulas da crista neural de codornas geneticamente marcadas, a embries de galinha. O anticorpo marcador reconhece e marca as clulas da crista neural de ambas espcies; o marcador gentico permite aos pesquisadores
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(A)
(B)
Hospedeiro Doador marcado radioativamente
Figura 7.35
(C)
Migrao das clulas da crista neural. (A) Pinto resultante do transplante de uma regio da crista neural do tronco de uma linhagem pigmentada de galinhas para uma regio da crista neural do tronco de uma linhagem no-pigmentada. As clulas da crista que deram origem ao pigmento foram capazes de migrar para a pele da asa. (B) Tcnica de enxerto para o mapeamento de clulas da crista neural. Um pedao de eixo dorsal excisado de um embrio doador; o tubo neural e a crista associada so isolados e implantados no embrio hospedeiro, cujo tubo neural e crista haviam sido excisados. Quando as clulas da crista do doador so marcadas radioativamente (com timidina tritiada) ou marcadas geneticamente (de uma espcie ou variedade diferentes), seus descendentes podem ser detectados no embrio hospedeiro durante o processo do desenvolvimento. (C) Auto-radiografia mostrando localizaes de clulas da crista neural que migraram da crista neural radioativa doadora para formar melanoblastos (M), gnglios simpticos (SG), gnglios da raiz dorsal (DRG) e clulas gliais (G). (A, fotografia original dos arquivos de B. Willier; B segundo Weston, 1963; C cortesia de J. Weston.)
distinguir entre clulas de codorna e galinha. Esses estudos mostram que clulas da crista neural, antes opostas regio posterior dos somitos, migram anteriormente ou posteriormente ao longo do tubo neural penetrando, assim, na regio anterior de seus somitos ou de outros adjacentes. Essas clulas da crista neural se juntam com outras que inicialmente estavam opostas poro anterior dos somitos, e formam a mesma estrutura. Dessa maneira, cada gnglio da raiz dorsal composto de trs populaes de crista neural: uma da crista neural oposta poro anterior do somito e uma de cada lado das regies de crista neural adjacentes, opostas s pores posteriores dos somitos. Em regies especficas do tronco, clulas da crista migrando pela mesma via, se agregam para formar gnglios simpticos e as clulas secretoras de epinefrina da medula da supra-renal. A diviso parassimptica do sistema nervoso perifrico tambm formada pelas clulas da crista neural migrando por essa via, mas somente nas regies sacral e cervical do embrio. A matriz extracelular e a migrao da crista neural do tronco Em qualquer anlise de migrao (seja de pssaros, borboletas ou clulas da crista neural) deve-se fazer trs perguntas: Como se inicia a migrao? Como os agentes migratrios conhecem a via a ser percorrida? Quais sinais indicam que o destino foi alcanado e que a migrao deve terminar? Mais ainda, deve -se perguntar se o agente competente para responder a esses sinais. Clulas da crista neural, pr-migratrias, expressam a protena Slug, um fator de transcrio. Oligonucleotdeos antisense contra o mRNA do slug impediro a migrao da crista neural, sugerindo que a protena
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Esclertomo do somito
Tubo neural
Anterior
Posterior
Anterior
Posterior
Anterior
Posterior
Figura 7.36
Migrao de clulas da crista neural. Fotomicrografias de fluorescncia de sees longitudinais de um embrio de pinto de dois dias, marcadas com anticorpo HNK-1, que reconhece seletivamente as clulas da crista neural. Extensa marcao vista na metade anterior, porm, no na posterior do esclertomo. (de Bronner-Fraser, 1986, cortesia de M. Bronner-Fraser.)
Slug deve ser necessria para que a clula epitelial imvel se torne um migrante (Nieto et al., 1994). Outro fator em potencial na iniciao da migrao da clula da crista neural a molcula de adeso N-caderina. Originalmente na superfcie da clula da crista neural, ela regulada para decrescer na poca da migrao celular. Clulas da crista em migrao no tm N-caderina em sua superfcie, mas comeam a express-la novamente enquanto se agregam para formar a raiz dorsal e os gnglios simpticos (Takeichi, 1988; Akitaya e Bronner-Fraser, 1992). Ao mesmo tempo que as clulas da crista neural perdem sua N-caderina e se tornam aptas a migrar como clulas individuais, a superfcie extracelular que as rodeia se torna mais adesiva (Perris et al., 1990). Parece haver vias especficas que devem ser seguidas pelas clulas da crista neural e quando as clulas, ou seus derivados, so colocadas (por transplante ou por injeo) em sua via normal de migrao em um embrio hospedeiro, elas migram ao longo dessa (BronnerFraser e Cohen, 1980; Erickson et al., 1980). O caminho das clulas da crista neural controlado pela matriz extracelular do embrio (Newgreen e Gooday, 1985; Newgreen et al., 1986). Pesquisas sobre o desenvolvimento de salamandra indicaram que a direo de migrao das clulas da crista neural determinada pela matriz extracelular sobre a qual elas migram. Em salamandras axolotle existe uma mutao onde h formao da crista neural mas suas clulas no migram pela via dorsolateral. Isso pode ser visto facilmente pela falta de clulas pigmentadas em todos os lugares, com exceo do topo do tubo neural desses animais (Figura 7.37), e essas clulas finalmente degeneram. Quando cristas neurais do tipo selvagem so transplantadas para embries mutantes, as clulas da crista so incapazes de migrar. Entretanto, quando cristas de embries mutantes so transplantadas em embries selvagens, suas clulas migram normalmente (Spieth e keller, 1984). Assim, o defeito nesse mutante est no ambiente em que as clulas encontram e no nas prprias clulas. (A estrada deficiente mas no o veculo.) Lfberg e colaboradores (1989) usaram essa informao para mostrar que a matriz extracelular contm compostos que so crticos na regulao da migrao das clulas da crista neural. Eles adsorveram, em microtransportadores da membrana, a matriz extracelular da regio subepidrmica da pele (atravs da qual migrariam as clulas da crista neural formadoras de pigmentos). Os microtransportadores foram ento colocados junto s cristas neurais de embries mutantes e do tipo selvagem, pouco antes do momento quando ocorreria a migrao. Os microtransportadores sozinhos no estimularam a migrao em nenhum dos dois embries. Os microtransportadores contendo matriz extracelular de mutantes tambm no estimularam migrao primativa de clulas da crista neural em nenhum dos embries. Entretanto, aqueles transportadores contendo a matriz extracelular do tipo selvagem estimularam a migrao de clulas da crista neural tanto no embrio mutante como no selvagem, demonstrando assim a importncia da matriz extracelular na migrao de clulas da crista neural. Uma situao semelhante se d em embries de galinha, pois o transplante de diferentes regies do mesoderma para a rea adjacente crista neural pode produzir diferentes modelos de migrao (Goldstein et al., 1990; Bronner-Fraser e Stern, 1991). As regies que permitem migrao de clulas da crista neural so determinadas no mesoderma antes que ocorra a migrao. Mas quais so as molculas que permitem ou impedem a migrao de clulas da crista neural? A matriz extracelular que suporta essa migrao uma mistura rica em molculas como fibronectina, laminina, tenascina, vrias molculas de colgeno e proteoglicanos. Experimentos programados para estudar esse aspecto devem ser cuidadosamente planejados, pois as clulas da crista neural podem ter necessidades de migrao diferentes em diferentes espcies e mesmo em diferentes partes do mesmo embrio. Uma soluo preparar anticorpos contra molculas das regies da matriz extracelular s quais as clulas se ligam. Quando esses anticorpos so injetados no embrio, bloqueando as regies da matriz, verifica-se alguma perturbao na migrao das clulas da crista neural? A migrao das clulas da crista neural craniana de galinha pode ser severamente alterada quando so injetados, no embrio em desen-
289
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 7.37
Deficincia na migrao das clulas da crista neural no mutante d/d do axolotle. (A) As larvas de axolotles do tipo selvagem so caracterizadas por clulas pigmentadas por todo o corpo exceto nas pores mais ventrais. (B) No mutante d/d, as clulas pigmentadas derivadas da crista neural formam uma estria ao longo da linha mediana dorsal da larva. (C,D) Micrografias eletrnicas de varredura da crista neural embrionria mostram que (C) as clulas da crista dos embries de tipo selvagem migram sobre o tubo neural para o interior dos somitos, enquanto (D) aquelas do mutante permanecem sobre o tubo neural. (de Lfberg et al., 1989, cortesia dos autores.)
volvimento, anticorpos fibronectina, a receptores de fibronectina, tenascina, ou ao proteoglicano laminina-heparan sulfato (Poole e Thiery, 1986; Perris e Bronner-Fraser, 1989). Entretanto, esses anticorpos no alteram significativamente a migrao de clulas da crista neural do tronco na galinha. No momento, existem dois candidatos principais para o papel de molculas modeladoras das clulas da crista neural do tronco. Uma delas o receptor de aglutinina do amendoim, um composto que liga resduos especficos de carboidratos de glicoprotenas. Quando troncos de embrio de galinha so tratados com aglutinina de amendoim, as clulas da crista neural migram na mesma velocidade, tanto para a metade caudal como para a ventral dos somitos (Krull et al., 1995). A outra molcula uma tirosina quinase receptora relacionada Eph. Essas molculas so capazes de guiar os axnios (veja Captulo 8) e sua expresso est ligada aos rombmeros do crebro posterior que excluem as clulas da crista neural (Irving et al., 1996; Weinstein et al., 1996). Em 1963, Weston sugeriu que no eram necessrias molculas especficas para sinalizar a via de migrao das clulas da crista neural do tronco; na verdade, essas clulas seriam capazes de usar qualquer espao livre para sua migrao, desde que essa no fosse ativamente inibida. Ele girou a crista neural, de modo a coloc-la na parte de baixo do tubo neural e notou que quando as clulas emergiam da regio ventral do tubo, elas migravam na direo ventro-dorsal (o inverso da migrao normal) atravs da metade anterior do esclertomo. Assim, parece no haver um direcionamento inerente migrao de clulas da crista. As clulas vo para onde h lugar para elas. Tanto barreiras qumicas como fsicas podem criar os modelos de migrao das clulas da crista neural.
290
&
Especulaes
Anlise das mutaes que afetam o desenvolvimento das clulas da crista neural
S PROPRIEDADES MIGRATRIAS e a diferenciao das clulas da crista neural tambm esto sendo estudadas levando em considerao mutaes que prejudicam uma ou mais linhagens de clulas da crista neural. As mutaes incluem as seguintes:
White-spotting. As clulas da crista neural desses camundongos no tm ckit tirosina quinase receptor funcional. A condico homozigtica geralmente letal mas os heterozigotos sobrevivem e podem ser reconhecidos pelas manchas sem pigmentos em seu plo. No homem, os heterozigotos tm um fentipo com manchas brancas e escuras. onde regies do cabelo e da pele so brancas, por no terem melancitos (Spritz et al., 1992). Steel. Esses camundongos no tm o fator da clula germinativa, o ligante para a protena quinase c-kit. Esse fator secretado por tecidos ao longo da rota de migrao e usado pelas clulas migratrias da crista neural, alm de estimular a diviso celular. A condio do homozigoto letal na maioria dos casos, e o heterozigoto tem uma pelagem de cor cinza esmaecida (veja White, 1990). Splotch. Os camundongos no tm o fator de transcrio Pax3. Como j mencionado, essa protena expressa na regio dorsal do tubo neural. Camundongos homozigotos para esse gene tm defeitos no fechamento do tubo neural e nas estruturas derivadas das clulas da crista neural, especialmente gnglios cranianos e nervos (Figura 7.38). O heterozigoto tem regies de pigmentao e outras sem pigmento. No homem, a condio heterozigtica conhecida como sndrome de Waardenburg (tipo I) (Tremblay et al., 1995).
Lethal-spotting e Piebald-lethal. Nessas mutaes, a deficincia de endotelina-3 e seu receptor, o receptor de endotelina-B. Endotelina-3 um fator de crescimento que estimula a proliferao de clulas como as da crista neural, e critico para o desenvolvimento de melancitos e neurnios entricos que causam o peristaltismo no trato digestivo. A ausncia homozigtica de genes para o receptor de endotelina-B produz o megaclon, a distenso do intestino grosso devido a impossibilidade de evacuar. No
homem, essa condio chamada doena de Hirschsprung. A ausncia de endotelina-3 d origem ao padro de manchas dos melancitos e, tambm, a falta de gnglios no intestino (Baynish et al., 1994; Hosoda et al., 1994; Puffenberger et al., 1994; Lahav et al., 1996). Ret e GDNF. Como o receptor de endotelina-B, o receptor tirosina quinase Ret necessrio para a diferenciao dos neurnios entricos. Os camundongos que no apresentam o receptor no tm neurnios entricos nem rins (a importncia de Ret para o desenvolvimento do rim ser discutida no Captulo 17). No homem, a perda de um dos genes ret pode produzir outra forma de doena de Hirschsprung- um megaclon ganglinico (Edery, 1994; Romeo et al., 1994). O ligante para a protena Ret parece ser o fator de crescimento derivado da glia, GDNF (Pichel et al., 1996). Camundongos sem as protenas GDNF tambm no tm rins nem neurnios entricos. Microphthalmia. Esses camundongos no tm um fator de transcrio determinado, levando surdez e deficincias melanocticas. A condio heterozigtica humana induz a sndrome de Waardenburg (tipo II) (Hemesath et al., 1994; Steingrimsson et al., 1994; Tassbehji et al., 1994). Silky. Essa mutao na galinha envolve a via da pigmentao. Em adio a um fentipo onde o adulto retm as penas macias de sua juventude, os rgos internos so pigmentados pela migrao e proliferao de melancitos. Em contraste, as penas permanecem brancas. Estudos com transplantes (Hallet e Ferrand, 1984) mostraram que esse defeito no devido aos precursores dos melancitos, mas sim devido ao ambiente para onde migram as clulas da crista neural. [ecto6.html]
Figura 7.38
Superfcie ventral de um camundongo heterozigtico para a mutao White. O camundongo tem nmeros reduzidos de clulas sangneas, clulas germinativas e melancitos. A mancha branca no ventre caracterstica de heterozigotos, pois esses no tm melancitos suficientes para circundar o camundongo. Animais White viveis no tm pigmento no tronco.
291
A potncia de desenvolvimento das clulas da crista neural do tronco

EVIDNCIA INDICANDO PLURIPOTNCIA DAS CLULAS DA CRISTA NEURAL DO TRONCO. Uma das caractersticas mais notveis das clulas da crista neural
sua pluripotencialidade. Uma nica clula da crista neural pode se diferenciar em vrios tipos diferentes de clulas, dependendo de sua localizao no embrio. Por exemplo, os neurnios parassimpticos, formados pelas clulas da crista neural cervical (pescoo) (opostas aos somitos 1-7) produzem tanto a acetilcolina como seu neurotransmissor; so portanto neurnios colinrgicos. Os neurnios simpticos formados pelas clulas da crista neural torcica produzem norepinefrina; esses so os neurnios adrenrgicos. Mas, quando cristas neurais cervicais e torcicas da galinha so reciprocamente transplantadas, a crista torcica original produz os neurnios colinrgicos dos gnglios parassimpticos, e a crista cervical original forma neurnios adrenrgicos nos gnglios simpticos (Le Douarin et al., 1975). Kahn e colaboradores (1980) mostraram que clulas da crista neural do tronco, pr-migratrias, tanto da regio cervical como da torcica, tm enzimas para sintetizar tanto acetilcolina como norepinefrina. Dessa maneira, clulas da crista torcica so capazes de desenvolverem-se em neurnios colinrgicos quando so colocadas no pescoo, e as clulas da crista cervical podem se tornar neurnios adrenrgicos se colocadas no tronco. A pluripotncia de algumas clulas da crista neural de tal ordem, que regies da crista que nunca produzem nervos em embries normais podem faz-lo em certas condies. Clulas da crista neural mesenceflica normalmente migram para o olho e interagem com a retina pigmentada, se diferenciando nas clulas da esclertica (Noden, 1978). Entretanto, se essa regio da crista neural transplantada para a regio do tronco, pode formar neurnios dos gnglios sensoriais, clulas adrenomedulares, gliais e clulas de Schwann (Schweizer et al., 1983). As pesquisas citadas estudaram o potencial de populaes de clulas. Ainda no est claro se a maioria das clulas que deixam a crista neural so pluripotentes ou se a maioria j teve seu destino restrito a certas funes. Bronner- Fraser e Fraser (1988, 1989) mostraram que algumas, se no a maioria das clulas individuais da crista neural, so pluripotentes ao deixar a crista. Eles injetaram molculas de dextrano fluorescente em clulas individuais da crista neural, enquanto as clulas ainda estavam acima do tubo neural e verificaram em que tipos de clulas elas se diferenciaram, aps a migrao. A prognie de uma nica clula da crista neural podia se transformar em neurnios sensoriais, clulas pigmentares, clulas adrenomedulares e gliais (Figura 7.39). Alm disso, verificaram que marcando clulas individuais da crista do tronco enquanto migravam ventralmente pelo embrio, a marcao podia ser encontrada mais tarde em vrios tipos de clulas, incluindo neurnios sensoriais, neurnios simpticos e clulas de Schawnn. Em mamferos, a clula da crista neural tambm vista como uma clula germinativa que pode dar origem a outras clulas multipotentes da crista neural. Entretanto, se algumas das clulas migratrias da crista neural so pluripotentes outras tm destinos mais restritos (Stemple e Anderson, 1992).
EVIDNCIAS INDICANDO POTNCIA RESTRITA DE CLULAS DA CRISTA NEURAL DO TRONCO. At na poca de emigrao, algumas clulas da crista neural
podem estar mais determinadas do que outras. Tambm, a potncia se torna mais restrita medida que a clula envelhece. Clulas da crista neural do tronco na galinha que migram mais cedo podem formar uma ampla variedade de derivados, incluindo clulas pigmentares, neurnios e clulas adrenrgicas. Clulas migrando mais tarde, na sua maioria, se tornam melancitos (Serbedzija et al., 1989; Artinger e Bronnerfraser, 1992). Realmente, as emigrantes tardias da crista neural parecem j estar destinadas a se tornarem melancitos antes de entrarem na via dorsolateral (Erickson e Goins, 1995). Existe evidncia de que alguma restrio de potncia pode ser identificada mesmo em algumas clulas emigrantes precoces. Vrios pesquisadores (veja SieberBlum e Sieber, 1984; Stocker et al., 1991; Weston, 1991) verificaram que um nmero
292
Figura 7.39
Pluripotncia das clulas da crista neural do tronco. Uma nica clula da crista neural injetada com uma molcula de dextrano altamente fluorescente. A descendncia dessa clula ir, cada uma, receber algumas dessas molculas fluorescentes. (A) Injeo de dextrano fluorescente pouco antes da migrao das clulas da crista neural ser iniciada. (B) Aps dois dias, tecidos derivados da crista contm clulas marcadas, descendentes do precursor que foi injetado. A figura resume dados de dois experimentos diferentes (caso 1 e caso 2). (Segundo Lumsden, 1988).
Injeo Caso 1
Injeo Caso 2 Dextrano fluorescente Melancitos Gnglios da raiz dorsal Clulas de Schwann da raiz ventral Gnglios simpticos
Resultados Caso 1
Resultados Caso 2
Crista neural
Aorta Medula supra-renal (A) (B)
significante de clulas da crista neural formam clones contendo relativamente poucos tipos de clulas. Alm disso, estudos com transplantes por Le Douarin e Smith (1988) sugerem que muitas clulas derivadas da crista neural que formam os neurnios sensoriais dos gnglios da raiz dorsal, so incapazes de formar os neurnios autonmicos dos gnglios sensoriais, e vice-versa. Esses estudos sugerem que algumas das clulas da crista neural j tm uma potencialidade restrita ao iniciar a migrao. Dois tipos de clulas da crista neural que teriam papis pr-determinados seriam o precursor do melancito-clula de Schwann (Nichols e Weston, 1977; Ciment, 1990), e um precursor simpatoadrenal que pode originar somente gnglios simpticos e clulas adrenomedulares (Landis e Patterson, 1981; Anderson e Axel, 1986). O mecanismo para o sucesso diferencial dessas clulas pr-determinadas pode envolver diferentes fatores de crescimento. Os precursores determinados dos neurnios ganglionares da raiz dorsal parecem necessitar de um fator neurotrfico derivado do crebro (BDNF), um fator de crescimento produzido pelo prprio tubo neural. Se uma membrana fina impermevel for colocada entre o tubo neural e a futura regio do gnglio da raiz dorsal, os gnglios no se formaro. Aquelas clulas da crista neural que continuaram sua migrao ventral para as regies dos gnglios do simptico, conseguiram sobreviver. A inibio na produo de gnglios da raiz dorsal pode ser revertida revestindo a barreira com um extrato de tubo neural ou com BDNF (Kalcheim et al., 1987; Sieber-Blum, 1991). Essa concluso fortalecida pela observao de que o gene BDNF enfraquecido em embries de camundongo provoca o desaparecimento dos gnglios da raiz dorsal e dos neurnios sensoriais dos placdios, mas no afeta os neurnios motores (Ernfors et al., 1994; Jones et al., 1994). As clulas da crista neural determinadas a formar gnglios simpticos no necessitam do fator de crescimento para sobreviver. Na verdade, sua diferenciao parece ser estimulada pelo fator de crescimento bsico dos fibroblastos e o fator neurotrfico derivado da glia (Kalcheim e Neufeld, 1990; Maxwell et al., 1996). Diferenciao final das clulas da crista neural A diferenciao final das clulas autonmicas da crista neural principalmente determinada pelo ambiente no qual as clulas se desenvolvem. A diferenciao no envolve a morte seletiva daquelas clulas j determinadas a secretar outro tipo de neurotransmissor (Coulombe e Bronner-Fraser, 1987). As clulas do corao, por exemplo, secretam uma protena, fator de inibio da leucemia (LIF), que pode converter neurnios adrenrgicos do simptico em neurnios colinrgicos, sem mudar sua sobrevivncia ou crescimento (Chun e Patterson, 1977; Fukada, 1980; Yamamori et al., 1989).
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Figura 7.40
NGF
GF bF
Clula NGF competente
Incapacidade de responder a glicocorticides
Neurnio simptico
Clula pluripotente da crista neural
Gl ico co rtic Clula id precursora es bipotente Inibio da diferenciao neural
Diferenciao final de uma clula da crista neural destinada a ser uma clula adrenomedular (cromafim) ou um neurnio simptico. Glicocorticides parecem agir em dois lugares. Primeiro, inibindo as aes daqueles fatores que promovem a diferenciao neural; segundo, induzindo as enzimas caractersticas das clulas adrenais. As clulas expostas seqencialmente ao fator de crescimento fibroblstico bsico (bFGF) e ao fator de crescimento nervoso (NGF) se diferenciam em neurnios simpticos.
Glicocorticides Promoo de enzimas cromafim especificas
Clula precursora cromafim
Clula cromafim (adrenomedular)
Analogamente, a protena morfogentica do osso 2 (BMP2), uma protena secretada pelo corao, pulmo e aorta dorsal, influencia clulas da crista neural do rato a diferenciarem-se em neurnios colinrgicos. Esses neurnios formam os gnglios simpticos na regio desses rgos (Shah et al., 1996). Enquanto BMP2 pode induzir essas clulas da crista neural a se tornarem neurnios, o fator de crescimento da glia (GGF; neuregulina) suprime a diferenciao neurnica e dirige o desenvolvimento para destinos gliais (Shah et al., 1994). possvel que outro fator parcrino, endotelina-3, estimule a produo de melancitos (Lahav et al., 1996). Assim, parece que o destino de uma clula determinada da crista neural pode ser dirigido pelo ambiente tissular no qual ela se estabelece. As clulas da crista neural do tronco da galinha que migram para a regio destinada a se tornar a medula da suprarenal podem se diferenciar em duas direes. A presena da protena morfogentica do osso 7 (BMP7) pode induzir essas clulas a se tornarem produtoras de epinefrina (Varley et al., 1995). Essas clulas usualmente se diferenciam em neurnios noradrenrgicos do simptico. Entretanto, se essas clulas da crista neural recebem glicocorticides, como aqueles produzidos pelas clulas corticais da glndula suprarenal, elas se diferenciam em clulas adrenomedulares (Figura 7.40; Anderson e Axel, 1986; Vogel e Weston, 1990). O tipo de matriz importante na diferenciao das clulas da crista neural da salamandra. Se clulas da crista de axolotle so cultivadas em matrizes de regies subepidrmicas (onde esto as clulas pigmentares), elas se tornam melancitos. Entretanto, se as mesmas clulas da crista so cultivadas em matrizes da regio dos gnglios da raiz dorsal, elas desenvolvem um fentipo neuronal (Perris et al., 1988).
A crista neural ceflica

Vias migratrias das clulas da crista neural ceflica O rosto principalmente o produto da crista neural ceflica (cranial), e a evoluo dos maxilares, dentes, cartilagem facial resulta de mudanas na colocao dessas clulas (veja Captulo 23). Como j mencionado, o crebro posterior segmentado ao longo do eixo ntero-posterior em rombmeros. As clulas da crista neural ceflica da galinha migram de acordo com sua origem rombomrica e existem trs vias principais usadas por essas clulas migratrias (Figura 7.41; Lumsden e Guthrie, 1991). Na
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(A)
Pregas neurais
Clulas migratrias da crista neural
(B)
Ro m mb ero s
Tubo neural Gnglios IX, X
Bolsa farngea III Clulas migratrias da crista neural Gnglios VII e VIII Primeiro arco farngeo (C) Bolsa farngea Cartilagem facial e Tubo neural Martelo Cartilagem de Meckel Bigorna Estribo Processo estilide Tronco arterial Bulbus cordis Aorta descendente Artria vitelnica Artria umbilical (D) Clulas migratrias da crista neural Bolsa farngea II
Osso hiide Cartilagem tireide Cartilagem cricide Anis traqueais
Figura 7.41
Migrao de clulas da crista neural na cabea de mamferos. (A) Micrografia de varredura eletrnica de um embrio de rato com parte de seu ectoderma lateral removido da superfcie. A migrao da crista neural pode ser vista sobre o mesencfalo, e a migrao da coluna de clulas da crista neural migrando para o futuro arco farngeo evidente. (B) A anlise da migrao de clulas cranianas da crista neural de rombmeros 4-6 no camundongo sugere que h uma migrao maior para os arcos farngeos e uma migrao menor para formao de gnglios dos nervos cranianos. (C) Estruturas formadoras na face humana pelas clulas ectomesenquimatosas da crista neural. Os elementos cartilaginosos das bolsas farngeas esto indicados por cores, e a regio pontilhada indica o esqueleto facial produzido pelas regies anteriores da crista ceflica. (D) Formao do septo tronco-conal (entre a aorta e a veia pulmonar) das clulas da crista neural cardaca. Clulas da crista do crebro posterior humano migram para os arcos farngeos 4 e 6 durante a quinta semana da gestao e entram no tronco arterial para gerar os septos. (A de Tan e Morriss-Kay, 1985, cortesia de S.-S. Tan; B, segundo Sechrist et al. 1993; D segundo Kirby e Waldo, 1990.)
295
primeira, clulas do rombmero 2 migram para a primeira bolsa farngea (mandibular) e tambm geram o gnglio do nervo trigmeo. Elas tambm so levadas pela epiderme em expanso a formar o processo naso-frontal (anterior). Na segunda via, clulas do rombmero 4 populam a segunda bolsa farngea (formando a cartilagem hiide do pescoo) e tambm produzem os gnglios para os nervos geniculado e o vestbuloacstico. Na terceira via, clulas do rombmero 6 migram para a terceira e quarta bolsas farngeas para formar as glndulas timo, paratireide e tireide, como tambm os gnglios dos nervos vago e glossofarngeo. Se a crista neural removida dessas regies incluindo o rombmero 6, o timo, as glndulas paratiride e a tireide no se formam (Bockman e Kirby, 1984). As clulas da crista neural dos rombmeros 3 e 5 no migram atravs do mesoderma que os envolve, mas sofrem morte celular apopttica ou entram nas correntes de clulas da crista em cada um de seus lados (Graham et al., 1993; Sechrist et al., 1993; Graham et al., 1994). Em embries de mamferos, clulas da crista neural cranial migram antes que o tubo neural se feche (Tan e Morriss-Kay, 1985) e do origem ao mesnquima facial (Johnston et al., 1985). As clulas da crista que se originam nos crebros anterior e mdio contribuem para o processo nasal, palato e o mesnquima da primeira bolsa farngea. Essa estrutura se torna parte do aparelho da guelra dos peixes; no homem origina os ossos da mandbula e os ossos martelo e bigorna do ouvido mdio. As clulas da crista neural, originando na regio anterior do crebro posterior, do origem ao mesnquima do segundo arco farngeo, que produz o osso estribo no homem, como tambm a maior parte da cartilagem facial (veja Figura 7.41 C; Tabela 7.2). As clulas da crista neural cervical do origem ao mesnquima do terceiro, quarto e sexto arcos farngeos (no homem, o quinto degenera) os quais produzem os ossos do pescoo e os msculos. Como discutido no Captulo 2, uma srie de genes parecem especificar os destinos das clulas da crista neural e suas vias migratrias. Chisaka e Capecchi (1991) eliminaram o gene Hoxa-3 de camundongos intracruzados encontrando que esses animais mutantes tinham as glndulas do timo, paratireide e tireide fortemente deficientes ou ausentes, vrtebras do pescoo encurtadas, e os principais vasos do corao mal formados. possvel que os genes Hoxa-3 sejam responsveis pela especificao das clulas da crista neural cranial que do origem cartilagem do pescoo e aos derivados do arco farngeo. Entretanto, esse gene no controla a migrao menor das clulas da crista neural que formam os gnglios neurais cranianos. Essa via migratria afetada quando os genes Hoxb-1 so eliminados. Nesse mutante, existem defeitos na produo do nervo facial* (Goddard et al., 1996; Studer et al., 1996). Potncia de desenvolvimento das clulas da crista neural ceflica Pela discusso anterior, pode parecer que todas as clulas da crista neural so idnticas na sua potncia original. Entretanto, este no o caso. Aqui, novamente as clulas da crista neural cranial so diferentes das clulas do tronco porque somente as primeiras so capazes de formar a cartilagem da cabea. Quando a crista neural craniana transplantada para a regio do tronco, ela participa da formao da cartilagem do tronco, que normalmente no produzida a partir de componentes da crista neural. Em alguns casos, essas clulas da crista neural craniana so instrudas precocemente a respeito de quais tecidos estaro aptas a formar. Noden (1983) removeu regies da crista neural da galinha, que normalmente deveria gerar o segundo arco farngeo, e as substituiu por clulas que migrariam para o primeiro arco farngeo. Os embries hospedeiros desenvolveram dois conjuntos de estruturas
* O fentipo dos camundongos mutantes, Hoxb-1, se assemelha ao de certas condies humanas como a Paralisia de Bell e a Sndrome de Moebius (paralisia facial congnita) e pode fornecer possveis esclarecimentos para essa condio.
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Tabela 7.2 Alguns derivados dos arcos farngeos Arco farngeo Elementos esquelticos (crista neural mais mesoderma) Bigorna e martelo (da crista neural); mandbula, maxila e regies do osso temporal (da crista do mesnquima drmico) Osso estribo do ouvido mdio apfise estilide do osso temporal; parte do osso hiide do pescoo (todos da cartilagem da crista neural) Borda inferior e cornos maiores do osso hiide (da crista neural) Cartilagens laringeanas (do mesoderma da placa lateral) Cartilagens laringeanas (do mesoderma da placa lateral) Arcos, artrias (mesoderma) Msculos (mesoderma) Nervos cranianos (tubo neural)
Ramo maxilar da artria cartida (para ouvido, nariz e queixo)
Msculos do queixo, soalho bucal; msculos do ouvido e do palato mole
Divises maxilares e mandibulares do nervo trigmeo
Artrias para a regio do ouvido: artria crticotimpnica (adulto); artria estribal (embrio)
Msculos da expresso facial; msculos do queixo e pescoo superior
Nervo facial (VII)
Artria cartida comum; raiz da cartida interna Arco da aorta; artria subclvia direita; bicos artrias originais de pulmonares Duto arterioso; razes das artrias pulmonares definitivas
Estilofarngeo (para elevar a faringe) Constritores da faringe e cordas vocais Msculos intrnsecos da laringe
Glossofarngeo (IX)
Ramo superior laringeano do nervo vago Ramo recorrente laringeano do nervo vago
Fonte: Baseado em Larsen, 1992
mandibulares, pois as clulas derivadas do enxerto tambm produziram uma mandbula. A base para essa instruo ser discutida no Captulo 16. Quando clulas da crista neural ceflica da galinha ou codorna so cultivadas, se obtm uma populao heterognea de clulas (Baroffio et al., 1991). Algumas das clulas so pluripotentes, e seus clones contm clulas de vrios tipos. Outras clulas da crista do derivados mais restritos. interessante notar que nem todas as combinaes de cartilagem, glia, neurnios colinrgicos, melancitos e neurnios adrenrgicos so observadas. A Figura 7.42 mostra os tipos de clones que emergem e traa vias hipotticas para os tipos restritos de clula
A crista neural cardaca

Como ser detalhado no Captulo 9, o corao formado inicialmente na regio do pescoo, diretamente abaixo dos arcos farngeos, e no surpreendente que adquira clulas da crista neural. Entretanto, as contribuies da crista neural ao corao s foram consideradas recentemente. A regio caudal da crista cfalica algumas vezes chamada de crista neural cardaca, porque essas clulas da crista neural (e somente essas clulas determinadas da crista) podem dar origem ao endotlio das artrias do arco artico e o septo entre a aorta e a artria pulmonar (veja Figura 7.41D). Na galinha, a crista neural cardaca se localiza acima da regio do tubo neural a partir do rombmero 7 at a medula espinhal, oposta ao terceiro somito, e essas clulas da crista migram para os arcos farngeos 3, 4 e 6. Se a crista neural cardaca for removida e substituda
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Neurnios colinrgicos
Figura 7.42
Cartilagem Melancitos
Clulas adrenrgicas Clulas gliais
Clulas semelhantes s germinativas
Clulas germinativas de linhagem restrita
Restrio hipottica de linhagem nas clulas da crista neural ceflica da codorna. Um total de 533 clones, cada um derivado de uma nica clula, foram observados para os tipos celulares derivados de cada clula. Os resultados so consistentes com a restrio progressiva do destino celular de clula germinativa pluripotente, atravs de clulas germinativas mais restritas, at uma clula progenitora unipotente. (A, neurnio adrenrgico; C, cartilagem; G, clulas da glia; M, melancitos; N, neurnios colinrgicos.) (Segundo Le Douarin et al., 1994.)
Progenitores unipotentes Tipos celulares derivados da crista neural
Cartilagem
Neurnios colinrgicos
Clulas gliais
Clulas adrenrgicas
Melancitos
pela crista neural do tronco ou pela crista ceflica anterior, ocorrem anormalidades cardacas (especialmente a falta da separao artica-pulmonar). Fica evidente, que a crista cardaca j est determinada para gerar clulas cardacas, e outras regies da crista neural no podem substitu-la (Kirby, 1989; Kuratani e Kirby, 1991). Defeitos cardacos congnitos no homem com freqncia ocorrem com defeitos nas glndulas paratireide, tireide e timo. No seria surpresa se esses estivessem ligados a defeitos na migrao de clulas da crista neural. [ecto7.html]
A EPIDERME E A ORIGEM DAS ESTRUTURAS CUTNEAS A origem das clulas epidrmicas

As clulas que cobrem o embrio aps a neurulao formam a epiderme presuntiva. Inicialmente, esse tecido tem a espessura de uma camada de clulas, mas na maioria dos vertebrados, logo em seguida se transforma em uma estrutura de duas camadas. A camada externa d origem periderme, uma cobertura temporria que descartada to logo se diferencia a camada inferior para formar a verdadeira epiderme. A camada interna, chamada camada basal (ou estrato germinativo), um epitlio germinativo que d origem a todas as clulas da epiderme (Figura 7.43). A camada basal se divide dando origem a uma outra, composta de uma populao de clulas externas chamada camada espinhosa. Essas duas camadas epidrmicas so conhecidas como a camada de Malpighi. As clulas da camada de Malpighi se dividem para produzir a camada granular da epiderme, assim chamada porque as clulas so caracterizadas por grnulos da protena queratina. De maneira diferente das clulas que permanecem na camada de Malpighi, as clulas da camada granular no se dividem, mas comeam a se diferenciar em clulas da pele, ou queratincitos. Os grnulos de queratina se tornam mais proeminentes medida que as clulas da camada granular envelhecem e migram para fora. Aqui, elas formam a camada crnea (estrato crneo), na qual as clulas se
298
Figura 7.43
Diagrama das camadas da epiderme humana. As clulas basais so mitoticamente ativas, enquanto as clulas totalmente queratinizadas, caractersticas da pela externa, esto mortas e so descartadas. Os queratincitos obtm esse pigmento pela transferncia de melanossomos dos processos de melancitos que restam na camada basal. (Segundo Montagna e Parakkal, 1974.)
Membrana plasmtica engrossada
Queratina
Camada crnea
Grnulos de queratina
Clula de transio
Melanossomos Camada granular
Camada espinhosa Camada de Malpighi Camada basal
Lmina basal Melancito
transformaram em sacos achatados da protena queratina. A profundidade da camada crnea varia de lugar a lugar, mas usualmente tem a espessura de 10 a 30 clulas. Os ncleos dessas clulas so deslocados para uma de suas margens. Logo aps o nascimento, as clulas da camada crnea so descartadas e substitudas por clulas novas da camada granular. Por toda a vida, as clulas mortas queratinizadas da camada crnea so eliminadas (os seres humanos perdem 1.5 gramas dessas clulas cada dia)* e so substitudas por clulas novas, originrias das clulas mitticas da camada de Malpighi. As clulas pigmentadas da crista neural tambm se situam na camada de Malpighi, onde transferem seus grnulos de pigmentos (melanossomos) aos queratincitos em desenvolvimento. As clulas germinativas epidrmicas da camada de Malpighi esto ligadas membrana basal por suas protenas, integrinas. Entretanto, ao se tornarem determinadas para diferenciar elas suprimem suas integrinas e as perdem enquanto migram para a camada espinhosa (Jones e Watt, 1993). Existem dois fatores de crescimento estimulando o desenvolvimento da epiderme. O primeiro o fator de crescimento transformador- (TGF-). O TGF- produzido pelas clulas basais e estimula sua prpria diviso. Quando um fator de crescimento produzido pela mesma clula que o recebe ele chamado fator de crescimento autcrino. Esses fatores precisam ser cuidadosamente regulados porque se tiverem seus nveis aumentados, mais clulas so rapidamente produzidas. Na pele adulta, uma clula nascida na camada de Malpighi leva aproximadamente 8 semanas para
* A maior parte dessa pele se transforma em poeira de casa em cima de mveis e no assoalho. Se voc tem alguma dvida, queime uma poro dessa poeira; o cheiro ser de pele chamuscada.
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alcanar o estrato crneo e permanece na camada crnea mais ou menos duas semanas. Em indivduos com psorase, uma doena caracterizada por esfoliao de uma enorme quantidade de clulas epidrmicas, o tempo de permanncia na camada crnea de somente dois dias (Weinstein e van Scott, 1965; Halprin, 1972). Essa condio est ligada a uma super expresso de TGF- (a qual ocorre secundariamente a uma inflamao imune) (Elder et al., 1989). Analogamente, se o gene TGF- for ligado a um promotor para queratina 14 (uma das principais protenas da pele), e inserido no proncleo do camundongo, os animais transgnicos ativam o gene TGF- em suas clulas da pele e no podem suprimi-lo. O resultado um camundongo com pele escamosa, pouco plo e um enorme excesso de epiderme queratinizada sobre uma nica camada de clulas basais (Figura 7.44C; Vassar e Fuchs, 1991). O outro fator de crescimento necessrio para a produo de epiderme o fator de crescimento do querancito (KGF; tambm chamado fator de crescimento fibroblstico 7) um fator parcrino que produzido pelos fibroblastos da derme subjacente (derivada do mesoderma). O KGF recebido pelas clulas basais que esto acima dos fibroblastos da derme e se considera que ele regula a proliferao dessas clulas basais. Se o gene KGF fundido com o promotor de queratina 14 e so produzidos camundongos transgnicos, o KGF se torna autcrino. Os animais resultantes (Figura 7.44A) tm uma epiderme espessada, pele solta, muitas clulas basais e no tm folculos de plo, nem mesmo folculos do bigode (Guo et al., 1993). Essas clulas basais so foradas a entrar na via de diferenciao da epiderme. A alternativa para a clula basal ajudar a gerar o folculo do plo.
Apndices cutneos
A epiderme e a derme tambm interagem em stios especficos para criar as glndulas sudorparas e os apndices cutneos: plos, escamas ou penas (dependendo da espcie). A primeira indicao de que um folculo do plo se formar em um local especfico uma agregao de clulas na camada basal da epiderme. Essa agregao dirigida pelas clulas dermais subjacentes e ocorre em diferentes tempos e locais no embrio. As clulas basais se alongam, se dividem e penetram na derme. As clulas dermais
(B) (A) (C)
Figura 7.44
KGF
Tipo selvagem
TGF-
Fatores de crescimento e proliferao epidrmica. (A) Um camundongo transgnico expressando baixos nveis de KGF em seus queratincitos. Notar a rarefao do plo ao redor das patas, olhos e focinho. (B) Um camundongo de tipo selvagem. (C) Um companheiro de ninhada de (B) que est expressando altos nveis de TGF- em seus queratincitos. Tem pele descamada e muito pouco plo. Abaixo de cada camundongo est um corte atravs de sua pele. O animal expressando KGF em excesso no tem folculos pilosos e um nmero aumentado de clulas epidrmicas basais. O camundongo expressando TGF- tem camadas muito extensas de epitlio queratinizado, o qual ele descarta. (de Vassar e Fuchs, 1991, e Guo et al., 1993. Fotografias cortesia de E. Fuchs.)
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(A) Ectoderma epidrmico
(B)
(C) Canal piloso em desenvolvimento
(D) Plo
Mesoderma condensado
Mesoderma drmico
Ponta do plo Papila drmica Glndula sebcea Bulbo contendo clulas germinativas pluripotentes do folculo piloso
Figura 7.45
Desenvolvimento de folculos pilosos na pele fetal humana. (A) Clulas epidrmicas basais tornam-se colunares e se abaulam ligeiramente para dentro da derme. (B) Clulas epidrmicas continuam a proliferar, e clulas mesenquimatosas da derme se agregam na base do germe primrio do plo. (C) Comea a diferenciao da haste do plo no germe piloso alongado. (D) A haste pilosa queratinizada se estende da raiz do plo, o broto secundrio forma a glndula sebcea, e por baixo existe uma regio que pode conter as clulas germinativas pilosas para o prximo ciclo produtor de plo. (E) Fotografia de um germe piloso alongado. (Segundo Hardy, 1992, e Miller et al., 1993. Fotografia cortesia de W. Montagna.)
respondem a esse ingresso de clulas epidrmicas basais formando um pequeno ndulo (a papila dermal) abaixo do tampo epidrmico. A papila drmica, em um movimento ascendente, estimula as clulas basais germinativas a dividirem-se mais rapidamente e produzir clulas ps-mitticas que se diferenciaro na haste queratinizada do plo (veja Hardy, 1992; Miller et al., 1993). Melanoblastos, que estavam presentes entre as clulas epidrmicas enquanto ingressavam, diferenciam-se em melancitos e transferiam seu pigmento haste (Figura 7.45). Enquanto isso ocorre, duas intumescncias epiteliais comeam a crescer nos lados do folculo. As clulas da intumescncia inferior podem reter uma populao de clulas germinativas que regeneraro a haste do plo periodicamente, quando ela for descartada (Pinkus e Mehregan, 1981; Cotsarelis et al., 1990). As clulas da intumescncia superior formaro as glndulas sebceas que produzem uma secreo oleosa, o sebo. Em muitos mamferos, incluindo o homem, o sebo se mistura com clulas peridrmicas escamadas para formar a vernix caseosa, esbranquiada, que envolve o feto no nascimento. [ecto8.html] Os primeiros plos do embrio humano so finos, localizados muito prximos, e formam o chamado lanugo. Esse tipo de plo geralmente descartado antes do nascimento e substitudo (pelo menos em parte, por novos folculos) por plos curtos e sedosos, o velo. Velo permanece em muitas partes do corpo humano, usualmente consideradas sem plos como a testa e as plpebras. Em outras partes do corpo, o velo d lugar para o plo definitivo. Durante a vida de uma pessoa, alguns dos folculos que produziram velo podem, mais tarde, formar plos definitivos, depois reverter para a produo de velo. As axilas das crianas, por exemplo, tm folculos que produzem velo at a adolescncia. Nessa fase, as hastes definitivas so produzidas. Inversamente, em calvcie normal masculina, os folculos do couro cabeludo voltam a produzir plos velos muito finos e no pigmentados (Montagna e Parakkal, 1974). A localizao e o padro de plos, penas, escamas e glndulas sudorparas envolve interaes da epiderme e da derme, e essas sero discutidas em detalhe no Captulo 17. Da mesma forma que existe uma clula germinativa neural, cuja descendncia se torna clulas neurais e clulas gliais, tambm parece existir uma clula germinativa epidrmica pluripotente, cujos descendentes podem se tornar epiderme, glndulas sebceas e hastes de plo.
Concluses
Neste captulo acompanhamos a diferenciao do ectoderma embrionrio em uma ampla variedade de tecidos. Vimos que o ectoderma produz trs conjuntos de clulas durante a neurulao: (1) O tubo neural que d origem aos neurnios, s clulas gliais
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e s clulas ependimrias do sistema nervoso central; (2) as clulas da crista neural, que do origem ao sistema nervoso perifrico, clulas pigmentadas, medula da suprarenal e certas reas da cartilagem da cabea; e (3) a epiderme da pele, que contribui para a formao das estruturas cutneas como o plo, penas, escamas e glndulas sudorparas e sebceas, como tambm a cobertura protetora externa dos nossos corpos. Tambm observamos como as interaes das clulas epidrmicas esto envolvidas na origem dos vrios tecidos do olho. Os Captulos posteriores (16 e 17) discutem com mais detalhe a induo do tubo neural e o desenvolvimento coordenado do olho. No prximo captulo discutiremos os mecanismos pelos quais os neurnios so dirigidos para locais especficos, assim, permitindo o desenvolvimento de reflexos e comportamentos.
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Especificidade axnica
Assim, para alm de questes de quantidade, existem questes de padres que so essenciais para a compreenso da Natureza.
ALFRED NORTH WHITEHEAD (1934)
Tal como o entomologista procura de borboletas brilhantes coloridas, minha ateno perseguiu no jardim da matria cinzenta, clulas de formas delicadas e elegantes, as misteriosas borboletas da alma.
S. RAMN Y CAJAL (1937)
para os seus locais de atuao, como tambm o fazem os seus axnios. Diferentemente da maioria das clulas cujas partes permanecem no mesmo lugar, a clula nervosa capaz de alongar axnios que podem se estender por metros. O axnio tem seu prprio aparelho locomotor residindo no cone de crescimento, que pode responder aos mesmos tipos de sinais que as clulas migratrias podem perceber. Assim, o movimento axnico pode ser direcionado pela quimiotaxia, galvanotaxia, e conduo por contato, tal como as clulas migratrias. Os sinais para a migrao axnica podem, alm disso, ser ainda mais especficos que aqueles empregados para conduzir certos tipos de clulas para determinadas reas. O crebro humano, por exemplo, a matria mais organizada conhecida. Cada um dos seus 1011 neurnios tem o potencial de interagir especificamente com milhares de outras clulas, e um neurnio grande (tal como uma clula de Purkinje ou um neurnio motor) pode receber informaes de mais de 105 outras clulas (Figura 8.1; Gershon et al., 1985). O entendimento da gerao dessa complexidade organizada um dos maiores desafios para a cincia moderna. Goodman e Doe (1993) enumeram oito estgios de neurognese: (1) induo e padronizao de uma regio formadora de neurnios (neurognica); (2) nascimento e migrao de neurnios e glia; (3) gerao de destinos celulares especficos; (4) conduo de cones de crescimento para alvos especficos; (5) formao de conexes sinpticas; (6) ligao de fatores trficos para a sobrevivncia e diferenciao; (7) rearranjo competitivo de sinapses funcionais; e (8) continuada plasticidade sinptica durante a vida do organismo. Os dois primeiros processos foram tpicos do captulo anterior. Aqui, continuamos a investigar o processo do desenvolvimento neural. [axon1.html]
O SOMENTE AS CLULAS PRECURSORAS NEURONIAIS MIGRAM
A gerao da diversidade neuronial

Neurnios so moldados em uma maneira hierrquica. A primeira deciso se uma determinada clula dever ser um neurnio ou algo diferente. Se a clula deve tornarse um neurnio, a deciso seguinte informa o neurnio sobre seu tipo. Ele dever tornar-se um neurnio motor, um neurnio sensorial, um neurnio comissural, ou algum outro tipo? Aps esse destino ter sido determinado, ainda tomada outra deciso, dando ao neurnio um alvo especfico. Para ilustrar essa especificao progressiva, iremos enfocar os neurnios motores de vertebrados e Drosophila.
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Figura 8.1
Conexes de axnios a um neurnio do hipocampo cultivado. O neurnio foi delineado pela protena sinptica sinaptotagmina, que est presente nos terminais dos axnios que contatam o neurnio. (Cortesia de M. Matteoli e P. De Camilli.)
Vertebrado Especificao do Neurnio Motor de Vertebrado Vertebrados formam um tubo neural dorsal, enquanto invertebrados, tal como a Drosophila, formam um tubo neural ventral. No entanto, a especificao do ectoderma neural mediada pela ligao de protenas semelhantes. Em Xenopus (e provavelmente outros vertebrados) a notocorda secreta as protenas Chordin e Noggin. Essas protenas ligam BMP4, e o ectoderma na vizinhana da notocorda desenvolve a capacidade de formar neurnios. Se o ectoderma est exposto a BMP4, ele torna-se epidrmico (Sasai et al., l995; Piccolo et al., 1996; veja Captulo 16). Na ausncia de estimulao por BMP4 as clulas ectodrmicas dos vertebrados parecem sintetizar um fator de transcrio (ou um conjunto de fatores de transcrio) que compromete as clulas uma linhagem neural. Posteriormente, as clulas iro sintetizar outras protenas (tal como a NeuroD) que levam-nas a expressar seu fentipo neural (Turner e Weintraub, 1994; Lee et al., 1995). As decises relativas ao tipo de neurnio parecem ser controladas pela posio do precursor neuronial no interior do tubo neural e pelo momento quando esse sofre sua ltima diviso celular. Conforme descrito no captulo anterior, os neurnios na margem ventro-lateral tornam-se neurnio motores, enquanto os neurnios sensoriais so derivados de clulas na regio dorsal do tubo. Como transplante de clulas da placa ectpica do assoalho ou notocorda (que secretam a protena Sonic hedgehog) para reas laterais pode re-especificar clulas dorsolaterais em neurnios motores, essa deciso quanto ao tipo de neurnio provavelmente uma funo de sua posio em relao placa do assoalho. Ericson e colega (1996) mostraram que so necessrios dois perodos de sinalizao de Sonic hedgehog para especificar os neurnios motores: um perodo precoce durante o qual as clulas so instrudas para se tornarem neurnios ventrais e um perodo mais tardio (que inclui a fase S de sua diviso de aniversrio) que especifica que o neurnio ventral est para se tornar um neurnio motor (em vez de um interneurnio). A primeira fase provavelmente regulada pela secreo de Sonic hedgehog pela notocorda, enquanto o estgio mais tardio mais
CAPTULO 8 Especificidade Axnica
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provavelmente regulado pelas clulas da placa do assoalho. A Sonic hedgehog parece especificar os neurnios motores pela induo do fator de transcrio Islet-1. Essa protena encontrada em todos os neurnios motores mas em nenhum outro tipo de neurnio (Ericson et al., 1992; veja Prancha 32). Outro fator que afeta o tipo neuronial a idade da clula por ocasio da ltima diviso. Como discutido no captulo anterior, o aniversrio de uma clula determina em que camada do crtex ela ir penetrar. A prxima deciso envolve a especificidade do alvo. Se uma clula se destina a ser um neurnio e, especificamente, um neurnio motor, esse neurnio motor ir inervar a coxa, o membro anterior, ou a lngua? A determinao da especificidade parece ser regulada pela posio do neurnio motor ao longo dos eixos ntero-posterior e mediano-lateral do tubo neural. O tubo neural tem uma distinta polaridade ntero-posterior do prosencfalo ao longo da medula espinhal. No Captulo 16 iremos discutir o complexo do gene Hox que determina essa polaridade dentro da medula espinhal e que fornece especificidade de alvo aos respectivos neurnios motores. Esses genes trabalham em combinao para definir a identidade posicional de cada regio do embrio. Landmesser (1978) e Holliday (1980b) mostraram que os neurnios motores que tm a mesma especificidade esto agrupados. Os corpos celulares de neurnios motores que se projetam para um nico msculo esto agregados em uma coluna longitudinal formando um pool. Os pools esto agregados formando colunas maiores de acordo com seu alvo. Neurnios motores na Coluna de Terni (CT) se projetam ventralmente para dentro dos gnglios simpticos. Pools motores da coluna motora lateral (LMC) se estendem para a musculatura dos membros, enquanto os neurnios motores na coluna motora mediana (MMC) se projetam para dentro dos msculos axiais. As colunas dos membros e as axiais so subdivididas ao longo do eixo mediano-lateral de maneira a se correlacionar com a posio dorsoventral dos seus respectivos alvos (Figura 8.2; Tosney et al., 1995). Esse arranjo de neurnios motores constante para os vertebrados. [axon2.html] As especificidades dos alvos desses neurnios motores so especificadas antes de seus axnios se estenderem para a periferia. Isso foi mostrado por Lance-Jones e Landmesser (1980), que reverteram segmentos da medula espinhal de pintos fazendo com que os neurnios motores se encontrassem em novos locais. Os axnios se dirigiram para seus alvos originais, no para aqueles esperados devido suas novas posies (Figura 8.3). A base molecular dessa especificidade poderia residir em membros da famlia de protenas LIM (veja Figura 8.2; Tsushida et al., 1994). A famlia LIM inclui Islet-1. Islet-2, LIM-1, LIM-2 e LIM-3, e cada uma dessas protenas um fator de transcrio. As protenas LIM foram implicadas na especificao do destino de clulas em nematides (nos quais o gene LIM mec-3 especifica um neurnio receptor de
Nveis Cervical
Colunas de um lado do tubo neural
Ordem da Neurnio expresso gnica motor
Projeo de neurnios dentro de cada coluna
Figura 8.2
Tubo neural Torcica Msculo Membro anterior Dorsal Parede do corpo
Ventral Torcico Membro posterior Msculo Dorsal Membro posterior Tempo ou Ventral
Organizao de neurnios motores e especificao LIM. esquerda est metade da medula espinhal. Os neurnios nessas colunas apresentam conjuntos especficos de genes LIM, e neurnios dentro de cada coluna fazem decises semelhantes quanto escolha de trajetrias. Neurnios motores CT projetam-se ventralmente para os gnglios simpticos. A coluna MMC projeta-se para os msculos axiais, e a LMC envia axnios para a musculatura dos membros. Quando essas colunas so subdivididas, as subdivises medianas (m) se projetam para as posies ventrais e as subdivises laterais (l) enviam axnios para as regies dorsais dos tecidos alvo. (Segundo Tsushida et al., 1994; Tosney et al., 1995.)
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(A)
Estgio 15-16
Estgio 28.5
Estgio 28.5
Plexo crural Axial Sartrio (B) Controle
Plexo crural Axial Sartrio (C) Revertido
Figura 8.3
Compensao por pequenos deslocamentos da posio de iniciao axnica no embrio do pinto. (A) Um pedao da medula espinhal compreendendo vrios segmentos T7-S3 (stimo torcico ao terceiro lombo-sacral) revertido no embrio de 2.5 dias. (B) Padro normal de projeo axnica para diferentes msculos aos 6 dias. (C) Projees axnicas no segmento revertido. Os neurnios localizados ectopicamente finalmente acharam seus caminhos neurais apropriados e inervaram os msculos apropriados. (de Lance-Jones e Landmesser, 1980.)
toque; Way e Chalfie, 1988) e so importantes para o desenvolvimento cerebral em camundongos (Shawlot e Behringer, 1995). Por exemplo, todos os neurnios motores expressam Islet-1 e (um pouco depois) Islet-2. Se nenhum outro desses genes LIM for expresso, os neurnios se projetam para os msculos da parede ventral do corpo. Aqueles neurnios na coluna mediana da MMC tambm expressam LIM-3, o que os distingue dos outros neurnios motores. Os pools laterais da coluna de LMC so distinguidos pela sua expresso curta de LIM-1, enquanto os neurnios motores CT param de expressar Islet-2. Assim, cada projeo caracterizada por uma constelao particular de fatores de transcrio LIM. Especificao dos Neurnios Motores em Drosophila A especificao do ectoderma neural em vertebrados e artrpodes parece ser conduzida de maneira surpreendentemente semelhante. A especificao do ectoderma neurognico em Drosophila envolve a secreo do homlogo de Chordin da Drosophila, a protena Short-gastrulation. Essa protena produzida pelas clulas ventro-laterais do blastoderma, e liga-se ao homlogo da BMP4 da Drosophila, a protena Decapentaplegic (veja Figura 15.32; Holley et al., 1995). As clulas que secretam a protena Shortgastrulation so poupadas dos efeitos lateralizantes da Decapentaplegic, e tornam-se capazes de formar o cordo nervoso ventral. Durante a gastrulao, as clulas colocadas mais vegetalmente, as precursoras do mesoderma, invaginam para o interior da blastocele vitelnica, causando a localizao do ectoderma neurognico na regio ventral do embrio (Figura 8.4). O ectoderma delamina cerca de 60 clulas (30 de cada lado) dentro do embrio, e essas (em conjunto com as clulas da linha mediana ventral) so as precursoras dos neurnios, os neuroblastos. O compromisso de tornar-se ectoderma uma conseqncia do posicionamento ao longo do eixo dorsoventral do embrio e ser discutido em captulos subseqentes. O compromisso de tornar-se um neuroblasto em lugar de uma clula epidrmica feito por um grupo de genes chamados
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Figura 8.4
Embrio de Drosophila
Blastoderma celular Ectoderma superficial Neuroectoderma presuntivo Clulas presuntivas da linha mediana Mesoderma
Gastrulao
Alongamento da banda geminativa
Delaminao do neuroblasto
Desenvolvimento da regio neurognica de insetos. No blastoderma, o neuroectoderma presuntivo est localizado em um outro lado dos precursores mesodrmicos. Durante a gastrulao e extenso da banda germinativa, o mesoderma se invagina da superfcie para o interior do embrio. As clulas precursoras da linha neural mediana so agora as clulas mais ventrais do embrio. O ectoderma delamina neuroblastos para dentro do embrio (juntamente com clulas da linha mediana ventral) para formar o sistema nervoso central. Os neuroblastos geram uma srie de clulas-me ganglionares, cada uma das quais gera dois neurnios. No caso, mostrado o neuroblasto 1-1. (Segundo Goodman e Doe, 1993.)
Neuroblastos Ectoderma ventral (do ectoderma neurognico) Neurnios Precursores da linha mediana
Clula-me do gnglio Neuroblasto NB 1-1 Interno Externo
Crescimento axnico
genes proneurais (Figura 8.5). Esses constituem um conjunto de fatores de transcrio encontrados em arranjos de cerca de quatro a seis clulas na regio ectodrmica.* Cada arranjo forma uma zona de interao onde uma (e apenas uma) das clulas se torna um neuroblasto. Uma clula compromissada para formar um neuroblasto, inibe as outras clulas de seu arranjo de se tornarem neuroblastos. Isso conseguido pela interao com um grupo de genes chamados de genes neurognicos. As protenas Notch e Delta so crticas nessas reaes. Essas protenas se integram na membrana celular. Suas interaes sugerem que a clula que est destinada a se tornar um neuroblasto diminui a regulao da sua protena Notch, que leva suas vizinhas a diminuir a regulao das suas protenas Notch. Essa deciso comunicada atravs de protenas Delta. Dessa maneira, o neuroblasto inibe lateralmente outras clulas do agregado de se tornarem neuroblastos (veja Captulo 17). [axon3.html] Tal como acontece em vertebrados, a especificao de neuroblasto em Drosophila conseguida pela expresso combinatria de diferentes genes. (De maneira interessante, esses genes foram usados anteriormente para especificar cada regio do blastoderma da Drosophila). Se quaisquer desses genes no forem capazes de funcionar, os neuroblastos se comportam como se fossem outros tipos de neurnios, freqentemente formando nervos que enviam seus axnios para alvos errados (ChuLaGraff et al., 1995). [axon4.html]
*Esses fatores de transcrio so membros da famlia achaete-scute. Interessantemente, alguns dos fatores de transcrio envolvidos na determinao neural de vertebrados so tambm membros dessa famlia (Turner e Weintraub, 1994).
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Figura 8.5
Ectoderma superficial
Especificao seqencial da linhagem de neuroblastos. (A) O ectoderma neurognico especificado por sinais posicionais ao longo dos eixos dorsoventral e ntero-posterior. (B,C) Agregados de neuroblastos potencias esto especificados por genes proneurais como o achaete (mostrado em F). (D) Interao entre neuroblastos potenciais seleciona uma clula do agregado para ser neuroblasto, e essa clula inibe as outras clulas do agregado de se tornarem neuroblastos. (E) Os neuroblastos brotam das clulas-me ganglionares (da maneira que ser discutida no Captulo 13), cada uma indo formar dois neurnios. (F) Embrio de Drosophila corado para o transcrito de achaete. Os agregados neurognicos expressam esse gene. Os parnteses indica um domnio de atividade neurognica. (Segundo Goodman e Doe, 1993; fotografia de Skeath e Carrol, 1922; cortesia de J. Skeath.)
Ectoderma neurognico
Formao de padres no sistema nervoso

O funcionamento do crebro vertebrado no depende somente da diferenciao e do posicionamento das clulas neurais, mas tambm das conexes especficas dessas clulas entre si e seus alvos perifricos. De alguma maneira, os nervos de um rgo sensorial como o olho devem se conectar a neurnios especficos no crebro, que podem interpretar estmulos visuais, e os axnios do sistema nervoso tm que atravessar grandes extenses de tecidos antes de inervar o tecido alvo apropriado. Como sabe o axnio nervoso atravessar numerosas outras clulas alvos em potencial para fazer sua conexo especifica? Harrison (1910) sugeriu que a especificidade do crescimento axnico devida s fibras nervosas pioneiras, que avanam na frente de outros axnios e servem como guias para elas.* Essa observao simplifica, mas no resolve, o problema de como os neurnios formam padres apropriados de interconexes. Harrison tambm observou que os axnios devem crescer em um substrato slido, e especulou que diferenas nas superfcies embrionrias podem permitir aos axnios viajar em certas regies especficas. As conexes finais ocorreriam por interaes complementares na superfcie celular: Que deve haver uma espcie de reao na superfcie entre cada tipo de fibra nervosa e a estrutura particular a ser inervada parece claro a partir do fato de que fibras sensoriais e motoras, embora correndo prximas no mesmo feixe, ainda assim formem conexes perifricas apropriadas, umas com a epiderme e as outras com o msculo... Esses Fatos sugerem que pode haver aqui certa analogia com a unio do vulo com o espermatozide. Pesquisa sobre a especificidade de conexes neuroniais tem enfocado dois tipos principais de sistemas: neurnios motores, cujos axnios viajam de um nervo para um msculo especfico, e o sistema ptico, cujos axnios originando na retina encontram seu caminho de retorno ao crebro. Em ambos, a especificidade das conexes axnicas desenrola-se em trs etapas (Goodman e Shatz, 1993): Seleo de trajetria, onde os axnios viajam por uma rota que os conduz a uma regio particular do embrio.
(A) Sinais posicionais: genes de segmentao (A/P), genes dorso/ventrais (B) Especificao neuroblstica genes de identidade neuroblstica
(C) Formao neuroblstica genes proneurais
(D) Inibio lateral genes neurognicos
(E) Linhagem celular neuroblstica clulas-me ganglionares e genes de identidade neural Neurnios Clulas-me ganglionares Neuroblastos
(F)
*Os cones de crescimento dos neurnios pioneiros migram para seus tecidos alvos enquanto as distncias embrionrias ainda so curtas e o tecido embrionrio interveniente ainda relativamente no-complicado. Mais tardiamente no desenvolvimento, os outros neurnios que inervam o tecido alvo se ligam (fasciculam) ao neurnio pioneiro e assim penetram no tecido alvo. Klose e Bentley (1989) mostraram que em alguns casos, os neurnios pioneiros morrem aps outros neurnios terem atingido sua destinao. No entanto, tivesse esse neurnio pioneiro sido impedido de se diferenciar, os outros axnios no teriam atingido seu tecido alvo.
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Seleo de alvo, onde os axnios, uma vez atingido a rea correta, reconhecem e ligam-se a um conjunto de clulas com as quais podem formar conexes estveis. Seleo de endereo, onde os padres iniciais so refinados fazendo cada axnio se ligar a um pequeno subconjunto (s vezes de somente um) de seus possveis alvos.
Os dois primeiros processos so independentes da atividade neuronial. O terceiro envolve interaes entre diversos neurnios ativos e converte projees sobrepostas, em um padro de conexes finalmente concatenadas. conhecido desde 1930 que os axnios motores podem encontrar seus msculos apropriados mesmo quando a atividade neural dos axnios est bloqueada. Twitty (que havia sido aluno de Harrison) e seus colegas acharam que os embries do trito Taricha torosa secreta uma toxina, tetrodotoxina, que bloqueava a transmisso neural em outras espcies. Transplantando pedaos de Taricha torosa para outros embries de salamandra, eles foram capazes de paralisar os embries hospedeiros por dias enquanto ocorria o desenvolvimento. Aproximadamente no momento em que os girinos iriam se alimentar, a toxina desaparecia, e as salamandras nadaram e se alimentaram normalmente (Twitty e Johnson, 1934; Twitty, 1973). Experimentos mais recentes usando mutantes do peixe-zebra tendo receptores neurotransmissores no-funcionais, demonstraram de maneira semelhante que os neurnios motores estabeleciam seus padres normais de inervao na ausncia de atividade neuronial (Westerfield et al., 1990). Porm, permanecia a questo, Como so instrudos os axnios a respeito do local para onde devem ir? Conforme mencionado no Captulo 3, as clulas migratrias recebem seus sinais de substncias difusivas, ons, ou da matriz extracelular sobre a qual viajam. O cone de crescimento capaz de responder ao mesmo tipo de sinais, e conduz o axnio da soma da clula neural para o seu tecido alvo. Deve-se recordar do captulo anterior que o cone de crescimento arrasta o axnio para frente. O axnio no esticado pelos empurres vindos do corpo celular.
Seleo de trajetrias: Orientao pela matriz extracelular

A matriz extracelular pode prover informao para a navegao de vrias maneiras algumas mais especficas que outras. Canais e pregas na matriz extracelular podem restringir o caminho de crescimento axnico uma certa regio; isso uma maneira muito crua de orientao. Alm disso, certas protenas da lmina basal podem ser mais adesivas que outras e estender vis para a movimentao axnica ao longo da membrana basal. Finalmente, molculas na matriz extracelular podem repelir ativamente certos axnios, causando o colapso do cone de crescimento. Como veremos, todos esses mecanismos parecem atuar no embrio. Terreno Orientao pelo Terreno Fsico: Orientao por Contato Uma das primeiras hipteses a respeito da especificidade do crescimento axnico envolve a orientao por contato, ou estereotropismo. Aqui, sinais fsicos do substrato dirigem o crescimento neural. Harrison desenvolveu uma tcnica de desenvolver axnios em cogulos sangneos, e usando essa tcnica, Weiss (1955) observou que os axnios em crescimento no somente necessitavam de um substrato slido para migrar, mas tambm que a migrao tendia a seguir descontinuidades no cogulo. Quando as fibras do cogulo se orientavam de maneira aleatria, os axnios seguiam esse padro aleatrio. Porm, quando as fibras foram produzidas paralelas pela aplicao de tenso sobre o cogulo, os axnios do nervo caminhavam ao longo dessas fibras, no se afastando da retido (veja Figura 3.31). Singer e seus colaboradores (1979) encontraram evidncia que tais fatores fsicos operam in vivo para guiar os cones de crescimento. Eles detectaram grandes canais entre clulas epidrmicas da medula espinhal da salamandra, atravs das quais migram os axnios em crescimento. Eles
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consideraram a hiptese de que esses canais proviam sinais para guiar os axnios em direo s regies apropriadas do crebro. Canais celulares foram tambm detectados na retina do camundongo (Silver e Sidman, 1980), e parecem guiar os cones de crescimento das clulas ganglionares da retina para o caule ptico durante seu desenvolvimento. A presena de canais preexistentes provavelmente no crtica para o crescimento da maioria dos axnios. O cone de crescimento parece capaz de digerir seus prprios canais atravs de uma matriz extracelular secretando enzimas proteolticas para sua vizinhana imediata (Pittman, 1985). Orientao para Gradientes de Adeso: Haptotaxia O cone de crescimento de um axnio em desenvolvimento encontra numerosos microambientes, e alguns locais podem conter molculas que so mais adesivas que outras encontradas em outros locais. A capacidade de um cone de crescimento (ou de uma clula) para migrar subindo um gradiente de adesividade chamada haptotaxia. O cone de crescimento tem receptores que reconhecem protenas encontradas em certas lminas basais e o cone conduz o axnio ao longo de caminhos recobertos por essas protenas. A hiptese da especificidade adesiva diferencial postula que o cone de crescimento ir encontrar um ambiente irregular e que reconhece o seu caminho por ter receptores particulares para certas molculas no ambiente. Isso pode ser visto in vitro. Quando colocado em cultura, um pedao de tecido da retina neural no emite facilmente
Figura 8.6
Efeitos dos fatores do substrato no crescimento neural. (A,B) Efeitos de fibronectina no crescimento neural de agregados da retina neural. O agregado em (A) foi cultivado por 36 horas em plstico de cultura de tecidos no-tratado. O agregado em (B) foi cultivado em plstico tratado com 50g de fibronectina por mililitro. (C) Crescimento de neurnios sensoriais colocados em substrato padronizado consistindo de faixas paralelas de laminina aplicadas sobre um fundo de colgeno de tipo IV. (A e B de Akers et al., 1981, cortesia de J. Lilien; C de Gundersen, 1987, cortesia de R. W. Gundersen.)
315
axnios para a placa de plstico. Porm, se a placa for recoberta com fibronectina ou laminina, crescimento de longos axnios so observados (Figura 8.6). Reciprocamente, glicosaminoglicanos, outro conjunto de protenas associadas com matrizes extracelulares, parecem impedir esses crescimentos neurais (Tosney e Landmesser, 1985). A presena de tais molculas delineia as trajetrias atravs do embrio (Akers et al., 1981; Gundersen, 1987), e muitos dos caminhos percorridos pelos axnios parecem ser pavimentados por laminina. Letourneau e colaboradores (1988) mostraram que os axnios de certos neurnios espinhais migram atravs do neuroepitlio por uma superfcie transitoriamente recoberta por laminina que indica precisamente o caminho desses axnios. De maneira semelhante, existe muito boa correlao entre o alongamento dos axnios da retina e a presena de laminina nas clulas neuroepiteliais e astrcitos no crebro do embrio do camundongo (Cohen et al., 1986, 1987; Liesi e Silver, 1988). Depsitos puntiformes de laminina so vistos nas superfcies das clulas gliais ao longo do caminho levando da retina para o tectum ptico, ao passo que reas adjacentes onde o nervo tico deixa de crescer no h tais depsitos de laminina. Aps os axnios da retina terem alcanado o tectum, as clulas gliais se diferenciam e perdem sua laminina. Nesse ponto, os neurnios ganglionares da retina que formaram o nervo tico perdem seu receptor integrina para a laminina. Depsitos de laminina podem tambm ser necessrios para a regenerao do tecido neural. Clulas astrogliais contendo laminina puntiforme em suas superfcies podem induzir a regenerao quando colocadas em embries nos quais os caminhos neuroniais do corpo caloso foram rompidos. Existem ao menos quatro regies da glicoprotena laminina que podem sustentar a migrao e o crescimento axnico (Figura 8.7). Primeiro, as integrinas do cone de crescimento podem se ligar seqncia RGD da protena laminina. Segundo, outro receptor do cone de crescimento pode reconhecer a seqncia de aminocidos YIGSR na laminina, enquanto a regio de 10 aminocidos rica em isoleucina do peptdeo B2 crtica para o crescimento neurtico de certos neurnios (Matsuzawa et al., 1996). O quarto receptor para laminina do cone de crescimento a glicosiltransferase que reconhece certas cadeias laterais de carboidrato da molcula de laminina (Begovac e Shur, 1990; Thomas et al., 1990). Esses carboidratos podem residir no domnio de crescimentos neurticos da cadeia A da laminina. Conduo por Sinais Migratrios Especficos do Axnio: A Hiptese das Trajetrias Marcadas Por serem encontradas em muitos lugares atravs do embrio, molculas da matriz extracelular como a laminina e N-CAM podem usualmente proporcionar somente sinais gerais para a movimentao dos cones de crescimento. Seria difcil para tais molculas generalizadas dirigir cones de crescimento de diferentes tipos em direes diferentes. Apesar disso, em Drosophila, gafanhotos e Caenorhabditis (e provavelmente na maioria dos invertebrados), a padronizao do movimento axnico um processo surpreendentemente preciso, e os axnios adjacentes esto dando instrues migratrias diferentes de seus ambientes. Por exemplo, de dentro de cada segmento do gafanhoto emergem 61 neuroblastos (30 de cada lado e um no centro). Um desses, o neuroblasto 7-4, uma clula germinativa e d origem a uma famlia de seis neurnios, chamados C, G, Q1, Q2, Q5 e Q6. Essa famlia de neurnios est mostrada na Figura 8.8, do mesmo modo que os neurnios amarelos na Prancha 20. Os cones de crescimento axnico desses neurnios alcanam seus alvos seguindo caminhos especficos formados por outros neurnios precoces. Q1 e Q2 seguem um caminho reto juntos, atravessando numerosas outras clulas, at encontrar o axnio do neurnio precursor da linha mediana dorsal (dMP2), na qual eles seguem posteriormente. Os outros quatro neurnios da famlia 7-4 migram atravs do axnio dMP2 como se esse no existisse. Axnios do neurnios C e G progridem juntos por um longo caminho, mas finalmente C segue os nervos X1 e X2 para a parte posterior do segmento, enquanto G adere aos axnios P1 e P2 (que prosseguiro posteriormente) e move-se anteriormente sobre suas superfcies (Goodman et al., 1984, Taghert et al., 1984).
Cadeia A
Regio de ligao de clulas epiteliais Cadeia B1
Local de fixao de clulas RDG Cadeia B2
Local YIGSR de fixao celular e migrao
Domnio de ligao de colgeno tipo IV
Regio de crescimento de neuritos
Regio ligante de heparina e axnio
Figura 8.7
Estrutura de laminina e propostas para regies ligantes.
316
Precursor da linha mediana Neuroblasto lateral Neuroblasto 7-4 Neuroblasto mediano Neuroblasto 7-4
Clulas-me ganglionares
Prognie: Neurnios irmos
Axnios Cones de crescimento Fascculos axnicos
Figura 8.8
Cada um dos 17 segmentos do embrio precoce do gafanhoto tem o mesmo padro de neuroblastos. Existem 30 neuroblastos laterais de cada lado, um neuroblasto mediano e 7 precursores na linha mediana. Os neuroblastos da linha mediana se dividem uma vez, enquanto os neuroblastos so clulas-tronco que dividem-se repetidamente para formar as clulasme ganglionares. Cada uma das clulas se divide uma vez para fornecer dois neurnios irmos. O neuroblasto 7-4 tem uma prognie de quase 100 neurnios, dos quais os primeiros 6 so aqui mostrados. (Segundo Goodman e Bastiani, 1984.)
O cone de crescimento G ter encontrado mais de 100 superfcies diferentes s quais poderia aderir, mas ele especfico para os neurnios P. Se os neurnios P so destrudos por laser, os cones de crescimento G agem anormalmente, seus filopdios procurando aleatoriamente pela superfcie migratria apropriada. Se qualquer dos outros cento e tantos neurnios forem destrudos, o cone de crescimento G comporta-se normalmente. Essa formulao de encontro de trajetrias axnicas em insetos foi chamada de hiptese de trajetrias marcadas porque significa que um dado neurnio pode reconhecer especificamente a superfcie de outro neurnio que se desenvolveu anteriormente. A evidncia para essa especificidade vem de estudos usando anticorpos monoclonais (Bastiani et al., 1987). Neurnios aCC e pCC so neurnios irmos no gafanhoto (ambos so derivados do neuroblastos 1-1) que tm destinos muito diferentes. Alm disso, conjuntos diferentes de axnios aderem a cada um deles, criando feixes independentes de axnio, chamados fascculos. A especificidade dessa fasciculao depende da presena da protena fasciclina I. Essa protena encontrada nos dois neurnios aCC de cada segmento do embrio de 10 horas, mas no est presente nos neurnios pCC. Perto da hora 11, porm, outros neurnios (mas no pCC) so vistos expressar essa molcula da superfcie celular. Esses neurnios so precisamente aqueles (RP1, RP2, U1, U2 ) cujos axnios fasciculam com aCC. Existem pelo menos quatro molculas de fasciclina expressas em diferentes subconjuntos de neurnios, e cada uma dessas molculas permite aos cones de crescimento de certos neurnios reconhecer especificamente aqueles axnios com os quais iro fascicular (Harrelson e Goodman, 1988; Zinn et al., 1988). Em outros animais com sistemas nervosos relativamente simples, tal como a sanguessuga, existe evidncia de que cada neurnio teria molculas de superfcie celular qualitativamente diferentes e que essas molculas poderiam ser importantes na especificidade sinptica. O sistema nervoso da sanguessuga consiste de 34 gnglios
317
(A)
(B)
Figura 8.9
pareados contendo cerca de 400 neurnios cada. Foram identificados neurnios individuais, e as funes de muitos desses neurnios so conhecidas. Zipser e Mckay (1981) injetaram o sistema nervoso da sanguessuga em camundongos e obtiveram centenas de anticorpos monoclonais que se ligaram a vrias regies do sistema nervoso. Em alguns casos, essas diferenas puderam ser correlacionadas com funo. O anticorpo monoclonal Lan 3-1 se ligou especificamente a um nico par de neurnios em cada um dos gnglios do corpo mediano (Figura 8.9). Esses pares de neurnios so conhecidos por controlar o processo da everso peniana nas sanguessugas em copulao. Outro anticorpo monoclonal, Lan 3-2, reconheceu todos os quatro neurnios em cada gnglio, que respondem a estmulos mecnicos nocivos. A situao, de acordo com Zipser e Mckay parece bastante anloga a cabos eltricos codificados por cores contendo muitos fios, onde cada fio tem sua prpria molcula (corante) para facilitar o reconhecimento apropriado e conexo terminais. Estudos sobre trajetrias marcadas especificamente em vertebrados esto muito atrasados em comparao com aqueles em invertebrados, mas estudos recentes nos neurnios motores do peixe-zebra indicam que as trajetrias marcadas tambm funcionam aqui. O peixe-zebra poder tornar-se o organismo de escolha em neurobiologia desenvolvimental em vertebrados, porque tem desenvolvimento muito rpido, muitos indivduos podem ser comparados, e os embries so transparentes, permitindo aos neurobiologistas observar o crescimento dos axnios em embries vivos. Neurnios podem ser identificados pela injeo de substncias marcadas por fluorescncia em percursores neuroniais (Kimmel e Law, 1985), e o crescimento axnico pode ser seguido visualmente ou por registro em vdeo. Eisen e colegas (1986) observaram o alongamento axnico de trs neurnios motores pioneiros nesses embries. Aps deixar a medula espinhal, todos os trs seguiram o mesmo caminho ao longo de um msculo at alcanarem um determinado local no embrio. Nesse ponto, eles divergiram em trs trajetrias especficas levando aos msculos apropriados. A hiptese das trajetrias marcadas tem sido extremamente importante tanto como modelo para a gerao de pesquisas, como em um contexto no qual podem ser inseridos dados existentes sobre a especificidade neuronial. Orientao pela Repulso Especfica de Cones de Crescimento Alm da adeso especfica existe tambm a possibilidade da repulso especfica pela matriz extracelular. Axnios dos neurnios dos gnglios da raiz dorsal do tronco passam somente atravs da parte anterior da rea de cada somito (assim como as clulas da crista neural iro migrar somente atravs dessas regies e no das regies posteriores)
Neurnios funcionais especficos corados por anticorpos monoclonais para componentes da superfcie celular. (A) Anticorpos Lan 3-1 reconhecem um nico par de neurnios em um determinado gnglio. Esses neurnios funcionam na everso peniana. (B) Um conjunto de neurnios reconhecidos pelos anticorpos Lan 3-2; esses neurnios respondem estimulao nociva da pele da sanguessuga. (de Zipser e Mckay, 1981, cortesia de B. Zipser.)
318
(A)
Esclertomo
Tubo neural (B)
Notocorda (C)
Figura 8.10
Repulso de cones de crescimento de gnglios da raiz dorsal. (A) Padro segmentado do crescimento axnico atravs do mesoderma somtico. Axnios (corados de negro com tetrxido de zinco) movemse atravs da poro anterior de cada somito, mas no da posterior. O limite entre anterior e posterior est assinalado com uma estrela. (B) Cone de crescimento de um axnio do neurnio ganglionar da raiz dorsal crescendo sobre laminina. Seus lamelipdios e filipdios podem ser facilmente visualizados. (C) Cone de crescimento colapsado de um neurnio ganglionar da raiz dorsal quando a protena inibitria foi adicionada cultura. (A segundo Keynes e Stern, 1984; B e C segundo Raper e Kapfhammer, 1990. Todas as fotografias cortesia dos autores.)
(Figura 8.10A). A superfcie celular da poro posterior do somito pode estar inibindo essa migrao. Davies e colegas (1990) mostraram que membranas isoladas da poro posterior do somito causam o colapso dos cones de crescimento dos neurnios dos gnglios da raiz dorsal (Figura 8.10B,C). Alm disso, eles isolaram uma frao de glicoprotena da soma de pinto, que causa o colapso desses cones; e os componentes dessa frao so especificamente encontrados na poro posterior dos somitos. Em insetos, a semaforina I (tambm conhecida como fasciculina IV) uma protena transmembrana que expressa em uma banda de clulas epiteliais no membro em desenvolvimento. Essa protena parece inibir os cones de crescimento dos neurnios sensoriais Ti1 moverem-se para frente, levando-os a se virarem (Figura 8.11; Kolodkin et al., 1992, 1993).
Figura 8.11
G-Sema I
A ao da semaforina I no membro em desenvolvimento do gafanhoto. Axnios de neurnios sensoriais Ti1 se projetam para o sistema nervoso central (CNS). (As longas flechas escuras representam etapas seqenciais do caminho.) Quando encontram a banda de clulas epiteliais expressando semaforina-I, eles reorientam seus cones de crescimento e se extendem ventralmente ao longo da borda distal das clulas expressando a semaforina I. Quando seus filipdios se conectam ao par de clulas Cx1, eles atravessam a borda e se projetam para o CNS. Quando a semaforina bloqueada por anticorpos, os cones de crescimento procuram aleatoriamente as clulas Cx1. (Segundo Kolodkin et al., 1993.)
Ti1 Membro em Desenvolvimento CNS
Cordo nervoso ventral
319
&
Especulaes
Sexo, Odor e Adeso Especfica

da Universidade Johns Hopkins (1898), o psiquiatra alemo Wilhelm Fliess (1887) e o sexologista vienense Richard Von Krafft-Ebing (1886) compartilharam a viso errnea de que havia semelhanas entre o desenvolvimento do pnis e do nariz. Todos trs investigadores usaram o mesmo estudo de caso como evidncia; o relato de um homem que no tinha sensao de olfato ausncia de nervos olfativos ou nasais e cujos rgo genitais eram muito menores que o normal. Tais pessoas so agora conhecidas por ter a sndrome de Kallmann, uma doena ligada ao X, caracterizada por anosmia (sem sensao de olfato), genitlia pequena e gnadas estreis. A anosmia devida a falta de neurnios cerebrais que recebem influxo de axnios oriundos de neurnios nasais. As gnadas e a genitlia pequenas so resultado da falta do hormnio liberador de gonodotrofina (GnRH). GnRH um hormnio peptdico secretado pelo hipotlamo que instrui a hipfise anterior a secretar o hormnio luteinizante, necessrio para o desenvolvimento das gnadas e amadurecimento genital. O que une esses dois problemas? Em 1989, dois laboratrios
M FINAIS DO SCULO DEZENOVE, o professor John Mackenzie
(Schwanzel-Fukada e Pfaff, 1989; Wray et al., 1989) fizeram a supreendente descoberta que os neurnios secretores de GnRH no se originavam no hipotlamo. Ao contrrio, eles se originavam no epitlio olfativo (o rgo vomeronasal) no rudimento nasal e migravam para a regio hipotalmica do crebro durante o desenvolvimento fetal (Figura 8.12). Os neurnios receptores olfativos do nariz originam-se do mesmo lugar. Os axnios dos neurnios receptores olfativos penetram no crebro para fazer sinapse com o bulbo olfativo, enquanto os corpos celulares desses neurnios permanecem no nariz em desenvolvimento. Pacientes com a sndrome de Kallmann no tm bulbo olfativo no crebro, pois o desenvolvimento desse bulbo requer inervao dos neurnios olfativos (Stout e Gradziadi, 1980). O defeito na sndrome de Kallmann pode ser atribudo falncia dos neurnios secretores de GnRH e dos cones de crescimento dos neurnios olfativos que migram para o crebro de origem do placdio olfativo (Scwanzel-Fukada et al., 1989). Admite-se que o axnios olfativos
Figura 8.12
migrem primeiro e que os neurnios secretores de GnRH sigam os fascculos do nervo olfativo para dentro do crebro (Livne et al., 1993). O gene cuja ausncia ou anormalidade causa a sndrome foi clonado, e sua seqncia de cDNA prediz uma protena de adeso celular da superfamlia das imunoglobulinas (Franco et al., 1991; Legouis et al., 1991). Membros dessa classe de protenas so conhecidas por mediar adeso clula-clula ou axnioaxnio (Grumet, 1991), e eles incluem NCAM, L1, LFA-1, CD4, fascilina II, contactina e neurogliana. A protena da sndrome de Kallmann tambm contm regies que se assemelham molcula de fibronectina, uma molcula da matriz extracelular de importncia crtica para numerosas migraes celulares durante o desenvolvimento. No entanto, os testes para verificar se essa protena se encontra nos trajetos seguidos pelas clulas migratrias e se os axnios alongam-se do epitlio olfativo, no foram ainda realizados em mamferos; tampouco determinou-se se os axnios ou clulas dessa regio realmente se ligam essa protena.
Modelo para a etiologia da sndrome de Kallmann. Na ilustrao esquerda, neurnios sensoriais do epitlio olfativo estendem axnios para o bulbo olfativo do crebro. Na sndrome de Kallmann, o bulbo olfativo degenerou, e essa perda considerada secundria carncia de axnios dos neurnios sensoriais. A srie de cortes sagitais da cabea de camundongos embrionrios mostra a migrao de neurnios secretores de GnRH (colorido) do primrdio nasal para dentro da poro hipotalmica do crebro. Essa migrao no ocorre na sndrome de Kallmann. (Segundo Calof, 1992.)
Bulbo olfativo Epitlio Olfativo Hipotlamo rea pr-ptica
Lobo Frontal
Bulbo olfativo
Lngua
Cavidade Nasal
Epitlio olfativo Clula neurossensorial secundria
Nariz Dia 11 Dia 13 Dia 14
Maxilar Dia 15
Clula neurossensorial primria
320
(A)
Seleo de trajetria: Orientao por molculas difusveis

Gradiente de netrina-2
Neurnio comissural
Gradiente de netrina-1 Placa do assoalho (B)
Placa do assoalho
Figura 8.13
Trajetria dos axnios comissurais da medula espinhal do rato. (A) Desenho esquemtico de um modelo onde os neurnios comissurais experienciam pela primeira vez um gradiente de netrina-2 e depois um gradiente mais ngrime de netrina-1. Os axnios comissurais so guiados quimiotaticamente em direo ventral descendo a margem lateral da medula espinhal em direo placa do assoalho. Ao ating-la, os axnios comissurais mudam sua direo devido conduo por contato das clulas do assoalho. (B) Localizao auto-radiogrfica do mRNA de netrina-1 pela hibridizao in situ para o crebro de um embrio de rato de 16 dias usando RNA antisenso. A hibridizao d um intenso sinal dos neurnios da placa de assoalho. (B de Kennedy et al., 1994; fotografia cortesia de M. Tessier-Lavigne.)
A idia de que sinais quimiotticos guiam os axnios no sistema nervoso em desenvolvimento foi primeiro proposta por Ramn y Cajal (1982). Ele sugeriu que os neurnios comissurais da medula espinhal poderiam viajar de suas posies dorsais para a placa ventral do assoalho por meio de fatores difusveis. Os axnios desse neurnio comeam a crescer ventralmente abaixo do lado do tubo neural. Porm, aproximadamente a dois-teros do caminho, sua direo muda, e eles se projetam atravs da rea do neurnio (motor) ventrolateral do tubo neural em direo s clulas da placa do assoalho (Figura 8.13). [axon1.html], [axon5.html] Em 1994, Serafini e colegas desenvolveram um ensaio que lhes iria permitir selecionar tais molculas difusveis. Quando explantes da medula espinhal dorsal foram colocados sobre placas de colgeno, a presena de clulas da placa de assoalho nas proximidades promoveria o crescimento dos axnios comissurais desses explantes. Serafini e seus colegas tomaram fraes de crebro de embries de pinto e homogenaram e testaram essas fraes para ver se alguma de suas protenas imitaria essa atividade. Isso resultou na identificao de duas protenas, netrina-1 e netrina-2. Netrina-1 produzida e secretada pelas clulas da placa de assoalho, enquanto netrina-2 sintetizada na regio mais inferior da medula espinhal, mas no na placa de assoalho (veja Figura 8.13). Os efeitos quimiotticos dessas netrinas foram mostrados pela transformao de clulas COS (que em geral no produzem essas protenas) com um vetor contendo um gene netrin ativo (Kennedy et al., 1994). Agregados das clulas COS secretoras de netrina provocaram o crescimento do axnio comissural de explantes da espinha dorsal do rato, enquanto aquelas clulas COS tratadas com o vetor sem o gene netrin ativo no provocaram tal atividade (Figura 8.14). Ambas netrinas se associam matriz extracelular.* possvel que os neurnios comissurais primeiro encontrem um gradiente de netrina-2, que os trazem para os domnios do gradiente mais ngreme da netrina-1 (veja Figura 8-13). As netrinas tm numerosas regies de homologia com UNC-6, uma protena envolvida no direcionamento da migrao circunferencial de axnios ao redor do corpo de Caenorhabditis elegans. No nematide de tipo selvagem, a UNC-6 induz axnios de certas posies centrais a moverem-se ventralmente, e isso induz alguns corpos celulares localizados ventralmente a estenderem o axnio dorsalmente (Figura 8.15). Em mutaes de perda-de-funo do gene unc-6, nenhum desses movimentos axnicos ocorre (Hedgecock et al., 1990; Ishii et al., 1992; Hamelin et al., 1993). Mutaes do gene unc-40 interrompem a migrao axnica ventral (mas no a dorsal), enquanto mutaes do gene unc-5 somente previnem a migrao dorsal. Culotti (1994) props que a protena UNC-6 pode atrair o conjunto de axnios que sintetiza UNC-40 e repelir os axnios que produzem UNC-5. Estudos recentes (Wadsworth et al., 1996) mostram que a UNC-6 restrita espacialmente s clulas mais ventrais da hipoderme (pele) e sistema nervoso, e que as propriedades atrativas e repulsivas dessa molcula so mediadas pelas regies diferentes da protena. Alm disso, os sinais da netrina tambm guiam clulas mesodrmicas assim como axnios.** Se a UNC-6 atrativa para certos neurnios e repulsiva para outros, poder-se-ia pensar que esse duplo papel tambm seria atribudo s netrinas. Colamarino e TessierLavigne (1995) mostraram que isso o caso observando a trajetria do nervo troclear
*A ligao de um fator solvel matriz extracelular cria uma ambigidade interessante entre quimiotaxia, haptotaxia e trajetrias marcadas. A natureza no se conforma necessariamente s nossas categorias. **No somente UNC-6 homloga netrina, mas UNC-40 homloga ao receptor de netrina dos mamferos e da Drosophila (Chan et al., 1996; Keino-Masu et al., 1996; Kolodziej et al., 1996). Em todos os tipos de organismos, a molcula de netrina parece proporcionar orientao para a migrao de clulas portando seu receptor.
321
(A)
(B)
Figura 8.14
(C)
(D)
Agregados de clulas COS secretando netrinas provocam o crescimento de axnios comissurais oriundos de explantes de medula espinhal dorsal de embrio de rato de 11-dias. (A) O crescimento do neurnio comissural visto quando o explante da medula espinhal dorsal (tecido superior) encontra um explante da placa do assoalho. (B) No h crescimento quando o explante dorsal exposto s clulas COS agregadas que foram transfectadas com o vetor clonador somente (sem o gene netrin). (C,D) Crescimentos de neurnios comissurais de clulas COS agregadas, que estavam expressando o gene para netrina-1 (C) e para netrina -2 (D). Sua identidade como neurnios comissurais foi confirmada por imunohistologia mostrando antgenos especficos das comissuras nesses axnios. (Barra de escala, 100 m.) (de Kennedy et al., 1994; fotografias cortesia de M. Tessier-Lavigne.)
(quarto craniano). Em seu caminho para inervar um msculo do olho, os axnios do nervo troclear se originam na placa do assoalho do pednculo cerebral e migram dorsalmente afastando-se da regio da placa dorsal. Essa trajetria mantida quando as regies do pednculo cerebral so explantadas para gis de colgeno. O crescimento dorsal dos neurnios trocleares pode ser impedido colocando as clulas da placa do assoalho ou clulas COS secretoras de netrina-1 dentro de 450m da poro dorsal do explante. Esse crescimento dorsal no foi impedido pelos explantes dorsais do tubo neural ou pelas clulas COS que no continham o gene netrim-1 ativo (Figura 8.16). Portanto, netrinas e UNC-6 parecem ser quimiotticas para certos neurnios e quimiorepulsivas para outros. A famlia semaforina compreende outro conjunto de molculas quimiorepulsivas (ainda no foram encontrados membros atrativos nessa famlia). A semaforina I encontrada em insetos e uma protena ligada membrana que inibe a ramificao dos axnios quando a encontram em um membro (Kolodkin et al., 1992). A semaforina secretada em Drosophila por nico grande msculo torcico. Dessa maneira, o msculo torcico previne a si mesmo de ser inervado por axnios inapropriados (Matthes
322
Figura 8.15
Expresso de UNC e funo na conduo axnica. (A) No corpo do embrio do tipo selvagem de C.elegans, neurnios sensoriais projetam-se ventralmente e neurnios motores projetam-se dorsalmente. Os epidermoblastos da parede ventral do corpo expressando unc-6 so preenchidos. (B) Nos embries mutantes unc-6 no ocorre migrao alguma. (C) As mutaes de perda-defuno unc-5 somente afetam os movimentos dorsais dos neurnios motores. (D) As mutaes de perda-de-funo unc-40 somente afetam a migrao ventral dos cones de crescimento sensoriais. (Segundo Goodman, 1994.)
C. elegans (A) (B)
neurnios sensoriais de unc 40+
Tipo selvagem
Epidermoblastos da parede ventral do corpo (C)
Neurnios motores unc5+
(D)
et al., 1995). A semaforina III, encontrada em mamferos e aves, tambm conhecida como colapsina (Luo et al., 1993). Essa protena secretada causa o colapso de cones de crescimento originrios dos gnglios da raiz dorsal (veja Figura 8.10C). H vrios tipos de axnios nos gnglios da raiz dorsal que penetram na medula espinhal dorsal. A maioria desses axnios impedida de viajar adiante e de penetrar a medula espinhal ventral. Entretanto, um subconjunto desses neurnios viaja ventralmente atravs das clulas neurais (Figura 8.17). Esses neurnios particulares (responsivos NT-3) no so inibidos pela semaforina III, enquanto os outros neurnios o so (Messersmith et al., 1995). Isso sugere que semaforina/colapsina padronizam as projees sensoriais dos gnglios da raiz dorsal repelindo seletivamente axnios para que terminem dorsalmente.
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 8.16
Netrina inibe o crescimento de axnios trocleares da medula espinhal dorsal. Axnios trocleares, corados para antgeno especfico do axnio troclear, emergem dorsalmente e no so inibidos pelo explante de medula espinhal dorsal (A) ou pelas clulas COS (B). Eles so inibidos pelas clulas COS secretando netrina-1 (C) ou pela placa do assoalho da medula espinhal (D). (Segundo Colamarino e Tessier-Lavigne, 1995; fotografias cortesia de M. Tessier-Lavigne).
323
(A)
Gnglio da raiz dorsal
Neurnios aferentes Ia (responsivos NT-3) Aferente para mecanorreceptores de baixo limiar Receptores de temperatura e dor (B)
Figura 8.17
Semaforina III como inibidor seletivo de projees axnicas para a medula espinhal ventral. (A) Trajetria de axnios em relao expresso de semaforina III na medula espinhal do embrio de rato de 14 dias. Os neurnios responsivos neurotrofina-3 podem viajar para a regio ventral da medula espinhal, mas os neuritos aferentes para os mecanorreceptores e neurnios receptores de temperatura e dor terminam dorsalmente. (B) Clulas COS secretoras de semaforina III inibem o crescimento de axnios mecanorrecepores (aqui mostrados crescendo num meio tratado com NGF, mas inibidos de crescer em direo fonte de semaforina III). (C) Os neurnios que so responsivos NT-3 para crescimento no so inibidos de se estenderem em direo fonte de semaforina III. (A segundo Marx, 1995; B e C segundo Messersmith et al., 1995; fotografias cortesia de A. Kolodkin.)
Sinais para conduo mltipla

Vertebrados Neurnios Motores Vertebrados Um dos mais importantes programas de pesquisa em neurobiologia do desenvolvimento refere-se inervao dos msculos dos membros. Crescimento axnico de neurnios motores ocorre muito cedo no desenvolvimento, antes da soma dos neurnios motores ter migrado para suas posies definitivas na medula espinhal e antes dos msculos terem se condensado fora do mesnquima (Landmesser, 1978; Hollyday, 1980a). Esse estgio pode ser visto na Figura 8.18. Para inervar a musculatura dos
Tubo neural (medula espinhal) Nervos espinhais
Rudimento renal Intestino Broto de membro
Figura 8.18
Sulco ectodrmico apical
Micrografia eletrnica de varredura de um corte de um embrio de pinto de 4-dias, mostrando a emergncia de nervos espinhais para dentro do broto do membro em desenvolvimento. (de Tosney e Landmesser, 1985, cortesia de K.Tosney.)
324
(A) Neurnios motores e
Medula espinhal
(B) Barreira Esclertomo posterior
Nervos epaxiais (para o dorso)
Trajetria Esclertomo dorso-anterior
Plexo
Nervo espinhal Tronco nervoso dorso-anterior Barreira Mesnquima perinotocordal Trajetria Mesnquima do plexo
Barreira precursor do cinturo plvico
Tronco nervoso ventroanterior
Nervo do msculo
Figura 8.19
Trajetrias de axnios motores na regio do membro posterior do embrio do pinto. (A) Padro neural do membro posterior. Axnios do neurnio motor unem-se no plexo e em seguida se separam em troncos nervosos dorsal e ventral. Um plexo anterior; o outro, posterior. (B) Os componentes ambientais que criam o padro neural. A segmentao dos nervos espinhais criada pelo esclortomo. O esclertomo dorsal anterior permite a migrao, enquanto o esclertomo dorsal posterior e todo o ventral (o mesnquima perinotocordal) uma barreira para os axnios do nervo motor. O plexo mesenquimatoso permissivo, mas o cinturo plvico forma uma barreira. Os dois orifcios nessa barreira permitem a passagem e extenso dos troncos nervosos. (Segundo Tosney, 1991.)
membros, o axnio se estende sobre centenas de clulas em um ambiente complexo e cambiante. Pesquisa recente descobriu vrias trajetrias e vrias barreiras que ajudam a conduo dos axnios para seus destinos apropriados. Conforme mencionado acima, em cada lado da medula espinhal h blocos de tecido mesodrmico chamados somitos. Pouco antes dos axnios iniciarem seu alongamento, o somito se cinde em dois tipos de tecido. A poro dorsal torna-se o dermomitomo (que produz a derme e a musculatura do dorso), enquanto a poro ventral do somito passa a ser o esclertomo (que produz a cartilagem vertebral). Lateralmente aos somitos, na base do broto do membro, est o mesnquima do plexo e as prospectivas clulas do cinturo escapular. Os corpos celulares dos neurnios motores esto nas regies ventrolaterais do tubo neural (Figura 8.19). Axnios dos neurnios motores que iro inervar os msculos dos membros esto misturados quando emergem da medula espinhal. Populaes de axnios de vrios nveis segmentais da medula espinhal podem formar um nervo espinhal comum. Esses nervos espinhais se renem em um plexo. Nesses plexos, porm, os axnios de diferentes regies percorrem trajetrias diferentes. Por exemplo, na Figura 8.19, neurnios motores para msculos diferentes divergem para apropriados troncos nervosos e finalmente se projetam para msculos singulares. Por meio de vrias manipulaes cirrgicas foram descobertas, no embrio precoce do pinto, alguns dos sinais ambientais que direcionam essa migrao. A parte ventral do esclertomo que circunda a notocorda forma uma barreira contra o alongamento do axnio motor. Apesar das clulas nessa regio parecerem soltas e facilmente evitadas, elas repelem os axnios em sua vizinhana. Quando o tubo neural girado para fazer com que os neurnios motores emerjam ventralmente para essa regio, eles imediatamente giram para evit-la, migrando somente atravs do esclertomo dorsal anterior (Figura 8.19B). Assim, o esclertomo perinotocordal uma barreira para o crescimento do axnio motor, enquanto o esclertomo anterior dorsal uma trajetria (Tosney e Oakley, 1990; Tosney, 1991). Os axnios que progredirem atravs do esclertomo dorsal anterior (juntamente com as clulas da crista neural que seguem pela mesma rota) chegam ao plexo mesenquimatoso na base do broto do membro, tambm um ambiente favorvel para o crescimento axnico. Porm, pouco alm do mesnquima do plexo ficam as clulas precursoras do cinturo plvico. Essas clulas inibem o crescimento axnico e os axnios se afastam delas. H dois orifcios no tecido precursor do cinturo plvico cheios de plexo mesenquimatoso; axnios se estendem por esses orifcios para formar os troncos nervosos anterior e
325
posterior que penetram no membro. Se outros orifcios forem feitos esperimentalmente no tecido precursor do cinturo plvico, os axnios os atravessam prontamente (Tosney e Landmesser, 1984, 1985). Os nervos podem at mesmo alcanar seus respectivos destinos se as clulas formadoras de msculos tiverem sido removidas (Phelan e Hollyday, 1990), e provvel que as outras clulas mesenquimatosas no broto do membro (tal como aquelas que formam a derme ou a cartilagem) estejam provendo os sinais direcionais. Essas trajetrias para as regies musculares dos membros parecem ser muito bem definidas. Quando se redireciona axnios de uma origem diferente (como um gnglio diferente) para o membro, eles se ramificam como o fazem os axnios que originalmente inervaram o membro. Em outras palavras, o membro capaz de ditar o padro de inervao para um conjunto de axnios que normalmente no o penetrariam (Hamburger, 1939; Hollyday et al., 1977). Ainda mais, se segmentos da medula espinhal do pinto forem revertidos fazendo com que seus neurnios motores se encontrem em novas localizaes, seus axnios iro encontrar seus alvos originais (veja Figura 8.3; Lance-Jones e Landmesser, 1980). No entanto, quando membros se desenvolvem com reas duplicadas (como duas coxas), os neurnios inervando a segunda coxa no sero neurnios especficos da coxa, mas neurnios que usualmente inervam a panturrilha (Whitelaw e Holliday, 1983). Esses experimentos apresentam um paradoxo ainda a ser resolvido: Axnios particulares esto predispostos a crescer para lugares especficos; no entanto, axnios de pools de neurnios motores diferentes podem substituir um outro no estabelecimento de padres nervosos normais (Purves e Lichtman, 1985). A explicao mais plausvel que vrios mecanismos atuam simultaneamente para assegurar que os axnios cheguem a seus lugares apropriados. Um desses mecanismos parece ser a conduo da superfcie celular de clulas mesenquimatosas no formadoras de msculos no broto do membro, enquanto outro mecanismo provavelmente envolve a quimiotaxia de mioblastos do broto do membro (Goodman e Shatz, 1993). Axnios da Retina Tambm se postularam sinais de orientao mltipla para explicar como neurnios retinianos individuais so capazes de enviar axnios para a rea apropriada do crebro, mesmo quando transplantados para longe do nervo ptico (Harris, 1986). Essa capacidade indica que os sinais de orientao no esto distribudos somente ao longo da trajetria normal, mas existem atravs de todo o crebro embrionrio. Orientar um axnio de um corpo celular nervoso para seu destino atravs do embrio um fenmeno complexo, e vrios tipos de sinais diferentes podem ser usados simultaneamente para assegurar que sejam estabelecidas as conexes corretas. Os primeiros passos para levar os axnios retinianos para suas regies especficas no tectum ptico se realizam no interior da retina (Figura 8.20A). medida que as clulas ganglionares retinianas se diferenciam, sua posio na margem interna da retina determinada pelas molculas de caderina (N-caderina assim como a R-caderina especfica da retina) das suas membranas celulares (Matsunaga et al., 1988; Inuzuka et al, 1991). Os axnios dessas clulas crescem ao longo da superfcie interna da retina em direo cabea do nervo ptico (Figura 8.20B). A adeso e o crescimento dos axnios das clulas da retina podem ser controlados pela lmina basal contendo laminina. Porm, a fixao laminina no pode explicar o direcionamento do crescimento. possvel que um gradiente da molcula inibidora do proteoglicano de sulfato de condroitina da matriz extracelular tenha um papel na especificao da direo do crescimento (Hynes e Lander, 1992). Quando os axnios penetram no nervo ptico, eles crescem sobre as clulas gliais em direo ao crebro. Estudos in vitro sugerem que numerosas molculas de adeso celular N-CAM, caderinas e integrinas tm funes na orientao do axnio para o tectum ptico (Neugebauer et al., 1988). N-CAM parece ser especialmente importante aqui, pois a migrao direcionada dos cones de crescimento ganglionares retinianos
326
(A) Estabelecimento das camadas retinianas

(clulas ganglionares na superfcie interna) Anti-N-caderina causa desarranjo
(B) Retina
Crescimento axnico direcionado

Anti-N-CAM interfere Forte crescimento neurtico em laminina in vitro
(C) Progresso organizada para o nervo ptico Nervo ptico (D)

Anti-N-CAM rompe. Possveis papis para laminina e caderinas. Enfeixamento axnico especfico para posio
Trato ptico
Deciso de atravessar ou girar

Possveis sinais inibidores e especificidade da fasciculao
(E) Voltando para a regio alvo

Possvel papel para laminina. Sinais para a posio global
(F)
Chegada ao alvo
Perda de laminina in vivo Perda de resposta laminina in vitro
Te c t um
(G)
ptic o
Estabelecimento de um mapa topogrfico

Inibidores especficos para posio. Possibilidade de outros sinais graduados
Figura 8.20
Sinais para a orientao mltipla direcionam o movimento dos axnios dos gnglios retinianos para o tectum ptico. (Segundo Hynes e Lander, 1992.)
dependem dos ps terminais gliais expressando N-CAM na superfcie interna retiniana (Figura 8.20C; Stier and Schlosshauer, 1995). Ao chegar no nervo ptico, os axnios fasciculam com axnios que j esto presentes. N-CAM tambm crtica para essa fasciculao, e anticorpos contra N-CAM (ou remoo do seu componente polisilico) faz com que os axnios entrem no nervo ptico de maneira desordenada, causando-os a emergir em posies erradas no tectum (Thanos et al., 1994; Yin et al., 1995). Ao entrar no crebro, os axnios retinianos de mamferos atingem o quiasma ptico, onde eles tm que decidir se iro continuar diretamente em frente ou se giram 90 e entram do outro lado do crebro (Figura 8.20D). Parece que aqueles axnios no destinados a atravessar para o outro lado do crebro, so repelidos de assim o fazerem quando entram no quiasma (Godement et al., 1990); a base molecular dessa repulso no conhecida. No trajeto para o tectum ptico, os axnios viajam por uma via (o trato ptico), sobre clulas gliais cujas superfcies so recobertas por laminina (Figura 8.20E). Muito poucas reas no crebro tm laminina, e a laminina nesse trajeto existe somente quando as fibras do nervo ptico esto nele crescendo (Cohen et al., 1987). O axnio que migra da retina para o tectum encontra numerosas outras clulas e alvos potenciais para inervao. No entanto, a combinao de vrios sinais de orientao, provavelmente envolvendo tanto atrao como repulso, orientam o axnio ao longo de seu caminho. Nesse ponto, os axnios retinianos alcanaram a regio ptica do crebro (Figura 8.29F), e comea a seleo de alvos.
Seleo de alvos
Quando os axnios chegam ao fim desse trajeto forrado de laminina, eles se espalham e acham seus alvos especficos. Estudos em rs e peixes (onde os neurnios retinianos de cada olho se projetam para o lado oposto do crebro) indicaram que cada axnio retiniano envia seu impulso para um local especfico (uma clula ou
327
TECTUM DIREITO
TECTUM ESQUERDO
Rostral
Caudal
Dorsal
Dorsal
Posterior
Campo visual direito
Campo visual esquerdo
Ventral OLHO ESQUERDO
Ventral OLHO DIREITO
Figura 8.21
Mapa da projeo retinotectal normal no Xenopus adulto. O olho direito inerva o tectum esquerdo, e o olho esquerdo inerva o tectum direito. Os nmeros nos campos visuais (retina) e os tecta mostram regies de correspondncia; isto , estimulao do ponto 15 na retina direita envia impulsos eltricos para a regio tectal esquerda 15. As flechas negras e coloridas sumariam o padro das conexes retinotectais. (de Jacobson, 1967.)
pequeno grupo de clulas) dentro do tectum (Sperry, 1951). Como mostra a Figura 8.21, existem dois tecta ptico no crebro da r. Os axnios do olho direito entram no tectum ptico esquerdo, enquanto aqueles do olho esquerdo formam sinapses com as clulas do tectum ptico direito. O crescimento de neurnios no trato ptico de Xenopus parece ser mediado por fatores de crescimento fibroblstico secretados pelas clulas forrando o trato. Os axnios ganglionares retinianos expressam receptores FGF nos seus cones de crescimento. Porm, medida que as clulas ganglionares atingem o tectum, a quantidade de FGF diminui, talvez retardando os axnios e permitindo-lhes achar seus alvos (McFarlane et al., 1995). O mapa das conexes retinianas at o tectum ptico da r (a projeo retinotectal) foi detalhada por Marcus Jacobson (1967). Jacobson definiu esse mapa lanando um estreito feixe de luz numa regio pequena e limitada da retina e anotou, por meio de um eletrodo registrador no tectum, quais clulas tectais estavam sendo estimuladas. A projeo retinotectal de Xenopus laevis mostrada na Figura 8.21. A luz iluminando a parte ventral da retina estimula clulas na superfcie lateral do tectum. Da mesma maneira, luz focalizada na parte posterior da retina estimula clulas na poro caudal do tectum. Esses estudos demonstraram uma correspondncia ponto-por-ponto entre as clulas da retina e do tectum. Quando um grupo de clulas da retina ativado, um grupo muito pequeno e especfico de clulas tectais estimulado. Podemos tambm observar que os pontos formam um contnuo; em outras palavras, pontos adjacentes na retina se projetam sobre pontos adjacentes no tectum. Esse arranjo permite r ver uma imagem inteira. Essa intrincada especificidade levou Sperry (1965) a lanar a hiptese da quimioafinidade: Os complicados circuitos das fibras nervosas cerebrais crescem, se juntam e se organizam atravs de intricados cdigos qumicos sob controle gentico. No incio do desenvolvimento, as clulas nervosas, contadas em milhes, adquirem
Posterior
Anterior
328
Nmero de clulas retinianas dorsais marcadas com 32p aderindo metade tectal
e retm depois disso, tarjas de identificao individual, de natureza qumica, pelas quais podem ser distinguidas e reconhecidas de outras. Teorias atuais no propem uma especificidade ponto-para-ponto entre cada axnio e o nervo contatado. Ao contrrio, a presente evidncia demonstra que gradientes de adesividade (em especial aqueles envolvendo a repulso) tm um papel na definio de territrios nos quais os axnios entram e que a competio gerada pela atividade entre esses neurnios determina a conexo final de cada axnio.* Tectum Regies Adesivas Especificidades Adesivas em Diferentes Regies do Tectum Existe boa evidncia que as clulas ganglionares retinianas podem distinguir entre as regies do tectum. Clulas preparadas da metade ventral da retina neural do pinto aderem-se preferencialmente s metades dorsais do tectum (Figura 8.22; Roth e Marchase, 1976). Gottlieb e colaboradores (1976) acharam que neurnios retirados da parte mais dorsal da retina do pinto aderem-se preferencialmente poro mais ventral do tectum e que os neurnios do extremo ventral da retina aderem-se preferencialmente aos extremos mais dorsais do tectum. Esses resultados foram confirmados sob outras condies experimentais usando extremidades axnicas em lugar de neurnios inteiros (Halfter et al., 1981). Um gradiente que foi identificado funcionalmente um gradiente de repulso que mais alto no tectum posterior e mais fraco no tectum anterior. Bonhoeffer e colegas (Walter et al., 1987) prepararam um tapete de membranas tendo tiras alternadas derivadas dos tecta posterior e anterior. Eles deixaram, ento, clulas das regies nasal (anterior) ou temporal (posterior) da retina estenderem axnios nesse tapete. As clulas ganglionares da poro nasal da retina estendem axnios igualmente bem nas membranas anterior e posterior do tectum. Os neurnios do lado temporal da retina, porm, estenderam axnios somente nas membranas tectais anteriores (Figura 8.23). A base dessa especificidade parece ser o fator repulsivo nas membranas das clulas tectais posteriores. Quando o cone de crescimento de um axnio retiniano temporal contata a membrana da clula tectal posterior, os filopdios do cone se retraem, e o cone de crescimento entra em colapso e se retrai (Cox et al., 1990). Baier e Bonhoffer (1992) demonstraram que um gradiente de uma substncia inibidora isolada da poro posterior do tectum capaz de guiar os axnios temporais da retina. Duas dessas molculas repulsivas foram identificadas em embries de pinto. Chamadas RAGS (sinal repulsivo de orientao axnica) e ELF-1 (famlia ligante de Eph 1), esto presentes num gradiente caudal-para-rostral atravs do tectum, e a protena clonada capaz de repelir axnios (Figura 8.24; Drescher et al., 1995). RAGS e ELF-1 revelaram ser ligantes para uma famlia de tirosina quinases receptores chamadas Quinases receptoras Eph. Essas quinases foram encontradas nas clulas ganglionares da retina do pinto, e elas so expressas em um gradiente temporalpara-nasal ao logo dos axnios da retina (Cheng et al., 1995). Parece haver vrios receptores Eph na retina e ligantes no tectum que podem ter o papel de empurra-epuxa na orientao dos axnios retinianos temporais para o tectum anterior e permitir os axnios retinianos se projetarem para a poro posterior do tectum.
Tempo de coleta (horas)
Figura 8.22
Adeso diferencial de clulas dorsais radioativas da retina do pinto s metades tectais dorsal e ventral. Clulas radioativas da metade dorsal de retinas de pinto de 7 dias foram adicionadas s metades dorsal (cor) e ventral (negro) de tecta pticos de pintos de 12 dias. Os dados mostram a adeso seletiva das clulas retinianas dorsais ao tecido tectal ventral. (Segundo Roth e Marchase, 1976).
*Nos ltimos anos, os pesquisadores encontraram dzias de mutantes no peixe-zebra que afetam a migrao dos axnios retinianos para o tectum ou a especificidade das conexes retinotectais. Esses mutantes vm somente sendo analisados agora, porm, prometem fornecer vises da maior importncia dos mecanismos pelos quais nossa descarga sensorial entra no crebro. A publicao de dezembro de 1996 (volume 123) de Development contm vrios artigos mapeando os genes envolvidos na migrao do axnio da retina para o crtex ptico. Foram encontrados mais de 30 genes mutantes que afetam ou a capacidade dos axnios retinianos do peixe-zebra acharem o tectum ptico, ou a capacidade dos axnios encontrarem suas apropriadas conexes dentro do tectum (Karlstrom et al., 1997).
329
Membranas tectais Anterior Posterior Anterior Posterior Anterior Posterior Anterior
Figura 8.23
Repulso diferencial de axnios temporais da retina sobre membranas tectais. Fitas alternadas de membranas tectais anteriores e posteriores foram absorvidas em papel de filtro. Quando os axnios das clulas ganglionares retinianas temporais (posterior) cresceram em tais tapetes alternados, elas preferencialmente estenderam axnios sobre membranas tectais anteriores. (de Walter et al., 1987.)
A possvel importncia de ELF-1 no tectum ptico foi demonstrada por Nakamoto e colegas (1996). Quando infectaram regies do crebro posterior do pinto com um vrus expressando ELF, pedaos de ELF-1 ficaram expressos em regies do tectum que normalmente pouco expressam essa molcula. Axnio da regio temporal (mas no
Nasal Olho Crebro
Temporal
Temporal Tectum
(A)
Receptor Eph da tirosina quinase (Mek-4)
Ligantes (RAGS, ELF-1)
Retina Anterior Nasal Temporal Posterior
Tectum
Figura 8.24
(B) Gradiente da protena ligante nas membranas tectais
Retina temporal
Retina nasal
Adeso retinotectal diferencial por gradientes receptoras Eph da tirosina quinase e seus ligantes. (A) Representao dos dois gradientes duplos receptor Eph da tirosina quinase (Mek-4) na retina, e seu ligante (RAGS, ELF1) no tectum. (B) Experimento mostrando que axnios temporais, mas no nasais, da retina respondem a um gradiente das membranas tectais posteriores, se afastando ou se retardando. (Segundo Barinaga, 1995.)
330
aqueles da regio nasal) da retina evitaram as regies expressando ELF-1. Assim, ELF1 pode prover sinais negativos para as regies temporais da retina. O aparecimento de RAGS e ELF-1 regulado pela expresso da protena Engrailed. A protena Engrailed expressa no dia 2 do desenvolvimento do pinto em uma banda que inclui a poro caudal (posterior) do futuro tectum ptico (veja Figura 7.18). Se a protena Engrailed for induzida experimentalmente na poro rostral do tectum, tambm essa adota um fentio caudal. Quando isso ocorre, RAGS e ELF-1 so expressos atravs de todo o tectum, e os axnios temporais so repelidos das duas metades (Logan et al., 1996). Assim, a expresso precoce de Engrailed parece induzir a expres-
(A) Cone de crescimento contata miotbulo
(D) Axnios
Miotbulo
Receptores de ACh
(B)
Agrina neuronial induz agregao de receptores de ACh
(E)
Miotbulo
(C)
Forma-se a lmina basal sinptica Vescula neurotransmissora

2 laminina
(F)
Envolvimento pelas clulas de Schwann
Matriz extracelular
Figura 8.25
Diferenciao da sinapse do neurnio motor com o msculo. Partes (E) e (G) esto representadas em menor aumento que outras para dar uma viso panormica da regio onde o axnio encontra o msculo. (A) Um cone de crescimento se aproxima de uma clula muscular em desenvolvimento. (B) O axnio pra e forma um contato no-especializado na superfcie do miotbulo. A agrina, liberada pelo tubo neural, causa a agregao de receptores de aceticolina. (C) Vesculas neurotransmissoras penetram no axnio terminal, e uma matriz extracelular conecta o axnio terminal com a clula muscular medida que a sinapse se alarga. Essa matriz contm uma laminina especfica do nervo. (D) Outros axnios convergem para o mesmo local sinptico. (E) Viso geral da inervao muscular por vrios axnios (vista em mamferos no nascimento). (F) Todos os axnios menos um so eliminados. O axnio remanescente pode se ramificar para formar uma juno complexa com o msculo. Cada terminal do axnio est recoberto por um processo de uma clula de Schwann e dobras se formam na membrana da clula muscular. (G) Viso panormica da inervao muscular vrias semanas aps o nascimento. (Segundo Hall e Sanes, 1993; Purves, 1994; Hall, 1995.)
(G)
Na maturidade
331
so de RAGS e ELF-1, e essas duas protenas mediam a excluso dos axnios retinianos temporais da poro caudal (posterior) do tectum.
Seleo de endereo: Desenvolvimento dependente de atividade

Quando um axnio contata seu alvo (em geral um msculo ou outro neurnio) forma uma juno especializada chamada sinapse. Neurotransmissores do terminal do axnio so liberados nessas sinapses para despolarizar ou hiperpolarizar a membrana da clula do outro lado da fenda sinptica. A construo de uma sinapse envolve vrios passos (Figura 8.25). Quando neurnios motores na medula espinhal estendem axnios para os msculos, os cones de crescimento que contatam as recm-formadas clulas musculares migram sobre suas superfcies. Quando o cone de crescimento adere primeiro membrana da clula muscular, a especializao no pode ser vista em membrana alguma. Porm, logo os terminais axnicos comeam a acumular vesculas sinpticas contendo neurotransmissores, as membranas de ambas as clulas se engrossam na regio de contato, e a fenda entre as clulas se enche com matriz extracelular que inclui uma forma especfica de laminina. Essa laminina derivada do msculo, especificamente liga os cones de crescimento dos neurnios motores e pode agir como um sinal de parada para o crescimento axnico (Martin et al., 1995; Noakes et al., 1995). Aps esse primeiro contato, os cones de crescimento de outros axnios convergem para esse local para formar sinapses adicionais. Durante o desenvolvimento, todos os msculos de mamferos estudados parecem ser inervados por, ao menos, dois axnios. No entanto, essa inervao polineuronial transitria. Durante a fase precoce da vida ps-natal, todos esses ramos axnicos, menos um, so recolhidos. Esse rearranjo est baseado na competio entre os axnios (Purves e Lichtman, 1980; Thompson, 1983). Quando um dos neurnios motores est ativo, ele suprime as sinapses dos outros neurnios, possivelmente atravs de um mecanismo dependente de xido ntrico (Dan e Poo, 1992; Wang et al., 1995). Finalmente, as sinapses menos ativas so eliminadas. O terminal axnico remanescente se expande e revestido pela clula de Schwann. A formao de sinapse dependente de atividade tambm parece estar envolvida nos estgios finais da projeo da retina para o crebro. Em embries de r, ave e roedor tratados com tetrodotoxina, os axnios iro crescer normalmente para seus respectivos territrios e iro estabelecer sinapses com os neurnios tectais. Porm, o mapa retinotectal grosseiro, carente de resoluo fina. Tal como na especificao final da sinapse do neurnio motor, a atividade neuronial necessria para a projeo retiniana ponto-por-ponto at os neurnios tectais (Harris, 1984; Fawcett e OLeary, 1985; Kobayashi et al., 1990). Essa eliminao de contatos retinianos transitrios pelo tectum tambm pode envolver a expresso do xido ntrico pelas clulas tectais alvo (Wu et al., 1994).
Sobrevivncia diferencial aps a inervao: Fatores neurotrficos

Refletindo sobre sua vida como um embrio, Lewis Thomas (1992) escreve, At o momento do meu nascimento, mais de mim havia morrido do que sobrevivido. No de se admirar que eu no possa recordar; durante aquele tempo passei por crebro aps crebro durante nove meses, finalmente conseguindo aquele modelo que podia ser humano, equipado para a linguagem. Realmente, um dos fenmenos mais intrigantes no desenvolvimento do sistema nervoso a morte da clula neuronial. Em muitas partes dos sistemas nervosos central e perifrico de vertebrados, mais da metade dos neurnios morrem durante
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o progresso normal do desenvolvimento. Alm disso, no parece ter semelhanas entre as espcies. Por exemplo, na retina do gato, cerca de 80 porcento das clulas ganglionares retinianas morrem, enquanto na retina do pinto, esse nmero de somente 40 porcento. Nas retinas de peixes e anfbios no parece haver morte das clulas ganglionares retinianas (Patterson, 1992). A extino de um neurnio no causada por qualquer defeito bvio. Na realidade, esses neurnios se diferenciaram e estenderam com sucesso axnios para seus alvos. Ao contrrio, parece que o tecido alvo regula o nmero de axnios que o inerva limitando um suprimento de algum fator crtico de sobrevivncia. Parece haver competio por esse fator limitante. Por exemplo, se mais de um tecido alvo transplantado no alvo original, mais axnios sobrevivem, e se o tecido alvo for removido antes dos axnios o alcanarem, quase todos os neurnios morrem. Esses fatores neurotrficos foram isolados e mostrados regular a sobrevivncia de diferentes subconjuntos de neurnios. O fator neurotrfico melhor caracterizado o fator de crescimento do nervo (NGF), uma glicoprotena composta de duas subunidades 13-kDa idnticas. O NGF necessrio para a sobrevivncia de neurnios simpticos e sensoriais. Tratar embries de camundongo com anticorpos anti-NGF reduz o nmero de neurnios ganglionares e da raiz dorsal do trigmeo simptico para 20% do seus valores controle (Levi-Montalcini e Booker, 1960; Pearson et al., 1983). O NGF parece funcionar aps ter ocorrido a inervao, j que o NGF no secretado pelos tecidos alvos at depois da inervao, e axnios em crescimento carecem de receptores para NGF, ento eles no podem responder antes (Davies et al., 1987). A remoo desses tecidos alvos causa a morte dos neurnios que os teriam inervado, e existe uma boa correlao entre a quantidade de NGF secretado e a sobrevivncia dos neurnios que inervam esses tecidos (Korsching e Thoenen, 1983; Harper e Davies, 1990). [axon1.html] Outras protenas neurotrficas foram caracterizadas. Duas dessas protenas fator neurotrfico derivado do crebro (BDNF) e neurotrofina 3 (NT-3) repartem a mesma estrutura bsica que NGF. Porm, elas favorecem a sobrevivncia de grupos de neurnios um tanto diferentes. Enquanto alguns neurnios respondem a todos os trs fatores, outros respondem somente a um ou dois (Figura 8.26; Oppenheim et al., 1992). O NGF suporta o crescimento e a diferenciao de clulas ganglionares do simptico e de certos neurnios sensoriais, mas no parecem influenciar a sobrevivncia dos neurnios motores. O BNDF, porm, pode salvar neurnios motores fetais in vivo da morte celular que ocorre normalmente e da morte celular induzida aps remoo de seus tecidos alvo. Os resultados desses estudos in vitro foram corroborados por experimentos de eliminao de genes, onde a deleo de determinados fatores neurotrficos causa a perda de somente certos subconjuntos de neurnios (Crowley et al., 1994; Jones et al., 1994). A NT-3 produzida pelos tecidos alvo podem sustentar a sobrevivncia de neurnios viscerais que no so responsivos ao NGF (Hohn et al., 1990; Maisonpierre et al., 1990). BDNF, NT-3 e duas outras molculas neurotrficas neurotrofina 4/5 (NT-4/5) e fator 5 de crescimento de fibroblastos (FGF5)- so sintetizadas em clulas musculares dos membros de ratos quando axnios dos neurnios motores esto crescendo para dentro do msculo e competindo por tais fatores de sobrevivncia. Alm disso, BNDF, NT-3, NT-4/5 e vrios FGFs previnem a morte de neurnios motores embrionrios de rato em cultura (Henderson et al, 1993, Hughes et al., 1993). Outra recm-descoberta neurotrofina, fator neurotrfico derivado da linhagem de clula glial (GDNF), estimula a sobrevivncia de outro grupo de neurnios: os neurnios dopaminrgicos do mesencfalo cuja destruio caracteriza a doena de Parkinson (Lin et al., 1993). Esse fator pode evitar a morte desses neurnios em crebros adultos (veja Lindsay, 1995). Ainda outra neurotrofina, fator neurotrfico ciliar (CNTF), parece apoiar a sobrevivncia de neurnios motores embrionrios; CNTF capaz de evitar a degenerao de neurnios motores em um mutante de camundongo caracterizado pela perda progressiva de neurnios motores (Sendtner et al., 1992).
333
(A)
Simptico
(B) Raiz dorsal
(C)
Nodoso
Figura 8.26
Efeitos do NGF (parte superior) e BDNF (em baixo) no crescimento de neuritos de (A) gnglios simpticos, (B) gnglios da raiz dorsal, e (C) gnglios nodosos. Enquanto tanto NGF como BDNF tinham um leve efeito estimulante do crescimento axnico do gnglio da raiz dorsal, os gnglios simpticos responderam ao NGF e quase de modo algum ao BDNF, enquanto o contrrio se demonstrou para o gnglio nodoso. (de Ibez et al., 1991.)
A sobrevivncia real de um dado neurnio no embrio pode depender de uma combinao de genes. Schmidt e Kater (1993) mostraram que fatores neurotrficos, despolarizao, e interaes com o substrato se combinam sinergicamente para determinar a sobrevivncia neuronial. Por exemplo, a sobrevivncia de neurnios do gnglio ciliar do pinto em cultura foi promovida pelo FGF, laminina ou despolarizao. Porm, o FGF no promoveu sobrevivncia quando a laminina estava ausente, e os efeitos combinados da laminina, FGF e despolarizao foram maiores do que a soma dos efeitos de cada um deles (Figura 8.27). Os fatores neurotrficos e os outros agentes ambientais parecem funcionar pela supresso de um programa suicida que seria expresso constitutivamente se no fosse reprimido por esses fatores (veja Captulo 13; Raff et al., 1993). A sobrevivncia das clulas ganglionares retinianas em cultura est baseada em fatores neurotrficos, mas essas clulas somente podem responder a esses fatores se tiverem sido despolarizadas (Meyer-Franke et al., 1995). Alm disso, j que a atividade neuronial estimula a produo de fatores neurotrficos pelos nervos ativos, provvel que neurnios recebendo um sinal produzam mais fator neurotrfico (Thoenen, 1995). Esse fator poderia ter um efeito sobre as sinapses prximas que esto ativas (i.e., capazes de responder a esse fator), com isso estabilizando um conjunto de sinapses ativas com excluso das inativas. A descoberta e purificao dessas protenas neurotrficas e a anlise de suas interaes com substratos e condies eltricas pode possibilitar novas terapias para doenas neurodegenerativas. Numerosas companhias farmacuticas esto iniciando testes clnicos de fatores neurotrficos para o possvel alvio de leses na medula espinhal (NGF), doena de Parkinson (GNDF), esclerose lateral amotrfica (BDNF, CNTF), neuropatias perifricas (NGF, NT-3) e doena de Alzheimer (NGF, GDNF).
Sobrevivncia neuronial (%)
Neurnios revestidos com laminina Neurnios revestidos com colgeno IV
Figura 8.27
Sem adio de agentes
FGF2
Despolarizao
FGF2 + Despolarizao
Interaes entre substrato, despolarizao e fator neurotrfico bsico FGF (FGF2) na sobrevivncia de neurnios do gnglio ciliar. Neurnios foram revestidos com laminina (um substrato favorecendo sobrevivncia) ou colgeno IV (que no favorece sobrevivncia neuronial) e observados aps 24 horas de cultura na presena ou ausncia de despolarizao ou FGF2. Quando as clulas foram despolarizadas e se desenvolveram na presena de FGF2, no importou em qual substrato elas cresceram. Todavia, quando o FGF2 estava presente sem despolarizao, o substrato causou uma grande diferena. (de Schmidt e Kater, 1993.)
334
&
Especulaes
Neurnios Fetais em Hospedeiros Adultos

m 1976, Lund e Hauschka implantaram tecido cerebral fetal de rato no crebro de um rato recm-nascido. Os neurnios fetais fizeram as conexes apropriadas com o crebro do hospedeiro. Esse estudo ofereceu a possibilidade de que transplantes de neurnios fetais possam ser capazes de reparar regies danificadas no crebro humano. H muitas doenas degenerativas neuroniais, e a doena de Parkinson uma das mais freqentes, afetando cerca de um milho de pessoas na Amrica. Nessa doena, neurnios produtores de dopamina da substncia nigra (um conjunto de clulas no pednculo cerebral) so destrudos, e seus terminais axnicos no ncleo caudado e putmen (dois ncleos cerebrais) degeneram. Isso leva a tremores musculares, dificuldade para iniciar movimentos voluntrios e problemas de cognio. A injeo de L-dopa (que o organismo metaboliza em dopamina) alivia temporariamente esses sintomas, mas a L-dopa perde seu efeito com o uso prolongado e algumas vezes tem efeitos adversos. Em 1990, Lindvall e colegas implantaram clulas neuroniais humanos da substncia nigra de fetos de 8 a 9 semanas, em um paciente com mal de Parkinson. Doa-
dor e recipiente no precisavam ser parentes, j que o crebro separado do sistema imune pela barreira hematoenceflica, que protege transplantes de tecidos no crebro da rejeio pelo sistema imune. Dentro de 5 meses, o transplante tinha restaurado muito da dopamina normalmente produzida pela substncia nigra, assim como a capacidade para movimentos voluntrios do paciente. Dois outros laboratrios relataram restauraes semelhantes de funo aps transplantes de neurnios fetais em pacientes (Freed et al., 1992; Spencer et al., 1992). Segundo Bjrkland (1987), o tecido doador timo aquele contendo presumidos neurnios secretores de dopamina, que tinham passado pela sua ltima diviso celular mas ainda no haviam formado extensas conexes sinpticas. Em 1992, Widner e colegas mostraram que enxertos de mesencfalos fetais foram capazes de restaurar funes motoras em dois pacientes que haviam destrudo suas substncias nigras injetando-os com uma de herona sinttica contaminada com o biproduto MPTP. Esse composto havia criado uma condio que parecia com a severa doena de Parkinson. Dois estudos recentes mostraram que transplantes de clulas humanas fetais
no so a nica maneira de se restaurar a anatomia funcional da substncia nigra em pacientes com Parkinson. Em primeiro lugar, os estudos de Isacson e colegas (1995) sugerem que as clulas embrionrias do doador no necessitam ser de humanos. Clulas do mesencfalo do embrio de porco reconstruram as conexes neuroniais normais quando injetadas no estriado de ratos adultos com uma doena semelhante doena de Parkinson. Em segundo lugar, quando Gash e colegas (1996) injetaram fator de crescimento derivado da glia nos crebros de macacos que haviam sido induzido para ter sndromes semelhantes ao Parkinson pela injeo de MPTP, os macacos injetados mostraram recuperao funcional de seus sintomas. Ainda mais, eles tinham substancialmente mais dopamina e neurnios produtores de dopamina. Como a doena de Parkinson progressiva, no sabido se os neurnios enxertados ou recm-divididos sero acometidos pelo mesmo processo que havia destrudo os neurnios endgenos. Porm, parece provvel que enxertos fetais e neurnios novos so capazes de reestabelecer conexes sinpticas que os neurnios destrudos haviam estabelecido.
O desenvolvimento de comportamentos: Constncia e plasticidade

Um dos aspectos mais fascinantes da neurobiologia do desenvolvimento a correlao de certas conexes neuroniais com certos comportamentos. Existem dois aspectos notveis desse fenmeno. Primeiro h aqueles casos nos quais os padres complexos do comportamento esto inerentemente presentes no circuito do crebro no nascimento. O ritmo cardaco de um embrio de pinto de 19 dias se acelera quando ele escuta o chamado de aflio, e nenhum outro chamado provocar essa resposta (Gottlieb, 1965). Alm disso, um pinto recm-eclodido imediatamente ir buscar abrigo se apresentado sombra de um gavio. O gavio verdadeiro no necessrio a sombra pela sua silhueta em papel ser suficiente, mas sombra de nenhuma outra ave causar essa resposta (Tinbergen, 1951). Parece, portanto, que so certas conexes neuroniais que levam a comportamentos inerentes em vertebrados. So igualmente notveis os exemplos em que o sistema nervoso to plstico que novas experincias podem modificar o conjunto original de conexes neuroniais,
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causando a criao de novos neurnios ou a formao de novas sinapses entre neurnios existentes. Iremos discutir a plasticidade neuronial em maior detalhe no Captulo 21, mas suficiente dizer neste ponto que o crebro no cessa de se desenvolver com o nascimento. O trabalho ganhador do prmio Nobel de Hubel e Wiesel (1962, 1963) demonstrou que havia competio entre neurnios retinianos de cada olho por alvos no crtex, e que suas conexes tinham que ser fortalecidas pela experincia. Em pssaros canoros, alm disso, novos neurnios so criados e novas sinapses formadas quando os pssaros aprendem seu canto (Alvarez-Buylla et al., 1990), e quando ratos adultos aprendem novas atitudes, seus neurnios corticais desenvolvem novas sinapses (Black et al., 1990). Assim, o sistema nervoso continua a se desenvolver na vida adulta, e o padro de conexes neuroniais um produto de padronizao herdada e padronizao produzida pela experincia. [axon6.html] Como um investigador (Purves, 1994) recentemente concluiu em sua anlise do desenvolvimento cerebral: Embora a grande maioria dessa construo deve se originar de programas desenvolvimentais configurados durante a evoluo de cada espcie, a atividade neuronial pode modular e instruir esse processo, armazenando assim a imensido de informao idiossincrtica que cada um de ns adquire pela experincia individual e prtica.
LITERATURA CITADA
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CAPTULO 9 Mesoderma e Endoderma
341
Incio do desenvolvimento vertebrado: Mesoderma e endoderma
Da fisiologia de alto a baixo, eu canto, Nem fisionomia somente nem crebro somente so dignos da Musa, Eu digo a forma completa de longe mais valorosa, A Fmea igualmente com o Macho eu canto.
WALT WHITMAN (1867)
derma em desenvolvimento. Neste captulo acompanharemos o desenvolvimento precoce das camadas germinativas mesodrmica e endodrmica. Veremos que o endoderma forma o revestimento dos tubos digestivo e respiratrio, com seus rgos associados; o mesoderma ser observado gerando todos os rgos entre a parede ectodrmica e os tecidos endodrmicos.
OS CAPTULOS 7 e 8 acompanhamos os vrios tecidos formados pelo ecto-
Teorias vm e teorias vo. A r permanece.

JEAN ROSTAND (1960)
MESODERMA
O mesoderma de um embrio em estgio de nurula pode ser dividido em cinco regies (Figura 9.1). A primeira regio o cordomesoderma. Esse tecido forma a notocorda, um rgo transitrio cuja principal funo inclui a induo da formao do tubo neural e estabelece o eixo corporal ntero-posterior. Como observamos no Captulo 6, o cordomesoderma se forma no centro do embrio no futuro lado dorsal. A segunda regio o mesoderma dorsal somtico. O termo dorsal se refere observao de que os tecidos em desenvolvimento originrios dessa regio estaro na parte de trs do embrio, ao longo da espinha. As clulas nessa regio formam somitos, blocos de clulas mesodrmicas em ambos os lados do tubo neural que iro produzir muitos dos tecidos conjuntivos das costas (osso, msculo, cartilagem e derme). O mesoderma intermedirio forma o sistema urinrio e os dutos genitais; discutiremos essa regio em detalhe em captulos posteriores. Mais distante da notocorda, o mesoderma da placa lateral d origem ao corao, vasos sangneos e clulas sangneas do sistema circulatrio, como tambm ao revestimento da cavidade do corpo e de todos os componentes mesodrmicos dos membros exceto os msculos. Ele tambm ir formar uma srie de membranas extra-embrionrias que so importantes para o transporte de nutrientes para o embrio. Por ltimo, o mesnquima da cabea ir contribuir para os tecidos conjuntivos e a musculatura da face.
Mesoderma dorsal: A notocorda e a diferenciao dos somitos

Mesoderma Paraxial Uma das principais tarefas da gastrulao criar uma camada mesodrmica entre o endoderma e o ectoderma. Como mostra a Figura 9.2, a formao de rgos mesodrmicos
341
342
Zigoto Gametas Clulas germinativas primordiais
Clivagem Gastrulao
Bexiga urinria
Ectoderma embr. ext. do mnio e crio
Glndulas sudorparas* Unhas
Glndulas mamrias* Alantide* Fgado Pncreas* Tubo digestivo* Tireide Traquia* brnquios* Pulmes
ENDODERMA
INTESTINO PRIMITIVO NOTOCORDA (CORDOMESODERMA)
Cabelo
ECTODERMA
EPITLIO EXTERNO DO CORPO Cristalino do olho Glndulas sebceas* Epitlio estomodeal Epitlio oral Esmalte dentrio Lbulo anterior da hipfise
FARINGE
MESODERMA
Vescula auditiva* Mecanismo do ouvido interno Epitlio nasal e olfativo e nervo olfativo Epitlio proctodeal
Bolsas farngeas* Ouvido mdio* tubo de eustquio Timo primitivo*, paratireides* Esqueleto axial Esqueleto apendicular Recessos tonsilares* Paratireides* Corpos ps-branquiais* Esclertomos Brotos dos apndices Mitomos MESODERMA PARAXIAL DORSAL
Canal anal*
Pars neuralis Razes dos nervos da hipfise motores espinhais Medula espinhal
Msculos Msculos dos esquelticos do tronco apndices Camadas de tecido Dermtomos conjuntivo da pele Epiddimo vasos deferentes Divertculo metanfrico, ureteres pelve renal, Dutos mesonfricos tbulos coletores Mesonefro, dutos eferentes Metanefro, tbulos renais* MESODERMA INTERMEDIRIO Dutos mulerianos Pronefro MESODERMA LATERAL
TUBO NEURAL Retina* e nervo ptico CRISTA NEURAL Vesculas pticas Crebro
Nervos motores cranianos Razes dos nervos sensoriais espinhais Medula da supra-renal
Nervos e gnglios cranianos sensoriais Gnglios da raiz dorsal espinhal Dentina dentria
Vagina* Ovidutos* tero* Mes. embr. ext. do mnio e crio Mesoderma somtico Pleura, pericrdio, peritnio Estroma das gnadas Mesnquima
MESNQUIMA DA CABEA Tecido conectivo Ms.emb. ext. ceflico do saco vitelnico e alantide Crtex da supra-renal
Crnio e cartilagens branquiais
Gnglios simpticos Camadas externas da cabea
Mesoderma esplncnico
Msculos Mesentrios Peritnio visceral Epimiocrdio epicrdio miocrdio
Corao
Pleura visceral Tecido hemangioblstico
* O esquema indica somente a origem da parte epitelial do rgo. Todos esses rgos tm investimentos de sustentao secundria de origem mesodrmica.
Tecido conjuntivo e msculo liso das vsceras e vasos sangneos
Corpsculos sangneos
Endotlio dos vasos sangneos
Endocrdio
343
Figura 9.1
O esquema ilustra a linhagem das partes especializadas do corpo, derivadas das trs camadas germinativas embrionrias. As clulas germinativas esto representadas como uma linhagem de clulas separada das trs camadas germinativas somticas pois, apesar dos precursores das clulas germinativas se localizarem no endoderma ou mesoderrma presuntivos, elas so provavelmente um nico tipo celular. (Segundo Carlson, 1981.)
e ectodrmicos no subseqente formao do tubo neural, mas ocorre sincronicamente. A formao da notocorda foi discutida no Captulo 6. Essa haste epitelial se estende desde a base da cabea at a cauda. Em cada lado da notocorda existem faixas grossas de clulas mesodrmicas. Essas faixas de mesoderma paraxial so referidas como as placas segmentares (nas aves) e mesoderma no segmentado (nos mamferos). Com a regresso dos sulcos primitivos, as dobras neurais comeam a se aglomerar no centro do embrio, o mesoderma paraxial se separa em blocos de clulas chamadas somitos. Embora os somitos sejam estruturas transitrias, elas so muito importantes na organizao do padro segmentar de embries de vertebrados. Como vimos no captulo anterior, os somitos determinam os caminhos da migrao das clulas da crista neural e axnios do nervo espinhal. Os somitos geram clulas que formam (1) as vrtebras e costelas, (2) a derme e a pele dorsal, (3) os msculos esquelticos das costas e (4) os msculos esquelticos da parede do corpo e membros. Somitmeros e a Iniciao da Formao do Somito Os primeiros somitos aparecem na parte anterior do embrio, e os novos somitos brotam da extremidade rostral do mesoderma paraxial em intervalos regulares (Figuras 9.2C,D e 9.3). Devido aos embries poderem se desenvolver em taxas um pouco diferentes (da mesma maneira que acontece com embries de galinha quando so incubados em temperaturas um pouco diferentes), o nmero de somitos presentes
Sulco primitivo
Epiblasto
(A)
Endoderma Epiderme Placa neural
Clulas mesodrmicas migratrias
(B) Endoderma
Mesoderma paraxial Tubo neural
Notocorda
Mesoderma lateral Mesoderma Esplncnico
Epiderme
Mesoderma somtico
(C) Mesoderma intermedirio
Somito
Celoma Mitomo do somito
Esclertomo do somito Dermtomo do somito Notocorda Celoma intra-embrionrio
Figura 9.2
Celoma extra-embrionrio (D) Aortas dorsais
O desenvolvimento progressivo do embrio do pinto, enfocando o componente mesodrmico. (A) Regio do sulco primitivo mostrando precursores migratrios mesodrmicos e endodrmicos. (B) Formao da notocorda e do mesoderma paraxial. (C,D) Diferenciao dos somitos, celoma e das duas aortas (as quais finalmente iro se fundir). A-C, embrio de 24 horas; D, embrio de 48 horas.
344
Figura 9.3
Tubo neural e somitos. Micrografia ao microscpio eletrnico de varredura, mostrando somitos bem-formados e mesoderma paraxial (embaixo direita) que ainda no se separou em somitos distintos. Um arredondamento do mesoderma paraxial em um somitmero pode ser visto na parte inferior esquerda, e as clulas da crista neural podem ser vistas em migrao ventral, a partir do teto do tubo neural. (Cortesia de K. W. Tosney.)
geralmente o melhor indicador para definir o progresso do desenvolvimento. A quantidade final de somitos formados uma caracterstica de cada espcie. O mecanismo para a formao do somito no foi ainda bem estabelecido, mas diversos estudos em pintos mostraram que as clulas da placa segmentar esto organizadas em espirais de clulas chamadas somitmeros (Meier, 1979; Packard e Meier, 1983). A converso de somitmero para somito observada quando as clulas mais anteriores do somitmero se tornam compactas. Essa transio de um somitmero frouxamente compactado para um somito epitelial est correlacionada com a sntese de duas protenas da matriz extracelular, fibronectina e N-caderina (Figura 9.4A; Ostrosky et al., 1984; Lash e Yamada, 1986; Hatta et al., 1987). Essas protenas, por sua vez, podem ser reguladas pela expresso de Notch1 e Paraxis. O gene Notch1 codifica o fator transcrio que est ativo na regio mais anterior do mesoderma dorsal no segmentado, e camundongos com falta desse fator desenvolvem somitos desalinhados de vrios tamanhos (Figura 9.4B,C; Conlon et al., 1995). Paraxis, um gene codificando um outro fator de transcrio, expressado na extremidade rostral (anterior) do mesoderma no segmentado de embries de camundongos e pintos. A injeo de oligonucleotdeos antisenso complementares ao Paraxis produz defeitos de segmentao somtica (Burgess et al., 1995; Barnes et al., 1997). Clulas de somitos normais recm-formados so organizadas aleatoriamente, mas logo se tornam organizadas em uma bola de clulas epiteliais colunares que circundam uma pequena cavidade repleta de clulas frouxamente conectadas. As clulas epiteliais se fixam umas s outras atravs de junes apertadas. A Paraxis uma parte essencial dessa converso de mesnquima em epitlio (Burgess et al.,1996). Gerao de Tipos de Clulas Somticas Quando o somito primeiro formado, qualquer uma de suas clulas pode se tornar qualquer das estruturas derivadas de somitos. No entanto, com a maturao do somito, as vrias regies do somito se tornam comprometidas em formar somente certos tipos de clulas. A clulas mediano-ventrais do somito (aquelas clulas localizadas o mais distante das costas, mas prximas ao tubo neural) sofrem mitose, perdem sua caracterstica epitelial redonda, se tornando clulas mesenquimatosas
(A)
(B) Notch1 presente
Somitos
Mesoderma paraxial (pr-somtico)
Figura 9.4
Transio de um somitmero para um somito. (A) A expresso da N-caderina se correlaciona com a converso de clulas mesenquimatosas soltas em um somito epitelial. (B) Nos embries de tipo selvagem, expresso de Notch1 vista na regio mais anterior do mesoderma paraxial no segmentado (i.e., a poro que est sendo organizada em um somito). (C) Em embries deficientes em Notch1, a organizao dos somitos perturbada. (A de Hatta et al., 1987; cortesia de M. Takeichi; B e C segundo Conlon et al., 1995.)
Concentrao de protena Notch ( C ) Notch1 ausente Somitos Transio Mesoderma paraxial
Anterior
Posterior
345
Clulas do esclertomo em migrao
(A) Dermtomo
Condensao de condrcitos das clulas do esclertomo Mitomo
(B)
Figura 9.5
Aorta dorsal Nefrtomo do rim em desenvolvimento Celoma intra-embrionrio Intestino
Camada mesodrmica somtica (C)
Camada mesodrmica esplncnica
Camada mesodrmica somtica (E)
Diagrama de uma seo transversal atravs do tronco de (A) um embrio humano precoce de 4 semanas e (B) um embrio tardio de 4 semanas, mostrando a formao das estruturas do somito. (A) As clulas do esclertomo comeam a migrar afastando-se do dermtomo e mitomo. (B) Ao fim da quarta semana, as clulas do esclertomo esto se condensando para formar vrtebras cartilaginosas, o dermtomo comea a formar a derme, e as clulas do mitomo estendem-se ventralmente ao longo das paredes do embrio. (C-E) A estrutura do somito do pinto em mudana enquanto ocorrema migraes celulares. (A e B segundo Langman, 1981; C-E segundo Ordahl, 1993).
(D) Tubo neural Dermamitomo
Dermtomo Clulas migratrias (Musculatura dos membros e ventrolateral)
Medial Lateral Notocorda
Esclertomo Esclertomo
Mitomo
novamente. A poro do somito que d origem a essas clulas chamada de esclertomo, e essas clulas mesenquimatosas no final se tornam condrcitos vertebrais (Figuras 9.2 e 9.5). Os condrcitos so responsveis pela secreo de um tipo especial de colgeno e GAGs (tais como o sulfato de condroitina) caractersticos da cartilagem. Esses condrcitos em particular sero responsveis pela construo do esqueleto axial (vrtebras, costelas, cartilagem e ligamentos). As clulas da poro lateral do somito (a regio mais distante do tubo neural) tambm se dispersam. Essas clulas formam os precursores dos msculos, dos membros e da parede do corpo. Ordahl e Le Douarin (1992) seguiram essas clulas transplantando pores de somitos de codorna em somitos de embries de galinha. As clulas dos pintos e das codornas podem ser distinguidas pela sua morfologia nucleolar. Os pesquisadores notaram que aquelas clulas que estavam mais distantes do tubo neural migram para formar a parede do corpo e a musculatura dos membros, mesmo se essas clulas doadoras forem originalmente da poro medial do somito. Uma vez que o esclertomo e os precursores das clulas musculares dos membros e da parede do corpo migraram para longe dos somitos, as clulas somticas prximas ao tubo neural migram ventralmente em direo poro epitelial remanescente do somito para formar uma slida camada epitelial dupla chamada dermamitomo (veja Figuras 9.2 e 9.5 ). A camada dorsal dessa estrutura chamada de dermtomo, sendo a responsvel pela gerao do tecido conectivo mesenquimatoso da pele dorsal: a derme. (A derme de outras reas do corpo se forma de outras clulas mesenquimatosas e no de somitos.) A camada interna de clulas chamada de mitomo, e essas clulas do origem aos msculos vertebrais que
346
(A) Ectoderma dorsal Musculatura apaxial Derme Msculos da parede corporal ?Wnt Tubo neural Tubo neural Myf5 BMP4 ?FGF5 Shh Aorta dorsal Esclertomo Myf5 Notocorda Mesoderma lateral Notocorda Pax3 c-met, MyoD Pax1 Mesoderma lateral Msculos dos membros Ectoderma dorsal Medial Dermamitomo
NT-3 Wnt
Derme Clulas musculares apaxiais Lateral
Figura 9.6
Modelo das principais interaes postuladas para a modelagem do somito. (A) Sonic hedgehog da notocorda e placa do assoalho induz formao do esclertomo; Wnt do tubo neural induz a regio do mitomo que forma musculatura apaxial, e a combinao da protena Wnt da epiderme e BMP4 (e talvez FGF5) do mesoderma da placa lateral induz a poro do mitomo que d origem aos msculos da parede corporal. Neurotrofina 3 do tubo neural pode causar a diferenciao das clulas do dermamitomo. (B) diferentes fatores de transcrio nas diferentes regies do somito anunciam o destino celular. As clulas do esclertomo expressam Pax1, enquanto as clulas medianas do dermamitomo expressam a protena miognica Myf5. As clulas laterais do dermamitomo expressam o fator de transcrio miognico o MyoD assim como o receptor cmet para o fator de espalhamento. A poro central do dermamitomo torna-se a derme e expressa Pax3. (Segundo Cossu et al., 1996b.)
circundam as vrtebras permitindo que as costas se curvem (Chevallier et al., 1977; Christ et al., 1977). Dessa maneira, os somitos so essenciais para a formao das costas de nosso corpo: as vrtebras que circundam a espinha dorsal, os msculos e o tecido conectivo que seguram as junes vertebrais, a subcamada drmica da pele das costas, e a musculatura das costas. E o que acontece com a notocorda, aquela estrutura mesodrmica central? Aps ter fornecido a integridade axial do embrio precoce, e induzido a formao do tubo neural dorsal, a maior parte degenera. Em qualquer lugar onde as clulas do esclertomo formaram o corpo vertebral, as clulas da notocorda morrem. No entanto, entre as vrtebras, as clulas da notocorda formam o tecido dos discos intervertebrais, chamados ncleos pulposos. Esses so os discos que se deslocam em certos tipos de leses nas costas. A especificao do somito completada pela interao de diversos tecidos que formam o seu ambiente. A poro mediana-ventral do somito induzida a se tornar esclertomo por fatores, especialmente pela protena Sonic hedgehog, secretada pela notocorda e pela placa do assoalho do tubo neural (Fan e Tessier-Lavigne, 1994; Johnson et al., 1994). Se pores da notocorda (ou outra fonte de Sonic hedgehog) forem transplantadas prximas a outras regies do somito, essas regies, tambm, se tornaro clulas do esclertomo. Essas clulas expressam um novo fator de transcrio, Pax1, que ativa genes especficos da cartilagem e cuja presena necessria para a formao das vrtebras (Figura 9.6; Smith e Tuan, 1996). Elas tambm expressam I-mf, um inibidor da famlia de fatores de transcrio MyoD que d incio formao muscular (Chen et al., 1996). Por caminhos similares, o mitomo induzido por dois sinais distintos. As clulas musculares epaxiais (que circundam o eixo do corpo) vm da poro medial do somito e so induzidas por fatores do tubo neural dorsal, provavelmente membros da famlia Wnt (Mnsterberg et al., 1995; Stern et al., 1995). Os msculos hipaxiais (que so formados pela poro medial do somito e formam a musculatura dos membros e parede do corpo) so provavelmente induzidos atravs da combinao de protenas Wnt procedentes da epiderme e da protena-4 morfogentica do osso, (BMP4) da placa lateral do mesoderma (Cossu et al., 1996a; Pourqui et al., 1996). Esses fatores levam as clulas do mitomo a expressarem fatores de transcrio particulares (MyoD e Myf5) que ativam os genes especficos do msculo. O dermtomo se diferencia em resposta a outro fator secretado pelo tubo neural, neurotrofina 3 (NT-3). Anticorpos que bloqueiam as atividades da
347
NT-3 previnem a converso do dermtomo epitelial em mesnquima drmico solto que migra por baixo da epiderme (Brill et al., 1995). Alm desses sinais positivos, existem pelo menos dois outros conjuntos de protenas necessrias para a padronizao do somito em suas regies particulares. Um desses fatores previne a ativao de um grupo de clulas pelas protenas inapropriadas. Por exemplo, o sinal BMP4 do mesoderma da placa lateral neutralizado por um fator do tubo neural que previne nveis reduzidos de BMP4 de agir em mais clulas mediais. O outro conjunto de protenas necessrio para a manuteno do padro da expresso do gene iniciada pelo sinal original (Pownall et al., 1996). [mesend1.html] Miognese: Diferenciao do Msculo Esqueltico A clula do msculo esqueltico extremamente grande, clula alongada que contm muitos ncleos. Em meados da dcada de 1960, biologistas do desenvolvimento debateram se cada um dessas clulas (freqentemente chamadas de miotubos) era derivada de uma fuso de diversas clulas precursoras musculares mononucleadas (mioblastos) ou de um nico mioblasto que sofre diviso nuclear sem citocinese. Evidncia da fuso de mioblastos esquelticos para a formao de miotubos multinucleados vem de duas fontes independentes. A evidncia crucial para a fuso do mioblasto esqueltico veio de camundongos quimricos. Esses camundongos podem ser formados pela fuso de dois embries precoces, que se ajustam para produzir um nico camundongo contendo duas populaes de clulas distintas (veja Figura 5.28). Mintz e Baker (1967) fundiram embries de camundongos que produziam diferentes tipos da enzima isocitrato desidrogenase. Essa enzima, encontrada em todas as clulas, composta de duas subunidades idnticas. Dessa maneira, se miotubos so formados de uma clula cujo ncleo se divide sem citocinese, esperava-se encontrar duas formas distintas de enzimas, isto , as duas formas parentais no camundongo alofnico (Figura 9.7). Mas se os miotubos so formados pela fuso entre as clulas, a expectativa seria de se encontrar clulas musculares expressando no somente os dois tipos parentais de enzimas (AA e BB), mas tambm uma terceira classe composta de uma subunidade procedente de cada tipo parental (AB). As formas diferentes de isocitrato desidrogenase podem ser separadas e identificadas pela sua mobilidade eletrofortica. Os resultados demonstraram claramente que apesar dos dois tipos parentais estarem presentes em todos os outros tecidos do camundongo alofnico, a enzima hbrida (AB) estava presente em extratos de tecido muscular esqueltico. Dessa maneira, os miotubos devem ter se formado pela fuso de inmeros mioblastos. Essa evidncia foi importante para mostrar que a fuso do mioblasto realmente ocorreu dentro do embrio. A anlise de como essa fuso acontece foi baseada em eventos de fuso ocorridos em cultura. Konigsberg (1963) descobriu que mioblastos isolados de embries de pinto proliferariam em placas de Petri revestidas com colgeno. Aps aproximadamente dois dias, no entanto, esses mioblastos pararam de se dividir e comearam a se fundir com seus vizinhos para produzir extensos miotubos sintetizantes de protenas especficas do msculo. A sntese de DNA e a diviso nuclear no foram encontradas em miotubos multinucleados. Esse processo de fuso uma complexa orquestrao de eventos bioqumicos na superfcie da clula mioblasto. A primeira etapa parece ser a retirada das clulas do ciclo da primeira diviso. Enquanto existir fatores de crescimento no meio (particularmente fatores de crescimento do fibroblasto), o mioblasto vai proliferar sem se diferenciar. Quando esses fatores so exauridos, o mioblasto cessa de se dividir, secreta fibronectina para sua matriz extracelular, fixando-se a essa atravs da sua integrina 51 , o principal receptor de fibronectina (Menko e Boettiger, 1987; Boettiger et al., 1995). Se essa adeso bloqueada, no resulta desenvolvimento muscular adicional algum, e parece que o sinal da ligao integrina-fibronectina decisivo para iniciar a diferenciao do mioblasto em clula muscular (Figura 9.8). A segunda etapa o
348
(A) Modelo de diviso
(B) Modelo de fuso
Mioblastos Msculo
Msculo Miotubos
Homogenize e coloque na origem de uma placa de eletroforese
Enzimas de isocitrato desidrogenase vistas por eletroforese
Enzima hbrida formada Origem AA AB BB
Origem AA BB
Gentipo AA Gentipo BB
Polipeptdeo A Polipeptdeo B
Enzima AA Enzima BB Enzima AB
Figura 9.7
Os dois mecanismos possveis da formao do msculo esqueltico, e como distingu-los. Camundongos quimricos so produzidos da fuso de embries de duas raas diferentes de camundongos, cada uma produzindo uma forma diferente da enzima isocitrato desidrogenase. Essa enzima composta de duas subunidades; uma raa produz isocitrato desidrogenase AA (indicada em negro) e a outra produz BB (colorida). (A) Se as enzimas forem produzidas em uma nica clula ou em clulas multinucleadas surgindo de divises nucleares dentro de uma nica clula, a enzima ser puramente AA ou BB. (B) Se houver dois diferentes ncleos em uma mesma clula, porm, um poder codificar para subunidades B enquanto o outro poder codificar para A, com o resultado de que algumas molculas da enzima sero hbridas (AB). Por eletroforese pode-se separar esses trs tipos de molculas. A presena de molculas AB no msculo esqueltico (mas no em outro tipos de clulas) confirma o modelo de fuso. (Segundo Mintz e Bakerr, 1967.)
Figura 9.8
Auto-radiografia mostrando sntese de DNA em mioblastos e sada de clulas em fuso do ciclo celular. Fosfolipase C pode congelar os mioblastos aps eles terem se alinhado com outros mioblastos, mas antes da fuso das membranas. Esses mioblastos cultivados foram tratados com fosfolipase C e expostos timidina radioativa. Mioblastos no fixados ainda se dividem e incorporam a timidina radioativa em seu DNA. Clulas alinhadas (mas ainda no fundidas) (setas) no incorporam o marcador. (de Nameroff e Munar, 1976, cortesia de M. Nameroff.)
alinhamento dos mioblastos em cadeias. Essa etapa mediada por glicoprotenas das membranas celulares, incluindo diversas caderinas e CAMs (Knudsen,1985: Knudsen et al., 1990). O reconhecimento e alinhamento entre clulas acontece somente se as duas clulas forem mioblastos. A fuso pode acontecer mesmo entre os mioblastos de rato e galinha (Yaffe e Feldman,1965); as identidades das espcies no so cruciais em cultura. A terceira etapa consiste no prprio evento da fuso celular. Como na maioria das fuses de membranas, ons de clcio so cruciais, e a fuso pode ser ativada pelos ionforos de clcio tais como A23187, que transporta ons de clcio atravs das membranas celulares (Shainberg et al., 1969; David et al., 1981). A fuso parece ser mediada por um conjunto de metaloproteinases chamadas meltrinas. Essas protenas foram descobertas durante uma pesquisa para se encontrar protenas de mioblastos que poderiam ser homlogas fertilina, uma protena envolvida na fuso vulo-espermatozide. Yagami-Hiromasa e colegas (1995) descobriram que uma dessas meltrinas (meltrina-) expressa em mioblastos aproximadamente ao mesmo tempo em que comea a fuso, e que o RNA antisenso para a mensagem meltrina- inibiu a fuso quando adicionado aos mioblastos.
349
&
Especulaes
Construo Muscular e a Famlia MyoD de Reguladores Transcricionais
omo uma clula mesenquimatosa embrionria instruda a formar uma clula muscular em lugar de uma clula da cartilagem, um fibroblasto ou uma clula adiposa? Quais molculas comprometem seu destino para uma linhagem e no para outra? Em 1986, Lassar e colaboradores tomaram DNA de clulas mioblastos e o transfectaram em um certo tipo de clula embrionria de camundon1 go, a clula C3H10T 2 . Essa clula tem um aspecto semelhante ao do fibroblasto, mas parece mesnquima primitivo, pois pode se tornar clula adiposa, uma clula muscular ou cartilagem. Quando DNA do msculo foi adicionado a essas clulas, as clu1 las C3H10T 2 foram transformadas em clulas musculares. DNA isolado de fibroblastos ou de outros tipos celulares no pode efetuar essa converso. Atravs de clonagem de subtrao (veja Captulo 2), foi encontrado um mRNA especfico do mioblasto que tambm podia efetuar essa mudana em um fentipo diferenciado. O mRNA mioblasto codificava uma protena chamada protena 1 de determinao do mioblasto ou, mais comumente, MyoD (Davis et al., 1987). O gene MyoD somente expresso em clulas das linhagens musculares. Parece ser um gene comutador-mor pois pode converter outros tipos celulares em msculo se esse gene nelas for ativo. Essa hiptese foi testada clonando o gene MyoD em um vetor viral de modo a mantlo sob o controle de um promotor viral constitutivamente ativo (estava sempre ligado). Quando esse gene de fuso MyoD foi transfectado em vrias clulas, clulas pigmentadas, clulas nervosas, clulas adiposas, fibroblastos e clulas do fgado, foram convertidas em clulas semelhantes s musculares (Figura 9.9; Weintraub et al., 1989). Assim, MyoD parece ser suficiente para ativar os genes especficos do msculo que compem o fentipo muscular. MyoD codifica uma protena nuclear ligante de DNA que pode se ligar a regies do DNA adjacentes aos genes especficos do msculo, e ativ-los. Por exemplo,
Protenas especficas do msculo (desmina, cadeias pesadas de miosina)
Gene MyoD Neuroblastos, clulas gordurosas, fibroblastos Promotor viral ativo Ncleo Receptores especficos do msculo e molculas de membrana Miotubo
Figura 9.9
Sumrio de vrios experimentos em que o gene MyoD foi ativado por um promotor viral e transfectado para clulas no musculares. A protena MyoD parece no levar em conta os reguladores originais do fentipo celular, convertendo as clulas em msculos.
a protena MyoD parece ativar diretamente o gene da fosfoquinase da creatina especfica do msculo, ligando-se ao DNA imediatamente superior aquele (Lassar et al., 1989). De maneira semelhante, h dois stios ligantes de MyoD no DNA adjacente uma subunidade do gene do receptor da acetilcolina do msculo da galinha (Piette et al., 1990). Ele tambm ativa a si prprio diretamente. Uma vez que o gene MyoD est ligado, seu produto protico liga-se ao DNA imediatamente a montante do gene MyoD e o impede de ser desligado (Thayer et al., 1989). Em outros casos, os efeitos de MyoD podem ser indiretos. Nem todos os genes envolvidos na produo do fentipo muscular podem ser ativados diretamente pela protena MyoD. MyoD provavelmente atua indiretamente ativando outros genes reguladores, que em seguida ativam os genes estruturais especficos do msculo. MyoD no o nico gene comutador de msculo. H uma famlia de protenas semelhantes MyoD que tem estruturas muito semelhantes e parecem ser capazes de substituir extensamente uma a outra. Essa famlia (algumas vezes chamada a famlia MyoD ou protenas miognicas bHLH) inclui miogenina, Myf5 e MRF4; essas protenas parecem ligar-se a stios semelhantes no DNA (a ser discutido no Captulo
10). A transfeco de qualquer desses genes miognicos para um extenso espectro de clulas em cultura tambm as converte em msculo. A expresso de MyoD leva expresso da miogenina, e a transfeco dos genes da miogenina ativa a expresso de MyoD. Assim, h um enlace de retroalimentao recproca positiva que faz com que quando miogenina ou MyoD ativado, tambm o o outro gene (Thayer et al., 1989). No pinto, MyoD ativado em clulas somticas que geram a musculatura abdominal e dos membros, enquanto myf5 ativado em clulas produzindo os msculos do dorso. Em ambos os casos, essa ativao compromete as clulas somticas linhagem miognica. Ambos grupos celulares expressam miogenina e MRF4 para produzir seus miotubos e miofibras (Figura 9.10; Lyons e Buckingham, 1992; Pownall e Emerson, 1992a,b; Braun e Arnold, 1996; Cossu et al., 1996a). Em alguns casos, esses fatores de transcrio miognica podem compensar para a perda de um ou de outro. Usando uma tcnica de alvejar genes (veja Captulo 2), Rudnicki e colegas (1992) mostraram que Myf5 e MyoD podem realizar as mesmas funes. Quando camundongos carecem de ambos genes MyoD, a expresso do gene myf5 assume o controle. Os camundongos resultantes tm desenvol-
350
(A) Myf5 ou MyoD
Miogenina
MRF4
Clula no somito
Mioblasto
Miotubo
Miofibra
Mesoderma Paraxial
Tubo neural
Dermtomo
Mitomo
(B)
Clulas do sangue
Notocorda
(C)
Figura 9.10
Comprometimento e diferenciao muscular mediada pela famlia MyoD de fatores de transcrio. (A) Papis postulados para protenas miognicas durante a formao do msculo esqueltico no camundongo. (B) Hibridizao in situ indicando a ausncia do mRNA myf5 no mesoderma paraxial no segmentado do embrio. O lado esquerdo mostra fotografia sob o microscpio ptico da rea. (C) Hibridizao in situ mostrando a presena do mRNA myf5 no mitomo do somito embrionrio do camundongo. (A segundo Rudnicki et al., 1993; fotografias cortesia de G. Lyons.)
vimento muscular normal. Quando os camundongos carecem de seus genes myf5, eles tambm tm desenvolvimento muscular normal. Porm, a ausncia da protena Myf5 atrasa em vrios dias a formao do mitomo, causando falha no desenvolvimento adequado da poro lateral do esclertomo. Embora esses camundongos tenham msculos normais, suas caixas torcicas esto distorcidas e eles so incapazes de respirar (Braun et al., 1992). Experimentos recentes no laboratrio de Rudolf Jaenisch (Rudnicki et al., 1993) mostram que quando os genes myf5 e MyoD esto ambos ausentes do embrio, no se formam msculos e costelas.* Enquanto MyoD e Myf5 podem substituir uma a outra, no parece haver redundncia nas funes da miogenina. Camundongos homozigotos para uma mutao alvejada no gene myogenina morrem logo aps o nascimento por causa dos defei-
tos na formao de suas clulas musculares (Hasty et al., 1993; Nabeshima et al., 1993). Os somitos se formaram normalmente e foram compartimentalizados em mitomo, esclertomo e dermtomo, mas os mioblastos deixaram de se diferenciar em miofibras (Venuti et al, 1995). MyoD e seus parentes parecem ser crticos para a remoo de mioblastos do ciclo celular. Conforme j mencionado, mioblastos em diviso no se diferenciam. Essa distino entre diviso e diferenciao caracterstica de vrios tipos celulares derivados de populaes de clulas germinativas (Bischoff e Holtzer, 1969; Holtzer et al., 1975). Parece haver duas maneiras pelas quais o mioblasto se retira do ciclo celular. O primeiro mecanismo inibir o caminho da diviso celular. Para isso, a protena MyoD induz a expresso de p21, um inibidor de quinases dependentes de ciclina (Figura 9.11; Halevy et
*Isso significa que existe alguma redundncia no desenvolvimento dos msculos esquelticos. Tal redundncia j do conhecimento dos embriologistas h longa data (Spemann, 1938), mas os geneticistas a esto redescobrindo (para sua consternao, j que confunde a interpretao de tais experimentos). Gould (1990) considera a redundncia desenvolvimental essencial para evoluo ocorrer, j que um dos scios redundantes fica livre para conseguir uma nova funo enquanto o outro scio mantm a funo original.
al., 1995). O segundo mecanismo envolve a sub-regulao de seus receptores para o fator de crescimento. Um dos principais fatores de crescimento que promove a diviso das clulas mioblastos o fator de crescimento fibroblstico bsico. O FGF2 promove diviso da clula mioblasto, ao mesmo tempo que inibe a diferenciao do mioblasto suprimindo a transcrio de MyoD e myogenina (Vaidya et al., 1989; Brunetti e Goldfine, 1990). Os receptores FGF so perdidos quando o mioblasto se diferencia em uma clula muscular (Olwin e Hauschka, 1988; Moore et al., 1990). Como so ativadas as protenas da famlia MyoD? Novos experimentos forneceram as bases para algumas fascinantes especulaes. George-Weinstein e seus colegas (1996) demonstraram que quando epiblastos de galinha so isolados do resto da gstrula e separados em clulas individuais, essas clulas epiblastos se tornam msculo. Alm disso, os pesquisadores acharam que o mRNA de MyoD (e talvez a protena) est presente nessas clulas. Parece que clulas epiblastos tm a capacidade preferencial de ficarem comprometidas com os mioblastos, e que
351
(A) Proliferao Diferenciao
Figura 9.11
Ciclina D1 Cdk4 p21 Ativao Inibio
MyoD
Comutao entre proliferao e diferenciao. (A) Condies favorecendo proliferao (como quando h abundncia de fatores de crescimento de fibroblastos no meio) favorecem a continuada expresso da quinase 4 dependente de ciclina. Essa quinase capaz de reprimir a expresso de MyoD. (B) Reciprocamente, uma vez formada, o MyoD pode suprimir cdk4 atravs das ativao da protena p21. Dessa maneira, as clulas em diviso no se diferenciaro e as clulas diferenciadas no se dividiro. (Segundo Halevy et al., 1995.)
(B) Proliferao Diferenciao
Ciclina D1 Cdk4 p21
MyoD
somente suas interaes com outros tipos de clulas que as previnem de se tornarem msculos. Nesse caso, os fatores que promovem a miognese (como as protenas Wnt) podem faz-lo atravs da represso dos inibidores. Um desses inibidores pode ser a protena Twist. Essa protena um ligante de DNA muito parecido com MyoD. Porm, ela parece inibir MyoD e outras protenas ligadas aos promotores de seus genes-alvo especficos do msculo. O gene twist est originalmente presente em todo o somito preco-
ce, mas em seguida se torna especificamente ausente no mitomo (Spicer et al., 1996). possvel que MyoD e outras protenas bHLH miognicas j estejam presentes nas clulas epioblastos mas que estejam proibidas de funcionar at que a protena twist fique sub-regulada. Essa sub-regulao pode possivelmente vir como um resultado da secreo da protena Wnt (pela epiderme ou tubo neural), que poderia anular um efeito inibitrio mediado por Notch1. Alm das protenas bHLH, outro fator de transcrio, MEF2A, parece ser de importncia para o desenvolvimento muscular esqueltico. MEF2A tambm induz fibroblastos a se tornarem msculos, e parece cooperar com MyoD nos intensificadores de genes especficos do msculo. Kaushal e colegas (1994) especulam que MEF2A fornece especificidade adicional para a adeso do MyoD de tal forma que MyoD no ative inadvertidamente genes no musculares que possuam seqncias de regulao capazes de ligar protenas bHLH.
Osteognese: O Desenvolvimento dos Ossos Algumas das estruturas mais bvias que derivam do mesoderma somtico so os ossos. Neste captulo descreveremos em linhas gerais os mecanismos da formao dos ossos, e estudantes que gostariam de obter maiores detalhes podem faz-lo ao consultar livros de histologia os quais dedicam captulos inteiros a esse tema. Existem trs linhagens que geram o esqueleto. O esclertomo gera o esqueleto axial, o mesoderma da placa lateral gera o esqueleto dos membros, e a crista neural craniana d origem ao arco branquial e os ossos craniofaciais e a cartilagem.* Existem dois modos principais de formao dos ossos, ou osteognese, e ambos envolvem a transformao de um tecido mesenquimatoso prexistente no tecido sseo. A converso direta do tecido mesenquimatoso em osso chamada de ossificao intramembranosa. Isso ocorre primeiramente nos ossos do crnio. Em outros casos, as clulas mesenquimatosas se diferenciam em cartilagem, e essa cartilagem posteriormente reposta pelo osso. Esse processo pelo qual uma cartilagem intermediria resposta por clulas sseas chamada de ossificao endocondral.
OSSIFICAO INTRAMEMBRANOSA. Ossificao intramembranosa o meio ca-
racterstico pelo qual so formados os ossos chatos do crnio. Clulas mesenquimatosas derivadas da crista neural interagem com a matriz extracelular das clulas epiteliais da cabea para formar o osso. Se as clulas mesenquimatosas no contatam essa matriz, no ser formado osso algum (Tyler e Hall, 1977; Hall, 1988). Isso foi demonstrado in vitro por Hall e colegas (1983), que isolaram clulas mesenquimatosas da
* O desenvolvimento da cartilagem craniofacial foi discutido no Captulo 7 e ser revisado no Captulo 23; o desenvolvimento dos membros ser detalhado no Captulo 18.
352
Figura 9.12
Diagrama esquemtico da ossificao membranosa. (A) Clulas mesenquimatosas, provavelmente derivadas da crista neural, se condensam para produzir osteoblastos, que depositam matriz osteide. Esses osteoblastos ficam enfileirados ao longo da regio calcificada da matriz. Osteoblastos aprisionados dentro da matriz ssea tornam-se ostecitos. (B) Espalhamento de espculas sseas do local da ossificao primria nos ossos chatos do crnio de um embrio humano de trs meses. Os ossos mostrados em negro so formados por ossificao endocondral. (Segundo Langman, 1981.)
Osteoblastos
Matriz osteide
Osso calcificado
Clula ssea (ostecito) Espculas do osso frontal
Espculas do osso parietal
(A)
Mesnquima frouxo
Osteoblastos
(B)
cabea e as colocaram em placas de cultura. Se nenhuma matriz extracelular estiver presente na superfcie dessas placas, as clulas permanecem mesenquimatosas. No entanto, se clulas epiteliais da cabea tivessem secretado primeiro uma matriz extracelular na superfcie, as clulas se diferenciariam em clulas sseas. Os mecanismos responsveis pela converso de clulas mesenquimatosas em clulas sseas ainda desconhecido, mas evidncias recentes apontam para um grupo de molculas em particular na juno epitlio-mesnquima. Protenas morfogenticas do osso podem ser isoladas do osso adulto e injetadas em msculo embrionrio ou tecidos conjuntivos. Quando isso realizado, a cartilagem se desenvolve das clulas dentro desses tecidos e posteriormente substituda pelas clulas sseas (Syftestad and Caplan, 1984; Urist et al., 1984; veja Captulo 17). Durante a osssificao intramembranosa, as clulas mesenquimatosas se proliferam e se condensam em nodos compactos. Algumas dessas clulas se desenvolvem em capilares, outras mudam sua forma para se tornar osteoblastos, clulas capazes de secretar a matriz ssea. A matriz colgeno-proteoglicana secretada capaz de aglomerar sais de clcio, levados para essa regio atravs dos capilares. Desse modo, a matriz se torna calcificada. Na maioria dos casos, os osteoblastos so separados da regio de calcificao por uma camada de matriz pr-ssea (osteide) secretada por eles. Ocasionalmente, esses osteoblastos ficam presos na matriz calcificada e se tornam ostecitos - clulas sseas. Com a continuidade da calcificao, as espculas sseas se irradiam para fora do centro, que onde comeou a ossificao (Figura 9.12). Ademais, a regio inteira de espculas calcificadas fica rodeada por clulas mesenquimatosas compactas que formam o peristeo. As clulas da parte interna do peristeo tambm se tornam osteoblastos e depositam matriz ssea em paralelo com quela das espculas j existentes. Dessa maneira, muitas camadas de osso so formadas.
OSSIFICAO ENDOCONDRAL. Ossificao endocondral envolve a formao de tecido cartilaginoso de clulas mesenquimatosas agregadas e a subseqente reposio desse tecido por osso (Horton, 1990). O tecido cartilaginoso um modelo para o osso que o sucede. Os componentes esquelticos da coluna vertebral, a plvis, e as extremidades so primeiramente formados de cartilagem e posteriormente mudados para osso. Esse processo notvel coordena a condrognese (produo de cartilagem) com a osteognese (crescimento do osso); os elementos esquelticos esto simultaneamente suportando uma carga, crescendo em largura e respondendo a estresses locais. As clulas que formam tecidos cartilaginosos expressam Scleraxis, um fator de transcrio ao qual atribuda a ativao de genes especficos da cartilagem (veja Figura 9.13; Pgina de rosto; Cserjesi et al., 1995). Dessa maneira, a Scleraxis expressa nos esclertomos, no mesnquima facial que forma os precursores cartilaginosos
353
Figura 9.13
Localizao da mensagem da scleraxis nos locais de formao dos condrcitos. (A) Expresso de scleraxis em somitos de um embrio de camundongo de 12,5 dias. Essa seo foi cortada tangencialmente, e o tubo neural corre ao longo do eixo ntero-posterior. (B) Seo atravs de um embrio de camundongo de 11,5 dias onde transcries de scleraxis so vistas na cartilagem condensada do nariz e face e nos precursores dos membros e costelas. (Segundo Cserjesi et al., 1995; fotografias cortesia do Dr. E. Olson.)
(A)
(B)
do osso e no mesnquima do membro. Essa protena se mantm ativa at a cartilagem comear a ser substituda por tecido sseo. [mesend2.html] A formao da cartilagem pode ser dividida em trs fases: proliferao do mesnquima, condensao do mesnquima pr-cartilaginoso e diferenciao do condrcito. A condrognese iniciada quando as clulas mesenquimatosas divididas da pr-cartilagem comeam a expressar protenas da matriz extracelular causando-as a se condensarem em ndulos. A N-caderina parece ser importante na iniciao dessas condensaes, e N-CAM tambm aparenta ser essencial para mant-las nessa situao (Oberlender e Tuan, 1994; Hall e Miyake, 1995). Uma vez condensadas, as clulas se tornam condrcitos e comeam a secretar proteoglicanos e colgenos especficos do condrcito.* Em humanos, os ossos longos dos brotos dos membros embrionrios se formam de clulas mesenquimatosas que formam ndulos nessa regio que iro se transformar em ossos. Essas clulas se tornam condrcitos, e secretam a matriz extracelular da cartilagem. As clulas mesenquimatosas em sua volta se tornam o peristeo (Figura
* Mutaes que afetam a formao de ndulos freqentemente causam anomalias nos membros. Nas galinhas, as mutaes talpid so caracterizadas pela duplicao e fuso dos membros. Isso, por sua vez, descobriu-se, ter sido causado por condensaes pr-condrognicas anormalmente grandes. Esses grandes ndulos so causados pelo excesso de adesividade das clulas mesenquimatosas nessas condensaes, e foi diretamente ligado a uma super expresso de N-CAM (Ede 1983; Chuong et al., 1993). Em humanos, o gene SOX9 expresso por condensaes pr-cartilaginosas, e isso codifica uma protena ligante de DNA. As mutaes do gene SOX9 causa displasia camptomelica, uma doena rara do desenvolvimento esqueltico, causando uma srie de deformidades nos ossos do corpo. A maioria dos bebs afetados morrem de parada respiratria devido a m-formao das cartilagens traqueobronquiais e das costelas. (Wright et al., 1995).
354
Cartilagem epifisria Osteoblastos (osso)
Mesnquima
Cartilagem
Condrcitos hipertrficos
Vasos sangneos
Condrcitos proliferando Placa de crescimento Medula ssea Osso
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F) (G) Centro de ossificao secundria
Placa de crescimento
Figura 9.14
Diagrama esquemtico da ossificao endocondral. (A,B) Clulas mesenquimatosas se condensam em ndulos cartilaginosos que formam o modelo do osso. (C) Condrcitos no centro da haste sofrem hipertrofia e alteram sua matriz extracelular, permitindo a entrada de vasos sangneos. (D,E) Vasos sangneos trazem osteoblastos que se ligam matriz cartilaginosa em degenerao e deposita matriz ssea. (F-H) Formao das placas de crescimento epipifisrio pelos condrcitos, que se proliferam antes de hipertrofiar. Centros secundrios de ossificao tambm se formam quando vasos sangneos penetram perto das extremidades do osso. (Segundo Horton, 1990.)
(H)
9.14). Logo aps o modelo cartilaginoso ser formado, as clulas na parte central do modelo se tornam dramaticamente maiores e comeam a secretar um tipo diferente de matriz, que contm tipos diferentes de colgeno, mais fibronectina e menos inibidor de protease. Essas clulas so os condrcitos hipertrficos. A sua matriz mais susceptvel invaso pelas clulas de vasos sangneos do peristeo. Um capilar do peristeo invade, em seguida, o centro da haste da cartilagem previamente avascular. Com a degradao da matriz da cartilagem, as clulas da cartilagem hipertrfica morrem, e osteoblastos (clulas formadoras de ossos), transportados pelos vasos sangneos, comeam a secretar matriz ssea sobre a cartilagem parcialmente degradada (Hattori et al.,1995). Finalmente toda a cartilagem substituda por osso. Como o centro do modelo da cartilagem convertido em osso, formada uma frente de ossificao entre o osso recm-sintetizado e o restante da cartilagem. O lado da cartilagem dessa frente contm a cartilagem hipertrfica que prepara a haste para a invaso pelos vasos sangneos, e o lado do osso contm as clulas osteoblsticas depositando a matriz ssea. Essa frente se espalha de dentro para fora em ambas as direes a partir do centro, enquanto mais cartilagem se transforma em osso. Se isso fosse tudo, no entanto, no existiria crescimento, e nossos ossos seriam somente do tamanho do modelo cartilaginoso original. Porm, com a frente de ossificao se aproximando dos finais do modelo cartilaginoso, os condrcitos prximos frente de ossificao se proliferam antes de sofrer hipertrofia. Isso estica a parte final cartilaginosa do osso, fornecendo uma fonte para nova cartilagem. Essas regies cartilaginosas no final dos ossos longos so chamadas placas de crescimento epifisrio. Essas placas contm trs regies: uma regio de proliferao de condrcitos, uma regio de condrcitos maduros, e uma regio de condrcitos hipertrofiados (Figura 9.15; Chen et al.,1995). Como essa cartilagem se hipertrofia e a frente de ossificao se estende mais adiante, a cartilagem remanescente na placa epifisria se prolifera. Essa cartilagem forma a rea de crescimento do osso. Dessa maneira, o osso se mantm em crescimento pela produo de novas clulas cartilaginosas que sofrem hipertrofia, permitindo aos vasos sangneos entrarem, e morrem medida que a matriz ssea
355
(B)
Cartilagem de reserva Clulas cartilaginosas em proliferao Zona de condrcitos maduros
(C)
(A)
Hipertrofia e calcificao das clulas cartilaginosas Zona de degenerao e ossificao de cartilagem
Osso calcificado
Figura 9.15
depositada. Enquanto as placas de crescimento epifisrio forem capazes de produzir condrcitos o osso continua a crescer. As placas de clulas de crescimento epifisrio so muito sensveis a hormnios, e sua proliferao estimulada pelo hormnio de crescimento e fatores de crescimento semelhantes insulina. Nilsson e colegas (1986) mostraram recentemente que hormnios de crescimento estimulam a produo do fator I de crescimento semelhante insulina (IGF-I) nesses condrcitos e que esses condrcitos respondem a isso proliferando-se. Quando eles adicionaram hormnio de crescimento placa de crescimento da tbia de um camundongo jovem (que no conseguia fabricar o seu prprio hormnio de crescimento porque suas hipfises haviam sido removidas), os hormnios de crescimento estimularam a formao de IGF-I dos condrcitos na zona proliferativa (veja Figura 9.15). A combinao de hormnios de crescimento e IGF-I parece fornecer um sinal mittico extremamente forte. Os pigmeus da floresta Ituri, no Zaire, tm nveis normais de hormnios de crescimento e IGF-I at a puberdade. No entanto, na puberdade, os nveis de IGF-I nos pigmeus caem para aproximadamente um tero em comparao com os de outros adolescentes. Parece que IGF-I essencial para uma arrancada normal no crescimento durante a puberdade (Merimee et al., 1987). Hormnios tambm so responsveis pela interrupo no crescimento. No final da puberdade, nveis elevados de estrgeno e testosterona fazem com que a cartilagem remanescente da placa epifisria sofra hipertrofia. Essas clulas cartilaginosas crescem, morrem e so substitudas por ossos. Sem alguma cartilagem adicional, o crescimento desses ossos cessa. A reposio de condrcitos por osteoblastos parece depender da mineralizao da matriz extracelular. Em embries de galinha, a fonte de clcio o carbonato de clcio da casca do ovo, e durante o seu desenvolvimento, o sistema circulatrio da galinha transloca aproximadamente 120 mg de clcio da casca do ovo para o esqueleto (Tuan, 1987). Quando embries de galinha so removidos de suas cascas no terceiro dia e crescem em cultura sem a casca (em envelopes plsticos) durante o restante do seu desenvolvimento, muito do esqueleto cartilaginoso deficiente em clcio no se desenvolve em tecido sseo (Figura 9.16; Tuan e Lynch, 1983). Nos mamferos, o clcio transferido atravs da placenta e depositado na matriz pelos
Proliferao de clulas na placa epifisria em resposta ao hormnio de crescimento. (A) Regio cartilaginosa em um rato jovem tornado deficiente em hormnio de crescimento pela remoo de sua hipfise. (B) A mesma regio no rato aps injeo de hormnio de crescimento. (C) Cartilagem corada em regies particulares da placa de crescimento. (Fotografias de I. Gersh, de Bloom e Fawcett, 1975: C de Chen et al., 1995; cortesia de P. Goetinck.)
356
Figura 9.16
Mineralizao esqueltica em um embrio de pinto de 17 dias que se desenvolve (A) em uma cultura sem casca e (B) dentro da casca durante a incubao normal. Os embries foram fixados e corados com vermelho de Alizarina par mostrar a matriz calcificada. (de Tuan e Lynch, 1983, cortesia de R. Tuan.)
(A)
(B)
condrcitos. J foi demonstrado que condrcitos hipertrficos mudam a respirao de aerbica para anaerbica (Brighton e Hunt, 1974; Brighton, 1984), causando uma diminuio no ATP celular e no emprego de uma via para energia mediada pela fosfocreatina, tal como a usada em msculos esgotados de oxignio (Shapiro et al., 1992). Por algum mecanismo ainda desconhecido, imagina-se que essas mudanas metablicas resultem em depsito de clcio na matriz extracelular, dentro de pequenas estruturas limitadas por membranas, conhecidas como vesculas da matriz (Wuthier, 1982). Isso inicia o processo da calcificao e permite os osteoblastos aderir e iniciar a formao do osso (Figura 9.17). medida que novo material sseo adicionado perifericamente da superfcie interna do peristeo, ocorre uma cavitao na regio interna para formao da cavidade da medula ssea. Essa destruio de tecido sseo devida aos osteoclastos, clulas multinucleadas que adentram o osso atravs dos vasos sangneos (Kahn e Simmons, 1975; Manolagas e Jilka, 1995). Osteoclastos so provavelmente derivados dos mesmos precursores que as clulas sangneas, e so responsveis pela dissoluo de ambas pores da matriz do osso, a inorgnica e a protena (Ash et al., 1980; Blair et al., 1986). Os osteoclastos estendem numerosos processos celulares na matriz, bombeando ons de hidrognio oriundos do osteoclasto para o material em seu redor, acidificando-o e solubilizando-o (Figura 9.18; Baron et al., 1985, 1986). Os vasos sangneos tambm importam as clulas formadoras de sangue, que iro residir na medula pelo resto da vida do organismo.
Clcio na matriz extracelular
Condrcitos
Figura 9.17
Deposio de clcio pelos condrcitos na regio distal da zona hipertrfica. Clcio (corado em escuro nesta montagem de micrografia eletrnica) colocado na matriz pelas clulas em crescimento. (de Brighton e Hunt, 1974; cortesia de C. T. Brighton.)
357
Porcentagem do osso solubilizado
45
Ca
[3H] Prolina
(A)
(B)
(C)
Tempo (horas)
Figura 9.18
Atividade osteoclstica na matriz ssea. (A) Micrografia eletrnica da membrana franzida de um osteoclasto de pinto cultivado em uma matriz ssea reconstituda. (B) Seo da membrana franzida corada para detectar presena de uma ATPase capaz de transportar ons de hidrognio da clula. A ATPase est restrita membrana do processo celular. (C) Solubilizao de componentes inorgnicos e colagenosos da matriz (conforme medido pela liberao de [45Ca] e prolina [3H], respectivamente) pelos 10.000 osteoclastos incubados sobre fragmentos sseos marcados. (A e C de Blair et al., 1986; B de Baron et al., 1986, cortesia dos autores.)
&
Especulaes
Controle da Condrognese na Placa de Crescimento
ESCOBERTAS RECENTES de mu-
taes do desenvolvimento esqueltico de seres humanos e murinos forneceram notveis vises sobre como a diferenciao, proliferao e padronizao de condrcitos so reguladas.
Receptores do Fator de Crescimento Fibroblstico

A proliferao das clulas epifisrias das clulas da placa de crescimento e da cartilagem facial pode ser interrompida pela presena de fatores de crescimento fibroblstico (Deng et al., 1996; Webster e Donoghue, 1996). Esses fatores parecem instruir os precursores da cartilagem de se diferenciarem em vez de se dividirem. Em humanos, mutaes nos receptores para fatores de crescimento de fibroblastos podem fazer com que esses receptores se tornem prematuramente ativados. Isso d origem aos principais tipos de nanismo humano. A acondroplasia uma
mutao dominante causada por mutaes na regio transmembrana do receptor 3 do fator de crescimento fibroblstico (FGFR3). Aproximadamente 95% dos anes acondroplsicos tm a mesma mutao de FGFR3, uma substituio do par de bases que converte glicina em arginina na posio 380 na regio transmembrana da protena. Alm disso, mutaes na poro extracelular da protena FGFR3 ou no domnio da tirosina quinase intracelular resultaram na displasia tanatofrica, uma forma letal de nanismo que se parece com a acondroplasia homozigota (Figura 9.19; Bellus et al., 1995; Tavormina et al., 1995). Mutaes em FGFR1 podem causar a sndrome de Pfeiffer, caracterizada por defeitos nos membros e fuso prematura das suturas cranianas (craniosinostose), resultando em formas anormais do crnio e da face. Mutaes diferentes em FGFR2 podem originar vrias anomalias nos membros e/ou face (Park et al., 1995; Wilkie et al., 1995). [cell7.html]
A matriz extracelular da cartilagem tambm crtica para a diferenciao e organizao apropriadas de condrcitos da placa de crescimento. Mutaes que afetam o colgeno do tipo IV ou a sulfatao de proteoglicanos da cartilagem podem causar severas anomalias esquelticas. Camundongos com deficincia de colgeno de tipo XI morrem ao nascer com anormalidades nas cartilagens dos membros, mandbula, costelas e traquia (Li et al., 1995). Falncia em adicionar grupos sulfato a glicoproteoglicanos da cartilagem causa displasia distrfica, um nanismo humano caracterizado por uma severa curvatura da espinha, p torto e lbulos da orelha deformados (Hstbacka et al., 1994).[cell6.html]
Receptores de Estrgeno
Hormnios tambm so conhecidos por ter um efeito marcado sobre a epfise humana. O surto de crescimento puberal e amadurecimento subseqente da placa epifisria
358
(A)
(B)
(C)
Figura 9.19
Displasia ssea humana causada por mutaes dominantes ativadoras do receptor 3 do fator de crescimento fibroblstico. (A) Displasia tanatofrica, uma condio fatal caracterizada por severo encurtamento das costelas e membros devido cobertura das epfises por tecido sseo. A morte devido a problemas respiratrios. (B) Fotografia por raios-X de um infante nascido com displasia tanatofrica. (C) Seo microscpica mostrando a desorganizao de uma epfise na displasia tanatofrica. Notar a ausncia de condrcitos em diviso. (de Gilbert-Barness e Opitz, 1996.)
(i.e., a converso de clulas em proliferao para cartilagem madura e osso) so induzidas por hormnios sexuais (Kaplan e Grumbach, 1990). Em condies de puberdade precoce, existe uma arrancada no crescimento inicial (tornando o indivduo mais alto do que o seu par), seguido pela interrupo da diviso celular epifisria (permitindo que seu par alcance e ultrapasse o seu peso). No se pensava que, no sexo masculino, o estrgeno tivesse alguma participao nesses eventos. No entanto, em 1994 Smith e colegas relataram o caso verdico de um homem cujo crescimento ainda era linear apesar de ter passado por uma puberdade normal. Suas placas epifisrias no haviam maturado, e ele
ainda possua proliferao de condrcitos aos 28 anos de idade. Sua idade ssea - a quantidade de cartilagem epifisria que havia retido - era aproximadamente a metade de sua idade cronolgica. Descobriu-se que nessa pessoa no estava presente qualquer receptor de estrgeno funcional. Portanto, o estrgeno cumpre um papel na maturao epifisria no sexo masculino tanto quanto no feminino. Hormnios da tireide e hormnios relacionados paratireide tambm so importantes na regulao da maturao e no programa de hipertrofia da placa de crescimento epifisrio (Ballock e Reddi, 1994). Dessa forma, crianas com hipotireoidismo so susceptveis a desenvolver doenas da placa de crescimento.[limb3.html]
Mesoderma da Placa Lateral

Nem todos os mantos mesodrmicos so organizados em somitos. Adjacente ao mesoderma somtico est a regio mesodrmica intermediria. Essa corda de clulas mesodrmicas se desenvolve no tbulo pronfrico, que precursor do rim e dos dutos genitais. O desenvolvimento desses sistemas de rgos ser discutido em detalhe nos Captulos 17 e 19, respectivamente. Mais adiante lateralmente em cada lado chegamos placa mesodrmica lateral. Essas placas se dividiem horizontalmente em mesoderma (parietal) somtico dorsal, abaixo do ectoderma e o mesoderma (visceral) esplncnico ventral, que se superpe ao endoderma (veja Figura 9.2C). Entre essas camadas est a cavidade corporal - o celoma - que se estende da futura regio do pescoo at a parte posterior do corpo. Mais tarde no desenvolvimento, os celomas do lado direito e esquerdo se fundem e se dobram alongando-se do
359
(A) EMBRIO DE R Placa neural Somito Notocorda Endoderma Tubo neural Mesoderma somtico Mesoderma Esplncnico Mesoderma da placa lateral
Crista neural Celoma
Intestino mdio
(B)
EMBRIO DO PINTO Cortes para remoo do embrio
Figura 9.20
Vitelo
Intestino primitivo Rasgo Rasgo
( C ) PINTO TRANSFORMADO EM R Tubo neural Somito Celoma Intestino primitivo Vitelo
Comparao entre o desenvolvimento mesodrmico em embries de r e pinto. (A) Embries de r em estgio de nurula mostrando desenvolvimento progressivo do mesoderma e celoma. (B) Seo transversa de um embrio de pinto. (C) Quando o embrio de pinto separado da sua enorme massa de vitelo, parece uma nurula anfbia em estgio semelhante. (A segundo Rugh, 1951; B e C segundo Patten, 1951.)
EMBRIO DE PINTO (removido do vitelo; margens rejuntadas)
EMBRIO DE R
mesoderma somtico, dividem o celoma em cavidades separadas. Nos mamferos, o celoma subdividido em espaos pleural, pericardaco e peritoneal, envolvendo o trax, corao e abdome, respectivamente. O mecanismo para a criao de somitos mesodrmicos e revestimento corporais mudou pouco atravs da evoluo dos vertebrados, e o desenvolvimento do mesoderma da galinha pode ser comparado com estgios similares nos embries da r (Figura 9.20). Formao das Membranas Extra-Embrionrias O desenvolvimento embrionrio nos rpteis, aves e mamferos tomou uma nova direo. Os rpteis desenvolveram um mecanismo para depositar ovos na terra seca, dessa forma liberando-os para explorar nichos que no estavam to perto das guas. Para conseguir isso, o embrio produziu quatro conjuntos de membranas extra-embrionrias para medi-lo com o ambiente, e mesmo que a maior parte dos mamferos tenha desenvolvido placentas ao invs de cascas, o padro bsico das membranas extra-embrionrias permaneceu o mesmo. Em rpteis, aves e mamferos em desenvolvimento, inicialmente no existe distino entre domnios embrionrios e extra-embrionrios. No entanto, como o corpo do embrio toma forma, o epitlio lateral se divide desigualmente para criar dobras corporais, isolando o embrio do vitelo e delineando quais reas devero ser embrionrias e quais extra-embrionrias (Miller et al., 1994).
360
(A) Dobra da cabea do mnio Ectoderma Mesoderma somtico Mesoderma esplncnico Endoderma Envoltrio vitelnico Vitelo (C) Cabea do embrio Celoma extra-embrionrio
(B) Celoma extra-embrionrio Ectoderma Mesoderma somtico Mesoderma esplncnico Endoderma Envoltrio vitelnico Vitelo
Dobra da cabea do mnio
Embrio Dobra caudal do mnio
Crio Ectoderma Tubo neural Notocorda Aorta Mesnquima Endoderma Mesoderma Esplncnopleura do saco vitelnico Invaginao Alantica (D) Embrio mnio Intestino Cavidade amnitica Crio Vitelo Membrana alantica (E)
Intestino mdio Intestino posterior
Cavidade amnitica Cavidade crio-amnitica
mnio
Proctdeo Alantide adentrando o celoma extra-embrionrio
Embrio Intestino mnio Cavidade amnitica Crio Vitelo Saco vitelnico Alantide
Figura 9.21
Membrana alantica
Desenho esquemtico das membranas extraembrionrias do pinto. O embrio est cortado longitudinalmente e os revestimentos de albumina e da casca no so mostrados. (A) embrio de 2 dias. (B) Embrio de 3 dias. (C) Diagrama esquemtico detalhado da regio caudal (posterior) do embrio do pinto, mostrando a formao da alantide. (D) Embrio de 5 dias. (E) Um embrio de 9 dias. (Segundo Carlson, 1981.)
As dobras membranosas so formadas pela extenso do epitlio ectodrmico e endodrmico escorado pelo mesoderma. A combinao de ectoderma e mesoderma, freqentemente referida como somatopleura, forma as membranas do mnio e crio e a combinao de endoderma e mesoderma - a esplancnopleura - forma o saco vitelnico e a alantide. Os tecidos endodrmicos e ectodrmicos agem como clulas epiteliais funcionais; e o mesoderma gera o suprimento de sangue essencial para l e para c do epitlio. A formao dessas dobras pode ser observada na Figura 9.21.
361
O primeiro problema de um ovo vivendo na terra a dessecao. Clulas embrionrias secariam rapidamente se no estivessem em um ambiente aquoso. Esse ambiente suprido pelo mnio. As clulas dessa membrana secretam fluido amnitico; assim, a embriognese ainda acontece na gua. Esse avano evolucionrio to significativo e caracterstico que rpteis, aves e mamferos esto agrupados como vertebrados amniticos. O segundo problema desses ovos a troca de gases. Essa troca realizada pelo crio, a membrana extra-embrionria mais externa. Nas aves e rpteis, essa membrana se adere casca, permitindo a troca de gases entre o ovo e o ambiente. Nos mamferos, como havamos dito, o crio evoluiu tornando-se placenta, que tem muitas funes alm da respirao. A alantide armazena resduos urinrios e media a troca de gases. Nos rpteis e aves, a alantide se torna um grande saco, j que no existe outro modo para manter os subprodutos do metabolismo do embrio em desenvolvimento. A camada mesodrmica da membrana da alantide freqentemente alcana e se funde com a camada mesodrmica do crio para criar a membrana corioalantica. Esse envelope extremamente vascularizado crucial para o desenvolvimento da ave, e o responsvel pelo transporte de clcio da casca do ovo para o embrio para produo de ossos (Tuan, 1987). Nos mamferos, o tamanho da alantide depende do sucesso da remoo dos resduos de nitrognio pela placenta corinica. Em humanos a alantide um saco vestigial; enquanto nos porcos um rgo grande e importante. O saco vitelnico a primeira membrana extra-embrionria a ser formada, visto que ele medeia a nutrio em aves e rpteis em desenvolvimento. Ele derivado de clulas endodrmicas que crescem sobre o vitelo para englob-lo. O saco vitelnico conectado ao intestino mdio por um tubo aberto, o duto vitelnico, para que as paredes do saco vitelnico e do intestino sejam contnuas. Os vasos sangneos dentro do mesoderma da esplancnopleura transportam nutrientes do vitelo para o corpo, pois o vitelo no levado diretamente para o corpo atravs do duto vitelnico. Ao contrrio, clulas endodrmicais digerem a protena em aminocidos solveis, que podem ento ser passados aos vasos sangneos envolvendo o saco vitelnico. Outros nutrientes, incluindo vitaminas, ons e cidos graxos so armazenados no saco vitelnico e transportados pela circulao embrionria. Por esses caminhos, as quatro membranas extra-embrionrias permitem que o embrio se desenvolva em terra. O Corao O sistema circulatrio uma das grandes conquistas do mesoderma da placa lateral. Consistindo de um corao, clulas sangneas e um intricado sistema de vasos sangneos, o sistema circulatrio fornece a nutrio para o embrio vertebrado em desenvolvimento. O sistema circulatrio a primeira unidade funcional no embrio em desenvolvimento, e o corao o primeiro rgo funcional. O corao vertebrado surge de duas regies do mesoderma esplncnico que interagiu com tecido adjacente para se tornar especfico para o desenvolvimento do corao. Essas clulas cardiognicas migram para uma posio mediana ventral e se fundem para se tornar um tubo simples de clulas musculares que se contraem. Esse corao tubular se contorce formando uma estrutura em forma de S, com um nico trio e um nico ventrculo. Com a continuao do desenvolvimento, o ventrculo forma suas camadas e se prolifera mais rapidamente que o trio, os septos separam as cmaras do corao e as vlvulas se desenvolvem.
FUSO DOS RUDIMENTOS DO CORAO. Nos anfbios, as duas provveis
regies formadoras do corao so inicialmente encontradas na posio mais anterior da manta mesodrmica. Enquanto o embrio est sofrendo neurulao, essas duas regies se juntam na regio ventral do embrio para formar uma cavidade pericardial comum. Nas aves e mamferos, o corao tambm se desenvolve pela
362
Anterior (rostral)
Clulas se tornam notocorda
m distante do ndulo de Hensen
Ndulo de Hensen Tronco arterioso Ventrculo Bulbus cordis
Clulas se tornam corao
Seio venoso (A) Posterior (caudal) (B) + = promotor de determinantes cardacos - = repressor de determinantes cardacos
Figura 9.22
Ectoderma
Mesoderma
Endoderma (C)
Clulas formadoras do corao no embrio do pinto. (A) Origem de clulas cardacas no embrio precoce do pinto (estgio 3b). O padro ntero-posterior geral do sulco primitivo visto no endocrdio e miocrdio do corao. (B) Modelo para a especificaco do mesoderma cardaco. Os caminhos da migrao mesodrmica nas vrias regies do sulco primitivo esto representados por setas. Sinais que induzem miognese cardaca esto representados por + , e inibidores da induo cardaca esto representados como - . O mesoderma migratrio na regio 1 no encontra indutores ou repressores. Clulas migrando da regio 3 encontram ambos. Somente clulas migrando da regio 2 encontram o indutor sem o inibidor. (C) Micrografia eletrnica de varredura do mesoderma formador do corao no embrio de pinto de 24 horas. O mesoderma facilmente separado do ectoderma, mas permanece em ntima associao com o endoderma. (A segundo Garcia-Martinez e Schoenwolf, 1993; B segundo Schultheiss et al., 1995; C de Linask e Lash, 1986, cortesia de K. Linask.)
fuso de primrdios pareados, mas a fuso desses dois rudimentos ocorre muito mais tardiamente no desenvolvimento. Nesses vertebrados amniticos, o embrio um disco achatado, e o mesoderma da placa lateral no circunda completamente o saco vitelnico. As provveis clulas do corao se originam no sulco primitivo precoce, um pouco posterior ao ndulo de Hensen e se estendem at cerca da metade do seu comprimento (Figura 9.22A). Essas clulas migram atravs do sulco e formam dois grupos de clulas mesodrmicas laterais ao (e no mesmo nvel do) ndulo de Hensen (Figura 9.22B; Garcia-Martinez e Schoenwolf, 1993). Quando o embrio do pinto tiver somente 18 a 20 horas de idade, essas provveis clulas do corao se movem anteriormente entre o ectoderma e o endoderma em direo ao meio do embrio, permanecendo em estreito contato com a superfcie endodrmica (Figura 9.22C; Linask e Lash, 1986). Quando as clulas alcanam a rea onde o intestino se estendeu at a regio anterior do embrio, a migrao cessa. O direcionamento para essa migrao parece ser fornecido pelo endoderma. Se o endoderma da regio cardaca girado com respeito ao resto do embrio, a migrao das clulas mesodrmicas pr-cardacas invertida. Pensa-se que o componente endodrmico responsvel por esse movimento um gradiente ntero-posterior de concentrao da fibronectina. Anticorpos contra a fibronectina interrompem a migrao, enquanto anticorpos contra outros componentes da matriz extracelular no o fazem (Linask e Lash, 1988a,b).
363
O endoderma tambm faz com que as clulas pr-cardacas comecem seu desenvolvimento como msculos do corao. O endoderma anterior pode fazer com que as clulas mesodrmicas no cardacas expressem protenas especficas do corao tanto em aves como em anfbios (Jacobson, 1961; Sugi e Lough, 1994; Nascone e Mercola, 1995; Schultheiss et al., 1995). Essa diferenciao ocorre independentemente nos dois primrdios formadores do corao, um migrando ao encontro do outro. As presuntivas clulas do corao de aves e mamferos formam um tubo de parede dupla consistindo de um endocrdio interior e um epimiocrdio exterior. O endocrdio formar o revestimento interno do corao, e o revestimento externo formar a camada dos msculos do corao que iro bombear por toda a vida do organismo. Com a continuao da neurulao, o intestino anterior fechado pelo dobramento interno do mesoderma esplncnico (Figura 9.23). Esse movimento junta os dois tubos, finalmente unindo o epimiocrdio em um tubo nico. Os dois endocrdios ficam em uma cmara comum por um curto perodo, mas tambm iro se fundir. Nessa altura, a dupla cmara celmica original se une para formar a cavidade do corpo que aloja o corao. A origem bilateral do corao pode ser demonstrada atravs de interveno cirrgica, prevenindo a fuso do mesoderma da placa lateral (Grper, 1907; DeHaan, 1959). Isso resulta em uma condio chamada crdia bfida, na qual um corao em separado se forma em cada lado do corpo (Figura 9.24). A prxima etapa na formao do corao a fuso dos tubos endocrdicos para formao de uma nica cmara de bombeamento (veja Figura 9.23C,D). Essa fuso ocorre aproximadamente s 29 horas do desenvolvimento das aves e na terceira semana da gestao humana. As partes posteriores no fundidas do endocrdio se tornam as aberturas das veias vitelnicas para o corao (Figura 9.25). Essas veias vo carregar nutrientes do saco vitelnico para o seio venoso. O sangue ento passa atravs de uma lmina semelhante vlvula de forma achatada, para a regio atrial do corao. Contraes do tronco arterioso aceleram o sangue para a aorta. As pulsaes do corao comeam enquanto os primrdios pareados ainda esto se fundindo. O marcapasso dessa contrao o seio venoso. Contraes comeam aqui e uma onda de contrao muscular ento propagada at o corao tubular. Desse modo, o corao pode bombear sangue mesmo antes do seu intricado sistema de vlvulas ter sido completado. As clulas musculares do corao tm na sua prpria herana a habilidade de contrair, e clulas do corao isoladas de um rato com 7 dias ou de embries de pintos, vo continuar a bater em placas de Petri (Harary e Farley, 1963; DeHaan, 1967). No embrio, essas contraes se tornam reguladas por estmulos eltricos procedentes da medula oblongata via nervo vago, e em 4 dias, o eletrocardiograma de um embrio de pinto se aproxima daquele de um animal adulto.
FORMAO DAS CMARAS DO CORAO. Em um embrio de pinto de 3 dias ou
um embrio humano de 5 semanas, o corao um tubo de duas cmaras, com um trio e um ventrculo. Em um embrio de pinto podemos observar a olho nu, o extraordinrio ciclo do sangue entrando na cmara de baixo e sendo bombeado para fora atravs da aorta. A separao desse tubo em um trio e um ventrculo distintos completada quando clulas do miocrdio produzem um fator (provavelmente o fator transformador de crescimento 3) que faz com que as clulas do endocrdio adjacente se desprendam e entrem na gelatina cardaca rica em hialuronato situada entre as duas camadas (Markwald et al., 1977; Potts et al., 1991). Nos seres humanos, essas clulas causam a formao do colcho endocrdico que divide o tubo nos canais trioventriculares direito e esquerdo (Figura 9.26). Enquanto isso, o trio primitivo dividido pelo crescimento de dois septos que crescem ventralmente em direo aos colches endocrdicos. Os septos, no entanto, possuem orifcios para que o sangue ainda possa atravess-los. Esse atravessar do sangue necessrio para a sobrevivncia do feto antes que a circulao para os pulmes funcionais seja estabelecida. Na primeira respirao, no entanto, esses orifcios se fecham e os circuitos circulatrios direito e esquerdo ficam estabelecidos (veja Informaes Adicionais e Especulaes
364
Figura 9.23
(A) Ectoderma da placa neural Notocorda Sulco neural Mesnquima ceflico Ectoderma superficial
Formao do corao. Sees transversais atravs da regio formadora do corao do pinto de (A) 25 horas, (B) 26 horas, (C) 28 horas e (D) 29 horas. (Segundo Carlson, 1981.)
Somatopleura
Intestino
Cavidade pericardial
Esplncnopleura Endoderma
Epimiocrdio (mesoderma esplncnico engrossado) (B) Sulco neural (fechando)
Conjuntos celulares angiogenticos
Mesnquima ceflico
Somatopleura Cavidade pericardial Esplancnopleura
Primrdio do epicrdio (C) Canal neural
Primrdio endocrdio
Intestino anterior Somatopleura
Cavidade Pericrdica Esplancnopleura
Tubo endocrdico Epimiocrdio (D) Tubo neural
Mesocrdio ventral
Intestino anterior
Somatopleura Cavidade Pericrdica Esplancnopleura Tubo endocrdico Epimiocrdio Mesocrdio ventral (desaparecendo)
na pgina 372). A separao entre esses ventrculos completada pelo crescimento do septo ventricular em direo ao colcho endocrdico. Com essa separao (que normalmente ocorre na stima semana do desenvolvimento humano), o corao uma estrutura com quatro cmaras com um tronco pulmonar conectado ao ventrculo direito e a aorta conectada ao esquerdo.
365
Figura 9.24
Fuso dos rudimentos cardacos esquerdos e direitos para formar um tubo cardaco nico. (A) Embrio de pinto ( 30 horas) mostrando os primrdios do corao pareados, encontrando-se nas linhas medianas ventrais. (B) Crdia bfida no embrio do pinto causado pelo impedimento da fuso de dois primrdios cardacos. (A cortesia de K. Linask; B cortesia de R. L. DeHaan.)
(A)
(B)
Uma questo que surge nesses estudos , como a polaridade direita-esquerda surge no corao se esses lados comeam igualmente? Por que o lado esquerdo do corao se torna diferente do lado direito? Estudos em fetos com coraes mal formados que possuem dois lados direitos ou dois lados esquerdos, mostram uma correlao entre a presena do bao e o lado esquerdo do corao. Polisplenia (um
(A)
(B) Razes articas
(C)
Bulbus cordis
Bulbus cordis
Sulco bulboventricular
Ventrculo trio Veias vitelnicas 21 dias (D) Razes articas Bulbus cordis
Ventrculo trio Seio venoso 22 dias (E) trio direito trio esquerdo Seio Venoso
trio esquerdo
24 dias
Figura 9.25
Tronco arterioso trio esquerdo Ventrculo Esquerdo
Ventrculo direito Ventrculo esquerdo Veias vitelnicas 25 dias Sulco interventricular 29 dias
Formao da cmara cardaca durante a terceira semana do desenvolvimento humano, mostrando a formao das cmaras a partir de um tubo simples. Vistas A-D mostram o corao em desenvolvimento do lado esquerdo; E uma viso frontal. Embora os trios sejam distintos externamente, no esto separados dentro do corao. Note que h duas razes articas e que essas se ramificam para formar os arcos articos (veja Figura 9.27). (Segundo Langman, 1981, e Larsen, 1993.)
366
Veia cava superior Septo primrio Forame primrio Septo atrial secundrio Seio venoso Canal trio-ventricular esquerdo Septo atrial primrio
Vlvula da veia cava inferior Vlvula do seio coronrio
Colches endocrdicos fundidos
Veia cava inferior Septo interventricular (A) 25 dias (B) 40 dias
Figura 9.26
Formao das cmaras do corao. (A) Corte diagramtico transversal do corao humano de 4,5 semanas. Os septos do rtrio e do ventrculo esto crescendo em direo ao colcho endocrdico. (B) Seo transversal do corao humano antes do nascimento. O sangue pode passar do lado direito do corao para o esquerdo, atravs das aberturas nos septos primrios e secundrios do trio. (Segundo Larsen, 1993.)
bao tanto do lado esquerdo como direito do corpo) est associada a coraes com dois lados esquerdos, enquanto asplenia (ausncia do bao) est associada a coraes com dois lados direitos (Anderson et al., 1990; Ho et al., 1991). O mecanismo para a assimetria esquerda-direita no entendido, mas Tsuda e colegas (1996) mostraram uma deposio assimtrica precoce da protena flectina, da matriz extra celular, a qual pode predispor um lado do corao a se desenvolver diferentemente do outro (Prancha 33)*. Vasos Formao dos Vasos Sangneos
LIMITAES RELATIVAS CONSTRUO DE VASOS SANGNEOS. Existem trs limitaes principais para a construo de vasos sangneos. A primeira fisiolgica. Diferentemente de novas mquinas, que no necessitam funcionar at terem sado da linha de montagem, os organismos novos precisam funcionar mesmo enquanto se desenvolvem. As clulas embrionrias precisam obter nutrientes antes que exista um intestino, fazer uso do oxignio antes que existam pulmes, e excretar resduos antes que os rins estejam prontos. Portanto, a fisiologia ciculatria do embrio em desenvolvimento difere daquela do organismo adulto, e o seu sistema circulatrio reflete tais diferenas. O alimento no absorvido atravs do intestino, mas pelo vitelo ou placenta, e a respirao no conduzida pelas guelras ou pulmes, mas atravs da membranas corinicas ou alanticas. Os principais vasos sangneos embrionrios devem ser construdos para servir a essas estruturas extra-embrionrias. A segunda limitao evolucionria. O embrio mamfero estender vasos sangneos at o saco vitelnico mesmo no havendo vitelo no interior. Alm disso, o sangue que deixa o circuito do corao passa por cima do intestino anterior para formar a aorta localizada dorsalmente. Os seis pares de arcos articos passam por cima da faringe (Figura 9.27). Nos peixes primitivos, esses arcos persistem e permitem que
*Discutiremos polaridade direita-esquerda no Captulo 16.
367
Figura 9.27
(A) 29 dias
Os arcos articos do embrio humano. (A) Originalmente, o tronco arterioso bombeia sangue para a aorta, que se ramifica para ambos os lados do intestino anterior. Os seis arcos articos tomam sangue da aorta ventral e o permitem fluir para a aorta dorsal. (B) Os arcos comeam a se desintegrar ou se modificar: as linhas pontilhadas indicam estruturas em degenerao. (C) Finalmente, os arcos remanescentes so modificados e o sistema arterial adulto formado. (Segundo Langman, 1981.)
Arcos articos
as guelras oxigenem o sangue. Na ave ou mamfero adultos, onde os pulmes oxigenam o sangue, tal sistema faz pouco sentido, mas todos os seis pares de arcos articos so formados nos embries mamferos e das aves antes que o sistema finalmente seja simplificado em um nico arco. Dessa maneira, mesmo que nossa fisiologia no requeira tal estrutura, nossa condio embrionria reflita nossa histria evolutiva. O terceiro conjunto de limitaes fsico. De acordo com a lei dos movimentos dos fluidos, o transporte mais efetivo de fluidos obtido por grandes tubos. Quando o raio dos vasos sangneos fica menor, a resistncia ao fluxo aumenta de r4 (Lei de Poiseuille). Um vaso sangneo que metade da largura de outro tem uma resistncia ao fluxo 16 vezes maior. No entanto, a difuso dos nutrientes ocorre somente quando o sangue flui vagarosamente e tem acesso membrana. Ento temos aqui um paradoxo: As restries na difuso ordenam que os vasos sangneos sejam pequenos, enquanto que a lei da hidrulica ordena que os vasos sejam grandes. Organismos vivos resolveram esse paradoxo desenvolvendo um sistema circulatrio com uma hierarquia no tamanho dos vasos (LaBarbera, 1990). Essa hierarquia formada muito cedo no desenvolvimento, como pode ser visto em embries de pinto de 3 dias. Nos ces, o sangue dos vasos grandes (aorta e veia cava) flui 100 vezes mais rapidamente do que nos capilares. Havendo vasos grandes especializados para o transporte e pequenos especializados para a difuso (onde o sangue passa a maior parte do tempo), nutrientes e oxignio podem alcanar as clulas individuais do organismo em crescimento. Mas essa no a estria completa. Se um fluido sob presso constante move-se diretamente de um tubo de grande dimetro para um tubo de pequeno dimetro (como um bico de esguicho), a velocidade do lquido aumenta. A soluo evolucionria para esse problema foi o surgimento de muitos vasos pequenos ramificados de um vaso sangneo de maior tamanho, tornando o corte secional coletivo de todos os vasos pequenos, maior que o daquele do grande vaso. Esse relacionamento (conhecido como lei de Murray) explica que o cubo do raio do vaso parental se aproxima da soma dos cubos dos raios de vasos menores. A construo de qualquer sistema circulatrio precisa negociar entre essas limitaes fsicas, fisiolgicas e evolucionrias.
VASCULOGNESE: FORMAO DE VASOS SANGNEOS DE ILHAS DE SANGUE. A criao de vasos sangneos de novo a partir do mesoderma chamada vascu-
Tronco arterioso Aorta dorsal direita Aorta dorsal esquerda
(B)
49 dias Artria cartida interna Artria cartida comum Artria subclvia direita Stima artria intersegmental
Artrias cartidas externas
Artria pulmonar
Arco da aorta Duto arterioso
Aorta
(C) 56 dias Artria cartida externa direita Artria subclvia Direita Artria cartida externa esquerda Artria cartida comum esquerda Artria subclvia Esquerda
lognese (Pardanaud et al., 1989). No intestino, pulmo, aorta e tambm no revestimento mesodrmico esplncnico do saco vitelnico, uma rede de vasos capilares surge independentemente dentro de seus prprios tecidos (Auerbach et al.,1989; Pardanaud et al., 1989). Nesses casos, os capilares no aparecem como extenses cada vez menores de vasos sangneos originados do corao. Pelo contrrio, o mesoderma de cada um desses rgos contm clulas chamadas angioblastos que se organizam em vasos capilares. Essa rede de capilares especficos do rgo finalmente se liga s extenses dos principais vasos sangneos. No pinto, existem duas fontes de angioblastos (Figura 9.28; Pardanaud et al., 1996). A primeira fonte o mesoderma paraxial. O mesoderma paraxial ceflico fornece angioblastos para os vasos sangneos da cabea (Couly et al., 1995), enquanto o mesoderma paraxial somtico do tronco contm angioblastos que migram para formar os vasos da parede do corpo, membros, rins e pores dorsais da aorta. A segunda fonte de angioblastos o mesoderma esplancnopleural. Esses angioblastos colonizam
Ligamento Aorta ascendente Artria pulmonar Aorta descendente
368
Figura 9.28
Duas fontes de angioblastos no embrio do pinto formam os endotlios de regies separadas. Os angioblastos dos somitos migram atravs do mesoderma intermedirio (rim), somatopleura e regies laterais do assoalho da aorta. Os angioblastos da esplancnopleura formam os vasos do intestino e rgos viscerais assim como do assoalho da aorta. Os angioblastos do assoalho da orta tambm produzem clulas sangneas. (Segundo Pardanaud et al., 1996.)
Tubo neural
Mesoderma intermedirio Somito
Somito Aorta Somatopleura Broto dos membros
Notocorda Aorta 1 dias
Esplancnopleura
Veia cardinal
Intestino 3 dias
Figura 9.29
Vasculognese. A formao de vasos sangneos primeiro vista na parede do saco vitelnico onde (A) mesnquima indiferenciado se condensa para formar (B) conjuntos de clulas angiogenticas. (C) O centro desses agregados forma as clulas sangneas, e a parte externa dos agregados desenvolve as clulas endoteliais dos vasos sangneos. (Segundo Langman, 1981.)
(A) Endoderma do saco vitelnico
os rgos viscerais, intestino e o assoalho da aorta. Esses angioblastos so na realidade hemangioblastos, porque no s geram revestimento endotelial como tambm fornecem os precursores das clulas sangneas (Pardanaud et al.,1996). A agregao de clulas do mesoderma esplncnico crucial para o progresso do desenvolvimento amnitico porque esses agrupamentos angiogenticos (por vezes chamados de ilhas de sangue) que forram o saco vitelnico produzem as veias vitelnicas (onfalomesentricas) que trazem nutrientes para o corpo e transportam os gases de ida e volta para os lugares onde so realizadas trocas gasosas (Figura 9.29). Essas clulas so primeiro vistas na rea opaca no estgio da dobra da cabea na embriognese do pinto, quando o sulco primitivo est totalmente estendido (Pardanaud et al., 1987). Esses cordes de clulas logo cavitam transformando-se em tubos com parede dupla anlogos aos tubos duplos do corao. A parede interna se torna o revestimento liso de clulas endoteliais do vaso, e as clulas externas se tornam msculo liso. Entre essas camadas existe a lmina basal contendo um tipo de colgeno especfico para vasos sangneos. Pensa-se que essa lmina basal inicia a diferenciao dos tipos de clulas no vaso (Murphy e Carson, 1978; Kubota et al., 1988). As clulas centrais das ilhas de sangue se diferenciam em clulas sangneas embrionrias. Com o crescimento, as ilhas de sangue finalmente se juntam para formar a rede capilar drenando as duas veias vitelnicas, que trazem alimento e clulas sangneas para o corao recm- formado. Trs fatores de crescimento podem ser responsveis pela iniciao da vasculognese. Um deles, o fator de crescimento fibroblstico bsico (FGF2) necessrio para a gerao de angioblastos a partir do mesoderma. Quando as clulas do blastodisco das codornas so dissociadas em cultura, elas no formam ilhas de sangue ou clulas endoteliais. No entanto, quando essas clulas so cultivadas em FGF2, surgem ilhas de sangue na cultura, e essas formam clulas endoteliais (Flamme e Risau, 1992). O FGF2 sintetizado na membrana corioalantica do embrio de pinto e responsvel pela vascularizao desse tecido (Ribatti et al., 1995). A segunda protena o fator de
(B) Agregado de clulas angiogenticas
(C) Clula sangnea primitiva
Clulas mesenquimatosas
Clula endotelial
369
(A)
Mesoderma perifrico Avascular
Sulco ectodrmico apical
Veia marginal Anterior
Somitos
Estgio Artria Subclvia
Figura 9.30
Veia marginal posterior
Vascularizao do membro anterior do pinto. (A) Desenvolvimento do sistema vascular durante o desenvolvimento precoce do broto alar do pinto. A periferia do broto avascular; e mais regies avasculares se formaro nas regies onde os condrcitos iro se condensar para formar os precursores cartilaginosos para o osso. (B) Vista dorsal do broto alar injetado com tinta da China no estgio 22. (A segundo Feinberg, 1991; B de Feinberg e Cafasso, 1995; fotografia cortesia do Dr. R. N. Feinberg.)
crescimento vascular endotelial (VEGF), que parece ser especfica para permitir a diferenciao dos angioblastos e sua multiplicao para formar os tubos endoteliais. Alm disso, os receptores para VEGF so encontrados nas ilhas de sangue e em outros lugares onde VEGF pode estar ativo (Millauer et al., 1993). Se embries de camundongos no possuem os genes codificando o principal receptor para VEGF (FlK1 tirosina quinase) as ilhas de sangue do saco vitelnico no aparecem, e a vasculognese no ocorre. Camundongos carentes de genes para o segundo receptor para VEGF (Flt1 tirosinoquinase), tm as clulas endoteliais e ilhas de sangue diferenciadas, mas essas clulas no so organizadas em vasos sangneos (Fong et al.,1995; Shalaby et al., 1995). Um terceiro fator, angiopoietina-1, intermedia a interao entre as clulas endoteliais e os msculos lisos recrutados para cobri-las. Mutaes de cada uma dessas angiopoietinas ou seus receptores levam a vasos sangneos mal-formados, deficientes em msculos lisos que normalmente os envolvem (Davis et al.,1996; Suri et al., 1996; Vikkula et al., 1996).
ANGIOGNESE: O SURGIMENTO DOS VASOS SANGNEOS. Vasculognese no
(B)
o nico meio de se produzir vasos sangneos. Em outros rgos (notavelmente nos brotos dos membros, nos rins e no crebro), vasos sangneos existentes se desenvolvem e enviam clulas endoteliais para o rgo em desenvolvimento (Wilson, 1983; Sariola, 1985). Esse tipo de formao de vaso sangneo, no qual novos vasos emergem da proliferao de vasos sangneos preexistentes chamado angiognese. No broto do membro anterior, por exemplo, a rede de capilares derivada do brotamento de clulas procedentes da aorta (Evans, 1909; Feinberg, 1991). Dentro dessa rede de capilares, uma artria central (que se torna a subclvia) forma o principal vaso de alimentao. O sangue retorna ao corpo atravs da veia marginal que se forma dos capilares anteriores e posteriores (Figura 9.30). Acredita-se que as regies formadoras de rgos secretam fatores de angiognese que promovem a mitose e a migrao de clulas endoteliais para aquela rea. VEGF (mencionado anteriormente como um fator de vasculognese) tambm promove a migrao de clulas endoteliais procedentes de vasos sangneos da superfcie do rgo para esses rgos. O grau de vascularizao dos membros est ligado aos nveis de VEGF no broto dos membros, e os padres espao-temporais da expresso de VEGF correlacionam-se bem com a hora e o lugar onde vasos sangneos penetram nos rins e no crebro (Figura 9.31; Breier et al., 1992; Millauer et al., 1993; Flamme et al., 1995).
370
Figura 9.31
Produo do fator da angiognese pelo tecido fetal de camundongo. Hibridizao in situ mostra que mRNA para VEGF secretado sintetizado pelos glomrulos do rim fetal do camundongo de 15 dias. A fotografia em campo iluminado esquerda corresponde a auto-radiografia em campo escuro direita. (de Breier et al., 1992, cortesia de W. Risau.)
Alguns rgos parecem produzir seus prprios fatores de angiognese. A placenta um rgo cuja funo depende do redirecionamento de vasos sangneos existentes dentro dela. Quando a placenta primeiro formada, induz a angiognese secretando a proliferina (PLF), um fator parecido com o hormnio de crescimento. Quando os vasos sangneos placentrios se estabeleceram (no camundongo aps o dcimo segundo dia), a placenta secreta uma protena relacionada proliferina (PRP), um peptdeo que age como um inibidor da angiognese (Jackson et al., 1994). O osso em desenvolvimento um outro rgo que redireciona vasos sangneos para si enquanto est em formao. Como j foi mencionado, a cartilagem normalmente um tecido avascularizado, exceto quando os capilares invadem a placa de crescimento para converter cartilagem em osso. Cartilagem hipertrfica (mas no cartilagem em diviso ou madura) secreta um fator de angiognese de 120-kDa (Alini et al., 1996). interessante que esse fator produzido somente quando os condrcitos hipertrficos precoces foram expostos a vitamina D. Isso ajudaria explicar as deformidades nos ossos vistas em pacientes com raquitismo. A angiognese crucial no crescimento de qualquer tecido, incluindo os tumores. Os tumores so bem sucedidos somente quando so capazes de direcionar para si os vasos sangneos. Portanto, os tumores secretam fatores de angiognese. A habilidade de inibir tais fatores pode se tornar uma maneira extremamente importante para prevenir o crescimento de tumores e metstases (Fidler e Ellis, 1994).[mesend3.html]
CIRCULAO EMBRIONRIA. O sistema circulatrio embrionrio para e do embrio do pinto e saco vitelnico mostrado na Figura 9.32. O sangue bombeado atravs da aorta dorsal passa sobre os arcos articos e se direciona para baixo, entrando no embrio. Parte desse sangue deixa o embrio atravs das artrias vitelnicas entrando no saco vitelnico. Nutrientes e oxignio so absorvidos, e o sangue retorna atravs das veias vitelnicas para o corao atravs do seio venoso. Nos embries de mamferos, alimento e oxignio so obtidos da placenta. Dessa maneira, embora o embrio de mamfero possua vasos anlogos s veias vitelnicas, o principal suprimento de oxignio e alimento procede da veia umbilical, que une o embrio com a placenta (Figura 9.33). Essa veia, que leva o sangue oxigenado e carregado de alimento de volta ao embrio derivada do que seria nas aves a veia vitelnica direita. A artria umbilical, carregando os resduos da placenta, derivada do que teria sido a artria alantica do pinto. Ela estende-se da poro caudal da aorta e prossegue ao longo da alantide e emergindo depois para a placenta. Aps a sua entrada no corao embrionrio do mamfero, o sangue bombeado para uma srie de arcos articos que circundam a faringe para trazer o sangue dorsalmente. Nos mamferos, o membro esquerdo dos quarto par de arcos articos o nico que sobrevive para alcanar a aorta. O membro direito desse par se tornou a raiz da artria subclvia. O terceiro arco artico se modificou para formar artrias cartidas comuns, que fornecem sangue para o crebro e cabea. O sexto arco modificado para formar a artria pulmonar; o primeiro, o segundo e o quinto arcos degeneram. A aorta e a artria pulmonar, portanto, tm uma abertura para o corao em comum, durante a maior parte do seu desenvolvimento. Finalmente, divises se
371
(A)
(B)
Veia vitelnica anterior Arcos articos
Corao Aorta dorsal
Veia vitelnica Artria vitelnica
Capilares Seio terminal
Figura 9.32
formam dentro do tronco arterioso para criar dois vasos diferentes. Somente quando a primeira respirao do animal recm-nascido indica que os pulmes esto preparados para a oxigenao do sangue, o corao se modifica para bombear sangue separadamente para a artria pulmonar.
Veia cardinal posterior Vilosidades corinicas Artria e veia vitelnica Veia cardinal comum Aorta dorsal Broto pulmonar Bolsa farngea IV Arco artico III
Sistema circulatrio do embrio de ave precoce. (A) Construo da vasculatura em um somito 7 de embrio de codorna corado com um anticorpo fluorescente que reconhece clulas endoteliais. A ilhas de sangue podem ser vistas nas margens. (B) Sistema circulatrio de um embrio de pinto de 44 horas. Esta viso mostra artrias em cor; as veias esto pontilhadas. O seio terminal o limite externo do sistema circulatrio e o local da gerao das clulas do sangue. (Montagem fotogrfica de Pardanaud et al., 1987; cortesia do Dr. F. Dieterlen-Livre; B segundo Carlson, 1981.)
Raiz artica ventral
Veia cardinal anterior Placenta Veia umbilical
Artria Umbilical
Artria cartida Interna
Figura 9.33
Saco vitelnico
Sistema circulatrio de um embrio humano de 4 semanas. Embora nesse estgio todos os vasos sangneos principais estejam pareados esquerda e direita, somente so mostrados os vasos direita. As artrias esto coloridas. (de Carlson, 1981.)
372
&
Especulaes
Redirecionando o Fluxo Sangneo no Mamfero Recm-nascido

to a necessidade de conseguir oxignio e nutrientes para seus tecidos, a fisiologia do feto mamfero difere drasticamente daquela do adulto. A principal diferena a falta de pulmes e intestinos funcionais. Todo oxignio e nutrientes devem provir da placenta. Isso levanta duas questes. Primeiro, como o feto obtm oxignio do sangue materno? E segundo, como a circulao do sangue redirecionada aos pulmes uma vez que o cordo umbilical for cortado e a respirao se fizer necessria? A soluo para o problema do feto conseguir oxignio do sangue de sua me envolve o desenvolvimento de uma hemoglobina fetal. A hemoglobina das hemcias fetais difere um pouco daquela do corpsculo adulto. Dois dos quatro peptdeos das cadeias da hemoglobina do adulto e do feto so idnticos - a cadeia alfa () - mas a hemoglobina do adulto tem duas cadeias beta (), onde o feto tem duas cadeias gama () (Figura 9.34). Cadeias normais fixam o regulador natural difosfoglicerato, que ajuda na descarga do oxignio. As cadeias isoformas no fixam difosfoglicerato to bem e portanto tm uma maior afinidade pelo oxignio. No ambiente de baixa oxigenao da placenta, o oxignio liberado da hemoglobina adulta. Nesse mesmo ambiente, a hemoglobina fetal no distribui oxignio, mas o fixa. Essa pequena diferena na afinidade pelo oxignio media a transferncia do oxignio da me para o feto (Figura 9.34). No feto, a mioglobina dos msculos fetais tem uma afinidade ainda maior por oxignio, fazendo com que molculas de oxignio passem de hemoglobina fetal para armazenagem e uso pelos msculos fetais. A hemoglobina fetal no nociva ao recm-nascido, e em humanos, a reposio de clulas sangneas contendo hemoglobina fetal por clulas sangneas contendo hemoglobina adulta no se completa at 6 meses aps o nascimento.*
MBORA O FETO EM DESENVOLVIMENTO divida com o adul-
Hemoglobina fetal
H
Saturao com O2 (%)
em
ia
fe
ta
is e at rn ai s
em
ia
Hemoglobina adulta
Presso de O2
Figura 9.34
Transferncia de oxignio da me para o feto em embries humanos. Molculas adultas e fetais de hemoglobina diferem em suas subunidades proticas. A cadeia fetal liga difosfoglicerato menos avidamente que o faz a cadeia adulta. Conseqentemente, a hemoglobina fetal pode ligar o oxignio mais eficientemente que a hemoglobina adulta. Na placenta, h um fluxo lquido de oxignio (seta) do sangue materno (que cede oxignio ao tecido com menor presso de oxignio) para o sangue fetal, que ainda o est recolhendo.
Mas uma vez que o feto no est conseguindo oxignio da me, como ele reestrutura sua circulao para conseguir oxignio de seus prprios pulmes? Durante o desenvolvimento fetal, uma abertura - o duto arterioso - direciona a passagem do sangue da artria pulmonar para a aorta (e conseqentemente para a placenta). Como o sangue no retorna da veia pulmonar no feto, mamferos em desenvolvimento tm que ter alguma outra maneira de obter sangue no seu ventrculo esquerdo para ser bombeado. Isso conseguido pelo forame oval, uma abertura no septo separando o trio direito do esquerdo. O sangue pode entrar no trio direito, passar pelo forame em direo ao
*A base molecular para essa mudana nas globinas ser posteriormente discutida no Captulo 11.
trio esquerdo, e depois entrar no ventrculo esquerdo (Figura 9.35). Quando ocorre a primeira respirao, o oxignio no sangue faz com que os msculos que envolvem o duto arterioso feche a abertura. O aumento da presso sangnea no lado esquerdo do corao causa o fechamento do septo sobre o forame oval, com isso separando a circulao sistmica e pulmonar**. Dessa maneira, quando comea a respirao, a circulao respiratria desviada da placenta para os pulmes. [other.html#4]
**Em algumas crianas, o septo no se fecha, e o formen oval deixado aberto. Em geral, a abertura to pequena que essas crianas no apresentam sintomas fsicos, e o formen finalmente acaba se fechando. No entanto, se o segundo septo falha na sua formao, a abertura septal do trio pode causar um aumento do lado direito do corao, que pode levar falncia cardaca durante a idade adulta jovem.
373
De e para a cabea Veia cava superior De e para o brao Artria pulmonar De e para o brao Ducto arterioso
FETO
Forame oval Veia cava inferior Ducto venoso Parede corporal Rim Fgado Veia umbilical Pulmo
Forame oval est aberto
De e para o Intestino
NEONATO
Artrias umbilicais
Ducto arterioso se fecha
De e para as pernas Placenta
Forame oval se fecha
Figura 9.35
Redirecionamento do fluxo sangneo no nascimento. A expanso de ar para os pulmes causa alteraes de presso que redirecionam o fluxo de sangue para o neonato. O ducto arterioso se comprime e se fecha, rompendo a conexo entre a aorta e a artria pulmonar, e o forame oval, uma passagem entre os trios esquerdo e direito, tambm se fecha. Dessa maneira, a circulao pulmonar fica separada da circulao sistmica.
O Desenvolvimento de clulas sangneas

Clula-T O Conceito de Clula-Tronco Enquanto muitas das clulas que possumos hoje so as mesmas clulas que adquirimos quando ramos embries, existem diversas populaes de clulas que esto constantemente se regenerando. Perdemos e repomos aproximadamente 1011 hemcias e pequenas clulas intestinais cada dia. De onde vm essas clulas de reposio? Elas so procedentes de populaes de clulas-tronco. Uma clula-tronco capaz de
374
Auto-manuteno
diferenciao Maturao e
Figura 9.36
Modelo da dinmica da proliferao e diferenciao da clula-tronco. A proliferao est representada por crculos horizontais, e a diferenciao se d ao longo do eixo vertical progredindo para baixo, para tipos mais diferenciados de clulas. As clulas-tronco iniciais (S) podem permanecer quiescentes (na fase G0 ) ou entrar no ciclo celular. Clulas-tronco que produzem mais clulas-tronco permanecem em um nvel, mas podem se dividir para produzir um tipo de clula de transio que cai para o prximo nvel. Em cada nvel mais baixo, a probabilidade de cair ainda mais na prxima diviso aumenta. Finalmente, uma clula madura diferenciada gerada. (Segundo Potten e Loeffer, 1990).
Clula-tronco
Fase S
Ciclo celular
Mitose (M) Diferenciao
Reabastecendo nicho do tronco (renovao /regenerao)
Clula-tronco intermediria tipo 1
Blastoclula comprometida com a diferenciao
extensa proliferao, criando mais clulas-tronco (auto-renovao) assim como uma prognie celular mais diferenciada. Clulas-tronco so, na realidade, uma populao embrionria de clulas, que sofrem um desenvolvimento posterior dentro de um organismo adulto. Nossas clulas sangneas, clulas das criptas intestinais, epiderme e espermatcitos (em homens) so populaes em estado estvel de equilbrio no qual a produo de clulas equilibra-se com a perda de clulas (Hay, 1966). Na maioria dos casos, as clulas-tronco podem regular a produo de mais clulas-tronco ou mais clulas diferenciadas, quando o equilbrio estressado por leso ou pelo meio ambiente. (Isso percebido pelo aumento da produo de uma grande quantidade de hemcias quando o organismo sofre anoxia.) As clulas-tronco foram identificadas em todos os tecidos mencionados anteriormente, mas elas so mais estudadas no desenvolvimento das hemcias. Potten e Loeffler (1990) apresentaram uma viso na qual algumas clulas-tronco so potencialmente clulas-tronco no-cclicas presas em Go, enquanto outras clulas-tronco esto ativamente no ciclo celular. Uma clula-tronco em ciclo, normalmente se divide para criar mais clulas-tronco, mas tambm pode gerar um tipo de clulatronco transitrio intermedirio (T1). Uma clula T1 pode regenerar-se, mas normalmente prossegue para produzir um segundo tipo de clula transitria, T2. (Sob certas condies, uma clula T1 pode regenerar a clula-tronco original se a populao de clulas-tronco original estiver muito esgotada.) A clula T2 pode se manter, mas normalmente se divide para criar clulas T3. Finalmente, um tipo de clula transitria produzida, que sempre amadurece para um tipo de clula diferenciada (Figura 9.36). Assim, o corpo vertebrado retm populaes de clulas-tronco, e essas clulas-tronco podem produzir tanto populaes de clulas-tronco como de clulas que passaro por um desenvolvimento futuro. O caminho do desenvolvimento pelo qual uma clula-tronco passa depende do meio molecular no qual ela reside. Isso se tornou aparente quando evidncias experimentais mostrou que hemcias (eritrcitos), clulas brancas (granulcitos, neutrfilos e plaquetas), e linfcitos compartilham de um precursor comum, a clula-tronco hematopoitica pluripotencial (por vezes chamada de clula-tronco hematopotica repopuladora a longo prazo). ClulasClulas-Tronco Pluripotenciais e Microambientes Hematopoticos
O CFU-S. A clula-tronco hematopotica pluripotencial uma das clulas mais impressionantes do nosso corpo. A partir dela iro surgir eritrcitos, neutrfilos, basfilos, eosinfilos, plaquetas, mastcitos, moncitos, macrfagos dos tecidos, osteoclastos, e os linfcitos T e B. A existncia de uma clula-tronco hematopotica pluripotencial foi mostrada por Till and McCulloch (1961), que injetaram clulas da medula ssea em camundongos fatalmente irradiados, procedentes da mesma linhagem gentica que os doadores da medula. (A irradiao mata as clulas hematopoiticas do hospedeiro, permitindo que se veja as novas colnias do camundongo doador.) Algumas dessas clulas doadoras produzem ndulos discretos no bao do animal hospedeiro (Figura 9.37). Estudos microscpicos mostraram que esses ndulos so compostos de precursores de eritrcitos, granulcitos e plaquetas. Assim, uma nica clula oriunda da medula ssea foi capaz de formar muitos dos
Clula madura totalmente diferenciada
M Reproduo (diviso / mitose) Auto-reproduo / replicao Reproduo / Replicao
375
diferentes tipos de clulas sangneas. A clula responsvel foi chamada de CFU-S, (colony-forming unit), unidade formadora de colnias do bao. Estudos mais avanados usaram marcadores cromossmicos para provar que os diferentes tipos de clula em uma colnia foram formados de uma mesma CFU-S. Aqui, clulas da medula foram irradiadas para que poucas pudessem sobreviver. Muitas das que sobreviveram tinham cromossomos anormais que puderam ser detectados microscopicamente. Quando essas clulas CFU-S irradiadas foram injetadas em um camundongo cujas clulas-tronco formadoras de sangue haviam sido destrudas, cada clula da colnia do bao, fosse precursora de granulcito ou de eritrcito, apresentou a mesma anormalidade cromossmica (Becker et al., 1963). Uma parte importante do conceito de clula-tronco o requisito de que a clula-tronco seja capaz de formar mais clulas-tronco alm dos seus tipos de clulas diferenciadas. E realmente isso tem acontecido. Quando colnias do bao derivadas de uma nica CFU-S so resuspensas e injetadas em outros camundongos, muitas colnias do bao so vistas emergir (Jurskov e Tkadlecek, 1965; Humphries et al., 1979). Assim, vemos que uma nica clula da medula consegue formar numerosos tipos de clulas diferentes e tambm pode sofrer auto-renovao; em outras palavras, a CFU-S uma clula-tronco hematopotica pluripotencial. A informao anterior indica que embora as CFU-S possam gerar diversos tipos de clulas sangneas, elas no so capazes de gerar linfcitos. Essa concluso amparada pelos experimentos de Abramson e seus colegas (1977), que mostrou que ambos CFU-S e linfcitos so derivados de uma outra clula-tronco hematopotica pluripotencial, por vezes chamada de unidade formadora de colnias de clulas mielides e linfides, ou CFU-M,L. Quando eles injetaram clulas da medula ssea irradiadas em camundongos com deficincia hereditria na formao de clulas sangneas, os pesquisadores encontraram as mesmas anormalidades cromossmicas em colnias do bao e em linfcitos circulantes. Esse trabalho foi confirmado por estudos nos quais clulas da medula foram injetadas com certos tipos de vrus que se incorporam ao DNA celular aleatoriamente. Os mesmos genes derivados viralmente foram encontrados nos mesmos lugares do genoma, nos linfcios e clulas sangneas (Keller et al., 1985; Lemischka et al., 1986). Em 1995, Berardi e colegas isolaram uma frao de clulas que pode ser a CFU-M,L humana. Eliminando todas as clulas que se dividem quando expostas a citocinas que iriam ativar clulas-tronco, foi deixada uma clula nucleada para cada 10.000 originalmente presentes na medula ssea. Essas clulas podem gerar ambas linhagens, sangnea e linfide.
LINHAGENS SANGNEAS E LINFOCTICAS. A Figura 9.38 sumariza diversos estu-
Figura 9.37
Colnias formadoras de sangue isoladas. Quando a medula ssea contendo clulastronco hematopoiticas injetada em um camundongo irradiado, discretas colnias de clulas de sangue so vistas na superfcie do bao desse camundongo. (de Till, 1981, cortesia de J. E, Till.)
dos. A primeira clula-tronco hematopotica pluripotencial a CFU-M. L. O desenvolvimento dessa CFU-M,L parece ser dependente do fator de transcrio SLC. Camundongos carentes dessa protena morrem por ausncia de todas linhagens de clulas sangneas e linfocticas. SLC pode especificar o mesoderma ventral como o destino de uma clula sangnea ou pode envolver a formao ou manuteno de clulas CFU-M,L (Porcher et al., 1996; Robb et al., 1996). Essa clula d origem s CFU-S (clulas sangneas) e aos CFU-L (linfcitos). As CFU-S e as CFU-L tambm so clulas-tronco pluripotenciais porque sua prognie pode se diferenciar em numerosos tipos de clulas. A prognie imediata da CFU-S, no entanto, so clulas-tronco restritas s linhagens. Cada uma pode produzir somente um tipo de clula alm de renovar a si mesma. A BFU-E (unidade formadora de rompimento de eritride), por exemplo, formada da CFU-S e ela pode formar somente um tipo de clula alm de si mesma. Essa nova clula a CFU-E (unidade formadora de colnia de eritride), a qual capaz de responder ao hormnio eritropoetina para produzir o proeritroblasto, o primeiro membro diferenciado reconhecvel da linhagem do eritrcito. Eritropoetina uma glicoprotena que rapidamente induz a sntese do mRNA para globina (Krantz e Goldwasser, 1965). Ela produzida predominantemente no rim, e sua sntese responde s condies ambientais. Se o nvel de oxignio do sangue cair, a produo de eritropoeitina aumentada, um evento levando produo de mais
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CLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES
CLULASTRONCO RESTRITIVAS DE LINHAGEM (COMPROMETIDAS)
CLULAS EM DIFERENCIAO
CLULAS DIFERENCIADAS
Clula pr-T
Clula T
Clula T ativada
Clula-tronco linfide
F ent SC mbi oa cr e
Clula plasma Clula pr-B Clula-B
Basfilos
Clula-tronco de granulcitos
Mic SCF i e n t e mb roa
Eosinfilos
Neutrfilos
Clula-tronco totipotente autorenovadora Clula-tronco mielide CFC-Meg
Moncito
Macrfagos
Megacaricito Plaquetas Eriotroblasto
Proeritroblasto
Reticulcito
Clulas sangneas vermelhas (hemcias) (Eritrcitos)
Figura 9.38
Um modelo para a origem de clulas linfides e de sangue de mamferos. (Outros modelos so consistentes com os dados e este sumariza aspectos de diversos modelos). EPO, eritropoietina; G-CSF, fator estimulador de colnias de granulcitos; GM-CSF, fator estimulador de colnias de granulcitos-macrfagos; IL, interleucina; LIF, fator inibidor de leucemia; M-CSF, fator estimulador de colnias de macrfagos; SCF, fator de clulas-tronco. (Segundo Nakauchi e Gachelin, 1993.)
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hemcias. Com a maturao, as hemcias se tornam eritroblastos, capazes de sintetizar enormes quantidades de hemoglobina. Finalmente, o eritroblasto mamfero expele o seu ncleo, tornando-se um reticulcito. Os reticulcitos j no conseguem mais sintetizar mRNA da globina, mas ainda conseguem traduzir mensagens existentes na globina. O estgio final da diferenciao o eritrcito. Nesse estgio no h diviso, sntese de RNA ou sntese de protena. As clulas deixam a medula ssea para exercer o seu papel de fornecedoras de oxignio aos tecidos corporais. Similarmente, existem clulas-tronco restritivas de linhagem para plaquetas e granulcitos (neutrfilos, basfilos e eosinfilos) e macrfagos. Alguns fatores de crescimento hematopoitico (tal como o IL-3) estimulam a diviso e a maturao de outras clulas-tronco mais primitivas, desse modo aumentando o nmero de tipos de clulas sangneas. Outros fatores (como a eritropoetina) so especficos somente para algumas linhagens de clulas. A habilidade da clula em responder a esses fatores depende da presena de receptores para esses fatores na sua superfcie. O nmero desses receptores muito baixo. Existem somente cerca de 700 receptores para eritropoetina em uma CFU-E, e a maioria das outras clulas progenitoras tem o mesmo baixo nmero de receptores do fator de crescimento. A exceo o receptor para o fator de estimulao de colnia de macrfagos -M-CSF, tambm conhecido como CSF-1- do qual pode haver at 73.000 por clula em algumas clulas progenitoras.
MICROAMBIENTES HEMATOPOITICOS INDUTIVOS. Alguns fatores de cresci-
mento hematopoitico so formados por clulas estromticas (fibroblastos e outros elementos do tecido conjuntivo) da prpria medula ssea. Outros fatores de crescimento viajam atravs do sangue e so retidos pela matriz extracelular das clulas estromticas. No bao, as clulas-tronco esto comprometidas com o desenvolvimento do eritride. Na medula ssea, o desenvolvimento de granulcitos predomina. O caminho do desenvolvimento percorrido pelos descendentes de uma clulatronco pluripotencial depende de quais fatores de crescimento ela encontra, e isso determinado pelas clulas estromticas da medula ssea. Wolf e Trentin (1968) demonstraram que interaes de curto alcance entre as clulas estromticas e as clulas-tronco determinam o destino do desenvolvimento da prognie das clulas-tronco. Esses investigadores colocaram plugues de medula ssea no bao e, em seguida, injetaram clulas-tronco. As colnias no bao eram predominantemente eritrides, ao passo que aquelas que se formaram nos plugues de medula eram predominantemente granulcitos. De fato, aquelas colnias que cobriam as bordas, se tornaram predominantemente eritrides no bao e granulocticas na medula. As regies de determinao so referidas como microambientes hematopoiticos indutivos (HIMs) As clulas estromticas da medula ssea criam HIMs atravs da sua habilidade de agregar fatores de crescimento hematopoitico (Hunt et al., 1987; Whitlock et al., 1987). GM-CSF e o fator de crescimento multilinhagens IL-3 ligam-se ao glicosaminoglicano heparan sulfato do estroma da medula ssea (Gordon et al., 1987; Roberts et al., 1988). Alm disso, eles permanecem ativos quando ligados. Desse modo, os fatores de crescimento podem ser concentrados e compartimentalizados, estimulando clulas-tronco em uma rea para se diferenciarem em um tipo de clula, permitindo que esse mesmo tipo de clula-tronco em outra rea se diferencie em outro tipo de clula. Sem esses fatores de crescimento, as clulas-tronco morrem. Desenvolvimento Osteoclstico Como vimos, as clulas-tronco so influenciadas por numerosos fatores de crescimento hematopoitico. Alm disso, esses fatores so, eles mesmos, influenciados pelo meio hormonal do organismo. Esse fato pode ser de extrema importncia na osteoporose ps-menopausa. A perda da funo ovariana em muitas fmeas de mamferos causa uma perda de massa ssea que pode ser freqentemente prevenida
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pelo fornecimento de estrgeno ao indivduo, e essa perda ssea foi associada com o aumento da produo de osteoclastos. Acredita-se que o osteoclasto (clula responsvel para formar buracos nos ossos, como descrito anteriormente) procedente da mesma clula-tronco que os macrfagos e granulcitos, o CFU-GM (Kurihara et al., 1990; Hattersley et al., 1991). O fator de crescimento interleucina 6 (IL-6) estimula a produo de osteoclastos. No entanto, a produo de IL-6 inibida pelo estrgeno que, quando adicionado s clulas de medula de camundongo em cultura, tanto a produo de IL-6 como a de osteoclastos so inibidas (Girasole et al, 1992). Jilka e colegas (1992) mostraram que a remoo dos ovrios do camundongo causa um aumento no nmero de CFU-GMs, acentuando o desenvolvimento do osteoclasto, e um aumento no nmero de osteoclastos encontrados no osso. Essas mudanas podem ser prevenidas injetando nesses camundongos estrgeno ou IL6. Isso sugere que o estrgeno normalmente suprime a produo de IL-6 e a formao de osteoclastos em fmeas de mamferos, e que a perda ssea ps-menopausa pode ser devida produo de novos osteoclastos pela IL-6.* [mesend4.html] Locais de Hematopoiese Nas espcies avcolas e anfbias, as primeiras clulas do sangue derivam do vitelo ou saco vitelnico. Essa populao celular, no entanto, transitria; as clulas-tronco hematopoiticas que perduram por toda vida do organismo so derivadas da rea mesodrmica que envolve a aorta. Isso foi demonstrado no pinto atravs de uma srie de experimentos elegantes por Dieterlen-Livre, que enxertou o blastoderma de um
*Ento, como os machos - que no tm ovrios ou mesmo estrgeno - normalmente no sofrem perda ssea osteoportica? Parece que a testosterona tambm suprime o desenvolvimento osteoclstico (Bellido et al., 1995). Nos seres humanos machos, a produo de testosterona normalmente mantida com a chegada da idade. Dada a fisiologia do osteoclasto, ns podemos apreciar a intuio presciente de H. L. Menken (1919): A vida uma luta, mas no contra o pecado ou o Poder Econmico, ou contra o malicioso magnetismo animal, mas contra os ons de hidrognio.
(B) Clula de pinto
Figura 9.39
Mapeamento de clulas sangneas por quimeras pinto-codorna. (A) Fotografia de uma quimera de saco vitelnico onde o blastoderma de uma codorna foi transplantado para o saco vitelnico de um pinto. (B) Fotografia de clulas de pinto e de codorna no timo de um animal quimrico, mostrando a diferena na colorao nuclear. As clulas linfides so todas de pinto, enquanto as clulas estruturais do timo so originrias da codorna. (C) Seo atravs da aorta de um embrio de pinto de trs dias, mostrando as clulas (setas) que do origem s clulas-tronco hematopoiticas. Se clulas dessa regio forem retiradas de embries de codorna e colocadas em embries de pinto, os embries de pinto tero sangue de codorna. (de Martin et al., 1978, e Dieterlen-Livre e Martin, 1981, fotografias cortesia de F. Dieterlen-Livre.)
Clula de codorna
(A)
(C)
379
pinto em um vitelo de codorna japonesa (Figura 9.39). As clulas do pinto so facilmente distinguidas daquelas da codorna porque o ncleo celular da codorna escurece muito mais (devido a seus densos nuclolos), assim fornecendo uma marca permanente para a distino entre os dois tipos de clulas. Usando essas quimeras do saco vitelnico, Dieterlen-Livre e Martin (1981) mostraram que as clulas-tronco do saco vitelnico no contribuem com clulas para o animal adulto, mas que as verdadeiras clulas-tronco so formadas dentro dos ndulos do mesoderma que revestem os principais vasos sangneos e o mesentrio. Esses so os hemangioblastos que so derivados da esplancnopleura (veja Figura 9.28; Pardanaud et al., 1996). No embrio de pinto de 4 dias, a parede da orta parece ser a fonte mais importante de clulas sangneas novas, onde foi encontrado numerosas clulas-tronco hematopoiticas (Cormier e Dieterlen-Livre, 1988). Nos mamferos a situao mais controversa, mas comea a ficar bem parecida com a do pinto. As primeiras ilhas sangneas no embrio do camundongo aparecem no mesoderma extra-embrionrio e saco vitelnico. Essas clulas parecem ter atividade de CFU-C. Essa populao derivada do saco vitelnico provavelmente transitria ou pode suprir somente as necessidades respiratrias do embrio (produzindo hemcias nucleadas). No dcimo primeiro dia, clulas-tronco hematopoiticas e clulas CFU-S podem ser encontradas na regio mesodrmica embrionria do camundongo que inclui a aorta, gnadas e mesonefro (a regio AGM; Kubai e Auerbach, 1983; Godlin et al., 1993; Medvinsky et al., 1993). Essas so as precursoras das clulas sangneas que iro colonizar o fgado e constituir o sistema circulatrio do feto e do adulto (Medvinsky e Dzierak, 1996). Mller e colegas (1994) propuseram
(A) Saco vitelnico
AGM Aorta dorsal Prnefro Mesonefro Sulco genital
(B)
AGM
CFU-C no rudimento heptico CFU-C CFU-S Clula-tronco hematopoitica pluripotente Segunda onda
Colonizao de fgado de camundongo por duas ondas de clulas-tronco hematopoiticas. As duas principais fontes das clulas progenitoras hematopoiticas so o saco vitelnico e a regio AGM. (A) No dia 9 o saco vitelnico contribui com uma linha precoce de clulas CFU-C que provavelmente no permanecem muito tempo aps o nascimento, e que produz um populao predominante de clulas sangneas vermelhas. Essa considerada a principal fonte da primeira onda hematopoitica do fgado. (B) No dia 10, as clulas derivadas da AGM fornecem clulas CFU-S e clulas-tronco hematopoiticas pluripotentes. Essas constituem as principais clulas da segunda onda. (Segundo Dzierzak e Medvinsky, 1995).
Inco das atividades hematopoiticas no fgado
Figura 9.40
Primeira onda
Dias aps o coito
380
que duas ondas de clulas colonizam o fgado fetal. A populao menor dessas clulas viriam do saco vitelnico e seriam predominantemente clulas CFU-C. A maior parte da populao viria de stios AGM e constituiriam tanto CFU-S como clulastronco hematopoiticas pluripotentes (Figura 9.40). Essa proposta foi fortalecida com a descoberta de que camundongos com deficincia no fator de transcrio AML1 possuem hematopoiese normal dos sacos vitelnicos, mas no tem hematopoiese (AGM) definitiva (Okuda et al., 1996). Esses camundongos mutantes, morrem no dia embrionrio 12,5. O seu fgado contm um pequeno nmero de hemcias nucleadas primitivas, enquanto os fgados controles esto repletos de clulas sangneas derivadas da AGM. A protena AML essencial para a ativao dos genes envolvidos na hematopoiese difinitiva. Ao redor da poca do nascimento, as clulas-tronco do fgado povoam a medula ssea, que assim se torna o principal local formador de sangue por toda a vida adulta.
ENDODERMA Faringe
A funo do endoderma embrionrio construir o revestimento de dois tubos dentro do organismo. O primeiro se estende atravs do comprimento do corpo; o tubo digestivo. Brotos desse tubo formam o fgado, vescula biliar e o pncreas. O segundo, o tubo respiratrio, que cresce a partir do tubo digestivo, finalmente se bifurcando e se transformando nos dois pulmes. Os tubos digestivo e respiratrio dividem uma cmara comum na regio anterior do embrio; essa regio chamada de faringe. Bolses epiteliais exteriores da faringe do origem as amgdalas, as glndulas tireide, timo e paratireide. Os tubos digestivo e respiratrio so ambos derivados do intestino primitivo (Figura 9.41). Com o avano do endoderma em direo ao centro do embrio, so formados o intestino anterior e posterior. Antes, a parte terminal oral bloqueada por uma regio do ectoderma chamada placa oral, ou estomodeu. Finalmente (aproximadamente aps 22 dias nos embries humanos), o estomodeu se rompe, criando a abertura oral do tubo digestivo. Essa abertura revestida por clulas ectodrmicas. Esse arranjo cria uma situao interessante, porque o ectoderma da placa oral est em contato com o ectoderma do crebro, qual se curvou ao redor da poro ventral do embrio. As duas regies ectodrmicas interagem mutualmente uma com a outra. A cobertura da regio oral forma a bolsa de Rathke e se torna a parte glandular da glndula pituitria. O tecido neural no assoalho do diencfalo d origem ao processo infundibular, que se torna a poro neural da pituitria. Assim, a glndula pituitria tem um dupla origem: essa natureza dupla se reflete em suas funes no adulto. A poro endodrmica dos tubos digestivo e respiratrio, se inicia na faringe. Aqui, o embrio de mamfero produz quatro pares de bolsas farngeas (Figura 9.42). Em vertebrados aquticos, essas estruturas produzem as guelras, porm, as bolsas farngeas humanas foram modificadas para o ambiente terrestre. Como discutido no Captulo 7, clulas da crista neural craniana migram para essas bolsas para formar o componente mesenquimatoso ou cartilaginoso dessas estruturas revestidas de endoderma. Entre essas estruturas esto os arcos farngeos. O primeiro par das bolsas farngeas se torna as cavidades auditivas do ouvido mdio e os tubos de eustquio associados. O segundo par d origem s paredes das amgdalas. O timo derivado do terceiro par de bolsas farngeas; ele ir direcionar a diferenciao dos linfcitos T durante os estgios tardios do desenvolvimento. Um par das glndulas paratireides tambm deriva do terceiro par das bolsas farngeas; o outro par deriva do quarto. Alm dessas bolsas pareadas, um pequeno divertculo central formado entre as segundas bolsas farngeas no assoalho da faringe. Essa bolsa de endoderma e mesnquima brotar da faringe e migrar descendo pelo pescoo para se tornar a glndula tireide.
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(A) Ndulo de Hensen Notocorda Placa neural Cavidade amnitica Vilosidade corinica
(B)
Pregas neurais comeando a se fundir

Intesti no po sterio r
Primrdio cardaco Ilha sangnea
Intestino anterior Saco vitelnico Divertculo alantico no pednculo de conexo
mnio (secionado)
Intestino mdio Intestino primitivo
Corao Celoma pericardaco
Portal intestinal anterior
Saco vitelnico
Pednculo de conexo Portal intestinal posterior
Sulco neural mnio Cavidade amnitica Somito Mesoderma somtico Mesoderma esplncnico Saco vitelnico Intestino mdio (C) (D) Broto pulmonar Tireide Tireide Faringe Estomodeu Neurporo anterior Corao Pulmo Fgado Saco vitelnico Placa da cloaca Broto caudal Pednculo corporal Estomodeo (agora aberto) Bolsa de Rathke Infundbulo Crebro Corao Saco vitelnico Fgado Proctodeu mnio (secionado) Pncreas Aorta dorsal Notocorda Alantide Estmago
Mesentrio Dorsal
Tubo Neural Mesoderma Somtico Intestino Mdio Mesentrio dorsal Cavidade abdominal Tubo neural Pncreas dorsal Peritnio visceral Saco vitelnico Duodeno Mesentrio Dorsal Peritnio parietal
Figura 9.41
Formao do sistema digestivo humano, apresentado aps aproximadamente (A) 16 dias, (B) 18 dias, (C) 22 dias e (D) 28 dias. (Segundo Crelin, 1961.)
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(A) Infundbulo Hipfise Bolsa de Rathke
Notocorda
Processo mandibular (da bolsa farngea I) Sulcos farngeos Traquia
(B) 29 dias Embrio secionado ao nvel mostrado esquerda Broto lingual mediano Arcos farngeos Entrada para o esfago (D) 42 dias Abertura auditiva externa Amgdala Glndula paratireide inferior Glndula paratireide superior
(C)
32 dias
Broto lingual lateral Expanso do segundo arco
Duto heptico Vescula biliar Pednculo vitelnico Alantide Membrana da cloaca Seio urogenital Intestino caudal
Esfago Fgado Estmago Pncreas dorsal Pncreas ventral Cavidade peritoneal Reto
Tubo auditivo Seio cervical lateral
Figura 9.42
Desenvolvimento endodrmico de um embrio humano de 6 semanas. (A) viso sagital do embrio. A regio estomacal comeou a se dilatar, e o pncreas est representado por dois brotos que no final iro se fundir. (B-D) Sees atravs do embrio de 6 semanas nos planos em (A), mostrando os destinos dos sulcos farngeos. O primeiro sulco forma as passagens auditivas externas, enquanto o segundo se expande, para finalmente cobrir os sulcos 2, 3 e 4. (Segundo Larsen, 1993.)
O tubo digestivo e seus derivados

Posteriormente faringe, o tubo digestivo se constringe para formar o esfago, o qual seguido na seqncia pelo estmago, intestino menor e intestino maior. As clulas endodrmicas geram somente o revestimento do tubo digestivo e de suas glndulas, pois clulas mesenquimatosas mesodrmicas iro rodear esse tubo provendo os msculos para o peristaltismo. A Figura 9.42 mostra que o estmago se desenvolve como uma regio dilatada prxima faringe. Mais caudalmente, se desenvolvem os intestinos, e a conexo entre o intestino e o saco vitelnico posteriormente cortada. Na terminao caudal do intestino forma-se uma depresso onde o endoderma encontra o ectoderma sobrejacente. Aqui, uma fina membrana cloacal separa os dois tecidos. Essa por fim se rompe, formando a abertura que ir originar o nus. O desenvolvimento das vrias regies do tubo digestivo ser detalhado no Captulo 17. Vescula Fgado, Pncreas e Vescula Biliar O endoderma tambm forma o revestimento de trs rgos acessrios que se desenvolvem imediatamente em posio caudal ao estmago. O divertculo heptico o tubo de endoderma que se estende do intestino anterior para dentro do mesnquima circunjacente. O mesnquima induz o endoderma a se proliferar, ramificar e formar o epitlio glandular do fgado. Uma poro do divertculo heptico (aquela regio mais prxima do tubo digestivo) continua a funcionar como um duto de drenagem do fgado e um ramo desse duto produz a vescula biliar (Figura 9.43). O pncreas se desenvolve da fuso dos divertculos dorsal e ventral distintos. Ambos primrdios nascem do endoderma imediatamente caudal ao estmago, e medida que eles crescem se aproximam um do outro, para finalmente se fundirem. Em seres humanos, somente o duto ventral sobrevive para transportar enzimas para o intestino. Em outras espcies (tais como o co), tanto o duto dorsal como o ventral se esvaziam no intestino. Tal como outros rgo endodrmicos, o pncreas se
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Broto Heptico
Estmago
Duto biliar Duto Heptico
Duto pancretico acessrio
Pncreas dorsal Vescula biliar Broto pancretico ventral (A) Vescula biliar Broto pancretico dorsal Pncreas ventral (B) Duodeno
Duto biliar
Vescula biliar
Duto pancretico Dorsal Duto pancretico ventral (C)
Duodeno
Duto pancretico ventral
Duto pancretico principal (D)
Figura 9.43
desenvolve atravs de interaes entre o epitlio e seu mesnquima associado. Ambos tecidos tm especificidades proporcionadas por sua posio ao longo do eixo ntero-posterior (a ser discutido nos Captulos 16 e 17). Se o epitlio pancretico cultivado num ambiente permissivo na ausncia de mesnquima, ele se diferencia quase inteiramente em clulas de llhotas, secretoras de insulina e glucagon. No so produzidas estruturas acinares (secretoras de quimotripsina ou amilase) nem dutos (Gittes et al., 1996). Isso sugere que a condio de ausncia de comando do epitlio pancretico a de produzir hormnios endcrinos e que as clulas secretoras e os dutos caractersticos de sua funo digestiva (excrina) so resultado de suas interaes com o mesnquima. O gene pdx-1 parece fornecer ao epitlio pancretico a capacidade de responder a seu mesnquima. Camundongos carentes desse gene no apresentam pncreas, embora seu epitlio seja capaz de se diferenciar em clulas pr-ilhotas que sintetizam pequenas quantidades de glucagon e insulina (Johnson et al., 1994; Ahlgren et al., 1996; Offield et al., 1996). O epitlio pancretico, portanto, pode ter capacidade endcrina autnoma, mas necessita interagir com o mesnquima para formar clulas excrinas e os dutos que transportam suas secrees para o duodeno. Tubo Respiratrio O Tubo Respiratrio Os pulmes tambm so um derivado do tubo digestivo, embora no tenham papel na digesto. No centro do assoalho farngeo, entre o quarto par de bolsas farngeas, o sulco laringotraqueal estende-se ventralmente (Figura 9.44). Esse sulco se bifurca em seguida em dois ramos, que formam o par de brnquios e pulmes. O endoderma laringotraqueal torna-se o revestimento da traquia, os dois brnquios e os sacos areos (alvolos) dos pulmes. Como veremos em um prximo captulo, a ramificao desse tubo endodrmico depende de interaes com os diferentes tipos de clulas mesodrmicas ao longo de sua trajetria. Os pulmes so uma novidade evolucionria, e esto entre os ltimos rgos do mamfero a se diferenciar totalmente. Os pulmes tm que ser capazes de recolher oxignio no momento da primeira respirao do beb. Para consegu-lo, as clulas alveolares secretam um surfactante para o fluido que banha os pulmes. Esse surfactante, consistindo de fosfolipdios tais como a esfingomielina e a lecitina, secretado muito tardiamente na gestao, e usualmente atinge nveis teis fisiologicamente ao redor da semana 34 da gestao humana. Esses compostos permitem s clulas alveolares tocarem-se mutuamente, sem se colarem. Assim, infantes nascidos prematuramente, freqentemente tm dificuldade respiratria e tm que ser colocados em respiradores at o amadurecimento de suas clulas produtoras de surfactante.
Desenvolvimento pancretico em humanos. (A) Aps 30 dias, o broto pancretico ventral est prximo aos primrdios hepticos. (B) Aos 35 dias comea a migrar posteriormente e (C) entra em contato com o broto pancretico dorsal durante a sexta semana do desenvolvimento. (D) Na maioria dos indivduos, o broto pancretico dorsal perde o seu duto para o duodeno; porm, em cerca de 10 porcento da populao, o sistema duplo de dutos persiste. (Segundo Langman, 1981.)
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Figura 9.44
Diviso do destino anterior em esfago e divertculo respiratrio durante as terceira e quarta semanas de gestao humana. (A) Viso lateral, fim da semana 3. (B,C) Viso ventral, semana 4. (Segundo Langman, 1981.)
Intestino anterior Faringe
Traquia
Divertculo respiratrio (Sulco laringotraqueal)
Brotos dos membros
Esfago (A) (B) (C)
Isso conclui nosso levantamento dos aspectos precoces do desenvolvimento animal. Agora nos dedicaremos aos mecanismos que permitem a ocorrncia desse desenvolvimento. Na parte III, enfocamos os eventos moleculares que direcionam a diferenciao celular. Na parte IV, vemos os papis dessas molculas na formao dos eixos do corpo embrionrio. A parte V ir discutir as foras genticas, celulares e ambientais que interagem durante a formao dos rgos.
LITERATURA CITADA
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Mecanismo da Diferenciao Celular

10 Regulao transcricional da expresso gnica: Fatores de transcrio e a ativao de promotores especficos 391 11
III
431
Regulao transcricional da expresso gnica: A ativao da cromatina 12 Controle do desenvolvimento pelo processamento e traduo diferencial do RNA 461
Regulao transcricional da expresso gnica: Fatores de transcrio e a ativao de promotores especficos
10
Quaisquer que sejam as operaes imediatas dos genes, elas certamente pertencem categoria de processos do desenvolvimento e, portanto, se enquadram no espao da embriologia. Esse problema central da biologia bsica est sendo, atualmente, tratado sob vrios aspectos, tanto por fisiologistas como bioqumicos e por geneticistas; mas essencialmente um problema embriolgico.
C. H. WADDINGTON (1956)
DIFERENTES TIPOS DE CLULAS produzem diferentes conjuntos de prote-
Entramos na clula, a manso onde nascemos e estamos comeando o inventrio da riqueza que adquirimos.
ALBERT CLAUDE (1974)
nas, mesmo que seus genomas sejam idnticos. Cada ser humano tem aproximadamente 150.000 genes em cada ncleo, mas cada clula usa somente um pequeno subgrupo desses genes. Alm disso, diferentes tipos de clulas usam diferentes subgrupos de genes. As clulas vermelhas do sangue produzem globinas, as clulas do cristalino produzem cristalinas, as clulas nervosas produzem neurotransmissores e as glndulas endcrinas produzem seus hormnios especficos. Gentica do desenvolvimento a disciplina que examina como o gentipo se transforma no fentipo, e o paradigma principal da gentica do desenvolvimento a expresso gnica diferencial a partir do mesmo repertrio nuclear. A regulao da expresso gnica pode ser realizada em vrios nveis: Transcrio gnica diferencial, regulando quais dos genes nucleares so transcritos em RNA Processamento seletivo do RNA nuclear, regulando quais dos RNAs transcritos passaro para o citoplasma tornando-se RNAs mensageiros Traduo seletiva de RNA mensageiro, regulando quais dos RNAs mensageiros no citoplasma sero traduzidos em protena Modificao protica diferencial, regulando quais protenas permanecero ou funcionaro na clula
Alguns genes (tais como aqueles codificando as protenas globina da hemoglobina) so regulados em cada um desses nveis. Neste e no prximo Captulo sero discutidos os mecanismos da transcrico gnica diferencial: como genes diferentes so ativados em diferentes tipos de clulas em tempos determinados. Os fenmenos bsicos da transcrio diferencial de genes foram discutidos no Captulo 2. Os tufos de cromossomos politnicos representam a ativao de grupos de genes em resposta a um hormnio produzido na larva do inseto. Analogamente, a expresso de genes especficos do endoderma na larva do ourio-do-mar foi controlada ao nvel da transcrio do gene. Nestes Captulos, discutiremos os mecanismos pelos quais diferentes genes podem ser ativados ou reprimidos em clulas especficas enquanto elas se diferenciam.
391
392
xons e ntrons
Quando genes so observados, a primeira coisa que se torna aparente que a maioria dos genes de eucariotos no se parecem maioria dos genes procariotos. Genes eucariotos no so colineares com seus produtos peptdicos. Ao contrrio, os terminais 3' e 5' do mRNA eucarioto se originam de regies no-contguas no cromossomo. Entre as regies de codificao de protenas no DNA-xons- esto seqncias intercaladas-ntrons- que no tm relao com a seqncia de aminocidos da protena.* A estrutura do gene da -globina humana est ilustrada na Figura 10.1. Esse gene consiste dos seguintes elementos: 1. Uma regio promotora responsvel pela ligao da RNA polimerase e subseqente iniciao da transcrio. Essa regio promotora do gene da -globina humana tem trs unidades distintas e se estende de 95 a 26 pares de base antes (a montante de) do stio de iniciao da transcrio (isto , de -95 a 26). 2. A seqncia ACATTTG, onde a transcrio se inicia. Essa freqentemente chamada seqncia de capeamento (cap) porque representa o terminal 5' do RNA, que receber um capeamento de nucleotdeos modificados logo aps sua transcrio. A seqncia especfica do capeamento varia entre os genes. 3. O cdon ATG para o incio da traduo. Esse cdon est localizado 50 pares de base depois do ponto de iniciao da transcrio (apesar dessa distncia variar muito em genes diferentes). A seqncia interposta de 50 pares de nucleotdeos entre os pontos de iniciao da trancrio e a traduo chamada seqncia lder. A seqncia lder pode determinar a velocidade de iniciao da traduo. 4. O primeiro xon contendo 90 pares de bases codificando para os aminocidos 1-30 da -globina humana. 5. Um ntron contendo 130 pares de bases sem seqncias codificadoras para a globina. A estrutura desse ntron importante para permitir que o RNA seja processado a RNA mensageiro e saia do ncleo. 6. Um xon contendo 222 pares de bases codificando para os aminocidos 31- 104. 7. Um grande ntron- 850 pares de bases- sem relao com a estrutura da protena globina. 8. Um xon contendo 126 pares de bases codificando para os aminocidos 105- 146. 9. Um cdon de terminao da traduo, TAA. 10. Uma regio 3' no-traduzida que, apesar de transcrita, no traduzida em protena. Essa regio inclui a seqncia AATAAA, a qual necessria para colocar uma cauda de cerca de 200 a 300 resduos adenilados no transcrito de RNA. Essa cauda de poli(A) confere estabilidade e traduzibilidade ao mRNA, e inserida no RNA cerca de 20 bases a jusante da seqncia AAUAAA. Entretanto, a transcrio continua alm do stio AATAAA por ainda 1000 nucleotdeos aproximadamente, antes de ser terminada. Dentro da seqncia 3' transcrita mas no traduzida (mais ou menos 600 a 900 pares de bases do stio AATAAA) est uma seqncia de DNA que serve como um intensificador. Essa seqncia necessria para a expresso temporal e especfica de tecido do gene da -globina em precursores das clulas vermelhas do sangue de adulto (Trudel e Constantin, 1987).
* O termo xon tem dois significados sobrepostos. No sentido original, isso definido anatomicamente como uma seqncia nucleotdica cujo RNA sai do ncleo. O termo tomou tambm a definio funcional de uma seqncia de nucleotdeos que codifica uma protena. Para discusso aqui, usaremos a primeira definio e definiremos as seqncias lderes e as seqncias 3' no traduzidas como xons no traduzidos. Alguns genes eucariotos (como os genes de histonas) no tm seqncias interpostas, e qualquer hiptese sobre funes de ntrons deve considerar essas excees. Por conveno, direes a montante, a jusante, 5' e 3' so especficas em relao ao RNA. Assim, o promotor est a montante do gene, perto de seu terminal 5'.
CAPTULO 10
Fatores de transcrio e promotores especficos 393
(A)
Stio de iniciao da transcrio (capeamento)
Stio de iniciao da traduo de Aminocido (aa) 1
Stio de terminao da traduo
Stio de adio de poli(A) Stio terminal da transcrio
Regio do promotor
Elementos promotores a montante TATA Box (B)
Lder (Regio no traduzida 5)
Regio no traduzida 3
Figura 10.1
Seqncia nucleotdica do gene da -globina humana. (A) Representao esquemtica da localizao da regio do promotor, stio de iniciao da transcrio (capeamento), seqncia lder, xons e ntrons do gene da globina. xons esto coloridos; os nmeros que os ladeiam, indicam a posio dos aminocidos que codificam na -globina. (B) A seqncia nucleotdica do gene da -globina, mostrada do terminal 5 ao terminal 3 do RNA. As seqncias promotoras esto enquadradas, como tambm esto os cdigos de incio de traduo e terminao, ATG e TAA. As letras maisculas grandes enquadradas em cores correspondem a xons, e os aminocidos para os quais codificam esto abreviadas acima dos quadros. As letras maisculas pequenas so as bases das seqncias interpostas. Os cdons representados por letras maisculas aps o trmino da traduo esto no mRNA da globina mas no so traduzidas em protenas. Dentro desse grupo est a seqncia considerada necessria para a poliadenilao. Um G no primeiro ntron (seta) mutado para um A em uma forma de +-talassemia. (Seqncia de Lawn et al., 1980.)
O RNA nuclear original transcrito para tal gene contm a seqncia do capeamento, a seqncia lder, os xons, os ntrons e a regio 3' no traduzida (Figura 10.2). Em adio, ambos terminais se modificam. Um capeamento consistindo de guanosina metilada colocado no terminal 5' do RNA em polaridade oposta ao prprio RNA. Assim, enquanto todas as bases no precursor da mensagem esto ligadas 5a 3', a
394
Regio promotora (ligao da RNA polimerase)
Iniciao da transcrio
ATG: cdon iniciador da traduo
TAA: cdon terminador da traduo
AATAAA: seqncia de adio de poli(A)
Seqncia terminadora da transcrio
Seqncia ATA
Lder Transcrio
GENE (DNA) PARA -GLOBINA Stio de adio de poli(A)
RNA NUCLEAR (capeamento) Processamento Cauda
RNA MENSAGEIRO Lder Traduo Cauda
PROTENA -GLOBINA Modificao ps-traduo
Figura 10.2
Sumrio das etapas envolvidas na produo da -globina e hemoglobina.

HEMOGLOBINA
estrutura do capeamento est ligada 5' a 5'. Isso significa que no h grupo fosfato 5' livre no RNA nuclear (Figura 10.3). Molculas de RNA mensageiro esto igualmente capeadas, apesar de no se ter certeza se o capeamento do mRNA o original recebido no ncleo. O capeamento 5' necessrio para a ligao do mRNA ao ribossomo e para a subseqente traduo (Shatkin, 1976). O terminal 3' usualmente modificado no ncleo pela adio de uma cauda de cerca de 200 resduos adenilados. Esses resduos de cido adenlico so ligados enzimaticamente e adicionados ao transcrito. Eles no so parte da seqncia do gene. Ambas as modificaes 3' e 5' podem proteger o RNA das exonucleases (Sheiness e Darnell, 1973; Gedamu e Dixon, 1978), assim estabilizando a mensagem e seu precursor.
Estrutura e funo do promotor

Alm da estrutura do gene que acabamos de discutir, existem seqncias reguladoras que podem estar em um ou outro terminal do gene (ou mesmo dentro dele). Essas seqncias,
CAPTULO 10
ANTES DO CAPEAMENTO Terminal 5 da molcula APS O CAPEAMENTO 7-metil guanosina Direo da traduo
Direo da traduo
Figura 10.3
Capeamento do terminal 5 de um mRNA eucaritico. Um capeamento de 7-metil-guanilato ligado 5 a 5 com a primeira base do mRNA recentemente transcrito. O terminal 5 original do mRNA tinha trs grupos fosfato. O mecanismo de capeamento une o GTP com o terminal, usando um grupo fosfato de GTP e dois grupos fosfato do mRNA. Em seguida, uma enzima metila a guanosina na posio 7; a primeira e a segunda bases de mRNA original so, com certa freqncia, tambm metiladas. (De acordo com Rottman et al., 1974.)
Terminal 3 da molcula
Terminal 3 da molcula
os promotores e intensificadores (introduzidas no Captulo 2), so necessrias para controlar onde e quando um determinado gene transcrito. Dois tipos de elementos reguladores so necessrios para efetuar a transcrio nos stios adequados. O primeiro conjunto de elementos reguladores chamado de cisreguladores. Esses representam seqncias especficas de DNA em um dado cromossomo. Cis-reguladores agem somente em genes adjacentes. O segundo grupo de elementos reguladores chamado trans-reguladores. Esses so molculas solveis (incluindo protenas e RNAs) que so produzidas por um gene e interagem com genes no mesmo ou em diferentes cromossomos. Relembrando a induo gnica no operon lac de E.coli, foi visto que um gene repressor produz uma protena repressora que interage com a seqncia operadora dos genes do operon lac. Nesse caso, o DNA operador um elemento cis-regulador porque controla somente o operon lac adjacente no seu prprio cromossomo. A protena repressora, entretanto, um trans regulador porque ele pode ser produzido por um cromossomo e se ligar ao operador cisregulador em outro cromossomo. Em genes eucariotos que codificam RNA mensageiro, foram descobertos dois tipos de seqncias de DNA cis-reguladoras que influenciam tais genes serem transcritos em tais clulas. Esses so os promotores e os intensificadores. Promotores, tipicamente esto localizados imediatamente a montante do stio onde se inicia a transcrio e geralmente tm centenas de pares de bases na sua cadeia. Eles so necessrios para a ligao da RNA polimerase II e para a exata iniciao da transcrio. RNA polimerases de eucariotos requerem fatores proticos adicionais para a ligao eficiente ao promotor. O intensificador uma seqncia de DNA que pode ativar a utilizao do promotor, controlando a velocidade e eficincia de transcrio daquele promotor especfico. Intensificadores s podem ativar promotores ligados aos cis (ou seja, promotores no mesmo cromossomo), mas podem faz-lo a grandes
396
distncias (algumas to grandes como 50 quilobases alm do promotor). Alm disso, intensificadores no precisam estar no lado 5' (a montante) do gene. Eles podem estar no lado 3', nos ntrons, ou mesmo na fita de DNA complementar (Maniatis et al., 1987). Como o promotor, os intensificadores funcionam ligando protenas especficas trans-reguladoras chamadas fatores de transcrio. Um tipo de intensificador um intensificador negativo, tambm chamado silenciador. Quando fatores de transcrio se ligam a silenciadores, eles reprimem a transcrio dos promotores ligados aos cis. Algumas seqncias podem agir como intensificadores positivos em certas clulas e como negativos em outras, dependendo de outros fatores de transcrio presentes na clula. Estrutura do promotor Promotores de genes que transcrevem quantidades relativamente grandes de mRNA tm estruturas similares. Eles tm uma seqncia TATA (algumas vezes chamada TATA box ou Goldberg-Hogness box) cerca de 30 pares de base a montante do stio onde se inicia a transcrio, bem como um ou mais elementos promotores ainda mais a montante (Figura 10.4; Grosschedl e Birnstiel, 1980; McKnight e Tjian, 1986). A anatomia funcional de uma regio promotora pode ser analisada determinando-se quais de suas bases so necessrias para uma transcrio eficiente. Genes clonados podem ser precisamente transcritos quando colocados nos ncleos de ocitos de r ou de fibroblastos ou quando incubados com RNA polimerase na presena de nucleotdeos e extratos nucleares (Wasylyk et al., 1980). Depois que a transcrio de um gene confirmada, usa-se enzimas de restrio para fazer delees especficas no gene ou em regies vizinhas. Pode-se observar se um gene assim modificado ainda ser transcrito precisamente. Tais estudos nos genes da -globina (Grosveld et al., 1982; Dierks et al.,1983) mostraram que os primeiros 109 pares de bases precedendo o stio do capeamento eram suficientes para a correta iniciao da transcrio do gene da globina pela RNA polimerase. Myers e colaboradores (1986) melhoraram essa anlise clonando a regio de um gene de -globina de camundongo, desde 106 pares de bases a montante do comeo da transcrio (-106) at os primeiros 475 pares de bases (+ 475) do primeiro xon. Esses clones foram submetidos a mutagnese in vitro (onde mutaes especficas podem ser colocadas em um gene clonado). Dessa maneira, 130 substituies de base nica diferentes foram introduzidas na regio do promotor do gene da globina. Esses genes clonados foram colocados em plasmdeos contendo um intensificador de um gene normalmente expresso em todos os tecidos. Os plasmdeos recombinantes foram em seguida introduzidos por transfeco em clulas cultivadas que normalmente no produzem globina. Deveriam essas clulas transcreverem uma mensagem de globina truncada (475 bases) a partir dos clones? A Figura 10.5 mostra os resultados. Na maioria dos casos, mutando uma base na regio flanqueando o terminal 5' no afetou a eficncia da transcrio do gene da globina. Entretanto, as mutaes reduziram drasticamente as transcries em trs agrupamentos de nucleotdeos. Um agrupamento foi na seqncia TATA, outro no elemento promotor a montante, CAAT, e um terceiro foi na regio CACCC, aproximadamente 95 a 87 pares de bases a montante do stio de capeamento. As seqncias CAAT e TATA foram consideradas elementos crticos em numerosos promotores eucariotos (Efstratiadis et al., 1980), mas a seqncia CACCC raramente encontrada a no ser nos promotores do gene da -globina em vrias espcies. Em humanos, essa seqncia parece ser crtica. Uma mutao natural nessa seqncia causa a perda total da transcrio do gene da -globina (Orkin e Kazazian, 1984), e essa seqncia reconhecida por um fator de transcrio especfico de eritrcitos (Mantovani et al., 1988). Duas mutaes, nas posies -78 e -79, realmente aumentaram a transcrio a um nvel trs vezes maior que o tipo selvagem. Considera-se que essas modificaes facilitam a interao do promotor com as protenas trans-reguladoras.
Elementos promotores a montante
TATA box
Iniciao de mRNA
Figura 10.4
Regio promotora tpica de um gene eucarioto codificando uma protena. O gene no diagrama contm uma seqncia TATA de elementos promotores a montante. Exemplos de alguns desses elementos a montante esto ilustrados abaixo do diagrama. (De acordo com Maniatis et al., 1987.)
CAPTULO 10
Figura 10.5
Nvel relativo de transcrio
Posio Stio do capeamento
O efeito de mutaes pontuais especficas no promotor da -globina do camundongo na habilidade do promotor de iniciar a transcrio. Cada linha representa o nvel de transcrio de um promotor mutante relativo ao nvel de transcrio de um promotor da globina do tipo selvagem testado simultaneamente. Os pontos escuros representam nucleotdeos para os quais no foram produzidas mutaes. O diagrama abaixo do histograma mostra a posio da seqncia TATA e os dois elementos promotores a montante no gene da -globina do camundongo. (De acordo com Myers et al., 1986.)
Funo do promotor Promotores podem funcionar no somente na ligao da RNA polimerase, mas tambm na especificao do lugar e tempo que a transcrio pode ocorrer daquele gene. Essa funo dos promotores pode ser claramente demonstrada em certos animais transgnicos. Aqui, um novo gene construdo, onde o promotor normal de um determinado gene substitudo pelo promotor de algum outro gene, e o gene fundido colocado no proncleo de um zigoto de mamfero. Palmiter e colaboradores (1982) isolaram o gene do hormnio de crescimento do rato e deletaram sua regio promotora 5'. Nesse espao, eles substituram a seqncia promotora de outro gene-Mt-1 por metalotionena 1 de camundongo, uma pequena protena envolvida na regulao dos nveis de zinco no soro. O gene hbrido est ilustrado na Figura10.6A. O gene Mt-1 pode ser induzido pela presena de metais pesados tais como zinco e cdmio, e as seqncias responsveis por essa induo esto no promotor desse gene. Fundindo essa regio do promotor de metalotionena ao gene do hormnio de crescimento do
seqncia ladeando 5 de Mt-1 seqncia ladeando 5 de GH Seqncias reguladoras do Mt-1 no transcrito Gene GH do rato
Figura 10.6
(A)
Funo do promotor vista em camundongos transgnicos. (A) Plasmdeo recombinante contendo o gene estrutural do hormnio de crescimento do rato, a regio reguladora da metalotionena do camundongo e o plasmdeo bacteriano pBR322. O plasmdeo, pMGH, foi injetado nos ocitos do camundongo. Os enquadramentos escuros no plasmdeo injetado correspondem aos xons do gene GH. A direo da transcrio indicada por uma seta. (B) Um camundongo derivado dos ovos injetados com pMGH (esquerda) e um membro normal da ninhada (direita). (de Palmiter et al., 1982; fotografia cortesia de R. L. Brinster.)
Seqncias reguladoras do Mt-1 do camundongo
Gene GH do rato
398
Figura 10.7
Funo do promotor vista em carneiros transgnicos. O gene estrutural para uma protena de importncia farmacutica como a 1antitripsina ou peptdeos do fator de coagulao so ligados ao promotor para a lactalbumina (ou casena) do leite de carneiro. O gene recombinante injetado no proncleo de um ovo de carneiro recentemente fertilizado, e o ovo implantado no tero de uma me adotiva. Os carneiros recm-nascidos so analisados (por PCR ou transferncia Southern) para verificar a presena do transgene. Quando os carneiros transgnicos fmeas maturam, o transgene deveria ser ativado na glndula mamria e a protena secretada no leite. Do leite pode-se isolar o composto de importncia farmacutica. (De acordo com Watson et al., 1992.)
Gene 1-antitripsina (AAT) Promotor da -lactoglobulina vulo de carneiro DNA recombinante injetado no proncleo Implante na me adotiva
rato (rGH), esse colocado sob o controle do promotor da metalotionena. Nesse caso, a mensagem para o hormnio de crescimento do rato deve ser concretizada quando o promotor de Mt-1 for ativado pela presena do zinco ou cdmio. Um plasmdeo contendo esse gene fundido foi cultivado em bactrias (veja Captulo 2), o pedao Mt-1/rGH foi isolado, e cerca de 600 cpias desse fragmento foram injetadas nos proncleos de ovos de camundongos recentemente fertilizados. Hibridizao de DNA mostrou que muitos desses camundongos recm-nascidos haviam incorporado, em seus cromossomos, numerosas cpias do gene do hormnio de crescimento do rato. Esses animais transgnicos foram ento alimentados com uma dieta com suplemento de zinco. Os fgados desses camundongos foram induzidos pelo zinco a secretar grandes quantidades de hormnio de crescimento do rato. (O fgado o local onde usualmente produzida a metalotionena, ao passo que o hormnio de crescimento secretado pela glndula pituitria.) A quantidade de hormnio de crescimento secretado foi correlacionada com o tamanho desses camundongos. Os camundongos transgnicos se tornaram enormes, at 80% maiores do que os membros normais da ninhada (Figura 10.6B).* O promotor da metalotionena regulou a sntese do hormnio de crescimento nesses camundongos transgnicos. Atualmente, essa estratgia est sendo utilizada por indstrias farmacuticas para produzir grandes quantidades de produtos proticos tais como hormnios peptdicos, 1-antitripsina (usada por pacientes com enfisema) e fatores de coagulao do sangue. Proncleos de vacas, carneiros e cabras foram injetados com DNA recombinante contendo a seqncia do gene da protena desejada, fundida aos promotores dos genes para casena, lactalbumina, ou -lactoglobulina (trs principais protenas do leite). Vacas em lactao sintetizam enormes quantidades de protenas do leite, e a maior parte dessa produo regulada pela transcrio de novas mensagens. A esperana que os animais ao transcreverem os genes para a casena ou lactalbumina (em resposta ao hormnio prolactina) tambm transcrevam e sintetizem os genes para essas protenas teraputicas. Por exemplo, em um caso, um gene humano para a protena 1antitripsina foi fundido a um promotor da -lactoglobulina e injetado nos proncleos de zigotos de carneiro. Um desses embries de carneiro se desenvolveu em uma fmea cujo leite continha 35 g/L de protena 1-antitripsina humana (Figura 10.7; Wright et al., 1991).** Os promotores, ento, exercem um papel na especificao de qual gene transcrito em qual clula durante o desenvolvimento.
*Dois fatos surgiram desse experimento. O primeiro nossa potencial habilidade para curar doenas genticas fertilizando ovos in vitro e injetando um gene normal dentro de um proncleo. Esses ovos podem iniciar seu desenvolvimento e, em seguida, ser retornados ao tero da mulher. O segundo fato que surgiu foi nossa responsabilidade (que geralmente proporcional ao nosso poder, quer queiramos ou no). **A maior parte da secreo no leite do animal transgnico no to grande assim, provavelmente porque os genes no esto ligados aos seus intensificadores apropriados, como veremos mais tarde.
Pipeta suporte
Prognie transgnica identificada por PCR
Obteno de leite de animais trransgnicos
Fracionamento de protenas do leite
Expresso de AAT restrita ao tecido mamrio
Protena ATT secretada no leite
Protena ATT pura
CAPTULO 10
&
Especulaes
RNA polimerase e os fatores trans-reguladores no promotor

rao entre a RNA polimerase e o DNA promotor. As clulas eucariticas possuem trs tipos de RNA polimerases, cada uma com funes e propriedades especficas (Rutter et al., 1976). RNA polimerase I encontrada na regio nucleolar do ncleo e responsvel pela transcrio dos grandes RNAs ribossmicos; RNA polimerase II transcreve precursores do RNA mensageiro; e RNA polimerase III transcreve RNAs pequenos tais como RNA de transferncia, RNA ribossmico 5S e outras pequenas seqncias de DNA.* Nenhuma das RNA polimerases eucariticas se ligam eficientemente ao DNA. Na realidade, existem famlias de protenas ligantes de DNA que se ligam inicialmente ao DNA, e uma vez ligadas, interagem com a RNA polimerase para iniciar a sntese de RNA. O elemento TATA e a RNA polimerase II. O diagrama clssico de transcrio mostra que o DNA, na presena da RNA polimerase e ribonucleosdeos trifosfato, transcreve molculas de RNA. Mas esse esquema simples no leva em considerao dificuldades como (1) fazer com que o RNA se inicie no local correto e (2) fazer com que a transcrio de um gene especfico ocorra somente em tempos e clulas especficos. Devem existir fatores que permitam que a RNA polimerase se ligue somente a promotores de determinados genes. Aqui, discutiremos aquelas protenas e seqncias de DNA que localizam a RNA polimerase nos stios promotores. A enzima responsvel pela transcrio de RNAs mensageiros a RNA polimerase II. Entretanto, no vai haver uma transcrio exata dos genes clonados, in vitro, se esses forem incubados
* Na maioria das clulas, os RNAs ribossmico e de transferncia so sintetizados constitutivamente. Entretanto, os animais desenvolveram mecanismos extraordinrios para acelerar a sntese de rRNA em seus ocitos. Assim, adiaremos a discusso sobre RNA polimerases I e III at o detalhamento de eventos na oognese no Captulo 22.
TRANSCRIO REQUER a inte-
com RNA polimerase purificada e nucleosdeos trifosfato. necessrio adicionar extratos nucleares para que se inicie uma transcrio exata. Quais so esses fatores que permitem o incio da transcrio? Pelo menos seis protenas nucleares foram consideradas como necessrias para uma iniciao adequada da transcrio pela RNA polimerase II (Figura 10.8; Buratowski et al., 1989; Sopta et al., 1989). TFIID e TFIIA.** Na primeira etapa da transcrio do mRNA, o complexo TFIID se liga seqncia TATA. Isso foi demonstrado em experimentos de proteo de DNase onde TFIID foi adicionado a genes clonados e o DNA, ento, foi digerido pela DNase. A nica maneira de salvar o DNA da digesto lig-lo ao TFIID, impedindo o acesso da DNase. Dessa maneira, Sawadogo e Roeder (1984) demonstraram que TFIID se liga especificamente regio TATA dos genes. TFIID uma protena multimrica e um de seus componentes-a protena ligante da seqncia TATA (TBP)- se liga diretamente no sulco menor da seqncia TATA (Lee et al., 1991; Starr e Hawley, 1991). O complexo TFIID tem vrias atividades; a primeira ligar a seqncia TATA e servir como fundao ao complexo transcricional. Outro papel do TFIID impedir a estabilizao de nucleossomos na regio do promotor. Quando DNA contendo promotor incorporado nos nucleossomos, esses genes no podem ser transcritos quando TFIID, RNA polimerase II e outros fatores so adicionados mais tarde. Entretanto, quando TFIID adicionado antes ou durante a formao de nucleossomos, a cromatina resultante transcricionalmente ativa (Workman e Roeder, 1987). Bloqueando a formao de nucleossomos, TFIID parece agir antagonicamente histona H1. Histona H1 (como
**TF significa fator de transcrio; II indica que o fator foi, inicialmente, considerado necessrio para a RNA polimerase II; as designaes de letras se referem s fraes da coluna de fosfocelulose que tinham a atividade.
veremos no prximo captulo) estabiliza nucleossomos e impede a transcrico na regio onde ela se liga. A adio de histona H1 impede que TFIID encontre os stios de TATA e, dessa maneira, a transcrio no se d; a inibio superada se TFIID adicionado antes (Laybourn e Kadonaga, 1991). A ligao de TFIID facilitada e estabilizada pelo fator de transcrio TFIIA (Buratowski et al., 1989; Maldonado et al., 1990). Muitos fatores de transcrio ativam a funo transcrio recrutando TFIID e ativando-o de modo que TFIID possa ligar outros membros do complexo de transcrio (Chi e Carey, 1996; Stargell e Struhl, 1996). Assim, a deciso de transcrever ou no um gene particular depende do equilbrio entre os fatores inibidores (como as histonas) e TFIID e TFIIA.
TFIIB e RNA polimerase II. O complexo TFIID/TFIIA no pode formar um complexo estvel diretamente com a RNA polimerase II. Em lugar disso TFIID liga o fator TFIIB. A ligao de TFIIB a TFIID parece ser a etapa limitante mais importante da velocidade de transcrio de numerosos genes. Essa velocidade pode ser dramaticamente aumentada pela proximidade de certos fatores de transcrio ligantes de promotores e intensificadores. Esses fatores de transcrio so especficos de seqncias e podem determinar quais genes sero transcritos. O domnio ativador desses fatores de transcrio se liga diretamente com TFIIB e facilita sua montagem com TFIID (Lin e Greene, 1991; Lin et al., 1991). Uma vez que TFIIB est localizado, ele pode ligar a RNA polimetrase II. A maior parte da RNA polimerase posicionada pela sua interao com TFIIB, mas a cauda carboxiterminal da subunidade grande da RNA polimerase II interage diretamente com TFIID (veja Figura 10.8D). Dessa maneira, RNA polimerase II situada no promotor. TFIIE/F e TFIIH. Imediatamente antes ou durante sua ligao a TFIIB, a RNA poli-
400
(A)
O complexo TFIID se liga sequncia TATA atravs da subunidade TBP +1 Stio de iniciao da transcrio
(B) TFIID estabilizado pelo TFIIA
(C)
TFIIB e TFIIH se juntam ao complexo na sequncia TATA
RNA polimerase II Domnio carboxi-terminal (CTD) Um complexo de RNA polimerase II, TFIIE e TFIIF posicionado pelo TFIIB e seu domnio carboxi-terminal ligado pelo TFIID
(D)
RNA polimerase II
merase II se associa ao TFIIF e TFIIE (Buratowski et al., 1991; Conaway et al., 1991). TFIIF tem uma atividade enzimtica necessria para desenrolar a hlice do DNA. TFIIE uma ATP-ase dependente de DNA e provavelmente necessria para gerar a energia para a transcrio (Bunick et al., 1982; Sawadogo e Roeder, 1984). Mas qual a vantagem de tudo isso, se a RNA polimerase permanece ligada a esse complexo na seqncia TATA? Para que haja transcrio, a RNA polimerase deve ser liberada da regio do promotor. Essa atividade de liberao parece ser funo do TFIIH. A RNA polimerase est fortemente ligada pelo seu domnio carboxiterminal (CTD) ao FTIID. Entretanto, TFIID somente se ligar forma no fosforilada de CTD. Nos mamferos CTD contm 52 repeties da seqncia de sete aminocidos YSPTSPS. Quando o complexo de iniciao est formado, o complexo completo ativa a protena quinase serina/treonina do TFIIH, o qual fosforila cada uma das 52 repeties (veja Figura 10.8E; Koleske et al., 1992; Lu et al., 1992; Usheva et al., 1992). TFIID no pode ligar essa regio altamente fosforilada e libera a RNA polimerase. Ao passo que a primeira ligao fosfodiester pode ser feita sem a fosforilao do CTD, essa fosforilao parece ser essencial para a transcrio posterior do RNA mensageiro (Akoulitchev et al., 1995). TAFs e a ativao da transcrio basal. TFIID uma protena multimrica, mas somente uma de suas unidades se liga seqncia TATA. Algumas das outras subunidades so chamadas fatores associados das protenas ligantes de TATA (TAFs). Purificao das TAFs, a partir de TFIID do homem e da Drosophila, mostrou que essas so compostas por um conjunto protenas (Figura 10.9; Dynlacht et al., 1991). Considera-se que as TAFs servem a duas funes: (1) elas podem determinar se TFIID permanece ou no no promotor, e (2) elas podem funcionar como co-ativadores, fazendo uma ponte entre as protenas ligadas ao intensificador e o complexo de transcrio atravs de interaes protena-protena. de importncia para o gene se as protenas ligantes de TATA permanecem no promotor. Se elas sarem, o gene no ser transcrito. Verrijzer e colegas (1995) mostraram que as TAFs de 250- e 150- kDa
(E)
O CTD fosforilado pelo TFIIH e liberado pelo TFIID; comea a transcrio
Transcrito de RNA
Figura 10.8
Formao do complexo de iniciao ativo nos eucariotos. O diagrama representa os complexos formados na seqncia TATA pelos fatores de transcrio e RNA polimerase II. (A) O complexo TFIID se liga seqncia TATA atravs de sua subunidade TBP. (B) TFIID estabilizado pelo TFIIA. (C) TFIIB eTFIIH se juntam ao complexo na seqncia TATA enquanto TFIIE e TFIIF se associam RNA polimerase II. (D) RNA polimerase posicionada pelo TFIIB, e seu domnio carboxi-terminal (CTD) ligado pelo TFIID. (E) O CTD fosforilado pelo TFIIH e liberado pelo TFIID. A RNA polimerase II est agora competente a transcrever o mRNA do gene.
CAPTULO 10
(A) Um complexo mnimo de TBP e um TAF no ativa a transcrio (Sp1 e NTF no podem se associar com TBP)
Figura 10.9
Esquema de experimentos sugerindo que diferentes TAFs interagem com diferentes fatores de transcrio para ativar a transcrio. O complemento total das TAFs ilustrado em (D). O ativador em (D) uma protena ligada uma seqncia de DNA que foi estabilizada pelas outras interaes. (De acordo com Chen et al., 1994.)
(B)
Adio do TAF p150 ou TAF p60 permite a ativao transcricional pelo NTF, mas no Sp1
(C) Adio do TAF p110 e do TAF p150 permite a ativao de ambos, NTF e Sp1
(D) O holo-TFIID suporta a ativao por vrios fatores e permitir o acesso de outras protenas de ativao ao complexo transcricional
Iniciao da transcrio Protena de ativao ligante de DNA
tm importncia crtica ao determinar se TBP permanece ligado seqncia TATA. Os TAFs reconhecem elementos a montante do promotor, os quais, se presentes, estabilizam ou desestabilizam o TBP no promotor. Isso significa que alguns promotores so intrinsicamente mais difceis de serem transcritos e que certos fatores deveriam estar presentes para produzir esses promotores transcritveis. Como veremos adiante, alguns promotores (como aquele para interferon- humano) so transcritos somente aps grande esforo em dobr-los, contorclos de modo a envolver o frgil complexo de transcrio. A associao de TBP com diferentes TAFs permite a ativao do complexo de transcrio por protenas ligadas a stios de intensificadores e a montante dos promotores. Alm disso, diferentes TAFs podem co-ativarem com fatores trans diferentes. Por exemplo, um dos fatores de transcrio mais comum o Sp1. Essa protena no-TAF se liga s seqncias promotora ou intensificadora GGGCGG atravs de seu terminal carboxila mas regula a atividade transcricional, via seu terminal amino (Dynan e Tjian, 1985; Kadonaga et al., 1988). Provavelmente, esse fator encontrado em todas as clulas e, portanto, no regula expresso gnica diferencial. Apesar disso, ele parece estar envolvido em interaes entre as regies promotora e intensificadora de maneira a produzir transcrio diferencial de determinados genes em determinadas clulas. Sp1 necessita se ligar ao TAF de 110-kDa para que seja ativado o complexo de transcrio. Dessa maneira, esse TAF faz uma ponte entre o Sp1 e o TBP formando uma ala no DNA (Hoey et al., 1993; Chen et al., 1994). TAFs permitiriam a formao de alas no DNA de maneira que os elementos Sp1 no intensificador encontrariam a protena TFIID no promotor (veja Figura 10.9). O fator de transcrio Bicoid se liga aos TAFs de 110- e 60- kDa, e mutaes em quaisquer desses TAFs reduzem a transcrio dependente de Bicoid em em-
bries de Drosophila (Sauer et al., 1996). Da mesma forma, o fator de transcrio NTF-1 de Drosophila se liga a ambos os TAFs de 60- e 150- kDa, e no homem, a ativao transcricional pelo receptor de estrgeno consumada pela sua ligao ao TAF de 30-kDa (Jacq et al., 1994). Na verdade, Jacq e colegas mostraram que nem todos TBPs tinham o TAF de 30-kDa. Parece que alguns TAFs so encontrados em todos TFIIDs, enquanto outros parecem ser mais especficos. Promotores sem elementos TATA. Existem muitos genes (a maioria codificando protenas metablicas gerais e no protenas especficas em clulas) que usam RNA polimerase II, mas cujos promotores no tm a seqncia TATA. Nesse caso, outras protenas se ligam na regio do promotor; usualmente so protenas ligantes de promotores tais como o SP1. A protena Sp1 no promotor rico em GC liga-se ao TFIID, diretamente ou atravs de um TAF. O TFIID est agora apto a iniciar a cascata de fatores que formaro o complexo de iniciao da transcrio e a ligao de uma protena da RNA polimerase II regio do promotor (Figura 10.10; Pugh e Tjian, 1991; Rigby, 1993). Mesmo que esses promotores no tenham uma seqncia TATA, TFIID ainda o fator decisivo para a regulao da ocorrncia da transcrio.
TAFs Protena ligante de TATA
Sp1
RNA polimerase II e fatores basais
Figura 10.10
Configurao possvel para fatores de transcrio mediando a ligao da RNA polimerase II a um promotor sem TATA contendo um stio de ligao de Sp1. (De acordo com Pugh e Tjian, 1991; Comai et al., 1992.)
402
Estrutura e funo dos intensificadores

Necessidade de intensificadores Alm de promotores, os intensificadores tambm so importantes na regulao da transcrio de genes vizinhos. Um dos primeiros intensificadores celulares encontrado foi demonstrado controlando a especificidade celular da transcrio do gene da imunoglobulina. As clulas B so as nicas do corpo que produzem a protena imunoglobulina (anticorpo). Gillies e seus colaboradores (1983) transfectaram um gene clonado da cadeia pesada da imunoglobulina, em clulas cultivadas de linfcitos B de tumores que haviam perdido sua habilidade de produzir sua prpria cadeia pesada. Essas clulas transfectadas passaram a sintetizar a cadeia pesada codificada pelo gene incorporado. Porm, adicionando o mesmo gene - mas sem uma pequena regio de um determinado ntron- nessas clulas B defeituosas foi observada apenas uma pequena transcrio do gene inserido. Havia uma regio intensificadora dentro do ntron que era necessria para a transcrio (Figura 10.11). Intensificadores so tambm elementos primrios responsveis pela transcrio especfica para tecidos: os genes clonados de imunoglobulina no so transcritos quando inseridos nos ncleos de clulas outras que as clulas B (Banerji et al., 1983;
Linhagem de clulas de mieloma produzindo IgG
Figura 10.11
Especificidade tecidual do efeito do elemento intensificador. O gene da cadeia pesada da imunoglobulina foi isolado e clonado de uma linhagem de clulas de mieloma produzindo IgG. Alguns dos clones foram mantidos intactos, enquanto em outros, vrias regies do ntron entre os xons VDJ e Cg (que sero discutidos mais tarde) foram excisadas com enzimas de restrio. DNA dos clones resultantes foi transfectado em clulas de mieloma que haviam perdido seus genes de imunoglobulina. O mRNA acumulado das clulas transfectadas foi isolado e separado por eletroforese em gel de poliacrilamida, junto com mRNAs de um fibroblasto normal de camundongo e da clula original do mieloma. O RNA foi transferido para papel de nitrocelulose e hibridizado com um fragmento de enzima de restrio radioativa da regio C. Se a regio C estivesse sendo transcrita desses genes clonados, a sonda radioativa deveria se ligar a ela. A sonda detectou a mensagem de C somente dos clones que continham uma certa regio do ntron (indicada pela barra colorida dentro do ntron). Quando transfectado em clulas fibroblsticas de camundongo, entretanto, mesmo o gene clonado inteiro no transcreveria mRNA de C. ( Protocolo e dados de Gillies et al., 1983.)
Isolamento e clonagem do gene da cadeia pesada de imunoglobulina Gene da cadeia pesada de Ig
Transfectar com gene normal
Remover pores do ntron
Transfectar com gene normal
Mielomas de camundongos sem genes da cadeia pesada
Transfeco com diferentes pores faltantes do ntron
Sem transfeco
Fibroblasto de camundongo
Extrair mRNA, separar em gel, transferir para papel, hibridizar com fragmento radioativo C de DNA
Posio do mRNA de C normal
CAPTULO 10
Gillies et al., 1983). Alm disso, quando a regio do intensificador da cadeia pesada da imunoglobulina inserida em um gene clonado de -globina, ele estimula a transcrio daquele gene da hemoglobina somente se o gene inserido em uma clula B. Ambos, os elementos reguladores cis e os fatores reguladores trans so necessrios para a transcrio de gene especfico da clula. Funo do intensificador: Modelos temporais e espaciais de transcrio Intensificadores podem regular a expresso temporal e especfica do tecido de todos os genes regulados diferencialmente, e genes ativos em tipos de clulas adjacentes tm diferentes intensificadores. No pncreas, por exemplo, os genes para as protenas excrinas (para as protenas quimotripsina, amilase e tripsina) tm intensificadores diferentes daqueles do gene para a protena endcrina insulina. Esses intensificadores se situam nas seqncias ladeando o terminal 5 dos seus respectivos genes. Walker e colegas (1983) colocaram essas regies de flanco no gene para o cloranfenicol acetill transferase de bactria (CAT), um gene cujo produto enzimtico no encontrado em clulas de mamfero. Atividade de CAT facilmente determinada em clulas de mamferos e usada como um gene reprter para mostrar ao pesquisador se um determinado intensificador est funcionando. Em seguida, os pesquisadores transfectaram esses genes hbridos em (1) clulas de ovrio (que no secretam insulina ou quimotripsina), (2) em uma linhagem de clulas que secretam insulina, e (3) em uma linhagem de clulas excrinas, e mediram a atividade da enzima marcadora em cada uma dessas clulas. Como mostrado na Figura 10.12, nenhuma das seqncias intensificadoras promoveu a produo da enzima nas clulas ovarianas. Nas clulas secretoras de insulina, a regio flanqueando a posio 5 do gene da insulina permitiu a expresso do gene da cloranfenicol acetiltransferase, mas a regio flanqueando a 5 do gene da quimotripsina, no o permitiu. Inversamente, quando os clones foram colocados na linhagem de clulas pancreticas excrinas, a regio flanqueando a 5 da quimotripsina permitiu a expresso de CAT enquanto o intensificador da insulina no
Figura 10.12
Especificao tissular de intensificadores de genes pancreticos. As regies ladeando o terminal 5 do gene da insulina (I) e o gene da quimotripsina (C) foram separadamente inseridos prximo ao gene para CAT bacteriano. Como um controle positivo, o intensificador do vrus do sarcoma de Rous (V), que parece operar em todos os tipos de clulas, foi tambm colocado prximo ao gene CAT. Os trs clones foram transfectados em trs tipos de clulas, (A) uma linhagem de clulas ovarianas que no produzem nem insulina nem quimotripsina, (B) uma linhagem de clulas secretando insulina, ou (C) uma linhagem de clulas secretando quimotripsina. A atividade de CAT foi ensaiada em todos lisatos celulares. As inseres mostram auto-radiografias tpicas do ensaio de CAT onde cloranfenicol radioativo (o substrato da reao de CAT) pode ser separado do cloranfenicol monoacetato (o produto da reao de CAT) por cromatografia. (De acordo com Walker et al., 1983.)
(C) Linhagem de clulas pancreticas excrinas (secretando quimotripsina)
(A)
Linhagem de clulas ovarianas
(B)
Linhagem de clulas pancreticas secretando insulina
Cloranfenicol monoacetato (produto)
Cloranfenicol (substrato)
Intensificador viral
Intensificador de quimotripsina
Intensificador de insulina
Tempo de incubao em minutos
Tempo de incubao em minutos
Tempo de incubao em (horas)
404
Stio de ligao de protena especfica do sexo
Regio do intensificador yp2
yp1
Intensificador do ovrio
o permitiu. Os intensificadores para 10 protenas excrinas compartilham uma seqncia de consenso de 20 pares de bases, sugerindo que essas seqncias similares tenham um papel na ativao desses genes nas clulas excrinas do pncreas (Boulet et al., 1986). Assim, parece que a expresso dos genes em clulas endcrinas e excrinas do pncreas controlada por intensificadores diferentes. Intensificadores so crticos para a regulao do desenvolvimento normal, durante a ltima dcada foram feitas cinco generalizaes que enfatizam sua importncia para a expresso gnica diferencial: 1. A maioria dos genes requer intensificadores para sua transcrio. 2. Intensificadores so os principais determinantes do tempo e do espao (tipo celular) na transcrio diferencial. 3. Estando o intensificador a uma distncia relativamente grande do promotor isso significa que pode haver mltiplos sinais para determinar se um dado gene transcrito. Um gene pode ter vrios stios de intensificadores a ele ligados, e cada intensificador pode se ligar a mais de um fator (que pode regular, seja inibindo ou estimulando, a transcrio). 4. A interao entre as protenas ligadas aos stios intensificadores com o sistema de transcrio agrupado no promotor considerada como regulador da transcrio. O mecanismo dessa associao no inteiramente conhecido, e nem entendemos como o promotor integra todos esses sinais. 5. Intensificadores so modulares. Existem elementos de DNA que conferem expresso gnica temporal e espacial, e esses podem ser misturados e pareados. Por exemplo, o intensificador da protena do vitelo da Drosophila melanogaster construdo de tal forma que um dos elementos do DNA permite a expresso do gene nos corpos gordurosos, outro elemento de DNA permite a expresso nos ovrios e o terceiro elemento liga protenas especficas do sexo (as protenas Doublesex). A protena Doublesex especfica da fmea estimula a transcrio; a protena especfica do macho inibe a transcrio. Assim, o gene da protena do vitelo ativado somente nos corpos gordurosos e ovrios da mosca fmea (Figura 10.13; Garabedian et al., 1985; An e Wensink, 1995). O elemento de DNA para expresso nos corpos gordurosos compartilhado com outros genes que so expressos nesse rgo, e o elemento de DNA ligado s protenas Doublesex tambm compartilhado pelos genes cuja expresso especfica para o sexo.
Intensificador dos corpos gorduros
Figura 10.13
Estrutura modular da regio do intensificador da protena do vitelo de Drosophila. Os dois genes da protena do vitelo ( yp1, yp2) so regulados por um intensificador entre eles. Uma regio do intensificador liga fatores de transcrio nos ncleos ovarianos e permite a expresso desses genes no ovrio. Outra regio do intensificador permite a expresso do gene nos corpos gordurosos. Dentro da regio controlando a expresso dos genes das protenas do vitelo nos corpos gordurosos existem seqncias de DNA que ligam fatores de transcrio especficos do sexo.
Fatores de transcrio: Os trans-reguladores dos promotores e dos intensificadores

Fatores de transcrio so protenas que se ligam s regies intensificadoras ou promotoras e que interagem de tal maneira que a transcrio ocorre somente a partir de um pequeno grupo de promotores numa dada clula. A maioria dos fatores de transcrio pode se ligar s seqncias especficas de DNA, e essas protenas trans-reguladoras podem ser agrupadas em famlias baseadas em similaridades de estrutura. Dentro de cada famlia, as protenas compartilham uma armao estrutural comum nos seus respectivos stios de ligao ao DNA, e pequenas diferenas de aminocidos no stio de ligao podem alterar a seqncia do DNA ao qual elas se ligam. Alm de terem o domnio ligante de DNA que especfico para uma seqncia, os fatores de transcrio contm um domnio envolvido na ativao da transcrio do gene cujo promotor ou intensificador ele ligou. Freqentemente, esse domnio trans-ativador permite ao fator de transcrio interagir com protenas envolvidas na ligao da RNA polimerase. Essa interao com freqncia aumenta a eficincia com a qual o complexo transcricional bsico pode ser construdo e ligar a RNA polimerase II. Existem vrias famlias de fatores de transcrio; as aqui discutidas so de alguns tipos principais.
CAPTULO 10
Figura 10.14
O homeodomnio da protena Engrailed se liga em um stio especfico do DNA. A hlice 3 contata os pares de bases no sulco principal, enquanto a poro amino-terminal do homeodomnio entra no sulco menor. (Segundo Pabo e Sauer, 1992.)
Protenas de homeodomnio Uma famlia extremamente importante de fatores trans-reguladores o conjunto de protenas de homeodomnio. Essas protenas so crticas para a especificao dos eixos corporais ntero-posteriores em todo o reino animal; elas sero mais detalhadas nos Captulos 14 e 16. O homeodomnio consiste de 60 aminocidos organizados em hlice-giro-hlice, de tal maneira que a terceira hlice se estende para dentro do sulco principal do DNA que ela reconhece. Os aminocidos da poro aminoterminal do homeodomnio tambm contactam as bases no sulco menor (Figura 10.14). Esse homeodomnio foi visto pela primeira vez em protenas que especificam a identidade de segmentos na Drosophila. Mutaes nessas protenas causaram a transformao de um segmento do corpo em outro (uma transformao conhecida como homeosis, que ser discutida em detalhe no Captulo 14). Vrias protenas de homeodomnio na Drosophila melanogaster foram clonadas, seqenciadas e testadas para sua habilidade de regular a transcrio. A Tabela 10.1 mostra nove protenas de Drosophila contendo homeodomnios e as seqncias de DNA que elas reconhecem. O reconhecimento de promotores especficos pelas protenas contendo o homeodomnio tem sido considerado essencial para o desenvolvimento da Drosophila. A protena Bicoid, por exemplo, um fator de transcrio de homeodomnio que se liga aos promotores do gene hunchback. Essa ligao ativa a transcrio desse gene; a protena Hunchback resultante tambm um fator de transcrio, e se liga aos intensificadores daqueles genes necessrios para a formao da cabea e do trax da Drosophila (Driever e Nsslein-Volhard, 1989; Struhl et al., 1989). Pequenas modificaes na composio de aminocidos do stio de ligao ao DNA podem mudar a seqncia de DNA reconhecida pela protena. Treisman e seus colegas (1989) demonstraram que alterando um nico aminocido no homeodomnio podia-se modificar os promotores que essa protena ativaria.
406
Tabela 10.1 Protena Abdominal B Antennapedia Bicoid Engrailed Even-skipped
Principais protenas de homeodomnio da Drosophila melanogaster e seus stios de ligao ao DNA. Stio(s) de ligao ao DNA TAATTTGCAT TCAATTAAAT TAATAATAATAATAA TCCTAATCCC TCAATTAAAT TCAATTAAAT TAATAATAATAATAA TCAGCACCG TCAATTAAAT TAATAATAATAATAA TCAATTAAAT TAATAATAATAATAA TCAATTAAAT
Fushi tarazu Paired Ultrabithorax Zerknlt
Os fatores de transcrio POU Alguns fatores de transcrio tm tanto um homeodomnio como uma segunda regio de ligao ao DNA (Figura 10.15). Em alguns casos, essa regio que compreende o homeodomnio e a segunda regio de ligao ao DNA chamada domnio POU (Herr et al., 1988). As iniciais so de quatro protenas nas quais pela primeira vez foram vistas contendo tais domnios: Pit-1 (tambm chamada GHF1), um fator especfico da pituitria que ativa os genes, codificando o hormnio de crescimento, prolactina e outras protenas da pituitria; Oct1, uma protena de ampla distribuio que reconhece uma certa seqncia de oito pares de bases chamada seqncia octa (octa box), e Oct2, a protena especfica da clula B que reconhece a octa box e ativa os genes da imunoglobulina; e UNC-86, um produto gentico do nematdeo envolvido na determinao do destino de clulas neuroniais. O homeodomnio de Pit-1 reconhece a seqncia ATATTCAT, enquanto o homeodomnio de Oct2 reconhece a seqncia similar ATTTGCAT. Se o elemento de DNA reconhecido pela Pit-1 alterado em dois lugares, ele se torna um stio de ligao de Oct-2, e o gene de prolactina expresso em linfcitos B (Elsholtz et al., 1990). Assim, uma modificao de duas bases no intensificador reconhecido pela protena POU pode converter uma transcrio especfica da pituitria em uma transcrio especfica do linfcito.
Domnio POU
Principal domnio trans-ativador
POU-especfico
Homeodomnio
Alta afinidade, Interao stio-especfico, protena-protena, ligante de DNA, ligante de DNA interao protena-protena dependente de DNA
Figura 10.15
Os domnios dos fatores de transcrio da famlia POU
CAPTULO 10
Gene Pit-1 do primrdio da pituitria no expresso
Transcrio do gene Pit-1 especfico do rgo
Figura 10.16
Traduo de Pit-1 especfico da clula Somatotrofos
Estrgeno
Lactotrofos
Embrio de 14 dias
Embrio de 16 dias
Tireotrofos
Corticotrofos
Gonadotrofos
A protena Pit-1 encontrada somente em clulas da pituitria. Quando genes do hormnio de crescimento (que so ativos na pituitria) so clonados e colocados em extratos nucleares de clulas outras que no as da pituitria, esses genes no so transcritos, ao passo que a transcrio se dar se os genes do hormnio de crescimento forem colocados em extratos nucleares de clulas da pituitria anterior. Alm disso, a adio de Pit-1 ao extrato nuclear das clulas no pituitrias permitir a transcrio do gene do hormnio de crescimento (Bodner e Karin, 1987). Conclui-se, ento, que a expresso especfica do gene do hormnio de crescimento na pituitria anterior mediada por uma protena trans-reguladora especfica para o tecido. Inversamente, quando outros genes (tais como aqueles para a globina) so clonados prximo s seqncias ligantes de Pit-1 e so usados para produzir camundongos transgnicos, esses genes mostram uma transcrio especfica da pituitria (Behringer et al., 1988). O intensificador ligante da protena Pit-1 , por sua vez, regulado pelo desenvolvimento (Doll et al., 1990; Simmons et al., 1990). Transcrio do gene Pit-1 do camundongo detectada dentro de um dia aps o aparecimento histolgico da bolsa de Rathke, o primrdio da pituitria anterior, mas a traduo desse mRNA em protena no ocorre antes de 2 ou 3 dias. O mRNA do hormnio de crescimento primeiro detectado quando o gene Pit-1 traduzido. interessante notar que em dois tipos de clulas da pituitria anterior, os corticotrofos que sintetizam a corticotrofina (tambm chamada hormnio adrenocorticotrfico, ou ACTH) e os gonadotrofos que sintetizam gonadotrofinas, o mRNA de Pit-1 produzido, mas no traduzido (Figura 10.16). Somente nas clulas da pituitria dos somatotrofos (produzem hormnio do crescimento), lactotrofos (produzem prolactina) e tireotrofos (que sintetizam hormnio estimulador da tireide) a mensagem do Pit-1 traduzida em protena nuclear que liga DNA. O intensificador ligante da protena Pit-1 no somente mediador da transcrio dos produtos diferenciados dessas clulas, mas necessrio para a formao das clulas da pituitria anterior na bolsa de Rathke. Duas mutaes dwarf em camundongos so causadas por uma mutao na protena Pit-1. Esses camundongos no tm as clulas tireotrficas, lactotrficas e somatotrficas da pituitria anterior (Li et al., 1990).
INTERAES COMBINATRIAS E FORMAO DE ALAS NA REGULAO DA TRANSCRIO DO GENE DA PROLACTINA. A atividade da protena Pit-1 no gene
Determinao do tipo celular por combinaes de protenas trans-reguladoras. O mRNA para o fator de transcrio Pit-1 transcrito em todos tipos de clulas destinadas a residir na pituitria anterior. Entretanto, a protena Pit-1 traduzida somente nas clulas tireotrficas, somatotrficas e lactotrficas. Somatotrofos sintetizam hormnio de crescimento aps a traduo de Pit-1. Lactotrofos sintetizam alguma prolactina concomitante com a traduo de Pit-1 mas produzem quantidade significante de prolactina quando somente co-estimulados com estrgeno (e sua protena receptora trans-reguladora). O mecanismo distinguindo a transcrio do hormnio estimulador da tireide parece envolver a regio do silenciador (veja Figura 10.17). (De acordo com Simmons et al., 1990.)
para a prolactina ilustra muitas das caractersticas dos fatores de transcrio. Primeiro, o intensificador do gene prolactina liga vrios fatores diferentes cuja interao regula a transcrio. O gene prolactina ativado durante a gravidez para produzir o hormnio da pituitria (prolactina) que estimula a produo de leite; esse gene estimulado ao mximo pela combinao de Pit-1 e estrgeno. Essa combinao regula o lugar (a glndula pituitria) e o tempo (gravidez e logo aps) para a sntese de prolactina. Simmons e colegas (1990) mostraram que esse sinergismo ocorre na regio do
408
Figura 10. 17
(A) Pit-1 Estrgeno
Sinergismo combinatrio no intensificador da prolactina. (A) Sinergismo entre stios do intensificador da prolactina no rato. O intensificador da prolactina foi fundido com um gene reprter (luciferinase) e o nvel de atividade do gene reprter determinado quando o gene fundido foi adicionado a clulas cultivadas. Quando Pit-1 ou estrgeno estavam presentes nessas clulas havia somente um pequeno aumento no nvel de transcrio. Entretanto, a adio de ambas as substncias causou um aumento de 1400 vezes no nvel da transcrio. (B) Sinergismo entre os stios intensificadores e promotores do gene da prolactina no camundongo. Genes fundidos foram produzidos portando o gene reprter e (1) a regio inteira 5 do intensificador da prolactina, seqncias laterais e o promotor da prolactina; (2) somente o intensificador especfico do tecido e o promotor da prolactina; (3) s o promotor de prolactina; (4) o intensificador da prolactina mais o promotor do gene timidina quinase (TK); e (5) somente o promotor do gene Tk. Essas construes foram colocadas em zigotos de camundongos, e a expresso do gene reprter foi monitorada em clulas lactotrficas e tireotrficas da pituitria. (C) Modelo para a regulao da expresso do gene da prolactina. Ambos, o promotor e o intensificador tm quatro stios de ligao de Pit-1. O receptor de estrgeno liga-se ao elemento responsivo de estrgeno (ERE) da regio do intensificador. As regies que inibem a transcrio de prolactina em tireotrofos e somatotrofos esto escuras.( A de acordo com Simmons et al., 1990; B de acordo com Crenshaw et al., 1989.)
Nmero de vezes da estimulao acima da linha de base (B) Construes do promotor da prolactina Seqncia flanqueadora Promotor Especificidade celular na expresso do transgene da prolactina Lactotrofos Tireotrofos
Intensificador
(C)
Sinergismo promotorintensificador
Sinergismo do intensificador Regies Ativantes: DNA
Promotor
Regies restritivas:
Somatotrofos Somatotrofos Tireotrofos Tireotrofos
intensificador do gene. A protena Pit-1 se liga a uma regio do intensificador enquanto o estrgeno, atravs da sua protena receptora, se liga a outra regio do intensificador. Quando esses fatores esto presentes ao mesmo tempo, a transcrio muito maior que aquela resultante da adio de cada um separadamente (Figura 10.17A). Mais ainda, parece haver regies silenciadoras flanqueando o intensificador que so necessrias para desligar o gene da prolactina nos tireotrofos (que de outra maneira ativariam o gene da prolactina) (Figura 10.17B,C; Crenshaw et al., 1989). Assim, Pit-1 age de forma combinatria com outros fatores de transcrio para regular seus genes alvos. Segundo, h um sinergismo entre o intensificador e o promotor do gene da prolactina. O intensificador do gene da prolactina no estimular o promotor de outro gene to eficientemente como estimular o seu prprio promotor (Figura 10.17B,C; Crenshaw
CAPTULO 10
et al., 1989). Esse sinergismo entre os stios promotor e intensificador parece ser causado pela formao de alas no DNA entre os dois stios. No gene da prolactina do rato, o intensificador est localizado a mais de 1300 pares de bases a montante do seu promotor. Usando um ensaio que funde DNA aproximado por interaes protenaprotena, Cullen e colegas (1993) mostraram que as regies do promotor e do intensificador so reunidas somente quando Pit-1 e estrgeno esto presentes. Parece que o receptor do estrgeno ligado ao hormnio no intensificador capaz de estabilizar a interao entre essa regio e a do promotor, assim permitindo a interao entre as protenas ligadas ao intensificador (Pit-1 e receptor do estrgeno) com o sistema de transcrio do promotor. Terceiro, a protena Pit-1 regula positivamente sua prpria sntese. Um dos alvos da protena Pit-1 o intensificador do prprio gene Pit-1 (Rhodes et al., 1993). Uma vez que o gene Pit-1 foi ativado (por outros fatores de transcrio), a protena Pit-1 se liga ao seu prprio intensificador e mantm a transcrio do gene Pit-1. Esse tipo de auto-regulao positiva importante como um mecanismo que compromete a clula a um determinado caminho de desenvolvimento. Assim o gene Pit-1, uma vez ativo, mantm o fentipo da pituitria. Tal auto-regulao tambm se d para a protena MyoD (que envolve a clula na via do desenvolvimento da clula muscular) e para vrias protenas de Drosophila que mantm os limites especficos dos segmentos e individuais do sexo.
&
Especulaes
Regulao da transcrio dos genes de cadeia leve das imunoglobulinas

gens clonadas de clulas congeladas em um estgio determinado do seu desenvolvimento nos permite amostrar os fatores de transcrio presentes naquele momento. Tais clones so obtidos de tumores de certos tecidos, e leucemias de linfcitos B (clulas B) do sistema imune permitiu aos pesquisadores identificar muitos dos elementos reguladores cis e trans, necessrios para o desenvolvimento da linhagem de clulas B. A estrutura dos genes da imunoglobulina. At agora, nosso modelo tem sido aquele em que cada clula do corpo contm exatamente os mesmos genes. Isso provavelmente verdade para a maioria dos tipos de clulas, mas os linfcitos so diferentes. Em cada clula B, o genoma foi organizado de tal forma que cada uma capaz de produzir um tipo de anticorpo (de um repertrio contendo possivelmente mais de 10 milhes de anticorpos).
HABILIDADE de se obter linha-
Anticorpos so produzidos quando uma substncia estranha o antgeno - entra em contato com as clulas B, que residem nos ndulos linfticos e no bao. Mesmo antes do contato com o antgeno, cada uma das clulas B em repouso produz protenas imunoglobulinas mas no as secretam. Em lugar disso, as molculas de imunoglobulinas so inseridas nas membranas das clulas B e so usadas como receptores de antgenos. Esses receptores, ao se ligarem aos antgenos, sinalizam para a clula se dividir e em seguida se diferenciar. Cada clula B produz um anticorpo que reconhece uma e somente uma forma antignica. Portanto, um anticorpo reconhecendo o envoltrio protico de um poliovrus no deveria reconhecer a toxina da clera, membranas da E. coli ou caspa de zebra. Todas as protenas do anticorpo na membrana da clula B tm uma estrutura muito semelhante. Cada uma consiste de dois pares de subunidades polipeptdicas. Existem duas cadeias pesadas idnticas e duas cadeias leves idnticas; as cadeias esto ligadas entre si por
pontes de dissulfeto (Figura 10.18). A especificidade da molcula de anticorpo (isto , se ela se ligar a um poliovrus, uma clula de E. coli ou alguma outra molcula) determinada pela seqncia de aminocidos na regio varivel. Essa regio composta dos aminoterminais das cadeias leve e pesada. As regies variveis das molculas de anticorpo so ligadas s regies constantes que do ao anticorpo suas propriedades efetuadoras necessrias para inativar o antgeno. Durante dcadas, os imunologistas se espantavam considerando como o sistema imune teria condio de produzir tantos tipos diferentes de anticorpos. Poderiam todos os 107 diferentes tipos de protena de anticorpo serem codificados no genoma? Isso tomaria uma quantidade enorme de espao cromossmico. Mais ainda, como o sistema imune saberia como produzir um anticorpo contra uma molcula que nem encontrada fora do laboratrio? Surpreendentemente, foi descoberto que a produo de molculas especficas de anticorpos envolve a criao de novos genes durante a diferenciao da clula B.
410
Sitio de combinao do antgeno
Stio de combinao do antgeno
Cadeia leve Pontes de dissulfeto
Cadeia pesada
Sito efetuador
Figura 10.18
HOOC
COOH
Estrutura de uma protena imunoglobulina tpica (anticorpo). Duas cadeias pesadas idnticas so ligadas por pontes de dissulfeto. O stio de combinao do antgeno composto de regies variveis (branco) de cadeias leves e pesadas, enquanto o stio efetuador do anticorpo (que controla se aglutina antgenos, se liga aos macrfagos, ou entra em secrees mucosas) determinado pela seqncia de aminocidos da regio constante da cadeia pesada (colorida).
Criao dos genes de cadeia leve dos anticorpos Os genes para as cadeias pesadas e leves dos anticorpos esto organizados em segmentos. Genes de cadeia leve de mamferos contm trs segmentos (Figura 10.19). O primeiro segmento do gene, V, codifica os primeiros 97 aminocidos da regio varivel da cadeia leve. Existem aproximadamente 300 seqncias V, unidas umas as outras no genoma do camundongo. O segundo segmento, J, consiste de 4 ou 5 seqncias possveis de DNA para os ltimos 15-17 resduos da regio varivel da cadeia leve do anticorpo. O terceiro segmento a regio constante (C) da cadeia leve. Durante a diferenciao da clula B, um dos 300 segmentos V e um dos cinco segmentos J se combinam para formar a regio varivel do gene do anticorpo. Isso feito movendo uma seqncia do segmento V para uma
Figura 10.19
seqncia do segmento J, um rearranjo que elimina o DNA interveniente. Esse rearranjo dos genes foi visto inicialmente por Hozumi e Tonegawa (1976), que isolaram DNA de um embrio de camundongo e de uma clula B de tumor secretando a cadeia leve.* Eles digeriram separadamente os dois DNAs com a enzima de restrio BamHI (veja Captulo 2), que cliva o DNA sempre que ela localiza a seqncia GGATCC. O resultado foi uma srie de fragmentos de DNA, de tamanho determinado pelo comprimento da molcula de DNA entre dois stios de clivagem. Os fragmentos de DNA foram colocados em uma cavidade na extremidade de um gel e submetidos eletroforese. Enquanto o DNA migrava para o eletrodo positivo, os fragmentos menores se moviam mais rapidamente do que os maiores, separando efetivamente os fragmentos de acordo com o tamanho. Aps a
eletroforese, o gel foi cortado em vrios pedaos, cada um contendo pedaos de DNA de um certo tamanho. O DNA em cada segmento de gel foi eludo e desnaturado em cadeias nicas. Parte desse DNA foi hibridizado com RNA radioativo, que codificava a cadeia leve inteira e foi isolado do tumor de clula B original. A outra parte foi hibridizada com RNA radioativo codificando somente a regio C da cadeia leve (a metade 3 da mensagem do RNA). Em dois segmentos do gel, o DNA do embrio ligou o mRNA da cadeia leve. O DNA do primeiro segmento tinha um peso molecular (MW) de aproximadamente 6 milhes; o peso do DNA do segundo segmento foi de 3.9 milhes. Quando o DNA do embrio de camundongo foi hibridizado com o mRNA da regio C da cadeia leve, somente o DNA de peso molecular 6 milhes se ligou ao RNA. Portanto, no embrio do camundongo, a regio C estava codificada dentro de fragmentos de DNA com peso molecular de 6 milhes (entre os stios de BamHI), enquanto a regio V estava codificada dentro de uma regio de peso molecular de 3.9 milhes (Figura 10.20). O DNA do tumor linfoctico, entretanto, deu resultados muito diferentes. O nico DNA linfoctico que ligou o mRNA de cadeia leve tinha um peso molecular de 2.4 milhes, e ele tambm ligou o mRNA da regio C da cadeia leve. Assim, tanto a regio C como a V foram codificadas no mesmo fragmento de DNA! A explicao mais simples (confirmada por numerosos laboratrios e mtodos; veja Bernard et al., 1978; Brack et al., 1978) foi a de que dois fragmentos de genes, um codificando a regio C da cadeia leve e outro codificando uma regio V especfica da cadeia leve se fundiram para formar um novo gene durante o desenvolvimento do linfcito. O modelo proposto para tal sntese do gene est apresentado na Figura 10.21.
* Tumores de clula B (mielomas) foram usados porque produzem uma quantidade enorme de uma imunoglobulina especfica (e do mRNA para aquela imunoglobulina).
Rearranjo dos genes da cadeia leve durante o desenvolvimento do linfcito B. Enquanto a clula B em desenvolvimento ainda est maturando na medula ssea, um dos 300 ou mais segmentos V do gene, se combina com um dos cinco segmentos J do gene e se aproxima do segmento constante do gene (C).
Organizao original do gene
Organizao do gene em linfcitos B produzindo anticorpos de Vn-1 e J4
CAPTULO 10
Figura 10.20
Clulas de mieloma
Camundongo embrionrio
Protocolo e resultados do experimento de Hozumi e Tonegawa. DNAs de clulas de embrio de camundongo e clulas B de tumores (mielomas) foram digeridos separadamente em BamHI, separados por eletroforese e eludos do gel. Aps a desnaturao, cada amostra de DNA eludo foi hibridizada com mRNA radioativo codificando as regies V e C da cadeia leve da imunoglobulina (total) ou com um mRNA radioativo fragmentado codificando somente a regio C daquela protena de cadeia leve (a metade 3). Para o DNA embrionrio, as regies V e C da protena de cadeia leve foram encontradas em dois pedaos diferentes de DNA (regio V em um pedao com peso molecular de 3.9x106, e a regio C em um fragmento de DNA de peso molecular de 6x106). No tumor linfoctico, as regies V e C foram encontradas juntas em um nico fragmento de DNA de peso molecular 2.4x106.
DNA extrado de clulas de mieloma e camundongos embrionrios
Criao de genes de cadeia pesada do anticorpo Os genes de cadeia pesada dos anticorpos contm mais segmentos do que a cadeia leve. Segmentos do gene de cadeia pesada incluem um segmento V (200 diferentes seqncias para os primeiros 97 aminocidos), um segmento D (10 a 15 seqncias diferentes codificando de 3 a 14 aminocidos), e um segmento J (4 seqncias para os ltimos 15 a 17 aminocidos da regio V). O prximo segmento codifica a regio C. A regio varivel da cadeia pesada formada justapondo um segmento V a um segmento D e a um segmento J (Figura 10.22A,B). Essa seqncia da regio varivel VDJ est agora adjacente primeira regio constante dos genes de cadeia pesadaa regio C, especificamente para anticorpos que podem ser inseridos na membrana plasmtica. Assim formada uma molcula de imunoglobulina a partir de dois genes criados durante o desenvolvimento do linfcito B no estgio independente do antgeno. Podem ser formadas cerca de 103 cadeias leves e 104 cadeias pesadas. Como cada uma formada independentemente da outra, cerca de 107 tipos de anticorpos podem ser criados pela unio de uma cadeia leve e uma cadeia pesada dentro da clula. Cada clula produz somente um desses 10 7 tipos de anticorpos e os coloca na membrana celular para serem usados como receptores de antgenos. O genoma de cada clone de linfcito pode ser bastante diferente daquele de qualquer outra clula. Mais tarde no desenvolvimento adulto, algumas clulas B sofrem outro arranjo chamado troca de classe. Aqui, toda a seqncia VDJ do gene de cadeia pesada transferido da regio C a outra regio C. A nova regio C ter propriedades diferentes. Na Figura 10.22C e D, a seqncia VDJ transferida para uma regio C. A seqncia C codifica a regio constante que permite que anticorpos sejam secretados na mucosa
Enzimas de restrio
DNA tratado com enzimas de restrio dando fragmentos de DNA

Sonda de V-CmRNA ou sonda de CmRNA Fragmentos so desnaturados e tratados com a sonda marcada para V-C ou C
As duas sondas se ligam aos mesmos fragmentos de DNA do mieloma, mas as sondas se ligam a diferentes fragmentos de DNA embrionrio
DNA de mieloma V-CRNA C-RNA

cpm no hbrido cpm no hbrido
DNA de embrio V-CRNA C-RNA
Tamanho do fragmento ligando-se sonda
Tamanho do fragmento ligando-se sonda
e aparelho digestivo, onde protegem o corpo contra antgenos no ar e nos alimentos. A clula B no o nico tipo celular que altera seu genoma durante a diferenciao. A outra clula importante do sistema imune, o linfcito T, tambm deleta uma poro do seu genoma na construo do
seu receptor de antgeno (Fujimoto e Yamagishi, 1987). As enzimas responsveis pela mediao dos eventos de recombinao do DNA parecem ser os mesmos nas linhagens de clulas B e T. Chamadas recombinases (Schatz et al., 1989; Oettinger et al., 1990), essas duas protenas reconhecem
412
PM 3.9x106 Stio Bam HI
PM 6x106
DNA embrionrio
DNA de clula B de tumor
as regies sinalizadas de DNA imediatamente a montante do DNA recombinvel e forma um complexo que inicia as quebras na fita dupla (Hiom e Gellert, 1997). Os genes para essas enzimas, so ativos somente nas clulas pr-B e clulas pr-T, onde os genes esto sendo recombinados. Esses genes de recombinases no so ativos em clulas maduras, tanto B como T, e tambm no esto na maioria de outros tipos de clulas.* Regies cis-reguladoras dos genes de imunoglobulinas. A descoberta da juno de V(D)J e a troca de classe resolveu a maioria dos proble-
PM 2.4x106
Figura 10.21
Modelo de modificaes no DNA entre clulas embrionrias e o linfcito B, de acordo com os dados de Hozumi e Tonegawa (1976).
mas relacionados origem da diversidade dos anticorpos. Entretanto, outros problemas foram criados. Cada segmento V tem seu prprio promotor a ele ligado. Por que no h expresso de cada gene dos segmentos V? Mapeamentos de deleo em genes clonados mostrou que o promotor da cadeia leve da imunoglobulina contm vrias regies crticas para a transcrio.
Um desses elementos, a montante do promotor, chamado seqncia octa (octa box) (Bergman et al., 1984; Parslow et al., 1984), devido a seus oito pares de bases: ATTTGCAT. Essa seqncia octa foi encontrada em todos os promotores da cadeia leve da imunoglobulina estudados. O promotor do gene de cadeia pesada da imunoglobulina tem uma sequncia octa in-
(A) Formao da regio varivel
(B)
Troca de classe
Figura 10.22
(C)
Formao da regio varivel do gene e troca de classe na produo de cadeias pesadas da imunoglobulina. (A) uma cadeia pesada contm trs segmentos (V, D e J) que se juntam para formar a regio varivel (V) e a regio constante (C). As quatro principais classes de anticorpos so classificadas com base na regio constante (IgA contm C: IgM, C; IgG, C). (B) Antes da apresentao do antgeno, a regio varivel se forma pela unio dos segmentos V, D e J. Esse segmento VDJ do gene est adjacente regio C e o anticorpo resultante est localizado na membrana celular. (C) Aps a apresentao do antgeno, pode ser feita uma ala na regio do DNA, de tal maneira que o segmento VDJ fique adjacente a uma outra regio C (nesse caso, a regio C, que permite a anticorpos penetrar em secrees mucosas). (D) Essa troca de classes mediada por uma srie de seqncias (S) de trocas, adjacentes a cada uma das regies constantes. (De acordo com Davis et al., 1980a,b.)
* At recentemente, considerava-se que as protenas recombinase eram encontradas somente em linfcitos, mas evidncia recente (Chun et al., 1991; Matsuoka et al., 1991) mostrou que eventos de recombinao e recombinases existem tambm no tecido cerebral. No se conhece a funo nas clulas neurais, mas fascinante especular que alguns dos receptores que ligam o axnio da clula nervosa ao seu alvo especfico podem ser feitos pela recombinao de vrias regies do gene.
CAPTULO 10
(A)
Gene da linhagem germinativa: sem transcrio Regio D Regio J Intensificador
Figura 10.23
(B) Gene rearranjado: transcrio da imunoglobulina Intensificador DNA
RNA nuclear
mRNA (C) Gene trocado de classe: Transcrio de nova classe de imunoglobulina Intensificador DNA
Modelo para a atividade do intensificador da imunoglobulina. (A) A regio do intensificador do gene de cadeia pesada da imunoglobulina parece envolver seqncias entre o segmento J do gene e as seqncias de troca (S) precedendo C. Se o intensificador removido, a transcrio muito diminuda. O promotor 5 precede cada um dos segmentos da regio V do gene e est originalmente muito distante do intensificador. (B) O rearranjo VDJ do gene trs um promotor para perto do intensificador e permite que a transcrio se concretize. (C) Durante a troca de classe, o intensificador permanece com os segmentos VDJ enquanto eles so colocados perto de uma nova regio constante (C).
RNA nuclear
mRNA
O rearranjo no gene coloca um determinado promotor na proximidade de um intensificador. Um evento semelhante ocorre com o gene de cadeia pesada, e durante a troca de classe (quando uma regio do DNA transformada em ala e deletada), a regio do intensificador permanece prxima ao pedao VDJ (Figura 10.23). cia translocada para genes de globina clonados, a transcrio desses genes tambm pode ocorrer especificamente em linfcitos (Picard e Schaffner, 1984). Para que a transcrio ocorra no linfcito, o promotor deve ser trazido para a proximidade do intensificador. Todos os segmentos V levam um promotor, mas somente o segmento V trazido prximo regio constante (com seu intensificador) ser ativado (Mather e Perry, 1982). Essa localizao ocorre durante a construo do gene da imunoglobulina.
PC Non-B
vertida: ATGCAAAT. Quando a seqncia octa colocada a montante de um gene da globina em um linfcito B cultivado, a transcrio do gene de globina aumenta de 11 a 18 vezes. Esse aumento visto somente em clulas linfides e no foi observado em fibroblastos (Wirth et al., 1987). A seqncia do intensificador do gene de cadeia leve da imunoglobulina est localizada no primeiro ntron entre a seqncia VJ e a regio C (Queen e Baltimore, 1983; Bergman et al.,1984). Quando essa seqnPre-B B
trans-Regulao da sntese de imunoglobulinas O rearranjo de genes em si, no suficiente para sua ativao, pois um gene de imunoglobulina rearranjado no transcrever ativamente quando colocado em um fibroblasto ou clula do fgado. Devem estar presentes fatores trans-reguladores especficos para a clula em questo. Staudt e colaboradores, em 1986, identificaram dois fatores que se ligam a promotores. Para isso, eles incubaram um pequeno pedao de DNA contendo uma seqncia octa com extratos nucleares de vrias clulas. Os produtos resultantes foram analizados em um gel. Se o extrato
Figura 10.24
Ligao no especfica
Ligao especfica da linhagem B
Fragmento de DNA somente
Ensaio de troca de mobilidade em gel. Extratos nucleares de clulas da linhagem B [pr-B, B e clulas de plasma (PC)] e clulas no-B (linhagens de clulas cervicais, de fibroblastos, de clulas precursoras dos glbulos vermelhos do sangue) foram misturadas com um pequeno segmento de DNA contendo o octmero. Aps incubao, as misturas foram separadas eletroforeticamente em um gel, transferidas para papel de nitrocelulose, e hibridizadas com DNA radioativo complementar seqncia do octmero. Na ausncia de uma ligao, fragmento contendo o octmero migra rapidamente para o fundo do gel. Todos os ncleos contm uma protena que se liga no-especificamente ao octmero e impede fortemente a migrao. Os ncleos da linhagem de clulas B, entretanto, tambm contm outra protena que inibe a migrao ligando-se seqncia do octmero. (de Staudt et al., 1986, cortesia de D. Baltimore.)
414
Figura 10.25
Regulao de NF-B por I-B. I-B se liga subunidade maior de NF-B e impede a entrada do complexo no ncleo. I-B pode ser fosforilado por vrias quinases que so ativadas pela replicao de vrus, antgenos, lipopolissacardeos ou o fator de necrose tumoral. A fosforilao de I-B libera NF-B que pode ento entrar no ncleo e se ligar aqueles stios promotores e intensificadores que ele reconhece. Esses genes incluem os que codificam a cadeia leve da imunoglobulina kappa, fator de necrose tumoral, interleucina 2, e o receptor para interleucina 2. O vrus da imunodeficincia humana tambm tem stios para ligao de NF-B.
Entrada do vrus
Receptor de antgeno de clula T ou B
Receptor de lipopolissacardeo
Receptor do fator de necrose tumoral
ds RNA quinase
Protena quinase C
Outras protenas quinases
IB inativo Fosforilao de IB Complexo
NF-B ativo
nuclear no tivesse uma protena capaz de se ligar a esse DNA, o pequeno fragmento de DNA deveria migrar rapidamente pelo gel. Mas, se uma protena se ligou a esse DNA, a migrao deveria ser prejudicada. Esse ensaio de mudana de mobilidade (Figura 10.24) demonstrou que cada ncleo tinha pelo menos um fator capaz de se ligar ao fragmento de DNA. Entretanto, a linhagem de clulas B (clulas prB, clulas B e clulas de plasma) continham, alm disso, um outro fator capaz de se ligar especificamente seqncia octa do DNA. Essas protenas ligantes foram isoladas, e a protena especfica para linfcitos foi denominada Oct2 (NF-A2). Ensaios similares foram usados para encontrar uma protena nuclear restrita linhagem de clulas B, que se ligasse especificamente s seqncias intensificadoras dos genes de cadeia leve das imunoglobulinas (Sen e Baltimore, 1986a; Atchinson e Perry, 1987). Uma tal protena, NF-B, foi encontrada somente em c lulas B maduras e clulas de plasma, e reconhecia a seqncia de ligao 5GGGACTTTCC-3 no intensificador da cadeia leve. Alm disso, quando clulas prB so induzidas a se tornarem clulas B, aparece a protena ativa NF-B*. Neste ponto o problema da atividade gnica diferencial levado a outro nvel: O que controla a sntese dos fatores transreguladores especficos da clula B, como Oct2 ou NF-B? (Ou seja, para explicar como so produzidas especificamente em uma clula, devemos explicar como essas protenas nucleares so produzidas nessas clulas especficas.) Parece que a protena NFB est presente em vrios tipos de clula, mas est ligada por uma protena de 65-kDa chamada IB (inibidor de kappa). No esta do ligado, NF-B no pode entrar no ncleo e se ligar ao DNA (Figura 10.25; Henkel et
inativo Ncleo Stio B Outros stios
al., 1992). Assim, NF-B pode reconhecer a regio do seu intensificador somente naquelas clulas que ou no sintetizam ou no ativam seu IB- ou seja, em linfcitos maduros (Sen e Baltimore, 1986b; Baeuerle e Baltimore, 1988). A sntese de cadeias leves de imunoglobulinas provavelmente iniciada quando um sinal na superfcie celular ativa protenas quinases que podem fosforilar IB. Considera-se que essa fosforilao libe-
ra NF-B e permite sua entrada no ncleo (Ghosh e Baltimore, 1990; Kerr et al., 1991). Alm da regulao positiva na transcrio do gene da imunoglobulina identificada nas clulas B, tambm existe regulao negativa da produo de imunoglobulina em clulas no-B. Parece haver vrios stios ladeando os genes da imunoglobulina, que so ligados pelas protenas que inibem a transcrio dos genes
* As clulas B so as nicas clulas que sintetizam imunoglobulinas. A clula pr-B pode produzir a cadeia pesada mas no a cadeia leve da protena imunoglobulina. NF-B ativo tambm foi encontrado em clulas T ativadas (mas no em inativadas). Genes especficos para a clula T, tais como os que codificam a interleucina 2 (fator de crescimento da clula T) e seu receptor tm intensificadores que ligam NF-B. Essa responsividade a NF-B pode ser importante na propagao do vrus da imunodeficincia humana (HIV). Quando HIV infecta uma clula T, ele induz a formao do NF-B ativo (Sen e Baltimore, 1986b; Lenardo e Baltimore, 1989). A produo de NF-B ativo estimula os genes da clula T, que tm stios nos intensificadores para essa protena. Assim, a clula T estimulada a se proliferar. Ao mesmo tempo, HIV tambm tem elementos intensificadores de NF-B que tambm o permitem transcrever seus produtos rapidamente. bvio que a NF-B tem um papel muito importante no desenvolvimento de linfcitos normal ou alterado. Pode-se conjecturar o que a protena, no especfica, ligante da seqncia octa, est fazendo em clulas no-B. Embora as protenas Oct1 e Oct2 possam se ligar mesma seqncia octa, elas exercem seus efeitos interagindo com outras protenas em certos promotores (Tanaka et al., 1992).
CAPTULO 10
(Calame, 1989). Protenas capazes de se ligar a essas regies silenciadoras dos genes da imunoglobulina tambm foram identificadas em clulas no-B. Concluise que a transcrio pode ser estimulada ou inibida por protenas trans-regulado-
ras, dependendo do histrico do desenvolvimento da clula. A anlise da transcrio especfica da clula dos genes de cadeia leve da imunoglobulina progrediu, ento, para um nvel onde se considera mais o produto
final na diferenciao de uma clula. Sabemos que a transcrio desse gene da imunoglobulina depende da atividade anterior de duas protenas nucleares, Oct2 e NF-B, cuja atividade vista somente em linhagens de clulas B.
Fatores de transcrio bsicos do tipo hlice-ala-hlice. Outro arranjo proeminente, identificado em protenas que se ligam aos promotores e intensificadores do DNA, o motivo (motif) bsico hlice-ala-hlice (bHLH). Os fatores de transcrio especficos do msculo, MyoD e miogenina (discutidos no Captulo 9) contm esse motivo, tal como vrias outras protenas da Drosophila que determinam as clulas do seu sistema nervoso perifrico: os produtos dos genes daughterless, achaete-scute e extramacrochaetae. Como veremos no Captulo 20, os genes que determinam o sexo na Drosophila tambm contm o modelo bHLH. As protenas bHLH se ligam ao DNA atravs de uma regio de aminocidos bsicos (tipicamente resduos 10 a 13) que precede a primeira -hlice (Figura 10.26). A hlice contm aminocidos hidrofbicos em cada terceira ou quarta posio, fazendo com que a hlice apresente uma superfcie de resduos hidrofbicos ao ambiente. Isso permite protena um pareamento, por interaes hidrofbicas, com a mesma protena ou outra relacionada, que apresenta tal superfcie (Jones, 1990). Estudos recentes mostraram que homodmeros (entre duas protenas bHLH idnticas) no se ligam adequadamente ao DNA. Na realidade, as protenas bHLH reconhecem suas seqncias promotoras de acordo com o seguinte paradigma (Tabela 10.2). Existe uma protena bHLH ubqua, sintetizada pela maioria das clulas que pode formar um dmero com qualquer um de dois parceiros em potencial. Um deles um regulador positivo (que estimula a transcrio); o outro parceiro um regulador negativo. Quando o regulador positivo se dimeriza com a protena bHLH ubqua, forma-se um complexo ativador que estimula a transcrio dos genes que ele reconhece. Quando a dimerizao da protena com o regulador negativo, o produto resultante reprime a transcrio desses mesmos genes. Por exemplo, a famlia de protenas MyoD ativa na promoo da miognese quando complexada com as protenas E12 ou E 47- duas protenas bHLH ubquas (French et al., 1991; Lassar et al., 1991). O desenvolvimento do msculo inibido quando as protenas MyoD, E12 ou E47 esto ligadas protena Id (inibidor da diferenciao). A protenas Id contm o motivo HLH, mas no a regio bsica que se liga ao DNA. Dimerizao de Id com MyoD, E12 ou E47 interfere com a habilidade dessas protenas se ligarem ao DNA, e a expresso de Id na clula impede a atividade das protenas MyoD (Benezra et al., 1990). A protena Id produzida enquanto os precursores da clula muscular ainda esto se dividindo, e desaparecem quando os mioblastos deixam o ciclo celular para comear a se diferenciarem em miotubos. Se Id for super expressa em mioblastos cultivados, eles no se diferenciaro em miotubos (Jen et al., 1992).
Tabela 2 Dmeros bHLH no desenvolvimento Neurognese de Miognese de Dmero Drosophila Mamfero Protena onipresente Regulador positivo Regulador negativo daughterless achaete-scute extramacrochaetae E12, E47 Famlia MyoD Id
HOOC Hlice
COOH Hlice
Ala Hlice
Ala Hlice
Domnio de ligao do DNA
Domnio de ligao do DNA
Figura 10.26
Domnios dos fatores de transcrio bsicos hlice-ala-hlice.
Diviso celular de Mamfero Max myc Mad ou Max
416
&
Especulaes
Regulando as protenas bHLH miognicas: Governando a troca entre proliferao e diferenciao de clulas musculares
lar protenas bHLH miognicas, alm da dimerizao com Id. Sabese h muito tempo (Stockdale e Holtzer, 1961; Bischoff e Holter, 1969) que clulas musculares geralmente no se diferenciam at que a proliferao esteja terminada. As clulas musculares em proliferao no expressam o fentipo especfico do msculo, enquanto que msculos diferenciados no mais se dividem. Crescimento e diferenciao so considerados estados mutuamente exclusivos no desenvolvimento do msculo esqueltico, e uma vez que a clula muscular abandonou o ciclo celular, ela no pode voltar, mesmo que sejam fornecidos fatores de crescimento (Konigsberg et al., 1960; Nadal-Ginard, 1978). Essa exclusividade mtua entre diferenciao e proliferao tambm vista no desenvolvimento de neurnios, adipcitos, clulas do sangue e queratincitos da pele. Os mecanismos para essas trocas durante a miognese parecem envolver a regulao das protenas bHLH miognicas. O primeiro desses mecanismos responsvel pela preveno da diferenciao muscular prematura quando as protenas bHLH miognicas comeam a aparecer. Protenas bHLH miognicas so extremamente sensveis a fatores de crescimento. Enquanto eles
XISTEM DUAS MANEIRAS de regu-
esto presentes para estimular a mitose, a miognese no ocorre mesmo que protenas MyoD ou Myf-5 estejam presentes na clula (Olson, 1992). A inativao dessas protenas bHLH est associada a sua inabilidade em se ligar seqncia CANNTG do DNA (onde N qualquer base) (Brennan et al., 1991). Por que essas protenas bHLH miognicas no podem funcionar? Fatores de crescimento tal como o fator de crescimento de fibroblastos (FGF) no somente estimulam a transcrio de Id mas tambm ativam a protena quinase C. Essa quinase induz a fosforilao das protenas bHLH miognicas exatamente no seu stio de ligao ao DNA (Li et al., 1992). Quando esse stio fosforilado as bHLH miognicas no ligaro DNA. Assim, enquanto os fatores de crescimento estiverem presentes e aptos a serem recebidos, a miognese no ocorrer. O segundo tipo de regulao envolve o impedimento da expresso de MyoD onde ela no necessria. MyoD um dos mais poderosos reguladores de transcrio. Como discutido no Captulo 9, se o regulador expresso dentro da maioria das clulas, essas clulas se tornam msculo. Isso significa que ele deve ser fortemente controlado. Um mecanismo fazer as clulas sintetizarem um inibidor potente da funo de MyoD e liberar esse controle so-
mente em certas reas. Esse parece ser o caso na expresso de MyoD no somito onde Twist inibe a expresso de MyoD no dermtomo e no esclertomo. (Captulo 9). MyoD pode tambm ser suprimida pela sinalizao da protena do receptor Notch. A protena Notch ativada estimula a transcrio do gene hes-1 que codifica outra protena bHLH. Essa protena parece se ligar MyoD, e inibir sua habilidade de funcionar como um fator de transcrio indutor do msculo (Sasai et al., 1992; Kopan et al., 1994; Jarriault et al., 1995). Como as clulas do epiblasto da galinha expressam MyoD e se tornam msculos quando dissociados em cultura, possvel que um sinal, mediado por contacto de clula justaposta, como o Notch, seja responsvel pela inibio dessa expresso e reteno da pluripotncia do epiblasto (Kopan et al., 1994; GeorgeWeinstein et al., 1996). MyoD freqentemente chamado um gene regulador mestre, pois seu produto capaz de converter quase todas as clulas em msculo. O paradoxo que qualquer gene controlador mestre tem que ser controlado com maestria. Seus produtos so to poderosos que a clula desenvolveu numerosos meios- em diferentes nveis- para impedir sua expresso nas clulas erradas e nos momentos imprprios.
Fatores de transcrio do zper bsico da leucina A estrutura dos fatores de transcrio do zper bsico da leucina muito semelhante a das protenas bHLH. As protenas bZip so dmeros, cada uma de suas subunidades, tendo no carboxi terminal, um domnio bsico ligante de DNA logo seguido por uma hlice contendo vrios resduos de leucina. Essas leucinas esto colocadas na hlice de tal maneira que elas interagem com outros resduos de leucinas similarmente espaados em outras protenas bZIP, para formar um zper de leucina entre elas, causando a formao de dmeros. Esse domnio seguido por um domnio regulador que interage com o promotor para estimular ou reprimir a transcrio (Landschulz et al., 1988; Pathak e Sigler, 1992). Os fatores de transcrio C/EBP, AP1 e o GCN4 de levedo so membros da famlia bZip. Mtodos genticos e de cristalografia de Raios X convergiram em um modelo de ligao de DNA mostrado
CAPTULO 10
Figura 10.27
Representao estereoscpica da regio ligante de DNA da protena bZip, C/EBP, interagindo com 20 pares de bases contendo a seqncia CCAAT. (Topo) Vista dorsal olhando para baixo, para uma dupla hlice do DNA e paralelamente ao zper de leucina. (Embaixo) Vista lateral em ngulo reto ao diagrama acima e perpendicularmente ao eixo do DNA. Resduos de leucina conectando as duas subunidades podem ser vistas embaixo, como tambm as alas da tesoura no DNA. (Se voc no est acostumado a cruzar seus olhos para ver a estreo imagem composta, use um estereptico.) (de Pathak e Sigler, 1992.)
na Figura 10.27 (Vinson et al., 1989; Pu e Struhl, 1991). Na figura, as duas hlices contendo a regio ligante de DNA esto inseridas no sulco maior desse DNA, cada hlice encontrando uma idntica seqncia de DNA. A ligao resultante assume a aparncia de uma tesoura ou hemostato. Sabe-se que existem vrias protenas bZIP que podem se ligar seqncia CCAAT; uma das mais importantes chamada protena ligante do intensificador CCAAT (C/EBP). C/EBP tem um papel na adipognese semelhante ao das protenas miognicas bHLH na miognese. Expresso precoce de C/EBP em clulas pradiposas em diviso causa a cessao da diviso celular e a iniciao do fentipo adiposo (Umek et al., 1991). (Ao contrrio das protenas bHLH miognicas, as quais podem converter clulas nervosas e fibroblastos em msculos, C/EBP no parece converter outros tipos de clulas na linhagem de adipcitos). A protena bZIP C/EBP se liga aos intensificadores de numerosos genes especficos de adipose quando a adipognese iniciada em cultura (Figura 10.28; Christy et al., 1989; Kaestner et al., 1990). mRNA antisenso contra C/EBP suprime a expresso coordenada de mensagens especficas de adipcitos e a diferenciao de pr-adipcitos em adipcitos. (Samuelsson et al., 1991; Lin e Lane, 1992). C/EBP tambm enriquecido nas clulas hepticas, e um dos mais importantes reguladores da expresso gnica especfica do fgado. Em hepatcitos de camundongo,
418
(A)
(B)
(C)
Figura 10.28
Adipognese (formao de clulas gordurosas) mediada pelo fator de transcrio C/EBP. Colorao de lipdios mostrada no quadro da direita. A coluna da esquerda mostra os mRNAs para as protenas SCD1 e GLUT4 que esto envolvidas na diferenciao de adipcitos. (A) Adipognese normal na linhagem de clulas pr-adipcitos 3T3-L1 em cultura. Os genes SCD1 e GLUT4 so ativados, e as clulas sintetizam e acumulam grandes quantidades de triglicerdeos. (B,C) Duas linhagens de clulas 3T3-L1 transfectadas com RNA antisenso contra a mensagem C/EBP. Nenhum dos genes est bem expresso, e os nveis de triglicerdeos so 15 e 5 % do normal (de Lin e Lane, 1992.)
outros fatores de transcrio se ligam s regies do promotor e intensificador de genes especficos do fgado durante o desenvolvimento. Entretanto, esses genes no transcrevem grandes quantidades de protena (tal como a albumina) at que C/EBP seja expresso nessas clulas imediatamente antes do nascimento (Milos e Zaret, 1992). Outro gene especfico de fgado, ativado por C/EBP, o gene para o fator IX da coagulao do sangue. Mutaes no gene desse fator da coagulao causam a hemofilia B. Em alguns pacientes, a causa dessa doena foi relacionada s mutaes no stio de ligao da C/EBP na regio promotora do gene do fator IX. Essas mutaes impedem a ligao de C/EBP ao gene (Crossley e Brownlee, 1990).
&
Especulaes
Armadilhas do intensificador: natural e experimental

Leucemias induzidas por translocao Um fator de transcrio crtico muito importante para a regulao da diviso celular a protena c-Myc. Essa um membro da classe de protenas ligantes ao DNA que incorporaram um zper de leucina e um motivo bsico hlice-ala-hlice. As protenas c-Myc funcionam de maneira similar s protenas bHLH e bZIP, formando heterodmeros que ligam DNA (veja Tabela 10.2). A c-Myc forma um complexo ativador quando unida protena de ampla distribuio Max. O complexo entre Max e uma protena inibidora, Mad, cria a protena repressora Mad-Max, que se liga ao mesmo stio que o complexo c-Myc/ Max, ou seja CACGTG (Ayer et al., 1993). O gene c-myc o homlogo celular do gene produtor de cncer, ou oncogene, vmyc do vrus da mielocitomatose aviria (Donner et al., 1982). O gene c-myc sintetiza mRNA de curta durao e produtos proticos quando estimulado por uma variedade de fatores de crescimento (Kelly et al., 1983). Esses produtos do gene c-myc aparecem repentinamente enquanto as clulas so induzidas do estado G0 ao estado G1 e so degradados logo em seguida. As protenas c-Myc sinalizam a diviso celular, e se no so degradadas rapidamente, a clula continuar a se proliferar, aumentando portanto o risco de formao de tumor. Considerando que os intensificadores esto aptos a controlar a expresso dos genes reprteres no relacionados aos seus alvos normais, pareceria que essas seqncias so reguladores muito poderosos da especificidade da transcrio de genes. O que aconteceria, se uma transposio cromossmica espontnea trouxesse um intensificador para uma protena adjacente a um gene estrutural para outra protena? Na maioria dos casos isso no seria importante. Mesmo que o intensificador estimulasse a expresso do gene na clula errada, o pro-
CAPTULO 10
duto de uma nica clula seria regulado de forma anormal. Talvez a clula morresse e fosse substituda por outra. tambm possvel que os descendentes dessa clula formassem um clone de clulas expressando uma protena que as outras clulas no tecido no produziam. Entretanto, se pela translocao o gene c-myc fosse colocado prximo a um intensificador de um gene ativamente transcrito, o gene c-myc seria ativado para transcrever grandes quantidades da mensagem enquanto a clula se diferenciava. Nesse caso, a clula nica daria origem a um tumor. Translocaes cromossmicas envolvendo o gene c-myc parecem ser responsveis por tumores das clulas B sintetizadoras de imunoglobulinas do nosso sistema imune (Croce, 1987). Aqui, o gene c-myc no fim do brao curto do cromossomo 8 humano foi translocado para o cromossomo 14, 22 ou 2. Esses trs cromossomos contm os genes para as protenas imunoglobulinas, e o gene c-myc foi translocado para a regio dos intensificadores do gene da imunoglobulina (Leder et al., 1983; Croce, 1985). A quantidade de mRNA de c-myc transcrito desses cromossomos translocados se correlaciona com a ativao dos genes da imunoglobulina. Assim, quando os intensificadores dos genes da imunoglobulina so ativados (durante o desenvolvimento da clula B), eles ativam o gene adjacente -que agora c-myc. O mRNA de c-myc produzido em quantidades enormes e traduzido em fator de transcrio c-Myc. Esse fator instrui a clula a se dividir, o que ela continua fazendo na presena contnua do fator, assim, se forma o tumor chamado linfoma de Burkitt (Nishikura et al., 1983; Croce et al., 1984). Nessas situaes, a translocao do gene c-myc a um intensificador de imunoglobulina em uma nica clula pode ser o causador de toda a leucemia. Realmente, a maior parte das leucemias resulta de uma nica clula. Vrios tipos de leucemias so causadas quando outros genes de fatores de transcrio so translocados a regies dos intensificadores dos genes da imunoglobulina. Esses tipos de rearranjos entre regies codificando fatores de transcrio e regies reguladoras especficas para linfcitos, podem ser erros causados pelas recombinases VDJ que so especficas para linfcitos e explicariam porque essas translocaes so vistas em tantas leucemias (Rabbitts, 1991).
(A) Elemento de transposio contendo um gene reprter em um promotor fraco
Promotor fraco
Reprter
Ativao
Transcrio
Intensificador
Promotor fraco
Reprter
Gene normalmente regulado pelo intensificador
(B)
Figura 10.29
Tcnica da armadilha para intensificadores. (A) um gene reprter fundido a um promotor fraco que no pode dirigir uma transcrio sozinho. A construo injetada no ncleo do ovo e se integra no genoma, aleatoriamente. Se a integrao for prxima de um intensificador, o gene reprter ser expresso quando o intensificador for ativado, mostrando um padro de expresso de um gene normalmente associado ao intensificador. (B) Expresso do gene reprter em Drosophila injetada com uma armadilha de intensificador. Esses intensificadores so ativos no desenvolvimento do sistema nervoso do inseto e no estavam identificados antes deste procedimento. (Fotografias cortesia Y. Hiromi.)
Identificao de intensificadores por meio de genes reprteres A habilidade de um intensificador em ativar outros genes foi usada pelos cientistas para encontrar novos intensificadores e os genes que os regulam. Para fazer isso faz-se uma armadilha para intensificador. A armadilha consiste de um gene reprter (como o gene para a -galactosidade de E. coli ou a protena fluorescente verde) fundido a um promotor eucarioto relativamente fraco. Esse promotor no iniciar a transcrio do gene
reprter sem a ajuda de um intensificador. Essa armadilha de intensificador recombinante ento introduzida em um ovo ou ocito de vrias maneiras (veja Captulo 2), onde ele se integra aleatoriamente ao genoma. Se o gene reprter for expresso, isso significa que ele deve ter entrado no domnio de um intensificador ativo (Figura 10.29). Isolando essa regio do genoma em moscas do tipo selvagem ou camundongos, o gene normal ativado por esse intensificador pode ser descoberto (OKane e Gehring, 1987). [trancr1.html]
420
Transativao
Ligao a DNA
Transativao Interface de dimerizao, ligao de HSP90, funo inibitria, transativao
Figura 10.30
Domnios funcionais dos fatores de transcrio dedo de zinco. Cistena (C) e histidina (D) coordenam um tomo de zinco, causando a formao de alas, dedos de zinco.
Fatores de Transcrio Dedo de Zinco Outro tipo de domnio ligante a DNA o motivo dedo de zinco. Protenas dedo de zinco incluem: WT-1 (um fator de transcrio importante, crtico na formao dos rins e das gnadas); o fator de transcrio de ampla distribuio, Sp1; o fator de transcrio de 5S rRNA, TFIIIA de Xenopus; Krox 20 (uma protena que regula a expresso gnica no desenvolvimento do crebro posterior); Egr-1 (que compromete o desenvolvimento dos leuccitos para a linhagem dos macrfagos); Krppel (uma protena que especifica as clulas abdominais na Drosophila); e numerosos fatores de transcrio ligantes de esterides. Cada uma dessas protenas tem dois ou mais dedos ligantes de DNA, domnios em hlice, cujos aminocidos centrais tendem a ser bsicos. Esses domnios esto ligados em fila e so estabilizados por um on de zinco localizado centralmente e coordenado por duas cistenas (na base da hlice) e duas histidinas internas (Figura 10.30). A estrutura cristalina mostra que os dedos de zinco se ligam no sulco principal do DNA. A protena WT-1 contm quatro regies dedos de zinco, e usualmente expressa nos rins e gnadas fetais. Pessoas com um alelo mutante WT1 (geralmente uma deleo do gene ou da regio de dedo de zinco) apresentam malformaes urogenitais e desenvolvem o tumor de Wilm nos rins (Haber et al., 1990; Bruening et al., 1992; veja Captulo 17). Em camundongos, ambos os genes WT1 podem ser deletados por endereamento de genes (gene targeting), e os camundongos resultantes morrem no tero, no tendo nem rins nem gnadas (Kriedberg et al., 1993). O fator WT1 se liga s regies reguladoras de vrios genes que so ativos durante o desenvolvimento dos rins e tambm se considera que ele inibe a expresso de certos fatores de crescimento (especialmente o fator de crescimento II semelhante insulina) no rim em desenvolvimento (Drummond et al., 1992). Receptores Nucleares de Hormnios e Seus Elementos Responsivos a Hormnios Hormnios esteride especficos so conhecidos por aumentar a transcrio de determinados conjuntos de genes. Uma vez que o hormnio entra na clula, ele se liga protena de seu receptor especfico, que assume uma conformao que lhe permite penetrar no ncleo e ligar seqncias particulares de DNA (Miesfeld et al., 1986; Green e Chambon, 1988). A famlia dos receptores de hormnios esterides inclui protenas que reconhecem estrgenos, progesterona, testosterona e cortisona, como tambm lipdios no esterides como o cido retinico, a tiroxina e a vitamina D. As seqncias de DNA capazes de ligar receptores nucleares de hormnios so chamadas elementos responsivos a hormnios, e podem ser promotores ou intensificadores. Um grupo de
CAPTULO 10
(A)
PROTENA
Transativao
Ligao a DNA
Ligao a hormnio
(B) Dedos de zinco
Cadeia principal da protena
Mdulo 1 (C) DNA
Mdulo 2
Elemento responsivo a glicocorticide Elemento responsivo a estrgeno Elemento responsivo tiroxina e ao cido retinico
Figura 10.31
esterides inclui os hormnios glicocorticides (cortisona, hidrocortisona e o hormnio sinttico dexametasona). Esses se ligam aos receptores de hormnios glicocorticides e lhes permitem se ligar aos elementos responsivos aos glicocorticides nos cromossomos (Figura 10.31). Os elementos responsivos aos hormnios esterides so muito semelhantes entre si e so reconhecidos pelas protenas muito relacionadas. As protenas receptoras de esterides contm, cada uma, trs domnios funcionais: (1) um domnio ligante de hormnio, (2) um domnio ligante de DNA que reconhece o elemento responsivo ao hormnio, e (3) um domnio de trans-ativao que est envolvido na mediao do sinal para o incio da transcrio. Essas funes podem sobrepor-se parcialmente, e todos os domnios parecem ter algum papel na ativao da transcrio (Beato, 1989). Para ocorrer a ativao transcricional, o receptor deve penetrar no ncleo e dimerizar com uma protena similar ligante de hormnio. A ligao do hormnio ao seu domnio ligante de hormnio pode ser necessria para a dimerizao, translocao para o ncleo, e habilidade da regio ligante de DNA em reconhecer o elemento responsivo a hormnio. (Kumar et al., 1987) Os elementos responsivos aos hormnios dentro do DNA foram inicialmente identificados por ensaios de ligao competitiva (Pfahl, 1982; Karin, 1984), onde fragmentos de restrio especficos do DNA foram testados para verificar sua habilidade de ligao a receptores de hormnios carregando hormnios radioativos. Usando vrios fragmentos derivados de enzimas de restrio do DNA e comparando as seqncias de vrios elementos responsivos a glicocorticides, foi determinado que a seqncia de consenso do elemento responsivo ao glicocorticide AGAACANNNT-GTTCT (onde N pode ser qualquer base). Mostrou-se que essas seqncias ligantes de glicocorticides agem como intensificadores: quando o
Organizao estrutural do receptor de hormnios de protenas ligantes de DNA. (A) Estrutura geral de uma protena ligante de hormnio esterides. As funes de cada frao foram determinadas analisando os efeitos de mutaes em cada uma dessas regies e produzindo molculas de protenas quimricas tendo regies derivadas de diferentes protenas receptoras. Uma estrutura similar vista no receptor do cido retinico e no receptor do hormnio tireoideano. (B) Regio dedo de zinco, ligante de DNA do receptor de glicocorticides. Resduos enquadrados no mdulo 1 discriminam entre elementos responsivos a estrgenos ou glicocorticides. Resduos nos crculos esto envolvidos na dimerizao. (C) A regio dedo de zinco do receptor de glicocorticide ligada a seu elemento responsivo. As seqncias de DNA para os elementos responsivos esto mostradas esquerda. Note que elas so palndromos invertidos, de modo que cada dmero exposto ao mesmo stio. N, qualquer base; GRE, elemento responsivo a glicocorticide (e progesterona); ERE, elemento responsivo a estrgeno; TRE, elemento responsivo tiroxina e cido retinico. A distino entre receptores ligando glicocorticides ou progesterona versus receptores ligando tiroxina ou cido retinico determinada pelo espaamento dos elementos responsivos, por quantidades limitantes de receptores, e por outras interaes de elementos cis. (De acordo com Kaptein, 1992.)
422
(A)
Gene viral responsivo a hormnio
Figura 10.32
Seqncia ligante de glicocorticide Enzimas de restrio
Gene viral no responsivo ao hormnio (timidina quinase) Enzimas de restrio
Ligao e seleo
Teste para a seqncia do intensificador de glicocorticide. (A) Um vrus recombinante contendo o intensificador responsivo ao glicocorticide do vrus de tumor mamrio de camundongo e o gene da timidina quinase do vrus de Herpes simplex podem se integrar no genoma de uma clula sem o gene da timidina quinase. Pelo tratamento com glicocorticides, o gene recombinante transcreve a timidina quinase viral. P, regio promotora; TK, gene da timidina quinase; VG, gene viral do vrus do tumor mamrio de camundongo. (B) Micrografia eletrnica dos elementos intensificadores de glicocorticides, mostrando o receptor de hormnio ligado quela regio do gene. (A modificado de Chandler et al., 1983: B de Payvar et al., 1983, cortesia de K. R. Yamamoto.)
Precipitar vrus contendo gene recombinante com fosfato de clcio e sobrepor em clulas sem timidina quinase
(B)
Algumas clulas incorporam o gene recombinante em seus cromossomos
Estimular com glicocorticide
Timidina quinase induzida
elemento responsivo ao glicocorticide foi ligado a genes que normalmente no so dependentes de hormnio, aqueles genes se tornaram responsivos aos glicocorticides (Figura 10.32; Chandler et al.,1983). A ligao da protena receptora ao elemento intensificador responsivo ao hormnio feita atravs da regio do dedo de zinco no domnio de ligao ao DNA (Green et al., 1988). Quando so produzidas protenas quimricas, onde o domnio do dedo de zinco do receptor de estrgeno substitui a mesma regio do receptor de glicocorticide, a protena reconhece o DNA que tem elementos responsivos a estrgenos e faz com que o gene seja responsivo aos glicocorticides. Os aminocidos crticos parecem se localizar na articulao do dedo de zinco (Danielsen et al., 1989; Umesono e Evans, 1989). Mesmo mudando somente dois aminocidos na articulao da regio do dedo de zinco j haver mudana na especificidade da protena ligante. Assim, mesmo que os domnios de ligao a DNA das protenas receptoras de hormnios sejam muito semelhantes, eles podem distinguir diferenas sutis nas seqncias dos intensificadores. Por exemplo, a seqncia (palindrmica) 5-GGTCACTGTGACC-3 um forte elemento intensificador responsivo a estrgeno que ligar a protena receptora contendo estrgeno. Duas mutaes simtricas nessa seqncia, dando 5-GGACACTGTGTCC-3, converter esse DNA em um intensificador responsivo ao glicocorticide (Klock et al.,
CAPTULO 10
1987; Martinez et al., 1987). Dadas as similaridades entre protenas receptoras de hormnios e as similaridades entre os elementos responsivos a hormnios, provvel que cada hormnio esteride o mediador de sua ativao transcricional usando o mesmo mecanismo geral.
(A)
Enhanceosome
Protenas que dobram o DNA

Alm das protenas ligantes de DNA, existe um conjunto de fatores de transcrio que funciona primariamente como protenas que dobram o DNA. A maioria dessas protenas se caracteriza por um elemento de ligao ao DNA chamado HMG box, um conjunto de cerca de 80 aminocidos que medeia a ligao dessas protenas ao sulco menor do DNA. Essas protenas incluem o fator determinante do sexo do cromossomo Y, SRY (a ser discutido no Captulo 20), a protena LEF-1 intensificadora do linfcito, e as protenas HMG-1(Y) e HMG-2 da cromatina. Considera-se que essas protenas no ativam a transcrio pela interao direta com o aparelho de transcrio. Ao contrrio, a hiptese que elas dobram o DNA de modo que ativadores e repressores so colocados em contacto. Por exemplo, a ligao de SRY ao DNA causa uma dobra de 70o-80o na hlice, convertendo o I em um L. Mutaes pontuais que impedem esse dobramento tambm impedem a protena de mediar a formao de testculos. Considera-se que a protena SRY dobra o DNA de modo que fatores que, de outra forma, estariam afastados no cromossomo so colocados em contacto (veja Figura 20.5; Werner et al., 1995). As protenas que dobram DNA podem criar estruturas tridimensionais chamadas enhanceosomes (Thanos e Maniatis, 1995). Um modelo para tal enhanceosomes mostrado na Figura 10.33A. Thanos e Maniatis mostraram que interaes protenaprotena diretas entre fatores de transcrio so muito facilitadas pela presena de HMG-1, uma protena dobradora de DNA. Existem trs stios para essa protena dentro do intensificador para o gene interferon- humano (IFN), e esses stios so essenciais para a ativao sinrgica do complexo pelos fatores de transcrio. Eles tambm mostraram que a mera presena desses fatores de transcrio no suficiente para a ativao do promotor de IFN. Os fatores de transcrio tinham que estar na ordem correta no intensificador. Embaralhando os elementos de ligao do DNA, eles produziram diferentes combinaes. Somente a combinao do tipo selvagem foi eficiente. Thanos e Maniatis mostraram tambm que a fase helicoidal importante. Adicionando um pouco de DNA que causava uma meia volta da hlice, o intensificador era inativado. Inserindo outra volta de meia hlice, tornava o intensificador novamente ativo. Portanto, o arranjo linear dos fatores de transcrio e sua organizao tridimensional era crtica. A protena HMG-1 ligava todos eles no enhanceosome. Quando esse estava completo, o DNA que antes tinha uma inclinao natural de 20o, agora estava com uma inclinao de +26o. Mais ainda, um intensificador inativo foi transformado em um ativador (Figura 10.33B; Falvo et al., 1995).
Sistema basal da transcrio
Figura 10.33
Estrutura de um enhanceosome. (A) A protena que dobra DNA, HMG-I(Y), empacota uma espiral 60 pares de bases do DNA ao redor de ativadores transcricionais NF-B (o complexo p50/p65), IRF1, e ATF2/c-Jun. O HMG-I(Y) est no sulco menor, enquanto os outros fatores de transcrio operam no sulco principal da dupla hlice. Uma vez que o enhanceosome montado, ele contata o sistema basal de transcrio em vrios stios. (B) O DNA tem inclinao de 20o, antes da formao do enhanceosome. Aps a formao do enhanceosome ele se inclina na direo oposta +26o. Esse ltimo complexo estimula a transcrio. (A de acordo com Thanos e Maniatis, 1995; B de acordo com Falvo et al., 1995.)
Ativao dependente de contexto ou silenciamento

As interaes entre os receptores de esterides e outras protenas reguladoras da transcrio podem determinar se o efeito do esteride positivo ou negativo. Diamond e colaboradores (1990) demonstraram que o efeito dos hormnios glicocorticides na transcrio do gene Proliferin do camundongo pode ser positivo ou negativo dependendo do estado fisiolgico anterior da clula. Uma seqncia de 25 pares de bases a montante do gene Proliferin pode ligar o receptor de glicocorticide e o dmero bZip de c-Jun e c-Jun ou de c-Jun e cFos. A ligao de c-Jun a esse stio necessria para a funo do receptor de glicocorticide. Se o dmero c-Jun/c-Jun estivesse presente nesse stio (sem o receptor de glicocorticide) haveria pouca transcrio. Essa transcrio dramaticamente aumentada pela adio de glicocorticides (Figura 10.34). Entretanto, se o dmero c-Jun/c-Fos estivesse presente
424
Figura 10.34
Sem glicocorticide
Com glicocorticide Hormnio
Efeitos alternativos intensificadores e silenciadores dos elementos responsivos a glicocorticides a montante do gene Proliferin do camundongo. O efeito do glicocorticide depende da condio anterior da clula (isto , se altas concentraes de c-Fos estavam sendo sintetizadas). As setas representam transcrio do gene Proliferin. O crculo grande representa o receptor de glicocorticide ligado ao hormnio. A protena c-Jun representada como um crculo menor, enquanto a protena c-Fos um pequeno quadrado. (De acordo com Diamond et al., 1990.)
Stio de iniciao da transcrio Sem c-Jun nem c-Fos Sem transcrio
Receptor de glicocorticide
Sem transcrio
c-Jun:c-Jun c-Jun: c-Jun Pouca transcrio Muita transcrio
c-Jun: c-Fos c-Jun: c-Fos Muita transcrio Pouca transcrio
no stio, ele poderia dirigir uma transcrio extremamente eficiente do gene Proliferin. Essa transcrio inibida pela presena de glicocorticides. Assim, se o glicocorticide tem um efeito estimulador ou inibidor na transcrio do gene Proliferin depende do estado fisiolgico anterior da clula. Uma nica seqncia de DNA ligando um determinado receptor de hormnio pode ser tanto um intensificador como um silenciador para a mesma protena. Existem outras maneiras para um elemento cis-regulador ser ativador em algumas situaes e repressor em outras. Por exemplo, o fator de transcrio Krppel da Drosophila (uma protena cuja atividade veremos no Captulo 14, responsvel pela formao do trax e abdmen superior da mosca) um ativador em baixas concentraes e um repressor em altas concentraes. Em baixas concentraes, ele se liga a seu elemento cis-regulador no DNA, e interage com TFIIB para facilitar a construo do complexo de iniciao da transcrio. Em altas concentraes, ele se liga a si mesmo, e os dmeros resultantes no complexam com TFIIB (Sauer et al., 1995). Em lugar disso, os dmeros interagem com TFIIE e podem bloquear sua funo. Se a protena p53 supressora de tumor um ativador ou repressor depende da estrutura do promotor do gene especfico. Se existe no promotor um elemento ligante de p53, a protena p53 age como um ativador. Se no existe um elemento p53 no promotor, p53 pode se ligar a TAF em TFIID e impedir a transcrio. Ela pode tambm interagir com o fator de transcrio WT1. Esse fator usualmente um ativador de transcrio, mas se est ligado p53, se torna um repressor* (Figura 10.35; Seto et al., 1992; Maheswaran et al., 1993).
*Temos boa e m novidades. A boa novidade que at o fim desta dcada, conheceremos a maioria, seno todos os fatores de transcrio ativos em muitos tipos de clulas, e como eles interagem para iniciar ou reprimir a transcrio. A m notcia que muitos de ns teremos que aprender fsico-qumica para entender esses dados.
CAPTULO 10
(A) Protena Krppel
Ativao Protena Krppel
Sem ativao
Figura 10.35
Elemento ligante de Kr (B) Ativao
Elemento ligante de Kr Sem ativao
Elemento ligante de p53
Fatores de transcrio podem ser ativadores ou repressores, dependendo do contexto. (A) Protena Krppel em baixas concentraes estimula TFIIB e ativa a transcrio. Em altas concentraes, forma dmeros que no se ligam a TFIIB (e que podem interferir com TFIIE). (B) A protena p53 um ativador onde existem stios especficos de ligao. Em alguns promotores, entretanto, ela pode se ligar a TFIID e inativ-lo quando tais stios esto ausentes. (C) A protena WT1 um ativador quando p53 est ausente. Na presena de altas concentraes de p53, a ligao de WT1 bloqueia a transcrio.
(C)
Ativao
Sem ativao
Elemento ligante de WT1
Elemento ligante de WT1
Regulao da atividade do fator de transcrio

Se os fatores de transcrio so protenas que regulam a expresso de determinados genes, ento como os fatores de transcrio so regulados por si prprios? Uma maneira bvia regular a sntese dos fatores de transcrio por outros fatores de transcrio. Esse mtodo est presente no desenvolvimento de Drosophila, no qual existe uma cascata de snteses de fatores de transcrio (veja Captulo 14). Em mamferos, vrios fatores de transcrio so igualmente regulados pela sntese de outros fatores de transcrio. A ativao do fator de transcrio Pit-1 na pituitria de mamferos, por exemplo, realizada pela ligao do fator de transcrio contendo o homeodomnio Prop1 seqncia ladeando o terminal 5 do gene Pit-1 durante um estgio anterior do desenvolvimento da pituitria (Sornson et al., 1996). Alm disso, fatores de transcrio freqentemente tm intensificadores muito complexos e promotores que permitem sua expresso somente em certas clulas. O gene Myogenin do camundongo, por exemplo, expresso no mitomo, arcos farngeos e brotos dos membros. Parece haver pelo menos trs stios separveis na regio reguladora a montante para esse gene. O stio mais prximo necessrio para a transcrio desse gene nos brotos dos membros. Se esse stio mutado, o gene Myogenin no l transcrito. Um segundo stio, mais a montante, necessrio para a expresso de Myogenin nos brotos de membros, arcos farngeos e clulas centrais dos somitos posteriores (Figura 10.36; Cheng et al., 1993; Yeo e Rigby, 1993). Um terceiro stio, ainda mais a montante, necessrio para aumentar a eficincia da transcrio do gene. Esses trs stios ligam diferentes fatores de transcrio. Uma situao semelhante parece existir para myf-5, onde regies diferentes do DNA regulam os diferentes elementos dos padres de expresso (Prancha 24; Patapoutian et al., 1993). Outro mecanismo de regulao da atividade de fatores de transcrio por fosforilao. Em um grupo de casos, a protena do fator de transcrio est presente, mas inativa, e a fosforilao ativa a protena dormente. Como discutimos antes, a fosforilao de uma fator de transcrio seqestrado ou seu inibidor (como IB) pode liberar a
426
(A)
(B)
(C)
Figura 10.36
A expresso de Myogenin no embrio de camundongo de 10.5 dias. Um gene reprter da galactosidase foi ligado s seqncias reguladoras a montante do gene Myogenin, e isso foi usado para produzir camundongos transgnicos. Os embries transgnicos com 10.5 dias foram corados para identificar a presena da -galactosidade bacteriana. (A) Regio promotora de Myogenin selvagem, mostrando todos os lugares onde o gene Myogenin usualmente expresso. (B) Expresso de um promotor de Myogenin com uma mutao em um stio prximo ao gene Myogenin. No h transcrio desse gene nos brotos dos membros. (C) Expresso de um promotor de Myogenin com uma mutao em um stio mais a montante do gene. No vista transcrio do promotor nos arcos farngeos, membros ou clulas centrais posteriores do mitomo. (de Cheng et al., 1993.)
inibio e permitir ao fator de transcrio (nesse caso NF-B) penetrar no ncleo e ligar sua seqncia de DNA. A fosforilao tambm pode funcionar mais diretamente. Como discutido no Captulo 3, os fatores de transcrio JAK/STAT esto presentes no citoplasma mas somente entram no ncleo quando so fosforilados em resposta a um sinal na membrana celular. A fosforilao tambm pode ser usada para reprimir fatores de transcrio, como quando a ligao de DNA por Pit-1, Oct1, ou miogenina inibida por estarem fosforilados (Hunter e Karin, 1992). Conclumos que a atividade dos fatores de transcrio pode ser regulada em diferentes nveis. Como cada gene freqentemente regulado por vrios fatores de transcrio, a clula tem muitas opes sobre como expressar certos genes em somente certos tipos de clulas. Nos ltimos cinco anos, nosso conhecimento sobre fatores de transcrio progrediu imensamente e nos deu uma nova e dinmica viso da expresso gnica. O gene, ele prprio, no mais visto como uma entidade independente controlando a sntese de protenas. Ao contrrio, o gene dirige e dirigido pela sntese de protenas. Angier (1992) escreve: Uma srie de novas descobertas sugere que o DNA mais parecido a um certo tipo de poltico, rodeado por um rebanho de manipuladores e consultores de protenas que devem massage-lo vigorosamente, torc-lo e, ocasionalmente, reinvent-lo antes que o grande plano do corpo possa fazer algum sentido. Certamente, as interaes entre o DNA e seus fatores de transcrio esto levando a relao interativa do ncleo e do citoplasma a novos e esplendidamente complexos nveis. At agora, focalizamos nossa ateno no relacionamento dos fatores de transcrio ao DNA. Mas os fatores de transcrio no contemplam um mero DNA. Ao contrrio, eles se confrontam com um complexo de protena e DNA altamente estruturado chamado cromatina. Para iniciar a transcrio, necessrio considerar estruturas celulares de ordem maior; continuaremos nossa discusso sobre a regulao transcricional do desenvolvimento no prximo captulo.
CAPTULO 10
LITERATURA CITADA
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Regulao transcricional da expresso gnica: A ativao da cromatina
11
Enquanto meu companheiro contemplava com seriedade e satisfao a magnfica aparncia das coisas, eu me deleitava em investigar suas causas.... Curiosidade, pesquisa sincera para conhecer as leis misteriosas da natureza, satisfao perto do xtase enquanto elas a mim se revelavam, esto entre as sensaes mais antigas que posso lembrar.
MARY WOLLSTONECRAFT SHELLEY (1817)
T AGORA, limitamos nossa discusso sobre a transcrio de RNA mensa-
Ento, no podemos negar categoricamente que em ltima anlise poderemos triturar genes em um almofariz e em seguida cozinh-los em um bquer.
H. J. MULLER (1922)
geiro estrutura do prprio gene. Mas genes no existem em uma forma isolada dentro do ncleo, facilmente acessvel RNA polimerase ou s protenas ligantes de intensificador ou promotor. Ao contrrio, cromossomos eucariticos contm tanta protena (por peso) quanto cido nucleico, e esse complexo DNA-protena chamado cromatina. As protenas mais abundantes da cromatina so polipeptdeos bsicos chamados histonas, que so organizados em nucleossomos. Alm dos nucleossomos, que so inibidores gerais da transcrio, outros elementos prioritrios na cromatina tambm podem ser importantes na regulao da expresso gnica. Assim, existem regies controladoras de loco (LCRs) regulando a expresso de uma regio do cromossomo; existem regies associadas matriz (MARs) onde o DNA est ancorado matriz nuclear e onde podem estar ativas protenas que desenrolam o DNA; e existem insulantes, seqncias que separam domnios reguladores e assim impedem que elementos reguladores, positivos e negativos, em um domnio possam agir em genes no domnio adjacente.
Nucleossomos e a ativao da cromatina reprimida

O nucleossomo a unidade bsica da estrutura da cromatina. composto de um octmero de histona (duas molculas cada, de histonas H2A-H2B e histonas H3H4) envolvido por duas alas de DNA com aproximadamente 140 pares de bases (Figura 11.1; Kornberg e Thomas, 1974). A cromatina pode ento ser visualizada como um cordo de contas nucleossmicas ligadas por 10 a 100 pares de bases de DNA. Enquanto geneticistas clssicos consideravam que genes se pareciam a contas em um cordo, geneticistas moleculares acham que os genes se assemelham a cordo nas contas. Os fatores de transcrio devem ser capazes de encontrar seqncias de DNA, apesar da maior parte desse estar acondicionado nos nucleossomos. Atualmente se considera que tornar um gene competente para transcrever RNA envolve (1) a ligao de fatores de transcrio ao DNA e (2) a excluso de nucleossomos da regio promotora do gene. As interaes de fatores de transcrio especficos e o DNA que eles ligam causam o fenmeno da transcrio gnica temporal e tissularmente especficos. Assim que a RNA polimerase comea a transcrio, possvel deslocar
431
432
PARTE III Mecanismos da Diferenciao Celular
Figura 11.1
(A)
(B) Ligante H1 Partcula central: 2 H2A; 2H2B; 2H3; 2H4 (D) Nucleossomo central DNA H1
Estrutura da cromatina e do nucleossomo. (A) Modelo da estrutura do nucleossomo como visto por cristalografia de Raios-X a uma resoluo de 0.33nm. A unidade protica bicncova central (branca) o tetrmero H3H4. Cada um dos dois ovides escuros flanqueando o tetrmero um dmero H2AH2B. (B) Relacionamento da histona H1 ao nucleossomo central (contendo duas cpias de cada histona, H2A, H2B, H3, e H4). (C) H1 pode juntar o DNA em formas compactas e pode aglomerar os nucleossomos. Aproxima- (C) damente 140 pares de bases envolvem o octmero da histona, e quase 60 pares de baDNA ses de DNA juntam os nucleossomos. (D) Modelo para a disposio dos nucleossomos Nucleossomo em uma estrutura de cromatina em solenide, e altamente compacta. Um modelo alternativo, colocando H1 entre o octmero do nucleossomo e uma ala do DNA foi proposto recentemente e est sendo testado (Pruss et al., 1996). Aqui, uma ponta da H1 se liga ao nucleossomo, enquanto a outra liga o DNA. (A de Histonas H1 Burlingame et al., 1985; B-D de acordo com Wolfe, 1993.)
DNA ligante
Cromatina
temporariamente o DNA do nucleossomo e sintetizar RNA (Clark e Felsenfeld, 1992; veja Lewin, 1994). [chrom1.html] Os nucleossomos no so os nicos impedimentos na ligao dos fatores de transcrio s suas seqncias de DNA, porque os prprios nucleossomos esto enrolados como solenides rgidos estabilizados pela histona H1. A histona H1 encontrada nos aproximados 60 pares de bases do DNA ligante entre os nucleossomos (Figuras 11.1 e 11.2; Weintraub, 1984). Essa conformao dos nucleossomos dependente de H1 inibe a transcrio de genes nas clulas somticas pelo empacotamento de nucleossomos adjacentes em conjuntos to apertados que impedem o acesso de fatores de transcrio e RNA polimerases (Thoma et al., 1979; Schlissel e Brown, 1984). trans-reguladores Acessibilidade a fatores trans reguladores realmente incrvel que o DNA possa se tornar acessvel a fatores trans-reguladores. Existe DNA suficiente em um nico corpo humano para estender o dimetro do sistema solar (Crick, 1966), e essa enorme extenso precisa estar rigidamente empacotada nos ncleos de nossas clulas. Mas apesar disso, nossa biblioteca gentica pode ser especificamente acessada em cada tipo celular. Experimentos de hibridizao solvel sugerem que no mnimo existem 10.000 genes especficos para tecidos no genoma da maioria dos vertebrados; de modo que no surpreendente que em um dado tipo de clula, a maioria desses genes estejam reprimidos. Geralmente, ento, considera-se que a condio de ausncia da cromatina um estado reprimido e que genes
CAPTULO 11 A Regulao Transcricional da Expresso Gnica
433
(A)
(B)
Figura 11.2
especficos de tecidos so ativados pela interrupo local de fatores repressivos (Weintraub, 1985). Como j mencionado, o principal mecanismo de represso geral do gene provavelmente a compactao do DNA em aglomerados de nucleossomos, e a iniciao da transcrio depende da remoo dos nucleossomos da regio promotora do gene. Existem duas maneiras pelas quais isso pode ser feito. Primeiro, durante a sntese de DNA (fase S no ciclo celular), nucleossomos so removidos de uma fita de DNA e so repostos pouco tempo depois. Nesse tempo de substituio, poderia haver competio pelos stios promotores entre histonas e fatores de transcrio tais como o TFIID ligante de TATA. Segundo, parece haver ativadores transcricionais (tais como o receptor de glicocorticide) que podem se ligar aos nucleossomos existentes e desorganiz-los (Rigaud et al., 1991; Adams e Workman, 1993). Uma vez que os nucleossomos esto dissociados na regio promotora, outros fatores de transcrio podem se ligar (Figura 11.3). A habilidade dos fatores de transcrio em remover nucleossomos de genes ativos e seus promotores pode ser vista em experimentos com nucleases. A acessibilidade de um gene s protenas nucleares pode ser detectada tratando a cromatina de um tecido com pequenas quantidades de DNase I. Essa DNase pancretica digere regies acessveis do DNA, mas o DNA coberto pelos nucleossomos protegido. Aps a digesto, o DNA da cromatina tratada extrado e misturado com cDNA radioativo de um determinado gene (Figura 11.4). Se o cDNA encontra seqncias as quais pode se ligar, ento o gene foi protegido da digesto pelas protenas da cromatina- ou seja, ele no estava acessvel DNase, e provavelmente no estaria acessvel tambm aos fatores de transcrio ou RNA polimerase. Entretanto, se a sonda de cDNA no encontra seqncias as quais possa se ligar, ento o gene foi exposto DNase e provavelmente seria acessvel RNA polimerase e a fatores trans-reguladores. Foi determinado que a susceptibilidade de um determinado gene ao da DNase I dependente do tipo de clula na qual ele reside (Tabela 11.1; Weintraub e Groudine, 1976). Tratando cromatina de clulas vermelhas do sangue de pinto em desenvolvimento com DNase I, e misturando o DNA extrado com cDNA radioativo de globina, esse encontrou muito poucas possibilidades de ligao. Os genes da globina na cromatina foram digeridos por uma pequena quantidade de DNase I. Entretanto, tratando cromatina de clulas de crebro com as mesmas quantidades de DNase I, essa no destruiu os genes da globina. Portanto, o gene da globina estava acessvel s enzimas externas na cromatina de clulas vermelhas do sangue em desenvolvimento mas no na cromatina de clulas do crebro. De modo semelhante, o gene da ovalbumina (clara de ovo) suscetvel digesto pela DNase I em cromatina do oviduto mas no na cromatina das
O papel da H1 na compactao da cromatina. (A) Cromatina de fgado de galinha observada no microscpio eletrnico. As contas representam os nucleossomos. (B) A mesma cromatina aps a remoo da histona H1 por eluio salina. A cromatina se tornou muito menos compacta (de Oudet et al., 1975; fotografias cortesia de P. Chambon.)
434
Figura 11.3
Nucleossomo
DNA est enrolado ao redor de um ncleo da histona, formando nucleossomos TF se ligando ao nucleossomo
A ligao de um fator de transcrio (TF) a um nucleossomo pode desestabiliz-lo, permitir a remoo de histonas e expor a regio a outros fatores de transcrio. (De acordo com Adams e Workman, 1993.)
Um TF (fator de transcrio) inicial se liga a um nucleossomo central, deslocando parte do ncleo da histona
Fatores adicionais podem se ligar ao complexo, desestabilizando mais ainda o ncleo da histona
Outros TFs
Histona H1
Quando as histonas so deslocadas, outros TFs podem se ligar
Outros TFs
Histona ou protenas carreadoras
clulas vermelhas do sangue. Quando a cromatina tratada com DNase I e o DNA extrado, o cDNA da ovalbumina capaz de encontrar seqncias na preparao de eritrcitos mas no no DNA da cromatina de oviduto tratada. Temos, aqui, uma clara correlao entre regulao gnica diferencial e a estrutura da cromatina. Stios hipersensveis DNase I Algumas regies da cromatina so identificadas como stios hipersensveis DNase I. Esses stios, identificados em transferncias Southern (Southern blots) por pequeTabela 11.1 Estudos de ligao com cromatina tratada com DNase I Porcentagem de ligao mxima do cDNA radioativo ao DNA extrado da cromatina tratada 94 90-100 90-100 25 90-100
Origem (galinha) DNA da clula vermelha do sangue Cromatina da clula do crebro Cromatina do fibroblasto Cromatina da clula vermelha do sangue Cromatina da clula vermelha do sangue
Tratamento com DNase + + + +
Sonda de cDNA radioativo cDNA da globina cDNA da globina cDNA da globina cDNA da globina cDNA da ovalbumina
Fonte: De acordo com Weintraub e Groudine, 1976.
435
Eritrcito nucleado ou clula do oviduto
Figura 11.4
Extrair cromatina Regies sensveis DNase I Fibra, 30-nm
Protocolo para a determinao de especificidade na digesto da cromatina por DNase I. Veja na Tabela 11.1 os resultados do experimento de digesto com DNase I.
Digesto com DNase I at digeto de 10% do DNA
Isolar DNA da cromatina
Produzir fita nica, hibridizar com sonda Hbrido de sonda e DNA
Medida de nucleotdeos radioativos ligados
nos fragmentos de DNA radioativo, so destrudos por quantidades muito pequenas de DNase, indicando que eles so altamente acessveis s molculas externas. Essa acessibilidade parece decorrer da quase total ausncia de nucleossomos nessa regio de DNA nos tecidos que os expressam (Elgin, 1988). Os stios hipersensveis DNase I marcam regies da cromatina, tais como promotores e intensificadores ativos, onde esto ligadas protenas ligantes de DNA. Regies hipersensveis DNase I esto portanto, associadas a genes especficos de tecido regulados pelo desenvolvimento. (Elgin, 1981; Conklin e Groudine, 1984). Por exemplo, genes da globina nas clulas vermelhas do sangue e seus precursores imediatos contm stios hipersensveis DNase I, mas genes da globina em outras clulas no os contm (Stalder et al.,1980; Groudine et al., 1983). A regio flanqueando a extremidade 5 do gene da vitelogenina do pinto contm vrios stios hipersensveis na cromatina do fgado de galinhas em postura; mas esses stios no esto presentes na cromatina do fgado de machos, fgado embrionrio, crebro ou linfcitos (Burch e Weintraub, 1983). Os stios hipersensveis DNase I freqentemente se situam dentro ou nas adjacncias de stios que tm funes intensificadoras, e certos fatores trans-reguladores so capazes de induzir a formao desses stios hipersensveis. Zaret e
436
Nucleossomo
Yamamoto (1984), estudando o intensificador responsivo a glicocorticides do vrus do tumor mamrio do camundongo, demonstraram que antes da adio do hormnio s clulas contendo o vrus, essa seqncia intensificadora no mostrou sensibilidade especial DNase I. Aps a administrao do hormnio, um stio discretamente hipersensvel DNase I se desenvolveu nessa regio. A formao do stio hipersensvel coincidiu com o incio da transcrio do gene viral; quando o hormnio foi retirado, ambos o stio hipersensvel e a transcrio do gene viral desapareceram. Zaret e Yamamoto especularam que a interao entre o complexo do receptor de glicocorticide e o intensificador de DNA altera a configurao da cromatina para facilitar a transcrio do promotor vizinho. Esse seria o caso se, como j mencionado, o receptor de glicocorticide pudesse remover nucleossomos da regio contendo a seqncia de DNA onde ele se liga. Ruptura e reorganizao de nucleossomos: o papel dos complexos de ruptura Como possvel remover nucleossomos? Estudos recentes identificaram dois fatores que podem ser importantes nesse processo. O fator de transcrio GAGA (uma protena constitutiva expressa em Drosophila que est ligada a numerosos promotores tendo seqncias GA) um desses fatores que podem romper nucleossomos. Quando esse se liga a um nucleossomo contendo a seqncia TATA do gene hsp70 (codificando a protena do choque trmico de 70-kDa), o nucleossomo se rompe e cria um stio hipersensvel DNase I no stio da seqncia TATA. Esse processo muito eficiente quando o nucleossomo no tem histona H1. O fator GAGA no produz esse efeito isoladamente, mas funciona em conjunto com uma protena contendo quatro peptdios chamada fator de remodelagem de nucleossomos (NURF). Na ausncia de fatores de transcrio, o NURF pode perturbar o nucleossomo em uma maneira dependente de ATP. Isso permite que fatores de transcrio tal como o GAGA se liguem s regies promotoras, rompendo os nucleossomos mais distante (Figura 11.5; Tsukiyama et al., 1994; Tsukiyama e Wu, 1995). Outro complexo protico capaz de romper nucleossomos, o complexo SW1/ SNF, foi originalmente descoberto no levedo, mas j foi encontrado na Drosophila e no homem (Peterson e Tamkun, 1995). Quando a seqncia TATA incorporada no DNA nucleossmico, ela no est acessvel protena ligante de TATA e a transcrio severamente reduzida. Essa inibio pode ser anulada por modificaes do nucleossomo dependentes de ATP, efetuadas por SW1/SNF (Imbalzano et al., 1994). De maneira semelhante, SW1/SNF pode romper os nucleossomos nas regies intensificadoras e permitir a ligao de fatores de transcrio (Kwon et al., 1994; Pazin et al., 1994). Parece que o complexo SW1/SNF realmente parte da RNA polimerase e est ligado ao seu domnio carboxi-terminal (Wilson et al., 1996). Esse complexo pode ser ativado por fatores de transcrio capazes de romper nucleossomos. Uma das principais vias de ruptura de nucleossomos atravs de acetilao. Existe uma boa correlao entre a acetilao de histona e a atividade transcricional de uma determinada regio da cromatina. Regies transcricionais extremamente ativas tm nucleossomos que so altamente acetilados, enquanto que domnios de transcrio reprimida tm histonas hipoacetiladas em seus nucleossomos (Braunstein et al., 1993; Jeppesen e Turner, 1993; Hebbes et al., 1994). Quando grupos acetil so colocados nas lisinas das caudas das histonas h uma mudana na estrutura total do nucleossomo (Figura 11.6 ; Lee et al., 1993; Garcia-Ramirez et al., 1995). As caudas se movem para fora, perdendo o contato com a dupla hlice, e tambm perdendo severamente seu domnio sobre o DNA. O DNA se torna muito mais acessvel ao fatores de transcrio. Uma acetiltransferase da histona, que acetila histonas em nucleossomos foi identificada em Tetrahymena, e um homlogo de um ativador transcricional do levedo (Brownell et al., 1996). Mais ainda, foi demonstrado recentemente que a subunidade
Fatores de transcrio
Figura 11.5
Modelo para o mecanismo proposto para o NURF em um nucleossomo. NURF pode hidrolizar ATP e utilizar a energia para reconfigurar as interaes histona-DNA (ou histona-histona). Essas perturbaes parecem facilitar a acessibilidade dos fatores de transcrio ao DNA nucleossmico. Isso pode levar a novas modificaes na estrutura do nucleossomo. (De acordo com Tsukiyama e Wu, 1995.)
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TAF (250-kDa) de TFIID capaz de acetilar histonas H3 e H4 (Mizzen et al., 1996). Essa atividade enzimtica pode ter um papel importante permitindo que TFIID substitua os nucleossomos. Ruptura e reorganizao de nucleossomos: o papel da competio de histonas A competio entre histonas e fatores de transcrio foi inicialmente sugerida para a regulao dos genes de rRNA 5S em Xenopus. Foi demonstrada uma competio entre o fator de transcrio TFIIIA e a histona H1 pelos stios regulando a sntese de rRNA 5S. Se esse gene fosse incubado com TFIIIA antes da histona H1, mesmo em presena de histonas centrais, havia a formao do complexo transcricional. Se H1 estivesse presente antes de TFIIIA, a transcrio era bloqueada (Schlissel e Brown, 1984). Prioleau e colegas (1994) relacionaram a competio entre histonas e a protena ligante de TATA e a ocorrncia da transio da blstula intermediria. Genes ativados na transio da blstula intermediria so reprimidos durante a clivagem precoce. Quando tais genes so injetados em ncleos de Xenopus na fertilizao ou em estgios precoces da clivagem, eles so envolvidos pela cromatina e so reprimidos. Aps a transio da blstula intermediria, os genes injetados so transcritos. A represso durante a clivagem precoce pode ser aliviada por uma pr-incubao dos genes injetados com a protena ligante de TATA. Portanto, em alguns sistemas possvel que a competio entre fatores de transcrio e histonas possa regular a expresso gnica. O grau de metilao do DNA (a ser logo discutido) pode ser crtico para essa competio, pois histona H1 se liga mais avidamente ao DNA metilado do que ao no metilado (McArthur e Thomas, 1996).
Histona acetiltransferase
DNA
Histona deacetilase
Figura 11.6
Histona acetiltransferase pode modificar as caudas da histona e modificar sua conformao com o DNA nucleossmico. Isso permite a soltura do DNA do nucleossomo central. (De acordo com Lee et al., 1993.)
Regies de controle de loco: transcrio do gene da globina

Regies controladoras de loco (LCRs) so seqncias de DNA que so essenciais para o estabelecimento de uma configurao aberta da cromatina. Ou seja, essas regies podem inibir a represso normal da transcrio em uma rea relativamente grande contendo vrios genes. Uma das LCRs melhor estudada a que regula a expresso especfica de tecido dos genes da famlia das -globinas no homem, camundongo e pinto. Em muitas espcies, incluindo o pinto e o homem, a hemoglobina embrionria ou fetal diferente daquela encontrada em clulas vermelhas do sangue de adultos. Um diagrama esquemtico dos tipos de hemoglobina humana e dos genes que as codificam est apresentado na Figura 11.7. Hemoglobina embrionria humana consiste principalmente de duas cadeias da globina, duas cadeias da globina e quatro molculas de heme. Durante o segundo ms da gestao humana a sntese de - e -globinas cessa abruptamente, enquanto que a sntese de e globinas aumenta (Figura 11.8). A associao de duas cadeias de -globina com duas de globina produz a hemoglobina fetal (22). No terceiro ms de gestao os genes da e globinas comeam a ficar ativos, e seus produtos crescem vagarosamente enquanto que os nveis de -globina gradualmente decrescem. Essa troca altamente acelerada aps o nascimento, e a hemoglobina fetal substituda pela hemoglobina adulta: (22). O perfil da hemoglobina adulta normal de 97 porcento 22, 2-3 porcento 22, e 1 porcento 22. No homem, os genes das globinas - e - esto no cromossomo 16, e os genes das -, -, - e -globinas esto ligados entre si na ordem de aparecimento, no cromossomo 11. Parece existir, ento, um mecanismo que dirige a troca seqencial dos genes do cromossomo 11 das globinas embrionrias s fetais s adultas. Alm dos stios hipersensveis DNase nos promotores e intensificadores perto e dentro de cada gene de globina, ainda existe uma regio controladora do loco bem a montante do membro mais 5 () do complexo de genes da -globina. Essa LCR
438
Figura 11.7
Cromossomo Embrionrio
Cromossomo
Ativao gnica seqencial na sntese da hemoglobina durante o desenvolvimento.
Fetal
Genes da globina Genes da globina
Adulto minoritrio
Adulto majoritrio
Protenas globina
contm quatro stios que so hipersensveis DNase I somente em clulas precursoras de eritrides e que parecem ser necessrios para altos nveis de ativao da transcrio especfica nessas clulas, da famlia inteira dos genes da -globina (-, -, - e -globinas) no cromossomo 11 humano (Grosveld et al., 1987). Deleo ou mutao da LCR causa o silenciamento de todos esses genes. Inversamente, se a LCR colocada adjacente a genes que no so usualmente expressos nas clulas vermelhas do sangue (como o gene especfico da clula T, thy-1) e ento transfectados nas clulas precursoras de eritrides, esses novos genes so expressos nas clulas vermelhas do sangue. Esse efeito especfico para precursores das clulas vermelhas do sangue, pois somente elas teriam os fatores trans-reguladores apropriados para se ligar a essa regio (Blom van Assendelft et al., 1989; Fiering et al., 1993). A LCR responsvel por permitir expresso gnica em uma regio inteira. Alm disso, se os genes da globina permanecem ligados LCR, eles podem ser expressos em clulas eritrides independentemente de onde elas residem no genoma. Se eles so separados da LCR, os genes da globina so reprimidos, mesmo nas clulas eritrides que transcreveriam os genes da globina. Ryan e colaboradores (1989) produziram
Stio da eritropoiese Fgado Bao Saco vitelnico
Porcentagem da sntese total de globina
Medula ssea
Figura 11.8
Porcentagens de cadeias polipeptdicas de hemoglobina em funo do desenvolvimento humano. A importncia fisiolgica da cadeia de globina na hemoglobina fetal foi examinada no Captulo 9. (De acordo com Karlsson e Nienhaus, 1985.)
Idade ps-concepo (semanas)
Nascimento
Idade ps-natal (semanas)
439
(A)
LCR
Stios hipersensveis DNase
Figura 11.9
Deleo nessa rea causa a, , , , -talassemia (B)
Genes da globina
Deleo nessa rea causa persistncia da hemoglobina fetal
Nucleossomos
(i)
LCR
Garfo de replicao
Protenas ligantes do promotor
Promotor ou intensificador
(ii) O complexo promotor-LCR estabilizado pelas protenas ligantes de promotores durante a construo do nucleossomo Nucleossomo formando no DNA replicado Promotor
Diagrama da famlia de genes da globina humana no cromossomo 11. (A) A regio LCR especfica para eritrides est localizada de 6 a 22 quilobases a montante do gene da globina. Os quatro stios hipersensveis DNase I dentro dessa regio esto indicados por setas. Um quinto stio hipersensvel DNase I a jusante do gene da globina est tambm marcado, e uma deleo dessa regio causa a persistncia da transcrio do gene da globina. Dois genes quase idnticos da globina (fetal) esto a jusante do gene da globina (embrionrio). Em seqncia a esses esto os genes da e globinas adultas. (B) Um modelo possvel para a atividade de LCR. Fatores de transcrio ligados a promotores da globina so estabilizados no garfo de replicao pela ligao LCR. Dessa forma, o complexo no seria dissociado, e as regies associadas LCR permaneceriam livres de nucleossomos. (A de acordo com Ryan et al., 1989; B de acordo com Felsenfeld, 1992.)
LCR
Protenas ligantes do promotor (iii) LCR Promotor ou intensificador hipersensveis
camundongos transgnicos contendo o gene da -globina humana e seus promotores e intensificadores imediatos. Estes animais transgnicos produziram somente pequenas quantidades da -globina humana (menos de 0.3 porcento da -globina celular total). Entretanto, quando os pesquisadores adicionaram LCR, a -globina humana correspondia a mais da metade da globina total nesses camundongos. Esse resultado explica observaes clnicas em pacientes que no tinham essa regio e mostravam deficincias de -, -, -, e -globinas, apesar de seus genes para essas protenas estarem intactos e os genes de globinas no outro cromossomo funcionarem normalmente (Tuan et al., 1987). A regio controladora do loco est abarrotada com stios de ligao de fatores trans-reguladores. Como foi observado por Gary Felsenfeld (1992) Os domnios parecem ter sido montados por um estudante super-entusiasmado determinado a construir um poderoso elemento atuante como cis. Ele sugere que uma das funes da LCR formar uma ala ao redor de uma das regies promotoras durante a replicao do DNA e se ligar a ela de maneira a impedir que nucleossomos se formem naquele promotor de globina (Figura 11.9). Realmente, os promotores da globina no so hipersensveis DNase I exceto na presena da LCR.
440
&
Especulaes
Trocas no gene de globina
PESAR DE SER BVIO que a trans-
crio do gene da globina passa pelas isoformas embrionria, fetal e adulta durante o desenvolvimento, no conhecemos o mecanismo dessa troca. Modelos recentes da troca de globina focalizam a competio e cooperao entre intensificadores, promotores e a regio controladora de loco. [chrom2.html]
Regulao do gene da globina humana O sistema de trocas na expresso gnica das globinas humanas complicado. Existem vrios elementos cis-reguladores para a -globina. J discutimos a regio promotora da -globina e a regio controladora do loco que mantm toda a regio do cromossomo pronta para ser transcrita. Alm disso, h um intensificador 3 (a montante do gene da -globina) que regula a expresso temporal do gene, e existe um outro intensificador intragnico que ajuda a regulao da especificidade tissular na expresso do gene da globina. Esse ltimo intensificador est realmente localizado dentro do terceiro xon do prprio gene da -globina
Figura 11.10
(Behringer et al., 1987; Trudel e Constantini, 1987). Como mostra a Figura 11.10, essas regies cis-reguladoras tm numerosos stios para fatores de transcrio ubquos e especficos para eritrides. Um dos fatores especficos para eritride mais importante a protena dedo de zinco, GATA-1 (Orkin, 1992). Esse fator se liga s seqncias GATA, que so encontradas ao longo das LCR bem como nos promotores e intensificadores de numerosos genes que so expressos nas clulas vermelhas do sangue (incluindo alguns dos genes para globina, sntese de heme e o receptor de eritropoietina). Experimentos de endereamento de genes (gene-targeting) mostram que camundongos sem o gene para GATA-1 no produzem a linhagem de clulas eritrides (Pevny et al., 1991). Um segundo fator de transcrio crtico parece ser o NF-E2. Esse fator de transcrio bZIP especfico para eritrides se liga a reas da LCR e pode mediar a comunicao entre a LCR e as regies promotoras (talvez se ligando GATA-1) (Talbot and Grosveld, 1991; Gong and Dean, 1993). Gata-1 e NF-E2 so tambm necessrios para a formao de um dos stios hipersensveis DNase I na LCR (Stamatoyannopoulos et al., 1995). Persistncia hereditria da hemoglobina fetal A maioria das pessoas trocam a globina fetal pela adulta ao redor do nascimento, mas isso
no acontece com algumas pessoas. Esses indivduos retm a transcrio de seu gene da -globina e so consideradas como tendo persistncia hereditria da hemoglobina fetal ( (HPFH). Isso no lhes causa dano.* As mutaes que do origem HPFH se agrupam nas regies cis-reguladoras. Mutaes deletivas que removem as regies promotoras ou intensificadoras da -globina so suficientes para elevar os nveis de -globinas em clulas adultas. Mutaes pontuais nos promotores de um ou outro gene da -globina podem tambm causar HPFH (Martin et al., 1989). Uma dessas mutaes cria um novo stio de ligao para GATA-1, enquanto a outra cria um stio de ligao forte para o fator ubquo Sp1 (Ottolenghi, 1992). Assim, parece
*Indivduos com HPFH so fenotipicamente normais e so identificados atravs de varreduras de populaes para identificar outras anormalidades de globinas (como talassemia e anemia falciforme). Pesquisadores gostariam muito de saber reativar o gene da globina em pessoas sofrendo de talassemia, anemia falciforme e outras doenas da globina. Se o gene da -globina fosse reativado, mesmo fracamente, muitos dos sintomas dessas doenas poderiam ser aliviados. Estudos recentes sugerem que a administrao de butirato ou a combinao de hidroxiuria e eritropoietina podem provocar a elevao da hemoglobina fetal em clulas vermelhas do sangue recm-geradas (Perrine et al., 1993; Rodgers et el., 1993). Esto em andamento estudos de avaliao desses procedimentos.
Representao esquemtica do gene da globina humana e suas regies reguladoras. As reas sombreadas representam diferentes fatores de transcrio e as setas duplas indicam que mais de um fator pode se ligar naquele stio. (De acordo com Ottalenghi, 1992.)
Protenas ligantes de promotor
Protenas ligantes de intensificador
Intensificador intragnico
Promotor
Gene da globina
Intensificador flanqueando a extremidade 3
441
haver uma competio entre os promotores dos genes de - e -globinas (Enver et al., 1990). Essa competio influenciada pela presena de fatores trans-reguladores intensificadores e silenciadores. Existem tambm mutaes pontuais que causam HPFH impedindo a ligao de um regulador negativo ao promotor da globina em clulas adultas (Berry et al., 1992). Bacon e colegas (1995) tiveram evidncia de que a relao entre os fatores de transcrio GATA-1 e Sp1 muda ao longo do tempo e que o tipo de globina pode depender da concentrao relativa desses fatores. A LCR e a troca de globina no homem
Fator de transcrio no stio hipersensvel 3
Aglomerado de genes semelhantes globina
Embrionrio
Fetal
Adulto
Holocomplexo
Figura 11.11
A principal competio pode no ser para a ativao pelo intensificador 3 (que pode funcionar localmente), mas pela LCR. Enquanto alguns investigadores consideram que o principal efeito da LCR manter a cromatina contendo locos da globina em uma conformao transcricionalmente permissiva (veja Martin et al., 1996), outros pesquisadores imaginam interaes especficas entre diferentes promotores do gene da globina e as regies da LCR. interessante notar que a distncia entre a LCR e os genes da globina afetam sua ativao (Hanscombe et al., 1991). Quando unido prximo LCR, o gene da -globina humana expresso em clulas embrionrias de camundongos transgnicos. Sua ativao correta (somente em clulas adultas) restaurada somente quando ele colocado mais longe da LCR. De maneira semelhante, o gene da -globina humana reprimido mais cedo (como o gene normal da -globina) quando ele est mais separado da LCR. Isso sugere que a interao entre LCR e os genes da globina polarizada (veja Figura 11.10; Hanscombe et al., 1991): os genes da globina mais perto da LCR so ativados mais cedo, enquanto os mais distantes o so mais tarde. Presumivelmente, existe um contato fsico entre a LCR e os promotores e intensificadores especficos dos genes. O mecanismo pelo qual a distncia da LCR poderia regular a ativao de diferentes promotores em diferentes tempos ainda tem que ser explicado. Um modelo (Figura 11.11; Ellis et al., 1996) foi recentemente proposto considerando que camundongos transgnicos contm pedaos de LCR no seu genoma. Nesse modelo, o terceiro stio
Mecanismo proposto para ativao da famlia das globinas pela LCR. (A) O stio hipersensvel 3 da LCR ativado por um fator transativador. (B) Uma vez aberto o stio 3, os outros stios hipersensveis abrem e ligam seus fatores de transcrio. Interaes entre essas protenas formam um holocomplexo de DNA e protena. Esse pode formar uma ala e interagir com os promotores dos genes da globina. Competio por essa interao, pela presena de diferentes concentraes de fatores de transcrio, permitiria a ativao diferencial e seqencial desses genes durante o desenvolvimento dos eritrcitos. (De acordo com Ellis et al., 1996.)
hipersensvel DNase aberto por um fator de transcrio trans-ativador. Uma vez aberto esse stio, os outros trs stios especficos para tecidos tambm se abrem. Interaes protena-protena entre esses stios os agrupa para formar um holocomplexo, que espalha a alterao na estrutura da cromatina atravs da regio da -globina. O holocomplexo formaria uma ala de interao com cada um dos genes da globina, e interagiria seqencialmente com as regies promotoras de cada gene. Os fatores de transcrio envolvidos nas sndromes de HPFH podem ser aqueles que so mediadores nas interaes entre os promotores e os stios hipersensveis da LCR. Alm disso, esses stios no so permutveis (isto , o stio 4 no pode substituir o stio 3) e, portanto, devem ter diferentes papis nessas interaes (Bungert et al., 1995). Nesses modelos, h uma competio entre os promotores pela LCR. Um fator de transcrio recentemente descoberto, EKLF (fator de eritride semelhante ao Krppel), pode ser crucial na regulao dessa competio por estabilizar as interaes entre LCR e o promotor da -globina. Em camundongos sem EKLF, mas tendo um sistema funcional do gene da -globina humana (incluindo a LCR humana), as - e
-globinas so produzidas normalmente. Entretanto, a troca para -globina no feita. Isso sugere que o holocomplexo da LCR continua a interagir com os promotores do gene da -globina a no ser que seja estabilizado ao promotor do gene da -globina pelo EKLF (Wijgerde et al., 1996). Inversamente, fatores de transcrio tais como GATA1 e YY1 podem interferir com a ligao de LCR com um promotor, enquanto eles intensificam a ligao da LCR a outro promotor (Raich et al., 1996; Wandersee et al., 1996). As interaes entre stios de LCR e promotores e como essas poderiam ser reguladas por diferentes relaes e tipos de fatores de transcrio ainda devem ser elucidadas, mas essas interaes entre intensificadores, promotores e a LCR devem fornecer uma estria fascinante sobre a expresso gnica diferencial em clulas humanas.*
* Se voc acha que as coisas esto complicadas, voc est certo. Harold Weintraub, que foi um dos lderes da pesquisa em cromatina disse: Um intensificador complexo pode ter 10 stios de ligao, uma LCR provavelmente outro tanto, um complexo de transcrio pode conter 15 protenas e a RNA polimerase talvez 12. Que confuso! (H. Weintraub, comunicao pessoal). No sabemos porque existem tantos fatores diferentes regulando a transcrio desses genes.
442
Metilao de DNA e atividade gnica

Freqentemente, assume-se que o gene contm exatamente os mesmos nucleotdeos na forma ativa ou inativa. Um gene da -globina em precursores de clulas vermelhas do sangue deveria ter os mesmos nucleotdeos que um gene da globina em um fibroblasto ou clula retiniana do mesmo animal. Existem, entretanto, diferenas sutis no DNA. Em 1948, R. D. Hotchkiss descobriu uma quinta base no DNA, 5-metilcitosina. Em alguns eucariotos, essa base produzida enzimaticamente aps replicao do DNA, e aproximadamente 5% das citosinas em DNA de mamferos so convertidas em 5-metilcitosina. Essa converso s pode ocorrer quando o resduo de citosina seguido por uma guanosina (CpG). Estudos recentes mostraram que o grau de metilao das citosinas em um gene pode tambm controlar a transcrio do gene. Em outras palavras, a metilao do DNA pode mudar a estrutura do gene e, assim fazendo, regula sua atividade. A metilao da citosina parece ser um mecanismo majoritrio na regulao transcricional em vertebrados. Entretanto, Drosophila, nematdeos e talvez a maioria dos invertebrados no metilam o seu DNA. Existem trs reas nas quais a metilao do DNA parece contribuir para a atividade gnica diferencial. Primeiro, a metilao de seqncias do promotor contribui para a regulao temporal e espacial dos genes codificando protenas especficas de tecidos. Segundo, a metilao do DNA considerada responsvel pela distino entre certos genes derivados do vulo ou do espermatozide nos mamferos, assim permitindo a expresso de somente um deles durante o desenvolvimento precoce. Terceiro, a metilao do DNA considerada responsvel pela represso continuada de genes em um dos dois cromossomos X em cada clula feminina de mamferos. Correlaes entre metilao do promotor e inatividade gnica A primeira evidncia de que a metilao do DNA ajuda a regular a atividade do gene vem de estudos mostrando correlao entre atividade gnica e baixa metilao da citosina (hipometilao), especialmente na regio promotora do gene. Em clulas vermelhas do sangue em desenvolvimento, no homem e no pinto, o DNA envolvido na sntese da globina est completamente (ou quase completamente) no metilado, enquanto que os mesmos genes, em clulas que no produzem globinas, esto altamente metilados (Figura 11.12). Clulas de fgado fetal que produzem hemoglobina no desenvolvimento precoce tm genes no metilados para a hemoglobina fetal. Esses genes so metilados no tecido adulto (van der Ploeg e Flavell, 1980; Groudine e Weintraub, 1981; Mavilio et al., 1983). Modelos de metilao com especificidade tissular podem tambm ser encontrados no gene da ovalbumina do pinto; o gene no est metilado nas clulas do oviduto, mas em outros tecidos do pinto est metilado (Mandel e Chambon, 1979). Desmetilao acompanha a troca de classe na sntese das imunoglobulinas (Rogers e Wall, 1981) e se correlaciona com a habilidade de linfcitos murinos em produzir a protena ligante de metais, metalotionena I (Compere e Palmiter, 1981). Em somitos de camundongo, a desmetilao de um intensificador MyoD precede sua transcrio e essencial para a especificao dessas clulas como precursores musculares (Brunk et al., 1996). Portanto, a ausncia de metilao do DNA tem boa correlao com a expresso especfica de tecido de certos genes. Um segundo tipo de evidncia indicando a metilao do DNA como um processo regulador vem de experimentos nos quais a expresso de genes clonados alterada pela introduo ou remoo de grupos metila em seus resduos de citosina. Quando Busslinger e colaboradores (1983) adicionaram genes de globina clonados a clulas (por co-precipitao com fosfato de clcio), essas absorveram o DNA e, em muitos casos, o incorporaram em seus ncleos. Em tais casos, os genes da globina
443
Promotor no metilado Gene da globina 6 semanas Ativo
Promotor metilado Gene da globina DNA globina Inativo
Figura 11.12
Metilao de genes da globina em clulas sangneas embrionrias em humanos. A atividade dos genes da globina tem correlao inversa com a metilao de seus promotores. (De acordo com Mavilio et al., 1983.)
12 semanas Inativo Ativo globina
clonados foram transcritos. Se certas regies dos genes de globina clonados forem protegidos da metilao, antes de adicion-los s clulas, ser possvel criar clones nos quais os genes da globina tm seqncias idnticas mas diferentes padres de metilao. Um gene completamente no metilado transcrito, enquanto que um gene completamente metilado (grupo metila em cada apropriado resduo C) no transcrito. Usando clones parcialmente metilados, Busslinger e colaboradores mostraram que a metilao na regio 5 do gene da globina (nucleotdeos 760 a +100) previne a transcrio. Parece, portanto, que a metilao no terminal 5 de um gene tem um papel direto na regulao da expresso gnica. De modo geral, a metilao da regio promotora inibe a transcrio de genes. Metilao e a manuteno dos padres de transcrio Diferenas na metilao podem ser responsveis pela manuteno (como o oposto iniciao) de um padro de atividade transcricional ao longo de vrias geraes de clulas (Holliday, 1987). Durante a replicao, cada fita de DNA serve como um molde para sua fita complementar. Nas regies de metilao, os grupos metila esto nas duas fitas da dupla hlice, visto que uma CpG em um lado do DNA refletida por uma CpG antiparalela no outro lado. Se o C em uma das fitas est metilado, o C na na outra fita tambm est (Figura 11.13). Durante a replicao, uma fita de DNA (a fita molde) teria o padro de metilao, ao passo que a fita recm-sintetizada no o teria. Entretanto, a enzima DNA (citosina-5)-metiltransferase tem uma forte preferncia por DNA com uma fita metilada, e quando encontra um metil-CpG em um lado do DNA, a enzima metila a nova citosina no outro lado (Gruenbaum et al., 1982; Bestor e Ingram, 1983). duvidoso que modificaes na metilao realmente iniciam modificaes na atividade do gene, pois a DNA metiltransferase no tem uma especificidade inerente em relao a uma seqncia (salvo uma propenso geral para reas ricas em CpG). Como o padro de metilao deve ser herdado aps cada diviso celular, alguma outra coisa deve reconhecer os genes de clulas diferenciadas no seu estado metilado e subseqentemente desmetil-los. Isso foi demonstrado transfectando um gene metilado de -actina para clulas cultivadas de mioblastos (que normalmente transcrevem aquele gene). Quando transfectado para os mioblastos, esse gene foi desmetilado e transcrito. Entretanto, se transferido a
Replicao
Novas fitas de DNA
Metilao de novas fitas de DNA
Figura 11.13
Modelo para a propagao de padres de metilao. Quando o DNA se replica, somente uma das duas fitas (a fita velha) retm o padro original de metilao. A outra fita (a fita nova) no metilada. Uma enzima metilante especfica para CpG seria capaz de se ligar aos pares de CpG onde um resduo C estava metilado, e ento metilaria o resduo C na fita complementar. (De acordo com Browder, 1984.)
444
outros tipos de clulas, esse gene especfico para o msculo permaneceu metilado. A desmetilao especfica para o msculo no necessitou de sntese de novo DNA mas certas seqncias cis-DNA foram necessrias (Yisraeli et al., 1986; Paroush et al., 1990). Uma situao semelhante foi vista na desmetilao de genes da imunoglobulina e vitelogenina (protena do vitelo) (Frank et al., 1990; Jost, 1993). Portanto, a metilao pode ser necessria para estabilizar o padro de transcrio do gene, mas a ativao inicial do gene provavelmente realizada por fatores de transcrio especficos para tecidos. Como que a metilao impede a transcrio? Uma possibilidade que os fatores de transcrio no podem se ligar s suas seqncias intensificadoras ou promotoras se o DNA estiver metilado (Iguchi-Ariga e Schaffner, 1989). Outra possibilidade que o DNA metilado seja especificamente reconhecido por certas protenas que competem contra os fatores de transcrio por esses stios. Boyse e Bird (1991, 1992) forneceram evidncias para esse segundo modelo mostrando que seqncias promotoras metiladas esto ligadas por uma protena ligante de metil-CpG. Essa protena parece competir com a ligao de fatores de transcrio, desse modo reduzindo a transcrio desses stios. A metilao do DNA pode tambm influenciar a formao de nucleossomos. Keshet e colaboradores (1986) demonstraram que a metilao afeta a estrutura da cromatina e sugerem que a desmetilao cria stios hipersensveis DNase I. Quando eles transfectaram genes da globina desmetilados em ncleos de fibroblastos de camundongo, os genes foram empacotados em cromatina sensvel DNase (independente da habilidade transcricional do gene). Quando os mesmos genes foram metilados em todos os stios CpG, as regies sensveis DNase no se formaram, possivelmente porque sua metilao os levou a um empacotamento de forma inacessvel. possvel que quando os fatores trans-reguladores removem os nucleossomos do DNA, essas regies se tornam desmetiladas. Essa desmetilao pode ser necessria para estabilizar essas regies de atividade. Os grupos metila interagiriam com as histonas para permitir que os nucleossomos se formem somente no DNA metilado e no no DNA desmetilado, deixando as regies ativas livres de nucleossomos no DNA (Keshet et al., 1986). Uma vez estabelecidas essas regies, seria mais fcil para outros elementos trans-reguladores encontrar essas regies livres de nucleossomos.
&
Especulaes
Metilao e impresso gnica
O CAPTULO 4, vimos que os genomas do espermatozide e do vulo nos mamferos no so equivalentes. Os zigotos no se desenvolvem adequadamente se seus ncleos so derivados de dois proncleos do vulo ou do espermatozide. Essa inabilidade de desenvolvimento provavelmente devida a certos genes que somente so ativos se forem derivados do espermatozide ou do vulo. Para a maioria dos genes (como foi previsto pela gentica Mendeliana) no importa se ele provem do pai ou da me, exis-
tem aproximadamente uma dzia de genes para os quais importante se ele deriva do espermatozide ou do vulo. Em algumas mutaes no camundongo e no homem, uma situao severa ou letal se desenvolve se o gene mutante derivado de um genitor, mas o mesmo gene mutante no tem efeito deletrio se herdado do outro genitor. Por exemplo, em camundongos, o gene para o fator de crescimento II semelhante insulina (Igf2) no cromossomo 7 ativo em embries precoces somente no cromossomo transmitido pelo pai. Inversamente, o gene (Igf-
2r) para uma protena ligante desse fator de crescimento no cromossomo 17 ativo somente quando transmitido pela me (Barlow et al., 1991; DeChiara et al., 1991; Bartolomei e Tilghman, 1992). Igf-2r age ligando e degradando o excesso de Igf-2. Um filhote de camundongo que herda uma deleo do gene Igf-2r de seu pai normal, mas se a mesma deleo herdada da me, o crescimento do feto intensificado e ele morre tardiamente na gestao.* No homem, a perda de um segmento especfico do brao longo do cromossomo 15 resulta em diferentes
445
Tabela 11.2 Evidncia que a impresso gnica afeta o fentipo em distrbios do gene humano no cromossomo 15 (loco 11q13) Origem genitora Me Alelo normal Alelo mutante Duas cpias do alelo Alelo ausente Pai Alelo mutante Alelo normal Alelo ausente Duas cpias do alelo Fentipo Sndrome de Prader-Willi Sndrome de Angelman Sndrome de Prader-Willi Sndrome de Angelman
Fonte: De acordo com Nicholls et al., 1993.
fentipos, dependendo se a perda no cromossomo derivado do homem ou da mulher (Tabela 11.2). Se o cromossomo com o segmento defeituoso ou ausente vem do pai, a criana nasce com a sndrome de PraderWilli, uma doena associada a um ligeiro retardamento mental, obesidade, gnadas pequenas e baixa estatura. Se o gene defeituoso ou ausente vem da me, a criana tem a sndrome de Angelman, caracterizada por severo retardamento mental, convulses, falta de fala e riso inapropriado (Knoll et al., 1989; Nicholls et al., 1989). [chrom3.html] Atualmente, considera-se que a maioria, seno todas, as diferenas entre genes pronucleares de machos e de fmeas em mamferos, envolvem diferenas em seus padres de metilao do DNA. A distribuio dos CG metilados ou no pode ser analisada cortando o DNA com duas enzimas de restrio, HpaII e MspI (McGhee e Ginder, 1979). Ambas as enzimas cortam no mesmo stio-CCGG- mas HpaII no cortar o DNA se o C central est metilado, enquanto MspI corta se a seqncia est ou no metilada. Portanto, o DNA de certo tipo de clula pode ser digerido separadamente com HpaII e MspI e os fragmentos de DNA obtidos transferidos pela tcnica Southern e hibridizados com uma sonda radioativa especfica para o gene (veja Captulo 2). Diferenas no padro de bandas na autoradiografia dos fragmentos clivados por MspI ou HpaII podem ser relacionadas s diferenas de metilao.
*O aumento de 30% no crescimento causado por um excesso de Igf-2. A letalidade provavelmente devida a defeitos lisossmicos, pois a protena ligante de Igf-2 tambm serve para direcionar enzimas lisossmicas para aquela organela. (Wang et al., 1994.)
A Figura 11.14 mostra o resultado de um experimento onde DNA de espermatozide foi isolado e tratado com HpaII ou MspI. A sonda foi um DNA radioativo do segundo xon do gene da globina. A auto-radiografia de fragmentos da digesto com MspI mostra que essa sonda se liga a fragmentos de DNA com 1400 pares de bases entre os stios CCGG. A autoradiografia da digesto de HpaII mostra que no espermatozide esses stios (e provavelmente numerosos outros) so metilados e que essa seqncia de DNA agora reside em um pedao de 25000 pares de bases do DNA onde todos os stios CCGG so metilados (Groudine e Conklin, 1985). Essa tcnica mostrou que os ncleos das clulas germinativas primordiais nos mamferos, macho e fmea, so surpreendentemente hipometilados (Monk et al., 1987; Driscoll e Migeon, 1980), mas ambos os genes do espermatozide e do vulo sofrem extensa metilao no amadurecimento dos gametas. Parece que na formao das clulas germinativas, informaes prvias sobre metilao so apagadas e, durante a meiose, nova informao introduzida no genoma. O padro de metilao em um determinado gene pode diferir entre o espermatozide e o vulo, e essas diferenas de metilao especficas dos genes podem ser vistas nos cromossomos das clulas embrionrias (Reik et al., 1987; Sanford et al., 1987; Sapienza et al., 1987; Chaillet et el., 1991; Kafri et al., 1992). Portanto, diferenas de metilao entre os genes do espermatozide e do vulo podem especificar um gene vindo do pai ou da me. Essa impresso materna ou paterna adiciona informao aos genomas herdados, informao essa que pode regular
temporal e espacialmente a atividade gnica e o comportamento cromossmico. Swain e colaboradores (1987) acompanharam esses eventos seguindo um gene especfico que sofre metilao diferencial no espermatozide e no vulo. Eles produziram uma linhagem de camundongos transgnicos nos quais um gene particular, c-myc, foi inserido em uma regio particular do genoma do camundongo. Quando esse gene foi herdado do genitor macho, ele foi transcrito especificamente no corao e em nenhum outro tecido. Quando esse gene foi herdado do genitor fmea, ele no se expressou. O padro de expresso foi correlacionado com o grau de metilao; esse gene metilado durante a maturao do vulo mas permanece hipometilado durante a formao do espermatozide. Em animais que herdam o transgene do macho, o gene no est metilado e expresso no corao. Em animais que adquirem o transgene de suas mes, o gene metilado e silencioso. Em ambos, macho e fmea, o padro de metilao eliminado nas clulas germinativas (Chaillet et al., 1991; Kafri et al., 1992). No camundongo, diferenas de metilao dos gametas tambm so vistas na impresso dos genes para Igf-2r e H19 (Ferguson-Smith et el., 1993; Stger et al., 1993). Alm disso, se esses genes so colocados em uma linhagem de camundongos
Msp I Hpa II =25
Pares de bases (x103)
1.4
Figura 11.14
Deteno de stios de metilao no DNA. DNA foi isolado de espermatozide de galinha e digerido com MspI (pista 1) ou HpaII (pista 2). Os fragmentos foram separados por eletroforese, transferidos para papel e hibridizados por uma sonda de DNA radioativo do segundo xon do gene da globina. Essa sonda se ligou a um fragmento de 1400 bases no digerido de MspI, mas a um fragmento de 25.000 bases no digerido de HpaII. (De acordo com Groudine e Conklin, 1985; fotografia cortesia de M. Groudine.)
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mutantes que no possui a enzima capaz de metilar os stios CpG, a transcrio do gene H19 ocorre a partir do alelo previamente silencioso, enquanto que a transcrio de Igf2r perdida (Li et al., 1993). Assim, em genes impressos, a metilao pode ser um sinal
negativo ou positivo para a transcrio. Essas diferenas de metilao especfica para gametas fornecem uma explicao plausvel para a falta de desenvolvimento nos mamferos partenogenticos e para a necessidade da presena de ambos os proncleos,
macho e fmea, no zigoto. Elas fornecem tambm um lembrete de que o organismo no pode ser explicado somente na base de seus genes. So necessrios conhecimentos tanto de parmetros desenvolvimentais como genticos.
Compensao de dosagem do cromossomo X de mamferos

Em animais to diversos como a Drosophila e o homem, as fmeas se caracterizam por terem dois cromossomos X por clula, enquanto os machos s tem um por clula. Em contraste com o cromossomo Y, o cromossomo X tem milhares de genes essenciais para a atividade celular. Mas, apesar das clulas femininas possurem um nmero de cromossomos X que o dobro das masculinas, as clulas de ambos tm quantidades aproximadamente iguais de produtos gnicos codificados pelo cromossomo X. Essa equalizao chamada compensao de dosagem. As taxas de transcrio dos cromossomos X foram alteradas de tal forma que clulas masculinas e femininas transcrevem a mesma quantidade de RNAs de seus cromossomos X. Na Drosophila, ambos os cromossomos X na fmea so ativos, mas h uma crescente transcrio do cromossomo X do macho, de modo que o nico cromossomo X das clulas do macho produz tanto produto quanto os dois cromossomos nas clulas femininas (Lucchesi e Manning, 1987). Isso possibilitado pela ligao de fatores de transcrio especficos a centenas de stios ao longo do cromossomo X do macho (Kuroda et al., 1991). Nos mamferos a compensao de dosagem do cromossomo X ocorre por inativao de um cromossomo X em cada clula feminina. Dessa forma, cada clula somtica em mamferos, seja de macho ou de fmea, tem somente um cromossomo X funcional. Esse fenmeno chamado inativao do cromossomo X. A cromatina do cromossomo X inativo convertida em heterocromatina- cromatina que permanece condensada ao longo da maior parte do ciclo celular e se replica aps a maior parte da cromatina do ncleo (a eucromatina). Essa heterocromatina, em uma formao chamada corpo de Barr (Figura 11.15), freqentemente vista no envoltrio nuclear de clulas femininas (Barr e Bertram, 1949). A inativao do cromossomo X deve ocorrer precocemente no desenvolvimento. Tagaki e Abe (1990) usando um cromossomo X mutado que no se inativava, mostraram que a expresso de dois cromossomos X por clula em embries de camundongo leva morte das clulas ectodrmicas e ausncia de formao do mesoderma, finalmente causando a morte embrionria no 100 dia de gestao.
Figura 11.15
Ncleos de clulas do epitlio oral humano coloridos com Cresil violeta. (A) Clula de um homem normal XY, mostrando ausncia do corpo de Barr. (B) Clula de uma mulher normal XX, mostrando um nico corpo de Barr (seta). (C) Clula de uma mulher com trs cromossomos X. Dois corpos de Barr podem ser vistos, e somente um cromossomo por clula ativo. (De acordo com Moore, 1977.)
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CLIVAGEM PRECOCE
IMPLANTAO
NA FERTILIZAO Corpos de Barr Cromossomo X materno Cromossomo X paterno (A) Zigoto feminino com dois cromossomos X Os dois cromossomos X so ativos em todas as clulas Inativao ao acaso de um cromossomo X em todas as clulas do embrio
(B)
Figura 11.16
Inativao do cromossomo X em mamferos. (A) Diagrama esquemtico ilustrando inativao ao acaso do cromossomo X. Considera-se que a inativao ocorra aproximadamente na poca da implantao. (B) Um camundongo fmea heterozigoto para o gene dappled, da colorao da pelagem, ligado ao X. Podem ser observadas regies distintamente pigmentadas. (Fotografia cortesia de M. F. Lyon.)
A inativao precoce de um cromossomo X por clula tem conseqncias fenotpicas importantes. Uma das primeiras anlises da inativao do cromossomo X foi feita por Mary Lyon (1961), que observou os padres de colorao na pelagem de camundongos. Se o animal heterozigoto para um gene autossmico controlando a pigmentao do plo, ento ele se parece a um dos dois genitores ou tem uma cor intermediria. Em qualquer caso, o camundongo tem uma cor nica. Mas se um camundongo fmea heterozigoto para o gene da pigmentao no cromossomo X, o resultado diferente: faixas da cor de um dos genitores se alternam com outras da cor do outro genitor (Figura 11.16). Lyon props a seguinte hiptese para explicar esses resultados: 1. Muito precocemente no desenvolvimento de mamferos do sexo feminino, ambos cromossomos X so ativos. 2. Prosseguindo o desenvolvimento, um cromossomo X desligado em cada clula. 3. Essa inativao ao acaso. Em algumas clulas, o cromossomo X derivado do pai o inativado; em outras aquele proveniente da me. 4. Esse processo irreversvel. Uma vez que um cromossomo X foi inativado, o mesmo cromossomo X inativado em toda a prognie daquela clula. (As reas de pigmentao nesses camundongos so manchas amplas, no um padro de sal e pimenta.) Desse modo, todos os tecidos em fmeas de mamferos so mosaicos de dois tipos de clulas.
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Figura 11.17
Reteno da inativao do cromossomo X. Aproximadamente 30 clulas de uma mulher heterozigota para a deficincia de HPRT foram colocadas em uma placa de Petri e permitido o seu crescimento. As clulas foram visualizadas por auto-radiografia aps incubao em um meio contendo hipoxantina radioativa. Clulas com HPRT incorporam o composto radiomarcado em seu RNA e escurecem a emulso fotogrfica colocada sobre elas. Os clones de clulas sem HPRT parecem mais claros porque suas clulas no podem incorporar o composto radioativo. (De acordo com Migeon, 1971, cortesia de B. Migeon.)
Algumas das evidncias mais impressionantes em favor desse modelo vm de estudos bioqumicos em clones de clulas humanas. Em humanos, existe uma doena gentica- Sndrome de Lesch-Nyhan- que se caracteriza pela falta de uma enzima ligada ao cromossomo X, hipoxantina fosforibosiltransferase (HPRT). A sndrome de Lesch-Nyhan transmitida atravs do cromossomo X ou seja, homens que tm essa mutao em seu nico cromossomo X sofrem (e morrem) da doena. Em indivduos do sexo feminino, entretanto, a presena do gene mutante HPRT pode ser mascarada pelo outro cromossomo X, que carrega o alelo do tipo selvagem. Uma mulher que tem filhos com essa doena considerada uma portadora, pois ela tem um gene HPRT mutante em um cromossomo, e um gene HPRT do tipo selvagem no outro cromossomo X. Se a hiptese de Lyon correta, cada clula dessa mulher deveria estar produzindo HPRT ativa ou inativa, dependendo de qual cromossomo X est ativo. Barbara Migeon (1971) testou essa possibilidade tomando clulas da pele de uma mulher heterozigota para o gene HPRT e colocando-as em cultura. Cada uma dessas clulas se dividiu formando clones de clulas. Migeon usou mtodos de colorao para detectar a presena de HPRT tipo selvagem nesses clones, verificando que aproximadamente metade dos clones tinham a enzima e a outra metade no ( Figura 11.17). A hiptese de Lyon sobre a inativao do cromossomo X fornece uma excelente explicao sobre a inativao gnica diferencial a nvel da transcrio. Algumas excees em relao regra geral mostram ainda mais sua importncia. Primeiro, a inativao do cromossomo X somente se d em clulas somticas, no em clulas germinativas. Em clulas germinativas femininas, o cromossomo X inativo reativado imediatamente antes que as clulas entrem em meiose (Gartler et al., 1973; Migeon e Jelalian,1977; Kratzer e Chapman, 1981). Assim, em ocitos maduros, ambos cromossomos X esto ativos. Em cada gerao, a inativao do cromossomo X tem que ser renovada. Segundo, existem algumas excees regra do acaso no padro da inativao. A primeira inativao do cromossomo X no camundongo vista no trofectoderma, onde o cromossomo X paterno especificamente inativado (Tagaki, 1974; West et al., 1977). Terceiro, a inativao do cromossomo X no se estende a cada gene no cromossomo X humano. Existem vrios genes no brao curto do cromossomo X (como aquele codificando a sulfatase de esterides) que escapam da inativao relacionada dosagem (Mohandas et al., 1980; Brown e Willard, 1990), e mesmo no brao longo, existem alguns genes que so transcritos de ambos os cromossomos X em cada clula somtica feminina. Portanto, no homem, a heterocromatizao no se estende por todo o cromossomo X. A quarta exceo, na verdade, acaba provando a regra. Existem alguns mamferos machos, cujos padres da cor de pelagem no poderia ser encontrada a no ser que os animais exibissem inativao do cromossomo X. Felinos machos tipo malhado e casco de tartaruga esto entre esses exemplos. Esses modelos de pelagem com manchas so normalmente encontrados em fmeas e considerados resultantes de uma inativao ao acaso do cromossomo X. Mas raros machos exibem tambm esses tipos de pelagem. Como pode ser isso? Acontece que esses felinos so XXY. O cromossomo Y os torna machos (veja Captulo 20), mas um cromossomo X inativado, como nas fmeas, de modo que h somente um X ativo por clula (Centerwall e Benirschke, 1973). Dessa forma, esses felinos tm clulas com um corpo de Barr e inativao ao acaso do cromossomo X. Est claro, ento, que um dos mecanismos para o controle do nvel de transcrio da regulao gnica produzir um grande nmero de genes heterocromticos e portanto transcricionalmente inertes.
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&
Especulaes
O mecanismo de inativao do cromossomo X
de inativao do cromossomo X ainda no bem conhecido, mas pesquisa recente nos d algumas indicaes dos fatores que podem estar envolvidos na iniciao e manuteno de um cromossomo X heterocromtico.
MECANISMO
Iniciao da inativao do cromossomo X: O gene Xist As primeiras indicaes sobre a existncia de um iniciador na inativao do cromossomo X vieram de estudos genticos onde cromossomos X rearranjados em camundongos no podiam ser inativados (Russell, 1963; Cattanach et al., 1969; Mattei et al., 1981). Esses cromossomos no tinham uma certa regio, chamada posteriormente de centro de inativao do cromossomo X (XIC). Em 1991, Brown e seus colegas encontraram um transcrito de RNA originado unicamente de um cromossomo X inativo de humano. (Nos se-
res humanos, nos locos que escapam inativao do cromossomo X, ambos os cromossomos X sintetizam o transcrito. Aqui o transcrito provinha somente do X inativo.) Esse transcrito, XIST, estava sendo produzido por um gene dentro da regio XIC. Alm disso, esse transcrito no parece codificar uma protena. Ele permanece dentro do ncleo e interage com a cromatina X inativa do corpo de Barr (Brown et al., 1992). Uma situao similar existe no camundongo, onde o gene Xist do cromossomo X inativo sintetiza um RNA nuclear cuja seqncia no pode codificar uma protena* (Borsani et al., 1991; Brockdorrf et al., 1992). O gene Xist um excelente candidato para o iniciador da inativao do X. Primeiro, os transcritos do gene Xist so vistos em embries de camundongo antes da inativao do cromossomo X, o que seria de se esperar se o gene tem um papel em iniciar essa inativao (Kay et al., 1993). Segundo, derrubando um
Clulas germinativas: TATA Espermatozide TATA vulo DNA
Clulas somticas: X-inativo
TATA
loco de Xist em uma clula XX impedese a inativao do X naquele cromossomo (Penny et al., 1996). Terceiro, a transferncia de um segmento de 450 quilobases contendo o gene Xist do camundongo para um autossomo de clulas precursoras embrionrias masculinas causa a inativao aleatria daquele autossomo ou do cromossomo X endgeno (Lee et al., 1996). O autossomo contado como um cromossomo X. A expresso de Xist somente necessria para a iniciao da inativao do cromossomo X. Uma vez ocorrida a inativao ele se torna dispensvel (Brown e Willard, 1994). Ainda no se sabe o que o RNA do Xist faz para inativar o cromossomo. O loco do Xist est impresso nos gametas, e a impresso efetuada pela metilao diferencial na regio promotora do Xist. Durante a espermatognese, trs stios CG no promotor do Xist so desmetilados, enquanto que os mesmos stios so completamente metilados durante a oognese. Em clulas somticas, o gene Xist ativo (no cromossomo X inativo) praticamente no metilado, enquanto que o gene Xist inativo (no cromossomo X ativo) est completamente metilado (Figura 11.18; Norris et al., 1994; Ariel et al., 1995; Zuccotti e Monk, 1995). Esse padro de expresso do Xist mantido nos tecidos extra-embrionrios do camundongo (de tal modo que o Xist de origem paterna est desmetilado e ativo, levando inativao daquele cromossomo). Entretanto, as clulas do epiblasto embrionrio perdem os padres de impresso de seus ancestrais e reestabelecem as diferenas de metilao ao acaso.
*A lista de tipos de RNA est crescendo. Alm dos bem conhecidos mRNA, tRNA, rRNA e pequenos RNAs nucleares (envolvidos nas emendas de RNA), existem tambm RNA H19 e RNA Xist, nenhum dos quais codificam protenas. Em Captulos mais adiante discutiremos RNAs de controle de traduo (antisenso natural) e RNAs como X1srt usados para localizar mensagens para regies do citoplasma de ocitos. O embrio usa RNAs de maneiras muito mais criativas do que os organismos adultos.
TATA X-ativo Stios de correlao da transcrio do gene
Figura 11.18
Sumrio dos padres de metilao do Xist no espermatozide, vulo e dois cromossomos X em clulas somticas. Quadrados abertos representam stios CG no metilados; quadrados cheios representam stios CG metilados. As reas sombreadas indicam stios correlacionados com a transcrio dos genes. (De acordo com Zuccotti e Monk, 1995.)
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Impedindo a transcrio: O nucleossomo no acetilado. O que est impedindo que a transcrio do DNA do cromossomo X inativo seja como aquela do ativo? Um estudo recente de Jeppeson e Turner (1993) sugere que os cromossomos X ativo e inativo diferem entre si pela acetilao de suas respectivas histonas H4. Uma das melhores maneiras de liberar protenas do DNA adicionar cargas negativas s protenas. Isso pode ser feito adicionando grupos fosfato ou acetato s regies da protena ligante de DNA. A acetilao de histona H4 tem sido correlacionada a genes transcrevendo ativamente. Nucleossomos de regies promotoras com CG no metilados tm protenas H4 altamente acetiladas, e a acetilao da histona H4 se correlaciona com a ativao de certos genes (Chahal et al., 1980; Tazi e Bird, 1990). Alm disso, apesar do fator de transcrio TFIIIA no poder se ligar ao gene do RNA 5S se esse estiver envolvido em um nucleossomo, aquele fator pode se ligar ao gene se as histonas do nucleossomo estiverem acetiladas (Lee et al., 1993). A acetilao de histonas parece no ser obrigatria para a transcrio do gene, mas pode facilitar a transcrio em vrios sistemas (Turner, 1991). Usando um anticorpo que reconhece a histona H4 acetilada (mas no a no acetilada), Jeppesen e Turner encontraram que cromossomos X ativos, no homem e no camundongo, tm tanta histona H4 acetilada como a maioria dos outros cromossomos. Entretanto, o cromossomo X inativo tem pouqussima histona H4 acetilada (Figura 11.19). No se sabe como a expresso de Xist causaria a ocorrncia de H4 no acetilada nos nucleossomos do cromossomo X inativo. Trancamento dos padres de transcrio: metilao do DNA O trancamento do estgio transcricional inativo feito pela metilao. A primeira evidncia indicando tais cis diferenas entre o estado ativo e o inativo do DNA do cromossomo X foi obtida quando Liskay e Evans (1980) transfectaram o gene ligado ao X para HPRT para clulas de camundongo deficientes em HPRT em cultura. Quando o DNA vinha de um clone de clulas nas quais o gene para
(A)
(B)
Figura 11.19
O cromossomo X inativo de clulas de indivduos humanos do sexo feminino contm histonas H4 subacetiladas. (A) Esfregao metafsico de uma clula fibroblstica feminina humana corada com Hoechst 33258, que cora cromatina. (Cromossomos 7 e 11 esto numerados, e a seta aponta o X inativo.) (B) A mesma preparao corada com anticorpo fluorescente para a histona H4 acetilada. Enquanto todos os outros cromossomos esto claramente visveis o X inativo no est. (de Jeppesen e Turner, 1993; fotografias cortesia dos autores.)
HPRT estava no cromossomo X inativo, o DNA no produzia a enzima na clula hospedeira deficiente em HPRT. Entretanto, se o DNA era derivado do clone de clulas expressando o gene HPRT no seu cromossomo X ativo, as clulas transfectadas produziram HPRT desse gene. Logo em seguida, Mohandas e colegas (1981) demonstraram que 5-azacitidina (uma droga que inibe a citosina metiltransferase) poderia reativar localmente esses genes no cromossomo X inativo. Pesquisas posteriores, usando enzimas de restrio e sondas de cDNA, mostraram que as ilhas de CG nos stios promotores de vrios genes esto metilados no cromossomo X inativo e no metilados no cromossomo ativo (Wolf et al., 1982; Keith et al., 1986). Esses modelos de metilao so removidos durante a formao da clula germinativa, permitindo
assim que um novo padro de inativao do cromossomo X ocorra na prxima gerao. Durante o primeiro trimestre do desenvolvimento humano, estabelecido de novo o padro adulto de metilao e inativao do cromossomo X (Migeon et al., 1991).* Ainda no conhecemos o mecanismo pelo qual o transcrito de Xist regula o estado da cromatina e como se d o espalhamento da inativao. Tambm, ainda no conhecemos as vias pelas quais a transcrio de Xist, a modificao dos nucleossomos e a metilao do DNA se relacionam heterocromatizao de um cromossomo X. Ainda no sabemos como feita originalmente a escolha entre os dois cromossomos X ou como o RNA de Xist transcrito de uma regio rodeada por genes inativados. Ainda h muito que aprender a respeito desse crtico fenmeno nos mamferos.
*Como mencionado em captulos anteriores, difcil extrapolar de um grupo de mamferos para outro. Certamente o caso da inativao do cromossomo X. Somente porque a inativao do cromossomo X acontece dessa maneira na placenta do camundongo, no significa que acontece da mesma maneira na placenta de todos os mamferos. Nas vilosidades corinicas humanas, algumas clulas contm dois cromossomos X ativos, e os cromossomos X inativados podem ser reativados (Migeon et al., 1985, 1986). Tambm a inativao do cromossomo X na placenta humana parece ser ao acaso; qualquer um dos dois cromossomos derivados do pai ou da me podem ser extintos. Nos marsupiais, o cromossomo X derivado do pai preferencialmente inativado em todo o embrio (Cooper et al., 1971; Sharman, 1971; Samollow et al., 1987). No homem, existem regies bvias do cromossomo X que escapam inativao. As diferenas somticas entre humanos com os caritipos XX e XO tambm predizem que devem existir genes ligados ao X que seriam necessrios em duas doses para o desenvolvimento normal de mulheres. No camundongo, a inativao do cromossomo X parece se estender ao cromossomo todo (Ashworth et al., 1991). Na determinao do sexo (Captulo 20), crucial que os genes para a compensao de dosagem do X sejam ligados aos genes responsveis pelo fentipo sexual. Se a dosagem no equalizada, o embrio geralmente morre.
451
Associao do DNA ativo com a matriz nuclear

Ligao da cromatina ativa a uma matriz nuclear As enzimas de replicao dentro do ncleo, de alguma maneira, devem encontrar seus stios para a iniciao da sntese de DNA; os fatores de transcrio e as polimerases devem encontrar seus promotores e intensificadores; os fatores de processamento de RNA devem encontrar seus stios de emendas no RNA; e o RNA mensageiro deve eficientemente encontrar os poros atravs dos quais ele sair do ncleo. Isso muito para se esperar de molculas em soluo. Deveria se esperar que os vrios fatores envolvidos na transcrio estivessem flutuando no fluido nuclear trombando ao acaso no DNA. O RNA assim formado seria ento emendado e estaria se movimentando no ambiente nuclear, ao acaso, at encontrar um poro atravs do qual deixaria o ncleo. Um modelo alternativo sugere que o RNA transcrito em um substrato slido no qual todas as enzimas necessrias para transcrio, processamento e transporte esto situadas juntamente. Existem precedentes para pensar nesses termos. A cadeia de transporte de eltrons das mitocndrias um agregado com tal ordenao, e conhecido h muito tempo que as enzimas de sntese de DNA em bactrias residem na face interna da membrana celular. Ento, o que se deve perguntar o seguinte: Existe um retculo nuclear onde tais enzimas poderiam ser encontradas? Se existe tal rede, esto os genes transcricionalmente ativos nela localizados? Se tal rede existe, esto as enzimas de sntese de RNA nela localizados? Uma matriz nuclear pode ser isolada dissolvendo ncleos em detergentes lipdicos e solubilizando a maior parte do DNA com DNases (Berezney e Coffey, 1977; Capco et al., 1982). Microscopia eletrnica de transmisso de tais complexos mostra um emaranhado de protenas que se estende atravs do ncleo e se conecta ao citoesqueleto no envoltrio nuclear (Figura 11.20). Essa matriz vista em todos os ncleos eucariotos at agora examinados (Wilson, 1985; Nelson et al., 1986). Quando se isola tal matriz, a DNase j removeu cerca de 98% do DNA. Est o DNA ainda ligado a essa matriz (e presumivelmente protegido da DNase por estar to fortemente associado matriz) enriquecida para transcrever genes ativamente? Existe evidncia que isso verdade para alguns genes. O gene da ovalbumina preferencialmente associado com a matriz nuclear em clulas do oviduto de galinhas adultas mas no em clulas do fgado ou eritrcitos na mesma espcie. Os genes da globina, entretanto, no esto associados com a matriz nuclear das clulas do oviduto (Robinson et al., 1982; Thorburn e Knowland, 1993). Ciejek e colaboradores (1983) confirmaram e estenderam essas observaes, mostrando que a unidade inteira da transcrio induzvel por hormnio do gene da ovalbumina est ligado matriz nuclear. Dentro de 100.000 pares de bases dessa unidade nenhum outro gene est associado a essa matriz. Alm disso, quando o estrgeno foi retirado dos animais, a conexo especfica desses genes matriz nuclear foi abolida. Os genes parecem estar ligados matriz nuclear somente quando esto ativados. Em 1985, Hutchinson e Weintraub mostraram que stios sensveis DNase no so encontrados uniformemente por todo o ncleo. Eles trataram ncleos com DNase I e ento repararam os cortes com nucleotdeos radioativos. O DNA marcado deveria representar somente os genes transcrevendo ativamente (ou seja, sensveis DNase I). Os resultados desse tratamento mostraram que o DNA sensvel DNase I estava localizado na periferia do ncleo e ao longo dos canais ou fibras que se ligavam ao envoltrio nuclear (Figura 11.21). Ento, possvel que genes ativos esto especificamente associados ao envoltrio nuclear ou matriz. Outro tipo de evidncia indicando a participao da matriz nuclear na transcrio a demonstrao de que a maioria do RNA recm-sintetizado (alguns consideram 95%) parece estar ligado matriz nuclear (Herman et al., 1978; Miller et al., 1978;
Figura 11.20
Micrografia de transmisso eletrnica (47.000x) de uma poro da matriz nuclear e citoplasma ao redor. Filamentos do citoesqueleto so claramente visveis. As clulas fibroblsticas do camundongo foram extradas com detergente para remover lipdios e em seguida tratadas com DNase I. Em 1895, E. B. Wilson, usando o microscpio de luz, relatou que o ncleo era atravessado por fibras que eram contnuas com aquelas do retculo citoplasmtico e que rodeavam a cromatina. (de Capco et al., 1982, cortesia de S. Penman.)
452
(A)
(B)
Alas de DNA cromossmico conectadas matriz nuclear atravs de origens de replicao. O empacotamento em nucleossomos e fibras de 30nm no mostrado para simplificao Genes ativos ligados aos canais da matriz atravs de domnios reguladores e RNA polimerase temporariamente imobilizada
Figura 11.21 Presena de cromatina ativa ao longo da periferia e canais nucleares. (A) Ncleos de eritrcitos tratados com DNase I, que parecem cortar regies de cromatina transcrevendo ativamente. Esse corte foi curado por traduo de corte dentro do ncleo em presena de nucleotdeos, cuja presena pode ser detectada por fluorescncia. Os nucleotdeos marcados foram encontrados na periferia do ncleo e ao longo de estruturas levando para dentro a partir do envoltrio nuclear. (B) Modelo especulativo da organizao da cromatina na interfase, imaginando a matriz nuclear como uma srie de canais internos. (A de Hutchinson e Weintraub, 1985, cortesia de N. Hutchinson; B de acordo com Razin e Gromova, 1995.)
Canal da matriz nuclear mRNA coberto com protenas
DNA
RNA sendo transportado para o citoplasma
Matriz nuclear
Citoplasma
Poro nuclear
van Eekelen e van Venrooij, 1981; Mariman et al., 1982). Essa ligao parece ser mediada por um conjunto de protenas da matriz nuclear. Essas protenas incluem laminina B1, um componente principal do envoltrio nuclear (Ludrus et al., 1992), uma protena ligante de DNA especfica do timo que desenrola o DNA adjacente ao seu stio de ligao (Dickinson et al., 1992), e o fator de transcrio YY1/NF-E1 que foi considerado idntico protena 1 da matriz nuclear (NMP-1) (Guo et al., 1995). Considerando que genes ativos, RNA polimerase, e transcritos nascentes parecem estar ligados a uma matriz nuclear, Jackson e Cook (1985) propuseram que a transcrio no ocorre pela migrao de uma polimerase ao longo do gene. Ao contrrio, eles imaginaram uma RNA polimerase acorrentada matriz nuclear, com o DNA migrando atravs dela. Existe tambm alguma evidncia de que o DNA ativo possa estar ligado matriz nuclear atravs de seqncias de DNA ricas em AT e denominadas regies associadas matriz (MARs), ou regies associadas a andaimes (Gasser e Laemmli, 1986). A maior parte dessas MARs se localizam perto ou dentro de intensificadores ou promotores. A importncia dessas regies foi mostrada por Stief e colaboradores (1989), que identificaram duas MARs no gene da lisozima do pinto. Nesse caso, as MARs no estavam no intensificador e por essa razo puderam ser separadas. Quando eles fundiram o intensificador e o promotor da lisozima do pinto ao gene CAT reprter e transfectaram o clone em clulas produtoras de lisozima, isso no produziu muita protena CAT. Ento eles produziram um gene similar que continha o promotor, o intensificador e seqncias CAT e o conjunto foi flanqueado por duas MARs. Quando
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Figura 11.22
Intensificador Promotor
Gene CAT
Importncia das regies associadas matriz na transcrio. Na transfeco de clones consistindo de promotor da lisozima, intensificador e o gene CAT, para uma linhagem celular secretora de lisozima, muito pouca protena CAT produzida, como determinado pela atividade enzimtica de CAT. Entretanto, se as duas MARs so includas no gene clonado, muito mais protena CAT pode ser encontrada nessas clulas. (De acordo com Stief et al., 1989.)
Regio associada matriz
Topoisomerase II Produtos
Substrato Resultados da transfeco
Stios de ligao para topoisomerase II
esse clone foi transfectado em clulas produtoras de lisozima, a sntese de CAT foi enormemente aumentada (Figura 11.22). Da mesma forma, duas MARs flanqueiam um intensificador do loco da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo, e a transcrio desse gene requer a presena tanto do intensificador como das duas MARs. As MARs parecem cooperar com o intensificador para estender uma regio de cromatina acessvel a fatores, ao promotor do gene da imunoglobulina (Forrester et al., 1994; Jenuwein et al., 1997). Topoisomerases e transcrio gnica Em vrios estudos, foram identificadas regies associadas matriz que continham ou eram adjacentes a uma seqncia de DNA que reconhecida por uma enzimatopoisomerase II que pode ser essencial transcrio (Cockerill e Garrard, 1986; Adachi et al., 1989; Scheuermann e Chen, 1989). Estudos recentes sugeriram que desenrolar a hlice de DNA importante para a facilitao da transcrio. Cromatina ativa transcricionalmente tem que ser torcida para permitir o desenrolar das fitas (Ryoji e Worcel, 1984), e a toro realizada por superespiralamento da hlice de DNA (Figura 11.23). Villeponteau e colaboradores (1984) mostraram que stios sensveis DNase I em genes ativos so formados somente quando os genes esto sob tenso torcional. A topoisomerase II a enzima responsvel pela toro do DNA e separao das fitas. Usando anticorpos para essa protena, Berrios e colegas (1985)
RNA polimerase
Superespiral negativa
Figura 11.23
Superespiralamento do DNA durante a transcrio. Topoisomerase II junta duas regies do DNA e introduz o superespiralamento quebrando transitoriamente e recombinando as fitas de DNA. Como resultante da distoro, uma poro da dupla hlice se separa em duas fitas, permitindo RNA polimerase (e presumivelmente a outros fatores trans-reguladores) iniciar a transcrio. Os stios de ligao da topoisomerase foram encontrados no DNA ligado matriz (Cockerill e Garrard, 1986). (De acordo com Darnell et al., 1986.)
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Figura 11.24
Uma das quatro regies do intensificador do gene de cadeia pesada da imunoglobulina protegida pela protena NF-NR. NF-NR foi adicionada ao DNA da regio do intensificador e o DNA foi digerido com DNase. Somente as seqncias cobertas pela NF-NR seriam preservadas. A regio protegida (cinza) inclui uma seqncia associada matriz e um stio de ligao da topoisomerase II (colorido). (De acordo com Scheuermann e Chen, 1989.)
Stio de ligao da topoisomerase
Seqncia de ligao matriz
Protegida por NF-NR
demonstraram que a topoisomerase II est localizada no complexo matriz nuclearenvoltrio nuclear. A proximidade entre as MARs e as regies de ligao da topoisomerase II sugerem que a ancoragem do DNA matriz deve ser necessria para impedir a rotao livre do DNA, permitindo assim que as topoisomerases ligadas matriz toram a cromatina (Bode et al., 1992). Se a ligao matriz essencial para a transcrio do RNA, possvel que protenas reguladoras negativas como os silenciadores possam inibir essa associao. Essa possibilidade foi sugerida por Scheuermann e Chen (1989), que isolaram uma protena que inibe a transcrio do gene de cadeia pesada da imunoglobulina. Essa protena, NF-NR, expressa em clulas no B e nos estgios precoces do desenvolvimento da clula B, mas est ausente em clulas B maduras que transcrevem grandes quantidades de genes da imunoglobulina. Essa protena se liga em quatro locais flanqueando o intensificador da cadeia pesada: duas seqncias de consenso MAR e duas seqncias de consenso topoisomerase II ( Figura 11.24). possvel que, com a presena de NF-NR no ncleo, essa se ligue s regies flanqueando o intensificador e impea a associao do gene de cadeia pesada da imunoglobulina com a matriz nuclear e a topoisomerase. Quando a protena no est presente, essas associaes no ocorrem resultando na transcrio do gene. A demonstrao de que a protena da matriz nuclear NMP-1 a mesma que o fator de transcrio YY1 especialmente interessante, pois YY1 foi implicado no silenciamento do gene de -globina uma vez que os genes da -globina so expressos (Raich et al., 1995; Wandersee et al., 1996).
Isoladores e domnios
O genoma eucarioto no meramente parcelado em determinados genes. Na verdade, ele parece estar dividido em regies de desenvolvimento relativamente independentes freqentemente denominadas domnios. Evidncia para os domnios veio de estudos onde blocos de DNA foram colocados prximos a genes reprteres que podiam ser normalmente ativados por um intensificador. Certas seqncias impediram o intensificador de ativar o gene reprter, enquanto que outras seqncias no o fizeram (Geyer e Corces, 1992). Foi proposto que essas seqncias isoladoras ligam protenas que impedem a interao de intensificadores e promotores no seu outro lado. Desse modo, elas poderiam estabelecer fronteiras: a ativao poderia ocorrer em um de seus lados, mas no cruzar para o outro lado. Algumas dessas seqncias fronteirias foram isoladas de DNA de Drosophila, como tambm algumas das protenas ligantes. Kellum e Schedl (1991) mostraram que o gene hsp70 (para a protena do choque trmico em Drosophila) estava confinado por duas seqncias, scs e scs, que impediam os efeitos da cromatina adjacente de influenciar sua transcrio. Zhao e colegas (1995) identificaram uma protena de 32-kDa que se liga ao elemento de fronteira scs e est localizada entre as bandas de numerosos genes na Drosophila (veja Prancha 31; Zhao et al., 1995). Isso pode ser visto quando os genes formam tufos e a colorao dessas protenas as mostram nas bordas dos tufos. O stio scs no complexo Bithorax parece estar localizado aps o ltimo gene (AbdB), de modo que a unidade inteira possa ser regulada como um nico loco gentico.
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Resumo
A transcrio gnica diferencial uma via majoritria na regulao do desenvolvimento. As regies cis-reguladoras no DNA e as protenas trans-reguladoras que ativam e reprimem a transcrio esto sendo identificadas e seus mecanismos de ao delineados. Parece que certos fatores de transcrio rompem ou previnem a formao de nucleossomos nos intensificadores e regies promotoras, assim permitindo a ligao da RNA polimerase II ao promotor e a transcrio do gene. Certos fatores de transcrio estimulam o processo interagindo com o complexo transcricional e acelerando sua formao. A desmetilao e o desenrolamento de regies genticas na matriz nuclear provavelmente tambm esto envolvidas na regulao da expresso gnica. Como disse Albert Claude, ns apenas comeamos a apreciar nossa riqueza adquirida.
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Controle do desenvolvimento pelo processamento e traduo diferencial do RNA

Entre a concepo E a criao... Entre a potncia E a existncia Entre a essncia E a origem Cai a Sombra.
T. S. ELIOT (1936)
12
No h descanso para o mensageiro at a mensagem ser entregue.

JOSEPH CONRAD (1920)
rencial do DNA. Mesmo que um determinado transcrito de RNA seja sintetizado, no h garantia que ele ir criar uma protena funcional na clula. Para se formar uma protena ativa, o RNA tem que ser: (1) processado em um RNA mensageiro pela remoo de ntrons, (2) trasladado do ncleo para o citoplasma, e (3) traduzido pelo aparelho sintetizador de protenas. Em alguns casos, a protena sintetizada no est em sua forma madura e (4) tem que ser modificada, aps a traduo, para tornar-se ativa. A regulao pode ocorrer em qualquer um desses passos durante o desenvolvimento.
REGULAO DA EXPRESSO GNICA no est restrita transcrio dife-
CONTROLE DO DESENVOLVIMENTO PELO PROCESSAMENTO DIFERENCIAL DE RNA

A essncia da diferenciao a produo de diferentes conjuntos de protenas em diferentes tipos de clulas. Nas bactrias, a expresso diferencial de genes pode ser efetuada a nvel da transcrio, traduo e modificao das protenas. Nos eucariotos, porm, outro nvel possvel de diferenciao existe, a saber, o controle ao nvel do processamento e transporte de RNA. Este captulo ir apresentar duas maneiras pelas quais o processamento diferencial do RNA pode regular o desenvolvimento. A primeira envolve a censura pela qual transcritos nucleares podem ser processados em mensagens citoplasmticas. Aqui, diferentes clulas podem selecionar diferentes transcritos nucleares para ser processados e colocados no citoplasma como o RNA mensageiro. O mesmo pool de transcritos nucleares pode, com isso, dar origem a diferentes populaes de mRNAs citoplasmticos em diferentes tipos de clulas. O segundo modo de processamento diferencial do RNA se refere a emendar precursores de mRNA em protenas diferentes usando diferentes combinaes de xons em potencial. Se um precursor de mRNA deve passar a ter cinco xons em potencial, uma clula poderia usar xons 1, 2, 4 e 5, uma outra clula poderia utilizar xons 1, 2 e 3, e ainda outra clula poderia usar uma combinao diferente. Assim, um gene pode criar uma famlia de protenas relacionadas.
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Controle do desenvolvimento precoce pela seleo de RNA nuclear

Em fins da dcada de 70, numerosos investigadores acharam que o mRNA no era o transcrito primrio dos genes. Ao contrrio, os genes transcreviam um RNA nuclear (nRNA), s vezes chamado RNA nuclear heterogneo (hnRNA) devido ao seu amplo espectro de tamanhos. Esse nRNA era freqentemente vrias vezes mais comprido que a mensagem, e parecia decair mais rapidamente. Hoje sabemos que o RNA nuclear contm ntrons que so excisados durante a passagem do ncleo para o citoplasma. Ainda, estudos em ourios-do-mar sugeriram que transcritos inteiros so degradados em algumas clulas e processados para mRNA em outras. Em outras palavras, esses estudos sugeriram que diferentes tipos celulares podem estar transcrevendo o mesmo tipo de RNA nuclear, mas que diferentes subconjuntos dessa populao esto sendo processados para mRNA em diferentes tipos de clulas. [RNA1.html] Kleene e Humphreys (1977, 1985) mostraram que o RNA nuclear de larvas pluteus intactas e de blstulas eram (dentro do erro experimental) idnticos. Ambos se ligavam aos mesmos 30% do genoma. Quando a complexidade foi analisada, o nRNA de clulas da blstula ligava-se a 15 porcento desse DNA (i.e., a 30% do DNA de cpia nica do genoma). Semelhantemente, o nRNA do estgio plteo, mesmo quando presente em grande excesso, tambm se ligava aos 30 porcentos do DNA de cpia nica. Sero esses dois conjuntos de seqncias de DNA os mesmos, ou sero diferentes? Essa questo foi examinada misturando-se RNAs nucleares de blstula e plteo e adicionando-os ao DNA de cpia nica desnaturado. Se as seqncias fossem completamente diferentes, poder-se ia esperar 30 porcento do DNA estar combinado (i. e., 60 porcento do genoma estaria codificando para o conjunto combinado de mensagens de blstula e plteo). Se fossem idnticos, poder-se ia esperar 15 porcento do DNA estar ligado. O resultado est mostrado na Figura 12.1. A mistura ligou-se somente a 15 porcento do DNA. As seqncias de nRNA de blstula e plteo se ligavam ao mesmo DNA. Dentro do erro experimental, o nRNA de clulas da blstula e do plteo eram idnticos. Wold e colegas (1978) estenderam essas observaes mostrando que seqncias presentes no RNA mensageiro da blstula (isolado de polissomos em traduo) mas ausentes no mRNA da gstrula e do tecido adulto estavam, apesar disso, presentes no RNA nuclear da gstrula e do tecido adulto. Esses resultados foram interpretados como indicando que mais genes so transcritos no ncleo do que aqueles permitidos se tornarem mRNAs no citoplasma (Figura 12.2; Tabela 12.1).
Figura 12.1
Hibridizao de RNA nuclear de embries de ourio-do-mar com [3H]DNA de cpia nica. DNA de cpia nica radioativo foi misturado com RNA de blstula, RNA de plteo ou RNA da mistura de blstula e plteo. As misturas foram incubadas para permitir o pareamento de todas as seqncias complementares. (O eixo RNA Cot a concentrao do RNA vezes o tempo deixado para incubar). Nos trs casos, cerca de 15 porcento do DNA hibridizou com o RNA. (Segundo Kleene e Humphreys, 1977.)
Porcentagem de [3H]DNA nos hbridos RNA:DNA
RNA de blstula + plteo RNA de blstula
RNA de plteo
CAPTULO 12 Processamento diferencial do RNA e Traduo
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Tabela 12.1 Comparaes entre tecidos das seqncias de genes estruturais em RNA mensageiros e RNA nucleares Reao normalizada com mRNA parental Pista referencial complementar a OURIO-DO-MAR mRNA de blstula (DNA de cpia nica) CAMUNDONGO mRNA cerebral (cDNA total) mRNA cerebral (cDNA representando mensagens raras) Fonte: Davidson e Britten, 1979. mRNA Blstula % 100 Reao normalizada com outro mRNA mRNA Intestino Celomcito Rim Rim % 12 13 78 56 Reao normalizada com nRNA nRNA Intestino Celomcito Rim Rim % 97 101 102 100
Crebro Crebro
100 100
(A)
Complexidade do RNA (106 nucleotdeos)
mRNA das blstula
Porcentagem de [3H]DNA reativo nos hbridos RNA:DNA
RNA do citoplasma intestinal
Figura 12.2
(B) (C) Clula tipo 1
Clula tipo 2
nRNA do celomcito nRNA da gstrula nRNA do intestino
Seqncias encontradas no RNA nuclear de vrios tipos de clulas mas no no mRNA. (A) Especificidade do cDNA mensageiro da blstula do ourio-do-mar. Hibridizao do cDNA mensageiro da blstula (cDNA ao mRNA da blstula) com mRNA de blstula e RNA do citoplasma intestinal mostra que os mRNAs so muito diferentes. (B) A hibridizao do cDNA mensageiro da blstula com RNAs nucleares (nRNAs) de gstrulas e celomcitos adultos e clulas intestinais sugere a identidade de todos os RNAs nucleares. (C) Modelo especulativo baseado no processamento diferencial do RNA. Em ambos tipos celulares, os mesmos RNAs (a, b, c, d, e) so transcritos, mas em um tipo celular, as seqncias c, d e e so processadas para mRNA citoplasmtico, enquanto em outro tipo de clula, seqncias a, b e c so processadas e enviadas para o citoplasma. (A e B segundo Wold et al., 1978.)
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Figura 12.3
Ensaios para deteco do acmulo de uma mensagem no citoplasma. (A) Ensaio de proteo de ribonuclease. RNA isolado e purificado de tecido embrionrio. Uma sonda de RNA radioativo sintetizada, complementar a um pequeno trecho do RNA que est sendo analisado. Se o RNA especfico estiver presente, a sonda radioativa se ligar a ele. RNase adicionada em seguida, destruindo todo o RNA exceto aquele da regio de dupla fita que contm o oligonucleotdeo radioativo. Esse pode ser submetido eletroforese em gel e auto-radiografado. (B) Ensaio nuclear runon (isola o ncleo e usa marcador radioativo para marcar o transcrito). Ncleos so isolados de tecido embrionrio. UTP radioativa adicionada aos ncleos. O mRNA que est sendo sintetizado incorpora a marca radioativa enquanto continua sendo transcrito. O mRNA pode ser isolado e hibridizado com seqncias complementares de DNA imobilizadas em papel. Se o transcrito radioativo ligar, ser detectado por auto-radiografia.
Dividir o tecido em duas amostras
(A) Ensaio de proteo de RNase
(B) Ensaio run-on nuclear
Isolar RNA
Isolar ncleos Ncleo
RNA polimerase Adicionar oligonucleotdeo radioativo Transcrito nascente de RNA Adicionar UTP radioativo
Ajunte RNase; RNA degradado
Poro radioativa de RNA Isolar RNA; hibridizar para DNA por transferncia Southern
Eletroforese em gel
Auto-radiografia
Filtro de papel
Auto-radiograma
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Esse controle ps-transcricional do processamento do RNA foi confirmado para mensagens especficas por ensaios de proteo de ribonuclease e ensaios run-on (isola-se o ncleo e usa-se marcador radioativo para marcar o transcrito) de transcrio nuclear. O ensaio de proteo de ribonuclease um teste sensvel para determinar a presena (ou ausncia) de uma determinada seqncia em uma populao de RNAs (Figura 12.3). Produz-se um RNA relativamente pequeno, marcado radiotivamente, que complementar a uma seqncia especfica do RNA que se deseja detectar. Essa sonda de RNA misturada com o RNA celular que est sendo testado para a presena de uma determinada sequncia. Se a seqncia estiver presente, a sonda se liga ela. Ento, ribonuclease (RNase, uma enzima que digere RNA de cadeia nica) adicionada mistura para clivagem e remoo de todo o RNA que no est hibridizado. O RNA de dupla fita formado pela hibridizao dos RNAs radioativo e celular no clivado. Esse RNA de dupla fita pode ser corrido em um gel e detectado por autoradiografia. Se a seqncia de RNA estiver presente, uma banda de um determinado tamanho dever aparecer na auto-radiografia. Gagnon e colaboradores (1992) realizaram essa anlise nos transcritos dos genes Spec1 e CyllIa do ourio-do-mar Strongylocentrotus purpuratus. Esses genes codificam protenas ligantes de clcio e actina, respectivamente, que so expressas somente no ectoderma aboral da larva plteo. Usando sondas que se ligam a um xon e a um ntron, eles acharam que esses genes estavam sendo transcritos no apenas nas clulas ectodrmicas mas tambm no mesoderma e endoderma. A anlise do gene CyIIIa mostrou que a concentrao de ntrons era a mesma tanto no ectoderma da gstrula como nas amostras de mesoderma e endoderma, sugerindo que esse gene estava sendo transcrito com a mesma velocidade em todos os tipos celulares (Figura 12.4A). O xon, porm, se acumulava no ectoderma (que expressa a protena), mas no no mesoderma ou endoderma (que no o fazem). Assim, enquanto os genes parecem ser transcritos com velocidades semelhantes no ectoderma e outros tecidos, o mRNA para essas protenas (representado pelos xons) se acumula somente no ectoderma. Essa concluso foi confirmada quando ncleos foram isolados de tecidos da gstrula. UTP radioativo permitiu aos pesquisadores seguir qualquer RNA que estivesse sendo transcrito no momento em que os ncleos foram isolados. Tanto os ncleos do ectoderma como endoderma/mesoderma estavam transcrevendo o gene Spec1 no estgio de gstrula (Figura 12.4B). Assim, a expresso dos genes Spec1 e CyIIIa est no nvel do processamento de RNA na gstrula. Mais tardiamente no desenvolvimento (no estgio plteo), esses genes ficam sob o controle transcricional, no qual a transcrio dos genes cessa nas clulas que no esto expressando essas protenas. Parece, assim, que o processamento de RNA tem um papel majoritrio no controle da expresso gnica em embries precoces do ourio-do-mar.
(A)
ntron Cyllla
xon Cyllla
Ectoderma (B)
Endoderma + mesoderma Vetor Spec1
Figura 12.4
Regulao da expresso do gene especfico do ectoderma por processamento de RNA. (A) Auto-radiografias do ensaio de proteo de ribonuclease. A coluna esquerda representa RNA isolado do tecido ectodrmico da gstrula; a coluna do lado direito representa RNA isolado dos tecidos endodrmicos e mesodrmicos. A banda superior o RNA protegido por uma sonda que se liga a uma seqncia de ntron (que deve ser encontrada somente no ncleo) de Cyllla. A banda inferior representa o RNA protegido por uma sonda complementar a uma seqncia de xon. (B) Resultados de um ensaio run-on de um transcrito nuclear. RNAs radioativos sintetizados in vitro por ncleos ectodrmicos (esquerda) e ncleos mesodrmicos e endodrmicos(direita) foram hibridizados com um ntron do gene Spec1 afixado a um filtro. Ncleos tanto do ectoderma como endoderma/mesoderma estavam transcrevendo esse gene na gstrula do ourio-do-mar, apesar da mensagen Spec1 ser vista somente nas clulas do ectoderma. (de Gagnon et al., 1992, cortesia de R. e L. Angerer.)
Os mecanismos de emenda de RNA: Spliceosomes

A emenda do pr-mRNA mediada atravs de uma partcula nuclear 60S chamada spliceosome. O spliceosome composto de cinco RNAs nucleares pequenos (sn) (os snRNAs U1, U2, U4, U5 e U6) e numerosas protenas. Essas protenas freqentemente se associam aos snRNAs para formar pequenas partculas nucleares de ribonucleoprotenas (snRNPs), assim chamadas por seus snRNAs associados (tal como o snRNP U2). O spliceosome no existe como um complexo pr-formado boiando no ncleo, mas reunido no pr-mRNA por um processo de mltiplas etapas. O local da emenda 5 primeiramente identificado pelo snRNA U1 por complementaridade de bases. O local da emenda 5 no comeo de cada ntron tem uma seqncia consensual que reconhecida pelo snRNA U1 (Figura 12.5). O final 3 do ntron reconhecido pelo fator auxiliar snRNA U2, U2AF (Ruskin et al., 1988; Wu e Maniatis, 1993). Esse reconhecimento do local da emenda estabelece um complexo de comprometimento onde outros snRNAs iro se associar com essas protenas e finalmente catalisar a remoo do ntron (Hodges e Beggs, 1994). [RNA2.html]
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PARTE III Mecanismos da Diferenciao Celular O pr-mRNA vertebrado mdio consiste de xons relativamente curtos (em mdia cerca de 140 bases), separados por ntrons que so usualmente muito mais compridos. Qualquer mecanismo coordenador das emendas em um RNA multi-xon tem que prover uma explicao de como xons pequenos so conservados e separados dos ntrons grandes. Berget (1995) props a noo que a emenda feita de um terminal do xon para o outro, em vez de atravs do ntron. Essa hiptese da definio do xon sustenta que o tamanho reduzido dos xons permite ao snRNA U2 (no terminal 5 do xon) conectar-se com o snRNA U1 no outro terminal. Seguindo essa definio dos limites do xon, os vrios xons so ajuntados. O processamento de mRNA maduro tambm requer a adio de uma cauda poli (A) ao mRNA nuclear. O terminal 3 da maioria dos mRNA eucariticos (mensagens de histonas sendo as nicas excees conhecidas) formado pela clivagem do transcrito original e adio de segmentos de resduos de adenilato. A regio 3 no-traduzida da maioria dos precursores do mRNA contm a seqncia AAUAAA, que essencial para a clivagem do RNA, 10 a 30 bases a jusante desse stio (Proudfoot e Brownlee, 1976). Mutaes nessa seqncia previnem a formao do terminal 3 do mRNA (Wickens e Stephenson, 1984; Orkin et al., 1985). Outro elemento de atuao cis uma seqncia rica em GU ou U, usualmente localizada mais a jusante (3) da clivagem. Essa seqncia parece ser crtica para a clivagem eficiente do RNA nuclear no stio de processamento 3 (McDevitt et al., 1984; Christofori e Keller, 1988). [RNA3.html]
COMPLEXO DE COMPROMETIMENTO ntron
xon xon
SPLICEOSOME xon
xon
Emenda alternativa do RNA: Criando protenas alternativas a partir do mesmo gene

Um Gene, Muitas Protenas Relacionadas Em adio deciso sobre quais RNAs tero entrada no citoplasma, a regulao do desenvolvimento pelo processamento do RNA tambm pode ocorrer pela emenda alternativa do RNA. A maioria dos pr-mRNAs mamferos contm numerosos ntrons. Pelo seu reconhecimento seletivo pode-se ter uma emenda alternativa do RNA. Isso pode ocorrer de vrias maneiras (ver Figura 12.6). As clulas podem diferir em sua habilidade de reconhecer o stio de emenda 5 ou o stio de emenda 3. Ou algumas clulas poderiam no reconhecer uma seqncia como um ntron, conseqentemente retendo-o dentro da mensagem. Se uma clula vai reconhecer os stios das emendas, depende de certos fatores no ncleo que podem interagir com esses stios e competir ou cooperar com as protenas que normalmente os reconhecem. O stio de emenda 5 reconhecido pelo snRNA U1, mas somente com a cooperao de uma protena chamada fator 2 de emenda (SF2; fator de emenda alternativa). Em pelo menos alguns casos, a escolha entre os stios da emenda 5 alternativo influenciada pela razo da protena SF2 e outra protena, hnRNP-A1. Em geral, um excesso de SF2 resulta na utilizao do stio de emenda 5 proximal (mais prximo), enquanto um excesso de hnRNP-A1 resulta na utilizao pelo spliceosome do stio de emenda 5 distal (mais distante) (Mayeda e Krainer, 1992). A escolha de stios de emenda 3 alternativos muitas vezes controlada por aquele stio de emenda que melhor pode ligar U2AF. O que um ntron no ncleo de uma clula pode ser um xon no ncleo de outra clula. Processamento alternativo de RNA foi encontrado controlando as formas alternativas de expresso de mais de 100 protenas. Deleo de certos xons em potencial em algumas clulas mas no em outras permite a um gene criar uma famlia de protenas estreitamente relacionadas. Em vez de um gene-um polipeptdeo pode-se ter um gene-uma famlia de protenas. Por exemplo, o precursor mRNA para a molcula de adeso N-CAM pode ser alternadamente processado para mais de 100 formas diferentes, dependendo de quais xons so includos no mRNA. Embora somente quatro formas principais dessa protena so usual-
xon
xon
ntron
Figura 12.5
Emendar o ntron e conectar os xons adjacentes. No complexo de comprometimento levando formao do spliceosome, as duas junes de emenda 5 e 3 no ntron foram reconhecidas pelo snRNA U1 e pela protena U2AF, respectivamente. Ambas so estabilizadas por protenas da famlia SR. As protenas U2AF e SR so consideradas ser substitudas por riboprotenas nucleares pequenas (snRNPs) que facilitam a clivagem do ntron e a ligao de dois xons adjacentes. (Segundo Hodges e Beggs, 1994.)
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EMENDA CONSTITUTIVA
TIPOS SELECIONADOS DE EMENDA ALTERNATIVA xons emendados
Figura 12.6
Diagrama esquemtico da emenda alternativa do pr-mRNA. xons esto representados como caixas sombreadas, xons emendados alternativamente esto representados por caixas hachuradas, e ntrons esto representados por linhas grossas. Por conveno, a trajetria da emenda mostrada por linhas finas em forma de V. (A) As bordas xon-ntron, mostrando as seqncias consensuais nos terminais 3 e 5 do ntron. R representa qualquer purina, Y qualquer pirimidina, e N qualquer nucleotdeo. (B) a emenda de um pr-mRNA com 5 xons. (C-F) Emenda alternativa por (C) stios de emenda 5 alternativa, (D) stio de emenda 3 alternativa (em alguns casos isso iria prover terminais diferentes ao mRNA, e ambos stios necessitariam de uma seqncia de poliadenilao, aqui mostrada como An), (E) uma deciso emenda/no emenda, e (F) incluso de xon/ excluso de xon. (Segundo Horowitz e Krainer, 1994.)
mente vistas em qualquer embrio, algumas das formas menos importantes so vistas no crebro e no corao (Zorn e Krieg, 1992). De maneira semelhante, a emenda alternativa do RNA permite que o gene para tropomiosina codifique tanto as formas do msculo esqueltico como as do fibroblasto dessa protena. O RNA nuclear para a tropomiosina contm 11 xons. xons 1-5, 8 e 9 so comuns a todos os RNAs expressos por esse gene. xons 6 e 11 so tambm usados em fibroblastos e clulas de msculo liso, enquanto xons 7 e 10 so usados na sntese da tropomiosina do msculo esqueltico (Figura 12.7). Nos msculos lisos e nos fibroblastos formada uma protena que impede spliceosomes de se formarem nos stios de emenda especficos dos msculos esquelticos (Guo et al., 1991; dOrval et al., 1991). No sistema nervoso, a diversidade do canal de K+ tem um papel importante na regulao da excitabilidade da membrana. Essas diferenas cinticas foram correlacionadas com a emenda alternativa de precursores de mensagens do gene shaker (Mottes e Iverson, 1995).
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Figura 12.7
Diagrama esquemtico da emenda alternativa do RNA no precursor do mRNA da tropomiosina. No msculo esqueltico, xons possveis 6 e 11 so evitados (e transformados em ntrons), enquanto em fibroblastos e clulas do msculo liso, xons possveis 7 e 10 so tornados ntrons, e 6 e 11 so usados como xons.
mRNA da tropomiosina especfico de msculo estriado
Processamento de clula muscular
Processamento de fibroblasto, clula do msculo liso
Precursor RNA nuclear de tropomiosina
mRNA de tropomiosina de fibroblasto e msculo liso
Em alguns casos, as propriedades das protenas emendadas alternativamente podem ter conseqncias importantes durante o desenvolvimento. As cinco diferentes protenas fibronectinas humanas so geradas por um par de genes idnticos da fibronectina. As formas diversas (e em alguns casos especficas de rgos) da fibronectina vm de mRNAs diferentes gerados pela emenda de diferentes xons dos precursores do mRNA da fibronectina (Tamkun et al., 1984; Hynes, 1987). Algumas formas de fibronectina so encontradas nas trajetrias sobre as quais migram clulas embrionrias, enquanto outras no o so, o que sugere que formas de fibronectina emendadas alternativamente tm diferentes funes embrionrias (ffrench-Constant e Hynes, 1989). Algumas isoformas emendadas do fator 8 de crescimento fibroblstico (FGF8) somente interagem com receptores gerados da emenda particular de RNA. Assim, o FGF8b (uma das sete variantes emendadas de FGF8) se ligar a receptores FGF 2c e 3c, mas no aos receptores FGF 1b, 1c, 2b ou 3b. No camundongo em desenvolvimento, o FGF8b produzido do sulco ectodrmico apical no broto dos membros e dos arcos branquiais e fossas nasais da cabea. Em cada um desses locais, o mesnquima subjacente expressa o receptor FGFR2c (Fotografia de rosto, Crossley e Martin, 1995; MacArthur et al., 1995). Processamento Alternativo de RNA e Determinao Sexual em Drosophila A emenda alternativa do RNA pode gerar famlias de protenas cujos membros podem ter diferentes funes. Nada previne tal emenda alternativa de produzir protenas de fatores de transcries alternativas, e essa tcnica foi usada pela Drosophila para controlar sua diferenciao sexual. Alm disso, a diferenciao sexual em Drosophila regulada por uma cascata de eventos processadores de RNA (veja Baker et al., 1987; MacDougall et al., 1995). Conforme veremos no Captulo 20, o desenvolvimento do fentipo sexual em Drosophila mediado por uma srie de genes que convertem a relao cromossomo X-autossomo em uma clula de macho ou uma de fmea. Quando a relao 1 (i.e., quando existem dois cromossomos por clula diplide), o embrio se desenvolve em uma mosca fmea. Quando a relao de 0.5 (i.e., quando a mosca XY com apenas um cromossomo X por clula diplide), o embrio se desenvolve em um macho (Figura 12.8). Um dos genes chave nessa trajetria o transformer (tra1). Esse gene necessrio para produo de fmeas, e sua perda resulta em moscas macho, independentemente da relao cromossmica. Atravs de todo o perodo larval, o gene tra1 sintetiza ativamente um transcrito que processado em um mRNA geral (que
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encontrado tanto em fmeas como em machos), ou em um mRNA especfico para fmeas (Figura 12.9). Somente fmeas contm a mensagem emendada alternativamente. O mRNA geral encontrado tanto em machos como em fmeas contm um cdon de parada precoce (UGA) no segundo xon, e a pequena protena produzida por esse mRNA no funcional. Portanto, o transcrito no-especfico geral no est relacionado com a determinao do sexo (Belote et al., 1989). Porm, na mensagem especfica para fmeas, esse cdon UGA est em um ntron que desemendado durante a formao do mRNA e no interfere com a traduo da mensagem. Em outras palavras, o transcrito fmea o nico transcrito funcional desse gene. De fato, quando o cDNA desse transcrito especfico de fmea incorporado nos genomas de moscas XY, essas moscas se tornam fmeas. A protena codificada pelo mRNA especfico de fmea parece ser um peptdeo rico em arginina com comprimento de 196 aminocidos (Boggs et al., 1987). O que faz o gene transformer (tra1) processar um transcrito especfico de fmea em clulas XX e no em clulas XY? Parece que a emenda alternativa especfica do sexo do nRNA tra1 envolve competio entre dois possveis stios de emenda 3 (aceptores) no ntron. Sosnowski e seus colegas (1989) apresentaram evidncia de que essa competio alterada pela presena ou ausncia de um produto funcional do gene Sex-lethal. O gene Sex-lethal (Sxl) um dos primeiros genes na via do fentipo sexual, e age antes do transformer. Se a relao X-paraautossomo for 1, a protena funcional SXl ser produzida*. Esse gene no produz uma protena funcional em embries XY ou larvas. Quando o gene Sex-lethal funcional, o gene transformer produz tanto o transcrito geral como o transcrito especfico de fmea e a mosca se tornar uma fmea. Se o gene Sex-lethal for deletado ou mutado, o gene transformer s produzir o transcrito no-funcional e a mosca se tornar um macho. Parece que o produto do gene Sex-lethal controla qual dos stios de emenda 3 est sendo usado. H duas maneira principais pelas quais a protena Sex- lethal poderia controlar qual stio de emenda 3 usado. Uma, bloquear o uso do stio geral do aceptor de modo que somente o stio alternativo aceptor especfico de fmea pode ser usado. A outra maneira ativar o stio aceptor especfico de fmea de um modo positivo. Valcrcel e colegas (1993) mostraram que a protena Sex-lethal inibe a emenda no stio aceptor (no especfico de fmea), ligando-se especificamente ao seu trato polipirimidina. Isso bloqueia a ligao de um fator de emenda, U2AF, ao stio geral, levando-o a usar o stio de menor afinidade especfico de fmea. Portanto, parece que se o stio de emenda aceptor geral 3 do transformer estiver bloqueado (seja por mutao ou pela protena Sex-lethal), o stio aceptor alternativo especfico ser usado (veja Figura 12.9). O resultado ser uma mosca fmea. A protena Transformer-1 , ela prpria, um fator de emenda alternativo, e regula a emenda do transcrito nuclear do gene doublesex (dsx). Esse gene necessrio para a produo de ambos fentipos sexuais, e mutaes de dsx podem reverter o fentipo esperado, fazendo com que embries XX se tornem machos, ou embries XY se tornem fmeas. Durante o estgio de crislida, doublesex produz um transcrito que pode ser processado de duas maneiras alternativas. Pode gerar um mRNA especfico de fmea ou um mRNA especfico de macho (veja Figura 12.9; Nagoshi et al., 1988). Em fmeas e machos, os trs primeiros xons so os mesmos. Porm, os quartos xons so diferentes. O RNA especfico de macho deleta uma grande seo do RNA precursor que inclui o xon especfico de fmea. Tian e Maniatis (1992) mostraram que o processamento especfico do sexo do prmRNA dsx envolve a ativao do stio de emenda 3 especfico de fmea pelos produtos dos genes transformer e transformer-2. A polipirimidina (rica em U/C) do trato em
XX;AA
XY;AA
Sex lethal mRNA especfico de fmea transformer mRNA especfico de fmea Doublesex mRNA especfico de fmea
Sex lethal mRNA no funcional transformer mRNA no funcional Doublesex mRNA especfico de macho
Fentipo feminino
Fentipo masculino
Figura 12.8
Determinao do sexo em Drosophila. Esse esquema simplificado mostra que a razo Xautossomo monitorada pelo gene Sex-lethal. Se esse gene estiver ativo, ele processa o prmRNA transformer em uma mensagem funcional especfica de fmea. Na presena da protena Transformer especfica de fmea, o transcrito do gene doublesex processado de forma especfica de fmea, levando produo do fentipo feminino. Se o gene transformer no produzir um produto especfico de fmea (i.e., se o gene Sex-lethal no for ativado), o transcrito double-Sex emendado da maneira especfica de macho, levando obteno de um fentipo masculino. (Os detalhes dessa trajetria sero discutidos no Captulo 20.)
*A protena Sxl ela prpria um produtor de um complexo tipo de emenda alternativa do RNA. Mais ser dito sobre isso no Captulo 20.
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Stios de emenda alternativa 3 xon ntron ntron xon gene tra1
Cdon de parada
Cdon de parada
FMEA Protena Sx1 funcional
MACHO Sem protena Sx1 funcional
prmRNA tra1 Sx1 bloqueia ligao de U2AF (e spliceosome) ao stio mais eficiente; assim, stio de emenda 3 menos eficiente usado RNA Transformer feminino
prmRNA tra1 U2AF se liga s regies ricas em polipirimidina para stios de emenda 3
mRNA transformer (macho e fmea) constitutivo produz protena truncada, no-funcional Protena degrada
Protena transformer
Gene doublesex Stio de emenda 3 ineficiente
Pr-mRNA doublesex Protenas Tra ajudam ligao de U2AF ao stio ineficiente
Pr-mRNA doublesex
mRNA doublesex especfico de fmea Protena Doublesex (DSX) especfica de fmea Ativa genes especficos de fmea Suprime genes especficos de macho
mRNA doublesex especfico de macho Protena Doublesex (DSX) especfica de macho Ativa genes especficos de macho suprime genes especficos de fmea
471
Figura 12.9
Representao esquemtica de eventos de emenda alternativa na trajetria da determinao do sexo em Drosophila. A trajetria feminina est esquerda, a trajetria masculina est direita, e os genes transformer-1 e doublesex esto no centro. Na trajetria feminina, a protena Sxl ativa produzida quando a razo X-para-autossomo for 1. (Como isso ocorre ser discutido no Captulo 20.) A protena Sxl ativa bloqueia o stio usual de emenda 3 do primeiro ntron do pr-mRNA tra1. Isso obriga o spliceosome a usar um outro stio de emenda 3. Na trajetria masculina, no produzida a protena Sxl, e o spliceosome usa o stio mais eficiente. Isso conduz incorporao no mRNA de seqncias que codificam precocemente um cdon de parada precoce (UAG) na mensagem. O peptdeo truncado produzido dessa mensagem no parece ter uma funo. como se o gene fosse inativo. Na trajetria feminina, a protena Tra1 ativa se combina com a protena Tra2 para estabilizar U2AF, e a assemblia de spliceosome no stio de emenda 3 do terceiro ntron do prmRNA doublesex. Isso leva formao de um mRNA contendo o quarto xon. Em machos, a ausncia da protena Tra1 previne a ligao de U2AF e a assemblia do spliceosome nesse stio. Em vez disso, xons 5 e 6 so utilizados no mRNA masculino. (Segundo MacDougall et al., 1995.)
frente ao xon 4 no precursor do mRNA doublesex geralmente um ligante fraco de U2AF, porque ele quebrado por um grupo de resduos de purina (representado pela linha serrilhada na Figura 12.9). Portanto, ele usualmente no um eficiente stio de emenda 3. Porm, na presena das protenas Transformer (e Transformer 2), esse stio torna-se um stio utilizado eficientemente (Tian e Maniatis, 1993). Isso significa que o stio de emenda ser utilizado em fmeas (que tm as protenas Transformer ativas), mas no em machos (que no as tm). O mRNA doublesex masculino no ter o xon 4, enquanto o transcrito feminino o tem. As protenas Doublesex produzidas por esses mRNAs so ambas fatores de transcrio. Alm disso, elas reconhecem a mesma seqncia de DNA. Porm, enquanto a protena Doublesex feminina ir ativar intensificadores especficos de fmea (como aqueles que produzem protenas do vitelo), as protenas Doublesex masculinas iro inibir a transcrio desses mesmos intensificadores (Coschigano e Wensink, 1993; Jursnich e Burtis, 1993). Reciprocamente, a protena Doublesex feminina pode inibir a transcrio a partir de genes que seriam, de outra maneira, ativados pela protena Doublesex masculina. A pesquisa sobre a determinao do sexo em Drosophila mostra que o processamento diferencial do RNA tem papel extremamente importante ao longo de todo o desenvolvimento. Uso Disseminado do Processamento de RNA para o Controle da Expresso Gnica Ainda sabemos relativamente pouco sobre os mecanismos de processamento alternativo do mRNA ou sobre as vias pelas quais algumas clulas processam transcritos que outras clulas no seguem. O mecanismo subjacente a tal processamento diferencial de RNA pode nos fornecer uma viso sobre a verdadeira essncia da diferenciao celular e da determinao embrionria.
REGULAO DA TRADUO DOS PROCESSOS DESENVOLVIMENTAIS

Aps o RNA mensageiro ter sido transcrito, processado e exportado do ncleo, ele ainda precisa ser traduzido para formar a protena codificada no genoma. Nas sees seguintes, iremos ver que a regulao a nvel da traduo um mecanismo extremamente importante no controle da expresso gnica. Nesses casos, a mensagem j est presente no citoplasma mas pode ou no ser traduzida, dependendo de certas condies celulares. Assim, o controle da traduo da expresso gnica pode ser usado quando uma exploso de sntese protica necessria imediatamente (como no caso de ovos recm-fecundados), ou pode ser usado como um mecanismo afinado para assegurar que uma quantidade muito precisa de protena seja produzida do suprimento disponvel de mensagens (como a sntese de hemoglobina). Iremos tambm ver que
472
h vrias maneiras para realizar o controle da traduo e que clulas diferentes desenvolveram diferentes meios de o fazerem.
Mecanismos da traduo eucaritica

Traduo o processo pelo qual a informao contida numa seqncia de nucleotdeo do mRNA instrui a sntese de um determinado polipeptdeo. Esse processo, esquematizado na Figura 12.10, foi dividido em trs fases - iniciao, alongamento e terminao - e regulado por protenas solveis chamadas (apropriadamente) fatores de iniciao, fatores de alongamento e fatores de terminao (Hershey, 1989; Safer, 1989). A iniciao consiste de reaes pelas quais o primeiro RNA de transferncia do aminoacil e o mRNA so ligados ao ribossomo. O nico RNA de transferncia (tRNA) capaz de iniciar a traduo um tRNA iniciador especial (tRNAi), que transporta o aminocido metionina. Conforme mostrado na Figura 12.11, as primeiras reaes envolvem a formao de um complexo de iniciao consistindo do tRNA iniciador do metionil ligado uma subunidade ribossmica 40S (pequena). Essa reao catalisada pela forma ativa do fator 2 de iniciao eucaritica (eIF2GTP) que liga o iniciador Met-tRNA subunidade ribossmica 40S. Note que essa ligao ocorre na ausncia de mRNA. O mRNA adicionado em seguida. Primeiro, uma protena cap ligante-eIF4E - liga-se ao cap de metil-guanosina no terminal 5 da mensagem. Sem esse cap, a ligao do mRNA subunidade ribossmica muitas vezes no completada (Shatkin, 1976, 1985), e o eIF4E crtico para o prosseguimento da traduo. No entanto, h menos eIF4E do que o nmero de mensagens na clula, o que faz pensar que cada mRNA tem que competir por essa protena cap ligante (Thach, 1992). O fator 4A de iniciao se complexa em seguida com o eIF4E e se posiciona numa ala helicoidal fechada na seqncia lder do mRNA. O eIF4A (estimulado por eIF4B e ATP) desenrola a hlice. Esse passo pode ser limitante se a eIF4A da ala helicoidal fechada for ocultada por alguma outra estrutura secundria estvel. A subunidade ribossmica 40S viaja em seguida ao longo da mensagem at atingir o cdon AUG no contexto adequado. Kozak (1986) mostrou que no apenas qualquer um AUG ir servir. Para que a subunidade
Figura 12.10
Representao esquemtica dos eventos da traduo eucaritica. Os passos da iniciao renem as subunidades ribossmicas 40S e 60S, mRNA e o tRNA iniciador, que est complexado ao aminocido metionina (Met). Durante o alongamento, aminocidos so trazidos para o polissomo, e ligaes peptdicas so formadas entre os aminocidos. A seqncia de aminocidos na protena em crescimento direcionada pela seqncia de cdons de cidos nuclicos no mRNA. Aps a ltima ligao peptdica da protena ter sido feita, um dos cdons UAG, UGA, ou UAA sinaliza o trmino da traduo. As subunidades ribossmicas e a mensagem podem ser reutilizadas.
INICIAO
ALONGAMENTO
TERMINAO
tRNA iniciador Ribossomo
Polipeptdeo nascente Ligao peptdica
Polipeptdeo completado
Subunidades ribossmicas
Fator de liberao Subunidades ribossmicas recicladas
473
Unidade ribossmica pequena Ligao do fator de iniciao
Figura 12.11
tRNA Iniciador
Fase de iniciao da traduo eucaritica. Todos os fatores de iniciao esto representados como crculos. O primeiro complexo produzido pela unio da subunidade ribossmica 40S com o tRNA iniciador. O tRNA iniciador foi complexado com a forma ativa (GTP) do fator 2 de iniciao. Aps a formao desse complexo, o mRNA posicionado com o auxlio da protena cap ligante (eIF4E) e outras subunidades eIF4. Uma vez estando o mRNA colocado em seu lugar, o eIF5 media a juno da subunidade ribossmica 60S e a liberao dos prvios fatores de iniciao. O eIF2, agora em sua forma inativa (GDP), reativado por eIF2B. (Segundo Hershey, 1989; Thach, 1992; Cooper, 1996.)
Escaneamento
Reciclagem de eIF2
Subunidade 60S
ribossmica pare e inicie a traduo, os nucleotdeos ao redor de AUG tambm so importantes. Mutando genes clonados e analisando a traduo de seus RNAs, Kozak achou que a seqncia tima seria ACCAUGG. Mutaes nos nucleotdeos nos flancos podiam reduzir a traduo em 20 vezes. A importncia dos nucleotdeos nos flancos tambm foi vista in vivo. Morle e colaboradores (1985) reportaram o caso de um paciente cuja talassemia (deficincia da subunidade globina da hemoglobina) era devida uma alterao nessa seqncia de ACCAUGG para CCCAUGG. A ligao da subunidade 40S AUG da mensagem posiciona o
474
Figura 12.12
Polissomo individual transcrevendo o mRNA gigante do puff BR2 de Chironomus tentans. (A) Microscopia eletrnica de um polissomo contendo 24 ribossomos. As protenas nascentes podem ser vistas se estendendo dos ribossomos e crescendo medida que os ribossomos se movimentam do terminal 5 da mensagem para o terminal 3. Prximo do terminal 3 esto ribossomos dos quais a protena se destacou. (B) Um tal polissomo sob maior aumento; o polissomo foi esticado durante a preparao do espcime. A relao entre o mRNA e as subunidades ribossmicas e o polipeptdeo nascente pode ser vista. (de Francke et al., 1982; fotografias cortesia de J. E. Edstrom.)
(A)
(B)
tRNA iniciador sobre o cdon AUG. Somente aps o mRNA ter sido posicionado apropriadamente na subunidade ribossmica pequena, pode a unidade ribossmica 60S (grande) se ligar. Isso completa a reao de iniciao. Durante esse processo, o GTP no eIF2 hidrolisado em GDP. Para o eIF2 captar um novo tRNA iniciador, esse tem que ser regenerado para eIF-GTP pelo eIF2B. O alongamento envolve a ligao seqencial de tRNAs do aminoacil ao ribossomo e a formao de ligaes peptdicas entre os aminocidos medida que eles abandonam seqencialmente seus tRNAs transportadores (veja Figura 12.10). medida que aminocidos so ajuntados, o ribossomo viaja ao longo da mensagem, expondo novos cdons para a ligao de tRNA. Isso permite a um outro ribossomo iniciar sua viajem no terminal 5 da mensagem. Assim, em geral, qualquer mRNA ter vrios ribossomos ligados a ele. Essa estrutura ento chamada poliribossomo- ou mais comumente, polissomo (Figura 12.12). A terminao da sntese protica ocorre quando um dos cdons mRNA UAG, UAA ou UGA exposto no ribossomo. Esses tripletes de nucleotdeos (chamados cdons de terminao) no so reconhecidos pelos tRNAs e portanto no codificam para quaisquer aminocidos. Ao contrrio, eles so reconhecidos pelos fatores de liberao, que hidrolizam o peptdeo do ltimo tRNA, destacando-o do ribossomo. O ribossomo se separa em duas unidades, e o ciclo da traduo recomea.
Controle da sntese protica pela longevidade diferencial do mRNA

Uma das principais maneiras de regular a expresso gnica ao nvel de traduo envolve degradao ou estabilizao seletiva do mRNA. Se o mRNA fosse degradado rapidamente aps penetrar no citoplasma, ele somente poderia gerar poucas protenas. Porm, se a mensagem com uma meia-vida relativamente curta for seletivamente
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estabilizada em certas clulas em certos momentos, ento ele poderia produzir grandes quantidades de uma protena particular em certos momentos e em certos locais. Degradao Seletiva de mRNAs
LONGEVIDADE DE UM mRNA E SUA REGIO 3 NO TRADUZIDA. Nem todos os mRNAs tm a mesma estabilidade dentro da clula. Uma mensagem estvel como a globina tem uma meia-vida de cerca de 17 horas, enquanto os mRNAs para vrios fatores de crescimento tm meia-vida de menos de 30 minutos. Assim, a quantidade de protena produzida de uma nica mensagem de globina deve ser muito maior que aquela de uma mensagem de um nico fator de crescimento. Dados recentes, sumariados por Decker e Parker (1994), sugerem que as seqncias de RNA dentro da regio 3 no-traduzida (3UTR) podem promover a rpida desadenilao da cauda do poliadenilato 3. Isso leva perda da cobertura do terminal 5 da mensagem e de sua subseqente degradao 5 a 3. Portanto, os principais determinantes reguladores da meia-vida da mensagem parecem residir na 3 UTR. As espcies mais efmeras de RNA contm uma ou mais seqncias ricas em AU nessa regio. Shaw e Kamen (1986) inseriram uma regio rica em AT com 51 pares de bases oriundas da 3UTR do gene para o fator de crescimento GM-CSF na 3UTR do gene da globina do coelho (Figura 12.13). A mensagem da globina resultante tinha uma meia-vida de menos de 30 minutos. Uma seqncia semelhante, mas contendo 14 resduos G e C, foi inserida em um outro gene da globina como um controle. Sua mensagem para globina normalmente tinha a meia-vida longa. A capacidade de degradar seletivamente mRNAs crtica para a funo celular. Por exemplo, o gene c-fos codifica um fator de transcrio necessrio para a diviso celular normal do fibroblasto (Holt et al., 1986). Tal como a mensagem do fator de crescimento GM-CSF, o mRNA para c-fos contm grandes regies 3 no-traduzidas ricas em seqncias AU. Se essas regies forem deletadas (experimentalmente ou por mutao natural), a mensagem ganha uma meia-vida mais longa. Conseqentemente, mais protena C-fos produzida, e a clula recebe sinalizao contnua para se dividir. O resultado um tumor das clulas que tm o gene c-fos, carente da 3 UTR rica em AU (Meijlink et al., 1985). Wilson e Treisman (1988) descobriram que essa regio estimula a remoo da cauda poli(A) quando a mensagem traduzida. Quando a regio rica em AU foi deletada ou substituda por uma outra seqncia, a cauda poli(A) permanecia, e a mensagem tinha uma meia-vida mais longa. Foram encontradas vrias protenas que reconhecem essas regies 3UTR ricas em AU, e elas podem acelerar a degenerao das mensagens quando ligada elas (Chen et al, 1992, 1994). Reciprocamente, a 3UTR do RNA de longa vida da globina contm trs regies ricas em C que ligam protenas que parecem estabilizar a mensagem (Kiledjian et al., 1995). Encurtamento diferencial da cauda poli(A) tem um papel decisivo no ciclo vital do fungo limoso Dictyostelium. Nesse organismo, um novo conjunto de mensagens transcrito durante a mudana do crescimento vegetativo (ameba) para o desenvolvi-
Figura 12.13
Regulao da longevidade do mRNA por uma seqncia na regio 3 no traduzida. (A) O terminal 3 do gene -globina do coelho foi alterado pela insero de um fragmento de 62 pares de base derivado do terminal 3 do gene humano GM-CSF ou uma seqncia relacionada, na qual vrios pares AT foram substitudos por pares GC (indicados em cores). (B) Os clones foram injetados em culturas de clulas de camundongo, e a presena da mensagem aps 30 horas foi medida incubando-se extratos celulares com DNA marcado com 32P, complementar ao terminal 5 da mensagem. Se a mensagem -globina ainda existisse, o cDNA radioativo a ela se ligaria e seria, portanto, resistente nuclease S1 (que destri somente cidos nuclicos de fita nica). Se a mensagem no estivesse presente, a nuclease S1 adicionada iria digerir a sonda at mononucleotdeos, e nenhum DNA radioativo seria ligado. As solues resultantes foram corridas em um gel e auto-radiografadas. Pista 1: Extratos de clulas incorporando o tipo selvagem (WT) do gene clonado da -globina. Pista 2: Extrato de clulas incorporando o gene -globina do coelho com o terminal 3 rico em AT (no mostrando mRNA aps 30 horas). Pista 3: Extrato de clulas incorporando o gene da -globina de coelho com o terminal 3 substitudo por GC (mostrando mRNA estvel aps 30 horas). O gene e a sonda para 2-microglobulina (produzindo um mRNA longevo) foram usados como controle. (Segundo Shaw e Kamen, 1986.)
Terminais 3 alternativos
RNA globina
CAP (A)
ntron
ntron (B)
RNA de controle 2-microglobulina
476
Porcentagem da marcao (pulso) inicial
Com prolactina
Sem prolactina
Perodo aps o rastreamento (horas)
Figura 12.14
Degradao de mRNA da casena na presena e ausncia de prolactina. Clulas mamrias em cultura foram tratadas com precursores radiativos de RNA (pulso) e aps um dado perodo foram lavadas e alimentadas com precursores no-radiativos (rastreamento). O mRNA da casena sintetizado durante o tempo de pulsao foi em seguida isolado e contado. Na ausncia de prolactina, o mRNA da casena recm-sintetizado decaiu rapidamente, com uma meia-vida de 1.1 horas. Quando o mesmo experimento foi feito em um meio contendo prolactina, a meia-vida estendeu-se para 28.5 horas. (Segundo Guyette et al., 1979.)
mento (grex). Ao mesmo tempo, as caudas poli(A) dos mRNAs existentes no estgio vegetativo so dramaticamente encurtadas. Como resultado, as mensagens recmtranscritas so traduzidas, enquanto as mensagens pr-existentes no o so (Palatnik et al., 1984). Esse mecanismo tambm foi observado em glndulas salivares na larva de Drosophila (Restifo e Guild, 1986).
ESTABILIZAO HORMONAL DE RNAs MENSAGEIROS ESPECFICOS. Produtos
diferenciados de genes so freqentemente sintetizados em resposta induo hormonal. Em alguns casos, hormnios no aumentam a transcrio de certas mensagens, mas atuam a nvel de traduo. Um desses casos envolve a sntese da casena por mamferos em lactao. A casena a principal fosfoprotena do leite sendo, por isso, um produto diferenciado da glndula mamria. Como ser discutido mais detalhadamente no Captulo 19, a glndula mamria preparada pela ao seqencial de vrios hormnios. Prolactina, porm, o hormnio responsvel pela lactao isto , a real produo do leite. A prolactina aumenta a transcrio de mensagens da casena somente cerca de duas vezes; seu principal efeito parece ser a estabilizao do mRNA da casena (Guyette et al., 1979). A prolactina aumenta a longevidade da mensagem da casena fazendo com que ela exista por um tempo 25 vezes maior que a maioria das outras mensagens na clula (Figura 12.14). Conseqentemente, cada mRNA da casena pode ser usado para mais repeties da traduo. Dessa maneira, um nmero maior do que o normal pode ser sintetizado de cada mensagem de casena. A Tabela 12.2 resume esses dados e mostra que outros hormnios tambm aumentam a estabilidade de RNAs mensageiros especficos.
Controle da traduo de mensagens do ocito

Na maioria das espcies animais, o ncleo diplide no expresso imediatamente. A evidncia que o desenvolvimento precoce controlado por fatores armazenados no ou produzidos pelo ocito veio de diversos experimentos no fim do sculo XIX (revisados por Davidson, 1976). Esses experimentos demonstraram claramente a dominncia de traos maternos durante o estgio inicial da embriognese, e uma troca para caractersticas paternas ou hbridas surgindo somente mais tardiamente no desenvolvimento. Tais efeitos maternos de longo alcance j foram mencionados em nossa dis-
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Tabela 12.2 Estabilizao de RNAs mensageiros especficos pelos hormnios mRNA Clula ou tecido Efetuador Regulatrio Viteologenina Albumina Vitelogenina Apo VLDL II Casena Hormnio do crescimento Insulina Ovalbumina Fgado de Xenopus Fgado de Xenopus Fgado de ave Fgado de ave Glndula mamria de rato Culturas de clula pituitria de rato Clulas de ilhotas pancreticas de rato Oviduto de galinha Estrgeno Estrgeno Estrgeno Estrgeno Prolactina Dexametasona e tiroxina Glicose Estrgeno, progesterona Meia-vida (horas) +Efetuador 500 10 22 26 92 202 77 ~24 -Efetuador 16 3 ~2.5 3 5
29 2-5
Fonte: Segundo Shapiro et. al., 1987.
cusso sobre a orientao da clivagem em embries de lesmas, nos quais o citoplasma do ocito contm um fator que direciona as rotaes dos planos de clivagem nas direes direita ou esquerda. [cleave1.html] Caracterizao de RNAs Mensageiros Armazenados em Ocitos
TIPOS DE mRNAS ARMAZENADOS EM OCITOS. Davidson e seus colegas avali-
aram a complexidade do mRNA do ocito de maneira semelhante quela empregada em sua anlise da complexidade do RNA nuclear. RNA (em grande excesso) foi hibridizado com DNA desnaturado, e a metade do valor Cot da hibridizao foi encontrada ser proporcional s quantidades das diferentes seqncias de RNA presentes. Por essa anlise, eles estimaram que cada ocito (em numerosos filos) tinha seqncias nucelotdicas diferentes em nmero suficiente para se responsabilizar por aproximadamente 1600 cpias cada de 20.000 a 50.000 tipos de RNA (Galau et al., 1976; HoughEvans et al., 1977). Essa a maior complexidade de mensagens de qualquer tipo de clula conhecida, e isso reflete o enorme potencial do desenvolvimento do ocito. Relativamente poucas dessas mensagens foram caracterizadas. Alm disso, muitos desses mRNAs no so utilizados no ocito, mas so armazenados e traduzidos aps a fecundao. Isso foi primeiro demonstrado usando inibidores da sntese protica; mais recentemente, ensaios de PCR e de proteo de RNase tambm mostraram a existncia de RNAs armazenados no ocito e primeiro traduzidos durante a maturao (imediatamente antes e durante a ovulao), fecundao ou clivagem precoce. A Tabela 12.3 apresenta uma lista parcial desses mRNAs armazenados. [RNA4.html] Alguns desses RNAs so para protenas que sero necessrias durante a clivagem, quando o embrio produz quantidades enormes de cromatina, membranas celulares e componentes do citoesqueleto. Uma das situaes mais notveis a armazenagem da informao necessria para produzir ribonucleotdeo redutase para o embrio do molusco. A grande subunidade armazenada como uma protena no citoplasma do ocito. A pequena unidade armazenada como uma mensagem materno no-traduzvel. Somente aps a fecundao, quando o mRNA para a pequena subunidade tiver sido traduzida, pode a recm-sintetizada pequena subunidade combinar-se com a grande subunidade pr-formada para gerar a enzima funcional (Standart et al., 1986). Alguns desses mRNAs armazenados regulam o perodo da diviso celular precoce. Em muitas espcies (incluindo o ourio-do-mar e a Drosophila) a taxa e o padro das divises celulares precoces no requerem um ncleo. Ao contrrio, eles requerem sntese de protena contnua a partir do mRNA materno armazenado (Wagenaar e Mazia, 1978). A razo dessa dependncia de mensagens armazenadas foi mostrada em 1983, quando Evans e colegas acharam uma classe de protenas que
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Tabela 12.3
Alguns mRNAs armazenados no citoplasma do ocito e traduzidos prximo ou na fecundao Funo(es) Regulao da diviso celular Movimento celular e contrao Formao de fusos mitticos, clios, flagelos Sntese de DNA Organismo(s) Ourio-do-mar, molusco, estrela-do-mar, r Camundongo, estrela-do-mar Molusco, camundongo Ourio-marinho, molusco, estrela-do-mar Camundongo R Ourio-do-mar, r, molusco R Camundongo Camundongo C. elegans C. elegans C. elegans Drosophila Drosophila Drosophila Drosophila C. elegans Drosophila Drosophila R R R, Drosophila
mRNAs codificando Ciclinas Actina Tubulina
Pequena subunidade da ribonucleotdeo redutase Hipoxantina fosforil-transferase Sntese de purinas Vg1 Determinao mesodrmica (?) Histonas Caderinas Metaloproteinases Fatores de crescimento Fator FEM-3 de determinao do sexo Produtos gnicos PAR Morfgeno SKN-1 Morfgeno Hunchback Morfgeno Caudal Morfgeno Bicoid Morfgeno Nanos Morfgeno GLP 1 Protena Germ cell-less Protena Oskar Ornitina transcarbamilase Fator de alongamento 1 Protenas ribossmicas
Formao de cromatina Adeso de blastmeros Implantao no tero Crescimento celular; crescimento de clulas uterinas (?) Formao de espermatozide Segregam determinantes morfognicos Determinao do destino do blastmero Determinao do destino do anterior Determinao do destino do posterior Determinao do destino do anterior Determinao do destino do posterior Determinao do destino do anterior Determinao da clula germinativa Localizao da clula germinativa Ciclo da uria Sntese protica Sntese protica
Fontes: Compilado de numerosas fontes, incluindo Raff, 1980; Shiokawa et al., 1983; Rappollee et al., 1988; Brenner et al., 1989; Standart, 1992.
chamaram ciclinas. Essas protenas regulam a diviso celular (conforme discutido no Captulo 5) e so codificadas por mRNAs materno. O que surpreendente sobre as ciclinas que elas so destrudas na diviso celular e tm que ser resintetizadas a partir de mensagens armazenadas aps o trmino de cada clivagem. A sntese de ciclinas oriundas de mensagens estocadas vista declinar medida que o embrio se aproxima do estgio de blstula. Outras mensagens armazenadas codificam protenas que determinam o destino celular. As mensagens bicoid e nanos da Drosophila, o mRNA vg1 de Xenopus, e o mRNA glp-1 de C. elegans so todas crticas para a determinao do destino celular. Como veremos posteriormente neste captulo, no somente o perodo de sua traduo crtico, como tambm o a localizao do mRNA quando ele traduzido.
479
(A)
Figura 12.15
Demonstrao de mensagens localizadas nos plos animal e vegetal do ocito de Xenopus. RNA foi obtido do ovo inteiro (T), do hemisfrio pigmentado animal (A) ou do hemisfrio pigmentado vegetal (V) e separado eletroforeticamente em gel. O RNA foi transferido para papel pelo procedimento Northern, e o papel incubado com DNA radioativo de clones derivados de cDNA complementar mensagem do ocito. O DNA radioativo do clone An2 hibridiza para a mensagem presente no plo animal, mas no no plo vegetal. A distribuio oposta vista para a mensagem hibridizando para o DNA do clone vg1. (B) Hibridizao in situ mostrando a mensagem vg1 em diferentes estgios de localizao no ocito de Xenopus. No ocito maduro, ela reside somente no crtex vegetal. (O RNA vg1 foi recentemente mostrado codificar um fator crtico para a determinao do eixo dorso-ventral em vertebrados e ser discutido mais extensamente no Captulo 15.) (A de Rebagliati et al., 1985, cortesia de D. Melton; B de Melton, 1987.)
(B)
LOCALIZAO DE mRNAS ARMAZENADOS. Alguns mRNAs armazenados no so
uniformemente distribudos no ocito (Rodgers e Gross, 1978). Rebagliati e colaboradores (1985) mostraram que enquanto a maioria das mensagens maternas encontrada distribuda uniformemente atravs do ovo no-fecundado de Xenopus, alguns mRNAS armazenados se localizam no plo animal ou vegetal do citoplasma. Eles extraram RNA contendo poli(A) de ocitos e usaram transcriptase reversa e DNA polimerase para converter os RNAs em uma populao de DNAs de dupla fita. Esses DNAs foram em seguida inseridos em vetores clonados e cultivados separadamente em E. coli. Cerca de 2 milhes de clones foram derivados dessa maneira. O DNA desses clones (a biblioteca do ocito de Xenopus) foi ento transferido para dois pedaos de papel de filtro e desnaturado sob condies de fornecer DNA de fita simples. Em seguida, os investigadores cortaram o plo animal ou vegetal do ovo e extraram o RNA contendo poli(A) dessas regies. cDNAs radioativos foram produzidos a partir dos RNAs, e um grupo e filtros contendo DNA foi incubado em cDNAs das mensagens animal, enquanto o outro foi incubado em cDNAs das mensagens vegetal. Quando a ligao de cDNAS radioativos foi medida, a maioria dos clones ligaram quantidades iguais de cDNA dos plos animal e vegetal, indicando que essas mensagens estavam igualmente distribudas. Porm, cerca de 1.2 porcento dos clones somente ligaram cDNA produzido de mensagens do plo animal, e cerca de 0.2 porcento dos clones somente se ligaram ao cDNA derivado do mRNA do plo vegetal. O DNA dos clones especfico para mensagens animal ou vegetal pde, ento, ser usado para identificar os mRNAs localizados. RNA foi extrado de ovos inteiros ou de seus plos animal e vegetal e corrido em gel. Os RNAs foram separados eletroforeticamente e foram transferidos para papel de nitrocelulose (transferncia Northern) e examinados com sondas de DNA radioativo para cada um dos clones especficos para a regio. Dois dos resultados esto mostrados na Figura 12.15 e Prancha 8. A localizao desses mRNAs em regies especficas do ovo conseguida atravs do citoesqueleto e ser detalhada nos Captulos 13 e 20.
480
Determinando o Destino Celular por Meio do mRNA Localizado do Ocito
&
RNA bicoid
Especulaes
UITAS DAS ATIVIDADES do
RNA hunchback
RNA nanos
Figura 12.16
desenvolvimento precoce ocorrem sem ativao do ncleo embrionrio. J que a especificao dos eixos embrionrios em geral um dos primeiros processos da embriognese, durante muito tempo foi considerado que esses eventos poderiam ser regulados pelo mRNA materno. Nos anos recentes, isso foi demonstrado ser o caso. O eixo ntero-posterior (cabea-cauda) da Drosophila especificado principalmente pelas protenas codificadas pelos genes bicoid, nanos e hunchback (Figura 12.16). Embora suas atuaes sero detalhadas de maneira mais completa nos prximos captulos, discutiremos suas regulaes de traduo aqui. Primeiramente, os mRNAs de bicoid e nanos so transportados das clulas foliculares do ovrio para dentro do ovo. O RNA bicoid permanece na regio mais anterior do ocito, enquanto a mensagem nanos vai para o plo posterior do ovo. A mensagem bicoid parece ser amarrada pelas suas 3UTR aos microtbulos anteriores pelos produtos dos genes swallow e staufen (Ferrandon et al., 1994; veja Captulo 22). A mensagem bicoid colocada no ocito tem uma cauda poli(A) relativamente curta, de cerca de 70 resduos. Porm, dentro do primeiro ciclo de diviso, a mensagem poliadenilada de maneira a sua cauda quase dobrar de tamanho (Salls et al., 1994; Lieberfarb et al., 1996). Essa poliadenilao coincide com a capacitao da mensagem bicoid ser traduzida. A protena Bicoid se difunde atravs da poro anterior do embrio precoce, sendo responsvel pela especificao das regies da cabea e trax da larva de Drosophila. Os produtos dos genes cortex e grauzone parecem ser crticos para a poliadenilao do mRNA bicoid porque mutaes nesse gene previnem a poliadenilao e traduo da mensagem bicoid. O mRNA nanos est localizado no plo posterior do ovo durante a oognese, mas quantidades significativas permanecem distribudas atravs do citoplasma. Durante o desenvolvimento precoce, porm, somente
Controle da polaridade ntero-posterior em
RNA oskar embries de Drosophila pelo mRNA materno. (A) As mensagens bicoid, nanos, oskar e Anterior Posterior hunchback so fornecidas ao ovo pelas clulas Localizao do RNA nutrizes ovarianas. Elas so codificadas pelo Poliadenilao de caudas de RNA para bicoid, derepresso de nanos
Gradiente de protena bicoide (A P)
Gradiente de protena nanos (A P) Nanos de liga 3 UTR hunchback
Gradiente de protena hunchback
a mensagem nanos ligada no citoplasma posteror traduzida (Gavis e Lehmann, 1994). O posicionamento correto dessa mensagem tambm devido as suas 3UTR e se outros mRNAs (tal como aquele para a tubulina) tiverem sido dado a 3UTR de nanos, essas mensagens ficaro localizadas no posterior do ocito. Quando traduzida, a protena Nanos se difunde atravs da parte posterior do embrio e especifica aquelas clulas que a rtem para tornarem-se abdominais. A mensagem nanos parece ser reprimida durante a traduo pela ligao da protena Smaug a dois stios em sua 3UTR (Smibert et al., 1996). Essa represso abolida uma vez que o mRNA nanos se localiza no plo posterior. A protena Oskar pode estar aqui envolvida na ligao da mensagem nanos ao citoesqueleto, e a protena Vasa pode atuar como helicase para desenrolar o RNA (Lian et al., 1994). A protena Oskar propriamente regulada por traduo. Porm, em contraste com a mensagem nanos, que traduzida aps a fecundao, o mRNA oskar sintetizado e transportado para o interior do ocito precocemente na oognese e fica localizado no plo posterior durante os estgios medianos da oognese. Uma vez localizada, a mensagem tra-
genoma materno. O mRNA oskar entra primeiro, transportado para o plo posterior e traduzido na meia oognese, antes da chegada de outras mensagens. A mensagem bicoid amarrada no anterior do ovo pela sua 3UTR. A mensagem nanos direcionada pela sua 3UTR para ir ao plo posterior, onde interage com a protena Oskar. O mRNA hunchback visto em todo o ocito. (B) Aps fecundao e ativao do ovo, o mRNA bicoid poliadenilado e se torna ativo para traduo, formando um gradiente ntero-posterior da protena Bicoid. O mRNA nanos no plo posteror torna-se competente para traduo e comea a produzir um gradiente posterior-para-anterior da protena Nanos. (C) A protena Nanos liga-se 3UTR da mensagem hunchback para impedir a traduo. A protena Bicoid liga-se a regio intensificadora do gene hunchback para promover a transcrio de novas mensagens hunchback. O resultado um gradiente ngreme da protena Hunchback. Essa protena ir ativar diferentes genes em diferentes concentraes, com isso especificando as diferentes regies do embrio.
duzida em protena que se mantm no plo posterior (Kim-H et al., 1995). Tal como as mensagens bicoid e nanos, sua localizao e momento de traduo dependem de sua 3UTR. Os mRNAs nanos e oskar tm extenses relativamente curtas de poli(A) que no so significativamente alongadas quando as mensagens se tornam traduzveis. Isso sugere que h ao menos dois mecanismos de ativao das mensagens materna em ovos de Drosophila (Salles et al., 1994). O primeiro depende da posio, e no envolve o crescimento da cauda poli(A) (p.ex., oskar e nanos). O segundo independe da posio e requer sntese de poli(A) (bicoid, e tambm mensagens de Toll e torso). As protenas Bicoid e Nanos realizam suas funes regulando a sntese da protena Hunchback. Essa ir finalmente especificar a cabea e o trax da mosca de uma maneira dependente da concentrao. A protena Bicoid (agora ativa no anterior) age como um fator de transcrio para ativar o
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gene hunchback, produzindo assim mais mensagem hunchback e protena no anterior do embrio. A protena Nanos, porm, trabalha ao nvel de traduo para inibir a produo da protena Hunchback a partir do mRNA hunchback existente. Isso cria um gradiente pelo qual a sntese da protena Hunchback aumentada no anterior do embrio e ativamente reprimida no posterior (Wharton e Struhl, 1991; Wang et al., 1994). A 3 UTR do mRNA contm vrios stios que ligam dois fatores (Pumilio e uma protena de 55-kDa) que por si no bloqueiam a traduo. Porm, essas duas protenas parecem formar uma stio de aterrisagem para a protena Nanos. Quando Nanos se liga, a traduo do mRNA hunchback inibida (Murata e Wharton, 1995). A protena Bicoid tambm trabalha a nvel de traduo para bloquear a sntese
mRNA glp-1 Anterior Posterior Protena GLP-1
(A)
mRNA hunchback Poly (A)
mRNA glp-1 Poly (A)
Figura 12.18
(B) Hunchback (Drosophila) GLP-1 (C. elegans)
Protena
Figura 12.17
Comparao entre a localizao da protena GLP-1 e a mensagem glp-1. A mensagem glp1 materna encontrada atravs do desenvolvimento precoce em cada clula do embrio de C. elegans. A protena GLP-1, porm, vista somente na prognie da clula anterior formada na primeira diviso. (Segundo Evans et al., 1994.)
da protena Caudal. Como Nanos, a protena Caudal crtica para o estabelecimento dos segmentos posteriores da mosca, mas ao contrrio da mensagem nanos, o mRNA caudal materno distribudo uniformemente atravs do ovo da Drosophila. A protena Bicoid liga-se 3UTR do mRNA caudal, impedindo-o de ser traduzido na parte anterior do embrio (Dubnau e Struhl, 1996). Os mecanismos pelos quais a regulao gnica da traduo determina o eixo ntero-posterior do embrio de Drosophila sero detalhados no Captulo 14. Isso parece ser uma soluo exeqvel para a especificao axial quando o embrio do estgio precoce de clivagem permanece um sinccio que permite a formao de tais gradientes. Porm, experimentos recentes (Evans et al., 1994) mostraram que tal controle da traduo da especificao celular tambm pode ocorrer em embries que formam clulas logo aps a fecundao. No nematdeo C. Elegans, muito da embriognese precoce depende da protena GLP-1. Essa um receptor da superfcie da clula que recebe sinais de clulas posteriores para
Semelhanas na a regulao de mRNAS hunchback e glp-1 atravs de suas 3UTRs. (A) A 3UTR da mensagem hunchback contm vrias regies consideradas essenciais para a ligao de Nanos e a supresso da traduo. Esses elementos de resposta nanos consistem nos motivos GUUGU e AUUGUA. Os mesmos elementos podem ser vistos na 3UTR da mensagem glp-1. (B) Modelo para a regulao da traduo de hunchback e glp-1. Ambas mensagens esto distribudas uniformemente atravs do ovo e embrio precoce. Em ambos os casos, a mensagem reprimida na parte posterior do embrio. O regulador da traduo hunchback a protena Nanos localizada posteriormente. O regulador da traduo de glp-1 ainda no conhecido mas pode ser a protena PAL-1. (Segundo Evans et al., 1994.)
especificar destinos das clulas anteriores (veja Captulo 17). Ela ativa entre os estgios de clivagem de 4 28 clulas. Colorao por anticorpos mostra que as nicas clulas que contm essa protena so os descendentes da clula anterior do estgio de 2 clulas. Porm, hibridizao in situ mostrou que a mensagem materna para essa protena encontrada em todas as clulas do embrio (Figura 12.17). A clula posterior do estgio bicelular e sua prognie parecem ter um inibidor da traduo do RNA glp-1. Esse inibidor no foi ainda encontrado, mas o seqenciamento das 3UTR mostrou que o mRNA gip-1 tem uma 3UTR com as mesmas seqncias que reconhecem Pumilio e Nanos (Figura 12.18). Assim, as clulas anteriores de C. Elegans, tal como as de Drosophila, so especificadas pela regulao gnica da traduo.
Mecanismos para a regulao da traduo das mensagens dos ocitos

No Captulo 4, vimos evidncia de que o ocito contm RNAs mensageiros que estavam presentes mas no traduzidos at a fecundao ou ativao do ocito (como na ativao da progesterona da r pouco antes da fecundao). H atualmente ao menos 5 mecanismos que regulam a traduo do mRNA do ocito. Trs deles envolvem a
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disponibilidade de mRNAs; os outros dois envolvem a eficincia da traduo do mRNA. A maioria das espcies provavelmente usa mais de um mecanismo para regular a traduo do mRNA do ocito. A pergunta fundamental , Como so recrutados os mRNAs para os polissomos? Embora o ocito e os blastmeros precoces contenham a mesma populao de mensagens, diferentes subconjuntos esto sendo traduzidos no ovo e no embrio (Young e Raff, 1979; Mermod et al., 1980; Rosenthal et al., 1990; Taylor e Smith, 1985). A pergunta ento se torna, Como mRNAS que estavam dormentes no citoplasma do ocito repentinamente adquirem a competncia de serem traduzidos? A Hiptese da Mensagem Materna Mascarada Essa hiptese sustenta que as mensagens do ocito esto mascaradas fisicamente pelas protenas, prevenindo os mRNAs se prenderem aos ribossomos. Na maturao ou fecundao, as protenas mascaradoras se desligariam, permitindo ao mRNA ser traduzido. RNA mensageiro nunca encontrado sem protenas. Porm, o tipo de protena associada com o RNA pode variar. Spirin, em 1966, props que o mRNA do ocito estocado em informossomos (informosomes), complexos de ribonucleoprotenas nos quais o mRNA est mascarado. As mensagens mascaradas seriam incapazes de se ligar aos ribossomos, e assim no seriam traduzidas. Na fecundao, as protenas mascaradoras seriam liberadas (possivelmente devido s alteraes inicas ocorrendo durante a fecundao) e a mensagem estaria livre para iniciar a traduo. Apoio para essa hiptese apareceu rapidamente. Em 1968, Infante e Nemer acharam que o ovo no-fecundado do ourio-do-mar contm partculas de RNP que sedimentam mais lentamente que os ribossomos, e Gross e colaboradores (1973) acharam que essas partculas contm vrios mRNAs. Apoio para a hiptese da mensagem materna mascarada veio de experimentos mostrando que enquanto o mRNA do ovo no-fecundado estocado em RNPs no pode ser traduzido, os mesmos RNAs podiam ser traduzidos se seus RNPs fossem colocados em solues mimetizando o estado inico mudado do ovo aps a fecundao (Jenkins et al, 1978; Raff, 1980). Foi proposto que o influxo de sdio durante a fecundao poderia desestabilizar a partcula de RNP, permitindo assim a traduo de seu mRNA. Tal desmascaramento poderia estar ocorrendo no molusco bivalve Spisula, no qual os mRNAs codificando a pequena subunidade de ribonucleotdeo redutase e ciclina A so severamente reprimidos nos ocitos, e eles no so traduzidos at a fecundao. Dois procedimentos podem desmascarar essas mensagens. Primeiro, altas concentraes de sal (KCL 0,5 M) permitem a esses mRNAs produzir protenas; assim tambm o faz a remoo de certas seqncias de bases nas regies 3 notraduzidas dessas mensagens (Figura 12,19; Standart et al., 1990). H regies nas 3UTRs de ambas mensagens que so muito semelhantes, podendo constituir stios de ligao para uma protena de 82-kDA que se liga 3UTR desses mRNAs (Standart, 1992). Na fecundao, essa protena fosforilada, e parece que a forma fosforilada no pode mais bloquear a traduo. A fosforilao dessa protena poderia ser conseguida pela quinase cdc2 que ativada na fecundao (Walker et al., 1996). Outro apoio para a hiptese da mensagem mascarada vem da anlise da traduo da mensagem codificando o receptor-1 do fator de crescimento do fibroblasto de Xenopus. Essa mensagem est presente, mas no traduzida em ocitos em crescimento. Ela comea a ser traduzida quando a progesterona inicia a maturao meitica. Robbie e colaboradores (1995) mostraram que a nova traduo no depende do alongamento da cauda poli(A) nem da translocao da mensagem. Ao contrrio, parece haver uma protena de 43-kDA que est associada com a 3UTR do mRNA Xfgfr1 e que possivelmente removida quando a progesterona estimula a maturao do ocito. Essa associao estoca o RNA 5S sob uma forma inativa at ser mais tarde incorporado em novos ribossomos. Ocitos de anfbios contm protenas especficas que se ligam a alguns mRNAs mas no a outros (Richter e Smith, 1984;
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(A) Extrato RNA
(B) KCI RNA antisenso (ug/ml)
Figura 12.19
Desmascarando a pequena subunidade da ribonucleotdeo redutase (RR) em ocitos de moluscos. (A) A mensagem RR do molusco est presente mas no traduzida nos ocitos. Extratos de ocitos (pista 1) ou ovos ativados (pista 2) foram misturados com ribossomos, fatores de traduo, aminocidos radioativos e traduzidos in vitro. As protenas foram corridas em um gel, e auto-radiografadas. A protena RR produzida no extrato do ovo, mas no no extrato do ocito. Quando o mRNA dos ocitos (Pista 3) e dos ovos (pista 4) foram isolados e separados de todas as protenas (por extrao com fenol), a mensagem RR foi traduzida em ambos os casos. (B) O grau de desmascaramento depende da presena de uma alta concentrao de sal ou da adio de mRNA antisenso, que bloqueia o stio ligante de protena da 3UTR. (Segundo Standart et al., 1990.)
Audet et al., 1987; Swiderski e Richter, 1988), mas no sabido se essas protenas mascaram funcionalmente RNAs endgenos. possvel que essas protenas facilitem a ligao de uma protena mascaradora de RNA geral que se associaria com o mRNA fazendo com que ele fique intraduzvel. A protena FGRY2 ativa em ocitos de Xenopus poderia ser uma tal protena mascaradora geral (Bouvet e Wolffe, 1994). Essa protena se complexa com certos transcritos de ocitos que esto sendo transcritos no ncleo e capaz de silenciar tais mensagens. O desempacotamento global de tais mensagens na fecundao pode envolver alteraes inicas, a fosforilao de certas protenas, ou mudanas na composio do RNP. A Hiptese da Cauda Poli(A) Estudos recentes demonstraram que a poliadenilao alterada crtica para estabelecer o momento da traduo do mRNA do ocito e que essa poliadenilao alterada regulada pela regio 3 no-traduzida. A 3UTR pode regular a eficincia da traduo de mensagens do ocito controlando o tamanho da cauda poli(A). Em ocitos, o encurtamento dessa cauda no condena a mensagem extino. Apenas reprime sua capacidade de ser traduzida (Hyman e Wormington, 1988). Essa represso muitas vezes temporria. Em ocitos de camundongo, aqueles mRNAs que esto sendo usados para o crescimento e metabolismo do ocito retm suas longas caudas poli(A) e so imediatamente traduzidos. Entretanto, aqueles mRNAs que devero ser estocados no ocito para traduo na maturao meitica (logo antes da ovulao) ou na fecundao tendem a perder a maior parte da suas caudas poli(A) quando entram no citoplasma. Esses
Peso molecular (KDa)
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Ncleo Ocito mRNA nuclear poliadenilado
Remoo da cauda poli(A) Ocito primrio imaturo e em crescimento Recomeo da meiose Mensagem Mensagem Cauda poli(A)
Dormente Adenilao
Ativamente traduzido Desadenilao
Cauda poli(A) Ocito em maturao
Ativamente traduzido
Dormente
Figura 12.20
Modelo para a regulao da traduo dos mRNAs do ocito do camundongo. Os mRNAs a serem usados no metabolismo do ocito tm seqncias de poliadenilao em suas 3UTRs e retm suas caudas poli(A). Esses mRNAs so traduzidos at a maturao meitica (logo antes da ovulao), quando perdem suas caudas poli(A). Aqueles mRNAs que permanecem traducionalmente dormentes at a maturao meitica tm elementos de poliadenilao citoplasmtica (CPEs), assim como suas seqncias de poliadenilao, e eles perdem suas caudas poli(A) no citoplasma do ocito imaturo. Quando a maturao meitica comea, as caudas so restauradas e a traduo dessas mensagens iniciada.
RNAs somente retm entre 15 e 90 resduos de adenilato (Figura 12.20). Na maturao meitica, uma inverso ocorre. Aqueles mRNAs que haviam sido ativamente traduzidos perdem suas caudas poli(A) e no mais funcionam, enquanto aqueles mRNAs pouco adenilados que haviam sido estocados, rapidamente adquirem longas caudas poli(A) (150 a 600 adenilatos) e so traduzidos em protenas (Vassalli et al., 1989; Huarte et al., 1992). Em mamferos, as mensagens que so traduzidas no ocito imaturo tm uma seqncia padro AAUAAA de poliadenilao. Essas mensagens retm suas caudas poli(A) at o recomeo da maturao meitica. Nesse momento, suas caudas so desadeniladas, e se tornam inativas para a traduo. Aqueles mRNAs que iro ser estocados no citoplasma do ocito imaturo para traduo aps a maturao tm suas caudas poli(A) cortadas imediatamente aps abandonarem o ncleo. Essas mensagens tem dois sinais em suas 3UTR: a seqncia de poliadenilao AAUAAA e uma seqncia conhecida como o elemento de poliadenilao citoplasmtica (CPE), tambm chamado de elemento de controle da adenilao (ACE); sua seqncia consensual em camundongos e rs UUUUUAU (Fox et al., 1989; Bachvarova, 1992; Huarte et al., 1992). Quando recomea a maturao do ocito, esses transcritos estocados so novamente poliadenilados (provavelmente pela mesma enzima de poliadenilao encontrada no ncleo) e tornam-se ativos para traduo. A aquisio de uma longa cauda crtica para o comeo da traduo do mRNA estocado do ocito; o controle desse alongamento depende da presena ou ausncia de um CPE.
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Em ocitos de Xenopus, a histria semelhante porm com algumas variaes.* Tal como os mRNAs de ocitos de mamferos, uma longa cauda poli(A) necessria para a traduo da mensagem. Uma troca na traduo de RNA ocorre durante a maturao. Quando a vescula germinativa (o ncleo haplide) se desintegra para iniciar a diviso meitica, liberam-se fatores de desadenilao. Os mRNAs sem CPEs so desadenilados, enquanto as mensagens contendo CPEs so capazes de ser poliadeniladas (Fox e Wickens, 1990; Varnum e Wormington, 1990; Varnum et al., 1992). Tanto a seqncia de adenilao como o CPE so necessrios para a ativao da traduo dessas mensagens, mas em alguns casos, a presena per se de uma cauda poli(A) no suficiente. Nesses casos o processo de poliadenilao crtico para a traduo da mensagem. Isto , um mRNA injetado com uma cauda poli(A) prexistente no ser traduzido. possvel que o processo da poliadenilao tambm remova um inibidor protico que mascara a mensagem (Fox et al., 1989; McGrew et al., 1989). Existem algumas diferenas entre os CPEs, e essas diferenas podem produzir diferentes padres de poliadenilao nas mensagens que os contm (Paris e Richter, 1990). Por exemplo, um certo CPE com um trecho de 12 bases U inibe a poliadenilao daqueles mRNAs que os contm, durante o perodo de maturao do ocito. Porm, aps a fecundao, os mRNAs contendo esse CPE so poliadenilados e traduzidos em protenas (Simon et al., 1992). Isso sugere que h fatores especficos que se ligam a esses CPEs em diferentes perodos. Joel Richter e colaboradores (Paris et al., 1991; Hake e Richter, 1994) demonstraram que uma protena do ocito de 58k-Da, CPEB, se liga a um CPE especfico (UUUUUAAU). Essa protena foi isolada por cromatografia de afinidade de RNA, na qual protenas do ocito de Xenopus foram incubadas com partculas de sefarose ligada a RNAs contendo um CPE com a seqncia UUUUUAAU. A ligao de CPEB a esse CPB previne a poliadenilao e pode inibir a traduo dessas mensagens at a maturao do ocito (logo antes da fecundao). Nesse momento, CPEB fosforilada por quinase cdc2. (A quinase cdc2 ativada pela progesterona, que estimula o ocito a reiniciar a meiose antes da fecundao.) Essa fosforilao parece permitir a CEPB recrutar uma polimerase poli(A) citoplasmtica para a mensagem (Ballantyne et al., 1995; Gebauer e Richter, 1995). Essas mensagens ficam poliadeniladas e so subseqentemente traduzidas. A quinase cdc2 (conforme lembramos do Captulo 5) somente ativa quando complexada com uma ciclina. As protenas ciclinas tambm esto sob regulao para traduo, e as 3UTRs dos mRNAs das ciclinas determinam os momentos que elas sero traduzidas. Em ocitos de Xenopus, os mRNAs para ciclinas A1, B1 e B2 tm todos, caudas poli(A) truncadas. Cinco horas aps o sinal de progesterona (na primeira metfase meitica), as caudas poli(A) dessas mensagens de ciclina so alongadas, e comea sua traduo (Sheets et al., 1994). Isso demonstra que avisos desenvolvimentais podem regular qual conjunto de mRNAs deve tornar-se funcional. Isso mostra tambm que existem cascatas de regulao gnica da traduo durante as horas precedendo a ativao do ncleo. A ativao de mensagens pela poliadenilao parece ser um processo de importncia crtica no desenvolvimento. No entanto, ainda no sabemos porque caudas poli(A) curtas no so capazes de iniciar a traduo, enquanto caudas
*As funes das seqncias poli(A) e CPEs diferem entre ocitos de camundongo e de r. Nos ocitos de r, a desadenilao que ocorre na maturao o estado de ausncia, e desadenilao e inativao para traduo ocorrem, a no ser que CPE esteja presente. A poliadenilao ir ativar a mensagem mascarada e manter a traduo dos mRNAs associados aos polissomos. Em ocitos de camundongo, o CPE controla tanto a poliadenilao como a desadenilao. Em ocitos imaturos, mensagens sem CPE so imediatamente traduzidas, enquanto mRNAs contendo CPE so desadenilados e inativados para a traduo. Na maturao, o sistema do camundongo torna-se semelhante ao de Xenopus, e os RNAs contendo CPE so agora poliadenilados e ativados para traduo (Huarte et al., 1992).
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Figura 12.21
[3H] Valina incorporada na protena (cpm x 103)
Evidncia da ineficincia da sntese protica em nveis de pH pr-fecundao. O sistema de traduo in vitro feito de ovos no-fecundados mantido a pH 6.9 ou dializado para pH 7.4. Mensagens endgenas so traduzidas muito mais eficientemente no pH ps-fecundao. (Segundo Winkler e Steinhardt, 1981.)
maiores o podem. Uma possibilidade (Kuge e Richter, 1995) que a adio de 3poli(A) estimula a metilao do cap 5. Eles encontraram que a maturao meitica estimulada por progesterona causava a metilao de caps de mRNA, e que essa metilao podia ser inibida prevenindo-se a poliadenilao. Assim, os terminais 3 e 5 da mensagem parecem interagir. Outra possibilidade (Hentze, 1997) que a cauda poli(A) se ligue a um fator de inibio na subunidade ribossmica 40S para estimular a traduo. A Hiptese da Eficincia da Traduo
Tempo (minutos)
Os modelos precedentes da regulao da traduo assumem que o aparelho de traduo capaz de traduzir eficientemente qualquer mensagem, mas que o mRNA e os ribossomos so conservados separados por meios fsicos ou qumicos. Isso no precisa ser o caso. O baixo pH inicial do ocito por si mesmo capaz de impedir a sntese protica. Conforme discutido no Captulo 4, h uma dramtica liberao de ons de hidrognio durante a fecundao do ovo do ourio-do-mar, resultando em uma elevao do pH citoplasmtico. Quando Winkler e Steinhardt (1981) aumentaram o pH de um lisado de ocitos (pH 6.9) para aquele do zigoto (pH 7.4), eles obtiveram um surto de sntese de protena semelhante aquele observado durante a fecundao (Figura 12.21). Hille e colegas (1985; Danilchik et al., 1986) sugeriram que a mudana de pH ativa o aparelho de traduo do ovo. Ribossomos e fatores de iniciao derivados de ovos no-fecundados eram menos ativos na traduo que aqueles derivados de ovos fecundados. Ainda mais, a injeo de mensagem exgena de globina em ovos no-fecundados no aumentou a quantidade de protena sendo sintetizada. O mRNA da globina estava sendo traduzido s custas de outras mensagens, sugerindo que h uma quantidade limitada de alguma poro do aparelho tradutor. O fator limitante , provavelmente, um fator iniciador da traduo. A adio de eIF2B (o fator reciclante ligante de GTP) ou eIF4F (que contm protenas cap ligantes) a um lisado preparado de ovos no fecundados aumentou a eficincia tradutora desse lisado (Colin et al., 1987; Lopo et al., 1988). A alcalinizao do citoplasma do ovo pode servir tanto para desmascarar o mRNA (fisicamente ou atravs da poliadenilao) como para ativar fatores de iniciao. Apoio para essa noo vem de Winkler e colegas (1985; KelsoWinemiller e Winkler, 1991), que viram aumentar de trs vezes a ligao do mRNA a ribossomos aps elevao do pH. Outros sistemas de ativao do mRNA: Mensagens sem Cap e Mensagens Seqestradas
mRNA SEM cap. Os terminais 3 e 5 modificados do RNA mensageiro so necess-
rios para a traduo eficiente. J vimos como diferenas no comprimento da cauda 3poli(A) pode efetuar traduo diferencial de RNA em ocitos de Xenopus e Spisula. Certas mariposas usam um mecanismo para controle de traduo envolvendo mudanas no cap 5 (Kastern et al., 1982). Para serem traduzidas eficientemente, quase todas as mensagens eucariticas necessitam de um cap de 7-metilguanosina em seus terminais 5 (Shatkin, 1976). As mensagens armazenadas da lagarta chifruda do tabaco tm um cap no-metilado. A guanosina est presente, mas o grupo
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metila no foi adicionado. Tais mensagens no so traduzidas em protenas em um sistema livre de clulas. Porm, na fecundao, h um surto de metilao nesses ocitos, e o caps so completados. Os mRNAs com os cap completos so ento capazes de se ligar aos ribossomos e iniciar a traduo. Dados sobre mensagens artificiais sugerem que estruturas secundrias (como alas tipo grampos de cabelo) na regio 5 no-traduzida, tambm podem regular o perodo da traduo do RNA no ocito (Fu et al., 1991).
mRNA SEQESTRADO. Em alguns casos, o aparelho sintetizador de protenas est compartimentalizado, impedindo que o mRNA (dentro do RNP) chegue perto dos ribossomos (Moon et al., 1982). Os mRNAs das histonas do ocito do ourio-domar parecem ser regulados por esse tipo de restrio. As mensagens de histona do ocito no so encontradas no citoplasma. Em lugar disso, esto localizadas no grande proncleo do ovo no-fecundado. Somente quando o proncleo se desintegra no fim da fecundao, o mRNA da histona entra no citoplasma (Figura 12.22; De Leon et al., 1983). Isso pode no ser o caso para outras mensagens. Menos de 0.1 porcento do mRNA total do ovo no-fecundado se encontra no proncleo (Angerer e Angerer, 1981; Showman et al., 1982). A observao de que algumas mensagens maternas assim como ribossomos individuais esto ligadas ao citoesqueleto (Moon et al., 1983) sugere que o citoesqueleto tambm pode separar mRNAs dos ribossomos. possvel que todos esses mecanismos de controle da traduo sejam utilizados no mesmo ocito. O ovo desenvolveu numerosos meios de regular a traduo do seu mRNA armazenado, e as espcies esto habilitadas a usar vrios desses mecanismos ao mesmo tempo.
70 minutos 80 minutos
80 minutos
90 minutos
Figura 12.22
Seqestro das mensagens de histona do ocito do ourio-do-mar. A sonda de cDNA que reconhece a mensagem da histona hibridizada para ovos de ourio-do-mar fixados em vrios perodos ps-fecundao. A auto-radiografia mostra a mensagem a ser seqestrada no proncleo materno at sua degradao 80-90 minutos aps a entrada do espermatozide. (Segundo DeLeon et al., 1983, cortesia de L. e R. Angerer.)
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&
Densidade da banda de tRNA (I)
Especulaes
A Ativao do Genoma Embrionrio

Frao de clulas com membranas mveis
Sntese de RNA (gros por ncleo) (o) Frao de clulas mveis (G)
PERODO de eventos do desenvolvimento difere enormemente entre espcies animais. Vinte e quatro horas aps a fecundao, larvas de Drosophila eclodiram e esto ocupadas comendo; embries de anfbios esto ou nos estgios de gstrula tardia, ou nurula precoce; e o embrio do ourio-do-mar uma blstula tardia ou gstrula precoce com centenas de clulas. Embries de mamferos no se apressam. Aps 24 horas de desenvolvimento, um zigoto de camundongo somente se dividiu uma vez, e o ovo humano ainda tem 6 horas at sua primeira clivagem. Os organismos tambm diferem no perodo e aspereza, da transio do controle citoplasmtico para a regulao do desenvolvimento pela transcrio nuclear. Na maioria das espcies estudadas, o embrio precoce um mundo de RNA onde o genoma nada conta (Wickens, 1992). Em outros embries, a transcrio nuclear se inicia logo aps a fecundao, e novos produtos dos genes so vistos durante o primeiro ciclo celular (Tabela 12.4). Embries de Xenopus parecem se desenvolver atravs do estgio de clivagem sem necessidade de transcrio nuclear. Conforme mencionado no Captulo 5, o ncleo essencialmente inativo at a transio da blstula intermediria ao fim da 12 diviso celular (Figura 12.23; Newport e Kirschner, 1982). At o momento dessa tran-
Densidade da banda Sntese de RNA
Clivagem Tempo (minuto)
Figura 12.23
Ativao da transcrio e motilidade da membrana em Xenopus aps a dcima segunda diviso. A transcrio foi avaliada por auto-radiografia, pelo nmero de gros de prata sobre os ncleos de embries imersos em uridina radioativa e pela ativao de um gene de tRNA clonado, cujo produto radioativo podia ser analisado medindo-se a densidade da banda no gel auto-radiografado. A motilidade foi avaliada determinando-se a frao de clulas mostrando pseudpodos ou vesculas em registros de vdeo. (Segundo Davidson, 1986).
sio na blstula intermediria, o desenvolvimento emprega os materiais estocados no citoplasma do ocito. Finalmente, a transcrio iniciada no ncleo do embrio. Aps a transio da blstula intermediria, diferentes genes so acionados em momentos diferentes, mas os genes ativados primeiro podem estar sendo ativados por fatores maternos no ocito. A protena OZ1 um fator de transcrio produzido no ocito em de-
senvolvimento. Ele liga-se uma seqncia de DNA de 14 pares de bases encontrada nos promotores de vrios genes que so acionados no momento, ou pouco depois da transio da blstula intermediria (Ovsenek et al., 1992). Se outros genes (como o gene -globina de Xenopus) estiverem conectados a essa seqncia, eles ficaro expressos na transio da blstula intermediria; porm, se a seqncia for
Tabela 12.4 Ativao de genomas embrionrios e durao do mRNA materno funcional Organismo Mamfero (Mus musculus) Anfbio (Xenopus laevis) Equinodermo (S. purpuratus e outros ouriosdo-mar) Inseto (Drosophila melanogaster) Perodo da primeira transcrio observvel do ncleoa Estgio tardio de 1-clula (11-17 h) Clivagem precoce ( 32 clulas) da blstula intermediria (3 h) Zigoto (estgio pronuclear) ( 0.5 h) Perodo da maior nova transcrio nucleara Mrula precoce de 8-16 clulas (dia 3) 12a clivagem (4000 clulas) da blstula intermediria (7 h) Blstula intermediria (~128 clulas) (11h) Blastoderma celular aps a 14a diviso nuclear (3.5 h) Longevidade da mensagem materna funcional Estgio de clivagem de 4 clulas (dia 2-4) Estgio de nurula (15-30 h) Blstula tardia (15 h) Organognese intermediria (~15 h)
Blastoderma sincicial aps a 10a diviso nuclear (2.5 h)
Fonte: Adaptado de Wilt, 1964; Woodland e Ballantine, 1980; Clegg e Piko, 1983; Gilbert e Solter, 1985; Poccia et al., 1985; Weir e Kornberg, 1985; Davidson, 1986; Edgar e Schubiger, 1986; Shiokawa et al., 1989. a Perodos indicam incubao nas temperaturas apropriadas.
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mutada eles no sero corretamente expressados (Figura 12.24). possvel que essa protena OZ1 seja por si mesma inativa, at que algum outro fator (talvez associado com o alongamento do ciclo celular) a ative. O conceito de que protenas maternas podem ativar o genoma durante a transio da blstula intermediria apoiado por investigaes sobre o mutante o da salamandra axolotle. Essa uma mutao de efeito materno no qual fmeas homozigotas produzem ovos que so fecundados com sucesso sendo completamente normais at os estgios de clivagem tardia e blstula precoce (Briggs e Cassens, 1966). Na blstula intermediria, ovos descarregados por uma fmea o/o tm mitoses mais lentas e continuam a formar um lbio do blastporo dorsal, mas sempre param na gastrulao. Malacinski (1971) e Carroll (1974) mostraram que em embries de fmeas do tipo selvagem, RNA novo e sntese protica comeam nesse estgio de blstula intermediria. No entanto, as blstulas intermedirias de ovos de mes o/o no sofrem esse surto de sntese de protena e tm um padro de protenas idntico aquele produzido por zigotos enucleados (Figura 12.25). Briggs e Cassens (1966) demonstraram que os embries de mes o/o no tinham um fator que ativa o genoma nuclear da blstula intermediria. Na ausncia de tal fator, o nico desenvolvimento que ocorre aquele que pode ser provido pelo mRNA estocado no ocito. Em anfbios, h material estocado no ocito suficiente para permitir ao embrio entrar na gastrulao. Porm, sem a sntese de novo RNA, no pode ocorrer ulterior desenvolvimento. Em Drosophila tambm parece haver uma transio da blstula intermediria dos mRNAs e protenas do citoplasma do ocito para a transcrio nuclear. Essa transio primeiro vista aps a dcima diviso nuclear. Esse o primeiro ciclo com uma fase G2, que aumenta de comprimento entre 10 minutos aps o dcimo ciclo at 60 minutos aps o dcimo quarto. Na fase G2 do dcimo quarto ciclo, o genoma est transcrevendo no mais alto nvel de atividade visto durante a embriognese (Anderson e Lengyel, 1979; Weir e Kornberg, 1985). Edgar e Schubiger (1986) mostraram que ncleos de Drosophila tornam-se competentes para transcrever no ciclo 10 mas que a maioria dos genes necessita de fases G2 mais longas para ficarem ativados. A alta atividade transcricional de embries de ciclo 14 pode ser induzida prematuramente, esten-
Auto-radiograma
Sem molde
Sem intensificador MBT
globina
Intensificador MBT tipo selvagem
globina
Intensificador MBT mutante
globina
Outro intensificador MBT mutante
globina
Figura 12.24
Efeito do intensificador da transio da blstula intermediria (MBT) ligante de OZ1. A seqncia de DNA que ativa a transcrio na MBT para o gene GS17 de Xenopus laevis foi colocada em um gene da -globina e injetada em ocitos de Xenopus. Essa construo de globina ficou expressa no estgio de blstula intermediria. Genes de globina sem esse intensificador ou com um intensificador MBT mutado no mostraram expresso significativa nesse estgio. (Segundo Ovsenek et al., 1992.)
dendo-se artificialmente o perodo G2 de embries jovens com cicloheximida. Essa ativao pode ser conseguida com embries to jovens como os do dcimo ciclo, mas no antes. Parece, portanto, que a maioria dos genes ficam capacitados para a ativao durante o ciclo 10, mas no iniciam sua transcrio at o ciclo 14.
Ourios-do-mar no apresentam uma transio da blstula intermediria distinta. Embora seus ovos enucleados possam se desenvolver atravs dos estgios de blstula, e embora certamente h um surto de transcrio nuclear a partir dos ncleos da blstula intermediria, no parece haver perodo no desenvolvimento do
Figura 12.25
Incorporao de [3H]uridina no RNA dos embries de axolotles tipo selvagem e mutante o/o. Embries em estgio de blstula foram incubados no precursor RNA radioativo por 3 horas, lavados, fixados, corados e observados por auto-radiografia. (A) Clulas embrionrias normais mostrando intensa radioatividade, indicando sntese de RNA. (B) Embrio de uma fmea o/o. Colorao est presente, mas no se v marcao significativa, indicando que pouca ou nenhuma transcrio havia ocorrido. (Segundo Carroll, 1974.)
490
ourio-do-mar em que o ncleo embrionrio no esteja funcionando. Baixos nveis de transcrio (incluindo novas mensagens de histonas) podem ser vistos em proncleos mesmo antes de sua fuso (Poccia et al., 1985). Essas mensagens recm-transcritas entram no pool maior do mRNA materno. A cromatina das quatro primeiras clivagens feita primariamente com histonas estocadas no citoplasma do ocito e histonas sintetizadas de mensagens maternas. Do estgio de 16 clulas em diante, porm, a maioria das histonas sintetizada de mensagens transcritas de ncleos de clulas embrionrias (Goustin e Wilt, 1981). Esse padro est em contraste marcado com aquele de embries de Xenopus, nos quais um grande pool de protena histona estocada pela me, e um grande suprimento de mensagem histona estocada no ocito so utilizados por milhares de clulas. Embries de mamferos, ascdios, nematides e moluscos tambm parecem iniciar a transcrio dentro do primeiro ciclo celular (Schauer e Wood, 1990). Porm, tal como em muitos eventos do desenvolvimento, no se pode dizer que os mamferos tenham aperfeioado uma estratgia uniforme. No grupo mamfero mais estudado, os camundongos, o genoma embrionrio extremamente ativo duran-
te o estgio de 2 clulas. Entre os estgios de 1 e 2 clulas do embrio, mais de dois teros das protenas sofrem uma alterao de cinco vezes em sua sntese (Latham et al., 1991, 1992). Quando cultivadas com o inibidor da transcrio aaminitina (que bloqueia a RNA polimerase II), ovos de camundongo so bloqueados no estgio bicelular (Flach et al., 1982). Em camundongos, os mRNAs maternos persistem por cerca de dois dias- a grosso modo, o mesmo tempo que em outros filos- e em seguida, durante o segundo dia, os mensageiros maternos so rapidamente degradados (Clegg e Piko, 1983; Paynton et al., 1988). medida que os produtos gnicos codificados pelas mensagens maternas decaem, eles so substitudos por novas protenas produzidas de mRNA que est sendo recm-transcrito do ncleo. Na maioria dos casos, os cromossomos derivados do espermatozide so provavelmente ativados simultaneamente com cromossomos derivados do ovo (Gilbert e Solter, 1985). Latham e colegas (1992) transplantaram ncleos para diferentes citoplasmas e demonstraram que o citoplasma muda durante a parte tardia do estgio de 1 clula. O citoplasma da clula precoce do embrio de 1 clula no suporta a transcrio de genes de ncleos de embries mais tardios. Porm, o ci-
toplasma de embries tardios de 1 clula o suporta. Como inibidores da protenaquinase (PKA) dependente de cAMP inibem a competncia do citoplasma para suportar a transcrio, possvel que a ativao de PKA seja essencial para a aquisio pelo citoplasma de seu estado transcricionalmente permissivo. Outros mamferos no seguem necessariamente o mesmo programa. A sntese do mRNA humano primeiro vista no estgio de 4 clulas, e inibidores da transcrio bloqueiam o desenvolvimento no estgio de 4- a 8-clulas. Em vacas e ovelhas, a atividade transcricional vista nos estgios de 8- a 16-clulas (Braude et al., 1988; Telford et al., 1990). Em todas as espcies animais observadas, h um perodo de tempo em que os fenmenos do desenvolvimento precoce so controlados pelas mensagens e protenas estocadas no citoplasma do ocito. Na maioria das espcies (os mamferos sendo a exceo), o genoma nuclear ativado muito antes das mensagens maternas serem degradadas, fazendo com que ambos conjuntos de mRNAs sejam traduzidos simultaneamente. Finalmente, quando as mensagens maternas tiverem sido degradadas nos dias 1 e 2, os transcritos do genoma embrionrio se tornaro mais importantes.
Regulao dos genes da traduo em larvas e adultos

O controle da traduo no existe somente para ovos e seus embries precoces. Estudos recentes mostraram o uso generalizado da regulao dos genes da traduo para vrios processos crticos do desenvolvimento mais tardio. Tal como em estudos sobre a embriognese precoce, as 3UTR mostraram ter um papel crtico. Essa regio da mensagem por muito tempo vista como terra perdida de informao gentica (Wickens, 1992) est comeando a se tornar uma das reas mais interessantes da regulao gnica do desenvolvimento. Determinao de Gametas em C. elegans Um papel particularmente dramtico para a 3UTR no mRNA mascarado visto em Caenorhabditis elegans. Esse verme nematide tem um corpo feminino, mas hermafrodita, produzindo tanto espermatozide como vulo em perodos diferentes. As primeiras clulas germinativas a se diferenciarem no nematide tornam-se espermatozide, os quais so armazenados no tero para uso posterior. Aps a quarta muda (de larva para adulto), as clulas germinativas deixam de produzir espermatozide e comeam a produzir vulos. Esses vulos iro finalmente ser fecundados pelo espermatozide estocado. O processo determinando qual o caminho a clula germinativa segue para espermatozide ou para vulo depende da represso da traduo de mensagens diferentes. A iniciao da formao de espermatozide conseguida pela represso da
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mensagem tra-2. A protena TRA-2 essencial para o desenvolvimento de vulos e clulas do organismo feminino, e a represso da traduo do mRNA tra-2 em clulas germinativas faz com que elas se tornem espermatozide. A 3UTR dessa mensagem contm duas regies de 28 nucleotdeos, cada uma das quais parece ligar uma protena repressora putativa que sintetizada durante estgios larvais associados espermatognese. Se essas regies forem mutadas, a traduo de mRNA tra-2 no reprimida, nenhum espermatozide produzido, e o nematide fmea funcional em lugar de hermafrodita (Evans et al., 1992). Uma protena que se liga a essas regies foi isolada; e pode mediar a represso da traduo (Figura 12.26; Goodwin et al., 1993). A histria no termina aqui. A mudana de espermatognese para ovognese tambm requer a supresso da traduo de mRNA fem-3 atravs de sua 3UTR. A protena FEM-3 crtica para a especificao de clulas do organismo masculino e produo de espermatozide. A transcrio do gene fem-3 inibida pela protena TRA-2, mas a represso de mensagens fem-3 existentes tambm necessria. A represso da traduo parece ser afetada pela ligao de um inibidor de traduo pela 3UTR do mRNA fem-3 (veja Figura 12.26; Ahringer and Kimble, 1991; Evans et al., 1992). Assim, a iniciao da espermatognese em nematides hermafroditas e a transio de espermatognese para ovognese parece ser regulada pela represso da traduo atravs da 3UTR. RNA Antisenso Natural Parece que tudo que as protenas podem fazer, os RNAs tambm podem. Se protenas podem regular a traduo ligando-se a stios especficos na 3UTR de RNAs mensageiros, assim tambm o podem fazer RNAs pequenos. O RNA de controle da traduo foi originalmente proposto por Bester e colaboradores, em 1975. Desde ento, foi encontrado em C. elegans e pintos. Caenorhabditis elegans faz jus a seu nome, tendo desenvolvido uma soluo particularmente elegante para o problema do controle da expresso gnica larval (Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993). Altos nveis do fator de transcrio LIN-14 especificam a sntese protica em rgos larvais precoces. Depois disso, a protena LIN-4 no mais vista, embora mensagens lin-4 sejam detectadas atravs de todo o desenvolvimento. C. elegans capaz de inibir a sntese de LIN-14 de seu mRNA, ativando o gene lin-4. Em mutaes de perda-de-funo de lin-4, a protena LIN-14 sintetizada continuamente, e o desenvolvimento precoce do nematide interrompido. O gene lin-4 no codifica protena alguma. Em vez disso, ele codifica dois pequenos mRNAs (o mais abundante tendo 25 nucleotdeos de comprimento, o outro continuando por mais 40 nucleotdeos)
no-traduzido espermatozides traduzido
traduzido vulos no-traduzido
Figura 12.26
A transio de espermatognese para oognese durante o quarto instar da larva de C. elegans regulada pela traduo das mensagens tra-2 e fem-3. Em ambos os casos, o bloqueio da traduo ocorre atravs da ligao de uma protena inibidora respectiva 3 UTR.
Figura 12.27
Modelo hipottico para a regulao do mRNA lin-14 pelos mRNAs lin-4. (Isso no foi confirmado experimentalmente.) O gene lin-4 no produz um mRNA. Em lugar disso, ele produz RNAs pequenos que no produzem protenas. Esses RNAs so complementares a uma seqncia repetida na 3UTR do mRNA lin-14. (Segundo Wickens e Takayama, 1994.)
Seqncia de codificao Poli(A)
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que so complementares a um stio imperfeitamente repetido na 3UTR de lin-14. A Figura 12.27 mostra um esquema hipottico do que pode estar acontecendo. Parece que a ligao desses transcritos lin-4 para a 3UTR do mRNA lin-14 no sinaliza a destruio da mensagem; antes, previne a mensagem de ser traduzida. [RNA5.html] No embrio do pinto, mRNA antisenso visto regular a sntese do fator do crescimento do fibroblasto bsico (FGF2). Alguns tecidos (como o mesonefro) tm mensagens Fgf2 sem o transcrito antisenso, enquanto outros tecidos (como uma linha no-diferenciada do mesoderma de membros) contm tanto o mRNA de Fgf2 como seu complemento antisenso. Acredita-se que o RNA antisenso conduz a sua prpria degradao e a do transcrito Fgf2 (Kimelman e Kirschner, 1989; Savage e Fallon, 1995). Disjuntores do Controle da Traduo A regulao oposta e coordenada das duas principais protenas ligantes de ferro de mamferos, ferritina e o receptor de transferrina, foi recentemente elucidada (veja Klausner e Harford, 1989; Klausner at al., 1993). Os mRNAs tanto da ferritina como do receptor de transferrina contm regies que ligam uma protena ligante responsiva ao ferro (IRE-BP). A mensagem da ferritina tem essa seqncia em sua seqncia lder (5 para a regio codificadora de protena), enquanto a mensagem do receptor de transferrina contm duas dessas seqncias na sua regio 3 notraduzida. Quando o ferro celular est em baixo suprimento, a protena ligante de ferro no pode ligar o ferro e encontra-se em uma conformao para se ligar a esses mRNAs. Quando se liga seqncia lder da mensagem da ferritina, ela bloqueia sua traduo, impedindo assim a sntese dessa protena de armazenagem de ferro. Simultaneamente a protena se liga ao terminal 3 da mensagem do receptor de transferrina, estabilizando-a contra a degradao e permitindo a produo de mais receptores de transferrina. Os receptores de transferrina trazem mais ferro para o interior da clula (Figura 12.28).
mRNA da FERRITINA IRE-BP ausente Seqncias de reconhecimento para protena reguladora ligante de ferro (IRE-BP) IRE-BP presente IRE-BP liga-se seqncia de reconhecimento
Regio codificadora de protena
Traduo de mRNA
Sem traduo de mRNA
mRNA DO RECEPTOR DE TRANSFERRINA IRE-BP ausente IRE-BP presente Seqncias de reconhecimento para IRE-BP
Figura 12.28
Regulao da traduo coordenada e oposta da ferritina e do receptor da transferrina. Ambas mensagens contm regies que so reconhecidas por uma protena reguladora ligante de ferro (IRE-BP). Na ausncia de ferro intracelular, essa protena se liga a essas mensagens inibindo a traduo do mRNA da ferritina e estabilizando o mRNA para o receptor de transferrina. (Segundo Klausner e Harford, 1989.)
Regio codificadora de protena Degradao de mRNA Sem degradao de mRNA
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Editorao do RNA Um dos mecanismos mais inesperados do controle da traduo foi visto recentemente na regulao das protenas apolipoprotenas-B. Protenas apo-B so componentes de protenas sricas portadoras de lipdios, e so consideradas como tendo um papel preponderante na gnese da arteriosclerose. Apo-B48 (48-kDA) sintetizada no intestino e torna-se parte do complexo de quilomcrons necessrios para absoro e transporte do colesterol e triglicerdeos dietticos. Apo-B100 (100-KDA) produzida no fgado e a principal componente das protenas portadoras de lipdios de densidade muito-baixa, baixa e intermediria. Apo-B100 e Apo-B48 so transcritas do mesmo gene e no se nota processamento diferencial algum para gerar mRNAs diferentes para essas duas protenas. A anlise dos DNAs de Apo-B indica que a mensagem apo-B no fgado codifica todo o peptdeo Apo-B100. A mensagem intestinal, porm, difere daquela do fgado por apenas uma base. Uma transio C-paraU ocorreu, mudando um cdon normal de glutamina (CAA) para um cdon terminador (UAA) no cdon 2153. Essa diferena resulta na formao de uma protena Apo-B48 mais curta no intestino (Chen et al, 1987; Powell et al., 1987). Essa editorao do RNA um exemplo de uma situao em que uma mudana especfica de base feita em um RNA existente, com isso alterando a mensagem. O transcrito primrio do gene apoB no parece ser editado, e a editorao C-para-U pode estar sendo conseguida por um fator contido no ncleo. Por isso, Lau e colegas (1991) concluram que essa editorao do RNA realizada durante os passos de processamento do RNA. A protena responsvel por essa editorao a citidina desaminase (Navaratnam et al., 1995); e pela alterao da estrutura seqencial do RNA prximo da citosina editada, Chen e colaboradores (1990) descobriram duas regies que so crticas para a editorao. Uma a regio de nucleotdeos conservada por vrias espcies de mamferos, e a outra uma seqncia espcie-especfica mais a jusante. Eles postulam uma enzima que reconhece essas duas regies e coloca seu stio cataltico sobre a citosina em questo. A desaminao dessa citosina converte-a em um resduo de uridina (Figura 12.29). At agora tem sido um axioma da biologia molecular que a seqncia de nucleotdeos de uma mensagem, uma vez transcrita, no pode ser alterada. Embora a editorao do RNA seja um evento excepcionalmente raro, tambm visto em certas mensagens de organelas (veja Scott, 1995; Simpson e Thiemann, 1995), na alterao da permeabilidade do on de clcio de certos canais inicos com portal de glutamato, durante o desenvolvimento do crebro de mamferos (Sommer et al., 1991; Higuchi et al., 1993), e na alterao do fator de transcrio WT1 (Sharma et al., 1994).
Enzima editora
Figura 12.29
mRNA Apo-B 5 No espcieespecfico Espcie-especfico
NH 3
Stio cataltico
Stio de reconhecimento
Modelo de um mecanismo enzimtico que poderia permitir a desaminao de uma citosina especfica do mRNA apo-B. Duas regies so necessrias para a editorao do RNA: uma regio que conservada em vrios mamferos e um elemento espcie-especfico que tem uma estrutura tipo grampo de cabelo que poderia ser reconhecida pela enzima. (Segundo Chan, 1993.)
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Subunidades Heme Heme
Heme Heme Subunidades
Figura 12.30
A estrutura da hemoglobina do humano adulto, com quatro cadeias polipeptdicas (duas , duas ) e quatro molculas de heme. (Segundo Dickerson e Geis, 1983.)
Controle da traduo e sntese protica coordenada: Produo de Hemoglobina

Um dos principais problemas da regulao gnica a produo coordenada de vrios produtos de diferentes regies do genoma. Quando uma clula sangnea vermelha em desenvolvimento sintetiza hemoglobina, ela deve garantir que as cadeia de globina, globina e molculas de heme estejam na relao 2:2:4 (Figura 12.30). Qualquer desvio maior dessa relao resulta em molstias severamente debilitantes. A molcula de heme parece regular a sntese proporcional dos componentes da hemoglobina. Esse feito conseguido de duas maneiras. Primeiro, um excesso de heme (i.e., heme no ligado uma protena como a globina) desliga sua prpria sntese (Karibian e London, 1965), inativando sintase aminolevulinato (sintase DALA), a primeira enzima na via de produo de heme (Figura 12.31). Assim, quando existe mais heme presente do que molculas para o ligar, ele no ser mais produzido. Em segundo lugar, o excesso de heme estimula a produo da protena globina (Gribble e Schwartz, 1965; Zucker e Schulman, 1968). Quando heme (ou sua forma oxidada, hemina) adicionado a um sistema de traduo isento de clulas mas que inclui todos os fatores necessrios para traduzir mRNAs (Tabela 12.5), a sntese da globina muito estimulada (Figura 12.32A). Portanto, se no h globina para ligar o heme, o excesso de heme desliga sua prpria sntese e estimula a produo de mais globina. Vrios laboratrios investigaram como uma molcula to pequena como o heme pode regular a sntese protica. Em 1972, Adamson e colegas demonstraram que o efeito estimulador do heme na sntese da globina podia ser imitado pela adio ao sistema de traduo daquelas protenas que esto frouxamente associadas aos ribossomos. Como tais solues so ricas em fatores de iniciao da traduo, cada
Succinil coenzima A + glicina sintase DALA cido aminolevulnico

Inibio
Porfobilingeno
Protoporfirina IX
Heme
Figura 12.31
Regulao por retroalimentao (feedback) da sntese do heme. (Segundo Harris, 1975.)
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Tabela 12.5 Componentes do sistema de traduo in vitro contendo lisato de reticulcitos de coelho Componente Lisato de reticulcitos (1:1) Tampo tris-HCl (pH 7.6) ATP GTP Fosfato de creatina Fosfoquinase de creatina Acetato de magnsio Fonte: Segundo London et al., 1976. Concentrao (em 100 l) 50 l 10 mM 1 mM 0.2 mM 5 mM 10 g 2 mM Componente KCl Mistura proporcional de aminocidos [14 C]Leucina leucina fria Hemina H2O para trazer o volume da reao para 100 l Concentrao (em 100 l) 76 mM 6-170 M 0.8 Ci 26 M 10-30 M
fator foi testado separadamente. Achou-se que o fator 2 de iniciao eucaritica (eIF2) restaurava a sntese protica para lisatos deficientes de heme no sistema de traduo (Figura 12.32B). Esse fator de iniciao responsvel pela combinao com o tRNA iniciador e complex-lo subunidade ribossmica 40S. Qual, ento, a relao entre heme e eIF2? Para responder a isso, London e colaboradores (Levin et al., 1976; Ranu et al., 1976; Ramaiah et al., 1992) adicionaram lisatos deficientes de heme a sistemas de traduo suplementados com heme. Eles acharam que uma poro do lisato deficiente de heme podia realmente deprimir a sntese da globina no sistema de traduo ao qual ele fora adicionado. Esse achado indicou que um inibidor estava presente. Essa protena inibidora responsiva ao heme, HRI, foi isolada e verificou-se que era uma quinase capaz de fosforilar eIF2. A hemina liga-se a essa quinase, inativando-a (veja Chen e London, 1995). O eIF2 finalmente ir parar a traduo. Normalmente, uma vez que as subunidades ribossmicas se juntam, o eIF2 liberado como um complexo com GDP (Raychaudhury et al., 1985). Para o eIF2 ser novamente usado na iniciao, ele
+Hemina
[14C]Leucina incorporada (cpm x 10-4)
+Hemina
[14C]Leucina incorporada (cpm x 10-3)
Sem adies
Figura 12.32
-Hemina
(A)
Tempo (minutos)
(B)
Tempo (minutos)
Regulao da traduo por hemina e pelo fator 2 de iniciao eucaritica. (A) Traduo do mRNA da globina no sistema de sntese protica in vitro do reticulcito de coelho. A incluso de hemina ocasiona uma dramtica elevao da sntese protica. (B) Efeito da adio do fator 2 de iniciao eucaritica no sistema de traduo in vitro do reticulcito de coelho. O eIF2 elevou o nvel da sntese protica para perto daquele do sistema estimulado pela hemina. (A segundo London et al., 1976; B segundo Clemens et al., 1974.)
496
Figura 12.33
Esquema para o controle da traduo da sntese da globina. Como um resultado da inativao pela protena quinase, o eIF2 depletado a no ser que o heme inative a protena quinase.
Subunidade ribossmica 40S Complexo de iniciao
Traduo
Protena quinase ativa
Heme
Protena quinase inativa
eIF2 - P (Seqestra o fator de reciclagem)
dever complexar-se com o eIF2B (fator de reciclagem). Esse eIF2B troca GTP por GDP (veja Figura 12.11), e o complexo eIF2-GTP resultante capaz de entrar num outro ciclo de iniciao. Porm, se a subunidade do eIF2 for fosforilada, o fator de reciclagem eIF2B se liga mas no consegue se despregar (Gross et al., 1985; Thomas et al., 1985). Por fim, todo eIF2B (cuja concentrao 10- a 20-vezes mais baixa que aquela do eIF2) ligado a esses complexos, e a traduo cessa. A adio de eIF2B a lisatos deficientes em heme restitui a sntese protica aos nveis dos sistemas suplementados com heme (Grace et al., 1984). Heme em excesso capaz de se ligar protena quinase, inativando-a (Fagard e London, 1981). Quinase inativada no ir fosforilar eIF2, fazendo com que a traduo prossiga. Assim, enquanto heme estiver presente, a sntese da globina continuar (Figura 12.33). A histria do controle da traduo da sntese da globina no termina aqui. Conforme discutimos no Captulo 11, h quatro genes globina ativos por clula diplide e somente dois genes globina ativos. Se cada gene fosse transcrito e traduzido com a mesma velocidade, esperar-se-ia duas vezes mais molculas globina que globina. Isso claramente no o caso. Encontra-se uma relao 1.4:1 de mRNA :, mas uma relao 1:1 de protenas (Lodish, 1971). A igualizao das protenas parece envolver regulao da traduo. Kabat e Chappell (1977) sugeriram que a igualizao feita no estgio de iniciao da traduo. Eles mostraram que o mRNA da globina compete com a mensagem da globina para fatores de iniciao e que a mensagem da globina parece ser o melhor competidor. A mensagem da globina reconhecida mais eficientemente pelos fatores de iniciao sendo por isso traduzida mais freqentemente. Quando os dois mRNAs esto presentes em quantidades iguais, mas com um suprimento de fatores de iniciao severamente limitante, somente 3% da protena resultante era globina. Porm, quando o mRNA no-fracionado (mensagens e globinas de clulas lisadas) foi adicionado a um excesso de tais fatores de iniciao, todos os mRNAs foram traduzidos com igual eficincia e a relao : resultante foi de 1.4:1. A protena cap ligante foi implicada como sendo o fator responsvel pela discriminao entre os dois tipos de mensagem da globina (Ray et al., 1983; Sarkar et al., 1984). Enquanto ainda no conhecido como se d a discriminao, conhecido que a estrutura secundria da seqncia lder 5 afeta a eficincia da traduo (Pelletier e Sonenberg, 1985). Como pode ser visto na Figura 12.34, os terminais 5 das mensagens e globina diferem significativamente. Assim, as razes apropriadas de globina e globina, e heme so estabelecidas no passo de iniciao da traduo. Embora a sntese da hemoglobina envolva regulao nos nveis de transcrio e processamento de RNA, a molcula final construda atravs da coordenao fina ao nvel da traduo.
497
mRNA da globina
mRNA da globina
Fator 12.34
Ao mesmo tempo, outro notvel exemplo da regulao da traduo est ocorrendo dentro da clula vermelha do sangue. O mRNA codificando a enzima 15-lipoxigenase (15-LOX) transcrito durante os estgios precoces do desenvolvimento da clula vermelha do sangue na medula ssea, mas ele somente traduzido quando a clula vermelha do sangue est a ponto de entrar na circulao perifrica. Essa enzima responsvel pela digesto das mitocndrias durante os ltimos estgios da formao da clula vermelha sangnea. A 3 UTR do mRNA 15-lox tem 10 repeties acopladas de uma seqncia rica em pirimidina que liga uma protena de 48-kDA especfica para eritrcitos. Essa protena reprime a traduo da mensagem 15-lox at o eritrcito estar pronto para entrar na circulao (Ostarek-Lederer et al., 1994). No ainda conhecido como essa protena repressora regulada durante o desenvolvimento da clula vermelha sangnea.
Provveis estruturas secundrias para os terminais 5 das cadeias de -globina e de globina do camundongo. Os cdons AUG iniciadores da traduo esto coloridos. (Segundo Pavlakis et al., 1980.)
Eplogo: Regulao Ps-traduo

O controle da traduo, portanto, um mecanismo importante e largamente empregado para regular a expresso gnica durante o desenvolvimento. Ele pode ser usado para ativar um certo conjunto de mRNAs existente em um certo momento ou para regular a relao pela qual diferentes mRNAs competitivos podem ser traduzidos. Os animais desenvolveram vrios mecanismos pelos quais mRNAs podem ser armazenados no ocito para posterior uso durante a embriognese precoce. As bases moleculares desses mecanismos reguladores da traduo esto sendo estudadas. Porm, a histria ainda no acabou quando o peptdeo sintetizado. Uma vez que uma protena tiver sido produzida, ela torna-se parte de um nvel mais elevado de organizao. Ela pode tornar-se parte da estrutura de suporte da clula, ou ela pode se envolver em um dos variados caminhos enzimticos para a sntese ou degradao de metablitos celulares. De qualquer maneira, a protena individual agora parte de um complexo ecossistema que a integra em um relacionamento com nu-
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merosas outras protenas. Assim, ainda podem ocorrer vrias mudanas que determinam se uma protena est ou no ativa. Em primeiro lugar, algumas protenas recmsintetizadas so inativas sem ulteriores modificaes que podem envolver a remoo por clivagem de certos setores inibitrios da protena, ou a ligao de um pequeno composto para intensificar sua atividade. Segundo, algumas protenas podem ser inativadas seletivamente. Em alguns casos, a inativao envolve a degradao da prpria protena; em outros, a inativao pode ser causada pela ligao de um ligante inibidor. Terceiro, algumas protenas tm que ser endereadas a seus destinos intracelulares especficos. A clula no simplesmente um saco de enzimas: protenas so muitas vezes seqestradas em certas regies, tais como membranas, lisossomos, ncleos ou mitocndrias. Em quarto lugar, algumas protenas tm que se juntar a outras protenas para formar uma unidade funcional. A protena hemoglobina, o microtbulo e o ribossomo so todos exemplos de numerosas protenas juntadas para formar uma unidade funcional. Portanto, a expresso da informao gentica ainda pode ser influenciada no nvel ps-traduo. Alguns desses casos (como a fosforilao do fator promotor da mitose) j foram discutidos, enquanto outros sero discutidos medida que aparecerem. Neste ponto, abandonaremos nossa discusso dos aspetos moleculares da expresso gnica e voltaremos para a dinmica do embrio em desenvolvimento. Podemos agora olhar para processos desenvolvimentais precoces para estudar mecanismos moleculares para a determinao do destino celular e da estrutura tissular.
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Especificao do Destino Celular e os Eixos Embrionrios

13 Especificao celular autnoma por determinantes citoplasmticos 14 A gentica da especificao axial em Drosophila 543
IV
505 591 635
15 Especificao do destino celular por interaes clula-clula progressivas 16 Estabelecimento dos eixos corporais em mamferos e aves
Especificao celular autnoma por determinantes citoplasmticos
13
Considero provvel que nas clulas germinativas existem tnues diferenas internas que predeterminam a transformao subseqente s substncias determinantes; essas diferenas no so meras potncias presentes nas clulas germinativas, mas diferenas materiais reais to pequenas que at agora no pudemos demonstr-las. R. VIRCHOW (1858) Estudando a fase de clivagem nos aproximamos da nascente de onde emergem os rios progressivamente ramificados da diferenciao que desguam finalmente em plcidas lagoas, as clulas individuais do complexo organismo adulto. E. E. JUST (1939)
ADA ORGANISMO METAZORIO formado por uma complexa variedade
de clulas especializadas. Por exemplo, as clulas vermelhas e brancas do sangue no s diferem umas das outras mas tambm diferem das clulas do corao, responsveis pela propulso dessas clulas pelo corpo. Tambm so diferentes dos neurnios alongados que conduzem impulsos neurnicos do crebro ao corao, e de clulas glandulares que secretam hormnios no sangue. A Tabela 13.1 apresenta uma lista incompleta dos tipos de clulas especializadas, seus produtos caractersticos e suas funes.
Comprometimento celular e diferenciao

O desenvolvimento de tipos especializados de clulas de um nico ovo fertilizado chamado diferenciao. Essa evidente mudana na bioqumica e funo celular precedida por um processo envolvendo um comprometimento dissimulado das clulas a um destino em particular ou a um conjunto de destinos. Nessa fase, a clula no parece ser fenotipicamente diferente do seu estado no comprometido, mas de alguma forma o seu desenvolvimento se tornou restrito. Embora os embriologistas tenham usado rotineiramente a palavra determinao para descrever esse comprometimento oculto, um tipo de tecido em particular pode ser classificado como determinado, ou no determinado, dependendo de qual ensaio foi usado para a determinao (ver Harrison, 1933). Slack (1991) dividiu esse comprometimento em dois estgios, especificao e determinao. Uma clula ou tecido pode ser especificado quando capaz de diferenciar-se de forma autnoma quando colocado em um ambiente neutro tal como uma placa de petri. (Esse ambiente neutro em relao via do desenvolvimento.) Uma clula ou tecido pode ser determinado quando capaz de diferenciarse de maneira autnoma quando colocado em outra regio do embrio. Se a diferenciao se d de acordo com o destino original mesmo com a colocao em outra regio do embrio, assume-se que o comprometimento irreversvel. Ns conhecemos trs vias principais pelas quais esse comprometimento pode acontecer (Tabela 13.2). O primeiro mecanismo de comprometimento, envolve a segregao citoplasmtica de molculas determinativas durante a clivagem embrionria pelo qual os planos de clivagem separam regies qualitativamente diferentes do citoplasma do zigoto em clulas-filha diferentes. Cada clula se torna especfica pelo tipo de citoplasma que ela adquire durante a clivagem, de modo que o destino da clula determinado sem nenhuma referncia s clulas vizinhas. Esse mecanismo de comprometer o destino das clulas chamado de especificao autnoma, porque as clulas 505
506
PARTE III Especificao do Destino Celular e os Eixos Embrionrios
Tabela 13.1 Alguns tipos de clulas diferenciadas e seus principais produtos Tipo de clula Queratincito (clula da pele) Eritrcito (clula vermelha do sangue) Clula do cristalino Linfcito B Linfcito T Produto da clula diferenciada Queratina Funo especializada Proteo contra abraso e dessecao Transporte de oxignio Transmisso de luz Sntese de anticorpos Destruio de clulas estranhas; regulao da resposta imune Produo de pigmento Regulao do metabolismo de carboidratos Caractersticas sexuais masculinas Tendes e ligamentos
Hemoglobina Cristalinas Imunoglobulinas Antgenos da superfcie celular (linfocinas) Melanina Insulina
Melancito Clulas das ilhotas pancreticas Clula de Leydig ( ) Condrcito (clula da cartilagem) Osteoblasto (clula formadora de osso) Micito (clula muscular) Hepatcito (clula do fgado)
Testosterona Sulfato de condroitina; colgeno tipo II Matriz ssea Actina e miosina do msculo Albumina do soro; numerosas enzimas Neurotransmissores (acetilcolina, epinefrina, etc.) Ovalbumina
Suporte do esqueleto Contrao
Neurnios
Produo de protenas do soro e numerosas funes enzimticas Transmisso de impulsos eltricos Protenas do albmen do ovo e proteo do embrio Protenas da casca do ovo para proteo do embrio
Clula tubular ( ) do oviduto da galinha
Clula folicular ( ) do oviduto de inseto
Protenas corinicas
so especificadas pelos seus prprios componentes citoplasmticos internos (Davidson, 1991). Dessa maneira, se um determinado blastmero fosse removido precocemente no desenvolvimento, esse produziria as mesmas clulas como quando ainda fazia parte de um embrio maior, e o embrio remanescente no possuiria aquelas clulas (e somente aquelas clulas) que teriam sido formadas pelas clulas que foram retiradas (veja Figura 1.29). A especificao autnoma faz surgir um padro de embriognese referido como desenvolvimento em mosaico, uma vez que o embrio parece ser formado por um mosaico de peas autodiferenciadas. Uma segunda maneira de comprometer o destino das clulas envolve a interao com clulas vizinhas. Aqui, as clulas originalmente tm a habilidade de seguir mais de um caminho de diferenciao, e a interao dessas clulas com outras clulas ou tecidos restringe os destinos de um ou ambos os participantes. Esse tipo de determinao do destino celular muitas vezes chamado de especificao condicional, porque o destino de uma clula depende das condies nas quais ela se encontra. Se um blastmero fosse removido de um embrio precoce de um organismo com especificao condicional de suas clulas, as clulas embrionrias remanescentes poderiam alterar seus destinos normais para que o papel da clula desaparecida fosse preenchido. Dessa maneira, a especificao condicional faz surgir um padro de embriognese chamado de desenvolvimento regulador. Como ainda veremos, todos os organismos
CAPTULO 13 Especificao celular autnoma por determinantes citoplasmticos
507
Tabela 13.2 Modelos de especificao do tipo celular e suas caractersticas I. Especificao autnoma Caracterstica da maioria dos invertebrados. Especificao pela aquisio de certas molculas citoplasmticas presentes no ovo. Clivagens invariantes produzem as mesmas linhagens em cada embrio da espcie. Destinos dos blastmeros so geralmente invariantes. Linhagens de Clulas ncoras so usualmente especificadas de maneira autnoma nos plos dos eixos embrionrio. Especificao do tipo celular precede qualquer migrao celular embrionria em larga escala. Produz desenvolvimento em mosaico (determinativo): clulas no podem modificar o destino se um blastmero perdido. II. Especificao condicional Caracterstica de todos vertebrados e poucos invertebrados. Especificao por interaes entre clulas. Posies relativas so importantes. Clivagens variveis no produzem destinaes invariantes para as clulas. Enormes rearranjos e migraes celulares precedem ou acompanham a especificao. Capacidade para desenvolvimento regulativo: permite que as clulas adquiram diferentes funes. III. Especificao sincicial Caracterstica da maioria das classes de insetos. Especificao das regies do corpo por interaes entre regies citoplasmticas antes da celularizao do blastoderma. Clivagem varivel no produz destinos celulares rgidos para certos ncleos. Aps a celularizao, a especificao condicional vista com freqncia.
Fonte: De acordo com Davidson, 1991.
usam ambos os meios, autnomo e condicional para especificar diferentes tipos de clulas, existindo um espectro de variaes entre o desenvolvimento em mosaico e o desenvolvimento regulativo. No entanto, na maioria dos invertebrados a especificao do tipo celular predominantemente autnoma, enquanto os vertebrados so caracterizados pelo uso extensivo da especificao condicional. Muitos insetos tambm usam uma terceira via para a determinao do destino celular. Nesses casos, interaes entre componentes maternos dentro do blastoderma sincicial ocorrem antes que tenham se formado as membranas celulares que separam os ncleos. Na especificao sincicial, grande parte das decises quanto aos destinos das clulas so feitas antes mesmo que as clulas tenham sido formadas. Este captulo focalizar experimentos que demonstram a especificao autnoma, enquanto que os captulos seguintes iro cobrir os modos condicionais e sinciciais do comprometimento celular durante a embriognese precoce.
Pr-formao e epignese
Qualquer explicao sobre a diferenciao das diversas clulas corporais, a partir do ovo fertilizado tem que explicar (1) a constante morfologia de cada espcie (i.e., que galinhas somente geram galinhas, e no crocodilos) e (2) a diversidade entre as partes corporais de cada organismo. Na verdade, uma das principais caractersticas do desenvolvimento que cada espcie reproduz seu padro de desenvolvimento. O desenvolvimento envolve a expresso das propriedades herdadas pelas espcies. No sculo dezessete, a unio de herana e desenvolvimento foi obtida com a hiptese do pr-formacionismo. De acordo com essa viso, todos os rgos do adulto estariam prefigurados em miniatura dentro do espermatozide ou (mais usualmente) no vulo. Os organismos no eram considerados como desenvolvidos, mais sim desenrolados. Essa hiptese encontrava apoio na cincia e na filosofia (Gould,
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1977; Roe, 1981). Primeiro, porque todos os rgos eram prefigurados, o desenvolvimento embrionrio meramente requeria o crescimento de estruturas existentes, e no a formao de novas. Nenhuma fora misteriosa extra era necessria para o desenvolvimento embrionrio. Segundo, assim como o organismo adulto era prefigurado em clulas germinativas, a outra gerao j existia em estado prefigurado dentro das clulas germinativas da primeira gerao prefigurada. Esse corolrio, chamado de embitment (encapsulao), assegurava que as espcies sempre permaneceriam constantes. Embora alguns microscopistas alegassem enxergar miniaturas humanas totalmente desenvolvidas dentro do espermatozide ou do vulo, os maiores proponentes dessa hiptese - Albrecht von Haller e Charles Bonnet- sabiam que o desenvolvimento dos sistemas orgnicos se dava em velocidades diferentes e que as estruturas embrionrias no precisavam estar no mesmo lugar daquelas do recm-nascido. Os pr-formacionistas no tinham uma teoria celular para fornecer um limite inferior para o tamanho dos seus organismos pr-formados, e nem tinham uma viso do domnio do ser humano sobre a Terra como sendo infinito. Pelo contrrio, como disse Bonet (1764) O trabalho da natureza to pequeno quanto ela deseja, e a espcie humana existia no finito espao compreendendo a criao e a ressurreio. Isso estava de acordo com a melhor cincia da poca, e de acordo com o princpio do matemtico e filsofo francs Ren Descartes sobre a divisibilidade infinita de uma natureza mecnica iniciada, mas no interferida por Deus. A pr-formao era uma teoria conservadora, enfatizando a falta de mudanas entre geraes. Sua principal falha era a inabilidade em explicar as variaes j conhecidas pela limitada evidncia gentica da poca. Sabia-se, por exemplo, que a unio entre uma pessoa branca e outra negra gerava filhos de uma cor intermediria entre as duas, uma impossibilidade se a herana e o desenvolvimento ocorressem somente atravs do vulo ou do espermatozide. Em experimentos com um controle maior, o botnico alemo, Joseph Klreuter (1766) produziu plantas hbridas de tabaco contendo caractersticas de ambas as espcies. Ademais, cruzando o hbrido tanto com o ascendente masculino ou o feminino, Klreuter foi capaz de reverter as caractersticas do hbrido de volta quelas de um ou outro ascendente, aps vrias geraes. Dessa maneira, a herana parecia depender de uma mistura de componentes dos pais. E mais, a pr-formao no podia explicar a gerao de monstruosidades e determinados desvios, tal como o hexadactilismo (seis dedos em cada mo), quando ambos os pais eram normais. Desenvolveu-se, ento, uma hiptese alternativa: epignese. De acordo com essa hiptese, cada organismo adulto se desenvolveria novamente a partir de uma condio no diferenciada. Essa viso do desenvolvimento, tendo razes filosficas remontando a Aristteles, foi revivida por Kaspar Friedrich Wolff, um embriologista alemo que trabalhava em St. Petersburg. Observando cuidadosamente embries de pinto, Wolff demonstrou que as partes embrionrias se desenvolvem de tecidos que no tm contrapartida no organismo adulto. O corao e os vasos sangneos (que de acordo com os pr-formacionistas, tinham que estar presentes desde o comeo para assegurar o crescimento embrionrio) podiam ser vistos se desenvolvendo de novo em cada embrio. Similarmente, foi visto que o tubo intestinal se originava das dobras de um tecido originalmente plano. Essa ltima observao foi explicitamente detalhada por Wolff (1767) que declarou: Quando a formao do intestino por essa maneira for adequadamente avaliada no existir nenhuma dvida, eu acredito, sobre a verdade da epignese. No entanto, para explicar como o organismo criado novamente a cada gerao, Wolff teve que postular uma fora desconhecida, a vis essentialis (fora essencial), a qual agindo como a gravidade ou o magnetismo organizaria o desenvolvimento embrionrio. O pr-formacionismo explica melhor a continuidade das geraes, enquanto que a epignese explica melhor a variao e as observaes diretas na formao dos rgos. Uma certa reconciliao entre as partes foi tentada pelo filsofo alemo Immanuel Kant (1724-1804) e seu colega, o biologista Friedrich Blumenbach (1752-1840). Na
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tentativa de construir uma teoria cientfica de descendncia racial, Blumenbach postulou uma fora mecnica, objetivamente dirigida chamada Bildungstrieb (fora de desenvolvimento). Tal fora, dizia ele, no era terica, mas poderia ser demonstrada atravs de experimentao. A Hydra, quando cortada, regenera suas partes amputadas atravs de um remanejamento de elementos existentes. Algum tipo de fora organizadora proposital podia ser observada nessa operao, e essa fora era uma propriedade do prprio organismo. Imaginava-se que essa Bildungstrieb fosse uma herana adquirida atravs de clulas germinativas. Dessa maneira, o desenvolvimento poderia prosseguir epigeneticamente atravs de uma fora predeterminada inerente matria do embrio (Cassirer, 1950; Lenoir, 1980). Ademais, acreditava-se que tal fora era suscetvel a mudanas, como demonstrado pela variante da concha do caracol, com espirais voltadas para o lado esquerdo. Nessa hiptese, onde o desenvolvimento epigentico direcionado por instrues pr-formadas, no estamos muito distantes da viso de alguns biologistas modernos considerando que A descrio completa do organismo j est escrita no ovo (Brenner, 1979). No entanto, at a redescoberta dos trabalhos de Mendel, no comeo do sculo vinte, no havia uma teoria gentica consistente na qual se poderia encaixar tais idias sobre variaes herdadas, e cada cientista era livre para especular sobre os mecanismos pelos quais os padres de desenvolvimento so herdados. Teratologistas Franceses Os Teratologistas Franceses As tentativas de encontrar hipteses que explicassem a constncia das espcies e o desenvolvimento epigentico levaram criao da moderna embriologia. As buscas por tais hipteses foram executadas sob duas tradies intelectuais diferentes. Uma, centralizada na Frana, buscava os mecanismos pelos quais erros embriolgicos causavam o nascimento de crianas com anormalidades de desenvolvimento. Essa cincia ficou conhecida como teratologia, ou estudo de malformaes congnitas. A segunda busca estava centralizada na Alemanha, e estava voltada para a fisiologia dos processos do desenvolvimento. Ambas as correntes de pesquisa iniciaram a manipulao de embries para verificar como um organismo em desenvolvimento iria responder a essas perturbaes (Churchill, 1973; Fischer e Smith, 1984). Os experimentos teratolgicos franceses comearam na dcada de 1820 com os estudos de Etienne Geoffrey Saint-Hilaire e seu filho, Isadore. Essas investigaes tentaram mostrar que nascimentos anmalos eram produtos de uma falha no desenvolvimento fetal ao invs de aberraes pr-formadas. Eles buscavam produzir anomalias de desenvolvimento artificialmente, alterando as condies de incubao do ovo de galinha em desenvolvimento. Apesar dos inmeros fracassos dessas tentativas (suas tcnicas rudimentares, ou permitiam a continuao do desenvolvimento normal ou terminavam por matar os embries), eles abriram o caminho para as anlises mais refinadas de Dareste em 1877. Dareste realizou milhares de experimentos e acompanhou anormalidades no desenvolvimento de aves desde os primeiros estgios do seu desenvolvimento. Mas o embrio de pinto foi uma m escolha de organismo para estudar os primeiros estgios da embriognese. Se a inteno era examinar se perturbaes nos primeiros estgios do desenvolvimento afetavam as estruturas adultas, dever-se-ia usar um outro organismo. Em 1866, um francs, estudante de medicina, Laurent Chabry, comeou a estudar a teratognese no embrio de tunicado, um organismo mais acessvel. Essa foi uma escolha muito feliz, porque esses embries desenvolvem-se rapidamente em larvas, com relativamente poucas variedades de clulas. Chabry se concentrou em produzir malformaes especficas, lancetando blastmeros especficos de embries de tunicados em clivagem. Ele descobriu que cada blastmero era responsvel pela produo de um conjunto particular de tecidos larvares. Na ausncia dessas clulas, a larva deixava de apresentar justamente as estruturas normalmente formadas por aquelas clulas. Alm disso, ele observou que quando algumas clulas em particular
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eram isoladas do resto do embrio, elas formavam sua estrutura caracterstica independentemente do contexto das outras clulas. Dessa maneira, cada uma das clulas tunicadas aparentavam estar se desenvolvendo de maneira autnoma.* Como discutimos anteriormente, essa habilidade de cada clula desenvolver-se independentemente de outras clulas embrionrias freqentemente chamada de desenvolvimento autnomo ou em mosaico, porque o embrio aparenta ser um mosaico de partes autodiferenciadas.
Especificaes autnomas em embries de tunicados

Estudos mais recentes mostraram que o embrio de tunicado de fato se assemelha a um mosaico de partes autodiferenciadas construdo com informaes armazenadas no citoplasma do ocito. Com a diviso do embrio, diferentes clulas incorporam diferentes regies do citoplasma. Acredita-se que essas diferentes regies citoplasmticas contenham determinantes morfogenticos que controlam o compromisso da clula com um determinado tipo de clula. Estudos de determinao em
*Essa no foi a resposta pela qual Chabry esperava ou pretendia encontrar. Na Frana do sculo dezenove, os conservadores favoreciam a viso dos pr-formacionistas, que era interpretada como apoio s desigualdades hereditrias dos membros de uma comunidade. O que voc era, era determinado pela sua linhagem. Os liberais, especialmente os socialistas, aprovaram as vises epigenticas, as quais foram interpretadas como indicando que todos comeavam com a mesma dotao hereditria, e que ningum tinha o direito a uma posio mais alta do que a do outro. Chabry, um socialista que odiava os direitos hereditrios dos aristocratas, se esforou para no extrapolar seus dados para nada alm dos embries tunicados.
Figura 13.1
Segregao dos determinantes citoplasmticos por ocasio da fertilizao. (A) Mapa de destino das regies citoplasmticas do tunicado Halocynthia roretzi logo aps o trmino dos movimentos citoplasmticos da fertilizao. Anterior para a esquerda, posterior para a direita. (B) Os rgos da larva tunicada. (A de acordo com Nishida, 1987.) (A) VISTA ANIMAL
VISTA LATERAL Medula espinhal Tronco cerebral Clulas pigmentadas Msculo Epiderme Palpos Crebro Tronco cerebral Medula espinhal Notocorda Endoderma Clulas pigmentadas Tronco cerebral Medula espinhal VISTA VEGETAL Msculo Endoderma Notocorda Clulas laterais do tronco Notocorda Mesnquima Msculo Tronco cerebral Clulas filamentosas endodrmicas (B) Manto (Ectoderma) Crebro Epiderme Msculo
Clulas pigmentadas Tronco cerebral Medula espinhal Msculo Notocorda Mesnquima Clulas filamentosas endodrmicas
Crebro Palpos
Clulas filamentosas endodrmicas Clulas laterais do tronco
Mancha ocelar Boca Palpo
Cordo nervoso
Notocorda
Estmago Faringe (endoderma) Corao Endstilo (endoderma)
Medula espinhal Msculo Clulas laterais do tronco Mesnquima Notocorda
Clula muscular
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clulas de tunicados tm sido imensamente auxiliados por ovos de certas espcies que segregam o seu citoplasma em uma srie de regies coloridas, imediatamente aps a fertilizao (Prancha11). O determinante formador de msculos do crescente amarelo Em 1905, E. G. Conklin descreveu como esses plasmas coloridos se repartiam em vrios blastmeros. A primeira clivagem separa o ovo em duas partes, imagens espelhares direita e esquerda. Da em diante, cada diviso celular em um lado paralela a uma diviso celular do outro lado. Observando o destino de cada blastmero do tunicado Styela partita, Conklin tirou a surpreendente concluso de que cada regio colorida do citoplasma delineia um destino embrionrio especfico (Figura 13.1). O citoplasma do crescente amarelo d origem s clulas musculares; o crescente equatorial cinza produz a notocorda e o tubo neural; o citoplasma claro do plo animal se torna a epiderme larval; e a regio vegetativa cinza do vitelo d origem ao intestino larval. Reverberi e Minganti (1946) analisaram a determinao tunicada em uma srie de experimentos de isolamento, e eles tambm observaram a autodiferenciao de cada blastmero isolado e o restante do embrio. O resultado de um desses experimentos mostrado na Figura 13.2. Quando o embrio de oito clulas separado em seus quatro pares (os lados direito e esquerdo sendo equivalentes), a determinao em mosaico a regra. O par posterior de blastmeros do plo animal do origem ao ectoderma; o par posterior do plo vegetal produz o endoderma, o mesnquima e o tecido muscular, como esperado pelo mapa de destino. O desenvolvimento neural uma exceo. As clulas produtoras de nervos so geradas por ambos os quadrantes anteriores, animal e vegetal, e nenhum deles as produz sozinho. Todavia, quando esses pares anteriores so reunidos surgem os tecidos do crebro e do palpo. Mesmo em embries estritamente
PLO ANIMAL Ectoderma ANTERIOR Sistema nervoso Notocorda Msculo Endoderma PLO VEGETAL Separao dos pares de blastmeros POSTERIOR Mesnquima
Ectoderma
Ectoderma
Notocorda
Msculo Mesnquima
Figura 13.2
Endoderma Endoderma
Determinao em mosaico nos tunicados. Quando os quatro pares de blastmeros do embrio de oito clulas esto dissociados, eles se desenvolvem como indicado, cada um formando estruturas separadas. (De acordo com Reverberi e Minganti, 1946.)
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Estgio celular Horas a 100 C A6.1 endoderma A7.3 notocorda A7.5 endoderma A7.6 clulas laterais do tronco A7.7 notocorda medula espinhal msculo crebro palpos epiderme epiderme epiderme endoderma
Esquerda Vegetal
Tronco cerebral Medula espinhal
Animal
Anterior
Crebro Faringe primordial Clula pigmentada Crebro
palpos epiderme
Posterior
mesnquima notocorda msculo

Vegetal
Endoderma Filamento endodrmico Msculo Endoderma Msculo Medula espinhal Filamento endodrmico Tronco cerebral Medula espinhal Msculo
filamento endodrmico mesnquima msculo
Direita
Animal
epiderme epiderme epiderme b5.4 epiderme
Figura 13.3
Linhagem determinativa de blastmeros tunicados. (A) Mapa de destino de linhagem no desenvolvimento embrionrio do tunicado H. roretzi. Como as metades direita e esquerda se desenvolvem da mesma maneira, somente metade do embrio aqui representado. (B) Linhagens das clulas musculares. (A de acordo com Nishida, 1987; B de acordo com Nishida, 1992a.)
determinados como os dos tunicados, algumas interaes indutivas acontecem entre os blastmeros. De fato, Ortolani (1959) mostrou que essa regio do ectoderma no est determinada para originar tecido nervoso at o estgio de 64 clulas, pouco antes da gastrulao. Dessa maneira, embora a maioria dos tecidos sejam determinados imediatamente aps a segregao do citoplasma do ovo, certos tecidos nesses embries tm uma determinao condicional por interao clula a clula. Pelos estudos de linhagem celular de Conklin e outros (Figuras 13.2 e 13.3), j era conhecido que somente um par de blastmeros (vegetativo posterior; B4.1) no embrio de oito clulas capaz de produzir o tecido muscular da cauda. Quando o citoplasma transferido do blastmero B4.1 (formador de msculo) para o blastmero b4.2 (formador do ectoderma) de um embrio tunicado de 8 clulas, o blastmero
Figura 13.4
Localizao do citoplasma formador de msculos durante o desenvolvimento precoce de ascdios. Regies do citoplasma foram transferidas para o blastmero a4.2 (epiderme presuntiva) e investigadas para detectar protenas especficas do msculo produzidas por clulas derivadas de a4.2. A regio colorida representa o crescente amarelo, que deve conter os determinantes da formao muscular. Porcentagens indicam a frao do espcimen mostrando expresso do gene muscular. (A) embrio de oito clulas; (B) ovo no fertilizado; (C) ovo fertilizado na primeira fase dos movimentos citoplasmticos. (D) ovo fertilizado na segunda fase dos movimentos citoplasmticos. (De acordo com Nishida, 1992b.)
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(B)
Estgio de 64 clulas
Estgio de 32 clulas
Estgio de 16 clulas
Estgio de 8 clulas
Especificao muscular autnoma
Especificao muscular condicionada
formador do ectoderma gera clulas musculares como tambm sua prognie ectodrmica normal (Whittaker, 1982). Alm disso, o citoplasma da rea de plasma amarelo do ovo fertilizado pode tambm fazer com que o blastmero 4.2a expresse protenas especficas do msculo (Figura 13.4; Nishida, 1992a). Tung e colegas (1977) mostraram o inverso, que quando os ncleos larvais so transplantados a fragmentos enucleados de ovos de tunicados, as clulas recm-formadas mostram uma estrutura tpica daquelas clulas que fornecem o citoplasma, e no daquelas clulas que fornecem o ncleo.
(A) 8 clulas
(B) ovo no fertilizado
(C) Segregao da primeira fase
(D) Segregao da segunda fase
Crescente amarelo
Lateral
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Podemos concluir, ento, que certos determinantes que existem no citoplasma causam a formao de certos tecidos. Esses determinantes morfogenticos parecem agir ativando (ou inativando) seletivamente genes especficos. A determinao dos blastmeros e a ativao de certos genes so controlados pela localizao espacial de determinantes morfogenticos dentro do citoplasma do ovo. [cyto1.html] Existe a hiptese de que o determinante miognico do crescente amarelo regula a transcrio de genes especficos para o msculo. Imaginava-se que os tunicados poderiam segregar uma protena semelhante MyoD dentro do crescente amarelo. No entanto, embora essa protena seja vista nas clulas musculares do embrio tunicado, ela s comea a funcionar no estgio de 32 clulas no sendo ento o fator do crescente amarelo (Satoh et al.,1995). Um melhor candidato a determinante miognico do crescente amarelo o RNA materno que parece estar ligado ao citoesqueleto do ocito e que segregado junto com o citoplasma formador de msculos. Esse RNA encontrado no crtex de ocitos maduros, segregado juntamente com o citoplasma amarelo formador de msculos para a coroa do plo vegetal na primeira fase dos movimentos citoplasmticos durante a fertilizao, e a partir da muda para a regio vegetativa posterior do zigoto enquanto se forma o crescente amarelo definitivo (Figura 13.5; Swalla e Jeffery, 1995). Esse RNA provavelmente no codifica uma protena, e no se sabe se pode direcionar o desenvolvimento muscular quando inserido em uma clula no muscular. Especificao citoplasmtica das linhagens endodrmicas e epidrmicas e o eixo ntero-posterior A anlise das clulas endodrmicas e epidrmicas foi feita de maneira semelhante. Reverberi e Minganti (1946) confirmaram o mapa de destino de Conklin, e Whittaker (1977) mostrou que enzimas especficas do endoderma eram sintetizadas somente nas clulas destinadas a formar o intestino. Mais recentemente, Nishida (1993) fundiu clulas e fragmentos de clulas para seguir os determinantes que davam origem s
(A) (B)
Figura 13.5
Localizao espacial de um RNA (YC-RNA) que se segrega com o citoplasma formador de msculo do crescente amarelo. Hibridizaes in situ foram realizadas em vrios estgios do desenvolvimento de Styela clava. (A) Ovo no fertilizado. (B) Aps a primeira fase dos movimentos de fertilizao do citoplasma oognico. (C) Seo frontal de um embrio de 4 clulas mostrando expresso em ambos os blastmeros vegetais. (D) Seo frontal de um embrio de 32 clulas mostrando expresso em seis clulas musculares posteriores. (E) Embrio com broto caudal mostrando expresso de YC-RNA em clulas musculares progenitoras em ambos os lados da notocorda. (de Swalla e Jefferey, 1995; fotografias cortesia dos autores.) (C)
(D)
(E)
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Primeira fase da segregao
Segunda fase da segregao
Embrio de 8 clulas
Figura 13.6
Msculo
Comparao dos movimentos dos determinantes citoplasmticos em trs tipos de tecidos de tunicados. Estas figuras representam somente a superfcie dos ovos. (De acordo com Nishida, 1994a.)
Endoderma
Epiderme
linhagens de clulas epidrmicas e endodrmicas. Aps a fuso da clula ou do fragmento de clula a uma clula de outra linhagem, Nishida usou um marcador bioqumico ou antignico para determinar se aquela clula assumiu o novo destino. Os determinantes epidrmicos migram para a regio apical da clula durante a fertilizao e entram nos blastmeros da coroa do plo animal (o par a4.2 e o par b4.2) do embrio de 8 clulas. Inversamente, foi encontrado que os determinantes endodrmicos migram para o hemisfrio vegetal do zigoto e se distribuem entre os blastmeros vegetativos (Figura 13.6; Nishida, 1994a). O eixo ntero-posterior tambm determinado durante a migrao das regies citoplasmticas do ocito. Pela remoo de aproximadamente 10% do citoplasma da regio vegetativa posterior do ovo, aps o segundo movimento ooplsmico, a maioria dos embries no formou o eixo ntero-posterior. Em lugar disso, os embries se desenvolveram em larvas radialmente simtricas com destinos anteriores. Esse citoplasma vegetativo posterior (PVC) era dominante em relao a outros citoplasmas, pois ao se transplantar o PVC para a regio vegetativa anterior de zigotos que tiveram seu prprio PVC removido, o anterior da clula se transformou no novo posterior, e o eixo foi invertido (Nishida, 1994b). Esses resultados sugerem que o destino posterior determinado por um determinante especfico do citoplasma, enquanto que o destino anterior determinado pela ausncia do citoplasma vegetativo posterior. Isso se correlaciona bem com a observao de que a maioria dos destinos celulares posteriores (como o msculo e o endoderma) so especificados pelo citoplasma, mas os destinos celulares anteriores (como o crebro e a notocorda) so gerados por indues (Figura 13.7). No embrio de tunicado, os movimentos ooplsmicos na fertilizao criam domnios citoplasmticos distintamente diferentes, que se distribuem proporcionalmente nos blastmeros. A identidade desses determinantes e seus mecanismos de ao ainda no foram esclarecidos.
Localizao citoplasmtica em embries de moluscos

O tipo de diferenciao em mosaico largamente difundido no reino animal, especialmente em organismos protostomatas, tais como ctenforo, aneldeos, nematdeos e moluscos, os quais, em sua totalidade, iniciam a gastrulao na futura extremidade anterior, aps somente algumas divises celulares. Moluscos fornecem alguns dos exemplos mais impressionantes de desenvolvimento em mosaico e do fenmeno de
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Figura 13.7
Comparao de embries normais de tunicados e embries cujo citoplasma vegetativo posterior (PVC) foi removido. (A) Larva do tipo selvagem. (B) Larva radialmente simtrica de ovo cujo PVC foi removido. A larva no tem o eixo ntero-posterior. Essas larvas consistem de uma camada epidrmica externa, uma massa notocordal central e uma camada endodrmica intermediria. (C) Vista vegetal de um embrio normal com 76 clulas. (D) Vista vegetal de um embrio radialmente simtrico cujo PVC foi removido. (De acordo com Nishida, 1994b.)
localizao citoplasmtica, onde os determinantes morfogenticos so encontrados em uma regio especfica do ocito. Alm disso, esses fatores citoplasmticos so ativamente transportados para um plo da clula, de tal modo que um blastmero tendo esses fatores pode restringir sua transmisso para somente uma de suas clulas-filha. O destino das duas clulas-filha definido por qual delas recebe o determinante morfogentico. E. B. Wilson, o famoso embriologista americano do comeo do sculo XX, isolou blastmeros precoces de embries do molusco Patella coerulea e comparou seu desenvolvimento com o das mesmas clulas deixadas dentro de outros embries de Patella. A Figura 13.8 mostra um grupo de resultados publicados por Wilson em 1904. Os blastmeros isolados no s seguiram seus destinos normais de desenvolvimento (nesse caso, para produzir as clulas trocoblsticas ciliadas), como tambm completaram o nmero normal de divises celulares precisamente ao mesmo tempo que as
Desenvolvimento normal de Patella
Figura 13.8
Trocoblasto presuntivo
(A-C) Diferenciao de clulas trocoblsticas no embrio normal do molusco Patella. (A) Estgio de 16 clulas visto de lado; as clulas trocoblsticas presuntivas esto sombreadas. (B) Estgio de 48 clulas. (C) Estgio de larva ciliada, visto do plo animal. So observados clios nas clulas trocoblsticas. (D-G) Diferenciao de clulas trocoblsticas isoladas e cultivadas in vitro. (D) Clula trocoblstica isolada. (E,F) Resultados da primeira e segunda divises em cultura. (G) Produto ciliado de (F). Mesmo em cultura isolada as clulas se tornam ciliadas no momento correto. (De acordo com Wilson, 1904.)
(A)
(B)
(C)
Desenvolvimento do trocoblasto isolado
(D)
(E)
(F)
(G)
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Citoplasma animal claro Citoplasma equatorial granular
Figura 13.9
Clivagem no molusco Dentalium. A extruso e a reincorporao do lbulo polar ocorre duas vezes. (De acordo com Wilson, 1904.)
Citoplasma vegetal claro
Lbulo polar
Lbulo polar absorvido no blastmero CD
Segunda extruso do lbulo polar
Lbulo polar absorvido no blastmero D
clulas permanecendo dentro do embrio. Suas clivagens se deram na orientao correta, e as clulas derivadas se tornaram ciliadas na poca apropriada. Desses experimentos, Wilson concluiu que essas clulas possuam dentro de si todos os fatores que determinavam a forma e o ritmo da clivagem e que a diferenciao complexa e caracterstica que elas sofriam era completamente independente de sua relao com o resto do embrio. [cyto2.html] O lbulo polar Em seu experimento seguinte, Wilson pde demonstrar que tal desenvolvimento era assegurado pela segregao de determinantes morfogenticos especficos em blastmeros especficos. Certos embries clivando espiralmente (principalmente nos filos molusco e aneldeo) expelem um bulbo de citoplasma imediatamente antes da primeira clivagem (veja Figura 13.9). Essa protruso chamada lbulo polar. Em certas espcies de caracis, a regio unindo o lbulo polar ao resto do ovo se torna um tubo delgado. A primeira clivagem divide o zigoto assimetricamente, de tal forma que o lbulo polar est ligado somente ao blastmero CD. Em vrias espcies, quase um tero do volume citoplasmtico total est presente nesses lbulos anucleados dandolhes a aparncia de outra clula. Essa estrutura trilobulada freqentemente referida como o embrio no estgio triflio (Figura 13.10). O blastmero CD absorve ento o material do lbulo polar, mas o extruda novamente antes da segunda clivagem (Figura 13.9). Aps essa diviso, o lbulo polar est ligado somente ao blastmero D, que absorve seu material. A partir da, no mais se forma o lbulo polar. Wilson mostrou que se o lbulo polar for removido no estgio triflio, as clulas remanescentes dividem-se normalmente. Entretanto, em lugar de produzir uma larva trocfora normal (caracol), elas produzem uma larva incompleta, sem seus rgos mesodrmicos - msculos, boca, glndula da concha e p.* Ainda mais, Wilson demonstrou que o mesmo tipo de embrio anormal pode ser produzido removendo o
A glndula da concha um rgo formado por induo pelas clulas mesodrmicas. Sem o mesoderma, no existem clulas presentes para induzir o ectoderma competente. Mais uma vez vemos alguma induo limitada em um embrio em mosaico.
(A)
(B)
Figura 13.10
Lbulos polares de moluscos. (A) Micrografia eletrnica de varredura do lbulo polar em extenso no ovo no clivado de Buccinum undatum. As cristas superficiais so restritas regio do lbulo polar. (B) Seo atravs da primeira clivagem ou estgio triflio do embrio de Dentalium. A seta aponta o grande lbulo polar grande. (Cortesia de M. R. Dohmen.)
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(A)
Figura 13.11
Desenvolvimento do blastmero D. (A) Diagramas esquemticos da linhagem do blastmero D em embries de Ilyanassa. (i) Embrio de 4 clulas. (ii) Blastmeros 1D e 1d no estgio de 8 clulas. (iii) Estgio de 16 clulas contendo blastmeros 2D e 2d (derivados de 1D). As clulas derivadas do D (coloridas) freqentemente se dividem mais tarde do que as outras. (iv) Diviso do macrmero 2D para gerar clulas 3D e 3d, enquanto a clula 2d se divide em 2d1 e 2d2. (v) Estgio de 64 clulas. O blastmero 3D produz as clulas 4D e 4d. (vi) O blastmero 4d divide-se simetricamente para produzir os dois mesentoblastos ME1 e ME2. (B) Embrio de 8 clulas. A pequena clula PB o lbulo polar e no parte do embrio. (C) Embrio de 12 clulas (1a-1d ainda no dividiram). (D) Embrio de 32 clulas. (A de acordo com Clement, 1962; fotografias de Craig e Morrill, 1986, cortesia dos autores.)
blastmero D do embrio de 4 clulas. O pesquisador concluiu que o citoplasma do lbulo polar contm os determinantes mesodrmicos e que esses do ao blastmero sua capacidade formadora do mesoderma. Wilson mostrou tambm que a localizao dos determinantes mesodrmicos estabelecida logo aps a fertilizao, demonstrando assim que uma regio citoplasmtica especfica do ovo, destinada a ser inclusa no blastmero D, contm os fatores (quaisquer que sejam) necessrios para os ritmos de clivagem especiais desse blastmero e para a diferenciao do mesoderma. Os determinantes morfogenticos seqestrados dentro do lbulo polar esto provavelmente localizados no citoesqueleto ou no crtex e no no citoplasma difusvel do embrio. Isso foi evidenciado a partir de estudos de A. C. Clement (1968). Quando o hemisfrio animal separado do vegetal no caracol Ilyanassa obsoleta, o hemisfrio animal forma rgos ectodrmicos que se assemelham a embries formados de ovos sem lbulos. Clement usou aqueles embries que haviam iniciado a reabsoro do seu segundo lbulo polar e os colocou em placas de gelatina. Em seguida, ele centrifugou os embries embebidos, forando o fluido citoplasmtico do vitelo da parte vegetativa da clula para dentro do hemisfrio animal. Centrifugando esses embries em um segundo meio viscoso, ele causou a separao dos hemisfrios animal e vegetal. As metades animais desses embries centrifugados no desenvolveram mais estruturas mesodrmicas e endodrmicas do que aquelas de ovos no centrifugados. Portanto, os determinantes do lbulo polar no foram transferidos ao hemisfrio animal pelo contedo fludico do hemisfrio vegetal. Van den Biggelaar obteve resultados semelhantes quando removeu o citoplasma do lbulo polar com uma micropipeta. O citoplasma de outras regies da clula fluram para o lbulo polar, repondo a poro que havia sido removida O desenvolvimento subseqente desses embries foi normal. Alm disso, quando o citoplasma solvel do lbulo polar foi adicionado ao blastmero B, no houve duplicaes de estruturas (Verdonk e Cather, 1983). Portanto, a parte difusvel do citoplasma no contm esses determinantes morfogenticos. Eles provavelmente se localizam no citoplasma cortical, no fluido, ou no citoesqueleto.
519
(A)
(B)
(C)
Clement tambm analisou o desenvolvimento subseqente do blastmero D para observar a futura partio desses determinantes. O desenvolvimento do blastmero D est ilustrado na Figura 13.11. Esse macrmero, tendo recebido o contedo do lbulo polar, maior do que os outros trs. Se for removido o blastmero D ou o seu primeiro ou segundo macrmeros derivados (1D ou 2D), obtm-se uma larva incompleta, sem corao, intestino, velum (a borda ciliada da larva), glndula da concha, olhos e p. Se o blastmero removido o 3D (aps a diviso da clula 2D para formar o blastmero 3d), obtm-se um embrio quase normal, tendo olhos, p, velum e parte da glndula da concha, mas sem corao ou intestino (Figura 13.12). Portanto, alguns dos determinantes morfogenticos originalmente presentes no blastmero D foram reservados para a clula 3d. Aps a produo da clula 4d (pela diviso do blastmero 3D), a remoo do derivado de D (a clula 4D) no produz diferena qualitativa no desenvolvimento. Realmente, todos os determinantes essenciais para a formao do corao e intestinos esto agora no blastmero 4d, e a remoo daquela clula resulta em uma larva sem corao e intestino (Clement, 1986). O blastmero 4d responsvel pela formao (na sua prxima diviso) dos dois mesentoblastos, as clulas que do origem a ambos rgos, mesodrmico (corao) e endodrmico (intestinos).
Figura 13.12
Importncia do lbulo polar no desenvolvimento de Ilyanassa. (A) Larva vliger normal. (B) Larva anormal, tpica para os casos onde o lbulo polar do blastmero D removido. (E, olho; F, p; S, concha; ST, estatocisto, rgo de equilbrio; V, velum; VC, clios velares; Y, vitelo residual; ES, estomodeu evertido; DV, velum desorganizado.) (de Newrock e Raff, 1975, cortesia de K. Newrock.)
520
(A)
Embrio normal
(B)
Embrio duplo
Figura 13.13
Formao de embries gmeos suprimindo a formao do lbulo polar em Dentalium. (A) Embrio normal no estgio da sexta clivagem. (B) Embries gmeos formados quando baixas concentraes de citocalasina inibem a formao do lbulo polar e o material do lbulo polar distribudo para ambos os blastmeros, AB e CD. (De acordo com Guerrier et al., 1978.)
O material do lbulo polar tambm responsvel pela organizao da polaridade dorso-ventral (costas-ventre) do embrio. Quando permitido que material do lbulo polar passe para o blastmero AB, como tambm para a clula CD, so formadas larvas gmeas unidas por suas superfcies ventrais (Figura 13.13; Guerrier et al., 1978; Henry e Martindale, 1987). Resumindo, experimentos mostraram que o citoplasma no difusvel do lbulo polar extremamente importante para o desenvolvimento normal de moluscos porque: 1. Contm os determinantes para um adequado ritmo e orientao de clivagem do blastmero D. 2. Contm certos determinantes (aqueles entrando no blastmero 4d e, portanto, levando produo dos mesentoblastos) para a diferenciao mesodrmica e intestinal. 3. Permite interaes indutivas (atravs do material entrando no blastmero 3d) que levam formao da glndula da concha e o do olho. 4. Contm determinantes necessrios para a especificao do eixo dorso-ventral do embrio. Apesar da evidente importncia do lbulo polar no desenvolvimento normal do caracol, ainda no se conhece os mecanismos desses efeitos. Parece no haver diferenas importantes no mRNA ou na sntese de protenas entre embries com ou sem o lbulo polar (Brandhorst e Newrock, 1981; Collier, 1983, 1984). Um possvel indcio foi fornecido por Atkinson (1987), que observou clulas diferenciadas no velum, aparelho digestivo e glndula da concha no embrio sem lbulo. Embries sem lbulo podem produzir essas clulas, mas parecem incapazes de organiz-las em tecidos e rgos funcionais. Tecidos do trato digestivo podem ser encontrados, mas no so ligados; micitos esto espalhados ao redor da larva sem lbulo, mas no esto organizados em um tecido muscular funcional. Parece, assim, que as funes do lbulo polar no desenvolvimento so muito complexas. [cyto3.html], [evo2.html]
521
Especificao celular no nematdeo Caenorhabditis elegans

A habilidade em analisar o desenvolvimento exige organismos apropriados. Ourios-do-mar h muito tempo tm sido o organismo favorito dos embriologistas porque pode-se facilmente obter seus gametas em grande nmero, seus ovos e embries so transparentes, e a fertilizao e o desenvolvimento podem ocorrer em condies de laboratrio. Mas, ourios-do-mar dificilmente podem ser criados no laboratrio por mais de uma gerao, dificultando o estudo de sua gentica. Geneticistas, de outro lado (especialmente aqueles que trabalham com eucariotos multicelulares), preferem a Drosophila. O rpido ciclo vital, facilidade de reproduo e os cromossomos politnicos da larva da mosca (que permite a localizao de genes) tornam esse animal soberbamente adequado para anlises hereditrias. Mas o desenvolvimento da Drosophila muito complexo e difcil de estudar. Um programa de pesquisa encabeado por Sidney Brenner (1974) foi organizado para identificar um organismo onde se pudesse identificar cada gene envolvido no desenvolvimento, como tambm seguir a linhagem de cada clula individual. Tal organismo o Caenorhabditis elegans, um pequeno nematdeo (1mm de comprimento) de vida livre encontrado no solo (Figura 13.14 A). um organismo com um rpido perodo de embriognese (aproximadamente 16 horas), que pode ser realizada em placas de Petri e relativamente poucos tipos de clulas. Alm disso, sua forma predominante hermafrodita, cada indivduo contendo vulos e espermatozides. Esses nematdeos podem reproduzir-se ou por autofertilizao ou fertilizao cruzada com machos que ocorrem com pouca freqncia. O corpo de um C. elegans hermafrodita contm exatamente 959 clulas somticas, cuja linhagem total foi identificada atravs de sua cutcula transparente (Figura 13.14 B; Sulston e Horvitz, 1977; Kimble e Hirsch,1979; Sulston et al.,1983). Alm disso, ao contrrio das linhagens de clulas dos vertebrados,
Figura 13.14
Caenorhabditis elegans. (A) Vista lateral do adulto hermafrodita. No incio do seu desenvolvimento, o espermatozide formado. Esse espermatozide armazenado durante os estgios posteriores, de tal forma que um vulo maduro passe atravs do espermatozide no seu caminho para a vulva. Dessa maneira, o hermafrodita une os seus prprios espermatozide e vulo. (B) Mapa completo da linhagem celular para C. elegans. Cada linha vertical representa uma clula; cada linha horizontal representa uma diviso celular. (De acordo com Pines, 1992, baseado em Sulston e Horvitz, 1977, e Sulston et al., 1983.)
(A) Intestino
Gnada Sistema nervoso
Faringe
nus Reto vulo Espermatozide vulo (B) Vulva
Clulas produtoras de cutcula Sistema nervoso Faringe
Vulva Gnada Intestino
Celulas germinativas
522
Ovo fertilizado PO (zigoto)
Hipoderme Neurnios Msculos farngeos Um msculo do corpo Glndulas (389 clulas)
Msculos do corpo Msculos farngeos Neurnios Glndulas (80 clulas)
Intestino (20 clulas)
Hipoderme Msculos do corpo Dois neurnios (47 clulas)
Msculos do corpo (20 clulas) Linhagem germinativa
Figura 13.15
Mapa resumido da linhagem celular de C. elegans, enfatizando os precursores da linhagem germinativa (clulas P, P0-P4) que recebem os grnulos P. O nmero de clulas (em parnteses) se refere s clulas presentes na larva recm-eclodida. Algumas dessas continuam a se dividir para produzir as 959 clulas somticas do adulto. (de Strome e Wood, 1983, cortesia de W. Wood.)
a linhagem de clulas do C. elegans quase inteiramente invarivel de um indivduo para o outro. Existem poucas possibilidades para o acaso (Sulston et al., 1983). (Essa uma conseqncia da organizao espacial da segregao citoplasmtica.) Caenorhabditis tambm tem um pequeno nmero de genes para um organismo multicelular- aproximadamente 15.000 (Sulston et al., 1992). A polaridade inicial parece residir no ovo alongado, o eixo ntero-posterior sendo o eixo longo do ovo. Entretanto, a deciso sobre qual ponta se tornar a anterior e qual ser a posterior parece depender do espermatozide. A posio de entrada do espermatozide no ncleo define o plo posterior (Goldstein e Hird, 1996). O esquema de diviso de C. elegans (Figura 13.15) semelhante ao da linhagem de clulas precursoras, pois durante a clivagem precoce, divises assimtricas produzem uma clula-filha diferenciada (coletivamente chamadas de clulas ncoras e denominadas como AB, MS, E, C e D) e outra clula precursora (a linhagem P1-P4). A localizao das substncias citoplasmticas em blastmeros especficos foi elegantemente demonstrada nessas divises assimtricas. Dentro do ovo est um conjunto de grnulos da linhagem germinativa, ou grnulos P, que so redistribudos no zigoto, pouco depois da fertilizao e so restritos s clulas capazes de formar gametas. Usando anticorpos fluorescentes contra um dos componentes dos grnulos P, Strome e Wood (1983) descobriram que durante a migrao pronuclear no zigoto, os grnulos P aleatoriamente espalhados passam a se localizar na ponta posterior do zigoto (em direo ao stio de entrada do espermatozide), de modo que somente entram no blastmero (P1) formado do citoplasma posterior (Figura 13.16; Prancha 10). Aps a clivagem, os grnulos P se dispersam atravs do blastmero P1 at o incio da mitose, quando eles novamente migram para a ponta posterior da clula. Aqui eles ficam reservados para o blastmero P2. Finalmente, os grnulos P se localizaro na clula P4, cuja descendncia se torna os espermatozides e os vulos do adulto. A localizao dos grnulos P requer microfilamentos mas pode ocorrer na ausncia de microtbulos. Tratando os zigotos com citocalasina D (um inibidor de microfilamentos), se impede a segregao desses grnulos na poro posterior da clula, enquanto que demicolcina (um inibidor microtubular semelhante colchicina) no impede esse movimento (Strome e Wood,1983). Uma vez dentro da regio posterior do zigoto, os grnulos P l permanecem, mesmo que os microfilamentos sejam destrudos (Hill e Strome, 1987, 1990). [other.html#cyto4]
523
Figura 13.16
(A)
Localizao assimtrica dos grnulos P durante a fertilizao e a primeira clivagem. As figuras esquerda esto coradas para mostrar o DNA; as figuras direita mostram as mesmas clulas marcadas com anticorpos fluorescentes contra a protena do grnulo P. (A) Um zigoto antes da migrao pronuclear mostra uma disperso aleatria dos grnulos P. (B) Com a aproximao dos proncleos, os grnulos se localizam na periferia posterior do zigoto. (C) Um embrio de duas clulas no qual P1 est entrando na prfase mittica; Os grnulos P esto agora posicionados na periferia posterior para serem transportados para a clula P2. (de Strome e Wood, 1983, cortesia de S. Strome.)
(B)
(C)
Os mecanismos para o movimento e a ancoragem desses grnulos citoplasmticos ainda so desconhecidos, mas eles so regulados pelos genes par que controlam a partio do citoplasma durante as primeiras clivagens do C. elegans. Mutaes em seis genes par (defectivos na partio) so expressas como mutantes com efeito materno, onde as distribuies de microfilamentos so aberrantes e os grnulos P so distribudos anormalmente (Kemphues et al., 1988; Kirby et al., 1990). Clivagens precoces nesses
Figura 13.17
(A)
(B)
Actina anormal e distribuio de grnulos P no mutante par-3. Distribuio da actina citoplasmtica no embrio do tipo selvagem (A) e no embrio de uma fmea deficiente em par-3 (B). A distribuio dos grnulos P assimtrica no embrio do tipo selvagem (C), mas simtrica no embrio deficiente em par-3 (D). No embrio mutante de 4 clulas (E), os grnulos P podem ser vistos em todas as quatro clulas. (de Kirby, 1992, cortesia de C. M. Kirby.)
(C)
(D)
(E)
524
embries mutantes so simtricas e sincronizadas, e os grnulos P so encontrados em vrios blastmeros (Figura 13.17). Os fentipos dos mutantes par-2 e par-3 se parecem aos embries do tipo selvagem quando esses so expostos a um inibidor de microfilamentos por um perodo de 10 minutos durante o primeiro ciclo celular (Hill e Strome, 1990). Alm disso, pelo menos trs das protenas (PAR-1, PAR-2 e PAR-3) so elas mesmas assimetricamente distribudas no crtex do zigoto (Etemad-Moghadam et al., 1995; Guo e Kemphues, 1995; Boyd et al., 1996). A protena PAR-2 uniformemente distribuda pelo crtex do ocito, mas se torna localizada no crtex posterior no embrio de uma clula. Na primeira clivagem, a protena PAR-2 entra somente na clula-filha posterior, P1. De forma similar, PAR-2 se torna restrita ao plo posterior de P1, P2 e P3. A protena PAR-2 parece ser crtica para a manuteno da protena PAR-1 no crtex posterior, e PAR-1 parece estar envolvida em ligao com os grnulos P (Boyd et al., 1996). Controle maternal da identidade do blastmero: O controle gentico das clulas progenitoras farngeas de C. elegans. A determinao na maior parte do embrio de C. elegans autnoma, sendo os destinos celulares determinados por fatores citoplasmticos internos, e no por interaes entre clulas vizinhas. Considera-se que os fatores proticos podem determinar o destino celular entrando no ncleo de blastmeros especficos e ativando ou reprimindo certos genes determinantes do destino. Foram encontrados fatores de transcrio em linhagens celulares determinadas de maneira autnoma? Apesar dos grnulos P de C. elegans estarem localizados de maneira consistente com um papel de determinante morfogentico, eles no entram no ncleo e sua funo no desenvolvimento ainda desconhecida. Entretanto, a protena SKN-1 do embrio de C. elegans uma candidata muito promissora para um morfgeno de fator de transcrio. A protena SKN-1 um polipeptdeo especificado maternalmente que pode controlar o destino do blastmero EMS, a clula que gera a faringe posterior. Aps a primeira clivagem, somente o blastmero posterior, P1, tem a habilidade de produzir as clulas farngeas de maneira autnoma quando isolado. Depois da diviso de P1, somente o EMS capaz de gerar clulas musculares farngeas, mesmo quando isolado das outras clulas do corpo (Priess e Thomson, 1987). Similarmente, quando a clula EMS se divide, somente uma de sua prognie, MS, tem a habilidade intrnseca para gerar tecido farngeo. Isso sugere que o destino da clula farngea pode ser determinado autonomamente por fatores maternos residindo no citoplasma que destinado particularmente para essas clulas. Bowerman e seus colaboradores (1992) procuraram mutantes de efeito materno que no tm clulas farngeas, e eles isolaram uma mutao no gene skn-1. Embries de mes homozigotas, deficientes em skn-1, no tm derivativos farngeos e intestinais de EMS (Figura 13.18). Em lugar de produzir as estruturas farngeas e intestinais normais, esses embries parecem produzir tecido hipodrmico (pele) extra, onde deveriam estar a faringe e o intestino. Somente aquelas clulas destinadas a formar faringe ou intestino so afetadas por essa mutao. Alm disso, a protena que seria codificada por essa mensagem tem uma seqncia no stio de ligao do DNA semelhante aquele visto na famlia bZIP de fatores de transcrio (Blackwell et al.,1994). Bowerman e colegas (1993) mostraram que a protena SKN-1 est presente no citoplasma do ovo. Entretanto, aps a primeira clivagem muito mais dessa protena entra no ncleo P1 do que no ncleo AB (Figura 13.19). Aps a segunda diviso, ambos os derivados P1 recebem a protena SKN-1 em seus ncleos. Assim, possvel que a protena SKN-1 seja um morfgeno que ativa certos genes na clula P1 e seus descendentes. Entretanto, alguma coisa a mais necessria para restringir a funo de SKN-1 clula EMS e para impedir seu funcionamento em P2. Restringir a identidade de EMS a um nico blastmero do embrio de 4 clulas requer a atividade de dois outros genes, ambos parecendo regular skn-1. Mutaes dos genes pie-1 (pharyngeal, intestinal excess) e mex-1 (muscle excess) alteram a
525
Tipo selvagem
Mutante skn-1
Figura 13.18
Antgeno do msculo da faringe
(A)
(B)
Deficincias de intestino e faringe de mutantes skn-1. Embries de fmeas do tipo selvagem (A,C) e de fmeas homozigotas para o mutante skn-1 (B,D) foram testados para verificar a presena de msculos farngeos (A,B) e grnulos especficos do intestino (C,D). O anticorpo especfico para o msculo farngeo marca a musculatura da faringe nos embries derivados de fmeas do tipo selvagem, mas no se liga a nenhuma estrutura dos embries de fmeas mutantes de skn-1. Analogamente, os grnulos birrefringentes do intestino esto ausentes nos embries derivados das fmeas mutantes para skn-1. (de Bowerman et al., 1992,cortesia de B.Bowerman.)
Grnulos especficos do intestino
(C)
(D)
determinao de clulas no embrio de oito clulas de C. elegans de tal maneira que vrias clulas adicionais no embrio so determinadas como clulas MS (Mello et al., 1992). Em embries derivados de fmeas deficientes em pie-1 os blastmeros irmos P3 e C so convertidos em blastmeros E e MS, respectivamente, enquanto que embries derivados de fmeas deficientes em mex-1, todos os descendentes da clula AB so redefinidos como clulas MS. Fmeas simultaneamente deficientes nos produtos de mex-1 e pie-1 geram embries nos quais as seis clulas anteriores so clulas MS e as duas posteriores, clulas E. Desse modo, as protenas PIE-1 e MEX-1 agem independentemente- MEX-1 durante a primeira diviso e a protena PIE-1 durante a segunda diviso (Figura 13.20; Bowerman et al., 1993). Em todos os casos o gene do tipo selvagem SKN-1 necessrio para a formao das clulas MS extras, e embries sem skn-1 no tm faringe. Isso relaciona as protenas MEX-1 e PIE-1 ativao (mais
Tipo selvagem mex-1
Figura 13.19
Localizao citoplasmtica da protena SKN1. Anticorpos protena SKN-1 mostram que ela est presente predominantemente no ncleo da clula P1, aps a primeira diviso. Aps a segunda diviso, essa protena se acumula nas duas clulas derivadas de P1, mas no nas clulas derivadas de AB (compare as intensidades dos ncleos indicados pelas setas). Em mutantes mex-1 a protena SKN-1 est distribuda igualmente em todos os blastmeros. (de Bowerman et al., 1993, cortesia de B. Bowerman.)
526
Figura 13.20
(A)
Ovo
Modelo esquemtico da determinao da clula MS em embries do tipo selvagem e mutantes. (A) O determinante MS (considerado como o produto do gene skn-1) est presente no estado inativo dentro do ovo. Durante a primeira diviso nos embries do tipo selvagem, o determinante MS est localizado no blastmero posterior (P1), e na segunda diviso, ele vai se localizar na clula EMS. Na terceira diviso, a clula EMS se divide na clula MS (onde o fator ativado) e a clula E. Em embries derivados de fmeas deficientes em mex-1, o fator no se segrega na primeira diviso, mas a segregao a partir de P1 normal na diviso seguinte. Em embries derivados de fmeas deficientes em pie-1, a segregao inicial do determinante de MS para o P1 normal, mas a segunda distribuio assimtrica do determinante (para a clula EMS) defeituosa. No mutante combinado, os padres so superpostos, de modo que todas as clulas do embrio de 4 clulas tm o determinante MS inativo. (B) Sumrio das interaes envolvendo skn-1, pie-1 e mex-1. (A de acordo com Mello et al., 1992; B de acordo com McGhee, 1995.)
Tipo selvagem
(B) Em mutantes mex-1, a protena SKN-1 tambm encontrada nos ncleos AB O produto de pie-1 pode reprimir atividade de skn-1 no ncleo P2
A protena SKN-1 normalmente encontrada nos ncleos de EMS e P2
P2 precisa contactar EMS para haver diferenciao do intestino
do que a localizao) de SKN-1*. Assim, a protena SKN-1 localizada no citoplasma do ovo pode ser um fator de transcrio que ativa genes especficos no blastmero MS, determinando o seu destino. A protena PIE-1 impede que SKN-1 especifique a faringe em P2 e, provavelmente tambm um fator de transcrio que antagoniza sua ao (Mello et al., 1996; Seydoux et al., 1996). provvel que PIE-1 tambm tenha um papel positivo. Durante cada diviso, a protena PIE-1 retida pelo centrossomo da clula que se torna o prximo blastmero da linhagem germinativa. Mutaes do gene pie-1 materno resultam em blastmeros da linhagem germinativa que adotam destinos somticos, com a clula P2 se comportando como um blastmero EMS do tipo selvagem. A localizao e as propriedades genticas de PIE-1 sugerem que esse reprime a determinao celular somtica e preserva a totipotncia da linhagem das clulas germinativas (Mello et al., 1996; Seydoux et al., 1996).
A localizao adequada de SKN-1 parece depender de protenas PAR, especialmente PAR-3 e PAR-6 (Watts et al., 1996).
527
Na terceira diviso, o blastmero EMS d origem ao E (que forma o intestino) e MS (que predominantemente forma a faringe e as clulas da parede muscular). As clulas EMS contm SKN-1, e cada um dos seus descendentes contm quantidades iguais de SKN-1. Assim, enquanto SKN-1 crtica na determinao de qual clula pode dar origem ao mesoderma farngeo (ou seja, qual blastmero se torna a clula EMS), alguma coisa alm de SKN-1 especifica MS excluindo E. Estudos de Lin e colegas (1995) mostraram que a protena POP-1 crtica na especificao de MS. Na ausncia de POP-1, a clula MS adota o destino de outro blastmero E do tipo selvagem. Nesses mutantes de efeito maternal, a clula MS no produz nem clulas farngeas nem musculares, e em lugar disso produz clulas intestinais. A protena POP-1 provavelmente um fator de transcrio, e pode interagir com SKN-1 para especificar o desenvolvimento de MS. [cyto5.html], [cyto6.html] Regulao em C. elegans O desenvolvimento de C. elegans principalmente autnomo, mas interaes regulatrias entre clulas tambm so importantes na especificao do destino celular. Se o blastmero EMS separado de todas as outras clulas no estgio de 4 clulas logo aps sua formao, ele no formar os grnulos de rabditina (rhabditin), especficos do intestino. Mas se for recombinado com o blastmero P2 formar esses grnulos; mas isso no acontecer se combinado com ABa, ABp, ou com ambos os derivados de AB (Figura 13.21; Goldstein,1992). Interaes celulares so necessrias para esse estgio de determinao intestinal. Como o nematdeo tem linhagens celulares invariantes, tem tambm interaes clula-clula invariantes. No embrio de 4 clulas, os blastmeros irmos Aba (anterior) e ABp (posterior) tm diferentes destinos no desenvolvimento. ABa produz neurnios, clulas hipodrmicas e clulas farngeas anteriores, enquanto ABp produz somente neurnios e clulas hipodrmicas. Entretanto, se sua posio invertida experimentalmente, seus destinos tambm so invertidos e se forma um embrio normal. Em outras palavras, ABa e ABp so clulas equivalentes cujos destinos so determinados por suas posies dentro do embrio (Priess e Thomson, 1987). Entretanto, em circunstncias normais, o esquema invariante de clivagem embrionria determina que os descendentes de ABa, no ABp, produzam 19 clulas farngeas. Clulas-filha de
(A)
(B)
Intestino se diferencia Intestino no se diferencia
Figura 13.21
(C)
Tempo de separao (minutos antes da clivagem de EMS)
Resultados de experimentos de isolamento e recombinao mostrando que so necessrias interaes celulares para que a clula EMS forme determinantes da linhagem intestinal. (A) Quando o blastmero EMS separado logo aps a sua formao, ele no pode produzir grnulos especficos para o intestino. Se ele deixado por perodos mais longos, ento, ele pode produzir. (B) Se a clula EMS recombinada com cada um ou ambos derivados do blastmero AB, no formar grnulos especficos para o intestino. (C) Se recombinado com o blastmero P2, a clula EMS dar origem a estruturas especficas do intestino.(de Goldstein, 1992.)
528
ABa se diferenciam nessas clulas musculares farngeas devido sua interao com o blastmero EMS ou seus descendentes (os quais produzem 18 clulas musculares da faringe de maneira autnoma). Estudos genticos mostraram que ABp se torna diferente de ABa pela interao com a clula P2. Alm disso, esses estudos mostraram que essa interao mediada pela protina GLP-1 na clula ABp e a protena APX-1 (anterior pharynx excess) no blastmero P2. Em um embrio no manipulado, tanto ABa como ABp contactam o blastmero EMS, mas somente ABp contacta a clula P2. Se a clula P2 destruda na fase precoce do estgio de 4 clulas, a clula ABp no gera as clulas da vlvula intestinal, o que normalmente faria (Bowerman et al., 1992). O contato entre ABp e P2 essencial para a especificao do destino das clulas ABp, e a clula ABa pode ser mudada em um tipo de clula ABp se for forado seu contacto com P2 (Hutter e Schnabel, 1994; Mello et al., 1994). O produto materno do gene glp-1 parece ser crtico na distino entre ABa e ABp. Nos embries de mes com glp-1 mutante, o ABp transformado em uma clula ABa (Hutter e Schnabel, 1994; Mello et al., 1994). Usando alelos de glp-1 sensveis temperatura, foi mostrado que o momento para a interao dependente de GLP-1 entre os estgios de 4 a 12 clulas, quando P2 necessrio para o estabelecimento dos destinos de ABp (Figura 13.22). A protena um membro de uma famlia amplamente conservada chamada de protenas Notch, que servem como receptores de membranas celulares em muitas interaes clula-clula e tambm detectada nas clulas ABa e ABp (Evans et al 1994).* Um dos ligantes mais importantes para protenas Notch como GLP-1 uma outra protena de superfcie chamada Delta. No C. elegans uma protena semelhante Delta a APX-1 encontrada na clula P2 (Mango et al., 1994; Mello et al., 1994). Esse sinal APX-1 parece quebrar a simetria entre ABa e ABp, pois estimula a protena GLP-1 somente no descendente AB que toca, ou seja, o blastmero ABp. Fazendo assim, a clula P2 inicia o eixo dorsoventral de C. elegans.
* Como discutido no captulo anterior, a protena GLP1 est localizada nos blastmeros ABa e ABp mas o mRNA do glp-1, maternalmente codificado, encontrado em todo o embrio. Evans e colegas (1994) postularam que deve haver algum determinante de traduo no blastmero AB que permite que a mensagem glp-1 seja traduzida nos seus descendentes. O gene glp-1 tambm ativo na regulao das interaes clula-clula ps-embrionrias. Ele usado mais tarde pela clula da extremidade distal da gnada para controlar o nmero de clulas germinativas entrando em meiose; da o nome proliferao da linhagem germinativa (em ingls: germinal line proliferation) (veja Captulos 17 e 22; Austin e Kimble, 1987).
Figura 13.22
Experimento com deslocamento de temperatura para determinar em qual estgio o produto do gene glp-1 materno est ativo. Neste mutante a protena GLP-1 funciona a 15o C, mas no a 25o C. Variando a temperatura em diferentes estgios embrionrios foi determinado que a protena GLP1 era necessria entre os estgios de 4 a 28 clulas. (De acordo com Priess et al., 1987.)
Larvas com musculatura farngea derivada do blastmero AB (%)
Nmero total de clulas no embrio quando a temperatura variou.
Prancha 2 Unidades de transcrio ativa em um cromossomo de trito
Ocitos de anfbios como Notophtalmus viridescens tm cromossomos tipo escova-de-lmpada nos quais os genes sintetizadores de RNA ativos se projetam para fora. O eixo do DNA dessas projees est corado com um corante branco. A mancha vermelha de um anticorpo que se liga s protenas ligantes de RNA. Captulo 22. (Fotografia cortesia de M. B. Roth e J. Gall.)
Prancha 1 Um clone de rs Xenopus
Os ncleos de todos os membros desse clone vieram de um nico indivduo um girino fmea do estgio de broto de membro, cujos antecessores (painel superior direita) foram ambos marcados com genes albinos. Os ncleos foram transferidos para ovos no-fecundados, enucleados e ativados de uma fmea do tipo selvagem. As rs resultantes eram todas fmeas e albinas (painel inferior). Captulo 2. (Fotografia cortesia de J. Gurdon.)
Prancha 3 O fator de crescimento do fibroblasto essencial para produo dos mesodermas lateral e ventral em Xenopus
Quando ovos de Xenopus so injetados com um receptor mutante negativo e dominante para o fator de crescimento de fibroblasto (FGF), o embrio incapaz de responder ao FGF. Na ausncia do sinal do FGF, os mesodermas lateral e ventral no se formam, e o embrio carece de tronco e cauda. Captulos 3 e 15. (Fotografia cortesia de M. Kirschner.)
Prancha 4 Capacidade do lbio dorsal do blastporo gerar o eixo neural secundrio em anfbios
O lbio dorsal do blastporo de embries de anfbios pode organizar um segundo eixo embrionrio quando transplantado para o lado ventral de outra gstrula. Esta fotografia foi tirada de uma lmina real preparada por Hilde Mangold e mostra que as estruturas dorsais secundrias contm tanto tecidos do hospedeiro (no pigmentados) quanto do doador (pigmentados). Captulo 15. (Fotografia cortesia de P. Fssler e K. Sander.)
(A)
Prancha 5 Salvamento de estruturas dorsais pela protena Noggin
A protena Noggin pode ser crtica para a induo do mesoderma dorsal e do tubo neural. Quando ovos de Xenopus so expostos irradiao UV antes da primeira clivagem, no se formam estruturas dorsais (painel superior). Se uma clula precoce de tal embrio for injetada com RNA de noggin, os embries formam estruturas dorsais. Se a mensagem noggin for injetada em demasia, os embries produzem muito mais tecido anterior dorsal (painel inferior). Captulo 15. (Fotografias cortesia de R. M. Harland.)
(B)
(C)
Prancha 6 ( direita) O gene noggin transcrito no mesoderma dorsal e tecido mesodrmico
O RNA de noggin se acumula na regio da zona marginal dorsal (A) e visto no lbio dorsal do blastporo (B). Quando essas clulas involuem, a expresso de noggin vista na notocorda e endoderma farngeo (C), que se estende anteriormente, no centro do embrio (D). Captulo 15. (Fotografias cortesia de R. M. Harland.)
(D)
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
Prancha 7 Rearranjos do citoplasma em Xenopus laevis
O ovo no-fertilizado de Xenopus laevis tem simetria radial. (B) Movimentos citoplasmticos so vistos medida que o ovo comea a clivar, 90 minutos aps a fecundao. O citoplasma do futuro lado dorsal ( direita) difere daquele do futuro lado ventral ( esquerda). Essas diferenas podem ser vistas durante toda a clivagem embrionria (C,D) e resultam no posicionamento dos determinantes morfogenticos dorsais, no lado do embrio oposto ao ponto de entrada do espermatozide. (E) Os movimentos citoplasmticos se correlacionam com o deslocamento da -catenina. No estgio bicelular precoce, a -catenina (cor laranja) est localizada predominantemente na futura superfcie dorsal do embrio. Esse padro persiste no estgio de blstula (F). Captulos 4, 6 e 15. (A-D cortesia de M. V. Danilchik; E e F cortesia de R. T. Moon.)
Prancha 8 Localizao de um RNA especfico numa regio do ovo
Prancha 9 Efeito do cido retinico na regenerao de membros
O RNA de vg1 que codifica um fator de crescimento da famlia TGF-, aps hibridizao in situ, encontrado residindo exclusivamente na regio vegetal do ovo de Xenopus. O crescente branco no fundo do ovo devido radioatividade da sonda que reconhece o RNA; o resto do ovo verde devido colorao com o corante Giemsa. Captulos 12, 15 e 22. (Fotografia cortesia de D. A. Melton.)
O cido retinico (RA) faz com que as clulas em regenerao esqueam sua posio original. Tecido do pulso da salamandra em regenerao, usualmente formar somente um pulso. Aps tratamento com RA, porm, o tecido em regenerao (aqui de uma salamandra pigmentada escura) regenera todo o antebrao (membro inferior direito) quando enxertado em um membro posterior cortado de um animal com pigmentao diferente. Captulo 18. (Cortesia de K. Crawford.)
Prancha 10 Localizao progressiva no citoplasma
A segregao de certos grnulos citoplasmticos (grnulos P) vista progredindo para dentro das clulas mais posteriores do embrio de Caenorhabditis elegans. Essas clulas geram o espermatozide e o vulo do nematide. Quando os proncleos se encontram durante a fecundao, os grnulos P se movem para a poro posterior da clula. Esse movimento prossegue at os grnulos serem encontrados somente na clula P que d origem aos gametas. A coluna esquerda est corada para mostrar a posio dos ncleos, enquanto a coluna direita est corada para mostrar os grnulos P. Captulo 13. (Fotografias cortesia de S. Strome.)
Prancha 11 Localizao citoplasmtica em embries de tunicados
A clivagem separa regies do citoplasma em clulas particulares. O crescente amarelo do embrio de Styela fica localizado em um pequeno grupo de clulas que iro gerar a musculatura larval. Esta figura mostra os estgios de 2-, 4-, 16- e 64-clulas. Captulo 13. (Fotografias cortesia de J. R. Whittaker.)
Prancha 12 Onda de ons de clcio atravs de ovos do ourio-do-mar durante a fertilizao
Quando o espermatozide se funde com o vulo, uma onda de clcio se inicia no local da entrada do espermatozide e se propaga atravs do vulo. Isso pode ser monitorado pr-carregando o ovo com um corante que fluoresce quando liga o clcio. A onda leva 30 segundos para atravessar o ovo. Captulo 4. (Fotografia cortesia de G. Schatten.)
(A)
Prancha 13 Regies responsivas ao cido retinico do embrio de camundongo
(B)
(C)
Um transgene consistindo de um elemento responsivo ao cido retinico fundido a um gene da -galactosidase foi inserido em um embrio de camundongo. Colorao para galactosidase deve revelar as clulas que respondem s concentraes endgenas de cido retinico. (A) O estgio de 3-somitos mostrando responsividade ao cido retinico na regio mediana do embrio; (B) Embries de 11,5 dias mostrando colorao regio frontonasal e crebro anterior; (C) Embrio de 14,5 dias mostrando colorao no maxilar, regio ptica, coxim do bigode e regies interdigitais do membro. Captulos 11, 18 e 21. (Fotografias cortesia de J. Rossant.)
Prancha 14 Formao de padres em Drosophila
(A) O eixo ntero-posterior especificado por mRNAs e protenas citoplasmticas. O gradiente da protena Bicoid especialmente importante. Altas concentraes dessa protena (amarelo a vermelho) causam formao da cabea e do trax ativando o gene hunchback. (B) Os gradientes de protenas no embrio precoce ativam os genes gap. Os produtos proticos dos genes gap (tais como hunchback e Krppel) definem grandes domnios no corpo do inseto. Essas protenas interagem para formar limites especficos no embrio. Aqui, as protenas Hunchback (laranja) e Krppel (verde) se sobrepem para formar um limite (amarelo). (C) Os nveis das protenas gap promovem a ativao de genes pair-rule especficos (aqui visveis pelas bandas escuras) que dividem o embrio em segmentos ao longo do eixo ntero-posterior. (D) No estgio da banda germinativa estendida, as 14 bandas do gene da polaridade segmentar engrailed podem ser vistas. Captulo 14. (Fotografias cortesia de (A) W. Driever e C. Nsslein-Volhard; (B) C. Rushlow e M. Levine; (C) T. Karr e (D) S. Carroll e S. Padock.)
Prancha 15 Compartimentao do disco imaginal da asa de Drosophila
O corante imunofluorescente vermelho marca as clulas onde a protena Vestigial produzida (a futura asa ventral); o corante verde marca as clulas que expressam a protena Apterous (necessria para a formao da asa dorsal). A rea sobreposta amarela. Captulo 19. (Fotografia cortesia de S. Carroll.)
Prancha 16 Localizao da RNA polimerase II nos ocitos do bicho-da-seda gigante
Fotomicrografia de fluorescncia (usando lentes confocais) da cmara do ovo de Hyalophora cecropia. Fluorescncia laranja indica a presena da RNA polimerase II (corada com amanitina marcada). Fundo verde indica a localizao da actina. (B) Maior aumento da regio cortical do ocito de Antherea polyphemus e clulas foliculares. Laranja indica RNA polimerase II. As outras cores so colorao de fundo de grnulos do vitelo e clulas foliculares. Captulo 22. (Fotografias cortesia de S. Berry.)
Prancha 17 ( acima ) Mariposa ginandromorfa
Um mosaico sexual (ginandromorfo) de uma mariposa lo, dividido bilateralmente em uma metade feminina rosa-pardacenta e uma metade masculina amarela, de asa menor. Tais mosaicos sexuais so causados quando um cromossomo X perdido de um ncleo durante a diviso mittica precoce. Captulo 20. (Fotografia de T. R. Manley; cortesia do The Journal of Heredity.)
Prancha 18 (esquerda) Controle do desenvolvimento pelo ambiente
Lagartas de Nemoria arizonaria que eclodem na primavera ingerem flores do carvalho e desenvolvem uma cutcula que mimetiza as flores. Lagartas da mesma espcie que eclodem no vero (aps o desaparecimento das flores) ingerem folhas de carvalho; essas lagartas desenvolvem cutculas que se parecem com as folhas do carvalho. Substncias qumicas nas folhas parecem modificar o desenvolvimento da cutcula. Captulo 21. (Fotografias cortesia de E. Greene.)
Prancha 19 Migrao das clulas da crista neural do pinto
Clulas da crista neural do pinto podem ser seguidas em sua migrao corando-as com um anticorpo monoclonal marcado, fluorescente. As clulas da crista neural (coradas de verde) so consideradas migrar atravs das regies anteriores (A) mas no das regies posteriores (B) do tecido somtico. Esse padro especfico de migrao das clulas da crista neural tem um papel na determinao da colocao dos neurnios perifricos. Captulo 7. (Fotografias cortesia de M. Bronner-Fraser.)
Prancha 20 Vias de migrao neural em insetos
Axnios neurais em embries de insetos migram de acordo com padres muito especficos. Neurnios derivados de um precursor comum (aqui mostrados com a mesma colorao) produzem axnios que migram seletivamente com outros axnios. O axnio Q1, por exemplo, viaja at encontrar o axnio dMP2 e em seguida viaja com esse, enquanto o axnio do neurnio G continua a mover-se em uma linha reta at encontrar o axnio P1. Captulo 8. (Fotografia cortesia de C. Goodman.)
Prancha 21 Um camundongo com seis pais
O camundongo multicolorido foi formado misturando clulas de trs embries do estgio de 4 clulas: Um embrio oriundo de dois camundongos pretos; um embrio oriundo de dois camundongos brancos; e um embrio oriundo de dois camundongos castanhos. Em lugar de formar um monstro de trs cabeas, o embrio regulou-se para formar um camundongo de tamanho normal com contribuies de cada um dos trs embries. Cada um dos trs embries tambm proveu clulas da linhagem germinativa, o que foi mostrado acasalando esse camundongo com um camundongo recessivo (branco); esse acasalamento produziu descendncia de todas as trs cores. Captulo 5. (Fotografia cortesia de C. Markert eThe Journal of Heredity.)
529
O eixo esquerdo-direito determinado mais tarde, no estgio de 12 clulas quando o blastmero MS contacta metade da prognie das clulas ABa e ABp, convertendoas em ABal (anterior esquerda) e ABpl (posterior esquerda), enquanto as outras duas clulas se tornam as contrapartidas do lado direito. O sinal da clula MS parece ativar GLP-1 na prognie de AB (Evans et al., 1994). Entretanto, o ligante dando esse sinal diferente de APX-1 e ainda no foi descoberto (Hutter e Schnabel, 1995).
&
Especulaes
Ser ou No Ser: Esse o Fentipo
ERTAMENTE, estamos sempre enfrentando decises de vida ou morte, mas essa dicotomia existencial raramente to inflexvel como aquela vista na linhagem celular de C. elegans. Durante o desenvolvimento normal de C. elegans, 131 clulas se suicidam. Essa morte celular programada, ou apoptose, um evento ativo iniciado por dois genes, ced-3 e ced-4. Quando esses genes so expressos, as clulas que os expressam morrem. Mutaes de perda de funo em qualquer um desses genes permitem a sobrevivncia de clulas que normalmente sofreriam apoptose. Os produtos de ced-3 ou ced-4 so considerados txicos para a clula ou causam a formao de compostos txicos a partir de outros metablitos (Ellis e Horvitz, 1986; Yuan e Horvitz, 1990) O que determina quais clulas vivero e quais morrero? Estudos no laboratrio de Robert Horvitz (Hengartner et al., 1992) demonstraram que o gene ced9 inibe as atividades de ced-3 e ced-4. Mutaes que inativam a protena CED9 fazem com que numerosas clulas que normalmente sobreviveriam ativem seus genes ced-3 e ced-4 e morram. Isso leva morte do embrio. Inversamente, mutantes de ganho de funo de ced-9 impedem a morte de clulas que normalmente sofrem apoptose. (Essas so as mesmas clulas que sobrevivem nos mutantes ced-3 e ced-4.) Portanto, a funo normal de CED-9 impedir as clulas, que devero viver, que iniciem o programa de morte celular (Figura 13.23). O gene ced-9 parece funcionar como um comutador binrio regulando a escolha entre vida ou morte. Essa deciso feita
independentemente em cada clula do embrio; possvel que cada clula do embrio esteja preparada para morrer, e aquelas que sobrevivem o fazem porque um gene ced-9 ativo impede a ocorrncia da morte celular programada.[cyto7.html] No se sabe como CED-9 impede a morte das clulas, nem como a protena se torna diferencialmente regulada, apesar de outros genes produzirem produtos que a ativam. Genes similares esto sendo descritos tambm nos mamferos. O gene BCL-2 codifica uma protena da membrana intracelular que previne ou atrasa a apoptose normal de neurnios e linfcitos humanos (Hockenbery et al., 1990; Williams et al., 1990; Allsopp et al., 1993). A maioria dos linfcitos e seus precursores morrem durante sua maturao, e aqueles que sobrevivem tm um limitado tempo de vida. Eles so protegidos da morte por certos fatores de crescimento
(A) ced-9 bcl-2 (B) ced-9
Figura 13.23
Inibe
ced-3 ced-4 (apopain)
Morte celular
Sobrevivncia da clula Morte celular
Modelo para o funcionamento do gene ced-9 em C. elegans. (A) ced-9 age como em regulador negativo de ced-3 e ced-4, os dois genes cujas atividades causam a morte celular. Em mamferos, o homlogo de ced-9 o Bcl-2 e o homlogo de ced-3 o apopain. Ainda no foi encontrado o homlogo para ced-4. (B) A troca binria efetuada por ced-9. Quando na forma ligada, as atividades de ced-3 e ced-4 so inibidas e a clula sobrevive. Se ced-9 no est ligado, os produtos dos genes ced-3 e ced-4 matam a clula. (De acordo com Hengartner et al.,1992.)
que parecem ativar o gene BCL-2. Alm disso, se genes BCL-2 em um promotor constitutivamente ativo so transferidos para clulas que vo morrer logo, a protena BCL-2 produzida e os intervalos de vida das clulas so significativamente aumentados (Nuez et al., 1990). Isso feito naturalmente pelo vrus de Epstein Barr (que causa mononucleose). Linfcitos infectados com o vrus de EpsteinBarr no morrem como seria usual porque uma das protenas virais induz a atividade do gene BCL-2 (Henderson et al., 1991). As similaridades entre ced-9 e BCL-2 so to impressionantes que se o gene humano BCL-2 ativo colocado em embries de C. elegans, ele impede que a morte celular ocorra normalmente (Vaux et al., 1992). Isso sugere que BCL-2 funciona no homem por sua ao nos homlogos humanos de ced-3 e ced-4. Os homlogos humanos de ced-3 foram encontrados, e constituem uma famlia de proteases de cistena que inclui apopana (CPP32). A apopana capaz de inativar, no incio da apoptose, a enzima poli(ADP-ribose) polimerase, uma protena que necessria para a estrutura e integridade do genoma (Nicholson et al., 1995). Considera-se ainda que a apopana deva ser negativamente regulada por BCL-2. Certas doenas degenerativas (como a apoptose linfoctica induzida por vrus na AIDS, ou doenas neurodegenerativas como apoplexias) podem se originar da inativao ou do impedimento da ativao de genes como BCL-2. Se for mostrado que esse o caso, aqueles genes ativos em impedir a morte celular no desenvolvimento podem se situar entre os genes do nosso corpo mais importantes para a medicina.
530
Divises celulares assimtricas no desenvolvimento tardio

Estudos do desenvolvimento do sistema nervoso da Drosophila forneceram evidncia de que a segregao de determinantes morfogenticos podem ocorrer no desenvolvimento tardio, aps o estabelecimento do plano principal do corpo. Na formao do sistema nervoso central da larva da Drosophila, clulas-tronco neurais (neuroblastos) se dividem formando dois tipos distintos de clulas. Uma clula-filha outro neuroblasto (ou seja, outra clula-tronco para manter o crescimento da populao), enquanto a outra clula-filha uma clula-me ganglionar cuja prognie est comprometida a se tornar neurnios (Captulo 8). Essa clula-me ganglionar contm um distinto conjunto de protenas, incluindo a protena de membrana Numb e o fator de transcrio Prospero, que especificam seu comprometimento neuronial. Surpreendentemente, tanto a protena Numb como a Prospero no so sintetizadas na clulame ganglionar; elas so sintetizadas no neuroblasto. Esse paradoxo foi resolvido quando os pesquisadores encontraram que enquanto no neuroblasto, as protenas Numb e Prospero permanecem no citoplasma. Entretanto, quando aquela clula comea a se dividir, essas protenas se associam membrana que ir formar a clula-me ganglionar. Quando a diviso termina, todas as protenas Numb e Prospero foram repartidas para a clula-me ganglionar onde elas exercem suas respectivas funes (Figura 13.24; Hirata et al., 1995; Knoblich et al., 1995; Spana e Doe, 1995). Essas duas protenas compartilham uma seqncia de aminocidos considerada responsvel pela sua segregao assimtrica. Quando esse segmento de aminocidos removido dessas protenas, elas se distribuem aleatoriamente em ambas as clulas-filha. [cyto8.html]
(B) Metfase Protena Prospero se acumula na membrana polar Anfase
(A) Clula-me ganglionar Clula-tronco do neuroblasto (C)
(D) Telfase
Interfase
Figura 13 24
Distribuio assimtrica da protena Prospero durante o desenvolvimento da clula-me ganglionar. (A) Clula-tronco do neuroblasto sintetiza a protena Prospero, a qual permanece difusamente distribuda no citoplasma. (B) Na metfase, toda a protena Prospero est acumulada em um dos plos do neuroblasto em diviso. (C) Na anfase e telfase, a protena Prospero entra na clula-me ganglionar e excluda do neuroblasto. (D) A protena Prospero, sendo um fator de transcrio, entra no ncleo da clula-me ganglionar. A protena Numb se junta Prospero ao deixarem o neuroblasto, mas no entra no ncleo do neuroblasto. (De acordo com Hirata et al., 1995.)
531
Localizao citoplasmtica de determinantes de clulas germinativas

Determinantes localizados no citoplasma so encontrados em todo o reino animal. Os determinantes observados mais freqentemente so os responsveis pela determinao de precursores de clulas germinativas, ou seja, as clulas que do origem aos gametas. Mesmo em embries onde outros aspectos do desenvolvimento precoce so reguladores, aquelas clulas contendo determinadas regies do citoplasma do ovo so destinadas a se tornarem precursoras de clulas germinativas. Determinao de clulas germinativas em nematdeos Theodor Boveri (1862-1915) foi o primeiro a observar os cromossomos de um organismo ao longo do seu desenvolvimento. Nesse estudo, ele descobriu um aspecto fascinante do desenvolvimento do nematdeo Parascaris aequorum (antes Ascaris megalocephala). Esse nematdeo tem somente dois cromossomos por clula haplide, permitindo assim observaes detalhadas dos cromossomos individuais. O plano de clivagem da primeira diviso embrionria pouco usual, porque sendo equatorial separa a metade animal da metade vegetal do zigoto (Figura 13.25A). Mais estranho, no entanto, o comportamento dos cromossomos na diviso subseqente desses primeiros dois blastmeros. As extremidades dos cromossomos no blastmero derivado do hemisfrio animal se fragmentam em dezenas de pedaos imediatamente antes da clivagem dessa clula. Esse fenmeno chamado diminuio cromossmica, porque somente sobrevive uma parte do cromossomo original. Numerosos genes so perdidos nessas clulas pela fragmentao dos cromossomos, e esses genes no esto includos nos ncleos recentemente formados (Tobler et al., 1972). Enquanto isso, no blastmero vegetativo, os cromossomos permanecem normais. Durante a segunda diviso, a clula animal cindida meridionalmente, enquanto a clula vegetal novamente se divide equatorialmente. Ambas as clulas derivadas vegetativamente tm cromossomos normais. Entretanto, os cromossomos de um dos dois blastmeros vegetativos, o mais prximo do plo animal, fragmentam-se antes da terceira diviso. Desse modo, no estgio de 4 clulas, somente uma clula- a mais vegetal- contm um conjunto completo de genes. Em clivagens sucessivas, ncleos somticos so emitidos
(A) Diminuio de cromossomos
Figura 13.25
Distribuio do plasma germinativo (colorido) durante a clivagem de zigotos de Parascaris (A) normais e (B) centrifugados. (A) O plasma germinativo conservado normalmente no blastmero mais vegetal, como mostrado pela falta de diminuio cromossmica naquela clula especfica. Desse modo, no estgio de 4 clulas, o embrio tem uma clula-tronco para seus gametas. (B) Quando a primeira clivagem deslocada 90o pela centrifugao, ambas as clulas resultantes tm plasma germinativo vegetal, e nenhuma delas sofre diminuio de cromossomos. Aps a segunda clivagem, essas duas clulas do origem s clulas-tronco germinativas. (De acordo com Waddington, 1996.)
Plasma germinativo (B)
Sem diminuio de cromossomos
Clulas-tronco
Plasma germinativo
Sem diminuio de cromossomos
Clulas-tronco
532
dessa linhagem, a mais vegetal, at o estgio de 16 clulas quando existem somente duas clulas com cromossomos no diminudos. Um desses dois blastmeros d origem s clulas germinativas; o outro finalmente sofre diminuio de cromossomos e forma clulas somticas. Os cromossomos s permanecem intactos nas clulas destinadas a formar a linhagem germinativa. Se esse no fosse o caso, haveria degenerao da informao gentica ao se passar de uma gerao para a outra. As clulas que sofreram diminuio de cromossomos originam as clulas somticas.* Boveri foi considerado o ltimo dos grandes observadores da embriologia e o primeiro dos grandes experimentadores. No satisfeito em observar a reteno do completo conjunto cromossmico pela clula germinativa, ele se disps a investigar se uma regio especfica do citoplasma protege o ncleo nela inserido da diminuio. Se esse fosse o caso, qualquer ncleo localizado nessa regio deveria ser protegido. Boveri (1910) testou essa possibilidade, centrifugando ovos de Parascaris pouco antes da primeira clivagem. Esse tratamento modificou a orientao do fuso mittico. Quando o fuso se forma perpendicularmente sua orientao normal, ambos os blastmeros resultantes devem conter parte do citoplasma vegetativo (veja Figura 13.25). De fato, Boveri encontrou que depois da primeira diviso, nenhum ncleo sofreu diminuio cromossmica. Entretanto, a prxima diviso foi equatorial ao longo do eixo animal-vegetal. Agora, ambos os blastmeros animais resultantes sofreram diminuio, mas no as duas clulas vegetativas. Boveri concluiu que o citoplasma vegetativo contm um fator (ou fatores) que protege os ncleos da diminuio cromossmica e os determina que sejam clulas germinativas. O plasma do plo dos nematdeos, incluindo o de C. elegans, permanece pouco caracterizado. A RNA helicase parece se localizar no plasma germinativo tanto de C. elegans como de Ascaris, e estudos com anticorpos sugerem que essas enzimas podem ser parte dos grnulos P (Roussell e Bennett, 1993; Kuznicki et al., 1996). Determinao da clula germinativa em insetos O citoplasma germinativo de insetos diferente de qualquer outro citoplasma no ovo. Hegner (1911) mostrou que quando se removia ou destrua essa regio de ovos de besouro, antes que ocorresse a formao da clula polar, os embries resultantes no possuiam clulas germinativas e eram estreis. Geigy (1931) mostrou que irradiando o plasma polar do ovo da Drosophila com luz ultravioleta eram produzidas moscas estreis; Okada e colaboradores (1974) estenderam essa linha de experimentao mostrando que a adio do plasma polar de embries doadores no irradiados, podia curar a esterilidade de ovos irradiados (Figura 13.26). Nenhuma outra parte do citoplasma podia reverter essa esterilidade. O plasma polar posterior convenientemente marcado com os grnulos polares (Figura 13.27A). No se conhece o seu papel na determinao das clulas germinativas, mas sua constante associao com o plasma polar e as clulas polares dele derivadas, fazem dos grnulos um marcador conveniente dessa regio. A regio das clulas polares identificada facilmente no microscpio eletrnico de varredura (Figura 13.27B). [cyto9.html] Trabalhos recentes sobre o citoplasma da clula polar esto focalizados principalmente em embries de Drosophila. Os ncleos de embries de Drosophila no estgio sincicial so totipotentes e podem dar origem a qualquer tipo celular. Quaisquer dos ncleos que se encontram no plo posterior so os primeiros a formar clulas e incorporar o plasma germinativo. Essas clulas se tornam os precursores dos gametas (Schbiger e Wood, 1977). A natureza confirmou a importncia do plasma polar e de seus grnulos polares. Fmeas homozigotas de Drosophila para a mutao grandchildless produzem descendentes normais mas estreis: GG x gg UGg (estril).
* Enquanto esses casos de diminuio e eliminao de cromossomos so excees da regra geral de que clulas diferenciadas retm genes no usados, no h evidncia que diferentes clulas somticas em Parascaris retm diferentes partes do genoma.
533
(A)
Agulha Agulha Plasma polar removido do ovo doador (B) Plasma polar injetado (ligeiramente fora do centro) no ovo hospedeiro irradiado
Blastoderma Clulas polares

Figura 13.26
Blastoderma
Blastoderma
Clulas polares
Habilidade do plasma polar para corrigir a esterilidade induzida por radiao. (A) Tcnica de transplante de plasma polar de um doador no irradiado a um hospedeiro irradiado. (B) Sees longitudinais da poro posterior do embrio de Drosophila fixado ao se completar a clivagem. (i) Embrio normal com o blastoderma completo e clulas polares. (ii) Embrio irradiado durante a clivagem precoce. O blastoderma se formou, mas as clulas polares esto ausentes. (iii) Embrio irradiado durante a clivagem precoce, mas subseqentemente injetado com plasma polar de embries normais. O blastoderma e clulas polares esto presentes. (De acordo com Okada et al., 1974, cortesia de M. Okada.)
Mahowald e colegas (1979) mostraram que essas fmeas cruzadas com machos normais produzem embries cujos ncleos nunca migram para o plasma polar no ovo. No se formam clulas polares, e os adultos resultantes no tm clulas germinativas primordiais para a produo de gametas. Outra mutao de efeito materno agameticcausa a ausncia de clulas germinativas em cerca de metade das gnadas dos descendentes de moscas fmeas homozigotas. Nesse caso, so formadas clulas polares em nmero normal, mas os grnulos polares degeneram logo aps a fertilizao (Engstrom et al., 1982). Experimentos com transplantes demonstram que o defeito est no citoplasma polar e no no ambiente ovariano. Dessa maneira, temos agora evidncia bastante segura que o plasma polar est diretamente envolvido na determinao da clula germinativa.
Figura 13. 27
(A)
O plasma polar de Drosophila. (A) Micrografia eletrnica de grnulos polares de uma frao particulada de clulas polares de Drosophila. (B) Micrografia eletrnica de varredura de clulas polares de um embrio de Drosophila pouco antes do trmino da clivagem. As clulas polares podem ser vistas direita da fotografia. (Fotografias, cortesia de A. P. Mahowald.)
(B)
534
Componentes do plasma polar da Drosophila O que so os determinantes do plasma polar da Drosophila e como eles se localizam na parte posterior do embrio? Grnulos polares de Drosophila foram isolados e parecem ser compostos de protena e RNA (Mahowald, 1971a,b; Waring et al., 1978), mas a identidade dessas macromolculas (e existem ainda algumas de identidade desconhecida) no foi estabelecida at que fosse usado um procedimento gentico. Um dos componentes do plasma germinativo o mRNA do gene germ cell-less (gcl). Esse gene foi descoberto por Jongens e seus colegas (1992) quando eles mutaram Drosophila e fizeram uma varredura procurando as fmeas que no tinham netos (descendentes de segunda gerao?). A argumentao era que se uma fmea no colocasse o plasma germinativo funcional em seus vulos, ela ainda podia ter descendentes, mas esses seriam estreis (pois no possuam clulas germinativas). O gene gcl do tipo selvagem transcrito nas clulas nutrizes do ovrio da mosca, e seu mRNA transportado para o vulo atravs dos canais anelares. Uma vez dentro do vulo, ele transportado para a poro mais posterior e permanece dentro do que ser o plasma polar (Figura 13.28AB). Essa mensagem traduzida em protena durante os estgios precoces da clivagem (Figura 13.28C,D). A protena codificada pelo gcl parece entrar no ncleo e essencial para a produo de clulas polares. Moscas mutantes para esse gene no tm clulas germinativas, e quando RNA antisenso contra a mensagem de glc colocado no embrio, a habilidade em formar clulas germinativas tambm destruda (Figura 13.29). O segundo candidato a determinante de plasma germinativo a protena Nanos. A mensagem nanos est localizada no plo posterior do vulo e a protena Nanos dela traduzida necessria para a formao do abdmen na Drosophila. Recentemente, Kobayashi e colegas (1996) mostraram que a protena tambm necessria para a formao de clulas germinativas. Clulas polares sem Nanos no migram para as gnadas e no se tornam gametas. Um terceiro candidato plasma germinativo foi uma grande surpresa: RNA ribossmico grande das mitocndrias. Usando o sistema de ensaio com ovos irradiados com luz ultravioleta, Kobayashi e Okada (1989) mostraram que a injeo de RNA ribossmico grande das mitocndrias (mtlrRNA) restaura a habilidade de formar clulas polares por esses embries. Alm disso, em ovos normais de mosca, o mtlrRNA est localizado fora das mitocndrias somente no plasma polar de embries em estgio de clivagem, onde aparece como um componente dos grnulos polares (Kobayashi et al., 1993: Amikura et al., 1996). Apesar do mtlrRNA estar envolvido na formao de clulas polares, elas no o contm.
Tipo selvagem
Figura 13.28
Mutante
Localizao dos produtos do gene germ cellless na parte posterior do ovo e do embrio. O mRNA de gcl pode ser visto no plo posterior em embries produzidos por fmeas do tipo selvagem, na fase precoce de clivagem (A), mas no nos embries produzidos por fmeas mutantes deficientes em gcl (B). Anticorpos contra a protena codificada pelo gene gcl podem ser detectados no estgio de blastoderma celular de embries produzidos por fmeas do tipo selvagem (C), mas no em embries de fmeas mutantes (D). (De acordo com Jongens et al.,1992, cortesia de T. A. Jongens.)
RNA gcl (A) (B)
Protena Gcl
(C)
(D)
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Tipo selvagem
Mutante
Figura 13.29
(A)
(B)
(C)
(D)
Migrao de clulas germinativas em embries produzidos por fmeas do tipo selvagem e em embries produzidos por mutantes que no podem sintetizar a protena do gene germ cellless. A marcao das clulas germinativas obtida por anticorpos dirigidos contra Vasa, um componente do grnulo polar que no mutado em nenhum dos tipos de Drosophila. Um embrio de fmea do tipo selvagem no estgio de blastoderma precoce (A), tem clulas polares no plo posterior. Embries de fmeas mutantes de glc (B) no as tm. Em embries de fmeas do tipo selvagem, essas clulas polares podem ser removidas para o primrdio do intestino mdio posterior (C) de onde elas migram para as gnadas (E). Essas clulas no so vistas em embries de fmeas sem a atividade do gene germ cell-less (D,F). (De acordo com Jongens et al., 1992, cortesia de T. A. Jongens.)
(E)
(F)
Um quarto componente do plasma polar da Drosophila (e um que se localiza nos grnulos polares) um RNA no traduzvel chamado componente do grnulo polar (Pgc). Sua exata funo permanece desconhecida, mas as clulas polares de moscas transgnicas fmeas que produzem RNA antisenso contra Pgc no migram para as gnadas (Nakamura et al., 1996). O que dirige o mRNA de germ cell-less, a mensagem de nanos, e o mtlrRNA (e provavelmente outras molculas do plasma polar) parte posterior do ovo? Existem pelo menos outros sete mutantes incapazes de formar clulas germinativas, e esses mutantes tambm tm abdomens malformados. Essas mutaes esto nos genes capuccino, spire, staufen, oskar, vasa, valois e tudor. Cada um desses genes ativo no ovrio e coloca um de seus produtos no ocito em crescimento. Sondando a localizao do mRNA ou protena para um gene em um mutante que no possui um outro gene, pode-se colocar as aes desses genes em uma ordem definida (Figura 13.30). Esses estudos (revisados por Strome, 1992; Ephrussi e Lehmann, 1992) mostram que duas protenas, aquelas produzidas pelos genes capuccino e spire, so necessrias para a localizao da protena Staufen no lado posterior. (Ou seja, a protena Staufen no ser colocada no posterior dos vulos de mes cujos ovrios no podem produzir Capuccino ou Spire.) A protena Staufen necessria para a localizao posterior do mRNA de oskar. A protena produzida pela mensagem oskar um componente dos grnulos polares e crtica para a localizao posterior da protena Vasa, outro componente dos grnulos polares. Mutantes de tudor e valois no afetam o posicionamento de Vasa, mas parecem ser crticos para a manuteno do plasma polar, uma vez formado (Hay et al., 1990; Lasko e Ashburner, 1990). A construo do plasma polar organizada pela mensagem oskar. A quantidade e posio desse mRNA determina o nmero de clulas polares e o lugar onde elas se
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Figura 13.30
(A)
(A) Diagrama explicativo da determinao de etapas da via gentica que leva os determinantes da clula germinativa a uma localizao posterior. (B) Sumrio dessas etapas.
Sonda oskar no ovo do tipo selvagem
Sonda oskar no ovo deficiente de staufen
Staufen afeta a posio do mRNA de oskar. oskar no afeta a posio do mRNA de staufen. Portanto, a funo do gene staufen precede a funo do gene oskar
Sonda staufen no ovo do tipo selvagem (B) cappucino spire
Sonda staufen no ovo deficiente de oskar oskar staufen (localizado posteriormente) vasa tudor Determinantes da clula germinativa
formam.* Embries derivados de fmeas com somente uma cpia do gene oskar produzem de 10 a 15 clulas polares no estgio de blastoderma celular, enquanto aquelas que contm duas cpias do gene produzem aproximadamente 35 clulas polares. Aumentando-se o nmero de cpias do gene oskar para quatro, sero formadas cerca de 50 clulas polares. Alm disso, Ephrussi e Lehmann (1992) demonstraram que clulas germinativas sero formadas onde estiver localizada a mensagem oskar e os estgios que a precedem so cruciais somente na colocao do mRNA de oskar no plo posterior do ovo. Se a mensagem oskar se localiza na parte anterior do embrio (o que pode ser feito experimentalmente), o plasma e as clulas germinativas se formaro no anterior. A protena Oskar provavelmente constri a primeira parte estrutural dos grnulos polares. As protenas Vasa e Tudor se ligam Oskar tornando a estrutura mais complexa e apta a ligar os determinantes da clula germinativa (Breitwieser et al., 1996). A localizao do mRNA de gcl e do mtlrRNA no plo posterior do ovo frustrada por qualquer uma das mutaes precedentes. Em mutantes valois e tudor, pequenas quantidades da mensagem de glc podem ser vistas no plasma posterior em embries em clivagem precoce, mas essa localizao perdida na clivagem tardia (Jongens et al., 1992). Assim, os grnulos polares incluem os determinantes das clulas germinativas e a estrutura que os mantm no posterior do ovo e do embrio. A estrutura ligar o mRNA do germ cell-less (e provavelmente produtos gnicos para outros determinantes de clulas germinativas). Essas mensagens so traduzidas em protenas durante a clivagem precoce, entram no ncleo das clulas polares, e (de uma forma ainda no conhecida) determinam que essas clulas devam ser germinativas. Determinao de clulas germinativas em anfbios A localizao citoplasmtica de determinantes de clulas germinativas foi tambm observada em embries de vertebrados. Bounoure (1934) mostrou que a regio vegetativa de ovos fertilizados de r contm um material com propriedades de colorao semelhantes s do plasma polar de Drosophila (Figura 13.31). Ele conseguiu
*O nome oskar no vm de Grouch nem do rei da Noruega, mas do anti-heri ano do romance de Gnter Grass, The Tin Drum. A traduo especfica de regio do mRNA do oskar em isoformas especficas um processo complexo. A mensagem oskar translocada atravs do ovo ao plo posterior por uma estrutura contendo tropomiosina que ligada pela protena repressora Bruno, para prevenir sua traduo prematura (Erdyli et al., 1995; Kim-Ha et al., 1995). Com a localizao do mRNA no plo posterior, a protena Staufen permite sua traduo. A protena Oskar necessria para reter o mRNA de oskar (e a protena Oskar) no plo posterior (Markussen et al., 1995; Rongo et al., 1995; Captulo 22).
537
Plaquetas de vitelo
Plasma germinativo
(A)
Plasma germinativo
Plo vegetativo do zigoto
(B)
Fuso mittico
Plaquetas de vitelo
Figura 13.31
Plasma germinativo de embries de r. (A) Plasma germinativo (reas escuras) perto do plo vegetativo de um zigoto recentemente fertilizado. (B) Clula contendo plasma germinativo na regio endodrmica da blstula na anfase mittica. Note o plasma germinativo penetrando em somente uma das clulas-filha carregadas com vitelo. (C) Clula germinativa primordial e clulas somticas perto do assoalho da blastocele na gstrula precoce. (Cortesia de A. Blackler.)
Clula somtica
Plaquetas de vitelo
seguir esse citoplasma cortical at algumas clulas no endoderma presuntivo que normalmente migraria para a crista genital. Transplantando clulas geneticamente marcadas de um embrio para outro, Blackler (1962) mostrou que essas clulas eram precursoras das clulas germinativas primordiais. Os movimentos precoces do plasma germinativo foram analisados em detalhe por Savage e Danilchik (1993), que marcaram o plasma germinativo com corante fluorescente. Eles encontraram que o plasma germinativo de ovos no fertilizados consiste de pequenas ilhas que parecem estar amarradas massa do vitelo prximo ao crtex vegetativo. Essas ilhas do plasma germinativo se movem com essa massa de vitelo vegetativo durante a rotao cortical na fertilizao. Aps a rotao, as ilhas so liberadas da massa de vitelo e comeam a se fundir e migrar para o plo vegetal. Essa agregao depende de microtbulos, e o movimento desses conjuntos ao plo vegetal dependente de uma protena semelhante quinesina que pode funcionar como um motor no movimento do plasma germinativo (Robb et al., 1996). Mais tarde, contraes peridicas da superfcie da clula vegetativa parecem empurrar esse plasma germinativo ao longo dos sulcos nos blastmeros recmformados, permitindo-lhe penetrar no embrio. Quando luz ultravioleta aplicada superfcie vegetativa (e em nenhum lugar mais) do embrio da r, os animais resultantes so normais mas no tm clulas germinativas em suas gnadas (Bounoure, 1939; Smith, 1966). Muito poucas clulas germinativas primordiais chegam s gnadas, e as que chegam tm cerca de um dcimo do volume das clulas germinativas primordiais normais e tm ncleos com formas aberrantes (Zst e Dixon, 1977). Savage e Danilchik (1993) mostraram que a luz UV impede as contraes da superfcie vegetativa e inibe a migrao do plasma germinativo ao plo vegetal. Os homlogos do Xenopus de Nanos (uma protena da Drosophila essencial para a migrao da clula polar) e Vasa so especificamente localizadas nessa regio (Forristal et al., 1995; Ikenishi et al., 1996; Zhou e King, 1996). Ento, como no plasma polar da Drosophila, o citoplasma da regio vegetativa dos zigotos de r contm os determinantes para a formao das clulas germinativas.
(C)
Clula germinativa
538
Resumo
Temos evidncia que em certos organismos a determinao do destino de uma clula devida poro do citoplasma do ovo que ela adquire durante a clivagem. Tal clula diferencia-se independentemente das outras clulas, e os organismos que utilizam o mecanismo tendem a um tipo de desenvolvimento em mosaico ou determinado. Essa forma de desenvolvimento exibida por moluscos, tunicados e nematdeos. A localizao dos determinantes morfogenticos dentro do citoplasma do ovo, sua redistribuio durante o desenvolvimento do ovo e a fertilizao e os padres de clivagem celular so importantes para determinar o destino de cada clula. Cada um desses fenmenos uma funo do ovo. Apesar da maior parte do desenvolvimento desses organismos seguir o padro de mosaico, alguma determinao interativa tambm existe. Em tunicados, o sistema nervoso e alguns msculos so formados por interaes indutivas entre blastmeros, e os caracis e nematdeos tambm tm certos rgos formados de maneira interativa. No prximo captulo nos ocuparemos de certos organismos nos quais as interaes entre molculas no blastoderma sincicial de ovos de insetos constituem o mecanismo primrio da determinao do destino celular.
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A gentica da especificao axial em Drosophila
14
Quando um espermatozide penetra no vulo, entra em um sistema celular que j alcanou um certo grau de organizao. ERNST HADORN (1955) Aqueles de ns que esto trabalhando com Drosophila encontram um aspecto da questo. Pois o material disponvel tudo que se pode desejar, e mesmo experimentos embriolgicos podem ser realizados... Depende de ns utilizarmos essas oportunidades. Temos uma histria completa a desemaranhar, pois podemos trabalhar as coisas por ambos trminos aos mesmo tempo. JACK SCHULTZ (1935)
O LTIMO CAPTULO, discutimos as especificaes de clulas embrionri-
as precoces, quando adquirem diferentes determinantes citoplasmticos que estavam armazenados no ocito. As membranas celulares estabelecem a regio do citoplasma incorporado em cada clula, e acredita-se que determinantes morfogenticos direcionam, em seguida, a expresso gnica nesses blastmeros. Durante o desenvolvimento de Drosophila, as membranas celulares no se formam antes da dcima terceira diviso nuclear. Antes disso, todos os ncleos dividem entre si um citoplasma comum, e o material pode difundir atravs do embrio. Nesses embries, a especificao de clulas ao longo dos eixos ntero-posterior e dorsoventral conseguida pelas interaes de materiais citoplasmticos dentro de uma nica clula multinucleada. Alm disso, o incio das diferenas entre os eixos controlada pela posio do vulo dentro do ovrio materno. Embora o local da entrada do espermatozide possa fixar os eixos em ascdios e nematides, os eixos ntero-posterior e dorsoventral da mosca so especificados por interaes entre o vulo e suas clulas foliculares que o circunda.
Inicialmente a principal vantagem da Drosophila foi uma que escapou viso dos historiadores: era um organismo excelente para projetos de estudantes. ROBERT E. KOHLER (1994)
Resumo do desenvolvimento de Drosophila

Como discutido no Captulo 3, os embries de Drosophila desenvolvem-se muito rapidamente atravs de um srie de divises nucleares que formam um blastoderma sincicial. Durante o nono ciclo da diviso, cerca de cinco ncleos alcanam a superfcie do plo posterior do embrio. Esses ncleos ficam envolvidos pelas membranas celulares e geram as clulas polares que do origem aos gametas do adulto. A maioria dos outros ncleos chegam periferia do embrio no ciclo dez e em seguida sofrem mais quatro divises com velocidades progressivamente menores. Aps o ciclo 13, membranas celulares crescem entre os ncleos para formar o blastoderma celular de cerca de 6000 clulas (Turner e Mahowald, 1977; Foe e Alberts, 1983). No ciclo 14, o nvel da transcrio geral, que era muito baixo, aumenta dramaticamente. Ao mesmo tempo, o embrio de 2 a 3 horas inicia a gastrulao. Os primeiros movimentos da gastrulao de Drosophila segregam o mesoderma, o ectoderma e o endoderma presuntivos (Figura 14.1). O mesoderma presuntivo - aproximadamente 1000 clulas contendo a linha ventral mediana - se dobram para produzir o sulco ventral. Esse sulco se desprende da superfcie para tornar-se o tubo ventral no
543
544
PARTE IV Especificao do Destino Celular e os Eixos Embrionrios
(A)
(B)
Invaginao do intestino anterior Sulco ceflico
(C)
Sulco ventral Sulco ventral
Clulas polares na invaginao do intestino mdio
(D)
(E)
Clipeolabro
Regio proceflica Crista ptica Crista dorsal
(F)
Segmento anterior
Figura 14.1
Gastrulao em Drosohila. (A) Sulco ventral comeando a formar medida que as clulas flanqueando a linha mediana ventral se invaginam. (B) O sulco se fecha, com clulas mesodrmicas colocadas internamente e ectoderma superficial flanqueando a linha mediana ventral. (C) Vista dorsal de um embrio um pouco mais velho mostrando as clulas polares e o endoderma posterior mergulhando no embrio. (D) Vista lateral mostrando migrao completa da banda germinativa. Sutis reentrncias marcam o comeo da segmentao ao longo da banda germinativa: Ma, Mx e Lb correspondem aos segmentos mandibular, maxilar e labial da cabea. T1-T3, segmentos torcicos; A1-A8, segmentos abdominais. (E) Banda germinativa revertendo sua direo. Os segmentos reais so agora visveis, assim como os outros territrios da cabea dorsal, tal como o clipeolabro, a regio proceflica, a crista ptica e a crista dorsal. (F) Larva recmeclodida do primeiro instar. (Cortesia de F. R. Turner.)
CAPTULO 14 Especificao axial em Drosophila
545
interior do embrio. Em seguida, se achata para formar uma camada de tecido mesodrmico sob o ectoderma ventral. O endoderma prospectivo invagina em duas bolsas nos terminais anterior e posterior do sulco ventral. As clulas polares so internalizadas juntamente com o endoderma. Nesse momento, o embrio se curva para formar o sulco ceflico e as dobras transversais anterior e posterior. [other.html#droso1] As clulas que permanecem na superfcie (o ectoderma) sofrem convergncia e extenso, migrando para a linha ventral mediana para formar a banda germinativa. Essa se estende posteriormente e talvez devido ao invlucro do ovo, se enrola em volta da superfcie superior (dorsal) do embrio. Assim, ao final da formao da banda germinativa, as clulas destinadas a formar as estruturas larvais mais posteriores esto localizadas logo aps a futura regio da cabea. Nesse momento, comeam a aparecer os segmentos corporais, dividindo o ectoderma e o mesoderma. A banda germinativa se retrai em seguida, colocando os presuntivos segmentos posteriores na extremidade posterior do embrio. Enquanto a banda germinativa estiver em sua posio estendida, vrios processos chaves morfogenticos ocorrem: organognese, segmentao e segregao dos discos imaginais.* Alm disso, o sistema nervoso forma-se a partir de duas regies de clulas ectodrmicas localizadas ventralmente. Conforme descrito no Captulo 8, os neuroblastos se diferenciam desse ectoderma neurognico dentro de cada segmento (e tambm da regio no-segmentada do ectoderma da cabea). Portanto, em insetos como a Drosophila, o sistema nervoso est localizado ventralmente, em vez de ser derivado do tubo neural dorsal, como nos vertebrados.
AS ORIGENS DA POLARIDADE NTERO-POSTERIOR Viso panormica

O plano geral do corpo da Drosophila o mesmo no embrio, na larva e no adulto, cada qual tendo um terminal da cabea e um da cauda distintos, entre os quais esto unidades repetitivas segmentares (Figura 14.2). Trs desses segmentos formam o trax, enquanto outros oito segmentos formam o abdome. Cada segmento da mosca
*Os detalhes da diferenciao do disco imaginal sero discutidos no Captulo 19. Para maiores informaes sobre a anatomia do desenvolvimento de Drosophila veja Bate e Martinez-Arias, 1993; Tyler e Schetzer, 1996; e Schwalm, 1997.
Cabea Protrax Mesotrax Metatrax
Figura 14.2
Segmentos abdominais
Comparao entre segmentao larval e adulta em Drosophila. Os trs segmentos torcicos podem ser distinguidos por seus apndices: T1 (protorcico) somente tem patas; T2 (mesotorcico) tem asas e patas; T3 (metatorcico) tem halteres e patas.
546
Polaridade citoplasmtica (efeito materno)
Gradiente de protena Hunchback
Genes gap
Genes pair-rule
Genes de polaridade segmentar
Genes hometicos
Figura 14.3
Modelo generalizado da formao do padro de Drosophila. O padro estabelecido por genes de efeito materno que formam gradientes e regies de protenas morfognicas. Esses determinantes morfognicos criam um gradiente da protena Hunchback que ativa diferencialmente os genes gap que definem territrios amplos do embrio. Os genes gap permitem a expresso de genes pair-rule cada qual dividindo o embrio em regies de largura aproximada equivalente a dois segmentos primordiais. Os genes da polaridade segmentar dividem o embrio em unidades de tamanho segmentar ao longo do eixo ntero-posterior. A combinao desses genes define os domnios espaciais dos genes hometicos que definem as identidades de cada segmento. Dessa maneira, periodicidade gerada a partir de no-periodicidade, e cada segmento recebe uma nica identidade.
adulta tem a sua prpria identidade. O primeiro segmento torcico por exemplo, somente tem patas; o segundo segmento torcico contm patas e asas. O terceiro segmento torcico tem patas e halteres (equilibradores). Os segmentos torcicos e abdominais tambm podem ser diferenciados por suas cutculas. Como aparece esse padro? Durante a ltima dcada, a combinao de mtodos da biologia molecular, gentica e embriologia, levou a um modelo detalhado descrevendo como gerado o padro peridico ao longo do eixo ntero-posterior, e como cada segmento diferenciado dos outros. A polaridade ntero-posterior no embrio, na larva e no adulto tem sua origem na polaridade ntero-posterior do ovo(Figura 14.3). Os genes de efeito materno nos ovrios da mosca produzem RNAs mensageiros que so colocados em diferentes regies do ovo. Esse codifica protenas regulatrias transcricional e de traduo que se difundem atravs do blastoderma sincicial, e ativam ou reprimem a expresso de certos genes zigticos. Um par dessas protenas, Bicoid e Hunchback, regula a produo de estruturas anteriores, enquanto outro par de protenas especificado maternalmente, Nanos e Caudal, regulam a formao da parte posterior do embrio. Em seguida, os genes zigticos regulados por esses fatores maternos so expressos em certos domnios largos (cerca de trs segmentos de largura), parcialmente sobrepostos. Esses genes so chamados genes gap (genes de fenda-porque suas mutaes causam fendas no padro de segmentao) e esto entre os primeiros genes transcritos no embrio. As diferentes concentraes das protenas dos genes gap causam a transcrio dos genes pair-rule que dividem o embrio em unidades peridicas. O padro de transcrio desses genes pair-rule fornece um padro de listas de sete bandas verticais perpendiculares ao eixo ntero-posterior. As listas das protenas dos genes pairrule ativam a transcrio dos genes de polaridade segmentar (segment polarity genes). Seus mRNAs e produtos proticos dividem o embrio em 14 unidades de largura segmentar. Isso estabelece a periodicidade do embrio. Ao mesmo tempo, protenas dos genes gap, pair-rule e de polaridade segmentar interagem para regular outra classe de genes, os genes hometicos, cuja transcrio determina o destino desenvolvimental de cada um desses segmentos.
Os genes de efeito materno

Evidncia Embriolgica da Regulao da Polaridade pelo Citoplasma do Ocito Experimentos embriolgicos clssicos demonstraram que existem pelo menos dois centros de organizao no ovo do inseto. Um o centro de organizao anterior, o outro o centro de organizao posterior. Klaus Sander (1975) postulou que essas duas reas de organizao formam dois gradientes, um iniciado no terminal anterior, e o outro no terminal posterior. Cada um desses gradientes forma as suas estruturas prprias nos plos e interage com o outro gradiente para formar a estrutura central do embrio. Sander baseou esse modelo em experimentos envolvendo a ligao do embrio em vrios tempos durante o desenvolvimento, e transplantando regies do citoplasma polar de uma regio do ovo para outra (Figura 14.4). Primeiro, quando ele moveu o citoplasma do plo posterior para mais anteriormente, obteve um pequeno embrio anterior ao plasma do plo posterior, enquanto segmentos extras, no organizados em um embrio, formavam-se atrs dele (veja Figura 14.4D). Em segundo lugar, ele quando ligava o ovo precocemente durante o desenvolvimento, separando a regio anterior da posterior, metade se desenvolveu em um embrio anterior, enquanto a outra metade se desenvolveu em um embrio posterior, porm, nenhuma das metades continha os segmentos medianos do embrio. Quanto mais tardiamente no desenvolvimento era feita a ligadura, menos segmentos medianos estavam faltando. Assim, pareceu que realmente havia gradientes emanando dos dois plos durante a clivagem e que esses gradientes interagiam para produzir a informao posicional determinante da identidade de cada segmento.
547
Anterior
Prosencfalo Segmentos da cabea Segmentos torcicos Segmentos abdominais Posterior
Figura 14.4
Experimento de ligadura de Sander no embrio do inseto saltador de folhas Euscelis. (A) Embrio normal em viso ventral. A bola preta na base representa um agregado de bactrias simbiticas que marca o plo posterior. (B) Aps ligadura do embrio precoce, forma-se um embrio parcial, mas a cabea e os segmentos torcicos esto ausentes em ambos embries. (C) Quando ligados mais tarde (no estgio de blastoderma) so formados mais dos segmentos faltantes, mas a maioria dos embries ainda no tem os segmentos mais centrais. (D) Quando o citoplasma do plo posterior transplantado para um embrio ligado no estgio de blastoderma, um embrio pequeno, porm completo, forma-se na metade anterior, enquanto a metade posterior forma um embrio parcial invertido. Esses resultados podem ser explicados em termos de gradientes nos plos do embrio que ativam um conjunto de estruturas e reprimem a formao de outras. (Segundo Sander, 1960, e French, 1988.)
A possibilidade do mRNA ser responsvel pela gerao do gradiente anterior foi sugerida por uma srie de experimentos de Kalthoff e Sander (1968). Esses autores acharam que quando a poro anterior de ovo de Smittia (mosquito plvora) foi exposta luz ultravioleta de comprimentos de onda capazes de inativar RNA (265 e 285 nm), os embries desenvolviam dois abdomes e telsos (caudas) com simetria de imagem espelhar: telso-abdome-abdome-telso (Figura 14.5). Evidncia adicional que o RNA importante para a especificao da poro anterior do embrio da mosca foi obtida por Kandler-Singer e Kalthoff (1976), que submergiram ovos de Smittia em solues contendo vrias enzimas e em seguida puncionaram os ovos em regies especficas. Abdomes duplos resultaram da permisso para a entrada de RNase no terminal anterior. Outras enzimas no causaram essa anormalidade, nem a RNase causou esse efeito quando penetrou em outras regies do ovo. Assim, o laboratrio de Sander postulou a existncia de um gradiente em cada terminal do ovo, e pareceu provvel que o ovo seqestrou um RNA que gerava um gradiente de material nteroformador. O Modelo Molecular: Gradientes Proticos no Embrio Precoce Em 1988, a hiptese do gradiente foi unida com uma metodologia gentica de estudo da embriognese de Drosophila. Se houvesse gradientes, quais eram os morfgenos cujas concentraes mudavam ao longo do espao? Quais eram os genes que moldavam esses gradientes? E essas substncias agiriam ativando ou inibindo certos genes nas reas onde estavam concentradas? Christiane Nsslein-Volhard conduziu um programa de pesquisa que encontrou um conjunto de genes que codificava morfgenos de gradientes para a parte anterior do embrio, outro conjunto de genes que codificava
Figura 14.5
Embries normal e irradiado do mosquito-plvora (Smittia). O embrio normal (no alto) mostra uma cabea esquerda e segmentos abdominais direita. O embrio irradiado com luz UV no tem a regio da cabea mas tem segmentos abdominais em ambos os lados. (De Kalthoff, 1969, cortesia de K. Kalthoff.)
548
Tabela 14.1 Genes de efeito materno que afetam a polaridade ntero-posterior do embrio de Drosophila Gene GRUPO ANTERIOR bicoid (bcd) exuperantia (exu) swallow (swa) GRUPO POSTERIOR nanos (nos) tudor (tud) oskar (osk) vasa (vas) valois (val) pumilio (pum) caudal (cad) GRUPO TERMINAL torso (tor) trunk (trk) fs(1)Nasrat[fs(1)N] fs(1)polehole[fs(1)ph] Fonte: Segundo Anderson, 1989 Fentipo Cabea e trax deletados, substitudos por telso invertido Estruturas anteriores da cabea deletadas Estruturas anteriores da cabea deletadas Sem abdome Sem abdome, sem clulas polares Sem abdome, sem clulas polares Sem abdome, sem clulas polares; oognese defeituosa Sem abdome, sem clulas polares; celularizao defeituosa Sem abdome Sem abdome Sem terminais Sem terminais Sem terminais; ovos em colapso Sem terminais; ovos em colapso Funes e estruturas propostas Morfgeno anterior graduado contm homeodomnio, reprime caudal ncora mRNA bicoid ncora mRNA bicoid Morfgeno posterior; reprime huchback Localizao de Nanos Localizao de Nanos Localizao de Nanos Estabilizao da localizao do complexo Nanos Ajuda protena Nanos ligar mensagem hunchback Ativa genes do terminal posterior Possvel morfgeno para terminais Transmite sinal torsolike para torso Transmite sinal torsolike para torso Transmite sinal torsolike para torso
os morfgenos responsveis pela organizao da regio abdominal do embrio e um terceiro conjunto codificava protenas que produziam as regies terminais de ambas as extremidades do embrio (Figura 14.6; Tabela 14.1). Esse trabalho resultou em um Prmio Nobel para a pesquisadora e seu colega Eric Wieschaus, em 1995. [droso1.html] O eixo ntero-posterior para o embrio de Drosophila parece ser padronizado antes mesmo do ncleo comear a funcionar (Figura 14.7). As clulas nutrizes do ovrio depositam mRNAs no ocito em desenvolvimento, e esses mRNAs se tornam poro de diferentes regies da clula. Em especial, quatro mRNAs so crticos para a formao do eixo ntero-posterior: mRNAs bicoid e hunchback, cujos produtos proticos so crticos para a formao da cabea e do trax mRNAs nanos e caudal cujos produtos proticos so crticos para a formao dos segmentos abdominais Os mRNAs bicoid so amarrados aos microtbulos anteriores, enquanto as mensagens nanos so ligadas ao citoesqueleto cortical posterior. Os mRNAs hunchback e caudal so distribudos atravs de todo o ocito. Aps a fecundao, os mRNAs podem ser traduzidos em protenas. No plo anterior o RNA bicoid traduzido em protena Bicoid, que forma um gradiente mais alto no anterior. No plo posterior, a mensagem nanos traduzida em protena Nanos, que forma o gradiente mais alto no
Figura 14.6
Trs vias genticas independentes interagem para formar o eixo ntero-posterior do embrio de Drosophila. Em cada caso, a assimetria inicial estabelecida durante a oognese, e o padro organizado pelos produtos maternos logo aps a fertilizao. A realizao do padro ocorre quando os produtos maternos localizados ativam ou reprimem genes zigticos especficos em diferentes regies do embrio. (Segundo St. Johnston e Nsslein-Volhard, 1992.)
Meiaoognese
Concluso da oognese mRNA bicoid
Blastoderma sincicial Protena Bicoid
Blastoderma celular RNA do gene gap anterior Protena Hunchback
Expresso gnica cron Cabea Trax
Fentipo
Tipo selvagem
mRNA bicoid
Clulas nutrizes
Abdome
Telso Deficiente em bicoid Telso Ocito

Clulas nutrizes ovarianas secretam mRNA bicoid para o ocito, cujo ncleo interage com clulas foliculares posteriores
Protena Caudal
mRNA bicoid localizado no anterior por produtos de exuparantia e swallow
Clulas embrionrias
Clulas polares Abdome
mRNA bicoid traduzido forma gradiente protico; reprime traduo de mRNA caudal
Protena Bicoid ativa os genes gap anterior, orthodentical buttonhead, e o gene hunchback
RNA hunchback Materno RNA nanos
Anterior Bicoid: Protena Hunchback
Telso
Deficiente em nanos cron Cabea
Trax Protena Nanos RNA nanos

mRNA nanos secretado por clulas nutrizes ovarianas localizadas no plo posterior mRNA nanos traduzido bloqueia traduo da mensagem hunchback no posterior do embrio
Protena Staufen
RNA oskar
RNA giant RNA Knirps

nanos ativa genes gap posteriores (tais como knirps e giant)
Telso
Clulas nutrizes ovarianas secretam forma posterior para ligar mRNA nanos
Posterior: Nanos Protena Torsolike Protena Torso ativada mRNA tailess e huckebein Deficiente em torso Cabea
Protena Torsolike
Protena Torso
Trax
Protena Torsolike
Clulas foliculares ovarianas produzem protena Torsolike nas extremidades anterior e posterior
Abdome Clulas foliculares

Torsolike ativa Torso nas extremidades
mRNA tailess e huckebein
Torso ativa genes gap terminais
Terminal: Torso
550
A) Ocito
(C) ANTERIOR
Concentrao
mRNA bicoid Bicoid Hunchback caudal Nanos Cortex, Grauzone, Staufen Protena Bicoid Protena Caudal POSTERIOR Hunchback Bicoid Caudal Nanos
mRNA caudal
Anterior (B) Embrio de clivagem precoce PROTENA

Concentrao
Posterior
mRNA nanos Smaug Oskar mRNA hunchback
Protena Nanos Anterior Embrio de clivagem precoce Posterior
Pumilio p55 Protena Hunchback
Figura 14.7
Um modelo da gerao do padro ntero-posterior por genes de efeito materno. (A) Os RNA mensageiros bicoid, nanos, hunchback e caudal so colocados no ocito pelas clulas nutrizes ovarianas. A mensagem bicoid seqestrada anteriormente. A mensagem nanos enviada para o plo posterior. (B) Na traduo, o gradiente da protena Bicoid enviado para o plo posterior, e o gradiente da protena Nanos se estende do posterior para o anterior. Nanos inibe traduo da mensagem hunchback (no posterior), enquanto Bicoid previne a traduo da mensagem caudal (no anterior). Isso resulta na oposio dos gradientes Caudal e Hunchback. O gradiente Hunchback reforado secundariamente pela transcrio do gene hunchback dos ncleos anteriores (j que Bicoid age como um fator de transcrio ativando a transcrio do gene hunchback). (C) Interaes paralelas pelas quais a regulao da traduo gnica estabelece o padro ntero-posterior do embrio de Drosophila. No anterior do embrio, o mRNA bicoid ligado ao citoesqueleto anterior e impedido de ser traduzido por ter uma pequena cauda poliadenilada. Na fecundao, a cauda estendida de maneira dependente das protenas Cortex, Grauzone e Staufen, e o mRNA bicoid traduzido. A protena Bicoid suprime a traduo do mRNA caudal. Na regio posterior do embrio, o mRNA nanos suprimido no ocito pela protena Smaug (que se liga sua 3UTR). Na fertilizao, Oskar ajuda em sua traduo e a protena Nanos age como um supressor da traduo de mRNA hunchback. (C segundo Macdonald e Smibert, 1996.)
posterior. A protena Bicoid inibe a traduo do RNA caudal, permitindo com isso que a protena Caudal seja somente sintetizada na parte posterior da clula. Reciprocamente, a protena Nanos, em conjunto com a protena Pumilio, liga-se ao RNA hunchback, impedindo sua traduo na parte posterior do embrio. Bicoid tambm eleva o nvel da protena Hunchback no anterior do embrio ligando-se aos intensificadores do gene hunchback e estimulando sua transcrio (Figura 12.18). O resultado dessas interaes a criao de quatro gradientes proticos no embrio precoce: Um gradiente anterior-para-posterior da protena Bicoid Um gradiente anterior-para-posterior da protena Hunchback Um gradiente posterior-para-anterior da protena Nanos Um gradiente posterior-para-anterior da protena Caudal O palco est agora preparado para a ativao dos genes zigticos naqueles ncleos que tinham sido ocupados dividindo-se enquanto esse gradiente estava sendo estabelecido.
551
&
Especulaes
Modelos de Gradientes da Informao Posicional
OMO PODEM CLULAS ser informadas de sua posio no embrio e em seguida usar tal informao para diferenciar-se no tipo apropriado de clula? Uma explicao prope gradientes de substncias morfogenticas (Boveri, 1901; Child, 1941; Wolpert, 1971). Nesses modelos, uma substncia solvel (morfgeno) posicionada de forma a se difundir de uma fonte (onde produzida) para um ralo (onde degradada), estabelecendo um intervalo contnuo de concentraes dentro dessa regio. Consideraes tericas (veja Crick, 1970) sugerem que cada um desses gradientes somente pode atuar ao longo de distncias curtas, menos que 100 clulas de dimetros. Em modelos de gradientes, a concentrao de morfgenos muda com a distncia, as concentraes mais altas esto prximas da fonte do morfgeno. As clulas teriam que ter sensores que responderiam diferentemente a concentraes diferentes do gradiente. Se o morfgeno for um fator de transcrio, elementos intensificadores ou promotores poderiam ligar o morfgeno com foras diferentes (Figura 14.8). Por exemplo, se um morfgeno estiver sendo produzido no anterior do corpo, os genes responsveis pela organizao do desenvolvimento da cabea poderiam ter um intenAmbos genes ativos Gene A Gene B Gene A inativo Ambos genes Gene B ativo inativos
sificador que liga o morfgeno fracamente. Somente quando houver uma grande concentrao do morfgeno esse gene estaria ativo. O(s) gene(s) responsveis pela formao do trax, por outro lado, poderiam apresentar um intensificador que ligasse o morfgeno mais eficazmente, o que o habilitaria a responder a nveis relativamente baixos daquele morfgeno. As clulas da cabea expressariam ambos os genes, enquanto os genes do trax expressariam somente aquele gene cujo intensificador puder ligar baixas quantidades do morfgeno. As clulas das pores posteriores do corpo no veriam quantidade alguma desse morfgeno, e nenhum desses genes seria ativado. Dessa maneira, as clulas poderiam sentir a presena de um morfgeno e responder diferentemente. O sensor no precisaria ser um intensificador; poderia bem ser um receptor para um fator de crescimento especfico na superfcie celular (veja Captulo 17). A maioria dos modelos de gradiente assume que todas as clulas que podem responder a um gradiente so equivalentes. Todas essas clulas interpretam o sinal do morfgeno da mesma maneira e a concentrao de morfgeno que recebem determina sua identidade. Porm, a interpretao dos gradientes no necessari-
(A)
(C)
(B) Concentrao Q
(D) Gradiente P
Gradiente Q
Centro da pinta ocular
Veias alares
Figura 14.9
Modelo de um gradiente de informao posicional proposto para explicar pintas em asas de borboleta. (A) Fotografia de uma pinta ocular na asa de Morpho peleides. (B) Diagrama de um modelo de dois gradientes que pode explicar a maneira pela qual a pinta foi gerada. A origem do morfgeno est no centro da pinta e corresponde ao pice de um cone, cuja altura reflete sua concentrao. A concentrao Q representa o nvel de morfgeno necessrio para alcanar o limiar de sensibilidade para formao de cor naquelas clulas alares. (C) Fotografia da asa de Smyrna blomfildia, na qual as pintas oculares so elpticas. (D) Orientaes diferentes do gradiente de sensibilidade Q podem resultar em tais pintas elpticas. (Segundo Nijhout, 1981, cortesia de H. F. Nijhout.)
Figura 14.8
Distncia da fonte
Modelo hipottico para gradientes estabelecendo informao posicional. A concentrao do morfgeno diminui a partir da origem. Neste diagrama, os receptores para o morfgeno so elementos intensificadores para dois genes que controlam o destino celular, porm, os receptores tambm poderiam ser citoplasmticos ou de membrana. Um dos receptores (neste caso, o intensificador no gene A) necessita de uma alta concentrao de morfgeno para atuar. Em altas concentraes de morfgeno, ambos genes A e B so ativos. Em concentraes moderadas, somente o gene B ativo. Onde a concentrao do morfgeno cai abaixo de outro limiar, nenhum dos genes ativo. (Segundo Wolpert, 1978.)
amente linear. Considere por exemplo, uma srie de notas de um exame que se estende uniformemente de 100 a 60. Em um esquema (uma leitura linear), uma nota entre 100 e 90 A, 89-80 B, 79-70 C e 69-60 D. Em uma outra classe (usando leitura curva), 100-95 A, 94-85 B, 8470 C e 69-60 D. Nijhout (1981) usou um modelo de dois gradientes para explicar o desenvolvimento dos padres marcas de olhos das asas de borboleta. Um gradiente consiste de uma difuso linear de morfgeno. O segundo envolve a interpretao desse morfgeno; ou seja, o limiar de sensibilidade das clulas envolvidas difere em diferentes regies das asas. A existncia do segundo gradiente d origem a uma marca elptica, no a marca circular que resultaria se no existisse o gradiente de sensibilidade (Figura 14.9).
Concentrao do morfgeno
Limiar A
Limiar B
552
Figura 14.10
(A)
(B)
Fentipo de um embrio fortemente afetado, oriundo de uma fmea deficiente no gene bicoid. (A) Padro da cutcula de um tipo selvagem. (B) Mutante bicoid. A cabea e o trax foram substitudos por um segundo conjunto de estruturas do telso posterior. Abreviaes: fk, filzkrper; ap, placas anais (ambas estruturas de telsos); T1-T3, segmentos torcicos; A1, A8, os dois segmentos abdominais terminais; mh, cs, estruturas da cabea. (de Driever et al. 1990. Cortesia de W. Driever.)
Evidncia que o Gradiente da Protena Bicoid Constitui o Centro de Organizao Anterior Em Drosophila, o fentipo do mutante bicoid muito interessante em ternos de gradientes. Em lugar de ter estruturas anteriores (cron, cabea e trax) seguidas por estruturas abdominais e um telso, a estrutura do mutante bicoid telso-abdomeabdome-telso (Figura 14.10). Parece que esses embries carecem de todo morfgeno necessrio para as estruturas anteriores. Alm disso, pode-se postular que a substncia da qual esses mutantes carecem aquela sugerida por Sander e Kalthoff de ativar os genes para as estruturas anteriores e desligar genes para as estruturas do telso (Compare as Figuras 14.10 e 14.5). Outros estudos reforaram o ponto de vista de que o produto do gene bicoid do tipo selvagem (bcd) o morfgeno que controla o desenvolvimento anterior. Em primeiro lugar, bicoid um gene de efeito materno. O RNA mensageiro dos genes
(A)
(B)
(C)
Figura 14.11
Gradiente da protena Bicoid no embrio precoce de Drosophila. (A) Localizao do mRNA bicoid na extremidade anterior do embrio. (B) Gradiente da protena Bicoid logo aps a fecundao. Notar que a concentrao mais alta anteriormente, diminuindo posteriormente. Notar tambm que a protena Bicoid est concentrada nos ncleos do embrio. (C) Escaneamento densidomtrico do gradiente da protena Bicoid. A curva superior representa o gradiente da protena Bicoid em embries tipo selvagem. A curva inferior representa a protena Bicoid em embries de mes deficientes em bicoid. (A de Kaufman et al., 1990; B e C de Driever e Nsslein-Volhard, 1988a; fotografias cortesia dos autores.)
Concentrao da protena Bicoid (intensidade da mancha)
Tipo selvagem Mutante bicoid
Anterior
Posterior
553
bicoid materno colocado no embrio pelas clulas ovarianas maternas (Frigerio et al., 1986; Berleth et al., 1988; detalhes no Captulo 22). O RNA bicoid est estritamente localizado na parte anterior do ocito (Figura 14.11A). Driever e Nsslein-Volhard (1988a) mostraram que quando a protena Bicoid traduzida desse RNA durante a clivagem precoce, forma um gradiente com a concentrao mais alta no anterior do ovo e com nveis de fundo na terceira parte posterior do ovo. Alm disso, essa protena logo fica concentrada nos ncleos embrionrios da poro anterior do embrio (Figura 14.11B,C; Prancha 14A). Mais evidncia que a protena Bicoid o morfgeno anterior veio de experimentos que alteraram a inclinao do gradiente. Dois genes, exuperantia e swallow, so responsveis pela manuteno da mensagem bicoid no plo anterior do ovo. Em sua ausncia, a mensagem bicoid difunde mais para o posterior do ovo, e o gradiente da protena Bicoid aumenta mais vagorosamente (Driever e Nsslein-Volhard, 1988b). O fentipo produzido por esses dois mutantes semelhante aquele de embries deficientes em bicoid, porm, menos severo. Esses embries carecem de suas estruturas anteriores e tm uma boca e regio torcica estendida. Assim, alterando-se o gradiente da protena Bicoid, em correspondncia altera-se o destino das regies embrionrias. A confirmao que a protena Bicoid crucial para o incio da formao da cabea e do trax veio de experimentos nos quais RNA bicoid purificado foi injetado nos embries em clivagem precoce (Figura 14.12; Driever et al., 1990). Quando injetado no anterior de embries deficientes de bicoid (cujas mes no tinham genes bicoid), o RNA bicoid salvou os embries e fez com que tivessem polaridade ntero-posterior normal. Alm disso, qualquer local no embrio onde as mensagens bicoid haviam sido injetadas, tornaram-se cabea. Quando RNA bicoid foi injetado no centro do embrio, essa regio mediana tornou-se a cabea e as laterais tornaram-se estruturas torcicas. Se uma grande quantidade de RNA bicoid foi colocada no plo posterior de um embrio de tipo selvagem (com sua prpria mensagem bicoid no plo anterior), duas cabeas emergiram, uma em cada terminal. Portanto, o gene bicoid atualmente considerado codificar o morfgeno anterior do embrio de Drosophila. A prxima questo que emergiu foi: Como foi conseguida essa localizao do RNA bicoid? As teorias correntes sero detalhadas no Captulo 22, mas resumidamente, o citoesqueleto anterior ancora o RNA bicoid atravs da regio 3 no-traduzida da mensagem 3. O citoesqueleto posterior tem locais especficos de ancoragem que iro
Figura 14.12
mRNA bicoid
Representao esquemtica do experimento demonstrando que o gene bicoid codifica o morfgeno responsvel pelas estruturas da cabea em Drosophila. Os fentipos dos embries deficientes em bicoid e tipo selvagem so mostrados nos lados. Quando embries deficientes em bicoid so injetados com mRNA bicoid, o local da injeo forma as estruturas da cabea. Quando o plo posterior de um embrio de clivagem precoce do tipo selvagem injetado com mRNA bicoid, estruturas de cabea se formam em ambos os plos. (Segundo Driever et al., 1990.)
Tipo selvagem
Tipo selvagem
Fentipo deficiente em bicoid cron Cabea Trax Abdome Telso
Fentipo tipo selvagem
554
Figura 14.13
(A) Estgio 1-6 (?) Clulas nutrizes Ocito
(B) Estgio 6-7
(C) Estgio 7-8 Ncleo do ocito
A importncia das interaes ocito-folculo na formao dos eixos dorsoventral e nteroposterior de Drosophila. (A) O ncleo do ocito fica localizado no lado posterior do ovo. Ele localiza um fator (a protena Gurken) que recebido pelas clulas no terminal posterior da cmara do ovo. (B,C) Isso faz com que as clulas foliculares se diferenciem em clulas foliculares posteriores e secretem algum fator que motiva o ocito a realinhar seus microtbulos. possvel que esse fator atue ativando a protena quinase A (PKA) na membrana celular do ocito (veja Captulo 22). (D) Essa reorganizao permite o transporte da protena Oskar e mRNA nanos para o plo posterior do ovo e retm a mensagem bicoid no plo anterior do ovo. Ao mesmo tempo, o ncleo do ocito viaja ao longo dos microtbulos repolarizados em direo regio dorso-anterior do ovo. Aqui, o mesmo sinal (a protena Gurken) inicia o eixo dorsoventral sinalizando essas clulas para tornarem-se clulas foliculares dorsais. (Segundo Gonzles-Reyes et al., 1995.)
gurken
Clulas foliculares polares nocomprometidas
Ncleo do ocito com mRNA gurken
Clulas foliculares anteriores
Clulas foliculares posteriores
(D) Estgio 9
Mensagem gurken sobre o ncleo
mRNA bcd Clulas foliculares dorsais Microtbulos Clulas foliculares posteriores mRNA osk
Clulas foliculares ventrais
reconhecer a 3UTR da mensagem nanos. Assim, a organizao global do citoesqueleto do ocito crucial para o desenvolvimento. Como ocorre essa organizao do citoesqueleto? No meio da oognese, o ncleo do ocito est posicionado perto do plo posterior do ocito (i.e., longe das clulas nutrizes). O ncleo do ocito serve como um local de coleta para o RNA gurken, uma mensagem que codifica um homlogo do fator de crescimento epidrmico e cuja sntese no bem compreendida. A mensagem gurken se coleta diretamente sobre o ncleo, entre o ncleo e as clulas foliculares dorsais posteriores. Aqui, ele traduzido em protena Gurken e secretado pelo ocito para aquelas clulas foliculares mais prximas do ncleo as clulas foliculares posteriores. Isso altera essas clulas foliculares motivando-as a secretar um fator que induz a reorganizao dos microtbulos do ocito. Esses microtbulos iniciam a reorganizao do citoesqueleto do ocito permitindo ao ncleo mover-se de sua posio posterior para a poro dorso-anterior do ocito em crescimento (Figura 14.13; Gonzles-Reyes et al., 1995; Roth et al., 1995). Assim, o primeiro sinal para o eixo ntero-posterior do embrio vem das clulas foliculares maternas. A distino entre clulas foliculares anteriores e posteriores no ovrio causa a distino entre o eixo anterior e posterior do embrio. A prxima questo emergiu em seguida: Como podia um gradiente da protena Bicoid controlar a determinao do eixo ntero-posterior? Evidncia recente sugere que Bicoid age de duas maneiras para especificar o anterior do embrio de Drosophila. Primeiro, agindo como um repressor da formao do posterior. Ela faz isso ligando e suprimindo a traduo do RNA caudal que encontrado em todo o ovo e no embrio precoce. O homeodomnio da protena Bicoid liga-se uma regio especfica da regio 3 no-traduzida da mensagem caudal (Dubnau e Struhl, 1996; Rivera-Pomar et al., 1996). Essa supresso necessria, pois se a protena Caudal for produzida no anterior, cabea e trax no sero formados de maneira apropriada. O segundo modo de funo de Bicoid a nvel da ativao transcricional. A protena Bicoid parece penetrar nos ncleos dos embries em clivagem. Aqui, ela ativa o gene hunchback (hb). A transcrio de hunchback somente vista na metade anterior do embrio a regio onde vista a protena Bicoid. Mutantes deficientes em protena Hunchback materna e zigtica carecem de partes orais e estruturas torcicas. Em fins da dcada de 1980,
555
dois laboratrios demonstraram, independentemente, que a protena Bicoid se liga e ativa o gene hunchback (Driever e Nsslein-Volhard, 1989; Struhl et al., 1898). A protena Hunchback derivada da sntese do novo mRNA hunchback junta-se protena Hunchback sintetizada pela traduo de mensagens materna no anterior do embrio. A protena Hunchback, tambm um fator de transcrio, considerada reprimir genes abominais especficos, permitindo com isso que a regio de expresso hunchback forme a cabea e o trax. Usando determinao da pegada (footprinting) de DNase (na qual as protenas so ligadas a um segmento de DNA, DNase adicionada, e o nico DNA que permanece aquele protegido pela protena ligante de DNA), os pesquisadores encontraram que a protena Bicoid se liga a cinco stios na regio promotora a montante do gene hunchback. Todos esses stios tm a seqncia consensual 5-TCTAATCCC-3. Porm, ligao no significa necessariamente ativao. A ativao desse gene pela protena Bicoid foi demonstrada fundindo esses stios promotores de hunchback com genes reprteres da acetiltransferase cloroanfenicol (CAT) e injetando esses genes em embries precoces de Drosophila. Em todos os casos, a protena Bicoid foi necessria para ativar os genes reprteres. Quando injetada em embries deficientes em bicoid no se produziu CAT (Figura 14.14). Tambm, enquanto alguma ativao foi vista quando somente uma das cinco seqncias ligantes de Bicoid estava presente, a expresso total do gene reprter (e presumivelmente de hunchback) apareceu quando trs dos cinco stios estavam presentes. Assim, o gradiente da protena Bicoid provavelmente atua ativando a transcrio do gene hunchback na poro anterior do embrio. A protena Hunchback tambm trabalha com a Bicoid gerando o padro anterior do embrio. Driever e colaboradores (1989) predisseram que ao menos um outro gene anterior alm de hunchback deve ser ativado por Bicoid. Primeiro, delees de hunchback produzem somente alguns dos defeitos observados no fentipo mutante bicoid. Segundo, conforme vimos nos experimentos com swallow e exuparentia, somente nveis moderados da protena Bicoid so necessrios para ativar a formao do trax (i.e., expresso gnica hunchback), mas a formao da cabea necessita de concentraes mais altas. Driever et al. (1989) predisseram que promotores tais como o gene gap especfico da cabea teriam stios de ligao de baixa afinidade para a protena Bicoid. Esse gene somente seria ativado em concentraes extremamente altas da protena Bicoid - isto , perto da extremidade anterior do embrio. Desde ento, trs genes gap da cabea dependentes de concentraes muito altas da protena Bicoid para sua expresso foram descobertos (Cohen e Jrgens, 1990; Finkelstein e Perrimon, 1990; Grossniklaus et al., 1994). Os genes buttonhead (bth), empty spiracles (sem) e orthodenticle (otd) so necessrios para especificar progressivamente as
Stios ligantes do promotor hunchback para o promotor bicoid
Gene transferido para: Embries deficientes em bicoid Embries tipo selvagem
Figura 14.14
Gene CAT
Atividade CAT
Influncia da protena Bicoid na ativao do gene hunchback. Diferentes regies do promotor hunchback foram fundidas com o gene reprter CAT e injetadas em outros embries tipo selvagem, ou embries de mes deficientes em bicoid. Quanto mais stios ligantes de Bicoid havia na regio promotora, tanto mais eficaz era sua expresso nos embries de tipo selvagem. Em embries sem protena Bicoid, nenhuma transcrio resultou de qualquer dos genes movimentados pelo promotor hunchback. (Segundo Driever e Nsslein-Volhard, 1989.)
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regies anteriores da cabea. Em adio sua necessidade por nveis altos de Bicoid para ativao, esses genes tambm requerem a presena da protena Hunchback para serem transcritos (Simpson-Brose et al., 1994; Reinitz et al., 1995). As protenas Bicoid e Hunchback atuam sinergicamente como intensificadores desses genes da cabea promovendo suas transcries. O Centro de Organizao Posterior: Localizando e Ativando o Produto de nanos O centro de organizao posterior definido pelas atividades do gene nanos (Lehmann e Nsslein-Volhard, 1991; Wang e Lehmann, 1991; Wharton e Struhl, 1991). O RNA nanos produzido no ovrio e transportado para o vulo, onde se liga na regio posterior (a mais distante das clulas nutrizes ovarianas). Os produtos de vrios outros genes (oskar, valois, vas, staufen e tudor) os mesmos produtos gnicos que colocam o determinante do plasma germinativo no plasma do plo posterior (veja Captulo 13) so necessrios para colocar RNA nanos na parte posterior do ovo.* Se nanos ou qualquer desses genes de efeito materno esto ausentes na me, no h formao de abdome embrionrio (Lehmann e Nsslein-Volhard, 1986; Schpbach e Wieschaus, 1986). A mensagem nanos traduzida em protena logo aps a fecundao, tal como acontece com a mensagem bicoid. Tautz (1988) mostrou que durante a formao normal do abdome, o produto protico do gene nanos reprime a traduo do RNA hunchback (veja Figura 14.7). Esse RNA hunchback est inicialmente presente em todo o embrio, embora mais dele possa ser produzido a partir de ncleos zigticos se forem ativados pela protena Bicoid. Assim, a combinao das protenas Nanos e Bicoid causa um gradiente de protena Hunchback atravs do ovo (Figura 14.15). A protena Bicoid ativa a transcrio do gene hunchback na parte anterior do embrio, enquanto a protena Nanos inibe a traduo do RNA hunchback na parte posterior do embrio. Se o produto do gene nanos no estivesse presente, a protena Hunchback seria fabricada em todo o embrio, e presumivelmente inibiria a expresso de genes gap geradores do abdome, como knirps (Hlskamp et al., 1989; Irish et al., 1989; Struhl, 1990). O gene hunchback, portanto, parece ser o ponto focal sob regulao tanto do centro organizador anterior como do posterior, h muito conhecido existir no desenvolvimento dos insetos. Esses estudos de funes nanos e bicoid podem agora explicar experimentos embriolgicos. Luz ultravioleta ou tratamento com RNase iria destruir RNA bicoid, causando a perda de estruturas anteriores e a duplicao do abdome; procedimentos de ligao podem bloquear o espalhamento de Nanos, permitindo assim o acmulo de nveis mais altos da protena Hunchback. Embora Nanos seja considerado o principal morfgeno posterior, duas outras protenas, Pumilio e Caudal, tambm so importantes para a construo dos segmentos posteriores da Drosophila. A protena Nanos no se liga diretamente mensagem hunchback. Em seu lugar, Pumilio, uma protena encontrada por todo o embrio, ligase a 3UTR da mensagem hunchback formando um stio de ligao ao qual Nanos pode se ligar (Barker et al., 1992; Murata e Wharton, 1995). A ligao de Nanos crtica para a represso da traduo da mensagem hunchback. A protena Caudal tambm importante para a formao de estruturas posteriores. Embora embries possam
*Tal como a colocao da mensagem bicoid, a localizao da mensagem nanos determinada pela sua regio 3 no-traduzida. Se a 3UTR bicoid for colocada sobre a regio codificadora do RNA nanos, a mensagem nanos ser colocada na parte anterior do ovo. Quando o RNA for traduzido, a protena Nanos ir inibir a traduo dos mRNAs bicoid e hunchback e o embrio formar dois abdomens um no anterior do embrio e um no posterior (Gavis e Lehmann, 1992). A localizao do RNA nanos ir, em ltima anlise, depender das interaes entre o ocito e as clulas foliculares vizinhas que localizam a mensagem oskar no plo posterior e localizam o RNA bicoid no plo anterior (veja Captulo 22).
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(A)
MATERNOS
Fatores de transcrio
Figura 14.15
Converso de gradientes maternos em expresso zigtica do gene gap. (A) Os gradientes dos fatores de transcrio maternos Bicoid, Caudal e Hunchback regulam a transcrio dos genes gap. As protenas Hunchback e Caudal vm de ambas mensagens maternas e nova transcrio zigtica. (B) A concentrao das protenas Bicoid, Hunchback e Caudal crtica na especificao das posies onde os genes gap so transcritos. Essas protenas se difundem, e a interao entre elas ser crtica para ativao da transcrio dos genes pair-rule. Nos dois terminais, a interao entre Torso e Torsolike ativa os genes gap tailless e huckebein. (Segundo Rivera-Pomar e Jckle, 1996.)
ZIGTICOS
cron
Cabea
Trax
Abdome
Telso
formar segmentos abdominais na ausncia de Caudal, esses segmentos so freqentemente fundidos uns aos outros ou esto parcialmente ausentes (MacDonald e Struhl, 1986; Mlodzik e Gehring, 1987). O Grupo Gene Terminal Terminal Quando ambos os centros de organizao, anterior e posterior, forem no-funcionais, um embrio pode ainda desenvolver algum padro ntero-posterior (Nsslein-Volhard et al., 1987). Quando fmeas so tornadas duplamente mutantes tanto para o morfgeno anterior como para o posterior, seus embries produzem dois telsos, um em cada terminal do embrio. Assim, existe um terceiro conjunto de genes de efeito materno que ajudam a criar os extremos do eixo ntero-posterior. Mutaes nesses genes terminais resultam na perda das extremidades no-segmentadas do organismo: o cron anterior e o telso posterior. Na ausncia dos produtos desses genes, a poro segmentada do embrio se expande at as extremidades (Degelmann et al., 1986; Klingler et al., 1988). Portanto, o conjunto de genes terminais define os limites das partes segmentadas do corpo. O gene crtico aqui parece ser torso, um gene codificando uma tirosina quinase receptora (veja Figura 14.6). O RNA torso sintetizado por clulas ovarianas, depositado no ocito e traduzido aps a fecundao. A protena transmembrana Torso no est restrita espacialmente aos terminais do ovo, mas est distribuda uniformemente pela membrana plasmtica (Casanova e Struhl, 1989). Uma mutao dominante de torso, que proporciona atividade constitutiva ao receptor, converte toda a metade anterior do embrio em um cron e toda a metade posterior em um telso. Assim, Torso precisa normalmente ser ativada somente nos terminais do ovo. Realmente, Stevens e seus colegas (1990) mostraram que a protena Torso ativada por clulas foliculares em cada plo do embrio. O ativador da protena Torso provavelmente Torsolike,
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Figura 14.16
Torsolike
Modelo hipottico da sinalizao de Torso. A protena Torsolike, secretada pelas clulas foliculares anteriores e posteriores ligada pelo receptor Torso (que encontrado por toda a membrana do ocito). Ligao do ligante conduz ativao de torso e autofosforilao em resduos especficos de tirosina. Os grupos fosfotirosina sero reconhecidos pelo domnio da protena Drk. O domnio SH3 da protena Drk liga-se protena SOS, com isso ativando a GTPase da protena Ras. Isso ir ativar a protena Raf que o primeiro membro de uma cascata de serina/ treonina. Essa cascata em geral funciona fosforilando um fator de transcrio permitindo-lhe com isso entrar ou funcionar no ncleo. Esse fator no foi ainda identificado. O resultado final a estimulao da transcrio dos genes gap huckebein e tailless. (Segundo Duffy e Perrimon, 1994.)
RAS Extracelular
Citoplasma Ativao de RAS Ativao de Torso MAP quinase quinase
MAP quinase
Fator de transcrio
Transcrio dos genes huckebein e tailless
pois a mutao de perda-de-funo do gene torsolike cria um fentipo quase idntico ao produzido por torso. O gene torsolike expresso nas clulas foliculares anteriores e posteriores, e a protena Torsolike secretada permanece prxima dessas clulas (Martin et al., 1994). Stevens e colegas mostraram que quando as clulas foliculares nos plos da cmara do ovo so deficientes no gene torsolike (mesmo quando outras clulas foliculares expressam o alelo tipo selvagem desse gene), o embrio resultante ter o fentipo semelhante quele de torso. Parece que a protena Torsolike secretada por clulas foliculares e que ativa a protena Torso na membrana do ocito. A ativao da tirosina quinase do receptor de Torso envolve a autofosforilao de resduos de tirosina e a subseqente ativao das protenas Ras e Raf (Figuras 14.15 e 14.16; Duffy e Perrimon, 1994). Essas protenas ativam a cascata da quinase MAP (veja Captulo 3), que (de uma maneira ainda desconhecida) estimula a transcrio dos genes gap, tailless e huckebein. Esses genes em seguida especificam os terminais do embrio. A distino entre os terminais anterior e posterior depende da presena de Bicoid. Se os genes terminais agem sozinhos, clulas se diferenciam em telsos. Porm, se Bicoid estiver tambm presente, as regies formam um cron (Pignoni et al., 1992). O eixo ntero-posterior do embrio portanto especificado por trs conjuntos de genes: aqueles que definem o centro de organizao anterior, aqueles que definem o centro de organizao posterior, e aqueles que definem a regio limtrofe terminal. O centro de organizao anterior est localizado no terminal anterior do embrio e age atravs de um gradiente da protena Bicoid que ativa os genes gap especficos do anterior e suprime genes gap especficos do posterior. O centro de organizao
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posterior est localizado no plo posterior e age atravs da formao da protena Nanos, que transportada para a regio abdominal. Aqui, Nanos inibe o inibidor da expresso gnica especfica do abdome e ativa aqueles genes que formam o abdome. Os limites do cron e do telso so definidos pelo produto do gene torso, que ativado nas extremidades do embrio.
Os genes da segmentao
Uma Viso Panormica O compromisso do destino celular em Drosophila parece ser um processo de duas etapas: especificao e determinao (Slack, 1983). Precocemente no desenvolvimento, o destino de uma clula depende de sinais ambientais tais como aqueles fornecidos pelos gradientes j mencionados. Essa especificao do destino celular flexvel e ainda pode ser alterada em resposta a sinais ambientais. Finalmente, as clulas iro sofrer uma transio desse tipo de comunicao frouxa para uma determinao irreversvel. Aqui, o destino da clula tornou-se intrnseco da clula.* A transio de especificao para determinao em Drosophila mediada pelos genes de segmentao (segmentation genes). Esses genes dividem o embrio precoce em uma srie repetitiva de primrdios segmentares ao longo do eixo ntero-posterior. Mutaes em genes de segmentao causam ao embrio tornar-se carente de certos segmentos ou partes de segmentos; essas mutaes demonstram a existncia de trs classes de genes de segmentao (Tabela 14.2). Freqentemente essas mutaes afetam parasegmentos, regies do embrio separadas por engrossamentos mesodrmicos e sulcos ectodrmicos e que dividem o embrio em 14 regies (Martinez-Arias e Lawrence, 1985). Os parasegmentos do embrio no se transformam nos segmentos da larva ou do adulto. Ao invs disso, incluem a parte posterior do segmento anterior e a poro anterior do segmento que o sucede (Figura 14.17). Embora os segmentos sejam as principais divises anatmicas do plano corporal da larva e do adulto, esses segmentos so construdos de acordo com regras que usam o parasegmento como a unidade bsica da construo.
* Aficionados da teoria da informao iro reconhecer que o processo pelo qual a informao ntero-posterior em gradientes morfogenticos transferida para domnios discretos de genes seletores hometicos representa uma transio de especificao analgica para digital. Especificao analgica, determinao digital. Isso permite que a informao transitria dos gradientes no blastoderma sincicial seja estabilizada de modo a poder ser utilizada muito mais tarde no desenvolvimento (Baumgartner e Noll, 1990).
TABELA 14.2 Principais locais afetando o padro de segmentao em Drosophila

Categoria Genes gap Locais Krppel (Kr) knirps (kni) hunchback (hb) giant (gt) tailless (tll) huckebein (hkb) buttonhead (btd) empty spiracles (ems) orthodenticle (otd) hairy (h) even-skipped (eve) runt (run) Categoria Genes pair-rule (secundrios) Locais fushi tarazu (ftz) odd-paired (op) odd-skipped (odd) sloppy-paired (slp) paired (prd) engrailed (en) wingless (wg) cubitus interruptusD (ciD) hedgehog (hh) fused (fu) armadillo (arm) patched (ptc) gooseberry (gsb) pangolin (pan)
Genes de polaridade segmentar
Genes pair-rule (primrios)
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Segmentos Comportamentos Parasegmento
Figura 14.17
Embrio precoce (normal) rea da ao gnica
Embrio mais tardio (normal)
Larva (normal)
Larva (mutante letal)
Segmentos e parasegmentos. A e P representam os compartimentos anterior e posterior dos segmentos. Os parasegmentos so mudados para um compartimento frente. Ma, Mx e Lb representam trs dos segmentos da cabea (mandibular, maxilar e labial), os segmentos T so torcicos, e os segmentos A so abdominais. Os parasegmentos esto numerados de 1 at 14. Abaixo do mapa esto os limites da expresso gnica observada pela hibridizao in situ do cDNA radioativo do gene pair-rule fushi tarazu (ftz). (Segundo MartinezArias e Lawrence, 1985.)
rea da ao gnica
Bandas de dentcula
(A) Gap: Krppel
(B) pair-rule: fushi tarazu
Existem trs classes de genes de segmentao, cada classe expressa aps outra (Figura 14.3). A transio de um embrio caracterizado por gradientes de morfgenos para um embrio tendo unidades distintas realizada por produtos dos genes gap. Os genes gap so ativados ou reprimidos pelos genes de efeito materno, e dividem o embrio em largas regies contendo vrios primrdios parasegmentares. O gene krppel, por exemplo, expresso primeiramente nos parasegmentos 4-6 no centro do embrio de Drosophila (Figuras 14.18A e 14.19; Prancha 14A); a ausncia de krppel faz com que o embrio no apresente essas regies. Os produtos proticos dos genes gap interagem com as suas protenas vizinhas codificadas por genes gap e ativam a transcrio de genes pair-rule. A transcrio desses genes subdivide os largos domnios do gene gap em parasegmentos. Mutaes dos genes pair-rule (como em fushi tarazu; Prancha 14C) usualmente deleta pores de cada segmento alternante. As Figuras 14.18 e 14.20 comparam o morfologia do embrio de tipo selvagem com aquela do mutante fushi tarazu. Finalmente, os genes de polaridade segmentar so responsveis pela manuteno de certas estruturas repetitivas dentro de cada segmento. Mutaes nesse grupo de genes faz com que uma poro de cada segmento seja deletada e substituda por uma estrutura em imagem espelhar de outra poro do segmento. Por exemplo, em mutantes engrailed, as pores posteriores de cada segmento so substitudas por duplicatas da regio anterior do segmento subseqente (Figura 14.18C; Prancha 14D). Assim, os genes de segmentao so fatores de transcrio que tomam os gradientes do embrio de clivagem precoce e transformam o embrio em uma peridica estrutura parasegmentar.
Figura 14.18
(C) Polaridade segmentar: engrailed
Trs tipos mutantes de padres de segmentao. O painel esquerda mostra o embrio em estgio de clivagem, com a regio onde um determinado gene normalmente transcrito no embrio tipo selvagem mostrado em cores. Nos trs painis direita, as reas coloridas foram deletadas medida que esses mutantes se desenvolvem. (Segundo Mange e Mange, 1990.)
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Aps os limites parasegmentares terem sido produzidos, os genes pair-rule e gap interagem para regular os genes hometicos que determinam a identidade de cada segmento. No fim do estgio de blastoderma celular, a cada primrdio segmentar foi atribuda uma identidade individual por sua constelao nica de produtos de genes gap, pair-rule e hometicos (Levine e Harding, 1989). Os Genes de gap Os genes gap foram originalmente definidos por uma srie de mutantes cujos embries no tinham grupos de segmentos consecutivos (Nsslein-Volhard e Wieschaus, 1980). Conforme mostra a Figura 14.21, delees causadas pelos genes hunchback (hb), Krppel (Kr) e knirps (kr) cobrem toda regio segmentar do embrio da Drosophila. O gene gap giant (gt), superpe-se a esses trs genes e os fentipos dos mutantes tailless e huckebein deletam pores dos terminais no-segmentados do embrio. A expresso desses genes dinmica. Em geral, h um baixo nvel de atividade transcricional atravs de todo o embrio que se define em discretas regies de alta atividade medida que a clivagem continua (Jckle et al., 1986). O elemento crtico parece ser a expresso da protena Hunchback, que ao fim do ciclo 12 da diviso nuclear, est em nveis altos na parte anterior do embrio e em seguida forma um gradiente ngreme por 15 ncleos. O ltimo tero do embrio no tem expresso de detectvel Hunchback. Os padres de transcrio dos genes gap anterior so iniciados pelas diferentes concentraes das protenas Hunchback e Bicoid.
Figura 14.19
Expresso do gene Krppel no centro e no posterior do embrio de Drosophila (setas). Um embrio de 25 horas foi hibridizado com cDNA que reconhecia acumulaes de mRNA Krppel. (de Levine e Harding, 1989, cortesia de M. Levine.)
(A)
(B) Pr-ceflico Maxilar
Figura 14.20
Clipeolabro Labial (C) Mandbula
Defeitos constatados no embrio ftz-. (A) Micrografia eletrnica de varredura de um embrio do tipo selvagem, visto lateralmente. (B) O mesmo estgio em um embrio ftz-. As linhas brancas conectam as pores homlogas de uma banda germinativa segmentada. (C) Diagrama da segmentao embrionria do tipo selvagem. As regies sombreadas mostram os parasegmentos da banda germinativa que esto faltando no embrio ftz-. (Segundo Kaufman et al., 1990, fotografias cortesia de T. Kaufman.)
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hunchback krppel Knirps tailless giant
Figura 14.21
Delees segmentares em mutantes de genes gap. A tabela sob as fotografias indica por barras brancas regies segmentares faltantes. Em mutantes hunchback, a regio estendida (sobreamento mais claro) quando tanto a me como o zigoto no tm atividade do gene hunchback. Os reais domnios da expresso hunchback no foram completamente expressos. (Segundo Gaul e Jckle, 1990; expresso huckebein segundo Weigel et al., 1990; fotografias cortesia de E. Wieschaus.)
Altos nveis da protena Hunchback induzem a expresso de giant, enquanto os transcritos de Krppel aparecem sobre a regio onde Hunchback comea a declinar (veja Figura 14.15). Tambm, altos nveis da protena Hunchback previnem a transcrio dos genes gap posterior (tal como knirps) na parte anterior do embrio (Struhl et al., 1992). No posterior, a protena Hunchback encontra-se em nveis baixos ou ausente. Considera-se que um gradiente da protena Caudal, mais alto no plo posterior,
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seja responsvel pela ativao dos genes gap abdominais knirps e giant. O gene giant tem dois modos de ativao um para sua banda de expresso anterior, e um para a banda de expresso posterior (veja Figura 14.15; Rivera-Pomar, 1995; Schultz e Tautz, 1995). Aps a colocao inicial dessas protenas pelos genes de efeito materno e Hunchback, elas se estabilizam e so mantidas por interaes entre os diferentes genes gap*. Por exemplo, a expresso do gene Krppel regulada negativamente no seu limiar anterior pela protena Hunchback, e no seu limiar posterior pelas protenas Knirps e Tailless (Jckle et al., 1986; Harding e Levine, 1988; Hoch et al., 1992). Se a atividade de Hunchback est faltando, o domnio da expresso de Krppel estende-se anteriormente. Se a atividade Knirps estiver faltando, a expresso gnica Krppel estende-se mais posteriormente. Os limites entre as regies de transcrio dos genes gap so provavelmente criados por represso mtua. Tal como as protenas Giant e Hunchback podem controlar o limite anterior da transcrio de Krppel, assim tambm Krppel pode determinar os limites posteriores da transcrio de giant e hunchback. Se um embrio no tiver o gene Krppel, a transcrio de hunchback continua para dentro da rea usualmente reservada para Krppel (Jckel et al., 1986; Kraut e Levine, 1991). Essas inibies formadoras de limites so consideradas ser mediadas diretamente pelos produtos dos genes gap, porque todos os principais genes gap (hb, gt, Kr e kni) codificam protenas ligantes de DNA que podem ativar ou reprimir a transcrio (Kniple et al., 1985; Gaul e Jckle, 1990; Capovilla et al., 1992). Alm do mais, essas interaes so altamente especficas e o produto de um gene gap pode se ligar aos promotores de outros genes gap. A determinao da pegada (footprinting) de DNase I mostra que a protena codificada pelo gene Krppel tipo selvagem liga-se regio promotora do gene hunchback (que ele inibe) e regio promotora do gene knirps (que ele estimula). A regio promotora de knirps tambm reconhecida pelo produto protico do gene tailless, que inibe a transcrio de knirps. A protena Hunchback (alm de reconhecer o promotor de Krppel) tambm reconhece seu prprio promotor, sugerindo que hunchback est envolvido na regulao de sua prpria expresso (Pankratz et al., 1990; Stanojevc et al., 1989; Treisman e Desplan, 1989). Os Genes pair-rule A primeira indicao de segmentao no embrio da mosca vem quando os genes pair-rule so expressos durante o dcimo-terceiro ciclo da diviso. Os padres de transcrio desses genes so marcantes porque cada um divide o embrio em reas precursoras do plano do corpo segmentado. Como pode ser visto na Figura 14.22 e Prancha 14C, uma faixa vertical de ncleos (as clulas esto apenas comeando a se formar) expressa esse gene, seguida por outra faixa de ncleos que no o expressa, e em seguida por outra faixa que o faz. O resultado um padro de faixa de zebra ao longo do eixo ntero-posterior, dividindo-o em 15 subunidades (Hafen et al., 1984). Oito genes atualmente so conhecidos como capazes de dividir o embrio precoce desse modo; eles esto listados na Tabela 14.2. importante notar que nem todos os ncleos expressam os mesmos genes pair-rule. Realmente, em cada parasegmento, cada fila de ncleos provavelmente tem sua prpria constelao de genes pair-rule que a distingue de qualquer outra fila. Como so instrudos alguns ncleos do embrio de Drosophila a transcrever um determinado gene, enquanto seus vizinhos so instrudos para no o fazer? A resposta parece vir da distribuio de produtos proticos dos genes gap. Enquanto o RNA de cada um dos genes gap tem uma distribuio muito discreta que
*As interaes entre genes e produtos de genes so facilitadas pelo fato de que essas reaes ocorrem dentro de um sinccio. As membranas celulares ainda no se formaram.
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(A)
Figura 14.22
Regies promotoras especficas do gene even-skipped (eve) controlam bandas de transcrio especficas no embrio. (A) um gene -galactosidase reprter foi fundido regio do promotor even-skipped e inseridos no genoma da mosca. A regio promotora completa produz as sete faixas normais de transcrio. (B) Se somente os 480 pares de bases mais proximais esto presentes, somente se formam as faixas 2, 3 e 7. (C) Mapa parcial do promotor eve, mostrando as regies responsveis pelas vrias faixas e pela auto-regulao. (Fotografias cortesia de S. Carroll e M. Levine.)
(B) (C) Faixa #4, #5, #6 Faixa #1 Auto-regulao Faixa #3 Faixa #2 + #7
define projetando ou ligeiramente superpondo regies de expresso, os produtos proticos desses genes estendem-se mais extensamente. Na realidade, eles se superpem por ao menos 8-10 ncleos (que nesse estgio contam com dois a trs segmentos primordiais). Isso foi demonstrado de uma maneira marcante por tanojevc e colaboradores (1989). Esses autores fixaram blastodermas celularizantes, coraram a protena Hunchback com um anticorpo contendo um corante vermelho, e simultaneamente coraram a protena Krppel com anticorpo contendo um corante verde. As regies celularizantes que continham ambas protenas ligaram ambos anticorpos e foram coradas de amarelo brilhante (Prancha 14B). De maneira semelhante, a protena Krppel superps-se protena Knirps na regio posterior (Pankratz et al., 1990). Trs genes so conhecidos como os genes pair-rule primrios. Esses genes hairy, even-skipped e runtso essenciais para a formao do padro peridico e so os genes diretamente controlados pelas protenas Gap. Os promotores dos genes pair-rule primrios so reconhecidos por protenas do gene gap, e acredita-se que as diferentes concentraes dessas protenas determinam se o gene vai ser transcrito ou no. Os promotores desses genes so freqentemente moduladores: o controle sobre cada faixa est localizado em uma discreta regio do DNA. Por exemplo, uma deleo particular da regio promotora do gene evenskipped previne a formao da terceira faixa even-stripped, enquanto uma deleo pouco mais abaixo causa a perda da segunda faixa even-skipped (Figura 14.23). A determinao da pegada da DNase I dessa regio final mostra que ela contm seis stios para a protena Krppel, trs para Hunchback e cinco para Bicoid. Evidncia gentica mostra que se alguns desses stios so deletados, a posio da segunda faixa se movimenta. tanojevc e colaboradores (1991) mostraram que a segunda faixa even-skipped reprimida tanto pelas protenas Giant como Krppel e ativada pela protena Hunchback, em baixas concentraes de Bicoid. Esse modelo mostrado na Figura 14.23B,C. A regio responsvel pela terceira faixa de transcrio even-skipped contm 20 stios de ligao Hunchback e nenhum stio para a protena Krppel (tanojevc et al., 1989). Essa situao permitir ao stio responder a nveis muito baixos do produto do gene hunchback. Protenas Gap ativam a transcrio de alguns genes pair-rule enquanto reprimem transcrio de outros. O resultado o padro de faixas de transcrio que emergem medida que o embrio se desenvolve. Uma vez iniciado por protenas Gap, o padro de transcrio dos genes primrios pair-rule fica estabilizado por suas interaes (Levine e Harding, 1989). Os genes primrios pair-rule tambm formam o contexto que permite ou inibe a expresso dos
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(A)
hunchback krppel giant Knirps giant
Figura 14.23
(B)
Faixas eve
Hiptese para a formao da segunda faixa de transcrio do gene even-skipped. (A) O gene ativo onde concentraes da maioria das protenas Gap baixa. (B) Assim, os limites da transcrio de eve so determinados por concentraes altas dessas protenas. Diferentes elementos intensificadores contm seqncias de ligao para diferentes fraes. No intensificador para a segunda banda de transcrio eve, a ligao da protena Hunchback estimula a transcrio. (C) Elementos intensificadores para a regulao da faixa 2, contendo seqncias ligantes para protenas Krppel, Giant, Bicoid e Hunchback. Notar que quase cada stio ativador est intimamente ligado a um stio repressor, sugerindo interaes competitivas nessas posies. (A e B segundo Reinitz e Sharp, 1995; C segundo tanojevc et al., 1991.)
Bicoid Hunchback
(C) Ativadores Repressores Giant
Krppel
genes pair-rule secundrios de ao tardia. Um desses genes pair-rule secundrios o fushi tarazu (ftz, japons demasiadamente poucos segmentos). No comeo do ciclo 14, o RNA ftz e a protena so vistos atravs de toda a regio segmentada do embrio. No entanto, medida que as protenas dos genes pair-rule primrios comeam a interagir com o promotor ftz, o gene ftz reprimido em certas faixas de ncleos para criar as regies inter-faixas. Nesse perodo, a protena Ftz interage com seu prprio promotor para estimular mais transcrio do gene ftz (Figura 14.24; Edgar et al., 1986; Karr e Kornberg, 1989; Shier e Gehring, 1992). Os Genes de Polaridade Segmentar (segmentation genes) At aqui, nossa discusso identificou interaes entre molculas dentro do embrio sincicial. Porm, uma vez formadas as clulas, interaes passam a acontecer entre elas. Essas interaes intercelulares so mediadas pelos genes da polaridade segmentar e realizam duas tarefas importantes. Primeiro, reforam a periodicidade parasegmentar estabelecida por fatores transcricionais anteriores. Em segundo lugar, atravs dessa sinalizao celular, os destinos das clulas so estabelecidos dentro de cada parasegmento. Muitos genes de polaridade segmentar codificam protenas que so constituintes de trajetos sinalizadores celulares. Por exemplo, Wingless e Hedgehog so protenas secretadas que agem como ligantes, enquanto Patched uma protena transmembrana que age como receptor (para Hedgehog). Outros genes de polaridade segmentar, como disheveled, zeste white-3 e fused, codificam transdutores de sinais (veja Captulo 3), e alguns, como engrailed, armadillo e cubitus interruptus, so considerados fatores de transcrio ativados por essas trajetrias. Mutaes nesses genes de polaridade segmentar levam a defeitos na segmentao e padronizao atravs do parasegmento.
(E) (A)
(B)
(C)
(D)
Figura 14.24
Transcrio do gene ftz. (A-D) No comeo do ciclo 14, h baixa transcrio em cada ncleo da regio segmentada do embrio de Drosophila. Dentro dos prximos 30 minutos, o padro da expresso se altera enquanto a transcrio de ftz intensificada em certas regies (que formam as faixas) e reprimida nas regies entre as faixas. (E) Dupla marcao dos transcritos even-skipped (bandas mais escuras) e fushi tarazu (bandas mais claras), mostrando que ftz expresso entre a bandas. (A-D segundo Karr e Kornberg, 1989; E cortesia de M. Levine.)
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O desenvolvimento de padres normais se baseia no fato de que alguns desses genes so transcritos em domnios espaciais especficos (Prancha 14D). Por exemplo, wingless, engrailed e hedgehog so cada um expressos em 14 bandas distintas da clula. Em particular, wingless expresso numa faixa de clulas anteriormente adjacente uma faixa de clulas que co-expressam engrailed e hedgehog. A expresso errnea de qualquer desses genes destri o padro do parasegmento. O estabelecimento desses padres restritos de expresso determinado pelas protenas par-rules. A transcrio do gene wingless reprimida por protenas Fushi tarazu e Even-skipped e estimulada por ativadores gerais encontrados em todo o embrio. Ao mesmo tempo, o gene engrailed est ativo nas clulas contendo a protena Fushi tarazu (que estimula a transcrio de engrailed) e carente de Odd-skipped (que inibe tal transcrio). Isso faz com que o wingless seja transcrito somente na clula diretamente anterior s clulas onde engrailed transcrito (Figura 14.25 A). Uma vez que a expresso de wingless e engrailed estiver estabelecida em clulas adjacentes, esse padro tem que ser mantido para que seja conservada a periodicidade parasegmentar do plano corporal, estabelecida pelos genes pair-rule. Deve ser lembrado que os mRNAs e as protenas envolvidos na iniciao desses padres so de vida curta, mas que esses padres tm que ser mantidos depois que os iniciadores de padro no estiverem mais sendo sintetizados. A manuteno desses padres regulada por interaes entre as clulas expressando wingless e aquelas expressando engrailed. A protena Wingless, secretada por clulas expressando wingless, sinaliza para clulas adjacentes, ligando-se protena transmembrana D-Frizzled-2 (veja Figura 3.38; Bhanot et al., 1996). Isso ativa o transdutor de sinais Disheveled, que ir causar a reduo da atividade da quinase Zeste white-3. Acredita-se que a diminuio da regulao dessa quinase permite a entrada da protena no-fosforilada Armadillo (-catenina) no ncleo, onde age como um fator de transcrio regulando positivamente e, assim, mantendo a expresso do gene engrailed (Siegfried et al., 1994). A ativao inicia outra poro dessa trajetria recproca. A protena Engrailed ativa a transcrio do gene hedgehog (hh). Esse gene codifica uma protena secretada que ativa uma trajetria sinalizadora de transduo nas clulas que esto respondendo anteriormente, levando manuteno da transcrio de gene wingless na clula vizinha. O resultado um enlace recproco pelo qual as clulas sintetizando Engrailed secretam a protena Hedgehog, que mantm a expresso do gene wingless na clula vizinha, enquanto a clula secretora de Wingless conduz expresso dos genes engrailed e hedgehog em outra clula (Heemskerk et al., 1991; Ingham et al., 1991; Mohler e Vani, 1992). Dessa maneira, o padro de transcrio dessas duas clulas permanece estabilizado. A segunda tarefa realizada pelos genes de polaridade segmentar estabelecer os destinos celulares atravs de cada parasegmento. Isso no est completamente compreendido, mas o grupo de clulas estabilizadas flanqueando o limiar parasegmentar expressando wingless e hedgehog, respectivamente, essencial. Isso pode ser observado na epiderme dorsal, onde as filas de clulas produzem diferentes estruturas cuticulares, dependendo de suas posies dentro do segmento. A 1a fila consiste de grandes dentculos pigmentados. Posteriormente a essas clulas, a 2a fila produz uma cutcula epidrmica lisa. As prximas duas filas tm um 3o destino, produzindo pequenos plos grossos; e so seguidas por vrias filas de clulas que adotam o 4o destino, que o de produzir plos finos. As clulas expressando wingless ficam dentro da regio que diferencia os plos finos, enquanto as clulas expressando hedgehog esto prximas das clulas da 1a fila. Os destinos das clulas podem ser alterados experimentalmente, aumentando ou diminuindo os nveis das protenas Hedgehog ou Wingless (Heemskerek e DiNardo, 1994; Bokor e DiNardo, 1996; Porter et al., 1996). Por exemplo, se hedgehog for colocado num promotor de choque trmico e os embries forem criados numa temperatura que ativa o gene hh, mais protena Hh ser produzida, e as clulas normalmente mostrando destinos da 3a fila tornar-se-o clulas do segundo tipo. As filas de clulas da
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Figura 14.25
Segmento Parasegmento (A)

Concentrao de produtos dos genes
Segmento Parasegmento
Iniciao por produtos de genes pair-rule
Eve
Ftz
Eve
Ftz
Anterior Clulas (B) Interao entre engrailed e wingless
Posterior
Anterior
Um segmento
Posterior
Modelo para a transcrio dos genes de polaridade segmentar engrailed (en) e wingless (wg). (A) A expresso de wg e en iniciada por genes pair-rule. O gene engrailed expresso quando as clulas contm altas concentraes das protenas Even-skipped ou Fushi tarazu. O gene wingless transcrito quando nem o gene eve nem ftz esto ativos, mas um terceiro gene (provavelmente oddpaired) expresso. (B) A expresso contnua de wg e en mantida pela interao entre clulas expressando engrailed e wingless. A protena Wingless secretada e se difunde para as clulas circunjacentes. Nas clulas com competncia para expressar engrailed (tendo protenas Eve ou Ftz), a protena Wingless ligada pelo receptor Frizzled. Isso permite a ativao do gene engrailed. A protena Engrailed ativa a transcrio do gene hedgehog e tambm ativa a transcrio de seu prprio gene (engrailed). A protena Hedgehog se difunde dessas clulas e se liga protena Patched. Essa ligao impede a protena Patched de inibir a sinalizao da protena Smoothened. O sinal permite a transcrio do gene wingless e a subseqente secreo da protena Wingless.
Engrailed competente
wingless competente
engrailed competente
Difuso da protena Wingless
Expresso wingless
Expresso engrailed
Receptores Patched Protena Wingless
Difuso da protena Hedgehog
Frizzled
Transcrio de wingless Armadillo Cubitus interruptus Receptores Patched Transcrio de engrailed, hedgehog
Hedgehog Protena smoothened
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Gradiente Hedgehog
Gradiente Wingless
Figura 14.26
Especificao celular pelo centro sinalizador Wingless/Hedgehog. (A) Fotografia em campo iluminado de embrio tipo selvagem de Drosophila, mostrando a posio do terceiro segmento abdominal. (B) Aproximao da rea dorsal do segmento A3, mostrando as diferentes estruturas cuticulares produzidas pelas 1a, 2 a, 3a e 4a filas de clulas. (C) Modelo para o papel de Wingless e Hedgehog. Cada sinal responsvel por aproximadamente metade do padro. Cada sinal, ou age de uma maneira gradual (aqui mostrada como gradientes diminuindo a partir de suas respectivas fontes) para especificar os destinos de clulas distantes dessas fontes, ou cada sinal pode agir localmente sobre clulas vizinhas para iniciar uma cascata de indues (aqui mostrada como setas em seqncia). (Segundo Heemskerk e DiNardo, 1994; fotografias cortesia dos autores).
4a mais distante das clulas secretoras de Wg tambm podem tornar-se de 3a ou 2a. Parece que as clulas mais prximas das secretoras de Wg no podem responder a Hh, e Hh no pode, por si s, especificar o 1o destino. (Isso pode requerer a expresso dos produtos do gene pair-rule, especialmente Engrailed.) Assim, Hedgehog e Wingless parecem necessrias para a elaborao de todo o padro de tipos celulares do parasegmento. Porm, o mecanismo pelo qual conseguem tal especificao no est claro. Ou esses sinais agem de uma forma gradual como morfgenos, ou agem localmente iniciando uma cascata de eventos do local de sinalizao, onde cada interao
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usa um ligante e um receptor diferentes (Figura 14.26). O padro dos destinos celulares tambm muda o foco da padronizao de parasegmento em segmento. Tem-se agora marcadores externos, as clulas expressando engrailed tornando-se as clulas mais posteriores de cada segmento.
Os genes de seleo hometica

Padres de Expresso dos Genes Hometicos Aps os limites segmentais terem sido estabelecidos, as estruturas caractersticas de cada segmento so especificadas. Essa especificao conseguida pelos genes seletores hometicos (Lewis, 1978). Existem duas regies do cromossomo 3 da Drosophila que contm a maioria desses genes hometicos (Figura 14.27). Uma regio, o complexo Antennapedia, contm os genes hometicos labial (lab), Antennapedia (Antp), Sex comb reduced (Scr), Deformed (Dfd) e proboscipedia (pb). Os genes labial e Deformed especificam os segmentos da cabea, enquanto Sex comb reduced e Antennapedia contribuem para dar identidade aos segmentos torcicos. O gene proboscipedia parece atuar somente em adultos, mas em sua ausncia, os palpos labiais da boca so transformados em patas (Wakimoto et al., 1984; Kaufman et al., 1990). A segunda regio de genes hometicos o complexo bithorax (Lewis, 1978). Existem trs genes codificadores de protenas nesse complexo: Ultrabithorax (Ubx), que necessrio para a identidade do terceiro segmento torcico, e abdominal A (abdA) e Abdominal B (AbdB), que so responsveis pelas identidades dos segmentos abdominais (Snchez-Herrero et al., 1985). O fentipo letal do mutante de trspontos Ubx-, abdA-, AbdB- idntico aquele de uma deleo de todo o complexo bithorax (Casanova et al., 1987). A regio do cromossomo contendo tanto o complexo Antennapedia como o complexo bithorax freqentemente referida como o complexo hometico (Hom-C).
(A)
Figura 14.27
Complexo Antennapedia (B) Complexo Bithorax
Os domnios funcionais dos genes dos complexos bithorax e Antennapedia em Drosophila. (A) O complexo bithorax foi dividido em trs grupos complementares letais identificados por E. B. Lewis. Os genes do complexo Antennapedia so labial (lab), Deformed (Dfd), Sex comb reduced (Scr) e Antennapedia (Antp). (B) Sumrio do controle dos genes AbdA e AbdB em Drosophila. Os limites so controlados pelos genes gap. As sries de mutaes infra-abdominal controlam os elementos reguladores desses genes. (A segundo Dessain et al., 1992; B segundo Casares e Snchez-Herrero, 1995.)
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Figura 14.28
(A)
(A) Cabea de uma mosca tipo selvagem. (B) Cabea de uma mosca contendo a mutao Antennapedia que converte antenas em patas. (Segundo Kaufman et al., 1990, cortesia de T. C. Kaufman.)
Como esses genes so responsveis pela especificao das partes corporais da mosca, suas mutaes levam a fentipos bizarros. Em 1984, William Bateson chamou esses organismos de mutantes hometicos, que fascinaram biologistas do desenvolvimento por dcadas. O gene Antennapedia, por exemplo, considerado especificar a identidade do segundo segmento torcico. Na mutao dominante de Antennapedia, esse gene expresso na cabea bem como no trax, e os discos imaginais da regio da cabea so especificados como torcicos. Com isso, patas em lugar de antenas crescem dos soquetes da cabea (Figura 14.28). No mutante recessivo de Antennapedia, o gene deixa de ser expresso no segundo segmento torcico, e antenas brotam das posies das patas (Struhl, 1981; Frischer et al., 1986; Schneuwly et al., 1987). De maneira semelhante, quando o gene Ultrabithorax deletado, o terceiro segmento torcico (caracterizado por halteres) se transforma em outro segundo segmento torcico. O resultado (Figura 14.29) uma mosca com quatro asas - uma situao embaraosa para um dptero clssico*.
*Dpteros (insetos com duas asas como as moscas) so considerados ter evoludo de insetos normais com quatro asas; possvel que essa mudana ocorreu atravs de alteraes no complexo bithorax. O Captulo 23 inclui mais especulaes sobre a relao entre genes bithorax e a evoluo.
Figura 14.29
A mosca das frutas de quatro asas foi construda juntando-se trs mutaes em reguladores cis do gene Ultrabithorax. Essas mutaes transformam eficazmente o terceiro segmento torcico em outro segundo segmento torcico (i.e., halteres em asas). (Cortesia de E. B. Lewis.)
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Segmentos: gene en: Parasegmentos: gene ftz:
Complexo Antennapedia labial (lab) Epiderme Sistema nervoso central (CNS) Epi CNS
Deformed (Dfd)
Sex combs reduced (Scr)
Epi CNS
Antennapedia (Antp) Epi CNS
Complexo bithorax Ultrabithorax (Ubx)
Epi CNS
abdominal A (abdA) Epi CNS Abdominal B (AbdB) Epi CNS caudal (cad) Epi
Figura 14.30
Esses principais genes seletores hometicos foram clonados e sua expresso analisada por hibridizao in situ (Harding et al., 1985; Akam, 1987). Os resultados desses experimentos esto sumariados na Figura 14.30. Transcritos de cada loco so detectados em regies especficas do embrio sendo especialmente proeminentes no sistema nervoso central. Em mutantes hometicos, essa expresso normal fica alterada. Por exemplo, em alelos dominantes de Antennapedia, o gene Antennapedia foi invertido no cromossomo, fazendo com que perdesse seu prprio promotor ficando sob o controle de um promotor diferente, ativo na cabea. Isso causa a expresso ectpica de Antp na cabea. De maneira semelhante, se o gene Ultrabithorax for colocado em um novo promotor e expresso na regio da cabea, as antenas comeam a produzir estruturas especficas de patas e protenas (Mann e Hogness, 1990).
Regies de expresso gnica hometica (tanto mRNA como protena) no blastoderma e (algumas horas mais tarde) no sistema nervoso central do embrio de Drosophila. As reas escurecidas so segmentos ou parasegmentos com mais produto. As barras adjacentes ilustrao representam a expresso gnica dentro dos limites parasegmentares. (Segundo Kaufman et al., 1990.)
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Iniciando os Padres da Expresso dos genes Hometicos A iniciao dos domnios dos genes hometicos influenciada pelos genes gap e genes pair-rule. Por exemplo, a expresso dos genes abdA e AbdB reprimida pelas protenas Gap Hunchback e Krppel. Essa inibio impede esses genes que especificam para o abdome, serem ativos na cabea e no trax (Casares e SnchezHerrero, 1995). Reciprocamente, o gene Ultrabithorax ativado por certos nveis da protena Hunchback, fazendo com que seja originalmente transcrito em uma larga banda no meio do embrio, e a protena Gap Krppel ative a transcrio de Antennapedia (Figura 14.31; Harding e Levine, 1988; Struhl et al., 1992). Os limites de expresso dos genes hometicos so logo confinados a parasegmentos definidos pela protenas Fushi tarazu e Even-skipped (Ingham e Martinez-Arias, 1986; Mller e Bienz, 1992). Mantendo os Padres de Expresso dos genes Hometicos A expresso de genes hometicos um processo dinmico. O gene Antp, por exemplo, embora expresso inicialmente no parasegmento 4 presuntivo, logo aparece no parasegmento 5. medida que a banda germinativa se expande, a expresso do gene Antp vista no tubo neural presuntivo to posteriormente quanto o segmento 12. Durante o desenvolvimento ulterior, o padro se contrai novamente, e transcritos Antp esto fortemente localizados nos parasegmentos 4 e 5. Tal como outros genes hometicos, a expresso Antp regulada negativamente por todos os produtos de genes hometicos posteriores a ele (Harding e Levine, 1989; Gonzlez-Reyes e Morata, 1990). Em outras palavras, cada um dos genes do complexo bithorax reprime a expresso de Antennapedia. Se Ultrabithorax for deletado, a atividade de Antp se estende atravs da regio que normalmente teria expresso Ubx e pra onde a regio Abd comea. (Isso permite que o terceiro segmento torcico forme asas tal como o segundo segmento torcico, como est na Figura 14.29). Se todo o complexo bithorax for deletado, a expresso de Antp se estende atravs de todo abdome. (A larva no sobrevive, mas o padro da cutcula atravs de todo o abdome aquele do segundo segmento torcico). As protenas Gap e as protenas Pair-rule so transitrias, mas as identidades dos parasegmentos tm que ser conservadas para que possa ocorrer a diferenciao especfica. Assim, uma vez que os padres de transcrio dos genes hometicos estiverem estabilizados, eles so presos nos seus lugares por alteraes na conformao da cromatina nesses genes. A represso dos genes hometicos parece ser mantida pela famlia de protenas Polycomb, enquanto a estrutura ativa da cromatina parece ser mantida pela protena trithorax (Ingham e Whittle, 1980; McKeon e Brock, 1991; Simon et al., 1992).
GENES REALIZADORES. Foi desencadeada a procura por genes realizadores,
(A)
(B)
Figura 14.31
A expresso inicial do gene hometico Antennapedia (B) est baseada na expresso anterior de Krppel (A) na mesma rea. Se a colocao da expresso Krppel for alterada, assim tambm a ser a expresso de Antennapedia. (de Levine e Harding, 1989, cortesia dos autores.)
genes que so alvos dos genes hometicos e que funcionam para formar os primrdios de tecidos especficos ou rgos. Um mtodo, pioneiro no laboratrio de Walter Gehring, usou armadilhas de intensificadores para detectar aqueles genes regulados por Antennapedia. Aqui, um transpson contendo um gene reprter da -galactosidase acoplado a um promotor fraco e introduzido aleatoriamente no genoma de diferentes Drosophila. A expresso da -galactosidase (que pode ser facilmente detectada por colorao) fica sob o controle de intensificadores na vizinhana do promotor. Se o intensificador for regulado pela protena Antennapedia (que est presente na regio torcica, mas no na cabea do embrio), ento a atividade da -galactosidase deveria ser diferente quando tecidos torcico e da cabea so comparados. Usando essa tcnica, Wagner-Bernholz e colaboradores (1991) encontraram o que pode ser o gene crtico regulado por Antennapedia. Esse gene, salm, no ativo em discos imaginais de pata do trax,
573
Disco antenal
(A)
(B)
(C)
Figura 14.32
A armadilha de intensificador do transpson transporta um gene -galactosidase, ativado quando colocado perto de um intensificador. Em uma linhagem, o transpson ficou incorporado perto de um gene regulado diferencialmente na cabea e no trax. (A) Discos imaginais da pata de larvas do tipo selvagem (no terceiro instar logo antes da transformao em crislida) no expressam um gene particular salm. (B) Os discos antenais da mesma larva expressam salm. (C) Discos antenais de um mutante de Antennapedia mostram que esse gene est reprimido nesse mutante. (Segundo Wagner-Bernholz et al., 1991, cortesia de W. J. Gehring.)
mas expresso no disco imaginal da antena (Figura 14.32). Assim, salm parece ser um gene que reprimido pela protena Antennapedia. A represso do gene salm pode ser crtica para a formao de tecido das patas, em lugar de tecido antenal, dos discos imaginais torcicos. Outro mtodo empregado para achar tais genes tem sido o seqenciamento. O seqenciamento de genes mostrou que alguns genes tm elementos intensificadores que ligam os genes hometicos, com isso, fazendo com que eles sejam regulados por padres de expresso dos genes hometicos. Um gene alvo, decapentaplegic, tem um stio de ligao em seu intensificador para a protena Ultrabithorax. Isso permite protena Decapentaplegic ser expressa no mesoderma visceral do parasegmento 7, onde necessria para o desenvolvimento do intestino mdio (Immergluck et al., 1990; Panganiban et al., 1990). Outro alvo das protenas hometicas, o gene Distal-less (ele prprio um gene contendo um homeobox) necessrio para o desenvolvimento dos membros e ativo somente no trax. A expresso Distal-less reprimida no abdome, provavelmente por uma combinao de protenas Ubx e AbdA que podem-se ligar a seu intensificador e bloquear a transcrio (Vachon et al., 1992; Castelli-Gair e Akam, 1995). Isso apresenta um paradoxo, j que ambos, o parasegmento 5 (inteiramente torcico e produtor de patas) e o parasegmento 6 (que inclui a maior parte do primeiro segmento abdominal livre de patas) expressam Ultrabithorax. Como podem dois segmentos to diferentes ser especificados pelo mesmo gene? CastelliGair e Akam (1995) mostraram que a mera presena da protena Ubx em um grupo de clulas no suficiente para a especificao. Em vez disso, o momento e o local de sua expresso dentro do parasegmento podem ser crticos. Antes da expresso Ubx, os parasegmentos 4-6 tm potenciais semelhantes. No estgio 10, a expresso de Ubx nas partes anteriores dos parasegmentos 5 e 6 impede-os de formarem estruturas (como a espiral anterior), caractersticas do parasegmento 4. Alm disso, no compartimento posterior do parasegmento 6 (mas no do parasegmento 5), a protena Ultrabithorax bloqueia a formao do primrdio dos membros reprimindo os genes Distal-less. No estgio 11, quando Ubx tiver alcanado todo parasegmento 6, o gene Distal-less tornou-se auto-regulatrio e no pode ser reprimido por Ultrabithorax (Figura 14.33).
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Figura 14.33
Anterior Segmentos: (A)
Posterior
Representao esquemtica das diferenas entre a expresso de Ubx nos parasegmentos 5 e 6. (A) Antes da expresso de Ubx, cada segmento tem competncia para produzir espirculos e patas. (B) No estgio 10, a expresso precoce de Ubx (sombreada) bloqueia a formao do espirculo anterior em PS5 e PS6, e previne a formao de patas no compartimento posterior de PS6. A protena AbdA prov o mesmo papel nos outros segmentos abdominais. (C) No estgio 11, o domnio da expresso Ubx se estende ao primrdio das patas de PS5 e PS6, mas vem tarde demais para reprimir a expresso do gene Distal-less. (Segundo Castelli-Gair e Akam, 1995.)
Primrdio do espirculo Primrdio da pata Parasegmentos Protena Ubx (B)
Protena AbdA
(C)
Os Elementos Cis-Reguladores e o Complexo Bithorax As diferenas temporais e espaciais na expresso de Ubx entre os parasegmentos 5 e 6 sugerem que Ubx regulado por diferentes elementos reguladores. Lewis e seus colegas (Lewis, 1978, 1985; Bender et al., 1983; Karch et al, 1985) identificaram essas regies cis-reguladoras. No princpio (antes que os trs genes do complexo bithorax fossem identificados), essas regies foram consideradas codificar protenas especficas. Hoje, sabe-se que elas regulam a transcrio de um dos trs genes do complexo bithorax em parasegmentos especficos. Por exemplo, os mutantes anterobithorax (abx) e bithorax (bx) faz com que o compartimento anterior do terceiro segmento torcico (equilibradores anteriores) assuma a identidade do compartimento anterior do segundo segmento torcico (asas anteriores). De maneira semelhante, os mutantes posterobithorax (pbx) e bithoraxoid (bxd) faz com que o compartimento posterior do terceiro segmento torcico se parea aquele do segundo segmento torcico. A combinao das mutaes abx, pbx e bxd em um nico embrio, causa a transformao total do terceiro segmento torcico em um outro segundo segmento torcico. (O resultado a mosca mostrada na Figura 14.29). Embora essas mutaes tivessem originalmente sido consideradas estar em genes separados, parece agora que so mutaes de elementos intensificadores que possibilitam a expresso especfica da posio do gene Ubx (Lewis, 1985; Peifer et al., 1987). A relao entre as mutaes cis-reguladoras e as trs unidades de transcrio do complexo bithorax mostrada na Figura 14.34. As regies codificadoras da protena do complexo bithorax ocupam menos que um dcimo do DNA nesse complexo. As mutaes reguladoras em geral, colocam-se nas regies flanqueadoras desses trs genes ou em ntrons no seu interior. Evidncia adicional que abx, bx e bxd so elementos cis-reguladores vem da anlise de mutaes e delees especficas. A deleo do gene Ubx resulta na transformao hometica do parasegmento 5 (T2 posterior e T3 anterior) e parasegmento 6 (T3 posterior e A1 anterior) em cpias do
575
Segmentos Compartimentos Parasegmentos Mutaes Ultrabithorax Mutaes reguladoras
Seqncias reguladoras Genes estruturais Unidades de transcrio
Figura 14.34
Mutaes reguladores no complexo bithorax. A mosca adulta esquematizada dividida em segmentos e compartimentos anterior e posterior. As regies reguladoras do gene Ultrabithorax esto mostradas abaixo da mosca. As reas sombreadas representam a regio especificada pelo domnio regulador particular. A linha contnua abaixo desse representa a regio de 300.00 pares de bases do complexo. As trs unidades de transcrio que codificam as trs protenas hometicas do complexo bithorax esto mostradas em relao aos locais reguladores. Cada um desses genes transcrito da direita para a esquerda. Os xons so mostrados como caixas escuras, os ntrons por linhas interrompidas. Acima da linha esto as seqncias reguladoras definidas por mutaes genticas, e a cor das linhas corresponde ao gene que a seqncia regula positivamente. (Segundo Peifer et al., 1897; Beachy, 1990; Casares e Snchez-Herrero, 1995.)
parasegmento 4 (T1 posterior e T2 anterior). Tal transformao letal; o embrio morre antes de eclodir. Nos mutantes abx e bx, porm, somente o parasegmento 5 transformado no parasegmento 4, quando a expresso de Ubx reduzida no parasegmento 5 (Casanova et al., 1985; Peifer e Bender, 1986). Da, a asa anterior emerge no que, de outra maneira, seria um haltere anterior. De modo semelhante, as mutaes bxd reduzem a expresso Ubx no parasegmento 6 (Peifer et al. 1987). O elemento regulador bithorax para Ubx, contm um intensificador que liga as protenas codificadas pelos genes de segmentao: tailless, fushi tarazu e hunchback (Quian et al, 1991). Na regio abdominal, as seqncias cis-reguladoras intraabdominal (iab) 2-8 direcionam a expresso de abdA ou AbdB nos vrios segmentos (Boulet et al., 1991; Snchez-Herrero, 1991).
576
&
Especulaes
Regulao Molecular do Desenvolvimento: As Protenas do Homeodomnio

O Homeodomnio Protenas do homeodomnio so uma famlia de fatores de transcrio caracterizados por um domnio de 60 aminocidos que se ligam a certas regies do DNA. O homeodomnio foi primeiro visto naquelas protenas cuja ausncia ou m-regulao causa transformaes hometicas em segmentos da Drosophila. Considera-se que protenas do homeodomnio ativem baterias de genes que especificam as propriedades particulares quele segmento. Tais protenas contendo homeodomnios incluem os produtos dos oito genes hometicos do complexo hometico, assim como outras protenas, como Fushi tarazu, Caudal e Bicoid. Fatores de transcrio do homeodomnio so importantes para a determinao dos eixos nteroposteriores tanto de invertebrados como de vertebrados. Em Drosophila, a presena de certas protenas contendo homeodomnios tambm necessria para a determinao de neurnios especficos. Sem esses fatores de transcrio, os destinos desses neurnios so alterados (Doe et al., 1988). O homeodomnio codificado por um homeobox de 190 pares bases (veja Captulo 10). Os homeodomnios parecem especificar os stios de ligao para essas protenas e so crticos para a especificao do destino celular. Por exemplo, se uma
(A)
protena quimrica construda em maior parte por Antennapedia, mas com o terminal carboxlico (incluindo o homeodomnio) de Ultrabithorax, a protena pode ser substituda por Ultrabithorax e especificar as clulas apropriadas como parasegmento 6 (Mann e Hogness, 1990). O homeodomnio isolado de Antennapedia ir se ligar aos mesmos promotores que a protena Antennapedia inteira, indicando que a ligao dessa protena depende de seu homeodomnio (Mller et al., 1988). O homeodomnio se dobra em trs -hlices, as ltimas duas se dobrando em uma conformao hlice-giro-hlice que caracterstica de uma famlia de fatores de transcrio que ligam DNA ao sulco maior da dupla hlice (Otting et al., 1990; Percival-Smith et al., 1990). A terceira hlice a hlice de reconhecimento, e aqui que os aminocidos entram em contato com as bases do DNA. Uma seqncia de quatro bases, TAAT, conservada em quase todos os stios reconhecidos pelos homeodomnios; ela provavelmente distingue aqueles stios aos quais as protenas do homeodomnio podem se ligar. O terminal T 5 parece ser crtico para esse reconhecimento, pois se mutado ele destri toda ligao do homeodomnio. Os pares de bases que seguem a seqncia TAAT so importantes para distinguir entre os stios si(B) Stio bicoid, 7 pares de bases Citosina Guanina
milares de reconhecimento. Por exemplo, o prximo par de bases reconhecido pelo aminocido 9 dentro da hlice de reconhecimento. Estudos de mutaes mostraram que os homeodomnios das protenas Bicoid e Antennapedia usam, respectivamente, lisina ou glutamina na posio 9 para distinguir stios de reconhecimento relacionados. A lisina do homeodomnio de Bicoid reconhece o G de pares CG, ao passo que a glutamina do homeodomnio de Antennapedia reconhece A de um par AT (Figura 14.35; Hanes e Brent, 1991). Se essa lisina for substituda por glutamina, uma protena Bicoid ir reconhecer stios ligantes de Antennapedia (Hanes e Brent, 1989, 1991). Outras protenas com homeodomnios mostram um padro semelhante, reconhecendo a seqncia comum, enquanto outra poro reconhece uma estrutura especfica prxima ao TAAT.
Figura 14.35
Interaes homeodomnio-DNA. (A) homeodomnio hlice-giro-hlice dentro do sulco maior do DNA. (B) Pareamento proposto entre a lisina do homeodomnio Bicoid e o par de bases CG da seqncia de reconhecimento, e entre a glutamina do homeodomnio de Antennapedia e o par de bases TA de sua seqncia de reconhecimento. Em ambos os casos o nono aminocido da hlice se liga ao par de bases imediatamente posterior seqncia TAAT. (A segundo Riddihough, 1992; B. segundo Hanes e Brent, 1991.)
Stio Antp, 7 pares de bases Timina Adenina
Hlice III
577
Co-fatores para os Genes Hom-C Os genes hoemticos do complexo hometico da Drosophila especificam o destino segmentar, mas podem requerer alguma ajuda para isso. Os stios ligantes de DNA reconhecveis pelos homeodomnios das protenas Hom-C so muito semelhantes, e h alguma superposio em suas especificidades de ligao. Em 1990, Peifer e Wieschaus descobriram que o produto do gene Extradenticle (Exd) interage com vrias protenas Hom-C e pode ajudar na especificao de identidades segmentais. Por exemplo, a protena Ubx responsvel pela especificao da identidade do primeiro segmento abdominal (A1); sem a protena
Extradenticle, ela ir transformar esse segmento em A3. Alm disso, as protenas Exd e Ubx so necessrias para a regulao de decapentaplegic, e a estrutura do promotor decapentaplegic sugere que a protena Extradenticle pode dimerizar com a protena Ubx no intensificador desse gene de alvo (Raskolb e Wieschaus, 1994; van Dyke e Murre, 1994). A protena Extradenticle inclui um homeodomnio, e a protena humana PBX1 se parece com a protena Extradenticle e pode ter um papel semelhante como um co-fator para genes hometicos humanos. O produto do gene teashirt tambm pode ser um co-fator importante. Esse
fator de transcrio dedo de zinco necessrio para o funcionamento do produto Scr distinguindo entre os segmentos labial e primeiro torcico. Ele crtico para a especificao da identidade do protorcico anterior (parasegmento 3), e pode ser o gene que especifica a condio basal do complexo hometico. Se o complexo bithorax e o gene Antennapedia forem removidos, todos os segmentos se tornam protrax anterior. A funo do gene teashirt parece ser crtica para o trabalho com a protena Scr, distinguindo o trax da cabea e trabalhando atravs do tronco para impedir a formao de estruturas da cabea (Roder et al., 1992). [droso2.html]
A GERAO DA POLARIDADE DORSOVENTRAL EM DROSOPHILA

Em 1936, o embriologista E. E. Just criticou os geneticistas que achavam que podiam explicar o desenvolvimento olhando as mutaes especficas que afetam a cor dos olhos, o nmero de cerdas e a forma das asas. Ele dizia que no estava interessado no desenvolvimento das cerdas nas costas de uma mosca; ao contrrio, ele queria saber como o embrio da mosca produzia as prprias costas. Cinqenta anos mais tarde, embriologistas e geneticistas esto finalmente respondendo essa pergunta*.
A protena Dorsal: Morfgeno para a polaridade dorsoventral

A polaridade dorsoventral estabelecida pelo gradiente de um outro fator protico de transcrio, Dorsal. Em contraste com Bicoid, cujo gradiente estabelecido dentro de um sinccio, o gradiente Dorsal forma-se sobre um campo de clulas estabelecido como uma conseqncia de eventos celulares sinalizadores. A especificao do eixo dorsoventral pode ser dividida em vrias etapas. A etapa crtica a translocao da protena Dorsal do citoplasma para os ncleos das clulas ventrais durante o ciclo da dcima quarta diviso. Anderson e Nsslein-Volhard (1984) isolaram 11 genes de efeito materno, cuja ausncia de cada um est associada com a falta de estruturas ventrais (Figura 14.36). Alm disso, a ausncia de outro gene de efeito materno, cactus, causa a ventralizao de todas as clulas. As protenas codificadas por esses genes maternos so crticas para certificar que a protena Dorsal entre somente em ncleos da superfcie ventral do embrio. As etapas posteriores translocao da protena Dorsal afetam aquilo que essa protena faz para especificar as diferentes regies do embrio. Aqui, diferentes concentraes da protena Dorsal parecem especificar os diferentes destinos dessas clulas. Translocao da Protena Dorsal A protena que realmente distingue o dorso do ventre o produto protico do gene dorsal. O RNA dos genes dorsais da me colocado no interior do vulo pelas clulas
*De uma maneira que no poderia ter sido predita por Just, revela-se que alguns dos genes (como o decapentaplegic) envolvidos na regulao do nmero de cerdas ou forma das asas tambm tm funes anteriores na regulao da polaridade dorsoventral.
578
(A)
(B)
ovarianas da mosca me. Porm, a protena Dorsal no sintetizada a partir da mensagem materna antes de decorridos 90 minutos aps a fecundao. Quando essa protena traduzida, ela encontrada em todo o embrio, no somente no lado ventral ou dorsal. Como pode ento essa protena atuar como um morfgeno, se existe por todo o embrio? Em 1989, a surpreendente resposta foi encontrada (Roth et al., 1989; Rushlow et al., 1989; Steward, 1989). Enquanto a protena Dorsal pode ser encontrada em todo o blastoderma sincicial no embrio precoce de Drosophila, ela somente transportada para os ncleos celulares na parte ventral do embrio (Figura 14.37A,B). Aqui, a protena Dorsal se liga a certos genes nucleares para ativar ou suprimir suas transcries. Se a protena Dorsal no penetrar no ncleo, os genes ventralizantes (snail e twisted) no so transcritos, os genes dorsalizantes (decapentaplegic e zerknllt) no so reprimidos, e todas as clulas do embrio so especificadas como clulas dorsais. Essa hiptese de que o eixo dorsoventral da Drosophila especificado pelo transporte seletivo da protena morfognica Dorsal para o ncleo reforada pela anlise de mutaes com um fentipo inteiramente dorsalizado ou ventralizado (Figura 13.37C,D). Nesses mutantes quando todas a clulas estiverem dorsalizadas (conforme se evidencia pela sua cutcula dorsal), a protena Dorsal no penetra no ncleo de nenhuma clula. Reciprocamente, nos mutantes cujas clulas tm um fentipo ventral, a protena Dorsal encontrada em todos os ncleos.
Figura 14.36
Salvamento da larva por injeo de mRNA do tipo selvagem em ovos destinados a ter o fentipo snake. (A) Larva deformada consistindo inteiramente de clulas dorsais. Larvas como essas se desenvolvem de ovos de uma fmea homozigota para o alelo snake. (B) Aparncia tipo selvagem de larvas desenvolvendose de ovos snake que haviam recebido injees de mRNA de ovos tipo selvagem. (de Anderson e Nsslein-Volhard, 1984. Cortesia de C. Nsslein-Volhard.)
Provendo o sinal assimtrico para a translocao da protena Dorsal

Sinal do Ncleo do Ocito para as Clulas Foliculares Se a protena Dorsal for encontrada no todo do embrio, mas se for transladada somente para os ncleos das clulas ventrais, algo mais deve estar provendo os sinais assimtricos (Figura 14.38). Parece que tal sinal mediado atravs de uma complexa interao entre o ocito e suas clulas foliculares adjacentes. O epitlio folicular ao redor do ocito em desenvolvimento inicialmente simtrico, mas essa simetria
Figura 14.37
Incluso da protena Dorsal em ncleos ventrais, mas no laterais ou dorsais. (A) Mapa de destinos atravs do centro do embrio de Drosophila. A parte mais ventral vira o mesoderma, a parte superior seguinte vira o ectoderma neurognico (ventral). O ectoderma lateral e epidrmico pode ser distinguido na cutcula, e a regio mais dorsal torna-se a amnioserosa, a camada extraembrionria que envolve o embrio. (B-D) Seo transversal de embries corados com anticorpo para mostrar a presena da protena Dorsal. Em todos os casos, a mancha escura representa a protena Dorsal. (B) Um embrio tipo selvagem, mostrando a protena Dorsal nos ncleos mais ventrais. (C) Um mutante dorsalizado, mostrando ausncia de protena Dorsal em todos os ncleos. (D) Um mutante ventralizado; a protena Dorsal penetrou no ncleo de cada clula. (A de Rushlow et al., 1989; B-D de Roth et al., 1989, cortesia dos autores.)
(A)
Dorsal Amnioserosa Ectoderma dorsal Ectoderma lateral Ectoderma neurognico Mesoderma Ventral Viso lateral Seo transversal
(B)
(C)
(D)
579
(A) Clulas nutrizes ovarianas Ocito
(B)
Dorsal
(C)
Torpedo
Destino da s clulas do rsais
Ncleo Dorsal Cactus Sinal Toll Protena Toll
Clulas foliculares
Ncleo Nenhum sinal para o lado ventral mRNA gurken
Inibio da sntese das protenas Windbeutel, Nudel, Pipe
Membrana celular Sptzle Sptzle ativado Protease Easter ativada
Easter
Sntese de Windbeutel, Nudel, Pipe
Snake
Gastrulation defective
las das clu Destino
ventrais
Windbeutel
Nudel
Pipe
Envoltrio vitelnico
Ventral 1. Ncleo do ocito viaja para o lado dorsal anterior do ocito. Ele coleta mRNA cornichon e gurken Mensagens cornichon e gurken traduzidas. A protena Gurken recebida pelas protenas Torpedo durante a meia oognese 5. Clulas foliculares ventrais sintetizam protenas Windbeutel, Nudel e Pipe Protenas foliculares ventrais absorvem protenas Snake e Gastrulation-defective para realizar ciso do zimgeno Easter, produzindo protease Easter ativa, somente no lado ventral Easter cinde Sptzle, que se liga protena receptora Toll Sinal Toll causa fosforilao e degradao da protena Cactus, liberando-a de Dorsal. A protena Dorsal entra no ncleo e ventraliza a clula
Figura 14.38
6. 2.
Representao esquemtica de um modelo para a gerao da polaridade dorsoventral em Drosophila. (A) O ocito desenvolve um folculo ovariano consistindo de 15 clulas nutrizes (que suprem protenas maternas e mensagens ao ovo em desenvolvimento) e clulas foliculares. (B) O ncleo do ocito reside no local que ir tornar-se o lado dorsal. Os genes cornichon e gurken do ocito sintetizam um sinal que recebido pelo receptor produzido pelo gene torpedo das clulas foliculares. Dada a curta difusibilidade do sinal, somente as clulas foliculares mais prximas do ncleo do ocito (i.e., as clulas foliculares dorsais) recebem esse sinal. O sinal do receptor Torpedo faz com que as clulas foliculares se diferenciarem para uma morfologia dorsal caracterstica e (de alguma maneira) inibir a sntese das protenas Windbeutel, Nudel e Pipe. Portanto, essas protenas somente so produzidas pelas clulas foliculares ventrais. (C) As trs protenas foliculares ventrais so consideradas ser incorporadas na membrana vitelnica, porm, somente no lado ventral. Elas cindem os produtos dos genes snake e gastrulation defective para criar
3 a. O sinal Torpedo faz com que as clulas foliculares se diferenciem para uma morfologia dorsal 3 b. Sntese de protenas Windbeutel, Nudel e Pipe inibida nas clulas foliculares dorsais 4. Protenas Cornichon e Gurken no se difundem para o lado ventral
7.
8.
9.
uma enzima ativa que ir cindir a forma zimognica da protena Easter numa protease Easter ativa. Essa ltima, cinde a protena Sptzle para uma forma que pode se ligar ao receptor Toll (que encontrado em toda a membrana celular). Assim, somente o lado ventral recebe o sinal Toll. Esse sinal separa a protena Cactus da protena Dorsal, permitindo essa ltima ser translocada para o ncleo. A protena Dorsal entra no ncleo e ventraliza as clulas. (Segundo Schpbach et al., 1991; Roth, 1994; Hong e Hashimoto, 1995.)
580
Figura 14.39
Quimeras de linhagem germinativa produzidas trocando-se clulas do plo (precursoras de clulas germinativas) entre embries de tipo selvagem e embries de mes homozigotas para o gene torpedo. Esses transplantes produzem fmeas do tipo selvagem cujos embries vm de ovos das mes mutantes, e embries deficientes em torpedo com ovos do tipo selvagem. Os ovos das mes deficientes em torpedo produzem embries normais se os ovos se desenvolvem no ovrio do tipo selvagem, enquanto os ovos do tipo selvagem produzem embries ventralizados se os ovos se desenvolvem no ovrio mutante.
quebrada por um sinal do ncleo do ocito. Conforme j mencionado neste captulo, o ncleo do ocito est inicialmente localizado no terminal posterior do ocito, longe das clulas nutrizes. Em seguida, ele transladado anteriormente, abaixo de uma superfcie cortical do ocito, para uma posio dorsal anterior, ao longo de uma trilha de microtbulos. O ncleo do ocito ento sinaliza para as clulas foliculares a ele sobrepostas, e as dorsaliza (Montell et al., 1991; Schpbach et al., 1991). As clulas foliculares acima do ncleo assumem uma forma mais colunar que outras clulas foliculares. Essas diferenas de forma e empacotamento tornam-se acentuadas medida que o vulo amadurece, terminando por distinguir as clulas foliculares dorsais das ventrais. O sinal dorsalizante do ncleo do ocito parece ser produzido pelos produtos dos genes gurken e cornichon (Schpbach, 1987; Forlani et al., 1993). Mutaes desses genes no ocito provocam a ventralizao tanto do embrio como de suas clulas foliculares circunjacentes. (Se a mutao se der nas clulas foliculares e no no vulo, o embrio normal.) O sinal dorsalizante parece ser recebido pelas clulas foliculares atravs de um receptor codificado pelo gene torpedo. A anlise molecular mostrou que gurken codifica um homlogo do fator de crescimento epidrmico (EGF), enquanto torpedo codifica um homlogo do receptor EGF de vertebrado (Price et al., 1989; Neuman-Silberberg e Schpbach, 1995). Deficincia materna de torpedo causa a ventralizao do embrio. Alm disso, o gene torpedo ativo nas clulas foliculares ovarianas e no no embrio. Isso foi descoberto produzindo quimeras da linhagem germinativa/somtica. Schpbach (1987) transplantou precursores de clulas germinativas de embries tipo selvagem para embries cujas mes carregavam a mutao torpedo. Reciprocamente, foi feito o transplante dessas clulas de embries torpedo para embries tipo selvagem (Figura 14.39). Os resultados foram surpreendentes pois os ovos do tipo selvagem produziram embries ventralizados quando esses ovos se desenvolveram em folculos do mutante torpedo. Os ovos desse mutante foram capazes de produzir embries normais quando se desenvolviam dentro de um ovrio do tipo selvagem. Assim, diferentemente dos produtos dos genes gurken e cornichon, o gene torpedo do tipo selvagem necessrio nas clulas foliculares, no no vulo propriamente. Sinalizao das Clulas Foliculares para o Citoplasma do Ocito Os genes nudel (nd), pipe (pip) e windbeutel (wind) tambm so necessrios na clula folicular e no no ocito. Se a me no tiver algum desses trs genes, o embrio
Embrio de me tipo selvagem
Clulas germinativas deficientes em torpedo em uma fmea tipo selvagem Eixo dorsoventral
Clulas polares (precursoras das clulas germinativas)
Troca entre clulas polares Clulas germinativas tipo selvagem em uma fmea deficiente em torpedo
Ocito deficiente em torpedo no folculo tipo selvagem
Embrio de me deficiente no gene torpedo
No h eixo dorsoventral (o todo do embrio dorsal) Clulas germinativas tipo selvagem em um folculo deficente em torpedo
581
forma um fentipo totalmente dorsalizado. Esses genes so desligados pela ativao do receptor de Torpedo (Stein et al., 1991). Se forem permitidos ser ativos (como normalmente ocorre no caso de clulas foliculares ventrais), suas protenas so consideradas como incorporadas na poro ventral do envoltrio vitelnico que secretado ao redor do envoltrio adjacente ao ovo pelas clulas foliculares (Hecht e Anderson, 1992; Stein e Nsslein-Volhard, 1992). Dessa maneira, um sinal assimtrico est agora presente no envoltrio adjacente ao ovo, e dele separado pelo fluido perivitelnico. No entanto, essas protenas no so suficientes para criar o sinal para a translocao da protena Dorsal para o ncleo. Mais uma vez, retornamos ao ocito (agora um embrio) para suprir componentes essenciais que iro gerar o sinal ventral das clulas foliculares para o embrio. O complexo formado pelas protenas Nudel, Pipe e Windbeutel considerado ativar trs proteases serina secretadas pelo embrio para o fluido perivitelnico (veja Figura 14.38; Hong e Hashimoto, 1995). Essas proteases so os produtos dos genes gastrulation defective (gd), snake (snk) e easter (ea). Como a maioria das proteases extracelulares, elas so secretadas em uma forma inativa, tornando-se ativas por clivagem peptdica. Considera-se que o complexo Nudel-Pipe-Windbeutel primeiro arrasta e ativa a protena Gastrulation defective. Essa protena uma protease, e cliva a protena Snake. Essa clivagem ativa a atividade protesica da protena Snake; em seguida, a protena Snake ativada cliva a protena Easter, que cliva a protena Sptzle (Chasan et al., 1992; Hong e Hashimoto, 1995). A protena Sptzle clivada agora capaz de se ligar a um receptor na membrana celular do ocito, o produto do gene Toll. A protena Toll tambm um produto materno regularmente distribudo na membrana celular do ovo (Hashimoto, 1988, 1991). A mutao recessiva de Toll tem um fentipo dorsalizado semelhante, e injees de RNA de ovos do tipo selvagem iro restaurar a polaridade dorsoventral de ovos postos por mes Toll-/Toll-. No entanto, diferentemente do caso de snake ou dos outros 10 genes maternos, o local da injeo importante. Qualquer parte injetada do ovo torna-se a regio ventral do embrio resgatado (Anderson et al., 1985). Isso sugere que ovos Toll-/Toll- no tm um eixo dorsoventral (enquanto em snake, a regio ventral est no seu lugar normal). No desenvolvimento normal, o receptor Toll est espalhado atravs de toda a membrana celular do ocito, mas torna-se somente ativo no local onde se liga protena Sptzle, produzida no lado ventral do ovo. Dessa maneira, os receptores Toll no lado ventral do ovo esto efetuando a transduo de um sinal para o interior do ovo, ao passo que os receptores Toll do lado dorsal do ovo no o fazem. O Estabelecimento do Gradiente da Protena Dorsal SEPARAO DAS PROTENAS DORSAL E CACTUS. O desenlace crucial da sinalizao atravs do receptor Toll o estabelecimento de um gradiente da protena Dorsal. Como estabelecido esse gradiente? Parece que a protena Cactus est assentada na poro da protena Dorsal que lhe permite penetrar nos ncleos. Enquanto a protena Cactus est ligada protena Dorsal, essa permanece no citoplasma. Porm, esse complexo sistema de sinalizao est organizado para cindir a protena Cactus da protena Dorsal na parte ventral do ovo. Quando Sptzle se liga e ativa a protena Toll, essa pode ativar a quinase da protena Pelle. (A protena Tube provavelmente necessria para trazer Pelle at a membrana celular, onde pode ser ativada; Gallindo et al., 1995). A quinase da protena Pelle pode ento fosforilar a protena Cactus. Uma vez fosforilada, Cactus degradada, e a protena Dorsal pode entrar no ncleo (Kidd, 1992; Shelton e Wasserman, 1993; Whalen e Steward, 1993; Reach et al., 1996). O resultado um gradiente de localizao de Dorsal nas clulas ventrais do embrio, com as mais elevadas concentraes da protena dorsal nos ncleos mais ventrais. O processo descrito para a translocao da protena Dorsal para os ncleos muito parecido com aquele descrito no Captulo 10 para a translocao do fator de
582
(A) Embrio de Drosophila
(B) Linfcito mamfero
Sptzle Receptor Toll Membrana plasmtica
IL-1 Receptor IL-1 Membrana plasmtica
quinase pelle
Citoplasma do ocito
Quinase
Citoplasma do linfcito
Cactus
Dorsal
Dorsal
Ncleo
Ncleo
Regulao de genes ventralmente especficos
Regulao de genes das imunoglobulinas
Figura 14.40
Modelo de uma trajetria conservada para regular o transporte nuclear de fatores de transcrio em Drosophila e mamferos. (A) Em Drosophila, a protena Toll liga o sinal da protena Sptzle e ativa a regio da quinase da protena Pelle. A protena Pelle fosforila Cactus e Dorsal, fazendo com que as duas protenas se separem uma da outra. A protena Dorsal pode ento entrar no ncleo e regular a transcrio de genes ventralmente especficos. (B) Em linfcito de mamferos, o receptor IL-1 pode causar a fosforilao de IB (atravs de uma protena quinase ainda no identificada). Isso permite protena NF-B penetrar no ncleo e efetuar a transcrio de vrios genes especficos do linfcito. (Segundo Shelton e Wasserman, 1993.)
transcrio NF-B para o ncleo de linfcitos de mamferos. De fato, existe uma substancial homologia entre NF-B e Dorsal, entre IB e Cactus, entre a protena Toll e o receptor da interleucina 1 (IL-1), entre a protena Pelle e uma protena quinase associada a IL-1, e entre as seqncias de DNA reconhecidas por Dorsal e NF-B (GonzlesCrespo e Levine, 1944; Cao et al., 1996). Assim, a via bioqumica usada para especificar a polaridade dorsoventral em Drosophila parece ser a mesma que aquela usada para diferenciar linfcitos em mamferos (Figura 14.40).*
LEITURA DO GRADIENTE DA PROTENA DORSAL. O que faz a protena Dorsal
uma vez localizada nos ncleos das clulas ventrais? Olhando o mapa de destino do corte transversal pelo meio do embrio de Drosophila no dcimo quarto ciclo da diviso (veja Figura 14.37), torna-se bvio que as 16 clulas com a mais alta concentrao da protena Dorsal so as que geram o mesoderma. A prxima clula acima dessa regio gera as clulas especializadas da glia e as clulas neurais da linha mediana. As prximas duas clulas so aquelas que do origem epiderme ventral e cordo nervoso
*Lemaitre e colegas (1996) mostraram que Toll e seu ligante (Sptzle) tambm esto envolvidos na resposta imune da Drosophila s infeces fngicas.
583
Figura 14.41
Gastrulao em Drosophila. Nesta seo transversal, as clulas mesodrmicas na poro ventral do embrio se dobram para o interior, formando um tubo que em seguida se achata e forma os rgos mesodrmicos. Os ncleos esto corados por anticorpos contra a protena Twist. (de Leptin, 1991b, cortesia de M. Leptin.)
ventral, enquanto as nove clulas acima dessas produzem a epiderme dorsal. O grupo mais dorsal de seis clulas no se divide; ele gera a cobertura amnioserosa do embrio (Ferguson e Anderson, 1991). Esse mapa de destinos gerado pelo gradiente da protena Dorsal nos ncleos. Grandes quantidades especificam que as clulas sejam mesoderma, enquanto quantias menores especificam-nas para ser tecido glial ou ectodrmico (Jiang e Levine, 1993). O primeiro evento morfogentico da gastrulao de Drosophila a invaginao das 16 clulas mais ventrais do embrio (Figura 14.41). Todos os derivados mesodrmicos dos msculos, corpos gordurosos e gnadas originam-se dessas clulas (Foe, 1989). A protena Dorsal especifica essas clulas para tornarem-se mesoderma de duas maneiras. Primeiro, a protena pode ativar genes especficos que criam o fentipo mesodrmico. Trs dos genes alvo de Dorsal so twist, snail e rhomboid (Figura 14.42). Esses genes so transcritos somente nos ncleos da clulas ventrais que receberam altas concentraes da protena Dorsal, pois esses intensificadores no se
Figura 14.42
Subdiviso do eixo dorsoventral pelo gradiente de protena Dorsal nos ncleos. A protena Dorsal ativa os genes zigticos rhomboid, twist e snail de acordo com sua concentrao nuclear. A protena Snail, formada mais ventralmente, inibe a transcrio da protena Rhomboid. A protena Dorsal inibe a expresso de tolloid, decapentaplegic e zerknllt na regio ventral. Diferentes concentraes da protena Zerknllt determinam os destinos das clulas dorsais. (Segundo Steward e Govind, 1993.)
Padronizao dorsal (represso) dorsal
zerknllt Dorsal
Amnioserosa Ectoderma dorsal
Padronizao ventral (ativao) dorsal Ativao
Inibio tolloid dpp zerknllt
tolloid decapentaplegic
rhomboid Inibio Ectoderma lateral
twist
snail
rhomboid Ectoderma neurognico twist snail Ventral Mesectoderma Mesoderma
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ligam protena Dorsal com alta afinidade (Thisse et al., 1988; Jiang et al., 1991; Pan et al., 1991). A protena Twist ativa genes mesodrmicos, enquanto a protena Snail reprime genes no-mesodrmicos em particular que poderiam, de outro modo, ser ativos. O gene rhomboid interessante porque ativado por Dorsal mas reprimido por Snail. Assim, a expresso de rhomboid no encontrada nas clulas mais ventrais (i.e., as precursoras do mesoderma), mas expressa nas clulas adjacentes ao mesoderma que formam o neuroectoderma presuntivo (veja Figura 14.42; Jiang e Levine, 1993). Tanto snail como twist so necessrios para produzir o fentipo mesodrmico e gastrulao apropriada (Leptin et al., 1991a). A borda aguda entre as clulas mesodrmicas e as clulas elas adjacentes que geram as clulas gliais produzida pela presena de produtos dos genes snail e twist nas clulas mais ventrais (Kosman et al., 1990). Em mutantes de snail, as clulas mais ventrais ainda tm o gene twist ativado, e parecem-se com as clulas mais laterais (Nambu et al., 1990). A protena dorsal tambm determina o mesoderma diretamente. Alm de ativar genes estimuladores do mesoderma (twist e snail), ela inibe diretamente os genes dorsalizantes zerknllt (zen) e decapentaplegic (dpp). Assim, nas mesmas clulas, a protena Dorsal pode agir como um ativador de certos genes e um repressor de outros. A opo se funciona como um ativador ou um repressor, depende da estrutura dos
Figura 14.43
Ativao e represso pela protena Dorsal. Um intensificador em um gene ativado pela protena Dorsal (como twist ou snail) tem mltiplos stios de ligao de baixa afinidade para a protena Dorsal e nenhum stio ligante de DSP1. Intensificadores naqueles genes que so reprimidos por Dorsal contm tanto stios ligantes de Dorsal, como um stio ligante de DSP1. (A) Na ausncia da protena Dorsal (i.e., naquelas futuras clulas ectodrmicas nas quais a protena Dorsal no penetrou no ncleo) os genes twist e snail no so ativados e genes como zerknllt no so reprimidos. (B) Reciprocamente, na presena da protena Dorsal no ncleo, os genes twist e snail tornam-se ativos e o gene zerknllt desligado. (Segundo Ip, 1995.)
Embrio de Drosophila
Dorsal
(A)
Co-repressores putativos que ligam seqncias ricas em AT de AT1-3
DSP1
Ectoderma dorsal
Sem twist ou snail
Dorsal Neuroectoderma (B)
Inibio
Mesoderma
Ativao twist, Snail Stios de ligao de Dorsal
Gradiente de Dorsal nuclear Ventral
585
intensificadores dos genes. O intensificador zen contm um stio de ligao para uma protena chamada DSP1 (protena de comutao dorsal 1). Essa protena encontrada em todo o embrio. Quando a protena Dorsal est ausente, no parece ter efeito algum sobre a transcrio. Porm, quando Dorsal tambm est presente no stio do intensificador, ela converte a funo ativadora de Dorsal em funo repressora (Figura 14.43; Lehming et al., 1994; Ip, 1995). Mutantes de dorsal expressam genes dpp e zen atravs do embrio (Rushlow et al., 1987), e embries deficientes em dpp e zen deixam de formar estruturas dorsais (Irish e Gelbart, 1987). Assim, em embries tipo selvagem, os precursores mesodrmicos expressam twist e snail (mas no zen e dpp); precursores da epiderme dorsal e da amnioserosa expressam zen e dpp, mas no twist ou snail; precursores da glia (mesectoderma) expressam somente snail; enquanto os precursores neuroectodrmicos laterais no expressam qualquer um desses quatro genes (Kosman et al., 1991; Ray et al., 1991). Assim, em conseqncia das respostas ao gradiente da protena Dorsal, o eixo fica subdividido em mesoderma, mesectoderma, ectoderma neurognico, epiderme e amnioserosa. [droso3.html]
PRIMRDIOS DE RGOS E EIXOS O modelo de coordenadas cartesianas e a especificao dos primrdios dos rgos
Os eixos ntero-posterior e dorsoventral de embries de Drosophila formam um sistema coordenado que pode ser empregado para especificar posies no embrio. Teoricamente, clulas que inicialmente so equivalentes quanto a seu potencial de desenvolvimento podem responder s suas coordenadas expressando diferentes conjuntos de genes. Isso foi visto na formao dos rudimentos da glndula salivar (Panzer et al, 1992). Primeiro, glndulas salivares s se formam na faixa de clulas definidas pelo gene Sex combs reduced (Scr) ao longo do eixo ntero-posterior (parasegmento 2). Glndulas salivares no so formadas em mutantes deficientes em Scr. Alm disso, se Scr motivado a funcionar atravs de todo o embrio, os genes das glndulas salivares so expressos em uma faixa ventrolateral ao longo da parte mais longitudinal do embrio. A posio da glndula salivar ao longo do eixo dorsoventral reprimida tanto por Decapentaplegic como por Dorsal. Essas protenas inibem a formao de glndulas salivares tanto dorsal como ventralmente. Assim, a glndula salivar se forma na interseo da banda de expresso vertical de Scr (segundo parasegmento) e a regio horizontal no meio da circunferncia do embrio que no apresenta produtos de genes decapentaplegic nem dorsal (Figura 14.44). As clulas que formam a glndula salivar so direcionadas a assim o fazer pela atividade de genes que intersectam os eixos ntero-posterior e dorsoventral. Uma situao semelhante vista em tecidos encontrados em todos os segmentos da mosca. Neuroblastos se formam de 10 agregados de 4 a 6 clulas cada um, que se formam duas vezes em cada segmento na faixa do neuroectoderma da linha mediana do embrio (Skeath e Carroll, 1992). O potencial para formar clulas neurais conferido a essas clulas pela expresso de genes proneurais do complexo de genes achaetescute: achaete (ac), scute (sc) e lethal of scute (lsc). As clulas em cada agregado interagem (nos modos discutidos nos Captulos 8 e 17) para gerar uma nica clula neural do agregado. Skeath e colegas (1993) mostraram que o padro de transcrio de achaete e de scute imposto por um sistema de coordenadas. Sua expresso reprimida pelas protenas Decapentaplegic e Snail ao longo do eixo dorsoventral, enquanto reforo positivo pelos genes pair-rule ao longo do eixo ntero-posterior causa sua repetio em cada meio-segmento. O intensificador reconhecido por essas protenas especificadoras do eixo fica entre os genes achaete e scute e parece regular ambos. muito provvel, portanto, que as posies dos primrdios dos rgos so especificadas por toda a mosca atravs de um sistema de coordenadas bidimensional baseado na interseo dos eixos ntero-posterior e dorsoventral.
Scr Ativa Inibe dpp
Inibe grupo dl, spitz
Figura 14.44
Sistema de coordenadas cartesianas para expresso de genes que originam as glndulas salivares. Os genes so ativados pelo produto protico do gene hometico Sex combs reduced ao longo do eixo ntero-posterior, e so inibidos nas regies marcadas por produtos dos genes decapentaplegic e dorsal ao longo do eixo dorsoventral. Isso permite que as glndulas salivares se formem na linha mediana do segundo parasegmento do embrio. (Segundo Panzer et al., 1992.)
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Resumo: Alguns princpios do desenvolvimento da Drosophila

Estamos comeando a aprender como o genoma influencia a construo do organismo. Os genes regulando a formao de padres em Drosophila operam de acordo com certos princpios. Existem morfgenos - tais como Bicoid e Dorsal cujos gradientes determinam a especificao de diferentes tipos celulares. Esses morfgenos podem ser fatores de transcrio ou atuar como molculas sinalizadoras. Existe uma ordem temporal pela qual diferentes classe de genes so transcritos, e os produtos de um gene freqentemente regulam a expresso de outro gene. Em Drosophila, limites de expresso de genes podem ser criados pela interao entre fatores de transcrio e seus alvos gnicos. Aqui, os fatores de transcrio transcritos anteriormente regulam a expresso do prximo conjunto de genes. O controle da traduo extremamente importante no embrio precoce; mRNAs localizados so crticos para a padronizao do embrio. Destinos celulares individuais no so imediatamente definidos. Em seu lugar, h uma especificao gradativa onde um dado campo dividido e subdividido, finalmente regulando os destinos de clulas individuais. Estudos genticos no embrio de Drosophila desvendaram numerosos genes que so responsveis pela especificaes dos eixos ntero-posterior e dorsoventral. Estamos longe de entender completamente a formao de padres formadores em Drosophila, mas estamos muito mais conscientes de sua complexidade do que estvamos h cinco anos atrs. As mutaes de Drosophila nos forneceram nossos primeiros vislumbres dos mltiplos nveis de regulao de padres em um organismo complexo e permitiram o isolamento desses genes e seus produtos. Alm disso, conforme veremos nos captulos subseqentes, esses genes podem proporcionar pistas para um mecanismo geral de formao de padres usado em todo o reino animal.
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Especificao do destino celular por interaes clula-clula progressivas
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O estudo da funo dos genes na ontogenia um campo da fisiologia do desenvolvimento. Isso no quer dizer que o geneticista ser excludo na resoluo desse problema - ele se tornar um embriologista gentico experimental. Aps uma longa jornada onde algumas vezes ele se distanciou de seus colegas biologistas, ele volta para casa com alguns novos conceitos e instrumentos. CURT STERN (1936) Nos mantemos eretos e andamos com partes de nosso corpo que poderiam ser usadas para raciocinar se elas tivessem se desenvolvido em outras partes do embrio. HANS SPEMANN (1943)
ficao do eixo podem ser causadas por interaes de substncias plasmticas especficas dentro de uma clula sincicial. Somente mais tarde ocorrem interaes clula-clula que fixam o destino celular. Mas, a maioria dos tipos de organismos no possui o estgio sincicial na embriognese precoce. Em muitas espcies, incluindo a maioria dos vertebrados, as clulas so especificadas pelas suas interaes com clulas vizinhas.
O LTIMO CAPTULO, observamos que a determinao celular e a especi-
Desenvolvimento regulativo
Em deuterostomatas, tais como ourio-do-mar e vertebrados, o destino da clula depende de sua posio no embrio e no da parte do citoplasma que ela adquiriu. Sidney Brenner (Citado em Wilkins, 1993) observou que o desenvolvimento animal pode se dar de duas maneiras. Alguns organismos so especificados predominantemente no estilo Europeu; ou seja, cada clula determinada por quem eram seus ancestrais. A linhagem o fator importante. Inversamente, os blastmeros da maioria dos vertebrados so especificados predominantemente no estilo Americano; existe uma grande mistura de clulas e cada clula determinada pela natureza de suas vizinhas. Toda clula se inicia com um potencial similar e se desenvolve de acordo com o que encontra. Nesses embries, em pelo menos parte da clivagem, cada clula capaz de se desenvolver no embrio todo se ela for separada das outras, e as clulas remanescentes so capazes de alterar seu destino para produzir o embrio completo (como na formao de gmeos). Esse tipo de comprometimento chamado especificao condicional (ou dependente), e d origem ao desenvolvimento regulativo. Durante o desenvolvimento autnomo, o eixo do embrio determinado pela distribuio de materiais em cada um dos blastmeros. Entretanto, no desenvolvimento regulativo, os eixos se formam a partir de interaes das clulas constituintes. Neste captulo acompanharemos os experimentos que se iniciaram h mais de um sculo para entender como se d a especificao do sistema nervoso nos anfbios.
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Testando a teoria do plasma germinativo

August Weismann: A teoria do plasma germinativo A descoberta da determinao regulativa tem suas razes no insucesso das teorias do desenvolvimento em mosaico formuladas na Alemanha no fim do sculo dezenove. Em 1883, August Weismann comeou propondo uma teoria que integrava fenmenos biolgicos diversos como hereditariedade, desenvolvimento, regenerao, reproduo sexual e evoluo por seleo natural. Esse modelo mecnico para a diferenciao celular foi chamado de teoria do plasma germinativo. Baseado no escasso conhecimento sobre fertilizao existente na poca, Weissmann audaciosamente props que a contribuio cromossmica do espermatozide e do vulo ao novo organismo era igual, no s quantitativa como qualitativamente. Ainda mais, foi postulado que os cromossomos transportavam os potenciais herdados pelo novo organismo e foram considerados como a base da continuidade entre geraes.* Entretanto, era considerado que nem todos os determinantes dos cromossomos entravam em cada clula do embrio; em lugar de dividir-se igualmente, a hiptese era que os cromossomos se dividiam de tal maneira que diferentes determinantes nucleares entravam em clulas diferentes. Enquanto o ovo fertilizado estaria levando a carga completa de determinantes, certas clulas conteriam os determinantes formadores do sangue e outras os determinantes formadores dos msculos. Somente os ncleos daquelas clulas destinadas a se tornarem gametas (as clulas germinativas) reteriam, como se pensava, todos os tipos de determinantes. Os ncleos de todas as outras clulas teriam somente uma frao dos tipos determinantes originais. A hiptese de Weismann propunha a continuidade do plasma germinativo e a diversidade das linhagens somticas. A diferenciao era devida segregao de determinantes nucleares para vrios tipos de clulas. Os cromossomos, apesar de iguais em todas as clulas, seriam desiguais em suas qualidades. Somente a linhagem das clulas germinativas manteria todos os determinantes, e essa linhagem seria totalmente independente das clulas somticas. Assim, no haveria herana de caractersticas adquiridas pelas clulas somticas. Weismann conseguiu suporte para esse modelo, cortando a cauda de camundongos recm-nascidos por 19 geraes. Os animais de cada gerao subseqente tinham caudas de tamanho normal, indicando que a linhagem germinativa estava protegida contra os insultos ao tecido somtico.** A teoria do plasma germinativo de Weismann est ilustrada na Figura 15.1. A teoria enfatiza a continuidade e a imortalidade da linhagem germinativa em contraste com a natureza temporria do organismo adulto, mostrando, como notado pelo fisiologista Michael Foster, que o corpo animal na realidade um veculo para os vulos. E. B. Wilson, que considerava seu extraordinrio livro, The Cell in Development and Inheritance (1896), como oriundo da hiptese de Weismann, tambm reconheceu as implicaes desse esquema:
* Os embriologistas pensavam nesses termos cerca de 15 anos antes da redescoberta do trabalho de Mendel. Weismann (1892, 1893) tambm especulou que esses determinantes nucleares da herana funcionavam elaborando substncias que se tornavam ativas no citoplasma. ** Nessa poca, o ponto de vista alternativo mais importante era o da pangnese. Essa hiptese, defendida como uma hiptese provisria por Charles Darwin, propunha que cada clula somtica continha partculas (pangenes) que migravam de volta para as clulas sexuais para permitir a transmisso das caractersticas daquelas clulas. De acordo com essa teoria, Weismann deveria ter obtido camundongos com caudas mais curtas. Mais recentemente, Thomas Jukes, comentando os resultados de Weismann citou a intuio de Hamlet que existe uma divindade que d forma aos nossos fins, no importa a crueza com que os fazemos. Deve ser notado que a independncia da linhagem germinativa em relao somtica no absoluta em todos os organismos. Em esponjas, platelmintos, hidrozorios e tunicados coloniais, as clulas germinativas podem se desenvolver de tecidos somticos, e mudanas genticas feitas nesses tecidos somticos podem ser herdados (Berrill e Liu, 1948; Buss, 1987).
CAPTULO 15 Especificao Condicional
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Clulas somticas
Diferenciao das clulas somticas
A clula germinativa
Continuidade das clulas germinativas
Figura 15.1
A teoria da herana de Weismann. A clula germinativa d origem s clulas somticas diferenciveis do corpo (indicadas em cor), como tambm s novas clulas germinativas. (de Wilson, 1986.)
A morte de um indivduo no envolve soluo de continuidade na srie de divises celulares pelas quais a vida da raa continua. O indivduo morre, verdade, mas as clulas germinativas continuam, levando com elas as tradies da raa da qual se originaram e as repassando aos seus descendentes. Wilhelm Roux: Desenvolvimento em mosaico Weismann intuiu que os cromossomos so os portadores da informao herdada para o desenvolvimento. Mais importante que isso, ele props uma hiptese de desenvolvimento que podia ser testada imediatamente. Weismann dizia que quando a primeira diviso da clivagem separava a futura metade direita do embrio da futura metade esquerda, haveria uma separao dos determinantes direitos dos determinantes esquerdos nos blastmeros resultantes. Essa afirmao foi testada por Wilhelm Roux, um jovem embriologista alemo. Em 1888, Roux publicou o resultado de uma srie de experimentos nos quais usou embries de r de 2 e 4 clulas, e destruiu algumas das clulas com uma agulha aquecida. A hiptese de Weismann predizia a formao de embries pela metade, direita ou esquerda; Roux obteve mrulas incompletas (metades), justamente como havia sido previsto por Weismann (Figura 15.2). Essas se desenvolveram em nurulas tendo somente um lado completo, direito ou esquerdo, com uma dobra medular, uma fossa auditiva e assim por diante. Portanto, ele concluiu que o embrio da r era um mosaico de partes autodiferenciveis e era provvel que cada clula estivesse recebendo um conjunto especfico de determinantes e se diferenciava de acordo com isso. Com essa srie de experimentos, Roux inaugurou seu programa de mecnica do desenvolvimento (Entwicklungsmechanik), um enfoque fisiolgico experimental da embriologia (veja Sander, 1991a,b). Nunca mais, insistia Roux, ser a embriologia submetida por estudos evolucionrios. Pelo contrrio, a embriologia assumiria seu papel como uma cincia experimental independente.
Figura 15.2
O desenvolvimento em mosaico, como Roux tentou mostrar. A destruio de uma clula de um embrio de r com 2 clulas resulta no desenvolvimento de somente uma metade do embrio.
Agulha quente Tecido morto Tecido vivo Meio embrio
Clivagem
Ovo fertilizado de r
Estgio de 2 clulas
Estgio de blstula
Metade destruda (tecido morto) Estgio de nurula
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(A) Larva pluteus normal
(B) Plutei desenvolvidas de clulas isoladas de embrio de 4 clulas
Figura 15.3
Demonstrao do desenvolvimento regulativo por Driesch. (A) Uma larva pluteus normal. (B) Plutei menores, mas normais, cada uma delas se desenvolveu a partir de um blastmero de um embrio dissecado de 4 clulas. (Todas as larvas esto desenhadas na mesma escala.) (De acordo com Hrstadius e Wolsky, 1936.) Note que as larvas derivadas dessa maneira no so idnticas, apesar de sua capacidade de gerar todos os tipos celulares necessrios. Essas variaes tambm esto presentes nos ourios-do-mar adultos formados dessa maneira (Marcus, 1979).
Hans Driesch: Desenvolvimento Regulativo Ningum mais do que Hans Driesch apreciava a abordagem experimental embriologia. A meta de Driesch era explicar o desenvolvimento em termos das leis da fsica e da matemtica. Sua investigao inicial era semelhante de Roux. Os experimentos de Roux eram, tecnicamente, estudos de defeitos, que respondiam questo de como os blastmeros remanescentes de um embrio se desenvolveriam quando uma parte deles era destruda. Driesch (1892) procurou estender essa pesquisa realizando experimentos de isolamento. Blastmeros de ourio-do-mar eram separados uns dos outros por agitao vigorosa (ou, mais tarde, colocando-os em gua do mar sem clcio). Para a surpresa de Driesch, cada um dos blastmeros de um embrio de 2 clulas se desenvolveu em uma larva completa. Analogamente, quando Driesch separou os blastmeros de embries de 4 e 8 clulas, algumas das clulas produziram larvas plutei inteiras (Figura 15.3). Esse era um resultado drasticamente diferente daquele previsto por Weismann e Roux. Em lugar de se autodiferenciar como sua futura parte embrionria, cada blastmero podia regular seu desenvolvimento de modo a produzir um organismo completo. Essa era a primeira situao experimentalmente observvel do desenvolvimento regulativo. O desenvolvimento regulativo tambm foi demonstrado em outro experimento de Driesch. Em ovos de ourio-do-mar, os primeiros dois planos de clivagem so meridionais passando pelos plos animal e vegetal, enquanto que a terceira diviso equatorial, dividindo o embrio em quatro clulas superiores e quatro inferiores (veja Figura 5.3). Driesch (1893) mudou a direo da terceira clivagem comprimindo suavemente os embries precoces entre duas placas de vidro, por conseguinte, fazendo com que a terceira diviso fosse meridional tal como as duas clivagens precedentes. Aps a diminuio da presso, a quarta diviso foi equatorial. Esse procedimento relocou os ncleos, de modo que um ncleo normalmente localizado na regio destinada a formar o endoderma estivesse agora na regio ectodrmica presuntiva. Alguns ncleos que
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8 clulas
Vista superior
16 clulas
8 clulas
Vista superior
16 clulas
Vista lateral Placa de vidro Vista lateral
(A) CLIVAGEM NORMAL
(B) CLIVAGEM SOB PRESSO
Figura 15.4
Experimento de Driesch com placas de presso para alterar a distribuio dos ncleos. (A) Clivagem normal de embries de ourio-do-mar com 8 a 16 clulas, com vistas do plo animal (seqncia superior) e lateral (seqncia inferior). (B) Planos de clivagem anormal formados sob presso, como observados do plo animal e lateralmente. (De acordo com Huxley e deBeer, 1934.)
normalmente produziriam estruturas dorsais agora eram encontrados em clulas ventrais (Figura 15.4). Se a segregao dos determinantes nucleares tivesse ocorrido (como havia sido proposto por Wiesmann e Roux), o embrio resultante deveria estar estranhamente desorganizado. Entretanto, Driesch obteve larvas normais desses embries. Ele concluiu que A posio relativa de um blastmero dentro do conjunto provavelmente definir de um modo geral o que com ele originar. As conseqncias desses experimentos foram monumentais para a embriologia e pessoalmente para Driesch. Primeiro, Driesch havia demonstrado que a potncia prospectiva de um blastmero isolado (aqueles tipos de clulas que ele tinha a possibilidade de formar) maior do que seu destino prospectivo (os tipos de clulas que normalmente originaria no curso inalterado do seu desenvolvimento). De acordo com Weismann e Roux, a potncia prospectiva e o destino prospectivo de um blastmero deveriam ser idnticos. Segundo, Driesch concluiu que o embrio do ourio-domar era um sistema eqipotencial harmonioso, porque todas essas partes potencialmente independentes funcionavam juntas para formar um nico organismo. Terceiro, ele concluiu que o destino de um ncleo dependia unicamente da sua localizao dentro do embrio. Driesch (1894) hipotetizou uma srie de eventos onde o desenvolvimento prosseguia por interaes do ncleo e do citoplasma: Como contm um ncleo, cada clula carrega durante a ontognese a totalidade dos primrdios; como ela contm um corpo celular citoplasmtico especfico, est especificamente apta a responder somente a efeitos especficos... Ento quando o material nuclear ativado, sob seu controle, o citoplasma de uma clula que a princpio havia influenciado o ncleo por sua vez modificado, e ento est estabelecida a base para um novo processo elementar, o qual no somente o resultado mas tambm a causa. Esse surpreendente conceito moderno de interao ncleo-citoplasma e equivalncia nuclear, por fim, fez Driesch abandonar a cincia. Ele no podia mais imaginar o embrio como uma mquina fsica, porque esse podia ser subdividido em partes, cada uma capaz de reformar o organismo todo. Em outras palavras, Driesch passou a acreditar que o desenvolvimento no podia ser explicado por foras fsicas. Ele foi levado
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Tabela 12.2 Procedimentos experimentais e resultados de Roux e Driesch 151 Estabilizao de RNAs mensageiros especficos por hormnios Pesquisador Roux (1888) Driesch (1892) Organismo R (Rana fusca) Ourio-do-mar (Echinus microtuberculatus) Ourio-do-mar (Echinus e Paracentrotus) Tipo de experimento Defeito Isolamento Concluso Desenvolvimento em mosaico (autnomo) Desenvolvimento regulativo (condicional) Desenvolvimento regulativo (condicional) Interpretao em relao potncia e destino Potncia prospectiva igual ao destino prospectivo Potncia prospectiva maior que o destino prospectivo Potncia prospectiva maior que o destino prospectivo
Dreisch (1893)
Recombinao
a invocar uma fora vital, entelechy (fora dirigida por uma meta interna), para explicar como prosseguia o desenvolvimento. Essencialmente, ele acreditava que o embrio era imbudo de uma psique interna e sabedoria para conseguir suas metas, apesar dos obstculos colocados no seu caminho por embriologistas. Incapaz de explicar seus resultados pela Fsica de sua poca, Driesch renunciou ao estudo da fisiologia do desenvolvimento e se tornou um professor de filosofia, proclamando o vitalismo at sua morte em 1941. Outros, especialmente Oscar Hertwig (1894), puderam incorporar os experimentos de Driesch em uma embriologia experimental mais sofisticada.* As diferenas entre os experimentos de Roux e os de Driesch esto resumidas na Tabela 15.1. A diferena entre experimentos de isolamento e de defeitos e a importncia das interaes fornecidas pelos blastmeros destrudos foi enfatizada em 1910, quando J. F. McClendon mostrou que blastmeros isolados de r se comportam exatamente como clulas isoladas de ourio-do-mar. Portanto, o desenvolvimento em mosaico dos primeiros dois blastmeros da r no estudo de Roux foi um artefato do experimento de defeito. Alguma coisa dentro do blastmero morto ou sobre ele ainda informava s clulas vivas que ele existia. Ns j vimos que blastmeros precoces de mamferos tm um desenvolvimento do tipo regulativo. Como discutimos no Captulo 5, cada blastmero isolado de uma massa de clulas internas do camundongo capaz de gerar um animal inteiro e frtil. A habilidade de dois ou mais embries precoces de camundongo se fundirem em um embrio normal (veja Figura 5.28) e o fenmeno de gmeos idnticos (veja Figura 5.27) tambm atestam a habilidade regulativa dos blastmeros de mamferos. Portanto, mesmo que Weismann e Roux tenham sido pioneiros no estudo da fisiologia do desenvolvimento, sua proposio que a diferenciao causada pela segregao de determinantes nucleares logo se mostrou incorreta.
*Esses experimentos reforaram dentro da embriologia um tipo de filosofia mecanstica chamada organicismo holstico. Essa filosofia se refere aos conceitos que (1) as propriedades do todo no podem ser previstas unicamente a partir das propriedades das partes componentes, e (2) as propriedades das partes so informadas pela sua relao ao todo. Como uma analogia, o significado de uma sentena obviamente depende do significado de suas partes componentes, as palavras. Entretanto, o significado de cada palavra depende da sentena toda. Na sentena Os lderes do partido estavam divididos no palanque, o significado possvel de cada substantivo e verbo limitado pelo significado da sentena toda e pelas relaes com outras palavras dentro da sentena. Similarmente, uma clula no embrio desenvolve seu fentipo dependendo de suas interaes dentro do embrio inteiro. O conceito materialista oposto o reducionismo, que mantm que as propriedades do todo podem ser conhecidas se todas as propriedades das partes forem conhecidas. Tradicionalmente, a embriologia tem apoiado o organicismo holstico, enquanto que a gentica tem se caracterizado como sendo uma disciplina reducionista (Haraway, 1976; Roll-Hansen, 1978; Allen, 1985; Tauber e Sarkar, 1992; Gilbert e Faber, 1996). Driesch se tornou um conhecido opositor do Nazismo, e foi um dos primeiros professores no judeus a se aposentar foradamente quando Hitler assumiu o poder (Harrington, 1996).
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Sven Hrstadius: Potncia e gradientes em ocitos Mas Driesch tambm no estava totalmente correto. Como vimos no captulo anterior, existem numerosos animais que desenvolvem-se principalmente como um mosaico de partes autodiferenciadas. Mais importante, no entanto, que mesmo o embrio do ourio-do-mar no uma coleo de clulas completamente eqipotenciais. Em uma srie de experimentos realizados entre 1928 e 1935 o biologista sueco Sven Hrstadius separou, com finas agulhas de vidro, vrias camadas de embries precoces de ouriodo-mar, e observou seu desenvolvimento subseqente (Hrstadius, 1928, 1939). Quando o embrio de 8 clulas foi dividido meridionalmente atravs do plo animal ao vegetal, as duas metades produziram larvas plutei, exatamente como Driesch havia previsto. Mas quando embries no mesmo estgio foram divididos equatorialmente (separando os plos animal e vegetal), nenhuma das partes se desenvolveu em uma larva completa (Figura 15.5). Em lugar disso, a metade animal se tornou uma bola vazia de clulas epidrmicas ciliadas (chamada uma dauerblstula), e a metade vegetal se desenvolveu em um embrio ligeiramente anormal com um intestino expandido. Hrstadius conseguiu duplicar esses resultados cortando pela metade vulos no fertilizados de ourio-do-mar e fertilizando as metades separadamente. No ourio-domar, os fragmentos dos ovos (merognias) podem se dividir e se desenvolver mesmo tendo somente um ncleo haplide. Se o espermatozide penetrar na metade que no tem o ncleo haplide do vulo, a merognia ainda se desenvolver (Figura 15.6). Quando o vulo foi partido meridionalmente, embries normais se formaram das duas metades do vulo. Entretanto, quando o ocito foi cortado equatorialmente, a fertilizao produziu uma bola animal ciliada ou um embrio com um intestino expandido a partir do plo vegetal. Portanto, mesmo em embries do ourio-do-mar parece haver certo grau de mosaicismo, pelo menos ao longo do eixo animal-vegetal. Isso foi confirmado por Maruyama e colaboradores (1985) que, analogamente, dividiram meridionalmente ou equatorialmente vulos no fertilizados de ourio-do-mar. Eles observaram que ao separar a metade animal da metade vegetal, somente a metade vegetal fertilizada era capaz de formar micrmeros e gastrular. Portanto, os determinantes que permitem a formao de micrmeros e a gastrulao parecem estar localizados na poro vegetal do vulo. [regul1.html]
(A) Plo animal (B) Plo animal
Agulha de vidro
Plo vegetal
Plo vegetal
Figura 15.5
Clios
Dauerblstula (blstula permanente)
Larva (levemente anormal)
Larva (pequena, mas normal)
Assimetria precoce no embrio de ourio-domar. (A) Quando os 4 blastmeros do plo animal so separados dos quatro blastmeros do plo vegetal e permitido que cada metade se desenvolva, as clulas animais formam uma dauerblstula ciliada e as clulas vegetativas formam uma larva com o intestino expandido. (B) Quando o embrio de 8 clulas dividido de modo que cada metade contenha clulas animais e vegetativas, desenvolvem-se larvas pequenas com aparncia normal.
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Figura 15.6
(A)
Assimetria no ovo de ourio-do-mar. (A) Quando Hrstadius dividiu o ovo do ourio-do-mar meridionalmente, de modo que ambas merognias contivessem citoplasma vegetal e animal, se desenvolveram pequenas plutei com aparncia normal. (B) Quando o vulo do ourio-do-mar foi dividido em metades animal e vegetal (merognias) e as metades foram fertilizadas por espermatozides, a metade animal se desenvolveu em uma dauerblstula ciliada, e a metade vegetal produziu uma pluteus com um intestino expandido.
Plo animal
(B)
Plo animal
Plo vegetal
Plo vegetal
Merognias Fertilizao
Merognias Fertilizao
Dauerblstula (blstula anormal)
Larva (quase normal)
REGULAO DO DESTINO CELULAR EM EMBRIES DE CLIVAGEM TARDIA.
Essas observaes levaram Hrstadius a realizar algumas das experincias mais excitantes da histria da embriologia. Primeiro, Hrstadius (1935) acompanhou o desenvolvimento normal de cada uma das 6 camadas de clulas do embrio de ourio-domar com 64 clulas. Como mostrado na Figura 15.7A, as clulas animais e a primeira camada vegetativa normalmente produzem o ectoderma; a segunda camada vegetativa d origem ao endoderma e parte do mesoderma larval; e os micrmeros geram o esqueleto mesodrmico. Em seguida, Hrstadius removeu a membrana de fertilizao dos embries de 64 clulas, separou as camadas com finas agulhas de vidro e as recombinou de vrias maneiras. O hemisfrio animal isolado se tornou uma bola de clulas ectodrmicas ciliadas (Figura 15.7B). Essa dauerbstula ciliada foi chamada de animalizada. Quando Hrstadius recombinou um hemisfrio animal isolado com a camada veg1 (Figura 15.7C), a larva resultante estava menos animalizada. O desenvolvimento ciliar foi suprimido, e foi formada uma poro do intestino. Entretanto, quando o hemisfrio animal foi combinado com a camada veg2 (Figura 15.7D), desenvolveu-se uma larva pluteus normal. Nessa combinao, as clulas veg2, que normalmente formam somente o arquntero e seus derivados, esto agora formando tambm as estruturas esquelticas. Analogamente, quando a metade animal foi combinada com somente os micrmeros (Figura 15.7E), uma pequena pluteus normal foi formada, mas nesse caso o endoderma foi completamente derivado das clulas animais. Nesse caso, o intestino foi formado por clulas que normalmente teriam dado origem ao ectoderma ciliado. Esses experimentos mostraram que as clulas animais tm potencial gentico para se tornarem clulas do intestino mesmo no estgio de 64 clulas. Formao de um organismo integrado: Restringindo a potncia das clulas vizinhas Driesch se referiu ao embrio como um sistema harmnico eqipotencial porque cada uma das clulas que o compem abdica da maior parte de seu potencial para fazer parte de um nico organismo completo. Cada clula poderia sozinha se tornar um
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(A) Desenvolvimento normal Hemisfrio animal
Figura 15.7
Micrmeros Larva pluteus Dauerblstula
(B) Somente metade animal
Demonstrao da regulao em ourio-do-mar por Hrstadius. (A) Destino de cada camada de clulas do embrio de ourio-do-mar de 64 clulas, desde a blstula at o estgio de larva pluteus. As diferentes camadas de clulas esto marcadas como na Figura 6.1. (B) Destino da metade animal isolada. (C) Recombinao da metade animal com a camada de clulas veg1. (D) Recombinao da metade animal com a camada de clulas veg2. (E) Recombinao da metade animal mais os micrmeros. Em cada caso, o destino original das clulas foi alterado pelos novos vizinhos. (De acordo com Hrstadius, 1939.)
Animalizao completa (C) Metade animal e veg1
Animalizao (incompleta) (D) Metade animal e veg2
Larva reconhecvel; mesoderma da camada veg2 (E) Metade animal e micrmeros
Larva reconhecvel; endoderma das camadas animais
animal completo, mas no o faz. O que fazia as clulas cooperarem em lugar de se tornarem entidades autnomas? No caso dos caracis e tunicados, a resposta era simples. O citoplasma materno no permite que cada clula se torne autnoma; cada clula pode somente se desenvolver em uma poro do embrio. Em ourio-do-mar e outros embries que mostram regulao, a resposta mais complexa. Evidncia recente sugere que o sistema harmnico eqipotencial causado por eventos de induo negativa que restringem mutuamente o destino de clulas vizi-
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Mesmeros
Macrmeros
Micrmeros
Figura 15.8
Sumrio das indues inibitrias na blstula do ourio-do-mar. Setas duplas ilustram as interaes mutuamente restritivas entre clulas adjacentes. (De acordo com Henry et al., 1989.)
nhas. Jon Henry e colegas no laboratrio de Rudolf Raff (1989) mostraram que se forem isolados pares de clulas do hemisfrio animal pigmentado de um embrio de ourio-do-mar com 16 clulas, essas clulas podem originar componentes tanto ectodrmicos como mesodrmicos. Entretanto, sua capacidade de formar mesoderma severamente restringida se elas so agregadas a outros pares do hemisfrio animal pigmentado. Assim, a presena de clulas vizinhas, mesmo sendo do mesmo tipo, restringe a potncia de ambos os parceiros. Ettensohn e McClay (1988) mostraram que a potncia tambm restringida quando uma clula combinada com suas vizinhas ao longo do eixo animal-vegetal. Primeiro, eles demonstraram que o nmero de clulas mesenquimatosas primrias parece ser fixo e pode ser regulado por variaes nos macrmeros. Se todas as 60 clulas mesenquimatosas primrias de Lytechinus variegatus so removidas da gstrula precoce, um nmero igual de clulas mesenquimatosas secundrias (do arquntero que havia sido macrmeros do plo vegetal) se convertem em mesnquima primrio e comeam a formar espculas. Se so removidas 20 clulas mesenquimatosas primrias, cerca de 20 clulas mesenquimatosas secundrias se tornam clulas mesenquimatosas primrias formadoras de espculas. E assim por diante. Portanto, as clulas mesenquimatosas primrias tm uma influncia restritiva, impedindo a formao de novas clulas mesenquimatosas primrias a partir do arquntero, havendo ento a ocorrncia de uma induo negativa. No conhecemos o mecanismo pelo qual as clulas mesenquimatosas primrias impedem que o arquntero forme o mesnquima primrio e estabelecem um limite para o nmero de tais clulas na blastocele. Recombinando clulas de vrias camadas, Khaner e Wilt (1990, 1991) observaram que na maioria dos casos, a clula de uma camada restringe a habilidade de uma clula de outra camada em expressar seus destinos potenciais (Figura 15.8). A exceo mais importante - como mencionado acima- a recombinao das clulas mesomricas do plo animal com certos micrmeros do plo vegetal para formar tecido intestinal dos mesmeros. Entretanto, no desenvolvimento normal de ourio-do-mar, essas clulas nunca se associam entre si.
Regulao durante o desenvolvimento de anfbios

Hans Spemann: Determinao progressiva das clulas embrionrias Nas sees anteriores descrevemos a evidncia do desenvolvimento regulativo. Notamos que dois aspectos principais da regulao - primeiro, que um blastmero isolado tem uma potncia maior do que seu destino embrionrio normal, e segundo, que o destino de uma clula determinado por interaes entre clulas vizinhassendo verdadeiro durante os estgios precoces da clivagem em ourio-do-mar. Finalmente, entretanto, os blastmeros se tornam comprometidos a certos destinos. Em 1918, Hans Spemann, da Universidade de Freiburg, descobriu que existia uma situao similar no ovo da salamandra. Os experimentos pelos quais ele e seus colegas analisaram esse fenmeno nos 20 anos seguintes formam a base de boa parte de nosso conhecimento da fisiologia embrionria e deram o Prmio Nobel a Spemann em 1935. Spemann, assim como Roux e Driesch, pretendia verificar a hiptese de Weismann e por um mtodo engenhoso, ele demonstrou que os blastmeros precoces da salamandra aqutica tm ncleos idnticos, cada um capaz de produzir uma larva completa. Logo aps a fertilizao de um vulo dessa salamandra, Spemann usou um fio de cabelo de beb para laar o zigoto no plano da primeira clivagem. Ele ento produziu uma constrio parcial do ovo fazendo com que todas as divises nucleares acontecessem em um dos lados da constrio. Freqentemente, at no estgio de 16 clulas, um ncleo escapava atravs da constrio para o lado no nucleado. Assim se iniciava a clivagem tambm nesse lado, quando o lao foi apertado ainda mais at que as duas metades estivessem completamente separadas. Larvas gmeas se desenvol-
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Ligadura
Estgio de 8 clulas
Estgio de 16 clulas
140 dias
Figura 15.9
veram, uma ligeiramente mais velha do que a outra (Figura 15.9). Spemann concluiu desse resultado que os ncleos precoces de anfbios so geneticamente idnticos e que cada clula capaz de originar um organismo completo. Nesse respeito, os blastmeros de anfbios eram similares aqueles de ourio-do-mar. Alm do mais, quando Spemann realizou um experimento similar com uma constrio ainda longitudinal, mas perpendicular ao plano da primeira clivagem (separando as futuras regies dorsal e ventral e no os lados direito e esquerdo), ele obteve um resultado completamente diferente. Os ncleos continuaram a se dividir em ambos os lados da constrio, mas somente um lado - o futuro lado dorsal do embrio- dava origem a uma larva normal. O outro lado produzia um massa desorganizada de tecido com clulas ventrais, que Spemann chamou de Bauchstck - poro ventral. Essa massa de tecido era uma bola de clulas epidrmicas (ectoderma) contendo sangue e mesnquima (mesoderma) e clulas de intestino (endoderma), mas nenhuma estrutura dorsal tal como sistema nervoso, notocorda ou somitos (Figura 15.10). Porque deveriam esses dois experimentos dar resultados diferentes? Poderia ser que quando o ovo dividido perpendicularmente ao plano da primeira clivagem, algumas substncias citoplasmticas no so igualmente divididas entre as duas
Demonstrao da eqivalncia nuclear na clivagem da salamandra aqutica feita por Spemann. (A) Quando o ovo fertilizado da salamandra Triturus taeniatus foi constringido por uma ligadura, o ncleo foi restrito a uma metade do embrio. A clivagem daquele lado do embrio atingiu o estgio de 8 clulas enquanto o outro lado permaneceu no dividido. (B) No estgio de 16 clulas, um nico ncleo penetrou na parte no dividida, e a ligadura foi constringida de modo a completar a separao das duas metades. (C) Aps 140 dias, cada metade tinha se desenvolvido em um embrio normal. (De acordo com Spemann, 1938.)
(A)
(B)
Primeira clivagem
Crescente Cinzento Separao dos blastmeros e desenvolvimento
Figura 15.10
Poro ventral Desenvolvimento Normal Desenvolvimento Normal Desenvolvimento Normal
Assimetria no ovo de anfbio. (A) Quando o plano da primeira clivagem divide o ovo em dois blastmeros, de modo que cada um receba uma metade do crescente cinzento, cada clula separada experimentalmente se desenvolve em um embrio normal. (B) Quando somente um dos dois blastmeros recebe todo o crescente cinzento, ele sozinho forma um embrio normal. O outro pedao no tem estruturas dorsais e permanece como uma massa desorganizada de tecidos. (De acordo com Spemann, 1938.)
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metades? Felizmente, o ovo da salamandra era um bom lugar para procurar respostas. Como foi visto nos Captulos 4 e 6, existem movimentos dramticos do citoplasma cortical aps a fertilizao de ovos de anfbios, e em alguns deles esses movimentos expem uma rea cinzenta do citoplasma em forma de um crescente na regio diretamente oposta ao ponto de entrada do espermatozide. Alm disso, o primeiro plano de clivagem normalmente divide essa regio em partes iguais, dando origem a dois blastmeros. Se essas clulas forem separadas, duas larvas completas se desenvolvem. Entretanto, se esse plano de clivagem for anormal (em um raro evento natural ou em um experimento onde o investigador faz uma constrio com um fio de cabelo, perpendicularmente ao plano normal de clivagem) o material do crescente cinzento passa para somente um dos dois blastmeros. Spemann observou que quando esses dois blastmeros so separados, somente aquele contendo o crescente cinzento se desenvolve normalmente. Parece, ento, que algo contido na regio do crescente cinzento essencial para o desenvolvimento embrionrio adequado. Mas como isso funciona? Qual o seu papel no desenvolvimento normal? A pista mais importante veio do mapa de destino dessa rea do ovo, ao mostrar que a regio do crescente cinzento origina as clulas que iniciam a gastrulao. Essas clulas formam o lbio dorsal do blastporo. Como visto no Captulo 6, as clulas do lbio dorsal do blastporo so de certa maneira comprometidas a invaginar para dentro da blstula, iniciando assim a gastrulao e a formao do arquntero. Porque o desenvolvimento futuro do anfbio depende da interao das clulas rearranjadas durante a gastrulao, Spemann especulou que a importncia do crescente cinzento era devida sua habilidade em iniciar a gastrulao, onde ocorriam mudanas cruciais para o desenvolvimento. Em 1918, Spemann demonstrou que enormes modificaes na potncia celular de fato ocorriam durante a gastrulao. Ele verificou que as clulas da gstrula precoce no estavam comprometidas com respeito diferenciao final, mas que o destino das clulas da gstrula tardia eram fixos. Spemann trocou os tecidos de gstrulas precoces de duas espcies pigmentadas de salamandra aqutica (Figura 15.11). Quando a regio das clulas epidrmicas prospectivas foi transplantada para uma rea de formao da placa neural, as clulas transplantadas deram origem ao tecido neural. Quando clulas da prospectiva placa neural foram transplantadas regio destinada a se tornar pele do ventre, as clulas se tornaram epidrmicas (Tabela 15.2). Portanto, essas clulas da gstrula precoce ainda no estavam comprometidas a um tipo especfico de diferenciao. Suas potncias prospectivas eram ainda maiores que seus destinos prospectivos. Essas clulas exibem desenvolvimento condicional (regulativo ou
Tabela 15.2 Resultados com transplantes de tecidos durante os estgios de gstrulas precoce e tardia na salamandra aqutica Regio doadora
GSTRULA PRECOCE
Regio hospedeira Epiderme prospectiva Neurnios prospectivos Epiderme prospectiva Neurnios prospectivos
Diferenciao do tecido doador Epiderme Neurnios
Concluso Desenvolvimento dependente (condicional) Desenvolvimento dependente (condicional) Desenvolvimento (determinado) independente (autnomo) Desenvolvimento independente (autnomo)
Neurnios prospectivos Epiderme prospectiva

GSTRULA TARDIA
Neurnios prospectivos
Neurnios
Epiderme prospectiva (determinada)
Epiderme
603
(A)
Ectoderma neural presuntivo
Epiderme presuntiva Placa neural
Figura 15.11
TRANSPLANTE EM GSTRULA PRECOCE Forma-se a epiderme (B) Ectoderma neural presuntivo Epiderme presuntiva
Placa neural
Determinao do ectoderma durante a gastrulao da salamandra aqutica. O ectoderma neural presuntivo de um embrio de salamandra transplantado a uma regio de outro embrio que normalmente se torna epiderme. (A) Quando a transferncia feita na gstrula precoce, o tecido neural presuntivo se desenvolve em epiderme e se observa somente uma placa neural. (B) Quando o mesmo experimento feito em tecidos da gstrula tardia, as clulas neurais presuntivas formam tecido neural, causando a formao de duas regies neurais no hospedeiro. (De acordo com Saxn e Toivonen, 1962.)
TRANSPLANTE EM GSTRULA TARDIA Forma-se a placa neural secundria
dependente) porque seu destino final depende da sua localizao no embrio. Entretanto, quando os mesmos experimentos de transplantes heteroplsticos (entre espcies) foram feitos entre gstrulas tardias, Spemann obteve resultados completamente diferentes. Em lugar de regular sua diferenciao de acordo com sua nova localizao as clulas transplantadas exibiram desenvolvimento autnomo (ou independente, ou em mosaico). Seus destinos prospectivos estavam determinados e as clulas se desenvolveram independentemente de sua nova localizao embrionria. Especificamente, clulas neurais prospectivas agora se desenvolviam em tecido cerebral mesmo quando localizadas na regio prospectiva da epiderme, e epiderme prospectiva formava epiderme mesmo na regio do prospectivo tubo neural. Durante o intervalo de tempo entre a gastrulao precoce e a tardia, as clulas ficavam restritas s suas vias de diferenciao. Essas clulas so consideradas como determinadas: elas no podem mais regular sua diferenciao em outros tipos de clulas. Deve ser notado que os critrios para a determinao so puramente operacionais. No ocorrem modificaes bvias nas clulas e no se detecta qualquer diferenciao. A base molecular da determinao permanece como uma das principais incgnitas do desenvolvimento. Hans Spemann e Hilde Mangold: Induo embrionria primria Os mais espetaculares experimentos com transplantes foram publicados por Hans Spemann e Hilde Mangold em 1924*. Eles mostraram que ao se colocar tecidos em novos locais, o lbio dorsal do blastporo a nica regio autodiferencivel da gstrula. Quando o tecido do lbio dorsal do blastporo de uma gstrula precoce foi transplantado para o ectoderma ventral de outra gstrula, ele no s continuou a ser o lbio do blastporo, como tambm iniciou a gastrulao e a embriognese no tecido vizinho. Nesses experimentos, Spemann e Mangold usaram embries de duas espcies de
* Hilde Proescholdt Mangold morreu em um trgico acidente quando seu aquecedor a gasolina explodiu. Na poca, ela tinha 26 anos e seu trabalho estava sendo publicado. Sua tese de doutoramento foi uma das poucas teses em biologia que resultaram diretamente na concesso do Prmio Nobel. Para maiores informaes sobre Hilde Mangold e sua poca veja Hamburger (1984) e Fssler e Sander (1996).
604
(A)
Blastocele
Notocorda presuntiva Somitos presuntivos Lbio dorsal do blastporo (B) Endoderma presuntivo Epiderme presuntiva Invaginao primria Estruturas primrias Lmen do intestino Notocorda Somito Endoderma
Estruturas secundrias induzidas Somito Tubo neural Notocorda Lmen do intestino
Tubo neural Invaginao secundria (C) Invaginao primria
Figura 15.12
Autodiferenciao do tecido do lbio dorsal do blastporo. (A) O lbio dorsal do blastporo da gstrula precoce transplantado em outra gstrula precoce na regio que normalmente se torna epiderme ventral. (B) O tecido se invagina e forma um segundo arquntero e depois um segundo eixo embrionrio. Tanto o tecido do doador como o do hospedeiro visto no tubo neural, notocorda e somitos. (C) Finalmente, se forma um segundo embrio ligado ao hospedeiro. Esta ilustrao e a Prancha 4 mostram o experimento onde o lbio dorsal do blastporo pigmentado de T. taeniatus foi implantado em uma gstrula precoce de um T. cristatus hospedeiro.
salamandra aqutica com pigmentao diferente: Triturus taeniatus com pigmentao escura e Triturus cristatus sem pigmentao. Ao preparar esses transplantes, Spemann e Mangold podiam identificar o tecido hospedeiro e o doador baseados na colorao. O lbio dorsal do blastporo (o tecido da regio marginal dorsal) de gstrulas precoces de T. cristatus foram removidos e implantados em regies da gstrula precoce de T. taeniatus destinadas a se tornar epiderme ventral (Figura 15.12). Diferentemente de outros tecidos da gstrula jovem, que se desenvolveram de acordo com sua nova localizao, o lbio do blastporo doado no se tornou epiderme ventral. Ao contrrio, ele invaginou como o faria normalmente (mostrando autodeterminao) e desapareceu sob as clulas vegetativas. O tecido no pigmentado doador continuou sua autodiferenciao em cordomesoderma e outras estruturas mesodrmicas que constituam o destino original do tecido do blastporo. Com a formao do eixo, as clulas do hospedeiro comearam a participar da formao do novo embrio, tornando-se rgos que normalmente nunca formariam. Assim, podia-se ver somitos contendo tanto tecido incolor (doador) como pigmentado (hospedeiro). Mais espetacular
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(A) Transplante do ndulo de Hensen do pato
(B)
Tubo neural induzido
Embrio hospedeiro
Embrio de pato
Embrio de pinto
Figura 15.13
Induo de um novo eixo embrionrio pelo ndulo de Hensen. (A) O tecido do ndulo de Hensen removido de um embrio de pato e implantado em um embrio de pinto hospedeiro. (B) Um tubo neural accessrio induzido no local do enxerto. (De acordo com Waddington, 1933.)
ainda, era que as clulas do lbio dorsal do blastporo podiam interagir com os tecidos do hospedeiro para formar uma placa neural completa a partir do ectoderma do hospedeiro. Por fim, formou-se um embrio secundrio, face a face com o seu hospedeiro (veja Figura 15.12; Prancha 4). Essas experincias, tecnicamente difceis, foram repetidas recentemente com marcadores nucleares e os resultados de Spemann e Mangold foram confirmados (Gimlich e Cook, 1983; Smith e Slack, 1983; Jacobson, 1984; Recanzone e Harris, 1985).* [regul2.html] Spemann (1938) se referiu s clulas do lbio dorsal do blastporo como o organizador porque (1) elas induziam os tecidos ventrais do hospedeiro a mudar seus destinos para formar um tubo neural e tecido mesodrmico dorsal e (2) elas organizavam esses tecidos do doador e do hospedeiro em um embrio secundrio com ntidos eixos ntero-posterior e dorsoventral. Ele props que durante o desenvolvimento normal, essas clulas organizariam o ectoderma dorsal em um tubo neural e transformariam o mesoderma dos flancos no eixo do corpo. Sabe-se agora (graas principalmente a Spemann e seus alunos) que a interao entre o cordomesoderma e o ectoderma no suficiente para organizar o embrio completo. Em lugar disso, essa interao inicia uma srie de eventos indutivos seqenciais. O processo pelo qual uma regio embrionria interage com uma segunda regio para influenciar a sua diferenciao ou comportamento (da segunda regio) chamado de induo. Como existem numerosas indues durante o desenvolvimento embrionrio, essa induo principal onde as clulas do lbio do blastporo induzem o eixo dorsal e o tubo neural tradicionalmente chamada de induo embrionria primria.** Sabemos tambm que o lbio dorsal do blastporo ativo na organizao de embries secundrios em Amphioxus, ciclstomos e em uma variedade de anfbios. Em aves e mamferos, o organizador se origina na foice de Koller (margem posterior do embrio), e o ndulo de Hensen age como o lbio dorsal do blastporo. Clulas migrando atravs do ndulo de Hensen se tornam o endoderma e o cordomesoderma da cabea, enquanto que clulas migrando atravs de outras partes da linha primitiva se tornam clulas mesodrmicas laterais e ventrais. Quando o ndulo de Hensen de uma gstrula jovem transplantado em um epiblasto de outra gstrula jovem ele induz a formao de outro eixo secundrio completo (Figura 15.13; Waddington, 1933; Storey et al., 1992; Khaner, 1995).
*O laboratrios de Spemann e de seus alunos usavam embries de salamandra para seus experimentos. Foi demonstrado que o ectoderma de r muito mais difcil de ser induzido do que o desses urodeles. ** Esse termo clssico tem sido uma fonte de confuso, porque a induo do tubo neural pela notocorda no mais considerada como o primeiro processo indutivo no embrio. Logo discutiremos os eventos indutivos que precedem essa induo primria.
606
O centro de Nieuwkoop
Apesar do considervel volume de pesquisa realizada com embries de anfbios, estamos apenas comeando a conhecer os mecanismos bsicos da induo embrionria primria. Na ltima dcada, numerosos laboratrios focalizaram seus esforos para explicar a induo embrionria em um anfbio Xenopus laevis e existe um consenso em relao s linhas gerais da induo embrionria primria nesse organismo. Os dados indicam uma orquestrao da induo que tem pelo menos quatro estgios. O primeiro estgio da induo se d na fertilizao. O vulo no fertilizado radialmente simtrico ao redor do eixo animal-vegetal. A entrada do espermatozide quebra essa simetria causando a rotao do citoplasma interno do ovo em relao ao crtex (veja Captulo 4). Essa assimetria especifica o eixo dorsoventral pela mistura dos citoplasmas animal e vegetal nas clulas vegetativas que se formam em oposio ao ponto de entrada do espermatozide. Parece que a mistura dos citoplasmas ativa determinantes da dorsalizao nessas clulas vegetativas. Essas clulas vegetativas dorsalizadas so chamadas centro de Nieuwkoop. No segundo estgio, os descendentes dessas clulas vegetativas induzem as clulas acima delas a se tornarem o organizador de Spemann-Mangold. As outras clulas vegetativas induzem as clulas marginais acima delas a se tornarem os mesodermas lateral e ventral. Portanto, existe uma induo antes da induo primria. No terceiro estgio, o organizador converte o mesoderma vizinho em mesoderma dorsal, e instrui o ectoderma dorsal a se tornar tecido neural. O quarto estgio envolve a caracterizao regional do tecido neural induzido (crebro anterior, crebro posterior, medula espinhal, etc.).
Fragmentos de blstula dissecada do origem a diferentes tecidos em cultura: Clulas do hemisfrio animal pigmentado Clulas equatoriais Clulas vegetativas
A formao do centro de Nieuwkoop e a polaridade mesodrmica O endoderma capaz de instruir as clulas acima dele a se tornarem o mesoderma. Alm disso, a polaridade do endoderma transferida s clulas mesodrmicas. Pieter Nieuwkoop (1969, 1973, 1977) demonstrou a importncia das clulas vegetativas (endoderma presuntivo) na induo do mesoderma. Ele removeu as clulas equatoriais da blstula e mostrou que nem o hemisfrio vegetal nem o animal produziram tecido mesodrmico. Entretanto, quando os dois hemisfrios foram recombinados, as clulas do hemisfrio animal foram induzidas a formar estruturas mesodrmicas tais como a notocorda, msculos, clulas renais e clulas do sangue (Figura 15.14). A polaridade dessa induo (se a regio das clulas animais formava notocorda ou msculos, etc.) dependia da polaridade dorsoventral do fragmento endodrmico. Esse conjunto de fatores capazes de induzir o mesoderma dorsal tem sido chamado de centro de Nieuwkoop (Gehart et al.,1989), e em Xenopus laevis, ele se localiza nas clulas vegetativas mais dorsais da blstula ( Figura 15.15). [regul5.html] As clulas vegetativas ventrais e laterais tambm tm papis na especificao do mesoderma. Enquanto as clulas vegetativas ventrais e laterais especificam os tipos intermedirio (msculo e mesnquima) e ventral (mesnquima, sangue, rim pronfrico) do mesoderma, as clulas vegetativas mais dorsais especificam os componentes mesodrmicos axiais (notocorda e somitos; Figura 15.16). Parece haver dois sinais: (1) um geral de todas as clulas vegetativas, vamos produzir mesoderma e (2) um sinal mais especfico essas clulas acima de ns so o mesoderma dorsal (organizador), vindo das clulas vegetativas mais dorsais (D1). Dale e Slack (1987) forneceram evidncia para um terceiro sinal indutivo, vindo das clulas organizadoras (aquelas clulas marginais diretamente acima do centro de Nieukoop) que dorsalizam as clulas mesodrmicas marginais adjacentes a elas. Quando as clulas marginais ventrais so isoladas, elas originam principalmente os tecidos mesodrmicos ventrais. Entretanto, se elas so cultivadas adjacentes s clulas marginais dorsais (ou seja, o organizador), elas geram tecido mesodrmico intermedirio. Um quarto sinal parece vir da regio ventral que se
Ectoderma Mesoderma Endoderma
Fragmentos animais e vegetais do mesoderma Hemisfrio animal pigmentado (ectoderma presuntivo) convertido a
Mesoderma
por fatores liberados das clulas vegetativas
Figura 15.14
Sumrio dos experimentos de Nieuwkoop e os de Nakamura e Takasaki, mostrando induo mesodrmica pelo endoderma vegetativo. Clulas isoladas do hemisfrio animal pigmentado se tornam uma massa de epiderme ciliada; clulas vegetativas isoladas geram tecido semelhante a intestino, e clulas isoladas equatoriais (zona marginal) se tornam mesoderma. Se as clulas do hemisfrio animal pigmentado so combinadas com clulas do hemisfrio vegetal, muitas das clulas do hemisfrio animal pigmentado geram tecido mesodrmico.
607
ope aos sinais do organizador. Assim, existe evidncia para uma especificao do mesoderma em trs etapas (Figura 15.17): (1) a induo da atividade do organizador pelas clulas vegetativas mais dorsais (o centro de Nieuwkoop), (2) a induo do mesoderma ventral pelas outras clulas vegetativas e (3) a dorsalizao das clulas marginais laterais adjacentes s clulas marginais dorsais para produzir o mesoderma intermedirio enquanto que outras clulas marginais seguem destinos ventrais. Na dcada passada foram feitas tentativas para identificar as interaes moleculares que originam essa modelagem mesodrmica. A especificao da polaridade dorsoventral na fertilizao Como vimos nos Captulos 4 e 6, a especificao dorsoventral consumada pela rotao do citoplasma interno do ovo em relao ao crtex. Se essa rotao inibida por luz ultravioleta, o embrio no formar estruturas dorso-anteriores (Vincent e Gerhart, 1987). Render e Elinson (1986) e Wakahara (1989) cortaram ovos em fragmentos antes e depois dessa rotao. Se o ovo fosse cortado antes da rotao, ambos os lados desenvolviam estruturas dorso-anteriores: cabea, notocorda e tubo neural. Se o corte era feito aps a rotao, um fragmento desenvolvia a cabea, corao, e algumas estruturas mesodrmicas dorsais, enquanto o outro fragmento se desenvolvia essencialmente em um Bauchstck, consistindo quase unicamente de clulas ventrais, tendo pouco ou nada de mesoderma dorsal e sem sistema nervoso. Sakai (1996) mostrou que se o citoplasma vegetativo do ovo fosse deletado antes da rotao, no se formaria o eixo dorsal, e certos determinantes dorsais se movem do crtex vegetativo para a zona marginal no futuro lado dorsal. Parece ento, que essa rotao citoplasmtica movimenta os determinantes que so ativadores dorsais em direo ao futuro lado dorsal do ovo.
Sinais ventrais (FGF, BMP-4)
Organizador
Sinais dorsais (Vg1, Noggin, activina, Wnt) Centro de Nieuwkoop
Figura 15.15
Modelo para induo do mesoderma em Xenopus. Um sinal ventral (provavelmente FGF2 ou BMP4) liberado em toda a regio vegetal do embrio. Isso induz as clulas marginais a se tornarem mesoderma. BMP4 pode especificar as clulas marginais a se tornarem mesoderma posterior. No lado dorsal (fora do local de entrada do espermatozide), um sinal (provavelmente iniciado por Vg1 e propagado pelas protenas activina, Noggin e Wnt) liberado pelas clulas vegetativas do centro de Nieuwkoop. Esse sinal dorsal induz a formao do organizador de Spemann nas clulas da zona marginal sobreposta ao centro. (De acordo com De Robertis et al., 1992.)
Porcentagem de indues totais Dorsal Intermediria Ventral
Plo animal
Plo vegetal
Figura 15.16
Plo animal
Camada D
Plo vegetal
Especificidade regional na induo do mesoderma pela recombinao de clulas do embrio de Xenopus com 32 clulas. As clulas do plo animal de embries de 32 clulas foram combinadas com blastmeros vegetativos individuais. As clulas do plo animal foram marcadas com polmeros fluorescentes para identificao de seus descendentes. As indues resultantes dessas recombinaes esto resumidas direita. (De acordo com Dale e Slack, 1987.)
608
Blastocele
Endoderma farngeo
Blastocele
Arquntero
Arquntero
Mesoderma ventral
Ec
tod
erm
Mesoderma dorsal
Animal
Mesoderma intermediria
Figura 15.17
Gastrulao
Interaes indutivas durante o desenvolvimento precoce de Xenopus. Durante a oognese, o eixo animal-vegetal se eleva. A fertilizao causa rearranjos citoplasmticos que subdividem a regio vegetal nas reas dorso-vegetal (DV) e ventro-vegetal (VV). Durante a clivagem, a induo mesodrmica ocorre de tal modo que a regio DV induz a atividade do organizador (O) nas clulas marginais dorsais acima dela, enquanto a VV induz as clulas acima para se tornarem mesoderma ventral (M). Um sinal do organizador converte o mesoderma ventral prximo em mesoderma lateral (M2, M3, M4). Durante a gastrulao, os mesodermas ventral e lateral vo para os lados da gstrula (no mostrado), enquanto o mesoderma dorsal se expande e induz a polaridade nas clulas ectodrmicas. Isso faz com que as clulas ectodrmicas se tornem diferentes regies do tubo neural (N1, N2, N3, N4). C representa a glndula do cimento, a estrutura mais anterior do girino. A polaridade do endoderma assim transferida ao tecido neural. O ectoderma no induzido se torna epiderme. (De acordo com Smith et al., 1985; Slack e Tannahill, 1992.)
Animal
Mesoderma ventral
Dorsalizao do mesoderma ventral
Mesoderma dorsal (organizador) Animal

Mesoderma ventral
Espermatozide Animal
Clivagem Vegetal Centro de Nieuwkoop
Induo do mesoderma por clulas vegetativas
Oognese
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No estgio de 32 clulas, os determinantes dorso-anteriores esto contidos nos blastmeros mais dorsais (D1) (Figura 6.20; Gimlich e Gehart, 1984; Gimlich, 1985, 1986). Essa localizao foi confirmada por experimentos de recombinao (veja Figura 15.16). Dale and Slack (1987) recombinaram blastmeros vegetativos isolados de um embrio de Xenopus de 32 clulas com a camada animal mais superior de um embrio no mesmo estgio, marcado por fluorescncia. A clula vegetativa mais dorsal, como esperado, induziu as clulas do plo animal a se tornarem mesoderma dorsal. As clulas vegetativas remanescentes de modo geral induziam as clulas animais a produzirem tecidos mesodrmicos intermedirios ou ventrais. Portanto, clulas vegetativas dorsais podem induzir clulas animais a se tornarem tecido mesodrmico dorsal. Deve ser notado que em Xenopus (e outros vertebrados), a formao do eixo ntero-posterior se segue a formao do eixo dorsoventral. Uma vez estabelecida a poro dorsal do embrio, o movimento do mesoderma involutivo estabelece o eixo ntero-posterior. O mesoderma que migra inicialmente atravs do lbio dorsal do blastporo d origem s estruturas anteriores; o mesoderma na margem ventral forma as estruturas posteriores.
A base molecular da induo mesodrmica

Estabelecendo a regionalizao dorsal: o possvel papel da catenina A catenina uma protena multifuncional que pode funcionar como uma ncora para as caderinas da membrana celular (Captulo 3) ou como um fator de transcrio nuclear. Em embries de Xenopus, a rotao cortical da fertilizao remove as cateninas para a futura parte dorsal do ovo. A catenina continua a se acumular preferencialmente no lado dorsal durante a clivagem precoce, e essa acumulao observada nos ncleos das clulas dorsais (Figura 15.18 A,B; Prancha 7E,F; Schneider et al., 1996; Larabell et al., 1997). Essa regio de acumulao de catenina originalmente parece conter tanto o centro de Nieuwkoop como as regies do organizador. Durante as clivagens posteriores, as clulas com catenina podem se localizar especificamente no centro de Nieuwkoop (Heasman et al., 1994; Guger e Gumbiner, 1995). A catenina necessria para a formao do eixo dorsal, pois a depleo de transcritos de catenina com oligonucleotdeos antisenso resulta na falta de estruturas dorsais (Heasman et al., 1994). Alm disso, a injeo de catenina exgena no lado ventral do embrio produz um eixo secundrio (Funayama et al., 1995; Guger e Gumbiner, 1995). A catenina parte da via Wnt de transduo sinalizadora e negativamente regulada pela quinase 3 da sntese glicognio (GSK-3; Captulo 3). GSK-3 tambm crtica para a formao de eixo e GSK-3 ativada bloqueia a formao de eixo quando adicionada ao ovo (Pierce e Kimelman, 1995; He et al., 1995; Yost et al., 1996). Se o GSK-3 endgeno eliminado por uma mutao negativa dominante nas clulas ventrais do embrio precoce, um segundo eixo se forma (Figura 15.18C). Experimentos com marcao (Yost et al., 1996; Larabell et al., 1997) sugerem que a catenina inicialmente sintetizada (a partir de mensagens maternas) em todo o embrio, mas que degradada pela fosforilao de GSK-3 especificamente nas clulas ventrais. No se conhece a causa dessas variaes regionais na atividade de GSK-3. Experimentalmente a GSK-3 endgena pode ser inibida pela adio de protenas Wnt ao ovo, e foi observado que essas Wnts induzem eixos secundrios (McMahon e Moon, 1989; Sokol et al., 1991). Mas Wnts podem no ser as reguladoras naturais de GSK-3 no lado dorsal do embrio; mutaes dominantes negativas de protenas Wnt e seus receptores no conseguem bloquear a formao do eixo normal (Hoppler et al., 1996; Sokol, 1996). Atualmente esto sendo realizados estudos para verificar se a rotao cortical em ovos de Xenopus de certa maneira regula a atividade de GSK-3 e se existe um outro agente (alm das protenas Wnt) capaz de inativar GSK-3.
610
(A) (D) -catenina ativada dorsalmente por rotao cortical
(B)
(C)
Figura 15.18
Papel da via das protenas Wnt na especificao do eixo dorsoventral. (A,B) Translocao diferencial da protena -catenina para os ncleos de blastmeros de Xenopus. (A) Lado dorsal presuntivo de uma blstula de Xenopus corado para -catenina mostra a localizao do ncleo. (B) Tal localizao nuclear no vista no lado ventral do mesmo embrio. (C) Formao do eixo dorsal causado pela injeo de ambos os blastmeros de um embrio de Xenopus de 2 clulas com GSK-3 inativa dominante. O destino dorsal ativamente suprimido pela GSK3 tipo selvagem. (D) Modelo irnico pelo qual o centro de Nieuwkoop (caracterizado pela expresso do gene Siamois e a habilidade para induzir o mesoderma dorsal) criado pelo sinergismo da ativao dorsal da -catenina e a ativao vegetal de Vg1. (A e B de Schneider et al., 1996, fotografias cortesia de P. Hausen; C de Pierce e Kimelman, 1995, fotografia cortesia de D. Kimelman.)
Traduo, processamento e difuso de Vg1
Expresso mxima de Siamois: centro de Nieuwkoop
A catenina um fator de transcrio do tipo HMG-box e pode ser uma protena de dobramento de DNA. Ela pode tornar clulas diferentes predispostas a responder de maneiras diferentes aps o incio da expresso gnica na transio da blstula intermediria. Uma vez dentro do ncleo das clulas vegetativas dorsais, ela ativa determinados genes alvo, um deles sendo o gene Siamois que contm a seqncia homeobox. Esse gene expresso no centro de Nieuwkoop imediatamente aps a transio da blstula intermediria. Se esse gene expresso ectopicamente nas clulas vegetativas ventrais, um eixo secundrio emerge no antigo lado ventral do embrio, e se a rotao cortical impedida, a expresso de Siamois eliminada (Lemare et al., 1995; Brannon e Kimelman, 1996). Estudos recentes (Brannon e Kimelman, 1996) sugerem que a expresso mxima de Siamois ocorre quando h sinergismo entre GSK-3/catenina e um sinal TGF- vegetalmente expresso. A rotao cortical pode ativar as cateninas e permitir a expresso de Siamois na regio dorsal do embrio. Ao mesmo tempo, a traduo das mensagens localizadas vegetalmente codificando um fator da famlia TGF- pode produzir uma protena que permite uma melhor ativao da catenina nas clulas vegetativas do que nas clulas animais (Figura 15.18D). Cui e colegas (1996) mostraram que esse membro da famlia TGF- a protena Vg1 madura, uma protena expressa somente nas clulas vegetativas. O resultado que Siamois seria expresso nas clulas vegetativas mais dorsais que constituem o centro de Nieuwkoop. O funcionamento do centro de Nieuwkoop: funes para Vg1 e Noggin
A PROTENA VG1 ATIVADA. Existem vrias maneiras de induzir o mesoderma dorsal.
Primeira, a protena Vg1 pode induzir a formao do mesoderma dorsal nas clulas acima dela. O mRNA para Vg1 restrito pela massa de vitelo vegetativo durante a oognese e permanece no hemisfrio vegetal durante a clivagem (Captulos 4 e 12; Prancha 8). Aps a fertilizao, a protena Vg1 produzida no hemisfrio vegetal da

Controle
611
Vg madura
EF1 (controle) Actina cardaca (mesoderma dorsolateral) Xbra (mesoderma geral) Gsc (mesoderma dorsal anterior) Noggin (mesoderma dorsal anterior) Xwnt8 (mesoderma ventrolateral) NCAM (neural) (B) (C)
(A)
Figura 15.19
blstula, mas est na forma de um precursor inativo que precisa ser cindido para ser ativo. A protena Vg1 ativada capaz de (1) induzir o mesoderma dorsal nas clulas do hemisfrio animal; (2) induzir um eixo embrionrio completo quando microinjetada em clulas vegetativas ventrais; e (3) recuperar o eixo dorsal em ovos irradiados com luz UV quando microinjetada nas clulas vegetativas dorsais (Dale et al., 1993; Thomsen e Melton, 1993; Kessler e Melton, 1995). Kessler e Melton (1995) mostraram que a protena Vg1 ativada causava a elongao ativa do mesoderma da notocorda como tambm a ativao dose-dependente dos marcadores mesodrmicos. Quando coroas do plo animal, no estgio de blstula so colocadas em baixa concentrao de Vg1 processada, a protena Vg1 induz a expresso de genes como Brachyury, que caracteriza o mesoderma geral. Doses ligeiramente maiores de Vg1 induz a expresso de marcadores mesodrmicos laterais (Xwnt8 e actina), e em altas concentraes, a Vg1 induz essas clulas a expressar os marcadores mesodrmicos dorsais goosecoid e noggin (Figura 15.19). Entretanto, Cui e colaboradores (1996) encontraram que a Vg1, sozinha, no capaz de causar diferenciao da notocorda in vivo. Para que isso ocorra, as clulas necessitam dos produtos de Vg1 e Wnt. (A via Wnt no foi suficiente para induzir sozinha o mesoderma dorsal.) possvel que a combinao de Vg1 com algum produto especificado pelo gene Siamois seja capaz de induzir a especificao do mesoderma dorsal e sua diferenciao na notocorda*. A protena Vg1 madura (processada) parece ser crtica para o funcionamento (se no o estabelecimento) do centro de Nieuwkoop nos anfbios. Vg1 tambm identificada na regio homloga do embrio de galinha - a zona marginal posterior. Alm disso, quando a protena Vg1 introduzida experimentalmente em reas laterais
Protena Vg1 madura induz movimentos morfogenticos e expresso gnica mesodrmica dorsal em explantes ectodrmicos. Explantes de hemisfrio animal pigmentado no estgio de blstula foram cultivados (A) em meio no tratado ou (B) em meio contendo a protena Vg1 madura (clivada). A protena Vg1 induziu movimentos de extenso convergente no hemisfrio animal pigmentado. Quando deixados no meio tratado por um tempo maior (C) os explantes do hemisfrio animal pigmentado formaram estruturas semelhantes larva, incluindo a notocorda, msculos, olhos, glndula do cimento e eixo ntero-posterior. (D) Com o aumento de sua concentrao, a protena Vg1 induz um conjunto mais dorsal de marcadores mesodrmicos. A concentrao mais baixa 0 (controle), seguida por 1, 3, 10 e 30% em sobrenadante de Vg1. (De acordo com Kessler e Melton, 1995; fotografias cortesia de D. A. Melton.)
* Alternativamente, isso pode ser outro exemplo do conceito de Spemann (1938) chamado de dupla certeza. O embrio poderia especificar o mesoderma dorsal pelo sinergismo de Vg1 e catenina (sem um centro de Nieuwkoop). O mesmo resultado poderia ser obtido a partir de um sinal iniciado pelo gene Siamois do centro de Nieuwkoop abaixo dele. Spemann considerava dupla certeza em analogia a usar tanto um cinto como suspensrios.
612
do blastoderma do pinto, um novo centro de Nieuwkoop formado e um eixo secundrio induzido (Seleiro et al., 1996). Induo de especificidade mesodrmica ventral e lateral At aqui discutimos a induo do mesoderma dorsal pelas clulas vegetativas mais dorsais. Mas, no s isso. As outras clulas vegetativas so capazes de induzir as clulas acima delas a se tornarem mesoderma ventral. Experimentos de Smith e seus colegas (1991) mostraram que na blstula intermediria os blastmeros vegetativos ventrolaterais e dorsais de Xenopus induzem a expresso do gene Brachyury nas clulas marginais acima deles. O mRNA de Brachyury codifica um fator de transcrio cuja funo crucial para a formao do mesoderma. Ele expresso antes da actina e outras protenas que so produtos das clulas mesodrmicas, e se o gene Brachyury expresso em clulas onde o fator de transcrio est normalmente inativo, aquelas clulas se tornam mesodrmicas (Cunliffe e Smith, 1992). Se o hemisfrio animal contendo as clulas da zona marginal removido do hemisfrio vegetal na blstula intermediria no se forma o mesoderma no hemisfrio animal. Entretanto, se clulas vegetativas so adicionadas de volta aos hemisfrios animais, o gene brachyury expresso, e as clulas que o expressam se tornam mesodrmicas. Desse modo, as clulas vegetativas induzem a expresso de genes mesodrmicos em clulas da zona marginal. Sem essa interao, as clulas da zona marginal permanecem ectodrmicas.
FATORES DE CRESCIMENTO FIBROBLSTICO. Existe muito debate sobre a
identidade dos indutores da mesodrmicos gerais encontrados nas clulas vegetativas ventrais e laterais. Os fatores de crescimento fibroblstico (e suas mensagens) foram encontrados no ovo e no embrio de Xenopus, e se considera que eles permitem s clulas marginais responderem Vg1 (ou a outra protena semelhante a activina) (Cornell e Kimelman, 1994; LaBonne e Whitman, 1994). O significado funcional dessas molculas FGF secretadas foi demonstrado pela destruio dos receptores para FGF no embrio por mutaes dominantes negativas (Captulo 3). Quando esse experimento foi feito, os embries que no tinham receptores FGF funcionais tinham reduzido dramaticamente as quantidades de mesoderma posterior e lateral (Prancha 3). Uma possibilidade que a quantidade graduada de Vg1 ativa cria o padro, com pequena quantidade induzindo o mesoderma ventral, quantidades maiores induzindo o mesoderma lateral e ainda maiores concentraes induzindo o mesoderma dorsal. Tais gradientes foram vistos em cultura.
BMP4. Outra molcula considerada importante para a especificao do mesoderma a protena morfogentica 4 do osso (BMP4). Parece haver uma relao antagnica entre a BMP4 e o mesoderma dorsal. Se o mRNA para a BMP4 injetado em ovos de Xenopus com uma clula, todo o mesoderma no embrio se torna mesoderma ventrolateral, e no ocorre involuo no lbio do blastporo (Dale et al., 1992; Jones et al., 1992). Experimentos de implantao produziram mais evidncia em relao ao papel da BMP4 na induo do mesoderma ventrolateral. Quando o hemisfrio animal pigmentado de embries injetados com a mensagem bmp4 foi isolada e implantada na blastocele de blstulas jovens de Xenopus, elas causaram a formao de uma cauda extra (Figura 15.20). Inversamente, a super expresso de um receptor negativo dominante de bmp4 resultou na formao de dois eixos dorsais (Graff et al., 1994; Maeno et al., 1994). possvel que a BMP4 esteja induzindo um conjunto de fatores de transcrio que especificam o mesoderma para que seja lateral ou posterior (Stennard et al., 1996; Zhang e King, 1996). Assim, a formao do mesoderma posterior (ventrolateral) parece ser originada pelas aes de FGF e BMP4.
Figura 15.20
A importncia de BMP4 na produo de estruturas posteriores pode ser vista quando o mRNA de bmp4 foi injetado em embries e as clulas da coroa animal resultantes foram transplantadas diretamente abaixo do ectoderma de gstrulas jovens. As larvas tratadas, de modo geral, desenvolveram uma cauda extra. (de Jones et al., 1992, cortesia de B. Hogan.)
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A criao da atividade do organizador

Protenas secretadas do organizador O organizador induzido pelo centro de Nieuwkoop. Enquanto as clulas do centro de Nieuwkoop permanecem endodrmicas, as clulas do organizador se tornam o mesoderma dorsal (mesoderma da cabea, notocorda, mesoderma paraxial) e se posicionam abaixo do ectoderma dorsal. Nesse local, induziro a formao do sistema nervoso central. As propriedades do tecido organizador podem ser divididas em cinco funes principais: 1. A habilidade de se tornar mesoderma dorsal (notocorda, etc.) 2. A habilidade de dorsalizar o mesoderma circundante em mesoderma lateral (que de outra maneira formaria o mesoderma ventral) 3. A habilidade de dorsalizar o ectoderma em ectoderma neural 4. A habilidade de iniciar os movimentos da gastrulao 5. A habilidade de fazer com que a placa neural se torne o tubo neural As clulas do organizador, em ltima anlise, contribuem para quatro tipos de clulas endoderma da faringe, mesoderma da cabea, notocorda e a dobradia cordoneural (Keller, 1976; Gont et al., 1993). O endoderma farngeo lidera a migrao do tecido organizador e parece induzir as estruturas mais anteriores da cabea. O mesoderma da cabea induz o crebro anterior e o intermedirio, a notocorda induz o crebro posterior e o tronco, e a dobradia cordoneural induz a extremidade da cauda. Recentemente, Vodicka e Gerhart (1995) correlacionaram tcnicas de marcao fluorescente de clulas e hibridizao in situ para obter um mapa da clulas que do origem ao organizador. Foi encontrado que a poro mais animal (10%) era derivada dos blastmeros A1 da blstula de 32 clulas; a regio central (70%) era derivada da prognie dos blastmeros B1; e cerca de 20% (as clulas vegetativas e as profundas) era derivada do blastmero C1 diretamente acima das clulas D1 do centro de Nieuwkoop. Todos os seis blastmeros, A1, B1 e C1 produziram clulas profundas e superficiais. A prognie do blastmero C1 produz a parte mais vegetal, lder do organizador, e essas so as clulas que formam o mesoderma da cabea. Quando o organizador foi inicialmente descrito, iniciou-se o primeiro programa de pesquisa realmente internacional - a procura das molculas do organizador. Pesquisadores da Inglaterra, Alemanha, Frana, Estados Unidos, Blgica, Finlndia, Japo e Unio Sovitica, todos tentaram encontrar essas extraordinrias molculas (veja Gilgert e Saxn, 1993). R. G. Harrison (citado por Twitty, 1966) se referiu gstrula dos anfbios como o novo Yukon para o qual mineiros ansiosos estavam se dirigindo rapidamente para escavar ouro ao redor do blastporo. Infelizmente, suas ps e picaretas se mostraram muito rudes para descobrir essas molculas. A anlise das molculas do organizador teve que esperar at que a tecnologia do DNA recombinante permitisse a produo de clones de cDNA do mRNA do lbio do blastporo para verificar qual desses clones codificava fatores que poderiam dorsalizar o embrio. A formao do mesoderma dorsal (organizador) envolve a ativao de vrios genes. Considera-se que as protenas secretadas no centro de Nieuwkoop ativam um conjunto de fatores de transcrio nas clulas mesodrmicas acima dele. Esses fatores de transcrio ativariam os genes codificando os produtos secretados pelo organizador. Vrias protenas especficas do organizador foram encontradas e se acham listadas na Tabela 15.3. Como as propriedades do organizador dependem desses fatores secretados, comearemos com essas protenas. [regul3.html] Vrias fontes evidenciaram a presena de sinais difusveis da notocorda, principalmente a partir dos estudos crticos com transfiltros pelo grupo de pesquisadores
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Tabela 15.3
Protenas expressas somente, ou quase exclusivamente, no organizador (lista parcial) Protenas secretadas Chordin Noggin Follistatin Sonic hedgehog Cerberus Protenas relacionadas Nodal (vrias)
Protenas nucleares Lim1 XANF1 Goosecoid Protenas relacionadas A HNF3 (p.ex., Forkhead, Pintallavis)
Filandeses (Saxn, 1961; Toivonen et al., 1975; Toivonen e Wartiovaara, 1976). O lbio dorsal da salamandra aqutica foi colocado em um lado de um filtro suficientemente fino, de modo que nenhum processo pudesse atravessar os poros, e o ectoderma competente de gstrula foi colocado no outro lado do filtro. Aps vrias horas, estruturas neurais foram observadas no tecido ectodrmico (Figura 15.21). As identidades desses fatores difundindo do organizador levaram um quarto de sculo para serem definidas. Atualmente, vrias dessas molculas esto sendo estudadas: Chordin, Noggin, Follistatin, Sonic hedgehog e Cerberus.
(A)
CHORDIN. Um dos papis iniciais do organizador se proteger contra a
(B)
Figura 15.21
Fatores indutivos solveis e sua identificao. (A) Estruturas neurais induzidas no ectoderma presuntivo pelo lbio dorsal da salamandra aqutica, separado do ectoderma por um filtro Nucleopore com poros de dimetro mdio de 0.05 m. Clulas neurais do tipo anterior so evidentes, incluindo alguns olhos induzidos. (B) Tipo similar de induo visto quando o hemisfrio animal pigmentado de Xenopus (ectoderma presuntivo) injetado com mRNA de chordin e tratado com FGF2 solvel. (A de Toivonen, 1979; B de Sasai et al., 1996; fotografias cortesia de L. Saxn e E. De Robertis, respectivamente.)
ventralizao. A BMP4 produzida em toda a blstula de Xenopus e ativamente produz mesoderma ventral (Graff et al., 1994). Em outras palavras, a produo do mesoderma ventral no meramente devida ausncia de sinais dorsais; ela ativamente construda. Alm do mais, como j descrito, a BMP4 pode bloquear os sinais dorsais. O mesoderma dorsalizado bloqueia o sinal de BMP4 secretando Chordin e Noggin (Sasai et al., 1994; Holley et al., 1995). Chordin uma protena secretada que ativada pelos fatores de transcrio Goosecoid e Xnot2 contendo o homeodomnio. A protena originalmente detectada na zona marginal dorsal cerca de uma hora antes da gastrulao; ao se iniciar a gastrulao, a mensagem chordin vista somente no lbio dorsal do blastporo (Figura 15.22). Daqui em diante, chordin expressa na placa precordal (o mesoderma da cabea que precede anteriormente a notocorda) e na notocorda. Quando esto ocorrendo as ltimas indues na cauda, Chordin encontrada na dobradia cordoneural, o ltimo vestgio do organizador. Chordin pode induzir um eixo secundrio quando microinjetada nos lados ventrais da blstula de Xenopus, possivelmente por interferir com a ao de BMP4. BMP4 inicialmente expressa nas regies ectodrmicas e mesodrmicas da blstula tardia. Entretanto, durante a gastrulao, transcritos de bmp4 esto restritos zona marginal ventrolateral (Hemmati-Brivanlou e Thomsen, 1995; Northrop et al., 1995). A protena BMP4 induz a expresso de vrios fatores de transcrio (Xvent-1, Vox, Mix.1, Xom) que so reguladores-chaves no desenvolvimento do mesoderma ventral. Portanto, a BMP4 ativa a expresso gnica ventral. Os fatores de transcrio induzidos por BMP4 reprimem goosecoid e outros genes dorsais, enquanto ao mesmo tempo ativam protenas mesodrmicas ventrolaterais (Gawantka et al., 1995; Hawley et al., 1995; Mead et al., 1996; Schmidt et al., 1996). Dessa maneira, a BMP4 ativa o desenvolvimento mesodrmico e suprime o desenvolvimento dorsal. Em Xenopus, chordin e noggin se ligam diretamente e inativam a BMP4, impedindo assim que a protena aja em clulas prximas ao organizador (Figura 15.23; De Robertis e Sasai, 1996; Piccolo et al., 1996; Sasai et al., 1996; Zimmerman et al., 1996).
615
(A)
(B)
(C)
Figura 15.22
Localizao do mRNA de chordin. (A) Montagem total da hibridizao in situ mostra que imediatamente antes da gastrulao, a mensagem chordin expressa na regio que se tornar o lbio dorsal do blastporo. (B) Quando a gastrulao comea, chordin expresso no lbio dorsal do blastporo, e (C) visto nos tecidos do organizador. (de Sasai et al., 1994; fotografias cortesia de E. De Robertis.)
(A) Animal
Ectoderma epidrmico
Ectoderma neural
Ventral
Dorsal MOLCULAS DO ORGANIZADOR: Chordin, Noggin, Follistatin, Xnr3 Mesoderma
Endoderma dorsal Vegetal (B)
Screw
Tolloid
Decapentaplegic
Genes homeobox no neurais
Chordin Short gastrulation Cordados Drosophila
Figura 15.23
Modelo para a ao do organizador. (A) BMP4 (e outras certas molculas) so poderosos fatores ventralizantes. Protenas do organizador como Chordin e Noggin podem bloquear a ao de BMP4. (Follistatin pode inibir a ao de BMP7, que combina com BMP4 para ativ-lo.) Os efeitos antagnicos dessas protenas podem ser vistos em todas as trs camadas germinativas. (B) Vias do desenvolvimento homlogo na formao do sistema nervoso central de um vertebrado (Xenopus) e de um invertebrado (Drosophila). O fator vertebrado est em preto, a protena homloga da Drosophila em cor. (De acordo com De Robertis e Sasai, 1996; Sasai et al., 1996.)
616
&
Especulaes
BMP4 e a lagosta de Geoffroy
ECENTEMENTE, os laboratri-
os de De Robertis e Kimelman mostraram que a reao que leva formao do tubo neural dorsal no Xenopus so as mesmas reaes que levam formao do cordo nervoso ventral nos insetos (veja Figura 15.23B; Holley et al., 1995; Schmidt et al., 1995). Em Drosophila, o homlogo do gene bmp4 o decapentaplegic (dpp). Como discutido no captulo anterior, a protena Dpp responsvel pela modelagem do eixo dorsoventral na Drosophila, e est presente na poro dorsal do embrio e difunde-se ventralmente. Aqui, ela sofre a oposio de uma protena chamada Short-gastrulation (Sog). A Short-gastrulation a homloga de Chordin na Drosophila. Esses homlogos no s se parecem como tambm podem ser substitudos um pelo outro. Quando o mRNA
do short-gastrulation injetado nas regies ventrais de embries de Xenopus, ele induz a notocorda e o tubo neural do embrio. A injeo do mRNA de chordin em Drosophila origina tecido nervoso ventral. Apesar da Chordin de Xenopus funcionar como um dorsalizador do embrio, ela ventraliza o embrio de Drosophila. Isso porque na mosca a Dpp produzida dorsalmente. Em Xenopus, BMP4 produzida ventralmente. Em ambos os casos, Sog/Chordin produz tecido neural bloqueando os efeitos de Dpp/ BMP4. Em Drosophila, a Dpp interage com o produto do gene screw para seu funcionamento. Em Xenopus, o homlogo de screw, Bmp7, parece ser essencial para o efeito ventralizante de BMP4 (Hawley et al., 1995). Em 1822, o anatomista francs Etienne Geoffroy Saint-Hilaire provocou
um dos mais calorosos e crticos confrontos em biologia quando ele props que a lagosta era um vertebrado de cabea para baixo. Ele acreditava que o lado ventral da lagosta (com seu cordo nervoso) era homlogo ao lado dorsal dos vertebrados (Appel, 1987). Parece que ele tinha razo ao nvel molecular, mas no no anatmico. De Robertis e Sasai (1996) propuseram que todos os filos bilatrios tinham uma origem comum- uma criatura hipottica (denominada Urbilateria) de cerca de 600 milhes de anos atrs que era o ancestral de ambos os subreinos, protostomatas e deuterostomatas. A interao BMP4 (Dpp)/Chordin(Sog) um exemplo de processos homlogos, sugerindo uma unidade de princpios de desenvolvimento em todos os animais (Gilbert et al., 1996).
NOGGIN. Um dos outros agentes do organizador deve ser o produto do gene noggin.
Smith e Harland (1991, 1992) isolaram esse gene construindo uma biblioteca de cDNAs de gstrulas dorsalizadas (tratadas com ltio). RNAs sintetizados de conjuntos desses plasmdeos foram injetados em embries ventralizados produzidos por irradiao com luz UV. Os conjuntos de plasmdeos cujos RNAs recuperavam o eixo dorsal foram divididos em conjuntos menores, e assim por diante, at o isolamento de clones nicos cujos mRNAs eram capazes de restaurar o eixo dorsal nesses embries. Um desses clones continha noggin. Smith e Harland (1992) mostraram que mRNA do noggin, recentemente transcrito, est localizado inicialmente na regio do lbio dorsal do blastporo e depois expresso na notocorda (Prancha 6). Ainda mais, se o embrio precoce tratado com cloreto de ltio (LiCl) de modo que o manto mesodrmico inteiro se torne um tecido organizador semelhante notocorda, ento o mRNA de noggin encontrado no manto mesodrmico inteiro. Tratamento do embrio precoce com luz ultravioleta (que impede a formao do lbio dorsal do blastporo) inibe a sntese do mRNA de noggin. Injeo de mRNA de noggin em embries de uma clula, irradiados com luz ultravioleta, restaura completamente o eixo dorsal e permite a formao do embrio completo (Prancha 5). Se muita protena Noggin sintetizada nessa ocasio, o embrio se torna hiperdorsal, formando somente a regio da cabea (da o nome noggin). O mRNA para a protena Noggin j est presente no ovo fertilizado, e a seqncia da protena (como deduzida pelo gene) sugere fortemente que Noggin uma protena secretada. Parece ento, que Noggin um excelente candidato para mediar algumas das funes do organizador.
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Evidncia recente sugere que a protena Noggin pode realizar duas funes importantes do organizador de Spemann-Mangold: ela induz o tecido neural do ectoderma dorsal, e dorsaliza as clulas mesodrmicas que, de outra maneira, contribuem para o mesoderma ventral. Smith e colaboradores (1993) mostraram que a protena Noggin pode dorsalizar as clulas da zona marginal ventral na gastrulao e reespecificar seu destino a partir do mesoderma ventral (mesnquima e clulas do sangue) a destinos mais intermedirios (msculo, corao e rim pronfrico). Quando Smith e colaboradores removeram as zonas marginais ventrais (o mesoderma ventral presuntivo) da gstrula de Xenopus e as colocaram em um meio contendo a protena Noggin solvel, esses explantes produziram um mRNA especfico para msculo que normalmente reservado para explantes marginais dorsais. Esses explantes tambm se tornaram alongados (outra caracterstica do desenvolvimento dorsal). Entretanto, os explantes alongados no coravam como tecido notocordal. Esses experimentos mostram que a protena solvel Noggin pode induzir clulas mesodrmicas ventrais da gstrula a se tornarem msculo (mas no notocorda) e, portanto, ela se assemelha ao sinal do organizador que dorsaliza o tecido mesodrmico lateral (veja Figura 15.17). A protena Noggin tambm pode induzir tecido neural no ectoderma da gstrula sem a presena de qualquer mesoderma dorsal (Lamb et al.,1993). Quando Noggin adicionada ao ectoderma da gstrula (ou hemisfrio animal pigmentado), as clulas ectodrmicas so induzidas a expressar marcadores neurais especficos para o crebro anterior. Alm disso, os produtos gnicos para as clulas do msculo ou da notocorda no so induzidos pela protena Noggin. Como Noggin uma protena secretada sintetizada pelos derivados do organizador (o mesoderma da cabea e o cordomesoderma) durante a gastrulao (quando se d a induo), e desde que ela inativa a BMP4 (a qual ventraliza o embrio), considera-se que Noggin tem um papel na dorsalizao do mesoderma e na dorsalizao do ectoderma dorsal.*
FOLLISTATIN. Hemmati-Brivanhou e Melton (1994) demonstraram que a protena
Follistatin, ligante de activina, est presente no lbio dorsal do blastporo e posteriormente se torna restrita notocorda. Embora originalmente se pensasse ligar somente a activina, agora existe evidncia (Yamashida et al., 1995) que a Follistatin pode inibir as atividades da BMP7. A BMP7 necessria para a ativao da BMP4, assim pela inibio da BMP7, a Follistatin pode tambm prevenir a ventralizao do mesoderma. A Follistatin tambm tem um papel na dorsalizao do ectoderma. Parece que a activina (ou, provavelmente, uma protena semelhante activina, tal como a BMP7) necessria para a represso da induo neural. Ligando essa protena Follistatin a inibio liberada e permite que o tecido se torne neural (HemmatiBrivanlou et al., 1994; Hawley et al., 1995). interessante que Noggin, Chordin e Follistatin so todas inibidoras. Aqui vemos um princpio que a base de boa parte do desenvolvimento: a ativao freqentemente realizada inibindo um repressor. Isso pode ser explicado pelo fato de que em cada ncleo a maioria dos genes esto reprimidos. Para ativar um determinado gene, necessrio um inibidor dessa represso. Analogamente, a inibio freqentemente realizada pela supresso do inibidor do repressor. (Biologistas do desenvolvimento se acostumam a falar com negativas duplas e triplas). Nesse caso, o estado default do ectoderma se tornar neural, a no ser que sofra a ao de BMP4. As protenas do mesoderma organizador impedem a ao de BMP4 no ectoderma.
*Noggin pode tambm estar funcionando como parte do centro de Nieuwkoop. Um material do mRNA de noggin traduzido na blstula precoce (Smith e Harland, 1992) e uma investigao recente (Lustig et al., 1996) mostra que Noggin funciona com um co-fator, Xenopus nodal related1(Xnr-1), para induzir a gstrula precoce. Xnr-1 pode tambm estar envolvido na formao do eixo esquerdo-direito em Xenopus. Durante a neurulao, ele expresso assimetricamente no mesoderma da placa lateral, estando presente somente no lado esquerdo do embrio. Esse modelo de expresso se assemelha aquele dos genes nodal em pintos e camundongos, onde a expresso de nodal crtica para o estabelecimento do eixo esquerdo-direito (Captulo 16).
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Placa do assoalho ventral secundrio
Conjunto de neurnios motores secundrios Conjunto de neurnios motores secundrios
Placa do assoalho ventral doadora ou outras clulas secretando Hedgehog
Regio do neurnio Motor
Notocorda doadora
Placa do assoalho ventral Notocorda (A) (B) (C) (D)
Figura 15.24
Cascasta de indues iniciada pela notocorda no tubo neural recm-formado. (A) Dois tipos de clulas no tubo neural recm-formado. As clulas mais perto da notocorda se tornam as clulas da placa do assoalho ventral. Os neurnios motores emergem nos lados ventrolaterais. (B) Se uma segunda notocorda transplantada adjacente ao tubo neural, ela induz um novo conjunto de clulas da placa do assoalho e dois novos conjuntos de neurnios motores. (C) Se as clulas da placa do assoalho ventral so transplantadas adjacentes ao tubo neural, novos conjuntos de neurnios motores se diferenciam. (D) As interaes indutivas entre essas clulas. As setas vermelhas representam a secreo da protena Sonic hedgehog. (De acordo com Placzek, et al., 1990.)
SONIC HEDGEHOG. Sonic hedgehog utilizada aps a concretizao da maioria
dos eventos indutivos da neurulao. Ela usada para padronizar o tubo neural recm-formado. Sonic hedgehog expressa na notocorda e a poro aminoterminal dessa protena secretada (veja Figura 7.11). Se fragmentos da notocorda de um embrio so transplantados para as laterais de um tubo neural hospedeiro, esse formar, nas suas laterais, outro conjunto de clulas da placa do assoalho. Se um pedao da notocorda removido de um embrio, o tubo neural adjacente regio deletada no tem clulas da placa do assoalho (Figura 15.24; Placzek et al., 1990; Yamada et al.,1991). Essas clulas da placa do assoalho, uma vez induzidas, induzem a formao dos neurnios motores em um de seus lados. O mesmo resultado pode ser obtido se os fragmentos de notocorda so substitudos por aglomerados de clulas secretando Sonic hedgehog (Echelard et al., 1993; Roelink et al., 1994). A Sonic hedgehog das clulas da placa do assoalho capaz, em seguida, de polarizar o tubo neural. Ela induz os neurnios motores nas regies ventrolaterais, e impede a dorsalizao do tubo neural ventral antagonizando os efeitos de BMP4 originada na epiderme dorsal* (veja Captulo 7).
CERBERUS. A induo da estruturas mais anteriores da cabea realizada por uma protena secretada chamada Cerberus. Diferentemente de outras protenas secretadas, Cerberus promove a formao da glndula do cimento, olhos e placdios olfatrios. Entretanto, diferente de Noggin e Chordin, a protena Cerberus suprime a formao do mesoderma dorsal, enquanto induz o mesoderma cardaco e fgado (um derivado endodrmico do intestino anterior). Quando o mRNA de Cerberus foi injetado no conjunto de blastmeros vegetativos ventrais (D4) no estgio de 32 clulas, se formaram estruturas ectpicas da cabea (Figura 15.25; Bouwmeester et al., 1996). Essas estruturas da cabea foram produzidas tanto a partir das clulas injetadas como das clulas circundantes. O gene cerberus expresso naquelas clulas que lideram o movimento anterior das clulas em gastrulao para dentro do embrio. Essas so as clulas do endoderma involutivo (na camada profunda do organizador) que do origem ao intestino anterior e seus derivados, os quais esto sob a cabea. A mensagem
*BMP4 age como um agente ventralizador na formao do tubo neural (impedindo ativamente sua formao na parte ventral do embrio), mas uma vez que o tubo neural est produzido, a protena pode agir como um agente dorsalizante, sendo secretada da epiderme superior para dorsalizar o tubo neural (veja Captulo 7). Um parceiro verstil, ela estimular o desenvolvimento do msculo no mitomo, padroniza o desenvolvimento do dente, e at destri a rede formada entre nossos dedos da mo e do p. A BMP4 freqentemente pareada com a Sonic hedgehog na formao dos primrdios dos rgos.
619
Figura 15.25
O mRNA de Cerberus injetado em um nico blastmero D4 (vegetativo ventral) de um embrio de Xenopus de 32 clulas induz estruturas da cabea como tambm um corao e um fgado duplicados. Um olho secundrio (um nico olho ciclpico) e um placdio olfatrio podem ser vistos facilmente. (de Bouwmeester et al., 1996; fotografia cortesia de E. M. De Robertis.)
do cerberus dependente da atividade do resto do organizador, e a sua transcrio ativada por Follistatin, Noggin e Chordin. Isso pode explicar porque a transcrio de cerberus limitada regio do endoderma involutivo mais prxima ao organizador, uma regio que se sobrepe expresso de chordin. Fatores de transcrio induzidos no organizador Considera-se que as atividades do centro de Nieuwkoop ativam um conjunto de genes codificando fatores de transcrio no mesoderma acima dele. Foram encontrados vrios fatores de transcrio especficos do organizador; ou seja, eles so expressos somente no lbio dorsal do blastporo e na notocorda resultante. Duas dessas protenas so XANF-1 e Goosecoid. XANF-1 um fator de transcrio contendo o homeodomnio que pode ser um dos primeiros a ser expresso. No comeo da gastrulao, a XANF-1 est predominantemente nas camadas profundas do lbio dorsal do blastporo, os precursores do mesoderma da cabea, e uma injeo de mRNA de XANF-1 nos blastmeros ventrais induz a formao de um eixo secundrio. Essas clulas injetadas se tornam o mesoderma anterior do eixo secundrio (Zaraisky et al., 1995). Assim, a XANF-1 parece controlar o comportamento migratrio das clulas profundas do lbio dorsal do blastporo e a diferenciao dessas clulas em tecido do organizador. Goosecoid parece funcionar de maneira muito semelhante XANF-1. A mensagem para a Goosecoid foi encontrada fazendo uma varredura das bibliotecas de cDNA do lbio dorsal do blastporo com sondas para genes que so ativos na formao do eixo em Drosophila (Blumberg et al., 1991; Cho et al., 1991a). Os transcritos de goosecoid so detectados inicialmente no estgio de blstula tardia, indicando que esse um gene controlado pelo ncleo, e esses transcritos se acumulam na rea localizada diretamente sobre o lbio dorsal do blastporo nas clulas precursoras mesodrmicas dorsais (blastmero C1). Em culturas do hemisfrio animal pigmentado, a protena Vg1 ou a activina, mas no FGF2 ou Noggin, podem induzir a transcrio do gene goosecoid (Cho et al., 1991a; Thomsen e Melton, 1993). A expresso do mRNA de goosecoid tambm se correlaciona com o domnio do organizador em animais tratados experimentalmente. Quando LiCl usado para aumentar o mesoderma indutor do dorso-anterior da zona marginal, a expresso de goosecoid da mesma forma aumentado. Inversamente, quando ovos so tratados com luz UV antes da primeira clivagem, ambas, a induo dorso-anterior e a expresso de goosecoid, so significativamente inibidas. Injeo do comprimento total da mensagem goosecoid nos dois blastmeros ventrais do embrio de Xenopus com 4
620
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 15.26
Habilidade do mRNA de goosecoid para induzir um novo eixo. (A) Na gstrula, o embrio controle (no injetado ou injetado com mRNA semelhante a goosecoid mas sem o homeobox) tem um lbio dorsal do blastporo. (B) Um embrio no estgio de 16 clulas cujos blastmeros vegetativos ventrais foram injetados com a mensagem goosecoid. Note o lbio dorsal do blastporo secundrio. (C) Superior, duas nurulas injetadas com mRNA de goosecoid, mostrando dois eixos; inferior, duas nurulas controle. (D) Embrio duplicado produzido pela injeo de goosecoid. Foram induzidas estruturas completas da cabea. (De acordo com Cho et al., 1991a; Niehrs et al., 1993; cortesia de E. De Robertis.)
(A)
Xbra Noggin Goosecoid Xnr3 (B)
clulas faz com que a prognie desses blastmeros involuam, sofram extenso convergente e formem o mesoderma dorsal e o endoderma da cabea do eixo secundrio (Figura 15.26; Niehrs et al., 1993). Alm disso, experimentos com marcao (Niehrs et al., 1993) mostram que clulas injetadas com goosecoid so tambm capazes de recrutar para o eixo dorsal clulas vizinhas do hospedeiro. Resumindo, o centro de Nieuwkoop ativa o gene goosecoid codificando uma protena ligante de DNA que (1) ativa as propriedades de migrao (involuo e extenso convergente) das clulas do lbio dorsal do blastporo, (2) de forma autnoma, determina os destinos endodrmico da cabea e mesodrmico dorsal das clulas que o expressam, e (3) permite s clulas que expressam goosecoid recrutarem clulas vizinhas para dentro do eixo dorsal. Foi observado que Goosecoid ativa o gene Xotx2 no mesoderma anterior e no ectoderma presuntivo do crebro (Blitz e Cho, 1995). Xotx2 o homlogo do gene orthodenticle em Xenopus que essencial para o desenvolvimento do crebro em moscas e camundongos. A expresso gnica especfica para o organizador pode ser usada para subdividir o organizador precoce em regies tendo diferentes combinaes dessas mensagens (Figura 15.27; Vodicka e Gerhart, 1995). No comeo da gastrulao, enquanto as clulas do organizador involuem para o embrio, essas configuraes mudam. Dentro das clulas profundas, o goosecoid agora visto nas pores mais anteriores (na maior parte construda de clulas C1), especialmente o mesoderma da placa precordal da cabea. A sobreposio parcial dos genes noggin e Xbra define a notocorda, e a regio tendo Xbra sem noggin define o domnio destinado a se tornar o endoderma posterior. Um segundo domnio de expresso de noggin visto na placa neural anterior. [regul6.html]
Figura 15.27
Estrutura fina do organizador. (A) No comeo da gastrulao, o Xbra est nas clulas mais animais do organizador, enquanto o noggin est mais vegetal. As clulas vegetativas involuem primeiro e se localizam mais anteriormente. (B) Os mesmos fatores vistos perto do fim da gastrulao. As zonas de expresso so mais discretas e menos superpostas, e no h correlao entre a localizao original das clulas e seu padro de expresso gnica posterior. (De acordo com Vodicka e Gerhart, 1995.)
621
&
Especulaes
Como o Organizador Neuraliza o Ectoderma?
ESMO QUE a identidade das
molculas sinalizadoras esteja sendo estabelecida, o mecanismo de suas aes ainda um enigma. provvel que alm de bloquear o sinal ventralizante (BMP4), o organizador deve tambm ativar as clulas ectodrmicas para se tornarem a placa neural. Apesar de no se conhecer a(s) molcula(s) responsvel(s), possvel que a neuralizao possa se dar pela combinao de duas reaes separadas: o aumento do AMP cclico intracelular nas clulas ectodrmicas e a ativao
da Protena Quinase C (PKC) nas suas membranas celulares. Vrios estudos (Davids et al., 1987; Davids, 1988; Otte et al., 1988, 1989) mostraram que se somente um desses eventos ocorre, no h formao do tecido neural. Entretanto, se a Protena Quinase C e a adenil ciclase forem ativadas artificialmente nas membranas das clulas ectodrmicas, o tecido neural gerado. Nesse modelo, a induo neural realizada por duas reaes, e cada reao pode ser iniciada por uma molcula diferente. A participao de PKC na induo neural
natural foi novamente confirmada quando Otte e colaboradores (1991; Otte e Moon, 1992) demonstraram que a PKC do ectoderma dorsal difere do PKC do ectoderma ventral, tanto na sua estrutura como na sua habilidade de ser ativada por compostos externos. Somente a PKC encontrada no ectoderma dorsal pode ser correlacionada com a habilidade de responder a indutores naturais. possvel que ningum ainda tenha conseguido isolar o fator indutor neural natural porque vrios fatores esto agindo simultaneamente.
A especificidade regional da induo

A determinao das diferenas regionais Um dos mais fascinantes fenmenos na induo neural a especificidade regional das estruturas neurais que so produzidas. As regies do crebro anterior (arquenceflica), do crebro posterior (deuterenceflica) e espinocaudal do tubo neural devem estar exatamente organizadas em uma direo anterior para posterior. Dessa maneira, o tecido organizador no somente induz o tubo neural mas tambm especifica as regies do tubo neural. Essa induo especfica da regio foi demonstrada por Otto Mangold (1933) em uma srie de experimentos onde vrias regies do teto do arquntero de Triturus (salamandra-aqutica) foram transplantadas para embries em gstrula precoce (Figura 15.28). Aps a remoo da placa neural superadjacente, quatro sees sucessivas do teto do arquntero foram retiradas de embries que tinham acabado de completar a gastrulao e colocadas em blastoceles de gstrulas precoces. A poro mais anterior do teto do arquntero induziu os equilibradores e as pores do aparelho oral (Figura 15.28A); a prxima poro mais anterior induziu a formao de vrias estruturas da cabea, incluindo nariz, olhos, equilibradores e vesculas ticas (Figura 15. 28B); a terceira seo induziu a estrutura do crebro posterior (Figura 15.28C); e o segmento mais posterior induziu a formao do tronco dorsal e o mesoderma da cauda (Figura 15.28D). A induo do mesoderma dorsal- e no do ectoderma dorsal do sistema nervoso- pela ponta posterior da notocorda foi confirmada por Bjtel (1931) e Spofford (1945) que mostraram que o quinto posterior da placa neural d origem aos somitos da cauda e s pores posteriores do ducto pronfrico do rim. Alm disso, quando lbios dorsais do blastporo de embries precoces de salamandra (gstrulas precoces) foram colocados em outros embries precoces de salamandra, eles formaram cabeas secundrias. Quando os lbios dorsais de embries em estgio mais avanado foram transplantados a embries precoces de salamandra, eles induziram a formao de caudas secundrias (Figura 15.29; Mangold,
622
Figura 15.28
(A)
A especificidade regional da induo pode ser demonstrada implantando diferentes regies (coloridas) do teto do arquntero em gstrulas precoces de Triturus. Os animais resultantes tm partes secundrias. (A) Cabea com equilibradores. (B) Cabea com equilibradores, olhos e crebro anterior. (C) Parte posterior da cabea, deuterencfalo e vesculas ticas. (D) Segmento tronco-cauda. (De acordo com Mangold, 1933.)
(B)
Poro do teto do arquntero transplantado para gstrula precoce
Animal resultante
(C)
(D)
(A) Transplante do lbio dorsal de gstrula jovem
(B) Transplante do lbio dorsal de gstrula avanada
Figura 15.29
Ao indutora especfica regionalmente do lbio dorsal do blastporo. (A) Labios dorsais de blastporos jovens (que formaro a poro anterior do mesoderma dorsal) induzem estruturas anteriores quando colocadas em gstrulas jovens da salamandra aqutica. (B) Lbios dorsais de blastporos mais velhos colocados em gstrulas de salamandra similares produzem estruturas mais posteriores. (de Saxn e Toivonen, 1962, fotografias cortesia de L. Saxn.)
623
1933). Isso significa que as primeiras clulas do organizador a entrarem no embrio induzem a formao de crebros e cabeas, enquanto as clulas que formam o lbio dorsal do blastporo de embries em estgio mais avanado induzem as clulas acima delas a se tornarem medulas espinhais e caudas. Um fenmeno similar ocorre em embries de pinto (Storey et al., 1992). O modelo do duplo gradiente Nos anos de 1950, P. Nieuwkoop (1952) e Toivonen e Saxn (1955) propuseram modelos para a especificidade regional que envolviam duas etapas. Na primeira delas, o tecido neural era induzido pelo organizador. Esse tecido neural era o tecido arquenceflico do crebro anterior. A segunda etapa consistia em um sinal de posteriorizao distribudo como um gradiente, com maior concentrao caudal. O sinal de posteriorizao agia no ectoderma anterior transformando-o em crebro posterior e tecido da medula espinhal. A evidncia de Nieuwkoop veio de transplantes de dobras do ectoderma competente em vrias posies ao longo do eixo ntero-posterior da gstrula hospedeira. As pores proximais dessas dobras produziram estruturas tpicas da regio de insero do hospedeiro, enquanto que a parte mais distal da dobra se desenvolveu em estruturas neurais de natureza mais anterior do que da insero (Figura 15.30). A evidncia de Toivonen e Saxn veio de estudos com indutores artificiais especficos de tecidos. Foi observado que a medula ssea de cobaia, por exemplo, induz somente estruturas mesodrmicas. Fragmentos de fgado de cobaia, entretanto, podiam induzir estruturas do crebro anterior. Eles implantaram os dois indutores juntamente dentro da blastocele da mesma gstrula precoce. Enquanto o fgado induziria somente o crebro anterior e a medula ssea induziria somente o mesoderma, os dois juntos induziram tudo normal; o crebro anterior, o crebro posterior, a medula espinhal e o mesoderma do tronco (Toivonen e Saxn, 1955). Portanto, a especificidade regional da induo neural pode ser devida a gradientes opostos de substncias indutoras do crebro anterior e da medula espinhal (Figura 15.31). Resultados semelhantes vieram de estudos onde o ectoderma neural anterior foi misturado
Anterior Posterior
Figura 15.30
Evidncia para um modelo de induo neural em dois estgios: ativao e transformao. Uma dobra do ectoderma de gstrula foi implantada em uma regio da placa neural. As estruturas mais anteriores esto no lado esquerdo e 1-4 representam diferentes estruturas neurais. Dobras do ectoderma de gstrula no especfica tendiam a se diferenciar em estruturas neurais anteriores, mas eram posteriorizadas por material oriundo do posterior do embrio. (De acordo com Doniach, 1993.)
(A)
Medula ssea
Fgado
Figura 15.31
(B)
Crebro anterior Olho Nariz Equilibrador Crebro posterior Vescula do ouvido Medula espinhal Notocorda Somitos Prnefros Nadadeira
Fgado 113 casos
Fgado + medula ssea 66 casos
Medula ssea 34 casos
Evidncia para o modelo de induo em gradiente duplo. (A) Implantao simultnea de um indutor neuralizante (fgado de cobaia) e um indutor de mesoderma (medula ssea de cobaia) na blastocele de uma gstrula precoce da salamandra aqutica. (B) Resultados dessa implantao. Estruturas do crebro posterior e da medula espinhal que eram intermedirias entre o crebro anterior e o mesoderma no mapa de destino da placa neural, no foram bem induzidas por cada um dos indutores. Quando os dois indutores foram implantados em conjunto, essas estruturas foram produzidas. (De acordo com Toivonen e Saxn, 1955.)
624
Crebro anterior
Crebro posterior
Medula espinhal
Porcentagem
Figura 15.32
Evidncia para a induo em gradiente duplo e dois estgios no embrio de anfbios. A regio anterior da placa neural (ou seja, clulas j induzidas naturalmente por um indutor do crebro anterior, aqui vistas em cor) e clulas da notocorda posterior foram removidas e misturadas em diferentes propores. A freqncia de estruturas intermedirias (crebro posterior) aumenta medida que a propores de clulas da placa neural anterior e clulas mesodrmicas se aproxima de 1:1. Isso sugere que a especificao regional ocorre aps a determinao das clulas da placa neural como neurais. (de Gilbert e Saxn, 1993.)
com diferentes quantidades de mesoderma dorsal posterior (Figura 15.32; Toivonen e Saxn, 1968). Assim, o tecido neural foi determinado a ser inicialmente crebro anterior, mas em seguida foi posteriorizado de maneira gradativa por substncias caudais. A maioria dos modelos de induo neural convergiram a um esquema que inclui (1) uma etapa de ativao inicial que determina que as clulas tm capacidade de se converterem em clulas neurais do crebro anterior e (2) uma etapa de transformao na qual um gradiente de material do mesoderma posterior causa a posteriorizao da especificao neural (Figura 15.33). [regul4.html] Correlatos moleculares da caudalizao neural Cada um dos indutores neurais: Chordin, Noggin e Follistatin induz exclusivamente tecidos neurais anteriores (tipo de crebro anterior). Ento, quais podem ser o(s) fator(es) que posteriorizam o tubo neural? Vrios estudos recentes apontam para o FGF como sendo o fator que especifica que o ectoderma neural se torne mais caudal (Cox e Hemmati-Brivanlou, 1995; Lamb e Harland, 1995). Quando o ectoderma de gstrula precoce (ainda sem a subcamada de mesoderma dorsal) foi isolado e
Formao da cabea anterior (Cerberus) Ativao neural (Chordin, Noggin, Follistatin)
Transformao posterior
Anterior
Posterior
Figura 15.33
Ativao: (Chordin Noggin Follistatin Xnr3) Ativao da cabea anterior (Cerberus) Anterior
Transformao posterior FGF, RA, Wnt? Posterior
O modelo de ativaotransformao na padronizao neural. De acordo com este modelo, a induo neural original (ativao) faz com que o ectoderma neural seja especificado como o tipo de clulas neurais mais anteriores. A caudalizao (transformao) dessas clulas realizada por um gradiente de uma outra substncia, cuja concentrao a mais alta posteriormente. (De acordo com Doniach, 1995.)
Mesoderma dorsal
Lbio dorsal do blastporo Endomesoderma anterior Ectoderma Endoderma
625
Concentrao de RA em contato com a nurula tardia No tratada
cido retinico Controle rRNA Glndula do cimento XCG-1 Glndula do cimento XAG-1
XA-1 Cabea XIF-1 Cabea
XIHbox6 Tronco Sistema neural N-CAM
Xhox36 Cauda
Figura 15.34
cido retinico (RA) causa a posteriorizao de estruturas neurais. (A) Embries em nurula tardia foram expostos continuamente a diferentes concentraes de cido retinico e seu crescimento foi permitido at que os controles atingissem o estgio de girinos. (B) Efeito na expresso do mRNA do marcador neural quando as blstulas so tratadas com 10-6 M de cido retinico por 2 horas (suficiente para produzir girinos aceflicos). Efeito inibitrio pode ser visto nos genes expressos mais anteriormente. (A de acordo com Ruiz i Altaba e Jessell, 1991; B de acordo com Sive et al., 1990.)
neuralizado por Noggin, Chordin ou Follistatin foram encontrados marcadores neurais do tipo anterior. Quando o tecido foi incubado com um indutor neural mais FGF2, o ectoderma expressou marcadores neurais mais posteriores. Realmente, o FGF2 capaz de induzir o crebro anterior a expressar genes especficos do crebro posterior. Quando a sinalizao de FGF bloqueada in vivo por um receptor dominante negativo do FGF, os girinos resultantes no tm seus segmentos posteriores (Amaya et al., 1991). O FGF2 provavelmente no o FGF posteriorizador natural em Xenopus, pois no secretado e no est localizado em lado nenhum do embrio. Entretanto, uma forma embrionria de FGF (eFGF, um FGF de Xenopus semelhante ao FGF4 de mamferos) encontrada no mesoderma posterior e do broto da cauda de Xenopus e tem os mesmos efeitos que FGF2 (Isaacs et al., 1992). A super expresso de eFGF estimula vrios genes expressos posteriormente, incluindo o homlogo de caudal em Xenopus. Isso, por sua vez, parece ativar a expresso de genes Hox mais posteriores, levando maior especificao posterior do sistema nervoso (Pownall et al., 1996). Alm dos FGFs, outros fatores podem estar envolvidos na padronizao do sistema nervoso de Xenopus. Quando gstrulas precoces de Xenopus so tratadas com concentraes nanomolares a micromolares de cido retinico (AR), seu desenvolvimento do crebro anterior e intermedirio prejudicado de forma dependente das concentraes usadas (Figura 15.34A; Papalopulu et al., 1991; Sharpe, 1991). Quando so usadas concentraes mais baixas, a induo do tecido neural no parece ser inibida, mas so produzidas menos mensagens e estruturas do crebro anterior (Figura 15.34B; Durston et al., 1989, 1991; Sive et al., 1990). O cido retinico parece afetar tanto o mesoderma como o ectoderma. Ruiz i Altaba e Jessell (1991) verificaram que o mesoderma dorsal anterior de gstrulas tratadas com cido retinico eram incapazes
626

o
Figura 15.35
Xwnt3a pode caudalizar o tecido neural anterior. Explantes de ectoderma competente ligados ao lbio dorsal do blastporo foram isolados como na Figura 15.30. Os mRNAs especficos expressos foram identificados por PCR de transcriptase reversa. Nesta figura, os marcadores neurais expressos mais anteriormente esto localizados mais ao alto. A superexpresso de Wnt3a no embrio com Xwnt3a anulou os marcadores neurais mais anteriores. As regies ectodrmicas de embries no injetados ou aquelas superexpressando uma protena controle (prolactina) no foram afetadas. (de McGrew et al., 1995; fotografia cortesia de R. T. Moon.)
o No in jetad
Embri
Xwnt3
XAG1 XANF2
Glndula do cimento Glndula pituitria
OtxA
Crebro anterior
En2 Krox20 Xlhbox6 NCAM
Crebro intermedirio Crebro posterior Medula espinhal Neural (geral)
Actina muscular
Mesoderma
de induzir estruturas da cabea em embries hospedeiros, e Sive e Cheng (1991) encontraram que o ectoderma tratado com cido retinico no respondia induo anterior do mesoderma de gstrulas no tratadas. Outro candidato para fator de caudalizao o Wnt3a de Xenopus (McGrew et al., 1995). Essa protena encontrada no ectoderma neural da nurula precoce. Quando o ectoderma isolado das gstrulas de Xenopus mas permanece ligada ao lbio dorsal do blastporo, o ectoderma desenvolve uma seqncia de marcadores neurais ntero-posteriores. Se o embrio tivesse sido injetado com RNA de Xwnt3a (causando a super expresso dessa protena), os marcadores anteriores seriam perdidos (Figura 15.35).
&
Especulaes
Sinais verticais e horizontais do organizador

OSSA DISCUSSO se limitou, at o momento, aos sinais que vo verticalmente do organizador ao ectoderma que a ele se sobrepe. Sabe-se agora que existe um segundo conjunto de sinais que produzido pelo lbio dorsal do blastporo e enviado horizontalmentre atravs do plano do ectoderma (Figura 15.36). Dados recentes sugerem que ambas, a induo vertical atravs do cordomesoderma e a induo horizontal (planar) atravs do ectoderma, so necessrias para a induo embrionria completa. E qual seria o papel desses sinais? Primeiro, existe alguma evidncia que sinais planares podem estar en-
volvidos nas atividades neuralizantes do organizador. possvel que eles forneam os sinais que faltam para ativar a neurulao (como oposto aos sinais que bloqueiam a ventralizao). Se sinais planares
movimentando-se do lbio dorsal do blastporo atravs do ectoderma so responsveis pela induo neural, ento a fonte original de tais sinais deveria ser o
Sinais verticais Sinal planar
Arquntero
Figura 15.36
Duas maneiras de induzir o eixo dorsal. No mecanismo planar, molculas so transferidas do tecido do lbio dorsal do blastporo atravs do plano do ectoderma. No mecanismo vertical, molculas solveis do cordomesoderma derivado do lbio dorsal do blastporo induzem as clulas acima delas para se tornarem tecido neural. (de Doniach, 1993.)
Blastocele
Anterior
Posterior
627
epitlio da zona marginal dorsal e no as clulas mesenquimatosas profundas daquela zona do organizador. Shih e Keller (1992) mostraram que isso correto. Eles repetiram os experimentos de Spemann e Mangold, mas em lugar de usar a zona marginal dorsal (DMZ) inteira, eles transplantaram as clulas epiteliais ou as clulas profundas da DMZ (as quais marcaram com partculas fluorescentes de dextrano). As clulas epiteliais tinham todas as propriedades indutivas do organizador de Spemann e se diferenciaram em tecido mesodrmico. O epitlio tambm recuperou os embries ventralizados por irradiao com luz ultravioleta. Essas atividades do organizador no puderam ser realizadas nem pelas clulas profundas da DMZ nem pelas clulas marginais ventrais. Uma protena indutora, recentemente descoberta, Xenopus nodal-related-3 (Xnr3), foi encontrada nessa camada superficial do organizador, e pode converter hemisfrios pigmentados do plo animal em ectoderma neural anterior. Ao contrrio de outros indutores, ela no dorsaliza o mesoderma. Ainda no se sabe se essa protena parte do sistema sinalizador planar (Hansen et al., 1997). Entretanto, os sinais planares no so considerados suficientes para a induo neural. Nieuwkoop e Koster (1995) impediram a ocorrncia de induo vertical durante a gastrulao de Xenopus, e observaram que no houve diferenciao neural. Alm do mais, se o fragmento ligante de fibronectina, RGD, for injetado na blastocele de gstrulas de Rana pipiens, o mesoderma axial no migra em direo ao plo animal. Em lugar disso, ela se divide em dois ramos que involuem horizontalmente ao longo do equador do embrio, formando duas notocordas localizadas lateralmente. Cada notocorda induz uma placa neural, mas uma placa neural no se forma no ectoderma dorsal, onde os sinais planares se espalhariam (Saint-Jeannet e Dawid, 1994). Assim, nesse modelo, os sinais planares so redundantes ou podem apoiar os sinais verticais da notocorda. No segundo modelo, os sinais planares podem ser importantes contribuintes para a especificidade regional da induo. Doniach e seus colegas (1992) mostraram que informaes instrutivas, posicionalmente especficas so fornecidas por sinais planares atravessando o ectoderma. Quando so usados explantes de gstrulas
(A)
Plo animal
(B) Corte
Ventral
Corte Blastporo Dorsal
(C)
Embrio controle
(D)
Tecido do explante
Figura 15.37
Padro de expresso dos marcadores neurais induzidos por contato com o lbio dorsal do blastporo no plano do ectoderma. (A) Seo sagital de gstrula precoce de Xenopus mostrando onde foram feitos os cortes. (B) Explante demonstrando a polaridade ntero-posterior esperada pelo mapa de destino: a regio branca a epiderme; a regio pontilhada o neuroectoderma presuntivo; a regio colorida o mesoderma dorsal; a regio estriada o teto do arquntero. Os explantes foram colocados sob lamnulas para impedir a migrao do mesoderma. (C) Expresso dos marcadores neurais no embrio controle, estgio 21. Os genes homeobox engrailed-2 e XlHbox6 so expressos na borda do crebro do posteriorintermedirio e na medula espinhal, respectivamente; o gene Krox-20 da protena do dedo de zinco expresso nos rombmeros 3 e 5 do crebro posterior. (D) A mesma ordem de expresso vista no ectoderma daqueles explantes tendo uma conexo com o lbio dorsal do blastporo. (De acordo com Doniach et al., 1992.)
precoces de Xenopus de tal forma que o ectoderma retm contato com o lbio dorsal do blastporo mas no com o mesoderma, no s so induzidos no ectoderma os marcadores pan-neurais NCAM e NF3, mas tambm so expressos quatro marcadores neurais especficos para posio -engrailed-2, Krox-20, XlHbox1 e XlH-box6- no explante de ectoderma na seqncia ntero-posterior apropriada (Figura 15.37). Parece ento que os sinais horizontalmente indutivos do lbio dorsal do blastporo so suficientes para induzir o padro neural ntero-posterior. Ruiz i Altaba (1992) tambm confirmou uma extensa padronizao neural nessas exogstrulas, mostrando que o padro de marcadores neurais nas exogstrulas reflete os padres normais, com exceo do crebro anterior e regies ventrais. Ele tambm fornece evidncia de que a transmisso desses sinais horizontais se
d atravs da notoplaca (o ectoderma acima da notocorda). No terceiro modelo, os sinais planares complementam os sinais verticais na criao do tubo neural. Os sinais planares parecem estar envolvidos na induo da extenso convergente do crebro posterior e do ectoderma da medula espinhal adjacente a ele (enquanto que o dobramento da placa neural em um tubo neural parece ser induzido pela notocorda) (Keller et al., 1992; Nieuwkoop e Koster, 1995). Ainda estamos tentando localizar todos os pedaos do quebra-cabea da induo, enquanto novos pedaos esto sendo descobertos. Spemann previu que os cientistas descobririam que o embrio usava mais de um mecanismo (segurana dupla) para atingir seus objetivos. O embrio pode muito bem estar usando ambos os sinais planares e verticais para induzir seu sistema nervoso.
628
Genes homeobox na especificao neural Uma das mais espetaculares descobertas desta dcada foi que moscas e camundongos usam os mesmos genes homeobox para especificar regies ao longo do eixo ntero-posterior. Entretanto, a anlise dos genes homeobox em Xenopus no progrediu tanto devido a impossibilidade de se fazer anulao (knock out) de genes nessas rs. Como veremos no Captulo 16, o cido retinico capaz de converter uma parte do corpo do camundongo em uma parte mais posterior, causando a expresso de genes homeobox que so caractersticos da regio mais posterior. Isso tambm se d em Xenopus. Tanto o cido retinico como o eFGF se mostraram capazes de alterar a expresso de genes Hox. Pownall e colegas (1996) mostraram que o eFGF promove a expresso de genes Hox posteriores no ectoderma de Xenopus, e tanto Cho e colegas (1991b) como Sive e Cheng (1991) mostraram que o cido retinico altera a expresso de genes homeobox em uma direo posterior tanto no ectoderma como no mesoderma. Assim, em uma variao do modelo de dois estgios antes proposto, agora prope-se que a induo neural leva criao de uma determinao neural anterior (do tipo crebro anterior) que influenciada por um gradiente posterior de cido retinico, eFGF ou Wnt3a para a criao de especificidades regionais (Otte et al., 1991; Sharpe, 1991). Tal gradiente de cido retinico (dez vezes maior no posterior do que no anterior) foi detectado no mesoderma dorsal de nurulas precoces de Xenopus (Chen et al., 1994).
Competncia e cascatas indutivas

As interaes indutivas primrias, apesar de complexas, no podem construir o embrio inteiro. Entretanto, a formao do tubo neural, mesoderma dorsal, endoderma farngeo e outros tecidos cria as condies para uma cascata de eventos indutivos posterior. Interaes pelas quais um tecido interage com outro para dirigir especificamente seu destino so chamadas interaes secundrias.* Qualquer sistema de induo embrionria tem pelo menos dois componentes: um tecido capaz de produzir o estmulo indutor e um tecido capaz de receber e responder ao estmulo. At agora, estivemos vendo a especificidade de produo; agora precisamos ver a especificidade das clulas que respondem ao estmulo. A habilidade para responder de uma forma especfica a um dado estmulo chamada competncia. Ns vimos que na gstrula precoce, um lbio do blastporo implantado pode induzir uma nova placa neural e eixo embrionrio em qualquer lugar do embrio onde ele pode encontrar ectoderma. Entretanto, com o aumento da idade embrionria, o ectoderma perde sua habilidade de responder, e a implantao de um lbio dorsal do blastporo abaixo da epiderme prospectiva de um embrio em estgio de nurula, no causar a formao de uma nova placa neural. O embrio perdeu sua competncia para responder ao novo lbio do blastporo. Apesar do ectoderma da nurula tardia no ser mais competente para responder ao lbio do blastporo, ela se tornou competente para responder a novos indutores. Essa competncia pode ser localizada em reas determinadas. Durante a gastrulao e neurulao precoce, o ectoderma da cabea (mas no o ectoderma do tronco) se torna competente para formar o cristalino, o nariz e os placdios do ouvido. Essa competncia adquirida porque a regio da placa neural est atuando sobre ele (Henry e Grainger, 1990). Assim, a regio da cabea na nurula agora competente para responder ao contato da vescula ptica (derivada do crebro anterior) para se tornar cristalino.
*Apesar das indues que se seguem s indues embrionrias primrias terem, freqentemente, sido chamadas de secundrias, no existe diferena conceitual entre elas. Retornaremos s indues secundrias no Captulo 17.
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Mais ainda, uma vez que um tecido foi induzido, ele pode induzir outros tecidos. Os blastmeros D1 do centro de Nieuwkoop induzem as clulas acima dele a se tornarem o organizador. O organizador ento induz o ectoderma acima dele a se tornar o tubo neural. O tubo neural pode induzir o ectoderma da cabea a formar o cristalino. E as indues continuam. Mais ainda, um tecido pode induzir vrios outros. O organizador induz tanto o mesoderma como o ectoderma. A Sonic hedgehog da notocorda no induz somente a placa do assoalho no tubo neural; originando-se tanto da placa do assoalho como da notocorda, A Sonic hedgehog induz o somito ventral mediano a se tornar o esclertomo formador de cartilagem (veja Figura 9.6; Fan e Tessier-Lavigne, 1994; Johnson et al., 1994). Continuaremos nossa discusso de indues secundrias no Captulo 17. Estamos finalmente dando nomes aos agentes e fatores solveis dos embriologistas experimentais. Estamos finalmente delineando as vias intercelulares dos fatores parcrinos e fatores de transcrio que constituem os primeiros passos nos processos da organognese. O programa internacional de pesquisa iniciado pelo laboratrio de Spemann na dcada de 1920 est chegando a sua concluso. Mas essa pesquisa encontrou nveis de complexidade muito mais profundos que Spemann teria concebido, e da mesma forma que seus experimentos nos mostraram o quanto no sabamos, assim hoje, enfrentamos um novo conjunto de problemas gerados pelas nossas solues aos problemas mais velhos: Como iniciado o centro de Nieuwkoop? Qual a atividade de Siamois? Como o mesoderma se torna padronizado? Como so limitados os sinais da notocorda? Como a notocorda se diferencia? Como o ectoderma adquire sua competncia? Analisando o campo em 1927, Spemann observou: Ns ainda estamos em presena de enigmas, mas no sem a esperana de os resolver. E enigmas com esperana de soluo - o que mais um cientista poderia desejar? O desafio ainda permanece.
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CAPTULO 16 Estabelecimento dos eixos corporais em mamferos e aves
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Estabelecimento dos eixos corporais em mamferos e aves
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Entre o quinto e o dcimo dia, a pequena massa disforme de clulas germinativas diferencia-se no plano geral da construo do embrio [do camundongo] e de seus rgos. um pouco como uma massa de ferro transformando-se numa nave espacial. Realmente, esse o maior milagre que ns ainda podemos imaginar e aceitar, e ao mesmo tempo to comum, que temos que nos forar para nos maravilhar com o carter maravilhoso dessa maravilha. MIROSLAV HOLUB (1990) sabido que a natureza trabalha constantemente com os mesmos materiais. Ela engenhosa em variar apenas as formas. Como se ela estivesse restrita s mesmas idias primitivas, vemo-la tendendo sempre a fazer com que os mesmos elementos reapaream, com o mesmo nmero, nas mesmas circunstncias e com as mesmas conexes. E. GEOFFROY SAINT-HILAIRE (1807)
STE CAPTULO DETALHA parte da pesquisa que forneceu conhecimentos sobre a maneira como foram estabelecidos os eixos do organismo dos mamferos e aves. Muito deste trabalho utiliza dados fornecidos pela anlise de embries cujo desenvolvimento ficou malformado atravs de mutaes ou rompido por determinados produtos qumicos. Apesar das tentativas do citado savant Geoffroy Saint-Hilaire (que acreditava que todos os animais do mundo compartilhavam de um plano corporal em comum), a maioria dos biologistas do desenvolvimento no teria predito que o plano corporal de moscas e de mamferos seria especificado pelo mesmo conjunto de genes. Tendo divergido h 500 milhes de anos atrs, o corpo da mosca e o corpo do vertebrado parecem excepcionalmente diferentes. A maioria dos insetos especifica seus eixos no citoplasma comum do blastoderma sincicial, ao passo que os eixos de vertebrados so especificados pelas interaes indutivas entre grupos de clulas. No embrio de Drosophila, o plano corporal geral especificado enquanto as clulas so uma monocamada cilndrica envolvendo o vitelo; nos mamferos, as clulas j sofreram extensa movimentao quando suas partes corporais so especificadas. A formao dos apndices nos insetos resulta da extenso dos discos imaginais, ectodrmicos enquanto o membro do mamfero gerado por complexas interaes indutivas entre as clulas mesodrmicas e as ectodrmicas que migraram para essas reas. Porm, estudos recentes mostraram que o eixo ntero-posterior de mamferos em desenvolvimento especificado pelos mesmos genes hometicos que especificam o eixo do corpo de Drosophila. Realmente, a seqncia homeobox foi chamada a pedra de Rosetta da Biologia do desenvolvimento (Riddihough, 1992; Slack e Tannahill, 1993), porque nos permite transferir nosso conhecimento gentico de embries de Drosophila para a regio menos conhecida do desenvolvimento dos mamferos.
Iniciando o eixo ntero-posterior

Estabelecendo um Centro de Nieuwkoop O estabelecimento do organizador parece ser semelhante para todos os vertebrados. Nos peixes telesteos, as clulas do blastoderma permanecem relativamente coerentes at a gastrulao, e os precursores mesodrmicos formam um cinto ao redor da margem, adjacente s clulas vitelnicas (Wilson et al., 1995). Existe evidncia
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Figura 16.1
Uma estratgia comum para estabelecer o centro de Nieuwkoop em vertebrados. Durante a oognese, determinantes maternos inativos (crculos abertos) so transportados (talvez com o vitelo) para um novo ambiente citoplasmtico. Isso resulta em sua converso para uma forma ativa (crculos cheios). No ovo de anfbio isso conseguido por rotao citoplasmtica. Nos embries de telesteos e aves o mecanismo no conhecido, mas os determinantes ativados ficam concentrados perto de um grupo de clulas da margem mesodrmica. (Segundo Grunwald e Wilson, 1996.)
Redistribuio citoplasmtica ativa localmente os determinantes maternos
Distribuio de determinantes ativados na blstula tardia
Anfbio
Dorsal
Telesteo Clula do vitelo
Dorsal
Ave Vitelo
(Openheimer, 1936; Tung et al., 1945; Grunwald e Wilson, 1996) que o futuro lado dorsal da clula vitelnica age como um centro de Nieuwkoop, transferindo fatores maternos para o blastoderma (Figura 16.1). Nos embries de aves (e presumivelmente tambm em mamferos) a zona marginal posterior (PMZ) pode ser equivalente ao centro de Nieuwkoop (Eyal-Giladi e Khaner, 1989; Khaner e Eyal-Giladi, 1989). Experimentos de transplante demonstraram que esse o local onde as clulas se renem para formar a linha primitiva. Pensou-se que o hipoblasto tinha habilidade indutora de eixos, mas estudos recentes (Khaner, 1995) sugerem que essa capacidade reside somente na PMZ. O hipoblasto parece apenas dirigir os movimentos subseqentes da linha. A identificao da zona marginal posterior do pinto com o centro de Nieuwkoop reforada pela descoberta de que o homlogo Vg1 do pinto transcrito nessa regio. Alm disso, quando clulas cultivadas secretando a protena Vg1 madura (processada) do pinto so colocadas ao longo das bordas laterais do blastoderma, elas induzem a formao de novas linhas primitivas (Seleiro et al., 1996). Tal como o centro Nieuwkoop de anfbios, a futura posio da PMZ fixada pouco depois da fecundao e depende da gravidade e rotao. Tecidos Expresso Gnica em Tecidos Organizadores Conforme mencionado no Captulo 6, o homlogo mamfero do lbio dorsal do blastporo dos anfbios o seu ndulo no terminal anterior da linha primitiva. Em aves, esse chamado ndulo de Hensen, e em mamferos (apesar de ter sido primeiro descrito por Hensen em coelhos), essa estrutura freqentemente chamada apenas de ndulo. A linha primitiva porta-se como os lbios laterais do blastporo. O ndulo contm muitas das mesmas protenas encontradas no organizador da r, incluindo Goosecoid, Nodal, Lim-1 e HNF3. O gene nodal essencial para a iniciao da linha primitiva e para sua contnua manuteno. Sua expresso primeiro vista na margem ventral (onde comea a gastrulao). Em seguida, a protena Nodal vista na regio mais anterior da linha (Figura 16.2; Conlon et al., 1994). Quando esse gene deletado, o embrio em desenvolvimento tem uma linha defeituosa e no pode gastrular. Mais tardiamente na gastrulao (como veremos), a expresso do gene nodal importante na formao do eixo esquerdo-direito do embrio.
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De maneira semelhante, o mRNA goosecoid primeiro visto nas clulas da foice de Koller, quando as clulas que formam a linha primitiva a se agregam. Ele , em seguida, detectado no ndulo de Hensen, medida que a linha se movimenta para frente. Porm, quando o ndulo regride, as clulas expressando goosecoid permanecem no mesoderma da cabea e no endoderma farngeo (placa precordal) tal como nos anfbios; medida que se forma a regio da cabea, a expresso de goosecoid ocorre nas clulas mais anteriores (Izpisa-Belmonte et al., 1993). Sua expresso nessas clulas parece ser crtica para a induo dos genes envolvidos na formao da cabea. Se os genes goosecoid forem deletados em embries de camundongo, os eixos se formam normalmente, mas a cabea no se forma adequadamente (Rivera-Prez et al., 1995). Outro gene, Lim-1, tambm expresso nessas clulas, e camundongos que tm os seus genes Lim-1 erradicados no desenvolvem cabeas (veja Figura 7.17). O gene HNF-3 se parece com genes semelhantes no organizador de Xenopus (XFH1, XFD1/1 e pintallavis). O HNF-3 encontrado no mesoderma precordal que considerado induzir a especificidade regional no crebro anterior e no mesencfalo, e quando o gene deletado, no se forma o ndulo. Os embries tm severas deficincias no seu mesoderma da cabea e na notocorda, deixam de gastrular adequadamente, e no apresentam estruturas do prosencfalo e mesencfalo (Ang e Rossant, 1994; Weinstein et al., 1994). Enquanto Goosecoid, Lim-1 e HNF-3 parecem ser necessrias para especificar clulas do mesoderma dorsal anterior, o eixo dorsal mdio e posterior parece ser especificado pela protena Brachyury (T) (MacMurray e Shin, 1988; Yanagisawa, 1990; Stott et al., 1993). A formao e a diferenciao da notocorda requerem a expresso do gene T (Gluecksohn-Schoenheimer, 1938; Herrmann, 1991; Rashbass et al., 1991), e mutaes do gene Brachyury causam malformaes do eixo posterior (Figura 2.25C). medida que o ndulo comea a se formar, ele comea a secretar fator de espalhamento (scatter factor). Essa protena parece promover a habilidade das clulas epiblsticas responderem a sinais de induo do ndulo e/ou da notocorda (Streit et al., 1995.) Conforme discutido no Captulo 6, a linha primitiva se alonga, e o tubo neural formado ao longo da linha mediana do embrio. O mesoderma precordal considerado induzir as estruturas da cabea, ao passo que a notocorda pode induzir o crebro posterior e a medula espinhal. medida que o tubo neural depositado, torna-se especificado para o tipo de tubo neural que vir a ser - prosencfalo, mesencfalo, crebro posterior ou medula espinhal. O mesoderma e o endoderma so padronizados de maneira semelhante. Estudos recentes sugerem agora que essa especificao conseguida pelos mesmos genes homeobox, que especificam o eixo nteroposterior em Drosophila.
Figura 16.2
Expresso do gene organizador em embries de camundongo em desenvolvimento. Expresso do gene nodal durante a extenso da linha primitiva. (Fotografia cortesia de M. R. Kuehn.)
Especificando o eixo ntero-posterior de mamfero: A hiptese do cdigo Hox

Homologia dos Complexos de Genes Hometicos entre Drosophila e Mamferos O complexo de genes hometicos de Drosophila (HOM-C) no cromossomo 3, contm as classes Antennapedia e Bithorax de genes hometicos e pode ser visto como uma unidade funcional nica. (Realmente, em outros insetos, como o caruncho da farinha Tribolium, ele uma unidade nica.) Os genes HOM-C esto arranjados na mesma ordem geral que seu padro de expresso ao longo do eixo ntero-posterior, os genes mais 3 (labial) sendo requeridos para produo das estruturas mais anteriores, os genes mais 5 (AbdB) especificando o desenvolvimento do abdome posterior. Genomas humanos e do camundongo contm quatro cpias de HOM-C por conjunto haplide (Hox A a D no camundongo, HOXA a D em humanos; Boncinelli et al., 1988; McGinnis e Krumlauf, 1992; Scott, 1992). No somente so encontrados
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os mesmos tipos gerais de genes hometicos em ambos, moscas e mamferos, mas a ordem desses genes nos respectivos cromossomos notavelmente semelhante. E caso essa semelhana no seja suficiente para argumentar a favor de um esquema comum de formao axial, foi descoberto que o padro de expresso desses genes segue o mesmo modelo: aqueles genes de mamferos homlogos aos genes de Drosophila: labial, proboscipedia e Deformed so expressos anteriormente, enquanto os genes homlogos aos genes Abdominal-B da Drosophila so expressos posteriormente. Os genes mamferos Hox/HOX so numerados de 1 a 13, comeando daquele terminal do complexo sendo expressos mais anteriormente. A Figura 16.3 mostra as relaes entre os conjuntos de genes hometicos da Drosophila do camundongo. Os genes equivalentes em cada complexo do camundongo (como Hoxa1, Hoxb-1 e Hoxd-1) so chamados de grupo parlogo. considerado que os quatro complexos Hox de mamferos foram formados de duplicaes cromossmicas. Como no existe uma correspondncia um-para-um entre os genes HOM-C de Drosophila e os genes Hox de mamferos, provvel que tenham ocorridos duplicaes independentes depois que esses dois ramos animais divergiram (Hunt e Krumlauf, 1992). Expresso de Genes Hox no Sistema Nervoso Central e seus Derivados A expresso do gene Hox pode ser vista ao longo do eixo dorsal (tubo neural, crista neural, mesoderma paraxial e mesoderma superficial) do limiar anterior do crebro posterior at a cauda. Tambm vista nos derivados desses tecidos, especialmente os derivados das clulas da crista neural. Por exemplo, a regio do crebro anterior da cabea d origem no s ao crebro anterior e seus gnglios cranianos, mas tambm cartilagem das orelhas, mandbula e pescoo, arcos articos, e rgos como as glndulas tireide, paratireide e timo. Conforme discutido no Captulo 7, o tubo neural do crebro posterior divide-se em unidades segmentais chamadas rombmeros. A migrao das clulas da crista neural craniana tambm parece estar organizada no padro rombomrico fazendo com que um gnglio craniano especfico e o arco branquial por ele inervado se originem da crista do mesmo rombmero (Lumsden et al., 1991). Essas clulas da crista neural tambm parecem reter informao posicional de seu lugar original ao longo do eixo ntero-posterior. Quando clulas pr-migratrias da crista neural de aves que normalmente migrariam para o primeiro arco branquial (para formar a cartilagem da mandbula) so colocadas na regio da crista cujas clulas normalmente migram para o segundo arco branquial (para formar a cartilagem hiide), as clulas enxertadas da crista neural migram para o segundo arco branquial, mas elas formam as estruturas (cartilagem da mandbula) caractersticas do primeiro arco. Alm disso, elas iro interagir com o ectoderma superficial e o mesoderma paraxial para formar a musculatura do primeiro arco (bico e msculos da mandbula). Isso sugere marcadamente que antes de migrar, as clulas da crista neural j esto comprometidas a formar ao menos algumas das estruturas apropriadas para seu nvel no eixo ntero-posterior (Noden, 1988). Esse compromisso posicional pode ser o resultado dessas clulas expressarem combinaes particulares de genes Hox. Por exemplo, os genes Hox-B so expressos no presuntivo tubo neural do camundongo antes da formao da crista neural, e quando as clulas da crista neural migrarem, iro reter o padro de expresso do gene Hox-B caracterstico do seu lugar de origem (Hunt et al., 1991a). Com uma nica exceo conhecida (Hoxb-1), o limite anterior de cada gene Hox pra no rombmero mais prximo, dois rombmeros frente do mais anterior do prximo gene Hox (Wilkinson et al., 1989; Keynes e Lumsden, 1990). Conforme representado na Figura 16.4, os genes homeobox Hoxb-2, -3, e 4 so encontrados atravs de toda a medula espinhal, mas o Hoxb-2 pra no limiar dos rombmeros 2 e 3; o Hoxb-3 pra no limiar 4/5, e o Hoxb-4 pra na fronteira entre o sexto e stimo
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(A) HOM-C de Drosophila
Figura 16.3
Hox-A Camundongo
Subgrupos Parlogos 3 Anterior Precoce Forte resposta de cido retinico Crebro posterior Tronco Posterior Tardio Fraca resposta de cido retinico
(B) Drosophila
Conservao evolucionria da organizao gnica hometica e expresso transcricional em moscas e camundongos. (A) Conservao entre o agregado homeobox no cromossomo 3 de Drosophila e os quatro agregados de genes Hox no genoma murino. As regies sombreadas mostram semelhanas estruturais particularmente fortes entre as espcies, e pode-se ver que a ordem nos cromossomos foi conservada. Os genes no terminal 5 (como todos genes homeobox murinos so transcritos na mesma direo) so aqueles que so expressos mais posteriormente, so expressos mais tarde, e podem ser induzidos somente por altas doses de cido retinico. Genes tendo estruturas semelhantes, as mesmas posies relativas em cada um dos quatro cromossomos, e padres de expresso semelhantes pertencem ao mesmo grupo parlogo. (B) Comparao entre os padres de transcrio dos genes HOM-C e Hox-B de Drosophila (10 horas) e camundongos (12 dias), respectivamente. Outro conjunto de genes que controla a formao da cabea da mosca (orthodenticle e empty spiracles) tem homlogos no camundongo que se expressam no crebro intermedirio e anterior. Os genes homlogos humanos so chamados (em maisculas) genes HOX. (A segundo Krumlauf, 1993; B segundo McGinnis e Krumlauf, 1992.)
Camundongo
Medula
Cervical
espinhal
Tor cica
Lo mb ar
Crebro intermedirio Crebro anterior Crebro posterior
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(A) Arcos viscerais Ectoderma superficial Arco branquial 1 Mesnquima do arco Sistema nervoso Gnglios craniais Tubo neural Rombmero 2
(B)
Arco Branquial 2
Figura 16.4
Arco Branquial 3
Arco Branquial 4
Medula espinhal
Transcrio do gene Hox. (A) Diagrama do padro de transcrio do gene Hox no camundongo. Notar que o padro est distribudo entre o tubo neural e o mesoderma (de modo que as clulas da crista do terceiro rombmero entrem no segundo arco branquial) e os limites da expresso do gene Hox coincide com os limites rombmeros. (B) Padres de transcrio de genes hometicos HoxB no crebro posterior do camundongo de 9,5 dias. (A de McGinnis e Krumlauf, 1992; B de Hunt et al., 1991a.)
rombmero. Os genes Hox, mais 5 so encontrados somente nas regies posteriores do tubo neural, onde formam tambm um conjunto aninhado. Os genes mais 5 tm limites de expresso mais posteriores que os genes menos 5. Quando as clulas da crista neural entram em contato com o ectoderma superficial levam as clulas ectodrmicas a expressarem o mesmo conjunto de genes Hox (Figura 16.4 A; Hunt et al., 1991b). Alguns dos genes Hox de mamferos so to semelhantes a seus homlogos de Drosophila, que eles podem substituir um ao outro. O gene do camundongo Hox-6 pode realizar algumas das funes reguladoras do gene Antennapedia da Drosophila quando o gene murino transfectado para a Drosophila. O gene humano HOXD-4 tambm pode executar algumas das funes do seu homlogo da Drosophila, Deformed (Malicki et al., 1990; McGinnis et al., 1990). Alm disso, a regio intensificadora do gene Deformed da Drosophila (um gene especificando a expresso gnica especfica da cabea em Drosophila) pode causar expresso gnica no crebro posterior do camundongo; e as seqncias reguladoras do homlogo humano de Deformed fornecem expresso gnica especfica da cabea em embries de Drosophila (Awgulewitsch e Jacobs, 1992; Malicki et al., 1992). Um padro semelhante da expresso gnica de Hox parece existir tambm dentro do tronco. Aqui os padres da expresso gnica correspondem a limiares somticos (em lugar de rombomricos) (Kessel e Gruss, 1991), e alguns genes parlogos so expressos em limiares somticos ligeiramente diferentes (Figura 16.5). Anlise Experimental de um Cdigo Hox: Gene Alvo Os padres de expresso dos genes Hox murinos sugerem um cdigo pelo qual certas combinaes de genes Hox especificam uma determinada regio do eixo ntero-posterior (Hunt e Krumlauf, 1991). Conjuntos particulares de genes parlogos fornecem identidade segmentria ao longo do eixo ntero-posterior do corpo. A evidncia para tal cdigo vem de trs fontes:
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Vrtebras occipitais
Vrtebras cervicais
Vrtebras torcicas
Vrtebras lombares
Vrtebras sacrais
Vrtebras caudais
cido retinico causa a expresso de genes em segmentos mais posteriores
cido retinico causa a expresso de genes em segmentos mais anteriores
Figura 16.5
Experimentos de eliminao (knock-out) ou de gene alvo (gene targeting) (veja Captulo 2) nos quais so construdos camundongos carentes de ambas cpias de um ou mais genes Hox particulares. Homeose induzida por cido retinico, na qual embries de camundongo tratados com o cido retinico tm um padro de expresso diferente do gene Hox ao longo do eixo ntero-posterior e diferenciao anormal de suas estruturas axiais. Anatomia comparada, pela qual tipos de vertebrados em diferentes espcies so correlacionados com a constelao de genes Hox nesses vertebrados. Quando Chisaka e Capecchi (1991) expulsaram o gene Hox-3 de camundongos endgamos, os mutantes homozigotos Hoxa-3 morreram logo aps o nascimento. Na autpsia mostrou-se que esses animais tinham a cartilagem do pescoo anormalmente curta e grossa e as glndulas tireides, paratiredes e timos severamente deficientes ou ausentes. Seus coraes e vasos sangneos estavam tambm malformados (Figura 16.6). Esse conjunto de malformaes muito semelhante desordem congnita humana, a sndrome de DiGeorge, na qual so encontradas essas mesmas deficincias em estruturas derivadas da crista neural. Anlises ulteriores mostraram que o nmero e a migrao de clulas da crista neural que formam essas estruturas so normais. Assim, parece que os genes Hoxa-3 so responsveis pela especificao do destino das clulas da crista neural craniana e pela permisso para que essas clulas se diferenciem e se proliferem formando a cartilagem do pescoo e os derivados do quarto e sexto arcos farngeos (Manley e Capecchi, 1995).
O cdigo do somito Hox no tronco e no pescoo do embrio do camundongo. As reas principais de expresso esto indicadas em cor mais escura, enquanto as regies posteriores da expresso no so to definidas como sugere a cor mais clara. O efeito do cido retinico o de empurrar a expresso gnica anterior mais posteriormente e a expresso gnica posterior mais anteriormente. (Segundo Kessel, 1992.)
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Figura 16.6
Desenvolvimento deficiente de estrutura de arcos farngeos derivados da crista neural em camundongos deficientes em Hox-3. direita, um embrio de 10,5 dias de um camundongo Hox-3 heterozigoto mostrando desenvolvimento normal do timo (bolsa 3), paratireide (bolsa 4) e outras estruturas. esquerda, um mutante homozigoto deficiente em Hox3 no apresenta desenvolvimento apropriado dessas estruturas. (de Chisaka e Capecchi, 1991.)
Mutante
Tipo selvagem
Outro experimento de alvejar genes eliminou o gene Hoxa-1 (Lufkin et al., 1991). A expresso de Hoxa-1 se sobrepe ao gene Hoxa3, mas tambm expressa mais anteriormente que Hoxa-3. Esses embries sem genes Hoxa-1 funcionais mostram uma constelao de anormalidades que indicam especificao deficiente dos rombmeros 4-7. Esses mutantes freqentemente deixam de fechar seus tubos neurais, no tm estruturas do ouvido interno, e no tm os gnglios do crebro posterior (que formam os nervos acstico, glossofarngeo e vago), derivados desses rombmeros. No entanto, no foram encontradas malformaes dos arcos farngeos, glndulas tireide, paratireide e timo, ou cartilagem do pescoo. Assim, defeitos dos mutantes Hoxa-1 somente so vistos na regio anterior da rea de expresso desse gene. ( possvel que suas funes no sejam requeridas ou sejam redundantes na poro posterior a seu alcance.) Ao contrrio dos defeitos (que se limitam crista neural) de camundongos Hox3 deficientes, os defeitos de Hox-1 so notados no sistema nervoso central e no tecido derivado do placdio, assim como no mesoderma paraxial. A eliminao de Hoxa-2 tambm produz camundongos cujas clulas da crista neural foram re-especificadas. Elementos cranianos normalmente formados pelas clulas da crista neural do segundo arco branquial (estribo, ossos estilides) esto faltando e so substitudos pela duplicao de estruturas do primeiro arco branquial (bigorna, martelo, etc.) (Gendron-Maguire et al., 1993; Rijli et al., 1993). Assim, sem certos genes Hox, alguns rgos regionalmente especficos ao longo do eixo ntero-posterior deixam de se formar ou so re-especificados para outras regies. A evidncia inicial apia a noo que diferentes conjuntos de genes Hox so necessrios para a especificao completa de toda regio do eixo e que um conjunto de genes parlogos pode ser responsvel por diferentes subconjuntos de rgos nessas regies. Transformao Parcial de Segmentos por Eliminao de Genes Hox Expressos no Tronco Se os genes Hox realmente formam um cdigo que especifica o eixo ntero-posterior, poder-seia esperar que a alterao da constelao de genes Hox expressos em qualquer regio particular do embrio poderia alterar uma estrutura em outra ao longo do eixo ntero-posterior. Isso mostrou ser o caso quando o gene Hoxc-8 deletado do embrio por mira ao gene alvo (Le Mouellic et al., 1992). Nesses camundongos, vrios segmentos esquelticos axiais parecem mais com segmentos anteriores, de tipo muito semelhante ao que se v em mutaes hometicas de perda-de-funo em Drosophila. Como pode ser visto na Figura 16.7, nesse camundongo a primeira vrtebra lombar formou uma costela algo caraterstico das vrtebras anteriores ela. A eliminao do gene Hoxb-4 converte parcialmente a segunda vrtebra cervical (a vrtebra axial) em
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(A)
(B)
(C)
uma cpia da primeira vrtebra cervical (o atlas), e a deleo do gene Hoxa-5 causa a transformao posterior da stima vrtebra cervical (pescoo) em uma vrtebra torcica formadora de costela (Jeannotte et al., 1993; Ramirez-Solis et al., 1993). Pode-se conseguir severas transformaes axiais eliminando dois ou mais genes do conjunto parlogo. Camundongos homozigotos para a deleo de Hoxd-3 tm anormalidades moderadas da juno crnio-cervical (o atlas est reduzido em tamanho), enquanto camundongos homozigotos para a deleo de Hoxa-3 no tm anormalidades nessa juno (veja a discusso anterior sobre esse mutante). Quando os dois mutantes so criados juntos, ambos conjuntos de problemas ficam mais severos. Os camundongos sem conjuntos de genes Hoxa-3 nem Hoxd-3 no tm osso atlas algum, e as cartilagens hiide e tireide so de tamanho to reduzido que h buracos no esqueleto (Condie e Capecchi, 1994). Parece que ocorrem interaes sinrgicas entre os produtos dos genes Hox e que para algumas funes, um dos parlogos pode substituir ao outro. A regulao dos genes Hox de vertebrados parece ser controlada por fatores semelhantes aqueles que regulam os genes HOM-C em moscas. Em Drosophila, h um gene homeobox, caudal, que reside externamente ao complexo HOM-C. Esse gene de efeito materno em Drosophila funciona para co-direcionar a expresso dos genes HOM-C mais posteriores (AbdB). Um homlogo mamfero desse gene, Cdx1, tem um papel semelhante no mesoderma paraxial. Ele torna-se expresso na linha primitiva durante a gastrulao, quando a especificao do eixo ntero-posterior est sendo feita; e desligado pouco depois. Se esse gene for deletado do embrio do camundongo, os padres de expresso dos genes Hox mudam posteriormente para um somito, e estruturas esquelticas anteriores so encontradas mais posteriormente (Subramanian et al., 1995). De maneira semelhante, a represso de genes Hom-C de Drosophila mediada por um conjunto de genes que inclui extra sex combs (esc). Se o homlogo murino desse gene (embryonic ectoderm development; eed) desempenhar o mesmo papel, poder-se-ia esperar que mutaes em eed resultassem na anti-depresso de genes Hox e na transformao hometica de estruturas anteriores em posteriores. Isso realmente acontece. Genes eed mutantes causam a transformao de estruturas esquelticas anteriores em posteriores (Schumacher et al., 1996). Anlise Experimental do Cdigo Hox: Retinico Teratognese do cido Retinico Tais alteraes hometicas tambm podem ser vistas quando a embries de camundongos so administradas doses teratognicas de cido retinico. O cido retinico exgeno dado a embries in utero pode fazer com que certos genes Hox sejam expres-
Figura 16.7.
Transformaes hometicas no camundongo induzidas por eliminao de genes expressos no tronco. (A) Transformao parcial da primeira vrtebra lombar em uma vrtebra torcica pela eliminao de um gene Hox-8. Vrtebras torcicas, mas no lombares, apresentam associao com as costelas. (B,C) Transformao parcial da segunda vrtebra cervical em uma segunda cpia da primeira vrtebra cervical pela eliminao do gene Hoxb-4. (B) O camundongo tipo selvagem tem a primeira vrtebra caracterizada por um tubrculo ventral. (C) No camundongo mutante, a segunda vrtebra cervical tambm tem esse tubrculo (seta). (A de Le Mouellic et al., 1992; B e C de Ramirez-Solis et al., 1993; Fotografias cortesia dos autores.)
644
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 16.8
Embries de camundongos cultivados sob condies controle no dia 8 (A,C), ou em um meio contendo retinides teratognicos (B,D). No dia 2 (A,B), o primeiro arco farngeo dos embries tratados tem uma aparncia encurtada e achatada e aparentemente se fundiu com o segundo arco farngeo. No dia 17 (C,D) podem ser vistas malformaes crnio-faciais na cartilagem derivada da crista neural dos embries tratados. A cartilagem de Meckel est completamente deslocada da regio mandibular (maxilar inferior) para a regio maxilar (boca superior). As cartilagens do martelo e da bigorna tambm no se formaram. (A e B de Goulding e Pratt, 1986; C e D de Morriss-Kay, 1993; Fotografias cortesia dos autores.)
sos em grupos de clulas que usualmente no os expressam (Conlon e Rossant, 1992; Kessel, 1992). Alm disso, as anormalidades crnio-faciais de embries murinos de mes tratadas com doses teratognicas de cido retinico (Figura 16.8) podem ser mimetizadas quando se faz com que o Hoxa-7 se expresse atravs do embrio (Balling et al., 1989). Se doses altas de cido retinico podem ativar genes Hox em clulas inapropriadas ao longo do eixo ntero-posterior, e se essa constelao de genes hox ativos especifica a regio do eixo ntero-posterior, ento camundongos tratados com cido retinico no tero devem mostrar transformaes hometicas manifestadas por malformaes ocorrendo ao longo desse eixo. Kessel e Gruss (1991) acharam que esse era o caso. Camundongos tipo selvagem tm 7 vrtebras cervicais (pescoo), 13 vrtebras torcicas, e 6 vrtebras lombares (em adio s vrtebras sacrais e caudais). Quando expostos ao cido retinico no dia 8 da gestao, a primeira ou as duas primeiras vrtebras lombares foram transformadas em vrtebras torcicas, enquanto a primeira vrtebra sacral freqentemente se tornou uma vrtebra lombar (Figura 16.9). Em alguns casos, a regio posterior inteira do embrio de rato deixou de se formar. Essas alteraes estruturais eram correlacionadas com alteraes na constelao dos genes Hox expressos nesses tecidos. Por exemplo, quando o cido retinico foi dado a embries no dia 8 (durante a gastrulao), a expresso de Hoxa-10 foi deslocada posteriormente, e um conjunto adicional de costelas se formou onde havia a primeira
(A)
(B)
(C)
Figura 16.9
cido retinico administrado a ratas grvidas altera a expresso do gene Hox e o fentipo em fetos. A figura mostra mudanas no esqueleto axial (vrtebras e costelas) causadas por exposio ao cido retinico no tero no dia 8. (A) O tipo selvagem tem 7 vrtebras cervicais, 13 torcicas, 6 lombares, 4 vrtebras sacrais fundidas e vrtebras caudais. Esse arranjo alterado pelo cido retinico dado s mes. Em alguns casos (B,C) o cido retinico causou a perda de vrtebras lombares, sacrais e caudais. (A e B segundo Kessel e Gruss, 1991; C de Kessel, 1992; Fotografias cortesia dos autores.)
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Figura 16.10
Dia 8.5 Controle + cido retinico

Crebro intermedirio
O cido retinico media a transformao hometica em regies do crebro posterior. Em embries de camundongo no tratados, no dia 8.5, a expresso de Hoxb-1 se limita ao rombmero r4. Quando expostos ao cido retinico nesse momento, a expresso de Hoxb-1 se expande anteriormente em direo ao crebro intermedirio. Aps 2 dias, em embries normais Hoxb-1 expresso nas clulas descendentes do rombmero r4 e em clulas da linha mediana de r5, que geram o nervo motor facial (mnVII). Em embries tratados com cido retinico, o padro normal de r4/5 foi duplicado em r2/3. A expresso da crista neural de Hoxb-2 tambm est duplicada, e um segundo nervo motor facial formado. Isso sugere que o cido retinico media a transformao hometica de r2/3 em r4/5. (Segundo Krumlauf, 1993.)
Crebro Posterior
vrtebra lombar. Quando genes Hox posteriores no foram expressos, a parte caudal do embrio deixou de se formar. * No sistema nervoso central, o cido retinico induz a expresso anterior dos genes hox que usualmente so somente expressos mais posteriormente, e fazem com que os rombmeros 2 e 3 assumam a identidade dos rombmeros 4 e 5 (Figura 16.10; Marshall et al., 1992; Kessel, 1993). Nessa situao, o nervo trigmeo (que se origina do rombmero 2) transformado em outro nervo facial (caracterstico do rombmero 4), e anormalidades do primeiro arco branquial indicam que as clulas da crista neural do segundo e terceiro rombmeros foram transformadas em fentipos mais posteriores. O cido retinico provavelmente desempenha um papel na especificao axial durante o desenvolvimento normal, e a fonte desse cido provavelmente o ndulo de Hensen (Hogan, 1992; Maden et al., 1996). Desde que o ndulo precoce parece conter os precursores tanto de estruturas anteriores como posteriores, possvel que a especificao dessas clulas dependa da quantidade de tempo despendido no meio de alta concentrao de cido retinico no ndulo. Quanto mais tempo for despendido no ndulo, mais posterior ser a especificao. Isso visto ocorrer em cultura, quando clulas embrionrias de carcinoma expressam mais genes Hox posteriores quanto maior for o tempo de sua exposio ao cido retinico (Simeone et al., 1990). Alm disso, Hoxa-1, Hoxb-1 e Hoxd-4 tem, cada um, elementos sensveis ao cido retinico nas regies reguladoras a montante (veja Captulo 21). A administrao de cido retinico exgeno iria mimetizar a situao normalmente encontrada somente pelas clulas posteriores. Avantaggiato e colegas (1996) mostraram que quando o cido retinico dado a embries durante os estgios de meia-linha, as regies mais anteriores do tubo neural no se formam e so substitudas por tecido parecendo o crebro anterior. Isso se correlaciona com uma perda de expresso gnica (Emx1, Emx2) do crebro anterior e mdio nessa regio, e sua substituio por genes Hox especficos para o crebro posterior como Hoxb-1. A evidncia aponta para um cdigo Hox enquanto constelaes diferentes de genes Hox especificam as caractersticas regionais ao longo do eixo ntero-posterior. Alm disso, como esses padres de expresso so semelhantes para mamferos e insetos, parece que existe um plano de desenvolvimento comum sobre o qual construdo o eixo nteroposterior da maioria dos animais. Evidncia para um Cdigo Hox da Anatomia Comparada Um novo tipo de embriologia comparada est atualmente emergindo. Gaunt (1994) e Burke e seus colaboradores (1995) compararam as vrtebras do camundongo e do pinto. Embora ambos tenham um nmero semelhante de vrtebras, elas distribuemnas diferentemente. Camundongos (como todos os mamferos, sejam elas girafas ou baleias) tm somente 7 vrtebras cervicais (pescoo). Essas so seguidas por 13
*Hoxa-10 tambm importante para a especificao do padro axial dos dutos genitais. Eliminaes de Hoxa-10 criam camundongos cuja regio uterina superior transformada em tecido parecendo o oviduto. Essa regio coincide com o limite anterior da expresso de Hoxa-10 no duto Mlleriano tipo selvagem (Benson et al., 1996).
Medula Espinhal
Dia 10.5
Vescula tica
Expresso de hoxb-1 Expresso de Krox-20 Expresso hoxb-2 da crista neural
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Figura 16.11
Representao esquemtica do padro vertebral do camundongo e do pinto ao longo do eixo ntero-posterior. Os limites de certos genes Hox foram colocados nestes domnios.
Cervical Pinto
Torcico
Lombar
Sacral Coccgeas Vrtebras Somitos
Camundongo Cervical Torcico Lombar Sacral Caudal
Vrtebras
Occipital
Cervical
Torcico
Lombar
Sacral
Caudal
Transicional
vrtebras torcicas (ligadas s costelas), 6 vrtebras lombares, 4 sacrais e um nmero varivel (20+) de vrtebras caudais (Figura 16.11). O pinto, por outro lado, tem 14 vrtebras cervicais, sete vrtebras torcicas, 12 ou 13 vrtebras lombosacrais (dependendo da variedade), e 5 vrtebras coccgeas. A pergunta : A constelao de genes Hox correlaciona-se com o tipo de vrtebra (e.g., cervical ou torcica) ou com a posio relativa das vrtebras (e.g., nmero 8 ou 9)? A resposta que a constelao de genes Hox prediz o tipo de vrtebra. No camundongo, a transio entre vrtebras cervicais e torcicas ocorre entre as vrtebras 7 e 8; no pinto est entre as vrtebras 13 e 14. Em ambos os casos, os parlogos de Hox-5 so vistos nas ltimas vrtebras cervicais, enquanto o limite anterior dos parlogos de Hox-6 se estende at a primeira vrtebra torcica. De maneira semelhante, em ambos os casos a transio torcico/ lombar vista no limite entre os grupos parlogos de Hox-9 e de Hox-10. Parece que h um cdigo de expresso do gene Hox que determina o tipo de vrtebra ao longo do eixo ntero-posterior.
&
Especulaes
Animais como Variaes sobre o Mesmo Tema Desenvolvimental
M DOS MAIS CELEBRADOS (e custicos) debates em biologia foi realizado no apogeu da Revoluo Francesa em Paris. A, na Academie des Sciences, E. Geoffroy Saint-Hilaire contestou Georges Cuvier sobre a natureza do reino animal. Cuvier, o eminente anatomista comparativo que tinha tornado a zoologia uma cincia francesa enfatizou as diferenas que separam os filos entre si. No poderia haver uma Corrente de Existncia ligando todos os organismos, nem poderia haver qualquer maneira que partes de um inseto poderiam ser vistas como homlogas daquelas de um molusco ou vertebrado. A
nica coisa ligando uma pata de inseto, um p de molusco e uma perna de vertebrado era a sua funo locomotora. Anatmica e embriologicamente, elas eram entidades distintas, no-comparveis. Geoffroy Saint-Hilaire enfatizou as semelhanas entre todos os filos. Ele argumentou que todos os animais estavam organizados de acordo com os mesmos princpios bsicos, e que um inseto no era mais que um vertebrado virado de cabea para baixo. Uma cabea era formada em uma extremidade, uma cauda na outra, e todos os animais tinham tubos neurais, fossem eles dorsais ou ventrais. Em lugar
de uma natureza composta de espcies intrinsecamente diferentes, todos os animais estavam unidos em uma espcie de irmandade, reminescente da egalit et fraternit revolucionrias (Appe, 1987). Desde aquele tempo, diferentes tradies biolgicas enfatizaram as diferenas, ou as semelhanas entre os organismos. A anatomia comparada (seguindo Cuvier) enfatiza as diferenas, enquanto a morfologia (seguindo Geoffroy Saint-Hilaire) celebra as unidades subjacentes. A Gentica e a Biologia celular olham para todos os animais (e plantas) como compostos basicamente da mesma maneira, seguindo as
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mesmas leis, enquanto a embriologia tradicionalmente via cada espcie se desenvolvendo de uma maneira diferente. Recentemente, porm, a embriologia est fornecendo evidncia para a unidade subjacente da natureza animal. Jonathan Slack e seus colegas (1993) definiram um animal como um organismo que exibe um particular padro espacial de expresso do gene Hox. eles propem que o plano corporal de cada filo tipificado em um particular estgio filotpico durante seu desenvolvimento. Para vertebrados, isso seria o estgio do broto caudal (onde, apesar de suas diferentes clivagens e gastrulaes, os embries de vertebrados convergem e tm brotos caudais e bolsas farngeas); para insetos, a banda germinativa completamente segmentada o local onde os embries convergem. Nesse estgio, o padro de expresso gnica hometica dos genes Hox/HOM-C visto mais claramente, sendo notavelmente semelhante em todos animais. Os genes parecendo com Deformed e labial so expressos no anterior do embrio; aqueles parecendo com Abdominal B so expressos no posterior. Mesmo nematides e hidras tm agregados de genes hometicos que parecem ser expressos da mesma maneira ntero-posterior (Schummer et al., 1992; Wang et al., 1993). Embora fungos e plantas tenham genes homeobox, esses no so homlogos com aqueles dos animais, nem esto arranjados na mesma ordem cromossmica, nem esto expressos pelo mesmo padro nteroposterior. Assim, o padro espacial da expresso do gene Hox est sendo usado como a caracterstica subjacente primria definindo a existncia animal. Essa observao ainda no foi testada em vrios filos, e ser muito interessante ver se esse padro geral visto em todo o reino animal.
Recebendo uma Cabea: Mais Homologias Vertebradas e Invertebradas Em Drosophila, o crebro composto de trs neurmeros. Esses so especificados por dois genes contendo homeobox que no esto ligados regio HOM-C; esses genes so orthodenticle (old), que expresso predominantemente no neurmero mais anterior, e empty spiracle (ems), expresso nos dois neurmeros cerebrais posteriores. Mutaes de perda-de-funo de old eliminam o neurmero mais anterior do embrio de Drosophila em desenvolvimento, e mutaes de perdade-funo de ems eliminam o segundo e terceiro neurmeros (Hirth et al., 1995). Em rs e camundongos, os homlogos desses genes (Otx-1, Otx-2, Emx-1, Emx-2) tambm so expressos no crebro (Simeone et al, 1992), embora os padres exatos de transcrio no sejam idnticos (Figura 16.12). O gene Otx-2 foi eliminado como gene alvo (Acampora et al., 1995; Matsuo et al., 1995; Ang et al., 1996), e os camundongos resultantes tinham deficincias neurais e mesodrmicas da cabea anteriores para o rombmero r3. Em seres humanos, mutaes de EMX-2 levam uma condio rara conhecida como esquizoencefalia, na qual h sulcos atravessando todo o crtex cerebral (Brunelli et al., 1996). Apesar dos genes old e ems de Drosophila serem especificados pelos gradientes Bicoid e Hunchback, e os transcritos Otx e Emx serem induzidos pelo mesoderma dorsal anterior, parece que esses mesmos genes so usados para especificar as regies cerebrais.
Drosophila
Camundongo Crebro anterior Crebro intermedirio
Crebro posterior r1-r8
Medula espinhal
Figura 16.12
Expresso dos genes reguladores em Drosophila e no camundongo enfatizando os genes expressos na cabea. A1-9 so segmentos abdominais; b1-3 so segmentos neurmeros (cerebrais); 1b, md e mx so os segmentos labial, mandibular e maxilar, respectivamente; r, rombmero; T1-3, segmentos torcicos. (Segundo Thor, 1995.)
*Alm de expressar os homlogos dos genes contendo homeobox ems e otd, o crebro de mamfero tambm expressa o homlogo do gene tailess. Esse gene expresso nas pores mais anteriores e posteriores do embrio de Drosophila, e um membro da famlia dos receptores esterides (Monaghan et al., 1995).
Eixos dorsoventral e esquerdo-direito em mamferos e aves

Muito pouco conhecido sobre a maneira pela qual mamferos formam o eixo dorsoventral. Em pintos, o eixo determinado por gravidade que coloca o hipoblasto no lado ventral (veja Captulo 5). Em camundongos e humanos, o hipoblasto se forma no lado da massa celular interna que est exposta ao fluido blastocstico. medida que prossegue o desenvolvimento, a notocorda mantm a polaridade dorsoventral, induzindo padres dorsoventrais de expresso gnica no tubo neural (Goulding et al., 1993). [mamaxis1.html] Tambm muito pouco sabemos sobre a formao de eixo equerdo-direito. O corpo do mamfero no simtrico. O corao demarcado para o lado esquerdo
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(A)
(B)
(C)
Figura 16.13
Assimetria da expresso gnica no embrio do camundongo. (A) Hibiridizao in situ para o mRNA nodal no embrio murino de 5 somitos. A expresso do gene nodal est restrita ao mesoderma da placa lateral no lado esquerdo do embrio. (B) Seo transversal atravs do embrio no mesmo estgio que em (A). (C) Em camundongos com a mutao inverted (iv), a expresso de nodal vista no mesoderma da placa lateral em ambos os lados do embrio. O corao tem a mesma chance de voltear para o outro lado. (Segundo Lowe et al., 1996; fotografias cortesia de M.R.Kuehn.)
da cavidade torcica, embora se forme no centro. O bao encontrado somente no lado esquerdo do abdome, enquanto o principal lobo heptico fica no lado direito. No conhecido o que regula essas assimetrias. Porm, achados recentes sugerem que dois nveis regulam o eixo esquerdo-direito: um nvel global e um nvel especfico do rgo. No camundongo, so conhecidos dois genes cujas mutaes destrem a assimetria esquerda-direita normal. O primeiro gene, situs inversus viscerum (iv), aleatoriza o eixo esquerdo-direito para cada rgo assimtrico (Hummel e Chapman, 1959; Layton, 1976). Isso significa que o corao pode se voltar para a esquerda em um animal homozigoto, ou se voltar para a direita em outro. Alm disso, a direo da volta do corao no est coordenada com a colocao do bao ou do estmago. Isso pode causar srios problemas, at mesmo a morte. O segundo gene, inversion of embryonic turning (inv), causa um fentipo mais global. Camundongos homozigotos para uma mutao de insero nesse local, foram encontrados tendo todos seus rgo assimtricos no lado errado do corpo (Yokoyama et al., 1993).* J que todos os rgo esto invertidos, essa assimetria no tem conseqncias danosas para os camundongos. Embora no saibamos quais protenas so codificadas por iv e inv, alguns dos componentes dessa trajetria foram recentemente descobertos. No camundongo, os genes lefty e nodal so expressos somente no mesoderma da placa lateral esquerda, e sua expresso precede a caracterstica volta direita do corao e a rotao direita do embrio (Figura 16.13; Collignon et al., 1996; Lowe et al, 1996; Meno et al., 1996). Em camundongos homozigotos para a mutao inversion of embryonic turning, esses genes so expressos somente no lado direito do mesoderma da placa lateral, enquanto que em camundongos com a mutao aleatria situs inversus viscerum, a expresso de nodal e lefty ou normal, trocada ou est ausente. Esses genes codificam fatores parcrinos da famlia TGF-, e no conhecido quais os tecidos eles influenciam. Um possvel local da influncia o tubo cardaco simtrico que se forma na linha mediana do embrio. Entre o endocrdio interno e o miocrdio externo desse tubo de parede dupla est uma matriz extracelular (gelia cardaca) que contm a protena Flectina. No embrio do pinto, essa protena expressa assimetricamente na hora do volteamento cardaco, acumulando-se predominantemente no lado esquerdo da matriz (Prancha 33; Tsuda et al., 1996). Os mecanismos que dariam transcrio assimtrica de nodal e lefty ainda no esto claros, mas indcios esto vindo de estudos com o embrio do pinto (Levin et al., 1995). A observao crtica que durante a gstrula intermediria, a mensagem sonic hedgehog (shh) transcrita simetricamente atravs de todo o ndulo de Hensen. Algumas horas depois, porm, a transcrio do lado direito cessa, e a transcrio de shh vista somente do lado esquerdo do ndulo. Ao mesmo tempo que se desenvolve essa assimetria, o gene receptor IIa da activin (cActRIIa) expresso somente do lado direito do ndulo (Figura 16.14). Esse receptor pode ser induzido pela activina. A expresso de sonic hedgehog no lado esquerdo no permanece por muito tempo, desaparecendo aps aproximadamente 24 horas de incubao, e a expresso do gene nodal do pinto fica expressa somente do lado esquerdo (Prancha 25). tentador colocar esses genes em um trajeto em comum onde a activina (ou uma molcula semelhante activina) seria somente produzida do lado direito do ndulo de Hensen do embrio do pinto. Isso induziria a sntese do receptor da activina IIa e funcionaria atravs desse receptor para bloquear a expresso sonic hedgehog onde quer que esse receptor estivesse localizado. Assim,
*Esse gene foi descoberto acidentalmente quando Yokoyama e colegas (1993) produziram camundongos transgnicos com o transgene (para a enzima tirosinase) inserido aleatoriamente no genoma. Em um caso, esse gene se inseriu em uma regio do cromossomo 4, eliminando o gene existente.
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Figura 16.14
(A) ESQUERDO 12-13 horas
DIREITO
Caminho para a assimetria esquerda-direita no embrio do pinto. (A) Topo: padro de expresso de genes sonic hedgehog, activin receptor IIa e cNR-1, em relao ao ndulo de Hensen. O receptor de activina o primeiro, seguido por sonic hedgehog e por ltimo por cNR-1. Base: Aps um dia, a assimetria vista no lao do lado direito do corao. O caminho hipottico entre esses genes mostrado abaixo deles. (B,C) Vistas dorsal e em aproximao da hibridizao in situ do mRNA sonic hedgehog. (D,E) Vistas dorsal e em aproximao da mensagem de activin receptor IIa. (A segundo Roush, 1995, e Wolpert e Brown, 1995; B-E de Levin,et al., 1995, cortesia de C. Tabin e C. Stern.)
sonic hedgehog cNR-1 (nodal) Notocorda Receptor IIa da activina
Ndulo de Hensen
Linha primitiva
(A)
(C)
(D)
(E)
sonic hedgehog
isso iria bloquear a transcrio no lado direito do ndulo. Sonic hedgehog seria assim somente expresso no lado esquerdo do ndulo. A protena Sonic hedgehog seria ento secretada no lado esquerdo do embrio ativando o gene nodal no mesoderma da placa lateral que contm os precursores do corao. A, poderiam causar acmulo da protena flectina no lado esquerdo da matriz extracelular. Experimentos sugerem que esse caminho uma boa aproximao. A activina realmente sintetizada no momento apropriado e somente do lado direito do ndulo de Hensen. Se bloqueada pela adio experimental de Follistatin, a assimetria da expresso de sonic hedgehog desaparece, e o corao tem uma chance igual de voltar-se para qualquer dos lados (Levin et al., 1997). Quando gotas impregnadas com activina foram colocadas no lado esquerdo do ndulo de Hensen, induziram a sntese de cActRIIa nesse lado, e o gene shh (usualmente expresso somente do lado esquerdo) foi reprimido. Isso, por sua vez, suprimiu a transcrio de nodal. Nessa situao, o tubo cardaco se formou aleatoriamente, tendo uma probabilidade igual de ir para a esquerda ou para a direita. Uma condio semelhante foi produzida quando clulas secretando Sonic hedgehog foram implantadas no lado direito do ndulo. Nesse caso, Nodal foi induzida simetricamente no mesoderma da placa lateral, e o corao teve 50 porcento de chance de ter um tubo esquerda (Figura 16.15). A formao do eixo esquerdo-direito no camundongo tambm parece usar receptores de activina e protena nodal, porm no parece ligar os dois atravs de Sonic hedgehog (Collignon et al., 1996). O pinto e o camundongo parecem ter variaes sutis sobre como construir seus eixos. [mamaxis2.html] Vrios caminhos diferentes teratognese, eliminao de genes, estudos de genes organizadores especficos, gentica clnica, at mesmo gentica da mosca das frutas esto nos conduzindo compreenso de um mistrio fundamental: como o embrio vertebrado comea a saber distinguir o lado de cima do lado de baixo, a boca do nus, e a esquerda da direita. Aprendemos mais sobre isso nos ltimos cinco anos do que em todos os anos que os precederam.
Sonic hedgehog
Activina
cNR-1 no mesoderma da placa lateral
Receptor IIa da activina
Tubo cardaco
40-45 horas
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(A) Notocorda Ndulo de Hensen
(B) Pastilha de Sonic hedgehog
Figura 16.15
Expresso ectpica de sonic hedgehog leva expresso simtrica de cNR-1 (nodal) e aleatorizao do volteamento cardaco. (A) Expresso tipo selvagem de cNR-1, mostrando expresso no lado esquerdo. Quase todos os coraes desenvolvem voltas do lado direito. Esse padro tambm visto quando pastilhas contendo substncias controles so implantadas no lado direito do ndulo ou quando uma pastilha contendo Sonic-hedgehog implantada no lado esquerdo (onde shh em geral expresso). (B) Quando pastilhas de Sonic hedgehog so implantadas no lado direito do ndulo, a expresso de cNR-1 se torna bilateralmente simtrica. (de Levin et al., 1995; fotografias cortesia dos autores.)
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Interaes Celulares Durante a Formao do rgo

17 Interaes proximais de tecidos: Induo secundria 18 Desenvolvimento do membro de tetrpode 20 Determinao do sexo 773 805 843 701 655
V
733 883
19 Interaes celulares distncia: Hormnios como mediadores do desenvolvimento 21 Regulao ambiental do desenvolvimento animal 22 A saga da linhagem germinativa
23 Mecanismos desenvolvimentais da mudana evolucionria
CAPTULO 17 Interaes Proximais de Tecidos
655
Interaes proximais de tecidos: Induo secundria
17
Tratando-se de um sistema to complexo como o embrio em desenvolvimento ftil perguntar se certo rudimento de rgo determinado e se alguma propriedade de sua vizinhana, com excluso de outras, o determina. Uma srie de diferentes fatores pode estar envolvida e seus efeitos entrelaados da maneira mais intrincada. Para resolver esse emaranhado temos que inquirir de que maneira o sistema sob considerao reage com outras partes do embrio durante os sucessivos estgios do desenvolvimento, sob uma variedade de condies experimentais to ampla o quanto for possvel impor. R. G. HARRISON (1933) Aspirar a verdade mais precioso do que assegurar sua posse. G. E. LESSING (1778)
RGOS SO ESTRUTURAS COMPLEXAS compostas de numerosos tipos de tecidos. No olho do vertebrado, por exemplo, a luz transmitida atravs do tecido corneano transparente e focalizada pelo tecido do cristalino (cujo dimetro controlado pelo tecido muscular), para finalmente atingir o tecido neural da retina. O arranjo preciso dos tecidos nesse rgo no pode ser alterado sem lesar a sua funo. Tal coordenao na construo dos rgos conseguida por um grupo de clulas modificando o comportamento de um conjunto adjacente de clulas, desse modo, fazendo com que elas mudem sua forma, velocidade mittica ou diferenciao. Essa ao queima-roupa, s vezes chamada interao proximal ou induo secundria, permite a um grupo de clulas responder a um segundo grupo de clulas, em modificao, tornando-se freqentemente capazes de alterar um terceiro conjunto de clulas.
Interaes instrutivas e permissivas

Howard Holtzer (1968) distinguiu dois modos principais de interao entre tecidos proximais. Na interao instrutiva, um sinal da clula indutora necessrio para iniciar nova expresso gnica na clula responsiva. Sem a clula indutora, a clula responsiva no seria capaz de se diferenciar de uma maneira particular. Por exemplo, no Captulo 15 discutimos a capacidade da notocorda induzir a formao de clulas da placa do assoalho no tubo neural. Todas as clulas do tubo neural so capazes de responder ao sinal da notocorda, porm, somente aquelas mais prximas da notocorda so induzidas. As outras clulas no se tornam clulas da placa do assoalho. Ainda mais, se removermos a notocorda do embrio, as clulas que normalmente se tornariam clulas da placa do assoalho no se diferenciaro nesse tipo de clula, e se adicionarmos uma notocorda lateralmente placa neural, essa nova notocorda ir induzir um conjunto secundrio de clulas da placa do assoalho. As clulas responsivas do tubo neural seriam, de alguma maneira, comandadas a expressar um conjunto de genes diferentes do conjunto de genes que expressariam, se no tivessem estado em contato com a notocorda. A notocorda considerada ser um tecido indutor que age instrutivamente. Wessell (1977) props quatro princpios gerais caractersticos da maioria das interaes instrutivas:
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656
PARTE V Interaes Celulares Durante a Formao do rgo
1. Na presena do tecido A, o tecido responsivo B desenvolve-se em uma certa maneira. 2. Na ausncia do tecido A, o tecido responsivo B no se desenvolve dessa maneira. 3. Na ausncia do tecido A, mas em presena de tecido C, o tecido B no se desenvolve dessa maneira. 4. Na presena da tecido A, um tecido D que normalmente desenvolve-se diferentemente, mudado para desenvolver-se como B. O segundo tipo de interao tissular proximal a interao permissiva. Aqui, o tecido responsivo contm todo o potencial necessrio para ser expresso, e somente requer um ambiente que permita a expresso desses traos. Por exemplo, muitos tecidos em desenvolvimento necessitam de um substrato slido contendo fibronectina ou laminina para se desenvolver. A fibronectina ou laminina no altera o tipo de clula que dever ser produzido, somente permite sua expresso*.
Competncia e receptores
Deve-se notar que nos princpios acima, o tecido responsivo deve ser competente para responder. Competncia a capacidade de responder a um sinal indutivo (Waddington, 1940). Isso no um estado passivo, mas uma condio adquirida. Quando detalhamos a induo do tubo neural, observamos que o ectoderma da gstrula capaz de ser induzido pelo lbio dorsal do blastporo ou seus derivados mesodrmicos. Assim, o ectoderma da gstrula dito ser competente para responder a estmulos indutivos. Essa competncia para a induo neural adquirida durante a clivagem tardia e perdida durante os estgios tardios da gstrula. medida que essa competncia para responder induo pelo lbio dorsal diminui, algumas regies do ectoderma adquirem competncia para responder a indutores do cristalino. Mais tarde ainda, a competncia dos indutores do cristalino perdida, mas o ectoderma pode responder a indutores do placdio do ouvido (Serventnick e Grainger, 1991). Portanto, a prpria competncia um fentipo diferenciado que distingue clulas tanto espacial como temporalmente. Considera-se, em geral, que a competncia pode ser adquirida de vrias maneiras. Primeiro, uma clula pode tornar-se competente sintetizando um receptor para a molcula indutora. Como veremos mais adiante neste captulo, uma clula B no competente para responder induo por clulas T at que tenha ligado antgenos. Quando os antgenos so ligados, eles criam um conjunto de receptores que os capacitam a responder s molculas indutoras secretadas pelas clulas T. Esse mecanismo de competncia tambm visto na induo da diferenciao de neurnios simpticos (Birren e Anderson, 1990; Cattanco e McKay, 1990). Desde o incio da dcada de 1960, era conhecido que a diferenciao dos neurnios simpticos depende do fator de crescimento nervoso (NGF); porm, quando as clulas progenitoras desses neurnios foram isoladas, elas no responderam ao NGF. Alm disso, no tinham receptores capazes de ligar NGF. Em vez disso, para se diferenciarem, essas clulas tinham que ser primeiro expostas ao fator de crescimento de fibroblasto (FGF). Essa exposio resultava na expresso de NGF nas suas membranas celulares. Tais clulas tratadas por FGF podiam responder ao NGF (Figura 17.1). A clula progenitora original no era competente para ser induzida pelo NGF porque no tinha o receptor NGF. Quando esse foi induzido pelo FGF, tornou-se competente para responder ao NGF.
* fcil distinguir as relaes permissivas e instrutivas por uma analogia com uma situao mais familiar. Este livro foi possvel ser feito pelas interaes permissivas e instrutivas. Os revisores podem convencer-me a alterar o material no captulo. Isso uma interao instrutiva, j que a informao passar a ser diferente daquela que teria sido. Porm, a informao no livro no poderia ter sido expressa sem as interaes permissivas com o editor e o impressor.
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Clula progenitora do nervo simptico
FGF Responsivo, NGF no responsivo Receptor FGF Ligao FGF sinaliza a sntese do receptor NGF Neurnio primitivo
Receptor NGF Ligao de NGF sinaliza a clula para se diferenciar em um neurnio simptico maduro
Neurnio simptico maduro
Neurnio dependente de NGF
Figura 17.1
Induo e competncia de uma linhagem precursora de neurnio simptico. A clula germinativa original uma clula mitoticamente ativa que no tem receptores NGF, mas que pode responder a FGF. Isso d origem a uma clula neural primitiva que tem processos, mas ainda se divide. Esse neurnio primitivo tem receptores para NGF. A clula responsiva ao NGF pode se diferenciar em um neurnio simptico maduro que no se divide (caracterizado pelo seu grande soma, nuclolos proeminentes, extensos processos e dependncia de NGF para a sobrevivncia). (Segundo Birren e Anderson, 1990.)
Em segundo lugar, uma clula pode alcanar a competncia sintetizando uma molcula que permite o funcionamento do receptor. Receptores podem ligar o indutor, mas isso no significa que os receptores sejam funcionais. Freqentemente, um receptor atua enviando um sinal para o ncleo. Como vimos no Captulo 3, uma vez que o receptor tenha fixado um ligante, ele ativa enzimas que fabricam o sinal para diviso ou diferenciao. Se alguma dessas enzimas no estiver presente, o sinal no transmitido. Assim, uma clula pode alcanar competncia sintetizando um elo faltante na trajetria da sinalizao. Em terceiro lugar, a competncia pode ser adquirida pela represso de um inibidor. Se o inibidor estiver presente, uma clula poder ligar o indutor, enviar o sinal para o ncleo e, apesar disso, no ser capaz de ser induzida. Por exemplo, os indutores freqentemente causam alteraes da forma celular (como na induo do tubo neural). Se a clula estiver inibida de mudar sua forma, ela no ser capaz de responder.
Fatores parcrinos
Interaes proximais so em geral mediadas por protenas que podem difundir-se ao longo de curtas distncias para induzir mudanas em suas clulas vizinhas. Essas protenas so muitas vezes chamadas de fatores parcrinos ou fatores de diferenciao
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e crescimento (GDFs).* Enquanto os fatores endcrinos (hormnios) circulam pelo sangue para exercer seus efeitos, os fatores parcrinos (como FGF e NGF mencionados anteriormente) so secretados para os espaos imediatamente ao redor da clula que os produz. Durante a dcada retrasada, os biologistas do desenvolvimento descobriram que a formao de numerosos rgos realmente efetuada por uma populao relativamente pequena de protenas. O embrio herda uma caixa de ferramentas relativamente compacta e usa muitas das mesmas protenas para construir o corao, os rins, os dentes, os olhos e outros rgos. Alm disso, as mesmas protenas so utilizadas atravs do reino animal, e os fatores ativos na criao do olho ou corao de Drosophila so muito semelhantes aqueles usados na gerao de rgos de mamferos. Essas protenas podem ser agrupadas em quatro famlias principais na base de suas estruturas. Essas famlias so: a famlia do fator de crescimento fibroblstico (FGF), a famlia Hedgehog, a famlia Wingless (Wnt) e a superfamlia TGF. Os Fatores de Crescimento Fibroblstico A famlia FGF tem nove membros relacionados estruturalmente. FGF1 tambm conhecido como FGF acdico, FGF2 s vezes chamado de FGF bsico e FGF7, fator de crescimento de queratincitos. Embora existam nove genes FGF distintos, esses podem gerar uma variedade de isoformas de protenas variando suas emendas de RNA ou do cdon de iniciao em diferentes tecidos (Lappi, 1995).Os FGFs ativam um conjunto de tirosina quinases receptoras chamado de receptores do fator de crescimento fibroblstico As reaes iniciadas por esses fatores de crescimento fibroblstico ativados foram discutidas no Captulo 3. Os FGFs esto associados com vrias funes desenvolvimentais, incluindo a angiognese, a formao do mesoderma e a extenso axnica. Enquanto os FGFs muitas vezes podem substituir um ao outro, seus padres de expresso lhes do funes separadas. O FGF2 especialmente importante na angiognese, e o FGF8 importante para o desenvolvimento do crebro intermedirio (Crossley et al., 1996). No camundongo, rompimentos de certos genes FGF produzem anormalidades especficas. A ausncia de Fgf3 leva formao desorganizada de somitos, vrtebras caudais anormais, e defeitos do ouvido interno, enquanto a ausncia de Fgf4 resulta em morte embrionria precoce causada pela falncia do crescimento da massa celular interna. O nico problema de camundongos deficientes em Fgf5 parece ser plo anormalmente longo (Figura 17.2; Herbert et al., 1994; Wilkie et al., 1995). Os FGFs so tambm ativos na placa de crescimento dos ossos longos e na suturas dos ossos cranianos (Muenke e Schell, 1995). Mutaes levando a ativao prematura de receptores de FGF so a principal causa do nanismo (maturao precoce das placas de crescimento dos ossos longos) e craniosinostoses (fuso prematura de ossos cranianos) (Figura 9.19). [cell7.html]
*Os fisiologistas descreveram trs maneiras principais pelas quais molculas solveis efetuam mudanas em clulas. Os fatores parcrinos so molculas solveis que efetuam mudanas nas clulas adjacentes, ou prximas, clula secretora. Em embriologia, tais fatores tm tambm sido chamados de morfgenos. Os fatores endcrinos (hormnios) so molculas solveis que viajam pelo sangue para realizar mudanas em clulas distantes da clula secretora. Os fatores autcrinos so molculas que efetuam mudanas nas clulas que os secretaram. Para que os efeitos autcrinos ocorram, a clula sintetiza uma molcula para qual ela tenha seu receptor prprio. Embora a estimulao autcrina no seja comum, ela vista em clulas citotrofoblsticas placentrias que sintetizam e secretam o fator de crescimento derivado das plaquetas, cujo receptor est na membrana celular daquelas clulas (Goustin et al., 1985). O resultado a proliferao explosiva daquele tecido. Existe aprecivel debate sobre at que ponto fatores parcrinos podem operar. A activina, por exemplo, pode difundir-se por muitos dimetros celulares e pode induzir diferentes conjuntos de genes em diferentes concentraes (Gurdon et al., 1994, 1995). As protenas Vg1, BMP4 e Nodal, porm, provavelmente somente trabalham sobre seus vizinhos adjacentes (Jones et al., 1996; Reilly e Melton, 1996). Esses fatores podem induzir a expresso de outros fatores de curto alcance desses vizinhos, e uma cascata de indues parcrinas pode ser iniciada.
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(A)
Figura 17.2
Papis dos fatores de crescimento fibroblstico e seus receptores. Crescimento do plo em um camundongo deficiente em FGF5 (a mutao angor) (A) torna o plo muito mais longo que o dos companheiros de ninhada no controle (B). (Fotografias cortesia de C. Peterson.)
(B)
A famlia hedgehog Em Drosophila, a protena Hedgehog tem vrios papis crticos na padronizao da mosca em desenvolvimento. No embrio precoce, ela atua de maneira dependente da concentrao na especificao de cada parasegmento embrionrio e como veremos nos prximos captulos, hedgehog tambm trabalha mais tardiamemte no desenvolvimento, especificando os eixos da pata e dos discos imaginais alares (Basler e Struhl, 1994; Heemskerk e DiNardo, 1994). Os vertebrados tm pelo menos trs homlogos do gene hedgehog de Drosophila: sonic hedgehog (shh), desert hedgehog (dhh) e indian hedgehog (ihh). O Desert hedgehog expresso nas clulas de Schwann e Sertoli, e camundongos homozigotos para um alelo zero (null) de dhh tm espermatognese defeituosa. O indian hedgehog expresso no intestino e na cartilagem (Bitgood e McMahon, 1995; Bitgood et al., 1996). Entre os trs homlogos de vertebrados Sonic hedgehog a mais empregada. Confeccionada pela notocorda, a protena responsvel pela induo de clulas da placa de assoalho e neurnios motores no tubo neural (Placzek et al., 1990; Yamada et al., 1993; veja Captulo 8). A protena Hedgehog secretada pela notocorda (na realidade, os dois-teros do N-terminal dessa protena) tambm responsvel pela induo do esclertomo nos somitos (Fan e Tessier-Lavigne, 1994; Johnson et al., 1994). A Sonic hedgehg foi mostrada mediar a formao do eixo esquerdo-direito em pintos, iniciar o eixo ntero-posterior nos membros, e induzir o eixo polarizado do intestino (Riddle et al., 1993; Levin et al., 1995; Roberts et al., 1995). Freqentemente, a Sonic hedgehog trabalha com outros fatores parcrinos, como Wnt e FGF. Como veremos no prximo captulo, o shh no broto dos membros induz a expresso de FGF4 no mesoderma posterior, e a combinao de FGF4 e Wnt7a necessria para manter a expresso de shh. No dente em desenvolvimento, Sonic hedgehog, FGF4, e outros fatores parcrinos esto concentrados em regies onde ocorrem interaes celulares (Figura 17.3; Vaahtokari et al., 1996a).
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Bucal (bochecha) Mesial (interno) N de esmalte
N de esmalte
Figura 17.3
Concentrao do fator parcrino de crescimento e fatores de diferenciao na regio onde a morfognese e a diferenciao esto ocorrendo no molar inferior do embrio do camundongo de 14 dias. (O limite do epitlio dental mostrado em branco.) Os fatores parcrinos esto sendo secretados pela clulas epiteliais no se dividindo, o n de esmalte. (O painel esquerda mostra que as clulas do n de esmalte no esto replicando DNA.) Acima de cada hibridizao in situ est a reconstruo seriada da rea de expresso. Veja pgina 682 para detalhes. (de Jernvall, 1995; fotografias cortesia de A. Vaahtokari, J. Jernvall e I. Thesleff.)
A famlia Wnt Esta famlia compreende uma famlia de glicoprotenas ricas em cistena; existem pelo menos 15 membros dessa famlia em vertebrados. Seu nome advm da fuso do nome do gene da polaridade segmentria de Drosophila, wingless, com o nome de um dos seus homlogos vertebrados, integrated. Como vimos no Captulo 7, a Wnt1 parece ser ativa na induo do mitomo nos somitos e no estabelecimento dos limites do crebro intermedirio (McMahon e Bradley, 1990; Ku e Melton, 1993; Stern et al., 1995). Conforme veremos em captulos subseqentes, os genes Wnt tambm so importantes no estabelecimento da polaridade dos membros vertebrados, tal como o wingless estabelece a polaridade durante o desenvolvimento dos membros dos insetos. interessante que em ambos os casos ocorrem interaes com membros da famlia hedgehog. Durante a gastrulao do camundongo Wnt3a, Wnt5a e Wnt5b so todos expressos em regies sobrepostas mas distintas na linha primitiva. A Wnt3a a nica protena Wnt vista nessa regio da linha que ir gerar o mesoderma dorsal (somito), e camundongos homozigotos para o alelo zero do gene Wnt3a no tm somitos caudais aos membros anteriores (Figura 17.4; Takada et al., 1994). A trajetria sinalizando Wnt est intimamente conectada trajetria hedgehog. Como mostrado na Figura 3.38, hedgehog estimula a expresso de wg e a protena Wingless estimula a expresso de hedgehog. Em Drosophila, uma das coisas feitas por Hedgehog para ativar a expresso gnica de wingless de contrapor a represso da protena Patched. Uma vez eliminada a represso do gene patched, o wingless pode ser expresso. A expresso ectpica do gene patched inibe o crescimento celular. Pensa-se existir uma trajetria semelhante em humanos, e cada uma das molculas na trajetria de Drosophila tem um homlogo humano. Em humanos, mutaes espordicas de perda-defuno do gene patched em tecidos somticos causam carcinomas de clulas basais, o tipo mais comum do cncer
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(A)
(B)
Figura 17.4
Ausncia de somitos caudais em embries de camundongos homozigotos para um alelo zero de Wnt3a. (A) Embrio de camundongo do tipo selvagem de 12,5 dias. (B) O mesmo estgio em um embrio de um mutante Wnt3a, mostrando falta de broto caudal e um eixo truncado. (C) Seo transversal atravs da rea do membro posterior de um embrio tipo selvagem de camundongo de 9,5 dias. (D) Seo transversal no mesmo estgio de um embrio mutante Wnt3a. No so vistos somitos (A massa de clulas perto da medula espinhal mais provavelmente oriunda da crista neural.) (de Takada et al., 1994; fotografias cortesia de A. P. McMahon.)
(C) (D)
humano. Mutaes herdveis do gene pathched do origem sindrome nevus da clula basal, uma condio autossmica dominante caraterizada por anomalias desenvolvimentais (alteraes craniofaciais e das costelas, dedos ligados) e tumores malignos (meduloblastomas e carcinomas de clulas basais) (Hahn et al., 1996; Johnson et al., 1996).* A superfamlia TGF Existem mais de 30 membros estruturalmente relacionados da superfamlia TGF, que regulam algumas das interaes mais importantes do desenvolvimento (Figura 17.5). Os peptdeos codificados pelos genes dessa superfamlia so processados de modo que a regio carboxlica terminal contenha o peptdeo maduro. Esses peptdeos so dimerizados em homodmeros (consigo mesmo) ou heterodmeros (com outros peptdeos TGF) e secretados pela clula. A superfamlia TGF inclui a famlia TGF , a famlia activina, as protenas da morfognese ssea (BMPs), a famlia Vg1, e outras protenas, incluindo a Dorsalina (ativa na padronizao do tubo neural, veja Captulo 7), o fator neurotrfico derivado da glia (necessrio para a diferenciao dos neurnios entricos e renais), e o fator inibidor Mlleriano (que envolvido na determinao sexual dos mamferos, veja Captulo 20). Em Drosophila, a protena decapentaplegic homloga BMP4 de vertebrado. Os receptores que ligam os membros da superfamlia TGF transmitem o sinal para o ncleo pela ativao de protenas smad especficas. Essas protenas residem no citoplasma, mas quando os receptores ligam membros da superfamlia
* Carcinomas de clulas basais, tumores da camada de clulas basais da epiderme, afligem cerca de 750.000 pessoas cada ano nos Estados Unidos, a maioria desses cnceres se originando aps exposio luz solar de pessoas de origem norte-europia. Por outro lado, a sndrome nevus de clulas basais (s vezes chamada de sndrome de Gorlin) extremamente rara.
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Famlia BMP osteogenina Dorsalina 1 (pinto)
TGF, eles ativam (provavelmente por fosforilao) um desses polipeptdeos de 50-kDa. Isso converte a protena smad em um fator de transcrio que pode penetrar no ncleo e ativar genes especficos (Graff et al., 1996; Hoodless et al., 1996; Liu et al., 1996).
A FAMLIA TGF. Essa famlia inclui TGF1, 2, 3 e 5. TGF1 parece ser impor tante para a formao de rgo ramificados. TGF1 exgeno foi achado inibir o crescimento de duetos em glndulas mamrias do camundongo (Daniel, 1989; Silberstein et al., 1992), causar malformaes de glndulas salivares embrionrias murinas (Hardman et al, 1994), e prevenir a ramificao dos rins embrionrios (Ritvos et al.,1995). Assim, TGF1 pode ser crtico no processo normal de ramificao, talvez mediando esse e outros processos, intensificando a produo de componentes da matriz extracelular como a fibronectina, colgenos I e IV (Ignotz e Massagu, 1968; Penttinen et al, 1988), osteonectina (Wrana e al., 1991) e proteoglicanos (Bassols e Massagu, 1988; Morales e Roberts, 1988), enquanto inibe a protelise da matriz celular (Edwards et al, 1987; Saksela et al., 1987). Isso poderia ter um efeito lquido de estabilizao da estrutura tissular. Os efeitos exatos das protenas TGF dependem, muitas vezes, do tipo celular que encontram, e a mesma TGF pode ter efeitos opostos (tal como interrompendo ou acelerando a diviso celular) em diferentes tipos de clulas. Os efeitos de TGF so de difcil separao porque componentes da famlia parecem funcionar de maneira semelhante e podem compensar por perdas dos outros quando expressos conjuntamente. Alm disso, delees apontadas para o gene Tgfb1 so difceis de interpretar, pois a me pode suprir esse fator atravs da placenta e do leite (Letterio et al., 1994). A FAMLIA BMP. Embora originalmente descoberta devido sua habilidade em induzir o crescimento sseo, as BMPs regulam processos desenvolvimentais to diversos como proliferao celular, apoptose, migrao celular, diferenciao celular e morfognese (Hogan, 1996). (Revelou-se que a BMP1 no membro dessa famlia.) BMPs se distinguem dos outros grupos da superfamlia TGF por terem sete, em vez de nove, cistenas conservadas no peptdeo maduro. J vimos protenas BMP tal como a Nodal (ativa na formao do eixo tanto em Xenopus como em camundongos), BMP4 (importante na especificao mesodrmica, polaridade do tubo neural e padronizao de somitos), e Decapentaplegic (que determina a polaridade dorsoventral em Drosophila). A BMP4 tambm est implicada na induo de apoptose em clulas da crista neural migrando de rombmeros de nmeros mpares (Graham et al., 1993) e membrana entre dedos dos ps dos embries de pintos (veja Captulo 23). BMP4 e Decapentaplegic so extremamente semelhantes, e genes BMP4 humanos podem salvar embries de moscas carentes de dpp (Padgett et al., 1993). A ausncia de algumas BMPs causa anormalidades esquelticas especficas (Kingsley et al., 1994; Storm et al., 1994). Mutaes do gene BMP5 resultam em um esqueleto pequeno e orelhas pequenas devido reduo de condensaes da precartilagem, enquanto mutaes de gdf5 causam membros curtos e um nmero reduzido de dedos do p. Como os outros membros TGF, as BMPs funcionam dimerizando receptores nas clulas-alvo e ativando suas quinases serina/treonina (Liu et al., 1995).
(braquipodismo)
(orelha curta)
(camundongo)
(Xenopus) (ourio-do-mar) Screw (Drosophila) Nodal activina activina
Inibina
Figura 17.5
Relacionamentos entre membros da superfamlia TGF-b. (Segundo Hogan, 1996.) *

*Infelizmente, laboratrios diferentes usam letras maisculas e/ou hifens para os nomes desses e de outros fatores de maneiras diferentes. A nossa ortografia particular no foi planejada para priorizar qualquer desses laboratrios ou convenes. Porm, lembramos o dito (Cohen, 1982) que Acadmicos podem mais facilmente compartilhar suas escovas de dentes do que a nomenclatura um do outro.
Sinalizao Justcrina (juxtacrine) Embora a maioria dos reguladores da induo conhecidos sejam protenas difusveis, algumas protenas podem permanecer ligadas superfcie celular. Certas protenas Wnt, por exemplo, carecem de um sinal para secreo e podem interagir com receptores de suas vizinhas enquanto ligadas suas membranas celulares. De maneira semelhante, as protenas Hedgehog podem existir em forma ligada membrana antes de seu
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Citoplasma
Figura 17.6
Serrate
Delta
Monmero Notch Extracelular Citoplasma
Notch
Sinalizao clula-clula entre duas clulas justapostas. Este modelo especulativo para a sinalizao Delta-Notch baseado em evidncia gentica de cruzamentos de Drosophila. A protena receptora Notch pode se ligar s protenas Serrate ou Delta das clulas adjacentes atravs de seus domnios extracelulares. A protena Delta age como um ligante e dimeriza a protena Notch na membrana desse ltimo. Essa dimerizao estabilizada por interaes entre as protenas, que podem permitir a troca da protena Suppressor of Hairless com Deltex. A protena Suppressor of Hairless estava ligada ao lado citoplasmtico da molcula Notch, mas uma vez liberada, torna-se um fator de transcrio. Esse fator pode controlar o destino da clula, direcionando-a a tornar-se pele em vez de tecido neural. (Segundo Artavanis-Tsakonas et al., 1995.)
Deltex
Suppressor of Hairless
Suppressor of Hairless
Ncleo
Hairless
processamento proteoltico. Nessa sinalizao, as clulas teriam que estar em contato direto para o sinal ser eficaz. Tal caminho foi visto para o sinal Delta recebido pela protena Notch, um sinal cujas funes desenvolvimentais em Drosophila sero discutidas mais tarde. Notch se estende atravs da membrana celular, e sua superfcie externa contata protenas Delta ou Serrate que se estendem de clulas adjacentes. Quando as protenas Delta se conectam Notch, estabilizam a sua dimerizao e permitem a ocorrncia de mudanas conformacionais no lado citoplasmtico da protena Notch. Essas mudanas permitem protena Deltex trocar com a protena chamada Suppressor of Hairless. Quando se separa da protena Notch, a protena Suppressor of Hairless entra no ncleo para se tornar um fator de transcrio (Figura 17.6; ArtavanisTsakonas et al, 1995). Assim, a protena Notch capaz de receber o sinal de Delta somente quando as clulas esto justapostas. Por isso, esse tipo de sinalizao , s vezes, chamado de sinalizao juxtcrina (juxtacrine). [prox1.html]
Interaes epitlio-mesnquima
Alguns dos casos melhor estudados de induo secundria so aqueles envolvendo as interaes de lminas epiteliais com clulas mesenquimatosas adjacentes. So chamadas interaes epitelio-mesnquima. O epitlio pode originar-se de qualquer camada germinativa, enquanto o mesnquima geralmente derivado de tecido mesodrmico frouxo ou da crista neural. Exemplos dessas interaes esto listados na Tabela 17.1. Especificidade Regional da Induo Usando como nossos exemplos a induo de estruturas cutneas, iremos examinar as propriedades das interaes epitlio-mesnquima. O primeiro fenmeno a especificidade regional da induo. A pele composta de dois tecidos principais: a
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Tabela 17.1 rgo
Algumas interaes epitlio-mesnquima Componente epitelial Epiderme (ectoderma) Componente mesenquimatoso Derme (mesoderma)
Estruturas cutneas (plo, penas, glndulas sudorparas, glndulas mamrias) Membro rgos viscerais (fgado, pncreas, glndulas salivares) rgos associados farngeo e respiratrio (pulmo, timo, tireide) Rim Dente
Epiderme (ectoderma) Epitlio (endoderma) Epitlio (endoderma) Epitlio do broto uretrico (mesoderma) Epitlio maxilar (ectoderma)
Mesnquima (mesoderma) Mesnquima (mesoderma) Mesnquima (mesoderma) Mesnquima (mesoderma) Mesnquima (crista neural)
epiderme externa, derivada do ectoderma e a derme derivada do mesoderma. A epiderme do pinto sinaliza as clulas drmicas subjacentes a formarem condensaes (provavelmente secretando Sonic hedgehog e TGF2); o mesoderma condensado responde secretando fatores que causam a formao de estruturas cutneas regionalmente especficas, compostas quase inteiramente de clulas ectodrmicas (Nohno et al., 1995; Tingerret e Chuong, 1996; Prancha 23). Essas so as penas largas das asas, penas estreitas das coxas, e as escamas e garras das patas. Aps separar o epitlio embrionrio e o mesnquima um do outro, pode-se recombin-los de diferentes maneiras (Saunders et al., 1957). Algumas das recombinaes esto ilustradas na Figura 17.7. Conforme se v, o mesnquima responsvel pela especificidade da induo no ectoderma competente. Esse mesmo tipo de ectoderma se desenvolve de acordo com a regio de onde foi retirado o mesoderma. Aqui, o mesnquima tem um papel instrutivo, chamando a participao de diferentes conjuntos de genes nas clulas responsivas. Essa especificidade regional da induo crtica durante o desenvolvimento dos sistemas digestivo e respiratrio. Na morfognese dos tubos endodrmicos, o
Fonte do mesoderma
Ectoderma alar
Induo especfica
Asa
Pena da asa
Figura 17.7
Coxa
Pena da coxa
Especificidade regional da induo. Quando clulas da derme (mesoderma) so recombinadas com a epiderme (ectoderma) no pinto, o tipo de estrutura cutnea produzida pelo ectoderma determinado pela localizao original do mesoderma. (Adaptado de Saunders, 1980.)
Escamas, garra
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epitlio endodrmico capaz de responder diferentemente aos diferentes mesnquimas especficos regionalmente. Isso capacita o tubo digestivo e o tubo respiratrio desenvolverem diferentes estruturas em diferentes regies do tubo. Assim, medida que o tubo digestivo encontra novos mesnquimas, se diferencia em esfago, estmago, intestino delgado e clon (Gumpel-Pinot et al., 1978; Fukumachi e Takayama, 1980). Essa especificidade regional da induo do mesnquima fica dramaticamente aparente na formao do sistema respiratrio. No mamfero em desenvolvimento, o tubo respiratrio epitelial responde de duas maneiras distintas. Quando na regio do pescoo, ele cresce de modo reto, formando a traquia. Aps penetrar no trax, ele se ramifica, formando os dois brnquios e depois o pulmo. O epitlio respiratrio pode ser isolado logo depois de ter se dividido nos dois brnquios, e os dois lados podem ser tratados de maneira diferente. A Figura 17.8 mostra o resultado de tal experimento. O epitlio bronquial direito manteve seu mesnquima pulmonar, enquanto o brnquio esquerdo foi rodeado pelo mesnquima traqueal (Wessells, 1970). O brnquio direito se proliferou e se ramificou sob a influncia do mesnquima pulmonar, enquanto o lado esquerdo continuou a crescer de uma maneira no-ramificada. Assim, o epitlio extremamente malevel e pode se diferenciar de acordo com suas instrues mesenquimatosas. A especificidade do mesoderma considerada ser controlada por suas interaes com o tubo endodrmico durante os estgios precoces do desenvolvimento. Roberts e colegas (1995) implicaram a Sonic hedgehog nessa especificao. No incio do desenvolvimento, a expresso de shh limitada ao endoderma posterior do intestino terminal. Isso parece ser necessrio para a induo no mesoderma de um conjunto aninhado de genes Hox que se parece com o conjunto posterior de genes HOM-C de Drosophila. Tal como a situao nas vrtebras, as margens anteriores do padro de expresso delineiam os limites morfolgicos das regies que iro formar a cloaca, o intestino grosso, o ceco, ceco mdio (na margem intestino mdio/intestino terminal), e a poro posterior do intestino mdio (Prancha 22; Figura 17.9). Assim, a expresso endodrmica de Sonic parece induzir uma expresso aninhada de genes Hox no mesoderma. Esses genes Hox provavelmente especificam o mesoderma de modo que eles possam interagir com o tubo endodrmico e especificar suas regies.
Figura 17.8
Capacidade do epitlio presuntivo pulmonar de se diferenciar em relao fonte do mesnquima indutor. Aps o epitlio pulmonar do camundongo ter se ramificado em dois brnquios, o rudimento inteiro excisado e cultivado. O brnquio direito deixado intocado, enquanto a extremidade do brnquio esquerdo coberta com mesnquima traqueal. A extremidade do brnquio direito forma os ramos caractersticos do pulmo, mas no ocorre ramificao na extremidade do brnquio esquerdo. (de Wessells, 1970, cortesia de N. Wessells.)
Grupo paralogo Hox
Intestino delgado
Ceco mediano
Ceco
Neurulao precoce
Intestino grosso
Figura 17.9
Cloaca Estgio do broto mediano
Especificao regional do mesoderma visceral atravs de interaes com o endoderma do intestino posterior. A expresso e secreo de Sonic hedgehog no endoderma gera um conjunto aninhado de expresso do gene Hox no mesoderma adjacente. Aps o mesoderma ter sido especificado, ele pode atuar sobre o tubo endodrmico para induzir regies morfolgicas especficas. (Segundo Roberts et al., 1995.)
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Especificidade Gentica da Induo Enquanto o mesnquima pode instruir o epitlio sobre quais conjuntos de genes deve ativar, o epitlio responsivo somente pode obedecer a essa informao at o ponto que seu genoma permitir. Em um experimento clssico, Hans Spemann e Oscar Schott (1932) transplantaram ectoderma do flanco de uma gstrula precoce de r para regio de uma gstrula de salamandra destinada a se tornar parte da boca. De maneira semelhante, o tecido ectodrmico presuntivo do flanco de uma gstrula de salamandra foi colocado na presuntiva regio oral de embries de rs. As estruturas da regio oral diferem muito entre as larvas de salamandras e rs. A larva da salamandra Triturus tem equilibradores em forma de clava sob a boca, enquanto os girinos de rs produzem glndulas secretoras de muco e sugadores (Figura 17.10). Os girinos de rs tm tambm um maxilar cornificado sem dentes, enquanto a salamandra tem um conjunto de dentes de calcrio em sua mandbula. As larvas resultantes dos transplantes eram quimeras. As larvas da salamandra tinham bocas semelhantes s das rs, e os girinos de rs tinham dentes de salamandra e equilibradores. Em outras palavras, as clulas mesodrmicas instruram o ectoderma a produzir uma boca, mas o ectoderma respondeu produzindo a nica boca que saba como produzir, no importa quo inadequada.* A mesma especificidade gentica encontrada em combinaes de pele de pinto e pele de camundongo (Coulombre e Coulombre, 1971). Quando ectoderma normalmente destinado a se tornar crnea isolado de embries de pinto e combinado com
*Spemann reportado como tendo descrito dessa maneira: O ectoderma diz ao indutor, voc me diz como produzir uma boca; est bem, assim o farei, porm, no posso produzir o seu tipo de boca; s posso produzir a minha e isso farei. (Citado por Harrison, 1933.)
Doador
Hospedeiro rea do presuntivo ectoderma oral
Resultado
Gstrula de r
Gstrula de salamandra
Sugador Salamandra com sugadores de girino de r
Figura 17.10
Especificidade gentica da induo. O transplante recproco entre as presuntivas regies ectodrmicas orais das gstrulas da salamandra e da r conduz a larvas de salamandra com sugadores de girino e girino de r com equilibradores de salamandra. (Segundo Hamburgh, 1970.)
Gstrula de salamandra
Gstrula de R Equilibradore Girino de r com equilibradores de salamandra
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Figura 17.11
(A)
(B)
Especificidade gentica da induo cutnea. (A) Seo da regio corneana de um embrio de pinto de 17 dias. Aos 5 dias de incubao, o cristalino deste olho foi substitudo pela derme do flanco de um embrio precoce de camundongo. Uma condensao de clulas embrionrias murinas est localizada diretamente sob o epitlio do pinto. (B) Formao de penas a partir do epitlio corneano de tal espcimen. Clulas de camundongo esto presentes no rudimento das penas. (de Coulombre e Coulombre, 1971, cortesia de A. J. Coulombre.)
mesoderma de pele de pinto, o ectoderma produz botes de penas tpicos da pele do pinto. Alm disso, quando o mesmo tecido - ectoderma presuntivo da crnea - combinado com ectoderma da pele de camundongo, botes de penas tambm aparecem (Figura 17.11). O mesoderma do camundongo instruiu a crnea do pinto a produzir uma estrutura cutnea. No camundongo, isso normalmente seria plo. O ectoderma competente do pinto, porm, faz o melhor que pode, desenvolvendo suas estruturas cutneas ou seja, penas. Assim, as instrues enviadas pelo tecido mesenquimatoso podem atravessar barreiras entre espcies. Salamandras respondem a sinais de rs, e tecido de pinto responde a indutores de mamferos. A resposta do epitlio, porm, espcieespecfica. Enquanto a especificidade do tipo de rgo (pena ou garra) usualmente controlada pelo mesnquima dentro de uma espcie, a especificidade da espcie controlada pelo epitlio responsivo. [prox2.html]
Cascatas de induo embrionria: Induo do cristalino

Os Fenmenos da Induo do Cristalino As interaes entre clulas prximas provem um mecanismo pelo qual o desenvolvimento coordenado pode ocorrer, para um tecido responsivo tambm poder tornar-se um tecido indutor. Estudos recentes mostraram que a induo secundria um processo muito complexo. Na verdade, o que tradicionalmente estivemos chamando de indues secundrias usualmente so apenas a ltima induo em uma cascata que comeou muito antes na embriognese, e muitos tecidos adquirem sua competncia atravs de uma induo prvia. Embora esses tecidos possam parecer inalterados ao microscpio, eles foram induzidos para poder responder a um novo indutor. Isso provavelmente acontece nas indues epidrmicas mencionadas acima, e certamente verdadeiro para a induo secundria mais estudada, a formao do cristalino.
O MODELO DO CLICE PTICO NA INDUO DO CRISTALINO. Conforme
discutido no Captulo 7, as clulas que formam o cristalino derivam da regio do ectoderma da cabea que contatado pela vescula ptica do crebro anterior. Esse trabalho pioneiro de Hans Spemann e sua reviso desses estudos em 1938, tornaram a induo do cristalino o paradigma dos eventos indutivos secundrios. Os experimentos bsicos foram como segue. Primeiro, quando Spemann (1901) destruiu o primrdio da vescula ptica da r Rana temporaria, no ocorreu o desenvolvimento do cristalino. Assim, Spemann conclui que o contato da vescula ptica com o ectoderma acima dela foi essencial para a formao do cristalino. Segundo, Warren Lewis (1904, 1907) confirmou e estendeu essa concluso. Ele removeu vesculas pticas de nurulas de estgio tardio e transplantou-as para o ectoderma da cabea de regies que usualmente no formariam cristalino. Ele achou que o ectoderma da cabea dessa regio formaria ento estruturas semelhantes ao
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cristalino, e concluiu que a vescula ptica era suficiente para induzir a formao de tecido do cristalino em ectoderma, que de outra maneira no o teria formado. Pareceu que o contato com a vescula ptica era tudo o que era necessrio para induzir cristalino no ectoderma sobrejacente.
DESACORDOS COM O MODELO DO CLICE PTICO. Houve dissidentes dessa
viso; Mencl (1908) notou que certos peixes tinham defeitos congnitos devido aos quais no formavam olhos. Apesar disso, esses peixes tinham cristalino no seu ectoderma da cabea. Mais importante, quando King (1905) tentou repetir os experimentos de Spemann, ele encontrou ao contrrio do esperado que o cristalino ainda se formava mesmo quando rudimentos da vescula ptica tinham sido obliterados. Esses e outros investigadores comearam a achar que os cristalinos podiam se formar sem contato com a vescula ptica.* medida que mais dados se acumulavam, pareceu que havia um alto grau de diversidade de espcies. Algumas espcies pareciam formar cristalinos sem a necessidade de vesculas pticas, ao passo que em outras espcies, os cristalinos pareciam depender inteiramente do contato com essa vescula. Spemann (1938) reconciliou esses resultados argumentando que um organismo podia evoluir com uma margem de segurana, desenvolvendo duas maneiras de formar determinado tecido. Assim, o cristalino normalmente se originaria pelo contato com a vescula ptica, porm, essa falhando, poderia originar-se separadamente se assim ele tivesse que fazer. Esse conceito foi chamado de hiptese da dupla segurana. Em 1966, Jacobson integrou mais dados nesse modelo. Ele notou que o ectoderma formador do cristalino entra seqencialmente em contato com o endoderma presuntivo do intestino anterior, o endoderma presuntivo do corao e a vescula ptica. Ele sugeriu que cada um desses tecidos atuaria de uma maneira aditiva para induzir a formao do cristalino nesse tecido. Em algumas espcies, o limiar para a induo do cristalino seria baixo, e o contato com o ectoderma seria suficiente. Em outras, o limiar seria alto, e todos os trs indutores teriam que estar ativos. Assim, a formao do cristalino parecia depender da vescula ptica, mas na realidade, essa seria somente o ltimo dos trs indutores. A Base Celular da Induo do Cristalino Sem descartar o papel do mesoderma e endoderma, estudos recentes em Xenopus enfatizam a importncia da placa neural anterior como um indutor precoce do ectoderma do cristalino. Esses experimentos indicam que o ectoderma presuntivo do cristalino recebe sua habilidade de tornar-se cristalino muito cedo durante o desenvolvimento (durante os estgios de gstrula tardia para meia-nurula) e que a vescula ptica apenas localiza a diferenciao desse tecido j autnomo. Em outras palavras, o ectoderma da cabea formar cristalinos sem o contato do clice ptico, mas esse necessrio para a completa diferenciao do cristalino e seu posicionamento adequado em relao ao restante do olho. Este modelo (Figura 17.12; Saha et al., 1989; Grainger, 1992) divide a determinao do ectoderma do cristalino em quatro estgios: competncia, propenso, determinao e diferenciao final. Competncia para responder ao sinal indutor inicial vista como um processo autnomo dentro do ectoderma, e a propenso para produzir cristalino provida pela placa neural anterior. A especificao do cristalino ocorre ao tempo do fechamento da placa neural, quando a vescula ptica se aproxima do ectoderma da cabea, e a determinao final induzida pela vescula ptica.
*A interpretao desses experimentos foi extremamente difcil devido s diferenas especficas nos mecanismos de induo, a temperatura na qual ocorre induo mxima, e a dificuldade de conseguir pedaos de tecidos no contaminados para transplante. Veja Jacobson e Sater (1988) e Saha et al. (1989, 1991) para revises sobre esses dissidentes e seus experimentos.
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(A) Gstrula precoce (competncia pr-cristalino)
Ectoderma
Figura 17.12
Mesoderma (B) Gstrula intermediria tardia (competncia do cristalino)
Endoderma rea da retina rea do cristalino
( C ) Nurula precoce (vis de formao do cristalino)
Placa neural rea do cristalino Ectoderma do cristalino
(D)
Nurula tardia (especificao do cristalino)
Tubo neural
Vescula ptica Ectoderma do cristalino
Um modelo corrente da induo do cristalino. Os sinais indutivos esto indicados por setas. (A) Na gstrula precoce, o ectoderma ainda no alcanou a competncia para tornar-se cristalino (embora tenha competncia para tornarse tecido neural). (B) Durante a gstrula intermediria, o ectoderma formador do cristalino torna-se competente para responder ao sinal indutor do cristalino da presuntiva placa neural (possivelmente as presuntivas clulas da retina). Durante a gstrula tardia, esse sinal do ectoderma neuralizado (provavelmente a regio presuntiva do olho) induz o presuntivo ectoderma formador do cristalino. Um sinal indutivo adicional pode estar vindo do mesoderma presuntivo ou do endoderma do intestino anterior. (C) Na nurula precoce, os sinais da regio neural anterior causaram o vis de formao do cristalino no ectoderma da cabea. Esse sinal pode ser reforado pela induo do mesoderma lateral anterior. (D) No estgio de nurula tardia, a vescula ptica contata o ectoderma formador do cristalino, sinalizando a determinao final desse tecido em cristalino. (E) No estgio de girino, o presuntivo ectoderma do cristalino diferencia-se em tecido do cristalino. (Segundo Saha et al., 1989; Grainger, 1992.)
Crebro em desenvolvimento (E) Girino jovem (diferenciao do cristalino) Clice ptico Cristalino
COMPETNCIA ECTODRMICA E PROPENSO DO CRISTALINO. Em 1987,
Henry e Grainger demonstraram que a determinao da habilidade de formao do cristalino ocorre muito precocemente no desenvolvimento de Xenopus. Eles transplantaram ectoderma de embries de Xenopus para a regio formadora do cristalino da nurula. Seria esse ectoderma capaz de formar um cristalino quando contatado horas mais tarde pela vescula ptica? Ectoderma de gstrulas muito jovens no foi competente. Porm, quando ectoderma de gstrula tardia foi transplantado para nurulas, mostrou-se capaz de responder vescula ptica com a formao de um cristalino (Tabela 17.2). Tecido algum respondeu dessa maneira. Outras regies ectodrmicas de gstrulas tambm tinham uma habilidade limitada de formar cristalinos, porm, essa era perdida durante o prosseguir do desenvolvimento. Parecia, pois, que o ectoderma formador de cristalino alcanava a competncia muito antes de ser contatado pela vescula ptica. Quando e como era alcanado esse estado formador de cristalino? Experimentos por Nieuwkoop (1952) haviam sugerido que um sinal da placa neural podia viajar atravs do ectoderma. Poderia a placa neural induzir a epiderme presuntiva lateral, a se tornar ectoderma formador de
670
Tabela 17.2
Aumento com a idade da capacidade responsiva do ectoderma prospectivo do cristalino

Operao
Estgio do Doador
Doador
Nurula hospedeira
Nmero examinados
Cristalinos induzidos (%)
Corpo semelhante ao cristalino %
Espessamento ectodrmico (%)
Corpo sem cristalino (%)
Sem resposta (%)
Total positivo
Gstrula intermediria Gstrula tardia Nurula precoce Nurula tardia Fonte: Segundo Henry e Grainger, 1987.
24 21 24 20
0 10 75 95
4 14 8 5
38 42 0 0
8 10 4 0
50 24 13 0
1 (4%) 5 (24%) 20 (83%) 20 (100%)
cristalino? Henry e Grainger (1990) testaram essa hiptese combinando a regio prospectiva anterior da placa neural de embries em gstrula tardia com ectoderma da regio que iria finalmente tornar-se cristalino. Enquanto o ectoderma isolado de uma potencial regio formadora de cristalino no produzia protenas do cristalino quando cultivado sozinho, a mesma regio produzia protenas do cristalino quando cultivada prxima do tecido prospectivo da placa neural anterior. Embora a diferenciao do cristalino era freqentemente rudimentar, ela era muito especfica. As protenas do cristalino no foram produzidas quando o ectoderma da gstrula foi combinado com outros tecidos, incluindo o endoderma do intestino anterior ou o mesoderma cardaco (Figura 17.13A). Esses experimentos mostram que a poro anterior da prospectiva placa neural (a qual contm a futura regio da retina) fornece um sinal que predispe esse tecido a se tornar o cristalino. Porm, todos os tecidos so capazes de responder a um sinal vindo da placa neural anterior? Servetnick e Grainger (1991) mostraram que somente o ectoderma de gstrula intermediria gstrula tardia competente para responder a esses sinais. Eles removeram ectodermas do hemisfrio animal pigmentado de vrios estgios de gstrula e transplantaram-nos para a regio presuntiva do cristalino de embries em estgio de placa neural (Figura 17.13B). O ectoderma de gstrulas precoces mostrou pouca ou nenhuma competncia para formar cristalinos (quando testado por meio da produo de protenas cristalinas), porm, o ectoderma de estgios um pouco mais tardios foi capaz de formar cristalinos. No fim da gastrulao, essa capacidade de responder ao sinal da placa neural tinha se perdido. Essa competncia foi verificada ser inerente ao prprio ectoderma e no ser induzida por outros tecidos circunjacentes. O ectoderma do hemisfrio animal pigmentado de vrios estgios embrionrios podia ser removido, cultivado in vitro por certos perodos, e colocado novamente em embries no estgio de placa neural. Tal ectoderma mostrou o mesmo padro de competncia, apesar de ter permanecido durante parte de seu desenvolvimento em uma placa de Petri. Parece, portanto, que o ectoderma adquire a competncia de responder a sinais indutores da placa neural anterior nos estgios precoces da gstrula intermediria, e que durante a gstrula tardia, a placa neural anterior induz um vis na formao do cristalino nesse tecido. Esse vis pode ser demonstrado transplantando-se o tecido para outras regies da cabea e tornando-o cristalino (enquanto o ectoderma dos estgios anteriores no pode faz-lo).
DETERMINAO E DIFERENCIAO DO CRISTALINO. A determinao do cris-
talino pode ser mostrada isolando-se ectoderma e cultivando-o separado do embrio. No momento do fechamento do tubo neural, o ectoderma das regies laterais do
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(A) FONTE DE ATIVIDADE PRECOCE INDUTIVA DE CRISTALINO Indutor Operao putativo
Figura 17.13
Resposta do cristalino
Endomesoderma lateral
Cultura
Placa neural
Determinao precoce da capacidade formadora do cristalino do ectoderma de Xenopus. (A) A fonte do sinal formador do cristalino foi achada ser a placa neural anterior. O ectoderma presuntivo do cristalino foi cultivado com ou sem endoderma lateral/mesoderma, ou com a placa neural anterior (os dois principais tecidos a ele adjacentes). O ectoderma somente formou protenas do cristalino quando cultivado com a placa neural. (B) O perodo no qual as clulas da placa neural anterior podiam induzir competncia no ectoderma foi determinado transplantando ectoderma presuntivo de gstrulas de doadores de estgio diferente para a regio formadora do cristalino da nurula. Somente o ectoderma de embries em gstrula intermediria foi competente para responder aos sinais. (Segundo Grainger, 1992.)
Cultura (B) DETERMINAO DO PERODO COMPETENTE DO CRISTALINO Estgio Operao Resposta do cristalino
Gstrula precoce
Gstrula intermediria
Gstrula tardia
crebro anterior ir dar origem pequenos cristalinos, mesmo sob essas condies. O clice ptico no contatou ainda esse tecido, mostrando que no crtico para a induo do cristalino em Xenopus. Porm, ele exerce uma funo em capacitar o fentipo completo do cristalino para ser expresso. Os cristalinos que se formam na ausncia da vescula ptica so em geral muito rudimentares. No conhecido se a influncia da vescula ptica diretamente positiva, promovendo a diferenciao do placdio do cristalino para um cristalino totalmente diferenciado, ou se tal influncia se d removendo um inibidor da diferenciao do cristalino. Foi proposto (von Woellwarth, 1961; Henry e Grainger, 1987) que as clulas da crista neural impedem a diferenciao do cristalino e que o contato com a vescula ptica serve como escudo do placdio do cristalino, frente a esses sinais inibidores.
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O fator de transcrio Pax6 participa de vrias maneiras nos processos de determinao e diferenciao do tecido ocular. Mutantes homozigotos Pax6 de humanos, camundongos, ratos e moscas no tm olhos. O ectoderma do embrio de ratos deficientes em Pax6 incapaz de tornar-se cristalino, mesmo quando cultivado com vesculas pticas de embries de tipo selvagem. O ectoderma da cabea no foi determinado por sinais anteriores da placa neural ou do mesoderma (Fujiwara et al., 1994). Pax6 tambm crtico para a expresso das cristalinas cristalino. No somente so vistos stios ligantes de Pax6 nas regies reguladoras de vrios genes do cristalino, mas a expresso especfica do cristalino dessas protenas depende da expresso de Pax6 (Cvekl et al., 1995; Richardson et al., 1995). O cristalino est situado entre as cmaras anterior e vtrea do olho, e acreditase que sua diferenciao (discutida no Captulo 7) seja mediada por fatores de crescimento emanando dessas duas cmaras. A cmara anterior parece concentrar uma protena mitognica (cuja identidade permanece desconhecida) que especfica para causar mitose e inibir a diferenciao no epitlio formador do cristalino. Essa protena tida como proveniente dos capilares sangneos para a cmara anterior. Na cmara vtrea, FGF1 e 2 estimulam o alongamento e a diferenciao das clulas do cristalino e bloqueiam a atividade mitognica do fator de crescimento da cmara anterior (Hyatt e Beebe, 1993; Schulz et al., 1993). O resultado o alongamento daquelas clulas do cristalino na superfcie dorsal do placdio do cristalino, e a continuada proliferao de clulas no lado ventral do placdio do cristalino (Figura 17.14). Formao da Crnea Aps ter invaginado, o placdio do cristalino fica coberto por duas camadas de clulas do ectoderma adjacente. Agora, o cristalino em desenvolvimento pode atuar como um indutor. O ectoderma destinado a se tornar crnea, provavelmente j havia sido determinado durante um estgio anterior do desenvolvimento (Meier, 1977). Agora, a diferenciao da crnea ocorre sob influncia do cristalino. O ectoderma sobrejacente torna-se colunar e se enche de grnulos secretores. Esses grnulos migram para a base das clulas e secretam um estroma primrio contendo cerca de 20 camadas de colgeno dos tipos I e II (veja Figura 17.14). As clulas endoteliais vizinhas migram para essa regio (no estroma primrio) e secretam cido hialurnico para essa matriz. O cido hialurnico faz com que a matriz se expanda e se torne um bom substrato para a migrao de duas ondas de clulas mesenquimatosas derivadas da crista neural. Ao penetrar a matriz, a segunda onda dessas clulas a permanece, secretando colgeno do tipo I e hialuronidase. Essa causa o encolhimento do estroma. Sob a influncia da tiroxina da glndula tireide em desenvolvimento, esse estroma secundrio desidratado, e a matriz rica em colgeno dos tecidos epitelial e mesnquima, transforma-se na crnea transparente (veja Hay, 1980; Bard, 1990). Podemos ver, assim, que simples interaes indutivas so na realidade dramas bem coordenados, nos quais os atores tm que vir ao palco e falar seus trechos no momento e posio corretos. Por adquirir nova informao, elas podem tambm transmitir informaes para outros usarem. Tendo isso em mente, ns podemos agora passar a estudar alguns dos princpios sobre a induo secundria, obtidos de outros rgos em desenvolvimento.
Formao de rgos parenquimatosos

As interaes epitlio-mesnquima so tambm vistas na formao de rgos formadores de dutos, como o rim, fgado, pulmo, glndula mamria e pncreas. Na formao desses rgos, notamos a induo recproca do mesnquima atuando sobre o epitlio e vice-versa.
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Cristalino Borda do clice ptico Vtreo Cmara anterior Epitlio Fatores de crescimento das cmaras anterior e vtrea fazem com que as clulas dorsais se diferenciem e as clulas ventrais se proliferem Mesnquima Cmara vtrea Mesnquima da cabea Clice ptico induz a formao do cristalino
Figura 17.14
Endotlio
Epitlio corneano Mesnquima O cristalino induz o ectoderma sobrejacente em epitlio colunar e secretor
Desenvolvimento corneano e do cristalino. O clice ptico induz a determinao final do cristalino. Protenas mitognicas (setas pretas) na cmara anterior mantm uma linha de clulas em proliferao na superfcie ventral do cristalino, enquanto fatores de crescimento fibroblstico (setas coloridas) estimulam a diferenciao do epitlio dorsal do cristalino. Sob a influncia indutiva do cristalino, o epitlio corneano se diferencia e secreta estroma primrio consistindo em camadas de colgeno; clulas endoteliais ento secretam cido hialurnico para essa regio, permitindo a entrada de clulas mesenquimatosas da crista neural. Em seguida, a hialuronidase (secretada pelo mesnquima ou pelo endotlio) digere o cido hialurnico, levando o estroma primrio a se encolher. (Segundo Hay e Revel, 1969; Hyatt e Beebe, 1993.)
Estroma primrio Mesnquima
Grnulos induzidos secretam estroma primrio contendo colgeno Endotlio Estroma primrio Clulas endoteliais entram e secretam cido hialurnico, levando o estroma a engrossar; clulas mesenquimatosas entram
Cristalino
Mesnquima Epitlio
Cristalino
Estroma secundrio Secrees das clulas mesenquimatosas levam o estroma a encolher; sob Endotlio a influncia de tiroxina o estroma ir finalmente tornar-se crnea
Morfognese do Rim de Mamfero

A PROGRESSO DOS TBULOS RENAIS. Como o olho, o rim mamfero uma
estrutura extraordinariamente intrincada. Sua unidade funcional, o nefro, contm mais de 10.000 clulas de no mnimo 12 tipos diferentes, cada tipo localizado em um espao particular em relao aos outros ao longo do nefro. O desenvolvimento do rim mamfero progride atravs de trs estgios. No incio do desenvolvimento (dia 22 em humanos, dia 8 em camundongos), o duto pronfrico surge no mesoderma intermedirio imediatamente ventral aos somitos anteriores. As clulas desse duto migram caudalmente, e a regio anterior do duto induz o mesnquima adjacente a formar os tbulos pronfricos do rim (Figura 17.15 A). Embora os tbulos pronfricos formam rins funcionais em peixes e em larvas de anfbios, eles so considerados inativos em amniotas mamferos. Em mamferos, os tbulos pronfricos e a poro anterior do duto pronfrico degeneram, mas as pores mais caudais do duto persistem tornando-se o
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(A)
(B)
(C) Tbulos mesonfricos
(D)
Prnefros
Duto nfrico Gnada
Cordo nefrognico Mesonefros
Gnada
Mesonefros Duto nfrico (Wolffiano) Cordo nefrognico Mesnquima metanefrognico Broto uretrico Duto nfrico Mesnquima metanefrognico Ureter
Cloaca
Figura 17.15
Esquema geral do desenvolvimento do rim vertebrado. (A) Os tbulos originais, constituindo o rim pronfrico, so induzidos a partir do mesnquima nefrognico pelo duto pronfrico migrando caudalmente. (B) medida que o prnefro de degenera, formam-se os tbulos mesonfricos. (C) O rim mamfero final, o metanefro, induzido pelo broto uretrico. (D) Seo de um rim de camundongo mostrando a iniciao do rim mesonfrico (abaixo) enquanto o mesonefro ainda est aparente. O tecido do duto est corado com um anticorpo fluorescente para citoqueratina encontrada no duto mesonfrico e seus derivados. ( A-C segundo Saxn, 1987; D cortesia de S. Vainio.)
componente central do sistema excretor atravs de todo seu desenvolvimento (Toivonen, 1945; Saxn, 1987). Esse duto remanescente freqentemente referido como duto nfrico ou Wolffiano. medida que os tbulos pronfricos degeneram, a poro mediana do duto nfrico inicia um novo conjunto de tbulos renais no mesnquima adjacente. Esse conjunto de tbulos constitui o mesonefro, ou rim mesonfrico. No ser humano, comeando ao redor do dia 25, formam-se cerca de 30 tbulos mesonfricos. Porm, medida que mais tbulos so induzidos caudalmente, os tbulos mesonfricos anteriores comeam a regredir (embora em camundongos, os tbulos anteriores permanecem, ao passo que os posteriores regridem; Figura 17.15B). Em fmeas de mamferos essa regresso completa. Porm, como discutiremos no Captulo 20, alguns desses tbulos mesonfricos persistem em machos para se transformar em tubos carreadores de espermatozide (vasos deferentes e dutos deferentes) dos testculos. O rim permanente dos aminotas, o metanefro, gerado por alguns dos mesmos componentes dos tipos anteriores transitrios do rim, e acredita-se ser originado atravs de uma complexa interao entre componentes mesenquimatosos e epiteliais do mesoderma intermedirio. Nos dois primeiros passos, o mesnquima metanefrognico se forma em regies localizadas posteriormente do mesoderma intermedirio, e induz a formao de um ramo de cada um dos dutos nfricos pareados. Esses tubos epiteliais so chamados de brotos uretricos. Esses brotos finalmente se separam do duto nfrico para tornarem-se os ureteres que levam a urina para a bexiga. Quando os brotos uretricos emergem do duto nfrico, entram no mesnquima metanefrognico. No terceiro e quarto passos, os brotos uretricos induzem esse tecido mesenquimatoso a se condensar ao redor dos brotos e se diferenciar nos nefros do rim dos mamferos. O quinto passo da iniciao renal ocorre quando esse tecido formador do nefro induz a ramificao adicional do broto uretrico (Figura 15C,D).
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Dutos coletores Mesnquima Metanefrognico
Ureter Broto uretrico
Ureter
Tbulos Renais Tbulo distal Mesnquima Tbulo Proximal
Broto Uretrico
Corpo com forma de S
Cpsula de Bowman do glomrulo
Clulas endoteliais
Figura 17.16
INDUO RECPROCA DURANTE O DESENVOLVIMENTO RENAL. Esses dois
tecidos mesodrmicos, o broto uretrico e o mesnquima metanefrognico interagem e induzem um ao outro reciprocamente (Figura 17.16). O mesnquima metanefrognico leva o broto uretrico a se alongar e se ramificar. Na ponta dessas ramificaes, o broto uretrico induz as clulas mesenquimatosas frouxas a formarem um agregado epitelial. Cada agregado de cerca de 20 clulas prolifera-se e se diferencia na intrincada estrutura do nefro renal. Primeiro, cada ndulo se alonga tomando a forma de uma vrgula, formando em seguida o caracterstico tubo em forma de S. Logo em seguida formao do tubo em forma de S, as clulas desse epitlio comeam a se diferenciar em tipos regionais de clulas especficas, como as clulas da cpsula, os podcitos e as clulas dos tubos renais distal e proximal. Nesse perodo, desenvolve-se uma conexo entre o broto uretrico e o tubo recm-formado que permite a passagem de material de um para o outro. Os tubos recm-formados derivados do mesnquima formam os nefros secretores do rim funcional, e o broto uretrico ramificado d origem aos dutos coletores renais e ao ureter, que drena a urina do rim. Clifford Grobstein (1955, 1956) documentou essa induo recproca, in vitro. Ele separou o broto uretrico do mesnquima e cultivou-os individualmente ou em conjunto. Na ausncia do mesnquima, os brotos uretricos no se ramificam. Na ausncia do broto uretrico, o mesnquima logo morre. Quando eles so colocados juntos, porm, o broto uretrico cresce e se ramifica, e tbulos se formam atravs do mesnquima (Figura 17.17). Embora certos outros tecidos (em especial o tubo neural) permitam ao mesnquima metanefrognico formar tbulos renais, o broto uretrico somente se ramifica sob instrues do mesnquima metanefrognico. Mesnquimas que induzem ramificao em outros epitlios (tais como a glndula salivar) no induziro a ramificao do broto uretrico (Bishop-Calame, 1996).
Induo recproca no desenvolvimento do rim dos mamferos. medida que o broto uretrico penetra no mesnquima metanefrognico, esse o induz a se ramificar. Nas extremidades dos ramos, o epitlio induz o mesnquima a se agregar e cavitar para formar os tbulos renais. A formao de nefro a partir das clulas mesenquimatosas mostrada na insero. Aps se agregar nos ramos, as clulas mesenquimatosas formam um ndulo epitelial que se estende em um tubo em forma de S, e se funde com o epitlio do broto uretrico. (Insero segundo Romanoff, 1960.)
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Tbulos renais
Dutos coletores
(A)
(B)
Figura 17.17
Induo de rim estudada in vitro. (A) Um rudimento metanfrico do camundongo de 11 dias inclui tanto o broto uretrico como o mesnquima metanefrognico. (B) Aps o primeiro dia em cultura, podem ser vistos tbulos nas extremidades dos ureteres em ramificao. (C) Os dutos coletores ramificados formados pelo broto uretrico e os tbulos renais formados pelas condensaes mesenquimatosas nas extremidades desses brotos podem ser claramente vistos aps 8 dias de cultura. (A e B de Saxn e Sariola, 1987; C de Grobstein, 1955; todas fotografias cortesia dos autores.)
(C)
Os primeiros nefros metanfricos so, ento, imediatamente ligados aos dutos coletores. medida que o ureter continua a crescer, esses nefros so levados em direo externa para o mesnquima metanefrognico (Figura 17.18A). Os terminais dos brotos uretricos, porm, conservam sua capacidade de induzir a formao dos tbulos nesse mesnquima, e o resultado a formao de arcadas tubulares (Figura 17.18B). medida que o ramo uretrico migra atravs do mesnquima, so formados novos nefros que se renem no mesmo duto coletor (Figura 18.18C; Osathanondh e Potter, 1963). Os Mecanismos da Organognese Renal Parece haver ao menos seis conjuntos de sinais operando na induo recproca do metanefro.
SINAL 1: FORMAO DO MESNQUIMA METANEFROGNICO. Uma coisa
afirmar que o broto uretrico induz o mesnquima metanefrognico a se tornar o epitlio dos nefros. Outra compreender como esse processo ocorre. Tal como o desenvolvimento do cristalino pela vescula ptica, considera-se que a induo do mesnquima metanefrognico pelo broto uretrico seja apenas a ltima etapa que engatilha uma cascata de eventos no mesnquima competente. Somente o mesnquima metanefrognico tem a capacidade de responder ao broto uretrico para formar tbulos renais; se induzido por outros tecidos (tais como a glndula salivar ou o tubo neural embrionrios), o mesnquima metanefrognico ir responder formando tbulos renais e nenhuma outra estrutura (Saxn, 1970; Sariola et al., 1982). Assim, o mesnquima metanefrognico no pode tornar-se qualquer outro tecido que seno os tbulos renais. A competncia para responder a indutores do broto uretrico considerada ser regulada por WT1, um fator de transcrio encontrado no mesnquima metanefrognico; e se esse mesnquima no tiver esse fator, as clulas no-induzidas morrem (Kriedberg et al., 1993). A hibridizao in situ mostra que Wt1 normalmente primeiro expressa no mesoderma intermedirio antes da formao do rim, sendo depois expressa no rim em desenvolvimento, gnadas e mesotlio (Pritchard-Jones et al., 1990; van Heyningen et al., 1990; Armstrong et al., 1992). Embora esse mesnquima parea ser homogneo, o mesnquima metanefrognico, pode conter tanto tecido derivado do
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Broto uretrico
(A) Mesnquima condensando
Glomrulo
(B)
Ureter (C)
mesoderma como algumas clulas originrias da crista neural (Le Douarin e Tiellet, 1974; Sariola, 1989; Sainio et al., 1994).
SINAL 2: FORMAO DO BROTO URETRICO. O segundo sinal no desenvol-
vimento do rim um conjunto de molculas difusivas que causa o crescimento de dois brotos uretricos dos dutos nfricos. Pesquisas recentes mostraram que o fator neurotrfico derivado da glia (GDNF), um componente crtico desse sinal. O GDNF sintetizado no mesnquima metanefrognico, e camundongos cujos genes gdnf foram eliminados morrem logo aps o nascimento em conseqncia da falta de rins (Moore et al., 1996; Pichel et al., 1996; Snchez et al., 1996). O receptor GDNF (a protena c-Ret) sintetizado nos dutos Wolffianos e posteriormente se concentra nos brotos uretricos em crescimento (Figura 17.19: Schuchardt et al., 1996; Trupp et al., 1996). Camundongos carentes de GDNF tambm morrem em conseqncia de agnese renal. Outra protena sintetizada pelo mesnquima metanefrognico o fator de crescimento heptico (HGF; fator de espalhamento); o receptor de HGF produzido pelos brotos uretricos. Anticorpos contra HGF bloqueiam o crescimento expansivo dos brotos uretricos em rudimentos renais em cultura (Santos et al., 1994; Woolf et al., 1995). A sntese de GDNF e HGF pelo mesnquima considerada ser regulada pelo gene WT1. Em outra mutao murina, o mutante Danforth short-tail, o broto uretrico iniciado mas no penetra no mesnquima metanefrognico (Gluecksohn-Schoenheimer, 1943). Aqui, tambm, o rim no se forma. A falta de crescimento dos brotos uretricos tem sido correlacionada com a ausncia da expresso Wnt11 nas extremidade do broto uretrico. A expresso de Wnt11 mantida por proteoglicanos produzidos pelo mesnquima. Parece que uma vez que o broto entra na regio mesenquimatosa, os proteoglicanos mesenquimatosos estimulam seu contnuo crescimento mantendo a expresso e secreo de Wnt11 (Davies et al., 1995; Kispert et al., 1996).
SINAL 3: PREVENO DA APOPTOSE MESNQUIMA. O terceiro sinal envia-
Figura 17.18
Representao esquemtica do desenvolvimento do nefro humano. (A) Formao de nefros precoces diretamente ligados ao epitlio do broto uretrico. (B) Formao de arcadas de nefros nas quais vrios nefros so ligados ao mesmo duto coletor. (C) O arranjo geral dos nefros humanos no nascimento. Os nefros mais profundos constituem uma arcada, enquanto os nefros mais prximos da superfcie esto diretamente conectados aos dutos coletores do ureter. (Segundo Osathanondh e Potter, 1963.)
do do broto uretrico ao mesnquima, e altera o destino das clulas mesenquimatosas. Se deixadas no induzidas pelo broto uretrico, as clulas mesenquimatosas sofrem apoptose (Koseki et al., 1992). Porm, se induzidas pelo broto uretrico, as clulas
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Duto Wolffiano
Duto Wolffiano
Broto uretrico Duto Wolffiano (A) Receptor Ret Mesnquima metanefrognico (B) Broto uretrico
(C)
Duto Wolffiano Receptor Ret Broto uretrico
(D)
Figura 17.19
O crescimento do broto uretrico depende de GDNF (fator neurotrfico derivado da glia) e seu receptor. (A) O broto uretrico do rim de um embrio murino do tipo selvagem de 11,5 dias cultivado durante 72 horas tem padro de ramificao caracterstico. (B) Em camundongos embrionrios heterozigotos para os genes codificando GNDF, o tamanho do broto uretrico e o nmero e comprimento de seus ramos est reduzido. (C) Em camundongos sem ambas cpias dos genes gdnf, o broto uretrico no se forma a partir do duto Wolffiano. (D) Os receptores para GDNF esto concentrados na poro posterior do duto Wolffiano. O GDNF secretado pelo mesnquima metanefrognico estimula o crescimento do broto uretrico desse duto. Em estgios posteriores, o receptor de GDNF somente encontrado nas extremidades dos brotos uretricos. Barras de escala iguais a 100m. (A-C de Pichel et al., 1996; fotografias cortesia de J. G. Pichel e H. Sariola; D segundo Schuchardt et al., 1995.)
mesenquimatosas so salvas do precipcio da morte e so convertidas em clulas germinativas em proliferao (Bard e Ross, 1991; Bard et al., 1996). Os fatores secretados do broto uretrico incluem o fator 2 de crescimento fibroblstico (FGF2) e a protena morfogentica 7 do osso (BMP7). O FGF2 tem trs modos de ao, inibindo a apoptose, promovendo a condensao de clulas mesenquimatosas e mantendo a sntese de WT1 (Perantoni et al., 1995). O BMP7 tem efeitos semelhantes, e na ausncia de BMP7, o mesnquima do rim sofre apoptose (Figura 17.20;
Rim
Glndula Supra-renal Rim
Figura 17.20
Malformao renal em um embrio de camundongo deficiente em BMP7. No dia embrionrio 19, os rins mutantes so significativamente menores que aqueles dos embries tipo selvagem. (de Dudley et al., 1995; fotografia cortesia de E. J. Robinson.)
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Figura 17.21
O proteoglicano syndecan da matriz extracelular no sintetizado ou secretado por clulas do mesnquima at aps a induo. Essa molcula provavelmente est envolvida na estruturao do novo epitlio tubular, e distingue as clulas do tbulo, do mesnquima remanescente. (A) Colorao imunolgica de syndecan mostra sua presena nas clulas mesenquimatosas recm-induzidas (T) que esto se tornando epiteliais. Alguma colorao (U) tambm vista no epitlio do broto epitelial. (B) Colorao intensa de syndecan vista na regio tubular em desenvolvimento que ir se tornar o glomrulo renal (G). (de Vainio et al., 1989, cortesia de L. Saxn.)
(A) (B)
Dudley et al., 1995; Luo et al., 1995). As clulas mesenquimatoses induzidas tambm sintetizam receptores para o fator de crescimento epidrmico e o fator de crescimento neural, e podem responder essas protenas com a proliferao.
SINAL 4: CONVERSO DE CLULAS MESENQUIMATOSAS EM EPITLIO. O broto uretrico causa mudanas dramticas na matriz extracelular das clulas do mesnquima metanefrognico. O mesnquima no-induzido secreta uma matriz extracelular consistindo predominantemente de fibronectina e colgenos dos tipos I e II. Aps a induo, essas protenas desaparecem e so substitudas por uma lmina epitelial basal feita de laminina e colgeno do tipo IV. As alteraes na matriz extracelular parecem ser crticas para formao dos tbulos, pois o mesnquima induzido secreta um receptor para laminina que permite sua participao na formao epitelial (Ekblom et al., 1994). O citoesqueleto tambm muda de uma caracterstica de clulas mesenquimatosas para um tpico de epitlio (Ekblom et al., 1983, Lehtonen et al., 1985). Dessa maneira, as clulas mesenquimatosas frouxas so ligadas umas s outras como um epitlio polarizado sobre uma lmina basal. Antes dessas mudanas o mesnquima metanefrognico rcem-induzido sintetiza duas protenas adesivas, E-caderina e Syndecan. A Syndecan um proteoglicano primeiro notado ao redor das clulas mesenquimatosas envolvendo o broto uretrico quando entra na regio do mesnquima. Quando o broto inicia sua primeira ramificao, toda a regio mesnquima ao redor do ramos se cora positivamente para Syndecan (Figura 17.21). O mRNA de Syndecan est presente no mesnquima renal no-induzido, mas no traduzido em protena a no ser que o mesnquima seja induzido (Figura 17.22; Vainio et al., 1989a, 1992). No s pode Syndecan regular a condensao do mesnquima em um epitlio, como pode tambm promover a proliferao dessas clulas. Por marcao de clulas em proliferao com bromodeoxiuridina (que incorporada em DNA somente em clulas em diviso) e marcando as clulas expressando Syndecan com anticorpos fluorescentes essa protena, Vainio e colegas (1992) demonstraram uma estreita correlao entre as clulas em diviso e aquelas expressando Syndecan. Alm disso, o fator de transcrio Pax2 sintetizado no mesnquima induzido.* Quando o RNA antisenso ao Pax2 previne a traduo do mRNA de Pax2 que transcrito em resposta induo, as clulas do mesnquima de rudimentos de rim em cultura, deixam de se condensar (Rothenpieler e Dressler, 1993). [prox3.html]
* Pax2 tem vrios papis durante o desenvolvimento renal. Sua funo mais crtica ocorre at mesmo antes da converso do mesnquima, pois parece que o Pax2 pode ser importante na especificao do mesoderma intermedirio. Em mutantes de Pax2 de camundongo no se forma o sistema urogenital (Torres et al., 1995).
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Figura 17.22
Syndecan isolado (contagem/min)
Expresso de syndecan em mesnquimas renais induzidos e no-induzidos. (A) Hibridizao in situ localizando mRNA de syndecan nos agregados mesenquimatosas de um rim embrionrio de camundongo de 15 dias. A visualizao da auto-radiografia feita por iluminao de campo escuro. (B) Mesnquima renal isolado (M) induzido por medula espinhal (SPC) mostra expresso intensa de syndecan aps colorao com anticorpos ao syndecan, fluorescentes. O mesnquima no-induzido no o faz. (C) A quantidade de syndecan (marcado com enxofre radioativo) isolada de um mesnquima induzido de rim dez vezes maior que aquela isolada de um quantidade semelhante de mesnquima no-induzido. (Segundo Vainio et al., 1992, cortesia de S. Vainio.)
(A)
Induzido
No-induzido (B) (C)
Uma vez induzido e aps ter comeado a se condensar, o mesnquima comea a secretar Wnt4, que atua de uma maneira autcrina para completar a transio de massa do mesenquimatosas para o epitlio (Stark et al., 1994). A expresso de Wnt4 detectada nas clulas mesenquimais em condensao e nos agregados em forma de vrgula. No agregado em forma de S, ele encontrado na regio na qual as clulas rcemepitelizadas se fundem com as pontas do broto uretrico. Em camundongos sem os genes Wnt4, o mesnquima permanece indiferenciado morfologicamente, no se formando agregados pr-tubulares.
SINAL 5: CONVERSO DAS CLULAS AGREGADAS EM UM NEFRO. No
quinto estgio da formao do rim, o epitlio condensado especificado em diferentes tipos celulares do nefro; e os genes responsveis pela especificao celular esto ativados. Nos ltimos anos foram encontrados trs genes cujos produtos podem ser importantes para essa especificao. O primeiro o gene para protena gap da juno, Conexina 43. Essa protena vista no mesnquima condensado e conecta as clulas do corpo em forma de S (Sainio et al., 1992). O segundo gene o Pax2, que est ativo no mesnquima condensado e desligado quando as clulas se diferenciam. Se ele permanecer ativo, os podcitos, os glomrulos e as clulas tubulares proximais se formam de maneira anormal (Dressler et al., 1993). O terceiro gene codifica o receptor de baixa afinidade do fator de crescimento nervoso, NGFR. Esse fator est ausente no mesnquima no condensado, mas se apresenta em abundncia nas clulas condensadas que
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posteriormente formam os nefros. Quando oligonucletidos antisenso para o NGFR foram adicionados a rudimentos renais em cultura, as clulas condensadas deixaram de formar tbulos renais (Figura 17.23; Sariola et al., 1991). O sinal que converte agregados em nefros no conhecido.
SINAL 6: O CRESCIMENTO CONTNUO DO BROTO URETRICO E A DIFERENCIAO DO NEFRO. Aps as interaes iniciais terem criado os primeiros agrega-
dos, as clulas do mesnquima metanefrognico perto da margem renal comeam a proliferar para formar clulas germinativas. Essas clulas podem interagir com os ramos do broto uretrico para formar novos nefros, ou podem produzir clulas do estroma. Essas clulas migram para a parte central do rim e produzem fatores (ainda desconhecidos) que (1) permitem o crescimento contnuo do broto uretrico e (2) estimulam a diferenciao do nefro em tbulos renais convolutos, ala de Henle, glomrulos e aparelho justaglomerular. O fator de transcrio BF2 sintetizado nessas clulas estromticas, e quando eliminado de embries de camundongo, o rim resultante no tem a rvore uretrica ramificada (ramifica somente trs ou quatro vezes em lugar de sete ou oito, resultando em uma reduo de 8 a 16 vezes no nmero de ramos), e os agregados no se diferenciam em nefros (Hatini et al., 1996). Assim, parece que os fatores necessrios para essas duas funes so sintetizados pelas clulas do estroma e regulados pelo fator de transcrio BF2. Existe tambm evidncia que interaes recprocas entre o broto uretrico e o mesnquima metanefrognico podem ser crticas para a manuteno dessas clulas estromticas. A combinao de FGF2 e um meio condicionado de linhagens celulares do broto uretrico do rato capaz de induzir a completa diferenciao de nefros no mesnquima metanefrognico isolado. O FGF2 necessrio para induzir a agregao de clulas mesenquimatosas, porm as substncias secretadas para o meio de cultura pelas clulas do broto uretrico so capazes de transformar esses agregados em nefros (Karavonova et al., 1996). provvel que os fatores do broto uretrico (que permanecem no identificados) estimulam as clulas estromticas a produzirem seus fatores (que tambm permanecem no identificados), de modo que o agregado possa se diferenciar em nefro e assim as ramificaes podem continuar a crescer. A identificao desses fatores tornou-se um dos novos focos de importncia para a biologia do desenvolvimento (Bard, 1996).
(A)
(B)
(C)
Figura 17.23
Papel do receptor NGF de baixa afinidade na morfognese do rim. (A) Hibridizao in situ mostra a localizao de mRNA de NGFR nos mesnquimas condensados de um rim embrionrio de rato de 18 dias. (B) Maior aumento do padro de ramificao do broto uretrico (corado com anticorpos para uma citoqueratina epitelial especfica) em rim de 13 dias cultivado durante 5 dias, in vitro. (C) Broto uretrico de um rim igual aquele em (B) mas cultivado em presena de oligonucletidos antisenso ao mRNA de NGFR . (de Sariola et al., 1991, cortesia de H. Sariola.)
682
&
Especulaes
Diferenciao Coordenada e Morfognese no Dente
URANTE A MORFOGNESE de qualquer rgo ocorrem numerosos dilogos entre os tecido em interao. Nas interaes epitlio-mesnquima, o mesnquima influencia o epitlio; o tecido epitelial, uma vez modificado pelo mesquima, pode secretar fatores que alteram o mesnquima. Tais interaes continuam at que seja formado um rgo com clulas mesenquimatosas especficas do orgo e epitlio especfico. A identificao das substncias envolvidas nessas conversas inter-tissulares est sendo estudada em diversos laboratrios. Algumas das interaes mais investigadas so aquelas que formam os dentes dos mamferos. Aqui, o epitlio da mandbula se diferencia em ameloblastos, enquanto as clulas mesenquimatosas derivadas da crista neural se tornam os odontoblastos secretores da dentina. Em primeiro lugar, o epitlio faz com que o mesnquima se agregue em locais especficos. Nesse momento, o epitlio possui o potencial de gerar estruturas dentais a partir de vrios tipos de clulas mesenquimatosas (Mina e Kollar, 1987; Lumsden, 1988). Porm, esse potencial de formao do dente logo transferido para o mesnquima que se agrega abaixo dele. Essas clulas mesenquimatosas formam a papila dental e so agora capazes de induzir a morfognese dental em outros epitlios (Kollar e Baird, 1970). Nesse estgio, o epitlio maxilar perdeu sua capacidade de instruir a formao do dente em outros mesnquimas. Assim, o potencial odontognico passou do epitlio para o mesnquima. Na membrana basal que separa o epitlio do mesnquima, o epitlio induz o mesnquima a se transformar em odontoblastos, enquanto o mesnquima induz o epitlio a se transfornar em clulas ameloblsticas (Figura 17.24; Thesleff et al., 1989). Esse deslocamento do potencial odontognico coincide com o deslocamento da sntese da protena morfogentica 4 do osso (BMP4). Durante as fases mais precoces do desenvolvimento do dente, a BMP4 sintetizada no epitlio; e induz a diferenciao do mesnquima e estimula-o a expressar trs
fatores de transcrio, incluindo protenas contendo os homeodomnios Msx1 e Msx2. A induo da diferenciao do mesnquima pode ser mimetizada colocando-se BMP4 em partculas de agarose e aplicando-as massa mesenquimatosa (Vainio et al., 1993). Assim, a BMP4 parece ser um sinal morfognico crtico do epitlio para o mesnquima. Um evento crtico na anlise do desenvolvimento dental foi a descoberta que o centro de sinalizao para o desenvolvimento dental um obscuro grupo de clulas epiteliais referidas como o n do esmalte (Jernvall et al., 1994). Esse grupo de clulas, primeiro visto no comeo do estgio de hemisfrio pigmentado, aparece como uma populao de clulas em no diviso, no centro das cspides em crescimento (veja Figura 17.3). Alm disso, a hibridizao in situ mostrou que esse n de esmalte a fonte da secreo de Sonic hedgehog, FGF4, BMP7, BMP4 e de BMP2 (Koyoma et al., 1996; Vaahtokari et al., 1996a). Sendo uma populao que no se divide, secretando fatores de crescimento capazes de serem recebidos tanto pelo epitlio como pelo mesnquima, o n de esmalte considerado dirigir a morfognese das cspides do dente e ser crtico no direcionamento das mudanas evolutivas na estrutura dentria nos mamferos (Jernvall, 1995). Um resumo de pesquisas recentes correlacionando induo e diferenciao do mesnquima mostrado na Figura 17.24. Como se pode ver, o mesnquima em um estgio diferente daquele em outros. As clulas mesenquimatosas so primeiro induzidas (pela expresso epitelial de BMP4, BMP2, BMP7 e provavelmente FGF8) a expressar um conjunto de fatores de transcrio que incluem Msx1 e Lef1. Se os genes para cada uma dessas protenas so eliminados, o camundongo em desenvolvimento no tem dentes. No ser humano, numa condio causada por uma mutao de MSX1, os pacientes tm falhas dentrias (Satokata e Maas, 1994; Kratochwil et al., 1996; Vastardis et al., 1996). medida que as clulas mesenquimatosas condensam-se, elas so induzi-
das a sintetizar a protena de membrana syndecan e a protena da matriz extracelular tenascina. Essas protenas (que podem se ligar uma outra) aparecem na ocasio em que o epitlio induz a agregao do mesnquima; Thesleff e colegas (1990) propuseram que essas duas molculas podem interagir para efetivar essa condensao. Como no rim, a expresso de syndecan tambm se correlaciona com a proliferao das clulas mesenquimatosas agregadas, sugerindo que ela est regulando a diviso celular assim como a agregao (Vainio et al., 1991). Depois de se agregarem, as clulas mesenquimatosas comeam a secretar FGF3, BMP3, BMP4, HGH e activina (Wilkinson et al., 1989, Thesleff e Sahlberg, 1996). Esses sinais, presumivelmente, induzem a formao do n de esmalte no epitlio. O n em seguida secreta seu potente coquetel de fatores de crescimento e diferenciao, os quais promovem o crescimento e a diferenciao tanto do mesoderma como do epitlio. As clulas mesenquimatosas comeam a se diferenciarem em odontoblastos, e a tenascina induzida para ser expressa em nveis muito mais elevados e nos mesmos locais que a fosfatase alcalina. Essas protenas foram associadas com a diferenciao do osso e da cartilagem, e podem promover a mineralizao da matriz extracelular (Mackie et al., 1987). Por ltimo, medida que emerge o fentipo do odontoblasto, so secretados osteonectina e colgeno de tipo I como componentes da matriz extracelular. O n de esmalte desaparece por apoptose (Vaahtokari et al., 1996b). Por esse processo em etapas, as clulas da crista neural craniana da mandbula podem ser transformadas em odontoblastos secretores de dentina. Essas interaes ocorrem durante perodos especficos do desenvolvimento e so correlacionadas com a maturao do epitlio. Em condies normais, dois fenmenos independentes morfognese e diferenciao celular - so coordenados na formao dos rgos.
683
Ectomesnquima
Condensao
Papila dental
Formao da cspide
Odontoblastos
Epitlio
Mesnquima
Nvel de diferenciao
N de esmalte
Pr-odontoblastos Osteonectina Colgeno tipo I
FGF3 BMP4, 3 activina- A do mesnquima ao epitlio BMP2, 4 FGF8 do epitlio ao mesnquima
BMP2, 4, 7 Sonic hedgehog FGF4 do n de esmalte BMP4 do mesnquima
Fosfatase alcalina, Tenascina receptor EGF metaloprotenas
Syndecan, tenascina TGF- no mesnquima msx1, 2
Iniciao
Agregao Idade desenvolvimental
Morfognese
Diferenciao terminal
Figura 17.24
Diferenciao coordenada e morfognese no dente do mamfero. medida que progride o desenvolvimento, o mesnquima da mandbula derivado da crista neural sofre diferenciao gradual interagindo com o epitlio mandibular (Segundo Thesleff et al., 1990; Thesleff e Sahlberg, 1996.)
Mecanismos de ramificao na formao de rgos parenquimatosos

A gerao dos padres de ramificao epitelial especfica do rgo permanece uma rea largamente inexplorada. Estudos anteriores (para revises, veja Bard, 1990; Mizuno e Yasugi, 1990) revelaram trs padres principais pelos quais o mesnquima regula a especificidade da ramificao. No rim, somente um tipo de mesnquima pode causar ramificao (Saxn, 1987). Nas glndulas salivares e mamrias, o mesnquima especifica o padro de ramificao, mas a diferenciao do epitlio determinada de modo autnomo pelo epitlio (Lawson, 1974; Sakakura et al., 1976). Nos tubos epiteliais que formam os tratos contendo diferentes regies em ramificao (tais como os tratos respiratrio, digestivo e reprodutivo), os mesnquimas regionais especificam tanto o padro de ramificao como os tipos de protena em cada regio (Wessells, 1979; Cunha et al., 1976a,b; Hilfer et al., 1985; Haffen et al., 1987). Por exemplo, na regio do tubo endodrmico que ir se tornar o fgado, o mRNA para a albumina (uma protena especfica do fgado) sintetizado na regio heptica do epitlio, mesmo antes das clulas se agregarem para formar o rudimento do fgado. Tudo que necessrio para a sntese do mRNA da albumina que o epitlio esteja em estreito contato com as clulas mesenquimatosas dessa rea. Tanto no fgado como no pncreas, essas interaes precoces com o mesnquima especfico da regio produzem um baixo nvel de expresso gnica especfica na regio do tubo endodrmico em proliferao (Rutter et al., 1964; Cascio e Zaret, 1991). Esse padro inicial ser amplificado quando os rgos formarem suas estruturas morfolgicas.
684
A Matriz Extracelular como um Elemento Crtico na Ramificao Os mecanismos para essa ramificao podem ter tanto os componentes gerais como os especficos (Grobstein, 1967), e podem depender da interao entre as foras que esto promovendo o crescimento celular e as foras que esto promovendo a coeso intercelular. Os componente gerais so considerados envolver a degradao seletiva da membrana epitelial basal nos locais da ramificao (Bernfield et al., 1984; Mizuno e Yasugi, 1990). Conforme visto no rim e em muitos outros rgos, o mesnquima pode interagir com um tubo epitelial levando-o a se ramificar. Isso ocorre quando os crescimentos epiteliais so divididos por fendas, apresentando lbulos de cada lado da fenda. Esses lbulos crescem criando ramos. A ramificao dos brotos epiteliais depende da presena do mesnquima. Em alguns casos, tal como na interao do epitlio respiratrio com mesnquimas diferentes, a interao instrutiva. Na maioria dos casos, porm, a interao meramente permissiva. Os brotos so preparados para ramificar e formar cinos, mas necessitam do apoio do mesnquima. hoje admitido que o mesnquima promova a formao de fendas e ramificaes cindindo o lbulo e digerindo seletivamente parte da lmina basal do tecido epitelial. O controle da formao de fendas parece ser, em parte, uma funo das molculas de colgeno. Fibras de colgeno III so produzidas por clulas mesenquimatosas, mas se acumulam somente dentro das fendas lobulares (Figura 17.25; Grobstein e Cohen, 1965; Nakanishi et al., 1988a). Alm disso, a extenso da ramificao pode ser regulada artificialmente pela preservao ou remoo das molculas de colgeno (Nakanishi et al., 1986a). A Figura 17.26 mostra a ramificao de um rudimento de 12 dias de uma glndula submandibular sob condies que impedem a degradao das fibras de colgeno (um inibidor de colagenase foi adicionado ao meio). Sem o colgeno, no se vem fendas, mas quando a colagenase endgena incapaz de remover o colgeno em excesso, aparecem fendas extranumerrias.
Clulas mesenquimatosas
Clula epitelial
Colgeno na fenda entre clulas epiteliais
Figura 17.25
Micrografia eletrnica de varredura da acumulao de fibras de colgeno dentro da fenda precoce da glndula salivar de um embrio de camundongo de 12 dias. (de Nakanishi et al., 1986b, cortesia de Y. Nakanishi.)
685
1 hr
18 hr
25 hr
Figura 17.26
(A)
Controle
Controle da formao da fenda epitelial pelo colgeno do mesnquima. Rudimentos da glndula salivar de um rato de 12 dias foram cultivados e observados em 1, 18 e 25 horas. (Linha A) Desenvolvimento normal, mostrando trs principais lbulos. (Linha B) Crescimento do lbulo mas sem ramificao quando a colagenase exgena (5g/ml) foi adicionada ao meio. (Linha C) Ramos supranumerrios quando o inibidor de colagenase (5g/ml) foi adicionado ao meio para suprimir a atividade da colagenase endgena. (Segundo Nakanishi et al., 1986a; cortesia de Y. Nakanishi.)
(B)
Adio de colagenase
(C)
Adio de inibidor de colagenase
O mecanismo pelo qual o colgeno inicia essa ramificao permanece inexplicado. Nakanishi e colaboradores (1986b) propuseram que as clulas mesenquimatosas alinham as fibras de colgeno por trao para formar cristas que cortam o epitlio lobular formando fendas. Essas fendas ficam mais claramente definidas medida que mais clulas mesenquimatosas migratrias deformam o lbulo por tracionamento (Nakanishi et al., 1987). As fibras de colgeno podem tambm ser responsveis pelo desenvolvimento da fenda em ramos distintos. Bernfield e Banerjee (1982) propuseram que o colgeno pode proteger a lmina basal das clulas epiteliais contra a hialuronidase secretada pelas clulas mesenquimatosas. Eles mostraram que essas clulas realmente digerem o glicosaminoglicano (GAG) do lbulo (Banerjee e Bernfield, 1979) e que os GAGs nas pontas so mais susceptveis que aqueles nas fendas. Quando GAGs de heparan sulfato so removidos de rudimentos de glndula salivar em cultura, a ramificao cessa (Nakanishi et al., 1993). A degradao da lmina basal permitiria a expanso do ramo pelo aumento das mitoses estimuladas nessa rea. Nesse modelo, mostrado na Figura 17.27, o mesnquima promove o crescimento epitelial, degrada o GAG, e deposita fibras de colgeno na fenda. O epitlio sintetiza materiais da lmina basal e estimula a sntese de colgeno do mesnquima. Isso resulta na degradao diferencial da lmina basal nas extremidades dos lobos, permitindo assim s clulas em diviso do lobo formarem ramos. Aqui, a interao de clulas mesenquimatosas com a matriz extracelular do epitlio ir determinar o padro de ramificao do rgo.
686
(A)
Fenda estreita
(B)
Hialuronidase Colgeno
Degradao da matriz extracelular causada por hialuronidase
Fibras de colgeno Mais mitose
GAG Clulas mesenquimais
Clulas epiteliais
Clulas mesenquimais
Clulas epiteliais
Colgeno
Figura 17.27
Um modelo para a formao e ramificao em um rudimento de glndula salivar de camundongo. (A) Um sulco produzido no lbulo pela contrao de um feixe de fibras de colgeno (mostrado aqui como uma estrutura torcida, como corda) pela trao das clulas mesenquimatosas. Como mostrado na Figura 17.25, as fibras se estendem entre dois grupos de clulas mesenquimatosas. (B) Alongamento dos dois lbulos separados em ramos pode ocorrer, j que as GAGs nas extremidades dos lbulos so mais sensveis hialuronidase, pois eles no tm a proteo das fibras de colgeno. O talo do lbulo estvel, enquanto o aumento da diviso nas extremidades (estimulado pelo mesnquima) empurra o lbulo para a frente. (A de Nakanishi et al., 1986b; B segundo Wessells, 1977.)
O colgeno tambm importante para a estabilizao das ramificaes formadas. Quando se adiciona colagenase a rudimentos de glndula salivar aps a ramificao, o colgeno removido e os ramos coalescem em um globo (Grobstein e Cohen, 1965; Wessels e Cohen, 1968). Fatores Parcrinos Efetuando Padres de Ramificao Ainda no temos certeza sobre as identidades das molculas secretadas pelo mesnquima que so responsveis pela induo desses padres de ramificao epitelial. Evidncia recente implicou vrios fatores parcrinos nesses eventos. O primeiro candidato o fator 1 de crescimento transformado (TGF1). Essa molcula abundante em rgos embrionrios. Quando o TGF1 exgeno adicionado a culturas de glndulas mamrias, ou de glndulas salivares embrionrias, pulmo, ou rudimentos de rim, o fator previne o epitlio de se ramificar (Figura 17.28; Silberstein et al., 1990; Hardman et al., 1994; Serra et al., 1994; Ritvos et al., 1995). O TGF1 sabido promover a sntese de protenas da matriz extracelular e de inibir as metaloproteinases que podem digerir essas matrizes (Penttinen et al., 1988; Nakamura et al., 1990). possvel que esse fator tenha um papel na estabilizao dos ramos aps seus surgimentos. Uma segunda molcula que pode ter importncia na ramificao epitelial a activina. A activina conhecida por sua importncia na especificao do eixo esquerdo/direito em pintos, e foi detectada em glndulas salivares, pncreas e rins de embries de camundongos. Quando a activina adicionada exogenamente ao rim, ou rudimentos salivar ou pancretico do embrio de rato, a activina distorce severamente o padro de ramificao normal (Figura 17.29; Ritvos et al., 1995). As clulas epiteliais no esto mortas e ainda so capazes de induzir as clulas mesenquimatosas a formarem nefros, mas os ramos esto muito desorganizados. As semelhanas entre os rudimento da glndula salivar tratada com colagenase e aqueles tratados com activina sugerem que essa ltima possa desencadear a digesto de matriz extracelular no local de um novo ramo, e que a sua adio exgena promove a destruio da matriz extracelular atravs de todo o epitlio. Vrios fatores parcrinos adicionais parecem ser responsveis pela induo da ramificao do epitlio pulmonar. Uma forma de fator de crescimento derivado das plaquetas pode induzir a ramificao pulmonar, e o RNA antisenso contra sua mensagem o inibe (Souza et al., 1995). Epitlio pulmonar em cultura tambm pode ser
687
Figura 17.28
O efeito do TGF-1 na morfognese do epitlio renal. (A) Um rim de camundongo de 11 dias cultivado por 4 dias no meio controle tem ramificao normal. (B) Um rim de um camundongo de 11 dias cultivado em TGF-1 s apresenta ramificao na periferia do mesnquima, e os ramos formados so alongados. (Segundo Ritvos et al., 1995.)
(A)
(B)
estimulado a se ramificar expondo-o anfiregulina, um fator parcrino semelhante ao fator de crescimento epidrmico. Anticorpos contra anfiregulina iro inibir a ramificao nessas culturas (Schugar et al., 1996). O mesnquima do pulmo do embrio do camundongo secreta FGF7, enquanto o epitlio pulmonar sintetiza o receptor FGF7. Oligonucletidos antisenso para FGF7 ou seu receptor bloqueiam a ramificao epitelial em rudimentos de pulmo em cultura, assim como o fazem as mutaes de perda-defuno desse receptor* (Peters et al., 1994; Post et al., 1996). Alm da secreo de anfiregulina e FGF7 pelo mesnquima, a Sonic hedgehog parece ser secretada pelos terminais distais dos brotos pulmonares (Bellusci et al., 1996).
Induo ao nvel de uma nica clula

A induo embrionria ocorre quando interaes entre clulas indutoras e responsivas trazem mudanas na trajetria desenvolvimental da clula responsiva (Jacobson e Sater, 1988). Sem a induo, a clula responsiva se tornaria um tipo de
* Em uma notvel coincidncia, a formao do sistema traqueal de Drosophila tambm depende de FGF (Glazer e Shilo, 1991; Samakoulis et al., 1996). Os pulmes e as traquias dos vertebrados so novidades evolucionrias que no tm semelhanas anatmicas ou embrionrias com as traquias dos insetos.
Figura 17.29
(A)
(B)
Os efeitos da activina na morfognese do epitlio da glndula salivar. Rudimentos da glndula salivar embrionria foram cultivados por 4 dias em meio controle (A), e em meio contendo activina 7.5 nM (B). Aps 4 dias, os rgos foram fixados e corados para citoqueratina epitelial. (de Ritvos et al., 1995.)
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Figura 17.30
Microfotografia eletrnica de varredura de um olho composto de Drosophila. Cada faceta um nico omatdio. Uma cerda sensorial se projeta de cada omatdio. (Cortesia de T. Venkatesh.)
clula; com a induo, torna-se um outro. Nossas discusses sobre induo usualmente ocuparam-se de tecidos e no de clulas. Porm, a induo tambm pode ocorrer ao nvel da nica clula. Os primeiros exemplos desse fenmeno vieram de estudos com o sistema imune. Aqui, a recepo de antgeno (substncias estranhas) pela clula B deu-lhe a competncia de responder a fatores parcrinos e justcrinos sintetizados pelas clulas T auxiliares. H um dilogo recproco entre as clulas B e as clulas T pelo qual ambas se diferenciam e se proliferam na presena de antgeno estranho (Clark e Ledbetter, 1994; Essen et al., 1995). Na verdade, a AIDS uma doena de induo, na qual a clula T auxiliar foi destruda e no pode induzir a diferenciao de clulas B e macrfagos.* [prox4.html] Pesquisas recentes sobre o desenvolvimento de Drosophila e Caenorhabditis mostraram que a induo realmente ocorre no nvel clula-para-clula. Alguns dos exemplos melhor estudados envolvem a formao dos fotorreceptores da retina do olho da Drosophila. A retina consiste de cerca de 800 unidades chamadas omatdios (Figura 17.30). Cada omatdio composto de 20 clulas organizadas em um padro preciso. O olho desenvolve-se na camada epitelial plana do disco imaginal do olho da larva. No h clulas diretamente acima ou abaixo dessa camada, de modo que as interaes so limitadas s clulas vizinhas em duas dimenses. A diferenciao das clulas epiteliais arranjadas de maneira aleatria nos fotorreceptores da retina e seu tecido do cristalino ao redor ocorre durante o ltimo (terceiro) estgio larval. Uma reentrncia se forma na margem posterior do disco imaginal, e esse sulco morfogentico comea a trafegar para frente em direo ao anterior do epitlio (Figura 17.31). O movimento do sulco depende das protenas do conjunto marcador, Hedgehog e Decapentaplegic. Hedgehog expresso por clulas imediatamente posteriores ao sulco (i.e., aquelas que acabaram de se diferenciar) e induz a expresso da protena decapentaplegic dentro do sulco (Heberlein et al., 1993; Ma et al., 1993). medida que as clulas da retina comeam a se diferenciar atrs do sulco, elas secretam a protena Hedgehog, que empurra o sulco anteriormente (Brown et al., 1995). Quando o sulco passa atravs de uma regio de clulas, essas comeam a se diferenciar em uma ordem especfica. A primeira clula a se desenvolver o fotorreceptor central (R8). (Ainda no sabido como o sulco instru certas clulas a se tornarem fotorreceptores R8, mas possvel que as protenas DPP e Hedgehog na regio do sulco induzam a determinao de R8). A clula R8 considerada induzir a clula anterior e a clula posterior a ela (em relao ao sulco), para se tornarem os fotorreceptores R2 e R5, respectivamente. Os fotorreceptores R2 e R5 so funcionalmente equivalentes, sendo o sinal de R8 provavelmente o mesmo para ambas (Tomlinson e Ready, 1987). Sinais dessas clulas induzem mais quatro clulas adjacentes a tornarem-se os fotorreceptores R3, R4, e depois R1 e R6. Em ltimo lugar aparece o fotorreceptor R7. As outras clulas ao redor desses fotorreceptores tornam-se clulas do cristalino. A determinao do cristalino a condio de revelia (default) se as clulas no forem induzidas. [prox5.html] Uma srie de mutaes foram encontradas bloquear alguns dos passos dessa cascata indutora. A mutao rough (ro), por exemplo, bloqueia a induo dos fotorreceptores R3 e R4. A mutao sevenless (sev) e a mutao bride of sevenless (boss) pode, cada uma, prevenir as clulas R7 de se diferenciarem. (Essas clulas tornam-se ento clulas do cristalino). A anlise dessas mutaes mostrou que elas esto envolvidas no processo indutivo. O gene sevenless requerido na prpria clula R7. Se embries mosaico so produzidos de modo que algumas das clulas do disco ocular sejam heterozigotas (normais) e algumas homozigotas para a mutao sevenless, o fotorreceptor R7 visto desenvolver-se somente se o precursor R7 tem o alelo sevenless
* Em seres humanos, essas clulas T so chamadas clulas T auxiliares / indutoras, um nome que reconhece seu papel no desenvolvimento. A glicoprotena CD4 normalmente est envolvida na mediao celular da adeso no-especfica entre a clula T auxiliar/indutora e os linfcitos B (Doyle e Strominger, 1987).
689
Figura 17.31
Diferenciao de fotorreceptores no disco imaginal do olho da larva tardia. O sulco morfogentico (seta) atravessa o disco do posterior (esquerda) ao anterior (direita). Atrs do sulco, as clulas fotorreceptoras se diferenciam em uma seqncia definida (mostrada abaixo). A primeira clula fotorreceptora a se diferenciar a R8, que parece induzir a diferenciao de R2 e R5; a cascata de induo continua at que o fotorreceptor R7 tenha se diferenciado. (Segundo Tomlinson, 1988, fotografia cortesia de T. Venkatesh.)
Poro antenal do disco
Diferenciao mais tardia (posterior ao sulco morfogentico)
Diferenciao precoce (entrando no sulco morfogentico)
tipo selvagem (Basler e Hafen, 1989; Bowtell et al., 1989). Anticorpos para essa protena encontram-na na membrana celular, e a seqncia do gene sevenless sugere que ela uma protena transmembrana com um stio tirosina quinase em seu domnio citoplasmtico (Banerjee et al., 1987; Hafen et al., 1987). Isso consistente com a suposio da protena ser um receptor para algum sinal. Esse sinal para o precursor R7 diferenciar-se no fotorreceptor R7, provavelmente vem diretamente de uma protena codificada pelo alelo tipo selvagem de bride of sevenless (boss). Moscas homozigotas para a mutao boss no tm os fotorreceptores R7. Estudos com genes de mosaico onde algumas das clulas do disco imaginal so normais e algumas das clulas so homozigotas para mutao boss mostram que o gene boss tipo selvagem no necessrio na clula precursora R7. Ao contrrio, o fotorreceptor R7 somente se diferencia se o gene boss tipo selvagem expresso na clula R8. Assim, o gene bride of sevenless est codificando alguma protena cuja existncia na clula R8 necessria para a diferenciao da clula R7.* O sinal produzido pela protena Boss provavelmente trabalha por contato celular. Genes
* Todos os precursores de fotorreceptores sintetizam a protena Sev, e o sinal Boss dado pelo fotorreceptor R8 provavelmente dado e recebido por todas as clulas circunjacentes. O que, ento, impede as clulas R1-R6 de tambm se tornarem clulas R7? O agente restritivo provavelmente o produto do gene seven-up (sup). Em mutante deficientes em sup, os precursores R1, R3, R4 e R6 todos desenvolvem o fentipo R7. O gene sup codifica um fator de transcrio da famlia receptora de esterides (Mlodzik et al., 1990). Isso, porm, no toda a histria. Provavelmente existe um caminho paralelo, pelo qual o receptor Sevenless tambm ativa a protena Corkscrew. Corkscrew ativa a protena Daughter-of-sevenless (dos). A protena Dos facilita a ativao de Ras (Herbst et al., 1996).
690
boss tipo selvagem numa clula R8 em um omatdio no iro corrigir a deficincia de alelo boss mutante nos omatdios adjacentes, e o domnio extracelular da protena Boss suficiente para ativar a tirosina quinase sevenless em uma clula vizinha (Reinke e Zipursky, 1988; Hart et al., 1993). Um resumo das indues clula-paraclula conhecidas na retina de Drosophila (Figura 17.32) mostra que clulas individuais so capazes de induzir outras clulas individuais a criar o arranjo preciso de clulas em tecidos particulares.
Figura 17.32
Sumrio de genes conhecidos por estarem envolvidos na induo dos fotorreceptores de Drosophila. Para que o desenvolvimento continue para alm da diferenciao dos fotorreceptores R8, R2 e R5, o gene rough (ro) deve estar presente tanto nas clulas R2 como nas R5. Para a diferenciao do fotorreceptor R7, o gene sevenless (sev) deve estar ativo na clula precursora R7, enquanto o gene bride of sevenless (boss) deve estar ativo no fotorreceptor R8. (Segundo Rubin, 1989.)
Vulvar Induo Vulvar no Nematide Caenorhabditis elegans A vulva de Caenorhabditis elegans um caso onde um sinal indutor pode gerar uma variedade de tipos celulares. Esse rgo se forma durante o estgio larval de seis clulas do blasto chamadas clulas precursoras vulvares (VPCs). A clula que conecta a gnada sobrejacente clulas precursoras vulvares chamada clula ncora. Ela secreta a protena LIN-3, um parente do fator de crescimento epidrmico (Hill e Sternberg, 1992). Se a clula ncora destruda (ou se o gene lin-3 mutado), as VPCs no formam uma vulva; elas tornam-se parte da hipoderme (pele) (Kimble, 1981). As seis clulas precursoras vulvares sob influncia da clula ncora formam um grupo de equivalncia. Cada membro desse grupo competente para ser induzido pela clula ncora e pode assumir um de trs destinos, dependendo de sua proximidade essa clula (Figura 17.33). A clula diretamente abaixo da clula ncora se divide para formar as clulas vulvares centrais. As duas clulas flanqueando a clula central se dividem para tornarem-se as clulas vulvares laterais, enquanto as trs clulas mais distantes da clula ncora geram as clulas hipoblsticas. Se a clula ncora destruda, todas as seis clulas do grupo de equivalncia dividem-se uma vez e contribuem para o tecido hipodrmico. Se as trs clulas centrais forem destrudas, as trs clulas externas, que normalmente formam clulas hipodrmicas, geram clulas vulvares em seu lugar. A protena LIN-3 recebida pela tirosina quinase do receptor LET-23 nas VPCs, e o sinal transferido para o ncleo atravs da trajetria Ras-MAP quinase (veja Captulo 3).
(A)
Gnada
Clula ncora
VPCs (clulas precursoras vulvares)
(B) Membrana basal Gnada
Clula ncora
Figura 17.33
Cutcula (C)
As VPCs e seus descendentes. (A) Localizao da gnada, clula ncora, e VPCs no segundo instar da larva de um C. elegans hermafrodita. (B,C) Relao da clula ncora com as seis VPCs e suas linhagens subseqentes. As primeiras linhagens resultam em clulas vulvares centrais; as segundas constituem as clulas vulvares laterais; as terceiras geram as clulas hipodrmicas. O esquema da vulva mostrado no quarto instar da larva, os crculos representando as posies do ncleo. (Segundo Katz e Sternberg, 1996.)
691
H trs mecanismos pelos quais tais indues podem ocorrer (Katz e Sternberg, 1996): 1. A hiptese do sinal graduado. Aqui, a VPC mais prxima da clula ncora recebe as mais altas concentraes de protena LIN-3 e gera as clulas vulvares centrais. As duas VPCs adjacentes recebem uma baixa quantidade de LIN-3 e se tornam as clulas vulvares laterais. As VPCs mais distantes da clula ncora no recebem LIN-3 suficiente, e se tornam hipoderme (Katz et al., 1995). 2. O modelo da induo seqencial. Aqui, a protena LIN-3 trabalha somente sobre a clula imediatamente abaixo a ela. Essa clula ir gerar a linhagem vulvar central. Ir tambm sinalizar lateralmente para as duas clulas adjacentes e instru-las para gerar linhagens vulvares laterais. Essas clulas no iro instruir as clulas perifricas de VPCs de fazer algo; por isso, essas tornam-se hipoderme (Koga e Oshima, 1995; Simske e Kim, 1995). 3. O modelo da no-equivalncia. Aqui, as VPCs podem substituir uma a outra, mas no so idnticas. Elas tm os seus vieses e podem responder at a baixas concentraes da protena LIN-3. Porm, os vieses fazem com que a clula abaixo da clula ncora gere a linhagem vulvar central (Sternberg, 1989; Sternberg e Horvitz, 1989). Interessante, existe evidncia que todos os trs modelos funcionam durante o desenvolvimento normal (Kenyon, 1995; Katz e Sternberg, 1996). Provavelmente h um sinal graduado de LIN-3 da clula ncora, que refora os vieses das VPCs j existentes. Alm disso, uma vez que a VPC abaixo da clula ncora fica determinada a formar a linhagem vulvar central, ela sinaliza as clulas a ela adjacentes proibindo-as de tambm formar clulas vulvares centrais. Essa inibio lateral das clulas precursoras vulvares secundrias pelas VPC primria conseguida atravs das protenas LIN-12 (Figura 17.34; Sternberg, 1988). Se todos esses sistemas estiverem operando durante o desenvolvimento normal, conforme nota Kenyon (1995), ento em conjunto elas poderiam produzir as to-perfeitas pequenas vulvas pelas quais C. elegans to famoso.
LET-3 Sinal ativa genes Vulval
Sinal ativa lin-12
Sinal ativa lin-12
Vul ligado lin-12 ligado
Vul ligado
Vol ligado lin-12 ligado
Figura 17.34
Hipoderme
Vulva
Hipoderme
Modelo para determinao de linhagens de clulas vulvares em C. elegans. O sinal LIN3 da clula ncora promove a determinao da clula P6.p gerar a linhagem vulvar central. Doses menores de LIN-3 fazem com que as clulas P5.p e P7.p formem as linhagens vulvares laterais. A clula P6.p (linhagem central) tambm secreta um sinal de curto alcance que induz as clulas vizinhas a ativarem a protena LIN-12. Isso tambm previne as clulas P5.p e P7.p de gerarem a linhagem primria de clulas vulvares centrais.
692
&
(A)
Especulaes
Interaes Clula-Clula e Possibilidade na Determinao de Tipos Celulares
DESENVOLVIMENTO da vulva
Sinal
Receptor
em C. elegans mostra vrias situaes de indues ao nvel celular. A primeira situao se refere induo da clula ncora gonadal. A formao da clula ncora mediada pelo gene lin-12, que codifica uma protena receptora da superfcie celular. Em hermafroditas do tipo selvagem, duas clulas adjacentes, Z1.ppp e Z4.aaa, tm o potencial de se tornarem clula ncora gonadal. Elas interagem de maneira a causar uma delas ser a clula ncora, enquanto a outra se torna o precursor do tecido uterino. Em mutantes recessivos lin-12, ambas clulas se tornam clulas ncora, enquanto em mutantes dominantes, ambas se tornam precursores uterinos (Greenwald et al., 1983). Estudos usando mosaicos genticos e ablaes celulares mostraram que essa deciso feita no segundo estgio larval e que o gene lin-12 somente precisa funcionar na clula destinada a se tornar a clula precursora uterina. A presuntiva clula ncora no o necessita. Seydoux e Greenwald (1989) especulam que essas duas clulas originalmente sintetizam o sinal para a diferenciao uterina (a protena LAG-2) e o receptor para essa molcula (a protena LIN-12) (Figura 17.35; Wilkinson et al., 1994). Durante um certo perodo no desenvolvimento larval, a clula que por acaso estiver secretando mais desse sinal de diferenciao faz com que sua vizinha pare de produzir a molcula sinalizadora e aumente a produo da protena LIN-12. A clula secretando o sinal se torna a clula ncora gonadal, enquanto a clula recebendo o sinal atravs de sua protena LIN-12 se torna a clula precursora uterina ventral. Assim, as duas clulas so consideradas determinar uma a outra antes de seus respectivos eventos de diferenciao. A deciso clula ncora/precursora uterina ventral ilustra dois aspectos importantes da determinao de duas clulas originalmente equivalentes. Primeiro,
(B)
(C)
(D)
Clula ncora
Precursor uterino ventral
Figura 17.35
Modelo para a gerao de dois tipos de clulas (clula ncora e precursor uterino ventral) de duas clulas equivalentes (Z1.ppp e Z4.aaa). (A) As clulas comeam como equivalentes, com quantidades flutuantes de sinal (seta) e receptor (seta invertida). O gene lag-2 considerado codificar o sinal; o gene lin-12 considerado codificar o receptor. A recepo do sinal diminui a produo de LAG-2 e aumenta a de LIN-12. (B) Um evento estocstico (aleatrio) causa uma clula a produzir mais substncia sinalizadora que outra em certo perodo crtico. Isso estimula mais atividade de LIN-12 na clula vizinha. (C) Essa diferena ampliada, j que a clula com mais LIN-12 no produz tanto sinal. (D) Finalmente, uma clula envia o sinal, e outra o recebe. A clula sinalizadora torna-se a clula ncora; a clula receptora torna-se o precursor uterino ventral. (Segundo Greenwald e Rubin, 1992.)
a diferena inicial entre elas criada pelo acaso. Segundo, essas diferenas iniciais so reforadas por retroalimentao. Tal determinao tambm vista na determinao de qual das clulas epidrmicas, originalmente equivalentes, do embrio do inseto geram os neurnios do sistema nervoso perifrico. Aqui, a escolha entre tornar-se uma pele (hipodrmica) ou
um neuroblasto. O gene Notch de Drosophila tambm canaliza uma clula bipotencial em uma de duas trajetrias alternativas. Logo aps a gastrulao, uma regio de cerca de 1800 clulas ectodrmicas encontra-se ao longo da linha mediana ventral do embrio de Drosophila. Essas clulas tm o potencial de formar o cordo nervoso ventral do inseto, e cerca de um-quarto delas se tornam neuroblastos, enquanto o resto se torna precursoras da hipoderme. As clulas que do origem aos neuroblastos esto intermisturadas com as clulas que so destinadas a dar origem a precursores hipodrmicos. Assim, cada clula ectodrmica nas regies formadoras de nervos do embrio da mosca pode dar origem ou a clulas hipodrmicas ou a clulas precursoras neurais (Hartenstein e Campos-Ortega, 1984), Na ausncia de transcrio do gene Notch no embrio, as clulas se desenvolvem em precursores neurais em lugar de uma mistura de clulas precursoras neurais e hipodrmicas (Figura 17.36; ArtavanisTsakonis et al., 1983; Lehmann et al., 1983). Esses embries morrem, com um grande excesso de clulas neurais, s custas da hipoderme ventral e da cabea (Poulson, 1937; Hoppe e Greenspan, 1986). O gene Notch foi clonado (Kidd et al., 1983; Yedvobnick et al., 1985) e encontrado ser transcrito durante a metade precoce da embriognese (e mais tarde no estgio pupal precoce). Tanto a protena Notch como a LIN-12 compartilham notveis homologias seqenciais entre si. Ambas so protenas transmembrana que podem atuar como receptores de sinais de clulas adjacentes (Yochem et al., 1988). Heitzler e Simpson (1991) propuseram que a protena Notch, tal como a LIN-12, funciona como um receptor para sinais intercelulares envolvendo a distino entre clulas equivalentes. Alm disso, elas provem evidncia que outra protena transmembrana, produto do gene delta (cuja ausncia cria um fentipo muito semelhante aquele das
693
Figura 17.36
Representao do efeito da mutao Notch. Em embries tipo selvagem, as clulas ectodrmicas neurognicas geram tanto neuroblastos como clulas de pele (hipodrmicas). Em embries deficientes em Notch, porm, todo o ectoderma neurognico gera neuroblastos. A proporo de neuroblastos para clulas hipodrmicas difere entre as regies do embrio.
Tipo selvagem Dorsal Clulas ectodrmicas neurognicas
Neuroblasto Hipoderme
Ventral
deficincias Notch) o ligante de Notch. Mosaicos genticos mostram que enquanto Notch requerido por clulas que devem se tornar epiderme, o gene delta necessrio nas clulas que induzem o fentipo epidrmico. Greenwald e Rubin (1992) propuseram um modelo baseado na hiptese LIN-12 para explicar o espaamento dos neuroblastos nos agregados pr-neurais de precursores epidrmicos e neurais (Figura 17.37). Inicialmente, todas as clulas tm potenciais e sinalizaes iguais. Porm, quando uma das clulas, por acaso, produz mais sinal (como o produto delta), ela ativa os receptores em clulas adjacentes, reduzindo o nvel de sinalizao. Como os nveis de sinalizao em clulas adjacentes so baixos, as vizinhas das clulas de baixa sinalizao tendero ser sinalizadores de alto nvel. Dessa maneira, um espaamento de neuroblastos produzido. O papel do acaso na determinao celular no to incomum como se pode supor. Conforme discutiremos no Captulo 22, o amadurecimento de somente um vulo por ms em humanos determinado
(A) (B)
Mutante notch
principalmente pelo nmero aleatrio de receptores hormonais nas clulas foliculares. De maneira semelhante, a deciso sobre se uma clula tornar-se- ou no parte do embrio ou parte do trofoblasto certamente uma deciso fundamental no desenvolvimento do mamfero tamFigura 17.37
bm determinada pela posio aleatria da clula durante a compactao. Tais fatores aleatrios podem ocasionar interaes que so amplificadas, distinguindo, finalmente, entre dois tipos celulares naquilo que havia sido uma populao celular homognea.
Modelo para explicar os padres de espaamento de neuroblastos entre as clulas ectodrmicas neurognicas inicialmente equivalentes. Baseando-se no modelo para duas clulas mostrado na Figura 17.36, cada clula tanto d como recebe o mesmo sinal. (A) Um campo de clulas equivalentes, todas sinalizando e recebendo igualmente. (B) Um evento aleatrio causa uma das clulas (sombreamento mais intenso) a produzir mais sinalizao. Suas clulas circunjacentes recebem essa quantidade aumentada de sinal e reduzem seu prprio nvel de sinalizao (sombreado mais leve). (C) O restante do padro est agora constrangido. Aquelas clulas que reprimiram sua prpria sinalizao (em resposta aos eventos em B), provavelmente no expressaro mais sinalizao que suas clulas vizinhas. As clulas rodeadas por sinalizadores mais reprimidos tero maior probabilidade de se tornar sinalizadoras. (D,E) Os destinos das clulas atravs do campo ficam especificadas medida que a amplificao dos sinais cria populaes de sinalizadores rodeados por populaes de receptores. No caso dos genes neurognicos, o sinal considerado emanar da protena Delta, o receptor sendo a protena Notch. (Segundo Greenwald e Rubin, 1992.)
(C) (D) (E)
Induo o processo iniciado quando uma clula ou grupo de clulas sinaliza clulas ou grupos de clulas vizinhas para mudar seu destino desenvolvimental. Em organismos to complexos como os mamferos, as interaes indutivas recprocas so essenciais para coordenar as partes em um todo coerente.
694
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CAPTULO 18 Desenvolvimento do Membro de Tetrpode
701
Desenvolvimento do membro de tetrpode
18
Meus braos so mais longos do que minhas pernas.... Eu sou meu prprio escultor: estou partindo do meu interior e me modelando com materiais vivos, molhados e maleveis: qual outro artista teve sua disposio um desenho to perfeito como esse disposio de meus martelos e cinzis: as clulas migram para o local exato para construir um brao: a primeira vez que elas o fizeram, nunca antes e nunca mais, entendem vocs mercies benz o que eu estou dizendo? Eu nunca serei repetido. CARLOS FUENTES (1989) O que pode ser mais curioso do que a mo de um homem, formada para pegar, a de uma toupeira para cavar, a perna de um cavalo, a nadadeira de um boto e a asa de um morcego, todos devem ser construdos no mesmo modelo e devem incluir ossos similares na mesma posio relativa? CHARLES DARWIN (1859)
Padronizao no membro
PADRONIZAO um processo pelo qual as clulas embrionrias formam arranjos de tecidos diferenciados, espacialmente ordenados. A possibilidade de realizao desse processo uma das propriedades mais dramticas do organismo em desenvolvimento, provocando um senso de estupefao em cientistas e leigos. Como que o embrio capaz no s de produzir os diferentes tipos de clulas do corpo, mas tambm produzi-las de maneira a formar tecidos e rgos funcionais? Uma coisa diferenciar os condrcitos e ostecitos que sintetizam a cartilagem e as matrizes dos ossos, respectivamente; outra coisa produzir essas clulas em uma orientao temporal e espacial gerando um osso funcional. E ainda outra coisa produzir um osso que um mero e no uma pelve ou um fmur. A habilidade das clulas dos membros em pressentir suas posies relativas e diferenciar-se de acordo com essas posies tem sido o tema de intensos debate e experimentao. Como que as clulas que se diferenciam em cartilagem do osso embrionrio so especificadas de modo a formar dedos em uma ponta e o ombro na outra? (Seria um apndice quase desnecessrio se a ordem fosse inversa.) Aqui, os tipos de clulas so os mesmos, mas os padres que os originam so diferentes. O membro dos vertebrados um rgo muito complexo com uma distribuio assimtrica de partes. Os ossos do membro anterior, seja uma asa, uma mo, uma nadadeira ou uma barbatana, consistem de um mero proximal (adjacente parede do corpo), um rdio e um cbito na regio mediana, e os ossos distais do pulso e dos dedos (Figura 18.1). Originalmente, essas estruturas so cartilaginosas, mas finalmente a maioria delas substituda por ossos. A posio de cada um dos ossos e dos msculos no membro precisamente determinada. A polaridade tambm existe em outras dimenses. No homem, bvio que cada mo se desenvolve como a imagem espelhar da outra. possvel tambm a existncia de outros arranjos- como o polegar se desenvolver no lado esquerdo de ambas as mos- mas isso no comum. Analogamente, a palma (ventral) facilmente distinta do pulso (dorsal). De alguma maneira, a estrutura tridimensional do membro anterior produzida rotineiramente. O problema fundamental da morfognese- como estruturas especficas se situam em lugares determinados- exemplificado no desenvolvimento dos membros. Como que o mesoderma da placa lateral desenvolve capacidades formadoras de membros? Como que dedos se formam em uma das extremidades do membro e em nenhum outro lugar? Como que o dedo mnimo se desenvolve em uma margem do membro e o polegar em outra? 701
702
Figura 18.1
Padro esqueltico da asa de pinto. De acordo com a conveno, os dgitos so numerados II,III, IV. Dgitos I e V no so encontrados em asas de pinto. (De acordo com Saunders, 1982.)
Rdio mero Dgitos
Metacarpos Cbito Anterior Proximal Posterior Distal
As regras morfogenticas bsicas para a formao dos membros parecem ser as mesmas para todos tetrpodes (veja Hinchliffe, 1991). Fallon e Crosby (1977) mostraram que enxertos de pedaos de brotos membros de mamferos ou de rpteis podem dirigir a formao de membros de pinto, e Sessions e colaboradores (1989) demonstraram que regies dos brotos de membros de salamandra e r podem, uns aos outros, dirigir a padronizao dos seus membros. Ainda mais, a regenerao dos membros da salamandra parece seguir as mesmas regras do desenvolvimento (Muneoka e Bryant, 1982). Mas quais so essas regras morfogenticas? A informao posicional necessria para construir um membro deve funcionar em um sistema coordenado tridimensional.* Durante os ltimos cinco anos, foram identificadas certas protenas que tm um papel na formao de cada um dos eixos do membro. O crescimento prximo-distal (ombro-dedo; coxa-artelho) parece ser regulado pela famlia de protenas do fator de crescimento dos fibroblastos (FGF). O eixo ntero-posterior (polegar-dedo mnimo) deve ser regulado pela protena Sonic hedgehog, e o eixo dorsoventral (n dos dedos-palma da mo) regulado, pelo menos em parte, por Wnt7a. A interao dessas protenas determina a diferenciao dos tipos de clulas, alm de se apoiarem mutuamente.
Formao do broto do membro

O campo do membro Um campo morfogentico pode ser descrito como um grupo de clulas cuja posio e destino so especificados em relao ao mesmo conjunto de limites (Weiss, 1939; Wolpert, 1977). Um campo especfico de clulas dar origem a seu rgo particular (membro anterior, olho, cauda, etc.) quando transplantado a uma parte diferente do embrio, e as clulas do campo podem regular seus destinos, contornando a falta de clulas no campo (Huxley e De Beer, 1934; Opitz, 1985; De Robertis et al., 1991). Um dos primeiros campos a serem identificados foi o campo do membro. As clulas mesodrmicas que originam o membro de vertebrados podem ser identificadas por (1) remoo de certos grupos de clulas e observando se um membro se desenvolve em sua ausncia (Detwiler, 1918; Harrison, 1918), (2) transplantando certos grupos de clulas a novos locais e observando se elas formam um membro (Hertwig, 1925), e (3) marcando grupos de clulas com corantes ou precursores radioativos e observando quais descendentes das clulas marcadas participam no desenvolvimento dos membros (Rosenquist, 1971). Com esses procedimentos, a rea prospectiva dos membros foi precisamente localizada em muitos embries de verte* Realmente, um sistema tetradimensional no qual o tempo o quarto eixo. Biologistas do desenvolvimento se acostumam a ver a natureza em quatro dimenses.
703
brados. A Figura 18.2 mostra a rea prospectiva do membro anterior no estgio de broto caudal da salamandra Ambystoma maculatum. O centro desse disco normalmente destinado a originar o prprio membro. Adjacente a ele esto as clulas que formaro o tecido do flanco peribraquial e a cinta do ombro. Essas duas regies compreendem o clssico disco do membro usado em experimentos citados neste captulo. Entretanto, se todas essas clulas so extirpadas do embrio, ainda se formar um membro, ainda que mais tarde, a partir de um anel adicional de clulas que envolve essa rea. Se esse anel de clulas for includo no tecido extirpado, no haver desenvolvimento do membro. Essa regio maior, representando todas as clulas na rea capazes de formar um membro, chamada campo do membro. O campo do membro originalmente tem a habilidade de regular a perda ou a adio de partes. No estgio de broto da cauda em Ambystoma, qualquer das metades do disco do membro capaz de regenerar o membro completo quando enxertado em um novo stio (Harrison, 1918). Esse potencial tambm pode ser evidenciado dividindo verticalmente o disco do membro em dois ou mais segmentos e colocando delgadas barreiras entre os segmentos para impedir sua reunio. Quando isso feito, cada parte se desenvolve em um membro completo. A habilidade reguladora do broto do membro foi realada recentemente em um admirvel experimento da natureza. Em um pequeno lago em Santa Cruz, Califrnia, foram encontrados numerosas salamandras e rs com vrias pernas (Figura 18.3). A presena desses apndices extras foi relacionada infestao do abdmen das larvas por vermes trematides parasticos. Os ovos desses vermes provavelmente dividiram o broto do membro em vrios locais enquanto o girino estava iniciando a formao dessas estruturas (Sessions e Ruth, 1990). Assim, como um embrio precoce de ourio-do-mar, o campo do membro representa um sistema eqipotencial harmonioso onde a clula pode ser instruda a formar qualquer parte do membro. Especificao dos campos do membro: Genes Hox e cido retinico Os membros no se formaro simplesmente em qualquer lugar ao longo do eixo corpreo. Ao contrrio, existem posies muito distintas onde os campos do membro so originados. Interessantemente, em todos os vertebrados existem somente quatro brotos de membros por embrio, e eles so sempre opostos entre si em relao linha mediana. Membros de diferentes vertebrados podem diferir em relao ao nvel do somito de onde se originam, mas sua posio constante em relao ao nvel de expresso do gene Hox ao longo do eixo ntero-posterior. Por exemplo, nos peixes (onde as nadadeiras peitorais e plvicas correspondem aos membros anteriores e posteriores, respectivamente), anfbios, aves e mamferos, os brotos dos membros anteriores so encontrados na regio mais anterior expressando o gene Hoxc-6, a posio da primeira vrtebra torcica (Oliver et al., 1988; Molven et al., 1990; Burke et al., 1995). A placa mesodrmica lateral na regio dos membros tambm especial, pois induz os mioblastos a sair dos somitos e penetrar no broto do membro. Isso no feito por nenhuma outra regio da placa mesodrmica lateral (Hyashi e Ozawa, 1995). [limb1.html], [mesend1.html] O cido retinico parece ser crtico para o incio do crescimento dos brotos dos membros, pois bloqueando a sntese de cido retinico com certas drogas se impede a iniciao do broto do membro (Stratford et al., 1996). Bryant e Gardiner (1992) sugerem que um gradiente de cido retinico ao longo do eixo ntero-posterior pode ativar certos genes hometicos em clulas particulares que so, dessa forma, especificadas para serem includas no campo do membro. A fonte de cido retinico seria o ndulo de Hensen (Hogan et al., 1992). A especificao de um campo de membro pelos genes Hox, ativados por cido retinico, pode explicar uma observao estranha feita por Mohanty-Hejmadi e colaboradores (1992) e repetida por Maden (1993). Quando caudas de girinos foram amputadas e o coto exposto ao cido retinico durante os primeiros dias de regenerao, esses girinos regeneraram vrias pernas do coto de sua
Somitos
Rim pronfrico Guelras
Tecido do flanco peribraquial
Membro livre
Cinta do ombro
Figura 18.2
Campo prospectivo do membro anterior da salamandra Ambystoma maculatum. A rea central contm aquelas clulas destinadas a formar o membro propriamente dito; as clulas rodeando o membro livre so aquelas que do origem ao tecido do flanco peribraquial e a cinta do ombro. As clulas fora dessas regies geralmente no so includas nos membros, mas podem formar um membro se os tecidos mais centrais so extirpados. (De acordo com Stocum e Fallon, 1982.)
Figura 18.3
Habilidade reguladora do campo do membro, vista quando os campos dos membros posteriores precoces de um girino de Hyla regila foram divididos por numerosos ovos de trematides. (Cortesia de S. Sessions.)
704
cauda (Figura 18.4). possvel que o cido retinico tenha causado uma transformao hometica na cauda em regenerao, reespecificando o tecido da cauda em campos de membros (Mller et al., 1996). Crescimento do broto de membro precoce: fatores de crescimento dos fibroblastos como indutores do broto do membro
Figura 18.4
Regenerao de pernas a partir do blastema da cauda de um girino de r balo marmorizado (marbled balloon). O blastema da cauda foi tratado com cido retinico aps a amputao. (de Mohanty-Hejmadi et al., 1992, cortesia de P. Monhanty-Hejmadi.)
O desenvolvimento dos membros comea quando as clulas mesenquimatosas comeam a proliferar a partir da camada somtica do mesoderma da placa lateral do campo do membro (precursores esquelticos do membro), e a partir dos somitos (precursores musculares do membro) (Figura 18.5). As clulas acumulam-se sob o tecido epidrmico da nurula. A protuberncia circular na superfcie do embrio chamada broto do membro. As clulas mesenquimatosas no broto do membro se multiplicam para criar uma protuberncia que vai se proliferar para formar um membro. Os estgios iniciais dessa proliferao podem ser regulados pelo mesoderma intermedirio vizinho, tal como os mesonefros (o rim primitivo). Se nesse estgio, o mesonefro de um dos lados do embrio removido, ou se uma delgada membrana impermevel inserida entre o mesonefro e um broto de membro, as clulas mesenquimatosas daquele broto de membro especfico param de se multiplicar (Stephens et al., 1991; Geduspan e Solursh, 1992). Experimentos recentes (Crossley et al., 1996) sugerem que a molcula proveniente do mesoderma intermedirio o fator 8 de crescimento do fibroblasto (FGF8). No mesnquima mesonfrico do pinto, nos estgios 14 e 15 (quando os prospectivos brotos do membro comeam a aparecer), as regies de expresso de FGF8 nos mesonefros coincidem com as regies onde se formaro os brotos de membro (Figura 18.6). Alm disso, os FGFs podem induzir a formao de membros. Uma partcula embebida em FGF8 (ou FGFs relacionados) pode ser inserida na regio intramembro (oposta aos somitos 21-25; veja Figuras 18.6 e 18.7) no estgio 15. Aps uma semana de incubao, um membro ectpico l se forma. [limb2.html] Induo da crista ectodrmica apical A habilidade do FGF8 (ou outros FGFs) em induzir o crescimento mesodrmico do broto do membro precoce pode ser somente uma atividade permissiva, e no instrutiva. A formao do broto do membro necessita, alm de um indutor mesodrmico ativo, de um ectoderma competente. O ectoderma competente para formar um broto de membro parece se localizar somente na borda entre as superfcies dorsal e ventral do embrio.
Mitomo do somito Medula espinhal Notocorda Clulas mesodrmicas Precursor do msculo do membro Broto do membro
Prnefro
Figura 18.5
Formao do broto do membro. A proliferao das clulas mesodrmicas da regio somtica do mesoderma da placa lateral causa uma projeo externa do broto do membro no embrio de anfbio. Essas clulas do origem aos elementos esquelticos do membro. (Migrao de clulas somticas para o broto do membro gera a musculatura do membro.)
Precursor esqueltico do membro Endoderma Mesoderma da placa lateral Mesoderma da placa lateral
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Enquanto o broto do membro se forma, as clulas mesodrmicas induzem o ectoderma sobrejacente a formar uma estrutura chamada crista ectodrmica apical (AER; Figura 18.8; Kieny, 1960; Saunders e Reuss, 1974). Essa crista corre ao longo da margem distal do broto do membro e se tornar o principal centro sinalizador para o membro em desenvolvimento. Suas funes incluem (1) manter o mesoderma abaixo dela em uma fase plstica e proliferativa permitindo o crescimento linear (prximodistal) do membro; (2) manter a expresso daquelas molculas que geram o eixo nteroposterior (polegar-dedo mnimo); e (3) interagir com as protenas especificando os eixos ntero-posterior e dorsoventral permitindo a cada clula receber instrues de como se diferenciar. A AER est localizada na juno entre o ectoderma dorsal e o ventral. No broto do membro precoce, s o ectoderma nessa juno tem a habilidade de formar uma AER (Goetinck, 1964; Fraser e Abbott, 1971). Nos mutantes onde o ectoderma do broto do membro est dorsalizado (como o mutante limbless de pinto), a AER no se forma e o desenvolvimento do membro cessa (Carrington e Fallon, 1988). Ainda mais, partculas embebidas com FGF no induziro uma AER quando colocadas abaixo do ectoderma puramente dorsal ou ventral das costas ou do ventre. A juno dorsoventral parece ser crtica. Experimentos recentes (Laufer et al., 1997; Rodriguez e Izpisa-Belmonte, 1997; Tanaka et al., 1997) demonstraram que a aposio do ectoderma dorsal e ventral do broto do membro do pinto necessria para causar a formao de uma AER. Quando o ectoderma dorsal do broto do membro foi enxertado no ectoderma ventral de outro broto do membro, uma nova AER se formou em adio original (Figura 18.9). Parece que no estgio 15 (justamente antes da formao do broto do membro), o ectoderma dorsal est sintetizando uma protena secretora chamada Radical fringe.* Ao emergir, o broto do membro (no estgio 17) se produz
*Assim chamada devido ao gene fringe de Drosophila. A procura dos homlogos do gene fringe nos vertebrados foi motivada por estudos (a serem discutidos no prximo captulo) mostrando que a formao da margem da asa na Drosophila depende da expresso marginal desse gene. Como os genes hedgehog e wingless parecem ter funes na formao de membros tanto nos vertebrados como nos insetos, vrios laboratrios procuraram os genes fringe em vertebrados para verificar se haveria a criao do equivalente margem da asa, ou seja, a AER. Foi previsto que expresses limtrofes entre as regies dorsal e ventral seriam crticas na formao de membros vertebrados e invertebrados (Bryant et al., 1981; Meinhardt, 1984; Javois e Iten, 1986), mas as molculas envolvidas s agora esto sendo identificadas.
Estgios embrionrios Somitos Mesoderma intermedirio
Membro posterior
Membro anterior
Expresso de FGF8 Mesoderma segmentrio
Figura 18.6
Expresso de FGF8 no mesoderma intermedirio do embrio de pinto nos estgios 13-15. Diagrama esquemtico representando a metade lateral do embrio durante a induo do broto do membro. Os nmeros esquerda indicam nveis de somitos. (Os somitos so representados como crculos se desprendendo do mesoderma segmentrio, que est representado por uma barra colorida). A faixa sombreada indica a posio do mesoderma intermedirio; a expresso de FGF8 nesse mesoderma intermedirio mostrada pelas regies mais escuras na faixa. As posies dos membros prospectivos, anterior e posterior foram marcadas em cinza. (De acordo com Crossley et al., 1996.)
Figura 18.7
Membro ectpico formado pela implantao de uma partcula embebida em FGF no mesoderma entre-membros no estgio 15. Embrio tardio mostrando membro anterior, membro posterior e membro intermedirio induzido pela partcula embebida em FGF. (Fotografia cortesia de G.R. Martin.)
706
Crista ectodrmica apical
Figura 18.8
Micrografia eletrnica de varredura de um broto de membro precoce de pinto, com sua crista ectodrmica apical em primeiro plano. (Cortesia de K. W. Tosney.)
Figura 18.9
uma forte demarcao entre as clulas dorsais que expressam o gene radical fringe e as clulas do ectoderma ventral que no o expressam. Durante o crescimento do broto, a expresso do radical fringe se restringe quase exclusivamente quelas clulas do ectoderma dorsal na margem dorsal/ventral do broto do membro. Essas clulas comeam a expressar Fgf8 e se tornam a AER. (Como veremos, a FGF8 secretada da AER considerada crtica por sua capacidade em manter a proliferao do mesoderma abaixo dela e manter a expresso do gene sonic hedgehog para a organizao do eixo ntero-posterior; veja Figura 18.10.) A importncia da margem expressando ou no o radical fringe confirmada em estudos onde esse gene expresso ectopicamente em retrovrus. Se as clulas ventrais do broto do membro so infectadas com um retrovrus expressando radical fringe, um novo limite criado entre as clulas que expressam o gene e aquelas que no o expressam, e uma nova AER nela originada. Inversamente, se a expresso ectpica de radical fringe destri a fronteira entre as clulas que o expressam e as que no o expressam, aquela regio da AER original no se forma. A formao da AER pode envolver uma interao entre a secreo de FGFs (tal como FGF8) pelo mesoderma e o limite de expresso de radical fringe ao longo da borda dorsoventral do ectoderma. A secreo limitada de FGFs pode ser crtica na identificao de quais clulas, ao longo do flanco dorsoventral do embrio produzem os brotos do membro. Ainda no se conhece como a borda entre expresso e no expresso de radical fringe e os FGFs induzem a formao da AER.
Produo do eixo prximo-distal dos membros

Formao de uma AER ectpica quando tecido ventral transplantado para o tecido dorsal do broto do membro. (A) Procedimento onde ectoderma ventral de um broto do membro posterior de pinto transplantado para a superfcie dorsal de um broto do membro posterior hospedeiro, no mesmo estgio. (B) Aps 26 horas de incubao se forma uma AER ectpica (a AER original est indicada por uma flecha e a AER ectpica por uma cabea de flecha). (C) Enquanto a AER se forma, a expresso de radical fringe (cabea de flecha) no broto do membro se torna confinada s clulas dorsais na juno D/V que formar a AER. (de Laufer et al., 1997; fotografias cortesia de E. Laufer.)
Estgio 18/19 Broto da perna do hospedeiro (A)
A crista ectodrmica apical: O componente ectodrmico O crescimento prximo-distal e a diferenciao do broto do membro possibilitado por uma srie de interaes entre o mesnquima do broto do membro e a AER (Figura 18.11; Harrison, 1918; Saunders, 1948): 1. Quando a AER removida em qualquer tempo durante o desenvolvimento do membro, cessa o desenvolvimento posterior de elementos esquelticos do membro distal.
(B)
(C)
Estgio 18/19 Jaqueta ectodrmica do doador
Somitos
Enxerto ectodrmico
AER
707
Estgio 15
Estgio 16
Estgio 17
Estgio 18
Figura 18.10
AER Induzido por Fgf8 Anterior Posterior shh induzido por FGF8 Somitos Mesoderma intermedirio Mesoderma da placa lateral shh mantido por FGF8 +FGF4 Fgf4 induzido por Shh Proliferao mantida por FGF8 Proliferao mantida por FGF8 + FGF4
Sinal dependente de Fgf8?
Ectoderma superficial
Fgf8 (Fator de crescimento dos fibroblastos) shh (sonic hedgehog) Fgf4 +Fgf8
Um modelo molecular para a iniciao do broto do membro. FGF8 secretado pelo mesoderma intermedirio e/ou expresso de radical fringe na margem ectodrmica induz a expresso de FGF8 no ectoderma superficial que a recobre. A borda ntero-posterior est presente no estgio 16 (e talvez antes). A secreo de FGF8 pelo ectoderma induz a proliferao nas clulas mesenquimais e induz a expresso de Sonic hedgehog na regio posterior do broto do membro. A Sonic hedgehog induz a expresso de FGF4 na poro posterior do ectoderma do broto do membro. A FGF2 tambm produzida pelo ectoderma, apesar de no estar claro se induzido pelo FGF8 do mesoderma mesofrnico. (De acordo com Crossley et al., 1995.)
2. Quando uma AER extra enxertada em um broto de membro existente, so formadas estruturas supranumerrias, freqentemente na direo da extremidade distal do membro. 3. Quando mesnquima da perna colocado diretamente abaixo da AER da asa, se desenvolvem estruturas distais do membro posterior (artelhos) na ponta do membro. (Entretanto, se esse mesnquima colocado mais longe da AER, o mesnquima do membro posterior se integra s estruturas da asa.) 4. Quando mesoderma no proveniente de membros enxertado abaixo da AER, a AER regride e o desenvolvimento do membro cessa.
AER removida Cessa desenvolvimento do membro
AER extra Asa
Mesoderma do membro anterior Asa
Perna
Mesoderma da Perna
AER regride; cessa desenvolvimento do membro Mesoderma no de membro
Figura 18.11
Sumrio do efeito da crista ectodrmica apical (AER) sobre o mesnquima subjacente. (Modificado de Wessells, 1977.)
708
Figura 18.12
Corte transversal atravs da regio distal de um membro de pinto, 3 dias aps a retirada de uma fatia de AER de uma rea que formaria tecido interdigital. Em lugar de degenerar, o tecido interdigital remanescente formou um dgito extra. (de Hurle et al., 1989, cortesia dos autores.)
Portanto, apesar das clulas mesenquimatosas induzirem e sustentarem a AER, e determinarem o tipo de membro a ser formado, a AER ainda a responsvel pelo contnuo crescimento e desenvolvimento do membro (Zwilling, 1955; Saunders et al., 1957; Saunders, 1972; Krabbenhoft e Fallon, 1989). A AER mantm o mesnquima diretamente subjacente em um estado de proliferao mittica e impede a formao de cartilagem pelas clulas mesenquimatosas. Hurle e colaboradores (1989) mostraram que pelo corte de pequena poro da AER de uma regio que normalmente cairia entre os dgitos da perna do pinto, um dgito extra emerge naquele lugar (Figura 18.12). Parece mesmo que uma funo da AER manter as clulas mesenquimatosas se proliferando e, portanto, impedindo que formem cartilagem. A zona progressiva: O componente mesodrmico O eixo prximo-distal definido somente aps a induo da crista ectodrmica apical pelo mesoderma subjacente. O broto do membro se alonga pela proliferao das clulas mesenquimatosas abaixo da AER. Essa regio de diviso celular chamada zona progressiva, e se estende cerca de 200 m para dentro da AER. Considera-se que as molculas da AER mantm as clulas mesenquimatosas da zona progressiva em diviso e que essas molculas responsveis so os FGFs (Savage e Fallon, 1995; Crossley et al., 1996). Quando as clulas mesenquimatosas deixam a zona progressiva, elas se diferenciam de maneira regionalmente especfica. As primeiras clulas deixando a zona progressiva formam as estruturas proximais; aquelas clulas que sofreram numerosas divises na zona progressiva se tornam as estruturas mais distais (Saunders, 1948; Summerbell, 1974). Portanto, quando a AER removida de um broto de asa em estgio precoce, as clulas da zona progressiva param de se diferenciar e somente um mero se forma. Quando a AER removida um pouco mais tarde, se formam o mero, o rdio e o cbito (Figura 18.13; Rowe et al., 1982). A polaridade prximo-distal reside no compartimento mesodrmico do membro. Se a AER fornece a informao posicional- de certa maneira instruindo o mesoderma subjacente, no diferenciado, sobre quais estruturas produzir- ento as AERs mais velhas combinadas com mesoderma mais jovem deveriam produzir membros com delees na sua parte mediana, enquanto as AERs mais jovens combinadas com mesoderma mais velho deveriam produzir duplicaes de estruturas. Mas no foi isso o que se encontrou (Rubin e Saunders, 1972). Ao contrrio, se formaram membros normais em ambos os experimentos. Mas quando a zona progressiva inteira, incluindo o mesoderma e a AER de um embrio precoce foi colocada no broto do membro de um embrio em estgio mais avanado, novas estruturas proximais foram produzidas alm daquelas j presentes. Inversamente, quando zonas progressivas mais velhas so adicionadas a brotos de membros jovens, imediatamente se desenvolveram estruturas distais, de tal forma que se viu dgitos emergindo do mero, sem o rdio e o cbito intermedirios (Figura 18.14; Summerbell e Lewis, 1975).
709
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
Figura 18.13
Vista dorsal do padro esqueltico do pinto aps remoo total da AER do broto da asa direita de embries em vrios estgios. A ltima foto (E) do esqueleto de uma asa normal. (de Iten, 1982, cortesia de L. Iten.)
Genes Hox e a especificao do eixo prximo-distal do membro A anlise de mutaes naturais ou experimentalmente induzidas deu origem a hiptese de que os genes Hox 5 (Abdominal-B) especificam pores individuais do eixo prximo-distal do membro. As extremidades 5 da srie de genes parlogos Hoxa e Hoxd (parlogos 9-13) parecem ser ativas no broto do membro anterior do camundongo. Davis e colegas (1995) eliminaram todos os quatro locus para os genes parlogos Hoxa-11 e Hoxd-11. (No existem genes Hoxb-11 em camundongo, e Hocx-11 no bem expresso no membro anterior, apesar de s-lo no membro posterior.) Os camundongos resultantes no tinham o cbito e o rdio de seus membros anteriores (Figura 18.15A,B). Com base nos padres de expresso dos genes das sries Hoxa e Hoxd, onde os genes mais 5 dos conjuntos Hox so expressos mais distalmente, esses
Figura 18.14
Controle da especificao prximo-distal por clulas da zona progressiva (PZ). (A) Conjunto extra de cbito e rdio formado quando PZ de broto precoce transplantada para o broto tardio da asa que j formou o cbito e o rdio. (B) Falta de estruturas intermedirias observada quando a PZ de broto tardio transplantada para broto precoce de membro. A posio das dobradias indica o local dos enxertos. (de Summerbell e Lewis, 1975, cortesia de D. Summerbell.)
(A)
(B)
710
(A)
(C)
Grupos parlogos de Hox cognatos
(B)
(D)
Figura 18.15
Deleo de elementos sseos do membro por deleo dos genes Hox parlogos. (A) Membro anterior de camundongo tipo selvagem. (B) Membro anterior de camundongo produzido duplamente mutante, com a falta funcional dos genes Hoxa-11 e Hoxd-11. O cbito e o rdio esto ausentes. (C) Sinpolidactilia resultante de homozigosidade nos locos HOXD-13. (D) Hiptese considerando que os parlogos 5 dos genes Hox poderiam especificar determinadas regies do membro anterior. (A, B e D de acordo com Davis et al., 1995; fotografia cortesia de M. Capecchi. C de Muragaki et al., 1996, cortesia de B. Olsen.)
pesquisadores propuseram um modelo onde os genes parlogos especificam a identidade de uma regio do membro (Figura 18.15D). Esse modelo est sendo testado e faz previses bvias em relao ao fentipo de outros camundongos com dupla ou tripla eliminao (quando os parlogos 13 ou 12 so deletados). Esse modelo tem suporte na anlise de duas mutaes naturais. Camundongos homozigotos para um alelo de perda-de-funo de Hoxa-13 apresentam severa malformao nas quatro patas, que desenvolvem somente um dgito, uma verso malformada do dgito 4 (Mortlock et al., 1996). Homozigotos humanos para uma mutao de perda-de-funo de Hoxd-13 mostram anormalidades nos ps e nas mos onde ossos metacrpicos e metatrsicos so transformados em ossos crpicos e trsicos curtos. Isso resulta na fuso dos dgitos (Figura 18.15C; Muragaki et al., 1996). Em ambos os casos, o autpodo (a poro mais distal do membro) afetado pela perda-de-funo do gene Hox mais 5. O mecanismo pelo qual os genes Hox
711
podem especificar o eixo prximo-distal ainda no est esclarecido, mas uma pista vem da anlise do Hoxa-13 de galinha. A expresso ectpica desse gene (que usualmente expresso nas extremidades distais dos membros em desenvolvimento do pinto) parece tornar mais pegajosas as clulas que o expressam. Isso, por sua vez, causaria condensao de ndulos cartilaginosos em formas especficas (Yokouchi et al., 1995; Newman, 1996). Interaes entre a AER e a zona progressiva Os sinais moleculares da interao entre a AER e o mesnquima da zona progressiva esto comeando a ser identificados. A diviso das clulas mesenquimatosas na zona progressiva parece ser regulada pela secreo de membros da famlia FGF, tais como FGF2 (Fallon et al., 1994), FGF4 (Niswander et al., 1993) e FGF8 (Mahmood et al., 1995; Crossley et al., 1996; Vogel et al., 1996). Considera-se que esses fatores de crescimento do fibroblasto so secretados da AER para o mesnquima adjacente (veja Capa; Figura 18.16). Ainda mais, se a AER removida, ela poder ser substituda pela implantao de partculas esfricas (contas) cheias de FGF2, FGF8 ou FGF4 (Figura 18.17). Parece, portanto, que a AER promove o crescimento pela secreo de fatores de crescimento do fibroblasto (Crossley et al., 1996; Vogel et al., 1996). O FGF8 uma das primeiras molculas identificadas na regio do ectoderma que se torna a AER, e sua expresso crtica no crescimento do broto do membro (Figura 18.16). Mutaes nas interaes entre a zona progressiva e a AER A relao entre a AER e o mesnquima do broto do membro pode ser melhor apreciada em mutaes no desenvolvimento de membros do pinto. A mutao polydactylous, como o nome sugere, adiciona dgitos extras em cada membro. Recombinando tecidos
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 18.16
FGF8 e morfognese de membros. (A) Hibridizao in situ mostrando expresso da mensagem de Fgf8 no ectoderma enquanto o broto do membro comea a se formar. (B) Expresso do RNA Fgf8 na crista ectodrmica apical, a fonte de sinais mitticos para o mesoderma subjacente. (C) Em embries normais de pinto (estgio 17; cerca de 24 horas), FGF8 expresso na crista ectodrmica apical de ambos os brotos do membro, anteriores e posteriores. tambm expresso em vrios outros lugares no embrio. (D) No mutante limbless de galinha, FGF8 no expresso nos brotos do membro, apesar de no estar perdido em outras regies do embrio. Aqui, os brotos do membro se formam mas no se desenvolvem em membros (A e B cortezia de J. C. Izpisa Belmonte; C e D cortesia de A. Lpez-Martnez e J. F. Fallon.)
712
(A)
Remover AER
20 horas Forma o mero
Sem AER (B)
Remover AER
Adicionar partcula com soluo salina
20 horas
Forma o mero
Partcula
(C)
Remover AER
Adicionar partcula contendo FGF2
20 horas
mero Rdio Cbito Partcula
(D)
Dgitos mero Rdio Cbito Remover AER Adicionar partcula contendo FGF2 24 horas Implantar segunda partcula contendo FGF2 20 horas
Segunda partcula
Carpos
Figura 18.17
Habilidade de FGF2 para substituir a crista ectodrmica apical no broto do membro anterior em desenvolvimento do pinto. (A) Quando a AER removida dos brotos da asa do pinto no estgio 20, somente se forma o mero. (B) Se uma partcula gelatinosa de lenta liberao embebida em soluo salina colocada no mesnquima da zona progressiva, o membro ainda fica truncado e forma somente o mero. (C) Quando um broto embebido em FGF2 colocado na zona progressiva o crescimento do broto do membro continua, e o cbito e o rdio so formados. (D) Se uma segunda partcula contendo FGF2 colocada na zona progressiva aps a dissipao da maioria do FGF2 da primeira partcula, o broto do membro continua a crescer e a produzir metacarpos e dgitos. (De acordo com Fallon et al., 1994.)
713
Tabela 18.1
Mutaes que afetam as interaes recprocas entre a AER e seu mesnquima subjacentea
Epiderme Resultado Concluso
Mesoderma POLIDCTILO Polidctilo Tipo selvagem EUDIPLOPODIA Eudiplopodia Tipo selvagem LIMBLESS Limbless Tipo selvagem
Tipo selvagem Polidctilo
Polidctilo Tipo selvagem
Mesoderma afetado pela mutao
Tipo selvagem Eudiplopodia
Tipo selvagem Eudiplopodia
Ectoderma afetado pela mutao
Tipo selvagem Limbless
Tipo selvagem Limbless
Ectoderma afetado pela mutao
aPor transplante recproco entre o tipo selvagem e AER mutante e mesnquima, o compartimento aberrante da induo pode ser identificado.
mutantes e do tipo selvagem (Tabela 18.1), os defeitos podem ser traados para as clulas mesodrmicas que induzem amplamente uma AER. No mutante eudiplopodia (Grego, dois bons ps), alm dos dgitos extras aparecem duas seqncias completas de dedos em cada membro posterior (Figura 18.18). Experimentos semelhantes com reconstituio mostram que aqui o defeito est no tecido ectodrmico. Embries de pintos homozigotos para a mutao limbless iniciam a formao do broto do membro, mas a AER no se forma. Experimentos de recombinao mostram que o ectoderma de limbless incapaz de formar uma AER, mesmo quando colocado no mesoderma de membro do tipo selvagem; uma crista normal pode ser formada quando ectoderma normal enxertado no campo do membro em lugar do ectoderma mutante (Figura 18.19; Carrington e Fallon, 1988). Alm disso, existem vertebrados naturalmente sem membros, cuja falta de membros pode ser relacionada s deficincias na interao AER-mesnquima. A praga contra cobras no Livro do Gnesis parece ter sido dirigida extremidade distal do broto do membro, pois a AER desses rpteis degenera-se prematuramente e ao mesmo tempo em que ocorre a morte celular no mesnquima adjacente (Lande, 1978). No se sabe se o defeito inicial est no mesnquima ou na AER. [limb3.html]
(A)
(B)
Figura 18.18
Seces transversais dos brotos dos membros posteriores em eudiplopodia de embries de pinto. (A) Duas AERs no broto do membro posterior; crescimento extra no lado dorsal formar um conjunto extra de dedos. (B) Ambas as regies de crescimento esto cobertas por uma AER. Recentemente foi demonstrado (Laufer et al., 1997) que duas reas de radical fringe aparecem no broto do membro desse mutante, e cada uma se associa com a nova AER. (De Goetinck,1964, cortesia de P. Goetinck.)
714
Figura 18.19
O embrio limbless no forma AER, e o defeito parece residir no ectoderma. Se o ectoderma de codorna do tipo selvagem substitui o ectoderma mutante do pinto na regio que forma o membro anterior, a asa se desenvolver naquele lado do embrio. No se forma outro membro. (De acordo com Carrington e Fallon, 1988; fotografia cortesia de J. Fallon.)
A regenerao dos membros da salamandra e a reteno do eixo prximo-distal

REQENTEMENTE TIL encontrar modelos adultos de desenvolvimento embrionrio. Durante dois sculos, a regenerao do membro de anfbios foi no somente uma das mais extraordinrias demonstraes de regulao, mas tambm um modelo para o desenvolvimento do membro tetrpode nos vertebrados. Quando um membro da salamandra amputado, as clulas remanescentes so capazes de reconstruir um membro completo com todas suas clulas diferenciadas organizadas de maneira correta. extraordinrio que no s o membro tenha sido regenerado, mas tambm que as clulas que ficaram mantiveram a informao especificando sua prpria posio como tambm a das clulas removidas. Em outras palavras, as novas clulas constroem somente as estruturas perdidas e nada mais; por exemplo, quando um punho amputado, a salamandra forma um novo punho e no um novo cotovelo (Figura 18.20). De certa maneira, o membro da salamandra sabe onde o eixo prximodistal foi cortado e pode regener-lo daquele ponto em diante. Oscar Schott disse que daria seu brao direito para conhecer o segredo da regenerao do membro (em Goss, 1991). Ao se amputar um membro, forma-se um cogulo de plasma; e dentro de 6-12 horas, clulas epidrmicas do coto remanescente,
&
Especulaes
Figura 18.20
Regenerao do membro anterior da salamandra. Na esquerda, a amputao foi feita abaixo do ombro; a amputao mostrada direita cortou atravs do mero. Em ambos os casos, a informao posicional correta foi reespecificada. (de Goss, 1969, cortesia de R. J. Goss)
migram para cobrir a superfcie do ferimento, formando a epiderme do ferimento. Essa estrutura em monocamada necessria para a regenerao do membro. Ela se prolifera para formar o hemisfrio ectodrmico apical. A inervao do membro se degenera em uma curta distncia a partir do plano de amputa-
o (veja Chernoff e Stocum, 1995). Durante os prximos 4 dias as clulas abaixo do hemisfrio em desenvolvimento sofrem uma dramtica desdiferenciao: clulas sseas, clulas da cartilagem, fibroblastos, micitos e clulas neurais perdem suas caractersticas diferenciadas e se destacam umas das outras. Genes expressos em tecidos diferenciados (como os genes MRF4 e Myf5 expressos em clulas musculares) so reprimidos, enquanto h um dramtico aumento na expresso de genes, tal como msx1, que so associados com o mesnquima da zona progressiva em proliferao (Simon et al., 1995). Portanto, a bem estruturada regio do membro, na face cortada do toco, forma uma massa proliferante de clulas indistintas e desdiferenciadas, logo abaixo do hemisfrio ectodrmico apical. Essa massa de clulas desdiferenciadas chamada de blastema de regenerao, e essas clulas continuaro a se proliferar e se diferenciar para formar as novas estruturas do membro. Se as clulas do blastema forem destrudas, a regenerao no se dar (Butler, 1935). Ainda mais, uma vez que as clulas se desdiferenciaram para formar um blastema, elas recuperaram sua plasticidade embrionria. Na maioria dos casos, entretanto, o tecido neural essencial para a formao do novo membro pelas outras clulas. Singer (1954) demonstrou que um nmero mnimo
715
(A)
(B)
Figura 18.21
Efeitos da vitamina A (um retinide) em membros de salamandra em regenerao. (A) Membro normal regenerado de axolotle (9x) com mero, rdio e cbito pareados, carpos e dgitos. A linha pontilhada mostra o plano de amputao. (B) Regenerao aps a amputao atravs da rea do corpo, mas aps a colocao do blastema do membro em palmitato de retinol por 15 dias. Aparecem um novo mero, cbito, rdio, conjunto de carpos e conjunto de dgitos (5x). (de Maden et al., 1982; fotografias cortesia de M. Maden.)
de fibras nervosas devem estar presentes para que se d a regenerao. Considerase que os neurnios liberam um fator estimulante de mitose que aumenta a proliferao das clulas do blastema (Singer e Caston, 1972; Mescher e Tassava, 1975). Aps uma fase inicial dependente de neurnios, a regenerao pode prosseguir sem estimulao neural. Um candidato para essa substncia neural crucial o fator de crescimento da glia (GGF). Sabe-se que esse peptdeo produzido pelas clulas neurais da salamandra aqutica, est presente no blastema e perdido na enervao. Quando o GGF adicionado ao blastema enervado, as clulas mitoticamente reprimidas so aptas a dividir-se novamente (Brockes e Kinter, 1986). Outro candidato a transferrina, uma protena transportadora de ferro que necessria para a mitose
em todas as clulas em diviso (pois a redutase ribonucleotdica, a enzima limitante da velocidade na sntese de DNA, requer um on frrico no seu stio ativo). Quando so removidos os membros posteriores, o nervo citico transporta a transferrina pelo axnio e libera grandes quantidades dessa protena no blastema (Munaim e Mescher, 1986; Mescher, 1992). Tanto extratos neurais como transferrina so capazes de estimular a diviso celular em membros enervados, e a quelao dos ons frricos nos extratos neurais impede sua atividade mittica (Munaim e Mescher, 1986; Albert e Boilly, 1988). Um terceiro candidato o FGF2. Mullen e colaboradores (1996) mostraram que o hemisfrio ectodrmico apical transcreve grandes quantidades de Dlx3, um homlogo anfbio de Distal-less de Drosophila. Durante os estgios de regenerao dependentes de neurnios, a expresso ectodrmica de Dlx3 dependente da inervao. Existe uma correlao entre a presena de Dlx3 e uma epiderme permissiva de crescimento. Nos estgios tardios da regenerao, a expresso de Dlx3 no depende dos neurnios. Se membros amputados so enervados em um estgio dependente de neurnios, a expresso de Dlx3 e a regenerao podem ser mantidas por partculas contendo FGF2 (Mullen et al., 1996). O cido retinico parece ter uma funo importante tanto na desdiferenciao das clulas para formar o blastema de regenerao como no processo de reespecificao quando as clulas rediferenciam. Se os blastemas de membros de salamandra em regenerao so mergulhados em solues com concentraes adequadas de cido retinico (ou outros retinides), os membros em regenerao tm duplicaes ao longo do eixo prximo-distal (Figura 18.21; Niazi e Saxena, 1978; Maden
Soluo controle
1982). Um membro completo (comeando do osso mais proximal) se desenvolve a partir do coto do membro, independentemente do nvel original da amputao. possvel que o cido retinico cause a reespecificao das clulas para a posio mais proximal (Figura 18.22; Prancha 9; Crawford e Stocum, 1988b). O cido retinico sintetizado na epiderme do ferimento do membro em regenerao, formando um gradiente ao longo do eixo prximo-distal do blastema (Brockes, 1992; Scadding e Maden, 1994). Esse gradiente de cido retinico pode ativar os genes diferencialmente em regies diferentes do blastema. Um dos genes responsivos ao cido retinico o msx1 que associado proliferao do mesnquima (Shen et al., 1994; Viviano et al., 1995). Outro conjunto de genes que podem ser reespecificados pelo cido retinico so os genes HoxA. Gardiner e colaboradores (1995) mostraram que o padro da expresso de certos genes HoxA nas clulas distais do blastema em regenerao modificado pelo cido retinico exgeno para um padro de expresso caracterstico de clulas mais proximais. provvel que durante a regenerao normal, a epiderme do ferimento/hemisfrio ectodrmico apical secrete cido retinico que ativa os genes necessrios para a proliferao celular, reprima os genes especficos para clulas diferenciadas e, finalmente, ative um conjunto de genes Hox que orientam as clulas quanto ao lugar onde esto e quanto devem crescer. O mecanismo pelo qual isso realizado pelos genes Hox no conhecido, mas foram verificadas variaes tanto na adeso clula-clula como em outras qualidades de superfcie das clulas (Nardi e Stocum, 1983; Stocum e Crawford, 1987; Bryant e Gardiner, 1992).
Soluo de cido retinico
Blastema forma punho e dgitos
Colocar blastema de punho doador na regio do ombro do membro cortado do hospedeiro
BLASTEMA
de punho doador
Colocar blastema de punho doador na regio do ombro do membro cortado do hospedeiro
Proximalizao dos destinos do blastema
Figura 18.22 - Blastemas de punho de membros de axolotle recentemente cortados regeneram
o punho quando colocados em membros hospedeiros cortados na rea do ombro (Veja Captulo 3). Entretanto, se forem colocados em soluo de cido retinico, esses blastemas comearo a se regenerar no local onde foram colocados no tecido hospedeiro, e geram estruturas proximais quelas do punho. (Dados de Crawford e Stocum, 1998a,b.)
716
Assim, estamos frente a uma situao onde as clulas adultas de um organismo podem retornar a uma condio embrionria e comeam novamente a formao de um membro. Exatamente como no desenvolvimento embrionrio, o blastema forma sucessivamente estruturas mais distais (Rose, 1962). Portanto, o blastema deve conter alguma informao posicional que informa ao blastema de um coto
contendo um mero, que no deve produzir outro mero e nem comear imediatamente a produzir dgitos. No somente o blastema regenera essas estruturas comeando no nvel prximo-distal apropriado no membro, como tambm as polaridades dos eixos ntero-posterior (polegar-dedo mnimo) e dorsoventral (punhopalma da mo) tambm correspondem quelas do coto.
Especificao do eixo ntero-posterior dos membros

A zona de atividade polarizante Uma autodiferenciao do eixo ntero-posterior a primeira modificao da condio pluripotente. Em pintos, esse eixo especificado muito antes que o broto do membro seja reconhecvel. Hamburger (1938) mostrou que j no estgio precoce de 16 somitos, o mesoderma prospectivo da asa transplantada para a rea do flanco se desenvolve em um membro com as polaridades ntero-posterior e dorsoventral do enxerto doado e no daquelas do tecido hospedeiro (Figura 18.23).
Anterior
Dorsal
Ventral
Desenvolvimento normal dos brotos do membro nas asas
Posterior
Brotos enxertados diferem do hospedeiro no eixo dorsoventral
Relacionamento de eixos entre enxerto (sombreado) e hospedeiro
Brotos enxertados diferem do hospedeiro no eixo ntero-posterior
Figura 18.23
Especificao dos eixos ntero-posterior e dorsoventral na asa do pinto. O broto do membro enxertado se desenvolve de acordo com sua prpria polaridade e no adota a polaridade do seu hospedeiro. As asas que se desenvolvem dos brotos do membro enxertados esto coloridas. Para maior clareza, as asas que o hospedeiro normalmente desenvolve no esto apresentadas. (De acordo com Hamburger, 1938.)
Brotos enxertados diferem do hospedeiro nos eixos ntero-posterior e dorsoventral
717
Estgio 17
Figura 18.24
Dgitos duplicados aparecem como imagem espelhar de dgitos normais quando ZPA enxertada no mesoderma do broto do membro anterior. (de Honig e Smmerbell, 1985, fotografia cortesia de D. Summerbell.)
Estgio 19
Considera-se que a diferenciao das estruturas prximo-distais depende do nmero de divises realizadas pela clula enquanto na zona progressiva, mas a informao posicional instruindo a clula quanto sua posio nos eixos ntero-posterior e dorsoventral deve vir de outras fontes. Vrios experimentos (Saunders e Gasseling, 1968; Tickle et al.,1975; Summerbell, 1979) sugerem que o eixo ntero-posterior especificado por um pequeno bloco de tecido mesodrmico perto da juno posterior do jovem broto do membro com a parede do corpo. Quando esse tecido de um jovem broto de membro transplantado para uma posio no lado anterior de outro broto de membro (Figura 18.24), o nmero de dgitos na asa resultante duplicado. Alm disso as estruturas do conjunto extra de dgitos a imagem espelhar daquelas estruturas normalmente produzidas. A polaridade foi mantida, mas agora a informao vem ao mesmo tempo das direes anterior e posterior. Essa regio do mesoderma chamada de zona de atividade polarizante (ZPA). A distribuio e a fora da atividade de sinalizao posicional da ZPA na asa do pinto e brotos da perna foram mapeados (Hinchliffe e Sansom, 1985; Honig e Summerbell, 1985). Como indicado nos desenhos da Figura 18.25, a atividade polarizante (medida aps o enxerto das clulas marginais posteriores na margem anterior do broto do membro) maior em uma regio determinada da margem posterior e de l vai diminuindo. A atividade enfraquece enquanto progride o desenvolvimento. ZPA Sonic hedgehog como definidor da ZPA A procura de molcula(s) conferindo atividade polarizante ao broto do membro do pinto se tornou uma das mais intensas buscas da biologia do desenvolvimento. Os candidatos atuais a fatores da ZPA foram identificados a partir de estudos que assumiram uma homologia evolucionria dos sistemas reguladores do desenvolvimento entre a Drosophila e os vertebrados. Como deve ser lembrado do Captulo 16, os genes hometicos da Drosophila tm contrapartidas nos vertebrados os quais tm
Figura 18.25
Estgio 21
Estgio 23
Estgio 25
Estgio 27
Mapa da atividade sinalizadora de posio enquanto o membro se desenvolve. As cores representam a intensidade de expresso de sonic hedgehog. Os nmeros representam a porcentagem de enxertos mostrando duplicaes completas quando essas regies foram transplantadas para a margem anterior do broto do membro precoce. (Desenhos de acordo com Honig e Summerbell, 1985, dados de expresso de Riddle et al., 1993.)
Estgio 29
718
Transfectar vrus expressando shh e permitir que o vrus se espalhe
Figura 18.26
Cepa infectvel de clulas fibroblsticas do embrio de pinto Clulas compactadas por centrifugao
Ensaio para a atividade polarizante de Sonic hedgehog. O gene sonic hedgehog foi inserido no promotor ativo de um vrus de pinto, e o vrus recombinante colocado em clulas fibroblsticas cultivadas de embrio de pinto. As clulas infectadas pelo vrus foram compactadas e implantadas na margem anterior do broto do membro de um embrio de pinto resistente infeco por esse vrus. O vrus no podia infectar o hospedeiro, mas podia expressar e secretar altos nveis de Sonic hedgehog. Os membros resultantes mostraram que o material secretado tinha atividade polarizante. (De acordo com Riddle et al., 1993.)
Implante na poro anterior do broto do membro (Embrio no estgio 19-23)
Anterior Cepa resistente do embrio hospedeiro Plete de clulas secretando Shh Posterior
funes desenvolvimentais crticas. E como foi mencionado no Captulo 14, o gene hedgehog responsvel pela polaridade de segmentos parece codificar uma protena difusvel que interage com as clulas vizinhas. Seria muito perguntar se existe um homlogo nos vertebrados que realiza uma funo semelhante? Usando a seqncia conhecida do gene hedgehog em Drosophila, Riddle e seus colaboradores (1993), usaram a reao da cadeia de polimerase para identificar uma mensagem semelhante a hedgehog em brotos de membros de pinto. Eles nomearam o gene como sonic hedgehog*. Hibridizao in situ mostrou que a expresso de sonic hedgehog no se d no broto do membro inteiro, mas localizada exatamente na regio que, segundo Honig e Summerbell, contm a maior atividade de ZPA (Figura 18.25). Riddle e colaboradores mostraram que a secreo da protena Sonic hedgehog poderia ser suficiente para a atividade de ZPA. Eles transfectaram fibroblastos embrionrios de pinto (que normalmente nunca sintetizariam essa protena) com um vetor viral contendo o gene sonic hedgehog (Figura 18.26). O gene foi expresso e traduzido nesses fibroblastos, os quais foram inseridos em uma crista anterior de um broto de membro precoce do pinto. Foi demonstrada tambm a reverso de polaridade dos dgitos, de maneira semelhante ZPA. Mais recentemente, partculas contendo a protena Sonic hedgehog provocaram as mesmas duplicaes (Lpez-Martinez et al., 1995). Portanto, a Sonic hedgehog parece ser o agente ativo da ZPA. ZPA Interaes entre a AER e a ZPA para integrar crescimento e padro Como Sonic hedgehog determina o padro ntero-posterior do membro? Pesquisas recentes indicam que a protena no age sozinha e que a cooperao com sinais da AER crtica para sua funo. Essas interaes podem estabelecer padres de expresso do gene Hox que especificariam o eixo ntero-posterior.
SONIC HEDGEHOG COMO INICIADOR DE SECREO DE MORFGENOS. Ain-
da no se sabe como a ZPA especifica o eixo ntero-posterior. Um modelo sugere que sinais de curto alcance especificam as clulas que produziro os dgitos e que essas clulas migram atravs do broto do membro (Figura 18.27A). Entretanto, essa migrao no foi observada. Isso conduz a dois outros modelos. No modelo da cascata indutiva (Figura 18.27B), uma progresso de sinais de curto alcance sucessivamente propagada da ZPA para os tecidos responsivos. Portanto, Sonic hedgehog no se difunde atravs do broto do membro em um gradiente suavemente decrescente. Em lugar disso, Sonic hedgehog se difunde a uma curta distncia e induz as clulas
*Sim, como o personagem do desenho Sega. O gene hedgehog em Drosophila, como na maioria dos genes, tem o nome do seu fentipo mutante. (Isso causa muita confuso. Os genes para falta de olhos ou de membros so na verdade aqueles genes cujos produtos impedem essas deficincias.) Em Drosophila, a deficincia da expresso do hedgehog resulta em uma cutcula tendo mais dentculos pontiagudos, portanto, parecendo um hedgehog (porco-espinho).
719
(A) Sinalizao de curto alcance e deslocamento Difuso de curto alcance
(B)
Sinalizao seqncial de curto alcance
(C)
Espalhamento progressivo de um sinal graduado e promoo em uma via Difuso de alcance mais longo com o passar do tempo
Figura 18.27
Modelos de atividade da ZPA. (A) Modelo de funo da ZPA por sinalizao de curto alcance e subseqente deslocamento do tecido especificado. (B) Modelo de funo da ZPA por sinais seqenciais de curto alcance. (C) Modelo de funo de ZPA por espalhamento progressivo de um sinal graduado, onde o tecido responsivo responde a gradiente de concentrao. (De acordo com Tickle, 1995.)
responsivas a secretar outra protena. Essa segunda protena se difunde tambm em uma curta distncia para ativar as clulas na sua vizinhana e essas clulas secretam uma terceira protena, e assim por diante. Dessa maneira, uma srie de sinais enviada da fonte de Sonic hedgehog em direo parte anterior do broto do membro (veja Lpez-Martnez et al., 1995). O terceiro modelo chamado de modelo do morfgeno solvel (Figura 18.27C; Wolpert, 1969, 1977; Tickle, 1981) onde o tecido responde de maneira diferente a diferentes concentraes de molculas solveis secretadas pela ZPA. Inicialmente, o tecido mais perto da ZPA recebe baixas concentraes do morfgeno e especificado para ser o dgito mais distal. Entretanto, ao continuar a secreo, aquele tecido exposto a uma maior concentrao e reespecificado como um dgito mais proximal (posterior). A prxima regio de clulas, ligeiramente mais afastada da ZPA, recebe uma baixa concentrao do morfgeno e se torna especificada para estruturas mais distais (anteriores). Isso continua at que todos os dgitos so especificados atravs do broto do membro. Nenhum dos dois ltimos modelos foi excludo, mas existe evidncia que mesmo que a Sonic hedgehog defina ou energiza a ZPA, a protena no o morfgeno solvel responsvel pela especificao dos dgitos. Deve existir uma cascata de sinais indutivos. Foi demonstrado que a parte ativa da protena Sonic hedgehog a sua regio N-terminal, que cindida do resto da protena em membros do pinto. Essa extremidade ativa pode se difundir da clula, mas essa difuso no vai muito longe de sua fonte no broto do membro posterior (Lpez-Martnez et al., 1995). Quando ela se
720
FGF4 cido retinico
Manter proliferao na zona progressiva; ativar a expresso do gene HoxD
Desenvolvimento esqueltico posterior
Wnt7a Sonic hedgehog
Figura 18.28
Algumas interaes moleculares pelas quais o broto do membro iniciado e mantido. Padro de expresso dinmica do gene HoxD durante uma parte da morfognese da asa do pinto. Algumas das principais ligaes incluem (1) a manuteno de Sonic hedgehog (Shh) pela combinao de Wnt7a e FGF4; (2) a manuteno de Shh pela combinao de cido retinico e FGF4; (3) a induo recproca de FGF4 e Shh para a manuteno de cada um; (4) a interao entre FGF4 e Shh para ativar a expresso dos genes HoxD e para manter a diviso celular no mesnquima da zona progressiva. (De acordo com Nelson et al., 1996; Niswander et al., 1994.)
difunde, parece ativar protenas morfogenticas do osso, especialmente a BMP2 (Francis et al., 1994; Laufer et al., 1994). Essas protenas tambm no se difundem para muito longe, e pesquisadores esto a procura de outras molculas que podem ser ativadas pelas protenas morfogenticas do osso.
SONIC HEDGEHOG COMO CO-ATIVADOR DE GENES HOX E PROLIFERAO CELULAR. Alm da ativao dos genes para as protenas morfogenticas do osso
(especialmente a BMP2), existem outros dois importantes alvos para Sonic hedgehog. O primeiro conjunto de alvos podem ser os genes Hoxd 5 (Figura 18.28; Hoxd-9 a Hoxd-13). Durante o desenvolvimento normal dos membros de pinto ou camundongo, desenvolve-se um padro caracterstico de expresso de genes Hoxd concentricamente aninhados e centrados na margem posterior que tinha sido definida como a ZPA (Doll et al., 1989; Nelson et al., 1996). A regio mais prxima do centro tem todos esses genes Hoxd 5 expressos, mas a expresso desses genes cai seqencialmente medida que as clulas esto progressivamente mais afastadas da ZPA. Alm disso, o transplante de ZPA ou de clulas secretoras de Sonic hedgehog para a margem anterior leva formao de padres de imagens espelhares na expresso dos genes Hoxd e padres de imagens espelhares de dgitos (Izpisa-Belmonte et al., 1991; Nohno et al., 1991; Riddle et al., 1993). Originalmente parecia haver um cdigo pelo qual a expresso dos diferentes genes HoxD especificaria o padro ntero-posterior dos dgitos, mas estudos recentes mostram que o problema mais complexo. Sonic hedgehog pode estar agindo em conjuno com sinais da AER na especificao de padres. Primeiro, a expresso de genes Hoxd controlada pela cooperao de AER e ZPA. Na ausncia de uma AER, a Sonic hedgehog incapaz de induzir a expresso de genes Hoxd (Laufer et al., 1994). Entretanto, a adio de cido retinico pode substituir a falta de AER (Helms et al., 1996; Ogura et al., 1996).* H muito tempo se sabe que o cido retinico induz polarizao de membros. Partculas embebidas em cido retinico podem mimetizar o tecido ZPA, e induzir uma reverso da imagem espelhar na polaridade ntero-posterior (Tickle et al., 1982, 1985), e uma nica partcula embebida com cido retinico pode substituir uma ZPA quando o tecido ZPA normal foi removido (Eichele, 1989). Entretanto, o contedo de cido retinico na ZPA no parece suficientemente alto para ativar genes responsivos ao cido (Prancha 13; Noji et al., 1991; Rossant et al., 1991), e consideraes tericas (veja Wanek et al., 1991) indicam que pouco provvel que o cido retinico seja o agente ativo da ZPA. De outro lado, estudos recentes sugerem que o
O cido retinico morfogeneticamente ativo no broto do membro pode diferir de acordo com a espcie. No membro do pinto, o cido retinico ativo parece ser o cido didehidroretinico. Entretanto, essa forma no encontrada no broto do membro de camundongo (Stratford et al., 1996).
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cido retinico induz um co-fator de Sonic hedgehog. Enquanto Sonic hedgehog sozinha poderia induzir Hoxd-9 at Hoxd-11, a induo dos genes mais 5 Hoxd, Hoxd-12 e Hoxd-13, somente pode ser realizada na presena de cido retinico (Ogura et al., 1996). Experimentos com enxertos mostram que esses fatores induzidos pelo cido retinico so produzidos na AER (Helms et al.,1996). Um candidato para fator induzido por cido retinico o FGF4. O cido retinico induz a expresso de Fgf4 na AER, e o faz independentemente da Sonic hedgehog detectvel (Niswander et al., 1994). Ainda mais, quando uma partcula contendo FGF4 substitui a AER, a expresso dos genes HoxD promovida (Laufer et al., 1994). Duprez e colegas (1996) verificaram que o cido retinico induz a BMP2 e essa, por sua vez, induz tanto o FGF4 na AER como a expresso de Hoxd11 e 13 no mesoderma. Portanto, a induo normal dos genes mais 5 Hox (que no pode ser feita por Shh sozinha) feita por uma combinao de BMP2 e FGF4. Isso cria uma situao interessante porque Sonic hedgehog e FGF4 se ativam mutuamente. A Sonic hedgehog ativa a expresso do gene Fgf4 na regio posterior da AER (veja Figura 18.9), enquanto a expresso de Fgf4 necessria para a expresso normal do gene sonic hedgehog. (Tal relao foi sugerida pelos estudos de Todt e Fallon, 1987, mostrando que a AER era necessria para a funo da ZPA). Existe, ento, uma ala de retroativao positiva onde a Sonic hedgehog do mesoderma posterior ativa o Fgf4 na AER, e o FGF4 (provavelmente em conjunto com o FGF8) da AER mantm a expresso de sonic hedgehog (veja Figura 18.28; Laufer et al., 1994; Niswander et al., 1994). ZPA Especificando a ZPA Ainda no sabemos o que causa a ativao dos genes sonic hedgehog, especificamente nas clulas do broto do membro posterior e no nas clulas mais anteriores. possvel que o gene sonic hedgehog esteja sendo ativado por uma protena FGF oriunda da crista ectodrmica apical, recentemente formada, e FGF8 estando presente na AER capaz de ativar sonic hedgehog. Mas por que no h ativao de todas as clulas mesenquimatosas abaixo da crista? A resposta pode estar na diferente competncia de certas clulas mesenquimatosas em responder ao sinal de FGF. Charit e colegas (1994) sugeriram que a protena Hoxb-8 pode ser crtica no fornecimento dessa competncia restrita. Eles observaram que o gene Hoxb-8 era geralmente expresso na metade posterior do broto do membro anterior do camundongo. Ento, eles produziram camundongos transgnicos nos quais o gene Hoxb-8 estava sob o controle de um novo promotor que causava sua expresso em todos os brotos de membros anteriores. Isso resultou na expresso de sonic hedgehog na poro anterior dos brotos dos membros, a criao de uma nova ZPA, uma nova regio de expresso de genes HoxD e duplicaes de membros anteriores como imagens espelhares. Essa evidncia sugere que a protena Hoxb-8 est envolvida na especificao da expresso de sonic hedgehog e portanto no estabelecimento da ZPA.
A produo do eixo dorsoventral

O terceiro eixo do membro define sua parte dorsal (ns dos dedos, unhas) e sua parte ventral (palmas e solas). Em 1974, MacCabe e colaboradores demonstraram que a polaridade dorsoventral do broto do membro determinada pelo seu envolvimento pelo ectoderma. Se o ectoderma gira 180o em relao ao mesnquima do broto do membro, o eixo dorsoventral parcialmente revertido; os elementos distais (dgitos) esto de cabea para baixo. Isso sugeriu que a especificao tardia do eixo dorsoventral do membro regulada pelo seu componente ectodrmico. O gene Wnt7a expresso no ectoderma dorsal (mas no no ventral) dos brotos de membros do pinto e do camundongo (Deally, 1993; Parr et al., 1993). In 1995, Parr e MacMahon deletaram geneticamente o Wnt7a do embrio do camundongo. Os embries resultantes tinham
722
(A)
(B)
Figura 18.29
Transformaes dorsal-para-ventral de regies do membro em camundongos deficientes de ambos os genes Wnt7a. (A) Seco histolgica (corada com hematoxilina e eosina) da pata do membro anterior em embrio de camundongo de 15.5 dias. Os tendes ventrais e as almofadas ventrais dos ps so facilmente vistas. (B) A mesma seo atravs de um embrio mutante deficiente em Wnt7a. Tendes e almofadas dos ps esto agora duplicados no que seria a face dorsal da pata. dt, tendes dorsais; dp almofada dorsal do p; vp, almofada ventral do p; vt, tendo ventral. Os nmeros indicam identidade dos dgitos. (de Parr e McMahon, 1995; fotografias cortesia dos autores.)
solas em ambas as superfcies de suas patas, mostrando que a Wnt7a era necessria para a padronizao dorsal do membro (Figura 18.29). A Wnt7a induz o gene Lmx1 no mesnquima dorsal, e esse gene codifica um fator de transcrio que parece ser essencial para a especificao do destino das clulas dorsais no membro (Riddle et al., 1995; Vogel et al., 1995). Se esse fator expresso nas clulas do mesnquima ventral, elas desenvolvem um fentipo dorsal. Os camundongos deficientes em Wnt7a tambm no tinham dgitos posteriores, sugerindo que o Wnt7a tambm era necessrio para o eixo ntero-posterior. Yang e Niswander (1995) fizeram observaes similares no embrio de pinto. Esses pesquisadores removeram o ectoderma dorsal do membro em desenvolvimento e observaram que esse procedimento resultou na perda dos elementos esquelticos posteriores dos membros. Esses membros no tinham dgitos posteriores porque a expresso de sonic hedgehog e Fgf4 estavam faltando. A expresso de Wnt7a induzida por vrus podia substituir o ectoderma dorsal e restaurar a expresso de sonic hedgehog e o padro posterior. A sntese de Sonic hedgehog estimulada pela combinao das protenas Wnt7a e FGF4. Os trs eixos do embrio de pinto so todos interrelacionados e coordenados.
Distinguindo o membro anterior do membro posterior

At agora, tratamos os membros anteriores e os posteriores como se fossem os mesmos. Realmente, ele seguem as mesmas regras da formao do padro. Mas seus padres so diferentes. Um p no uma mo, e uma perna de pinto certamente no uma asa. Ento, como eles se tornam diferentes? Parece que as clulas da precartilagem da asa e da perna do pinto respondem de maneira muito diferente aos fatores de crescimento, e isso faz com que se associem umas as outras e se diferenciem de diferentes maneiras (Downie e Newman, 1994). Em culturas de clulas embrionrias, o cido retinico aumenta a condrognese no mesnquima da asa e inibe a condrognese no mesnquima da perna. O TGF-1 converte ndulos formadores da cartilagem da perna em camadas, mas no tem efeito nos ndulos cartilaginosos da asa exceto para promover a condrognese. As clulas da precartilagem da asa produzem um padro diferente de fibronectina daquele produzido pelas clulas correspondentes da cartilagem da perna (Figura 18.30).
723
Asa
Perna
Soro
TGF
cido retinico
Rede de fibronectina
Figura 18.30
Resposta diferencial de clulas da precartilagem da asa e da perna (estgio24) a fatores morfogenticos especficos. Fotografias das clulas em soro, TGF- e cido retinico so fotografias macroscpicas de colnias de clulas. As fotografias das redes de fibronectina depositadas pelas clulas so fotomicrografias fluorescentes em aumento de 40x. (de Downie e Newman, 1994.)
Essa deposio variada de fibronectina pode ser muito importante considerando as diferenas entre a perna e a asa. A localizao, temporalidade e arquitetura na deposio de cartilagem em culturas de tecido do broto do membro so estritamente paralelas deposio de fibronectina. Em culturas de asa, as condensaes de cartilagem eram amplas e planas; em culturas de perna, elas eram compactas e esferoidais. Em ambos os casos, a deposio de cartilagem era paralela localizao da fibronectina (Downie e Newman, 1995). Portanto, existem diferenas inerentes entre as clulas mesenquimatosas precartilaginosas nos membros anteriores e posteriores, e que so responsveis pelas respostas diferentes aos fatores de crescimento e pela diferente deposio de fibronectina. A disposio de fibronectina crtica no direcionamento da colocao e extenso da condrognese. O mecanismo pelo qual se d a formao e bifurcao da cartilagem para formar o esqueleto do membro assunto de grande interesse. [limb4.html] Recentemente foi demonstrada a expresso diferenciada de pares relacionados de fatores de transcrio em brotos de membros anteriores e posteriores. No pinto, Hoxc4 e Hocx-5 so expressos nos brotos das asas, enquanto que Hocx-9, Hocx-10 e Hocx-11 so expressos exclusivamente nos brotos das pernas (Nelson et al., 1996). O gene tbx5 semelhante ao Brachyury transcrito nos membros anteriores do camundongo, enquanto o gene estreitamento relacionado, o tbx4 expresso nos membros posteriores (Gibson-Brown et al., 1996). Ainda tem que ser verificado se qualquer um desses genes causalmente envolvido ao direcionar a especificao para membros anteriores ou membros posteriores*. Entretanto, a perda de TBX5 humana resulta na sndrome de Holt-Oram, caracterizada por anormalidades do corao e membros superiores (Basson et al., 1996; Li et al., 1996). As pernas no so afetadas.
*Quando se refere mo tem-se um conjunto ordenado de nomes para especificar cada dgito (Digitus pollicis, d. indicis, d. medius, d. annularis e d. minimus, respectivamente do polegar ao dedo mnimo). No existe tal nomenclatura para os dgitos do p, mas o plano proposto por Phillips (1991) tem muito mrito. Os dgitos do p, desde o hlux at o dedinho, seriam chamados porcellus fori, p. domi, p. carnivorus, p. non voratus e p. plorans domi, respectivamente.
724
&
Especulaes
Lies de limbless
OMO J MENCIONADO, o mu-
tante limbless pode formar brotos de membros, mas esses brotos regridem porque no forma uma AER. Estudos recentes sobre a expresso gnica nesse mutante mostra que o brotamento do membro acompanhado por padres normais de expresso gnica que no so estabelecidos pelos trs centros de sinalizao. Esses dados sugerem que os padres de expresso gnica, normalmente associados ao desenvolvimento do membro tetrpode, teriam se dado de qualquer maneira e representam um pr-padro que dirige o desenvolvimento desse membro (Ros et al., 1996). Os centros sinalizadores somente reforam e suportam esse padro.
Em primeiro lugar, o broto do membro limbless no expressa nem FGF4 nem FGF8, implicando que essas protenas no so necessrias para o brotamento normal. Segundo, o mesoderma do limbless expressa os genes Hoxd-11 a Hoxd-13 de forma aninhada posteriormente, junto com a expresso assimtrica de BMP4 e Wnt5a. Isso se d na ausncia de expresso detectvel de sonic hedgehog ou de uma AER (Grieshammer et al., 1996; Noramly et al., 1996; Ros et al., 1996). A anlise experimental do broto do membro de limbless revela que esse formar AERs e membros se receber partculas secretando FGFs. Mais ainda, essas partculas induzem Sonic hedgehog na regio posterior, mostrando que existe uma polaridade no broto do membro, mesmo em au-
sncia da AER. Interessantemente, o membro formado bi-dorsal, expressando Wnt7a em todo o ectoderma. Isso levanta a possibilidade de que a induo da AER necessita de uma interface ectodrmica dorsoventral. O mutante limbless tambm sugere a possibilidade de que o mesoderma da placa lateral j tem a habilidade para expressar os genes padronizadores ntero-posterior e prximo-distal, e que esse pr-padro subseqentemente estabilizado, mantido ou aumentado pela AER e Sonic hedgehog. O membro um rgo complicado e pesquisa atual o faz parecer ainda mais complexo. A anlise do desenvolvimento do membro tetrpode deu aos biologistas alguns dos maiores sucessos no entendimento do desenvolvimento, mas tambm tem levantado alguns dos nossos maiores desafios.
Morte celular e a formao de dgitos

A morte celular tambm tem uma funo na escultura do membro. Na verdade essencial para a formao de juntas e para a separao dos dedos (Zaleske, 1985). A morte (ou a falta de morte) em clulas especficas do membro de vertebrados geneticamente programada e foi selecionada durante a evoluo. Um dos casos envolve a formao ou no da membrana interdigital nos ps. A diferena entre um p de galinha e um de pato envolve a presena ou ausncia de morte celular entre os dgitos (Figura 18.31A,B). Saunders e colaboradores (1962; Saunders e Fallon, 1966) mostraram que na galinha, aps certo estgio, as clulas entre a cartilagem dos dgitos esto destinadas a morrer e o faro mesmo que transplantadas a outra regio do embrio ou colocadas em cultura. Entretanto, se antes desse estgio forem transplantadas para um membro de pato elas sero salvas. Entre a poca em que a morte celular determinada e quando ela realmente se d, os nveis de DNA, RNA e sntese de protenas decrescem dramaticamente (Pollack e Fallon, 1976). Alm da zona necrtica interdigital, existem trs outras regies que so esculpidas pela morte celular. O cbito e o rdio so separados entre si por uma zona necrtica interior, e duas outras regies, as zonas necrticas anterior e posterior, acabam a modelagem do fim do membro (Figura 18.31B; Saunders e Fallon, 1966). Apesar dessas zonas serem chamadas necrticas, isso uma herana da poca quando no se distinguia entre morte celular necrtica e morte celular apopttica. Essas clulas morrem por apoptose, e a morte do tecido interdigital est associada fragmentao de DNA (Mori et al., 1995). Em humanos, existem vrias sndromes caracterizadas por dedos ligados (sndromes sindctilas), mas a mutao responsvel conhecida somente em um situao (Vortkamp et al., 1991; Hui e Joyner, 1993), na qual o gene codifica um fator de transcrio que expresso no mesnquima interdigital. O sinal para apoptose em membros de pinto pode ser a protena BMP4. A expresso de BMP4 observada nos espaos interdigitais em membros de
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(A) PRIMRDIO DA PERNA DO PATO Morte celular mnima
Zona necrtica interior (B) PRIMRDIO DA PERNA DO PINTO Morte celular extensa Zona necrtica interdigital
Zona necrtica anterior
Zona necrtica posterior Zona necrtica interior
(C) Expresso gnica em regies da perna do embrio de pinto antes da morte celular
Receptor de cido retinico
CRBP
msx-1
Figura 18.31
Padres de morte celular em primrdios de pernas de embries de (A) pato e (B,C) de pinto. Sombreamento indica reas de morte celular. No pato, a morte celular mnima, enquanto que existem regies de extensa morte celular no tecido interdigital da perna do pinto (De acordo com Saunders e Fallon, 1966.)
pinto, e a inibio da sinalizao de BMP4 impede a apoptose em clulas interdigitais. interessante considerar que essa expresso de BMP no vista nessa fase no mesnquima interdigital embrionrio do pato (Gaan et al., 1996; Zou e Niswander, 1996; veja Captulo 23). Os membros tm sido uma pedra fundamental no estudo da produo de padres em vertebrados. Isso se origina de numerosos processos inter-relacionados que envolvem a disposio e crescimento do broto do membro, a induo da AER, a manuteno do mesnquima da zona progressiva, a formao e manuteno mtua de ZPA e AER, a formao do eixo dorsoventral, a gerao de condensaes precartilaginosas do mesnquima que formaro os tecidos cartilaginoso e sseo, e a imposio de assimetria ao broto do membro pela ZPA. Ainda existem animados debates em relao aos mecanismos desses processos e considervel controvrsia sobre as molculas que poderiam regular tais fenmenos.
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&
Especulaes
Evoluo do membro tetrpode

Sobre nadadeiras e membros Macroevoluo, a produo de novidades morfolgicas na evoluo de novas espcies e grupos taxonmicos mais altos, resulta de alteraes do desenvolvimento. Algumas das mais importantes modificaes macroevolucionrias resultaram da transio de animais aquticos para terrestres. Uma das mudanas mais bvias foi a da nadadeira do peixe para a perna do anfbio. Como apontado por Richard Owen (1849) existe uma considervel homologia entre os ossos da nadadeira e do membro tetrpode, sendo as nadadeiras peitorais e plvicas do peixe homlogas aos membros anterior e posterior, respectivamente. Foi possvel fazer homologias especficas entre os elementos proximais da nadadeira e do membro (zeugpode; tbia e fbula), mas as homologias entre o autpode do membro (a mo ou o p na ponta distal) e os raios da nadadeira no se consolidaram. Isso era verdade mesmo ao se comparar o membro tetrpode s nadadeiras dos peixes crossoptergios (nadadeiras lobulares), considerados como estreitamente relacionados aos ancestrais dos anfbios (veja Coates, 1994; Hinchliffe, 1994). O problema fica mais vexatrio quando se observa os membros dos primeiros tetrpodes conhecidos. Em lugar de ter cinco dgitos cannicos, esses anfbios primitivos tinham seis (Turlepedon), sete (Ichthyostega), ou mesmo oito (Acanthostega) dgitos em seus membros. Esses membros no possuem raios semelhantes s nadadeiras associadas a eles, e considera-se que funcionavam mais como remos em poas rasas de gua do que como suporte do peso do corpo em terra. Novamente, apesar da homologia para os elementos proximais do membro, o autpode parece algo novo- o que os biologistas evolucionrios chamam de estrutura neomrfica. Estudos recentes fortemente sugeriram que a localizao do terminal 5 (semelhante a Abd) dos genes Hox do grupo HoxD pode ser crucial na troca de nadadeiras para membros. Nos brotos de membros precoces de pintos e de camundongo, os genes 5 (Hoxd-11, 12, 13) esto
(A) Perna do pinto (B) Peixe (Danio)
Estgio 21 Mesnquima Mesnquima

Dobra ectodrmica apical da nadadeira
Estgio 26
Figura 18.32
Diferenas na expresso de Hoxd-11 em apndices embrionrios nos peixes e no pinto. (A) Regies de expresso de Hoxd-11 no membro posterior do camundongo desde o estgio de broto precoce at um estgio mais tardio. Durante os estgios mais tardios, o padro de expresso de Hoxd-11 atravessa a borda nteroposterior da zona progressiva. (B) Na nadadeira peitoral do peixe zebra, Hoxd-11 continua a ser expresso posteriormente, mas no se estende anteriormente. hpf, horas aps a fertilizao (De acordo com Sordino et al., 1995.)
(como previamente se acreditava) atravs do quarto dgito (produzindo os raios da nadadeira homlogos aos outros dgitos), mas atravs de um arco de condensaes distais de punho (metaptergio) que comeam posteriormente e se dirigem anteriormente atravs do mesnquima distal (Figura 18.33). Portanto, a borda de expresso do gene 5 HoxD segue o eixo metaptergio que Shubin e Alberch hipotetizaram como sendo a origem dos dgitos. Sordino e colegas propuseram que a localizao proximal dos transcritos do gene HoxD representa o padro original e comum a todos os vertebrados. A fase reorientada, distal, da expresso do gene HoxD representa uma condio nova e derivada. Isso, por sua vez, pode ter evoludo em resposta s modificaes na regulao dos genes 5 HoxD. O padro precoce de HoxD formado independentemente de Sonic hedgehog, mas o padro de expresso distalizado pode ser
restritos extremidade posterior do broto do membro. Algo semelhante ocorre no broto da nadadeira do peixe zebra (Figura 18.32). Entretanto, nos tetrpodes, existe uma segunda fase onde muda a expresso dos genes HoxD semelhantes a Abd. Em lugar de ficar restrita ao posterior do broto do membro, a expresso dos genes 5 HoxD perpassa o mesnquima distal, logo abaixo da AER. Essa banda de expresso coincidente como o arco digital do qual se formam os dgitos (Morgan e Tabin, 1994; Sordino et al., 1995; Nelson et al., 1996). Esses estudos mostram que enquanto o padro de expresso do gene HoxD homlogo nas regies proximais, a expresso no mesnquima distal do broto tardio nova. Isso tambm confirma os estudos paleonto-desenvolvimentais de Shubin e Alberch (1986), que propuseram que a via de formao dos dgitos no era
(A)
(B)
(C)
Figura 18.33 Origem dos dgitos (autpodos)
como uma novidade evolucionria dependente da expresso 5 do gene HoxD (semelhante a AbdB). (A) Representao de uma nadadeira primitiva de peixe, mostrando um eixo central (preto) com raios irradiando anteriormente (cinza claro) e posteriormente (cinza escuro). (B) Representao da hiptese mais antiga do desenvolvimento do membro tetrpode. O eixo central est curvado atravs do quarto dgito. O quinto dgito era considerado homlogo a um raio posterior; o primeiro, segundo e terceiro dgitos eram considerados homlogos aos raios anteriores. (C) Viso atual da formao autpode. O eixo originalmente se estende posteriormente, e em seguida se dobra anteriormente atravs da cartilagem metaptergia. Considera-se que a tbia se ramifica anteriormente mas os dgitos no so homlogos aos raios. (De acordo com Nelson e Tabin,1995.)
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governado pela expresso de Sonic hedgehog. O p e a mo parecem ser novas estruturas na evoluo, e provvel que tenham sido formados por um reposicionamento da expresso do gene HoxD durante o desenvolvimento da nadadeira. desnecessrio enfatizar que essa no a nica modificao que ocorreu na criao dos dgitos. Outros genes Hox e provavelmente sonic hedgehog mudaram tambm seu padro de expresso. Estamos chegando a um ponto na biologia onde mudanas na expresso gnica podem ser relacionadas s grandes variaes evolucionrias. Sobre pernas de moscas e pernas de galinha Evoluo envolve modificao com descendncia. Isso foi freqentemente documentado com homologias. A nadadeira de uma foca, a asa de um morcego, o brao de um esquilo e o brao de um homem so todos baseados em um mesmo plano homlogo, mas com modificaes. Cada um uma modificao diferente do plano de membros reptilianos, que por sua vez homlogo ao dos vertebrados. Uma das mais importantes descobertas da moderna biologia do desenvolvimento est relacionada homologia de processos e estruturas. Como veremos no Captulo 23, certas vias de desenvolvimento e interaes foram conservadas durante o tempo da evoluo e foram modificadas por diferentes grupos animais. Isso pode ser visto com o desenvolvimento do membro. Membros de mosca e membros de vertebrados so exemplos familiares de analogia (como o oposto da homologia). Onde estruturas homlogas so vistas como modificaes de uma estrutura original e podem agora ter diferentes funes, as estruturas anlogas tm a mesma funo mas no so
Desenvolvimento normal
Expresso experimental de hedgehog no primrdio do membro anterior
Pinto
Broto do membro Membro embrionrio
Expresso de shh Expresso de hh Drosophila
Disco imaginal da asa
Asa adulta
Figura 18.34
Homologia de processos de formao dos eixos ntero-posterior em Drosophila e apndices em pinto. (A) Um broto de membro do pinto expressa sonic hedgehog na sua regio posterior. Se sonic hedehog tambm for expresso em uma regio anterior, o membro em desenvolvimento desenvolve uma duplicao que a imagem espelhar do eixo ntero-posterior. (B) Um disco da asa da Drosophila expressa hedgehog no seu compartimento posterior. Se hedgehog tambm for expresso em um compartimento anterior, a asa desenvolve uma duplicao que a imagem especular do eixo ntero-posterior. (De acordo com Ingham, 1994.)
consideradas como derivadas de uma mesma estrutura. Membros de moscas e membros de vertebrados tm pouco em comum a no ser sua funo. Entretanto, ambos os membros do vertebrado e da mosca parecem ser formados atravs da mesma via de desenvolvimento. (Parece haver uma homologia de processos subjacente analogia de estruturas). Como vimos, sonic hedgehog usualmente expresso na parte posterior do broto do membro. Se for expresso na parte anterior do broto, aparecem duplicaes que so imagens espelhares (Riddle et al., 1993). No disco da asa da Drosophila (o campo de clulas que d origem a asa
durante a metamorfose), a protena Hedgehog usualmente expressa na poro posterior do disco. Se for expressa anteriormente surgiro duplicaes que so imagens espelhares da asa (Figura 18.34; Basler e Struhl, 1993; Ingham, 1994). Alm disso, certos genes regulados por Hedgehog tambm foram conservados (Marigo et al., 1996), e os compartimentos ventrais dos membros de insetos e vertebrados parecem ser regulados pela expresso do gene engrailed (Davis et al., 1991; Loomis et al., 1996). Assim, parece que a natureza descobriu como produzir um membro somente uma vez, e ambos artrpodos (Drosophila) e vertebrados (galinhas e camundongos) usam esse processo at hoje.
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Interaes celulares distncia: Hormnios como mediadores do desenvolvimento
19
Mudou a velha ordem cedendo seu espao para a nova.

ALFRED LORD TENNYSON (1886)
As fases iniciais presas na terra construram aparelhos digestivos enormes e os movimentou sobre ps de lagartas. Mais tarde na histria da vida, esses recursos puderam ser liquidados e reinvestidos na construo de um organismo inteiramente novo- uma mquina voadora dedicada ao sexo.
CARROLL M. WILLIAMS (1958)
numerosos tipos de clulas. Nos dois captulos precedentes discutimos como as interaes no desenvolvimento podem ser mediadas por populaes celulares adjacentes. Neste captulo discutiremos a regulao do desenvolvimento pelas molculas difusveis que se deslocam em longas distncias, de um tipo de clula a outro. Reguladores difusveis do desenvolvimento que se deslocam pelo sangue para promover modificaes na diferenciao ou morfognese de outros tecidos so chamados hormnios.
FORMAO DE RGOS NOS ANIMAIS consumada por interaes de
Metamorfose: o direcionamento hormonal do desenvolvimento

extremamente difcil isolar hormnios de embries pois quantidades muito pequenas desses so suficientes para concretizar sua ao. Portanto, algumas das anlises mais detalhadas do controle hormonal do desenvolvimento foram centralizadas na dramtica reprogramao do desenvolvimento conhecida como metamorfose. Em muitas espcies de animais, o desenvolvimento embrionrio leva a um estgio larval com caratersticas muito diferentes daquelas do organismo adulto. Muito freqentemente, as formas larvais so especializadas para algumas funes tais como crescimento ou disperso. A larva pluteus do ourio-do-mar, por exemplo, pode se deslocar em correntes ocenicas, enquanto o ourio adulto leva uma existncia sedentria. As larvas, em forma de lagarta, das borboletas e mariposas so especializadas para a alimentao, ao passo que suas formas adultas so especializadas para o vo e a reproduo e freqentemente no possuem as partes da boca necessrias para a alimentao. A diviso de funes entre a larva e o adulto freqentemente bastante distinta (Wald, 1981). As efemridas eclodem de ovos e se desenvolvem durante vrios meses. Todo esse desenvolvimento lhes permite passar um dia como insetos alados completamente desenvolvidos, acasalando rapidamente antes de morrer. Como seria de se esperar dessa discusso, a forma larval e o adulto com freqncia vivem em ambientes diferentes. Mais ainda, como primeiro observado por Weismann (1875), as larvas devem ter sua prpria adaptao para lhes ajudar a sobreviver. A borboleta viceroy adulta (limenitis archippus) mimetiza a menos apetitosa borboleta monarca, mas a lagarta viceroy no se parece com a bonita lagarta da monarca. Ao contrrio, a larva viceroy escapa da deteco parecendo excremento de pssaros (Begon et al., 1986). 733
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PARTE V Interaes Durante a Formao do rgo
Durante a metamorfose, hormnios especficos reativam processos do desenvolvimento, e o organismo inteiro se modifica preparando-se para sua nova existncia. Essas modificaes no so somente na forma. Em girinos de anfbios, a metamorfose causa no s a maturao desenvolvimental de enzimas do fgado, da hemoglobina e de pigmentos do olho, como tambm remodela os sistemas nervoso, digestivo e reprodutor. Portanto, a metamorfose uma fase de mudanas dramtica no desenvolvimento, afetando o organismo todo. Este captulo focaliza trs casos nos quais os hormnios reativam os processos de desenvolvimento aps o nascimento: metamorfose em anfbios, metamorfose em insetos e desenvolvimento das mamas do camundongo.
Metamorfose anfbia
Em anfbios, a metamorfose geralmente associada com as mudanas que preparam um organismo aqutico para uma existncia terrestre. Em urodelos (salamandras), as modificaes incluem a reabsoro das nadadeiras da cauda, a destruio das guelras externas e a mudana da estrutura da pele. Nos anuros (rs e sapos), as mudanas metamrficas so mais surpreendentes, e quase todos os rgos so modificados (Tabela 19.1). As modificaes na forma so muito bvias (Figura 19.1). Mudanas regressivas incluem a perda dos dentes crneos e das guelras internas do girino, como tambm a destruio de sua cauda. Ao mesmo tempo, so evidentes os pro-
Tabela 19.1 Sistema Locomotivo Respiratrio
Resumo de algumas modificaes metamrficas em anuros Larva Aqutica; nadadeiras de cauda Guelras, pele, pulmes; hemoglobinas larval Arcos articos; aorta; veias cardinais anteriores, posteriores e comuns Herbvoros: longo intestino em espiral- simbiontes intestinais; boca pequena- mandbulas corneadas, dentes labiais Falta da membrana nictitante; porfiropsina, sistema de linha lateral- Neurnios de Mauthner Adulto Terrestre; tetrpode sem cauda Pele, pulmes; hemoglobinas adultas
Circulatrio
Arco cartido; arco sistmico; veias jugulares
Nutricional
Carnvoros: intestino curto- proteases; boca grande- lngua longa
Nervoso
Desenvolvimento de msculos oculares, membrana nictitante, rodopsina, perda do sistema de linha lateral- degenerao dos neurnios de Mauthner; membrana timpnica Principalmente uria, alta atividade das enzimas do ciclo ornitina-uria (ureotlico) Epiderme escamosa estratificada com queratinas adultas; derme bem desenvolvida contm glndulas mucosas e granulares secretando peptdeos antimicrobianos
Excretrio
Principalmente amnia, pouca uria (amonotlico)
Integumentrio
Epiderme fina com bicamada e derme fina; sem glndulas mucosas ou granulares
Fonte: Dados de Turner e Bagnara, 1976; Reilly et al., 1994.
CAPTULO 19 Hormnios e metamorfose
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cessos construtivos como o desenvolvimento dos membros e a construo da glndula dermide. Para a locomoo, a cauda tipo remo retrocede enquanto os membros anteriores e posteriores se diferenciam. O crnio cartilaginoso do girino substitudo pelo crnio predominantemente sseo da pequena r. Os dentes crneos, construdos para dilacerar plantas das lagoas, desaparecem enquanto a boca e a mandbula assumem novas formas e se desenvolve o msculo da lngua. Enquanto isso, o amplo intestino caracterstico dos herbvoros se encurta para se adaptar dieta mais carnvora da r adulta. As guelras regridem e os arcos das guelras degeneram. Os pulmes aumentam, e msculos e cartilagem se desenvolvem para bombear ar para dentro e para fora dos pulmes. O sistema sensorial muda, tambm, assim como o sistema da linha lateral do girino degenera e o olho e o ouvido sofrem mais diferenciaes. No ouvido se desenvolve o ouvido mdio e a membrana do tmpano, to caracterstica de rs e sapos. No olho, aparecem as membranas nictitantes e as plpebras; o pigmento do olho tambm muda. Nos girinos, como nos peixes de gua doce, o fotopigmento mais importante da retina a porfiropsina, um complexo entre a protena opsina e o aldedo da vitamina A2. Em rs adultas, o pigmento muda para rodopsina, o fotopigmento caracterstico dos vertebrados terrestres e martimos. A Rodopsina um conjugado de opsina e o aldedo da vitamina A1 (Wald, 1945, 1981; Smith-Gill e Carver, 1981; Hanken e Hall, 1988). Outros eventos bioqumicos tambm esto associados metamorfose. A hemoglobina do girino liga o oxignio mais rapidamente e o libera mais lentamente do que a hemoglobina do adulto (McCutcheon, 1936). Alm disso, Riggs (1951) mostrou que a ligao do oxignio pela hemoglobina do girino independente do pH, ao passo que a hemoglobina da r (como a maioria das outras hemoglobinas de vertebrados) mostra um aumento na ligao de oxignio com o aumento do pH (efeito de Bohr). Outra mudana bioqumica na metamorfose de certas rs a induo daquelas enzimas necessrias para a produo de uria. Girinos, como a maioria dos peixes de gua doce so amonotlicos; ou seja, eles excretam amnia. Muitas rs adultas (tal como o espcie Rana mas no o Xenopus) so ureotlicos, excretando uria, como a maioria dos vertebrados terrestres. Durante a metamorfose, o fgado desenvolve enzimas necessrias para produzir uria de dixido de carbono e amnia. Essas enzimas constituem o ciclo da uria, e cada uma delas aparece durante a metamorfose (Figura 19.2). Controle hormonal da metamorfose de anfbios Todas essas variadas modificaes so induzidas pela secreo dos hormnios da tireide tiroxina (T4) e triiodotironina (T3), durante a metamorfose (Figura 19.3). Atualmente se acredita que T3 o hormnio ativo, pois ele causa mudanas metamrficas em girinos tireoidectomizados em concentraes muito menores do que o faria o T4 (Kistler et al., 1977; Robinson et al., 1977). O controle da metamorfose pelos hormnios da tireide foi demonstrado por Gudernatsch (1912), observando que girinos sofriam uma metamorfose prematura ao serem alimentados com a glndula tireide de carneiro pulverizada. Allen (1916) e Hoskins e Hoskins (1917) mostraram que pela retirada do rudimento da tireide de girinos precoces, a larva no sofria metamorfose tornandose, em lugar disso, um girino gigante.
MODIFICAES REGIONALMENTE ESPECFICAS. Os vrios rgos do corpo
Figura 19.1
Seqncia da metamorfose na r Rana pipiens. (A) Girino premetamrfico. (B) Girino prometamrfico mostrando crescimento do membro posterior. (C) Incio do clmax metamrfico ao emergirem os membros anteriores. (D,E) Estgios do clmax.
respondem de maneira diferente estimulao hormonal. O mesmo estmulo causa a degenerao de certos tecidos enquanto outros se desenvolvem e se diferenciam. Por exemplo, a degenerao das estruturas da cauda so claramente associadas a nveis crescentes de hormnios da tireide. A degenerao das estruturas da cauda relativamente rpida, pois o esqueleto sseo no se estende at a cauda, que somente suportada pela notocorda (Wassersug, 1989). Essa degenerao pode ser mostrada in vitro (Weber, 1967) quando pedaos isolados de cauda so colocados em recipientes
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Figura 19.2
(A)
Desenvolvimento do ciclo da uria durante a metamorfose de anuros. (A) Os principais aspectos do ciclo da uria, pelo qual resduos nitrogenados podem ser detoxificados e excretados. (B) Emergncia de atividades enzimticas do ciclo da uria correlacionada com mudanas metamrficas na r Rana catesbeiana. (De acordo com Cohen, 1970.)
Carbamoilfosfato sintase Carbamoilfosfato Ornitina carbamoiltransferase
Ornitina
Citrulina Aspartato Argininosuccinato sintetase
Uria Arginase Arginina
Argininosuccinato Argininosuccinato liase
Fumarato (B)
Porcentagem de nveis de enzimas ps-metamrficas
Carbamoilfosfato sintase Ornitina carbamoiltransferase Argininosuccinato sintetase Argininosuccinato liase
Excreo de uria
Estgio do desenvolvimento
com gar e submetidos a tratamentos qumicos. As caudas cultivadas em meio no tratado permanecem sadias, enquanto aquelas colocadas em meio contendo hormnios da tireide sofrem uma regresso caracterstica. Alm disso, a prolactina inibe a degenerao da cauda induzida pelos hormnios da tireide (Brown e Frye, 1969). Considera-se que a regresso da cauda se d em quatro estgios. Primeiro, a sntese de protena diminui nas clulas do msculo estriado da cauda (Little et al., 1973). Em seguida, h um aumento das enzimas do lisossoma. As concentraes de proteases, RNase, DNase, colagenase, fosfatase e glicosidases aumentam na epiderme, notocorda e clulas do cordo nervoso (Fox, 1973). Provavelmente a morte celular causada pela liberao dessas enzimas no citoplasma. A epiderme ajuda a digesto do tecido muscular, possivelmente pela liberao dessas enzimas digestivas. Se a epiderme cirurgicamente removida das extremidades da cauda, essas no sofrero regresso quando cultivadas em tiroxina (Eisen e Gross, 1965; Niki et al., 1982). Aps essa morte celular, macrfagos se acumulam na regio da cauda, digerindo os detritos com suas prprias enzimas proteolticas (Kaltenbach et al., 1979). O resultado que a cauda se
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Tiroxina (T 4 )
Triiodotironina (T 3 )
Figura 19.3
Frmulas da tiroxina (T4) e da triiodotironina (T3).
torna uma grande sacola de enzimas proteolticas (Figura 19.4). As principais enzimas proteolticas parecem ser as colagenases e outras metaloprotenases cuja sntese depende dos hormnios da tireide. Se um inibidor de metaloprotenases (TIMP) adicionado s caudas, ele impede a regresso da cauda induzida pelo hormnio da tireide (Oofusa e Yoshizato, 1991; Patterson et al., 1995). A resposta aos hormnios da tireide intrnseca ao prprio rgo e no depende dos tecidos vizinhos. Na epiderme, a resposta aos hormnios tireoidianos depende de qual parte do corpo a epiderme est cobrindo. As clulas epidrmicas da cabea e do corpo do girino sofrem uma lenta renovao (como esperado na pele), e T3 no modifica essa velocidade. Na cauda, entretanto, T3 causa um rpido aumento na queratinizao e morte dessas clulas. Tambm se d uma supresso, especfica para a cauda, das divises das clulas precursoras que poderiam originar mais clulas epidrmicas. O resultado a morte das clulas epidrmicas da cauda enquanto
Concentrao da protease catepsina lisossmica (unidades/g nitrognio)
Figura 19.4
Comprimento relativo da cauda (%)
Aumento da atividade protesica lisossmica durante a regresso da cauda em Xenopus laevis. As enzimas lisossmicas so consideradas responsveis pela digesto das clulas da cauda. (De acordo com Karp e Berrill, 1981.)
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(A) Extremidade da cauda transplantada no tronco
(B)
Figura 19.5
Especificidade de rgos durante a metamorfose da r. (A) Extremidades da cauda regridem mesmo quando transplantadas no tronco, enquanto (B) os clices oculares permanecem intactos mesmo quando transplantados para a cauda em regresso. (De acordo com Schwind, 1933; fotografias de Geigy, 1941, cortesia do Journal of Experimental Zoology.)
Cauda
que a epiderme da cabea e do corpo continua a funcionar (Nishikawa et al., 1989). Essas respostas epidrmicas locais parecem ser controladas pela especificidade regional do mesoderma drmico. Se as clulas do dermtomo da cauda (que do origem a derme da cauda) so transplantadas para o tronco, a epiderme que elas contactam sofrer degenerao na metamorfose. Inversamente, quando o dermtomo do tronco transplantado para a cauda, aquelas regies da pele persistem. Modificando o ectoderma no se altera a resposta regional aos hormnios da tireide (Kinoshita et al., 1989). Essa resposta especfica dos rgos dramaticamente demonstrada quando extremidades da cauda so transplantadas para a regio do tronco ou quando clices oculares so colocadas na cauda (Schwind, 1933; Geigy, 1941). A extremidade da cauda extra colocada no tronco no protegida da degenerao, mas o olho retm sua integridade apesar de estar colocado dentro da cauda em degenerao (Figura 19.5). Portanto, a degenerao da cauda representa uma morte celular autnoma programada. Somente tecidos especficos morrem quando dado o sinal. Essas mortes celulares programadas so importantes na modelagem do corpo. Em humanos, a degenerao programada ocorre nos tecidos entre os dedos e os artelhos, e a degenerao da cauda humana durante a semana 4 do desenvolvimento se parece regresso da cauda do girino (Fallon e Simandl, 1978).
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COORDENAO DAS MUDANAS NO DESENVOLVIMENTO. Um dos princi-
pais problemas da metamorfose a coordenao dos eventos desenvolvimentais. A cauda no deve degenerar at que outro meio de locomoo- os membros- estejam desenvolvidos, e as guelras no devem regredir at que o animal possa utilizar os seus msculos pulmonares recm-desenvolvidos. A maneira de coordenar os eventos metamrficos parece ser atravs de diferentes quantidades de hormnio que produzem diferentes efeitos especficos (Kollros, 1961). Esse modelo chamado de conceito do limite. Com o crescimento gradual da concentrao de hormnios da tireide, diferentes eventos ocorrem dependendo do nvel de concentrao do hormnio. Quando girinos privados de suas tireides so colocados em uma soluo diluda de hormnios da tireide, os nicos efeitos morfolgicos so o encurtamento dos intestinos e o crescimento acelerado dos membros posteriores. Entretanto, em concentraes mais altas do hormnio, a regresso da cauda observada antes da formao dos membros posteriores. Esses experimentos sugerem que ao se elevarem os nveis de hormnio da tireide, os membros posteriores se desenvolvem primeiro e depois regride a cauda. Analogamente, quando girinos recebem T3 induz-se a formao dos ossos precoces nas dosagens mais baixas e os mais tardios em dosagens mais altas, mimetizando a situao natural (Hanken e Hall, 1988). Portanto, o planejamento na metamorfose regulado pela competncia dos diferentes tecidos em responder aos hormnios da tireide.
MUDANAS NEURONIAIS. Mas o que acontece com o sistema nervoso quando o
animal est construindo um novo organismo a partir do velho? A anatomia adaptiva de uma r certamente difere daquela de seu girino. Uma conseqncia imediata da metamorfose nos anuros observada na transferncia dos olhos para frente, a partir de sua posio lateral original (Figura 19.6).* Os olhos laterais do girino so tpicos de herbvoros como presa, ao passo que os olhos frontais da r so mais adequados
*Um dos movimentos mais espetaculares de olhos durante a metamorfose ocorre nos peixes chatos como o linguado. Originalmente, os olhos esto em lados opostos da face. Todavia, durante a metamorfose, um dos olhos migra dorsalmente para encontrar o outro no topo da cabea, permitindo ao peixe permanecer no fundo, olhando para cima (Martin e Drewry, 1978).
Figura 19.6
A migrao do olho e mudanas neuroniais associadas durante a metamorfose do girino de Xenopus laevis. Os olhos do girino so localizados lateralmente, por isso, existe um plano binocular relativamente pequeno. Os olhos migram dorsalmente e rostralmente durante a metamorfose, criando um amplo campo binocular para a r adulta. Abaixo do girino em metamorfose est uma representao da regio ptica de seu crebro. Quando se injeta peroxidase de rabanete (horseradish) na retina, os neurnios pticos a transportam para o lado contralateral (oposto) do crebro (flecha pequena), mas no para o lado ipsilateral. Com a continuao da metamorfose, as projees ipsilaterais (envolvidas na viso binocular) comeam a ser vistas (flecha grande). (de Hoskins e Grobstein, 1984, cortesia de P. Grobstein.)
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ao seu estilo predatrio de vida. Para alcanar sua presa, a r deve enxergar em trs dimenses. Ou seja, ela deve adquirir um campo de viso binocular onde os sinais de ambos os olhos convergem no crebro. No girino, o olho direito inerva o lado esquerdo do crebro e vice-versa. No existem projees ipsilaterais (do mesmo lado) dos neurnios da retina. Entretanto, durante a metamorfose essas vias ipsilaterais adicionais emergem, permitindo que sinais de ambos os olhos atinjam a mesma rea do crebro (Currie e Cowan, 1974; Hoskins e Grobstein, 1985a). Em Xenopus, essas novas vias neuroniais no resultam da remodelao de neurnios existentes, mas da formao de novos neurnios que se diferenciam em resposta aos hormnios da tireide (Hoskins e Grobstein, 1985a,b). Tanto o movimento dos olhos para sua nova posio como a diferenciao de novos neurnios que estendem processos ipsilaterais para o crebro so modificaes dependentes de hormnios da tireide. Outros neurnios tambm sofrem mudanas profundas. Algumas clulas nervosas morrem, como aquelas que inervam os msculos da cauda de girinos (Forehand e Farel, 1982). Essa morte neuronial parece ser uma outra resposta ao hormnio da tireide, e no causada pela morte do tecido alvo. Outros neurnios, como certos neurnios motores na mandbula do girino trocam sua fidelidade do msculo larval para o msculo adulto recm-formado (Alley e Barnes, 1983). E ainda outros neurnios, como aqueles inervando a lngua (um msculo recm-formado, no presente na larva) estiveram dormentes durante o estgio de girino e s iniciam a formao de conexes durante a metamorfose (Grobstein, 1987). O crebro tambm sofre mudanas em sua estrutura durante a metamorfose. Portanto, o sistema nervoso dos anuros sofre enorme reestruturao durante a metamorfose. Alguns neurnios morrem, outros nascem, e outros mudam sua especificidade.
MUDANAS DE COMPORTAMENTO. A metamorfose tambm traz mudanas de
comportamento; obviamente, o comportamento de uma r diferente do seu girino. Recentemente, o estudo de rs tropicais demonstrou comportamentos surpreendentes envolvendo inter-relaes r-girino. A r flecha de veneno, Dendrobates, encontrada nas florestas tropicais da Amrica Central. A maior parte do tempo, essas rs altamente txicas vivem nos detritos foliares do solo da floresta. Aps a postura dos ovos sobre uma folha mida, um dos pais (s vezes o macho, outras a fmea) serve de guardio dos ovos. Quando os ovos se transformam em girinos, o guardio permite que eles se aboletem em suas costas (veja Prancha 34). A r sobe ento para a copa das rvores at encontrar bromlias com poas de gua em suas folhas da base, onde deposita um de seus girinos. Em seguida, vai buscar outro, e assim por diante at que a ninhada toda tenha sido depositada em numerosas pequenas poas de gua. Em seguida, a fmea retorna todos os dias a essas poas onde deposita ovos no fertilizados, e reabastece o suprimento de alimento para os girinos, quando esse escasseia, at que se complete a metamorfose (Mitchell, 1988; vanWijngaarden e Bolanos, 1992; Brust, 1993). No se sabe como a fmea se lembraou informada- onde foram depositados os girinos. Repostas Moleculares aos Hormnios da Tireide Durante a Metamorfose Evidncia de experimentos com inibidores sugeriram que os hormnios da tireide controlam a metamorfose ao nvel da transcrio. Weber (1967) demonstrou que a injeo de actinomicina D em girinos prometamrficos normais inibiu a regresso da cauda e a remodelao da cabea. No fgado (que remodelado na metamorfose e no destrudo ou substitudo) as mudanas metamrficas so acompanhadas por aumentos dramticos da sntese de RNA ribossmico e mensageiro, com a velocidade de sntese de protenas aumentada quase 100 vezes dentro de 4 horas aps a estimulao pelos hormnios da tireide (Cohen et al., 1978). Muitos desses novos mRNAs esto
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codificando as novas enzimas do fgado adulto. Mori e colaboradores (1979) mostraram que muito do aumento de carbamoilfosfato sintase pode ser atribudo ao aumento da transcrio do seu gene. O mtodo de transferncia de manchas, onde mRNA radioativo de girinos da r boi (bullfrog) na fase premetamrfica e em metamorfose hibridizado com genes clonados, demonstrou trs tipos de resposta aos hormnios da tireide. A transcrio de um conjunto de genes aumenta em resposta a uma metamorfose induzida natural ou experimentalmente; a transcrio de um outro conjunto de genes dramaticamente reduzida; e um terceiro conjunto de genes permanece inalterado pelos hormnios da tireide (Lyman e White, 1987; Mathison e Miller, 1987). A transcrio dos mRNAs para albumina, globina adulta, queratina da pele adulta e o homlogo de Sonic hedgehog em Xenopus controlada por T3. A transcrio do gene sonic hedgehog interessante, pois sugere que o padro regional de formao de rgos durante a metamorfose pode ser conseqncia do reaparecimento de algumas das mesmas molculas que haviam estruturado o embrio (Stolow e Shi, 1995). Mas essas so respostas ao T3 relativamente tardias. A resposta a T3 mais precoce a ativao transcricional dos genes do receptor do hormnio da tireide (TR) (Yaoita e Brown, 1990; Kawahara et al., 1991). Os receptores de hormnios da tireide so membros de uma superfamlia de receptores de hormnios esterides dos fatores de transcrio. Existem dois tipos principais de TR, TR e TR, e os mRNAs de ambos esto presentes em nveis relativamente baixos antes do incio da metamorfose (Tabela 19.2; Kawahara et al., 1991; Baker e Tata, 1992). Entretanto, a sntese desses mRNAs acelerada dramaticamente ao se iniciar a metamorfose. A injeo de T3 exgeno causa um aumento de 2 a 5 vezes na mensagem de TR e um aumento de 20 a 50 vezes no mRNA para TR. Essa auto-induo da mensagem do receptor de T3 pelo prprio T3 pode ter um papel significativo na acelerao da metamorfose (Figura 19.7). Quanto mais receptores de T3 tiver um tecido, mais competente ele ser para responder pequenas quantidades de T3. Portanto, o clmax metamrfico, quando as mudanas visveis da metamorfose ocorrem rapidamente, pode ser conseqncia de um aumento na produo e induo de mais receptores de T3. O mecanismo dessa induo no conhecido, mas Kanamori e Brown (1992) mostraram que a acelerao na formao do mRNA de TR significativamente bloqueada por inibidores da sntese de protenas. Assim, outras protenas esto provavelmente envolvidas na responsividade de genes de TR ao T3. O TR no funciona sozinho, mas forma um dmero com o receptor retinide, RX. Esse dmero liga hormnios da tireide e pode entrar no ncleo para efetuar a transcrio (Wong e Shi, 1995).
Tabela 19.2
Acumulao relativa de mRNA TR e em girinos de Xenopus aps tratamento com T3 e prolactina Unidades relativas
Tratamento Nenhum T3 Prolactina + T3 Prolactina
TR 505 1290 799 405
TR 24 368 <10 43
Fonte: De acordo com Baker e Tata, 1992.
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(A) PREMETAMORFOSE Concentrao baixa de tirotropina
(B)
METAMORFOSE PRECOCE (PROMETAMORFOSE)
(C)
CLMAX METAMRFICO
Concentrao de tirotropina aumenta Concentrao de T 3 e T4 aumenta Concentrao do receptor de T3 aumenta
Alta concentrao de tirotropina Alta concentrao de T3 e T4 Alta concentrao do receptor de T3
Concentrao baixa de T3 e T4
Concentrao baixa do receptor de T3
Gene do receptor de T3 Transcrio (Nenhuma transcrio) Outros genes responsivos a T3 Ligao ao receptor de T3 estimula a produo de mais receptores de T3 Aumenta transcrio dos genes induzidos por T 3 Transcrio Transcrio
Transcrio Ligao ao receptor de T3 estimula a transcrio de outros genes
Transcrio
Transcrio
Algumas protenas induzidas por T3 estimulam mais mensagem de T3
Figura 19.7
Modelo hipottico para a acelerao da metamorfose em Xenopus pela auto-induo de receptores de T3 por T3. (A) No girino, a premetamorfose caracterizada por baixos nveis de tirotropina (fator de liberao do hormnio da tireide), hormnios da tireide e receptores de T3. (B) No incio da metamorfose, os nveis de tirotropina aumentam (provavelmente devido maturao desenvolvimental da glndula pituitria). Isso aumenta a quantidade de T3 que se liga pequena quantidade de seu receptor estimulando a transcrio de mais mRNA do receptor de T3. Algumas outras protenas induzidas por T3 tambm so necessrias para a transcrio de mais mensagem de T3. (C) No clmax metamrfico, as grandes concentraes de T3 induzem, ainda mais, a sntese de seus receptores, o que causa uma resposta mais rpida ao T3.
Foi observado que o hormnio prolactina tambm inibe o aumento de mRNAs de TR e TR. Ainda mais, se a acelerao dos receptores da tireide bloqueada pela prolactina, a cauda no reabsorvida, e o gene de queratina especfico para o adulto no ativado (Tata et al., 1991; Baker e Tata, 1992). Injees de prolactina estimulam o crescimento larval e inibem a metamorfose (Bern et al., 1967; Etkin e Gona, 1967), mas controverso se isso reflete o papel natural da prolactina (Taka hashi et al., 1990; Buckbinder e Brown, 1993). Ainda no conhecemos o mecanismo de regulao dos nveis de hormnios da tireide no girino, nem como a recepo do hormnio desencadeia respostas diferentes (proliferao, diferenciao, morte celular) em tecidos diferentes.
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&
Especulaes
Heterocronia
MAIORIA DAS ESPCIES animais
se desenvolve atravs de uma fase larval. Entretanto, algumas espcies modificaram seus ciclos de vida alongando ou encurtando seu perodo larval. O fenmeno pelo qual os animais modificam o perodo de aparecimento e a velocidade de desenvolvimento de caracteres j presentes em seus ancestrais chamado heterocronia. Aqui discutiremos trs tipos extremos de heterocronia. Neotenia, se refere reteno da forma juvenil devido a um atraso no desenvolvimento do corpo, em relao s clulas germinativas e s gnadas, cuja maturidade alcanada em tempo normal. Prognese tambm se refere reteno da forma juvenil, mas nesse caso as gnadas e a linhagem germinativa se desenvolvem mais rapidamente do que o normal e elas se tornam sexualmente maduras, enquanto o resto do corpo est ainda na fase juvenil. No desenvolvimento direto, os embries abandonam completamente os estgios de desenvolvimento larval e passam a construir um pequeno adulto.
(A)
(B)
Figura 19.8
Metamorfose induzida no axolotle. (A) Condio normal do axolotle. (B) Espcimen tratado com tiroxina para induzir a metamorfose. (Cortesia de G. Malacinski.)
Neotenia Em certas salamandras, a maturidade sexual ocorre em uma fase que considerada larval. O sistema reprodutivo e as clulas germinativas amadurecem, enquanto o resto do corpo retm a forma juvenil ao longo de sua vida. Na maioria dos casos, a metamorfose no se concretiza, e a maturidade sexual se d em um corpo larval. A axolotle Mexicana, Ambystoma mexicanum, no sofre metamorfose na natureza porque sua glndula pituitria no libera a forma ativa do hormnio estimulante da tireide (TSH) para que seja estimulada a sntese de T3 em sua glndula tireide (Prahlad e De-Lanney, 1965; Norris et al., 1973; Taurog et al., 1974). Assim, quando os pesquisadores forneceram A. mexicanum o hormnio da tireide ou TSH, eles observavam uma metamorfose em um adulto no encontrado na natureza (Huxley, 1920). Outras espcies como a A. tigrinum, s sofrem metamorfose se receberem sinais do ambiente. Isso no acontecendo, elas se tornam neotnicas e realizam, como
larvas, acasalamentos bem sucedidos. Em parte do seu habitat, A. tigrinum uma salamandra neotnica, se deslocando atravs dos frios lenis de gua das Montanhas Rochosas. Entretando, na parte mais quente do seu habitat, a forma larval de A. tigrinum transitria, originando-se a salamandra tigre terrestre. Populaes neotnicas das Rochosas podem ser induzidas a sofrer metamorfose quando colocadas em guas mais quentes. Parece que o hipotlamo dessas espcies no pode produzir o fator liberador de TSH em baixas temperaturas. Algumas salamandras, entretanto, so permanentemente neotnicas, mesmo no laboratrio. Enquanto a tiroxina capaz de produzir a antiga forma adulta perdida de A. mexicanum (Figura 19.8), as espcies neotnicas Necturus e Siren no respondem a hormnios da tireide (Frieden, 1981); sua neotenia permanente. Yaoita e Brown (1990) notaram que o mRNA para o receptor do hormnio da tireide est ausente em Necturus e, portanto, no pode ser induzido por T3. As leses genticas consideradas responsveis pela neotenia em vrias espcies esto mostradas na Figura 19.9.
De Beer (1940) e Gould (1977) especularam que a neotenia um dos fatores importantes na evoluo de grupos taxonmicos mais complexos. Retardando o desenvolvimento de tecidos somticos, se d seleo natural um substrato mais flexvel. De acordo com Gould, a neotenia estaria fornecendo um escape da especializao. Os animais podem abandonar suas formas adultas especializadas, retornar labilidade da juventude e se preparar para novas direes evolucionrias. Prognese Na prognese, a maturao das gnadas acelerada enquanto o resto do corpo se desenvolve normalmente a um certo estgio. A prognese permitiu que certas espcies de salamandra encontrassem novos nichos ecolgicos. Bolitoglossa occidentalis uma salamandra tropical diferente de outros membros do seu gnero, por viver em rvores. Essa salamandra palmpedes e tem um corpo pequeno, condies adequadas para uma vida arbrea; os ps produzem a suco para a subida e o corpo pequeno torna a trao eficiente. Alberch e Alberch (1981) mostraram que
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Estmulos externos
Hipotlamo Ambystoma tigrinum Ambystoma gracilus Hormnio liberador de tirotropina (TSH-RF)
Pituitria Ambystoma mexicanum Hormnio estimulante da tireide
Tireide Tiroxina, Triiodotironina Eurycea neotenes Espcies de Necturus e Siren
Tecidos alvo capazes de sofrer metamorfose
mento direto, tpico em espcies de rs que no tm girinos e ourios-do-mar que no tm larvas pluteus. Elinson e seus colegas (del Pino e Elinson, 1983; Elinson, 1987) estudaram uma pequena r, Eleutherodactylus coqui, que um dos animais mais abundantes na ilha de Porto Rico. Diversamente dos ovos de Rana e Xenopus, os ovos de E. coqui so fertilizados enquanto esto no corpo da fmea. Cada ovo tem 3.5mm de dimetro (cerca de 20 vezes o volume dos ovos de Xenopus). Aps a postura, o macho permanece levemente apoiado sobre os embries, protegendo-os de predadores e da dessecao (Taigen et al., 1984). O desenvolvimento precoce semelhante maioria das rs. A clivagem holoblstica, a gastrulao iniciada na posio subequatorial (Figura 19.10A), e as dobras neurais se elevam a partir da superfcie (Figura 19.10B). Entretanto, logo aps o fechamento do tubo neural, os brotos dos membros aparecem na superfcie (Figura 19.10C). Essa emergncia precoce de brotos de membros a primeira indicao de que o desenvolvimento direto e que no passar pelo estgio de girino sem membros. Mais ainda, a emergncia dos membros no depende de hormnios da tireide (Lynn e Peadon, 1955). O que
(A)
emerge do ovo gelatinoso, trs semanas aps a fertilizao, no um girino, mas uma pequena r (Figura 19.10D). A pequena r tem uma cauda durante a primeira parte de sua vida, mas ela usada para respirao e no para a locomoo. Tais rs com desenvolvimento direto no necessitam de gua para seus estgios larvais e podem, portanto, colonizar novas regies inacessveis a outras rs. Raff (1987) estudou o desenvolvimento direto em ourios-do-mar. Em ouriosdo-mar tpicos, as clulas mesenquimatosas primrias invaginam e secretam o esqueleto de carbonato de clcio da larva pluteus. Essas larvas se alimentam e crescem at que se formem as vesculas celmicas (tambm derivadas dos micrmeros) nos lados do intestino (Pehrson e Cohen, 1986). O celoma esquerdo continua a crescer produzindo uma hidrocele que induz o ectoderma sobrejacente a invaginar formando um vestbulo. A hidrocele e o vestbulo formam um rudimento que cresce dentro da larva at ser liberado na metamorfose para se tornar um ourio-do-mar juvenil (Figura 19.11). Vrias espcies de ourio-do-mar tm estgios suprimidos da larva pluteus enquanto aceleram o desenvolvimento do rudimento adulto. Como no desenvolvimento
(B)
Figura 19.9
Estgios ao longo do eixo hipotlamo-pituitriatireide da salamandra onde se considera que vrias espcies tm bloqueio da metamorfose. Eurycea, Necturus e Siren parecem ter um defeito no receptor dos tecidos responsivos. Eurycea ter metamorfose ao ser exposta concentraes extremamente altas de tiroxina, enquanto que Necturus e Siren no respondem a qualquer dose. (De acordo com Frieden, 1981.)
B. accidentalis se assemelha aos juvenis das espcies relacionadas B. subpalmata e B. rostrata (cujos jovens so pequenos, com dgitos que ainda no ultrapassaram a interligao). Considera-se que B. occidentalis se tornou um adulto sexualmente maduro com um tamanho muito menor do que seus predecessores. Isso deu-lhe um fentipo que possibilitou a vida em rvores. Desenvolvimento direto Enquanto alguns animais estenderam o perodo larval de sua vida, outros aceleraram seu desenvolvimento abandonando suas formas larvais normais. Esse ltimo fenmeno, chamado desenvolvi-
(C)
(D)
Figura 19.10
Desenvolvimento direto da r Eleutherodactylus coqui. (A) Gstrula precoce mostrando o lbio do blastporo. (B) Vista dorsal da nurula mostrando a elevao das dobras neurais. (C) Um dia aps o fechamento das dobras neurais, pode se ver os brotos dos membros. (D) Trs semanas aps a fertilizao eclode uma pequena r, aqui vista ao lado de uma moeda de um penny Canadense (a inflao da cauda um artefato causado pelos fixadores qumicos usados para preparar o espcimen). (de Elinson, 1987, cortesia de R. P. Elinson.)
745
(A)
(B)
Rudimento do ourio-do-mar (C) (D)
Estmago
Rudimento do ourio-do-mar
Apndices adultos
Figura 19.11
Metamorfose normal da larva pluteus para adulto no ourio-do-mar Lytechinus pictus. (A) Larva pluteus, 8 dias aps a fertilizao. (B) Larva pluteus de 11 dias com rudimento do ourio-do-mar e bolsa celmica esquerda. (C) Uma pluteus de 19 dias com o rudimento do ourio-do-mar em desenvolvimento. (D) Cerca de 11 minutos aps a fixao ao substrato, os braos da larva comeam a ser reabsorvidos. (De Hinegardner, 1969, cortesia de R. T. Hinegardner.)
direto na r, esse desenvolvimento em ourio-do-mar depende de um ovo grande com vitelo. De fato, Raff encontrou uma correlao entre o volume do ovo e a extenso do desenvolvimento direto (Tabela 19.3). Ourios-do-mar na Amrica do Norte e na Europa tm ovos cujo dimetro varia de 60 a 200 m. Essas espcies tm um desenvolvimento indireto atravs da larva pluteus. Ovos no intervalo de 300-350 m produzem larvas pluteus parciais que possuem o esqueleto larval mas no o intestino
(portanto, no se alimentam). Essas espcies mostram um crescimento acelerado do rudimento adulto, de modo que um ourio-do-mar juvenil, capaz de se alimentar, produzido rapidamente. Existem alguns ovos com vitelo alcanando um dimetro de 2mm (prximo do volume de ovos de Xenopus). Esses embries desenvolvemse diretamente sem qualquer estgio pluteus. O estgio de alimentao no necessrio porque a nutrio garantida pelo vitelo.
Tabela 19.3 Relao entre o tipo de desenvolvimento e o tamanho do ovo em ourios-do-mar Nmero de Espcies 83 1 2 19 Intervalos de tamanho de ovo (m) 60 - 345 280 300 - 350 400 - 2000 Tipo de desenvolvimento Larva pluteus com alimentao Pluteus com alimentao facultativa Pluteus abreviada, sem alimentao Pluteus perdida; desenvolvimento direto
Fonte: De acordo com Raff, 1987.
A natureza forneceu uma excelente comparao em duas espcies australianas de ourio-do-mar do gnero Heliocidaris. Heliocidaris erythrogramma e H. tuberculata so espcies comuns, que de acordo com dados morfolgicos e de seqenciamento de DNA, so estreitamente relacionadas. Eles vivem lado a lado e desovam ao mesmo tempo no vero. Entretanto, H. erythrogramma tem um ovo com o dimetro de 425m e de desenvolvimento direto; H. tuberculata produz um ovo com 95m de dimetro e se desenvolve atravs de uma larva pluteus tpica. Uma comparao entre as duas espcies revela que o desenvolvimento direto eliminou os estgios larvais e h um prosseguimento direto para a formao do celoma e a construo do ourio-do-mar juvenil (Figura 19.12). A larva pluteus destinada natao e alimentao (Strathmann, 1971, 1975), usando seus braos como suporte de faixas de clios que varrem partculas de alimento para dentro da boca. As clulas nos organismos de desenvolvimento direto mudaram seus destinos de modo a no se formar o esqueleto larval ou a boca. Tambm, na gastrulao desses ourios-do-mar de desenvolvimento direto no se observa descendentes das clulas do micrmero que invaginam para formar o esqueleto larval. Pelo contrrio, essas clulas so imediatamente envolvidas na formao da espinha calcria do jovem adulto. Tambm, a extremidade do arquntero nas formas de ourio-do-mar com desenvolvimento direto forma uma extensa hidrocele que interage com o vestbulo ectodrmico para formar o rudimento de ourio-do-mar na gastrulao. No desenvolvimento indireto, somente duas clulas iniciam a formao do vestbulo, e essas interagem com a hidrocele depois do estabelecimento da estrutura de pluteus (Wray e Raff, 1990, 1991). Dessa forma, temos um interessante paradoxo. De um lado, o desenvolvimento dos estgios larvais parecem estar fortemente contidos. Larvas de diferentes classes de equinodermos so muito parecidas, e os girinos de diferentes grupos de rs so tambm muito semelhantes. Entretanto, essas contenes podem ser eliminadas se for abandonada a necessidade de um estgio larval para alimentao. O aumento da quantidade de vitelo disposio do embrio parece tornar isso possvel.
746
Figura 19.12
DESENVOLVIMENTO INDIRETO S. purpuratus, H. tuberculata
Modificaes no destino celular e gastrulao no ourio-do-mar em desenvolvimento direto e indireto. Os mapas de destino no estgio de 32 clulas mostram as diferenas de destino celular. Os destinos vegetais (indicados por sombreamento) incluem o celoma (C), intestino (G), clulas pigmentadas (P) e mesnquima esqueletognico (S). As clulas dando origem aos tecidos neurais so denotadas como N. Note que o desenvolvimento direto no produziu micrmeros e macrmeros separados. No desenvolvimento indireto forma-se uma pluteus, e dentro dessa estrutura larval as interaes formam o rudimento do ourio-do-mar juvenil (colorido). No desenvolvimento direto, tais interaes entre o celoma e as clulas do vestbulo ocorrem imediatamente na gastrulao, e o rudimento juvenil (colorido) formado sem o estgio larval de alimentao. Ambos os tipos de desenvolvimento geram as mesmas estruturas adultas. (De acordo com Raff, 1994.)
Seqestro do adulto para o primrdio da bolsa celmica Destinos em 32 clulas Pluteus 4 semanas
DESENVOLVIMENTO DIRETO Ourio-do-mar juvenil H. erythtogramma 4 dias
Destinos em 32 clulas
Sem alongamento do arquntero, iniciao do esqueleto larval, formao do intestino larval ou seqestro do primrdio embrionrio
Metamorfose em insetos
Everso e Diferenciao dos Discos Imaginais Enquanto a metamorfose em anfbios caracterizada pela remodelao de tecidos existentes, a metamorfose nos insetos freqentemente envolve a destruio de tecidos larvais e sua substituio por uma populao de clulas totalmente diferente. Existem trs padres principais de desenvolvimento dos insetos. Alguns poucos insetos, como os poduras (subordem dos colmbolos) no tm o estgio larval e se desenvolvem diretamente. Outros insetos, notavelmente gafanhotos e insetos rastejantes, sofrem uma metamorfose gradual hemimetablica (Figura 19.13A). rgos adultos so formados sem uma descontinuidade intensa. Os rudimentos da asa, rgos genitais e outras estruturas adultas esto presentes na ecloso, e se tornam mais maduros em cada muda. Na ltima muda, o inseto emergente um adulto alado e sexualmente maduro. A forma larval do inseto hemimetablico chamada de ninfa. Nos insetos holometablicos (moscas, besouros, mariposas e borboletas) existe uma transformao dramtica e sbita entre os estgios de larva e adulto (Figura 19.13B). A larva juvenil (lagarta, verme, larva de inseto) sofre uma srie de mudas enquanto se torna maior. Uma larva de inseto recm-eclodida coberta com uma dura cutcula. Para crescer, o inseto precisa produzir uma cutcula nova e maior, como tambm descartar a cutcula velha. Portanto, o desenvolvimento ps-embrionrio
747
(A) DESENVOLVIMENTO HEMIMETABLICO
(B)
DESENVOLVIMENTO HOLOMETABLICO
Muda
Muda
Muda
Muda
Muda
Muda Muda
Muda
Muda e metamorfose pupa
Muda e metamorfose
Metamorfose
Adulto
Adulto
Figura 19.13
(A) Metamorfose hemimetablica (incompleta). (B) Metamorfose holometablica (completa).
desses insetos consiste em uma sucesso de mudas. O nmero de mudas antes da fase adulta caracterstico das espcies, apesar de fatores ambientais poderem aumentar ou diminuir esse nmero. Os estgios entre essas mudas so chamados instares. Os estgios instar crescem em degraus, cada um sendo qualitativamente maior do que o anterior. Aps o ltimo estgio instar, a larva sofre uma muda metamrfica para se tornar uma pupa. A pupa no se alimenta, e sua energia deve se originar daqueles alimentos ingeridos enquanto larva. Durante a pupao, as estruturas adultas so formadas e substituem as estruturas larvais. Finalmente, uma muda imaginal permite ao adulto descartar o invlucro pupal e emergir. A Drosophila sofre quatro mudas no seu ciclo vital. O embrio se desenvolve no primeiro instar da larva e muda, em seguida, para se tornar a larva do segundo instar. Mudas subseqentes separam o segundo instar do terceiro, do terceiro para a pupa e da pupa para o adulto. Em cada muda, as clulas epidrmicas se separam da cutcula e secretam um fluido de muda nos espaos intervenientes. Aps a secreo da nova cutcula, as clulas epidrmicas degradam a velha pela ativao de enzimas no fluido de muda (Hepburn, 1985). A transformao de juvenil para adulto ocorre dentro da cutcula pupal. A maior parte do corpo antigo da larva sistematicamente destrudo ao se desenvolverem novos rgos adultos a partir de ninhos de clulas no diferenciadas,
748
Figura 19.14
Discos para: Parte da boca Placa frontal e lbio superior Antena Cabea Olho Perna Haltere Asa Abdmen Trax
As localizaes e os destinos desenvolvimentais dos discos imaginais de Drosophila melanogaster. (De acordo com Fristrom et al., 1969.)
Discos imaginais
Genitlia
Larva de Drosophila
Metamorfose
Adulto de Drosophila
os discos imaginais (e, em alguns insetos, os histoblastos). Quando o organismo adulto (imago) est desenvolvido, a muda imaginal resulta no descarte da cutcula e na emergncia do inseto adulto. Em larvas holometablicas, ento, existem dois tipos de populaes celulares: as clulas larvais, usadas para as funes do juvenis, e as milhares de clulas imaginais, as quais esperam em aglomerados o sinal para diferenciar. A Figura 19.14 mostra a localizao dos discos imaginais na Drosophila e as estruturas nas quais eles se desenvolvem. Na Drosophila existem 10 pares principais de discos imaginais, que reconstroem o adulto inteiro (com exceo do abdmen), e um disco genital que forma as estruturas reprodutivas. A epiderme abdominal se forma de um pequeno grupo de clulas imaginais chamadas histoblastos, que se situam na regio do intestino larval, e outros ninhos de histoblastos localizados em toda a larva formam os rgos internos do adulto. Os discos imaginais podem ser vistos na larva recm eclodida como espessamentos locais da epiderme. Na Drosophila esses discos recm-eclodidos do olho-antena, asa, halteres, pernas e genitais contm 70, 38, 20, 36-45 e 64 clulas, respectivamente (Madhavan e Schneiderman, 1977). Enquanto que a maioria das clulas larvais tem uma capacidade mittica limitada, os discos imaginais dividem-se rapidamente em tempos caracteristicamente especficos. Ao se proliferarem, as clulas formam um epitlio tubular que se dobra sobre si mesmo em uma espiral compacta (Figura 19.15A). O disco maior, o da asa, contm cerca de 60.000 clulas, ao passo que os discos da perna e do haltere contm 10.000 (Fristrom, 1972). Na metamorfose, essas clulas se diferenciam e se alongam (Figura 19.15B). O mapa do destino e a seqncia de alongamento do disco da perna esto ilustrados na Figura 19.16. No fim do desenvolvimento larval, o disco da perna um saco epitelial conectado epiderme larval por um delgado pednculo. Em um lado do saco, o epitlio est dobrado em uma srie de dobras concntricas, reminescentes da rosca Dinamarquesa (Kalm et al., 1995). No fim do perodo larval, as clulas do centro do disco se projetam para fora para se tornarem as pores mais distais da perna- a garra e o tarso. As clulas de fora se tornam as estruturas proximais- a coxa e a epiderme
749
(A)
(B)
Figura 19.15
Alongamento do disco imaginal. Eletromicrografia de varredura do disco da perna de Drosophila no terceiro instar antes (A) e aps (B) o alongamento. (De Fristrom et al., 1977, cortesia de D. Fristrom.)
adjacente. Aps a diferenciao, as clulas dos apndices e epiderme secretam uma cutcula apropriada para a regio especfica. Apesar dos discos serem compostos primariamente de clulas epidrmicas, um pequeno nmero de clulas adepiteliais migram para o disco no incio do desenvolvimento. Durante o perodo pupal, essas clulas do origem aos msculos e nervos que servem essa estrutura. O processo de alongamento pode ser iniciado em cultura colocando-se discos imaginais em soluo contendo o hormnio de muda, 20-hidroxiecdisona. Ainda mais, tal everso pode ser inibida adicionando um de trs conjuntos de drogas. (1) Inibidores de sntese de RNA e de protenas inibem a everso quando adicionados a discos imaginais cultivados, ao mesmo tempo que o 20-hidroxiecdisona. Sabe-se que a sntese de RNA e de protena ocorrem antes do alongamento e que algumas dessas protenas so necessrias para que isso ocorra. (2) Citocalasina B, um inibidor da funo de microfilamentos, tambm inibe o alongamento, indicando assim a necessidade de microfilamentos de actina. (3) Inibidores de proteases tambm inibem o alongamento (Pino-Heiss e Schubiger, 1989), pois proteases da superfcie das clulas so necessrias para a liberao de constritores da forma celular. Em conjunto, esses dados sugerem que a everso de discos imaginais requer sntese de novas protenas, um sistema bem desenvolvido de microfilamentos de actina e alguma comunicao celular atravs da superfcie da clula (Fristrom et al., 1977; Kalm, 1995). Estudos de Condic e seus colegas (1990) demonstraram que o alongamento do disco imaginal devido primariamente s mudanas da forma celular dentro do epitlio
Trocanter Trax presuntivo Fmur Tbia Membrana peripodial Fmur Tbia T1 Coxa T2-5 T1 Tbia Coxa Garra Trocanter Coxa (A) T1 T2-5 Garras Trax presuntivo (B) Fmur Trocanter Fmur Coxa Trax presuntivo (D) Tarso Garras Tbia Trax presuntivo (C) Fmur Tbia T1 T2-5 Trocanter Fmur
Trocanter
Figura 19.16
Seqncia de alongamento do disco da perna de Drosophila. (A) Vista da superfcie do disco no invertido. (B,C) Seco longitudinal atravs do disco da perna em alongamento e completamente invertido. t1, basitarso; t2-5, segmentos tarsais 2-5. (D) Perna adulta. (de Fristrom e Fristrom, 1975, cortesia de D. Fristrom.)
750
Figura 19.17
(A)
(B)
(C)
Modificaes na forma da clula durante o alongamento do disco imaginal da perna da Drosophila. Superior: Sees pticas atravs do segundo disco da perna em alongamento. As flechas marcam os segmentos basitarsais, e a barra de calibrao representa 100m. Inferior: Aumento maior (barra de calibrao representa 10m) dos pices celulares atravs da rea basitarsal. Os limites celulares esto marcados com faloidina marcada por fluorescncia. (A) Incio do estgio prepupal. (B) Prepupa com 6 horas. (C) Disco da perna de uma prepupa em fase inicial tratada com tripsina. As clulas basitarsais esto inicialmente comprimidas ao longo do eixo prximo-distal. Por tratamento com hidroxiecdisona ou tripsinizao, a compresso liberada, e as clulas se expandem para alongar o tecido. (de Condic et al., 1990, cortesia dos autores.)
do disco. Usando faloidina marcada por fluorescncia para corar os microfilamentos perifricos das clulas do disco da perna, eles mostraram que as clulas dos discos precoces do terceiro instar esto fortemente comprimidas ao longo do eixo prximodistal. Essa compresso mantida por vrias rodadas de diviso celular. Ento, ao se iniciar o alongamento do tecido, a compresso removida e as clulas saltam para sua forma mais arredondada (Figura 19.17). Essa converso de um epitlio de clulas comprimidas em um epitlio mais longo de clulas no comprimidas representa um novo mecanismo para a extenso de um rgo durante o desenvolvimento.
&
Especulaes
A determinao dos discos imaginais da perna e da asa

Determinao dos discos do ectoderma A biologia molecular da metamorfose de insetos comea com a especificao de certas clulas epidrmicas para se tornarem precursoras do disco imaginal. Como foi discutido no Captulo 14, os rudimentos de rgos na Drosophila so especificados em uma grade ortogonal pela interseco dos sinais ntero-posterior e dorsoventral. Na maioria dos segmentos, os produtos do gene homeobox impedem a expresso do gene Distal-less e o estabelecimento de primrdios dos membros; mas naqueles segmentos especificados para serem torcicos permitida a formao de membros (veja Figura 14.33). Cohen e colegas (1993) demonstraram que a perna e a asa se originam do mesmo conjunto de precursores imaginais, especificados na interseco entre as faixas ntero-posterior da expresso da protena Wingless (Wg) e a banda horizontal de clulas expressando a protena Decapentaplegic (Dpp). Ambas as protenas so solveis e tm um alcance limitado. No embrio precoce de Drosophila (em uma extenso da banda germinativa cerca de 4.5 horas aps a fertilizao), um nico grupo de clulas na interseco desses domnios forma os precursores do disco imaginal no abdmen. Essas clulas (e somente elas) expressam a protena Distal-less. Enquanto as clulas expressando dpp so movidas dorsalmente, essas clulas expressando Distal-less se movem para estabelecer um agrupamento secundrio de clulas imaginais (derivadas do agrupamento ventral original). Os agrupamentos iniciais formam os discos imaginais da perna, enquanto que os secundrios formam os discos da asa e do haltere. Portanto, os discos da perna e da asa tm uma origem comum (Figura 19.18). Determinao da identidade do disco Apesar de sua origem comum, bvio que os discos da perna e da asa so determinados para se tornarem estruturas diferentes. Como detalhado anteriormente, a especificao desses discos para seus destinos particulares provavelmente realizada pelas interaes dos genes hometicos. Mesmo assim, ainda no conhecemos as molculas que especificam que os discos da perna sejam diferentes dos discos da asa, ou que os discos do olho sejam diferentes dos discos da antena. Sabemos sim que quando certos genes hometicos so expressos nos lugares errados (como a expresso de Antennapedia no disco do olho-antena), os discos se
751
Clula expressando Distal-less Alcance do sinal Wg Alcance do sinal Dpp Clula expressando dpp Clula expressando wg 4.5 horas 10 horas Embrio maduro
Figura 19.18
Modelo esquemtico para a alocao e separao do disco perna-asa no trax da Drosophila. O embrio dividido em uma grade ortogonal com faixas verticais de Wingless (Wg) e uma banda horizontal de sntese e secreo de Decapentaplegic (Dpp). O disco inicial se forma na interseco desses domnios secretores. As clulas secretoras de Dpp migram dorsalmente, trazendo com elas algumas clulas do disco imaginal. Essas clulas do disco dorsal geram o disco da asa, enquanto as clulas remanescentes formam o disco da perna. (De acordo com Cohen et al., 1993.)
reespecificam (de modo que pernas nascem do disco da antena). A determinao do disco da asa parece ser regulada pelo gene vestigial, que regula a sua (do disco da asa) identidade. Usando um sistema de endereamento da expresso gnica, Kim e colegas (1996) fizeram com que o gene vestigial fosse expresso nos discos do olho, antena e perna (Figura 19.19). Quando isso acontece, regies da estrutura normal so convertidas em asa. Determinao da polaridade do disco Evidncia recente sugere que os eixos da perna e da asa so especificados por interaes nos limites de seus compartimentos (Meinhardt, 1980; Causo, 1993; Tabata, 1995). Aps essas interaes ini(A)
ciais, um sistema polar coordenado (semelhante aquele discutido no captulo anterior, para o desenvolvimento do membro de vertebrados) pode subdividir mais precisamente as regies (Held, 1995). O eixo ntero-posterior Durante o primeiro instar larval, os discos imaginais da perna e da asa adquirem seu eixo ntero-posterior (A/P). Os discos se tornam divididos em dois compartimentos representando as futuras regies anterior e posterior dos apndices (ou seja, da frente para trs da asa). O compartimento posterior definido pela expresso do gene engrailed nas clulas posteriores do disco (Figura 19.20; Garcia-Bellido et al., 1973; Lawrence e Morata, 1976). Se a funo
engrailed est ausente, todas as clulas do disco se tornam anteriorizadas. O limite entre os compartimentos anterior e posterior estritamente observado. Clulas de um lado no podem produzir descendentes que cruzam o limite para o outro lado. No disco da asa, as clulas posteriores expressam a protena Hedgehog que age como um sinal de curto alcance para induzir a expresso de Dpp nas clulas anteriores adjacentes, enquanto a expresso de engrailed nas clulas posteriores as torna no responsivas Hedgehog que elas secretam. A protena Dpp age como um sinal de longo alcance para estabelecer o eixo ntero-posterior da asa (Guillen et al., 1995; Tabata et al., 1995; Nellen et al., 1996). No disco da perna, o compartimento posterior tambm secreta a protena Hedgehog. Aqui, entretanto, Hedgehog induz as clulas dorsais do compartimento anterior a secretar Dpp enquanto essa induz as clulas ventrais do mesmo compartimento a secretar Wingless (Jiang e Struhl, 1996). O eixo dorsoventral No segundo instar da larva, um segundo eixo, o dorsoventral determinado no disco da asa. O limite D/V se situa na futura margem da lmina da asa, assim separando as superfcies superior e inferior da asa (Bryant, 1970; Garcia-Bellido et al., 1973). O gene envolvido nesse evento de compartimentao o apterous. Clulas expressando o gene apterous se tornam as clulas dorsais
Gene vestigial Protena GAL4 Intensificador do olho GAL4 Elemento ligante de GAL4 (USP) Vestigial expresso ectopicamente nas clulas do olho Crescimento semelhante asa a partir do olho ventral Olho
(B) Vista ventral da cabea da Drosophila
Figura 19.19
O gene vestigial determina a identidade do disco da asa. (A) Kim e colegas construram linhagens de Drosophila que possuem a protena ativadora transcricional do levedo GAL4 acoplada a um intensificador, tal como o intensificador do olho mostrado nesta figura. Apesar de GAL4 ser expressa nos olhos dessas moscas, no h ligao a qualquer DNA da Drosophila. Entretanto, se a mosca cruzada com outra espcie que contm o gene vestigial a vazante do elemento ligante de GAL4 (a seqncia ativadora a montante - UAS), a protena GAL4 ativa esse gene. Portanto, nessas moscas, a protena GAL4 produzida no disco do olho e ativa a expresso do gene vestigial. (B) O olho resultante contm regies do tecido da asa. (De acordo com Kim et al., 1996.)
752
Primeiro instar
Anterior Posterior
Figura 19.20
Segundo instar Ventral Dorsal A
Fim do terceiro instar
Margem Ventral
Compartimentao e expresso gnica no disco da asa. (A) No primeiro instar da larva foi formado o eixo ntero-posterior e manifestado pela expresso do gene engrailed no compartimento posterior. No segundo instar, forma-se o eixo dorsoventral, e visto pela expresso do gene apterous na futura superfcie dorsal. No terceiro instar da larva, as bordas da expresso de engrailed se estendem ligeiramente alm do limite de A/P. Onde h interao das protenas secretadas e da membrana na juno dos eixos D/V e A/P, as clulas so determinadas a se tornar a extremidade distal da asa (X). (De acordo com Blair, 1995.)
Dorsal
Lmina da asa Adulto Dorsal Ventral Margem
engrailed apterous ambos
perna realizada por interaes nos limites entre os eixos D/V e A/P. Na perna, a protena Hedgehog do compartimento posterior induz as clulas mais prximas do compartimento anterior dorsal, a secretar a protena Decapentaplegic e induz a protena Wingless das clulas mais prximas do compartimento anterior ventral. Ambas as protenas, Decapentaplegic e Wingless ativam o gene optomotorblind, cujo produto protico promove o crescimento dos apndices do membro (Wilder e Perrimon, 1995; Grimm e Pflugfelder, 1996). Ainda mais, onde essas trs protenas difusveis se encontram se define a extremidade mais distal do
membro (ou seja, a garra). Essa regio comea a expressar os genes Distal-less e arista-less que caracterizam a regio da extremidade distal e estimulam o crescimento e a diferenciao das clulas (Figura 19.21A; Campbell et al., 1993; Basler e Struhl, 1994; Diaz-Nenjumea et al., 1994). Se a protena Dpp produzida por um aglomerado de clulas no compartimento anterior ventral ou se a protena Wingless expressa por um pequeno grupo de clulas no compartimento anterior dorsal (ativando genes), um eixo prximo-distal inteiramente novo ser formado no local da expresso (Figura 19.21B; Prancha 27). A situao na asa um pouco mais difcil de compreender. A protena Hedgehog do compartimento posterior induz as clulas adjacentes dos compartimentos anterior dorsal e anterior ventral a secretar Dpp. Isso estabelece as condies de crescimento celular e padronizao ao longo do eixo A/ P. Nas clulas que do origem margem, as clulas da superfcie dorsal que expressam
(A)
Distalless
(B)
Anterior
Posterior
(Prancha 15; Frontispcio; Blair, 1993; DiazBenjumea et al., 1993). Quando o apterus deletado, todas as clulas no disco adquirem destinos ventrais. Tanto engrailed como apterous so considerados genes seletores pois eles regulam o destino de um compartimento. Da mesma maneira que os genes hometicos seletores discutidos no Captulo 14, esses genes contm homeoboxes que parecem codificar fatores de transcrio. Na asa, no h crescimento ao longo do eixo D/V, pois o ectoderma permanece com a espessura de uma camada de clulas em cada lado da margem da asa. No se sabe o que causa a polaridade inicial do D/ V no disco da perna. O eixo prximo-distal A interao entre os eixos D/V e A/P nos seus limites crtica para o crescimento ao longo do eixo prximo-distal. Durante a metamorfose, a distalizao do eixo prximo-distal da base do trax para fora em direo extremidade da asa ou da
(C)
Figura 19.21 Modelo da formao do eixo na perna da Drosophila em desenvolvimento. (A) A protena Hedgehog somente sintetizada e secretada pela clulas sintetizadoras de Engrailed no lado posterior do disco. A protena Hedgehog se difunde em uma distncia de alguns dimetros celulares e induz a faixa de clulas posteriores adjacentes na regio dorsal do disco a expressarem os genes decapentaplegic. A protena Dpp ento se difunde e padroniza o lado dorsal anterior do disco. A secreo de Hedgehog pelas clulas posteriores instrui as clulas anteriores ventrais, adjacentes s clulas posteriores, a sintetizarem e secretarem a protena Wingless. Isso ajudar a padronizar a asa anterior ventral. (B) Quando um clone de clulas expressando Wingless produzido na regio dorsal do disco (pela manipulao de um transgene wingless), esse organiza a formao de um novo eixo do membro. Aqui, esse eixo pode ser visto quando corado para a presena de expresso do gene Distalless. (C) Novo eixo de membro formado quando um clone de clulas expressando Dpp expresso ectopicamente. (B e C de DiazBenjumea et al., 1994; fotografias cortesia dos autores.)
Prancha 22 Expresso de sonic hedgehog no embrio do pinto de trs dias.
O sonic hedgehog est envolvido em numerosas interaes indutivas nas quais um tecido influencia a diferenciao de outro tecido. Hibridizao in situ da montagem total encontra mRNA de sonic hedgehog na notocorda, clulas da placa do assoalho neural, intestino anterior e mediano e no mesoderma do broto do membro posterior. Captulos 7, 8 , 15 e 18. (Fotografia cortesia de C. Tabin.)
Prancha 23 Expresso de sonic hedgehog no embrio do pinto de dez dias.
Depois de mediar vrias interaes importantes durante a formao de rgos, sonic hedgehog torna-se expresso no ectoderma dos germes das penas em desenvolvimento e escamas dos ps. Essa hibridizao in situ da montagem total mostra o arranjo hexagonal do padro das penas. Captulo 17. (Fotografia cortesia de Won-Sun Kim e John F. Fallon.)
Prancha 24 expressa muscular. A protena Myf-5 expressa em precursores da clula muscular.
Os elementos genticos regulando a expresso temporal e espacial do gene Myf-5 podem ser discernidos fundindo-se o gene da -galactosidase com as seqncias envolvendo o loco Myf-5. Aqui, uma seqncia particular a montante do gene Myf5 causa a expresso do gene (cor preta) nos msculos do pescoo, arcos farngeos, msculos oculares, msculos dos membros anteriores, e mitomos segmentados do embrio de camundongo de 13.5 dias. Captulos 2 e 9. (Fotografia cortesia de A. Patapoutian, G. Lyons, J. Miner e B. Wold.)
Prancha 25 Expresso assimtrica do gene nodal no embrio do pinto de 24 horas.
Hibridizao in situ da montagem total usando sondas para o gene nodal do pinto encontra-o expresso no mesoderma da placa lateral somente do lado esquerdo. Pode aqui ser visto como a regio de cor prpura. Esse gene importante para o estabelecimento do eixo esquerdo-direito do pinto. Captulo 16. (Cortesia de C. Stern.)
Prancha 26 Regulao da expresso hometica dos genes na formao das patas dos insetos.
Ao contrrio das lagartas das borboletas, as larvas das moscas no tm pr-pernas. Aqui, os produtos dos genes hometicos Ultrabithorax e abdominal-A esto corados de verde e a protena Distal-less (necessria para o desenvolvimento dos membros) est corada de laranja. Na larva precoce da borboleta do castanheiro Precis, os membros torcicos (de T1-3) so facilmente vistos. Alguns segmentos abdominais (A3-6) comeam a produzir buracos em seu domnio de expresso das protenas hometicas. Abaixo, quando a lagarta cresceu, a expresso de Distalless pode ser vista nessas regies. (O amarelo indica sobreposio de domnios de expresso.) Captulos 14, 19 e 23. (Fotografias cortesia de B. Warren, S. Paddock e S. Carroll.)
Prancha 27 A protena Wingless tem um papel crtico na orgaDrosophila. nizao do disco alar imaginal de Drosophila.
Clulas na juno entre os compartimentos dorsal e ventral do disco alar induzem a expresso da protena Wingless em uma estreita faixa de clulas abarcando esse limite. A protena Wingless induz ento a expresso de outras protenas tal como a Vestigial (aqui corada de vermelho) a vrios dimetros de distncia. Captulo 19. (Fotografia cortesia de K. Basler.)
Prancha 28 Expresso ectpica do gene eyeless de Drosophila causa a formao de novos olhos em outras regies do adulto.
Aqui, o gene eyeless foi ativado experimentalmente nas regies da larva da mosca que formam a cutcula da cabea. Na metamorfose, olhos compostos pigmentados emergiram desse tecido. Captulo 23. (Fotografia cortesia de W. Gehring e Science.)
Prancha 30 Expresso do fator de transcrio Oct4 no blastocisto do camundongo.
Prancha 29 levana, Polifenismo sazonal de Araschina levana, a borboleta mapeada europia.
Vrias espcies de borboletas desenvolvem-se de maneira diferente nas diferentes estaes do ano. Em A. levana, a forma de vero representada no alto; a forma de primavera representada abaixo. Neste caso, as diferenas desenvolvimentais so produzidas pelo ambiente, especificamente as diferenas na durao do dia. Captulo 21. (Fotografia cortesia de H. F. Nijhout.)
O fator de transcrio Oct4 encontrado nas clulas que iro formar o embrio, ao passo que est ausente naquelas clulas que iro formar a placenta. A cromatina est corada com iodeto de propdio (vermelho) enquanto a protena Oct4 est corada de verde. A sobreposio indicada pela cor amarela que mostra a presena de Oct4 somente nas clulas da massa celular interna. Captulos 5 e 22. (Fotografia cortesia de H. R. Schler.)
Prancha 31 Isoladores da expresso gnica.
A protena BEAF-32 liga-se a centenas de stios nos cromossomos politnicos de Drosophila, dividindo os cromossomos em domnios funcionais. Suspeitase que sinais regulatrios de um domnio no atravessem o limite para o prximo. O DNA foi corado de vermelho com iodeto de propdio. O anticorpo da protena BEAF-32 est corado de verde e a sobreposio aparece em amarelo. Captulo 11. (Fotografia cortesa de U. K Laemmli.)
Prancha 33 Expresso assimtrica da protena Flectina no corao em desenvolvimento do pinto. Prancha 32 Polaridade dorsoventral do tubo neural do pinto.
Sinais difusveis da notocorda (tubo verde em baixo) induzem a formao da placa do assoalho no lado ventral do tubo neural (verde). As clulas da placa do assoalho induzem a formao de duas regies de neurnios motor (dourado) nos lados ventrolaterais. A notocorda tambm restringe a expresso da protena Dorsalin (necessria para o desenvolvimento das clulas da crista neural) para a regio mais dorsal do tubo neural (azul). Captulos 7 e 17. (Fotografia cortesia de T. M. Jessell.)
Essa protena da matriz extracelular (corada de amarelo) acumula-se predominantemente no lado esquerdo do embrio do pinto no estgio 10. Captulos 9 e 16. (Fotografia confocal laser de varredura cortesia de K. Linask.)
Prancha 35 Localizao das clulas mesenquimatosas -mar. ourio-do-mar primrias no embrio do ourio-do-mar. Prancha 34 Cuidado parental de girinos de r.
Girinos da r de jato-venenoso reticulada (poison-dart frog) so carregados no dorso de seus pais para pequenas poas de gua na base de folhas de bromlia no dossel da floresta tropical. A fmea das espcies amaznicas do Peru, em seguida, supre ovos no-fertilizados como alimento aos girinos em desenvolvimento. Captulo 9. (Fotografia por M. Fogden/DRK Foto.)
Nesta micrografia confocal imunofluorescente somente mostrada parte da blstula mesenquimatosa. As clulas mesenquimatosas primrias esto coradas de verde e a -catenina est corada de vermelho. -catenina vista nas junes aderentes das membranas celulares embrionrias, e tambm encontrada no citoplasma e ncleos das clulas que servem de alvos para a migrao das clulas mesenquimatosas primrias. Captulo 6. (Fotografia cortesia de J. R. Miller e D. McClay.)
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Segmentos da antena Arista
ANTENA
Garras
PERNA
Coxa Segmentos tarsais Trocanter
Tbia
Fmur
Figura 19.22
Correspondncia entre pores da antena e pores da perna. No mutante Antennapedia, regies da antena so transformadas em estruturas da perna. As flechas mostram as pores da antena que formam pores correspondentes especficas da perna. Essa correspondncia foi tambm observada nos padres de transcrio de genes tais como salm. (De acordo com Postlethwait e Schneiderman, 1971.)
apterous se encontram com as clulas ventrais que no expressam apterous. O fator de transcrio de Apterous ativa a expresso dos genes fringe e serrate nas clulas dorsais (Irvine e Wieschaus, 1994; Williams et al., 1994; Kim et al., 1995). As protenas Fringe e Serrate agem promovendo a transcrio dos genes vestigial e wingless nas clulas que revestem a fronteira D/V (Frontispcio). O fator de transcrio Vestigial ativa os genes especficos da asa ventral, enquanto que a protena Wingless se difunde da clula para sinalizar a clula dorsal adjacente que expresse seus genes especficos da asa dorsal. Dessa maneira, o crescimento e a diferenciao das
superfcies dorsal e ventral da asa so coordenados. As superfcies dorsal e ventral da asa so grudadas pelas integrinas em ambos epitlios (Brower e Jaffe, 1989; Kim et al., 1996). [meta1.html] A hiptese do limite aqui discutida, no explica certas observaes envolvendo a polaridade D/V da perna ou a distalizao dos apndices. Held (1995) sugere que existe um gradiente da protena Dpp que estimula a sntese de molculas (ainda no identificadas) necessrias para estender o apndice e estabelecer a polaridade nas trs dimenses. Especificao homloga. As molculas
usadas pelos discos imaginais para especificar informao posicional podem ser as mesmas na mosca inteira. Ou seja, os discos podem especificar os destinos respectivos de suas clulas pelos mesmos mecanismos. Isso chamado de especificao homloga. Portanto, clulas no disco do olho podem responder s mesmas deixas posicionais que as clulas no disco da perna. Especificao homloga pode ser vista com certos mutantes hometicos como Antennapedia, na qual estruturas antenais so transformadas em pernas (Postlethwait e Schneiderman, 1971). Ocasionalmente, a antena inteira se torna uma perna inteira, mas mais comum que somente uma poro da antena seje parecida com a perna. No ltimo caso, a troca absolutamente especfica da posio. As clulas do disco da antena que normalmente formariam a extremidade distal da antena (arista) so transformadas na poro mais distal da perna (garra); clulas especificadas para dar origem segunda poro da antena so transformadas na segunda poro (trocanter) da perna. As partes correspondentes das duas estruturas esto ilustradas na Figura 19.22. Ento, aparente que os dois discos determinados diferentemente usam um mecanismo comum para a especificao dos destinos das clulas dentro dos respectivos discos.*
Sim, muito complexo e provvel que fique ainda mais complexo. Mas no h falta de humor. Sidney Brenner (1996) relembra a frustrao do Prmio Nobel Francis Crick com essa complexidade dizendo Deus sabe como esses discos imaginais funcionam. Brenner fantasiou uma reunio onde Crick pergunta a Deus como ele construiu essas entidades e fazendo com que o prprio Deus tambm se supreendesse com essa complexidade. Finalmente tudo o que Deus pde fazer foi assegurar a Crick que estamos construindo moscas aqui por 200 milhes de anos e no tivemos nenhuma reclamao.
Remodelao do sistema nervoso Como na metamorfose de anuros, a metamorfose de insetos causa uma grande reestruturao do sistema nervoso do organismo. Alguns nervos morrem, outros assumem novas funes. No Captulo 17, vimos o desenvolvimento de fotorreceptores a partir das clulas epiteliais do disco do olho. Aqui, um novo conjunto de neurnios gerado para assumir uma nova funo. Os neurnios que se conectaram para matar tecidos, ou morrem com o tecido ou so reespecificados para novas funes. O nervo do msculo proleg da lagarta da mariposa Manduca independentemente sensvel ecdisona e morre simultaneamente com o tecido alvo larval. Entretanto, o neurnio
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motor inervando o segundo msculo oblquo da larva sobrevive a morte de seu alvo, para inervar um msculo adulto recm-formado (o quarto msculo externo dorsal) que se diferencia durante a metamorfose (Truman et al., 1985). Em alguns casos, as funes larvais so assumidas por diferentes regies no adulto. O vaga-lume larval tem suas lanternas pareadas no oitavo (ltimo) segmento abdominal; os neurnios desse segmento controlam a luminescncia da larva. Durante a pupao, o sexto e o stimo segmentos tambm desenvolvem os fotocitos produtores de luz e os nervos para controlar a regulagem do flash. No fim da pupao, somente o sexto e o stimo segmentos tm lanternas funcionais. Ainda mais, se as lanternas larvais forem removidas, as lanternas adultas ainda se formaro (Strause et al., 1979). Portanto, o que havia sido uma funo neural dos gnglios do oitavo segmento se tornou uma funo dos gnglios do sexto e stimo segmentos. Controle Hormonal da Metamorfose de Insetos O controle hormonal da metamorfose de insetos foi mostrado nos experimentos dramticos de Wigglesworth (1934), que estudou o Rodnius prolixus, um inseto sugador de sangue que tem cinco instares antes de sofrer uma surpreendente metamorfose. Quando uma larva de Rodnius do primeiro instar foi decapitada e fundida a uma larva em muda do quinto instar, o diminuto primeiro instar desenvolveu a cutcula, a estrutura do corpo e a genitlia do adulto. Isso mostrou que os hormnios carreados pelo sangue so responsveis pela induo da metamorfose. Wigglesworth tambm mostrou que a corpora allata, perto do crebro do inseto, produz um hormnio que contra ataca essa tendncia para sofrer metamorfose. Se a corpora allata fosse removida de uma larva do terceiro instar, a prxima muda transformaria a larva em um adulto precoce. Inversamente, se a corpora allata de uma larva do quarto instar fosse implantada em uma larva do quinto instar, essas larvas se tornariam larvas enormes do sexto instar e no adultos. Sabemos atualmente que a corpora allata secreta o hormnio juvenil, um inibidor natural da metamorfose (que ser discutido em breve). Transplante de tecidos em insetos, realizados em vrios laboratrios, permitiram o estabelecimento de uma viso integrada de como se d a metamorfose. Ainda que o mecanismo detalhado da metamorfose seja diferente entre as espcies, o padro geral da ao hormonal usualmente bastante similar (Figura 19.23). Como na metamorfose dos anfbios, a metamorfose nos insetos parece ser regulada por hormnios efetores controlados por hormnios peptdicos neurosecretores no crebro (para revises, veja Gilbert e Goodman,1981; Granger e Bollenbacher, 1981). O processo de muda iniciado no crebro, onde clulas neurosecretoras liberam o hormnio protoracicotrpico (PTTH) em resposta a fatores neurais, hormonais ou ambientais. PTTH uma famlia de hormnios peptdicos com um peso molecular de aproximadamente 40.000, que estimulam a produo de ecdisona pela glndula protorcica (Figura 19.24). A ecdisona, entretanto, no um hormnio ativo, mas um pr-hormnio que precisa ser convertido para a forma ativa. Essa converso realizada por uma oxidase contendo heme nas mitocndrias e microssomos de tecidos perifricos como o corpo gorduroso. Aqui a ecdisona transformada no hormnio ativo 20hidroxiecdisona (Figura 19.25).* Cada muda ocasionada por um ou mais pulsos de 20-hidroxiecdisona. Para uma muda de uma larva, o primeiro pulso produz um pequeno aumento na concentrao de hidroxiecdisona na hemolinfa da larva (sangue) e produz uma mudana no comprometimento celular. O segundo, grande pulso de hidroxiecdisona inicia os eventos de
Desde sua descoberta em 1954, quando Butenandt e Karlson isolaram 25mg de ecdisona a partir de 500kg de pupas da mariposa do bicho-da-seda, a 20-hidroxiecdisona teve vrios nomes, incluindo -ecdisona, ecdisterona e crustecdisona.
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Hormnio protoracicotrpico (PTTH) Glndula protorcica Clulas neurossecretoras Crebro Ecdisona
PTTH
Corpus cardiacum 20-hidroxiecdisona
Hidroxiecdisona
Regulao
Corpus allatum
Epiderme L/P
L/P Epiderme
Protena ligante (JHBP) Hormnio juvenil (JH)
Hormnio juvenil
P/A discos imaginais
Disco imaginal P,L/A Epiderme P/A
JH-JHBP
Dia do quarto instar
Dia do quinto instar
Pupa
Figura 19.23
Diagrama esquemtico ilustrando o controle da muda e da metamorfose na mariposa do verme chifrudo do tabaco. Parecem haver perodos criticamente sensveis quando a presena ou ausncia de JH determina se um tecido retido no mesmo estgio ou se muda a um estado de maior maturidade. Diferentes tecidos tm diferentes perodos sensveis. (De acordo com Nijhout, 1994.)
diferenciao associados com a muda. A hidroxiecdisona produzida por esses pulsos compromete e estimula as clulas epidrmicas a sintetizar enzimas que digerem e reciclam os componentes da cutcula. Em alguns casos, condies ambientais podem controlar a muda, como no caso da mariposa do bicho-da-seda Hyalophora cecropia. Aqui, a secreo de PTTH cessa aps a formao da pupa. A pupa permanece nesse estado de suspenso chamado diapausa, durante todo o inverno. Se no for exposta ao frio, a diapausa pode durar indefinidamente. Mas se for exposta ao frio por duas semanas, a pupa pode sofrer uma muda quando retornada a uma temperatura mais quente (Williams, 1952,1956; veja Captulo 21). O segundo importante hormnio efetor no desenvolvimento de insetos o hormnio juvenil (JH). A estrutura de um ativo hormnio juvenil comum em borboletas e lagartas de mariposas est ilustrada na Figura 19.25A. O JH secretado pela corpora allata. As clulas secretoras da corpora allata so ativas durante as mudas larvais mas inativas na muda metamrfica. Esse hormnio responsvel pela preveno da metamorfose. Enquanto o JH est presente, as mudas estimuladas por hidroxiecdisona resultam em um novo instar larval. No ltimo instar larval, o nervo mediano do crebro corpora allata inibe a produo do hormnio juvenil pela glndula, e h um aumento simultneo na habilidade do corpo em degradar o JH existente (Safranek e Williams, 1989). Ambos os mecanismos causam uma queda dos nveis de JH a um valor abaixo do limite crtico. Isso desencadeia a liberao de PTTH do crebro (Nijhout e Williams, 1974; Rountree e Bollenbacher, 1986). PTTH, por sua vez, estimula as glndulas protorcicas a secretar uma pequena quantidade de ecdisona. A hidroxiecdisona resultante, na ausncia de JH, compromete as clulas
Figura 19.24
Localizao celular do mRNA de PTTH na larva de Bombyx mori (mariposa do bichoda-seda). Hibridizao in situ de um gene radioativo clonado para o peptdeo de 224 aminocidos localiza o mRNA do PTTH em duas clulas neurossecretoras no hemisfrio esquerdo do crebro e duas clulas neurossecretoras no hemisfrio direito. Nesta seo, uma clula secretora de PTTH pode ser vista em cada lado. A barra representa 100m. (de Kawakami et al., 1990, cortesia de H. Ishizaki e A. Kawakami.)
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Hormnio juvenil
Ecdisona
20-hidroxiecdisona
Figura 19.25
Estruturas de um hormnio juvenil de ocorrncia comum, ecdisona, e do hormnio ativo da muda, 20-hidroxiecdisona.
para o desenvolvimento pupal. Os mRNAs especficos para as larvas no so substitudos e novos mRNAs so sintetizados, cujos produtos proticos inibem a transcrio das mensagens larvais. Aps o segundo pulso de ecdisona, so sintetizados novos produtos de genes especficos de pupas (Riddiford, 1982), e a muda subseqente transforma o organismo de larva para pupa. Parece, portanto, que o primeiro pulso de ecdisona durante o ltimo instar larval desencadeia o processo que inativa os genes especficos da larva e prepara para transcrio os genes especficos de pupa. O segundo pulso de ecdisona transcreve os genes especficos para a pupa e inicia a muda (Nijhout, 1994). At recentemente e desde a dcada de 1950, acreditava-se que o tipo de muda era determinado pela concentrao de hormnio juvenil no momento dos pulsos de ecdisona. Altos nveis de JH induziam as larvas, nveis intermedirios produziam pupas e baixos nveis de JH produziam adultos (veja Piepho,1951; veja tambm o Captulo 20 da Quarta Edio deste livro). Entretanto, quando o ttulo de JH pde efetivamente ser determinado, encontrou-se que ele flutuava durante o perodo do ltimo instar, tendo picos e vales especficos. A metamorfose no est correlacionada a um declnio progressivo na atividade de JH e nem causada por ele. O controle da metamorfose deve ser mais complexo. Na mariposa chifruda do tabaco Manduca sexta, existem momentos quando diferentes clulas so sensveis a hormnios juvenis (veja Figura 19.23). Como regra geral, se o JH est presente em um perodo sensvel ao hormnio, o estado corrente do desenvolvimento mantido, mas se o JH estiver ausente nesse perodo esse tecido progredir a um estgio de desenvolvimento mais maduro. O incio e a durao do perodo sensvel ao JH parece ser um estado autnomo da clula e no controlado por hormnios (Nijhout, 1994). (Foi considerado que esse deve ser um momento quando receptores de JH esto disposio nesses tecidos.) Em cada instar larval existe um perodo quando a presena de JH impede a transformao da epiderme larval em epiderme pupal. Se o JH est presente, a epiderme continua a ser larval; se o JH est ausente, ela se torna pupal. Em larvas no penltimo instar, os ttulos de JH conseguem reter a epiderme no seu estado larval. Durante o ltimo instar existem duas janelas de sensibilidade ao JH. A primeira para a epiderme; nesse momento, entretanto, os nveis de JH j baixaram significativamente e a epiderme ser transformada de larval a pupal. O segundo perodo sensvel ao JH diz respeito ao tecido do disco imaginal. Nesse momento, todavia, o ttulo de JH aumentou novamente, de modo que os discos imaginais no so instrudos para inverter ou diferenciar. A muda transforma a larva em pupa (Nijhout e Wheeler, 1982). No momento seguinte, ocorrem pulsos de ecdisona, e no se identifica JH nos perodos crticos. A epiderme se transforma de pupal adulta, e os discos imaginais podem inverter e se diferenciar. A injeo de JH na pupa nesse momento pode fazer com que ele mude para uma segunda pupa (Williams, 1959). Como na metamorfose da r, a regulagem da ecdise deve ser meticulosamente coordenada. Muitos dos comportamentos vistos durante a metamorfose so caractersticos daquele estgio, e o fracasso em realiz-los deixa o inseto fatalmente enredado na sua velha cutcula. A coordenao dos movimentos e trocas de cutcula provavelmente regulada por uma cascata de hormnios, onde o hormnio da ecloso do crebro ativa a secreo de hormnios desencadeadores de ecdise pelas clulas na base de cada espirculo. Os hormnios desencadeadores de ecdise sinalizariam os gnglios abdominais de cada segmento para iniciar os movimentos que permitem que a larva descarte sua velha casca (itan et al., 1996). Na Drosophila, existe uma variao desse tema geral (Riddiford, 1993). A ecdisona liberada pela glndula em anel (uma estrutura tendo regies similares tanto ao corpus allatum como a glndula protorcica). Um pulso de ecdisona com ttulo alto no fim do terceiro instar sinaliza o incio da metamorfose. A larva cessa o movimento, inverte seus espirculos e permite que a cutcula larval endurea em um puparium (casulo pupal) que envolve o organismo durante sua metamorfose. Nesse estgio,
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os discos imaginais se invertem para formar o esquema bsico do corpo adulto, mas ainda com a cabea presa dentro da cavidade do corpo. Aps 12 horas (a 25C), um breve pulso de ecdisona desencadeia a emergncia da cabea a partir do trax e a transio de prepupa pupa. A cabea empurrada para fora pela contrao de msculos abdominais, que empurram uma bolha de ar para o interior, produzindo um espao para a cabea everter (Fristrom e Fristrom, 1993). Um surto subseqente de ecdisona completa a diferenciao final da pupa de Drosophila para a forma adulta, imediatamente antes da ecloso, a produo do adulto a partir do casulo pupal. Como em outros insetos, a Drosophila tem um hormnio de ecloso que inicia os movimentos e comportamentos que permitem ao adulto se desvencilhar de seu casulo pupal para um mundo maior. A biologia Molecular da Atividade da Hidroxiecdisona
A LIGAO DE HIDROXIECSIDONA AO DNA. Durante a muda e a metamorfose, certas regies dos cromossomos politnicos da Drosophila formam tufos em certas clulas (Veja Figura 2.13; Clever, 1966; Ashburner, 1972; Ashburner e Berondes, 1978). Esses tufos cromossmicos representam reas onde o DNA est sendo ativamente transcrito. Mais ainda, o padro especfico de rgos de formao de tufos pode ser reproduzido cultivando o tecido larval e adicionando hormnios ao meio ou fornecendo hidroxiecdisona larva em um estgio precoce. Quando a hidroxiecdisona adicionada s glndulas salivares da larva, certos tufos so produzidos e
Figura 19.26
Tufos induzidos por ecdisona em clulas cultivadas da glndula salivar de D. melanogaster. Aqui, a regio do cromossomo a mesma da Figura 2.13. A formao de tufos induzida pela ecdisona. (i) Controle no induzido. (ii-v) Cromossomos estimulados por hidroxiecdisona aps 25 minutos, 1, 2 e 4 horas. (Cortesia de M. Ashburner.)
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outros regridem (Figura 19.26). A formao de tufos mediada pela ligao de hidroxiecdisona a locais especficos nos cromossomos; anticorpos fluorescentes contra a hidroxiecdisona encontram esse hormnio localizado nas regies sensveis a ele (Gronemeyer e Pongs, 1980).
DIFERENTES RECEPTORES DE HIDROXIECDISONA EM DIFERENTES TECIDOS. Os tecidos de larvas em instares tardios podem ser grosseiramente divididos
em trs tipos com base em suas respostas hidroxiecdisona: (1) os tecidos estritamente larvais (tais como, glndulas salivares, msculo e intestino) que sofrem morte celular em resposta hidroxiecdisona; (2) os tecidos imaginais que se dividem e se diferenciam para produzir estruturas adultas quando expostos hidroxiecdisona; e (3) tecidos que sofrem extensas modificaes ou remodelagem, tais como o corpo gorduroso ou o sistema nervoso central. No se sabe como um grupo de clulas prolifera enquanto outro degenera recebendo o mesmo sinal, mas estudos recentes (Talbot et al., 1993; Truman et al., 1994) sugerem que nem todos os receptores de ecdisona so os mesmos em cada tecido. O gene para o receptor de ecdisona (EcR) pode ser alternativamente emendado dentro de trs mRNAs que fornecero trs protenas diferentes, mas relacionadas: EcR-A, EcR-B1 e EcR-B2 (Figura 19.27). Todas as clulas parecem ter um pouco de cada uma, mas os tecidos estritamente larvais e os neurnios regressivos so caracterizados por sua abundncia em EcRB1 em comparao com EcR-A. Discos imaginais e neurnios diferenciados, de outro lado, mostram uma preponderncia da isoforma EcR-A sobre EcR-B1. possvel, portanto, que os diferentes receptores ativem diferentes conjuntos de genes quando ligam hidroxiecdisona.
O BROAD-COMPLEX. Outra razo para a resposta especfica de tecidos ecdisona pode ser a presena de outros fatores de transcrio nesses tecidos. Um dos genes precoces estimulados pela ecdisona o gene Broad-Complex (Br-C). Esse um gene complexo, composto de unidades de transcrio parcialmente superpostas que criam vrias protenas de fatores de transcrio atravs de mensagens diferencialmente emendadas. Em alguns mutantes de BR-C, as glndulas salivares no morrem como normalmente o fazem na metamorfose. Em outros mutantes, a cabea no emerge ou o SNC no sofre remodelao. A marcao com anticorpos especficos para as isoformas mostra uma fascinante correlao entre o tipo de protena BRC no ncleo e o tipo de resposta ecdisona. rgos como as glndulas salivares, destinadas histlise durante a metamorfose, expressam a isoforma Z1; os discos imaginais destinados diferenciao celular expressam a isoforma Z2; e o sistema nervoso central (que sofre intensa remodelao na metamorfose) expressa todas as isoformas, com Z3 predominando (Figura 19.28; Emery et al., 1994). Moscas
Figura 19.27
Formao dos receptores de ecdisona. Emendas alternativas no mRNA de transcritos do receptor de ecdisona (EcR) cria trs tipos de mRNAs de EcR. Esses geram protenas com os mesmos stios de ligao tanto para o DNA como para a hidroxiecdisona, mas com aminoterminais muito diferentes. (De acordo com Talbot et al., 1993.)
A1 A2 A3
Sntese de mRNA
Protena EcR
Seqncias lider ou seguidora (no traduzidas) xons traduzidos ntrons Stio de ligao de DNA Stio de ligao de ecdisona
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(A) Anti Z3 Corpo gorduroso Glndula salivar
(B) Colorao de DNA Corpo gorduroso Glndula salivar
Figura 19.28
Especificidade das isoformas do BroadComplex. Anticorpos fluorescentes localizam a isoforma Z3 nos ncleos do corpo gorduroso mas no nos ncleos das glndulas salivares. (A) Preparaes de cromossomos do corpo gorduroso (esquerda) e da glndula salivar (direita) marcados com anticorpos especficos isoforma Z3 do Broad-Complex. (B) As mesmas preparaes coradas para DNA. (Fotografias cortesia de I. Emery.)
transgnicas demonstraram que essas diferenas so funcionalmente importantes. Transcrio de genes dependente de ecdisona nas glndulas salivares (finalmente levando sua destruio) envolve a expresso precoce, dependente de ecdisona, da isoforma Z1 do Broad-Complex. As protenas Z2, Z3, ou Z4 no sero suficientes (Crossgrove et al., 1996). Essas isoformas tambm tm correlao com os tipos de mutao gerados pelos alelos mutantes nesse loco. Portanto, a especificidade de resposta pode ser controlada por uma isoforma especfica do Broad-Complex que estimulada pela ecdisona. Entretanto, algum outro fator no tecido larval deve interagir com o mecanismo de emenda na clula produzindo a estrutura especfica do xon na mensagem BR-C.
DIFERENTES RECEPTORES DE ECDISONA DENTRO DE UMA NICA CLULA.
Complexo receptor de ecdisona (EcR)
Hidroxiecdisona EcR
As respostas hidroxiecdisona devem ser coordenadas tanto temporal quanto espacialmente. Assim, em adio heterogeneidade de respostas hidroxiecdisona entre tecidos, existe tambm uma heterogeneidade de respostas dentro de uma clula individual. Os tufos sensveis hidroxiecdisona ocorrendo nos estgios tardios da larva no terceiro instar (ao se preparar para formar a pupa) podem ser divididos grosseiramente em trs categorias: tufos que regridem devido hidroxiecdisona; tufos que a hidroxiecdisona induz rapidamente; e tufos vistos inicialmente algumas horas aps a estimulao. Por exemplo, nas glndulas salivares da larva, cerca de seis tufos emergem dentro de poucos minutos aps o tratamento com hidroxiecdisona. Esses genes no necessitam de sntese de protena para serem ativos. Um conjunto muito maior de genes induzido mais tarde no desenvolvimento, e esses necessitam de sntese protica para serem transcritos. Ashburner (1974, 1990) predisse que os genes precoces produzem uma protena que essencial para a ativao dos genes tardios. Ainda mais, essa prpria protena desligaria a transcrio do gene precoce (Figura 19.29). Pesquisas recentes suportam essa idia e sugere que os genes precoces representam fatores de transcrio que podem mediar o efeito da ecdisona. Os receptores de ecdisona (EcRs) constituem uma famlia de fatores de transcrio derivados de um nico gene, e eles ligam esse hormnio esteride e o trazem regio especfica do DNA. Como nos receptores ligantes de esterides dos vertebrados, os EcRs formam
Tufo precoce Sntese de protena
Tufo tardio
Figura 19.29
Modelo de Ashburner da regulao de hidroxiecdisona da transcrio. A hidroxiecdisona se liga ao seu receptor e esse composto se liga a um gene de tufo precoce e a um gene de tufo tardio. O gene do tufo precoce ativado, e seu produto protico (1) reprime a transcrio de seu prprio gene e (2) ativa o gene do tufo tardio, talvez por deslocar o receptor de ecdisona. (De acordo com Richards, 1992.)
760
Figura 19.30
(A)
Formao do puparium
Padres de expresso gnica regulada por ecdisona na metamorfose de Drosophila. (A) Padro temporal da expresso gnica. Os pulsos de ecdisona so as barras verticais na parte superior, a altura corresponde intensidade dos pulsos. O desenvolvimento progride da esquerda para a direita, comeando com o terceiro instar, as mudas so representadas por linhas pontilhadas. (B) Interaes subjacentes aos padres de transcrio temporal. Flechas representam ativao, enquanto as linhas bloqueadas representam os efeitos repressivos. (De acordo com Thummel, 1996.)
Pupa Larva do terceiro instar Prepupa Picos de ecdisona
mRNAs precoces
mRNA precoce-tardio mRNA prepupal intermedirio Genes de adeso Genes tardios L71 (B) Larva precoce do terceiro instar Baixa concentrao de ecdisona Genes de resposta secundria
Larva tardia do terceiro instar Alta concentrao de ecdisona
Prepupa intermediria Baixa concentrao de ecdisona
Prepupa tardia Alta concentrao de ecdisona
Genes ng Pig-1
Genes de adeso
Genes tardios L71
Genes tardios
heterodmeros. Os receptores de ecdisona no ligam ecdisona ou suas respectivas seqncias de DNA sem antes formar um heterodmero com o produto do gene ultraspiracle (USP) (o anlogo do receptor retinide em Drosophila; Yao et al., 1992; Thomas et al., 1993). Quando o heterodmero EcR/USP est formado, ele liga a hidroxiecdisona e ativa os genes responsivos ecdisona mais precoces. Algumas dessas interaes esto sendo elucidadas. Como ilustrado na Figura 19.30, os genes EcR, BR-C e E74B so expressos em baixas concentraes de ecdisona, tais como aquelas encontradas no final do perodo do terceiro instar. As protenas BRC so necessrias para manter a transcrio dos genes das protenas de aderncia (as protenas de aderncia permitem pupa da Drosophila aderir ao seu substrato) e a reprimir genes larvais anteriores. E74B necessria tanto para manter a ativao dos genes de aderncia como para reprimir genes como o L71 cujas protenas formam o puparium. No fim do perodo do terceiro instar, existe um pulso alto e caracterstico de ecdisona. Essas concentraes mais altas de ecdisona reprimem os genes da aderncia
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e substituem a transcrio do gene E74 que em lugar de sintetizar E74B passa a transcrever a protena E74A relacionada.* Enquanto E74B inibia a expresso do gene L71, E74A a estimula (Urness e Thummel, 1995). Nesse e em outros casos, est ocorrendo a transio de larva para pupa. Alm disso, a cascata de ativaes e represses transcricionais pode gerar novos receptores de ecdisona. Quando o gene EcR desacelerado na formao do puparium, os produtos dos genes E75 ou E78 podem assumir suas funes (Koelle et al 1991; Stone e Thummel, 1993). Dessa maneira, a ecdisona induz uma cascata de fatores de transcrio que podem ativar ou reprimir diferentes conjuntos de genes. Assim, possvel que a ecdisona inicie ondas de ativao transcricional, e que diferentes nveis do hormnio possam ativar diferentes conjuntos de genes. Dessa maneira, o desenvolvimento da Drosophila parece ser semelhante ao dos anfbios, a coordenao das mudanas sendo orquestradas por diferentes concentraes de hormnios. Os alvos desses fatores de transcrio esto comeando a ser identificados. Alguns desses alvos parecem ser fatores de competncia que do a outros genes a possibilidade de serem induzidos mais tarde no desenvolvimento. Por exemplo, na metade do estgio prepupal o ttulo de ecdisona diminudo. Isso torna possvel a transcrio de outro fator, FTZ-F1. O gene codificando FTZ-F1 necessita ter um pulso anterior de ecdisona para se tornar potencialmente ativo, mas ele inicia a transcrio somente quando o ttulo do hormnio diminudo. Outros alvos podem incluir os genes reaper e hid, que se tornam ativados naqueles tecidos (como as glndulas salivares) que sofrem morte celular dependente de ecdisona. A biologia molecular est comeando a interpretar uma das mais fascinantes redes de interaes conhecidas da biologia do desenvolvimento e certamente um dos primeiros exemplos de desenvolvimento animal que conhecemos- a metamorfose da larva para um inseto adulto.
* As protenas E74A e E74B se originam do mesmo gene pela ativao de diferentes promotores. Ambas partilham a mesma ponta carboxi-terminal com sua regio de ligao a DNA. Entretanto, a protena E74A tem um amino terminal mais longo. Os mRNAs de E74B so transcritos em concentraes de ecdisona dez vezes menores do que aquelas necessrias para ativar a transcrio das mensagens de E74A (Karim e Thummel, 1991).
&
Especulaes
Controle ambiental sobre a forma e a funo da larva
MAIORIA DAS DISCUSSES no desenvolvimento se limitam ao interior do corpo do organismo. Entretanto, o desenvolvimento de um organismo algumas vezes pode ser regulado por fatores ambientais, fora do corpo. Existem vrios tipos de fenmenos desenvolvimentais onde substncias produzidas por um organismo (freqentemente de outra espcie) induz modificaes no desenvolvimento de outro organismo. Quando Karel Slma veio da Checoslovquia para trabalhar no laboratrio de
Carroll Williams em Harvard, ele trouxe consigo seu principal animal experimental, o inseto de plantas Europeu Pyrrhocoris apterus. Para a consternao geral do laboratrio, os insetos no sofreram metamorfose no fim do quinto instar, mas se tornaram grandes larvas do sexto instar- o que nunca havia sido observado no laboratrio ou na natureza- e no fim morreram antes de se tornarem adultos. Aps o teste de muitas variveis, foram testadas as toalhas de papel que forravam os recipientes para verificar seu efeito sobre
as larvas. Os resultados foram tanto conclusivos como surpreendentes: larvas cultivadas sobre papel Europeu (incluindo pginas da revista Nature) sofriam metamorfose como sempre, mas as larvas criadas em papel Americano (tais como cpias descartadas da revista Science) no sofreram metamorfose. Finalmente, foi verificado que a fonte do papel Americano era um abeto balsmico, uma rvore indgena do Norte dos Estados Unidos e Canad. Essa rvore sintetiza um composto muito semelhante ao hormnio juvenil
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Primeiro estgio da ninfa
Segundo estgio da ninfa
Terceiro estgio da ninfa
Quarto estgio da ninfa
Quinto estgio da ninfa
Adulto
Precoceno 1 Aps tratamento com precocenos no estgio 2
Figura 19.31
Adulto precoce Precoceno 2 (A) (B)
Metamorfose precoce no inseto Dysdercus causada por precocenos. (A) Estrutura de dois precocenos ativos encontrados em plantas. (B) Desenvolvimento inibido no Dysdercus. Quando ninfas no segundo estgio so tratadas com precocenos, elas se metamorfoseiam em adultos precoces estreis em lugar de continuar sua seqncia de mudas do desenvolvimento normal. (De acordo com Bowers et al., 1976.)
(Bowers et al., 1966; Slma e Williams, 1966; Williams, 1970), e provavelmente usa esse anlogo do hormnio juvenil para se livrar de certos predadores de insetos. Outras plantas tm compostos que produzem o mesmo efeito- a morte de predadores de insetos- mas o fazem induzindo a metamorfose muito cedo. Dois compostos que foram isolados de ervas compostas causam metamorfose precoce em larvas de certos insetos transformandoos em adultos estreis (Bowers et al., 1976). Esses compostos so chamados preco-
cenos e suas estruturas qumicas esto representadas na Figura 19.31A. Quando as larvas ou ninfas desses insetos so pulverizadas com qualquer um dos compostos, elas sofrem mais uma muda e se metamorfoseia forma adulta (Figura 19.31B). Precocenos causam a morte seletiva das clulas do corpus allatum no inseto imaturo (Schooneveld, 1979; Pratt et al., 1980). Essas clulas so responsveis pela sntese do hormnio juvenil. Sem esse hormnio, a larva comea suas mudas metamrficas e imaginais. Mais ainda, o
hormnio juvenil tambm responsvel pela maturao do ovo do inseto (Captulo 21). Sem esse hormnio, as fmeas so estreis. Assim, os precocenos podem proteger as plantas causando uma metamorfose prematura de certas larvas de insetos a adultos estreis.*
Muitas mais dessas mudanas induzidas pelo ambiente no desenvolvimento das larvas sero discutidas no Captulo 21.
Interaes hormonais mltiplas no desenvolvimento da glndula mamria

O desenvolvimento das mamas iniciado durante o desenvolvimento embrionrio, mas somente completado no mamfero lactante no fim da gravidez. Durante o desenvolvimento da mama, diferentes hormnios fornecem informao variada ao tecido rudimentar. O desenvolvimento da mama pode ser dividido em quatro estgios: o estgio embrionrio; o estgio adolescente, a gravidez e a lactao. Os produtos diferenciados das glndulas mamrias, casena e outras potenas do leite, so produzidos somente durante o estgio final (Topper e Freeman, 1980). Estgio embrionrio No desenvolvimento normal da fmea do camundongo, duas bandas elevadas de tecido epidrmico aparecem em ambos os lados da linha mediana ventral no dia 11 da gestao. Esse tecido chamado de crista mamria. Dentro de cada crista, as clulas se renem em centros de concentrao e l permanecem formando os brotos mamrios (Figura 19.32). No camundongo existem cinco desses brotos em cada lado; nos humanos, somente um por lado. Nos dias imediatamente antes do nascimento, as clulas epiteliais nesses lugares proliferam-se rapidamente, dando origem
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(A)
Figura 19.32
Seqncia do desenvolvimento precoce da glndula mamria no camundongo fmea. (A) Broto mamrio no feto de 12 dias. Clulas ectodrmicas epiteliais invadem o mesnquima. (B) Corda mamria de um feto de 15 dias. Uma pequena fenda no fundo sinaliza o incio da ramificao. (C) Cavidade da corda se estendendo para formar um lmen oco no feto de 20 dias. (de Hogg et al., 1983, cortesia de C. Tickle.)
(B)
(C)
corda mamria. Essa corda abre na pele, em uma extremidade, formando um mamilo enquanto a outra extremidade comea a se ramificar em dutos. Aqui o desenvolvimento cessa at a puberdade. O desenvolvimento do tecido mamrio no camundongo macho idntico ao da fmea at 13-15 dias de gestao. Nessa poca, o mesnquima se condensa ao redor do centro do broto mamrio, e as clulas da corda morrem. Portanto, uma pequena corda de clulas epiteliais destacada da pele (Figura 19.33), e a glndula mamria no se estende at a superfcie. No ocorre desenvolvimento adicional. Essa morte celular na corda mamria dos machos tem sido estudada cultivando os brotos mamrios in vitro. Tais brotos de camundongos fmeas normalmente desenvolvem lbulos conectados superfcie (Figura 19.34). Entretanto, se testosterona adicionada ao meio de cultura, os brotos se degeneram. Os brotos mamrios de camundongos machos tambm desenvolvem lbulos quando cultivados em ausncia de testosterona; portanto, o hormnio testosterona impede o desenvolvimento mamrio no macho. A testosterona motiva essa morte celular especfica instruindo as clulas mesenquimatosas a destruir a corda epitelial. Isso foi mostrado por uma srie de experimentos de recombinao. Existe em camundongos (e tambm em humanos) uma mutao chamada sndrome de insensibilidade andrognica, na qual indivduos cromossomicamente machos (XY) no produzem um receptor funcional de testosterona. Assim, apesar desses indivduos possurem testculos que esto secretando testosterona ativamente, eles so incapazes de responder a ela. Um dos resultados que esses indivduos tm um desenvolvimento mamrio do tipo feminino (veja Figura 19.9). Kratochwil e Schwartz (1976) isolaram clulas epiteliais e mesenquimatosas a partir de brotos mamrios normais e mutantes e os cultivaram em vrias combinaes. Algumas culturas tiveram a adio de testoterona e outras no. Os resultados esto mostrados na Figura 19.35. Quando ambos, o mesnquima e o epitlio, eram do tipo selvagem, o rudimento se desenvolvia em tecido mamrio.
Figura 19.33
Rudimento mamrio em um feto de camundongo macho. O rudimento (flecha) se separou da epiderme. (de Raynaud, 1961.)
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Figura 19.34
Epiderme
Papel da testosterona como mediador do desligamento da corda mamria. (A) O tecido mamrio do camundongo fmea, in vivo ou em cultura, crescer para baixo a partir da epiderme e se ramifica. (B) Quando o tecido mamrio do camundongo fmea cultivado na presena de testosterona, o broto se alonga, mas as clulas mesenquimatosas se agregam ao redor da haste e a poro inferior separada, exatamente como no desenvolvimento normal do macho. (C) Quando o tecido mamrio do camundongo macho cultivado em ausncia de testosterona, o desenvolvimento o mesmo que o da fmea. (De acordo com Kratochwil, 1971.)
Broto
Derme
Haste
Lbulos (A) TECIDO NORMAL DE FMEA (B) TECIDO DE FMEA MAIS TESTOSTERONA (C) TECIDO DE MACHO SEM TESTOSTERONA
Quando testosterona foi adicionada, o mesnquima se condensou ao redor do broto e a corda foi separada. Quando epitlio normal foi cultivado com mesnquima mutante (que no podia responder testosterona), o desenvolvimento normal da mama ocorreu na presena de testosterona. Entretanto, quando o mesnquima era normal e o epitlio mutante, a testosterona era capaz de causar a degenerao da corda
Figuras 19.35
Evidncia de que a clula mesenquimatosa o alvo da testosterona na interrupo do desenvolvimento mamrio. (A) Cultivo de um rudimento mamrio de um embrio de fmea de 14 dias. (B) Rudimento mamrio de um embrio de macho de 14 dias comeando sua resposta testosterona. (C) Broto mamrio recombinado contendo clulas epiteliais do tipo selvagem e mesnquima insensvel a andrgenos, cultivado com testosterona. No se verifica resposta a andrgenos. (D) Broto mamrio recombinado contendo clulas epiteliais insensveis a andrgenos e mesnquima do tipo selvagem, cultivado com testosterona. As clulas mesenquimatosas esto condensando na constrio do broto. (de Kratochwil e Schwartz, 1976, cortesia de K. Kratochwil.)
(A)
(B)
(C)
(D)
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mamria. Assim, o alvo da testosterona o mesnquima e no o epitlio. O mesnquima deve ser responsivo testosterona para que sua ao ocorra. Nos machos, a testosterona induz o mesnquima mamrio a destruir seu epitlio adjacente. O efeito especfico para o rgo visto que nenhum outro mesnquima destruir o epitlio mamrio, e nenhum outro epitlio pode ser destrudo pelo mesnquima mamrio (Drnberger e Kratochwil, 1980). Adolescncia Durante a adolescncia (que no camundongo ocorre da semana 4 semana 6), o sistema de dutos da glndula mamria prolifera extensivamente. As clulas alveolares secretoras de leite nas extremidades dos dutos ainda no se diferenciaram e o leite no produzido. A extensa diviso celular est sob o controle de hormnios estrognio e de crescimento e parece estar concentrada nas extremidades dos dutos. Estudos da pesquisadora Coleman e seus colegas (1988) implicaram o fator de crescimento epidrmico (EGF) como o fator responsvel pelo crescimento dos dutos nesse perodo. Eles implantaram pletes plsticos de lenta liberao contendo EGF em glndulas mamrias de camundongos de 5 semanas. Os ovrios desses camundongos haviam sido removidos e, portanto, seu desenvolvimento mamrio foi interrompido. Os dutos adjacentes ao implante de EGF reiniciaram seu crescimento e desenvolvimento morfolgico, ao passo que os dutos mais distantes no o fizeram (Figura 19.36). Ainda mais, quando seces da glndula mamria foram incubadas com EGF radioativo, o EGF foi detectado na extremidade dos dutos e associado com as clulas sofrendo mitose. Provavelmente o EGF age diretamente causando o crescimento das glndulas mamrias durante a adolescncia.* Gravidez e lactao Entre a adolescncia e a gravidez, as clulas da mama no camundongo esto mitoticamente dormentes e indiferenciadas. Esse estado se modifica durante a segunda metade da gravidez. Sob a influncia dos hormnios estrognio e progesterona (o ltimo da placenta), novos dutos so formados, e suas clulas distais comeam a desenvolver as caractersticas de um tecido secretor.
O receptor do fator de crescimento epidrmico (EGFR) pode ser um elemento chave na etiologia dos cnceres de mama (que afetam uma em cada oito mulheres nos Estados Unidos). Considera-se que alguns cnceres de mama podem se desenvolver se o estrognio induz TGF-, um ligante alternativo para o EGFR. A ativao de EGFR causaria a contnua proliferao do tecido mamrio (Sainsbury et al., 1985; Klijn et al., 1992; McIntyre et al., 1995).
Figura 19.36
Crescimento da glndula mamria dependente de EGF em ausncia de estrognio. (A) No se observa crescimento de dutos ou diferenciao em camundongos deficientes em estrognio quando um plete de albumina de soro bovino (*) implantado na glndula mamria. (B) Quando um plete contendo EGF implantada na glndula mamria deficiente em estrognio, dutos vizinhos aumentam de tamanho e desenvolvem tecido lobular em suas extremidades (flechas). (C) Desenvolvimento normal dos dutos mamrios em um camundongo controle de 5 semanas virgem. (de Coleman et al., 1988, cortesia de S. Coleman.)
(A)
(B)
(C)
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Clula precursora
Clula secretora secretando casena
Insulina e hidrocortisona (diviso celular e diferenciao)
Prolactina (sem diviso celular)
Insulina (diviso celular) Retculo endoplasmtico rugoso (A) (B)
Figura 19.37
Diferenciao da glndula mamria dependente de hormnios. (A) Diagrama esquemtico do desenvolvimento dependente de hormnio da glndula mamria in vitro. (B) Auto-radiografia da glndula mamria de um camundongo virgem com uma sonda de cDNA radioativo para o mRNA da casena. (C) Auto-radiografia da glndula mamria de um camundongo em lactao, com uma sonda de cDNA reconhecendo a mensagem da casena. (D) Autoradiografia da glndula mamria de um camundongo virgem incubada com insulina, hidrocortisona e prolactina, 72 horas antes de ser submetida a uma sonda de cDNA para a mensagem da casena. (A de acordo com Turkington, 1968; B-D de Liscia et al., 1988; fotografias cortesia de G. Smith.)
(C) (D)
Quando glndulas mamrias da metade da gravidez so cultivadas in vitro, a maior parte das clulas tem pouco retculo endoplasmtico rugoso e aparelho de Golgi e no tem grnulos de casena. Quando insulina ou outro promotor de sntese de DNA adicionado a essas culturas, as clulas se tornam responsivas a outros hormnios (Turkington et al., 1965). ( provvel que a insulina esteja apenas mimetizando os efeitos dos lactognios placentrios, hormnios que tm uma estrutura semelhante e so produzidos durante a gravidez). Glucocorticides ento induzem a formao do retculo endoplasmtico rugoso, onde a casena e outras protenas so sintetizadas. Quando o camundongo d luz, a prolactina secretada. A prolactina causa a transcrio do gene da casena e estabiliza a mensagem da casena uma vez formada (Figura 19.37). Durante o perodo de lactao (quando os filhotes esto mamando), um camundongo fmea pode produzir cerca de 10% do seu peso corporal em leite por dia. Quase 80% das protenas daquele leite so casenas, e destas, a -casena a mais abundante. O promotor do gene da -casena no camundongo est localizado imediatamente a montante do gene de -casena e ligado por um fator de transcrio, o fator da glndula mamria (MGF). Altos nveis desse fator de transcrio se acumulam perto do fim da gravidez e na lactao, mas o fator inativo a no ser que seja fosforilado. A fosforilao de MGF ocorre quando a prolactina rene seus dois receptores na superfcie da clula. Isso ativa seus domnios de tirosina quinase, que fosforilam uma tirosina
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Matriz extracelular
Matriz extracelular
Substratos
Matriz extracelular
Matriz extracelular
Nveis de mRNA de -casina em culturas de clulas da glndula mamria de camundongo em diferentes condies de cultura. (A) mRNA endgeno de -casena quando as clulas foram cultivadas durante 6 dias em matriz extracelular ou plstico em meio contendo hormnios como insulina, hidrocortisona ou prolactina. A matriz extracelular e a prolactina foram essenciais. (B) Expresso do gene reprter CAT quando fundido a uma construo contendo o intensificador e o promotor de -casena. O gene fundido foi transfectado para clulas mamrias do camundongo cultivadas durante 6 dias sob vrias condies de substrato e hormnios. O gene fundido foi expresso somente em presena de prolactina e matriz extracelular. Sem o intensificador (tendo somente o promotor), no houve transcrio em nenhuma das condies. (De acordo com Schmidhauser et al., 1992.)
Insulina, hidrocortisona + prolactina
Figura 19.38
(A)
Insulina + prolactina
Insulina + hidrocortisona
Hormnios
Plstico
Plstico
Somente Insulina
especfica na molcula de MGF. O MGF fosforilado pode entrar no ncleo e se ligar regio do promotor nos genes das protenas do leite (Groner e Gouilleux, 1995). A separao dos filhotes da me durante a lactao resulta em um rpido decrscimo da atividade de MGF. A volta amamentao dos filhotes faz com que a atividade volte ao seu mximo dentro de 4 horas. O efeito pode ser mediado pelos hormnios pituitrios ou hipotalmicos que so responsivos suco (Schmitt-Ney et al., 1992). A casena sintetizada nas clulas mamrias competentes em resposta prolactina somente quando as clulas esto ancoradas a uma matriz extracelular (Figura 19.38). O intensificador de -casena responsivo a ambos, a prolactina e a matriz extracelular. Usando um gene reprter (CAT) ligado a diferentes regies da seqncia flanqueando a ponta 5, Schmidhauser e colegas (1992) encontraram uma seqncia com 160 pares de bases, a 1517 pares de bases do stio de incio da transcrio (Figura 19.39). Esse stio intensificador s funciona em clulas mamrias, e responsivo prolactina e matriz extracelular (veja Figura 19.38B). Portanto, o desenvolvimento da glndula mamria envolve uma complexa interao de vrios hormnios, protenas parcrinas e fatores ambientais em quatro diferentes estgios da vida: embrionrio, adolescncia, gravidez e lactao. A glndula mamria nunca se desenvolve em machos normais e no se torna um rgo completamente diferenciado nas fmeas at a metade da gravidez no organismo adulto. Estudos desse rgo nos deu uma viso da complexidade do controle local e hormonal no desenvolvimento de mamferos.
Plstico
Auto-radiograma -casena
(B)
Sntese de CAT
Intensificador de -casena
Promotor de -casena
Gene CAT
Delees no 5 da -casena
Atividade de CAT CAT (cpm convertidas/min/g)
Figura 19.39
Construes importantes na identificao do intensificador do gene da -casena no camundongo. O gene CAT foi usado como um reprter e foi fundido ponta 5 do gene da -casena no camundongo. A exonuclease removeu pedaos sucessivamente maiores da regio do gene flanqueando a ponta 5. Enquanto o gene contendo 1677 pares de bases na seqncia flanqueando a ponta 5 foi totalmente ativo, a seqncia contendo somente 1517 pares de bases apresentou pouca atividade. Portanto, foi postulado que o intensificador estava dentro dos 160 pares de bases. (De acordo com Schmidhauser et al., 1992.)
Plstico
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Vimos que a regulao difusvel nas interaes clula-clula so tambm importantes na regulao do desenvolvimento. Estudando a reativao do desenvolvimento que ocorre durante a metamorfose e o desenvolvimento da mama, podemos identificar o papel dos hormnios na elicitao de novos padres de diferenciao e morfognese. Podemos tambm ver as interaes entre o desenvolvimento do organismo e o ecossistema do qual ele faz parte. No prximo captulo, estudaremos os papis de fatores difusveis e autnomos da clula nos processos responsveis pelo desenvolvimento das gnadas e pela determinao do sexo.
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Determinao do sexo
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A reproduo sexual ... a obra-prima da Natureza. ERASMUS DARWIN (1791) curioso notar que o nmero de especulaes conectadas com a natureza do sexo praticamente dobraram desde que Drelincourt, no sculo dezoito, reuniu duzentas e sessenta e duas hipteses sem fundamento, e desde que Blumenbach causticamente observou que nada era mais certo do que a teoria do prprio Drelincourt constituir a ducentsima sexagsima terceira hiptese. J. A. THOMSON (1926)
das grandes perguntas da embriologia desde a antigidade. Aristteles, que colecionava e dissecava embries, afirmava que o sexo era determinado pelo calor do parceiro masculino durante a relao sexual. Quanto mais calorosa a paixo, maior era a probabilidade de uma prognie masculina. (Aristteles aconselhava homens idosos a conceber no vero se quisessem ter herdeiros masculinos.) Aristteles (ca. de 335 A.C.) promulgou uma hiptese muito direta para determinao sexual: as mulheres eram homens cujo desenvolvimento havia parado porque o frio do ventre materno suplantara o calor do smen masculino. Mulheres eram mais frias e mais passivas que os homens, e os rgos sexuais femininos no haviam amadurecido at o ponto em que poderiam prover sementes ativas. Essa viso foi aceita pela igreja crist e por Galeno (cujos textos de anatomia foram o padro durante mais de 1000 anos). Ao redor do ano 200 D.C., Galeno escreveu: Assim como a espcie humana a mais perfeita de todos os animais, assim dentro da humanidade, o homem mais perfeito que a mulher, e a razo para essa perfeio seu excesso de calor, pois o calor o instrumento primrio da Natureza... a mulher menos perfeita que o homem em relao s suas partes geradoras. Porque as partes foram formadas em seu interior enquanto ela ainda era um feto, mas devido ao defeito do calor, no podiam emergir e se projetar para o exterior. O ponto de vista que as mulheres eram apenas homens subdesenvolvidos e que seus rgos genitais eram iguais aos dos homens, somente virados de dentro para fora, foi muito popular durante mais de mil anos. Mesmo em 1543, Andreas Vesalius, o anatomista paduano que derrubou muito da anatomia de Galeno (e que se arriscou censura pela igreja por reiterar que homens e mulheres tm o mesmo nmero de costelas), manteve esse conceito. As ilustraes de seus dois principais trabalhos, De Humanis Corporis Fabrica e Tabulae Sex, mostram que ele via a genitlia feminina como uma representao interna da genitlia masculina (Figura 20.1). Apesar disso, o livro de Vesalius iniciou uma revoluo na anatomia, e ao fim do sculo XVI, os anatomistas descartaram as representaes galnicas da anatomia feminina. Durante os sculos XVII e XVIII, seres femininos foram reconhecidos como produtores de ovos que podiam
S MECANISMOS pelos quais determinado o sexo de um indivduo uma
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774
(A)
(B)
transmitir traos parentais, e a fisiologia dos rgos sexuais comeou a ser estudada. Ainda assim, no havia consenso sobre como os sexos eram determinados (veja Horowitz, 1976; Tuana, 1988; Schiebinger, 1989). Naquele tempo o ambiente em especial, calor e nutrio - eram acreditados ser de importncia para a determinao do sexo. Em 1890, Geddes e Thomson resumiram todos os dados disponveis sobre a determinao sexual, e chegaram concluso que constituio, idade, nutrio e ambiente dos pais deveriam ser especialmente considerados em qualquer dessas anlises. Eles argumentavam que fatores favorecendo a armazenagem de energia e nutrientes influenciavam a favor de prognie feminina, enquanto que fatores favorecendo a utilizao da energia e nutrientes influenciavam a favor de prognie masculina. Essa viso ambiental da determinao sexual permaneceu a nica teoria cientfica importante at a descoberta do trabalho de Mendel em 1900 e da redescoberta do cromossomo sexual por McClung em 1902. Baseado em seu conhecimento do Mendelismo, Correns especulou que a relao sexual 1:1 da maioria das espcies, podia ser conseguida se o macho fosse heterozigoto e a fmea homozigota para algum fator determinante do sexo. Porm, somente em 1905 a correlao (em insetos) do sexo feminino com os cromossomos sexuais XX e do sexo masculino com os cromossomos XY ou XO foi estabelecida (Stevens, 1905; Wilson, 1905). Isso sugeriu fortemente que um componente nuclear especfico era responsvel pelo direcionamento do desenvolvimento do fentipo sexual. Assim, acumulou-se evidncia que a determinao sexual ocorria por herana nuclear em vez de por circunstncias ambientais. Hoje, achamos que tanto os mecanismos ambientais como os internos da determinao sexual podem atuar em diferentes espcies. Iremos primeiro discutir os mecanismos cromossmicos da determinao do sexo, e em seguida considerar os meios pelos quais o ambiente regula o fentipo sexual.
Determinao cromossmica do sexo em mamferos

Determinao Sexual Primria A determinao sexual primria se refere determinao das gnadas. Nos mamferos, a determinao do sexo estritamente cromossmica e no usualmente influenciada pelo ambiente. Na maioria dos casos, a fmea XX e o macho XY. Cada indivduo tem que ter ao menos um cromossomo X. Como a fmea XX, cada um de seus vulos tem um nico cromossomo X. O macho, sendo XY, pode gerar dois tipos de espermatozide: metade contm o cromossomo X, metade o Y. Se o vulo receber outro cromossomo X do espermatozide, o indivduo resultante XX, forma ovrios, e feminino; se o vulo recebe um cromossomo Y do espermatozide, o indivduo XY, forma testculos, e masculino. O cromossomo Y carrega um gene que codifica um fator determinador de testculos. Esse fator organiza a gnada em um testculo em vez de um ovrio. Diferentemente do caso da Drosophila (a ser discutido adiante), o cromossomo Y do mamfero um fator crucial para determinao do sexo nessa espcie. Uma pessoa com cinco cromossomos X e um cromossomo Y (XXXXXY) seria macho. Alm disso, um indivduo com somente um nico cromossomo X e nenhum segundo X ou Y (i.e., XO) se desenvolve como fmea e comea a formar ovrios, mas incapaz de manter os folculos ovarianos. Determinao Secundria do Sexo A determinao secundria do sexo se refere ao fentipo corporal externo s gnadas. Um mamfero masculino tem um pnis, vesculas seminais, uma glndula prstata, e freqentemente tamanho, cartilagem vocal e musculatura especficos do sexo. Um mamfero feminino tem a vagina, crvix, tero, ovidutos, glndulas mamrias, e freqentemente tamanho, cartilagem vocal e musculatura especficos
Figura 20.1
Representaes de Vesalius (1538, 1543) dos rgos reprodutivos femininos. (A) Interpretao de Vesalius concepo de Galeno do trato feminino da vagina ao tero. (B) Interpretao de Vesalius do sistema reprodutivo feminino. (Reproduzido em Schiebinger, 1989.)
CAPTULO 20 Determinao do Sexo
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Clulas Foliculares OVRIO Clulas tecais Sulco Genital Gnada bipotencial Clulas de Sertoli Clulas de Leydig Testosterona Folculos
Genitlia interna feminina (tero, oviduto, crvix, vagina superior)
Duto Mlleriano
TESTCULOS
Regresso Seio urogenital do tubrculo genital
Pnis, prstata Duto Wolffiano Genitlia interna masculina (epiddimo, vasos deferentes, vescula seminal)
do sexo. As caractersticas sexuais secundrias so geralmente determinadas pelos hormnios secretados pelas gnadas. Porm, na ausncia das gnadas, gerado o fentipo feminino. Quando Jost (1953) removeu as gnadas de fetos de coelhos antes da sua diferenciao, os coelhos resultantes eram fmeas, independentemente de serem XX ou XY. Cada um tinha ovidutos, um tero e uma vagina, mas no tinha um pnis ou estruturas acessrias masculinas. O esquema da determinao do sexo de mamferos est mostrado na Figura 20.2. Se o cromossomo Y estiver ausente, os primrdios gonadais desenvolvem-se em ovrios. Os hormnios estrognicos produzidos pelo ovrio permitem o desenvolvimento do duto Mlleriano em tero, ovidutos e terminal superior da vagina. Se o cromossomo Y estiver presente, formam-se testculos que secretam dois hormnios principais. O primeiro -hormnio anti-duto Mlleriano (AMH; tambm chamado de substncia inibidora Mlleriano, (MIS) -destri o duto Mlleriano. O segundo hormnio -testosterona- masculiniza o feto estimulando a formao do pnis, escroto e outras pores da anatomia masculina, inibindo tambm o desenvolvimento dos primrdios do seio. Assim, o corpo tem o fentipo feminino a no ser que seja mudado pelos dois hormnios elaborados pelos testculos fetais. Olharemos agora mais detalhadamente para esses eventos. As Gnadas em Desenvolvimento O desenvolvimento das gnadas uma situao embriolgica nica. Todos os outros rudimentos de rgos normalmente se diferenciam em um nico tipo de rgo. Um rudimento de pulmo somente pode tornar-se pulmo e um rudimento de fgado somente se desenvolve em fgado. O rudimento da gnada, porm, tem duas opes normais. Quando se diferencia, pode desenvolver-se em um ovrio ou em um testculo. O tipo de diferenciao seguido por esse rudimento determina o desenvolvimento sexual futuro do organismo. Porm, antes dessa deciso ser tomada, a gnada do mamfero se desenvolve primeiro atravs de um estgio indiferente (bipotencial) durante o qual no tem caractersticas femininas nem masculinas. Em humanos, o rudimento da gnada aparece no mesoderma intermedirio durante a quarta semana e permanece sexualmente indiferente at a stima semana. Durante esse estgio, o epitlio do sulco genital se prolifera para dentro do tecido mesenquimatoso conjuntivo frouxo acima dele (Figura 20.3A,B). Essas camadas epiteliais formam as cordas sexuais, que iro envolver as clulas germinativas que migram para a gnada humana durante a
Figura 20.2
Cascatas postuladas levar formao de fentipos sexuais em mamferos. A converso do sulco genital na gnada bipotencial necessita dos genes SF1 e WT1, pois camundongos carentes de um ou de outro desses genes no tm gnadas. A gnada bipotencial parece ser conduzida para a via feminina pelos genes WNT4 e DAX1, e para a via masculina pelo gene SRY (do cromossomo Y), em conjunto com genes autossmicos como SOX9. O ovrio produz clulas tecais e clulas granulosas, que juntas so capazes de sintetizar estrgeno. Sob estrgeno (primeiro provindo da me, em seguida das gnadas), o duto Mlleriano se diferencia em genitlia feminina e a prole desenvolve caractersticas sexuais secundrias femininas. Os testculos produzem dois hormnios principais, o fator anti-duto Mlleriano (AMH), que causa regresso do duto, e a testosterona, que causa a diferenciao do duto Wolffiano em genitlia interna masculina. Na regio urogenital, a testosterona convertida em diidrotestosterona (DHT) que causa a morfognese do pnis e da prstata. (Segundo Marx, 1995).
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GNADAS INDIFERENTES Duto Wolffiano Glomrulo Aorta Duto Wolffiano
Sulco mesonfrico
Tbulo Sulco mesonfrico Genital excretrio (A) 4 SEMANAS
Mesentrio Dorsal
Duto Mlleriano
Epitlio celmico em proliferao (B)
Cordas sexuais primitivas
6 SEMANAS
DESENVOLVIMENTO TESTICULAR
DESENVOLVIMENTO OVARIANO
Duto Wolffiano (vasos deferentes)
Tbulo mesonfrico em degenerao Cordas da rede testicular Duto Wolffiano
Tbulo mesonfrico em degenerao
Mesnquima urogenital Cordas sexuais corticais
Duto Mlleriano Tnica albugnea (C) 8 SEMANAS Cordas da rede testicular Dutos eferentes (vasos eferentes)
Cordas testiculares Duto Mlleriano (E) Epitlio superficial 8 SEMANAS
Cordas sexuais em degenerao Tnica albugnea Epitlio Superficial
Duto Wolffiano (vasos deferentes) Duto Mlleriano (D) 16 SEMANAS
Cordas testiculares
Duto Wolffiano Duto Mlleriano (F) Folculos ovarianos 20 SEMANAS
Oognia
Figura 20.3
Diferenciao das gnadas humanas mostrada em seo transversal. (A) Sulco genital de um embrio de 4 semanas. (B) Sulco genital de uma gnada indiferente de 6 semanas mostrando cordas sexuais primitivas. (C) Desenvolvimento testicular na oitava semana. As cordas sexuais perdem contato com o epitlio cortical e desenvolvem a rede testicular. (D) Na dcima-sexta semana de desenvolvimento, as cordas testiculares so contnuas com a rede testicular e se conectam com o duto Woffiano. (E) O desenvolvimento ovariano em um embrio humano de 8 semanas, quando as cordas sexuais primitivas degeneram. (F) O ovrio humano de 20 semanas no se conecta ao duto Wolffiano, e novas cordas sexuais corticais rodeiam as clulas germinativas que migaram para o sulco genital. (Segundo Langman, 1981.)
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sexta semana. Tanto em gnadas XY como XX, as cordas sexuais permanecem conectadas ao epitlio superficial. Se o feto for XY, as cordas sexuais continuam a proliferar durante a oitava semana, estendendo-se profundamente no tecido conjuntivo.* Essas cordas fundem-se uma com a outra, formando uma rede de cordas sexuais internas (medulares) e, em seu terminal mais distal, a rede testicular (rete testis) mais fina (Figura 20.3C,D). No fim, as cordas testiculares perdem o contato com o epitlio superficial e dele ficam separadas pela grossa matriz extracelular, a tnica albugnea. Assim, as clulas germinativas so encontradas nas cordas dentro dos testculos. Durante a vida fetal e a infncia, essas cordas permanecem slidas. Na puberdade, porm, ficam ocas para formar os tbulos seminferos, e as clulas germinativas comeam a produo de espermatozide. O espermatozide transportado do interior dos testculos atravs da rede testicular, que se junta com os dutos eferentes. Esses tbulos eferentes so os remanescentes da rim mesonfrico, e ligam os testculos ao duto Wolffiano. Esse duto tinha sido o tubo coletor do rim mesonfrico. Em machos, o duto Wolffiano se diferencia em vasos deferentes, o tubo atravs do qual o espermatozide passa para uretra e para fora do corpo. No intervalo, durante o desenvolvimento fetal as clulas mesenquimatosas intersticiais dos testculos se diferenciaram em clulas de Leydig, que produzem a testosterona. As clulas das cordas testiculares se diferenciam em clulas de Sertoli, que criam o espermatozide e secretam o hormnio anti-duto Mlleriano. Em fmeas, as clulas germinativas iro residir perto da superfcie externa da gnada. Ao contrrio das cordas sexuais nos machos, que continuam sua proliferao, as cordas sexuais iniciais de gnadas XX degeneram. Porm, o epitlio logo passa a produzir um novo conjunto de cordas sexuais, que no penetram profundamente no mesnquima, mas permanecem perto da superfcie externa (crtex) do rgo. Por isso, so chamadas cordas sexuais corticais. Essas cordas so divididas em agregados, cada qual envolvendo uma clula germinativa (Figura 20.2E,F). A clula germinativa se transformar em vulo, e as cordas sexuais epiteliais que a rodeiam iro se diferenciar em clulas granulosas. As clulas mesenquimatosas do ovrio diferenciam-se em clulas tecais. Juntas, as clulas tecais e granulosas formam os folculos que envolvem as clulas germinativas e secretam hormnios esterides. Cada folculo ir conter uma nica clula germinativa. Em fmeas, o duto Mlleriano permanece intacto, e se diferencia em ovidutos, tero, crvix e vagina superior; o duto Wolffiano, privado de testosterona, degenera. Um resumo do desenvolvimento dos sistemas reprodutivos dos mamferos encontra-se na Figura 20.4. [sex1.html]
Determinao sexual primria dos mamferos: Genes cromossmicos Y para a determinao dos testculos
Vrios genes cuja funo necessria para a diferenciao sexual normal foram encontrados. Ao contrrio do que ocorre em outros rgos em desenvolvimento, os genes envolvidos na determinao do sexo diferem extensamente entre os filos, fazendo com que no se possa olhar para genes determinantes de sexo em Drosophila esperando ver seus homlogos direcionando a determinao sexual de mamferos. Todavia, desde que o fentipo de mutaes em genes determinantes do sexo muitas vezes a esterilidade, estudos clnicos foram empregados para identificar aqueles genes ativos na determinao do sexo em humanos femininos ou masculinos. As manipulaes experimentais visando confirmar as funes desses genes puderam ser realizadas em camundongos.
* Em camundongos e coelhos, algumas clulas do mesonefro (o rim primitivo) migram para o sulco genital e tornam-se parte da populao celular intersticial. Essas parecem ser necessrias para estabelecer a estrutura normal da corda (Buehr et al., 1993).
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Figura 20.4
(A)
SEXUALMENTE INDIFERENTES Gnadas
Sumrio do desenvolvimento das gnadas e seus dutos em mamferos. Notar que tanto os dutos Wolffiano como o Mlleriano esto presentes no estgio da gnada indiferenciada. O desenvolvimento dos dutos Wolffianos depende do mesnquima que eles encontram. As partes inferiores do duto Wolffiano que normalmente formariam o epiddimo formaro o tecido da vescula seminal se cultivados com mesnquima associado com pores superiores (vescula seminal) do duto. (Higgins et al, 1989.)
Rim metanfrico Mesonefro Ureter Duto Wolffiano Duto Mlleriano
Cloaca
Epiddimo Testculos
Rins metanfricos
Ovrios
Oviduto
Ureteres Duto Mlleriano degenerado Duto Wolffiano (vasos deferentes) Duto Wolffiano degenerado Bexiga Bexiga urinria urinria Uretra Uretra
Duto Mlleriano (oviduto) tero Vagina
(B)
MASCULINO GNADAS
(C)
FEMININO
Tipo gonadal Cordas sexuais
Testculos Medular (interno) DUTOS
Ovrio Cortical (externo)
Dutos remanescentes para clulas germinativas Diferenciao do duto
Wolffiano Vasos deferentes Epiddimo, vescula seminal
Mlleriano Oviduto, tero, crvix, parte superior da vagina
Sexual SRY: SRY: O Determinante Sexual do Cromossomo Y Em seres humanos, o principal gene para o fator determinante dos testculos reside no brao curto do cromossomo Y. Indivduos que nascem com o brao curto, porm, sem o brao longo do cromossomo Y so machos enquanto que indivduos que nascem com o brao longo do cromossomo Y, mas no o brao curto, so fmeas. Analisando o DNA de homens XX e fmeas XY, a posio do gene determinador dos testculos foi restringida uma regio de 35.000 pares de bases do cromossomo Y, localizada perto da extremidade do brao curto [sex2.html]. Nessa regio, Sinclair e colaboradores (1990) encontraram uma seqncia de DNA especfica de macho que podia codificar um peptdio de 223 aminocidos. Tal peptdio provavelmente seria um fator de
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transcrio, j que contm um domnio ligante de DNA chamado de seqncia (box) HMG. Esse domnio HMG (grupo de alta mobilidade) encontrado em vrios fatores de transcrio e protenas de cromatina no-histnicas; ele induz curvatura na regio de DNA qual ele se liga (Figura 20.5: Giese et al., 1992). O gene foi chamado SRY (regio determinante do sexo do Y) e existe evidncia que realmente ele codifica o fator determinante dos testculos humanos. O SRY encontrado em machos XY e nos raros machos XX, estando ausente em fmeas normais XX e em muitas fmeas XY. Outro grupo de fmeas XY foi achado ter mutaes de ponta ou de mudana de moldura no gene SRY, e essas mutaes impedem a protena SRY de se ligar ao DNA ou curv-lo (Pontiggia et al., 1994; Werner et al., 1995). Pelo menos dois genes envolvidos na determinao sexual secundria (os genes para AMH e a aromatase P450 envolvida na sntese de esterides) contm stios ligantes de SRY em seus promotores (Haqq et al., 1993), a ligao especfica de sequncia de SRY a um outro gene especfico de testculo leva ativao daquele gene (Cohen et al., 1994). Se SRY realmente codifica o principal fator determinante dos testculos, poderse-ia esperar que ele atuasse no sulco genital imediatamente antes, ou durante, a diferenciao dos testculos. Essa previso foi confirmada por estudos do gene homlogo encontrado em camundongos. O gene do rato (Sry) tambm se correlaciona com a presena de testculos; ele est presente em machos XX e ausente de fmeas XY (Gubbay et al., 1990; Koopman et al., 1990). O gene Sry expresso nas clulas somticas da gnada indiferenciada do camundongo, imediatamente antes ou durante sua diferenciao em um testculo; sua expresso desaparece em seguida (Hacker et al, 1995). A evidncia mais convincente de que o Sry o gene para o fator determinante dos testculos vem de camundongos transgnicos. Se Sry induz os testculos, a insero de seu DNA no genoma de um zigoto de camundongo XX normal deve lev-lo a formar testculos. Koopman e colaboradores (1991) tomaram a regio de 14 kilobases do DNA que inclui o gene Sry (e presumivelmente seus elementos regulatrios) e microinjetaram essa seqncia em proncleos de zigotos de camundongos recm-fertilizados. Em vrios casos, os embries XX assim injetados, desenvolveram testculos, rgos acessrios masculinos e pnis (Figura 20.6). (No se formou espermatozide funcional; porm, isso era esperado porque a presena de dois cromossomos X previne a formao
Figura 20.5
Associao de DNA com a protena SRY pode levar o DNA a se curvar de 70o - 80o. As partes escuras representam a seqncia (box) HMG da protena SRY. A espiral vermelha a dupla hlice do DNA ligado especificamente por SRY. Nesse caso, uma regio do promotor do gene do hormnio anti-Mlleriano. (Segundo Haqq et al., 1994; Werner et al., 1995.)
Controle (A) (B)
Figura 20.6
Um camundongo XX transgnico para Sry macho. (A) A reao da cadeia de polimerase seguida por eletroforese mostra a presena do gene Sry em machos XX normais, e em um camundongo Sry XX transgnico. O gene est ausente na fmea XX da ninhada. (B) A genitlia externa do camundongo transgnico masculina (direita) e essencialmente a mesma como a de um macho XY (esquerda). (Segundo Koopman et al., 1991; fotografia cortesia dos autores.)
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de espermatozide em camundongos e homens XXY.) H, por isso, boas razes para se pensar que Sry/SRY o gene principal no cromossomo Y para a determinao de testculos em mamferos. O gene determinante de testculos do cromossomo Y necessrio mas no suficiente para o desenvolvimento dos testculos em mamferos. Estudos em camundongos (Eicher e Washburn, 1983; Washburn e Eicher, 1989) haviam mostrado que a SRY de algumas variedades de ratos deixam de produzir testculos quando colocados em meio autossmico diferente. Quando a protena SRY se liga a seus stios no DNA, provavelmente cria grandes alteraes conformacionais. Desenrola a dupla hlice em sua vizinhana e curva o DNA em at 80o (Pontiggia et al., 1994; Werner et al., 1995). Essa curvatura pode levar protenas ligadas distncia do aparelho de transcrio a um maior contato, permitindo-lhes interagir e influenciar a transcrio. A identidade dessas protenas ainda no conhecida. [sex3.html]
Determinao sexual primria em mamferos: Genes autossmicos na determinao de testculos

SOX9: Reverso Autossmica na Displasia Campomlica Se SRY for um fator de transcrio, deveria ser esperado ativar ou reprimir uma bateria de genes no sulco genital. Um candidato para tal gene o SOX9 em seres humanos. O SOX9 codifica um fator de transcrio putativo que tambm contm uma seqncia HMG. Indivduos sem uma cpia funcional desse gene tm uma sndrome chamada de displasia campomlica, uma doena envolvendo numerosos sistemas do esqueleto e rgos; eles morrem logo aps o nascimento em conseqncia de dificuldades respiratrias decorrentes de brnquios e traquias defeituosos (Foster et al., 1994; Wagner et al., 1994; Mansour et al., 1995). Cerca de 75 porcento dos pacientes XY com essa sndrome desenvolvem-se como fentipos femininos ou hermafroditas. Parece que SOX9 essencial para a formao de testculos. Alm disso, o homlogo murino desse gene, Sox9, expresso somente nos sulcos genitais masculinos (XY), mas no nos femininos (XX), e nas mesmas clulas do sulco genital que Sry. Sox9 expresso somente pouco aps a expresso de Sry (Wright et al., 1995; Kent et al., 1996). Masculinas SF1: A Ligao Entre SRY e as Trajetrias Desenvolvimentais Masculinas Uma outra protena que poderia ser ativada por SRY e ser um cofator com SRY o fator de transcrio SF1. O SF1(fator 1 esteroidognico) uma protena que ativa vrios genes envolvidos na sntese de esterides. Na verdade, ele atua nas clulas de Leydig dos testculos, ativando genes que codificam as enzimas da via da testosterona. Todavia, o SF1 foi recentemente mostrado ter duas outras funes crticas (Figura 20.7). Primeiro, deletando os genes Sf1 dos camundongos, esses se desenvolvem sem as glndulas supra-renais ou as gnadas (Luo et al., 1994). (As gnadas se desenvolvem mas degeneram em seguida, e os camundongos morrem por falta de corticosterona.) Segundo, o SF1 parece estar relacionado ao desenvolvimento dos testculos. medida que os nveis de SF1 declinam no sulco genital dos embries XX, o SF1 permanece nos testculos em desenvolvimento. Acredita-se que a SRY ative o gene Sf1, e que a protena SF1, em seguida, ative ambos componentes da diferenciao sexual masculina (o AMH de Sertoli e a via Leydig da testosterona) (Shen et al., 1994). Tanto SRY como SF1 podem ser necessrias para ativar o gene AMH, sugerindo que interaes entre essas protenas sejam importantes (Haqq et al. 1994, Shen et al., 1994). A pesquisa de reverso de sexo em camundongos mostrou que o cromossomo Y de um tipo no necessariamente produz testculos em outra linhagem de camundongos. Parece que as protenas SRY divergiram tanto que elas podem, no muito distante, interagir com outra protenas do aparelho de transcrio (Coward et al., 1994; Eicher, 1994).
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Rim
Rim
Epiddimo
Testculo Oviduto
(A) (B) (C)
Figura 20.7
Funes de SF1 durante a gonadognese. (A). Eliminao do gene SF1 do embrio do camundongo leva perda tanto das supra-renais como dos testculos. (O duto Mlleriano persiste e torna-se o oviduto.) (B) Um controle mostrando epiddimo e testculos. (C) Hibridizao in situ mostrando a ativao do gene Sf1 atravs do desenvolvimento testicular de um embrio de camundongo de 12.5 dias. (A de Luo et al., 1994; C de Shen et al., 1994.)
Determinao sexual primria em mamferos: Desenvolvimento ovariano

DAX1: Um Potencial Gene Determinante de Ovrio no Cromossomo X Em 1980, Bernstein e colaboradores descreveram o caso de duas irms geneticamente XY. Seus cromossomos Y eram normais, mas tinham duplicado uma pequena poro do brao curto do cromossomo X (Xp21). Subseqentes casos foram encontrados; concluiu-se que quando houvesse duas cpias dessa regio no cromossomo X ativo, o sinal SRY seria revertido (Figura 20.8). Uma dose dupla dessa regio interromperia a formao dos testculos, mas a ausncia dessa regio foi compatvel com a formao de testculos. Bardoni e colegas (1994) propuseram que essa regio continha um gene que compete com o fator SRY e que foi importante para o direcionamento do desenvolvimento do ovrio. No desenvolvimento testicular, esse gene seria suprimido, mas a presena de duas cpias ativas do gene se sobreporia a essa represso. Esse gene, DAX1, foi clonado e mostrou codificar um membro da famlia do receptor do hormnio nuclear (Muscatelli et al., 1994; Zanaria, 1994). Dados preliminares (Zanaria, 1994) sugerem que o DAX1 expresso nos sulcos genitais do embrio de camundongo. Wnt4a: Um potencial Gene Determinante de Ovrio em um Autossomo O gene WNT4a outro gene que pode ser crtico para a determinao ovariana. Esse gene expresso no sulco genital do camundongo quando ele ainda est no seu estgio indiferenciado. Depois, se torna indetectvel nas gnadas XY (que se tornam
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Gentipo DAX1 inativo
2 cpias de DAX1
Gnadas Fentipo
Testculos Macho
Ovrio Fmea
Disgnese gonadal Fmea
Figura 20.8
Reverso sexual fenotpica em seres humanos tendo duas cpias do loco DAX1. DAX1 (no cromossomo X) mais SRY no Y produzem testculos. DAX1 sem SRY (pois o outro loco DAX1 est no cromossomo X inativo) produz ovrios. Duas cpias ativas de DAX1 (no cromossomo X ativo) mais um SRY (do cromossomo Y) levam a uma gnada mal-formada. Como a gnada no produz AMH nem testosterona, o fentipo feminino. (Segundo Genetics Review Group, 1995.)
testculos), enquanto que a expresso de WNT4a mantida nas gnadas XX quando elas comeam formar ovrios. Se forem criados camundongos sem os genes WNT4a, o ovrio no se forma de maneira adequada, e suas clulas expressam marcadores especficos do testculo, incluindo AMH e testosterona produzindo enzimas (Vainio e McMahon, 1996). possvel que SRY forme testculos reprimindo a expresso de WNT4a no sulco genital, como tambm promovendo SF1. Deve-se compreender que tanto o desenvolvimento dos testculos como o do ovrio so processos ativos. Em mamferos, a determinao sexual primria em caso algum um estado revelia (Eicher e Washburn, 1986). Embora os ltimos anos tenham presenciado notvel progresso, ns ainda no sabemos o que fazem os genes determinantes do testculo ou do ovrio, e o problema da determinao sexual primria permanece (como desde a pr-histria), uma das grandes questes no resolvidas da biologia. [sex4.html]
Determinao sexual secundria em mamferos

Regulao Hormonal do Fentipo Sexual A determinao sexual primria envolve a formao de um ovrio ou de um testculo de uma gnada indiferenciada. Isso, porm, no fornece o fentipo sexual completo. A determinao sexual secundria se refere ao desenvolvimento dos fentipos masculino e feminino por hormnios secretados pelos ovrios e testculos. A determinao sexual secundria, tanto masculina como feminina, tem dois componentes temporais principais. O primeiro ocorre dentro do embrio durante a organognese; o segundo ocorre durante a adolescncia. Conforme mencionado anteriormente, se gnadas indiferentes so removidas de um animal embrionrio concebido o fentipo feminino. Os dutos Mllerianos se desenvolvem enquanto o duto Wolffiano se degenera. Isso tambm visto em certos seres humanos que nascem sem gnadas funcionais. Indivduos cujas clulas tm somente um cromossomo X (e nenhum cromossomo Y) originalmente desenvolvem
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ovrios; porm, esses ovrios se atrofiam antes do nascimento, e as clulas germinativas morrem antes da puberdade. Porm, sob a influncia de estrgeno primeiramente derivado do ovrio, mas depois da me e da placenta, essas crianas nascem com um trato genital feminino (Langman e Wilson, 1982).* A formao do fentipo masculino envolve a secreo de hormnios testiculares que promovem o desenvolvimento do duto Wolffiano e promovem atrofia do duto Mlleriano. O primeiro desses hormnios o hormnio anti-duto Mlleriano, o hormnio da clula de Sertoli que causa a degenerao do duto Mlleriano. O segundo desses hormnios a testosterona esteride, que secretado pelas clulas de Leydig testiculares fetais. Esse hormnio causa a diferenciao do duto Wolffiano em epiddimo, vasos deferentes e vesculas seminais, e causa o desenvolvimento de tumefaes urogenitais e seios no interior do escroto e pnis. A existncia desses dois sistemas independentes de masculinizao demonstrada em pessoas tendo sndrome da insensibilidade andrgena. Esses indivduos XY tm o gene do fator determinante testicular e, por isso, tm testculos que produzem testosterona e AMH. Porm, essas pessoas no tm a protena receptora de testosterona e portanto no podem responder testosterona produzida em seus testculos (Meyer et al., 1975). Porque elas so capazes de responder ao estrgeno produzido em suas glndulas supra-renais, elas so de aparncia distintamente feminina (Figura 20.9). Porm, apesar dessa aparncia feminina, esses indivduos tm testculos, e embora no possam responder testosterona, eles respondem ao AMH. Assim, seus dutos Mllerianos degeneram. Essas pessoas se desenvolvem como mulheres normais mas so estreis, no tendo um tero ou ovidutos e tendo testculos em seu abdome.** Testosterona e Diidrotestosterona Existem dois diferentes hormnios masculinizantes, testosterona e AMH. Existe evidncia que a testosterona, em certos tecidos, pode no ser o hormnio ativo. A testosterona parece ser responsvel pela promoo da formao de estruturas reprodutivas masculinas (o epiddimo, vesculas seminais e vasos deferentes) do primrdio do duto Wolffiano. No entanto, a testosterona no masculiniza diretamente a uretra masculina, prstata, pnis ou escroto. Essas funes posteriores so controladas pela 5-diidrotestosterona. Siiteri e Wilson (1974) mostraram que a testosterona convertida em 5diidrotestosterona nos seios urogenitais e tumefaes, mas no no duto Wolffiano. Imperato - McGinley e colegas (1974) acharam uma pequena comunidade na Repblica Dominicana na qual vrios habitantes tinham uma deficincia gentica da enzima 5-cetoesteride redutase 2, que converte testosterona em diidrotestosterona. Indiv-
Figura 20.9
Um indivduo XY com a sndrome da insensibilidade andrgena. Apesar do caritipo XY e da presena de testculos, o indivduo desenvolve caractersticas sexuais secundrias femininas. Internamente, porm, a mulher no tem os derivados do duto Mlleriano e tem testculos no descidos. (Cortesia de C. B. Hammond.)
*Os mecanismos pelos quais o estrgeno poderia promover a diferenciao dos dutos Mllerianos no so bem compreendidos. Durante o desenvolvimento embrionrio, o duto extremamente sensvel a compostos estrognicos, conforme conhecido pelos efeitos teratognicos da dietilstilbesterol (DES). Esse composto um estrgeno sinttico que foi dado s mulheres nas dcadas de 1940 at 1960 para manuteno da gravidez. As filhas nascidas dessas mulheres que usaram essa droga apresentaram alta incidncia de anomalias do duto Mlleriano, incluindo malformaes dos epitlios vaginal e cervical, anomalias estruturais dos ovidutos e tero, e uma incidncia acima do normal de cncer vaginal (Robboy et al., 1982; Bell, 1986). **A sndrome da insensibilidade andrgena uma de vrias condies chamadas pseudohermafroditismo. Os hermafroditas verdadeiros (raros em humanos e na maioria dos mamferos, mas normal em certos invertebrados) contm tecidos gonadais tanto masculino como feminino. Hermafroditas mamferos verdadeiros tm anormalidades na determinao sexual primria e podem ocorrer quando o cromossomo Y translocado para o cromossomo X. Se o X translocado for inativado, o Y ser desligado. Algumas das clulas gonadais sero XX e outras XY (Berkovitz et al., 1992). Na condio pseudo-hermafrodita, existe somente um tipo de gnada, mas as caractersticas sexuais secundrias diferem daquilo que esperado do sexo gonadal. Em humanos, pseudo-hermafroditas masculinos podem resultar da sndrome da insensibilidade andrgena, ou da incapacidade de produzir testosterona devido a um defeito gnico em uma das enzimas levando sua sntese (Geissler et al., 1994). Pseudo-hermafroditas femininos ocorrem quando o organismo tem uma superproduo de testosterona.
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Bexiga urinria
Reto Pbis Vescula seminal Prstata Pnis Uretra Vaso deferente Epiddimo
Testculo
Dependente de diidrotestosterona Dependente de testosterona
Figura 20.10
Regies dependentes de testosterona e diidrotestosterona no sistema genital do feto humano masculino. (Segundo Imperato-McGinley et al., 1974.)
duos afetados no tinham um gene funcional para essa enzima (Andersson et al., 1991; Thigpen et al, 1992). Embora esses indivduos XY tenham testculos funcionantes, eles tm uma bolsa vaginal cega e um clitris aumentado. Pareciam meninas e so criadas como tais. Suas anatomia interna, porm, masculina: testculos, desenvolvimento de duto Wolffiano e degenerao do duto Mlleriano. Assim, parece que a formao da genitlia externa est sob o controle da diidrotestosterona, enquanto que a diferenciao do duto Wolffiano controlada pela prpria testosterona (Figura 20.10). interessante que a genitlia externa torna-se responsiva testosterona na puberdade, causando bvia masculinizao em uma pessoa originalmente considerada como sendo uma menina. Hormnio Anti-Mlleriano O hormnio anti-duto Mlleriano (AMH) uma glicoprotena com 560 aminocidos (Cate et al., 1986) produzido nas clulas de Sertoli (Tran et al., 1977). Quando fragmentos de testculos fetais ou clulas de Sertoli isolados so colocados ao lado de segmentos em cultura, contendo pores dos dutos Wolffiano e Mlleriano, o duto Mlleriano se atrofia apesar de nenhuma alterao ocorrer no duto Wolffiano (Figura 20.11). Essa atrofia causada tanto pela morte celular como pela transformao em mesnquima e migrao de clulas epiteliais do duto (Trelstad et al., 1982). O gene AMH de camundongo tem uma seqncia promotora que ligada tanto pela protena SF1 como por SRY (Haqq et al., 1994; Shen et al., 1994). [sex5.html] Vemos assim, que uma vez formados, os testculos secretam dois hormnios que causam a masculinizao do feto. Um desses hormnios - testosterona - pode ser convertido em uma forma mais ativa pelos tecidos que criam a genitlia externa. Em fmeas, o estrgeno secretado pelos ovrios fetal parece ser suficiente para induzir a diferenciao do duto Mlleriano em tero, ovidutos e crvix. Dessa maneira, os cromossomos sexuais controlam o fentipo sexual de um indivduo.
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Figura 20.11
Exame da atividade do hormnio anti-duto Mlleriano no segmento anterior do trato reprodutivo de um feto de rato de 15.5 dias, aps 3 dias em cultura. (A) Tanto o duto Mlleriano (seta esquerda) quanto o duto Wolffiano (seta direita) esto abertos. (B) O duto Wolffiano (seta) est aberto, mas o duto Mlleriano se degenerou e se fechou. (Cortesia de N. Josso.)
(A) (B)
O Sistema Nervoso Central Uma das reas mais controversas da determinao sexual secundria envolve o desenvolvimento de comportamentos especficos do sexo. Em aves canoras, a testosterona vista regular o crescimento de agregados neuroniais especficos do macho no crebro. Machos de canrios e tentilhes-zebra cantam eloqentemente, enquanto as fmeas cantam pouco ou nunca. Esses cantos servem para marcar territrios e atrair consortes. A habilidade de cantar controlada por seis diferentes agregados de neurnios (ncleos) no crebro da ave (Figura 20.12). Neurnios conectam cada uma dessas regies entre si. Em canrios machos, esses ncleos so vrias vezes maiores que agregados correspondentes de neurnios em canrios-fmea; em fmeas de tentilhes-zebra, uma dessas regies pode at estar inteiramente ausente (Arnold, 1980; Konishi e Akutagawa, 1985). A testosterona tem um papel importante na produo do canto. Em machos adultos de tentilhes-zebra, Prve (1978) demonstrou uma correlao linear entre a quantidade de canto e a concentrao de testosterona srica. Foi mostrado que mudanas sazonais nos nveis de testosterona esto correlacionadas com os padres canoros desses pssaros. Quando os nveis de testosterona esto baixos, no somente ocorre um decrscimo de canto do pssaro mas tambm uma diminuio do tamanho dos ncleos cerebrais especficos de machos (Nottebohm, 1981). Em tentilhes adultos, a castrao elimina o canto, mas a injeo de testosterona induz tais pssaros a cantar mesmo em Novembro, o que normalmente no fazem (Thorpe, 1958). Em vrias espcies de pssaros, as fmeas podem ser induzidas a cantar pela injeo de testosterona (Nottebohm, 1980). Quatro regies controladoras do canto no crebro dessas aves crescem 50-69 porcento em tais pssaros, enquanto outras regies cerebrais no o fazem. Estudos auto-radiogrficos (Arnold et al., 1976) mostraram que os neurnios dos ncleos controladores do canto incorporam testosterona radioativa, enquanto outras regies do crebro no o fazem. Parece, portanto, que os hormnios das gnadas tm um papel importante no desenvolvimento das regies do sistema nervoso que geram comportamentos especficos do sexo.
Syrinx
Tentilho-zebra macho
Figura 20.12
Dimorfismo sexual no crebro avicular. O diagrama esquemtico indica as principiais rea neurais acreditadas estar envolvidas na produo do canto no tentilho-zebra. Os crculos representam reas cerebrais especficas; o tamanho de cada crculo proporcional ao volume ocupado por essa regio. Crculos com linhas hachuriadas so volumes estimados. Os nmeros dentro de cada crculo representam a porcentagem de clulas que incorporam testosterona radioativa. As diferenas de volume entre trs dessas regies (HVc, RA e NXIIts) so significantes entre os sexos, e a rea X no foi observada nos crebros de tentilhes fmeas. As diferenas na ligao de testosterona nas regies HVc e MAN so significativas, e no foram observadas diferenas sexuais relativas ligao de hormnio esteride em outras regies do crebro. As setas indicam as vias axnicas conectando as regies no tentilho macho. (Segundo Arnold, 1980.)
Tentilho-zebra fmea
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A situao menos clara em mamferos, porque a h menos comportamentos que caracterizam exclusivamente um sexo. A penetrao peniana em ratos um desses comportamentos, e controlado por neurnios motores dos msculos levator ani e bulbocavernoso. Ambos neurnios se originam de um ncleo espinhal que especificamente concentra testosterona. Em ratas, esses msculos so vestigiais, e o volume dos seus neurnios controladores muito reduzido (Breedlove e Arnold, 1980; Tobin e Joubert, 1992). A testosterona parece promover dois tipos de mudanas nesses neurnios responsivos. Em fetos e ratos recm-nascidos, a testosterona impede a morte normal de neurnios nessa regio. Ratas perdem at 70 porcento dos neurnios desse ncleo espinhal, enquanto ratos machos perdem somente 25 porcento. Em ratos adultos, a testosterona atua nesse ncleo para manter o tamanho das clulas nevosas e seus dendritos. A rea do soma e o comprimento dos dendritos desse ncleo espinhal so reduzidos metade quando um rato adulto castrado. Essa reduo revertida pela injeo de testosterona (Nordeen et al., 1985; Kurz et al., 1986). Em seres humanos, as diferentes taxas de crescimento entre os sexos produzem aspectos anatmicos ligeiramente diferentes. Embora os crebros humanos femininos sejam 10 porcento menores que os masculinos, a camada granular de algumas regies corticais contm neurnios empacotados mais densamente em comparao com regies semelhantes de crebros masculinos (Witelson et al., 1995). A testosterona no o nico esteride capaz de mediar o comportamento. No crebro do mamfero, tambrm so vistos neurnios sensveis ao estrgeno. Esses neurnios esto colocados em posies dos circuitos neurais conhecidas por mediar o comportamento reprodutivo: o hipotlamo, a hipfise e a amgdala (Figura 20.13; McEwen, 1981). Pfaff e McEwen (1983) demonstraram que o estrgeno altera as propriedades eltricas e qumicas dos neurnios hipotalmicos capazes de ligar estrgeno em sua cromatina. Terasawa e Sawyer (1969) j tinham encontrado que a atividade eltrica desses neurnios varia durante o ciclo estrognico sazonal do rato, aumentando no perodo da ovulao. Alm disso, o estrgeno parece estimular aqueles neurnios nas regies que induzem o comportamento reprodutivo feminino. Ratas ovariectomizadas injetadas com estrgeno diretamente no hipotlamo exibem lordose, uma posio que estimula o comportamento de monta em camundongos machos, enquanto que ratas ovariectomizadas controles no mostraram tal comportamento (Barfield e Chen, 1977; Rubin e Barfield, 1980). O mecanismo pelo qual o estrgeno promove atividade neuronial especfica nesses perodos considerado envolver aumento da permeabilidade ao potssio desses neurnios (Nabekura et al., 1986).
Telencfalo
Diencfalo
Mesencfalo
Rom- Medula benc- espinhal falo Cerebelo
Crtex
Te t o ptico
Bulbo olfativo
Figura 20.13
Representao das regies ligantes de estrgeno no crebro de uma rata. (Segundo Kandel e Schwartz, 1985.)
Septo
rea pre-ptica
Hipotlamo
Hipfise
Medula espinhal
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&
Especulaes
O Desenvolvimento de Comportamentos Sexuais

A Hiptese da Organizao/Ativao A exposio pr-natal (ou neonatal) a certos hormnios impe mudanas especficas do sexo no sistema nervoso central? Tais mudanas neurais especficas do sexo foram demonstradas nas regies do crebro que regulam a fisiologia sexual involuntria. A secreo cclica de hormnio luteinizante pela hipfise da rata adulta depende da falta de testosterona durante a sua primeira semana de vida. A secreo do hormnio luteinizante das ratas pode ser tornada no-cclica dandolhes testosterona 4 dias aps o nascimento; inversamente, as secrees do hormnio luteinizante em machos podem ser tornadas cclicas removendo seus testculos dentro de um dia aps o nascimento (Barraclough e Gorski. 1962). Acredita-se que os hormnios sexuais podem atuar durante o estgio fetal ou neonatal da vida dos mamferos para organizar o sistema nervoso e que durante a vida adulta, os mesmos hormnios podem ter efeitos ativadores transitrios. Isso chamado hiptese da organizao/ativao. Interessantemente, o principal hormnimo responsvel pelo padro do crebro masculino o estradiol.* A testosterona do sangue fetal ou neonatal pode ser convertida em estradiol pela aromatase P450; e essa converso ocorre no hipotlamo e no sistema lmbico -duas reas do crebro conhecidas por regular os comportamentos reprodutivos e hormonais (Reddy et al., 1974; MdEwen et al., 1977). Assim, a testosterona capaz de causar seus efeitos atravs da converso em estradiol. Mas o ambiente fetal rico em estrgenos oriundos das gnadas e da placenta. O que impede os estrgenos de masculinizar o sistema nervoso de um feto feminino? O estrgeno fetal (tanto masculino como feminino) ligado -fetoprotena. Essa protena produzida no fgado fetal e torna-se
Os termos estrgeno e estradiol so freqentemente usados indistintamente. Todavia, o estrgeno refere-se uma classe de hormnios esterides responsveis pela estabilizao e manuteno das caractersticas femininas especficas. O estradiol um desses hormnios, e na maioria dos mamferos (incluindo os humanos) ele o mais potente dos estrgenos.
o principal componente do sangue fetal e fluido crebro-espinhal. Ela se ligar ao estrgeno, mas no testosterona. Tentativas de estender a hiptese da organizao/ativao aos comportamentos sexuais voluntrios so mais controversos porque no h um comportamento verdadeiramente especfico do sexo que distinga os dois sexos de muitos mamferos e porque existem mltiplos efeitos do tratamento hormonal no mamfero em desenvolvimento. Por exemplo, a injeo de testosterona em uma rata de uma semana ir aumentar seus impulsos plvicos e diminuir sua quantidade de lordose (Phoenix et al., 1959; Kandel et al., 1995). Essas mudanas podem ser atribudas s alteraes mediadas por testosterona no sistema nervoso central, mas tambm podem ser devidas a efeitos hormonais em outros tecidos. A testosterona possibilita o crescimento dos msculos que permitem o impulsionamento plvico. Visto que a testosterona estimula o amplo crescimento das fmeas e o fechamento de seus orifcios vaginais, no se pode concluir que a ausncia de lordose seja somente devida s mudanas mediadas pela testosterona no circuito nervoso (Harris e Levine, 1965; De Jonge et al., 1988; Moore, 1990; Moore et al., 1992; FaustoSterling, 1995). A extrapolao de ratos para humanos um empreendimento muito arriscado, j que nenhum comportamento especfico do sexo foi identificado em humanos, e o que masculino em uma cultura pode ser considerado feminino em outra (veja Jacklin, 1981; Bleier, 1984; Fausto-Starling, 1992). Conforme conclui uma reviso (Kandel et al., 1995): Existe ampla evidncia que a organizao neural dos comportamentos reprodutivos, enquanto influenciada de maneira importante por eventos hormonais durante um perodo prnatal crtico, no exerce uma influncia imutvel sobre o comportamento sexual do adulto, ou mesmo sobre uma orientao sexual individual. Ao longo da vida de um indivduo, motivos religiosos, sociais ou psicolgicos
podem levar pessoas semelhantes biologicamente a divergirem extensamente em suas atividade sexuais. Homossexualidade Masculina Certos comportamentos so freqentemente citados como sendo parte do fentipo completo masculino ou feminino. Temse dito que o crebro do homem maduro formado de forma que ele tenha o desejo de copular com uma mulher madura, e o crebro da mulher madura faz com que ela deseje copular com um homem maduro. Porm, por mais importantes que sejam os desejos em nossas vidas, eles no podem ser detectados por hibridizao in situ nem isolados por anticorpos monoclonais. No sabemos ainda se os desejos sexuais so instilados em ns pela nossa educao social ou se so armados em nossos crebros por genes ou hormnios durante nosso desenvolvimento intra-uterino ou por outros meios. Em 1991, Simon LeVay props que parte do hipotlamo anterior de homens homossexuais tinha a forma anatmica tpica da mulher em lugar daquela de homens heterossexuais. O hipotlamo considerado ser a fonte de nossas necessidades sexuais, e ratos tm uma rea sexualmente dimrfica no hipotlamo anterior que parece regular o comportamento sexual. Esse estudo gerou muita publicidade e discusso. Os principais resultados esto mostrados na Figura 20.14. Os ncleos intersticiais do hipotlamo anterior (INAH) foram divididos em quatro regies. Trs delas no mostraram sinais de dimorfismo sexual. Uma delas, INAH3, mostrou uma diferena estatstica significativa entre machos e fmeas; foi apregoado que o INAH3 masculino , em mdia, mais de duas vezes maior que o INAH3 feminino. Alm disso, os dados de LeVay sugeriram que o INAH3 de homens homossexuais era semelhante ao das mulheres e tinha menos da metade do tamanho do INAH3 de homens heterossexuais. Esse achado, proclamou LeVay, sugere que a orientao sexual tem um substrato biolgico. Houve vrias crticas essa interpretao dos dados por LeVay. Em primeiro
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Figura 20.14
Uma parte dos dados que podem sugerir uma base biolgica para o homossexualismo. INAH4 e INAH3 so dois grupos de neurnios hipotalmicos. O INAH4 no mostra dimorfismo sexual no volume, enquanto o INAH3 mostra agregao estatisticamente significativa, embora o intervalo seja semelhante. O INAH3 de autpsias de crebros masculinos homossexuais mostra agregao em direo da distribuio feminina. Porm, no se pode posicionar uma relao causa e efeito. (Segundo LeVay, 1991.)
Mulheres Homens heterossexuais presumidos Homens homossexuais presumidos
Mulheres
Homens heterossexuais presumidos
Homens homossexuais presumidos
lugar, os dados provinham de populaes, no de indivduos. Pode-se tambm dizer que h um intervalo estatstico e que homens e mulheres tm o mesmo intervalo geral. Na realidade, o INAH3 de um homem homossexual era maior do que de todos, exceto de um dos 16 homens heterossexuais. Em segundo lugar, os homens heterossexuais no eram necessariamente heterossexuais, nem os homens homossexuais eram necessariamente homossexuais; os crebros vieram de cadveres de pessoas cujas preferncias sexuais no eram conhecidas. Isso levanta um outro aspecto: o homossexualismo tem muitas formas e, por-
tanto, no um fentipo no sentido usual da palavra. Em terceiro lugar, os crebros dos homens homossexuais eram de pacientes que tinham falecido de AIDS. A AIDS afeta o crebro, e seu efeito sobre os neurnios hipotalmicos no conhecido. Em quarto lugar, como o estudo foi feito em crebros de sujeitos mortos, no se pode inferir causa e efeito. Conforme mencionado no Captulo 1, tais dados mostram apenas correlaes, no causas. to provvel comportamentos poderem afetar o tamanho da densidade neuronial regional como a densidade neuronial regional poder afetar comportamentos. Se os dados forem interpretados como indicando que o INAH3 de homossexuais masculinos menor que aquele de heterossexuais masculinos, ainda no se sabe se isso um resultado da homossexualidade ou uma causa. Em quinto lugar, mesmo se a diferena existe, no h evidncia que a diferena tenha algo a ver com sexualidade. Em sexto lugar, esses estudos no indicam quando tais diferenas (se existirem) emergem. A questo se diferenas de INAH3 entre homens, mulheres e homens homossexuais ocorrem durante o desenvolvimento embrionrio, logo aps o nascimento, durante os primeiros anos de vida, durante a adolescncia, ou em um outro momento, no foi estudada. Em 1993, foi feita um correlao entre uma certa seqncia de DNA no cromossomo X e um certo subgrupo de homosse-
xuais masculinos (homens homossexuais que tinham um irmo homossexual). Entre 40 pares de irmos homossexuais dos quais um havia herdado uma regio particular no cromossomo X de sua me, 33 deles tinham irmos que tambm haviam herdado essa regio (Hamer et al., 1993). Era de se esperar que isso tivesse ocorrido, em mdia, em somente 20 deles. Novamente, isso somente uma concordncia estatstica, que poderia ser coincidente. Alm disso, o controle (a observao se o mesmo marcador existia nos homens no-homossexuais dessas famlias) no foi apresentado, e o vis estatstico das observaes foi questionado, especialmente porque outros laboratrios no foram capazes de repetir o resultado (Risch et al., 1993; Marshall, 1995). Em um estudo mais recente do mesmo laboratrio, Hu e colegas (1995) encontram pouco ou nenhum aumento nessa regio quando homens homossexuais foram comparados com seus irmos no-homossexuais. Os autores concluram que essa regio era nem necessria nem suficiente para uma orientao homossexual. Assim, apesar de relatos desses estudos na mdia pblica, no foi encontrado o gene gay. Merece ser lembrado que genes codificam RNAs e protenas, no comportamentos. Enquanto os genes podem causar vis em resultados comportamentais, no temos evidncia para sua ao controladora sobre eles. A existncia de pessoas com a sndrome da personalidade mltipla indica que um gentipo pode apoiar um grande intervalo de personalidades. Isso certamente um problema para qualquer definio de um fentipo homossexual, j que muitas pessoas alternam entre comportamentos homossexual e heterossexual. Assim, a pergunta se desejos homossexuais so formados por genes dentro do ncleo, por hormnios sexuais durante o desenvolvimento fetal, ou por experincias ps-nascimento ainda permanece uma questo aberta.
Determinao sexual cromossmica em Drosophila

A Via do Desenvolvimento Sexual Os mecanismos determinantes do sexo em mamferos e insetos como Drosophila so muito diferentes. Nos mamferos, o cromossomo Y tem papel de piv na determinao do sexo masculino. Assim, mamferos XO so fmeas, com ovrios, tero, ovidutos (em geral, porm, com pouqussimos, se tanto, vulos). Em Drosophila, a determinao
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Tabela 20.1 Razes de cromossomos X para autossomos em diferentes fentipos sexuais de Drosophila melanogaster Cromossomos X 3 4 4 3 2 2 1 1
Fonte: Segundo Strickberger, 1968.
Conjuntos de Autossomos (A) 2 3 4 3 2 3 2 3
Relao X:A 1.50 1.33 1.00 1.00 1.00 0.66 0.50 0.33
Sexo Metafmea Metafmea Fmea normal Fmea normal Fmea normal Intersexo Macho normal Metamacho
sexual conseguida por um equilbrio entre determinantes femininos no cromossomo X e determinantes masculinos nos autossomos (cromossomos no-sexuais). Se houver ao menos um cromossomo X em uma clula diplide (1X:2A), a mosca ser macho. Se houver dois cromossomos X em um clula diplide (2X:2A) a mosca ser fmea (Bridges, 1921,1935). Assim, Drosophila XO so machos estreis. A Tabela 20.1 mostra as diferentes relaes X-para-autossomos e o sexo resultante. Em Drosophila, e insetos em geral, podem-se observar ginandromorfos animais nos quais certas regies so masculinas e outras femininas (Figura 20.15; Prancha 17). Isso pode acontecer quando um cromossomo X perdido de um ncleo embrionrio. As clulas descendentes daquela clula, em vez de serem XX (fmeas) so XO (masculinas). Como no h hormnios sexuais para modular tais eventos em insetos, cada clula produz a sua prpria deciso sexual. As clulas XO exibem caractersticas masculinas, enquanto as clulas XX exibem traos femininos. Essa situao fornece um belo exemplo da associao entre cromossomos X e sexo. Conforme pode ser visto nesse exemplo, o cromossomo Y no tem qualquer papel na determinao do sexo em Drosophila. Ele somente necessrio para garantir fertilidade em machos. O cromossomo Y somente ativo tardiamente no desenvolvimento, durante a formao de espermatozide. Qualquer teoria de determinao sexual em Drosophila precisa explicar como lida a razo X-para-autossomo, e como essa informao transmitida aos genes que controlam os fentipos masculinos ou femininos. Embora ns ainda no conheamos os mecanismos ntimos pelo qual a razo X:A tornada conhecida para as clulas, a pesquisa durante a ltima dcada revolucionou nossa viso da determinao sexual em Drosophila. Muito dessa pesquisa se ocupou da identificao e anlise dos genes que so necessrios para a diferenciao sexual e a colocao desses genes em uma seqncia desenvolvimental. Mutaes de perda-de-funo na maioria desses genesSex-lethal (Sxl), transformer (tra) e transformer-2 (tra2)- transformam indivduos
Crista sexual masculina
Figura 20.15
Tipo selvagem eosin eye miniature wing eosin eye miniature wing
Ginandromorfo de D. melanogaster no qual o lado esquerdo feminino (XX) e o lado direito masculino (XO). O lado masculino perdeu um cromossomo portando os alelos tipo selvagem da cor dos olhos e forma das asas, permitindo com isso a expresso dos alelos recessivos eosin eye e miniature wing no cromossomo X remanescente. (Segundo Morgan, 1919.)
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Razo X:A
No-ativado (sem protena funcional)
No-ativado (sem protena tra funcional) Reprime genes msl ix Genes ligados ao X Genes de diferenciao feminina Protenas Dsx especficas da fmea Reprime Genes de diferenciao masculina Genes de diferenciao masculina Protenas Dsx especficas da macho Reprime Genes de diferenciao feminina Genes ligados ao X Genes msl
Taxa de transcrio feminina
Fentipo feminino
Fentipo masculino
Taxa de transcrio masculina
Figura 20.16
Cascata da regulao proposta para a determinao sexual somtica em Drosophila. Setas representam ativao, enquanto um bloco no fim de uma linha indica supresso. Os locos msl, sob o controle do gene Sxl, regulam a transcrio compensatria de dosagem do cromossomo X masculino. (Segundo Baker et al., 1987.)
XX em machos. Tais mutaes no tm efeito sobre a determinao sexual em machos XY. A homozigozidade do gene intersex (ix) leva moscas XX a desenvolver um fentipo intersexual que tem pores de tecido masculino e feminino no mesmo rgo. O gene doublesex (dsx) importante para a diferenciao sexual dos dois sexos. Se dsx estiver ausente, tanto moscas XX como XY se transformam em intersexuais (Baker e Ridge, 1980; Belote et al., 1985a). A posio desses genes numa trajetria desenvolvimental est baseada (1) nas interpretaes de cruzamentos genticos resultando em moscas tendo duas ou mais dessas mutaes e (2) na determinao do que acontece quando ocorre ausncia total dos produtos de um desses genes. Tais estudos geraram o modelo da cascata regulatria visto na Figura 20.16. O Gene Sex-lethal como o Piv para a Determinao do Sexo
INTERPRETANDO A RAZO X:A. A primeira fase da determinao sexual em Drosophila requer a leitura da razo X:A. Quais elementos no cromossomo X so contados e como usada essa informao? Parece que valores altos da razo X:A so responsveis pela ativao do gene comutador feminilizante Sex-lethal (Sxl). Em valores baixos (machos), Sxl permanece inativo durante os estgios
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precoces do desenvolvimento (Cline, 1983; Salz et al., 1987). Em Drosophila XX, Sxl ativado durante as primeiras duas horas aps a fecundao, e esse gene transcreve um particular tipo embrionrio de mRNA Sxl que somente encontrado durante mais duas horas (Salz et al., 1989). Uma vez ativado, esse gene permanece ativo apesar de ulteriores mudanas na razo X:A (Snchez e Nthiger, 1983). Funo precoce de Sxl necessria para que embries XX iniciem a via desenvolvimental feminina e mantenham um nvel apropriado de transcrio de dois cromossomos X. Essa ativao especfica da fmea de Sxl considerada ser estimulada pelos elementos numeradores no cromossomo X que constituem a parte X da razo X:A. Cline (1988) demonstrou que dois desses elementos numeradores so os genes sisterless-a e sisterless-b. O gene Sxl no parece sentir esses elementos numeradores sem a presena de produtos dos genes runt e daughterless (da). A falta da protena Daughterless previne a ativao de Sxl. Isso no afeta os embries XY (j que de qualquer maneira eles no ativam Sxl), mas letal em embries femininos, j que o mecanismo para a compensao de dosagem faz com que os dois cromossomos X sejam transcritos com uma taxa maior (masculina) (Cline, 1986; Cronmiller e Cline, 1987; Duffy e Gergen, 1991) da o nome da mutao. Assim, pouco aps a fecundao, os genes sis-a, sis-b, runt e da permitem o Sxl ser somente transcricionalmente ativo em embries femininos. Os elementos denominadores so aqueles genes que so contados dos autossomos. Um dos principais elementos denominadores parece ser o gene deadpan (YoungerShepherd et al., 1992). Machos com uma razo demasiadamente alta de sis-b para deadpan ativam Sxl e morrem, enquanto que fmeas com essa razo demasiadamente baixa no ativam o Sxl e morrem. Outro gene denominador codifica Extramachrochaetae, uma protena que compete com a ligao de Daughterless ao promotor Sxl (Van Doren et al., 1991). Os genes daughterless, sisa, sis-b e deadpan so todos fatores de transcrio Hlice-lao-hlice (HLH), e possvel que as protenas denominadora e numeradora formem heterodmeros uma com a outra. Presumivelmente, as protenas denominadoras so capazes de formar heterodmeros que bloqueiam aqueles das protenas ativadoras (Sis e Daughterless) (Figura 20.17). Parece, portanto, que a razo X:Autossomo medida pela competio da ativao codificada pelo X e repressores codificados autossomicamente no promotor do gene Sxl. [sex6.html]
MANUTENO DA FUNO SXL. Pouco aps a transcrio de Sxl, um segundo promotor no gene Sex-lethal ativado, e esse gene transcrito tanto em machos como em fmeas. Porm, a anlise de cDNA do mRNA Sxl mostra que o mRNA Sxl dos machos difere daquele das fmeas (Bell et al., 1988). Isso o resultado do processamento diferencial do RNA. Alm disso, a protena Sxl parece ligar-se a seu prprio precursor de mRNA emendando-o da maneira feminina. Como machos no tm protena Sxl disponvel, os seus novos transcritos so processados da maneira masculina (Keyes et al., 1992). O mRNA Sxl masculino no funcional. Enquanto a mensagem Sxl especfica de fmea codifica uma protena de 354 aminocidos, o transcrito Sxl especfico de macho contm um cdon de terminao tradutora (UGA) posterior ao aminocido 48. O processamento diferencial do RNA que coloca esse cdon de terminao no mRNA especfico para machos est mostrado nas Figuras 20.17B e 20.18. Em machos, o transcrito nuclear emendado de uma maneira que fornece trs xons, e o cdon de terminao est no interior do xon central. Em fmeas, o processamento de RNA fornece somente dois xons, e o xon central especfico de macho est agora externalizado como um grande ntron. Assim, o mRNA especfico de fmea carece do cdon de terminao. A protena produzida pelo transcrito Sxl especfico de fmea pode ser predita a partir de sua seqncia nucleotdica. Essa protena conteria duas regies que so importantes para ligao ao RNA compartilhadas com protenas nucleares ligantes de
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(A)
2X:2A
feminino
(B)
1X:2A
masculino
TRANSCRIO PROMOTORA PRECOCE
Fatores de transcrio de heterodmeros no iniciam a transcrio de Sxl
Fatores de transcrio dos promotores precoces
Gene Sxl
Gene Sxl
Transcrio No h transcrio de Sxl, traduo ou subseqente atividade do fator de emenda da protena Sxl
Protena Sxl Cdon Iniciador Emenda e traduo
TRANSCRIO PROMOTORA TARDIA
TRANSCRIO PROMOTORA TARDIA
Transcrio
Transcrio Sem Protena Cdon iniciador Cdon Terminao
Protena Sxl age como fator de emenda para remover o xon do transcrito
Emenda masculina revelia inclui cdon de parada no transcrito de RNA; protena no traduzida
Figura 20.17
Ativao diferencial do gene Slx em machos e fmeas. (A) em Drosophila tipo selvagem com dois cromossomos X e dois conjuntos de autossomos (XX; AA), as subunidades do fator de transcrio numerador (sis-a, sis-b, etc.) no esto totalmente complexadas pelas subunidades inibidoras derivadas dos genes (como deadpan) nos autossomos. Esses fatores numeradores ativam o promotor precoce do gene Sxl, que produz um transcrito que automaticamente emendado no mRNA especfico de fmea que codifica a protena Sxl funcional. Por fim, a transcrio constitutiva de Sxl comea a partir do promotor tardio. Se Sxl j estiver disponvel (i.e., de uma transcrio precoce), o mRNA de Sxl ser emendado para formar a mensagem funcional especfica de fmea. (B) Em Drosophila de tipo selvagem com um cromossomo X e dois conjuntos de autossomos (XO; AA), os fatores de transcrio numeradores so ligados pelas subunidades denominadoras e no podem ativar o promotor precoce. Quando o gene Sxl for transcrito do promotor tardio, a emenda de RNA no ir excluir o xon especfico de macho no mRNA. A mensagem resultante codifica um peptdio truncado e no-funcional, visto que o xon especfico de macho contm um cdon de terminao da traduo. (Segundo Keyes et al. 1992.)
RNA tais como quelas em snRNPs. Bell e colegas (1988) propuseram que existem dois alvos para a protena ligante de RNA codificada pelo Sxl. Um desses alvos o prmRNA do prprio Sxl. Isso seria o mecanismo que manteria o estado feminino da trajetria aps a ocorrncia do evento ativador inicial. O segundo alvo seria o prmRNA do prximo gene da trajetria, transformer.
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Os Genes transformer O gene Sxl regula a determinao sexual somtica controlando o processamento do transcrito do gene transformer. Como vimos no Captulo 12, o gene transformer (tra) emendado alternadamente em machos e fmeas. Existe um mRNA especfico de fmea e tambm um mRNA no-especfico encontrado tanto em fmeas como em machos. Tal como a mensagem Sxl masculina, o mRNA tra contm um cdon de terminao precoce na mensagem, tornando a protena no-funcional (Boggs et al., 1987). Em tra, o segundo xon do mRNA no-especfico tem um cdon de terminao. Esse xon no utilizado na mensagem especfica de fmea (veja Figura 20.18). Como fmeas produzem um transcrito diferente dos machos? Acredita-se que a protena especfica de fmea do gene Sxl ative um local de emenda 3 especfico de fmea no pr-mRNA do transformer fazendo com que ele seja processado de uma maneira que expele o segundo xon. Para isso, a protena Sxl bloqueia a ligao do fator de emenda U2AF ao stio de emenda no-especfico, ligando-se especificamente ao trato de polipirimidina adjacente. Isso leva o U2AF a se ligar ao local de emenda 3 de menor afinidade (especfico de fmea) e gerar um mRNA especfico de fmea (Valcrcel et al., 1993). A protena codificada por essa mensagem crtica para a determinao do sexo feminino. Se o transcrito especfico de fmea for produzido artificialmente em moscas XY, essas moscas se tornam fmeas. O transcrito no-especfico no tem efeito quer em machos quer em fmeas (McKeown et al., 1988). O produto de tra especfico de fmea age em conjunto com o gene transformer-2 (tra2) para ajudar a gerar o fentipo feminino. (O gene tra2 no necessrio para a determinao do sexo masculino, embora seja necessrio mais tarde para a espermatognese.) O gene tra2 constitutivamente ativo e produz o mesmo produto protico em machos e fmeas. Essa protena TRA-2, tal como a protena especfica de fmea Sxl, contm um domnio ligante de RNA (Amrein et al., 1988; Goralski et al., 1988). Propese que o gene tra2 pode se ligar ao transcrito do gene doublesex, mas somente na presena da protena Tra especfica de fmea (Baker, 1989). doublesex: O Gene Comutador da Determinao Sexual doublesex: O gene doublesex ativo tanto em machos como fmeas, mas seu transcrito primrio processado de uma maneira especfica do sexo (veja Figura 12.9; Baker et al., 1987). Os transcritos masculino e feminino so idnticos atravs dos trs primeiros xons. Os xons 3 diferem marcadamente. O que um xon para os transcritos especficos de fmea parte do terminal 3 no-traduzido da mensagem especfica de macho. Alm disso, anlises moleculares das mutaes dsx dominantes revelam que elas
Figura 20.18
O padro de emenda do RNA especfico do sexo em trs principais genes determinantes do sexo em Drosophila. Os pr-mRNAs esto localizados no centro do diagrama e so idnticos nos ncleos masculinos e femininos. Em cada caso, o transcrito especfico de fmea mostrado esquerda, enquanto o transcrito revelia (seja masculino ou noespecfico) mostrado direita. xons esto numerados, e as posies dos cdons terminais e stios poli(A) esto marcados. (Segundo Baker, 1989.)
mRNA masculino ou no-especfico AAA Cdon de parada
mRNA feminino
Emenda especfica de fmea
Pr-mRNA Sex-lethal
Emenda revelia
Transformer AAA Cdon de parada Doublesex AAA
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contm inseres no xon especfico de fmea. Se existir um alelo dsx dominante em um indivduo XX, a mosca se torna um macho. O processamento alternativo de RNA parece ser o resultado dos genes transformer (veja Figura 20.18). As protenas Tra2 e as protenas especficas de fmea Tra1 ligam-se especificamente uma seqncia de DNA adjacente ao local de emenda 3 especfica de fmea do pr-RNA dsx, e recruta fatores de emenda no-especficos para esse stio (Tian e Maniatis, 1993). Se tra no for produzido, o transcrito doublesex emendado de uma maneira especfica de macho. O stio de emenda 3 a jusante usado para produzir um transcrito especfico de macho. Esse codifica uma protena ativa que inibe traos femininos e promove traos masculinos. Por outro lado, se o gene trasnformer estiver produzindo sua protena ativa especfica de fmea d-se um tipo diferente de processamento (Ryner e Bruce, 1991). As protenas Transformer se ligam seqncia no interior do xon especfico de fmea e ativam o stio de emenda 3 especfico de fmea. (A alternativa seria elas bloquearem o stio 3 especfico de macho). Essa ativao, de um outro modo no usada do stio de emenda 3 especfico de fmea, produz um mRNA codificando uma protena especfica de fmea que ativa genes especficos de fmea (como aqueles das protenas do vitelo) e inibe o desenvolvimento masculino. As funes das protenas Doublesex podem ser observadas na formao da genitlia de Drosophila. Aqui, tanto genitlia masculina como feminina derivam de populaes celulares diferentes. Em moscas masculinas (XY), o primrdio feminino reprimido e o masculino se diferencia em estruturas genitais adultas. Em moscas femininas (XX), o primrdio masculino reprimido, e o feminino se diferencia. Se o gene doublesex estiver ausente (e a nenhum transcrito ser produzido), ambos primrdios, masculino e feminino, se desenvolvem e sero produzidas genitlias intersexuais. Assim, um dos papis dos transcritos doublesex especficos do sexo o de inibir ativamente o crescimento da genitlia inapropriada. Transcritos dsx masculinos inibem o desenvolvimento da fmea; transcritos dsx especficos de fmea inibem o desenvolvimento masculino (Nthiger et al., 1977; Schpbach et al., 1978). De acordo com esse modelo (Baker, 1989), a cascata da determinao sexual se reduz a qual tipo de mRNA ser processado do transcrito doublesex. Se a razo X:A for 1, ento Sxl produz um fator de emenda especfico de fmea que faz com que o transcrito do gene tra seja emendado de uma maneira especfica de fmea. Essa protena especfica de fmea interage com o fator de emenda Tra2 para levar o pr-mRNA doublesex a ser emendado de uma maneira especfica de fmea. Se o transcrito doublesex no sofre tal atuao, ele ser processado revelia para produzir a mensagem especfica de macho. Genes-alvo para a Cascata de Determinao Sexual Muitas protenas esto presentes em um sexo de Drosophila e no no outro. Em fmeas, essas incluem as protenas do vitelo e as da casca do ovo (crio). Em machos, as cristas sexuais das patas so estruturas especficas do sexo. Coschigano e Wensink (1993) mostraram que tanto os transcritos doublesex masculinos como os femininos se ligam a trs stios no interior do intensificador de 127 pares de bases dos genes yolk protein (protenas do vitelo). Seus estudos de ligao e mutagnese demonstram que o produto Doublesex especfico de macho inibe a transcrio ligando-se a esses stios, enquanto a protena Doublesex especfica de fmea ativa a transcrio gnica a partir dos mesmos stios. Alm disso, a protena Doublesex masculina pode tambm exercer um papel positivo na promoo da diferenciao das cristas sexuais masculinas (Jursnich e Burtis, 1993). Mutaes termosensveis dos genes determinantes do sexo podem capacitar pesquisadores a determinarem os momentos crticos em que certos genes-alvo esto sensveis a uma comutao determinante do sexo. Quando alelos sensveis temperatura (ts) do gene tra2 foram usados, as vias de desenvolvimento sexual em Drosophila
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mostraram-se ativas desde os estgios larvais tardios at o perodo adulto. O gene tra2ts um alelo sensvel temperatura no qual o fentipo feminino expresso em temperaturas permissivas (mais frias) e o fentipo masculino em temperaturas nopermissivas (mais quentes). Durante estgios tardio larval e de pupa, o aumento da temperatura de nveis permissivos para no-permissivos faz com que uma larva ou pupa XX se desenvolva em macho. Alm disso, quando mutantes adultos so conservados a temperaturas baixas, o corpo gorduroso adulto produz protenas do vitelo (yolk proteins) que iro penetrar no ocito. Quando movidos para temperatura mais altas, no-permissivas, a transcrio dos genes yolk protein cessa (Belote et al., 1985b). Um achado notvel foi que se moscas adultas XX tra2ts so conservadas em temperatura no-permissiva durante vrios dias, elas comeam a exibir comportamento de cortejar masculino (Belote e Baker, 1987).
Hermafroditismo
Hermafroditismo no Nematide C. elegans O nematide Caenorhabditis elegans tem usualmente dois tipos sexuais: hermafrodita e macho. A maioria dos indivduos dessa espcie so hermafrodticos,* tendo tanto testculos como ovrios. Quando larvas, esses hermafroditas produzem espermatozide, que armazenado no trato genital do nematide (Figura 20.19). O ovrio adulto produz vulos que so fertilizados quando migram para o tero. (O espermatozide j est presente no hermafrodita adulto.) A autofertilizao quase sempre produz mais hermafroditas. Somente 0.2 porcento da prognie so machos. Esses, porm, podem copular com hermafroditas; como seu espermatozide tem uma vantagem competitiva sobre o espermatozide hermafrodita endgeno, a razo sexual resultante de tais unies de cerca 50% hermafroditas e 50% machos (Hodgkin, 1985). Em C. elegans, o hermafrodita XX, e o macho XO. Como em Drosophila, o sexo determinado pela razo de cromossomos X para autossomos. Em espcies estreitamente relacionadas de nematides so encontradas fmeas XX, sugerindo que os hermafroditas evoluram de fmeas. Somaticamente, as fmeas e os hermafroditas so idnticos, a nica diferena sendo a produo de espermatozide durante o desenvolvimento precoce antes dos hermafroditas mudarem para a produo de vulos. Em C. elegans existe uma mutao dominante (tra-1D) que transforma indivduos XX ou XO
*Hermafroditas receberam o nome em homenagem ao filho de Hermes (Mercrio) e Afrodite (Vnus). Tendo herdado a beleza de ambos os pais, excitou o amor da ninfa da fonte de Salmacis. Enquanto ele se banhava nessa fonte, ela o abraou, pedindo aos deuses que eles ficassem unidos para sempre. Ela conseguiu seu desejo da forma mais literal possvel.
Hermafrodita: XX Ovrio vulos no tero Espermatozide na espermateca
Ovrio
Boca
Ocitos
nus rgo copulatrio
Macho: XO
Vulva Espermatozide Vasos deferentes Testculos
Figura 20.19
Cloaca
Diagramas esquemticos do macho e do hermafrodita de Caenorhabditis elegans, enfatizando seus sistemas reprodutivos. (de Hodgkin, 1985.)
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1.0
Baixo
Alto
Baixo
Alto
Baixo
Alto Hermafrodita
Ratio X:A Alto Baixo Alto Baixo Alto Baixo Macho
Figura 20.20
Modelo esquemtico da determinao sexual somtica em C. elegans. O gene sdc-1 postulado estar envolvido na transmisso da razo X/A. Ele controla compensao de dosagem do cromossomo X assim como a supresso do gene her-1 se a razo for 1. A designao alto/ baixo reflete a atividade funcional do gene. A atividade dos genes sdc, ao final, leva atividade do gene tra-1, cuja atividade promove o fentipo hermafrodita. Os genes scd podem ser inibidos pelo gene xol, que somente ativo em XO (machos). (Segundo Hodgkin, 1985; Miller et al., 1988.)
em fmeas frteis. Em colnias com tal alelo, trs sexos so possveis e funcionais (Hodgkin, 1980). Como em Drosophila, a determinao do sexo em C. elegans envolve vrios genes autossmicos que lem e respondem razo X:A. O gene que integra os numeradores e denominadores do desenvolvimento de C. elegans o xol-1 (XO-lethal). Nveis altos de XOL-1 durante a gastrulao desligam a trajetria para o desenvolvimento hermafrodtico, transformando com isso o animal em um macho (Rhind et al., 1995). XOL-1 parece conseguir isso reprimindo os genes sdc (controle da determinao do sexo), cujas atividade tornam o animal hermafrodita (Miller et al., 1988). A trajetria para determinao do sexo em C. elegans foi decifrada encontrando-se mutaes em genes necessrios para o desenvolvimento hermafrodita (os genes tra), bem como outros necessrios para a expresso do fentipo masculino (os genes her e fem). Criando gentipos carreando diferentes combinaes dessas mutaes Hodgkin (1980) e outros foram capazes de construir um modelo para essa via desenvolvimental (Figura 20.20). Por exemplo, mutaes tra-2 suprimiram a mutao her-1, indicando que her-1 mais tardio na trajetria. O gene crucial na trajetria para a determinao sexual parece ser o tra-1. Se o tipo selvagem tra-1 for ativo, o indivduo um hermafrodita. Se esse gene no for funcional, o indivduo um macho. Os outros genes parecem regular esse gene singular de troca. Porm, o que tem essa via gentica linear a ver com os reais eventos celulares levando determinao sexual? Estudos recentes indicam que alguns desses genes codificam protenas de uma via sinalizadora entre clulas. A anlise de mosaicos genticos sugere que sdc-1 e her-1 no so necessariamente ativos nas clulas que os produzem. Ao contrrio, esses genes parecem produzir produtos secretados. Em contraste, tra-1 age de um modo celular autnomo e, portanto, provavelmente parte de um aparelho receptor de sinais. A seqncia do gene tra-1 sugere que esse codifica um fator de transcrio dedo de zinco (Hunter e Wood, 1990; Zarkower e Hodgkin, 1992; Perry et al., 1993). Kuwabara e Kimble (1992) propuseram recentemente um modelo que integra essa via gentica com a biologia celular da determinao do sexo. A protena HER-1 considerada promover o desenvolvimento masculino em nematides XO inibindo a TRA-2. A protena codificada por tra-2, porm, no um fator de transcrio ou um fator de emenda, mas sim uma protena integral de membrana com mltiplos domnios transmembrana. Alm disso, seu mRNA encontrado (em quantidade diferentes) tanto em machos como em fmeas. De acordo com esse modelo especulativo (Figura 20.21), as protenas FEM se combinam para criar um grande complexo de protena FEM, e esse complexo est ligado pela protena TRA-2 da membrana. Em indivduos XX, esse complexo ligado membrana, e a protena TRA-1 pode entrar no ncleo. Em nematides XO, porm, a protena HER-1 se liga regio extracelular da protena TRA-2, causando a liberao do complexo FEM. Esse complexo, uma vez livre no citoplasma, pode ligar a protena TRA-1 e impedir sua entrada no ncleo. Desde que a
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Hermafroditas XX
Machos XO
Figura 20.21
Citoplasma
Esquema hipottico para as aes dos genes determinantes do sexo em C. elegans. Em indivduos XX, as protenas FEM esto seqestradas prximo da membrana celular pelos produtos dos genes tra-2. Na ausncia das protenas FEM, a protena TRA-1 penetra no ncleo para transcrever os genes necessrios para o desenvolvimento hermafrodtico. Em indivduos XO, a protena HER-1 se liga ao produto de TRA-2, levando-o a liberar as protenas FEM. Uma vez livres no citoplasma, essas protenas podem se ligar ao produto de TRA-1, impedindo-o de penetrar no ncleo. (Segundo Kuwabara e Kimble, 1992.)
Ncleo
protena TRA-1 (um fator de transcrio putativo) no pode entrar no ncleo, ela no poder ativar os genes especficos do hermafrodita. Mais estudos tero que ser realizados para confirmar ou desaprovar esse modelo que, no entanto, til por sugerir novas pesquisas e por visualizar como os genes poderiam gerar vias para a determinao sexual em C. elegans. Um dos problemas mais interessantes desse nematide seu hermafroditismo. Como se originou essa condio em um organismo que provavelmente tinha um sistema sexual macho/fmea? Quais mudanas genticas apareceram, e haveria outras solues que poderiam ter prevalecido? Os genes determinantes do sexo de uma espcie estreitamente relacionada, a C. ramanei (com indivduos macho e fmea) esto sendo agora identificados para se poder responder a essas perguntas. [sex7.html] Hermafroditismo em Peixes Embora o hermafroditismo no seja incomum em vermes e insetos, s visto raramente em vertebrados. Em aves e mamferos, o hermafroditismo geralmente uma condio patolgica causando infertilidade. Os hermafroditas vertebrados mais comuns so peixes, que exibem vrios tipos de hermafroditismo (Yamamoto, 1969). Alguns peixes, porm, so gonocorsticos; isso , eles tm um sexo determinado cromossomicamente como macho ou fmea. Peixes hermafroditas podem ser divididos em trs grupos. Os primeiros so os hermafroditas sincrnicos, nos quais ovrios e tecidos testiculares existem ao mesmo tempo e nos quais tanto espermatozide como vulos so produzidos. Uma dessas espcies Servanus scriba. Na natureza e em aqurios, esses peixes formam pares procriadores. Assim que um dos peixes pe seus ovos, o outro peixe os fertiliza. Em seguida os peixes invertem seus papis, e o peixe que havia sido macho pe seus ovos para que possam ser fertilizados pelo espermatozide de seu parceiro (Clark, 1959). Em outras espcies hermafroditas, um indivduo passa por uma mudana sexual geneticamente programada durante seu desenvolvimento. Nesses caso, as gnadas so dimrficas, tendo tanto reas femininas como masculinas. Uma ou outra predomina durante certa fase da vida. Em hermafroditas protginos (fmea primeiro), o animal comea sua vida como uma fmea para mais tarde tornar-se um macho. O reverso acontece em espcies protndreas (machos primeiro). A Figura 20.22
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Figura 20.22
(A)
FASE MASCULINA Ovrio
(B)
FASE TRANSITRIA
(C)
FASE FEMININA
Alteraes nas gnadas no peixe hermafrodita Sparus auratus, mostradas em seo atravs da gnada de (A) a fase masculina, (B) a fase transitria e (C) a fase feminina final. (Cortesia da famlia de T. Yamamoto.)
Ovrio Ovrio
Testculo Testculo Testculo
mostra as mudanas gondicas no peixe hermafrodita protndreo Sparus auratus. A princpio predomina o tecido testicular, mas aps um perodo de transio no qual so vistos tanto tecidos testiculares como ovarianos, as clulas ovarianas predominam.
Determinao ambiental do sexo

Temperatura Sexual Determinao Sexual Dependente de Temperatura em Rpteis Enquanto o sexo da maioria das serpentes e lagartos determinado pelos cromossomos sexuais no momento da fecundao, o sexo da maioria das tartarugas e todas as espcies de crocodilos determinado pelo ambiente aps a fecundao. Nesses rpteis, a temperatura dos ovos durante um certo perodo do desenvolvimento o fator decisivo na determinao do sexo (Bull, 1980), e pequenas alteraes na temperatura podem causar mudanas dramticas na razo sexual. Em geral, ovos incubados baixa temperatura (22o 27oC ) produzem um sexo, enquanto ovos incubados a temperaturas mais altas (30oC e acima) produzem o outro. H somente um pequeno intervalo de temperatura que permite tanto machos como fmeas emergir de um mesmo choco de ovos. A Figura 20.23 mostra mudana abrupta causada por mudana de temperatura nas razes sexuais para certas espcies de tartarugas. Se os ovos forem incubados abaixo de 28oC, todas as tartarugas sero machos. Acima de 32oC cada ovo origina uma fmea. Em temperaturas intermedirias daro origem a indivduos de ambos os sexos. Existem variaes disso. Os ovos das tartarugas mordedoras (snapping turtles), por exemplo, sero fmeas no frio (20oC ou abaixo) ou no calor (30oC ou acima). Entre esses extremos, predominam os machos. Um dos rpteis melhor estudados a tartaruga europia de lagoas, Emys obicularis. No laboratrio, a incubao de ovos de Emys temperaturas acima de 30oC produz fmeas, enquanto abaixo de 25oC as crias sero todas masculinas. A temperatura limite (na qual a razo sexual 1) de 28.5oC (Pieau et al., 1994). O perodo desenvolvimental durante o qual ocorre a determinao sexual, pode ser estudado incubando ovos na temperatura produtora de machos por um certo perodo, e em seguida mudando os ovos para uma incubadora temperatura produtora de fmeas (e vice-versa). Em Emys, a ltima tera parte do desenvolvimento parece ser o perodo mais crtico para a determinao sexual. No se acredita que as tartarugas possam reverter seu sexo aps esse perodo. Os caminhos para a masculinidade e feminilidade esto apenas sendo delineados. O estrgeno induz a diferenciao ovariana temperaturas masculinizantes, e o perodo sensvel para os efeitos do estrgeno coincide com quele em que a determinao
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(A) Lagartos
Porcentagem de nascimentos masculinos
(B) Tartarugas
Porcentagem de nascimentos masculinos
Graptemys (3 espcies) Chrysemys picta Testudo graeca
Todos machos Agama agama Eublepharis macularius
Todos machos Emys obicularis
Caretta caretta
Todas fmeas
Todas fmeas
Figura 20.23
Relao entre a razo sexual e a temperatura de incubao em rpteis. (A) Duas espcies de lagartos nas quais temperaturas mais altas resultam na gerao de prole masculina. (B) Sete espcies de tartarugas nas quais temperaturas mais altas resultam em prole feminina. (Segundo Bull, 1980.)
do sexo normalmente ocorre (Bull et al., 1988; Gutzke e Chymiy, 1988). Parece que a enzima aromatase (que pode converter testosterona em estrgeno) importante. A atividade da aromatase de Emys muito baixa temperatura masculina de 25oC. temperatura feminina de 30oC, a atividade da aromatase aumenta dramaticamente durante o perodo crtico para a determinao do sexo (Desvages et al., 1993; Pieau et al., 1994). Atividade dependente de temperatura de aromatase tambm vista em terrapneos (tartarugas-diamondback terrapins), e sua inibio masculiniza suas gnadas (Jeyasuria et al., 1994). possvel que o regulador da atividade da aromatase seja o hormnio anti-Mlleriano. AMH conhecido por diminuir a atividade da aromatase em gnadas de Emys (Desvages e Pieau, 1992). Ferguson e Joanen (1982) estudaram a determinao sexual no jacar do Mississipi, tanto no laboratrio como no campo; eles concluram que o sexo determinado entre 7 e 21 dias de incubao. Ovos criados a 30oC ou abaixo produzem fmeas, enquanto aqueles incubados a 34oC ou acima produzem somente machos. Alm disso, ninhos construdos sobre barragens (perto de 34oC) produzem machos, enquanto aqueles construdos em pntanos midos (perto de 300C) produzem fmeas. As vantagens e desvantagens da determinao sexual dependente de temperatura so discutidas no Captulo 21. Determinao Sexual Dependente da Localizao em Bonellia viridis e Crepidula fornicata O sexo do verme equiuride Bonellia depende de onde a larva se aloja. Bonellia fmea marinha, habita rochas, tem um corpo de cerca de 10 cm (Figura 20.24), Tem, porm, uma probscide que pode se estender por mais de um metro. Essa probscide tem duas funes. Em primeiro lugar, varrer comida das rochas para o trato digestivo da fmea. Em segundo lugar, se uma larva aterrissar na probscide, essa entra na boca do animal, migra at o tero, e se diferencia em macho simbitico de 1-3 mm de comprimento. Assim, quando uma larva se aloja numa superfcie rochosa, torna-se uma fmea, mas se a mesma larva se aloja sobre a probscide de uma fmea, se torna um macho. O macho de Bonellia passa sua vida no interior do corpo da fmea, fecundando seus ovos. Baltzer (1914) demonstrou que quando larvas eram cultivadas na ausncia de fmeas adultas, cerca de 90 porcento se tornavam fmeas. Porm, quando essas larvas
(A)
Probscide
(B)
Figura 20.24
Dimorfismo sexual extremo em Bonellia viridis. (A) Fmea, de cerca de 10 cm, com uma probscide capaz de se estender por mais de um metro. (B) Macho simbitico (muito aumentado comparado com a fmea), 1-3 mm de comprimento. (Segundo Barnes, 1968.)
800
gua do mar pura gua do mar e fragmentos de probscide
Porcentagem
Indiferentes
Figura 20.25
Anlise in vitro da diferenciao de Bonellia. Larvas foram colocadas em gua do mar normal ou em gua do mar contendo fragmentos de probscide feminina. A maioria dos animais cultivados na presena dos fragmentos de probscide tornaram-se machos, enquanto normalmente se tornariam fmeas. (Segundo Leutert, 1974.)
eram cultivadas na presena de uma fmea adulta ou de sua probscide isolada, 70 porcento aderiam probscide e desenvolviam estruturas masculinas. Esses resultados foram mais recentemente confirmados por Leutert (1974; Figura 20.25). A(s) molcula(s) responsvel pela masculinizao das larvas podem ser extradas da probscide de fmeas adultas. Quando larvas so cultivadas em gua do mar normal, na ausncia de fmeas adultas, a maioria se torna fmea. Quando cultivadas em gua do mar contendo extratos aquosos de tecido da probscide, a maioria adquire forma de macho ou intermediria, nem totalmente masculina nem feminina (Nowinski, 1934; Agius, 1979). O composto ou compostos que atraem a larva para a probscide e causam sua masculinizao esto sendo purificados. Outro exemplo em que a determinao sexual afetada pela posio do organismo o caso do caramujo escorregador Crepidula fornicata. Aqui, indivduos se empilham uns em cima dos outros para formar um montculo (Figura 20.25). Indivduos jovens so sempre machos. Essa fase seguida pela degenerao do sistema reprodutivo masculino e um perodo de labilidade. A prxima fase pode ser masculina ou feminina, dependendo da posio do animal no montculo. Se a lesma est fixada uma fmea, torna-se macho. Se tal lesma for removida da fixao, torna-se fmea. Da mesma maneira, a presena de um grande nmero de machos ir fazer com que alguns dos machos se tornem fmeas. Porm, uma vez que o indivduo se torna fmea, no ir reverter para macho (Coe, 1936).
Resumo
A Natureza forneceu muitas variaes em sua obra prima. Em algumas espcies, o sexo determinado somente por cromossomos, enquanto em outras, sexo uma questo de condies ambientais. Entre essas grandes categorias, existem numerosas variaes. Um catlogo completo dos mecanismos de determinao sexual conhecidos iria requerer um volume em separado (e muito interessante).
Figura 20.26
Morto
Agregados de lesmas Crepidula. Dois indivduos esto mudando de machos para fmeas. Aps esses moluscos se tornarem fmeas, sero fecundados pelo macho acima deles. (Segundo Coe, 1936.)
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Regulao ambiental do desenvolvimento animal
21
Podemos agora passar a considerar adaptaes para o ambiente externo; e inicialmente as adaptaes diretas.... nas quais um animal, durante seu desenvolvimento, modificado por fatores externos de tal maneira que h um aumento da eficincia com que esses fatores so tratados. C. H. WADDINGTON (1957)
mo em relao s suas condies de existncia, e a investigao do organismo vivo era geralmente realizada em seu habitat original. Somente ao redor de 1850, que a fisiologia emergiu como uma tentativa de quantificar o fenmeno biolgico no laboratrio. A embriologia permaneceu dentro do reino da biologia, enquanto a fisiologia investigava as estruturas e funes dos organismos adultos independentemente dos seus ambientes originais (Nyhart, 1995). Dentro desse contexto biolgico, a embriologia foi vista como o motor da mudana evolucionria, e o desenvolvimento como sendo condicionado pelo ambiente. Por exemplo, Augusto Weismann (1875) verificou que borboletas da mesma espcie eclodindo em estaes diferentes podiam apresentar cores diferentes, e ele podia transformar a forma do vero na forma da primavera, resfriando as pupas. Carl Siebold mostrou que alguns afdios partenogenticos podiam dar origem a machos e fmeas sexuadas tardiamente na poca de reproduo para produzir um ovo que hibernava (e que invariavelmente eclodia como uma fmea partenogentica), e vrios pesquisadores estudaram a determinao sexual pelo ambiente na Bonellia e em colmias de insetos (veja Hertwig, 1894). A primeira gerao de embriologistas experimentais estudou os efeitos do ambiente sobre o desenvolvimento, incluindo o efeito de falta de ons ou de nutrientes na determinao do sexo e na morfognese (Selenka 1876; Born, 1881; Herbst, 1893). (Os estudos de Born mostrando que o sexo de embries de rs podia ser alterado por fatores ambientais foi mostrado com proeminncia no filme Jurassic Park.) Mas a mar estava mudando. Nas dcadas de 1870 e de 1880, jovens zoologistas se afastavam dessas questes biolgicas em direo s questes de fisiologia interna e anatomia. Embriologistas mais velhos, como Carl Siebold e Ernst Haecke, que desenvolveram seus trabalhos em um contexto evolucionrio ou ambiental, se desesperavam porque a prxima gerao de zoologistas cientficos somente conheceria cortes seccionais e tecidos corados, mas nem o animal inteiro e nem seu modo de vida (Haeckel, 1881). Eles estavam atnitos pela falta de interesse dos
A PRIMEIRA METADE do sculo 19, biologia era o estudo do organis-
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jovens pesquisadores em estudar o embrio vivo no seu habitat natural.* Siebold justificou esses excessos observando que a presso para publicar exercida sobre os jovens cientistas os forava a realizar pesquisa que podia ser feita em poucos meses, em lugar das que ele realizava e que levavam anos para serem completadas (Nyhart, 1995). Quando Wilhelm Roux tentou unir a embriologia experimental com a fisiologia, ele postulou que o desenvolvimento era causado por fatores internos, especialmente aqueles dentro do ncleo. A embriologia experimental se afastou das explicaes ambientais e se concentrou naquelas foras dentro do ovo fertilizado que permitem o desenvolvimento do embrio. Essa tem sido a direo geral da biologia do desenvolvimento. Agora, com o novo interesse na relao entre desenvolvimento e evoluo, com a surpreendente perda de diversidade nos organismos e os efeitos dos poluentes ambientais, existe uma renovada preocupao com a regulao do desenvolvimento pelo ambiente (veja Weele, 1995). Algumas pessoas esto convencidas de que o DNA fornece o programa que controla o desenvolvimento do embrio (Wolpert, 1991) ou que tudo que necessrio para formar o embrio est dentro do ovo fertilizado. Entretanto, existem numerosos exemplos (e o Homo sapiens fornece os melhores) onde o ambiente tem um papel crtico na determinao do fentipo do organismo. Ns j discutimos a regulao ambiental do desenvolvimento quando estudamos a determinao do sexo em Bonellia, Crepidula e muitos rpteis (veja Captulo 20). Naturalmente, a habilidade gentica para responder a tais fatores ambientais deve ser herdada, mas nesses casos o ambiente que pode dar os diferentes fentipos a partir do mesmo gentipo nuclear.
REGULAO AMBIENTAL DO
DESENVOLVIMENTO NORMAL
Sugestes ambientais usadas pelos organismos para completar seus desenvolvimentos

Certas sugestes ambientais, tais como um campo gravitacional de 1G ou um oceano salino a 0.85%, podem ser utilizados durante o desenvolvimento. Portanto, no surpreendente que muitos ovos usam a gravidade como a fora que assegura a polaridade de seus ocitos, e a perturbao da gravidade pode desregular o desenvolvimento em rs e aves (Pflger, 1883; Born, 1884). Analogamente, vimos no Captulo 4 que ocitos de ourio-do-mar (e sem dvida os ocitos de muitas outras espcies) usam ons de sdio da gua do mar para substituir os ons de hidrognio e ajudar a ativar o ovo (Jaffe, 1980). Embries de mamferos esto intimamente ligados ao seu alimento, oxignio e fontes inicas durante seu inteiro desenvolvimento pr-natal. Nesses casos, as sugestes para o desenvolvimento normal no esto no ocito, mas assume-se que esto presentes no ambiente onde o ovo se desenvolve. A colonizao larval A incluso de sugestes ambientais no desenvolvimento normal ocorrem durante a colonizao de larvas marinhas. Aqui, as sugestes podem no ser universais, mas devem ser parte do ambiente se o desenvolvimento deve prosseguir. Uma larva planctnica freqentemente necessita se estabelecer prximo a uma fonte de alimento ou a um substrato firme no qual sofre a metamorfose. Se a presa ou as ncoras fornecem molculas solveis, essas molculas podem ser usadas pelas larvas como
* Essas preocupaes e a retrica que as expressa so extraordinariamente similares quelas dos embriologistas mais velhos de hoje que se desesperam porque os pesquisadores mais jovens so somente clonadores de genes sem conhecimentos sobre a estrutura total dos embries (veja Nyhart, 1995).
CAPTULO 21
Regulao Ambiental do Desenvolvimento Animal
807
Tabela 21.1 Substratos especficos para a colonizao de larvas de moluscos Espcies de moluscos Substrato
GASTROPODA (caracis, nudibrnquios) Nassarius obsoletus Philippia radiata Adalaria proxima Doridella obscura Phestila sibogae Rostanga pulchra Trinchesia aurantia Elysia chlorotica Haminoea solitaria Aplysia californica Aplysia juliana Aplysia parvula Stylocheilus longicauda Onchidoris bilamellata AMPHINEURA (CHITONS) Tonicella lineata Lithophyllum sp. e Lithothamnion sp. (algas vermelhas) Lama do habitat do adulto Porites lobata (um cnidrio) Electra pilosa (um briozorio) Electra crustulenta (um briozorio) Porites compressa (um cnidrio) Ophlitaspongia pennata (uma esponja) Tubularia indivisa (um cnidrio) Filme primrio de microorganismos do habitat do adulto Filme primrio de microorganismos do habitat do adulto Laurencia pacifica (uma alga vermelha) Ulva spp. (algas verdes). Chondrococcus hornemanni (uma alga vermelha) Lyngbya majuscula (uma cianobactria) Crustceos vivos
LAMELLIBRANCHIA (Bivalvos) Teredo sp. Bankia gouldi Mercenaria mercenaria Placopecten magellanicus Mytilus edulis Crassostrea virginica Madeira Madeira Lquidos de moluscos; areia Concha adulta; areia; etc. Algas filamentosas; outro material no biolgico de seda Lquido da concha; extrato do corpo; glicognio de crustceo
sugestes para iniciar sua colonizao. Nos moluscos, freqentemente existem sugestes muito especficas para a colonizao (Tabela 21.1). A maioria das larvas dos nudibrnquios (lesma do mar) sofrem metamorfose somente se induzida por uma presa adulta viva (que diferente de espcie a espcie). Em alguns casos, foi identificado o produto solvel da presa que dispara a metamorfose (Hadfield, 1977). A larva do teredo (shipworm) Teredo navalis induzida a se estabelecer por compostos liberados pela madeira, e material solvel eludo de conchas de ostras induzem a colonizao das larvas de ostras.* O haliote vermelho (abalone) Haliotis rufescens tem larvas que somente colonizam quando entram em contacto fsico com algas vermelhas coralinas. Somente um contacto breve necessrio para que a larva competente pare de nadar e comece a metamorfose. Ainda no foi isolado o agente qumico responsvel por essa modificao, mas o reconhecimento de um peptdeo de algas induz a metamorfose em larvas competentes. As larvas que no so competentes para a induo da metamorfose parecem no ter esse receptor. Considera-se que esse receptor esteja ligado a uma
* Em 1880, William Keith Brooks, um embriologista na Universidade de Johns Hopkins (e supervisor da tese de T. H. Morgan, E. B. Wilson, R.G. Harrison e E. G. Conklin), foi solicitado a ajudar a problemtica indstria de ostras de Chesapeake Bay. Durante dcadas, as ostras foram dragadas da baa, e sempre havia uma nova colheita em seu lugar. Mas, recentemente, a produo estava caindo ano a ano. O que seria responsvel por esse declnio? Realizando experimentos com larvas de ostras, Brooks descobriu que a ostra Americana (diferentemente de sua prima Europia- melhor conhecida) necessitava de um substrato rgido no qual sofriam metamorfose. Durante anos, os pescadores de ostras jogavam as conchas de volta para o mar, mas com o advento das caladas suburbanas, os pescadores estavam vendendo as conchas para as fbricas de cimento. A soluo de Brooks: jogar as conchas de volta na baa. A populao de ostras respondeu: o cais de Baltimore at hoje vende seus descendentes.
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protena G semelhante quelas encontradas em vertebrados, e a ativao dessa protena G pode ser necessria para a induo da colonizao larval e a metamorfose (Morse et al., 1984; Baxter e Morse, 1992; Degnan e Morse, 1995). O alimento no a nica sugesto usada na colonizao larval. A larva da mosca preta, por exemplo, se adere a superfcies duras nos rios e se alimenta passivamente das partculas suspensas no fluxo. Essas larvas procuram ativamente reas com correntes de alta velocidade. Nessa zona de alta velocidade as larvas so relativamente imunes aos ataques dos platelmintos. Em experimentos de laboratrio (Hansen et al., 1991), platelmintos no podiam capturar larvas da mosca preta em fluxos mais rpidos que 35 cm/segundo. A razo disso que os platelmintos ingerem sua presa elevando a cabea para fora da superfcie. Isso expe sua superfcie frontal ao fluxo e reduz a rea da superfcie de aderncia ao substrato. Portanto, em correnteza de alta velocidade, os platelmintos correm o risco de serem levados rio abaixo se eles tentam se alimentar. Dessa maneira, as moscas pretas sobrevivem, sofrem metamorfose e dificultam a vida dos prximos acampados. Refeies de sangue Em muitos mosquitos, a produo de ovos induzida por uma refeio sangnea. (Na Drosophila a sugesto ambiental para a produo de ovos parece ser o fotoperodo.) Nos mosquitos, s a fmea pica e ela no produz vitelogenina antes dessa refeio. No Aedes aegypti, os produtos digeridos do alimento sangneo estimulam o crebro a secretar o hormnio neurosecretor para o desenvolvimento do ovo (EDNH, tambm conhecido como hormnio ecdisteroidognico ovariano, OEH). Esse estimula o ovrio a produzir ecdisterides, os quais instruem as clulas do corpo gorduroso a produzir vitelogenina para os ocitos (Fallon et al., 1974; Hagedorn, 1983; Borovsk et al., 1990). A vitelogenina crtica para a produo de ovos. Portanto, sem uma refeio sangnea, no h vitelogenina e nem ovos (Figura 21.1). No inseto sugador de sangue, Rhodinus prolixus, as fmeas adultas produzem uma nova carga de ovos toda vez que sugam sangue. Esse alimento sangneo serve a dois propsitos. As protenas do sangue fornecem os aminocidos necessrios para a sntese de vitelogenina, e o estiramento fsico do abdmen pelo sangue inicia o estmulo endcrino que ativa a secreo do hormnio juvenil pela corpora allata. O hormnio juvenil estimula a sntese de vitelogenina no ovrio e no corpo gorduroso (veja Nijhout, 1994). Alm disso, o estiramento causado por uma nica refeio sangnea induz a muda larval. Se esse inseto se alimentar com vrias pequenas refeies, ele sobreviver, mas no sofrer muda e nem crescer. Nessa situao, mamferos so usados em parte do desenvolvimento de insetos. Simbiose no desenvolvimento Em alguns dos exemplos acima, o desenvolvimento de um indivduo possvel pela presena de outro indivduo de uma espcie diferente. Em alguns organismos, essa relao se tornou simbitica (Sapp, 1994). Aqui, os simbiontes esto fortemente integrados ao organismo hospedeiro, e esse no pode se desenvolver sem eles. A lula adulta Euprymna scolopes est equipada com um rgo de luz composto de sacos contendo a bactria luminosa Vibrio fischeri. A lula juvenil no tem esses simbiontes emitentes de luz e nem as estruturas para abrig-los. Na verdade, a lula adquire a bactria atravs da gua do mar bombeada atravs da cavidade de sua cobertura. As bactrias se ligam a um epitlio ciliado que se estende nessa cavidade. As bactrias induzem a morte dessas clulas, sua substituio por um epitlio no ciliado e a diferenciao das clulas epiteliais vizinhas para se tornar receptculos de armazenagem das bactrias (Figura 21.2; McFall-Ngai e Ruby, 1991; Montgomery e McFall-Ngai, 1995).
CAPTULO 21
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Emergncia
Refeio de sangue
Figura 21.1
Crebro
Crebro
Diagrama de fluxo mostrando as interaes que permitem a produo de ovos no mosquito Aedes aegypti. (De acordo com Hagedorn, 1983; Nijhout, 1994.)
Corpora allata Acasalamento e comportamento alimentar Ovrio imaturo Corpo gorduroso Competncia crescimento
EDNH
JH
Ovrio no estgio de repouso
Vitelogenina
Ovrio vitelognico
Ovos e ovrio ps-vitelognico
Competncia
Corpo gorduroso competente
Ecdisterides
A simbiose entre massas de ovos e algas fotossintticas crtica para o desenvolvimento de certas espcies. O suprimento de oxignio limita a taxa de desenvolvimento quando os ovos esto agrupados em massas compactas, e o desenvolvimento dos embries na parte interna do aglomerado retardado em comparao com aqueles mais prximos da superfcie (Strathmann e Strathmann, 1995). Apesar do forte gradiente de oxignio partindo de fora do aglomerado para seu interior, os embries parecem ter resolvido o problema envolvendo-se com uma fina camada de algas fotossintticas. Em ninhadas de ovos de anfbios e caracis, fotossntese infratora das algas permite produo lquida de oxignio na luz, enquanto a respirao excede a fotossntese no escuro (Bachmann et al., 1986; Pinder e Friet, 1994; Cohen e Strathmann, 1996). Portanto, as algas salvam os ovos pela fotossntese. Uma ligao ainda mais intensa entre morfognese e simbiose verificada na cigarrinha Euscelis incisus. Aqui, a simbiose ocorre dentro do ovo. Existem bactrias simbiticas nessas espcies que esto dentro do citoplasma do ovo e que so transferidas atravs de geraes, exatamente como as mitocndrias. Essas bactrias se tornaram to especializadas que s podem se multiplicar dentro do citoplasma do organismo, e o embrio do hospedeiro se tornou to dependente da bactria que lhe
Figura 21.2
(A)
(B)
Micrografia eletrnica de varredura do primrdio do rgo de luz de uma lula juvenil E. scolopes de 3 dias. (A) rgo de luz em um juvenil no infectado. (B) rgo de luz de um juvenil infectado com a bactria simbitica V. fischeri. Regresso do epitlio bvia em (B). (De acordo com Montgomery e McFall-Ngai, 1995; fotografias cortesia de M. McFall-Ngai.)
810
Figura 21.3
Simbiontes microbianos so necessrios para a formao do intestino da cigarrinha Euscelis incisus. (A) Embrio controle com simbiontes tem formao normal do intestino. (B) Embrio anormal com formao deficiente do intestino quando antibiticos eliminaram a maioria das bactrias do ovo. (De acordo com Schwemmler, 1974; fotografias cortesia de W. Schwemmler.)
Trax Cabea Abdmen
0.1 mm (A) Cabea Trax Abdmen
0.1 mm (B)
impossvel completar a embriognese sem ela. De fato, considera-se que os simbiontes bacterianos so essenciais para a formao do intestino embrionrio. Se as bactrias so removidas cirurgicamente ou metabolicamente (alimentando as larvas ou os adultos com antibiticos), elas podem ser eliminadas dos ovos em desenvolvimento. Esses ocitos livres de simbiontes se desenvolvem em embries que no tm o abdmen (Figura 21.3; Sander, 1968; Schwemmler, 1974, 1989). O endossimbionte pode estar secretando um fator que penetra no citoplasma do ovo. Existe at uma simbiose desenvolvimental no intestino de mamferos. As bactrias colonizam o intestino desde o momento do nascimento, e a sucesso ecolgica no intestino humano progride atravs de uma srie de colonizaes envolvendo cerca de 400 espcies bacterianas. As clulas epiteliais do intestino de camundongos mantidos livres de germens, no sintetizam certos mRNAs que codificam determinadas enzimas de glicosilao (Bry et al., 1996). Entretanto, se uma determinada cepa de bactrias comea a colonizar seus intestinos, esses micrbios induzem o mRNA a se tornar expresso. [env1.html]
Diferenas ambientais previsveis como sugestes para o desenvolvimento

olvox Volvo sex Sazonalidade e sexo: Afdios e Volvox Como j mencionado, vrias espcies de afdios partenogenticos tm um fascinante estilo de vida onde os ovos eclodidos do origem vrias geraes de fmeas reproduzindo-se assexualmente. Entretanto, durante o outono produzido um determinado tipo de fmea, cujos ovos podem dar origem a machos e fmeas sexuadas. Essas formas sexuadas se acasalam, e o ovo que se forma est apto a sobreviver o inverno. Quando esse eclode, uma nova gerao de fmeas assexuadas produzida. Um dos grandes mistrios desse tipo de partenognese foi resolvido em 1909 por
CAPTULO 21
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Nmero de cromossomos Ovo com 12 cromossomos Ovo Ovo Me precursora partenognico hibernal assexuada Fema capaz de produzir gerao sexuada
Oognese completa Fmea sexuada Espermatognese completa Ovo com 10 cromossomos Macho sexuado Ovo haplide
Cruzamento Fertilizao
Degenerao
Figura 21.4
Mudanas cromossmicas durante o ciclo vital do afdio da famlia Phylloxeridal. O clima do outono induz a produo de machos e fmeas, que se cruzam para produzir o ovo hibernal.
Thomas Hunt Morgan (antes dele comear a trabalhar com a mosca da fruta). Morgan analisou os cromossomos do afdio da nogueira (hickory) durante vrias geraes (Figura 21.4). Ele encontrou que o nmero diplide das fmeas de afdios 12. Durante a oognese, somente um corpo polar expelido do vulo em desenvolvimento, de modo que o nmero diplide de 12 retido. Esse ovo desenvolve-se partenogeneticamente sem ser fertilizado. Nas fmeas que podem dar origem a ovos que se tornam macho ou fmea, ocorre uma modificao dessa oognese. Nos ovos produtores de fmeas, seis pares de cromossomos penetram no nico corpo polar. Portanto, o nmero diplide de 12 retido. Nos ovos produtores de machos, entretanto, um par extra de cromossomos entra no corpo polar. O nmero diplide do macho 10. Esses machos e fmeas so sexuados e tm divises meiticas completas. A fmea produz ocitos com um conjunto haplide de 6 cromossomos. Os machos, entretanto, dividem os seus 10 cromossomos para produzir uma parte do espermatozide com o nmero haplide de 4 cromossomos e a outra parte com o nmero haplide de 6 cromossomos. O espermatozide com 4 cromossomos se degenera. O espermatozide com 6 cromossomos fertiliza o ovo com esses para restaurar o nmero diplide de cromossomos a 12. Quando o ovo eclode, aps o inverno, uma fmea. Isso resolveu uma charada. A outra, de como o clima do outono regula se a fmea sexuada ou partenognica ou se o organismo alado ou ptero permanece sem soluo. Da mesma maneira, no sabemos o que regula o ocito diplide a produzir ovos dando machos ou fmeas. Alm disso, fatores ambientais so usados de maneiras diferentes pelas vrias espcies. A Figura 21.5 mostra um tipo de ciclo vital encontrado em afdios. Nos afdios da nogueira e na Megoura viciae, existe uma alternncia de geraes sexuadas e assexuadas. Em Megoura, a temperatura determina o sexo precocemente no desenvolvimento (temperaturas extremas favorecendo a produo de fmeas). No desenvolvimento da fmea, o fotoperodo e a temperatura determinam se a fmea se reproduzir sexualmente ou partenogeneticamente, e uma combinao de temperatura e densidade populacional determinar se a fmea alada ou sem asas (Beck, 1980). possvel que o hormnio juvenil controle a troca partenogentica/sexual (adio de hormnio juvenil a adultos produzindo descendentes sexuados os leva a ter descendentes partenogenticos) e inibe a formao de asas (Hardie, 1981; Hardie e Lees, 1985). Mas no se sabe como as mudanas ambientais se transformam em ttulos de hormnio juvenil ou como o clima de outono ou a luz solar causam o movimento diferencial dos cromossomos para o corpo polar.
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Figura 21.5
(A) Primavera Vero
Efeitos ambientais no ciclo vital do afdio Megoura viciae. (A) Alternncia de geraes sexuadas e assexuadas, onde a gerao sexuada produzida no outono. (B) Alternativas de desenvolvimento fornecidas por fatores ambientais no ciclo vital de Megoura. (A de acordo com Nijhout, 1994; B de acordo com Beck, 1980.)
Fmea assexuada alada Ovo hibernal Macho
Fmea assexuada sem asas
Inverno
Outono
Fmea sexual (B) Aglomerao, baixa temperatura Isolamento, alta temperatura
Fmeas assexuadas aladas
Dia longo, alta temperatura Temperatura alta ou baixa Dia curto, temperatura mdia
Fmeas assexuadas sem asas Fmea sexuada
Temperatura mdia Macho
No Captulo 1, discutimos o ciclo vital do volvox e sua dependncia da temperatura. Aqui, tambm, a temperatura responsvel pela troca das formas assexuadas do organismo pelas formas sexuadas. A fmea reproduzindo-se assexualmente d origem a descendentes que produzem espermatozides ou vulos. O resultado dessa fertilizao o zigoto cuja camada externa pode proteg-lo da dessecao e do frio ao secar a lagoa e chegada do inverno. Diapausa Muitas espcies de insetos desenvolveram uma estratgia chamada diapausa. Diapausa a suspenso do desenvolvimento que pode ocorrer no estgio embrionrio, larval, pupal ou adulto, dependendo das espcies. Em algumas espcies, a diapausa facultativa e ocorre somente quando induzida por condies ambientais; em outras espcies, a diapausa se tornou uma parte obrigatria do ciclo vital. Essa ltima freqentemente encontrada em insetos da zona temperada, onde a diapausa induzida por mudanas no fotoperodo (a durao relativa dos dias e das noites). O comprimento do dia onde 50% da populao entrou em diapausa chamado de comprimento crtico do dia, e geralmente bastante repentino (Figura 21.6). Insetos entrando na diapausa quando o comprimento do dia cai abaixo desse limite so chamados de insetos de dia longo. Os insetos que se desenvolvem normalmente quando existem somente algumas horas de luz solar e que entram em diapausa quando expostos a dias mais longos so chamados de insetos de dia curto. O comprimento crtico do dia uma propriedade geneticamente determinada (Danilevskii, 1965; Tauber et al., 1986).
CAPTULO 21
813
A diapausa no uma resposta fisiolgica desencadeada por condies drsticas. Sem dvida, ela induzida por estmulos sinalizadores que so um pressgio de mudana no ambiente, antes que as condies adversas realmente se instalem. A diapausa especialmente importante para os insetos da zona temperada, permitindolhes sobreviver o inverno. Embries do bicho-da-seda Bombyx mori passam o inverno como embries, entrando na diapausa pouco antes da segmentao. A mariposa cigana Lymantia dispar inicia sua diapausa como uma larva completamente formada, pronta a eclodir assim que a diapausa termine. Outros insetos experimentam a diapausa como ovos, pupas ou mesmo como adultos. No bicho-da-seda Bombyx, a diapausa embrionria parece ser regulada pelo hormnio da diapausa, um peptdeo de 24 aminocidos que produzido no gnglio subesofagiano (Fukuda, 1952; Hasegawa, 1952). Esse hormnio age nos ocitos em maturao no estgio pupal e leva interrupo do desenvolvimento, uma vez que o embrio alcance 12.000 clulas (Kitazawa et al., 1963). A diapausa larval, entretanto, parece ser controlada pela inibio de produo do PTTH (veja Captulo 19). Isso impede que a larva sofra uma muda e se transforme em pupa. Em muitas borboletas, a inibio de PTTH devida a um ttulo elevado contnuo do hormnio juvenil. Analogamente, a falta de secreo de PTTH e ecdisona uma vez ocorrida a pupao, originar a diapausa nessa etapa do desenvolvimento. Pupas em diapausa podem ser reativadas pela adio de 20-hidroxiecdisona. Entretanto, em condies normais, o crebro de uma pupa em diapausa (tal como a mariposa Hyalophora) ativado pela exposio ao clima frio durante certo tempo. Pupas de mariposas conservadas em condies aquecidas permanecero em diapausa at a morte (veja Nijhout, 1994). Os mecanismos pelo quais essas modificaes na temperatura e no comprimento do dia regulam a produo hormonal devem ainda ser elucidados. [env2.html]
porcentagem de indivduos entrando na diapausa
Laspeyresia molesta Pieris brassicae Acronycta rumicis Leptinotarsa decemlineata
Comprimento do dia (horas)
Figura 21.6
A resposta fotoperidica de insetos de dia longo, que so induzidos a entrar em diapausa quando as horas de luz natural caem abaixo de certo nvel. Cada uma das quatro espcies aqui mostradas, (Laspeyresia molesta, Pieris brassicae, Acronycta rumicis e Leptinotarsa decemlineata) deixam a diapausa com luz solar de 14-17 horas. (De acordo com Danilevskii, 1965.)
Plasticidade fenotpica: Polifenismo e regras de reao

A habilidade de um indivduo em expressar um fentipo sob um conjunto de circunstncias e outro fentipo sob outro conjunto de condies ambientais chamada plasticidade fenotpica. Existem dois tipos principais de plasticidade fenotpica: polifenismo e regras de reao. Polifenismo se refere a fentipos descontnuos (um ou outro) elicitados pelo ambiente. Gafanhotos migratrios, por exemplo, existem em duas formas mutuamente exclusivas: a fase solitria de asas curtas e colorao uniforme e a fase gregria de asas longas e cores brilhantes. O ambiente (principalmente a densidade populacional) determina qual morfologia assumir o jovem gafanhoto (veja Pener, 1991). Analogamente, as ninfas de gafanhotos de plantas podem se desenvolver de duas maneiras, dependendo do seu ambiente. Alta densidade populacional e certas comunidades de plantas levam a produo de insetos migratrios, onde o terceiro segmento torcico produz uma grande asa posterior. Densidade populacional baixa e outras plantas alimentcias levam ao desenvolvimento de sugadores de plantas, no voadores, onde o terceiro segmento torcico se desenvolve em uma asa vestigial semelhante a um haltere (Figura 21.7; Raatikainen, 1967; Denno et al., 1985). A mudana sazonal da colorao do plo de animais rticos um outro exemplo de polifenismo.* Em certos casos, o genoma codifica uma variedade potencial de fentipos, e o ambiente seleciona aquele fentipo que usualmente o mais adaptativo. Por exemplo, o trabalho intenso e constante pode fazer com que os msculos aumentem de tamanho; mas existe um limite geneticamente definido que determina o quanto a
* Apesar do polifenismo sazonal ser geralmente considerado como adaptativo, existem certas ocasies que no h aumento da aptido do organismo. Por exemplo, o fotoperodo pode fazer com que o plo da lebre mude de marrom para branco, mas se no houver neve, a lebre ficara conspcua em um segundo plano escuro.
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Figura 21.7
Forma estacionria
Forma migratria
Diagrama composto mostrando as formas de asa curta (esquerda) e de asa longa (direita) do gafanhoto de plantas Prokelisia marginata. A forma de asa longa um excelente voador; a forma de asa curta no voadora. (De acordo com Denno et al., 1985.)
hipertrofia possvel. Analogamente, o micro-habitat de uma salamandra jovem pode causar sua mudana de cor (novamente, dentro de limites geneticamente definidos). Essa variao contnua de fentipos expressos por um nico gentipo atravs de uma srie de condies ambientais chamada de regra de reao (Woltereck, 1909; Schmalhausen, 1949; Stearns et al., 1991). A regra de reao , portanto, uma propriedade do genoma e pode tambm ser selecionada. de se esperar que diferentes gentipos sejam diferentes na direo e quantidade de plasticidade que sero capazes de expressar (Gotthard e Nylin, 1995; Via et al., 1995). A extenso pela qual regras de reao podem ser herdadas fornece a base para a evoluo da plasticidade fenotpica. Polifenismo sazonal em borboletas Um exemplo dramtico de polifenismo ocorre na mariposa Nemoria arizonaria. Essa mariposa tem um ciclo vital bastante tpico. Os ovos eclodem na primavera, e as lagartas se alimentam das flores jovens do carvalho (amentos). Essas larvas sofrem metamorfose no final da primavera, se acasalam no vero, e produzem outra prole de lagartas nos carvalhos. Essas lagartas comem as folhas do carvalho, sofrem metamorfose e se acasalam. Seus ovos hibernam para novamente comear o ciclo na prxima primavera. O que surpreendente que as lagartas que eclodem na primavera em nada se parecem com seus descendentes que eclodem no vero (Prancha18). As lagartas que eclodem na primavera e se alimentam de amentos so castanhoamareladas, rugosas e pontilhadas parecendo um amento. Elas esto magnificamente camufladas contra predadores. E as lagartas que eclodem no vero, quando os amentos j no existem? Elas tambm esto bem camufladas parecendo ramos de carvalhos de um ano de idade. Como isso controlado? Fazendo experimentos de alimentao recproca, Greene (1989) conseguiu transformar as formas de primavera em formas de vero, alimentando-as com folhas de carvalho. O experimento recproco no transformou as formas de vero em lagartas semelhantes aos amentos. Parece, portanto, que a forma do amento o estado normal (default state) e alguma coisa induz a morfologia semelhante aos ramos do carvalho. Essa substncia provavelmente um tanino que concentrado nas folhas de carvalho durante sua maturao. Outro exemplo de polifenismo sazonal a borboleta do mapa Europeu, Araschnia levana, que tem dois fentipos to diferentes que foram classificados por Linnaeus como duas espcies diferentes (Weele, 1995). A forma da primavera cor de laranja brilhante com manchas pretas, enquanto a forma do vero quase toda preta com uma banda branca (Figura 21.8; Prancha 29). A mudana das formas da primavera para as do vero controlada tanto por mudanas no comprimento do dia como da temperatura durante o perodo larval. Esses fatores regulam a liberao de ecdisona, que inicia as ltimas mudas metamrficas (Shapiro, 1976; Koch e Buchmann, 1987). Quando pupas em diapausa so injetadas com 20-hidroxiecdisona de modo a recomear o desenvolvimento dentro de 3 dias aps a pupao, a forma que emerge a do vero. Se a injeo for feita 10 dias aps a pupao, so produzidas as formas da primavera.
CAPTULO 21
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Figura 21.8
Polifenismo sazonal na borboleta Araschnia laevana. (A) A forma do vero que emerge da pupa em no diapausa. (B) A forma alaranjada e marrom da primavera, que emerge da pupa em diapausa. (Veja Prancha 29 para fotografias coloridas.) (Fotografias cortesia de H. F. Nijhout.)
(A) (B)
Em quase toda a rea do Hemisfrio Norte, pode-se verificar o polifenismo nas borboletas Colias e Pieris (repolhos brancos e sulfurosas) entre aquelas que eclodem durante os longos dias do vero e aquelas que eclodem no fim da estao, nos dias curtos do outono. O pigmento da asa posterior nas formas de dia curto mais escuro do que nas borboletas de dia longo. Isso tem uma vantagem funcional durante os meses mais frios do outono; as borboletas mais escuras de dia curto usam seus pigmentos para se aquecer entre os vos. Os pigmentos mais escuros absorvem a luz mais eficientemente, aumentando a temperatura do corpo mais depressa do que os pigmentos mais claros (Shapiro, 1968; 1978; Watt, 1968, 1969; Hoffmann, 1973; veja Nijhout, 1991). [env3.html] Nas zonas tropicais do mundo, freqentemente existem estaes secas e chuvosas. Na frica, a borboleta do Malawi Bicyclus anynana tem um polifenismo que adaptivo s mudanas sazonais. A forma da estao fria e seca crtica, parecendo as folhas mortas de cor castanha do seu habitat. A forma da estao quente e chuvosa mais ativa, e ela tem manchas em forma de olhos (ocelos) nas asas posteriores ventrais que desviam ataques de aves predadoras e lagartos (Figura 21.9). O fator determinante parece ser a temperatura durante a pupao. Baixas temperaturas produzem a forma da estao seca; altas temperaturas, a forma da estao chuvosa (Brakefield e Reitsma, 1991). O desenvolvimento das manchas em forma de ocelos nas borboletas comea nos estgios larvais tardios, quando a transcrio do gene Distal-less est restrita a um pequeno foco que se tornar o centro de cada ocelo. Durante a fase precoce do estgio pupal, a expresso de Distal-less vista em uma rea maior, e considera-se que esse o sinal ativador que determina o tamanho da mancha. Finalmente, as clulas recebendo o sinal determinam a cor que elas tero. As formas sazonais de Bicyclus parecem divergir nos estgios mais adiantados da ativao de sinais e diferenciao de cor (Figura 21.10; Brakefield et al., 1996).
(A)
(B)
Figura 21.9
As duas formas sazonais da borboleta de Malawi, Bicyclus anynana. (A) A forma da estao seca que se mistura a restos de folhas mortas, secas e escuras. (B) Forma da estao chuvosa com visveis manchas em forma de ocelos das asas posteriores ventrais. A forma da estao chuvosa pode ser mimetizada pelo cultivo da larva em temperaturas mais altas (23oC); larvas cultivadas em temperaturas mais baixas (17oC, se aproximando das temperaturas na transio para a estao seca) se desenvolvem na forma da estao seca. (De acordo com Brakefield et al., 1996; fotografias cortesia de S. Carroll e P. Brakefield.)
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Figura 21.10
(A) Diviso da asa
(B) Expresso de Distal-less T alta
(C)
(D)
Estgios do desenvolvimento levando formao das manchas em forma de ocelos. (A) A expresso do gene Distal-less nas regies do disco imaginal da asa onde h potencial para a formao das manchas em forma de ocelos. (B) Focos de expresso de Distal-less so estabilizados em regies especficas da asa. (C) Na pupa, os focos de Distal-less se expandem. (D) As clulas vizinhas respondem ao sinal produzindo pigmentos especficos, dependendo de suas distncias do foco e de suas posies na asa. No Bicyclus, as duas formas so indistinguveis at o estgio de sinalizao (C). (De acordo com Brakefield et al., 1996.)
T baixa
Prepadronizao
Determinao Focal
Sinalizao
Diferenciao
Polifenismo nutricional Nem todo polifenismo controlado pelas estaes. Nas abelhas, o tamanho da larva fmea na muda pupal determina se o indivduo ser uma operria ou uma rainha. A larva que alimentada com gelia real, rica em nutrientes, retm a atividade da sua corpora allata durante o estgio do ltimo instar. O hormnio juvenil secretado por esses rgos atrasa a pupao, fazendo com que a abelha emergente seja maior e (em algumas espcies) mais especializada em sua anatomia (Figura 21.11A; Brian, 1974, 1980; Plowright e Pendrel, 1977). Os nveis de hormnio juvenil em larvas destinadas a se tornar rainha 25 vezes maior que o ttulo das destinadas a serem operrias, e a aplicao desse hormnio em larvas operrias pode transform-las em rainhas (Wirtz, 1973; Rachinsky e Hartfelder, 1990). Analogamente, colnias de formigas so predominantemente fmeas, e essas podem ser extremamente polimrficas (Figura 21.11A). Os dois tipos principais de fmeas so a operria e a gine. A gine uma rainha em potencial. Em espcies mais especializadas, tambm se observa uma operria maior, o soldado. Na Pheidole bicarinata, essas castas so determinadas pelos nveis de hormnio juvenil nas larvas em desenvolvimento. Larvas recebendo alimento rico em protenas tm um ttulo elevado de hormnio juvenil que causa uma abrupta mudana no desenvolvimento
(A) (B) Nascimento (C) Nascimento Operrios secundrios Operrios principais (soldados)
Gines
Operrias
Gines
Figura 21.11
(A) Fotografia do notvel dimorfismo da formiga operria (esquerda) e a rainha (direita) na espcie Pheidologeton diversus. As duas so irms, mas uma foi alimentada de tal maneira que sua larva continua a crescer e finalmente se metamorfoseia em uma rainha frtil. (B,C) Formao da gine (rainha) e da operria nas formigas. reas levemente coloridas representam bipotencialidade para se tornarem operrias ou gines. O N no crculo representa uma troca nutricional controlada pelo ambiente da larva. (B) Myrmica rubra, onde somente as larvas que hibernam (OW) permanecem bipotenciais. No ltimo instar, a troca nutricional determina a casta. (C) Pheidole pallidula, onde a rainha controla a determinao das gines, atravs dos hormnios que agem durante a embriognese. (Fotografia com copirraite, cortesia de Mark W. Moffett na National Geographic Society; B e C de acordo com Wheeler, 1986.)
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que reprograma o tamanho no qual as larvas iniciaro a metamorfose. Isso causa uma grande e descontnua diferena de tamanho entre as castas de soldados e operrias, com a cabea e as mandbulas crescendo mais rapidamente do que o resto do corpo. Essa reprogramao tambm envolve mudanas na atividade gnica, pois as protenas cuticulares das operrias e dos soldados so diferentes (Passera, 1985; Wheeler, 1991). Em espcies diferentes, a determinao de casta pode ser ambiental, hormonal ou a combinao de ambos. Os padres do desenvolvimento na determinao de castas foram analisados por Diana Wheeler (1986, 1991) e esto resumidos na Figura 21.11B,C. Na maioria das espcies, larvas de formigas so bipotenciais at perto da pupao. Na Myrmica rubra, somente larvas que hibernam permanecem bipotenciais. Aps o inverno, a rainha estimula os operrios a subalimentar as larvas do ltimo instar. Isso significa que enquanto houver uma rainha, no podero resultar outras. Se as larvas so alimentadas, elas podem se tornar gines. Portanto, as larvas permanecem bipotenciais at bem tarde no seu ltimo instar. Em outras espcies como a Pheidole pallidula, a rainha controla a formao de gines atravs de substncias qumicas que agem durante a embriognese, de modo a no se formarem novas rainhas. Entretanto, as operrias permanecem bipotenciais e podem se tornar majoritrias ou minoritrias, dependendo da nutrio. sexual Determinao sexual dependente do ambiente Existem muitas espcies onde o ambiente determina se o indivduo ser macho ou fmea. A determinao sexual em peixes e rpteis, dependente da temperatura, representa o caso melhor estudado. A Figura 21.12 demonstra os principais padres de determinao sexual dependente da temperatura em rpteis. Esse tipo de determinao sexual ambiental tem vantagens e desvantagens. Uma das vantagens que d s espcies o benefcio da reproduo sexual sem limit-las a uma relao de sexos 1:1. Nos crocodilos, onde extremos de temperatura produzem fmeas e temperaturas moderadas produzem machos, a relao de sexos pode ser de at 10 fmeas para um macho (Woodward e Murray, 1993). A maior desvantagem na determinao sexual dependente da temperatura pode estar no estreitamento dos limites de temperatura dentro dos quais uma espcie pode existir. Isso significaria que poluio trmica (ou localmente ou por aquecimento global) pode realmente eliminar uma espcie em uma determinada rea (Janzen e Paukstis, 1991). Ferguson e Joanen (1982) especularam que os dinossauros podem ter tido uma determinao sexual dependente da temperatura e que seu sbito desaparecimento pode ter sido causado por uma pequena mudana da temperatura criando condies onde somente machos ou fmeas eclodiam de seus ovos. Charnov e Bull (1977) argumentaram que a determinao sexual ambiental seria adaptativa em certos habitats caracterizados por retalhamento, havendo certas regies onde mais vantajoso ser macho e outras onde mais vantajoso ser fmea. Conover e Heins (1987) forneceram evidncia que em certos peixes, as fmeas se
Figura 21.12
Padres da determinao sexual dependente da temperatura. Nos primeiros trs painis, diferentes temperaturas do a predominncia de machos ou fmeas. No ltimo painel, a temperatura no tem efeito. De acordo com Bull, 1980.)
Alguns lagartos, cobras e tartarugas
Lagartos, crocodilos
Porcentagem de fmeas
Muitas tartarugas
Tartarugas mordedoras (e outras), crocodilos
Temperatura (oC)
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Figura 21.13
Razo sexual: F/(F+M)
Relacionamento entre temperatura e razo sexual F:(F+M) durante o perodo da determinao sexual em Menidia menidia. Nos peixes coletados na poro mais norte da rea (Nova Scotia), a temperatura teve pouco efeito na determinao sexual. Quando foram coletados embries de peixes em locais mais ao sul (especialmente da Virginia para a South Carolina), o ambiente teve um grande efeito. (De acordo com Conover e Heins, 1987.)
Norte Nova Scotia Prince Edward Island New York Virginia North Carolina South Carolina Sul
beneficiam por serem maiores, pois tamanho se traduz em maior fecundidade. uma vantagem nascer cedo na poca da reproduo para uma fmea Menidia, que teria um perodo mais longo de alimentao e um tamanho maior. Nos machos, o tamanho no tem importncia. Conover e Heins mostraram que na parte sul da rea da Menidia, as fmeas realmente nascem cedo na estao de reproduo. A temperatura parece ter um papel importante. Entretanto, na parte norte de sua regio, a mesma espcie no mostra determinao sexual ambiental. Na verdade, uma relao 1:1 gerada em todas as temperaturas (Figura 21.13). Os autores especulam que as populaes mais ao norte tm uma estao de alimentao muito curta, de modo que no h vantagem para uma fmea nascer antes. Portanto, essa espcie de peixes tem uma determinao sexual ambiental nas regies onde adaptiva e uma determinao sexual genotpica nas regies onde no adaptiva. Aqui, novamente, observa-se que o ambiente pode induzir um fentipo sexual, ou o fentipo sexual pode ser uma propriedade do genoma, como o caso na maioria dos mamferos.
Fatores ambientais imprevisveis controlando o desenvolvimento animal

A maioria dos estudos de adaptao se preocupa com o papel assumido pelas estruturas adultas, permitindo que o indivduo sobreviva em ambientes precrios e hostis. Entretanto, o embrio tambm deve sobreviver no seu habitat, e ele tem que faz-lo antes que essas adaptaes adultas sejam feitas. Como j mencionado, a colorao protetora da larva um dos exemplos, e a habilidade da larva em ingerir alimentos txicos para seus predadores outro exemplo. Essas duas estratgias so exemplificadas pelas lagartas das borboletas viceroy e monarca, respectivamente (veja pgina 733). A temperatura no o nico fator ambiental que pode efetuar a determinao sexual no peixe. O sexo do peixe limpador (wrasse) de cabea azul, um peixe Panamenho, depende da populao que ele encontra. Se o embrio atinge um recife onde um macho vive com muitas fmeas, o peixe limpador cresce e se acasala como fmea. Quando o macho morre, uma das fmeas (usualmente a maior) se torna
CAPTULO 21
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macho. Dentro de um dia, seus ovrios regridem e seus testculos crescem. Se o mesmo embrio tivesse chegado a um recife que no tivesse machos ou a um territrio no defendido por um macho, o embrio se desenvolveria como um peixe limpador macho (Warner, 1993). Defesas induzveis contra a predao Alguns embries so protegidos das condies ambientais por materiais secretados dentro do ovo ou ao seu redor. Em outros casos, o ambiente induz uma via especfica de desenvolvimento em lugar da via normal. Na lagarta Nemoria, a dieta altera o fentipo e protege o indivduo da predao. Alguns animais levaram isso um passo a frente: O desenvolvimento de um jovem modificado por substncias liberadas pelo prprio predador, permitindo aos jovens escapar desses mesmos predadores. Isso algumas vezes chamado de defesa induzida pelo predador (ou polifenismo induzido pelo predador). Para demonstrar defesa induzida pelo predador, deve-se demonstrar que a mudana fenotpica causada pelo predador (geralmente por substncias solveis liberadas pelo predador) e que a modificao fenotpica aumenta a aptido de seus portadores quando o predador est presente (Adler e Harvell, 1990).* Por exemplo, vrias espcies de Daphnia e rotferos alteraro sua morfologia quando desenvolvidos em guas onde seus predadores foram cultivados (Figura 21.14; Dodson, 1989; Adler e Harvell, 1990). O rotfero predatrio Asplanchna libera na gua um composto solvel que induz os ovos de uma espcie de presa, Keratella slacki, a se desenvolver em indivduos com um corpo ligeiramente maior, mas com espinhas anteriores 130% mais longas do que seria o normal. Essas modificaes as torna mais difceis de serem devoradas. O caracol Thais lamellosa desenvolve uma concha mais grossa e um dente na sua abertura quando exposto ao efluente das espcies de caranguejo que so seus predadores. Em uma populao mista, os caranguejos no atacam os caracis mais espessos at que mais de 50% dos normais tenham sido devorados (Palmer, 1985). Polifenismo envolvendo predadores no se limita aos invertebrados. McCollum e Van Buskirk (1996) mostraram que na presena de seus predadores, a nadadeira da cauda da r de rvore Hyla chrysoscelis cresce mais e se torna vermelho brilhante.
*O fenmeno da ciclomorfose, no qual h uma variao cclica da morfologia em certas espcies de Daphnia (Woltereck, 1909), no foi correlacionado com um predador especfico. O fenmeno pode ser devido a outros fatores (Dodson, 1989).
Figura 21.14
Polifenismo induzido por predadores. Formas tpicas (linha superior) e induzidas por predadores (linha inferior) em vrios organismos. Os nmeros abaixo de cada coluna representam a porcentagem de organismos sobrevivendo predao, quando indivduos induzidos e no induzidos foram submetidos a predadores (em vrios ensaios). (Dados de Adler e Harvell, 1980 e referncias neles citados.)
Forma tpica
Abertura grossa com dente Forma induzida por predador Cladocera (Daphnia) Rotfero (Keratella) Cirrpede (Chthalamus) Bryozoa (Membranipora) Molusco (Thais) Sem predao at que 50% das formas tpicas sejam devoradas
Inflado e com corcova
Carpa (Carassius)
Sobrevivncia (tpica/induzida)
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Isso permite que o girino se afaste nadando rapidamente e desvie golpes na regio da cauda. A carpa Carassius carassius reponde presena do lcio (pike) predatrio somente se esse j se alimentou com peixe. A carpa cresce adquirindo uma forma entumecida e com uma corcova que no mais se ajusta s mandbulas do lcio. Como na maioria das defesas induzidas pelo predador, existe uma contrapartida (ou ento seria de se esperar que a forma induzida se tornasse o fentipo normal). Nesse caso, a morfologia induzida produz um retardamento nas condies de natao, e o peixe mais gordo no pode nadar to eficientemente (Brnmark e Pettersson, 1994). A Figura 21.14 mostra as formas tpicas e as induzidas pelo predador para vrias espcies. Em cada caso, filtrados solveis da gua envolvendo o predador so capazes de induzir essas modificaes. Como mostra a Figura 21.14, a forma induzida mais susceptvel a sobreviver ao seu predador. [env4.html] Plasticidade fenotpica e mudanas no ambiente O sapo p de espada (spadefoot toad), Scaphiopus couchii, tem um ciclo de vida extraordinrio. Os sapos terminam a hibernao com o barulho do trovo que acompanha as primeiras tempestades da primavera no deserto de Sonoran. (Infelizmente, motocicletas produzem o mesmo som, fazendo com que esses sapos saiam da hibernao e morram no escaldante sol do Arizona.) Os sapos se reproduzem nas lagoas temporrias formadas pelas chuvas, e os embries se desenvolvem rapidamente em larvas. Aps a metamorfose das larvas, os novos sapos retornam ao deserto, se afundando na areia at que as tempestades do ano seguinte os tragam para fora. As lagoas do deserto so poas efmeras e tanto podem secar rapidamente como persistir por algum tempo, dependendo da profundidade inicial e a freqncia das chuvas. Poderia se considerar que existem somente dois cenrios alternativos confrontando o embrio do sapo: ou (1) a lagoa persiste at que ele sofra a metamorfose e ele vive, ou (2) a lagoa seca antes da metamorfose e ele morre. Esses sapos (e numerosos outros anfbios), entretanto, desenvolveram uma terceira alternativa. A poca da metamorfose controlada pela lagoa. Se essa no seca, o desenvolvimento continua em uma velocidade normal, e os girinos se alimentando de algas finalmente se transformam em sapos p de espada juvenis. Entretanto, se a lagoa est secando, se cria uma superpopulao e alguns dos girinos embarcam em uma via alternativa de desenvolvimento. Eles desenvolvem uma boca mais larga e necessitam de msculos mais fortes nas mandbulas que os permita comer, entre outras coisas, outros girinos de Scaphiopus. Esses girinos carnvoros sofrem uma rpida metamorfose, ainda que em uma verso menor do sapo p de espada juvenil. Mas eles sobrevivem, enquanto que os outros girinos Scaphiopus morrem ou por dessecao ou ingeridos por seus companheiros de lagoa (Figura 21.15; Newman, 1989, 1992).
Grupo de msculo hiideos da mandbula
Grupo de msculo hiideos da mandbula
Figura 21.15
Polifenismo nos girinos do sapo p de espada, Scaphiopus couchii. A forma tpica a onvora, usualmente se alimentando de insetos e algas. Quando as lagoas esto secando formada a forma carnvora (canibalstica). A boca mais larga, os msculos das mandbulas so maiores, e o intestino modificado para uma dieta carnvora. (Fotografia e desenho cortesia de R. Ruibel.)
Msculo interhiideo Alas intestinais CARNVORO (outros girinos) Superfcie ventral
Musculo interhiideo Alas intestinais
ONVORO (camaro do mar, algas) Superfcie ventral
CAPTULO 21
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Essa plasticidade fenotpica vista tambm em larvas de equinodermos. Quando o alimento est escasso, os membros ciliados da larva pluteus crescem mais longos e aumenta a habilidade da larva em obter alimento. Mas isso feito com um custo para o rudimento do adulto que cresce dentro da larva, e leva mais tempo para essas plutei de membros longos (mesmo que elas possam adquirir alimento) sofrerem metamorfose (Hart e Strathmann, 1994). A plasticidade fenotpica d ao indivduo a habilidade para responder s diferentes condies ambientais. Diferentes fentipos se adaptam melhor em diferentes ambientes. No sapo p de espada, a forma de rpido desenvolvimento mais adequada para lagoas que secam rapidamente, mas os sapos de desenvolvimento lento (os quais se desenvolvem em sapos maiores, e mais robustos) so mais adequados para condies com mais gua. Existe um custo nessa plasticidade fenotpica, mas assegurado que sempre alguns animais sobrevivero em cada condio.
&
Especulaes
Assimilao Gentica
a discusso sobre a relao custo/ benefcio entre formas induzidas e no induzidas, foi mencionado que se a forma induzida no tivesse um custo significativo, seria de se esperar que essa se tornasse a forma predominante da espcie. Isso foi previsto independentemente por C. H. Waddington e I. I. Schmalhausen para explicar como algumas espcies podiam evoluir rapidamente em determinadas direes (veja Gilbert, 1994). Ambos estavam impressionados com os calos encontrados nos ps de avestruzes. Na maioria dos mamferos, a pele capaz de formar calos nas reas que se desgastam em contacto com o solo ou outra superfcie.* Aqui, as clulas da pele respondem frico proliferando-se. Apesar dos exemplos de calos induzidos pelo ambiente serem muito difundidos, o avestruz nasce com calos onde tocar o solo (Figura 21.16). Waddington e Schmalhausen propuseram que as clulas da pele j so competentes para serem induzidas pela frico, elas poderiam ser induzidas por outras coisas tambm. Com a evoluo dos avestruzes, uma mutao permitiu que as clulas da pele respondessem a uma substncia dentro do embrio. Waddington (1942) escreveu:
* E at este sculo, escritores eram reconhecidos pelos calos em seus dedos. (Portanto, da observao dos seus dedos, Sherlock Holmes corretamente deduziu que o homem ruivo havia sido contratado como um escriba.)
Presumivelmente sua pele, como a de outros animais, reagiria diretamente presso externa e frico tornando-se mais espessa... Essa capacidade para reagir deve ser dependente de genes... No deve ser difcil que ocorra uma mutao gnica que modificar alguma outra rea no embrio, de tal maneira que ela passa a assumir a funo da presso externa, interagindo com a pele, de modo a puxar o gatilho e desencadear o desenvolvimento de calosidades. Por essa transferncia de induo, de um indutor externo para um interno, um carter induzido pelo ambiente se tornou parte do genoma do organismo e pode ser selecionado. Waddington chamou esse fenmeno de assimilao gentica enquanto Schmalhausen (1949) chamou-o de seleo estabilizada. Ambos os cientistas usaram a embriologia e a gentica ortodoxas para explicar exemplos que haviam sido considerados casos Lamarckianos de herana de caractersticas adquiridas. A transferncia de estmulos ambientais para estmulos genticos pode ser vista na determinao sexual em Menidia e na determinao de casta em formigas. Analogamente, a plasticidade de desenvolvimento preexistindo nas larvas alimentares nos equinodermos pode ter sido a ponte na transio da larva pluteus (alimentar) para a larva que no tem os membros ciliados. A troca na distribuio de recursos entre as es-
Figura 21.16
Lado ventral de um avestruz; a flecha marca os calos. (de Waddington, 1942.)
truturas larval e juvenil paralela quela vista onde as reservas de alimento so estocadas no ovo. Portanto, as trocas j presentes como adaptaes s fontes externas de recursos alimentares poderiam ter se tornado geneticamente fixas naquelas espcies cujas larvas no precisam procurar seu alimento (Strathmann et al., 1992).
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Se a assimilao gentica indica a fixao de um dos fentipos adaptivamente expressos, ento as borboletas seriam uma boa fonte onde encontrar mais exemplos. Brakefield e colegas (1996) mostraram que podiam fixar geneticamente as diferentes formas do polifenismo adaptivo de Bicyclus, e Shapiro (1976) mostrou que o fentipo
adaptivo ao dia curto (clima frio) de vrias borboletas o mesmo que o nico fentipo, geneticamente produzido, de espcies relacionadas ou subespcies vivendo em altas altitudes ou latitudes. Pode-se tambm produzir o fentipo de clima frio incubando no refrigerador as larvas ou pupas das borboletas da estao quente. [env5.html]
A assimilao gentica pode ter um papel importante fornecendo um vis para mudanas evolucionrias. Se um organismo herda uma norma de reao, as vias de desenvolvimento levando a um fentipo particular j esto colocadas, e tudo o que a evoluo deve fazer suprir um iniciador constante dessas vias.
A contnua plasticidade do desenvolvimento

A habilidade de um organismo em monitorar e responder mudana ambiental crtica para a sobrevivncia em habitats complexos. Nossos dois principais sistemas sensoriais, os sistemas nervoso e imune, nos permite regular desenvolvimentalmente nosso corpo em resposta aos estmulos ambientais. O sistema imune: Desenvolvimento no adulto Se o polifenismo induzido por predadores uma resposta adaptativa s ameaas potenciais, o sistema imune dos mamferos seu maior feito. O sistema imune dos mamferos um mecanismo incrivelmente elaborado para detectar e destruir materiais estranhos ao corpo. Quando somos expostos a uma molcula estranha (chamada antgeno), ns produzimos anticorpos e os secretamos no soro sangneo (veja Captulos 10 e 17 para detalhes). Os anticorpos combinam com os antgenos inativando-os ou eliminando-os. A base da resposta imune resumida na hiptese da seleo clonal (Burnett, 1959). Ela contm cinco postulados principais: 1. Cada linfcito B (clula B) pode produzir um e somente um tipo de anticorpo. Ou seja, uma clula B pode estar produzindo um anticorpo que se liga ao poliovrus, enquanto uma clula vizinha pode estar produzindo um anticorpo que se liga toxina diftrica. 2. Cada clula B colocar o anticorpo que produz na sua membrana celular com o lado portador da especificidade voltado para fora. 3. Os antgenos so apresentados s clulas B (geralmente na superfcie dos macrfagos). 4. Somente aquelas clulas B que se ligam ao antgeno podem completar seu desenvolvimento em clulas plasmticas secretoras de anticorpo. As clulas B dividem-se repetidamente, produzem um extenso retculo endoplasmtico rugoso, e sintetizam enormes quantidades de molculas de anticorpos. Esses anticorpos so secretados no sangue. 5. A especificidade do anticorpo exatamente a mesma daquela na superfcie celular das clulas B. O tipo de molcula de anticorpo na superfcie celular da clula B determinado por acaso. De dez milhes de tipos de anticorpos proticos que a clula pode sintetizar, cada clula B produz somente um tipo. Essas clulas B so continuamente criadas e destrudas. Entretanto, quando um antgeno se liga a um conjunto de clulas B, essas clulas so estimuladas a se dividir e se diferenciar em clulas plasmticas (que secretam o anticorpo) e clulas de memria (que populam os ndulos linfticos e respondem rapidamente quando expostas mais tarde ao mesmo antgeno) (Figura 21.17). Portanto, a constelao de clulas plasmticas e de memria de cada pessoa difere dependendo de quais antgenos ela encontrou. Gmeos idnticos tm diferentes populaes de descendentes de clulas B em seus baos e ndulos linfticos.
CAPTULO 21
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Clula B Ncleo Citoplasma
Linfcito em repouso
Anticorpo na superfcie celular reconhecendo o antgeno A
Anticorpo na superfcie celular reconhecendo o antgeno B
Dia 1
Antgeno A Clones de linfcito em repouso Sem diviso ou diferenciao dos linfcitos cujos anticorpos da superfcie celular no reconhecem o antgeno A
Ribossomos Dia 2 Molculas de anticorpo so sintetizadas no retculo endoplasmtico Dia 3 Proliferao Retculo endoplasmtico
Figura 21.17
Modelo de seleo clonal na formao de anticorpos. Cada clula B produz um tipo particular de protena de anticorpo (imunoglobulina) e a expe na sua superfcie celular. Quando um antgeno (estranho ao corpo) se liga s protenas do anticorpo na membrana da clula B, a clula B est apta a se dividir e se diferenciar em uma clula plasmtica secretora de anticorpos. A clula plasmtica secreta somente aquele tipo especfico de anticorpo que foi originalmente produzido pela clula B.
Dia 4 Diferenciao Clula plasmtica Anticorpo anti-A secretado Clula de memria
Dia 5 Anticorpo secretado
Aprendizado: Um sistema nervoso adaptvel ao ambiente No Captulo 8, discutimos como a atividade pode ser um fator crtico na deciso de quais sinapses neuroniais so retidas pelo organismo adulto. Aqui, estenderemos aquela discusso para realar aquelas situaes extraordinrias onde novas experincias modificam o conjunto original de conexes neuroniais, causando a criao de novos neurnios ou a formao de novas sinapses entre neurnios existentes. Como neurnios aps formados no se dividem, o seu aniversrio pode ser identificado tratando o organismo com timidina radioativa. Normalmente, muito pouca timidina radioativa incorporada no DNA de um neurnio que j se formou. Entretanto, se um novo neurnio se diferencia por diviso celular durante o tratamento, ele incorporar a timidina radioativa no seu DNA. A produo de tais novos neurnios pode ser observada em machos de aves canoras quando esses aprendem suas canes. Os tentilhes-zebra juvenis memorizam uma msica modelo e em seguida aprendem o padro de contraes musculares necessrias para cantar uma frase especfica. Nesse processo de aprendizado e repetio, so gerados novos neurnios no corpo hiperestriado do crebro do tentilho. Muitos desses novos neurnios enviam axnios ao arquistriado que responsvel pelo controle da musculatura vocal (Nordeen e Nordeen, 1988). Essas modificaes no so observadas em machos que so muito velhos para aprender a msica, e nem em fmeas juvenis (que no cantam essas frases); isso discutido mais completamente no Captulo 20.
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Os crtices cerebrais de ratos jovens criados em ambiente estimulante tm mais neurnios, sinapses e dendritos do que so encontrados em animais criados isolados (Turner e Greenough, 1983). Mesmo o crebro adulto est se desenvolvendo em resposta s novas experincias. Quando canrios adultos aprendem uma nova msica, eles geram novos neurnios cujos axnios se projetam de uma regio vocal do crebro a outra (Alvarez-Buylla et al., 1990). Analogamente, quando ratos adultos aprendem a se equilibrar sobre cilindros de madeira, seus neurnios das clulas de Purkinje do cerebelo desenvolvem novas sinapses (Black et al., 1990). Portanto, o sistema nervoso continua a se desenvolver na vida adulta, e o padro das conexes neuroniais o produto do padro herdado e do padro produzido pelas experincias. Essa interao entre o desenvolvimento inato e o experimental foi detalhada o mais dramaticamente em estudos da viso em mamferos.
MUDANAS EXPERIMENTAIS NAS VIAS VISUAIS INERENTES NOS MAMFEROS. Algumas das pesquisas mais interessantes sobre padronizao neuronial
em mamferos se concentram nos efeitos da privao sensorial no desenvolvimento do sistema visual em gatinhos e macacos. As vias pelas quais os impulsos eltricos passam da retina ao crebro nos mamferos esto ilustradas na Figura 21.18. Os axnios das clulas ganglionares da retina formam os dois nervos pticos, que se encontram no quiasma ptico. Como nos girinos de Xenopus, algumas fibras vo para o lado oposto (contralateral) do crebro, mas diferentemente da maioria dos outros vertebrados, as clulas retinianas dos mamferos tambm enviam sinais para o mesmo lado (ipsilateral) do crebro. Esses nervos terminam nos dois ncleos geniculados laterais. Aqui, a entrada de cada olho mantida separada, as camadas mais superiores e anteriores recebendo os axnios do olho contralateral, e o meio dos corpos recebendo a entrada do olho ipsilateral. A situao se torna mais complicada quando os neurnios do ncleo geniculado lateral se conectam com os neurnios do crtex visual. Mais de 80% das clulas neurais no crtex recebem entradas de ambos os olhos. O resultado viso binocular e percepo de profundidade. Outro conhecimento importante que a projeo retinocortical a mesma para os dois olhos. Se um neurnio cortical estimulado por luz reluzindo atravs de uma regio do olho esquerdo, 5o acima e 1o esquerda da fvea,* ele tambm ser estimulado por uma luz reluzindo atravs de uma regio do olho direito, 5o acima e 1o esquerda da fvea. Alm disso, a resposta evocada na clula cortical quando ambos os olhos so estimulados maior do que a resposta quando cada retina estimulada sozinha. Hubel, Wiesel e seus colaboradores (veja Hubel, 1967) demonstraram que o desenvolvimento do sistema nervoso depende at certo ponto da experincia do indivduo durante um perodo crtico do desenvolvimento. Em outras palavras, nem todo o desenvolvimento neuronial est codificado no genoma: uma parte aprendida. A experincia parece reforar ou estabilizar algumas conexes neuroniais que j esto presentes no nascimento e enfraquecer ou eliminar outras conexes. Essas concluses vm de estudos de privao sensorial parcial. Hubel e Wiesel (1962, 1963) fecharam com costura as plpebras direitas de gatos recmnascidos e as deixaram fechadas durante trs meses. Aps esse tempo, eles descosturaram as plpebras direitas. As clulas corticais desses gatos no puderam ser estimuladas por luz brilhante no olho direito. Quase todas as entradas no crtex visual vinham somente do olho esquerdo. O comportamento dos gatinhos revelava a ineficincia do olho direito: quando o olho esquerdo desses animais foi vedado, eles se tornaram funcionalmente cegos. Como os neurnios geniculados laterais pareciam ser estimulados pelos dois olhos, direito e esquerdo dos gatinhos, o defeito fisiolgico parecia ser entre os ncleos geniculados laterais e o crtex visual. Nos macacos
*A fvea uma depresso no centro da retina onde somente os cones esto presentes e os bastonetes e vasos sangneos esto ausentes. Aqui ela se torna um marco conveniente.
CAPTULO 21
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(A) Retina Nervo ptico
Olho direito
Olho esquerdo
Quiasma ptico
Ncleo geniculado lateral
Radiaes pticas Crtex visual
Vias visuais do olho direito (vista da superfcie ventral do crebro)
Vias visuais do olho esquerdo
Vias visuais combinadas, esquerda e direita
Figura 21.18
(B)
(C)
rhesus, onde fenmenos semelhantes so observados, o defeito foi relacionado falta de sntese de protenas nos neurnios geniculados laterais inervados pelo olho coberto (Kennedy et al., 1981). Seria tentador concluir que a cegueira resultante foi devida no formao de conexes visuais apropriadas, mas esse no o caso. Realmente, quando um gato nasce, axnios dos neurnios geniculados laterais recebendo entradas de cada olho se superpe extensivamente no crtex visual (Hubel e Wiesel, 1963). Entretanto, quando um olho coberto muito cedo na vida do filhote, suas conexes com o crtex visual so assumidas por aquelas do outro olho (Figura 21.19). Existe competio, e a experincia tem um papel na fortificao e estabilizao das conexes de cada ncleo geniculado lateral ao crtex visual. Portanto, quando ambos os olhos do gatinho so costurados durante 3 meses, a maioria das clulas corticais pode ser estimulada pela iluminao apropriada de um ou outro olho. O tempo crtico no desenvolvimento do gato para essa validao das conexes neuroniais comea entre a quarta e a sexta semana na vida do animal. A privao monocular at a quarta semana produz pouca ou nenhuma deficincia fisiolgica, mas aps 6 semanas ela produz todas as mudanas neuroniais caractersticas. Se um gatinho teve uma experincia visual durante os primeiros 3 meses, qualquer privao monocular posterior (mesmo por um ano ou mais) no tem efeito. As sinapses se estabilizaram.
Vias principais do sistema visual de mamferos. (A) Em mamferos, o nervo ptico de cada olho se ramifica, enviando fibras nervosas a um ncleo geniculado lateral em cada lado do crebro. No lado ipsilateral, uma parte especfica da retina vai a uma parte especfica do ncleo geniculado lateral. No lado contralateral, o ncleo geniculado lateral recebe entradas de todas as partes da retina. Neurnios de cada ncleo geniculado lateral inervam o crtex visual no mesmo lado. (B,C) Retinas isoladas (e filetadas) mostrando projees ipsilaterais (B) e contralaterais (C), das clulas ganglionrias da retina de um embrio de camundongo de 16 dias. O corante fluorescente carbocianina DiI foi inserido atrs do quiasma ptico, e foi permitido que o corante penetrasse nos axnios retinianos. O corante se difunde ao longo dos axnios, assim demarcando a sua origem. Projees ipsilaterais na sua maioria vm de uma nica parte da retina (neste caso, da regio ventro-temporal). Projees contralaterais para o mesmo stio vm de toda a retina. (B e C de Colello e Guillery, 1990, cortesia dos autores.)
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(B)
(A)
(C)
(D)
Camada cortical 3 Camada cortical 4
Figura 21.19
Auto-radiografia de fundo escuro do crtex estriado de macaco, 2 semanas aps injeo de [3H]prolina no humor vtreo de um olho. Cada neurnio retiniano absorve a marcao radioativa e a transfere para as clulas com as quais forma sinapses. (A) Padro normal de marcao. As listas brancas indicam que cerca da metade das colunas absorveram a marcao, enquanto a outra metade no a obsorveu; esse padro indica que metade das clulas estavam inervadas pelo olho marcado e metade pelo olho no marcado. (B) Padro de marcao quando o olho no marcado permaneceu fechado por suturas durante 18 meses. As projees axnicas do olho normal (marcado) assumem as regies que normalmente seriam inervadas pelo olho suturado. (C,D) Desenhos de axnios dos ncleos geniculados de gatinhos que tiveram um olho ocludo por 33 dias. A ramificao terminal dos axnios no olho ocludo (C) foi muito menos extensa do que aquela do olho no ocludo (D). (A e B de Wiesel, 1982, cortesia de T. Wiesel; C e D de acordo com Antonini e Stryker, 1993.)
Portanto, dois princpios podem ser visualizados na padronizao do sistema visual nos mamferos. Primeiro, conexes neuroniais envolvidas na viso esto presentes mesmo antes que o animal enxergue; e segundo, a experincia tem um papel importante na determinao de quais conexes permanecem.* Da mesma maneira que a experincia refina as conexes neuromusculares originais, ela tambm tem um papel no refinamento e melhora das conexes visuais. tambm possvel, que funes adultas como aprendizado e memria se originam no estabelecimento e/ou reforo de diferentes sinapses pela experincia. Purves e Lichtman (1985) observaram: A interao entre animais individuais e seu mundo continua a moldar o sistema nervoso atravs da vida de uma maneira impossvel de ter sido programada. Modificao do sistema nervoso pela experincia , portanto, a ltima e mais sutil estratgia desenvolvimental.
*Estudos recentes (Colman et al., 1997) mostraram que a divergncia na liberao de neurotransmissores resulta em modificao da adesividade sinptica e causa a remoo do axnio fornecendo a estimulao mais fraca. Os que estudaram neurobiologia se lembraro (se potenciados adequadamente) que o conceito da sinapse de Hebbian se baseia na premissa que a experincia influencia vias neuroniais. Se um axnio do neurnio A ativa o neurnio B, de tal maneira que o disparo de B est sempre associado ao de A, ento a sinapse entre os neurnios A e B reforada. Existem vrias maneiras pelas quais esse reforo poderia ocorrer, mas a maioria das hipteses focalizam as modificaes que permitiriam a entrada mais rpida de ons de clcio no neurnio B. Esse tipo de sinapse poderia explicar o fenmeno de potenciao de longo prazo, a qual considerada como a base da memria correlativa (onde uma sensao relembra outras). Tais mecanismos Hebbianos podem mediar a competio entre os axnios dos ncleos geniculados laterais por clulas no crtex visual (Stent, 1973; Reite e Stryker, 1988).
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DISTRBIOS AMBIENTAIS DO DESENVOLVIMENTO NORMAL Malformaes e distrbios

Da primeira parte deste captulo, ficou claro que as instrues para o desenvolvimento no residem completamente nos genes ou mesmo no zigoto. O organismo sensvel s sugestes do ambiente. Entretanto, isso torna o organismo vulnervel s mudanas ambientais que podem provocar distrbios no desenvolvimento. Se parece surpreendente que qualquer um de ns sobrevive para nascer, isso real; estima-se que da metade a dois teros de todas as concepes humanas no se desenvolvem a termo com sucesso (Figura 21.20). Muitos desses embries expressam sua anormalidade to cedo que no h implantao no tero. Outros se implantam mas no conseguem estabelecer uma gravidez de sucesso. Portanto, a maioria dos embries anormais so espontaneamente abortados antes mesmo que a mulher saiba que est grvida (Bou et al., 1985). Edmonds e colaboradores (1982) usando um teste imunolgico muito sensvel que pode detectar a presena de gonadotropina corinica humana (hCG) 8 ou 9 dias aps a fertilizao, monitoraram 112 gestaes em mulheres normais. Dessas gestaes determinadas por hCG, 67 no foram mantidas. Parece, ento, que muitos embries humanos so prejudicados cedo no desenvolvimento e no sobrevivem por muito tempo no tero. Os defeitos nos pulmes, membros, face ou boca no seriam deletrios para o feto (que no depende desses rgos enquanto dentro da me), mas podem ameaar seriamente a vida aps o nascimento. Cerca de 5% de todos os nascimentos humanos tm uma malformao reconhecvel, algumas leves, outras muito severas (McKeown, 1976). Anormalidades congnitas (no nascimento) e a eliminao de embries e fetos antes do nascimento so causadas tanto intrinsecamente como extrinsecamente. As anormalidades causadas por eventos genticos (mutaes, aneuploidia, translocaes) so chamadas malformaes. Por exemplo, aniridia (ausncia da ris) causada pela mutao do gene PAX6, uma malformao. A sndrome de Down, causada pela trissomia do cromossomo 21, tambm uma malformao. A maior parte da eliminao precoce de embries e fetos provavelmente devida s anormalidades cromossmicas que interferem com o processo normal do desenvolvimento.
Figura 21.20
Os destinos hipotticos de 20 ovos que so fertilizados naturalmente nos Estados Unidos e Europa ocidental. Em condies normais, somente 6.2 ovos dos 20 originais teriam possibilidade de se desenvolver a termo com sucesso. (De acordo com Volpe, 1987.)
vulos em contacto com o espermatozide Fertilizao bem sucedida
Implantao bem sucedida Desenvolvimento bem sucedido, 4 semanas Desenvolvimento bem sucedido, 8 semanas Fetos levados a termo Nmero de sobreviventes dos 20 originais
Porcento
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Tabela 21.2 Alguns agentes considerados causadores de distrbios no desenvolvimento fetal humanoa DROGAS E SUBSTNCIAS QUMICAS cido retinico (Isotretinoina, Accutane) cido valprico Agentes antitirideos (PTU) lcool Aminoglicosdeos (Gentamicina) Aminopterina Bromo Chumbo Cocana Cortisona Dietilestilbesterol (DES) Difenilhidantona Estreptomicina Fumaa de cigarro Herona Metilmercrio Penicilamina Talidomida Tetraciclina Trimetadiona Warfarina RADIAO IONIZANTE (RAIOS-X) HIPERTERMIA MICROORGANISMOS INFECCIOSOS Cytomegalovrus Herpes simplex Parvovrus Rubola (Sarampo Alemo) Toxoplasma gondii (toxoplasmose) Treponema pallidum (sfilis) Vrus Coxsackie CONDIOES METABLICAS NA ME Doena auto-imune (incluindo incompatibilidade de Rh) Diabetes Deficincias dietticas, malnutrio Fenilcetonria
Fonte: Adaptado de Opitz, 1991. a Esta lista inclui agentes teratognicos conhecidos e possveis e no exaustiva.
Anormalidades devidas a agentes exgenos (certos agentes qumicos ou vrus, radiao ou hipertermia) so chamados distrbios. Os agentes responsveis pelos distrbios so chamados teratognicos (do Grego, formadores de monstros), e o estudo de como agentes ambientais rompem o desenvolvimento normal chamado teratologia.* Teratognicos funcionam durante certos perodos crticos no desenvolvimento. O perodo mais crtico para qualquer rgo quando ele est crescendo e formando suas estruturas. Diferentes rgos tm diferentes perodos crticos, apesar do espao de tempo entre 15 e 60 dias ser crtico para muitos rgos. O corao se forma primariamente durante as semanas 3 e 4, enquanto a genitlia externa mais sensvel nas semanas 8 e 9. O crebro e o esqueleto so sempre sensveis, do comeo da semana 3 at o fim da gravidez e alm.
Agentes teratognicos
Agentes diferentes so teratognicos em diferentes organismos. Uma lista parcial de agentes teratognicos no homem est apresentada na Tabela 21.2. A principal classe de teratognicos inclui drogas e compostos qumicos ambientais. Alguns compostos qumicos que so encontrados naturalmente no ambiente podem causar defeitos de nascimento. Mesmo nos puros campos alpinos intocados das Montanhas Rochosas so encontrados teratognicos. Aqui nasce o repolho de gamb Veratrum californicum, que algumas vezes serve de alimento para os carneiros. Se ovelhas grvidas se alimentam dessa planta, seus fetos tendem a desenvolver graves danos neurolgicos, incluindo ciclopia, a fuso dos dois olhos no centro da face (Figura 21.21). Essa condio tambm ocorre no homem, porco e muitos outros mamferos; o organismo afetado morre logo aps o nascimento (como resultado do grave defeito no crebro, incluindo a falta da glndula pituitria). Quinina e lcool, duas substncias derivadas de plantas, podem tambm causar malformaes. A quinina pode causar surdez, e o lcool (quando mais de 60-90 g por dia so ingeridas pela me) pode causar retardamento fsico e mental na criana. No foi provado que a nicotina e a cafena causam anomalias congnitas, mas mulheres que fumam muito (20 cigarros ou mais por dia) podem ter crianas menores que aquelas nascidas de mes que no fumam. Fumar tambm diminui significativamente o nmero e a motilidade de espermatozides em homens que fumam pelo menos quatro cigarros por dia (Kulikauskas et al., 1985). Alm disso, nossa sociedade industrial produz anualmente centenas de novos compostos artificiais que passam para o uso geral. Pesticidas e compostos orgnicos de mercrio tm causado anormalidades neurolgicas e de comportamento em bebs cujas mes os ingeriram durante a gravidez. Uma trgica demonstrao disso ocorreu em 1965, quando uma firma japonesa despejou mercrio em um lago, onde foi ingerido pelos peixes que foram comidos por mulheres grvidas da aldeia de Minamata. O dano cerebral congnito e a cegueira nas crianas nascidas se tornou conhecido como a doena de Minamata.
Em alguns casos, as mesmas condies podem ser causadas por um distrbio (causado por um agente exgeno) ou uma malformao (do ncleo). Por exemplo, certas malformaes axiais em camundongos podem ser produzidas pela administrao de cido retinico ou por mutaes em certos genes Hox. Considera-se que, em alguns casos, a mutao e o teratognico esto afetando a mesma enzima. A condroplasia puntacta um defeito congnito do osso e da cartilagem, caracterizada por uma mineralizao anormal do osso, subdesenvolvimento da cartilagem nasal e dedos encurtados; esse defeito causado por um gene defeituoso no cromossomo X. Um fentipo idntico produzido pela ingesto de warfarina, o composto que mata ratos. Parece que o gene defeituoso normalmente responsvel pela produo de uma protena, a arilsulfatase, necessria para o crescimento da cartilagem. O composto warfarina inibe essa mesma enzima (Franco et al., 1995).
CAPTULO 21
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cido retinico como um teratgeno Em alguns casos, um composto usado para o desenvolvimento no corpo pode ter efeitos deletrios se fornecido em grandes quantidades em tempos determinados. O cido retinico importante na formao do eixo ntero-posterior do embrio de mamferos e tambm na formao de membros. Nesse caso, o cido retinico produzido de clulas discretas e funciona em uma pequena rea. Entretanto, se cido retinico fornecido pela me em grandes quantidades, as clulas respondem a isso, pois normalmente no receberiam concentraes to altas dessa molcula. No Captulo 16, discutimos o efeito do cido retinico no desenvolvimento do camundongo. No corpo, vitamina A e cido 13-cis-retinico so isomerizados s formas ativas de cido retinico no desenvolvimento, cido retinico todotrans- e cido retinico 9-cis (Creech Kraft, 1992). O cido retinico no pode ligar-se diretamente aos genes. Para a funo de regular os genes, o cido retinico deve se ligar a um grupo de fatores de transcrio chamado de receptores de cido retinico (RARs). Essas protenas tm a mesma estrutura geral que os receptores de esterides e de hormnios da tireide, e so ativos somente quando ligados ao cido retinico (Linney, 1992). Os receptores de cido retinico se ligam a elementos intensificadores especficos no DNA que so denominados elementos de resposta ao cido retinico. Os elementos de resposta ao cido retinico contm pelo menos duas cpias da seqncia GGTCA (Ruberte et al., 1990, 1991a). Alguns genes Hox tm elementos de resposta a cido retinico nos seus promotores (Yu et al., 1991; Ppperl e Featherstone, 1993; Studer et al., 1994). Existem trs tipos principais de receptores de cido retinico: RAR-, RAR- e RAR-. Cada um deles liga ambas as formas de cido retinico e cada um deles se liga ao mesmo elemento de resposta a cido retinico. O cido retinico tem sido til no tratamento da acne cstica grave e est disponvel (sob o nome de Accutane; no Brasil um dos produtos farmacuticos contendo cido retinico Retin-A) desde 1982. Os efeitos deletrios resultantes da administrao de grandes doses de vitamina A ou seus anlogos para vrias espcies de animais em gestao so conhecidos desde a dcada de 1950 (Cohlan, 1953; Giroud e Martinet, 1959; Kochhar et al., 1984), e por essa razo a droga contm uma etiqueta de alerta indicando que no pode ser usada por mulheres grvidas. Apesar disso, cerca de 160.000 mulheres em idade frtil (15 a 45 anos) tomaram essa droga desde que foi introduzida, e algumas a usaram durante a gravidez. Lammer e colaboradores (1985) estudaram um grupo de mulheres que se expuseram inadvertidamente ao cido retinico e que decidiram permanecer grvidas. Dos 59 fetos, 26 nasceram sem anomalias observveis, 12 abortaram espontaneamente e 21 nasceram com anomalias bvias. Os bebs malformados tinham um padro caracterstico de anomalias, incluindo orelhas ausentes ou defeituosas, queixos ausentes ou pequenos, lbio leporino, anormalidades do arco artico, deficincias do timo e anormalidades do sistema nervoso central.* Esse padro de mltiplas anomalias congnitas semelhante aquele visto em embries de rato e de camundongo cujas mes quando grvidas receberam essas drogas. Goulding e Pratt (1986) colocaram embries de camundongo de 8 dias em uma soluo contendo cido retinico 13-cis em concentraes muito baixas (2x10-6M). Mesmo nessa concentrao, aproximadamente um tero dos embries desenvolveram
Figura 21.21
Cabea de carneiro ciclope nascido de uma cabra que havia ingerido Veratrum californicum no incio da gestao. Os hemisfrios cerebrais se fundiram, formando um nico olho e sem glndula pituitria. (de Binns et al. 1964, cortesia de J. F. James e o USDA-ARS Poisonous Plant Laboratories.)
*Sade Pblica um fator crtico, pois existe uma significante sobreposio entre a populao que usa medicamentos para a acne e a populao de mulheres em idade frtil. Alm disso, considerase que metade das gestaes na Amrica do Norte no so planejadas (Nulman et al., 1997). A prpria vitamina A teratognica quando injetada em mega doses. Rothman e colegas (1995) encontraram que mulheres grvidas que tomaram mais de 10.000 unidades internacionais de vitamina A pr-formada/dia (na forma de suplementos vitamnicos) tinham cerca de 2 por cento de chance de terem uma criana nascida com distrbios semelhantes aqueles produzidos pelo cido retinico.
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Figura 21.22
Embrio de camundongo normal com 17 dias (A) e um embrio de camundongo de 17 dias cuja me recebeu cido retinico no dia 8 da gestao (B). Podem ser vistas malformaes craniofaciais na cartilagem derivada da crista neural dos embries tratados. A cartilagem de Meckel est completamente deslocada da regio mandibular (queixo inferior) para a regio maxilar (parte superior da boca). As cartilagens do martelo e bigorna tambm no so formadas. (de Morriss-Kay, 1993; fotografia cortesia de G. Morriss-Kay.)
(A) (B)
um padro de anomalias muito especfico, incluindo uma dramtica reduo no tamanho do primeiro e segundo arcos farngeos (Figura 21.22). Em camundongos normais, o primeiro arco forma o maxilar e a mandbula do queixo e dois ossculos do ouvido mdio, enquanto o segundo arco forma o terceiro ossculo do ouvido mdio como tambm outros ossos faciais. A base para esse distrbio do desenvolvimento parece residir na habilidade da droga em alterar a expresso dos genes Hox e, portanto, reespecificar pores do eixo ntero-posterior e inibir a migrao das clulas da crista neural da regio craniana do tubo neural (Moroni et al., 1994; Studer et al., 1994). O cido retinico marcado radioativamente se liga s clulas da crista neural craniana e impede no s sua proliferao como sua migrao (Johnston et al., 1985; Goulding e Pratt, 1986). A ligao parece ser especfica s clulas derivadas da crista neural craniana, e o efeito teratognico da droga confinado a um perodo especfico do desenvolvimento (dias 8-10 no camundongo; dias 20-35 em humanos). A teratognese do cido retinico em modelos animais tem sido extremamente bem sucedida em elucidar seus mecanismos a nvel celular. [env6.html] Talidomida como um teratgeno Antes de 1961, havia pouca evidncia sobre malformaes induzidas por drogas em humanos. Mas, naquele ano, Lenz e McBride independentemente acumularam evidncia de que um sedativo leve, talidomida, causava um enorme aumento em uma sndrome previamente rara de anomalias congnitas. A mais evidente dessas anomalias era a focomelia, uma condio na qual os ossos longos dos membros esto ausentes (amelia) ou severamente deficientes (peromelia), fazendo com que os apndices resultantes paream membros de foca (Figura 21.23). Mais de 7000 crianas afetadas nasceram de mes que haviam tomado a droga, e uma mulher necessitava ingerir apenas um comprimido para produzir crianas com os quatro membros deformados (Lenz, 1962, 1966; Toms,1962). Outras anormalidades induzidas pela ingesto de talidomida incluem defeitos no corao, ausncia de ouvidos externos e intestinos malformados. A droga foi retirada do mercado em Novembro de 1961. Nowack (1965) documentou o perodo de susceptibilidade durante o qual a talidomida causava essas anormalidades. Foi encontrado que a droga era teratognica somente durante os dias 34-50 aps a ltima menstruao (cerca de 20 a 36 dias ps-concepo). A especificidade da ao da talidomida mostrada na Figura 21.23C. Do dia 34 ao dia 38, no se observa anormalidades nos membros. Durante esse perodo, a talidomida pode causar a ausncia ou deficincia dos componentes do ouvido. Malformaes dos membros superiores so vistas antes daquelas dos membros inferiores, pois durante o desenvolvimento os braos se formam pouco antes do que as pernas.
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(A)
(B)
Figura 21.23
Estrutura e efeito da talidomida. (A) Estrutura qumica da talidomida. (B) Focomelia em uma criana cuja me tomou talidomida durante os primeiros dois meses de gestao. (C) Perodo de suceptibilidade aos efeitos teratognicos da talidomida. (De acordo com Nowack, 1965.)
(C)
Ausncia de ouvido Dedos ausentes ou mal formados Ausncia de braos Severo encurtamento dos braos Deslocamento da bacia Malformao do ouvido Ausncia de pernas Severo encurtamento das pernas Dedos malformados
Dias aps a ltima menstruao
A tragdia da talidomida mostrou os limites de modelos animais como testes do potencial efeito teratognico de drogas. Diferentes espcies (e linhagens dentro das espcies) metabolizam talidomida de maneira diferente. Ratas e camundongos fmeas grvidas - os animais usados normalmente para testar tais compostos-no produzem filhotes malformados quando recebem talidomida. O coelho produz alguns descendentes malformados, mas os defeitos so diferentes daqueles vistos em crianas humanas afetadas. Primatas, tais como o sagi parecem ter uma susceptibilidade semelhante do homem, e fetos de sagi afetados tm sido estudados como uma tentativa de descobrir como a talidomida causa esses distrbios. McCredie (1976a,b) props que a talidomida pode afetar a diferenciao das clulas derivadas da crista neural, e McBride e Vardy (1983) mostraram que a diferena mais notvel vista antes das malformaes dos membros se referia ao tamanho da raiz dorsal dos gnglios e seus neurnios. O nmero de neurnios nesses gnglios marcadamente reduzido (Figura 21.24). Esses autores especulam que os neurnios desses gnglios so necessrios para a manuteno do desenvolvimento dos membros e que a talidomida interfere com os neurnios ou os destroem. Outra hiptese (Neubert et al., 1995; Geitz et al., 1996) prope que o alvo inicial da talidomida so as molculas de adeso do broto do membro e seus capilares. A adio de pequenas doses de talidomida a sagis ou a clulas endoteliais cultivadas resulta em uma desacelerao de vrias molculas de adeso clula-clula ou clula-substrato.
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Figura 21.24
Efeitos da talidomida no feto de sagi. As figuras superiores mostram fentipos de fetos de sagis tardiamente na gestao. As figuras inferiores mostram sees da medula espinhal ao nvel dos membros anteriores. (A) Feto de um sagi controle. (B) Feto de um sagi tratado com 25mg de talidomida por quilograma de peso coporal entre os dias 38 e 46 da gestao. (de McBride e Vardy, 1983, cortesia de W. G. McBride.)
Um terceiro mecanismo para explicar a teratogenicidade da talidomida foi proposto por Lash e Saxn (1972). Lash (1963) observou que o rim primitivo, o mesonefro, induzia o crescimento da cartilagem em tecido de membro cultivado. Lash e Saxn observaram que a talidomida inibia esse crescimento de cartilagem induzido por mesonefros em culturas de rgos humanos obtidos de embries abortados eletivamente. Alm disso, a talidomida radioativa parecia se ligar especificamente ao mesonefro humano. O mecanismo molecular dessa teratogenicidade seletiva da talidomida ainda no conhecido, e isso ser um problema difcil de ser estudado enquanto nossos nicos modelos animais forem outros primatas. A tragdia da talidomida acentua outro princpio importante: o metabolismo em embries diferente do que nos adultos, e a construo de um rgo pode ser afetado por substncias qumicas que no tm efeito deletrio sobre o funcionamento daquele rgo. Vrios medicamentos para adultos so teratognicos para embries. Esses incluem metotrexato (uma droga usada para deter o crescimento de
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clulas tumorais), anticonvulsivantes como trimetadiona e fenitona, e anticoagulantes como warfarina. Fumar cigarros durante a gravidez foi associado com o retardamento do crescimento fetal, mas nem a ingesto de caf ou de antidepressivos triocclicos produziu anormalidades significativas de desenvolvimento (veja Friedman, 1992: Nulman et al., 1997). lcool como um teratognico Em termos de freqncia e custo sociedade, o teratognico mais devastador indubitavelmente o etanol. Em 1968, Lemoine e colegas verificaram uma sndrome de defeitos de nascimento em crianas de mes alcolatras. Jones e Smith (1973) tambm observaram a sndrome alcolica fetal (FAS). Bebs com FAS eram caracterizados como tendo uma cabea pequena, um filtro indistinto (o par de cristas que correm entre o nariz e a boca acima do centro do lbio superior), um lbio superior estreito, e uma baixa fossa nasal. O crebro dessa criana pode ser dramaticamente menor do que o normal e freqentemente mostra defeitos na migrao neuronial e glial (Figura 21.25; Clarren, 1986). Existe tambm uma proeminente morte celular extra no processo frontonasal e nos gnglios do nervo craniano (Sulik et al., 1988). A sndrome alcolica fetal o terceiro tipo mais prevalente de retardamento mental (atrs da sndrome do X frgil e da sndrome de Down) e afeta uma entre 500 a 750 crianas nascidas nos Estados Unidos (Abel e Sokol, 1987). Crianas com sndrome alcolica fetal so retardadas no desenvolvimento e mentalmente, com um QI mdio ao redor de 68 (Streissguth e LaDue, 1987). Foi determinado que pacientes com uma idade cronolgica mdia de 16.5 anos tinham um vocabulrio funcional de crianas de 6.5 anos e habilidades matemticas de alunos da quarta-srie. A maioria dos adultos e adolescentes com FAS no podem gerenciar dinheiro ou suas prprias vidas, e eles tm dificuldades em aprender com experincias passadas. Entretanto, em muitos exemplos de FAS, as anormalidades de comportamento existem sem grandes mudanas fsicas no tamanho da cabea ou no QI (J. Opitz, comunicao pessoal, 1996). Existe uma grande variao na habilidade de mes e fetos para metabolizar o etanol, e se considera que 30-40% das crianas nascidas de mes alcolicas que bebem durante a gravidez tero FAS. A ingesto de menores quantidades de etanol pela me pode levar ao efeito alcolico fetal, uma forma menos severa de FAS, mas uma condio que diminui as habilidades funcionais e intelectuais do paciente.*
* Para uma notvel descrio da criao de uma criana com sndrome alcolica fetal bem como uma anlise de FAS na cultura dos ndios Americanos nos Estados Unidos, veja Dorris (1989). Os efeitos pessoais e sociolgicos de FAS esto bem integrados aos dados cientficos e econmicos.
Figura 21.25
Comparao de um crebro de uma criana com sndrome alcolica fetal (esquerda) com o crebro de uma criana normal da mesma idade (direita). O crebro de uma criana com FAS significativamente menor, e o padro de convolues est obscurecido pelas clulas gliais que migraram sobre o topo do crebro. (Fotografia cortesia de S. Clarren.)
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Figura 21.26
Possveis mecanismos que produzem a sndrome alcolica fetal. (A-C) Morte celular pelos radicais de superxido induzidos pelo etanol. Colorao com sulfato de Azul do Nilo revela reas de morte celular. (A) Regio da cabea de um embrio controle de camundongo de 9 dias. (B) Regio da cabea de um embrio tratado com etanol, mostrando reas de morte celular. (C) Regio da cabea de um embrio de 9 dias tratado com etanol e superxido dismutase, um inibidor de radicais superxido. O inibidor do superxido impede a morte celular induzida pelo lcool. (D) Grfico representando a inibio da adeso celular mediada por L1 pelo etanol. (A-C de Kotch et al., 1995; fotografias cortesia de K. Sulik; D de acordo com Ramanathan et al., 1996.)
Porcentagem de clulas aderentes
Clulas aderindo pelo L1 Clulas controle no expressando L1
Concentrao de etanol, mM
Um sistema modelo no camundongo foi usado para explicar os efeitos do lcool na face e no sistema nervoso. Quando camundongos recebem etanol na poca da gastrulao, induzido o mesmo espectro de defeitos do desenvolvimento como em humanos. Aps 12 horas da ingesto de lcool pela me, j so observadas anormalidades do desenvolvimento. As estruturas da linha mediana no se formam, permitindo a proximidade anormal dos processos medianos da face. So vistas tambm anomalias no crebro anterior, e os fetos afetados mais severamente no tm um crebro anterior completo (Sulik et al., 1988). Nos embries tratados com etanol, a morte celular pode ser vista com proeminncia no processo frontonasal (facial), como tambm nos gnglios do nervo craniano e no mesoderma do arco visceral. Estudos recentes sugerem que etanol pode induzir seus efeitos teratognicos por mais de um mecanismo. Primeiro, evidncia anatmica sugere que a migrao da crista neural severamente prejudicada. Segundo, a morte celular pode ser causada pela produo de radicais de superxido que oxidam membranas celulares e levam citlise (Figura 21.26A-C; Davis et al., 1990; Kotch et al., 1995). Terceiro, o lcool pode impedir diretamente que a molcula L1 de adeso celular funcione mantendo as clulas agregadas. Ramanathan e colegas (1996) mostraram que o etanol pode bloquear as funes
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adesivas das protenas L1 in vitro a nveis to baixos como 7mM, uma concentrao de etanol produzida no sangue ou crebro com um nica dose (Figura 21.26D). Alm disso, mutaes nos genes L1 humanos causam uma sndrome de retardamento mental e malformaes semelhantes quelas vistas em casos severos da sndrome alcolica fetal. [env7.html] Outros agentes teratognicos Drogas e substncias qumicas no so os nicos agentes capazes de causar distrbios no desenvolvimento. Outra classe de teratognicos inclui os vrus. Gregg (1941) foi o primeiro a documentar o fato que mulheres com rubola (sarampo Alemo) durante o primeiro tero da gravidez tinham uma chance em seis de dar luz uma criana com catarata ocular, malformaes cardacas ou surdez. Essa foi a primeira evidncia de que a me no podia proteger totalmente seu feto contra o meio ambiente externo. Quanto mais cedo na gravidez ocorria a infeco por rubola, maior era o risco de que o embrio seria malformado. As primeiras cinco semanas parecem ser as mais crticas, porque nesse perodo que esto sendo formados o corao, os olhos e os ouvidos. A epidemia de rubola entre 1963 e 1965 nos Estados Unidos provavelmente resultou em 20.000 mortes fetais e 30.000 crianas com defeitos de nascena. Dois outros vrus, Cytomegalovirus e Herpes simplex, so tambm teratognicos. Infeco por Cytomegalovirus em embries precoces quase sempre fatal, mas infeco mais tardia pode levar cegueira, surdez, paralisia cerebral e retardamento mental. Bactrias e protistas so raramente teratognicos, mas dois deles podem prejudicar embries humanos. Toxoplasma gondii, um protozorio carreado por coelhos e gatos (e por suas fezes), pode atravessar a placenta e causar defeitos no crebro e olhos do feto. Treponema pallidum, a causa da sfilis, pode matar fetos precoces e produzir surdez em outros mais velhos. A radiao ionizante pode quebrar cromossomos e alterar a estrutura do DNA. Por essa razo, mulheres grvidas so alertadas para evitar RaiosX desnecessrios, mesmo que no exista evidncia para anomalias congnitas resultantes de radiao diagnstica (Holmes, 1979). O calor em febres altas tambm um teratognico possvel. [env8.html], [env11.html] Apesar de conhecermos as causas de certas malformaes, a maioria das anormalidades congnitas ainda no esto explicadas. Por exemplo, anomalias cardacas congnitas ocorrem 1 em 200 nascimentos vivos. As causas genticas so responsveis por cerca de 8% dessas anomalias cardacas, e cerca de 2% podem ser explicadas por teratognicos conhecidos. Isso deixa 90% das anomalias sem explicao (ORahilly e Mller, 1992). Ainda existe muita pesquisa a ser realizada e ainda no foram feitas anlises da maioria das substncias qumicas para avaliar seus efeitos teratognicos. Atualmente, existem mais de 50.000 substncias qumicas artificiais em uso na nossa sociedade e entre 200 e 500 novos materiais sendo produzidos a cada ano (Johnson, 1980). O problema de analisar esses produtos qumicos de grande importncia, e protocolos padro so caros, longos, e sujeitos a diferenas metablicas entre espcies. Ainda no existe consenso em como testar a teratogenicidade de uma substncia em embries humanos. Na antiga Unio Sovitica, a prtica no regulada de uma produo industrial a qualquer custo, deixa uma herana de defeitos de nascimentos em elevao. Em algumas regies do Kazakhstan, teratognicos como o chumbo, o mercrio e o zinco so encontrados em altas concentraes na gua potvel, nos vegetais e no ar. Nesses lugares, quase metade das pessoas testadas apresentaram extensa quebra cromossmica. Em algumas reas, a incidncia de defeitos de nascimento dobrou desde 1980 (Edwards, 1994). Apesar da constante presena de teratognicos entre ns, os fetos esto expostos a riscos cada vez maiores com o aparecimento anual de muitos compostos no testados em nosso ambiente.
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&
Especulaes
Estrognos Ambientais
ma das maiores controvrsias na toxicologia ambiental , provavelmente, a questo se pesticidas so os responsveis pelo cncer de mama, pelo declnio da contagem de espermatozides no homem e por malfunes congnitas em animais selvagens. Os Americanos usam quase 2 bilhes de libras de pesticidas cada ano. Alm disso, alguns resduos de pesticidas permanecem na cadeia alimentar durante dcadas. O DDT foi banido nos Estados Unidos em 1972 mas sua meia-vida ambiental de 100 anos (Nature, 1995). Evidncia recente mostrou que o DDT [dicloro-difeniltricloroetano] e seu principal produto metablico, DDE (que no tem um dos tomos de cloro), podem agir como compostos estrognicos, mimetizando o hormnio sexual feminino estrogno, ou inibindo a eficincia de andrognios (Davis et al., 1993; Kelce et al., 1995). Esses compostos foram associados a problemas ambientais como o decrscimo na populao de crocodilos na Flrida, a feminizao de peixes no Lago Superior, o aumento de cncer de mama, e o declnio mundial nas contagens de espermatozide humano (Carlsen et al., 1992; Keiding e Skakkebaek, 1993; Stone, 1994). Guillette e colaboradores (1994) associaram uma contaminao de DDT no lago Apopka na Flrida a um declnio em 90% no ndice de nascimentos de crocodilos e ao tamanho reduzido do pnis em machos jovens. Dioxina, outro ingrediente de pesticidas, foi relacionado com cncer; e os descendentes machos de ratas prenhes expostas dioxina tm contagem de espermatozide mais baixa, testculos menores e menos comportamentos especficos de machos. Alguns cientistas, entretanto, consideram exageradas essas afirmaes. Apesar de pesticidas poderem mimetizar os estrgenos, s o fazem em grandes quantidades e se ligam ao receptor de estrgeno 1000 vezes mais fracamente do que os estrgenos normais. Outro argumento que alguns componentes de pesticidas tm fracos efeitos anti-estrognicos, que cancelariam os fracos efeitos estrogni-
cos. Crticos de pesticidas, entretanto, alegam que ainda que esses componentes se liguem fracamente ao receptor de estrgenos, eles esto presentes no soro sangneo 100 vezes mais do que a concentrao dos estrgenos normais. Eles tambm argumentam que pequenas quantidades de outros compostos ativos podem agir sinergisticamente para estimular a atividade estrognica normalmente fraca dessas molculas (veja Hansen e Jansen, 1994; Stone, 1994). Arnold e colegas (1996), por exemplo, mostraram que a combinao de dois fracos estrgenos ambientais produz um efeito 1000 vezes mais forte do que cada composto sozinho. Um trabalho recente de Kelce e colegas (1995) sugere que o modo de operao crtico pode no ser o efeito fracamente estrognico do DDT, mas o potente efeito antitestosterona de seu metablito, DDE. O DDE capaz de inibir a transcrio responsiva a andrognios em doses comparveis quelas encontradas em solos contaminados nos Estados Unidos e outros pases. Alguns compostos estrognicos podem estar no nosso alimento ou na sua embalagem, pois compostos qumicos usados para estabilizar plsticos foram, em alguns casos, demonstrados como estrognicos. A descoberta desse efeito dos estabilizadores de plsticos foi feita de maneira preocupante. Pesquisadores da Tufts University Medical School estudavam clulas tumorais responsivas a estrgenos. Essas clulas requerem o estrgeno para proliferar. Os experimentos foram bem at 1987 quando algo aconteceu. As clulas controle estavam crescendo to bem como as tratadas com estrgenos. Parecia que o meio havia sido contaminado por estrgenos. Qual seria a fonte de contaminao? Aps quatro meses de testes com todos os componentes de seu sistema experimental, os pesquisadores descobriram que a fonte de estrgeno era os tubos plsticos que continham a gua e o soro. A companhia que produziu os tubos se recusou a identificar seu novo processo de estabilizao
do plstico polistireno e os pesquisadores tiveram que faz-lo eles mesmo. Descobriu-se que o composto era o pnonilfenol, usado para endurecer o plstico PVC dos encanamentos que trazem gua e para estabilizar o plstico polistireno que contm gua, leite, suco de laranja e outros lquidos (Soto et al., 1991; Colburn et al., 1996). Esse composto tambm o produto de degradao de detergentes e produtos de limpeza caseira. Um composto relacionado, 4-tert-pentilfenol, tem um potente efeito estrognico em clulas humanas cultivadas e pode fazer com que carpas machos (Cyprinus carpis) desenvolvam ovidutos, tecido ovariano e ocitos (Gimeno et al., 1996). Alguns outros estrgenos ambientais so os bifenis policlorinados (PCBs). Esses compostos eram muito usados como refrigeradores at serem banidos, na dcada de 1970, como causadores de cncer em ratos. Entretanto, eles permanecem na cadeia alimentar e tm sido responsabilizados pelo declnio generalizado da capacidade reprodutiva de lontras, focas, vises e peixes. Os PCBs se assemelham ao dietil-estilbesterol (DES) na forma, e eles podem afetar o receptor de estrgenos como o faz o DES, talvez se ligando a outro stio do receptor estrognico. A estrutura desses compostos se parece com a estrutura dos hormnios da tireide (Figura 21.27). Hormnios da tireide so crticos para o crescimento da cclea do ouvido interno, e ratos cujas mes foram expostas a PCBs mostravam ccleas mal desenvolvidas e defeitos de audio (Goldey e Crofton em Stone, 1995). [env9.html] No norte dos Estados Unidos e sul do Canad est havendo um dramtico aumento no nmero de rs com deformaes desenvolvimentais no que parecem ser puras lagoas de florestas. As principais anormalidades so membros extras e malformados. No se conhece a causa desses distrbios, mas a especulao (veja Hilleman, 1996) que pesticidas (pulverizados para o controle de mosquitos e carrapatos) estejam ativando os recepto-
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Estradiol-17
Dietilestilbesterol
Figura 21.27
Estruturas de hormnios e compostos que provocam distrbios em hormnios.
Bisfenol-A
o,p-DDT
Tiroxina
Estrutura PCB
res de cido retinico e reespecificando tecidos como membros. difcil documentar os efeitos dos compostos ambientais no homem, e ainda mais difcil determinar os efeitos de cocktails consistindo de diferentes compostos ingeridos em tempos diferentes. Ainda necessrio um grande volume de pesquisa na bioqumica desses compostos, seus efeitos no desenvolvimento e a epidemiologia das anormalidades do desenvolvimento. No momento, a evidncia proveniente de estudos com animais sugere que o homem e as populaes de animais silvestres esto ameaados por esses moduladores hormonais, mas no esto disponveis todos os dados necessrios. [env10.html]
Interaes gentica-ambiental
A observao de que uma substncia pode ser teratognica em uma espcie mas no em outra, sugere fortemente que existe um componente gentico para que uma substncia possa ou no produzir modificaes no desenvolvimento normal. Evidncia recente sugere que diferentes alelos na populao humana podem influenciar se uma substncia benigna ou perigosa para o feto. Por exemplo, existe na populao em geral, um pequeno risco de que o fumo intenso pela me cause malformaes faciais no seu feto. Entretanto, se o feto possui um determinado alelo (A2) do gene para o fator de crescimento TGF-, a fumaa absorvida atravs da placenta pode aumentar de dez vezes o risco de lbio e plato fissurados (Shaw et al., 1996). Analogamente, diferentes alelos codificando a enzima lcool desidrogenase-2 tm diferentes habilidades de degradar o etanol. Se o alto consumo de lcool pela me leva uma sndrome alcolica fetal ou a um efeito alcolico fetal depender do tipo de isozimas de lcool desidrogenase presentes na me e no feto (McCarver-May, 1996). Portanto, se um composto teratognico depende de muitos fatores, incluindo os genes do indivduo a ele exposto.
Resumo
Freqentemente, o desenvolvimento ocorre em um meio ambiente rico, e a maioria dos animais sensvel s sugestes do ambiente. O ambiente pode determinar o fentipo sexual, pode induzir incrveis adaptaes qumicas e estruturais de acordo com a estao, pode induzir determinadas modificaes morfolgicas que permitem
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que o indivduo escape predao e pode induzir a determinao de castas nos insetos. O ambiente tambm pode alterar a estrutura de nossos neurnios e a especificidade de nossas clulas imunocompetentes. Infelizmente, o ambiente tambm pode ser a fonte de compostos qumicos que prejudicam processos normais de desenvolvimento. Enquanto o desenvolvimento ocorre normalmente em um ambiente natural complexo, ele pode ser facilmente estudado no laboratrio. Na verdade, nossos sistemas modelo so animais facilmente domesticados, cujo desenvolvimento pouco afetado por fatores ambientais (Bolker, 1995). Entretanto, ao conhecermos a complexidade do desenvolvimento, compreendemos que esse criticamente ligado ao ambiente. necessria uma comunidade para desenvolver um embrio. A explorao de como o ambiente regula o desenvolvimento est apenas comeando.
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A saga da linhagem germinativa
22
E o fim de todo nosso explorar Ser o retorno para de onde partimos E pela primeira vez o conhecimento do lugar. T. S. ELIOT (1942)
OMEAMOS NOSSA ANLISE do desenvolvimento animal discutindo a
fecundao, e iremos terminar nosso estudo sobre o desenvolvimento individual investigando a gametognese, os processos pelos quais so formados o espermatozide e o vulo. Clulas germinativas proporcionam a continuidade da vida entre as geraes, e os ancestrais mitticos de nossas prprias clulas germinativas residiram uma vez nas gnadas de rpteis, anfbios, peixes e invertebrados. Em muitos animais, como insetos, nematelmintos e vertebrados existe uma clara e precoce separao das clulas germinativas de tipos celulares somticos. Em vrios filos animais (e no todo do reino vegetal), essa diviso no est to bem estabelecida. Nessas espcies (que incluem cnidrios, platelmintos e tunicados), as clulas somticas podem facilmente se tornarem clulas germinativas mesmo em organismos adultos. Os zoides, brotos e plipos de muitos filos de invertebrados atestam a capacidade das clulas somticas dar origem a novos indivduos. Naqueles organismos nos quais existe uma linhagem germinativa estabelecida, separando-se precocemente no desenvolvimento, as clulas germinativas no se originam de dentro da gnada propriamente. Ao contrrio, seus precursores as clulas germinativas primordiais (PGCs) migram para o interior das gnadas em desenvolvimento. O primeiro passo na gametognese, portanto, envolve a formao das PGCs e sua conduo para o sulco genital medida que a gnada est se formando. A iniciao da linhagem da clula germinativa (a linhagem germinativa) em anfbios, insetos e nematelmintos foi discutida no Captulo 13. Reiniciamos nossa histria da linhagem germinativa com a migrao das PGCs de seu local de origem para as gnadas.
Migrao das clulas germinativas

Migrao das Clulas Germinativas em Anfbios Conforme discutido no Captulo 13, o plasma germinativo de anfbios anuros sapos e rs se agrupa ao redor do plo vegetal do embrio de 1 clula. Durante a clivagem, esse material levado para cima atravs do citoplasma vitelnico, e os grnulos ricos em RNA se associam com as clulas endodrmicas revestindo o assoalho da blastocele (Figura 22.1; Bounoure, 1934; Ressom e Dixon, 1988; Kloc et al., 1993). As PGCs ficam concentradas na regio posterior do intestino larval, e medida que se forma a cavidade abdominal, as PGCs do anuro emigram ao longo do lado dorsal do
843
844
Figura 22.1
Alteraes na posio do plasma germinativo (colorido) no embrio precoce da r. Originalmente localizado perto do plo vegetal do ovo no-clivado (A), o plasma germinativo avana ao longo dos sulcos de clivagem (B) at se localizar no assoalho da blastocele (C). (Segundo Bounoure, 1934.)
Plo animal (A) (B)
Sulco de clivagem (C)
Plasma germinativo Plo vegetal
Blastocele
intestino, primeiramente ao longo do mesentrio dorsal (que conecta o intestino com a regio onde os rgos mesodrmicos esto se formando) e em seguida ao longo da parede abdominal e para dentro dos sulcos genitais. Elas migram para cima nesse tecido at atingirem as gnadas em desenvolvimento (Figura 22.2). As PGCs de Xenopus se movimentam extruindo um nico filopdio e em seguida escorrendo seu citoplasma vitelnico para o filopdio enquanto retraem sua cauda. Conduo por contato dessa migrao parece provvel pois ambas as clulas e a matriz extracelular sobre a qual elas migram esto orientadas na direo dessa migrao (Wylie et al., 1979). Alm disso, a adeso e a migrao de PGC pode ser inibida se o mesentrio for tratado com anticorpos contra a fibronectina de Xenopus (Heasman et al., 1981). Assim, o caminho para a migrao das clulas germinativas nessas rs parece ser constitudo por uma matriz extracelular contendo fibronectina orientada. As fibrilas sobre as quais as PGCs viajam perdem essa polaridade logo aps o trmino da migrao.* Enquanto elas migram, as PGCs de Xenopus se dividem cerca de trs vezes, e aproximadamente 30 PGCs colonizam as gnadas (Whitngton e Dixon, 1975; Wylie e Heasman, 1993). Essas iro se dividir para formar as clulas germinativas. As clulas germinativas primordiais dos anfbios urodelos (salamandras) tm uma origem aparentemente diferente, que foi tracejada por experimentos de transplantes recprocos para as regies do mesoderma que involuem atravs dos lbios ventrolaterais do blastporo. Alm disso, no parece existir qualquer plasma germinativo em ovos de salamandra. Em vez disso, a interao das clulas endodrmicas dorsais e as clulas do hemisfrio animal cria as condies necessrias para formar clulas germinativas nas reas particulares que involuem atravs dos lbios ventrolaterais (Sutasurya e Nieuwkoop, 1974). Assim em salamandras, as PGCs so formadas por induo dentro da regio mesodrmica e presumivelmente seguem um caminho diferente para o interior da gnada. Migrao das Clulas Germinativas em Mamferos No existe plasma germinativo bvio em mamferos, e as clulas germinativas de mamferos no so morfologicamente distintas durante o desenvolvimento inicial. Porm, usando anticorpos monoclonais que reconhecem diferenas na superfcie celular entre as PGCs e suas clulas circunjacentes, Hahnel e Eddy (1986) mostraram que as PGCs de camundongos residem originalmente no epiblasto do embrio em gastrulao. Ginsburg e seus colegas (1990) localizaram essa regio no mesoderma extraembrionrio imediatamente posterior estria primitiva do embrio de camundongo de sete dias. Aqui so vistas cerca de oito grandes clulas coradas pela fosfatase alcalina. Se essa rea for removida, o embrio remanescente torna-se livre de clulas germinativas, enquanto o segmento isolado desenvolve um grande nmero de clulas primordiais. Em embries de camundongos normais, os precursores das clulas
*Isso no parece necessariamente ser verdade para todos os anuros. Na r Rana pipiens, as clulas germinativas seguem um caminho semelhante mas podem ser viajantes passivos ao longo do mesentrio em vez de clulas ativamente mveis (Subtelny e Penkala, 1984).
Figura 22.2
Migrao das clulas germinativas primordiais em uma r. Esta fotomicrografia de contraste de fase de uma seo atravs da parede corporal e mesentrio dorsal de um embrio de Xenopus mostra a migrao de duas grandes clulas germinativas primordiais (setas) ao longo do mesentrio dorsal. (de Heasman et al., 1977, cortesia dos autores.)
CAPTULO 22 A Saga da Linhagem Germinativa
845
Figura 22.3
Intestino anterior
Intestino posterior
Alantide Sulcos genitais
Corao Clulas germinativas primordiais Mesonefros Mesentrio dorsal Saco vitelnico (A) (B) Cloaca Intestino posterior
Trajetria para a migrao de clulas germinativas primordiais de mamfero. (A) clulas germinativas primordiais vistas no saco vitelnico prximas da juno do intestino posterior e da alantide. (B) Migrao atravs do intestino e, dorsalmente, acima do mesentrio dorsal para o interior do sulco genital. (C) Quatro grandes PGCs no intestino posterior de um embrio de camundongo (perto da alantide e do saco vitelnico) se coram positivamente para altos nveis de fosfatase alcalina. (D) Tais clulas podem ser vistas migrando subindo o mesentrio dorsal e entrando nos sulcos genitais. (A e B de Langman, 1981; C de Heath, 1879; D de Mintz, 1957; fotografias cortesia dos autores.)
Clulas germinativas primordiais
(C)
Clulas germinativas primordiais
(D)
Mesentrio dorsal
Sulcos genitais
germinativas no mesoderma extra-embrionrio migram em seguida de volta para o embrio, primeiramente para o mesoderma da linha primitiva e em seguida para o endoderma atravs da alantide. O caminho dessa migrao (Figura 22.3) assemelhase migrao de PGCs em anuros. Aps juntarem-se na alantide no dia 7.5 (Chiquoine, 1954; Mintz, 1957), as PGCs de mamferos migram para o saco vitelnico adjacente (Figura 22.3A,C). Nesse tempo, elas j se separaram em duas populaes que iro migrar para o sulco genital direito ou esquerdo. Em seguida, as PGCs iro se mover caudalmente no saco vitelnico atravs do intestino posterior recm-formado subindo pelo mesentrio dorsal para dentro do sulco genital (Figura 22.3B,D.) A maioria das PGCs alcanam a gnada em desenvolvimento no dcimo primeiro dia aps a fecundao. Durante esse trajeto, elas tero se proliferado de uma populao inicial de 10 a 100 clulas para as 2500 a 5000 PGCs presentes nas gnadas no dia 12. Tal como as PGCs de Xenopus, as PGCs de mamferos parecem estar estreitamente associadas com a clulas sobre as quais elas migram, movimentando-se por extenso de filopdios sobre as superfcies celulares subjacentes. Essas clulas tambm so capazes de
846
penetrar monocamadas celulares e migram atravs de camadas celulares (Stott e Wylie, 1986). O mecanismo pelo qual as clulas germinativas primordiais tm conhecimento da rota dessa jornada permanece ainda desconhecido. A fibronectina provavelmente um substrato importante sobre as quais as PGCs migram (ffrench-Constant et al., 1991), e evidncia in vitro sugere que os sulcos genitais dos embries de camundongo de 10.5 dias secretam uma protena semelhante TGF-1 difusvel que capaz de atrair as clulas germinativas primordiais do camundongo (Godin et al., 1990; Godin e Wylie, 1991). Permanece por ser testado se o sulco genital pode prover tais sinais. Embora nenhum plasma germinativo tenha sido encontrado, a reteno da potncia total foi correlacionada com a expresso de um fator de transcrio nuclear, o Oct4. Esse fator expresso em ncleos do blastmero de clivagem precoce sendo em seguida expresso na massa celular interna. Durante a gastrulao, ele expresso somente naquelas clulas epiblsticas posteriores consideradas dar origem s clulas germinativas primordiais. Depois, essa protena somente vista nas clulas germinativas primordiais e em ocitos (Figura 22.4; Yeom et al., 1996; Prancha 30). A proliferao das PGCs parece ser provida pelo fator da clula-tronco, o mesmo fator de crescimento necessrio para a proliferao dos melanoblastos derivados da crista neural e de clulas-tronco hematopoiticas (veja Captulo 7). O fator da clula-tronco produzido pelas clulas ao longo do seu trajeto de migrao e permanece ligado s suas membranas celulares. Parece que a apresentao dessa protena nas membranas importante para sua atividade. Camundongos homozigotos para a mutao White (W) so deficientes em clulas germinativas (e em melancitos e clulas sangneas), j que suas clulas-tronco carecem do receptor para o fator de crescimento da clula-tronco. Camundongos homozigotos para a mutao Steel tm um fentipo semelhante, pois tambm carecem da capacidade de produzir esse fator de crescimento. Camundongos homozigotos para o alelo Steel-Dickie (Sld) tm um nmero reduzido de clulas germinativas, pois embora esses camundongos possam produzir o fator de crescimento da clula-tronco, esse no permanece ligado s suas membranas (Dolci et al., 1991; Matsui et al., 1991). A adio do fator da clulatronco precursor s PGCs retiradas de camundongos de 11 dias ir estimular sua proliferao por cerca de 24 horas e parece prevenir a morte programada de clulas que de outra maneira iria ocorrer (Pesce et al., 1993).
(A)
(B)
(C)
Figura 22.4
Expresso de mRNA Oct4 se correlaciona com a totipotncia e a capacidade de formar clulas germinativas. Um transgene Oct4/lacZ impulsionado pela regio promotora Oct4 mostra sua expresso na (A) massa celular interna, (B) epiblasto posterior de um embrio de 8.5 dias, e (C) em PGCs migrando em um embrio de 10.5 dias. (Segundo Yeom et al., 1996; permisso cortesia de H. R. Schler.)
847
&
Especulaes
Teratocarcinomas e Clulas-Tronco Embrionrias
FATOR DA CLULA-TRONCO
Epitlio
aumenta a proliferao de clulas germinativas primordiais de camundongo em cultura, e essa proliferao pode ainda ser aumentada pela adio de outro fator de crescimento, o fator de inibio de leucemia (LIF). Porm, o tempo de vida dessas clulas curto e elas morrem logo. Se um regulador mittico adicional- o fator de crescimento de fibrobalsto bsico for adicionado, acontece uma mudana notvel. As clulas continuam a proliferar, produzindo uma clula-tronco embrionria pluripotente com caractersticas semelhantes s das clulas da massa celular interna (Matsui et al., 1992). Discutimos essas clulas-tronco embrionrias anteriormente, pois so as clulas que podem ser transfectadas com genes recombinantes e inseridas no blastocisto para criar camundongos transgnicos. Tal clula germinativa ou clula-tronco de mamfero contm em seu interior toda a informao necessria para o subseqente desenvolvimento. O que aconteceria se tal clula se tornasse maligna? Em um tipo de
Clulas queratinizadas
Eritrcitos
Matriz ssea
Cartilagem
Tecido conjuntivo
Epitlio queratinizante
Figura 22.5
tumor, as clulas germinativas tornam-se clulas-tronco embrionrias, tal como nos experimentos j referidos. Esse tipo de tumor chamado teratocarcinoma. Seja espontneo ou produzido experimentalmente, um teratocarcinoma contm uma populao de clulas-tronco no diferenciadas que tem propriedades bioqumicas e desenvolvimentais notavelmente semelhantes quelas das clulas da massa celular interna (Graham,
Fotomicrografia de uma seo atravs de um teratocarcinoma mostrando numerosos tipos de clulas diferenciadas. (de Gardner, 1982, fotografia de C. Graham, cortesia de R. L. Gardner.)
1977). Alm disso, essas clulas-tronco no somente se dividem, como tambm podem se diferenciar em uma grande variedade de tecidos, incluindo epitlios intestinal e respiratrio, msculos, nervos, cartilagem e osso
Insero no blastocisto
Transferncia cirrgica para a me de criao
Incorporao na massa celular interna
Isolamento da linhagem de clulas-tronco
Teratocarcinoma maligno
Figura 22.6
Mosaico Tipo selvagem
F1 onde as clulas germinativas foram derivadas do tumor
Nova linhagem formada quando foram cruzados dois camundongos F1
Protocolo para a criao de camundongos cujos genes so predominantemente derivados de clulas tumorais. Clulas-tronco foram isoladas de um teratocarcinoma de camundongo e inseridas em blastocistos de uma variedade diferente de camundongo. Os blastocistos quimricos foram colocados em uma me de criao. Se as clulas tumorais estiverem integradas no blastocisto, o camundongo que se desenvolve ter muitas de suas clulas derivadas do tumor. Se o tumor tiver dado origem s clulas germinativas, os camundongos mosaicos podem ser cruzados com camundongos normais para produzir uma gerao F1. Os animais F1 devem ser heterozigotos para todos os cromossomos das clulas tumorais. Cruzamentos entre animais F1 produzem camundongos F2 tendo alguns genes homozigotos derivados das clulas tumorais. (Segundo Stewart e Mintz, 1981.)
848
(Figura 22.5). Uma vez diferenciadas, essas clulas no podem mais se dividir e, portanto, no so malignas. Tais tumores podem dar origem maioria dos tipos de tecidos no organismo. Assim, as clulas-tronco do teratocarcinoma copiam o desenvolvimento mamfero precoce, mas o tumor que formam caracterizado por desenvolvimento randomizado, descontrolado. Em 1981, Stewart e Mintz formaram um camundongo de clulas derivadas em parte de uma clula-tronco de teratocarcinoma. Clulas-tronco que haviam surgido em um teratocarcinoma de uma va-
riedade agouti (ponta-amarela) de camundongo foram cultivadas por vrias geraes e foram vistas manter o complemento cromossmico caracterstico do camundongo ancestral. Clulas-tronco individuais desse tipo foram injetadas em blastocistos de camundongos negros. Os blastocistos foram em seguida transferidos para o tero de uma me de criao, nascendo camundongos vivos. Alguns desses tinham pelagem de duas cores, indicando que as clulas tumorais haviam se integrado no embrio. Alm disso, quando cruzado com um camundongo
portando um marcador apropriado, o camundongo quimrico foi capaz de gerar camundongos tendo parte do fentipo do tumor paterno. A clula do carcinoma embrionrio maligno tinha produzido muitos, seno todos, tipos de clulas somticas normais, e tinham mesmo produzido clulas germinativas normais, funcionais! Quando camundongos tendo uma clula tumoral para um pai foram cruzados entre si, a prole resultante continha camundongos homozigotos para um grande nmero de genes da clula tumoral (Figura 22.6).
Migrao de Clulas Germinativas em Aves e Rpteis Em aves e rpteis, as clulas germinativas primordiais so derivadas de clulas epiblsticas que migram da regio central da rea pelcida para uma zona em forma de crescente no hipoblasto na borda anterior da rea pelcida (Figura 22.7; Eyal-Giladi et al., 1981; Ginsburg e Eyal-Giladi, 1987). Essa regio extra-embrionria chamada de crescente germinativo, e as clulas germinativas primordiais a se multiplicam. Ao contrrio das PGCs em anfbios e mamferos, as clulas germinativas em aves e rpteis migram primariamente por meio da corrente circulatria (Figura 22.8). Quando os vasos sangneos se formam no crescente germinativo, as PGCs penetram nos vasos e so carreadas pela circulao para a regio onde est se formado o intestino posterior. Aqui, elas saem da circulao, associam-se ao mesentrio, e migram para os sulcos genitais (Swift, 1914; Kuwana, 1993). As PGCs do crescente germinativo parecem entrar nos vasos sangneos por diapedese, um tipo de movimento em comum de linfcitos e macrfagos que permite s clulas se espremerem entre as clulas endoteliais dos vasos sangneos menores.
Crescente germinativo
rea pelcida rea opaca Ndulo de Hensen
Figura 22.7
Vista dorsal de um embrio em estgio de linha primitiva, mostrando a regio, chamada crescente germinativo, na qual se originam as clulas germinativas. (Segundo Swift, 1914.)
849
Vaso sangneo Clulas sangneas Epitlio gonadal Clula germinativa primordial
(A)
(B)
Figura 22.8
Dessa forma, as PGCs entram no embrio sendo transportadas pelo sangue (Pasteels, 1953, Dubois, 1969). As PGCs tm tambm que saber como sair do sangue quando encontram a gnada em desenvolvimento (veja Figura 22.8B). Quando o crescente germinativo de um embrio de pinto removido, e a circulao desse embrio juntada quela de um embrio normal, as clulas germinativas primordiais do embrio normal iro migrar para ambos conjuntos de gnadas (Simon, 1960). No conhecido o que causa a atrao para os sulcos genitais. Uma possibilidade que a gnada em desenvolvimento produz uma substncia quimiottica que atrai as PGCs e as retm nos capilares limitando a gnada (Regulska, 1969). (Tais substncias so conhecidas como secretadas pelos linfcitos nos locais de infeco para atrair os macrfagos permitindo que esses passem atravs da parede capilar por diapedese.) A evidncia para essa quimiotaxia veio de estudos (Kuwana, et al., 1986) nos quais as PGCs circulantes do pinto foram isoladas do sangue e cultivadas entre rudimentos gonadais e outros tecidos embrionrios. As PGCs migraram para o interior dos rudimentos gonadais durante 3 horas de incubao. Outra possibilidade que as clulas endoteliais dos capilares gonadais tm um composto na superfcie celular que promove as PGCs aderirem especificamente a esse local. Usando anticorpos monoclonais que reconhecem diferentes molculas da superfcie celular, Auerbach e Joseph (1984) mostraram que as clulas endoteliais de vrias redes capilares tm diferentes componentes da membrana celular, e que as clulas endoteliais de capilares ovarianos diferem de todas as outras testadas.* Tanto a quimiotaxia como os mecanismos diferenciais de adeso celular podem estar atuando. Seja como for, esses fatores no so espcie-especficos. A gnada do pinto atrai as PGCs circulantes do peru e at mesmo do camundongo (Reynaud, 1969; Regulska et al., 1971). Primordiais Migrao de Clulas Germinativas Primordiais em Drosophila Durante a embriognese de Drosophila, as clulas germinativas passam do plo posterior para as gnadas. O primeiro passo uma fase passiva, na qual as clulas germinativas so deslocadas pelos movimentos das clulas embrionrias durante a gastrulao. A diferenciao do endoderma aciona o movimento amebide ativo
*Uma situao semelhante parece ocorrer quando linfcitos migram atravs da corrente sangnea e abandonam a circulao quando entram no leito capilar de um determinado rgo linfide. O mecanismo para esse alojamento e especificidade para o rgo envolvem a capacidade do linfcito de aderir especificamente s clulas endoteliais dos vasos sangneos nesses rgos. Clulas endoteliais dos ndulos linfticos perifricos contm uma glicoprotena, uma selectina, em suas membranas celulares que essencial para a ligao e sada daqueles linfcitos que podem reconhec-la. Para cada selectina nessas clulas endoteliais, existe uma molcula complementar no linfcito que pode reconhec-la (Gallatin et al., 1983, 1986).
Clulas germinativas primordiais no embrio do pinto. (A) Micrografia eletrnica de varredura de PGC de pinto em um capilar de um embrio em gastrulao. A PGC pode ser identificada pelo seu grande tamanho e as microvilosidades em sua superfcie. (B) Seo transversal prxima prospectiva regio gonadal do embrio. Vrias PGCs dentro do vaso sangneo se agregam prximo ao epitlio. Uma PGC est atravessando o endotlio da parede vascular, e outra j est localizada no interior do epitlio. (A de Kuwana, 1993, cortesia de T. Kuwana; B segundo Romanoff, 1960.)
850
(A)
(B)
(C)
Figura 22.9
Migrao de clulas germinativas em Drosophila. (A) Clulas germinativas coradas com anticorpos contra a protena Vasa mostram clulas germinativas originando do plo posterior. (B) Durante a extenso da banda germinativa, as clulas so movidas para o intestino intermedirio posterior. (C) Clulas germinativas migram atravs da parede do intestino (o embrio est contracorado para a protena Engrailed) e (D) migram em duas filas nicas atravs do mesoderma, onde (E) elas se agregam nas gnadas em desenvolvimento. (F) Processo de migrao atravs da parede intestinal, iniciado pela diferenciao endodrmica. (A-F de Warrior 1994, permisso cortesia de R. Warrior; F segundo Jaglarz e Howard, 1995.)
(D) Clulas germinativas
(E)
(F)
nas clulas germinativas promordiais, e elas viajam atravs do endotlio intestinal, migrando em direo ao mesoderma. A se dividem em dois grupos, cada qual ficando associado com um primrdio da gnada em desenvolvimento (Figura 22.9; Warrior et al., 1994). O produto do gene wuwen parece ser responsvel pelo direcionamento da migrao das PGCs do endoderma para dentro do mesoderma. Essa protena expressa no endoderma imediatamente antes da migrao da PGC, e ele repele as PGCs. Nos mutantes de perda de funo desse gene, as PGCs viajam ao acaso (Zhang et al., 1997).
Meiose
Uma vez na gnada, as clulas germinativas primordiais continuam a dividir-se mitoticamente, produzindo milhes de gametas potenciais. As PGCs de gnadas tanto masculinas como femininas enfrentam ento a necessidade de reduzir seu nmero de cromossomos da condio diplide para a haplide. Nessa ltima, cada cromossomo est representado somente uma vez, enquanto as clulas diplides tm duas cpias de cada cromossomo. Para conseguir essa reduo, as clulas germinativas masculina e feminina passam por meiose. Aps a ltima diviso meitica, ocorre um perodo de sntese de DNA, fazendo com que as clulas iniciando a meiose tenham o dobro da quantidade normal de DNA em seus ncleos. Nesse estado, cada cromossomo consiste de duas cromtides irms fixadas a um centrmero comum. (Em outras palavras, o ncleo diplide contm quatro cpias de cada cromossomo, mas os cromossomos so vistos como duas cromtides ligadas.) A meiose (mostrada na Figura 1.13) envolve duas divises celulares. Na primeira diviso, cromossomos homlogos (p.e., o par cromossmico 3
851
na clula diplide) se juntam e so ento separados em clulas diferentes. Assim, a primeira diviso meitica separa cromossomos homlogos em duas clulas-filhas de modo que cada clula tenha somente uma cpia de cada cromossomo. Porm, cada um dos cromossomos j se replicou. A segunda diviso meitica em seguida separa as duas cromtides irms uma da outra. Em conseqncia, cada uma das quatro clulas produzidas pela meiose tem uma nica cpia (haplide) de cada cromossomo. A primeira diviso meitica se inicia com uma longa prfase, que subdividida em cinco partes. Durante o estgio leptteno (do grego, fio fino), a cromatina das cromtides muito finamente esticada, e no possvel identificar os cromossomos individuais. Porm, a replicao do DNA j ocorreu, e cada cromossomo consiste de duas cromtides paralelas. No estgio zigoteno (do grego, fios juntados), os cromossomos homlogos formam pares lado a lado. Esse emparelhamento chamado sinapse sendo caracterstico da meiose, e no ocorre durante as divises mitticas. Embora o mecanismo pelo qual cada cromossomo reconhece seu homlogo no seja conhecido, o emparelhamento parece requerer a presena da membrana nuclear e a formao de uma fita protica chamada complexo sinptico. Esse complexo uma estrutura tipo escada com um elemento central e duas barras laterais (von Wettstein, 1984; Schmekel e Daneholt, 1995). A cromatina est associada com as duas barras laterais e as cromtides esto assim ligadas uma a outra (Figura 22.10). O exame do ncleo da clula meitica pelo microscpio eletrnico (Moses, 1968; Moens, 1969) sugere que os pares de cromossomos esto ligados membrana nuclear, e Comings (1968) sugeriu que o envoltrio nuclear favorece o encontro dos cromossomos homlogos. A configurao formada pelas quatro cromtides e do complexo sinptico referida como uma ttrade ou uma bivalente. Durante o prximo estgio da prfase meitica, as cromtides engrossam e se encurtam. Esse estgio foi por isso chamado de paquiteno (do grego, fio grosso). As cromtides individuais podem agora ser distinguidas sob o microscpio
Cromatina Elementos laterais (A) (B)
Filamentos transversos
Figura 22.10
O complexo sinptico. (A) cromossomos homlogos conservados juntos na primeira prfase meitica no ocito de Neottiella. (B) Diagrama interpretativo da estrutura do complexo sinptico. (A de von Wettstein, 1971, cortesia de D. von Wettstein; B segundo Schmekel e Daneholt, 1995.)
Elementos centrais Pilar Elementos laterais Cromatina
852
Figura 22.11
Quiasmas em cromossomos bivalentes dipltenos de ocitos de salamandra. Centrmeros so visveis como crculos intensamente corados; as setas apontam para os dois quiasmas. (Cortesia de J. Kezer.)
de luz, e pode ocorrer crossing-over. Esse crossing-over representa trocas de material gentico atravs do qual genes de uma cromtide so trocados por genes homlogos de outra cromtide. Esse crossing-over continua no prximo estgio, o diplteno (do grego, duplos fios). Aqui, o complexo sinptico se decompe, e os dois cromossomos homlogos comeam a se separar. Em geral, porm, eles ficam fixados em vrios lugares chamados quiasmas, os quais so considerados representar regies onde ocorre o crossing-over (Figura 22.11). O estgio diplteno se caracteriza por um alto nvel de transcrio gnica. Em algumas espcies, os cromossomos tanto de clulas germinativas masculinas como femininas assumem a aparncia de escova caracterstica de cromossomos que esto ativamente fabricando RNA. Durante o prximo estgio, diacinese (do grego se afastando), os centrmeros se afastam um do outro, e os cromossomos permanecem ligados somente nas pontas das cromtides. Esse ltimo estgio da prfase meitica termina com a desintegrao da membrana nuclear e a migrao dos cromossomos para a placa da metfase. Durante a anfase I, os cromossomos homlogos so separados um do outro de uma maneira independente. Esse estgio conduz telfase I, durante a qual so formadas duas clulas-filhas, cada uma contendo um dos parceiros do par de cromossomos homlogos. Aps uma breve intercinese, ocorre a segunda diviso da meiose, durante a qual o centrmero de cada cromossomo se divide durante a anfase fazendo com que cada uma das novas clulas obtenha uma das duas cromtides, o resultado final sendo a criao de quatro clulas haplides. Notar que a meiose tambm reagrupou os cromossomos em novos grupamentos. Cada uma das clulas haplides tem agora um sortimento diferente de cromossomos. Em humanos, nos quais h 23 diferentes pares de cromossomos, pode haver 223 (perto de 10 milhes) de diferentes tipos de clulas haplides formados do genoma de uma nica pessoa. Alm disso, os cruzamentos (crossing-over) que ocorrem durante os estgios paquiteno e diplteno da prfase I aumentam ainda mais a diversidade gentica tornando incalculvel o nmero de gametas diferentes. O mecanismo do emparelhamento homlogo desconhecido. Pensa-se que os primeiros eventos envolvam a procura por regies homlogas de cromatina e que esse processo possa utilizar enzimas reparadoras de DNA (Baker et al., 1996). Mutantes de camundongo carentes de tais enzimas de reparo tm sinapses anormais. Aps o alinhamento das regies homlogas, a sinapse iniciada em regies localizadas. Em Drosophila, evidncia recente sugere que as sinapses so iniciadas em regies de heterocromatina (Dernburg et al., 1996). Alm disso, interaes entre a protena Mei-S332 e a heterocromatina rodeando o cinetocentro so crticas para manter as cromtides irms juntas (Karpen et al, 1995, 1996; Kerrebrock et al. 1995). O gene para a protena Mei-S332 foi encontrado selecionando-se mutaes para incapacidade de completar a meiose. Nesses mutantes, as cromtides irms separam-se precocemente durante 90 porcento do tempo. Em vertebrados, a protena Rad51 corresponde aos elementos laterais do complexo sinptico e parece mediar o emparelhamento dos homlogos (Ashley et al., 1995). Ao fim da meiose, essa protena est localizada somente em stios onde ainda esto fixados os homlogos. Seria importante saber como essas e outras protenas interagem durante a gametognese humana, j que a maioria dos eventos no disjuncionais (como aqueles levando trissomias) so considerados defeitos do pareamento meitico (veja Yoon et al., 1996).
853
&
Especulaes
Grandes Decises: Mitose ou Meiose? Espermatozide ou vulo?
M MUITAS ESPCIES, as clulas
(A) Gnada intacta Regio de meiose Zona de transio Regio de mitose
germinativas migrando para o interior das gnadas so bipotenciais e podem diferenciar-se em espermatozides ou vulos, conforme seu ambiente gonadal. Quando ovrios de salamandras so transformados experimentalmente em testculos, as clulas germinativas residentes cessam sua diferenciao oognica e comeam a desenvolver-se em espermatozide (Burns, 1930; Humphrey, 1931). Da mesma maneira, na mosca domstica e no camundongo, a gnada pode direcionar a diferenciao da clula germinativa (McLaren, 1983; Inoue e Hiroyoshi, 1986). Assim, na maioria dos organismos, o sexo das gnadas e de suas clulas germinativas o mesmo. Porm, o que se passa em animais hermafroditas, nos quais a mudana de produo de espermatozide para produo de vulos um evento fisiolgico que ocorre naturalmente? Como pode o mesmo animal ser capaz de produzir espermatozide durante parte de sua vida e ocitos durante outra? Usando Caenorhabditis elegans, Kimble e seus colegas identificaram duas decises que clulas germinativas presumveis tm que fazer. A primeira envolve a deciso de entrar em meiose ou permanecer uma clula-tronco dividindo-se mitoticamente. A segunda se a clula meitica ir se converter em um vulo ou um espermatozide. Evidncia recente mostra que essas decises esto intimamente ligadas. A deciso mittica/meitica controlada por uma nica clula que no se divide, no terminal de cada gnada, a clula da extremidade distal. Os precursores das clulas germinativas prximos dessa clula dividem-se mitoticamente formando o reservatrio de clulas germinativas, mas medida que essas clulas se afastam da clula da extremidade distal, elas entram em meiose. Se as clulas da extremidade distal forem destrudas por um feixe focalizado de raio laser, todas as clulas germinativas entram em meiose, e se a clula da extremidade distal for colocada em um local diferente na gnada, clulas-
Clula da extremidade distal (B) Clula da extremidade distal removida Todas clulas sofrem meiose
Figura 22.12
(C) MITOSE
Regulador terminal para mitose
Trajetria da determinao sexual
OOGNESE
ESPERMATOGNESE
tronco da linhagem germinativa sero produzidas perto dessa nova posio (Figura 22.12; Kimble, 1981; Kimble e White, 1981). Parece que as clulas da extremidade distal secretam alguma substncia que mantm essas clulas em mitose e inibe sua diferenciao meitica. Austin e Kimble (1987) isolaram uma mutao que mimetiza o fentipo obtido quando as clulas da extremidade distal so removidas. Todos os precursores das clulas germinativas de nematides homozigotos para a mutao recessiva glp-1 iniciam a meiose, no deixando populao mittica. Em lugar das 1500 clulas germinativas geralmente encontradas no quarto estgio larval do desenvolvimento hermafrodito, esses mutantes
Regulao da deciso meiose-mitose pela clula da extremidade distal do ovo-teste de C. elegans. (A) Gnada intacta no incio do desenvolvimento com regies de mitose (clulas sombreadas) e meiose. (B) Gnadas aps ablao por laser da clula da extremidade distal. Todas as clulas germinativas entram em meiose. (C) Modelo para as interaes pelas quais clulas germinativas adotam um destino nico. O gene gld-1 est ativo (e ocorre oognese) a no ser que seja inibido ou pelo sinal mittico (se a clula for ativada por GLP-1) ou pelo sinal espermatognico (se os genes da determinao sexual como tra-1 e fem-3 estiverem ativos). O sinal mittico pode inibir tanto o sinal oognico (GLD-1) como o sinal espermatognico (FOG-1, FOG-3). Ambos sinais inibem o sinal mittico, e o sinal espermatognico pode inibir o sinal oognico. A mitose promovida pela ativao de GLP-1 da clula germinativa, enquanto a trajetria da determinao sexual pode ativar os genes fog-1 e fog-3. (C segundo Ellis e Kimble, 1995.)
produzem somente de 5 a 9 clulas espermticas. Quando so produzidas quimeras genticas nas quais so encontrados precursores de clulas germinativas do tipo selvagem em larvas mutantes, as clulas do tipo selvagem so capazes de responder s clulas da extremidade distal e sofrer mitose. Porm, quando precursores de clulas germinativas mutantes so encontrados em
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(A) Tipo selvagem: Espermatozides e ocitos
Espermateca (regio de armazenagem de espermatozide)
Espermatozides Primeiro ocito maduros Estgios precoces da espermatognese (B) Feminilizado: Somente ocitos
Espermateca (vazia)
Primeiro ocito
(C) Masculinizado: Somente espermatozides
Espermateca
Espermatozide maduro
Figura 22.13
Estgios precoces da espermatognese
Gnadas de C. elegans tipo selvagem e mutante. (A) Hermafrodita tipo selvagem produzindo primeiro espermatozides e em seguida vulos. (B) Animal fmea produzido por mutao fem1 produz somente vulos. (C) Hermafrodita masculinizado produzido por mutaes de perda-defuno de genes mog (ou mutaes do 3UTR de fem-3) produz somente espermatozides. (Fotografia cortesia de J. Kimble.)
larvas do tipo selvagem, essas entram em meiose. Assim, o gene glp-1 parece ser responsvel pela capacitao de clulas germinativas responderem ao sinal das clulas da extremidade distal.* Aps as clulas comearem suas divises meiticas, ainda precisam transformarse em espermatozide ou vulo. Geralmen* O gene glp-1 parece estar envolvido em vrias interaes indutivas em C. elegans. Deve ser relembrado que glp-1 tambm necessitado pelo blastmero AB para receber os sinais indutivos do blastmero EMS para formar os msculos farngeos (veja Captulo 13).
te, em cada ovrio/testculo, as clulas germinativas mais prximas produzem espermatozide, enquanto as mais distantes (perto da extremidade) tornam-se vulos (Hirsch et al., 1976). A gentica dessa mudana est atualmente sendo analisada. Conforme discutido no Captulo 20, os genes para a determinao sexual geram ou um corpo feminino funcionalmente hermafrodita ou um corpo masculino. Na linhagem germinativa, o caminho da determinao sexual ativa ou reprime certos genes que so crticos para as clulas se transformarem em vulo ou espermatozi-
de. Por exemplo, mutantes homozigotos mog (masculinizao da linhagem germinativa) se desenvolvem como machos produtores de espermatozide, e mutantes homozigotos fem-1 desenvolvem-se como fmeas produtoras de vulos (Figura 22.13). Os mutantes duplos homozigotos tanto para tra-1 como para fem-1 tm um nico fentipo. Eles so somaticamente machos, mas so fmeas na linhagem germinativa (Doniach e Hodgkin, 1984). Isso sugere que tra-1 o gene chave na determinao sexual dos tecidos somticos, mas que os genes fem so responsveis pela deciso espermatozide/ocito (Figura 22.14). Os laboratrios de Hodgkin (1985) e Kimble (1986) isolaram vrios genes necessrios para a seleo do caminho da clula germinativa. A Figura 22.14 apresenta um esquema de como esses genes podiam funcionar na mudana de formao de espermatozide para a formao de ocito. Durante o desenvolvimento precoce, os genes fem, em especial fem-3, so crticos para a especificao das clulas espermticas. Mutaes de perda-de-funo desses genes convertem nematides XX em fmeas (i.e., hermafroditas sem espermatozide). Enquanto so produzidas protenas FEM nas clulas germinativas, so produzidos espermatozides. Os genes fem ativos so considerados ativar os genes fog (cujas mutaes de perda-de-funo causam a feminizao da linhagem germinativa e eliminam a espermatognese). Os produtos do gene fog ativam os genes envolvidos na transformao da clula germinativa em espermatozide e tambm inibem aqueles genes que iriam de outra maneira dirigir as clulas germinativas para iniciar a oognese. A oognese pode comear somente quando a atividade fem suprimida. Essa supresso parece atuar ao nvel da traduo do RNA. A regio 3 no-traduzida (3UTR) do mRNA de fem-3 contm uma seqncia que liga um repressor durante o desenvolvimento normal. Se essa regio mudada de maneira que a protena repressora no pode se ligar, o mRNA de fem-3 permanece traduzvel, e a oognese nunca ocorre. O resultado um corpo de hermafrodita que somente produz espermatozide (Ahringer e Kimble, 1991; Ahringer et al., 1992). O fator de represso que age no trans ainda no foi identificado, mas provavelmente o produto de um dos genes mog (Graham e Kimble, 1993). Pensa-se que protenas ou mensagens estocadas no
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(A) Determinao sexual somtica
Figura 22.14
baixo ALTO
ALTO baixo
baixo ALTO
ALTO baixo
baixo ALTO
ALTO baixo
(B) Determinao sexual da linhagem germinativa
Modelo da determinao sexual na linhagem germinativa de hermafroditas de C elegans, baseado na anlise de mutaes. (A) Determinao sexual em tecidos somticos, mostrando uma hierarquia de regulao negativa. (B) Controle da determinao sexual na linhagem germinativa. Os genes fog-2 e mog-1 regulam a determinao sexual na linhagem germinativa. Os genes fog-1 e fog-3 agem a jusante para iniciar a espermatognese. (Segundo Ellis e Kimble, 1995.)
baixo precoce baixo tardio ALTO
ALTO ALTO baixo
ALTO baixo ALTO
baixo ALTO baixo
ALTO baixo ALTO
ESPERMATOZIDES OCITOS ESPERMATOZIDES
ocito podem controlar o momento desse processo, fazendo com que a espermatognese ocorra enquanto h repressores da expresso de mog. Quando esses inibidores maternos da expresso de mog decaem, as protenas MOG tornam-se capazes de inibir a sntese das protenas FEM, com isso
mudando a gametognese de espermatozide para vulos. Um outro gene gld-1 (defeituoso no desenvolvimento da linhagem germinativa) essencial para que a oognese ocorra. A entrada de ocitos presuntivos na via meitica correlacionase com um dramtico aumento de GLD-1.
Em mutantes de perda-de-funo para gld1, a oognese est ausente e as clulas da linhagem germinativa continuam a proliferar formando tumores (Francis et al., 1995; Jones et al., 1996). Em Drosophila, as clulas germinativas so instrudas pelas clulas gonadais, para se diferenciarem em espermatozide ou vulo. As clulas gonadais femininas produzem um produto que recebido pela clula geminativa e que ativa uma srie de protenas cuja atividade essencial para a transcrio precoce do gene Sxl da clula germinativa. Uma razo apropriada X: autossomo tambm necessria. Por esse mecanismo, as moscas XX acabam produzindo vulos, enquanto as moscas XY produzem espermatozide (Burtis, 1993, Oliver et al., 1993).
Espermatognese
A espermatognese a produo de espermatozide pelas clulas germinativas primordiais. Uma vez que as clulas germinativas primordiais de mamferos chegam no sulco genital dos embries masculinos, elas se incorporam s cordas sexuais. A permanecem at a maturidade quando as cordas sexuais tornam-se ocas para formar os tbulos seminferos, e o epitlio dos tbulos se diferencia em clulas de Sertoli. Durante sua vida, um homem pode produzir de 1012 a 1013 gametas (Reijo et al., 1995). As clulas espermticas so ligadas s clulas de Sertoli por molculas de N-caderina em suas respectivas superfcies celulares, e por molculas de galactosil-transferase nas clulas espermatognicas que ligam um receptor nas clulas de Sertoli (Newton et al., 1993; Pratt et al., 1993.) As clulas de Sertoli alimentam e protegem as clulas espermticas em desenvolvimento, e espermatognese - a via de desenvolvimento da clulatronco espermatognia at o espermatozide maduro ocorre nos recessos das clulas de Sertoli (Figura 22.15). Os processos pelos quais as PGCs produzem espermatozide foram estudados em detalhe em vrios organismos, mas enfocaremos aqui a espermatognese em mamferos. Aps atingir a gnada, as PGCs se dividem para formar espermatognias tipo A1. Essas clulas so menores que as PGCs e so caracterizadas por um ncleo ovide que contm cromatina associada com a membrana nuclear. As espermatognias A1 so encontradas adjacentes membrana basal externa das cordas sexuais. Na maturidade, essas espermatognias so consideradas dividir-se para produzir uma outra espermatognia tipo A1, assim como um tipo de clula mais plida, a espermatognia tipo A2. Assim, cada espermatognia tipo A1 uma clula-tronco capaz de se regenerar assim como produzir um novo tipo de clula. A espermatognia tipo A2 se divide para produzir a espermatognia tipo A3, que produz
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Lmem do tbulo
Espermtides Corpo residual
Espermatcito secundrio
Espermatcito primrio
Espermatognia Tipo A1
Clula de Sertoli
Espermatognia Tipo A2
Espermatognia Tipo B
Figura 22.15
Desenho de uma seo do tbulo seminfero, mostrando a relao entre clulas de Sertoli e o espermatozide em desenvolvimento. medida que as clulas amadurecem, elas progridem em direo ao lmen do tbulo seminfero. (Segundo Dym, 1977.)
a espermatognia tipo A4. possvel que cada tipo de espermatognia A seja uma clula-tronco capaz de auto-renovao. A espermatognia A4 tem trs opes. Ela pode formar outra A4 (auto-renovao); pode apresentar morte celular (apoptose), ou pode diferenciar-se na primeira clula-tronco comprometida, a espermatognia intermediria. Essas esto comprometidas a se tornarem espermatozide e se dividem uma vez para formar as espermatognias tipo B. Essas clulas so os precursores dos espermatcitos e so as ltimas clulas a sofrerem mitose. Essas clulas dividem uma vez, gerando os espermatcitos primrios - as clulas que entram em meiose. No conhecido o que faz com que as espermatognias tomem o caminho da diferenciao em lugar da auto-renovao; tambm no conhecido o que estimula as clulas a entrar em diviso meitica em vez de mittica (Dym, 1994). Examinando a Figura 22.16, vemos que durante as divises espermatognicas, a citocinese no completa. Antes, as clulas formam um sinccio pelo qual cada clula se comunica com a outra atravs de pontes citoplamticas de cerca de 1 m de dimetro (Dym e Fawcett, 1971). As sucessivas divises produzem clones de clulas interconectadas, e como ons e molculas passam facilmente por essas pontes intercelulares, cada grupo amadurece sincronicamente. Cada espermatcito primrio sofre a primeira diviso meitica para fornecer um par de espermatcitos secundrios, que completam a segunda diviso da meiose. As clulas haplides formadas so chamadas espermtides e ainda esto conectadas uma a outra por pontes citoplasmticas. Essas espermtides tm ncleos haplides mas so funcionalmente diplides, j que o produto gnico formado em uma clula pode facilmente se difundir para o citoplasma de suas vizinhas (Braun et al., 1989). Durante as divises de espermatognias tipo A1 at a espermtide, as clulas se distanciam mais e mais da membrana basal do tbulo seminfero e se aproximam de seu lmen (veja Figura 22.15). Assim, cada tipo de clula pode ser encontrado em uma camada particular do tbulo. As espermtides esto localizadas na margem do lmen,
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Espermatognia tipo A1
Mais espermatognia tipo A1 ou
Figura 22.16
Espermatognias tipo A2 Espermatognias tipo A 3
Formao de clones sinciciais de clulas germinativas masculinas humanas. (Segundo Bloom e Fawcett, 1975.)
Espermatognias tipo A 4
Espermatognias intermedirias Espermatognias tipo B Espermatcitos primrios (1a diviso meitica) Espermatcitos secundrios (2a diviso meitica) Pontes citoplasmticas
Espermtides
Corpos residuais
Clulas espermticas
aqui perdendo duas conexes citoplasmticas e diferenciando-se em clulas espermticas. Em humanos, a progresso da clula-tronco espermatognica at o espermatozide maduro demora 65 dias (Dym, 1994). Espermiognese A espermtide haplide uma clula redonda no-flagelada que no se parece em absoluto com o espermatozide maduro dos vertebrados. O prximo passo na maturao do espermatozide, portanto, a espermiognese (ou espermateliose), a diferenciao da clula espermtica. Para que a fecundao possa ocorrer, o espermatozide ter que encontrar e ligar-se ao vulo; a espermiognese diferencia o espermatozide para essas funes de motilidade e interao. Os processos da diferenciao do espermatozide mamfero podem ser vistos na Figura 4.2. O primeiro passo envolve a construo da vescula acrossmica a partir do aparelho de Golgi. O acrossomo forma uma coroa que cobre o ncleo espermtico. medida que a coroa formada, o ncleo gira fazendo com que a coroa acrossmica fique de frente para a
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membrana basal do tbulo seminfero. Essa rotao necessria porque o flagelo est comeando a se formar do centrolo do outro lado do ncleo, e esse flagelo ir se estender para o interior do lmen. Durante o ltimo estgio da espermiognese, o ncleo se achata e se condensa, o citoplasma remanescente (a gotcula citoplasmtica) descartado, e as mitocndrias formam um anel em volta da base do flagelo. O espermatozide resultante penetra em seguida no lmen do tbulo. No camundongo, o integral desenvolvimento da clula-tronco at o espermatozide leva 34.5 dias. Os estgios espermatognicos duram 8 dias, a meiose 13 dias, e a espermiognese gasta mais 13.5 dias. Em seres humanos, o desenvolvimento espermtico perto de duas vezes mais longo. Como as espermatognias do tipo A1 so clulas-tronco, a espermatognese pode ocorrer continuamente. Cada dia, perto de 100 milhes de espermatozides so produzidos em cada testculo humano, e cada ejaculao liberta cerca de 200 milhes de espermatozides. Quando no usado, esses so reabsorvidos ou eliminados do organismo pela urina.
Expresso Gnica Durante o Desenvolvimento do Espermatozide

Expresso Gnica Antes da Meiose Masculina A expresso gnica no espermatozide estgio-especfica, e mesmo as clulas haplides so aptas a sintetizar certos produtos. A iniciao da espermatognese na puberdade provavelmente regulada pela sntese de BMP8B pelas espermatognias. Quando BMP8B atinge uma concentrao crtica, as espermatognias podem se diferenciar em espermtides redondas. Essas clulas produzem altos nveis de BMP8B, que podem estimular as espermatognias a se diferenciarem. Camundongos carentes de BMP8B no iniciam a espermatognese na puberdade (Zhao et al., 1996). Em humanos, o gene DAZ localizado no brao longo do cromossomo Y est deletado em muitos homens infrteis, muitos dos quais no produzem espermatozide algum. O gene DAZ expresso exclusivamente em clulas germinativas masculinas, especialmente nas espermatognias, e parece codificar uma protena ligante de RNA (Reijo et al., 1995; Menke et al., 1997). DAZ homlogo de dois genes da Drosophila, Rb97D e boule, os quais tambm codificam protenas ligantes de RNA, e ambos so essenciais para a espermatognese. Espermatognias se degeneram em moscas masculinas deficientes em Rb97D, enquanto as clulas germinativas de moscas carentes do gene boule no entram em meiose (Karsch-Mizrachi e Haynes, 1993; Eberhart et al., 1996). Protenas ligantes de RNA so crticas na espermatognese porque muitos dos genes expressos no espermatozide so regulados no nvel da traduo (Schfer et al., 1995). Realmente, em alguns animais, muito da espermatognese ocorre na ausncia de transcrio de novos genes. A sntese de protamina, a protena bsica que substitui as histonas no ncleo espermtico haplide do espermatozide, regulada pela fosforilao de uma protena ligante de 18-kDa que reconhece a regio 3 no-traduzida da mensagem protamina do camundongo (Kwon e Hecht, 1993). Em Drosophila, o gene roughex transcrito por espermatognias de Drosophila pr-meitica controla o nmero de divises meiticas. Machos carentes de cpias funcionais do gene roughex sofrem uma metfase meitica extra em adio s duas normais. O aumento da concentrao de Roughex resulta na incapacidade de executar meiose II (Gnczy et al., 1994). Expresso Gnica durante a Meiose Masculina Muito da transcrio gnica durante a espermatognese ocorre durante o estgio diplteno da prfase meitica. Os genes que so transcritos especificamente durante a espermatognese so freqentemente aqueles cujos produtos so necessrios para motilidade do espermatozide ou sua fixao ao vulo. Em Drosophila melanogaster, um dos genes especficos do espermatozide transcrito aquele para a 2-tubulina. Essa isoforma da tubulina vista somente durante a espermatognese, e responsvel pela formao de fusos meiticos, do axonema e dos microtbulos associados com as mitocndrias em processo de extenso.* Hoyle e Raff (1990) mostraram que uma outra isoforma da tubulina, a 3tubulina (que normalmente expressa em clulas mesodrmicas e na epiderme), no pode substituir a 2-tubulina.. Quando os autores fundiram a regio regulatria 5 do gene da 2-tubulina com a seqncia codificadora do gene da 3-tubulina, esse gene pde ser expresso no espermatozide em desenvolvimento. Quando esse gene foi expresso na ausncia do gene da 2tubulina, as clulas germinativas resultantes no sofreram meiose, reunio de axonemas, ou conformao nuclear. Somente ocorreu a extenso mitocondrial. Isso indica que a formao dos fusos meiticos e do axonema de clulas espermticas no
* A confeco do axonema espermtico em Drosophila uma tarefa de monta. A cauda do espermatozide tem 2 mm de extenso to comprida quanto a mosca masculina inteira. O espermatozide da espcie relacionada D. bifurca, de 58.3 mm de comprimento, aproximadamente 20 vezes mais longo que as moscas que o produzem. notvel que o ovo de D. melanogaster incorpora todo o espermatozide (Karr, 1991). Somente cerca de 3 mm do espermatozide de D. bifurca incorporado pelo ovo (Pitnick et al., 1995).
&
Especulaes

conseguida por qualquer tubulina e que a transcrio de suas isoformas especficas do espermatozide importante. Os genes cujos produtos so necessrios para ligao do espermatozide e das matrizes extracelulares do vulo so tambm transcritos durante a espermatognese. O gene da bindina do ourio-domar transcrito relativamente tarde na espermatognese e seu mRNA traduzido em bindina logo aps ser produzido (Nishioka et al., 1990). A bindina se acumula em vesculas que se fundem para formar a vescula acrossmica nica no espermatozide maduro do ourio-domar. A Figura 22.17 mostra a localizao da protena bindina na vescula acrossmica do espermatozide enquanto esse ainda est nos testculos. Expresso Gnica Haplide em Espermatcitos. Alm da transcrio de genes em clulas diplides durante a prfase meitica, certos genes so transcritos na espermtide (revisado por Palmiter et al., 1984). Essa evidncia para expresso gnica haplide vem de estudos envolvendo camundongos heterozogotos nos quais so vistas duas populaes diferentes de espermatozide uma expressando o fentipo mutante, e outra expressando a caracterstica tipo selvagem. Se a sntese do RNA ou da protena ocorresse enquanto as clulas ainda fossem diplides, todo o espermatozide apresentaria o mesmo fentipo. Transcries do gene para a protamina so vistas nas clulas haplides precoces (espermtides redondas) embora sua traduo seja retardada por vrios dias (Peschon et al., 1987). O gene para a 1, 4-galactosiltransferase que liga o espermatozide zona pelcida somente transcrito durante a fase haplide da maturao do espermatozide do camundongo (Hardvin-Lepers et al., 1993). Esses genes expressos no estgio haplide podem ser regulados pelo hormnio estimulador de folculos da glndula pituitria (Foulkes et al. 1993; Blendy et al.,1996; Nantel et al., 1996).*
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para o alelo mutante, leva a embries normais. Um desses genes de efeito paterno o spe-11 em C. elegans. Os espermatozides contendo alelos mutantes nesse loco so incapazes de direcionar movimentos cromossmicos que orientam o fuso mittico do embrio, sugerindo que a mutao afeta as regies organizadoras dos microtbulos, tais como os centrolos (Figura 22.18; Hill et al., 1989). Mutaes de efeito paterno foram identificadas em Drosophila e essas podem tambm envolver a estrutura do fuso mittico do zigoto (Karr, 1996). [fert10.html] Expresso Gnica Terminal Por fim, o genoma haplide condensado medida que as histonas so substitudas por protaminas ou histonas especificamente modificadas. Muitas histonas do espermatozide so modificadas no estgio de espermtide tardia da espermiognese. Essas modificaes (tal como a desfosforilao das regies N-terminais de certas histonas causam a condensao da cromatina), que resulta em severa reduo da transcrio. Assim, a transcrio do genoma masculino no detectada novamente at ser reativada algum tempo durante o desenvolvimento (Poccia,1986; Green e Poccia, 1988).
Figura 22.17
Localizao de bindina no acrossomo do espermatozide, por meio de anticorpos antibindina marcados com ouro. Os tomos de ouro permitem aos anticorpos aparecerem como pontos negros na micrografia eletrnica. Esses espermatozides ainda esto no interior dos testculos do ourio-do-mar. (Cortesia de D. Nishioka.)
Genes de Efeito Paterno Em algumas espcies, o espermatozide fornece importante informao desenvolvimental que no pode ser compensada pelo vulo. J discutimos a impresso (imprinting) de cromossomos de mamferos no qual o DNA do espermatozide e do vulo diferem nos seus padres de metilao (veja Captulos 4 e 11). Existem tambm casos de genes de efeito paternos. Aqui, alelos homozigotos recessivos no macho causam desenvolvimento anormal no embrio, mesmo se a fmea for homozigota para o alelo de tipo selvagem, enquanto o cruzamento recproco, no qual o pai do tipo selvagem e a me homozigota
(A)
(B)
Figura 22.18
* Esse mecanismo parece indevidamente complexo. Os genes ps-meiticos parecem ser regulados pelo fator de transcrio CREM. Esse gene para o fator de transcrio, o modulador do elemento responsivo ao AMP-cclico transcrito durante a espermatognese precoce, mas a mensagem decai rapidamente. A protena que produz, inibe a transcrio de dois genes ps-meiticos. Porm, a recepo de FSH pelas clulas meiticas causa a emenda alternativa do precursor do mRNA de CREM, fazendo com que ele se torne uma mensagem estvel para uma isoforma ativadora da molcula. O direcionamento para o alvo do gene CREM de camundongo resulta na ausncia da expresso gnica ps-meitica e na morte dos espermatcitos.
Fotomicrografias imunofluorescentes de fusos mitticos no embrio de primeira clivagem de C. elegans quando o espermatozide (A) de um macho tipo selvagem e (B) de um macho homozigoto para o gene spe-11 de efeito paterno. Em (B), trs centrolos organizadores de microtbulos podem ser vistos em lugar dos dois plos mitticos usuais. (De Hill et al., 1989, cortesia de S. Strome.)
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Oognese
Meiose oognica Oognese - a diferenciao do vulo- difere de vrias maneiras da espermatognese. Enquanto o gameta formado pela espermatognese essencialmente um ncleo mvel, o gameta formado pela oognese contm todos os fatores necessrios para iniciar e manter o metabolismo e o desenvolvimento. Portanto, alm de formar um ncleo haplide, a oognese tambm constri um reservatrio de enzimas citoplasmticas, mRNAs, organelas e substratos metablicos. Enquanto o espermatozide torna-se diferenciado para motilidade, o ocito desenvolve um citoplasma notavelmente complexo. Os mecanismos da oognese variam mais que os da espermatognese. Essa diferena no deve surpreender, j que os padres de reproduo variam extremamente entre espcies. Em algumas espcies, tais como os ourios-do-mar e as rs, a fmea rotineiramente produz centenas ou milhares de vulos de uma vez, enquanto em outras espcies, como nos seres humanos e na maioria dos mamferos, somente so produzidos alguns vulos durante a vida de um indivduo. Nas espcies que produzem milhares de vulos, as oognias so clulas-tronco auto-renovveis que perduram durante a vida do organismo. Nas espcies que produzem menos vulos, as oognias se dividem para formar um nmero limitado de clulas precursoras de vulos. Em humanos, as mil, ou coisa assim, oognias dividem-se rapidamente do segundo ao stimo ms da gestao para formar cerca de 7 milhes de clulas germinativas (Figura 22.19). Aps o stimo ms do desenvolvimento, porm, o nmero de clulas germinativas decresce abruptamente. A maioria das oognias morre durante esse perodo, enquanto as oognias remanescentes entram na prfase da primeira diviso meitica (Pinkerton et al., 1961). Essas clulas tardias, chamadas de ocitos primrios, progridem atravs da primeira prfase meitica at o estgio diplteno, no qual so mantidas at a puberdade. Com o advento da adolescncia, grupos de ocitos periodicamente reiniciam a meiose. Assim, na fmea humana, a primeira parte da meiose iniciada no embrio, e o sinal para reiniciar a meiose no dado antes de decorridos cerca de 12 anos. Na realidade, alguns ocitos so mantidos em prfase meitica por perto de 50 anos. Como indicado na Figura 12.19, ocitos primrios continuam a morrer mesmo aps o nascimento. Dos milhes de ocitos primrios presentes na ocasio do nascimento, somente cerca de 400 amadurecem durante a vida da mulher.
Nmero de clulas germinativas x 106
Meses antes da concepo
Nascimento
Anos aps o nascimento
Figura 22.19
Mudanas no nmero de clulas germinativas no ovrio humano. (Segundo Baker, 1970.)
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Figura 22.20
Formao do corpo polar no ocito do peixe branco Coregonus. (A) Anfase da primeira diviso meitica, mostrando o primeiro corpo polar comprimindo-se com seus cromossomos. (B) Metfase (no interior do ocito, seta) da segunda diviso meitica, com o primeiro corpo polar ainda no seu lugar. O primeiro corpo polar pode ou no dividir-se novamente. (de Swanson et al., 1981, cortesia de C. P. Swanson.)
A meiose oognica tambm difere da espermatognese na sua colocao na placa metafsica. Quando o ocito primrio se divide, o seu ncleo, chamado de vescula germinativa, se desintegra e o fuso metafsico migra para a periferia da clula. Na telfase, uma das duas clulas-filhas contm praticamente nada de citoplasma, enquanto a outra tem quase a totalidade do volume dos constituintes celulares (Figura 22.20). A clula menor chamada de primeiro corpo polar, e a clula maior referida como o ocito secundrio. Durante a segunda diviso da meiose, ocorre uma citocinese semelhante. A maior parte do citoplasma retida pelo vulo maduro e o segundo corpo polar recebe pouco mais que um ncleo haplide. Assim, a meiose oognica serve para conservar o volume do citoplasma do ocito em uma nica clula em lugar de dividi-lo igualmente entre quatro prognies. Em algumas espcies de animais, a meiose severamente modificada fazendo com que o gameta resultante seja diplide e no necessite ser fertilizado para se desenvolver. Tais animais so ditos ser partenogenticos. Na mosca Drosophila mangabeirai, um dos corpos polares atua como espermatozide e fecunda o ocito aps a segunda diviso meitica. Em outros insetos (como a Moraba virgo) e o lagarto Cnemidophorus uniparens, a oognia duplica seu nmero de cromossomos antes da meiose, a fim de que a diviso dos cromossomos restaure o nmero diplide. As clulas germinativas do gafanhoto Pycnoscelus surinamensis dispensam a meiose por completo, formando vulos diplides atravs de duas divises mitticas (Swanson et al., 1981). Nos exemplos precedentes, as espcies consistem inteiramente de fmeas. Em outras espcies, a partenognese haplide largamente empregada no somente como um meio de reproduo, mas tambm como um meio de determinao sexual. Nos Himenpteros (abelhas, vespas e formigas), ovos no-fertilizados desenvolvem-se em machos, enquanto ovos fertilizados, sendo diplides, desenvolvem-se em fmeas. Os machos haplides so capazes de produzir espermatozide abandonando a primeira diviso meitica, com isso formando duas clulas espermticas atravs da segunda meiose. Maturao do Ocito em Anfbios O ovo responsvel pela iniciao e direcionamento do desenvolvimento, e em algumas espcies (conforme visto anteriormente), a fecundao nem necessria. O material acumulado no citoplasma do ocito inclui fontes de energia e organelas (o vitelo e as mitocndrias); as enzimas e precursores para sntese de DNA, RNA e protenas; RNAs mensageiros armazenados; protenas estruturais; e fatores reguladores morfogenticos que controlam a embriognese precoce. Um catlogo parcial dos materiais armazenados no citoplasma do ocito mostrado na Tabela 22.1. A maior parte dessa acumulao ocorre durante a prfase meitica I, e esse estgio freqentemente subdividido em fases pr-vitelognica (do grego, antes da formao do vitelo) e vitelognica (formadora de vitelo). Ovos de peixes e anfbios so derivados de uma populao de clulas-tronco oognias que pode gerar um novo grupo de ocitos cada ano. Na r Rana pipiens, a oognese dura trs anos. Durante os dois primeiros anos, o ocito aumenta de tamanho gradualmente. Durante o terceiro ano, porm, o rpido acmulo de vitelo no ocito faz com que o vulo inche, atingindo seu caracterstico tamanho grande (Figura 22.21). Os vulos amadurecem em grupos anualmente, o primeiro grupo amadurece pouco aps a metamorfose; o prximo grupo amadurece um ano depois.
(A)
(B)
Tabela 22.1 Componentes celulares armazenados no ocito maduro de Xenopus laevis

Excesso aproximado em relao quantidade existente em clulas larvais 100.000 60.000 100.000 100.000 200.000 10.000 15.000 2.500
Componente
Mitocndria RNA polimerases DNA polimerases Ribossomos tRNA Histonas Deoxirribonucleosdeo trifosfatos
Fonte: Segundo Laskey, 1979.
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Figura 22.21
Crescimento de ocitos na r. Durante os trs primeiros anos de vida so produzidos trs grupos de ocitos. Os desenhos seguem o crescimento dos ocitos da primeira gerao. (Segundo Grant, 1953.)
Primeiro grupo
Dimetro (mm)
Fase vitelognica
Fase pr-vitelognica
Segundo grupo Terceiro grupo
Primavera
Primavera
Primavera
Inverno
Inverno
Outono
Outono
Vero
Vero
Primeiro ano
Segundo ano
Terceiro ano
A vitelognese ocorre quando o ocito alcana o estgio diplotnico da prfase meitica. O vitelo no uma substncia nica, mas uma mistura de materiais usados para a nutrio do embrio. O principal componente do vitelo uma protena de 470kDa, chamada vitelogenina. Essa no produzida no ocito da r (como so as principais protenas do vitelo de organismos tais como os aneldeos e o lagostim), mas sintetizada no fgado e levada pela corrente sangnea at o ovrio (Flickinger e Rounds, 1956). Essa grande protena passa entre as clulas foliculares do ovrio e incorporada ao ocito por micropinocitose, o desligamento de vesculas envoltas pela membrana na base das vilosidades (Dumont, 1978). No ocito maduro, a vitelogenina cindida em duas protenas menores: a altamente fosforilada fosvitina e lipoprotena lipovitelina. Essas duas protenas esto acondicionadas juntas em plaquetas do vitelo envoltas pela membrana (Figura 22.22A). Grnulos de glicognio e incluses lipocondriais armazenam o carboidrato e os componentes lipdicos do vitelo, respectivamente. A maioria dos vulos so altamente assimtricos, e durante a oognese que o eixo animal-vegetal do vulo especificado. Danilchik e Gerhart (1987) mostraram que embora a concentrao de vitelo em ocitos de Xenopus aumente cerca de 10 vezes medida que vai do plo animal para o plo vegetal do ovo maduro, a captao de vitelogenina uniforme na superfcie do ocito. O que difere seu movimento dentro do ocito, que depende do local onde se deu a entrada das protenas vitelnicas. Quando as plaquetas do vitelo so formadas no futuro hemisfrio animal, movimentam-se em direo ao centro da clula. As plaquetas do vitelo vegetal, porm, no se movem ativamente, permanecendo na periferia por muito tempo, a aumentando de tamanho. Elas so depois deslocadas lentamente do crtex medida que novas plaquetas entram da superfcie. Como um resultado desse transporte intracelular diferenciado, a quantidade de vitelo aumenta regularmente no hemisfrio vegetal, at que a metade vegetal do ocito maduro de Xenopus contenha perto de 75% do vitelo (Figura 22.22B-E). O mecanismo dessa translocao permanece desconhecido.
Vero
Outono
Inverno
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(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
Figura 22.22
Distribuio do vitelo em Xenopus. (A) Uma plaqueta de vitelo anfbio. (B-E) Estabelecimento da polaridade animal-vegetal das plaquetas de vitelo em ocitos de Xenopus. (B) No ocito no final do estgio III (600 m), plaquetas de vitelo penetram na clula igualmente por todos os pontos da superfcie. (C,D) medida que o ocito cresce, as plaquetas do futuro plo animal so deslocadas para o plo vegetal, enquanto aquelas no plo vegetal a permanecem. Continua a entrada de vitelo por todos os lados. (E) Ao fim da vitelognese, as plaquetas mais precoces (III) esto todas no hemisfrio vegetal, que concentrou agora 75% do vitelo do ocito. O momento de entrada do vitelo nas plaquetas do ocito est indicado pelo grau de sombreamento e nmeros romanos: III, plaquetas de estgio III; IV-e, plaquetas do estgio precoce IV; IVl:plaquetas de estgio tardio IV; V, plaquetas do estgio V; gv, vescula germinativa. (Segundo Danilchik e Gerhart, 1987; fotografia cortesia de L. K. Opresko.)
medida que o vitelo est sendo depositado, as organelas tambm se arranjam assimetricamente. Os grnulos corticais comeam a se formar a partir do aparelho de Golgi, estando originalmente espalhados aleatoriamente atravs do citoplasma do ocito. Posteriormente, migram para a periferia da clula. As mitocndrias se replicam nesse perodo, dividindo-se para formar milhes de organelas que sero distribudas para as diferentes clulas durante a clivagem. (Em Xenopus no so formadas novas mitocndrias antes do incio da gastrulao.) Quando a vitelognese se aproxima de seu final, o citoplasma do ocito se estratifica. Os grnulos corticais, mitocndrias e grnulos pigmentados so encontrados na periferia da clula, dentro do crtex do ocito rico em actina. No interior do citoplasma interior, emergem gradientes distintos. Enquanto as plaquetas do vitelo se concentram mais no plo vegetal, os grnulos de glicognio, ribossomos, vesculas lipdicas e retculo endoplasmtico so encontrados mais em direo do plo animal. Mesmo os mRNAs especficos armazenados no citoplasma se localizam em determinadas regies do ocito. [germ1.html] Enquanto os mecanismos precisos para o estabelecimento desses gradientes permanecem desconhecidos, estudos usando inibidores mostraram que o citoesqueleto criticamente importante para a localizao de RNAs especficos e de fatores morfogenticos. Parece haver dois caminhos para conseguir a localizao no crtex vegetal (Foristall et al., 1995; Kloc e Etkin, 1995). Mensagens tais como as que codificam a protena Vg1 esto inicialmente presentes em todo o ocito, sendo trasladadas para o crtex vegetal em dois passos (Yisraeli et al., 1990). Na primeira fase, so necessrios microtbulos para trazer o mRNA Vg1 para o hemisfrio vegetal. Na segunda fase, os microfilamentos so responsveis pelo ancoramento da mensagem de Vg1 no crtex. A poro do mRNA Vg1 que se liga a esses elementos citoesquelticos reside na regio 3 no-traduzida. Quando uma seqncia especfica de 340 bases colocada sobre uma mensagem de -globina, o mRNA -globina colocado de maneira semelhante no crtex vegetal (veja Captulo 12; Mowry e Melton, 1992). Outros mRNAs, como Xlsirt (uma famlia de RNAs
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RNAs maternos
Estgio 1-2
que no codificam protenas mas podem ser necessrios para a manuteno de Vg1 no crtex), Xwnt11 e Xcat2 (que codifica uma protena ligante de RNA relacionada a Nanos), deixam a vescula germinativa para se localizarem na nuvem mitocondrial no plo vegetal do ncleo. Essas mensagens ficam compartimentalizadas em agregados associados com o plasma germinativo e so transportadas para o crtex vegetal de uma maneira que parece ser independente do citoesqueleto (Figura 22.23; Kloc et al., 1996). Progesterona Concluso da meiose: Progesterona e Fecundao
Estgio 2-3
Estgio 4
Trajetria Vg1
Trajetria metro (Xwnt11, Xcat2)
Figura 22.23
Representaes esquemticas de duas trajetrias para a localizao de mRNAs na regio vegetal do ocito de Xenopus. A trajetria METRO (organizadora do transporte de mensagens message transport organizer) acumula mensagens na nuvem mitocondrial, e suas ilhas so transportadas para o crtex do plo vegetal. Na trajetria Vg1 so vistas mensagens por todo o ovo, porm, essas so trasladadas por um sistema movido pelos microtbulos para os microfilamentos do crtex vegetal. (Segundo Kloc e Etkin, 1995.)
Ocitos de anfbios podem permanecer anos no estgio diplteno da prfase meitica. O recomeo da meiose no ocito primrio dos anfbios requer progesterona. Esse hormnio secretado pelas clulas foliculares em resposta ao hormnio gonadotrfico secretado pela hipfise. Seis horas aps a estimulao por progesterona, ocorre a desintegrao da vescula germinativa (GVBD), as microvilosidades se retraem, os nuclolos se desintegram e os cromossomos em forma de escova se contraem e migram para o plo animal para iniciar a diviso. Pouco depois, ocorre a primeira diviso meitica, e o vulo maduro liberado pelo ovrio pelo processo da ovulao. Quando liberado, esse vulo se encontra na segunda metfase meitica. Como pode a progesterona capacitar o vulo a interromper sua dormncia e reiniciar a meiose? Para compreender esse mecanismo de ativao, necessrio revisar rapidamente o modelo para diviso precoce do blastmero apresentado no Captulo 5. O fator promotor da maturao (MPF) responsvel pelo reincio da meiose. Sua atividade cclica, sendo alta durante a diviso celular e indetectvel durante a interfase. O MPF uma protena quinase que contm uma subunidade enzimtica (ciclina). Como todos os componentes do MPF esto presentes no ocito do anfbio, considera-se que a progesterona de alguma maneira converte um complexo pr-MPF em MPF ativo, talvez pela ativao da fosfatase cdc25 (veja Captulo 5; Minishull, 1993). O mediador do sinal de progesterona provavelmente a protena c-mos. A progesterona reinicia a meiose, fazendo o ovo poliadenilar o mRNA c-mos maternal que havia sido armazenado em seu citoplasma (Sagata et al., 1988, 1989; Sheets et al., 1995). Essa mensagem traduzida em uma fosfoprotena de 39-kDa, pp39mos, detectvel somente durante a maturao do ocito, sendo rapidamente destruda aps a fecundao. No entanto, durante sua breve vida, essa protena exerce um papel principal na liberao do vulo da sua dormncia. Se a traduo de pp39mos for inibida (injetando-se mRNA mos-antisenso no ocito), esse no aparece e a desintegrao da vescula germinativa e a renovao da maturao do ocito no acontecem. Aps ter estimulado o reincio da meiose, pp39mos capacita o ocito a passar por uma diviso meitica, mas congela o segundo ciclo meitico na metfase. Esse bloqueio causado pelas aes combinadas de pp39mos e outra protena, a quinase 2 dependente de ciclina (cdk2; Gabrielli et al., 1993). Essas duas protenas so consideradas constituir o fator citoesttico (CSF) encontrado nos ovos maduros da r, que pode bloquear os ciclos celulares na metfase (Masui, 1974). Acredita-se que o CSF previne a degradao da ciclina. A prxima pergunta envolve os mecanismos pelos quais a fecundao capacita o ocito que est na segunda metfase a completar a diviso para formar um gameta haplide. Evidncia recente sugere que o fluxo de ons de clcio ocorrendo durante a fecundao capacita a protena ligante de clcio calmodulina a tornar-se ativa. A calmodulina, por sua vez, pode ativar a protena quinase II dependente de calmodulina. Essa necessria e suficiente para inativar a quinase cdc2 e estimular a degradao de c-mos (Lorca et al., 1993). A calpaina II, uma protease dependente de clcio, degrada pp39mos (Watanabe et al., 1989). Assim, os dois componentes do CSF so inativados ou destrudos. Sem CSF, a ciclina pode ser degradada, e a diviso meitica pode ser completada (Figura 22.24).
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Progesterona secretada pelas clulas foliculares libera a parada da interfase Parada em interfase Meiose I em metfase
Liberao da parada da metfase pela fertilizao Metfase: meiose II parada de metfase mediada por CSF Mitose I em metfase
Estgio do ciclo celular Alta

Atividade de MPF
Primeira fase-S
Baixa Sntese protica Calpaina II Cam-PK II
Ciclina B
Estgio desenvolvimental Ocito Imaturo (Parada G2) GVBD (primeira meiose) Ocito ou vulo maduro (segunda meiose)
Espermatozide Fertilizao Primeira mitose Primeira clivagem
Figura 22.24
Representao esquemtica da maturao do ocito de Xenopus, mostrando a regulao da diviso meitica da clula por pp39mos, cdk2 e calpaina II. A linha slida no grfico representa os nveis relativos de MPF ativo. As barras sob o traado mostram os perodos quando as snteses de determinadas protenas so necessrias para a entrada na prxima fase M. GVBD o ponto da desintegrao da vescula germinativa. A morfologia do ocito est representada embaixo. (Segundo Minishull, 1993.)
Transcrio Gnica em Ocitos Na maioria dos animais (insetos sendo uma exceo importante), o ocito em crescimento ativo na transcrio de genes onde os produtos so ou (1) necessrios para o metabolismo celular, (2) necessrios para processos especficos do ocito, ou (3) requeridos para o desenvolvimento precoce antes do ncleo comear a funcionar. Em camundongos, por exemplo, o ocito diplteno em crescimento est ativamente transcrevendo os genes para as protenas da zona pelcida ZP1, ZP2 e ZP3. Esses genes so transcritos somente no ocito e no em qualquer outra clula (Epifano et al., 1995; veja Captulo 2). O ocito anfbio tem certos perodos em que a sntese de RNA muito ativa. Durante o estgio diplteno, certos cromossomos estendem grandes laos de DNA, fazendo com que o cromossomo se assemelhe a uma escova (um til instrumento para limpeza de tubos de ensaio em tempos anteriores ao uso de materiais descartveis). Esses cromossomos em forma de escova (Prancha 2) podem ser vistos nos locais da sntese de RNA por hibridizao in situ. Cromossomos de ocitos podem ser preparados, desnaturados e incubados com RNA radiativo que codifica uma protena especfica. Aps o RNA no-ligado ter sido removido por lavagem, a auto-radiografia visualiza a localizao precisa do gene. A Figura 22.25 mostra o cromossomo diplteno I da salamandra Triturus cristatus aps incubao com mRNA da histona radiativo. Fica bvio que o gene (ou conjunto de genes) da histona est localizado em uma das dobras do cromossomo em forma de escova (Old et al., 1977). Micrografias eletrnicas de transcritos de genes dos cromossomos em forma de escova tambm permitem que se veja cadeias de mRNA destacando-se de cada gene medida que esse estiver sendo transcrito (Hill e MacGregor, 1980).
Figura 22.25
Localizao (ponta da seta) dos genes histona em um cromossomo em forma de escova em um ocito de anfbio. Os genes foram visualizados por hibridizao in situ e auto-radiografia. (de Old et al., 1977, cortesia de H. G. Callan.)
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Figura 22.26
Alta
Taxa relativa de sntese
Produo de RNA ribossmico em ocitos de Xenopus. (A) Taxas relativas da sntese de DNA, tRNA e rRNA na oognese de anfbios durante os ltimos trs meses antes da ovulao. (B) A transcrio do precursor do RNA dos RNAs ribossmicos 28S, 18S e 5.8S. Essas unidades esto ligadas em srie, aproximadamente 450 por genoma haplide. (A de Gurdon, 1976; B cortesia de O. L. Miller Jr.)
tRNA
RNAs ribossmicos
DNA
RNA 5S
Baixa Amplificaes de rDNA Comea o acmulo de vitelo Ocito totalmente crescido Hormnio pituitrio Fertilizao Maturao 16 horas
3 meses crescimento do ocito Transcrio por gravidade do RNA ribossmico
(B)
Comea a transcrio
Fim da transcrio
DNA de espaamento no-transcrito
Em adio sntese de mRNA, os padres de transcrio de rRNA e tRNA so tambm regulados durante a oognese. A Figura 22.26 A mostra a sntese de ribossomos e RNA de transferncia durante a oognese de Xenopus. A transcrio parece comear em ocitos precoces (estgio I, 25-40 m), durante o estgio diplteno da meiose. Nesse ponto, todos os RNAs ribossmico e de transferncia necessrios para a sntese protica at o estgio de blstula intermediria so produzidos, e todos os mRNAs maternos para o desenvolvimento precoce so transcritos. Esse estgio dura meses em Xenopus. A taxa de produo de RNA ribossmico espantosa. O genoma do ocito de Xenopus tem mais de 1800 genes codificando o rRNA 18S e 28S, e esses genes so amplificados seletivamente at que existam mais de 500.000 genes produzindo esses RNAs ribossmicos (Figura 22.26B; Brown e Dawid, 1968). Aps atingir certo tamanho, os cromossomos do ocito maduro (estgio VI) se condensam, e os genes no esto transcrevendo ativamente. Essa condio de ocito maduro tambm pode perdurar por meses. Aps estimulao hormonal, o ocito completa sua primeira diviso meitica e ovulado. Os mRNAs armazenados pelo ocito agora se juntam aos ribossomos para iniciar a sntese protica. Dentro de horas, a segunda diviso meitica comeou, e o ocito secundrio foi fertilizado. Os genes do embrio no comeam a transcrio ativa antes da transio da blstula intermediria (Davidson, 1986). [germ2.html] Conforme vimos no Captulo 12, os ocitos de vrias espcies produzem duas classes de mRNAs aqueles de uso imediato no ocito e aqueles que so armazenados para uso durante o desenvolvimento precoce. Em ourios-do-mar, a traduo das mensagens maternas armazenadas iniciada pela fecundao, enquanto em rs o sinal para tal traduo iniciado pela progesterona quando o ovo est prestes a ser ovulado. Uma das aes da atividade da quinase MPF induzida pela progesterona pode ser a fosforilao das protenas ligantes de CPE nos mRNAs do ocito armazenados.
867
A fosforilao desses fatores est associada com o prolongamento das caudas poli(A) nas mensagens armazenadas e com a traduo dos mRNAs armazenados (Paris et al., 1991). Oognese Merostica em Insetos Existem vrios tipos de oognese em insetos, mas a maioria dos estudos focalizaram os insetos, tais como Drosophila e mariposas, que sofrem oognese merostica. Nesse processo as conexes citoplasmticas permanecem entre as clulas produzidas pelo oognio. Em Drosophila, cada oognio se divide quatro vezes para produzir um clone de 16 clulas conectadas uma outra atravs de canais anelares. A produo dessas clulas interconectadas (chamadas cistcitos) envolve uma seqncia altamente organizada de divises celulares (Figura 22.27). Somente as duas clulas apresentando quatro interconexes so capazes de se desenvolver em ocitos, e dessas duas, somente uma torna-se um vulo. A outra inicia a meiose mas no a termina. Assim, somente um de 16 cistcitos pode tornar-se um vulo. Todas as outras clulas se tornam clulas nutrizes. Mostra-se que a clula destinada a ser o ocito aquela residindo na extremidade mais posterior da cmara do ovo que contm o clone de 16 clulas. Porm, j que as clulas nutrizes esto conectadas ao ocito atravs de suas pontes citoplasmticas, o complexo inteiro pode ser visto como uma unidade produtora de um vulo. O ovrio merostico nos confronta com alguns problemas interessantes. Se todas as clulas esto conectadas de modo que as protenas e os RNAs podem transitar livremente entre elas, porque teriam destinos desenvolvimentais diferentes? Porque uma clula se torna o ocito enquanto as outras se tornam fbricas sintetizadoras de RNA, enviando mRNAs, ribossomos e mesmo centrolos para o interior do ocito? Porque o fluxo de protena e RNA vai somente em uma direo? medida que os cistcitos se dividem, se forma uma grande estrutura rica em espectrina chamada fussomo, cobrindo as pontes citoplasmticas entre as clulas (Figura 22.27). Esse construdo assimetricamente, pois sempre cresce do plo do fuso que permaneceu em uma das clulas (Lin e Spradling, 1995). A clula que reteve o fussomo durante a primeira diviso se torna o ocito. No ainda conhecido se o fussomo contm determinantes oognicos, ou se ele dirige o trfego de materiais para o interior dessa clula em particular. Uma vez estabelecidos os padres de transporte, o citoesqueleto fica ativamente envolvido no transporte de mRNAs das clulas nutrizes para o citoplasma do ocito (Cooley e Theurkauf, 1994). O arranjo microtubular crtico para a determinao do ocito. Se essa grade for rompida (quimicamente ou por mutaes tais como bicaudal-D
(A) Anterior
Figura 22.27
A formao de 16 cistcitos interconectados em Drosophila. (A) Diagrama de um ovarolo adulto mostrando a seqncia da oognese com cistos germinativos mais jovens, amadurecendo dentro do ovarolo. (B) Diviso das clulas formadoras de cistcitos (cistoblastos). As clulas esto representadas esquematicamente dividindo-se em um nico plano. Uma clulatronco se divide para produzir outra clula-tronco mais uma clula comprometida a formar os cistcitos. Somente um dos 16 cistcitos torna-se um ocito; os outros tornam-se clulas nutrizes, conectadas ao ocito por canais anelares (pontes citoplasmticas). O centrolo do cistcito 1 retm o fussomo (em vermelho), que cresce atravs do canal anelar em direo sua irm mittica. A seta mostra a polaridade, apontando para a clula da qual cresceu o fussomo. Aps mais trs divises mitticas formado o cisto de 16 clulas. Se o transporte intracelular for coordenado pelo fussomo, o transporte de mRNAs e protenas iria para o cistcito 1, que assim se tornaria o ocito. (A segundo Ruohola et al., 1991; B segundo Lin e Spradling, 1995.)
Ocito Posterior Clulas foliculares posteriores
Clula nutriz
(B)
Mais 2 divises Cistoblasto em diviso Fussomo Cisto de 2 clulas
868
Figura 22.28
Transporte de mRNA de clulas nutrizes para ocitos da mosca. (A,B) Auto-radiografias da clula folicular da mosca domstica, Musca domestica, aps incubao com citidina [3H]. (A) Cmara do ovo fixada imediatamente aps introduo da marca. Os ncleos das clulas nutrizes esto fortemente marcados, indicando que esto sintetizando novo RNA. O ocito permanece no-marcado exceto onde algum RNA esteja escapando para o ocito atravs da conexo citplasmtica entre esse e a clula nutriz (seta). (B) Uma cmara do ovo semelhante fixada 5 horas mais tarde. A marca desapareceu dos ncleos da clula nutriz, movendo-se para o citoplasma. Alm disso, o RNA radiativo pode ser visto passando para o citoplasma do ocito atravs dos dois canais entre as clulas nutrizes e o ocito. (C) Autoradiografia da cmara do ovo de Drosophila corada por uma sonda radioativa para o mRNA bicoid. Essa mensagem transportada das clulas nutrizes e permanece na poro mais anterior do ocito. (A e B de Bier, 1963, cortesia de D. Ribbert; C de Stephanson et al., 1988, cortesia de E. C. Stephanson.)
(A)
ou egalitarian), os produtos dos genes so transmitidos em todas as direes e todas as 16 clulas se diferenciam em clulas nutrizes (Gutzeit, 1986; Theurkauf et al., 1992, 1993; Spradling, 1993). possvel que alguns compostos transportados das clulas nutrizes para o ocito fiquem associados com protenas transportadoras como a cinesina, o que poderia capacit-las a viajar na esteira de microtbulos estendendo-se atravs do canal anelar (Theurkauf et al., 1992; Sun e Wyman, 1993). A actina pode tornar-se importante na manuteno dessa distino durante os estgios mais tardios da oognese. Mutaes que impedem microfilamentos de actina forrarem os canais anelares previnem o transporte de mRNAs da clula nutriz para o ocito, e a ruptura dos filamentos de actina faz com que a distribuio de mRNA seja ao acaso (Cooley et al., 1993; Watson et al., 1993). Assim, o citoesqueleto microtubular e microfilamentoso parece controlar o movimento de organelas e RNAs entre clulas nutrizes e ocito fazendo com que os sinais desenvolvimentais sejam trocados somente na direo apropriada.
TRANSPORTE DE RNA DAS CLULAS NUTRIZES PARA O OCITO. Os ocitos de insetos merosticos no passam pelo estgio transcricional ativo, nem apresentam cromossomos em forma de escova. Ao contrrio, evidncia auto-radiogrfica mostra que a sntese de RNA , em grande parte, confinada s clulas nutrizes e que o RNA produzido por essas clulas ativamente transportado para o citoplasma do ocito. Isso pode ser visto na Figura 22.28. Quando as cmaras de ovo da mosca domstica so incubadas em citidina radioativa, os ncleos das clulas nutrizes mostram intensa marcao. Quando a marcao interrompida, e as clulas so incubadas por mais 5 horas em meios no-radioativos, o RNA marcado visto entrar no ocito a partir das clulas nutrizes (Bier, 1963). A oognese ocorre em somente 12 dias, sendo as clulas nutrizes metabolicamente muito ativas durante esse tempo. Elas so ajudadas na sua eficincia transcricional tornando-se politnicas. Em lugar de ter duas cpias de cada cromossomo, elas replicam seus cromossomos at terem produzido 512 cpias. As 15 clulas nutrizes so conhecidas por passar RNAs ribossmicos e mensageiros assim como protenas para o citoplasma do ocito; e ribossomos inteiros podem ser tambm transportados (Prancha 16). Os mRNAs no se associam com polissomos, sugerindo que eles no so imediatamente ativos na sntese protica (Paglia et al., 1976; Telfer et al., 1981).
(B)
(C)
Ncleo da clula nutriz Citoplasma da clula nutriz
Citoplasma do ocito
Epitlio folicular
869
&
Especulaes
A Origem dos Eixos Embrionrios de Drosophila Durante a Oognese
S EIXOS NTERO-POSTERIOR e
dorsoventral so estabelecidos durante a metade da oognese (Gonzlez-Rayes et al., 1995; Roth et al., 1995). O mRNA para o determinante anterior, bicoid, colocado na regio anterior do vulo; os mRNAs para os determinantes posteriores, oskar e nanos, so enviados para o plo posterior; a mensagem gurken fica concentrada em uma regio do vulo, a iniciando as reaes que estabelecem esse lado como a superfcie dorsal do embrio. Os mecanismos para a construo desses eixos envolvem complexas interaes entre as clulas nutrizes, o ocito e as clulas foliculares (veja Figura 14.13). Primeiro, a mensagem gurken produzida pelas clulas nutrizes, e se aglutina ao redor do ncleo do ocito, posicionando-se entre o ncleo e a membrana plasmtica. O ncleo est na regio posterior do vulo, e a protena Gurken recm-transcrita ativa seu receptor nas clulas foliculares no plo posterior. (A protena Gurken se parece com o fator de crescimento epidrmico.) Essas clulas foliculares do plo posterior respondem enviando um sinal (talvez AMP cclico) que ativa a protena quinase A (PKA) na membrana celular do ocito. Como um resultado da ativao de PKA, os microtbulos do ocito so reorientados (Lane e Kalderon, 1994).* Em lugar de ter seus terminais positivos apontados para as clulas nutrizes (i.e., anteriormente), elas revertem seus terminais positivos de modo que fiquem posteriores (onde havia estado o ncleo).
*PKA tambm conhecida por organizar microtbulos no crescimento axnico (Shea et al., 1992), e como vimos no Captulo 1, isso pode mediar a diferenciao da clula peduncular em Dictyostelium (Williams et al., 1993).
A reorientao dos microtbulos um evento crtico. Os mRNAs nanos e oskar so sintetizados pelas clulas nutrizes e so inicialmente vistos na futura zona anterior do vulo. Esses mRNAs podem ser transportados para o plo posterior ao longo dos microtbulos para o teminal positivo (mas no para o terminal negativo). Assim, essas mensagens podem agora ser transportadas para o plo posterior. A mensagem oskar crtica para a organizao do plasma polar, e se for traduzida antes de atingir o plo posterior, pode estabelecer abdomens e clulas germinativas em outros lugares. Durante sua jornada para o posterior, a mensagem oskar reprimida pela protena Bruno (que se liga 3UTR da mensagem oskar). Uma vez na posio posterior, essa represso abolida e a protena Oskar pode ser produzida (Kim-Ha et al., 1995; Rongo et al., 1995). Reciprocamente, a mensagem bicoid conservada no anterior pelos terminais negativos dos microtbulos. Se esses forem desagregados, a mensagem se difunde para o citoplasma, e se a polaridade dos microtbulos for retida em sua conformao original (como nas moscas carentes em PKA), a mensagem bicoid ser transportada para o plo posterior (Figura 22.29; Macdonald et al., 1991; Marcey et al., 1991; Pokrywka e Stephenson, 1991.) Esse posicionamento do mRNA bicoid na futura posio anterior a das mensagens oskar e nanos na futura posio posterior estabelece as condies para a organizao do eixo ntero-posterior (veja Captulo 15). O realinhamento dos microtbulos facilita o movimento do ncleo com seu sinal Gurken, ao longo da membrana plasmtica do vulo em direo ao canto dorsal anterior (Roth et al., 1995; GonzlezReyes et al., 1995). Aqui, a protena Gurken faz com que
(A) WT
gurken Ncleo oskar
bicoid gurken (B) PKA oskar bicoid
Figura 22.29
Localizao do RNA nos ocitos de Drosophila tipo selvagem e mutantes deficientes em PKA. (A) No ocito do tipo selvagem (estgio 9), o mRNA oskar est no plo posterior, o mRNA bicoid est nas margens anteriores, e o mRNA gurken est localizado no canto anterior dorsal. (B) Nos ocitos deficientes em PKA, a distribuio da mensagem gurken no afetada, mas o mRNA oskar deixa de se localizar no plo posterior e se acumula centralmente, enquanto o mRNA bicoid transportado para o plo posterior. (Segundo Lasko, 1995.)
as clulas foliculares adjacentes se convertam em clulas dorsais. (As clulas foliculares polares e laterais produzem protenas diferentes e respondem de maneira diferente ao sinal Gurken. As clulas foliculares polares ativam a PKA do ocito; as clulas foliculares laterais se tornam dorsalizadas e reprimem a sntese de protenas ventralizantes). Assim, os eixos ntero-posterior e dorsoventral em Drosophila so iniciados antes mesmo de ocorrer a fertilizao.
TRANSPORTE DAS PROTENAS DO VITELO PARA O OVO. As trs principais protenas do vitelo em Drosophila so produzidas no corpo gorduroso e ovrio, mas no no ocito propriamente dito (Bownes, 1982; Brennen et al., 1982). A sntese do vitelo controlada por vrios agentes interativos, incluindo sexo, nveis de
870
Crebro
Hormnio cerebral
Corpora allata
Hormnio juvenil Clulas abdominais produtoras de ecdisona Ecdisterides Protenas vitelnicas Ovrio
Protenas vitelnicas
Corpo gorduroso
hormnio juvenil, ecdisona e nutrio. Esses agentes fisiolgicos so integrados pela regio intensificadora entre os dois genes da protena do vitelo de Drosophila (veja Figura 10.13; Bownes et al, 1988). Esses genes so somente ativos em moscas fmeas, e isso regulado pela ligao da protena Doublesex especfica de fmea a essa regio do intensificador. Acredita-se que um hormnio cerebral, respondendo a sinais ambientais*, estimule o corpora allata a secretar hormnio juvenil (Figura 22.30). O hormnio juvenil (1) regula a captao de peptdeos vitelnicos na superfcie do ocito, (2) estimula a sntese de protenas vitelnicas do ovrio (que so idnticas quelas produzidas pelo corpo gorduroso), e (3) faz com que os folculos ovarianos e outras clulas abdominais secretem ecdisona. Essa metabolizada para sua forma ativa - 20-hidroxiecdisona - e estimula o corpo gorduroso a produzir protenas do vitelo, tal como o estradiol estimula o fgado anfbio a faz-lo. Da mesma maneira, a administrao de ecdisona a machos adultos faz com que seus corpos gordurosos secretem protenas vitelnicas (Postlethwait et al., 1980) e que a protena vitelnica seja levada para os ocitos de insetos atravs de endocitose mediada por receptores (Raikhel e Dhadialla, 1992). Os receptores para a vitelogenina esto localizados em regies da membrana do ocito na base das microvilosidades e entre as mesmas. Os complexos receptorvitelogenina so internalizados e a vitelogenina liberada do receptor dentro do vacolo endoctico. Esse se funde com outros endossomos para formar o grnulo repleto de vitelogenina armazenado pelo vitelo. Oognese em Mamferos A ovulao do vulo dos mamferos segue um de dois padres bsicos, dependendo da espcie. Um tipo de ovulao estimulado pelo ato fsico da copulao. A estimulao fsica do crvix desencadeia a liberao de gonadotrofinas da hipfise. Essas gonadotrofinas sinalizam o ovo para recomear a meiose e iniciar os eventos que expelem o vulo do ovrio. Esse mtodo assegura que a maior parte das copulaes conduz a vulos fertilizados; e animais que utilizam esse mtodo de ovulao coelhos e vises tm a reputao de procriaes bem sucedidas. A maioria dos animais, porm, tem um tipo peridico de ovulao. A fmea apenas ovula em pocas especficas do ano, chamadas de estro (ou seu equivalente portugus cio). Nesses casos, sinais ambientais, mais notavelmente a quantidade e o tipo de iluminao diurnos, estimulam o hipotlamo a liberar o fator liberador de gonadotrofina. Esse estimula a hipfise para liberar suas gonadotrofinas o hormnio estimulante de folculos (FSH) e o hormnio luteinizante (LH) que faz com que as clulas foliculares se proliferem e secretem estrgeno. O estrgeno subseqentemente penetra em certos neurnios e evoca o padro de comportamento copulatrio caracterstico da espcie. As gonadotrofinas tambm estimulam o crescimento folicular e a iniciao da ovulao. Assim, estro e ovulao ocorrem em pocas prximas. Os seres humanos apresentam variao sobre o tema da ovulao peridica. Embora fmeas humanas tenham ovulao cclica (em mdia de cerca de 29.5 dias), sem estro anual definido, a maior parte da fisiologia reprodutiva humana compartilhada com outros primatas. A caracterstica periodicidade dos primatas na maturao e liberao de vulos chamada ciclo menstrual porque envolve o
Figura 22.30
Modelo para a regulao hormonal da sntese de peptdio vitelnico em D. melanogaster. Em resposta a um hormnio cerebral, o corpora allata produz hormnio juvenil, que faz com que o ovrio produza protenas vitelnicas e ecdisterides. O hormnio juvenil tambm induz a sntese de ecdisterides nas clulas abdominais. Esses ecdisterides motivam o corpo gorduroso a produzir protenas vitelnicas que so transportadas para o ovrio. (Segundo Bownes, 1982.)
* Em Drosophila, o sinal ambiental parece ser o fotoperodo. No mosquito comum, o sinal a refeio sangnea. Somente mosquitos fmeas picam, e elas no produzem vitelogenina antes da refeio. Algum fator sangneo estimula o crebro do mosquito para liberar o hormnio juvenil e o fator estimulador do corpocardaco. Esse ltimo fator causa a liberao do hormnio neurosecretrio do desenvolvimento do ovo (EDNH). Esse estimula o ovrio a secretar vitelogenina (Hagedorn, 1983; Borovsk et al., 1990). (Veja Captulo 21.)
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(A)
Clulas Granulosas
Clulas Granulosas
Clulas tecais FOLCULOS PRIMORDIAIS
Clulas tecais
(B)
Zona pelcida
Clulas tecais
Coroa radiata
Antro
Clulas granulosas
Membrana granulosa FOLCULO GRAAFIANO
Ocito
Figura 22.31
O folculo ovariano dos mamferos. (A) Maturao do folculo ovariano. Quando maduro, ele freqentemente chamado folculo Graafiano. (B) Microfotografia eletrnica de varredura de um foliculo maduro no rato. O ocito (centro) est rodeado pelas menores clulas granulosas que iro constituir a coroa. (A segundo Carlson, 1981; B cortesia de P. Bagavandoss.)
peridico sangramento e descarte de detritos celulares do tero em intervalos mensais.* O ciclo menstrual representa a integrao de trs atividades muito diferentes: (1) o ciclo ovariano, cuja funo amadurecer e liberar um ocito, (2) o ciclo uterino, cuja funo prover o ambiente apropriado para o blastocisto desenvolvido se implantar, e (3) o ciclo cervical, cuja funo de somente permitir a entrada do espermatozide no trato reprodutivo feminino no momento apropriado. Essas trs funes esto integradas atravs dos hormnios da hipfise, hipotlamo e ovrio. A maioria dos ocitos so mantidos no interior do ovrio humano adulto no estgio diplteno prolongado da primeira prfase meitica (freqentemente referida como o estado dictado). Cada ocito est envolvido por um folculo primordial consistindo de uma camada nica de clulas granulosas epiteliais e uma camada menos organizada de clulas tecais mesenquimatosas (Figura 22.31). Periodicamente um grupo de folculos primordiais entra em estgio de crescimento. Nesse perodo, o ocito sofre um aumento de volume de 500 vezes (correspondendo a um aumento do dimetro de 10 m em um folculo primordial, para 80 m em um folculo totalmente desenvolvido).
* O descarte peridico do revestimento uterino um processo ativo observado em todos os mamferos. O tero tem intrincadas adaptaes circulatrias (como as artrias espirais) que permitem ao sangue fluir livremente por algum tempo sem coagular e em seguida cessar seu fluxo (para evitar uma hemorragia). Profet (1993) props que a menstruao trata-se de uma crucial funo imunolgica, protegendo o tero contra infeces pelo smen ou outros agentes ambientais.
872
Concomitantemente com o crescimento do ocito ocorre um aumento no nmero de clulas granulosas foliculares, que forma camadas concntricas ao redor do ocito. Essa proliferao das granulosas mediada pelo fator parcrino, GDF-9, um membro da famlia TGF- (Dong et al., 1996). Atravs de todo esse perodo de crescimento, o ocito permanece no estgio dictaco. O folculo completamente crescido contm um grande ocito rodeado por vrias camada de clulas granulosas. Muitas dessas clulas permanecero com o vulo liberado, formando o cumulus, que envolve o vulo no oviduto. Alm disso, durante o crescimento do folculo se forma um antro (cavidade), que se enche com uma complexa mistura de protenas, hormnios, cAMP e outras molculas. A qualquer momento, um pequeno grupo de folculos est madurecendo. Porm, aps progredir para um estgio mais maduro, a maioria dos ocitos e seus folculos morrem. Para sobreviver, um folculo tem que encontrar uma fonte de hormnios gonadotrficos e pegando a onda no momento apropriado, ele tem que cavalg-la at que atinja o cume. Assim, para que ocorra a maturao do ocito, o folculo ter que estar em um certo estgio de desenvolvimento quando nascem as ondas de gonadotrofina. O dia 1 do ciclo menstrual considerado ser o primeiro dia do sangramento (Figura 22.32). Esse sangramento da vagina representa o desbastamento de tecido extra-uterino e vasos sangneos que teriam ajudado na implantao do blastocisto. Na primeira fase do ciclo (chamada fase proliferativa ou folicular), a glndula pituitria comea a secretar quantidades cada vez maiores de FSH. O grupo de folculos em maturao que j sofreram algum desenvolvimento, respondem a esse hormnio com mais crescimento e proliferao celular. O FSH induz tambm a formao de receptores de LH nas clulas granulosas. Pouco aps esse perodo de crescimento folicular inicial, a pituitria comea a secretar LH. Em resposta ao LH, o bloqueio meitico quebrado. A membrana nuclear de ocitos competente se desintegra e os cromossomos se renem para sofrer a primeira diviso meitica. Um conjunto de cromossomos conservado no interior do ocito, e o outro fornecido ao pequeno corpo polar. Ambos esto revestidos pela zona pelcida, que foi sintetizada pelo ocito em crescimento. nesse estgio que o ovo ser ovulado. As duas gonadotrofinas, atuando em conjunto, fazem com que as clulas foliculares produzam quantidades crescentes de estrgeno, que tem ao menos cinco principais atividades na regulao do progresso do ciclo menstrual: 1. Faz com que a mucosa uterina inicie sua proliferao e se enriquea em vasos sangneos. 2. Faz com que o muco cervical se afine, permitindo o espermatozide entrar nas pores internas do trato reprodutivo. 3. Causa um aumento do nmero de receptores de FSH nas clulas granulosas (Kammerman e Ross, 1975) e simultnea diminuio da produo de FSH pela hipfise. Estimula tambm as clulas granulosas a secretarem o hormnio peptdico inibina, que tambm suprime a secreo hipofisria de FSH (Rivier et al., 1986; Woodruff et al., 1988). 4. Em baixas concentraes, inibe a produo de LH, mas em altas concentraes a estimula. 5. Em concentraes muito altas e longos perodos, o estrgeno interage com o hipotlamo, fazendo com que ele secrete o fator liberador de gonadotrofina. medida que os nveis de estrgeno aumentam como um resultado da produo folicular, os nveis de FSH declinam. Todavia os nveis de LH continuam a aumentar medida que mais estrgeno secretado. medida que o estrgeno produzido (dias 7-10), as clulas granulosas continuam a crescer. Comeando no dia 10, a secreo de estrgeno aumenta pronunciadamente. Esse aumento seguido no meio do ciclo por uma enorme onda de LH e uma menor exploso de FSH.
873
Figura 22.32
Gonadotrofinas (da hipfise anterior)
Hormnio luteinizante (LH)
(A)
O ciclo menstrual humano. A coordenao de ciclos (B) ovarianos e (D) uterinos controlada pelos (A) hormnios hipofisrio e (C) ovariano. Durante a fase folicular, o ovo amadurece dentro do folculo, e o revestimento uterino preparado para receber o embrio. O ovo maduro liberado ao redor do dia 14. Se um embrio no for implantado no tero, a parede uterina comea a se desintegrar, levando menstruao.
Hormnio estimulante de folculos (FSH) (B) Eventos no ovrio Folculo em desenvolvimento Ovo Ovulao Corpo lteo
(C)
Hormnios ovarianos Estrgeno
Progesterona
Revestimento uterino (D)
Menstruao
Fase folicular
Fase ltea
Dia do ciclo menstrual
Experimentos com macacas mostraram que a exposio do hipotlamo a mais de 200pg de estrgeno por ml de sangue por mais que 50 horas resulta na secreo hipotalmica do fator libertador de gonadotrofina. Esse fator subseqentemente causa a liberao de FSH e LH da hipfise. Dez a 12 horas aps o pico de gonadotrofina, o vulo ovulado (Figura 22.33; Garcia et al., 1981). Embora o mecanismo detalhado da ovulao no seja ainda conhecido, a expulso fsica do ocito maduro do folculo parece ser devida a um aumento induzido de LH na colagenase, ativador de plasminognio e prostaglandina no interior do folculo (Lemaire et al., 1973). O mRNA para o ativador de plasminognio encontrava-se dormente no citoplasma do ocito. O LH faz com que essa mensagem seja poliadenilada e traduzida nessa poderosa protease (Huarte et al., 1987). As prostaglandinas podem causar contraes localizadas nos msculos lisos do ovrio e pode tambm aumentar o fluxo de gua dos capilares ovarianos (Diaz-Infante et al., 1974; Koos e Clark, 1982). Se a sntese de prostaglandina ovariana for inibida, a ovulao no ocorre. Alm da presso induzida pela prostaglandina, as colagenases e a protease ativadora de plasminognio se afrouxam e digerem a matriz extracelular do folculo (Beers et al., 1975; Downs e Longo, 1983). O resultado do efeito do LH seria, ento, um aumento da presso folicular acoplada com a degradao da parede folicular. Um orifcio seria formado e digerido, atravs do qual o vulo irromperia.
874
Figura 22.33
Ovulao no coelho. O ovrio de um coelho vivo anestesiado foi exposto e observado. Quando o folculo comeou a ovular, o ovrio foi removido, fixado e corado. (Cortersia de R. J. Blandau.)
Cumulus
Ocito
Ovrio
Folculo imaturo
Clulas foliculares remanescentes
Aps a ovulao, comea a fase ltea do ciclo menstrual. As clulas restantes do folculo rompido sob a influncia do LH tornam-se o corpo lteo. (Elas so capazes de responder a esse LH porque o surto de FSH as estimula a desenvolver mais receptores de LH.) O corpo lteo secreta algum estrgeno, mas a sua secreo predominante a progesterona. Esse hormnio esteride circula at o tero, onde completa a tarefa de preparar o tecido uterino para a implantao do blastocisto, estimulando o crescimento da parede uterina e seus vasos sangneos. O bloqueio do receptor da progesterona com o esteride sinttico mifepristona (RU486) impede a parede uterina de engrossar e previne a implantao do blastocisto no tero (Couzinet et al., 1986).* A progesterona tambm inibe a produo de FSH, com isso prevenindo a maturao de mais folculos e vulos. (Por essa razo, tal combinao de estrgeno e progesterona tem sido usada em plulas de controle da natalidade. O crescimento e a maturao de novos vulos so prevenidos enquanto o FSH estiver inibido). Se o vulo no for fecundado, o corpo lteo se degenera, a secreo de progesterona cessa e a parede uterina descartada. Com o declnio dos nveis de progesterona srica, a hipfise volta a secretar FSH e o ciclo recomeado. Porm, se ocorrer fertilizao, o trofoblasto secreta um novo hormnio, luteotropina, que faz com que o corpo lteo permanea ativo e os nveis de progesterona srica se mantenham altos. Assim, o ciclo menstrual permite a maturao peridica e a ovulao dos vulos humanos permitindo ao tero desenvolver-se periodicamente em um rgo capaz de nutrir durante nove meses um organismo em desenvolvimento. O vulo e o espermatozide iro ambos morrer se no se encontrarem. Voltamos assim para onde comeamos. O palco est preparado para a fecundao. Como reconhecido por F. R. Lillie em 1919, Os elementos que se unem so clulas nicas, cada qual a ponto de morrer; mas pela sua unio formado um indivduo rejuvenescido, que constitui um elo no eterno processo da Vida.
* RU486 considerado competir pelo receptor de progesterona no interior do ncleo. RU486 pode se ligar ao stio de progesterona no receptor, e o complexo receptor-RU486 parece formar heterodmeros com o receptor normal de progesterona a essa ligado. Quando esse complexo RU486progesterona se liga aos elementos intensificadores responsivos progesterona no DNA, a transcrio desse stio inibida (Vegeto et al., 1992; Spitz e Bardin, 1993). Na Europa o RU486 tornou-se uma alternativa largamente empregada ao aborto cirrgico (Palka, 1989; Maurice, 1991).
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&
Especulaes
O Reincio da Meiose nos Ocitos de Mamferos
E NUMEROSOS FOLCULOS so capazes de maturar quando secretado o hormnio estimulante de folculos, por que em geral somente um folculo e seu ocito prevalecem? Parece que o folculo capaz de produzir a maior quantidade de estrgeno em resposta ao FSH aquele que amadurece, enquanto todos os outros morrem. Aqueles conjuntos de folculos que inicialmente receberam FSH no somente comeam a proliferar, mas tambm produzir novos receptores de hormnio luteinizante nas suas clulas tecais (Figura 22.34). A recepo de LH faz com que essas clulas iniciem a produo de estrgeno. Como vimos, o estrgeno tem dois efeitos diferentes envolvendo a futura recepo de FSH. Em um nvel, deprime a secreo hipofisria de FSH, enquanto em outro nvel aumenta os receptores de FSH nas clulas foliculares. Assim, quanto mais estrgeno um
Recepo de FSH Mais receptores de LH Diminuio dos nveis de FSH LH
Mais receptores de FSH
Mais estrgeno secretado pelo folculo
Figura 22.34
Ciclo de retroalimentao positiva em clulas foliculares de mamferos. A recepo do hormnio estimulante de folculos (FSH) leva produo de mais receptores do hormnio luteinizante (LH). As clulas foliculares secretam estrgeno quando estimuladas pelo LH; o estrgeno ocasiona tanto um aumento no nmero de receptores de FSH como um decrscimo na produo de FSH pela hipfise. Por fim, muito poucos folculos permanecem capazes de receber as pequenas quantidades de FSH produzidas, com isso amplificando sua capacidade de receber LH. Esses poucos folculos so capazes de amadurecer.
folculo produz, mais receptores de FSH ele tem, e menos FSH permanece na circulao. medida que a concentrao de FSH diminui progressivamente, somente um folculo pode ligar o FSH disponvel. Somente esse folculo pode crescer; os outros folculos morrem. O que faz o LH causar o reincio da meiose? Para responder a essa pergunta, a natureza do bloqueio meitico foi intensamente estudada. Como em ocitos de anfbios, o estgio dictado extremamente importante porque durante esse perodo que os ocitos crescem, diferenciam as estruturas especficas para ocitos, e adquirem a capacidade de recomear a meiose (Sorensen e Wassarman, 1976). Experimentos iniciais demonstraram que ocitos envoltos em folculos no sofrem maturao in vivo ou in vitro a no ser quando expostos a gonadotrofinas, enquanto ocitos removidos dos folculos reiniciam espontaneamente a meiose mesmo na ausncia de estimulao hormonal (Pincus e Enzmann, 1935). Parece, portanto, que a meiose normalmente inibida pelas clulas foliculares e pode ser reiniciada pelas gonadotrofinas. Essa hiptese que as clulas foliculares so importantes reguladores da meiose fortalecida por observaes que clulas granulares se comunicam com o ocito por processos que se estendem atravs da zona. Esses processos tm junes de fenda que permitem pequenas molculas passarem entre o ocito e as clulas granulosas do folculo (Figura 22.35; Anderson e Albertini, 1976; Gilula et al., 1978). Porque a elevao dos nveis de cAMP inibe a maturao do ocito (Cho et al., 1974), foi proposto que a parada meitica mantida pela transferncia de cAMP atravs das junes de fenda da clulas granulosas foliculares para o ocito (Dekel e Beers, 1978, 1980). O surto de hormnio luteinizante poderia desencadear a maturao terminando a comunicao pela juno de fenda, com isso inibindo a transferncia da cAMP para o ocito. Vrias linhas de evidncia apoiam essa hiptese. Primeiramente, o declnio de cAMP parece
(A) Processo da clula folicular
(B)
Ocito
Figura 22.35
Comunicao entre ocito e clulas granulosas. (A) Ocito de carneiro rodeado pela zona pelcida e clulas foliculares. As clulas granulosas do folculo esto estendendo processos atravs da zona pelcida, tocando o ocito. (B) Micrografia eletrnica de processos de clulas foliculares estabelecendo conexes de juno de fenda com um ocito de macaco rhesus. Junes de fenda (setas) esto coradas com lantanio ionizado. (A de Moor e Cran, 1980, cortesia dos autores; B de Anderson e Albertini, 1976, cortesia de D. Albertini.)
ser crtico para o reincio da meiose. A desintegrao da vescula germinativa pode ser prevenida inibindo-se a degradao de cAMP em ovos livres de folculos ou diretamente provendo tais ovos com cAMP (Bornslaeger et al., 1986). O declnio da concentrao de cAMP do ocito ocorre
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imediatamente antes do reincio da meiose (Figura 22.36; Schultz et al., 1983). Em segundo lugar, as gonadotrofinas podem causar a perda de comunicao entre as clulas foliculares e o ocito. As clulas foliculares parecem ser fontes importantes de cAMP do ocito, e mudanas da concentrao de cAMP nessas clulas se refletem nos nveis de cAMP no ocito (Bornslaeger e Schultz, 1985; Racowsky, 1985). Essa observao explica porque os ocitos permanecem em parada meitica quando rodeados por clulas foliculares, mas reiniciam a meiose quando essas so removidas. O surto de gonadotrofinas pode elevar a concentrao de cAMP da clula folicular para novos nveis. Em resposta a essa elevao, as clulas foliculares maduras sintetizam cido hialurnico, que causa ruptura fsica do contato entre os processos das clulas foliculares e o ocito (Eppig, 1979; Larsen et al., 1986). As pontes pela quais o cAMP flui da clula granulosa folicular para o ocito, com isso, foram removidas, permitindo o ocito mamfero reiniciar a meiose (Dekel e Sherizly, 1985; Racowsky e Satterlie, 1985). Tal como ocitos de anfbios, o ocito ovulado do camundongo est suspenso na segunda metfase meitica e fecundado nesse estado. Paules e colaboradores (1989) mostraram que ocitos de camundongo em maturao tambm contm
Baixa atividade de adenil ciclase ou alta atividade da fosfodiesterase
Alta atividade de adenil ciclase ou baixa atividade de fosfodiesterase
Alta concentrao de cAMP
Baixa concentrao de cAMP
Alta atividade da quinase dependente de cAMP
Baixa atividade da quinase dependente de cAMP
Fosforilao de certas protenas do ocito
Certas protenas do ocito no so fosforiladas
Manuteno da parada meitica
Desintegrao da vescula germinativa; liberao da parada meitica
Figura 22.36
Sumrio do mecanismo proposto por meio do qual o nvel de cAMP do ocito regula o recomeo da meiose pelo ocito. Os nveis de cAMP no ocito so providos, ao menos em parte, pelo cAMP das clulas foliculares. O AMP cclico no pode atravessar membranas celulares, mas pode penetrar no ocito atravs das junes de fenda conectando o ocito com suas clulas foliculares. Quando as conexes so liberadas, os nveis de cAMP do ocito declinam, conduzindo liberao da parada meitica.
o fator citosttico pp39mos responsvel pela parada de meiose na metfase II. Camundongos fmeas deficientes no gene mos no param sua diviso na metfase II, e seus ovos freqentemente tentam desen-
volver-se partenogeneticamente (Colledge et al., 1994: Hashimoto et al., 1994). evidente que eventos semelhantes tm que ocorrer para a maturao dos ocitos de anfbios e mamferos.
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Mecanismos desenvolvimentais da mudana evolucionria
23
Como a acontece a novidade no mundo? Como nasce? De que fuses, tradues, junes, realizada? Como ela sobrevive extrema e perigosa como ? Que compromissos, que acordos, que traies de sua natureza secreta dever fazer para afastar os tripulantes destruidores, o anjo exterminador, a guilhotina? SALMAN RUSHDIE (1988) O primeiro Pssaro nasceu do ovo de um Rptil. WALTER GARSTANG (1922)
harles Darwin foi herdeiro de sculos de especulao relacionada com as origens da diversidade da vida animal. A prpria educao de Darwin foi baseada na tradio Britnica da teologia natural que sustentava que a onipotncia e benevolncia de Deus podiam ser observadas nos trabalhos de Sua criao. A parte dominante dessa tradio foi o relato da Criao proclamando que as espcies foram trabalhos planejados intrincadamente do Criador. Os dedos da mo humana eram encarados como um requinte (alguns diziam ser perfeito) de inventos planejados que permitiu aos humanos dominarem o seu meio ambiente. As garras em forma de p da toupeira estavam, novamente, perfeitamente adaptadas no seu trabalho de existncia, tal como as asas de um pssaro ou as barbatanas de um peixe. Uma forma mais sofisticada da teologia natural, definida na Gr Bretanha pelo anatomista e embriologista Richard Owen, que afirmou que as adaptaes eram apenas de importncia secundria. Pelo contrrio, as homologias eram crticas. Estruturas homlogas eram aqueles rgos que tinham as mesmas partes bsicas arranjadas da mesma forma, fazendo das diferenas a sua modificao secundria. O que era realmente importante era que a mo humana, as garras da toupeira, as asas do pssaro e as barbatanas do peixe foram cada uma baseada no mesmo plano. Resumindo o plano dos membros, ns podiamos determinar o grandioso desenho pelo qual Deus construiu todos os apndices dos vertebrados. Para Owen (1848), as homologias baseadas na diversidade animal eram o que contava, e no as adaptaes secundrias dessas unidades bsicas.
Unidade de Tipo e Condies de Existncia

A Sntese de Charles Darwin Darwin reconheceu sua dvida com esses debates primrios quando escreveu em (1859), amplamente reconhecido que todos os seres orgnicos foram formados segundo duas grandes leis - Unidade de Tipo e Condies de Existncia. Darwin continuou a explicar que sua teoria poderia explicar a unidade de tipo atravs da descendncia. As mudanas criando esses tipos e causando adaptaes maravilhosas para as condies de existncia, alm disso, eram explicadas atravs da seleo natural. Darwin chamou isso de Linhagem com modificao. Aps a leitura do sumrio de Johannes Mller sobre a lei de von Baer em 1842, Darwin acreditou que semelhanas
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(A) Tetraclita
(B) Penaeus
Figura 23.1
Larvas nauplius de (A) crustceo (Tetraclita, vista pela face ventral) e (B) um camaro (Penaeus, vista pela face dorsal). O camaro e a craca tm um estgio larval similar apesar da radical divergncia no desenvolvimento posterior. (De acordo com F. Mller, 1864.)
embrionrias seriam um argumento muito forte em favor da conexo gentica em grupos de animais diferentes. Uma comunidade de estruturas embrionrias revela uma comunidade de linhagem, ele concluiria na Origens das espcies. Formas larvais foram usadas para a classificao taxonmica mesmo antes de Darwin. J. V. Thompson, por exemplo, demonstrou que a larva da craca (cirrpede) era quase idntica s larvas do caranguejo e portanto contou as cracas como artrpodes e no como moluscos (Figura 23.1; Winsor, 1969). Darwin, um perito em taxinomia da craca comemorou esse achado: Mesmo o ilustre Cuvier no se apercebeu de que a craca tratava-se de um crustceo, mas num relance a larva mostra isso de maneira indubitvel. A interpretao evolucionria de Darwin sobre a lei de von Baer criou um paradigma que foi seguido por muitas dcadas, especificamente, que relaes entre grupos podem ser descobertas observando-se formas larvais em comum. Kowalevsky (1871) faria em breve uma descoberta similar (publicada em Descent of Man por Darwin) que a larva tunicada tem notocordas e forma o seu tubo neural e outros rgos de uma maneira muito similar ao cordado anfioxo primitivo. Os tunicados, outro enigma dos esquemas de classificao (normalmente colocados, juntamente com as cracas, como um molusco), desse modo encontraram um lar entre os cordados. Darwin tambm notou que organismos embrionrios, s vezes, produzem estruturas que so inapropriadas para sua forma adulta, mas que mostram sua relao com outros animais. Ele mostrou a existncia de olhos em toupeiras embrionrias, rudimentos plvicos em cobras embrionrias, e dentes nas barbatanas em embries de baleia. Neste livro, notamos que os embries mamferos formam um saco vitelnico rudimentar, enviam vasos sangneos para esse saco, e sofrem gastrulao de uma maneira semelhante s aves e rpteis, cujo desenvolvimento confinado pelo vitelo. Darwin tambm argumentou que as adaptaes que partem do tipo e permitem que o organismo sobreviva em ambiente prprio, se desenvolvem mais tarde no embrio. Ele notou que diferenas entre espcie e gneros so, como as previstas pela lei de von Baer, somente produzidas mais tarde no desenvolvimento; ele at mesmo colocou pombos em clorofrmio (com grande relutncia) para provar a si prprio de que esse era realmente o caso. Dessa maneira, Darwin reconheceu duas maneiras de encarar a linhagem com modificao. Poderamos enfatizar a linhagem comum, assinalando homologias embrionrias entre dois ou mais grupos de animais, ou poderamos enfatizar as modificaes mostrando como o desenvolvimento foi alterado para produzir estruturas que permitem aos animais se adaptarem s condies particulares. Darwin no procurou construir filogenias completas a partir de dados embriolgicos, mas o seu trabalho influenciou muitos dos seus contemporneos a faz-lo. Um dos primeiros cientistas a perceber a importncia evolucionria dos estudos de von Baer foi Elie Metchnikoff. Metchnikoff reconheceu que a evoluo consiste na modificao de organismos embrionrios, e no de adultos. Assim ele escreveu (1891): O homem parece ser um resultado unilateral, mas no total, de um organismo melhorado, no s pela juno de macacos adultos, mas preferivelmente por ter seus fetos desenvolvidos desigualmente. Do ponto de vista puramente histrico natural, seria possvel reconhecer o homem como um monstro de macaco, com um crebro, face e mos enormemente desenvolvidos. Dessa maneira, os organismos eram vistos atravs das mudanas no seu desenvolvimento embrionrio. No incio do sculo 20, essa fuso de evoluo e embriologia foi mal interpretada apoiando o modelo linear de evoluo (oposto ao ramificado). A interpretao de Ernst Haeckel foi de que muitos organismos evoluram pela adio terminal de um estgio novo ao fim do anterior. Dessa maneira, ele interpretou todo o reino animal como representaes de etapas encurtadas do desenvolvimento humano (veja Gasman,1971; Gould, 1977). [evo1.html]
CAPTULO 23 Mecanismos Desenvolvimentais da Mudana Evolucionria
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F. R. E. B. Wilson e F. R. Lillie Se mudanas no desenvolvimento embrionrio afetaram mudanas evolucionrias, como acontecem essas mudanas de desenvolvimento? No final do sculo 19, muitos investigadores tentaram ligar o desenvolvimento filogenia atravs de anlises das linhagens celulares. Eles observaram meticulosamente cada clula nos embries em desenvolvimento e compararam os caminhos pelos quais organismos diferentes formaram seus tecidos. Em 1898, dois embriologistas eminentes realizaram palestras sobre linhagem celular no Marine Biology Laboratories em Woods Hole, Massachusetts, e suas palestras serviram para enfatizar os dois caminhos da embriologia que estavam sendo usados para apoiar a biologia evolucionria. A primeira palestra, apresentada por E. B. Wilson, foi um marco no uso de homologias embrionrias para estabelecer relaes filogenticas. Wilson havia observado que os padres de clivagem espiral de platelmintos, moluscos e aneldeos e ele havia descoberto que em cada caso, os mesmos rgos provinham do mesmo grupo de clulas. Para ele, isso significou que esses filos tinham um antepassado comum. Os vrios grupos de clulas em estgio de clivagem em platelmintos, moluscos e aneldeos Mostram uma correspondncia to prxima tanto em relao origem como ao destino, que parece impossvel explicar a similaridade obtida a no ser como um resultado da comunidade de linhagem. As muitas diferenas, como veremos, do algumas das mais interessantes e convincentes evidncias da afinidade gentica; para processos nos quais nas formas inferiores desempenham um papel importante no desenvolvimento esto nas formas superiores to reduzidos a ponto de no ser mais que vestgios ou reminiscncias do que eram, e em alguns casos parecem ter desaparecidos to completamente como os dentes de pssaros ou os membros de serpentes. O prximo palestrante foi F. R. Lillie, que tambm havia realizado pesquisas sobre o desenvolvimento de embries de moluscos e em modificaes de linhagens celulares. Ele enfatizou as modificaes, no as similaridades, da clivagem. Suas pesquisas no Unio, um mexilho cuja clivagem foi alterada para produzir uma larva com forma de armadilha de urso permitindo-lhe sobreviver em gua corrente, foram descritas no Captulo 5. Lillie argumentou que os estudos evolucionrios modernos estavam melhor concentrados nas mudanas do desenvolvimento embrionrio que permitiram a sobrevivncia em ambientes particulares em vez de enfocar homologias ancestrais que uniam os animais em linhas de descendncia. Em 1898, portanto, as duas principais vias de aproximao para a evoluo e o desenvolvimento estavam claramente definidas: encontrar unidades bsicas que unem grupos de animais distintos, e detectar diferenas no desenvolvimento que permitem espcies se adaptarem a ambientes particulares. (Certamente, essas mesmas linhas de pensamento caracterizaram os dois tipos de teologia natural antes de Darwin.) Darwin pensou serem apenas distines temporrias, isto , seriam encontradas unidades bsicas nos primeiros estgios, enquanto os ltimos estgios se divergiriam para permitir adaptaes especficas (veja Ospovat, 1981). No entanto, Wilson e Lillie estavam ambos discutindo o estgio da clivagem da embriognese. Essas duas maneiras de caracterizar o desenvolvimento e a evoluo ainda so as principais correntes de pensamento hoje.
A evoluo do desenvolvimento precoce: E. Pluribis Unum

A emergncia dos embries Na evoluo e desenvolvimento de organismos vivos, podemos observar a emergncia de multicelularidade a partir de organismos unicelulares. Uma nova totalidade formada de componentes celulares. Isso um passo fundamental na emergncia de um novo
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patamar de complexidade. As volvocaceas e os dictiosteldeos mencionados no Captulo 1 representam somente 2 de 17 tipos de protistas nos quais a multicelularidade foi conseguida (Buss, 1987). No entanto, somente trs grupos (aqueles que geraram fungos, plantas e animais) desenvolveram a capacidade de formar agregados multicelulares que poderiam se diferenciar em tipos de clulas particulares, i. e., um embrio. Os primeiros embries tiveram que resolver um problema fundamental. Uma vez que cada um dos componentes celulares tinha o aparelho gentico e a arquitetura citoplasmtica necessria para a diviso, porque cada clula no haveria de continuar a sua prpria proliferao? O que causaria essas clulas sacrificarem sua capacidade proliferativa para formar um indivduo coletivo? Pode ter havido mais de uma soluo. Buss sugere que nesses embries precoces houve uma dicotomia abrupta entre a proliferao e a diferenciao e que nosso ancestral protista nunca aprendeu o truque da diviso aps a diferenciao dos clios. Enquanto outros grupos de protistas (especialmente os ciliados) podiam produzir mais centros organizadores de microtbulos, nossos ancestrais no o podiam. At os dias atuais, nenhuma clula metazoria ciliada se divide (embora clulas metazorias ciliadas podem perder os seus clios e depois se dividir). Buss especula que os ancestrais dos metazorios de hoje pararam sua proliferao celular se diferenciando em uma blstula de clulas ciliadas. (Os embries precoces dos primeiros filos metazorios- esponjas e cnidrios- so caracterizados como bolas de clulas ciliadas, como os embries de ourio-do-mar discutidos no Captulo 5.) Essas blstulas ciliadas podiam se mover, mas parecia que todo o seu desenvolvimento havia parado, para as clulas ciliadas no se dividirem, nem se tornarem outro tipo diferenciado de clula. Para se desenvolver em um organismo, esse dilema tinha que ser resolvido. Esse problema foi resolvido pela reteno ou produo de uma populao de clulas no-ciliadas. Essas clulas podiam se proliferar em novas clulas, enquanto as clulas ciliadas permitiam ao embrio se mover. Mas essas clulas divididas no podiam simplesmente ir para qualquer lugar. No podiam crescer em cima das clulas ciliadas ou seu movimento cessaria. Elas no podiam crescer na gua ou seriam sugadas pelos movimentos do embrio. Ao contrrio, teriam que migrar para dentro da blastocele (Figura 23.2). Acredita-se que esse movimento e proliferao de clulas seja a origem da gastrulao. Dessa maneira, a blstula surge como uma maneira de juntar clulas autnomas em uma federao. A gstrula surgiu como um acordo com essa federao permitindo ao embrio se desenvolver enquanto se move (Buss, 1987).* Os primeiros embries provavelmente se desenvolveram sob essa forma de mosaico. No entanto, a induo proporcionou um segundo mecanismo para assegurar que blastmeros totipotentes permanecessem juntos para formar um nico indivduo. Aqui, cada clula sacrificou sua autonomia para criar uma comunidade coerente. Henry e seus colaboradores (1989) descobriram que enquanto os blastmeros individuais do ourio-do-mar podem ser totipotentes, os agregados produzidos dessas mesmas clulas no o so. Ao contrrio, cada clula restringe a potncia da sua vizinha (veja Captulo 15). Essa regulao restritiva tambm vista em camundongos quimricos (veja Captulo 5), onde blastmeros de mamferos se combinam para formar um nico camundongo quimrico ao invs de dois camundongos individuais. Parece haver restries muito importantes na potncia celular, uma vez que as clulas se juntam. Ademais, uma vez que a populao interna pode interagir com a populao
*Essa uma modificao da teoria originalmente proposta por Metchnikoff (1886) para explicar a origem dos organismos multicelulares. Usando embries de hidrides e de esponjas, Metchnikoff assinalou que certas clulas da parede da blstula arrastadas por seu flagelo, se tornam amebides e mveis, se multiplicam por diviso, preenchem a cavidade da blstula, e se tornam capazes de fazer digesto. Esse estado embrionrio, ele sentiu, como com o direito de ser considerado o prottipo dos seres multicelulares. Metchnikoff tentou fazer uma filogenia de todos os organismos baseada nas suas camadas germinativas, e ele acreditava que todas as clulas mesodrmicas poderiam ser caracterizadas por sua habilidade de fagocitar substncias estranhas. As suas descobertas em embriologia comparativa finalmente lhe permitiu formular fundaes conceituais de uma nova cincia, a imunologia. (Para maiores detalhes sobre a teoria de origens multicelulares de Metchnikoff, veja Chernyak e Tauber, 1988, 1991.)
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Figura 23.2
(A) Aequoria foskalea
(B)
(C)
(D)
(E)
Gastrulao em dois cnidrios hidrides. (AE) Gastrulao em Aequoria foskalea, onde formada uma blstula ciliada. As clulas do plo vegetal perdem seus clios e migram para dentro da blastocele para formar uma populao em diviso mittica. (F-I) Gastrulao em Clava squamata, onde uma estereoblstula repleta de clulas formada e em seguida a camada externa se torna ciliada. Ambos os planos convergem para a larva plnula ciliada caracterstica dos cnidrios. (A epbole de um ectoderma no-ciliado no est presente em embries livres para nadar.) (De acordo com Buss, 1987.)
(F) Clava squamata
(G)
(H)
(I)
celular externa e com outras partes da populao interna, eventos indutivos podem dar origem ao surgimento de novos rgos. Independentemente da maneira pela qual essa comunidade de clulas foi formada, a integrao delas em um embrio unificado realizada pela contribuio materna ao citoplasma do ovo. esse conjunto de instrues que causa a clivagem das clulas de um modo especfico, aderir uma a outra, e se diferenciar em perodos particulares. Como foi observado no Captulo 12, o embrio do ourio-do-mar se torna uma blstula ciliada mesmo na ausncia de transcrio nuclear. Somente na gastrulao o ncleo comea a regular o desenvolvimento. Dessa maneira, seleo a nvel de propagao celular (que tem sido a regra da sobrevivncia entre os protistas) foi suplantada pela seleo ao nvel de organismos multicelulares individuais. Filo: Formao de um Novo Filo: Modificando os Caminhos do Desenvolvimento Somente trs dzias de modelos de corpos animais esto sendo usados atualmente neste planeta (Margulis e Schwartz, 1988; Brusca e Brusca, 1990). Esses constituem o filos animais. Isso no quer dizer que esses modelos so os nicos possveis. O Burgess Shale, um depsito de fsseis de corpos moles do perodo Cambriano inicial, conhecido por conter representantes de 20 filos ou mais que nunca desenvolveram descendentes nas camadas superiores (Figura 23.3). Alm disso, essa pequena banda de sedimento, aproximadamente do tamanho de um quarteiro, contm cerca de uma dzia de classe de artrpodes previamente desconhecida. Esses animais no so membros primitivos de uma classe ou filo existente, mas so exemplos especializados do seus prprios grupos. (Whittington, 1985; Gould, 1989). Existem tambm duas espcies no Burgess Shale que podem estar relacionadas s formas ancestrais do filo existente. Uma um animal parecido com um peripato, que deve ser prximo uma forma ancestral de inseto; e outro aparenta ser um cordado bem preservado chamado Pikaia gracilens que pode estar relacionado aos cordados ancestrais (veja Figura 23.3B). Esse ltimo fssil apresenta muitos traos que recomendam que seja classificado em nosso filo: ele parece ter uma notocorda, e as bandas
(A)
(B)
Figura 23.3
Dois organismos fsseis do Burgess Shale da metade do perodo Cambriano. (A) Opabina, um organismo com cinco olhos na cabea, um apndice frontal com uma garra terminal, segmentos corpreos com guelras dorsais e um pedao de cauda de trs segmentos. (B) Pikaia gracilens, possivelmente um cordato. (de Gould, 1989.)
888
Boca Tentculo Plipo reprodutivo
Medusas reprodutivas sexualmente com clulas mutantes
Colnias jovens compostas de clulas mutantes
Plipos de nutrio
Broto de medusa
Ovo Espermatozide
Zigoto
Larva
Brotamento
Mutao somtica d origem a uma nova linhagem
Figura 23.4
Colnia madura
Aparecimento rpido de novas variantes em invertebrados com alternao de geraes. Aqui, uma mutao somtica ocorre nas clulas de uma colnia hidride. Algumas dessas clulas mutantes se tornam parte do plipo reprodutivo, dando origem s medusas (gua-viva) que contm os alelos mutantes. Essas medusas se reproduzem para formar uma nova colnia que pode ser produzida de clulas mutantes.
em zigue-zague ao longo de sua lateral se parecem muito com a musculatura derivada de somito encontrada nos Amphioxus (Conway Morris e Whittington, 1979).* Dessa maneira, todos os filos metazorios conhecidos (e muitos at agora desconhecidos) parecem ter se formado pela radiao Cambriana h cerca de 540 milhes de anos atrs (Bowring et al., 1993; Wray et al., 1996). Como que nenhum filo novo surgiu nos ltimos 500 milhes de anos? Kauffman (1993) prope um modelo matemtico que prev que qualquer sistema evolutivo (sendo ele filo, espcie, automvel ou religio) mostra esse padro de divergncia seguido pela clausura dentro de um subconjunto particular da diversidade original. Kauffman usa uma metfora de um terreno acidentado onde existem picos e vales de aptido, e todos os organismos comeam com o mesmo valor de aptido mdio igual (na metade do pico). Se eles do saltos grandes, eles tm uma chance de 50% de se tornarem organismos fisicamente aptos. Por fim, a chance de encontrar um plano corporal fisicamente apto diminui se um organismo d um salto para longe de onde est situado. Saltos longos se tornam arriscados, e as chances desses picos mais altos j estarem ocupados aumenta. Ao invs disso, saltos pequenos (sobre o mesmo pico) podem tornar um organismo fisicamente mais apto do que a populao ao seu redor. Portanto, o que vemos uma diversificao em torno de poucos modelos de sucesso. Geralmente, o intervalo entre saltos longos com sucesso duplica a cada tentativa. No comeo do perodo Cambriano, possvel que o genoma no tivesse se estabilizado nos conjuntos de interaes que vemos hoje. Alm do mais, em muitos grupos invertebrados existe uma alternao de geraes onde uma forma sexuada gera uma forma assexuada (zoide, plipo, broto) que ento d origem novamente uma forma sexuada. Em tais casos, mutaes somticas na forma assexuada podem entrar no corpo da forma sexuada e serem propagadas de uma forma muito rpida (Figura 23.4; Buss, 1987).
*Um fssil ainda mais antigo, Yunnanazoon lividum, do comeo do perodo Cambriano, em torno de 525 milhes de anos atrs, foi primeiramente reportado como sendo um cordado (Chen et al., 1995). No entanto, a interpretao da notocorda fssil foi questionada por Shu e colegas (1996), que interpretaram o Yunnanazoon como sendo o hemicordado mais antigo conhecido.
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Como, ento, podemos modificar um Bauplan para criar um outro Bauplan? O primeiro passo seria modificar os primeiros estgios do desenvolvimento. De acordo com von Baer (veja Captulo 7), animais de diferentes espcies mas do mesmo gnero, divergem muito tardiamente no desenvolvimento. Quanto mais divergente for uma espcie da outra, mais cedo poderemos distinguir os seus embries. Dessa maneira, embries de gansos da neve so indistinguveis dos gansos azuis at quase os ltimos estgios. No entanto, o desenvolvimento do ganso da neve diverge do desenvolvimento do pinto um pouco antes, e os embries do ganso podem tambm serem distinguidos de embries de lagarto em estgios ainda mais precoces. Parece ento que mutaes que criaram Bauplne novos poderiam faz-lo alterando os primeiros estgios do seu desenvolvimento. Essas mudanas precoces do desenvolvimento podem ser afetadas pela mudana de localizao dos determinantes citoplasmticos, mudando a razo da diviso celular de uma clula ou grupo de clulas relativa a outras, ou mudando as posies das clulas enquanto elas se dividem. No Captulo 5, vimos que a modificao da clivagem do molusco pode dar a massa de citoplasma para as clulas ectodrmicas que formam a concha larval. Isso devido mudana na maneira pelo qual os blastmeros dividem e partilham o citoplasma. Nos vermes aneldeos, as diferenas entre poliquetas e oligoquetas, derivam de diferenas na localizao citoplasmtica de morfgenos dentro do ovo (Figura 23.5). Embora ambos sofram clivagem espiral, eles partilham
(A) Podarke Mapa de destino
Figura 23.5
Comparao do desenvolvimento de duas classes de vermes aneldeos, (A) o poliqueto Podarke e (B) o oligoqueto Tubifex. Esto mostrados seus embries em clivagem, mapas de destino da blstula e produtos da gastrulao. No Podarke, a gastrulao leva formao de uma larva trocfora. No Tubifex, no h um estgio larval, e o embrio se desenvolve diretamente em um corpo segmentado. (De acordo com Anderson, 1973.)
Larva trocfora Tufo apical
Tufo apical presuntivo Prototroco presuntivo Ectoderma anterior presuntivo Ectoderma presuntivo posterior Estomodeu
Prototroco
Embrio de 40 clulas
Estomodeu presuntivo Intestino mdio presuntivo
Mesoderma presuntivo
Banda mesodrmica
Intestino mdio
Ectomesoderma presuntivo
Ectoderma dorsal temporrio do saco vitelnico Somitos mesodrmicos Ectoteloblasto
(B) Tubifex
Estomodeu presuntivo
Ectoderma do saco vitelnico presuntivo Ectoderma do ectoteloblasto presuntivo
Banda ectoteloblstica
Intestino mdio presuntivo
Mesoderma presuntivo
Ectoteloblasto Ectoderma ventral temporrio do saco vitelnico Intestino mdio
Embrio em clivagem
Mapa de destino
Gastrulao
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Vestimentiferano Polygordius Patella
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
Figura 23.6
Divergncia no desenvolvimento aps o estgio larval de trocfora. (A-C) A metamorfose do aneldeo poliqueto Polygordius a partir de sua forma larval trocfera de nado livre mostra a formao de um tronco segmentado. Por fim, as estruturas larvais se encurtam na extremidade anterior medida que a cabea se forma. (DE) Metamorfose do molusco prosobrnquio (mexilho) Patella. Aps o estgio trocforo, ele desenvolve um p de molusco, uma glndula da concha e uma corcova visceral. (F) Micrografia eletrnica de varredura de uma larva trocfora de um vestimentiferano. (A-E de acordo com Grant, 1978; F de Jones e Gardiner, 1989; cortesia dos autores.)
seus morfgenos em clulas diferentes. Poliquetas sofrem uma clivagem espiral relativamente padronizada, dando origem larva trocfora. Oligoquetas, no entanto, colocam a maior parte de seu citoplasma nas clulas destinadas formao de estruturas adultas, ao invs de larvais. Esse grupo passa depois para o estgio larval. Se uma mutao colocasse um certo morfgeno citoplasmtico em uma nica regio do ovo ao invs de uma outra, ou se a mutao originasse uma mudana no eixo da diviso celular para que conjuntos diferentes de clulas adquirissem esses determinantes, ento um fentipo radicalmente diferente poderia ser produzido. Como E. G. Conklin escreveu em 1915, Ns somos vertebrados porque nossas mes eram vertebrados e produziram ovos de padro vertebrado. Uma outra maneira de evoluo de um novo filo pode envolver uma modificao da larva. Darwin e outros pensavam que similaridades na forma larval significavam origem em comum. No entanto, isso pode ser reinterpretado para significar que as mudanas que originam filos diferentes podem ocorrer na larva. Caramujos, equiurides e poliquetos tm padres de diviso muito semelhantes e formam larvas trocforas (Figura 23.6). De fato a colocao do filo recm-descoberto Vestimentfera (invertebrados vermelho brilhante, sem tubo digestivo, encontrados nas valas profundas do oceano) prximo aos aneldeos foi feita em parte baseada nas larvas trocforas das vestimentferas (Jones e Gardiner, 1989; Young et al., 1996). Assim, um dos principais mecanismos para estabelecer novos filos e classes pode ser a relocao do desenvolvimento durante o estgio larval para que a metamorfose surja com novos tipos de organizao. Garstang (1928) mostrou como a larva vliger de alguns caramujos pode ter surgido atravs de mutao e depois ter sido selecionada porque a nova disposio da cabea e concha permitiam que a cabea se retrasse, por segurana, abaixo da concha. Ele tambm inventou a hiptese de que cordados se desenvolveram das larvas tunicadas ancestrais que se tornaram neotnicas. Infelizmente, larvas de corpo mole raramente se fossilizam, portanto sabemos muito pouco dos mecanismos pelos quais cordados e outros filos surgiram de larvas* Cambrianas precoces.
* Formas larvais freqentemente preenchem a lacuna entre as diferentes formas adultas. A forma larval vista ou como sendo ancestral a dois grupos ou como um separador por neotenia e formando um diferente tipo de organismo. Isso vem freqentemente sendo hipotetizado como um mecanismo pelo qual os cordados emergiram de invertebrados e vertebrados surgiram de cordados. A larva tornaria dos hemicordados formada de uma maneira deuterstoma, similar s larvas equinodermos e se mostra muito parecida com uma larva equinodermo tendo sido originalmente confundida com elas. Isso ligaria os equinodermos e cordados. Garstang (1928) e Berril (1955) hipotetizaram que as larvas de certos tunicados podiam ter evoludo em cordados tais como os anfioxos pelo desenvolvimento neotnico. Desse modo, os tunicados manteriam a notocorda, musculatura larval e o aparelho alimentar da larva tunicada enquanto se tornam sexualmente maduras. Existem, na verdade, tunicados nadadores neotnicos (como as Larvacea). Modificaes dessa interpretao (usando linhagens de protocordados diferentes) foram sugeridas por Jefferies (1986). A origem dos cordados permanece um problema difcil.
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Modularidade: O pr-requisito para mudana evolutiva atravs do desenvolvimento

Existem somente cerca de 35 Bauplne, mas existem milhes de diferentes espcies, cada uma com o seu padro de desenvolvimento. Portanto, a maior parte da evoluo ocorreu nos moldes de um Bauplan existente. Como isso feito? Como o desenvolvimento de um embrio pode ser modificado j que um processo to precisamente afinado e complexo? Costumava-se pensar que o nico caminho para promover a evoluo era adicionar um degrau no fim do desenvolvimento embrionrio, mas agora sabemos que mesmo os estgios mais iniciais podem ser alterados para produzir novidades evolucionrias. A razo pela qual mudanas podem ser produzidas durante o desenvolvimento que o embrio, como o organismo adulto, composto por uma srie de mdulos que se interagem (Riedl, 1978; Bonner, 1988). Modularidade O desenvolvimento ocorre atravs de mdulos discretos e interativos (Riedl, 1978; Gilbert et al., 1996; Raff, 1996; Wagner, 1996). Os organismos so construdos de unidades que so coerentes em si e ainda parte de uma unidade maior. Dessa maneira, clulas fazem parte dos tecidos, que fazem parte dos rgos, que fazem parte de um sistema, e assim por diante. Tal sistema to hierarquicamente entrelaado foi chamado de arranjo modular interagindo em nveis (Dyke, 1988). No desenvolvimento, esses mdulos incluem campos morfogenticos (por exemplo, aqueles descritos para o membro ou o olho) discos imaginais, linhagens celulares (tais como a massa celular interna ou trofoblasto), parasegmentos de insetos e rudimentos de rgos de vertebrados. Unidades modulares permitem que diferentes partes do corpo mudem sem a interferncia de outras funes. O princpio fundamental da modularidade permite trs processos de alterao do desenvolvimento: dissociao, duplicao e divergncia, e co-opo (Raff, 1996). Uma vez que os mdulos esto em todos os nveis, do molecular ao orgnico, no surpreendente que esses princpios sejam vistos operando em todos os nveis do desenvolvimento. Dissociao: Heterocronia e Alometria Nem todas as partes do embrio so conectadas umas s outras. Podemos dissecar um campo do membro de uma nurula de salamandra sem afetar os olhos. Por mutao ou perturbao ambiental, uma parte do embrio pode mudar sem a outra parte. Essa modularidade do desenvolvimento pode permitir mudanas que so tanto espaciais quanto temporais. Heterocronia uma mudana no ajustamento relativo de dois processos do desenvolvimento durante a embriognese, de uma gerao para outra. Em outras palavras, um mdulo pode mudar sua expresso temporal relativa para outros mdulos do embrio. Chegamos a esse conceito em nossas discusses de neotenia e prognese em salamandras (veja Captulo 19). A heterocronia pode ser causada de diferentes maneiras. Em heterocronias de salamandra onde o estgio larval retido, a heterocronia causada por mutaes gnicas no sistema de competncia da induo. Outros fentipos heterocrnicos, entretanto, so causados pela expresso heterocrnica de certos genes. O desenvolvimento direto do rudimento do ourio-domar adulto (veja Captulo 19) envolve a ativao precoce de genes adultos e a supresso da expresso do gene larval (Raff e Wray, 1989). A heterocronia pode retornar um organismo para o seu estado larval, livre das adaptaes especializadas do adulto. A heterocronia tambm pode dar caractersticas larvais a um organismo adulto, como nos pequenos e enredados ps da salamandra arbrea ou na taxa de crescimento fetal do tecido cerebral do recm nascido humano. [evo2.html] Outra conseqncia da modularidade a alometria. Alometria ocorre quando diferentes partes do organismo crescem com taxas diferentes. Alometria pode ser muito
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Figura 23.7
Nasal Pr-maxilar Parietal Occipital Maxilar Frontal
Crescimento alomtrico na cabea da baleia. A mandbula se estendeu para frente, fazendo com que o nariz se deslocasse para o topo do crnio. (O pr-maxilar est presente no feto humano precoce, mas ele se funde ao maxilar j no fim do terceiro ms de gestao. O pr-maxilar humano foi descoberto por Wolfgang Goethe, entre outros, em 1786.) (De acordo com Slijper, 1962.)
Parietal Nasal Occipital
Zigomtico Maxila Mandbula
Escamoso (temporal)
Figura 23.8
Seco transversal atravs da regio anterior do embrio da toupeira com bolso (Thomomys) mostrando a abertura anterior da bolsa (AP) e a continuidade entre a bolsa neste estgio e a cavidade bucal (BC) atravs da rea de desenvolvimento do lbio. (EP, clulas epiteliais; MC, cartilagem de Meckel; T, lngua.) (De acordo com Brylski e Hall, 1988, cortesia dos autores.)
importante na formao de variantes de planos corporais dentro do Bauplan. Tais mudanas no crescimento diferencial podem envolver uma alterao da sensibilidade das clulas alvo a fatores de crescimento ou alterao da quantidade de fatores de crescimento produzidos. Novamente, o membro vertebrado pode fornecer uma ilustrao til. Diferenas locais nos condrcitos fazem com que o crescimento do dgito central do cavalo seja 1.4 vezes maior se comparado aos dgitos laterais (Wolpert, 1983). Isso significa que medida que o cavalo aumentava de tamanho durante a evoluo, essa diferena regional transformou o cavalo de 5 dgitos em um cavalo de um s dgito. Um exemplo particularmente dramtico de alometria na evoluo vem do desenvolvimento do crnio. No embrio muito jovem da baleia (4-5 mm), o nariz se encontra na posio usual dos mamferos. No entanto, o enorme crescimento do maxilar e do pr-maxilar (parte superior da mandbula) empurra o osso frontal e fora o nariz para o topo do crnio (Figura 23.7). Essa nova posio do nariz (orifcio do sopro) permite que a baleia tenha uma mandbula grande e altamente especializada que permite a respirao enquanto paralela superfcie da gua (Slijper,1962). Alometria pode tambm gerar novidades evolucionrias atravs de pequenas mudanas incrementais que finalmente cruzam algum limite do desenvolvimento (algumas vezes chamado de ponto de bifurcao). Finalmente, uma mudana na quantidade se torna uma mudana na qualidade quando esses limites so ultrapassados. Foi postulado que esse tipo de mecanismo produziu as bolsas externas, revestidas de plos, do pescoo das toupeiras com bolso e dos ratos cangurus que moram no deserto. As bolsas externas diferem das internas (1) por apresentar plos e (2) no apresentar conexo interna com a boca. Elas so muito teis pois permitem a esses animais armazenarem sementes sem correrem o risco de desidratao. Brylski e Hall (1988) dissecaram a cabea de embries de toupeiras com bolso e ratos cangurus com bolsa, e observaram como a bolsa bucal externa construda. Quando os dados desses animais foram comparados com dados de animais que formam bolsas bucais internas (como os hamsters), os investigadores descobriram que as bolsas so formadas de maneiras muito semelhantes. Em ambos os casos, as bolsas so formadas dentro das bochechas embrionrias atravs de uma protuberncia em forma de bolsa no epitlio da bochecha (bucal) para dentro do mesnquima facial (Figura 23.8). Em animais com bolsa bucal interna, essas evaginaes ficam dentro da bochecha. No entanto, nos animais que formam bolsas externas, o alongamento do focinho leva essas bolsas a se elevarem para a regio do lbio. medida que o epitlio labial rola para fora da cavidade oral, tambm o fazem as bolsas externas. O que antes era interno agora externo. O revestimento de pele provavelmente derivado de bolsas externas que entram em contato com o mesnquima dermal, que pode induzir o epitlio formao de cabelo (veja Captulo 17).
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Essa bolsa no possui abertura interna para a boca. Certamente, a transio de bolsa interna para externa uma questo de limiares. A localizao das evaginaes, anterior ou posteriormente, determina se a bolsa interna ou no. No existe estgio de transio com duas aberturas, uma interna e outra externa. Poderia-se imaginar essa externalizao como uma ocorrncia de mutao por acaso deslocando a posio da bolsa externa para uma posio um pouco mais anterior. Esse trao seria selecionado no deserto. Como Van Valen refletiu em 1976, a evoluo pode ser definida como o controle do desenvolvimento pela ecologia. Duplicao e Divergncia Modularidade tambm permite a ocorrncia de duplicao e divergncia. A parte da duplicao nesse processo permite a formao de estruturas redundantes, e a parte divergente do processo permite que essas estruturas assumam novos papis. Uma das cpias pode manter o papel original enquanto as outras esto livres para mutar e divergir funcionalmente. Isso pode acontecer em vrios nveis. A famlia TGF-, a famlia MyoD e as globinas, cada uma provavelmente comeou como um nico gene que se duplicou diversas vezes. Aps a duplicao, mutaes causaram as divergncias que deram aos membros de cada famlia novas funes. Em nvel de tecido, podemos observar duplicao e divergncia nos somitos que do origem aos esqueletos cervicais, lombares e torcicos. Tambm existem duplicaes e divergncias de padres particulares do desenvolvimento. Interaes epitlio-mesnquima parecem ser variaes de um nico tema (Figura 23.9; Maderson, 1975; Burke, 1989a). As glndulas de secreo da epiderme so modificaes do mesmo tipo de induo - glndulas mamrias so glndulas sudorparas
Figura 23.9
As inter-relaes nas indues epidrmicasmesenquimatosas. Durante a morfognese, o mesnquima pode causar a invaginao (A-C) ou a evaginao (D-H) da epiderme adjacente. Em alguns casos, como na formao dos membros ou da carapaa da tartaruga, o mesnquima causa a formao de uma crista ectodrmica apical (G,H). (De acordo com Burke, 1989a.)
INDUO INICIAL
INDUES SECUNDRIAS
(A) Cabelo (na pele)
(B) Glndula sudorpora ou mamria (na pele)
Epitlio ectodrmico
(C) Dente (na gengiva)
Morfognese
(D) Pena (na pele de aves)
Mesnquima
(E) Escama (na pele do rptil)
(F) Escama (na pele do peixe)
(G) Membro (em vertebrados)
(H) Carapaa (em tartaruga)
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Figura 23.10
Seco atravs do meio do tronco do embrio da tartaruga Chelydra serpentina. (A) A crista da carapaa (seta) se forma no limite entre o mesoderma da placa somtica e o mesoderma da placa lateral e agora representa o limite dorsoventral. As bandas mesodrmicas engrossadas se estendendo do centro para a rea da carapaa so as condensaes da costela. (B) Aumento maior da crista da carapaa. (De acordo com Burke, 1989b, cortesia do autor.)
(A)
(B)
modificadas embriologicamente. Da mesma maneira, a temida fileira de dentes do tubaro so modificaes das escamas do corpo. Mudanas na induo podem transformar escamas em penas (como no caso das galinhas garniz) e so responsveis por adaptaes to extraordinrias quanto o pulmo das aves, o estmago dos ruminantes, as presas dos elefantes (incisivos modificados), e as presas das morsas (dentes caninos superiores modificados). A carapaa (casco) da tartaruga uma novidade evolucionria que parece se formar de maneira reminiscente aos membros. Existe at mesmo uma crista da carapaa que organiza o mesnquima de maneira semelhante crista ectodrmica apical do broto do membro (Figura 23.10; Burke, 1989b). CoCo-opo Nenhuma estrutura destinada a um propsito particular. Um lpis pode ser usado para escrita, mas ele tambm pode ser usado como um palito, uma adaga, um instrumento perfurante ou uma baqueta. Ao nvel molecular, sabemos que o gene engrailed, usado para segmentao nos embries de Drosophila, usado posteriormente tambm para especificar seus neurnios e usado nos estgios larvais para fornecer um eixo nteroposterior aos discos imaginais. Similarmente, uma protena que funciona como uma enzima no fgado pode funcionar como uma protena cristalina estrutural no cristalino (Piatigorsky and Wistow, 1991). Em outras palavras, unidades prexistentes podem ser recrutadas para novas funes. Essa co-opo tambm vista a nvel morfolgico. As asas evoluram trs vezes durante a evoluo dos vertebrados, e em cada caso, diferentes estruturas de antebraos foram modificados para uma funo inteiramente nova. Um dos casos mais celebrados de co-opo o uso de partes da mandbula embrionria para a criao do ouvido mdio dos mamferos (revisado por Gould, 1990). Clulas da crista neural distinguem vertebrados dos protocordados e invertebrados. Os protocordados tm um tubo neural dorsal e notocorda, mas no uma cabea verdadeira. As clulas da crista neural craniana so as grandes responsveis pela criao da face, crnio e arcos branquiais. Considera-se que o desenvolvimento da cabea originalmente permitia uma predao mais eficiente, pela colocao das estruturas sensoriais adjacentes s mandbulas que capturam as presas (Gans e Northcutt, 1983; Langille e Hall, 1989; Hall, 1992). Duas transies notveis ocorreram na evoluo da mandbula do vertebrado. A primeira a criao de mandbulas a partir
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dos arcos das guelras de peixes sem mandbulas. A segunda o uso de ossos que articulavam as mandbulas superiores e inferiores nos rpteis para a formao dos ossos martelo e bigorna do ouvido mdio. Nos primeiros vertebrados, uma srie de guelras se abriu atrs de uma boca sem mandbula. Quando as fendas das guelras foram sustentadas por elementos cartilaginosos, o primeiro conjunto desses suportes de guelras circundou a boca para formar a mandbula. Existem amplas evidncias de que as mandbulas so suportes de guelras modificadas. Primeiro, esses dois conjuntos de ossos so produzidos de clulas da crista neural. (A maioria dos outros ossos procedem de tecidos mesodrmicos.) Segundo, ambas estruturas se formam de barras superiores e inferiores que se curvam para a frente e so dobradas no meio. Terceiro, a musculatura da mandbula parece ser homloga musculatura dos suportes de guelras originais. Dessa maneira, a primeira transformao da cartilagem do primeiro arco branquial foi aquela do aparelho da guelra para o aparelho da mandbula. Mas a histria no termina aqui. A parte superior do segundo arco branquial que suporta a guelra se transforma no osso hiomandibular de peixes com mandbula. Esse elemento segura o crnio e junta a mandbula ao crnio (Figura 23.11A). Como vimos no Captulo 7, essa funo do osso hiomandibular nos mamferos realizada pelo estribo, um dos ossos do ouvido mdio. Mas os peixes no usam esse osso para escutar; ento, como um osso usado para suporte de guelras e depois como suporte para o crnio se torna parte do aparelho auditivo dos mamferos? Quando o peixe chegou terra deparou-se com um novo problema: como conseguir escutar em um meio to pouco denso como o ar? Acontece que o osso hiomandibular est prximo da cpsula auditiva, e a matria ssea um excelente transmissor do som. Dessa maneira, enquanto ainda funcionava como um suporte para o crnio, o osso hiomandibular dos primeiros anfbios tambm comeou a funcionar como um transdutor de som (Clark, 1989). medida que os vertebrados terrestres alteraram sua locomoo, estrutura mandibular e postura, o crnio prendeu-se firmemente em seu lugar sem necessitar de apoios hiomandibulares. Parece ter se especializado em seguida como o osso estribo do ouvido mdio. O que havia sido a segunda funo desse osso acabou se tornando sua funo primria. Os ossos originais da mandbula tambm mudaram. O primeiro arco branquial gera o aparelho da mandbula. Nos anfbios, rpteis e pssaros, a poro posterior dessa cartilagem forma o osso quadrado da mandbula superior e o osso articular da mandbula inferior. Esses ossos se conectam e so responsveis pela articulao na mandbula superior e inferior. No entanto, nos mamferos, essa articulao ocorre em outra regio (os ossos dentrios e escamosos), com isso liberando esses elementos sseos para adquirirem novas funes. Os osso quadrado da mandbula superior dos rpteis evoluiu nos mamferos transformando-se no osso bigorna e o osso articular da mandbula inferior dos rpteis se tornou nosso osso martelo. Esse segundo processo foi primeiramente descrito por Reichert em 1837, que observou no embrio do porco que a mandbula se ossifica pelo lado da cartilagem de Meckel, enquanto a regio posterior dessa cartilagem se ossifica, se destaca do resto da cartilagem, e entra na regio do ouvido mdio para se tornar o osso martelo (Figura 23.11B,C)*
* A falta de formas de transio freqentemente citada pelos Criacionistas como uma crtica da evoluo. Por exemplo, na transio de rpteis para mamferos, trs ossos da mandbula dos rpteis se tornaram martelo e bigorna, deixando somente um osso (dentrio) na mandbula inferior. Gish (1973), um Criacionista, disse que isso uma situao impossvel, pois nenhum fssil com dois ou mais ossos da mandbula e dois ou trs ossculos do ouvido fora encontrado. Ele considerou que tal animal teria arrastado suas mandbulas pelo cho. Entretanto, tal forma de transio especfica no precisaria ter existido (h mais de dzia de formas de transio documentadas entre crnios de rpteis e mamferos). Hopson (1966) mostrou com bases embriolgicas como os ossos da mandbula poderiam ter se dividido e usados para diversas funes, e Romer (1970) encontrou fsseis de rpteis onde as novas articulaes da mandbula j eram funcionais enquanto ossos mais antigos se tornavam inteis. Existem vrias espcies de rpteis terapsdeos com duas articulaes de mandbula, com a bigorna junto a parte superior do osso quadrado (que vir se tornar o osso bigorna). [evo3.html]
(A) Mandbula superior Caixa craniana Suportes das guelras
Mandbula inferior
Hiomandibular
Escamoso (B) Quadrado Pr-maxilar Nasal Maxilar
Articular Dentrio
(C)
Escamoso (temporal)
Nasal
Auditivo Zigomtico Maxila Mandbula
Figura 23.11
Evoluo da mandbula no peixe (A), no rptil (B) e no mamfero (C). (A) Homologias da mandbula e dos arcos das guelras como vistas no crnio do tubaro paleozico Cobeledus aculentes. (B) Vista lateral do crnio de um crocodilo. A poro articular da mandbula inferior se articula com o osso quadrado do crnio. Nos mamferos, o quadrado se internaliza para formar a bigorna do ouvido mdio. O osso articular mantm seu contato com o quadrado, tornando-se o martelo do ouvido mdio. Vista lateral do crnio humano, mostrando a juno da mandbula inferior com a regio escamosa (temporal) do crnio. (De acordo com Zangerl e Williams, 1975.)
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A existncia de discretos mdulos de desenvolvimento permitiu que os princpios de dissociao, duplicao e divergncia e co-opo formassem novos tipos de organismos. Progresso correlacionada Uma conseqncia evolucionria da natureza modular do desenvolvimento a progresso correlacionada. Aqui, mudanas em uma parte do embrio induzem mudanas em outras. A cartilagem esqueltica informa a colocao dos msculos, e os msculos induzem a colocao dos axnios dos nervos. Nesses casos, se uma estrutura muda, isso ir induzir que outras estruturas tambm o faam (Thomson, 1988). As mudanas dramticas na organizao dos ossos, desde os gnatos at os peixes com mandbulas, dos peixes com mandbulas at os anfbios, e dos rpteis at os mamferos foram todas coordenadas atravs de mudanas nas estruturas da mandbula, musculatura da mandbula, deposio e formato dos dentes e modificaes da abboda cranial e ouvido (Kemp, 1982; Thomson, 1988). Em 1995, Rowe formulou a tese de que a migrao da cartilagem da mandbula dos rpteis para formar a cartilagem do ouvido mdio por si s um caso de progresso correlacionada, ou seja, uma conseqncia do aumento da caixa craniana pelo qual os precursores da cartilagem foram liberados para migrar caudalmente. Podemos observar tambm a progresso correlacionada ao longo de um curto perodo em animais domsticos. Humanos tm um grande talento para selecionar variantes hereditrias em animais domsticos que envolvem aquelas clulas da crista neural formadoras dos processos mandibular e frontonasal. Em tais casos, como o do bulldog, a raa selecionada para se obter uma face larga com um ngulo muito pequeno entre a mandbula e a cabea. Outras raas como o collie so selecionadas visando obter um focinho estreito com uma mandbula alongada distanciando-se da cabea. Todas as raas podem mover suas mandbulas, sacudir suas cabeas e latir, apesar das diferenas na via que seus ossos so formados ou posicionados. Cada variao geneticamente determinada; e importante notar que cada uma representa uma reordenao harmoniosa dos diferentes ossos que interagem entre si e com suas ligaes musculares. Com a seleo dos elementos esquelticos, tambm foram selecionados os msculos que os movem, os nervos que controlam os movimentos, e os vasos sangneos que os alimentam.* O mecanismo pelo qual o aparelho da mandbula manteve sua integridade desde as lamprias at os amniotas um extraordinrio exemplo de mdulos embrionrios. As estruturas da cabea de vertebrados derivadas da crista neural, incluem os arcos farngeos (os precursores da mandbula, ouvido mdio, esqueleto da lngua, etc.) to bem quanto os ossos drmicos da face e a musculatura facial (veja Captulo 7). A caixa craniana um produto de tecidos mesodrmicos. Substituindo rombmeros individuais de pinto pelos de codornas, Kntges e Lumsden (1996) foram capazes de mapear os destinos das clulas da crista neural associadas com os rombmeros da codorna (Figura 23.12). Os anticorpos marcando as clulas da crista neural das codornas mostraram que cada rombmero d origem a um elemento esqueltico em particular e aos msculos a eles atados. Ademais, se descobriu que os mdulos msculo-e-esqueleto de cada rombmero foram enervados por um nervo cranial especfico. Por exemplo, as clulas da crista neural do rombmero 4 geraram quatro tecidos esquelticos - o processo retroarticular da mandbula inferior (encontrado nas aves mas no nos mamferos), uma poro do esqueleto da lngua, o osso bigorna do ouvido mdio, e supreendentemente, a pequena poro da caixa craniana onde os msculos de abertura da mandbula se ligam ao crnio, principalmente derivado do mesoderma. Os msculos que conectam esses quatro elementos esquelticos tambm
*Entretanto essa coordenao no totalmente universal. Em ces com faces muito acentuadas (como os bulldogs), a pele no coordenou o seu desenvolvimento com os ossos e, portanto, fica pendente em dobras desde a cabea (Stockard, 1941).
(A) Crebro mdio Crebro posterior
(B)
Estribo
Parte da caixa craniana Esqueleto da lngua Processo retroarticular
Figura 23.12
Clulas da crista neural de rombmeros do embrio de pinto e seus pacotes msculoesquelticos. (A) Embrio de pinto de dois dias mostrando a contribuio das clulas da crista rombomrica aos arcos farngeos. (A maioria das clulas da crista neural de r3 e r5 sofrem apoptose, enquanto que o resto dessas clulas contribuem para a populao maior de clulas da crista neural de r4.) (B) Embrio de 10 dias mostrando os ossos das mandbulas superior e inferior, o esqueleto da lngua e o ouvido mdio derivados das clulas da crista rombomrica. Os msculos derivados de r4 so ligados aos ossos do mesmo rombmero, e a parte da caixa craniana ligada ao msculo da abertura da mandbula derivado de r4 tambm derivada do mesmo rombmero. (Para maior clareza outros msculos foram omitidos.) (De acordo com Ahlberg, 1997.)
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(A) Padres esquelticos embrionrios Archaeopteryx
(B) Padres esquelticos finais
(C) Padres musculares finais
Ave moderna
Msculo poplteo
Ave experimental
Rptil (Crocodylus)
(D)
Figura 23.13
vieram das clulas da crista neural do rombmero 4. Todos esses msculos so inervados pelo nervo cranial VII. Os rombmeros formam uma unidade modular, constituindo dos elementos esquelticos do arco farngeo, os msculos que os movem, o local de ligao dos msculos caixa craniana, e os nervos que inervam os msculos. Como esses msculos e ossos so formados das mesmas clulas, suas relaes podem ser mantidas apesar das mudanas dramticas nas posies e funes que esses elementos poderiam sofrer ao longo do tempo. A progresso correlacionada tambm foi mostrada experimentalmente. Repetindo experimentos anteriores de Hamp (1959), Gerd Muller (1989) inseriu barreiras folheadas de ouro dentro de brotos precondrognicos de membros posteriores de um embrio de pinto de trs dias e meio. A barreira separava as regies da formao da tbia e da formao fbula. Os resultados desse experimento so duplos. Primeiro, a tbia encurtada e a fbula se dobra e retm sua conexo ao fibular. Tais relacionamentos entre a tbia e a fbula no so muito comuns em pssaros, mas so caractersticos de rpteis (Figura 23.13). Segundo, a musculatura do membro posterior sofre mudanas paralelas com os ossos. Trs dos msculos que se ligam a esses ossos agora mostram padres de insero caractersticos de rpteis. Nos parece, portanto, que manipulaes experimentais que alteram o desenvolvimento de uma parte do campo mesodrmico formador de membros tambm altera o desenvolvimento de outros componentes mesodrmicos. Como na progresso correlacionada observada no desenvolvimento da face, essas mudanas parecem ser todas devidas s interaes dentro de um campo, nesse caso, o campo dos membros posteriores do pinto. Esses no so efeitos globais e podem ocorrer independente de outras partes do corpo.
Atavismos experimentais produzidos pela alterao de campos embrionrios no membro. (A-C) Resultados dos experimentos de Mller onde lminas folheadas de ouro dividem o campo do membro posterior do pinto. (A,B) O padro embrionrio e final do osso, indicando que a estrutura fibular foi retida pelo membro experimental do pinto, como o em rpteis existentes e como se considera que foi no Archaeopteryx. (C) Algumas das mudanas musculares correlacionadas nos embries experimentais de pinto. O msculo poplteo est presente no pinto, mas ausente nos membros de rpteis e nos membros experimentais. O msculo fibular brevis, que normalmente se origina da tbia e da fbula no pinto, assume o padro reptiliano originando somente da fbula nos membros operados. (D) Archaeopteryx fssil em calcrio. A impresso das penas pode ser vista claramente. Se no fossem as penas, esse organismo dentado seria provavelmente classificado como um rptil. (A-C de acordo com Mller, 1989; fotografia cortesia de B. A. Mller/Biological Photo Service.)
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Restries ao desenvolvimento
Embora discretamente, os mdulos de desenvolvimento podem interagir uns com os outros. Essas interaes limitam os fentipos possveis que podem ser criados, e tambm permitem a ocorrncia de mudanas em certas direes com maior eficincia do que em outras.* Coletivamente, essas restries na produo de fentipos so chamadas de restries do desenvolvimento. Restries Fsicas Fizemos aluso ao fato de que existem relativamente poucos Bauplne, e podemos facilmente imaginar tipos de animais que no existem dentro de um filo existente. Por que no existem mais tipos principais de corpos entre os animais? Para responder a isso, temos que considerar as restries impostas na evoluo. Existem trs classes principais de restries na evoluo morfogentica. Primeiro, existem as restries fsicas na construo de um organismo. Essas restries de difuso, hidrulica e sustentao fsica permitem que somente certos mecanismos do desenvolvimento ocorram. Podemos observar que no existe um vertebrado com apndices virados (parecido com que Dorothy viu em o Mgico de Oz) porque o sangue no circula em rgos que giram; toda essa possibilidade da evoluo foi abandonada. Similarmente, parmetros estruturais e a dinmica de fluidos impossibilitam a existncia de um pernilongo de um metro e meio de altura. [evo4.html] Restries Morfogenticas Existem tambm restries envolvendo regras de construo morfogentica (Oster et al., 1988). Bateson (1894) ressaltou que quando organismos se afastam do seu desenvolvimento normal, eles o fazem em somente um nmero limitado de maneiras. Pesquisas nessa rea tentam encontrar parmetros arquitetnicos pelos quais os organismos so construdos e procuram mostrar como esses parmetros podem ser modificados durante a evoluo. Alguns dos melhores exemplos desses tipos de restries vm da anlise da formao de membros em vertebrados. Holder (1983) afirma que embora possam ter havido muitas modificaes do membro vertebrado nestes 300 milhes de anos, algumas modificaes (tais como o dedo indicador ser mais curto que os dedos vizinhos) no foram encontradas. Alm do mais, anlises de populaes naturais sugerem que existe um nmero relativamente pequeno de caminhos pelos quais a mudana nos membros pode ocorrer (Wake e Larson, 1987). Se um membro mais longo favorvel em determinado ambiente, o mero pode se tornar alongado. Jamais veremos dois meros pequenos unidos juntos em dois lugares, embora possamos imaginar as vantagens seletivas que essa distribuio poderia ter. Isso indica um esquema de construo que tem certas regras. As regras principais para a formao de um membro vertebrado foi resumida por Oster e seus colegas (1988). Eles descobriram que o mecanismo de reao-difuso pode explicar as morfologias conhecidas do membro e tambm pode explicar porque outras morfologias so proibidas. Esse modelo postula que as agregaes da cartilagem recrutam ativamente mais clulas da rea em volta e inibem lateralmente a formao de outros focos de condensao. O nmero de focos depende da geometria do tecido e a fora da inibio lateral. Se a inibio permanece a mesma, o tamanho do volume do tecido deve aumentar para permitir a formao de dois focos onde inicialmente s havia um. Num dado limite (chamado de limite de bifurcao), esse tamanho alcanado, e o membro pode se ramificar em dois focos.
*Leibniz, provavelmente o filsofo que mais influenciou Darwin, notou que a existncia deve ser limitada no somente pelo possvel, mas tambm pelo mutuamente compatvel. Isto , enquanto diversas coisas podem vir a existir, somente aquelas que so mutualmente compatveis iro realmente existir (veja Lovejoy, 1964). Assim, embora muitas mudanas do desenvolvimento sejam possveis, somente aquelas que podem se integrar ao resto do organismo (ou que podem causar mudanas compensatrias no resto do organismo) sero vistas.
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Prognese natural
(D) Hemidactylium scutatum Tbia (A) Ambystoma mexicanum Fbula Tbia
(E) Proteus anguinus Tbia VARIAO NATURAL Fbula
Fbula
Tbia Tbia VARIAO EXPERIMENTAL Fbula Fbula
Decrscimo experimental no nmero de clulas
Figura 23.14
Evidncias para esse modelo matemtico vm de manipulaes experimentais e da anatomia comparativa. Quando um broto do membro de axolotle tratado com a droga antimittica colchicina, as dimenses dos membros so reduzidas. Nesses membros no ocorre somente a reduo dos dedos, mas a reduo de certos dedos em uma certa ordem, como esperado pelo modelo matemtico e pelas morfologias proibidas. Ademais, essas redues de dedos especficos so muito similares aqueles membros de salamandras progenticas, aquelas espcies que alcanam a maturidade em um estgio menor do que seus ancestrais e cujos membros se desenvolvem a partir de brotos de membros menores (Figura 23.14; Alberch e Gale, 1983, 1985). Dessa maneira, o uso de mecanismos de reao-difuso para construir membros pode restringir as possibilidades que podem ser geradas durante o desenvolvimento, porque somente certos tipos de membros so possveis usando essas regras. Filticas Restries Filticas Restries filticas compreendem o terceiro conjunto de restries na evoluo de novos tipos de estruturas (Gould e Lewontin, 1979). Essas so as restries histricas baseadas na gentica do desenvolvimento do organismo. Por exemplo, uma vez gerada uma estrutura por interaes indutivas, difcil recomear novamente. A notocorda, que ainda funcional em protocordados adultos (Berril, 1987), considerada vestigial em mamferos e aves adultos. No entanto, ela pode ser momentaneamente necessria no embrio para especificar o tubo neural. Similarmente, Waddington (1938) notou que embora o rim pronfrico do embrio de pinto seja considerado vestigial (uma vez que no tem habilidade para concentrar urina), ele a fonte do broto uretrico que induz a formao de um rim funcional durante o desenvolvimento do pinto. Esse tipo de restrio filtica foi recentemente revisto por Raff e colegas (1991). At recentemente, acreditava-se que os primeiros estgios do desenvolvimento seriam os mais difceis para mudar, porque a sua alterao iria destruir o embrio ou gerar um fentipo radicalmente novo. Mas trabalho recente (e reavaliao do antigo) mostrou que alteraes podem ser feitas nas primeiras clivagens sem alteraes no resultado final. Modificaes de morfgenos em embries de moluscos podem dar origem
Relao entre o nmero de clulas e o nmero de dgitos na salamandra. (A) O membro posterior de um axolotle (Ambystoma mexicanum) com seus cinco dgitos simtricos. (B,C) Dgitos no membro posterior do axolotle aps incubao do broto do membro posterior em colchicina para reduzir o nmero de clulas. (D,E) Duas salamandras selvagens formadas por prognese, cada uma possuindo um broto de membro menor. (D) Hemidactylium scutatum. (E) Proteus anguinus. Os paralelos entre as variaes experimental e natural podem ser vistos, e o denominador comum o nmero reduzido de clulas nos brotos do membro. (De acordo com Oster et al., 1988.)
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a novos tipos de larvas que ainda sofrem metamorfose em moluscos, e mudanas nos morfgenos citoplasmticos do ourio-do-mar podem gerar ourios-do-mar que se desenvolvem sem larvas mas ainda so ourios-do-mar. Na realidade, ao olharmos para os vertebrados, podemos observar que existe uma histria completa que nos leva at o famoso diagrama da lei de von Baer mostrado no Captulo 7. Todos os vertebrados chegam a esse estgio particular do desenvolvimento (chamado de farngula), mas o fazem por meios diferentes (Figura 23.15). Aves, rpteis e peixes chegam a esse ponto aps clivagens meroblsticas de tipos diversos; os anfbios chegam a esse estgio por meio de clivagem holoblstica radial; e os mamferos alcanam o mesmo ponto aps construrem um blastocisto, crion e mnio. Portanto, os primeiros estgios do desenvolvimento parecem ser extremamente plsticos. Similarmente, os ltimos
SALAMANDRA
PINTO
HOMEM
Ovo (em escala)
Blstula (seco)
Gstrula
Figura 23.15
O gargalo no estgio faringular do desenvolvimento dos vertebrados. A parte inferior deste esquema a ilustrao padro da lei de von Baer (como mostrado no Captulo 7), demonstrando a divergncia das classes de vertebrados aps um estgio embrionrio comum. A parte superior deste esquema representa os incios divergentes do desenvolvimento. O prprio von Baer (1886) estava consciente desse gargalo. (De acordo com Elinson, 1987.)
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estgios so muito diferentes, como as diferenas nos fentipos de camundongos, peixes-lua, cobras e salamandras demonstram amplamente. Existe algo no meio do desenvolvimento que aparenta ser invariante. Raff argumenta que a formao de novos Bauplne inibida pela necessidade de seqncias globais de induo durante o estgio de nurula (Figura 23.16). Antes desse estgio, existem poucos eventos indutivos. Aps aquele perodo, existem muitos efeitos indutivos, mas quase todos eles feitos em mdulos discretos. Durante a organognese precoce, no entanto, existem diversos eventos indutivos ocorrendo simultaneamente que so globais na natureza. Nesse estgio, os mdulos se sobrepem e interagem uns com os outros. Nos vertebrados, usando o exemplo de von Baer, nos primeiros estgios se d a especificao dos eixos e a gastrulao. A induo no aconteceu em larga escala. Ademais, como Raff e seus colegas mostraram (Henry et al.,1989), existe aqui uma grande habilidade regulativa, assim, pequenas mudanas na distribuio dos morfgenos, ou na posio das clivagens planas podem ser acomodadas. Aps a fixao do principal plano corporal, ocorrem indues por todo o corpo, mas essas so compartimentalizadas em discretos sistemas de formao de rgos. O cristalino induz a formao da crnea, e se essa falhar, somente o olho afetado. Similarmente, existem indues na pele que formam penas, escamas ou plo. Se essas no ocorrerem, a pele ou parte dela pode no ter essas estruturas. Mas durante a organognese precoce, as interaes so mais globais (Slack, 1983). Uma falha na colocao do corao em determinado lugar pode afetar a induo dos olhos (veja Captulo 17). Uma falha na induo do mesoderma em uma certa regio leva a m formao dos rins, membros e cauda. esse estgio que restringe a evoluo e que tipifica o filo vertebrado. Dessa maneira, uma vez vertebrado, muito difcil se desenvolver em outra coisa. Evoluo Conjunta do Ligante e Receptor: Isolamento Reprodutivo Outra restrio do desenvolvimento envolve a habilidade de um tecido de interagir com outro. No desenvolvimento, as coisas tm de se ajustar perfeitamente se o organismo ir sobreviver. Os ligantes tm que se ajustar aos receptores, e devem ser expressos no lugar certo e na hora certa. Mudanas no ligante tm que ser acomodadas por mudanas complementares no receptor para que esse possa funcionar. No entanto, se a mudana na estrutura do ligante (ou receptor) produzir uma mudana muito grande, esse no se ligar ao seu receptor (ou ligante), e o desenvolvimento ir cessar. Essas mudanas complementares podem levar a uma separao de funes, como pode ser observada na evoluo das famlias de hormnios e seus receptores (Moyle et al.,1994). Tal separao de funes pode causar isolamento reprodutivo e a separao de espcies quando o receptor e o ligante so protenas no espermatozide e no vulo. Enquanto a maioria das protenas de espcies marinhas relacionadas so muito similares, as protenas responsveis pela fertilizao so muitas vezes extremamente diferentes (Metz et al., 1994). Nos ourios-do-mar, a bindina do espermatozide e os receptores complementares do vulo co-evoluram em conjunto de modo que a bindina de uma espcie freqentemente no reconhece os receptores bindina no ocito de outra. Hofmann e Glabe (1994) propuseram um modelo onde existiriam diversos stios de reconhecimento distintos entre a bindina e seus receptores. As mutaes poderiam causar alguma alterao nesses stios e, dessa forma, selecionando alteraes complementares no gameta oposto. Existiria um estgio no qual alguns espermatozides poderiam se unir, embora precariamente aos vulos, mas finalmente, esse processo de alterao e acomodao produziria dois grupos reprodutivos isolados dentro das espcies (Figura 23.17). Nos haliotes, as mutaes de uma pequena regio da protena lisina e seus receptores correspondentes parecem ser as responsveis pela especificidade de fertilizao da espcie. Ademais, a evoluo dessas mudanas nas protenas lisina e bindina parece
(A)
(B)
(C)
Figura 23.16
Mecanismo do gargalo no estgio faringular do desenvolvimento em vertebrados. (A) No embrio em clivagem existem interaes globais, mas elas so muito poucas (principalmente para especificar os eixos do organismo). (B) Entre os estgios de nurula e farngula existem muitas interaes globais. (C) Aps o estgio faringular existem ainda mais interaes indutivas, mas essas so principalmente de efeito local, confinadas aos seus prprios campos. (De acordo com Raff, 1994.)
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Figura 23.17
Modelo hipottico para o sistema de reconhecimento entre o espermatozide e o vulo em duas espcies relacionadas de ourio-domar. O espermatozide de Strongylocentrotus purpuratus pode ligar o receptor no vulo. Analogamente, o espermatozide de S. franciscanus pode se ligar com seu receptor do vulo. O espematozide de S. purpuratus no se ligar a vulos de S. franciscanus, mas o espermatozide desse se ligar fracamente a vulos de S. purpuratus. Postula-se que cada um dos elementos repetidos na protena bindina interage com stios complementares nos seus respectivos receptores de bindina. A co-evoluo entre a bindina e seu receptor pode ter separado as duas espcies. (De acordo com Shaw et al., 1994.)
Cruzamento homlogo
Protena bindina do espermatozide Bindina S.p. Receptor S.p. Protena do receptor no vulo Bindina S.f. Receptor S.f.
Cruzamento heterlogo
Bindina S.p.
Bindina S.f. Receptor S.p.
Receptor S.f. Sem ligao Ligao fraca
ser rpida e se correlaciona com a especiao (Shaw et al.,1994; Lee et al., 1995; Metz e Palumbi, 1996).*
O mecanismo gentico do desenvolvimento da mudana evolucionria: Genes reguladores homlogos

Descendncia com modificao pode ser demonstrada agora a nvel molecular. Ademais, pode se mostrar que as modificaes envolvem genes reguladores. Roth (1984) definiu homologia como o compartilhamento de vias do desenvolvimento, as quais so controladas por genes relacionados genealogicamente. Mas quando Roth fez essa definio influente, os caminhos do desenvolvimento ainda no haviam sido elucidados. Podemos dizer agora muito mais sobre evoluo e desenvolvimento e podemos dar sustentao ao conceito de que herdamos vias de desenvolvimento e que a evoluo pode ocorrer quando os elementos dessas vias so mudados. Pax6 e o desenvolvimento do olho Na gentica populacional, a principal suposio relacionada evoluo foi que a busca de genes homlogos completamente intil a no ser em parentes muito prximos (Dobzhansky, 1955; Mayr, 1966). No entanto, a biologia molecular e a gentica do desenvolvimento mostraram que essa suposio totalmente invlida. A extraordinria concluso que os genes responsveis por determinadas funes no desenvolvimento foram conservados por mais de 100 milhes de anos. Ademais, modificaes nesses genes e seus alvos podem causar a maior parte da diversidade dos organismos vivos. Uma das descobertas mais eletrizantes foi que o gene Pax6 rege o desenvolvimento do olho em espcies to distantes quanto moscas e humanos. O desenvolvimento do olho do mamfero, do inseto e do molusco, so muito diferentes um do outro. O olho das moscas contm numerosos omatdios e se desenvolvem a partir de um sulco morfogentico que se estende ao longo de um disco imaginal. O olho do cefalpode se desenvolve atravs da separao das regies formadoras do cristalino e da retina a partir de um placdio comum. O olho de
*Um outro exemplo de mutao do desenvolvimento que causa isolamento reprodutivo envolve uma funo mais mecnica. As mutaes no espiralamento da concha do caramujo discutidas no Captulo 5 so mutaes que agem durante o desenvolvimento precoce para mudar a posio dos rgos mesodrmicos. O acasalamento entre caramujos de conchas com espiralamento para a esquerda e com caramujos de conchas com espiralamento direita mecanicamente muito difcil, para no dizer impossvel, em algumas espcies. (Clark e Murray, 1969). Como essa mutao herdada como um gene de efeito materno, seria produzido um grupo de caramujos relacionados podendo se acasalar um com o outro, mas no com outros membros da populao original. Esses caramujos reprodutivamente isolados poderiam expandir seu alcance, e por acumulao de novas mutaes, formar uma nova espcie (Alexandrov Sergievski, 1984).
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mamfero se desenvolve atravs de uma srie de interaes indutivas envolvendo uma protuberncia do diencfalo em contato com o ectoderma da superfcie (veja Captulo 17). Considerava-se que os trs tipos de olhos mostravam evoluo convergente e que o olho tinha evoludo independentemente em cada um desses trs grupos. Porm, pesquisas recentes mostram que os olhos de insetos e de vertebrados no tm origens distintas, mas se originaram em um passado distante de um antepassado em comum. Alelos mutantes do gene humano PAX6 so responsveis por malformaes do olho (Hanson et al., 1994). Heterozigotos so notveis pois carecem de ris. Um feto humano que se acreditava ter mutaes homozigotas do PAX6 foi descrito como no tendo olhos e com vrias anormalidades craniofaciais (Hodgson e Saunders, 1980). No camundongo e no rato, esse gene chamado Small eyes, devido ao fentipo do heterozigoto. Fetos homozigotos de camundongo e rato morrem logo aps o nascimento e no tm nariz nem olhos (Hogan et al., 1986; Grindley et al., 1995). A grande semelhana entre a estrutura e funo dos genes Pax6 em camundongos e humanos era esperada. Porm, em 1994, a pesquisadora Quiring e seus colegas no laboratrio de Walter Gehring mostraram que o genoma da Drosophila continha um homlogo de Pax6 que codificava uma protena cuja seqncia mostrava 94% de identidade com a protena Pax6 humana. Mutaes de perda-de-funo no Pax6 da Drosophila apontam para o gene eyless, um gene caracterizado por olhos pequenos em heterozigotos e falta de olhos em homozigotos. Parece, portanto, que existe um gene em comum - Pax6 - que necessrio para o desenvolvimento dos olhos tanto em insetos como vertebrados.* Como evidncia positiva mais forte do que evidncia negativa, o laboratrio de Gehring expressou o Pax6 de Drosophila (i.e., o gene eyeless tipo selvagem) em discos imaginais que normalmente no o expressam. Halder e seus colegas (1995) colocaram genes codificando a protena ativadora de transcrio, GAL4, do levedo a jusante de um intensificador que iria funcionar em uma poro no-neural da mosca, tal como um disco imaginal de uma perna ou asa. Em seguida, eles construram um transposon, colocando o cDNA para o gene eyless a jusante de uma seqncia composta de cinco stios de ligao de GAL4. A protena GAL4 s podia ser produzida em um determinado disco imaginal, e quando essa protena fosse produzida, causaria a transcrio do cDNA de eyeless nessas clulas em particular (Figura 23.18A). Em moscas nas quais o cDNA eyeless era expresso nos discos antenais, as antenas tornaram-se os omatdios pigmentados e com cerdas, caractersticas dos olhos de Drosophila (Prancha 28). Quando o cDNA de eyeless foi expresso no disco alar, parte da cutcula alar deu origem a olhos (Figura 23.18B). Mais notvel ainda, quando o cDNA do eyeless de Drosophila foi substitudo por cDNA de Pax6 de camundongo e colocado sob controle do sistema de expresso GAL4, a protena Pax6 murina causou a formao de olhos ectpicos de Drosophila (Figura 23.18C)! O gene Pax6 parece ser um regulador da via formadora do olho tanto de vertebrados como de insetos. Mas os olhos no so os mesmos. Permanece para ser entendido como esses caminhos divergiram durante a evoluo para produzir os diferentes tipos de olhos atualmente vistos. Parece que o gene Pax6 conservado em todo o do reino animal e que codifica um fator de transcrio que se liga a genes formadores de olhos em todo esse reino. O gene Pax6 no o nico regulador do desenvolvimento que parece ser homlogo em insetos e mamferos. Outro tal gene o tinman que contm a seqncia homebox. Esse gene expresso no mesoderma esplncnico de Drosophila, finalizando por residir na
*O modelo antes dessa pesquisa era que os olhos haviam se desenvolvido independentemente pelo menos 40 vezes. O laboratrio de Gehring mencionou a clonagem de homlogos de Pax6 de platelmintos e cefalpodes. Um segundo gene de Drosophila, dachshund (dac), tambm pode dar origem a olhos ectpicos quando expresso no disco imaginal errado. Como parece que eyeless pode ativar a expresso de dachshund, e vice-versa, os dois genes podem ter desenvolvido uma ala de retroalimentao (feedback) positiva autoreforante (Shen e Mardon, 1997).
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Figura 23.18
Pax-6 como um gene homlogo para o desenvolvimento do olho em insetos e vertebrados. (A) A expresso dirigida do cDNA de Pax6 em um disco imaginal no de olho em Drosophila. Uma espcie de Drosophila construda onde o gene para a protena GAL4 do levedo colocado a jusante de uma seqncia intensificadora que estimula a expresso no disco imaginal da asa, perna ou antena. Normalmente, a protena do levedo no encontra uma seqncia para ativar. Entretanto, se adicionado ao embrio um transposon que leva um cDNA para Pax6 a jusante dos stios de ligao de GAL 4, aquele cDNA ser expresso em quaisquer dos discos imaginais onde produzida a protena GAL4. (B) Omatdios de Drosophila emergindo da asa de uma mosca da fruta quando o cDNA de eyeless foi expresso no disco da asa de Drosophila. (C) Omatdios de Drosophila emergindo na perna de uma mosca da fruta quando o cDNA de Pax6 de camundongo foi expresso no disco da perna de Drosophila. (de Halder et al., 1995; fotografias cortesia de W. J. Gehring.)
Seqncia intensificadora especfica do disco imaginal
GAL4
Protena ativadora de GAL4
Stios ligantes de GAL4
cDNA de Pax6
Expresso GAL4 especfica de tecido
Expresso do cDNA de Pax6 especfica de tecido
regio do mesoderma cardaco. Mutantes de perda-de-funo de tinman no tm o corao (da seu nome segundo o personagem do Mgico de Oz) (Bodmer, 1993). Em camundongos, o gene homlogo chamado Cardiac-specific homebox (Csx), e tambm expresso originalmente no mesoderma esplncnico e em seguida continua a ser expresso nas clulas que iro formar os tubos cardacos (Manak e Scott, 1994). Assim, embora o corao dos vertebrados e o corao dos insetos praticamente nada tm em comum, exceto sua capacidade de bombear fluidos, ambos parecem ser preditos pela expresso do mesmo gene Csx/tinman. A diferena entre os coraes deve residir nos genes regulados pela protena CSX/Tinman. BMP4 e a Morfognese dos Membros Em alguns casos, um gene homlogo pode assumir uma nova funo quando expresso em um novo local. A expresso de Bmp4 no membro do pinto um bom exemplo de como uma pequena mudana desenvolvimental pode criar uma importante alterao morfolgica, do ponto de vista evolucionrio. A maioria das pessoas concordaria que o pato e o pinto no so iguais, embora sua embriognese seja extremamente semelhante at os ltimos dias. Nesse momento, o bico do pato torna-se distinguvel do bico do pinto, e os ps interdigitados do pato so retidos, mas a interdigitao perdida nos ps posteriores do pinto. BMP4 conhecida como indutora de apoptose em clulas na crista neural craniana, no mesnquima pulmonar e nos brotos dentais. Ela tambm causa apoptose no tecido interdigital frouxo do membro do pinto. No s o Bmp4 expresso no tecido interdigital, mas se os membros do pinto forem infectados com um vrus expressando uma forma negativa dominante do receptor de BMP, o tecido interdigital no sofrer apoptose quando receber o sinal BMP4 (Figura 23.19; Yokouchi et al., 1996; Zou e Niswander, 1996). O pinto e o pato mostram padres muito similares na expresso de BMP. Porm, embries de pato no expressam Bmp4 (ou BMP2 ou 7, relacionados) em seus tecidos
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(B) (A)
Figura 23.19
interdigitais. Portanto, mudando ligeiramente a regulao de Bmp4 produzida uma nova morfologia que pode ser selecionada ou rejeitada pela seleo natural. Alteraes no desenvolvimento podem produzir a chegada do mais apto. Sua sobrevivncia depende do seu ambiente. Hox Vertebrados Genes Hox e a Evoluo dos Vertebrados Uma das mais notveis peas de evidncia da profunda homologia entre todos animais do mundo fornecida pelos genes Hox. Conforme mencionado no Captulo 16, os genes Hom-C da mosca da fruta so homlogos aos do mamfero. No somente so os genes homlogos, como tambm esto na mesma ordem em seus respectivos cromossomos. Os padres de expresso so tambm notavelmente semelhantes; a expresso dos genes do terminal 3 ocorre anteriormente, enquanto aqueles do terminal 5 so expressos mais posteriormente. Como se essa evidncia de homologia no fosse o suficiente, Malicki e colegas (1992) demonstraram que o gene humano HOX4B podia imitar a funo de seu homlogo na Drosophila, Deformed, quando introduzido em embries de Drosophila deficientes em Dfd. Slack e colegas (1993) postularam que o padro de expresso do gene Hox define o desenvolvimento de todos os animais e que constante para todos os filos, o gene Hox tipo labial sendo expresso anteriormente, o gene Hox tipo Ubx no centro, e o gene Hox tipo AbdB posteriormente. A regulao global desses genes Hox tambm semelhante de espcies para espcies. A protena Caudal usada para induzir os domnios posteriores da Drosophila, e parece fazer o mesmo em camundongos e nematides (Subramanian et al., 1995). Se a expresso subjacente do gene Hox for uniforme, considera-se que diferenas nos filos emergem de diferenas em como esses genes so regulados e quais genes so regulados pelas protenas derivadas de Hox.* Em vertebrados, existem quatro complexos Hox. Em anfioxus, um cordado novertebrado que carece de uma cabea verdadeira, crebro, tecidos da crista neural, e medula espinhal, h somente um complexo Hox muito parecido com aquele dos insetos (Figura 23.20; Holland e Garcia-Fernndez, 1996). Quando da evoluo dos peixes, haviam quatro complexos Hox. Os genes Hox parecem interpretar a informao posicional ao longo do eixo ntero-posterior do corpo, e a importncia desses genes relacionando evoluo e desenvolvimento foi sugerida por certas estruturas atavisticas que resultaram da perda de determinados genes Hox. A ruptura de genes
* Considera-se que a razo dessa notvel conservao de estrutura do complexo do gene Hox o compartilhamento de regimes cis-reguladores pelos genes vizinhos. Se um gene Hox movido para uma regio diferente dentro do complexo, sua regulao alterada. Os regimes reguladores crticos podem ser os stios ligantes para as protenas Polycomb. Essas protenas so tambm conservadas atravs da evoluo, e silenciam os genes Hox em determinados momentos e locais. Aqui, portanto, vemos uma restrio filtica a nvel molecular (Chiang et al., 1995; Mller et al., 1995; van der Hoeven et al., 1996).
Expresso de BMP necessria para a induo de apoptose no enredamento interdigital em embries de pinto. (A) A BMP4 vista no enredamento interdigital do membro posterior do pinto (esquerda) mas no no do pato (direita) no mesmo estgio do desenvolvimento. (B) Quando o sinal de BMP bloqueado por um receptor negativo dominante infectado no membro posterior, a apoptose interdigital no ocorre e os dgitos so mais curtos. (de Zou e Niswander, 1996; fotografias cortesia de L. Niswander.)
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Figura 23.20
Ascendncia postulada de genes hometicos a partir de um ancestral hipottico tanto de deuterostomatas como protostomatas. Anfioxos tm somente um aglomerado, semelhante aos insetos. Vertebrados tm quatro aglomerados, nenhum dos quais completo. (De acordo com Holland e Garcia-Fernndez, 1996.)
HOM-C de Drosophila HOM-C de inseto em geral Ancestral comum hipottico
Aglomerado Hox de Anfioxo Hox- de Camundongo Hox- de Camundongo Hox-C de Camundongo Hox-D de Camundongo
Hoxa-2 resulta numa transformao parcial do segundo arco farngeo em uma cpia do primeiro arco. Os fetos mutantes carecem dos ossos estribo e estilide formados do segundo arco, mas tm extra os ossos martelo, bigorna, timpnico e escamoso. Eles tm tambm uma cartilagem filamentosa que est fundida ao elemento alisfenide e cujo terminal caudal est em contato com a bigorna supranumerria. Essa cartilagem no tem contrapartida em camundongos normais, mas suas relaes anatmicas sugerem que seja homloga com a cartilagem pterigoquadrtica vista em rpteis. O complexo formado por essa cartilagem e a bigorna considerado ter estado presente em terapsdeos, o grupo de rpteis que deu origem aos mamferos (Rijli et al., 1993; Mark et al., 1995). Quando o gene Hoxa-2 desregulado pela eliminao de receptores de cido retinico, uma distinta cartilagem pteroquadrada se desenvolve ligando os ossos bigorna e alisfenide (Figura 23.21; Lohnes et al., 1994). Porm, permanecia a pergunta se os genes Hox especificam o eixo de acordo com um sistema de contagem ou por um cdigo pelo qual diferentes genes Hox especificam vrtebras diferentes. Essa uma pergunta importante porque d a viso de como os mesmos genes Hox podem especificar corpos diferentes. Comparando os padres de expresso do gene Hox com o tipo de vrtebras mostrouse que esse era especificado pela constelao de genes Hox expressos nos somitos (Gaunt, 1994; Burke et al., 1995). Por exemplo, o camundongo tem 5 vrtebras occipitais, 7 cervicais, 13 torcicas, 6 lombares e 4 sacrais. O pinto, por outro lado, tem 5 vrtebras occipitais, 14 cervicais, 7 torcicas, 9 lombares e 4 sacrais. Embora o nmero total de vrtebras pr-sacrais difira somente por uma (34 versus 35), existem bvias transposies entre as espcies (Goodrich, 1930). Em ambos os animais, Hoxc-5 expresso no fim das vrtebras cervicais, enquanto Hoxc-6 aparece no comeo da srie torcica. No camundongo isso ocorre no limiar entre a dcima segunda e dcima terceira vrtebra e em pintos entre a dcima nona e a vigsima. Assim em vertebrados, alteraes da morfologia podem se concretizar mudando-se os domnios da expresso gnica de Hox.
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Figura 23. 21
Representao de elementos do esqueleto derivados do primeiro arco farngeo (em cinzento) e do segundo arco farngeo (em preto). (AS, alisfenide; I, bigorna; I2 bigorna duplicado; P e P2, cartilagem pteride normal e duplicada; PQ, cartilagem pterigoquadrada; SQ, escamoso; SQ2 escamoso duplicado.) (De acordo com Mark et al., 1995.)
Camundongo selvagem/mamfero
Genes Hox e a Evoluo dos Artrpodes A mesma pergunta produziu uma resposta diferente quando feita a respeito dos artrpodes. Borboletas (Lepidpteros) diferem de Drosophila (Dpteros) de duas bvias maneiras. Primeiro, borboletas tm quatro asas, ao passo que os dpteros tm duas. Segundo, larvas de borboletas tm membros abdominais chamados prpernas que no existem em larvas de moscas. A maneira mais provvel de criar essas diferenas seria alterar o padro da expresso do gene hometico (Lewis, 1978). Em Drosophila, o Ultrabithorax (Ubx) expresso nos halteres, mas no nas asas. Mutaes de perda-de-funo de Ubx convertem os halteres em asas mesotorcicas, enquanto que a expresso ectpica de Ubx nos discos alares faz com que eles formem halteres (veja Captulo 14). Poder-se-ia esperar, por isso, que o Ubx seria inativo nos discos das asas posteriores da borboleta. Esse no o caso. Warren e colaboradores (1994) mostraram nveis altos de expresso de Ubx nos discos das asas posteriores da borboleta buckeye, Precis coenia. Na realidade, o padro de expresso do gene Hom-C em Precis foi essencialmente o mesmo que o padro em Drosophila. Na borboleta, o Ubx modifica a morfologia alar para produzir uma asa posterior (em lugar de uma anterior). Na mosca, ele modifica a asa em um haltere. A hiptese atual que os genes alvo de Ubx podem ter mudado, mas no o padro da expresso de Ubx.
A EVOLUO DO NMERO DE ASAS. As asas dos insetos so consideradas ter
Rptil
Mutante com Hoxa-2 anulado
evoludo de apndices multiramificados de guelras de crustceos ancestrais. Especificamente, o padro de expresso ptero das abas osmorreguladoras dorsais (eppodos) dos crustceos se parece com sua expresso em asas de insetos em desenvolvimento (Kukalova-Peck, 1978; Averof e Cohen, 1997). Carroll e seus colegas (1995) sugerem que o inseto original tinha asas saindo de todos os segmentos (como as guelras dos crustceos). Em insetos modernos, diferentes genes hometicos suprimem esse potencial na maioria dos segmentos. Em outras palavras, a formao das asas originou-se independentemente dos genes hometicos em um organismo que estava usando os genes hometicos para identidade segmentar ou padronizao neural. Somente mais tarde o programa formador de asas ficou sob o controle dos genes hometicos. H vrias observaes apontando para essa concluso. Primeiro, embora o Antennapedia seja expresso em dois segmentos (segundo e terceiro torcico), capazes de produzir asas, ele no necessrio para formao das asas. O segmento mesotorcico alar (T2) pode, portanto, representar o estado fundamental presente em todos os segmentos antes dos genes hometicos comearem a regular a formao das asas. Segundo, em vez do Antennaedia estar regulando positivamente o desenvolvimento alar em T2 e T3 parece que outros genes Hom-C reprimem o desenvolvimento alar em outros primrdios. Mutaes de perda-de-funo dos genes Hom-C causam a formao de primrdios alares ectpicos nos segmentos em que so expressos (veja Figura 14.29 mostrando uma mosca cujo Ubx foi removido). Portanto, com a possvel exceo dos segmentos abdominais inferiores controlados por Abd-b, o potencial para o desenvolvimento de asas existe em todos os segmentos e reprimido pelos genes hometicos. Terceiro, se a expresso de Scr induzida em discos alares (usando o sistema GAL4 mencionado anteriormente), o desenvolvimento alar abortado em seus estgios precoces.
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(A) Apterigoto
Figura 23.22
Esquema evolucionrio do desenvolvimento da asa. Apterigotos (A) j tinha o esquema padro Hom-C dos insetos. Quando emergiram as asas (B,C), todos os segmentos as possuam, independente dos genes Hom-C neles expressos. (D,E) Na maioria dos insetos, AbdB, Scr e abdA impediram a formao da asa. (F) Em dpteros tais como a Drosophila, Ubx tambm adquiriu a habilidade para reprimir o desenvolvimento da asa. (De acordo com Carroll et al., 1995.)
(B) Ninfa Paleodictiptera
(C) Ninfa de efemrida paleozica
Combinando gentica do desenvolvimento e registro fssil (Kukalova-Peck, 1978), Carroll e colegas propuseram o seguinte cenrio (Figura 23.22): quando as asas se originaram, elas foram encontradas em todos os segmentos, e no havia regulao hometica de seu nmero ou carter. Admitindo que o padro de expresso gnica de Hom-C tenha permanecido o mesmo, as protenas HOM-C adquiriram a capacidade de regular a formao de asas atravs da evoluo de stios sensveis a Scr, AbdA e Ubx nas regies reguladoras dos genes formadores de asas. A evoluo de elementos responsivos a Scr levaria modificao ou reduo das asas protorcicas (T1), enquanto os elementos responsivos a AbdA levariam reduo das asas abdominais. Em insetos de quatro asas, o Ubx reprime a formao de asas no primeiro segmento abdominal (A1) e, em insetos de duas asas, ele controla o desenvolvimento de asas em ambos, A1 e T3. Assim, diferentemente da situao em mamferos, a evoluo da identidade de segmentos de insetos no parece corresponder com mudanas nos genes Hom-C. Ao contrrio, as protenas codificadas por esses genes hometicos adquiriram novos alvos reguladores.
EVOLUO DO NMERO DE PATAS DE INSETOS. Outra importante lio
(D) Adulto neptero primitivo
(E) Endopterigoto moderno (Lepidptero)
(F) Endopterigoto moderno (Dptero)
evolucionria que os genes Hom-C no so reguladores todo-poderosos. Ao contrrio, eles podem ser regulados localmente pelos produtos de outros genes. Em artrpodes, muitos grupos so distinguidos pelo nmero de membros. Os insetos tm seis patas quando adultos, trs pares se originando de cada um dos trs segmentos torcicos. Em Drosophila, o gene Distal-less (Dll) crtico para prover o eixo prximo-distal dos apndices (veja Figuras 14.33 e 19.21). A expresso de Distal-less ocorre nos discos formadores de membros ceflicos e torcicos (tanto para patas, mandbulas e asas), mas excluda no abdmen pelas protenas AbdA e Ubx. Assim, os apndices crescem como patas e asas no trax e como mandbulas na cabea. A larva de Drosophila nunca desenvolve membros no seu abdmen. No obstante, larvas de borboletas e mariposas so caracterizadas por patas abdominais rudimentares chamadas pr-patas. A pesquisadora Panganiban e seus colegas (1994) clonaram o homlogo do Distal-less da borboleta buckeye e mapearam sua expresso durante o desenvolvimento da borboleta. Durante a poro precoce da embriognese de Precis a expresso de Dll a mesma que em Drosophila. Primeiro vista nas regies da cabea durante a gastrulao (segmentos antenais, maxilares, e labiais) e nas regies torcicas que iro dar origem aos discos imaginais das patas (Figura 23.23A). No entanto, com o progresso do desenvolvimento, o gene Dll de Precis torna-se expresso do terceiro at o sexto segmento abdominal (Figura 23.22B). Enquanto a expresso de Dll vista tanto no anel proximal como em soquetes das patas torcicas verdadeiras, a expresso de Distal less no abdmen est restrita ao anel proximal. Assim, as pr-pernas dos lepidpteros parecem ser homlogas poro proximal das patas torcicas. A expresso nos segmentos maxilar e labial tanto em Drosophila como em Precis interessante por ser consistente com recente evidncia paleontolgica (Kukalova-Peck et al., 1992) de que embora essas estruturas da mandbula se originaram de primrdios de membros, elementos de membros distais esto perdidos de todas as mandbulas de artrpodes.
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Figura 23.23
Expresso do gene Distal-less em Precis. (A) Aos 12% da embriognese, transcritos de Dll aparecem em trs segmentos torcicos (T1, T2, T3) como tambm nos segmentos antenal (an), maxilar (mx),o embrionrio, a expresso de Dll em Precis divergiu significativamente daquela da Drosophila mostrando tambm expresso Dll nos segmentos abdominais 3-6. (A e B de acordo com Panganiban et al., 1994, cortesia dos autores.)
(A)
(B)
A presena de pr-pernas larvais e a expresso de Distal-less nos segmentos abdominais de Precis sugere que Distal-less regulado de maneira diferentemente em dpteros e lepidpteros. Duas possibilidades chegam frente. (1) Os genes Distal-less de Precis no so reprimidos pelas protenas AbdA e Ubx do homeodomnio, ou (2) a expresso dos genes repressores do homeodomnio de alguma maneira abolida nas regies abdominais de Precis. Warren e colaboradores. (1994), mostraram que os embries de Drosophila e Precis tm o mesmo padro inicial da expresso gnica de Hom-C. Porm, a cerca de 20% do caminho da embriognese de Precis, a expresso do gene Hom-C perdida em pequenos pedaos dos segmentos A3-A6. Nem Ubx nem AbdA so expressos na regio dos segmentos abdominais que do origem s pr-pernas (Prancha 26). Pouco tempo depois, os genes Distal-less e Antennapedia so expressos nesses furos. No conhecido quais molculas so empregadas para reprimir a expresso dos genes abdA e Ubx nas regies de expresso do Distal-less. Os genes do grupo Polycomb so os suspeitos mais provveis por serem capazes de reprimir ambos genes em Drosophila.
Caminhos homlogos do desenvolvimento

Uma das descobertas mais emocionantes da dcada passada no foi somente os genes reguladores homlogos, mas tambm as vias homlogas do desenvolvimento (Zuckerkandl, 1994; Gilbert, 1996; Gilbert et al., 1996). Duas dessas vias j foram discutidas em captulos anteriores. Primeiro, como foi visto no Captulo 15, a via chordin/BMP4 demonstra que em ambos, vertebrados e invertebrados, a chordin/ short-gastrulation inibe os efeitos de lateralizao de BMP4/decapentaplegic, portanto, permitindo ao ectoderma protegido por chordin/short-gastrulation se tornar ectoderma neurognico. As reaes so to parecidas que a protena decapentaplegic da Drosphila pode induzir destinos ventrais em Xenopus e pode substituir para a protena short-gastrulation (Holley et al., 1995). Em segundo lugar, vimos no Captulo 18, que as interaes entre Hedgehog e Wingless foram conservadas entre insetos e
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Figura 23.24
Drosophila melanogaster (corpo gorduroso) Fatores de transcrio
Regulao semelhante do gene da lcool desidrogenase em Drosophila e humanos. CREB/ATF e C/EBP so reguladores positivos do gene da lcool desidrogenase. AEF um regulador negativo. (De acordo com Abel et al., 1992; Zuckerkandl, 1994.)
Seqncia reguladora a montante
Homo sapiens (fgado)
Figura 23.25
A via RTK-RAS amplamente usada. O esquema da via est mostrado no lado esquerdo junto com os nomes em diferentes espcies. O ligante, que pode ser solvel (como no EGF) ou uma protena ligada membrana em outra clula (como na protena Boss [Bride of sevenless] associada ao sevenless do RTK). Os domnios citoplasmticos das RTKs so autofosforilados ao se dimerizarem, e isso lhes permite se ligar protena adaptadora e estimular a protena Ras G. A protena Ras G transloca a protena Raf para a membrana celular, dessa maneira ativando-a. Isso pode ser inibido pelas protenas gap, as quais podem inativar Ras. A protena Raf ativada inicia a cascata de fosforilao que termina em um fator de transcrio fosforilado (ativado) que entrando no ncleo efetua a transcrio do RNA.
Ligante Receptor
Seqncia reguladora a montante
vertebrados na formao dos membros. Na verdade, as mesmas interaes so usadas para estabelecer o padro de segmentao em embries precoces de Drosophila (veja Captulo 14) e para estabelecer compartimentos no crebro dos mamferos (veja Captulo 7). Tambm foi mostrado que numerosas interaes DNA-protena regulando genes especficos so conservadas atravs de espcies divergentes. Dessa maneira, o gene da lcool desidrogenase controlado no corpo gorduroso da Drosophila pelo mesmo conjunto de protenas que governa sua expresso no fgado humano (Figura 23.24; Abel et al.,1992). Entre as primeiras vias homlogas conhecidas est a via de transduo do sinal RTK-Ras que foi recentemente identificada em todo o reino animal, embora usada estritamente em diferentes funes (veja Captulo 3; Figura 23.25). Na Drosophila, a determinao do fotorreceptor sete cumprida quando a protena Sevenless
Protena G
Fora da clula Membrana plasmtica Citoplasma
Domnio da tirosina quinase Organismo e tecido Ligante Tirosina quinase do receptor Protena LET-23 Receptor de EGF Sevenless Protena SH2-SH3 SEM-5 GRB2 Drk Protena G Ativador de GTPase e protenas de troca GDP/GTP ?/LET-341 (?) GAP/GNRP Gap1/ Son of sevenless Efeito
Vulva de C. elegans Pele de mamfero Olho de Drosophila
Protena LIN-3 EGF Bride of sevenless
Protena LET-60 Protena Ras Ras1
Diferenciao e diviso da clula vulvar Diviso da clula epidrmica Diferenciao do fotorreceptor sete em cada omatdio
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(no suposto fotorreceptor 7) se junta protena Bride Sevenless (Boss) no fotorreceptor 8. Essa interao ativa a tirosina quinase da protena Sevenless a se autofosforilar. A protena DRK se liga ento a essas novas tirosinas fosforiladas atravs da sua regio de homologia-2 de Src (SH2) e ativa a protena Son of Sevenless (SOS). Essa protena uma trocadora de nucleotdeos de guanosina e troca GDP por GTP na protena Ras1 G. Isso ativa a protena G, permitindo que ela transmita seu sinal ao ncleo atravs da cascata da quinase MAP. Esse mesmo sistema foi encontrado na determinao da vulva do nematide, da epiderme do mamfero, e dos segmentos terminais da Drosophila. A similaridade nesses sistemas to impressionante que muito dos componentes so intercambiveis entre as espcies. O gene para o GRB2 humano pode corrigir os defeitos fenotpicos dos nematides deficientes em Sem-5 e a protena do nematide SEM-5 pode se juntar forma fosforilada do receptor EGF humano (Stern et al.,1993). Caminhos homlogos formam a infra-estrutura bsica do desenvolvimento. Os alvos desse caminho podem mudar, dependendo do organismo. No ectoderma de um organismo, o caminho RTK-Ras pode ativar os genes responsveis pela proliferao. Em outro organismo, o mesmo caminho pode ativar os genes responsveis pela produo de um fotorreceptor. E num terceiro organismo, o caminho ativa os genes necessrios para a construo de uma vulva.
Criando novos tipos de clulas: O mistrio evolucionrio bsico

Uma das principais questes no resolvidas na biologia evolucionria e do desenvolvimento , Como os organismos desenvolvem um novo tipo de clula? Essa uma questo importante, uma vez que mudanas no filo esto associadas com a evoluo de novos tipos de clulas. Hipoteticamente, novas combinaes de genes tambm podem criar novos tipos de clulas. No entanto, isso permanece uma hiptese ainda no provada. Kauffman (1993) modelou matematicamente a gerao de novos tipos de clulas a partir de um genoma aleatrio consistindo de 10.000 genes, cada um regulado por 2 outros genes. Em tais casos, ele encontra somente 100 estados estveis de interao (de aproximadamente 210.000 estados possveis). Cada um desses estados possveis representa um tipo celular diferenciado. Em alguns casos, a mutao de um gene regulador suficiente para a restruturao das interaes, e quando uma nova clula criada. A maioria dos genes, no entanto, permanecem inalterados por esse novo arranjo. A criao de novos tipos de clula um evento raro na natureza, e freqentemente pode mudar a natureza do animal. Como mostra a Figura 23.26, os vertebrados so conhecidos por terem surgido de invertebrados nas diversas etapas que envolveram a formao e modificao de novos tipos de clulas. Como mencionado anteriormente neste captulo, as clulas da crista neural foram importantes na origem dos cordados. Enquanto no sabemos como surgiram as clulas da crista neural, Holland e colegas (1996) forneceram uma fascinante especulao que envolve dissociao, duplicao e divergncia, e co-opo. Tambm envolve os homlogos vertebrados do gene da Drosophila discutidos anteriormente, Distal-less. Anfioxo um protocordado que tem notocorda, somitos, e um tubo neural oco. Falta-lhe um crebro e estruturas faciais e, o mais importante, no possui clulas da crista neural. Como a Drosophila, o anfioxo tem somente uma cpia do gene Distal-less por genoma haplide, e como na Drosophila, esse gene expresso na epiderme e no sistema nervoso central. No entanto, enquanto o anfioxo tem somente uma cpia desse gene, os vertebrados tm de quatro a seis cpias bem parecidas do Distal-less, cada uma provavelmente originria de um nico gene ancestral que se assemelha ao do anfioxo (Price, 1993; Boncinelli, 1994). Esses homlogos Distal-less encontraram novas funes. Algumas esto no mesoderma,
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CORDADOS
VERTEBRADOS
Cefalocordados (Amphioxus) Gnatostomatas Equinodermos Hemicordados Calcicordados
Conodontes
Urocordados (ascidianos)
Agnatos
Modificao do arco mandibular em mandbulas
Crista neural, placdios epidrmicos (formao da cabea) Podcitos renais Simetria radial Sistema vascular aquoso Mesoderma forma a notocorda Cordo nervoso dorsal oco Fendas farngeas pareadas Arcos articos Simetria bilateral em adultos Sistema circulatrio fechado Larva ciliada bilateralmente simtrica Formao de deutorostomatas Mesoderma enteroclico
Figura 23.26
Mudanas de desenvolvimento na evoluo de invertebrados para vertebrados. Os invertebrados deuterostomatas originais foram capazes de formar os equinodermos e outros organismos que finalmente deram origem linhagem vertebrada. A habilidade do mesoderma para formar a notocorda e seu ectoderma sobrejacente para se tornar um tubo neural, separou os cordatos dos invertebrados remanescentes. O desenvolvimento das clulas da crista neural e os placdios epidrmicos que do origem aos nervos sensoriais da face distinguem os vertebrados dos protocordatos. (De acordo com Gans, 1989; Langille e Hall, 1989.)
um lugar onde o Distal-less no expresso em anfioxos. Outros homlogos vertebrados de Distal-less so expressos no crebro anterior, imitando um padro de expresso visto no anterior do tubo neural do anfioxo. Isso sugere que o crebro anterior vertebrado homlogo ao tubo neural anterior do anfioxo. Um outro homlogo vertebrado de Distal-less expresso nas clulas da crista neural. Embora no esteja comprovado, possvel que um novo tipo do gene Distal-less possa fazer com que as clulas ectodrmicas migratrias dos anfioxos evoluam em clulas da crista neural.
Uma nova sntese evolucionria

Em 1922, Walter Garstang declarou que a ontogenia (desenvolvimento individual) no recapitula a filogenia (evoluo); ela cria a filogenia. Os animais que surgiram mais tarde na histria evolucionria, no surgiram atravs de uma adio terminal em um embrio existente. Ao contrrio, surgiram atravs de mutaes que afetaram a interao de mdulos j existentes no Bauplan do organismo: Uma casa no um chal com um andar extra em cima. Uma casa representa um grau maior na evoluo de uma residncia, mas o prdio todo alterado- fundaes, madeiramento e telhado- mesmo que os tijolos permaneam os mesmos.
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Dessa maneira, quando dizemos que o cavalo moderno de um s dedo evoluiu de um ancestral com cinco dedos, ns queremos dizer que ocorreram mudanas hereditrias na diferenciao do mesoderma do membro para condrcitos durante a embriognese na linhagem do cavalo. Nessa perspectiva, a evoluo o resultado de mudanas hereditrias afetando o desenvolvimento.* Esse o caso se a mutao muda o embrio do rptil em um pssaro ou muda a cor dos olhos da Drosophila. Essa perspectiva do desenvolvimento, no entanto, esteve perdida durante a dcada de 1940. Um dos maiores eventos na teoria evolucionria foi a sntese moderna da biologia evolucionria e gentica Mendeliana (Mayr e Provine, 1980). Um resultado dessa fuso duramente obtida que a evoluo foi redefinida para significar mudanas nas freqncias gnicas de uma populao atravs do tempo. Uma vez que a evoluo uma mudana na composio gentica das populaes, escreveu Dobzhansky (1937), os mecanismos da evoluo constituem problemas da gentica de populaes. A abordagem desenvolvimental da evoluo foi excluda da sntese (Hamburger, 1980; Gottlieb, 1992; Dietrich, 1995; Gilbert et al., 1996). Pensava-se que a gentica de populaes poderia explicar a macroevoluo, de modo que a morfologia e o desenvolvimento foram considerados como tendo papis de menor importncia na teoria evolucionria moderna (Adams, 1991). Em outras palavras, a macroevoluo (as grandes mudanas morfolgicas vistas entre espcies, classes e filos) poderia ser explicada pelos mecanismos da microevoluo, os valores adaptativos diferenciais de gentipos ou desvios no acasalamento aleatrio ou ambos fatores agindo juntos (Torrey e Feduccia, 1979). No entanto, essa viso tinha seus crticos (seus hereges, alguns diriam). Talvez o mais importante desses tenha sido Richard Goldschmidt. Goldschmidt comeou o seu livro The Material Basis of Evolution (1940) com um desafio sntese moderna. Eu podia desafiar os devotos da viso estritamente Darwiniana, a qual estamos discutindo aqui, para tentar explicar a evoluo das seguintes caractersticas pela acumulao e seleo de pequenos mutantes: plo nos mamferos, penas nos pssaros, segmentao nos artrpodes e vertebrados, a transformao dos arcos de guelras em filogenia incluindo os arcos articos, msculos, nervos, etc.; mais adiante, dentes, conchas dos moluscos, ectoesqueletos, olhos compostos, circulao sangnea, alternao de geraes, estatocistos, sistemas ambulacrrios de equinodermos, pedicelria dos mesmos, cnidocistos, aparelho de veneno das cobras, osso da baleia, e finalmente, diferenas qumicas como hemoglobina versus hemocianina. Goldschimidt afirmou que as novas espcies no surgiram do mecanismo da microevoluo e que a gentica de populaes era incapaz de explicar novos tipos de estrutura que envolvem diversos componentes mudando simultaneamente. Tais mudanas macroevolucionrias requerem outros mtodos evolucionrios do que simplesmente acumulao de micromutaes. Goldschmidt viu mutantes hometicos como macromutaes que poderiam mudar uma estrutura em outra e possivelmente criar novas estruturas ou novas combinaes de estruturas. Essas mutaes no seriam nos genes estruturais, mas nos genes reguladores. Uma nova espcie, afirma ele, comearia como um esperanoso monstro (uma frase um tanto infeliz tendo como antecedentes a prosa de Metchnikoff).
*Uma maneira de visualizar isso usar uma analogia matemtica (Gilbert et al., 1996): Biologia funcional = anatomia, fisiologia, biologia celular, expresso gnica Biologia do desenvolvimento = [biologia funcional]/ t Biologia evolucionria = [biologia do desenvolvimento]/ t
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Ao mesmo tempo, Conrad H. Waddington estava tentando descobrir mecanismos de desenvolvimento para a produo dessas novas espcies. Ele tambm considerou mutaes hometicas em moscas como modelos de fentipos drasticamente novos, formulando a noo de transferncia de competncia (assimilao gentica, veja Captulo 21) para explicar certos aspectos da evoluo morfolgica. Poucos cientistas prestavam ateno a Goldschmidt ou Waddington porque eles no estavam escrevendo no paradigma da gentica de populaes da sntese moderna e seus programas cientficos eram suspeitos. (Goldschmidt no acreditava na opinio de Morgan sobre o gene como uma entidade particular, e o trabalho de Waddington foi mal interpretado como apoiando a herana de traos adquiridos.) No entanto, na dcada de 1970, eventos na paleontologia (teoria do equilbrio pontuado), eventos na sociedade (os Criacionistas dando a disputa microevolucionria para os biologistas mas contestando a macroevoluo), e eventos em biologia molecular (Notadamente o trabalho de King e Wilson em 1975 mostrando que os DNAs, humano e do chimpanz, eram mais do que 99% idnticos) levaram os cientistas a considerar seriamente que mutaes em genes reguladores podem criar grandes mudanas na morfologia. Na dcada de 1990, as tcnicas de biologia molecular permitiram aos biologistas descobrirem (1) genes reguladores homlogos como o Pax6, que controlam o desenvolvimento dos mesmos rgos em todo reino animal, (2) caminhos homlogos para o desenvolvimento, cujas funes podem mudar entre organismos ou entre clulas do mesmo organismo, e (3) os padres de mudana da expresso dos genes hometicos, permitindo que diversas partes do corpo tenham estruturas e funes diferentes. Tais descobertas convergiram para a formao de uma sntese evolucionria do desenvolvimento que incorpora a abordagem da gentica de populaes mas que expande a teoria evolucionria para explicar tambm o fenmeno macroevolucionrio. A sntese evolucionria do desenvolvimento tambm retm uma multiplicidade de paradigmas. Em alguns momentos (tais como a criao das clulas da crista neural), uma mudana qualitativa ocorre, enquanto em outros casos (como a formao da bolsa do toupeira com bolso), quantidade se torna qualidade quando um limite ultrapassado. Sinalizando a unio dessa sntese, Biologia Evolucionria do Desenvolvimento se tornou um tpico separado em uma enciclopdia da cincia (Hall, 1996), e o Rouxs Archives of Developmental Biology, uma das mais antigas publicaes da embriologia experimental, mudou o nome para Development, Genes, and Evolution. Ns estamos em um extraordinrio momento de nosso entendimento da natureza, pois a sntese da gentica do desenvolvimento com a biologia evolucionria pode transformar nossa apreciao dos mecanismos fundamentais da mudana evolucionria e diversidade animal. Tal sntese na realidade um retorno a uma teoria evolucionria mais ampla que se fragmentou na virada do ltimo sculo (Figura 23.27). Nos ltimos anos do sculo 19, a biologia evolucionria continha as cincias que ns chamamos hoje de biologia evolucionria, sistemtica, ecologia, gentica e desenvolvimento. Quando Wilhelm Roux (1894) anunciou a criao da mecnica do desenvolvimento, ele no rompeu totalmente com a biologia evolucionria. Ao contrrio, ele afirmou que uma mecnica do desenvolvimento ontogentico e filogentico deve ser aperfeioada. Ele citou que a mecnica do desenvolvimento dos embries (o ramo ontogentico) iria crescer mais rpido do que os estudos em filogentica, mas afirmou que em conseqncia das conexes causais ntimas entre os dois, muitas das concluses surgidas da investigao sobre ontogenia [iriam] esclarece os processos filogenticos. Cem anos mais tarde, estamos em um ponto onde podemos nos ater segunda mecnica do desenvolvimento de Roux e criar uma teoria unificada da evoluo.
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Figura 23.27
EVOLUO Roux, Wilson, outros
Roteiro disciplinar do lado evolucionrio da biologia, desde 1880 at o presente. Para maior clareza, outras vias (tais como a da gentica geral gentica humana ou da evoluo imunologia) no foram mostradas.
Questo geracional
Mecnica desenvolvimental
Biologia evolucionria Sistemtica Ecologia Anatomia comparada Gentica de populaes
Morgan
Gentica
Embriologia experimental Regenerao Fertilizao Imunologia Biologia celular
Sntese moderna NeoDarwinismo
Grupo do fago
Biologia do desenvolvimento Gentica molecular Gentica do desenvolvimento
Sob Construo SNTESE DESENVOLVIMENTAL
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Fontes para as citaes das aberturas dos Captulos

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ndice de Autores
Abassi, Y A., 149 Abbott, U. K., 705 Abe, K., 446 Abel, E. L., 833 Abel, T., 910 Abramson, S., 375 Acampora, D., 268, 647 Adachi, Y., 453 Adams, C. C., 433, 434 Adams, M., 913 Adamson, S. D., 494 Adeslon, D. C., 173 Adler, F. R., 819 Afzelius, B. A., 124 Agius, L., 800 Ahlberg, P. E., 896 Ahlgren, U., 383 Ahringer, J., 491, 854 Akam, M. E., 571, 573, 574 Akers, R. M., 314, 315 Akitaya, T., 288 Akoulitchev, S., 400 Akutagawa, E., 785 Alberch, J., 744 Alberch, P., 726, 743, 899 Albert, P., 715 Albertini, D. F., 875 Alberts, B. M., 193, 194, 543 Alexandrov, D. A., 902 Alfandari, D., 231 Alini, M., 370 Allen, B. M., 735 Allen, G. E., 36, 37, 38, 596 Alley, K. E., 740 Allsopp, T. E., 529 Almeida, E. A. C., 140 Alvarez, I. S., 259, 260 Alvarez-Buylla, A., 335, 824 Amaya, E., 110, 625 Amikura, R., 534 Amos, L. A., 124 Amrein, H., 793 An, W., 404 Ancel, P., 157 Anderson, C., 366 Anderson, D. J., 291, 292, 293, 656, 657 Anderson, D. T., 889 Anderson, E., 875 Anderson, K. V., 489, 548, 577, 581, 583 Andersson, S., 784 Ang, S.-L., 637 Angerer, L. M., 465, 487 Angerer, R. C., 465, 487 Angier, N., 426 Anstrom, J. A., 214 Antonini, A., 827 Appel, T. A., 616, 646 Ariel, M., 449 Arion, D., 198 Aristotle, 773 Armstrong, J. F., 676 Armstrong, P. B., 85, 86, 203, 204, 785, 786 Arnold, H.-H., 349 Arnold, S. F., 836 Artavanis-Tsakonis, S., 692 Artinger, K. B., 291 Asai, D. J., 124 Ash, P. J., 356 Ashburner, M.,51,52,535,757,759 Ashley, T., 852 Ashworth, A., 450 Atchinson, M. L., 414 Atkinson, J. W., 520 Audet, R. G., 483 Auerbach, R., 367, 379, 849 Austin, C. R., 127, 131, 145, 146 Austin, J., 528, 853 Averof, M., 907 Awgulewitsch, A., 640 Axel, R., 292, 293 Ayabe, T., 147 Ayer, D. E., 418 Azar, Y., 238 Babcock, D. F., 129 Bachmann, M. D., 809 Bachvarova, R. F., 484 Bacon, E. R., 441 Baeuerle, P. A., 414 Bagavandoss, P., 871 Bagnara, J. T., 734 Baier, H., 328 Baird, G., 682 Baker, B., 468 Baker, B. S., 741, 742, 790, 793, 794, 795 Baker, S. M., 852 Baker, T. G., 860 Baker, W. W., 347, 348 Balinsky, B. I., 179, 224, 235, 236, 256 Ballantine, J. E. M., 488 Ballantyne, S., 485 Ballock, R. T., 358 Bally-Cuif, L., 268 Baltimore, D., 413, 414 Baltz, J. M., 136 Baltzer, F., 37, 799 Banerjee, S. D., 685 Banerjee, U., 689 Banerii, J., 402 Banks, M. S., 282 Barclay, A. N., 95 Bard, J. B. L., 672, 678, 681, 683 Bardin, C. W., 874 Bardoni, B., 781 Barfield, R. J., 786 Barinaga, M., 329 Barker, D. D., 556 Barlow, D. P., 155, 444 Barlow, P., 182 Barnes, G. L., 344 Barnes, M. D., 740 Barnes, R. D., 799 Barnett, T., 51 Baroffio, A., 296 Baron, R., 356, 357 Barr, M. L., 446 Barraclough, C. A., 787 Bartolomei, M. S., 444 Barton, S. C., 155 Basler, K., 659, 689, 727, 752 Basson, C. T., 723 Bastiani, M. J., 96, 316 Bate, M., 545 Bateson, W., 570, 898 Baumgartner, S., 559 Bavister, B. D., 154 Baxter, G. T., 808 Baynish, A. G., 290 Beach, D., 199 Beachy, P. A., 575 Beams, H. W., 174, 190 Beato, M., 421 Beck, S. D., 811, 812 Becker, A. J., 375 Becker, H. J., 50 Beckerle, M. C., 104 Bedford, J. M., 154 Beebe, D. C., 672, 673 Beermann, W., 50, 51, 52, 53 Beers, W. H., 873, 875 Beggs. J. D., 466 Begon, M., 733 Begovac, P. C., 315 Behrendsten, O., 106 Behringer, R. R., 268, 310, 268, 407, 440 Bell, L. R., 791, 792 Bell, S. E., 783 Bellairs, R., 189, 234 Bellido, T., 378 Bellus, G. A., 357 Bellusci, S., 687 Belote, J. M., 469, 790, 795 Bement, W. M., 201 Bender, W., 574, 575 Benezra, R., 415 Benirschke, K., 448 Bennett, K. I., 532 Bennett, P. J., 282 Bensen, G. V., 645 Bentley, D., 312 Bentley, J. K., 129 Benzer, S., 91 Berardi, A. C., 375 Berezney, R., 451 Berg, L. K., 214 Berget, S. M., 466 Bergman, K., 13, 15 Bergman, Y., 412, 413 Berkovitz, G. D., 783 Berleth, T., 553 Bern, H. A., 742 Bernard, O., 410 Bernfield, M., 102, 103, 684, 685 Bernstein, R., 781 Berondes, H. D., 51, 757 Berridge, M. J., 111, 147 Berrill, N. J., 592, 737, 890, 899 Berrios, M., 453 Berry, M., 441 Bertram, E. G., 446 Bester, A. J., 491 Bestor, T. H., 443 Bestor, T. M., 153 Beug, H., 25, 95 Bevilacqua, A., 98 Bhanot, P., 566 Bi, G-Q., 130 Bianchi, D. W., 242, 246 Biedler, L., 174 Bienz, M., 572 Bier, K., 868 Bijtel, J. H., 621
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Binns, W., 829 Bird, A. P., 444, 450 Birnstiel, M. L., 396 Birren, S. J., 656, 657 Bischoff, R., 350, 416 Bischoff, T. L. W., 36 Bisgrove, B. W, 216 Bishop-Calame, S., 675 Bissell, M. J., 112 Bitgood, A J., 659 Bixby, J. L., 113 Bjrkland, A., 334 Black, J. E., 335, 824 Black, S. D., 225 Blackler, A. W., 152, 537 Blackwell. T. K., 524 Blair, H. C., 356, 357 Blair, S. S., 752 Blandau, R. J., 874 Blattner, F. R., 56 Bleier, R., 787 Bleil, J. D., 135, 136, 137, 138, 143 Blendy, J. A., 859 Blitz, I. L., 620 Blobel, C. P., 140 Blom van Assendelft, G., 438 Bloom, W., 277, 355, 857 Bluemink, J. G., 204 Blumberg, B., 619 Bockman, D. E., 295 Bode, J., 454 Bodmer, R., 904 Bodner, M., 407 Boettiger, D., 347 Bogart, J. P., 149 Boggs, R. T., 469, 793 Boilly, B., 715 Bokor, P., 566 Bolanos, F., 740 Bolker, J. A., 838 Bollenbacher, W. E., 754, 755 Boncinelli, E., 637, 911 Bonder, E. M., 202 Bonhoeffer, F., 328 Bonner, J. T., 22, 23, 28, 891 Bonnet, C., 508 Bookbinder, L. H., 137 Booker, B., 332 Borland, R. M., 185 Born, G., 805, 806 Bornslaeger, E. A., 875, 876 Borovsk, D., 808, 870 Borsani, G., 449 Boucaut, J. C., 82, 230, 231 Bou, A., 827 Boulet, A. M., 403, 575 Bounoure, L., 536, 537, 843, 844 Bouvet, P., 483 Bouwmeester, T., 618, 619 Boveri, T., 36, 37, 55, 140, 142, 531, 532, 551 Bowerman, B., 524, 525, 528 Bowers, W. S., 762 Bownes, M., 869, 870 Bowring, S. A., 888 Bowtell, D. D. L., 689 Boycott, A. E., 177 Boyd, L., 524
Boyse, E. A., 89 Boyse, J., 444 Brack, C., 410 Brackenbury, R., 95 Braden, A. W. H., 146 Bradley, A., 269, 660 Brakefield, P. M., 815, 816, 822 Brandhorst, B. P., 520 Brannon, M., 610 Braude, P., 490 Braun, R. E., 856 Braun, T., 349, 350 Braunstein, M., 436 Breedlove, S. M., 786 Breier, G., 369, 370 Breitweiser, W., 536 Brennen, M. D., 869 Brenner, C. A., 186, 478 Brenner, S., 509, 521, 753 Brent, R., 576 Brian, M. V, 816 Bridges, C. B., 789 Briggs, R., 42, 44, 489 Brighton, C. T., 356 Brill, G., 347 Brinster, R. I., 70, 397 Brinton, C. C. Jr., 12 Briscoe, J., 107 Britten, R. J., 463 Brock, H. W., 572 Brockendorrf, N., 449 Brockes, J. P., 715 Brnmark, C., 820 Bronner-Fraser, M., 104, 284, 286, 288, 289, 291, 292 Brooks, P. C., 112 Brooks, W. K., 807 Browder, L. W., 443 Brower, D. L., 105, 753 Brown, C. J., 448, 449 Brown, D. D., 432, 437, 741, 742, 743, 866 Brown, N. A., 649 Brown, N. L., 688 Brown, P. S., 736 Brownell, J. E., 436 Brownlee, G. G., 418, 466 Bruce, B. S., 794 Bruening, W, 420 Brunelli, S., 647 Brunetti, A., 350 Brunk, B. P., 442 Brusca, G. J., 887 Brusca, R. C., 887 Brush, S., 37 Brust, D. G., 740 Bry, L., 810 Bryant, S. V., 702, 703, 705, 715 Brylski, P., 892 Bchmann, D., 814 Buck, W. R., 147 Buckbinder, L., 742 Buckingham, M. E., 349 Buehr, M., 777 Bull, J. J., 798, 799, 817 Bungert, J., 441 Bunick, D., 400 Buratowski, S., 399, 400
Burch, J. B., 435 Burgart, L. J., 147 Burgess, R., 344 Burian, R., 40 Burke, A. C., 645, 646, 703, 893, 894, 906 Burke, R. D., 217 Burkholder, G. D., 50 Burks, D. J., 138 Burlingame, R. W., 432 Burnett, F. M., 822 Burns, R. K., Jr., 853 Burnside, B., 260 Bursdal, C. A., 244 Burtis, K. C., 471, 794, 855 Busa, W. B., 147 Buss, L. W., 592, 886, 887, 888 Busslinger, M., 442 Butenandt, A., 754 Butler, E. G., 714 Butt, F. H., 195 Byers, B., 199 Byers, T. J., 203, 204 Cafasso, E., 369 Calame, K. L., 414 Calarco-Gillam, P. G., 185 Cales, C., 109 Callan, H. G., 865 Calof, A. L., 319 Calvin, H. I., 154 Campbell, G., 752 Campos-Ortega, J., 220, 692 Canning, D. R., 238, 239 Cao, Z., 582 Capco, D. G., 201, 451 Capecchi, M., 69, 70, 295, 641, 642, 643, 710 Caplan, A. I., 352 Capovilla, M., 563 Cappecchi, M. R., 269 Carey, M., 399 Carlsen, E., 836 Carlson, B. M., 173, 343, 360, 364, 371, 871 Carlson, E. C., 368 Carnahan, J., 12 Carosella, E. D., 248 Carrington, J. L., 705, 713, 714 Carroll, C. R., 489 Carroll, E. J., 142 Carroll, S. B., 312, 564, 585, 815, 905, 908 Carson, D. D., 106, 186 Carver, V., 735 Casanova, J., 557, 569, 575 Casares, F., 569, 572, 575 Cascio, S., 683 Cassens, G., 489 Cassirer, E., 509 Castelli-Gair, J., 573, 574 Caston, J. D., 715 Catala, M., 255, 257, 258, 259, 260, 265, 266 Cate, R. L., 784 Cather, J. N., 518 Cattanach, B. M., 449 Cattanco, E., 656
Causo, J. P., 751 Centerwall, W. R., 448 Cepko, C. L., 274, 275, 276, 281 Chabry, L. M., 509, 510 Chahal, S. S., 450 Chaillet, J. R., 445 Chalfie, M., 310 Chambers, E. L., 146, 149 Chambon, P., 420, 433, 442 Chan, L., 493 Chan, S. S.-Y., 320 Chandler, D. E., 126, 143, 145 Chandler, V. L., 422 Chang, M. C., 131 Chaouat, G., 248 Chapman, A. L., 28 Chapman, D. B., 648 Chapman, V. M., 448 Chappell, M. R., 496 Charit, J., 721 Charnov, E. L., 817 Chasan, R., 581 Chen, C.-M., 346, 354 Chen, C.-Y A., 475 Chen, J.-J., 401, 495, 786 Chen, J.-Y., 888 Chen, Q., 355 Chen, S.-H., 493 Chen, U., 453, 454 Chen, W T., 104 Chen, Y. P., 628 Cheney, C. M., 101 Cheng, H-J., 328 Cheng, L. Y., 217 Cheng, P. F., 626, 628 Cheng, T.-C., 425, 426 Chenn, A., 270 Chernoff, E. A. G., 714 Chernoff, G. F., 262 Chernyak, L., 886 Cherr, G. N., 135, 212, 213, 214 Chevallier, A., 345 Chi, T., 399 Chiang, A., 905 Chiang, C., 263 Child, C. M., 551 Chiquet, M., 104 Chiquoine, A. D., 845 Chisaka, O., 70, 295, 640, 641, 642 Cho, K. W. Y., 619, 620, 628 Cho, W. K., 875 Chong, J. P. J., 200 Christ, B., 345 Christofori, G., 466 Christy, R. J., 417 Chu-LaGraff, Q., 312 Chun, J. J. M., 412 Chun, L. L. Y., 292 Chuong, C. -M., 97, 353, 664 Churchill, F. B., 509 Chymiy, D. B., 799 Ciapa, B., 147 Ciejek, E. M., 451 Ciment, G., 292 Cisek, L. J., 198 Clack, J. A., 895 Clapham, D. E., 147 Clark, B., 902
ndice de Autores
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Clark, D. J., 432 Clark, E. A., 688, 797 Clark, M. R.. 873 Clarren, S. K., 833 Clegg, K. B., 181, 488, 490 Clemens, M. J., 495 Clement, A. C., 518, 519 Clermont, Y., 123 Clever, U., 51, 757 Cline, T. W., 791 Coates, M. I., 726 Cockerill, P. N., 453 Coe, W. R., 800 Coffey, D. S., 451 Cohen, A. M., 288 Cohen, B., 750, 751 Cohen, C. S., 809 Cohen, D. R., 779 Cohen, J., 315, 326, 684, 686 Cohen, J. H., 686 Cohen, L. H., 744 Cohen, P. P., 736, 740 Cohen, S. M., 555, 907 Cohen, S. N., 56 Cohlan, S. Q., 829 Colamarino, S. A., 320, 322 Colburn, T., 836 Colello, R. J., 825 Coleman, S., 765 Colin, A. M., 486 Colledge, W H., 876 Collier, J. R., 520 Collignon, J., 648, 649 Collins, F. D., 133 Colman, H., 826 Colwin, A. L., 129, 139 Colwin, L. H., 129, 139 Comai, L., 401 Comings, D. E., 851 Compere, S. J., 442 Conaway, R. C., 400 Condic, M. L., 749, 750 Condie, B. G., 643 Conklin, E. G., 156, 511, 513, 890 Conklin, K. F., 435, 445 Conlon, F. L., 636 Conlon, R. A., 344, 644 Conover, D. O., 817, 818 Constantini, F., 392, 440 Conway Morris, S., 888 Cook, J., 605 Cook, P. R., 452 Cook, S. P., 129 Cooke, J., 225 Cooley, L., 867, 868 Cooper, D. W, 450 Cooper, G. M., 473 Corces, V. G., 454 Corden, J. L., 198 Cormier, F., 379 Cornell, R. A., 612 Corselli, J., 131 Coschigano, K. T., 471, 794 Cossu, G., 346, 349 Cotsarelis, G., 300 Coulombe, J. N., 292 Coulombre, A. J., 283, 666, 667
Coulombre, J. L., 666, 667 Couly, G., 367 Couzinet, B., 874 Covault, J., 95 Cowan, W. M., 740 Coward, P., 781 Cox, E. C., 328 Cox, W. G., 624 Craig, J. A., 283 Craig, M. M., 176, 518 Crampton, H. E., 176 Cran, D. G., 875 Crawford, K., 87, 88, 715 Creech Kraft, J., 829 Crelin E. S., 381 Crenshaw, E. B., 408, 409 Crick, F. H. C., 432, 551 Croce, C. M., 419 Crofton, 836 Cronmiller, C., 791 Crosby, G. M., 702 Cross, N. L., 142 Crossgrove, K., 759 Crossley, M., 418 Crossley, P. H., 268, 468, 658, 704, 705, 707, 708, 711 Crowley, C., 332 Cruz, Y. P., 195, 196, 246 Cserjesi, P., 352, 353 Cui, Y., 610, 611 Cullen, K. E., 409 Culotti, J. G., 320 Cunha, G. R., 683 Cunliffe, V., 612 Currie, J., 740 Cuvier, G., 646, 647 Cvekl, A., 672 Czeizel, A., 263 da Silva, A. M., 25 Dale, L., 606, 607, 609, 611, 612 Dan, J. C., 130 Dan, K., 172, 218 Dan, Y., 331 Daneholt, B., 53, 851 Danielian, P. S., 269 Danielsen, M., 422 Danilchik, M. V., 157, 204, 232, 486, 537, 862, 863 Danilevskii, A. S., 812, 813 Dan-Sohkawa, M., 172 Dareste, C., 509 Darnell, J. E., 394, 453 DArribre, T., 231 Dai, X., 138 Darwin, C., 196, 883, 884, 885, 890, 898 Davenport, R. W., 278 David, J. D., 348 Davids, M., 621 Davidson, E. H., 463, 476, 488, 506, 507, 866 Davidson, N., 54 Davies, A. M., 332 Davies, J. A., 318, 677 Davis, A. P., 710, 727 Davis, B. K., 132 Davis, D. L., 836
Davis, M. M., 412 Davis, R. L., 349, 369 Davis, W. L., 834 Dawid, I. B., 64, 66, 67, 152, 627, 866 Dazy, A.-C., 9 De Beer, G. R., 595, 702, 743 De Jonge, F. H., 787 de la Chappelle, A., 187 de Laat, S. W, 178, 204 de Nooij, J. C., 200 De Robertis, E. D. P., 124 De Robertis, E. M., 607, 614, 615, 616, 619, 620, 702 Dealy, C. N., 722 Dean, A., 440 DeCamilli, P., 308 DeChiara, T. M., 155, 444 Decker, G. L., 130 Degelmann, A., 557 Degnan, B. M., 808 DeHaan, R. L., 363, 365 Dekel, N., 875, 876 del Pino, E. M., 744 DeLanney, L. E., 743 Delarue, M., 231 DeLeon, C. V., 487 Denegre, J. M., 158 Deng, C., 357 Denno, R. F., 813, 814 Dernburg, A. F., 852 Desmond, M. E., 267 Desplan, C., 563 Dessain, S., 569 Desvages, G., 799 Detrick, R. J., 95, 263 Detwiler, S. R., 702 Devreotes, P., 23 Dhadialla, T. S., 870 Diamond, M. I., 423, 424 Diaz-Benjumea, F. J., 752 Diaz-lnfante, A., 873 DiBerardino, M. A., 42, 44, 45 Dickerson, R. E., 494 Dickinson, L. A., 452 Dickinson, M. E., 269 Dierks, P., 396 Dieterlen-Livre, F., 371, 378, 379 Dietrich, M., 913 DiNardo, S., 568, 659 Dixon, G. H., 394 Dixon, K. E., 537, 843, 844 Dobzhansky, T. G., 902, 913 Dodson, S., 819 Doe, C. Q., 307, 311, 312, 530, 576 Dohmen, M. R., 517 Dolci, S., 846 Doll, P., 407, 720 Dong, J., 872 Doniach, T., 623, 624, 626, 627, 854 Donner, P., 418 Donoghue, D. J., 110, 357 Dorris, M., 833 dOrval, B. C., 467 Downie, S. A., 722, 723 Downs, S., 873 Doyle, C., 688 Drescher, U., 328
Dressler, G. R., 680 Drewry, G. E., 739 Driesch, H., 202, 594, 595, 596, 597, 600 Driever, W., 219, 220, 405, 552, 553, 555 Driscoll, D. J., 445 Drummond, I. A., 420 Duband, J. L., 240 Dube, F., 152 Dubnau, J., 481, 554 Dubois, R., 849 Dudas, I., 263 Dudley, A. T., 678 Duffy, J. B., 558, 791 Dulhunty, A. F., 97 Dumas, J. B., 122 Dumont, J. N., 41, 862 Dunphy, W. G., 198 Duprez, D. M., 721 Drnberger, H., 765 Duronio, R. J., 200 Durston, A., 27, 625 Dyce, J., 182 Dyke, C., 891 Dym, M., 856, 857 Dynan, W. S., 401 Dynlacht, B. D., 400 Dzierak, E., 379 Early, A., 26 Eberhart, C. G., 858 Echelard, Y., 618 Ecker, R. E., 197 Eddy, E. M., 844 Ede, D. A., 353 Edelman, G. M., 88, 95, 97 Edery, P., 290 Edgar, B. A., 194, 195, 198, 199, 488, 489, 565 Edmonds, D. K., 827 Edmondson, J. C., 273 Edstrom, J. E., 474 Edwards, M., 835 Efstratiadis, A., 396 Eichele, G., 254., 720 Eicher, E. M., 780, 781, 782 Eisen, A., 146 Eisen, A. Z., 736 Eisen, J., 317 Eisenbach, M., 132 Ekblom, P., 679 Elder, J. T., 299 Elgin, S., 435 Elinson, R. P., 142, 146, 156, 157, 159, 226, 607, 744, 900 Ellis, J., 441 Ellis, L. M., 370 Ellis, R. E., 529, 853, 855 Elsholtz, H. P., 406 Emerson, C. E., Jr., 349 Emery, I. F., 758, 759 Endo, Y. G., 138 Engstrom, L., 524 Enver, T., 440 Enzmann, E. V., 875 Epel, D., 126, 133, 139, 142, 146, 150, 151
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ndice de Autores
Ephrussi, A., 536 Epifano, O., 865 Eppig, J. J., 876 Erdlyi, M., 536 Erickson, C. A., 260, 264, 285, 286, 288, 291 Ericson, J., 308, 309 Ernfors, P., 292 Etemad-Moghadam, B., 524 Etkin, L., 863, 864 Etkin, W., 742 Ettensohn, C. A., 84, 173, 212, 215, 217, 600 Evans, H. M., 369 Evans, M.J., 188 Evans, R., 450 Evans, R. M., 422 Evans, T., 199 Evans, T. C., 481, 491, 528, 529 Eyal-Giladi, H., 189, 233, 234, 238, 239, 636, 848 Faber, M., 596 Fagard, R., 496 Faix, J., 25 Fallon, A. M., 808 Fallon, J. F., 492, 702, 703, 705, 708, 711, 712, 713, 714, 721, 724, 725, 738 Falvo, J. V, 423 Fan, C. M., 346, 629, 659 Farach, M. C., 106 Farel, P. B., 740 Farley, B., 363 Fssler, P. E., 603 Fausto-Sterling, A., 787 Fawcett, D. W., 277, 355, 856, 857 Fawcett, J. W., 331 Featherstone, M. S., 829 Feduccia, A., 913 Feinberg, R. N., 369 Feldman, M., 348 Fell, P., 30 Felsenfeld, G., 432, 439 Ferguson, E. L., 583 Ferguson, M. W. J., 799, 817 Ferguson-Smith, A. C., 445 Ferrand, R., 290 Ferrell, J. E., 202 Ferris, C. D., 147 ffrench-Constant, C., 468, 846 Fidler, I. J., 370 Field, M. C., 267 Fiering, S., 438 Fink, R., 83 Fink, R. D., 212, 213, 214 Finkelstein, R., 555 Firtel, R. A., 28 Fischer, J -L., 510 Fishell, G., 273, 276 Fisher, M., 240 Fisher, S. J., 246 Flach, G., 490 Flaherty, D., 214 Flamme, I., 368, 369 Flavell, R. D., 442 Fleming, T. P., 182, 183, 184 Flickinger, R. A., 862
Fliess, W., 319 Flor, H., Florman, H. M., 130, 135, 136, 138, 144 Foe, V. E., 193, 194, 543, 583 Foerder, C. A., 143 Fol, H., 122 Foltz, K. R., 134, 135, 149 Fong, G.-H., 369 Forehand, C. J., 740 Forlani, S., 580 Forrester, W. C., 453 Forristall, C., 537, 863 Forscher, P., 277, 278 Foster, J. W., 780 Foty, R. A., 87 Foulkes, N., 859 Fox, C. A., 484, 485 Fox, H., 736 Francis, P. H., 719 Francis, R., 855 Francke, C., 474 Franco, B., 319, 828 Frank, D., 444 Franklin, L. E., 130 Frantz, G. D., 275 Fraser, R. A., 705 Fraser, S. E., 96, 291 Freed, C. R., 334 Freeman, C. S., 762 Freeman, G., 178 French, B. A., 415 French, V., 547 Frieden, E., 743, 744, 749 Friedman, J. M., 833 Friet, S. C., 809 Frigerio, G., 553 Frischer, L. E., 570 Fristrom, D., 749, 757 Fristrom, J. W., 748, 757 Frye, B. E., 736 Fu, L., 487 Fuchs, E., 299 Fujimori, T., 95, 263 Fujimoto, S., 411 Fujisawa, H., 172 Fujita, S., 270 Fujiwara, M., 672 Fukada, K., 292 Fukuda, S., 813 Fukumachi, H., 665 Fullilove, S. L., 193 Fulton, B. P., 146 Fulton, C., 10, 12 Funayama, N., 609 Funk, C., 204 Furuichi, T., 147 Gabrielli, B., 864 Gachelin, G., 375 Gagnon, M. L., 465 Galau, G., 477 Gale, E., 899 Galen, C., 773, 774 Galileo, D. S., 214 Galindo, R. L., 581 Gall, J. G., 63 , Gallatin, W. M., 849 Gallera, J., 257 Gaan, Y., 725
Gans, C., 894, 912 Garabedian, M. J., 404 Garbers, D. L., 129, 153 Garcia, E., 9 Garcia, J. E., 873 Garcia-Bellido, A., 751 Garcia-Fernndez, J., 905, 906 Garcia-Martinez, V., 362 Garcia-Ramirez, M., 436 Gardiner, D. M., 146, 703, 715 Gardiner, R. C., 186 Gardiner, S. L., 890 Gardner, R. L., 70, 847 Garrard, W. T., 453 Garstang, W., 890, 912 Gartler, S. M., 448 Gash, D. M., 334 Gasman, D., 884 Gasseling, M. T., 717 Gasser, S. M., 452 Gaul, U., 562, 563 Gaunt, S. J., 645, 906 Gautier, C., 198 Gautier, J., 199 Gavis, E. R., 480, 556 Gawantka, V., 614 Gebauer, F., 485 Gedamu, L., 394 Geddes, P., 774 Geduspan, J. S., 704 Gehring, A. J., 557, 572 Gehring, W. J., 419, 565, 573, 903, 904 Geigy, R., 532, 738 Geis, I., 494 Geissler, W. M., 783 Geitz, H., 831 Gelbart, W. M., 585 Gellert, M., 412 Gendron-Maguire, M., 642 Geoffroy Saint-Hilaire, E., 509, 616, 635, 646, 647 George-Weinstein, M., 350, 416 Gergen, J. P., 791 Gerhart, J. C., 157, 158, 159, 197, 225, 226, 227, 606, 607, 613, 620, 862, 863 Gerisch, G., 24, 95 Gershon, M. D., 307 Geyer, P. K., 454 Ghosh, S., 414 Gibbs, J. B., 109 Gibson-Brown, J. J., 722 Giese, K., 779 Gilbert, L. I., 754 Gilbert, S. F., 32, 37, 38, 40, 488, 490, 596, 613, 616, 624, 821, 891, 909, 913 Gilbert, S. G., 243, 248 Gilbert-Barness, E., 358 Giles, R. E., 152 Gilkey, J. C., 145 Gillies, S. D., 402 Gilula, N. B., 98, 875 Gimeno, S., 836 Gimlich, R. L., 226, 227, 605, 607, 609
Ginder, G. D., 445 Ginsburg, M., 844, 848 Ginzburg, A. S., 146 Girasole, G., 378 Giroud, A., 829 Gish, D. T., 895 Gittes, G., 383 Giudice, A., 172 Giudice, G., 84 Glabe, C. G., 132, 133, 134, 135, 140, 143, 901 Glaser, T., 282 Glazer, L., 687 Glover, D. M., 202 Gluecksohn-Schoenheimer, S., 39, 637, 677 Goddard, J. M., 295 Godement, P., 326 Godin, L, 846 Godlin, I. E., 379 Goebl, M., 199 Goethe, W., 892 Goetinck, P., 355, 705, 713 Goins, T. L., 291 Golden, J. A., 262 Goldey, 836 Goldfine, I. D., 350 Goldman, P. S., 276 Goldschmidt, R. B., 38, 913, 914 Goldstein, B., 522, 527 Goldstein, R. S., 288 Goldwasser, E., 375 Gona, A. G., 742 Gnczy, P., 858 Gong, Q., 440 Gong, X., 137 Gont, L. K., 255, 265, 613 Gonzlez-Crespo, S., 582 Gonzlez-Martinez, M. T., 130 Gonzlez-Reyes, A, 554, 572, 869 Gooday, D., 288 Goodenough, U. W., 13, 15 Goodman, C. S., 307, 311, 312, 315, 316, 322, 325 Goodman, W., 754 Goodrich, E. S., 906 Goodwin, E. B., 491 Goralski, T. J., 793 Gordon, R., 256 Gordon, M. Y., 377 Gorski, R. A., 787 Goss, R. J., 714 Gossler, A., 70 Gotthard, K., 814 Gottlieb, D. I., 328 Gottlieb, G., 334, 913 Gouillex F., 767 Gould, K., 198 Gould, M., 142, 146 Gould, S. J., 276, 350, 743, 884, 887, 894, 899 Goulding, E. H., 644, 647, 829, 830 Gould-Somero, M., 142 Goustin, A. S., 490, 658 Govind, S., 583 Grace, M., 496 Gradziadi, P. P. C., 319 Graf, J., 105
ndice de Autores
IA1 - 5
Graff, J. M., 612, 614 Graham, A., 295 Graham, C. E., 847 Graham, C. F., 185 Graham, P. L., 855 Grainger, R. M., 628, 656, 668, 669, 670, 671 Granato, M., 189 Granger, N. A., 754 Grant, P., 862, 890 Grper, L., 363 Grbic, M., 195, 196 Green, G. R., 153, 859 Green, S., 420, 422 Greene, E., 814 Greenough, W. T., 824 Greenspan, R. J., 692 Greenwald, G., 90, 281 Greenwald, I., 692, 693 Gregg, N. M., 835 Gregory, W. A., 273 Grey, R. D., 146 Gribble, T. J., 494 Grieshammer, W., 724 Grimm, S., 752 Grindley, J. C., 903 Grobstein, C., 675, 676, 684, 686 Grobstein, P., 739, 740 Gromova, I. I., 452 Gronemeyer, H., 758 Groner, B., 107, 108, 767 Gross, J., 28, 736 Gross, K. W., 482 Gross, M., 496 Gross, P. R., 152, 479 Grossbach, U., 52 Grosschedl, R., 396 Grossniklaus, U., 555 Grosveld, F., 396, 438, 440 Groudine, M., 433, 434, 435, 442, 445 Gruenbaum, Y., 443 Grumbach, M. M., 358 Grumet, M., 319 Grunwald, D. J., 636 Gruss, P., 640, 644 Gubbay, J., 779 Guerrier, P., 178, 520 Guger, K. A., 609 Guild, G. M., 60, 476 Guillen, I., 751 Guillery, R. W., 825 Guillette, L. J., 836 Gulyas, B. J., 181 Gumbiner, B. M., 94, 609 Gumpel-Pinot, M., 665 Gundersen, G. G., 140 Gundersen, R. W., 314, 315 Guo, B., 452 Guo, L., 299 Guo, S., 524 Guo, W., 467 Gurdon, J. B., 43, 44, 196, 658, 866 Gustafson, T., 172, 210, 212, Guthrie, S., 267, 293 Gutzeit, H. O., 868 Gutzke, W. H. N., 799
Guyette, W. A., 476 Gwatkin, R. B. L., 131 Gyllensten, U., 152 Haas, H., 238 Haber, D. A., 420 Hacker, A., 779 Hadfield, M. G., 807 Hadler, N. M., 102 Haeckel, E., 805, 884 Hafen, E., 563, 683, 689 Hafner, M., 145 Hagedorn, H. H., 808, 809, 870 Hahn, H., 661 Hahnel, A. C, 844 Hakamori, S., 103 Hake, L.E., 485 Halder, G., 282, 903, 904 Halevy, O., 350, 351 Halfter, W., 328 Hall, B. K., 351, 353, 735, 892, 894, 912, 914 Hall, C. G., 149 Hall, H. G., 216, 137 Hall, Z. W., 330 Hallet, M. M., 290 Halprin, K. M., 299 Hamaguchi, M. S., 146, 153 Hamburger, V., 39, 325, 603, 716, 913 Hamburgh, M., 666 Hamelin, M., 320 Hamer, D. H., 788 Hmmerling, J., 8, 9 Hammond, C. B., 783 Hamp, A., 897 Hanes, S. D., 576 Hanken, J., 735 Hanscombe, O., 441 Hansen, C. S., 627 Hansen, L. G., 836 Hansen, R. A., 808 Hanson, I. M., 903 Haqq, C. M., 779, 780, 784 Hara, K., 173, 197 Harary, I., 363 Haraway, D. J., 596 Hardie, J., 811 Hardin, J. D., 201, 217, 218, 228, 229 Harding, K. W., 561, 563, 564, 571, 572 Hardman, P., 686 Hardvin-Lepers, A., 859 Hardy, D. M., 129 Hardy, M. H., 300 Harford, J. B., 492 Harkey, M. A., 215 Harland, R. M., 197, 616, 617, 624 Harper, S., 332 Harrelson, A. L., 96, 316 Harrington, A., 596 Harris, G. W., 787 Harris, H., 9, 494 Harris, W. A., 325, 331, 605 Harrison, R. G., 38, 39, 277, 312, 313, 505, 666, 702, 703, 706
Hart, A. C., 690 Hart, M. W., 821 Hartenstein, V., 692 Hartfelder, K., 816 Hartmann, G., 240 Hartmann, M., 17 Hartsoeker, N., 122 Harvell, C. D., 819 Harwood, A. J., 27, 28 Harwood, J., 40 Hasegawa, K., 813 Hashimoto, C., 579, 581 Hashimoto, N., 876 Hstbacka, J., 357 Hasty, P., 350 Hatini, V., 681 Hatta, K, 94, 344 Hatten, M. E., 273 Hattersley, G., 378 Hattori, M., 354 Hauschka, S. D., 334, 350 Hausen, P., 610 Hawley, D. K., 399 Hawley, S. H. B., 614, 616, 617 Hay, B., 535 Hay, E. D., 374, 672, 673 Hayashi, K., 703 Haynes, S. R., 858 He, X., 609 Heasman, J. M., 94, 95, 103, 174, 175, 609, 844 Heath, J. K., 845 Hebbes, T. R., 436 Heberlein, U., 688 Hebert, J., 658 Hecht, N. B., 858 Hecht, P. M., 581 Hedgecock, E. M., 320 Heemskerk, J., 566, 568, 659 Hegner, R. W, 532 Heinecke, J. W, 150 Heins, S. W., 817, 818 Heitzler, P., 692 Held, L. I. Jr., 751, 753 Helde, K. A., 191 Helms, J. A., 720, 721 Hemesath, T. J., 290 Hemler, M. F., 104 Hemmati-Brivanlou, A., 614, 617, 624 Henderson, C. E., 332 Henderson, S., 529 Hendrickson, A., 282 Hengartner, M. O., 529 Henkel, T., 414 Hennen, S., 45 Henry, E. W., 278 Henry, J. J., 520, 600, 628, 669, 670, 671, 886, 901 Hensen, V., 277 Hentze, M. W, 486 Hepburn, H. R., 747 Herbst, C., 214, 805 Herbst, R., 689 Herman, R., 452 Herr, W, 406 Herrmann, B. G., 637 Hershey, J. W B., 472, 473
Hertwig, O., 36, 122, 153, 596, 702, 805 Heuser, J., 145 Higgins, S. J., 778 Higuchi, M., 493 Hilfer, S. R., 280, 683 Hill, D. P., 522, 524, 859 Hill, R. J., 690 Hill, R. S., 865 Hille, M. B., 486 Hilleman, B., 836 Hillman, N., 185 Hinchliffe, J. R., 702, 717, 726 Hinegardner, R. T., 196, 745 Hiom, K., 412 Hiramoto, Y., 146, 153 Hirata, J., 530 Hird, S. N., 522 Hiroyoshi, T., 853 Hirsh, D., 521, 854 Hirth, F., 647 His, W., 36, 277 Hitt, A. L., 105 Ho, S. Y., 366 Ho, R. K., 220 Hoch, M., 563 Hockenbery, D. M., 529 Hodges, P. E., 466 Hodgkin, J., 795, 796, 854 Hodgson, S., 903 Hoey, T., 401 Hoffmann, R. J., 815 Hoffner, N., 42 Hofmann, A., 901 Hogan, B. L. M., 58, 612, 645, 703, 903 Hogg, N. A. S., 763 Hogness, D. S., 571, 576 Hohn, A., 332 Holder, N., 898 Holland, N. D. et al., 911 Holland, P. W. H., 58, 905, 906 Holley S. A., 310, 614, 616, 909 Holliday, R., 443 Hollinger, T. G., 146 Hollyday, M., 309, 323, 325 Holmes, L. B., 835 Holowacz, T., 226 Holt, A. B., 276 Holt, J. T., 475 Holter, H., 416 Holtfreter, J., 80, 82, 83, 92, 94, 223, 227 Holtzer, H., 350, 416, 655 Hong, C. C., 579, 581 Hong, K., 140 Honig, L. S., 717, 718 Hoppe, P. E., 692 Hoppler, S., 609 Hopson, J. A., 895 Horder, T., 39 Horowitz, D. S., 467 Horowitz, M. C., 774 Hrstadius, S., 171, 172, 211, 594, 597, 598, 599 Horton, W. A., 352, 354 Horvitz, H. R., 521, 529, 691 Horwitz, A., 104, 105
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ndice de Autores
Hoskins, E. R., 735 Hoskins, M. M., 735 Hoskins, S. G., 739, 740 Hosoda, K., 290 Hotchkiss, R. D., 442 Hough-Evans, B. R., 477 Houliston, E., 157 Howard, K. R., 850 Hoyle, H. D., 858 Hozumi, N., 410, 411, 412 Hu, S., 788 Huarte, J., 484, 485, 873 Hubel, D. H., 335, 824, 825 Huettner, A. F., 262 Hughes, R. A., 332 Hui, C.-C., 724 Hlskamp, M., 556 Hummel, K. P., 648 Humphrey, R. R., 853 Humphreys, T., 152, 173, 462 Humphreys, W. J., 173 Humphries, R. K., 375 Hunt, P., 356, 377, 638, 640 Hunter, C. P., 796 Hunter, R. H. F., 132 Hunter, T., 426 Hurle, J. M., 708 Hutchinson, N., 451, 452 Hutter, H., 528, 529 Huxley, J. S., 595, 702, 743 Hyatt, G. A., 672, 673 Hylander, B. L., 130, 143 Hyman, L. E., 483 Hynes, R. O., 325, 326, 468 Ibez, C. F., 333 Iguchi-Ariga, S. M. M., 444 Igusa, Y., 146 lhle, J. N., 107 Ikenishi, K., 537 Imbalzano, A. N., 436 Immergluck, K., 573 Imperato-McGinley, J., 783, 784 Infante, A., 482 Ingersoll, E. P., 173 Ingham, P. W., 114, 566, 572, 727 Ingram, V. M., 443 Inoue, H., 853 lnou, S., 171 Inuzuka, H., 325 Ip, Y. T., 584, 585 Irish, V. F., 556, 585 Irvine, K. D., 753 Irvine, R. F., 147 Irving, C., 289 Isaacs, H. V., 626 Isacson, O., 334 Ishii, N., 320 Ishizaki, H., 755 Iten, L. E., 705, 709 Iverson, L. E., 467 Iwao, Y., 142 Izpisa-Belmonte, J.-C., 637, 705, 711, 720 Jckle, H., 557, 561, 562, 563 Jacklin, D., 787 Jackson, D., 370
Jackson, D. A., 452 Jackson, J., 132 Jacob, F., 48 Jacobs, D., 640 Jacobs, P. A., 154 Jacobson, A. G., 193, 256, 258, 259, 363, 668, 687 Jacobson, M., 270, 271, 285, 327, 605 Jacq, X., 401 Jaffe, L. A., 142, 143, 146, 147, 151, 806 Jaffe, L. F., 146, 149 Jaffe, S. M., 753 Jaglarz, M. K., 850 James, J. F., 829 Jamrich, J., 67 Jansen, H. T., 836 Janzen, F. J., 817 Jarriault, S., 416 Javois, L. C., 705 Jeannotte, L., 643 Jefferies, R. P. S., 890 Jeffery, W. R., 514 Jelalian, K., 448 Jen, Y., 415 Jenkins, N. A., 482 Jenuwein, T., 453 Jephcott, 239 Jeppesen, P., 436, 450 Jermyn, K. A., 21, 26, 27 Jernvall, J., 660, 682 Jessell, T., 625 Jessus, C., 199 Jesuthasan, S., 220 Jeyasuria, P, 799 Jiang, J., 583, 584, 751 Jilka, R. L., 356, 378 Joanen, T., 799, 817 Johannsen, O. A., 195 Johnson, E. M., 835 Johnson, H. H., 313 Johnson, M. H., 184, 186 Johnson, R. L., 23, 346, 629, 659, 661 Johnston, M. C., 295, 830 Jones, A. R., 855 Jones, C. M., 612, 658 Jones, K. L., 833 Jones, K. R., 292, 332 Jones, M. L., 890 Jones, N., 415 Jones, P. H., 298 Jones, R., 138 Jongen, W. M. F., 98 Jongens, T. A., 534, 535, 536 Jonnson, J., 346, 383 Jordan, T., 282 Joseph, J., 849 Josso, N., 785 Jost, A., 775 Jost, J. P., 444 Joubert, Y., 786 Joyner, A. L., 724 Judson, H. F., 48 Jukes, T., 592 Jurand, A., 244 Jrgens, G., 555
Jursnich, V. A., 479, 794 Jurskov, V., 375 Just, E. E., 38, 39, 80, 141, 142, 577 Kabat, D., 496 Kadokawa, Y., 93, 106 Kadonaga, J. T., 399, 401 Kaestner, K. H., 417 Kafri, T., 445 Kahn, A. J., 356 Kahn, C. R., 291 Kalcheim, C. R., 292 Kalderon, D., 869 Kalimi, G. H., 97 Kalt, M. R., 174 Kaltenbach, J. C., 736 Kalthoff, K., 547, 552 Kamen, R., 475 Kammerman, S., 872 Kanamori, A., 741 Kandel, E. R., 786, 787 Kandler-Singer, I., 547 Kane, D. A., 190, 218 Kapfhammer, J. P., 318 Kaplan, S. L., 358 Kaptein, R., 421 Karavanova, I. D., 681 Karch, F., 574 Karfunkel, P., 260 Karibian, D., 494 Karim, F. D., 761 Karin, M., 407, 421, 426 Karlson, P., 754 Karlsson, S., 438 Karlstrom, R. O., 328 Karp, G. C., 214, 215, 737 Karpen, G. H., 852 Karr, T. L., 193, 194, 565, 858, 859 Karsch-Mizrachi, I., 858 Karsenti, E., 197 Kastern, W. H., 486 Kater, S. B., 333 Kato, Y., 186 Katz, W. S., 690, 691 Kauffman, S. A., 888, 911 Kaufman, M. H., 155, 188 Kaufman, T. C., 178, 552, 569, 570, 571 Kaushal, S., 351 Kawahara, A., 741 Kawakami, A., 755 Kay, G. F., 449 Kay, R. R., 24, 26 Kazazian, H. H., 396 Kaznowski, C. E., 274, 275 Keiding, N., 836 Keino-Masu, K., 320 Keith, D. H., 450 Kelce, W. R., 836 Keller, E. F., 22, 40 Keller, G., 375 Keller, R. E., 210, 222, 223, 228, 229, 230, 231, 232, 257, 288, 613, 627 Keller, S. H., 130 Keller, W., 466
Kelley, R. I., 263 Kellum, R., 454 Kelly, K., 418 Kelly, S. J., 185 Kelso-Winemiller, L., 486 Kemp, T. S., 896 Kemphues, K. J., 523, 524 Kennedy, C., 825 Kennedy, T. E., 320, 321 Kent, J., 780 Kenyon, C., 691 Kerr, L. D., 414 Kerrebrock, A. W., 852 Keshet, I., 444 Kessel, M., 640, 641, 644, 645 Kessel, R. G., 174, 190 Kessler, D. S., 611 Keyes, L. N., 791, 792 Keynes, R., 267, 318, 638 Kezer, J., 852, Khaner, O., 238, 239, 600, 605, 636 Kidd, S., 581, 692 Kieny, M., 705 Kiledjian, M., 475 Kim, J., 751, 753 Kim, S. K., 691 Kimble, J., 491, 521, 528, 796, 797, 853, 854, 855 Kimelman, D., 195, 492, 609, 610, 612, 616 Kim-Ha, J., 480, 536, 869 Kimmel, C. B., 189, 190, 191, 218, 219, 220, 221, 317 Kimmelman B. A., 38 King, H. D., 668 King, M. C., 914 King, M. L., 537, 612 King, T. J., 42, 43, 44 Kinoshita, T., 738 Kinter, C. R., 715 Kintner, C., 95 Kirby, C. M., 523 Kirby, M. L., 285, 294, 295, 297 Kirk, D. L., 16, 17, 18, 19, 21 Kirk, M. M., 21 Kirschner, M. W., 168, 194, 196, 197, 198, 200, 225, 488, 492 Kispert, A., 677 Kistler, A., 735 Kitazawa, T., 813 Klag, J. J., 158 Klausner, R. D., 492 Kleene, K. C., 462 Klein, C., 25 Klijn, I. G. M., 765 Kline, D., 146, 147, 150 Klingler, M., 557 Kloc, M., 843, 863, 864 Klock, G., 422 Kloppstech, K., 9 Klose, M., 312 Klug, A., 124 Knecht, D. A., 24, 25 Knipple, D. C., 563 Knoblich, J. A., 200, 530 Knoll, J. H. M., 445 Knowland, J., 451
ndice de Autores
IA1 - 7
Knudsen, K., 104, 348 Kobayashi, S., 534 Kobayashi, T., 331 Koch, P. B., 814 Kochav, S. M., 238 Kochert, G., 19 Kochhar, D. M., 829 Koelle, M. R., 761 Koga, M., 691 Khler, G., 90 Koleske, A. J., 400 Kollar, E. J., 682 Kollros, J. J., 739 Kolodkin, A. L., 318, 321, 323 Kolodziej, P. A., 320 Klreuter, J. G., 508 Komuro, H., 273 Konigsberg, I. R., 347, 416 Konijn, T. M., 22 Konishi, M., 785 Kntges, G., 896 Koopman, P., 779 Koos, R. D., 873 Kopan, R., 416 Kopf, G. S., 129 Kornberg, R. D., 431 Kornberg, T., 488, 489, 565 Korsching, S., 332 Koseki, C., 677 Kosman, D., 584, 585 Koster, K., 627 Kotch, L. E., 834 Kowalevsky, A., 884 Koyoma, E., 682 Kozak, M., 472, 473 Krabbenhoft, K. M., 708 Krainer, A. R., 466, 467 Krantz, S. B., 375 Kratochwil, K., 682, 763, 764, 765 Kratzer, P. G., 448 Kraut, R., 563 Kreidberg, J. A., 420, 676 Krieg, P. A., 467 Krull, C. E., 289 Krumlauf, R., 637, 638, 639, 640, 645 Krutch, J. W., 20 Ku, M., 660 Kubai, L., 379 Kubota, Y., 368 Kuehn, M. R., 637, 648 Kukalova-Peck, J., 907, 908 Kulikauskas, V., 828 Kumar, V., 421 Kunkle, M., 153 Kuratani, S. C., 297 Kurihara, N., 378 Kuroda, M. I., 446 Kurz, E. M., 786 Kuwabara, P. E., 796, 797 Kuwana, T., 848, 849 Kuznicki, K., 532 Kvist, U., 154 Kwon, H., 436 Kwon, Y. K., 858 LaBarbera, M., 367 LaBonne, C., 612
Lacy, E., 186 LaDue, R. A., 833 Laemmli, U. K., 452 Lahav, R., 290, 293 Lamb, T. M., 617, 624 Lambert, B., 53 Lammer, E. J., 829 Lamoureux, P., 278 Lance-Jones, C., 309, 310, 325 Lande, R., 713 Lander, A. D., 95, 325, 326 Landis, S. C., 292 Landmesser, L. T., 96, 309, 310, 315, 323, 325 Landschulz, W. H., 416 Landstrom, U., 222 Lane, M. C., 214, 216 Lane, M. D., 417, 418 Lane, M. E., 200, 869 Langeland, J., 189, 191, 219, 220, 221 Langille, R. M., 894, 912 Langlais, J., 132, 187, 345, 352, 365, 367, 368, 383, 384, 776, 783, 845 Lappi, D. A., 658 Larabell, C. A., 609 Larsen, W. J., 243, 244, 245, 272, 296, 272, 296, 365, 366, 382, 876 Larson, A., 898 Lasco, P, 869 Lash, J. W, 101, 103, 241, 362, 363, 832 Laskey, R. A., 196, 197, 861 Lasko, P. F., 535 Lassar, A. B., 349, 415 Latham, K. E., 490 Lau, P. P., 493 Laufer, E., 705, 706, 713, 719, 720, 721 Law, R. D., 190., 317 Lawn, R. M., 393 Lawrence, P. A., 560, 751 Lawson, K. A., 244, 245, 683 Laybourn, P. J., 399 Lazarides, E., 103, 105 Le Douarin, N. M., 241, 258, 259, 260, 266, 284, 285, 286, 291, 292, 297, 345, 677 Le Livre, C. S., 285 Le Mouellic, H., 642, 643, 649 Leblond, C. P., 123 Lechleiter, J. D., 147 Ledbetter, J. A., 688 Leder, P., 419 Lederman, M., 38 Lee, C.-H., 94 Lee, D. K., 399 Lee, D. Y., 436, 437, 450 Lee, H. Y., 260 Lee, J. E., 308 Lee, M. S., 198, 199 Lee, R. C., 491 Lee, R. K., 191 Lee, S., 98 Lee, Y-H., 902 Lees, A. D., 811
Leevers, S. J., 109 Legouis, R., 319 Lehmann, R., 480, 535, 536, 556, 692 Lehming, N., 585 Lehtonen, E., 679 Leibniz, 898 Lemaire, P., 610 Lemaire, W. J., 873 Lemaitre, B., 582 Lemischka, I. R., 375 Lemmon, V., 96 Lemoine, E. M., 833 Lenardo, M. J., 414 Lengyel, J. A., 489 Lennarz, W. J., 130, 133, 134 Lenoir, T., 509 Lenz, W., 830 Leonard, C. M., 102 Lepage, T., 173 Leptin, M., 105, 583 Letourneau, P. C., 270, 315 Leutert, T. R., 800 LeVay, S., 787, 788 Levi-Montalcini, R., 332 Levin, D., 495 Levin, M., 648, 649, 650, 659 Levine, A. E., 130 Levine, M., 561, 563, 564, 565, 572, 582, 583, 584 Levine, S., 787 Levy, J. B., 184 Lewin, B., 432 Lewis, E. B., 58, 569, 570, 574, 907 Lewis, J. H., 708, 709 Lewis, W., 667 Lewontin, R. C., 899 Leyton, L., 132, 138 Li, E., 446 Li, L., 416 Li, Q. Y., 723 Li, S., 407 Li, Y., 357 Li. W., 112 Liang, L., 480 Lichtman, J. W., 325, 331, 826 Lieberfarb, M. F., 480 Liem, K., 264 Liesi, P., 315 Lilien, J., 314 Lillie F. R., 38, 39, 178, 201, 876, 885 Lin, F.-T., 417, 418 Lin, H., 867 Lin, L.-F. H., 332 Lin, R., 527 Lin, Y.-S., 399 Linask, K. K., 237, 362, 363, 365 Linask, K. L., 103 Lindsay, R. M., 332 Lindvall, O., 334 Linney, E., 829 Lira, A. A., 74, 75 Liscia, D. S., 766 Liskay, R. M., 450 Little, G., 736 Liu, C. K., 592
Liu, J.-K., 112 Livne, I., 319 Lo, C., 97, 98 Lodish, H. F., 496 Loeffler, M., 374 Lfberg, J., 288, 289 Logan, C., 331 Lohnes, D., 906 London, I. M., 494, 495, 496 Longo, F. J., 139, 142, 146, 152, 153, 873 Loomis, C. A., 727 Loomis, W. F., 24, 26 Lopez, L. C., 132, 137 Lpez-Martnez, A., 711, 718, 719 Lopo, A. C., 486 Lorca, T., 864 Loring, J. F., 286 Lough, J., 363 Lovejoy, A. O., 898 Lovtrup, S., 222 Lowe, L. A., 648 Lu, H., 400 Lucchesi, J. C., 446 Luckett, W. P., 242 Ludrus, L. A., 452 Lufkin, T., 642 Lumsden, A., 267, 292, 293, 638, 682, 896 Luna, E. J., 105 Lund, R. D., 334 Lundelius, J. W, 178 Lundmark, C., 221, 222 Luo, G., 679 Luo, X., 780, 781 Luo, Y., 322 Lustig, K. D., 617 Luttmer, S., 146 Lutz, B., 169 Lyman, D. F., 741 Lynch, M. H., 355, 356 Lynn, W. G., 745 Lyon, M. F., 447 Lyons, G. E., 349, 350 Ma, C., 688 Maas, R., 682 MacArthur, C. A., 468 MacCabe, J. A., 721 Macdonald, P. M., 550, 557, 869 MacDougall, C., 468, 471 MacGregor, H. C., 865 Mackenzie, J. L., 319 Mackie, E. J., 682 MacMurray, A., 637 Maden, M., 645, 703, 715 Maderson, P. F. A., 893 Madhavan, M. M., 748 Madine, M. A., 200 Maeda, Y., 27 Maeno, M., 612 Maheswaran, S., 424 Mahmood, R., 711 Mahowald, A. P., 533, 534, 543 Maisonpierre, P. C., 332 Malacinski, G. M., 221, 222, 489 Maldonado, E., 399 Malicki, J., 640, 905
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ndice de Autores
Malinda, K. M., 215 Malocinski, G., 743 Manak, J. R., 904 Mancilla, A., 284 Mandel, J. L., 442 Manes, M. E., 156, 159 Mange, A. P., 560 Mange, E. J., 560 Mango, S. E., 528 Mangold, H., 603, 604, 605 Mangold, O., 621, 622 Maniatis, T., 396, 423, 465, 469, 471, 794 Manley, N. R., 641 Mann, I., 280, 281 Mann, R. S., 571, 576 Manning, J. E., 446 Manolagas, S., 356 Mansour, S., 780 Mantovani, R., 396 Marcey, D., 869 Marchase, R. B., 328 Marcus, N. H., 594 Mardon, G., 903 Margulis, L., 887 Marigo, V., 727 Mariman, E. C. M., 452 Marin, F., 268 Mark, M., 906, 907 Mark, W. H., 186 Markert, C. L., 187, 188, 197 Markussen, F.-H., 536 Markwald, R. R., 363 Marshall, E., 788 Marshall, H., 645 Martin, C., 378 Martin, D. I. K., 440, 441 Martin, F. D., 739 Martin, G. R., 188, 468, 705 Martin, J. R., 558 Martin, P. T., 331 Martindale, M. Q., 520 Martinet, M., 829 Martinez, E., 422 Martinez-Arias, A., 545, 559, 560, 572 Martins-Green, M., 112 Maruyama, Y. K., 597 Marx, J., 775 Massagu, J., 102 Masui, Y, 197, 864 Mather, E. L., 413 Mathison, P. M., 741 Matrisian, L. M., 106, 107 Matsui, Y., 846, 847 Matsukuma, S., 27 Matsunaga, M., 325 Matsunami, H., 94, 276 Matsuo, I., 647 Matsuoka, M., 412 Matsuzawa, M., 315 Mattei, M. G., 449 Matteoli, M., 308 Matthes, D. J., 322 Maurice, J., 874 Mavilio, F., 442, 443 Mayeda, A., 466 Mayer, T. C., 285
Mayor, R., 284 Mayr, E., 902, 913 Mayr, W. R., 187 Mazia, D., 139, 477 McArthur, M., 437 McBride, W. G., 830, 831, 832 McCarver-May, D. G., 837 McClay, D. R., 83, 84, 212, 213, 214, 215, 218, 600 McClendon, J. F., 596 McClung, C. E., 774 McCollum, S. A., 819 McConnell, S. K., 270, 274, 275 McCormick, F., 109 McCredie, J., 831 McCulloch, E. A., 374 McCulloh, D. H., 149 McCutcheon, F. H., 735 McDevitt, M. A., 466 McDonald, S. A., 27 McEwen, B. S., 786, 787 McFall-Ngai, M. J., 808, 809 McFarlane, S., 327 McGhee, J. D., 445, 526 McGinnis, N., 640 McGinnis, W., 58, 59, 637, 639 McGrath, J., 45, 46., 155 McGrew, L., 485, 626 McIntyre, B. S., 765 McKay, R., 317, 656 McKeon, J., 572 McKeown, M., 793 McKeown, T., 827 McKinnell, R. G., 43, 44 McKnight, S., 396 McLaren, A., 853 McMahon, A. P., 269, 609, 659, 660, 661, 722, 782 McPherson, S. M., 146, 147 Mead, K. S., 151 Mead, P. E., 614 Medvinsky, A. L., 379 Mee, J. D., 27 Mehregan, A. H. H., 300 Meier, S., 344, 672 Meijlink, F., 475 Meinhardt, H., 705, 751 Meizel, S., 131 Mello, G. C., 525, 526, 528 Melton, D. A., 479, 611, 617, 619, 658, 660, 863 Mencken, H. L., 378 Mencl, E., 668 Mendel, G., 35, 774 Menke, D. B., 858 Menko, A. S., 347 Meno, C., 648 Mercer, E. H., 172 Merimee, T. J., 355 Mermod, J. J., 482 Mescher, A. L., 715 Messersmith, E. K., 322, 323 Messing, J., 56 Metchnikoff, E., 884, 886, 913 Metz, C. B., 129 Metz, E. C., 901, 902 Meyer, W. J., 783 Meyer-Franke, A., 333
Miake-Lye, R., 198 Miesfeld, R., 420 Migeon, B. R., 445, 448, 450 Millauer, B., 369 Miller, B. A., 897 Miller, D. J., 137, 144 Miller, J. R., 215 Miller, L., 741 Miller, L. M., 796 Miller, O. L., Jr., 8, 866 Miller, R. L., 128, 129 Miller, S. A., 359 Miller, S. J., 300 Miller, T. E., 452 Milos, P. M., 418 Milstein, C., 90 Mina, M., 682 Minganti, A., 511, 514 Minishull, J., 864, 865, 199, 200 Mintz, B., 188, 347, 348, 845, 847, 848 Mitchell, A. W., 740 Miyake, T., 353 Miyazaki, S.-I., 146, 147 Mizuno, T., 683, 684 Mizzen, C. A., 437 Mlodzik, M., 557, 689 Moens, P. B., 851 Moffett, M. W., 816 Mohandas, T., 448, 450 Mohanty-Hejmadi, P., 703, 704 Mohler, J., 566 Mohri, T., 147, 150 Moller, C. C., 138, 144 Molven, A., 703 Monaghan, P., 647 Monk, M., 445, 449 Monod, J., 47, 48 Monroy, A., 85 Montagna, W., 298, 300 Montagu, M. F. A., 276 Montell, D. J., 580 Montgomery, A. M. P., 112 Montgomery, M. K., 808, 809 Moon, R. T., 487, 609, 621 Moor, R. M., 875 Moore, C. L., 787 Moore, G. D., 148 Moore, J. A., 48 Moore, J. W., 350 Moore, K. L., 266, 446 Moore, M. W., 677 Morange, M., 40 Morata, G., 751 Morgan, B. A., 726 Morgan, T. H., 35, 36, 38, 175, 177, 202, 789, 810, 914 Mori, C., 724 Mori, M., 741 Morle, F., 473 Moroni, M. C., 830 Morowitz, H. J., 276 Morrill, J. B., 176, 211, 212, 214, 216, 518 Morris, H. R., 26 Morriss, G. M., 245 Morriss-Kay, G., 294, 295, 644, 830
Morse, A. N. C., 808 Morse, D. E., 808 Mortlock, D. P., 710 Moscona, A. A., 84, 85 Moses, M. J., 851 Mottes, J. R., 467 Moury, J. D., 257, 258 Moury, J. G., 258 Moustafa, L. A., 70 Mowry, K. L., 863 Moy, G. W., 132, 133, 134 Moyle, W. R., 901 Mozingo, N. M., 126, 143 Muenke, M, 658 Mullen, L. M., 715 Mller, A. M., 379 Mller, F., 835, 884 Mller, G., 704 Wller, G. B., 897 Mller, J., 572, 883, 905 Mller, K., 24 Mller, M., 576 Mulnard, J. G., 181 Multigner, L., 124 Munaim, S. I., 715 Munar, E., 348 Muneoka, K., 702 Mnsterberg, A. E., 346 Muragaki, Y., 710 Murata, Y., 481, 556, 572 Murphy, M. E., 368 Murray, A. W., 200 Murray, J. D., 22, 23, 817, 902 Murre, C., 577 Muscatelli, F., 781 Myers, R. M., 396, 397 Myles, D. G., 140 Nabekura, J., 786 Nabeshima, Y., 350 Nadal-Ginard, B., 416 Nagafuchi, A., 94 Nagel, M., 231 Nagele, R. G., 255, 260 Nagoshi, R. N., 469 Nakamoto, M., 329 Nakamura, A., 535 Nakamura, O., 606 Nakamura, T., 686 Nakanishi, Y., 684, 685, 686 Nakatsuji, N., 231 Nakauchi, H., 375 Nambu, J. R., 584 Nameroff, M., 348 Nantel, F., 859 Nardi, J. B., 87, 715 Nascone, N., 363 Nathans, D., 55 Navaratnam, N., 493 Neely, C. A., 137 Nellen, O., 751 Nelson, C. E., 720, 722, 726 Nelson, W. G., 451 Nemer, M., 482 Neubert, R., 831 Neufeld, G., 292 Neugebauer, K. M., 325 Neuman-Silberberg, F. S., 580
ndice de Autores
IA1 - 9
New, D. A. T., 189, 241 Newell, P., 28 Newgreen, D. F., 288 Newman, R. A., 820 Newman, S. A., 711, 722, 723 Newport, J. W., 168, 194, 196, 197, 202, 488 Newrock, K. M., 519, 520 Newton, S. C., 855 Niazi, I. A., 715 Nicholls, R. D., 445 Nichols, D. H., 260, 292 Nicholson, 529 Niehrs, C., 619, 620 Nieto, M. A., 287 Nieuhaus, A. W., 438 Nieuwkoop, P. D., 174, 606, 623, 627, 669, 844 Nievelstein, R. A. J., 255 Nigg, E. A., 197 Nijhout, H. F., 551, 755, 756, 808, 809, 812, 813, 815 Niki, K., 736 Nilsson, A., 355 Nishida, H., 510, 512, 513, 514, 515, 516 Nishikawa, A., 738 Nishikura, K., 419 Nishioka, D., 859 Nishizuka, Y., 112, 147 Niswander, L., 114, 711, 720, 721, 722, 725, 904, 905 Noakes, P. G., 331 Noda, Y. D., 131, 140, 141 Noden, D. M., 291, 295, 638 Nohno, T., 720, 664 Noji, S., 720 Noll, M., 559 Noramly, S., 724 Nordeen, E. J., 786, 823 Nordeen, K. W., 823 Norris, D. O., 743 Norriss, D. P., 449 Northcutt, R. G., 894 Northrop, J., 614 Nose, A., 93, 94 Notenboom, R. G. E., 112 Nthiger, R., 791, 794 Nottebohm, F., 785 Nowack, E., 830, 831 Nowinski, W, 800 Nulman, I., 829, 833 Nuez, G., 529 Nurse, P., 198 Niisslein-volhard, C., 189, 405, 547, 548, 552, 553, 555, 556, 557, 561, 577, 578, 581 Nyhart, L. K., 805, 806 Nylin, S., 814 Oakley, R. A., 324 Oberlander, S. A., 353 Oettinger, M. A., 411 OFarrell, P. H., 199, 200 Ofield, M. F., 383 Ogawa, K., 124 Ogura, T., 720, 721 Ohama, K., 154
Ohmori, T., 27 Ohshima, Y., 691 Okada, M., 532, 533, 534 OKane, C. J., 419 Okazaki, K., 218 Okuda, T., 379 OLeary, D. D. M., 331 Old, L. J., 89 Old, R. W., 865 Olds, J. L., 147 Oliphant, G., 132 Oliver, B., 855 Oliver, G., 703 Olsen, B., 710 Olson, E. N., 416 Olwin, B. B., 350 Oofusa, K., 737 Opitz J. M., 358, 702, 828, 833 Oppenheim, R. W., 332 Oppenheimer, J. M., 40, 220, 636 Opresko, L. K., 863 ORahilly, R., 835 Ordahl, C. P., 345 Orkin, R. W., 102 Orkin, S. H., 396, 440, 466 ORourke, N. A., 275 Orr, N. H., 45 Ortolani, G., 512 Osathanondh, V., 676, 677 Ospovat, D., 885 Ostareck-Lederer, A., 497 Oster, G. F., 898, 899 Ostrovsky, D., 344 Otte, A. P., 621, 628 Otting, G., 576 Ottolenghi, S., 440 Oudet, P., 433 Ovsenek, N., 489 Owen, R., 726., 883 Ozawa, E., 703 Pabo, C. O., 405 Packard, D. S., Jr., 344 Paglia, L. M., 868 Palatnik, C. M., 476 Palka, J., 874 Palmer, A. R., 819 Palmiter, R. D., 397, 442, 859 Palumbi, S. R., 902 Panganiban, G., 573, 908, 909 Pankratz, M. J., 563, 564 Panzer, S., 585 Papaconstantinou, J., 283 Papalopulu, N., 625 Parakkal, P. F., 298, 300 Pardanaud, L., 367, 368, 371, 379 Pardue, M. L., 63 Paris, J., 485, 867 Park, W.-J., 357 Paroush, Z., 444 Parr, B. A., 722 Parrington, J., 149 Parslow, T. G., 412 Passera, L., 817 Pasteels, J., 255, 265, 849 Patapoutian, A., 425 Pathak, D., 416 Paton, D., 283
Patten, B. M., 262, 359 Patterson, D., 737 Patterson, P. H., 292, 332 Paukstis, G. L., 817 Paul, D. B., 38 Paules, R. S., 876 Pavlakis, G. N., 497 Payne, J. E., 134, 144 Paynton, B. V., 490 Payvar, F., 422 Pazin, M. J., 436 Pazmany, L., 248 Peadon, A. M., 744 Pearson, J., 332 Pedersen, R. A., 182, 246 Pehrson, J. R., 744 Peifer, M., 574, 575, 577 Pelletier, J., 496 Pendrel, B. A., 816 Pener, M. P., 813 Penkala, J. E., 844 Penman, S., 451 Penny, G. D., 449 Penttinen, R. P., 686 Peracchia, C., 97 Perantoni, A. O., 678 Percival-Smith, A., 576 Perez, L., 134 Perona, R. M., 186 Perreault, S. D., 154 Perrimon, N., 114, 555, 558, 752 Perrine, S. P., 440 Perris, R., 288, 289, 293 Perry, M. D., 796 Perry, R. P., 413 Persaud, T. V. N., 266 Perucho, M., 69 Pesce, M., 846 Peschon, J. J., 859 Peter, M., 198 Peters, K., 687 Peterson, C. L., 436, 659 Petters, F. M., 187, 188 Pettersson, L., 820 Pevny, L., 440 Peyrieras, N., 184 Pfaff, D. W., 319, 786 Pfahl, M., 421 Pflger, E., 36, 202, 806 Pflugfelder, G. O., 752 Phelan, K. A., 325 Phillips, C., 223 Phillips, D. M., 124 Phillips, J., 723 Phoenix, C. H., 787 Piatigorsky, 1., 283, 894 Picard, D., 413 Piccolo, S., 308, 614 Pichel, J. G., 290, 677, 678 Pieau, C., 798, 799 Piepho, H., 756 Pierce, M., 106 Pierce, S. B., 609, 610 Pierschbacher, M. D., 104 Piette, J., 349 Pignoni, F., 558 Piko, L., 181, 488, 490 Pincus, G., 875
Pinder, A. W., 809 Pinkerton, J. H. M., 860 Pinkus, H., 300 Pino-Heiss, S., 749 Pinto-Correia, C., 122 Pitnick, S., 858 Pittman, R. N., 314 Placzek, M., 618, 659 Plowright, R. C., 816 Poccia, D., 153, 488, 859 Poccia, E. L., 153 Poirier, G. R., 132 Pokrywka, N. J., 869 Pollak, R. D., 724 Pomeranz, H. D., 284, 284 Pommerville, J., 19 Pongs, O., 758 Pontiggia, A., 779, 780 Poo, M.-M., 331 Poole, T. J., 289 Ppperl, H., 829 Porcher, C., 375 Porter, D. C., 153 Porter, J. A., 566 Portmann, A., 276 Post, M., 687 Postlethwait, I. H., 753. 870 Potten, C. S., 374 Potter, E., 676, 677 Potts, J. D., 363 Poulson, D. F., 692 Pourqui, O., 346 Powell, L. M., 493 Powers, J. H., 21 Pownall, M. E., 347, 349, 387, 625 Prahlad, K. V., 743 Prather, R. S., 46, 181 Pratt, G. E., 762 Pratt, H. P. M., 185 Pratt, R. M., 644., 829, 830 Pratt, S. A., 855 Prevost, J. L., 122 Price, J. V., 580 Price, M., 911 Priess, R. A., 524, 527, 528 Primakoff, P., 138, 140 Prioleau, M. N., 437 Pritchard-Jones, K., 676 Profet, M., 871 Proudfoot, N. J., 466 Prve, E., 785 Provine, W., 913 Psychoyos, D., 236 Pu, W.T., 417 Puelles, L., 268, 269 Puffenberger, E. G., 290 Pugh, B. F., 401 Purcell, S. M., 222 Purves, D., 325, 330, 331, 335, 826 Qian, S., 575 Queen, C., 413 Quiring, R., 282, 903 Raatikainen, M., 813 Rabbitts, T, H., 419
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ndice de Autores
Rachinsky, A., 816 Racowsky, C., 876 Raff, E. C., 858 Raff, J. W., 202 Raff, M. C., 333 Raff, R. A., 178, 478, 482, 519, 600, 744, 745, 746, 891, 899, 901 Raich, N., 441, 454 Raikhel, A. S., 870 Rakic, P., 273, 274, 276 Ralt, D., 131, 132 Ramaiah, K. V. A., 495 Ramanathan, R., 834 Ramarao, C. S., 129 Ramirez-Solis, R., 643 Ramn y Cajal, S., 277, 320 Ranu, R. S., 495 Raper, J. A., 318 Raper, K. B., 23 Rappaport, R., 203 Rappollee, D., 66, 478 Rashbass, P. R., 637 Raskolb, C., 577 Ratner, N., 102 Raunio, A. M., 32 Ravnik, S. E., 132 Rawles, M. E., 286 Ray, B. K., 496 Ray, R., 585 Raychaudhury, P., 495 Raynaud, A., 763 Razin, S. V., 452 Reach, M., 582 Ready, D. F., 688 Reather, C., 184, 246 Reaume, A. G., 98 Rebagliati, M. R., 479 Recanzone, G., 605 Reddi, A. H., 358 Reddy, V R., 787 Reichert, C. B., 895 Reijo, R., 855, 858 Reik, W., 445 Reilly, 734 Reilly, K. M., 658 Reinitz, J., 556, 565 Reinke, R., 690 Reiter, H. O., 826 Reitsma, N., 815 Render, J., 607 Renfree, M. B., 246 Ressom, R. E., 843 Restifo, L. L., 476 Reuss, C., 705 Revel, J.-P., 236, 673 Reverberi, G., 511, 514 Reyer, R. W., 41 Reynaud, G., 849 Reynolds, G. T., 146 Rhind, N. B., 796 Rhodes, S. J., 409 Ribatti, D., 368 Ribbert, D., 868 Richards, G., 759 Richardson, J., 672 Richter, J. D., 483, 485 Rickmann, M., 286
Riddiford, L. M., 756 Riddihough, G., 576, 635 Riddle, R. D., 659, 717, 718, 720, 722, 727 Ridge, K. A., 790 Riedl, R., 891 Rigaud, G., 433 Rigby, P. W. J., 401, 425 Riggs, A. F., 735 Rijli, F. M., 642, 906 Risau, W., 368, 370 Risch, N., 788 Ritvos, O., 69, 686, 687 Rivera-Prez, J. A., 637 Rivera-Pomar, R., 554, 557, 563 Rivier, C., 872 Robb, D. L., 537 Robb, L., 375 Robbie, E. P., 482 Robboy, S. J., 783 Roberts, D. J., 659, 665 Roberts, R., 377 Robertson, A., 22 Robins, D. M., 69 Robinson, E. J., 678 Robinson, H., 735 Robinson, S. L., 451 Robl, J. M., 46 Roder, L., 577 Rodgers, G. P., 440 Rodgers, W. H., 479 Rodriguez, C., 705 Roeder, R. G., 399, 400 Roegiers, F., 156 Roelink, H., 618 Rogers, J., 442 Rogulska, T., 849 Roller, R. J., 74, 75 Roll-Hansen, N., 596 Romanes, G. J., 254 Romanoff, A. L., 675, 849 Romeo, G., 290 Romer, A. S., 895 Rongo, C., 536, 869 Ros, M. A., 724 Rose, S. M., 715 Rosenberg, U. B., 73 Rosenquist, G. C., 234, 703 Rosenthal, E. T., 482 Ross, A. S. A., 678 Ross, F., 28 Ross, J., 872 Rossant, J., 186, 637, 644, 720 Rossignol, D. P., 135 Roth, S., 92, 94, 106, 328, 554, 578, 579, 869 Roth, V. L., 902 Rothenpieler, U. W., 680 Rothman, K. J., 829 Rothman, F. A., 395 Rounds, D. E., 860 Rountree, D. B., 755 Roush, W., 649 Rousseau, F., 110 Roussell, D. L., 532 Roux, W., 36, 157, 593, 594, 595, 596, 600, 806, 914 Rowe, D. A., 708
Rowe, T., 896 Rowning, B., 157, 159 Rubenstein, J. L. R., 268, 269 Ruberte, E., 829 Rubin, B. S., 786 Rubin, G. M., 70, 690, 692, 693 Rubin, L., 708 Ruby, E. G., 808 Rudnicki, M. A., 349, 350 Rugh, R., 184, 359 Ruibel, R., 820 Ruiz i Altaba, A., 625, 627 Ruohola, H., 867 Ruoslahti, E., 104 Rushlow, C. A., 578, 585 Ruskin, B., 465 Russell, L. B., 449 Ruth, S. B., 703 Rutishauser, U., 94 Rutter, W., Jr., 399, 683 Ryan, T. M., 438, 439 Ryner, L. C., 794 Ryoji, M., 452 Safer, B., 472 Safranek, L., 755 Sagata, N., 864 Saha, M., 279, 668, 669 Sahlberg, C., 682, 683 Saiki, R. K., 66 Sainio, K., 97, 677, 680 Sainsbury, J. R. C., 765 Saint-jeannet, J.-P., 627 Sakai, M., 607 Sakakura, T., 683 Saling, P. M., 132, 135, 136, 138 Salls, F. J., 480 Salz, H. K., 791 Samakoulis, C., 687 Samollow, P. B., 450 Samuelsson, L., 417 San Antonio, J. D., 102 Snchez, L., 791 Snchez, M. P., 677 Snchez-Herrero, E., 569, 572, 575 Sander, K., 40, 546, 547, 552, 593, 810 Sanderson, D., 102, 103 Sandler, K., 603 Sanes, J. R., 95, 330, 445 Sanger, F., 59 Sansom, A., 717 Santos, L. L., 212, 216 Santos, O. F. P., 677 Sapienza, C., 445 Sapp, J., 38, 808 Sardet, C., 146, 147, 149 Sargent, M., 67 Sargent, T. D., 64, 66 Sariola, H., 369, 676, 677, 678, 681 Sarkar, G., 496 Sarkar, S., 596 Sasai, Y., 308, 416, 614, 615, 616 Sater, A. K., 259, 668, 687 Sato, H., 106 Satokata, L., 682
Satou, Y., 514 Satterlie, R. A., 876 Satterwhite, L. L., 198 Sauer, F., 270, 401, 424 Saunders, J. W., Jr., 170, 664, 702, 705, 706, 708, 717, 724, 725 Saunders, K., 903 Savage, M. P., 492, 708 Savage, R. M., 537 Sawada, T., 156 Sawadogo, M., 399, 400 Sawyer, C. H., 786 Saxena, S., 715 Saxen, L., 603, 613, 614, 622, 623, 624, 674, 676, 679, 683, 832 Scadding, S. R., 715 Schaap, P., 26, 28 Schackmann, R. W., 130 Schfer, M., 858 Schaffner, W., 413, 444 Scharff, M. D., 89 Schatten, G., 139, 153, 156 Schatten, H., 139 Schatz, D. G., 411 Schauer, I. E., 490 Schedl, P., 454 Schejter, E. D., 193 Schell, U., 658 Schetzer, J. W., 545 Scheuermann, R. H., 453, 454 Schickler, M., 74 Schiebinger, L., 774 Schier, A. F., 565 Schindler, J., 28 Schlesinger, A. B., 241 Schlissel, M. S., 432, 437 Schlosshauer, B., 326 Schmalhausen, I. I., 814, 821 Schmekel, K., 851 Schmidhauser, C., 767 Schmidt, B., 220 Schmidt, J. E., 614, 616 Schmidt, M., 333 Schmitt-Ney, M., 767 Schnabel, R., 528, 529 Schneider, S., 609, 610 Schneiderman, H. A., 748, 753 Schneuwly, S., 570 Schoenwolf, G. C., 229, 232, 234, 242, 245, 255, 257, 258, 259, 260, 267, 362 Schler, H. R., 846 Schooneveld, H., 762 Schott, O., 666, 714 Schroeder, T. E., 127, 201, 218 Schubiger, G., 488, 489, 532, 749 Schuchardt, A., 677, 678 Schuetz, A. W., 146 Schugar, L., 687 Schulman, H. M., 494 Schultheiss, T. M., 362, 363 Schultz, R. M., 875, 876 Schulz, C., 563 Schulz, M. W., 672 Schumacher, A., 643 Schummer, M., 647
ndice de Autores
IA1 - 11
Schpbach, T., 556, 579, 580, 794 Schwalm, F., 545 Schwanzel-Fukada, M., 319 Schwartz, H. C., 494 Schwartz, J. H., 786 Schwartz, K. V., 887 Schwartz, P., 763, 764 Schweiger, H. G., 9 Schweizer, G., 291 Schwemmler, W., 810 Schwind, J. L., 738 Scott, J., 493 Scott, M., 637, 904 Sechrist, J., 294, 295 Segal, L. A., 22 SeGall, G. K., 130 Seidel, F., 186 Seleiro, E. A. P., 612, 636 Selenka, E., 805 Selleck, M. A., 284 Selwood, L., 186 Sen, R., 414 Sendtner, M., 333 Serafini, T., 320 Serbedzija, G. N., 291 Sergievsky, S. O., 902 Serra, R., 686 Servetnick, M., 656, 670 Sessions, S. K., 702, 703 Seto, E., 424 Seydoux, G., 526, 692 Shaffer, B. M., 22 Shah, N. M., 293 Shainberg, A., 348 Shalaby, F., 369 Shapiro, A. M., 814, 815, 822 Shapiro, B. M., 130, 143, 150 Shapiro, D. J., 477 Shapiro, I., 356 Sharma, P. M., 493 Sharman, G. B., 450 Sharp, D. H., 565 Sharpe, C. R., 625, 628 Shatkin, A. J., 394, 472, 486 Shatz, C. J., 312, 325 Shaulsky, G., 26 Shaw, A., 902 Shaw, G., 475 Shaw, G. M., 837 Shawlot, W., 268, 310 Shea, T. B., 869 Sheets, M. D., 485, 664 Sheiness, D., 394 Shelton, C. A., 581, 582 Shen, R. Q., 715 Shen, S. S., 147, 151 Shen, W., 903 Shen, W.-H., 780, 781, 784 Sherizly, I., 876 Shi, D.-L., 231 Shi, Y. B., 741 Shiang, R., 110 Shih, C., 109 Shih, J., 627 Shilling, F. M., 111, 148, 149 Shilo, B. Z., 687 Shimamura, K., 94 Shimomura, H., 129
Shin, H.-S., 637 Shiokawa, K., 478, 488 Showman, R. M., 487 Shu, D., 888 Shubin, N. H., 726 Shur, B. D., 106, 137, 315 Sidman, R. L., 273, 278, 314 Sieber, F., 292 Sieber-Blum, M., 292 Siebold, C., 805, 806 Siegert, F., 23, 27 Siegfried, E., 566 Sies, H., 25 Sigler, P. B., 416 Siiteri, P. K., 783 Silberstein, G. B., 686 Silver, J., 314, 315 Simandl, B. K., 738 Simeone, A., 645, 647 Simerly, C., 153 Simmons, D. J., 356 Simmons, D. M., 407, 408 Simon, D., 849 Simon, H. G., 714 Simon, J., 572 Simpson, L., 493 Simpson, P., 692 Simpson-Brose, M., 556 Simske, J. S., 691 Sinclair, A. H., 778 Singer, S., 28 Singer, M., 313, 714, 715 Sive, H. L., 625, 626, 628 Skakkebaek, N. E., 836 Skeath, J., 312, 585 Slack, J. M. W., 505, 559, 605, 606, 607, 608, 609, 635, 647, 901, 905 Slma, K., 761, 762 Slijper, E. J., 892 Sluder, G., 152 Smibert, C. A., 480, 550 Smith, C. A., 345 Smith, D. W, 833 Smith, E. P., 358 Smith, G., 766 Smith, H. O., 55 Smith, J., 509 Smith, J. C., 221, 222, 605, 608, 612 Smith, J. L., 257, 259, 260, 292 Smith, L. D., 43, 197, 482, 483, 537 Smith, S. J., 277, 278 Smith, W. C., 616, 617 Smith-Gill, S. J., 735 Smythe, C., 202 Snell, W. J., 136 Sokol, R. J., 833 Sokol, S., 609 Solnica-Krezel, L., 220 Solomon, M. J., 198, 199 Solter, D., 45, 46, 155, 488, 490 Solursh, M., 214, 215, 236, 240, 245, 704 Sommer, B., 493 Sonenberg, N., 496 Sopta, M., 399
Sordino, P., 726 Sorensen, R., 875 Sornson, M. W., 425 Sosnowski, B. A., 469 Soto, A., 836 Southern, E. M., 58 Souza, P., 686 Spallanzani, L., 122 Spana, E. P., 530 Speksnijder, J. E., 156 Spemann, H., 38, 39, 259, 350, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 611, 627, 629, 666, 667, 668 Spencer, D. D., 335 Sperry, R. W., 327 Spicer, D. B., 351 Spiegelman, S., 47, 48 Spieth, J., 288 Spirin, A. S., 482 Spitz, I. M., 874 Spofford, W. R., 621 Spradling, A. C., 70, 867, 868 Spratt, N. T., Jr., 235, 237, 238, 241 Spring, J., 104 Spritz, R. A., 290 St. Johnston, D., 548 Stainier, D. Y. R., 191, 192 Stalder, J., 435 Stamatoyannopoulos, J. A., 440 Standart, N., 477, 478, 482, 483 Stanojevic, D., 563, 564 Stargell, L. A., 399 Stark, K., 680 Starr, D. B., 399 Staudt, L. M., 413 Stearns, S. C., 814 Stein, D., 581 Steinberg, M. S., 85, 87, 92 Steingrimsson, E., 290 Steinhardt, R. A., 145, 146, 150, 151, 486 Stemple, D. L., 291 Stennard, F., 612 Stent, G. S., 826 Stephano, J. L., 142 Stephens, T. D., 704 Stephanson, E. C., 868, 869 Stephenson, P., 466 Stern, C. D., 236, 238, 239, 240, 288, 318, 649 Stern, H. M., 346, 660 Stern, M. J., 911 Sternberg, P. W., 690, 691 Stevens, L. M., 557 Stevens, N. M., 37, 774 Steward, F. C., 46, 47 Steward, R., 578, 582, 583 Stewart, T. A., 847, 848 Stice, S. J., 46 Stief, A., 452 Stier, H., 326 Stockard, C. R., 896 Stockdale, F. E., 416 Stocker, K. M., 292 Stocum, D., 87, 88, 703, 714, 715 Stger, R., 445
Stokoe, D., 109 Stolow, M. A., 741 Stone, B. L., 761 Stone, R., 836 Storey, B. T., 131, 135 Storey, K., 605, 623 Stott, D., 637, 846 Stout, R. P., 319 Strahle, U., 220 Strand, M. R., 196 Stratford, T., 703, 720 Strathmann, M. F., 809 Strathmann, R. R., 745, 809, 821 Strause, L. G., 754 Streissguth, A. P., 833 Streit, A., 240, 637 Streuli, C. H., 112 Strickberger, M. W., 13, 14, 789 Strickland, S., 186 Strome, S., 522, 523, 524, 525, 535, 859 Strominger, J. L., 688 Struhl, G., 405, 481, 554, 555, 556, 557, 562, 570, 572, 659, 727, 752 Struhl, K., 399, 417 Stryker, M. P., 826 Studer, M., 829, 830 Sturtevant, M. H., 177 Suarez, S. S., 132, 138 Subramanian, V., 643, 905 Subtelny, S., 844 Sugi, Y., 363 Sugiyama, K., 214 Sulik, K., 244, 245, 834 Sulston, J. E., 521, 522 Summerbell, D., 708, 709, 717, 718 Summers, R. G., 130, 139, 143, 170 Sumper, M., 20 Sun, Y-A., 868 Surani, M. A. H., 155 Suri, C., 369 Sussman, M., 28 Sutasurya, L. A., 844 Sutherland, A. E., 185 Swain, J. L., 445 Swalla, B. J., 514 Swann, K., 112, 147 Swanson, C. P., 861 Swenson, K. L., 199 Swiderski, R. E., 483 Swift, C. H., 848 Sze, L. C., 167, 168 Tabata, T., 751 Tabin, C., 649, 726 Tagaki, N., 446, 448 Taghert, P. H., 315 Taigen, T. L., 744 Takada, S., 660, 661 Takahashi. N., 742 Takasaki, H., 606 Takayama, K., 491 Takayama, S., 665 Takeichi, M., 92, 93, 94, 276, 288 Takeuchi, I., 27
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ndice de Autores
Talbot, D., 440 Talbot, P., 131 Talbot, W. S., 758 Tamkun, J. W., 104, 436, 468 Tan, S.-S., 104, 294, 295 Tanaka, M., 414, 705 Tannahill, D., 608, 635 Tarkowski, A. K., 185 Tassabehji, M., 290 Tassava, R. A., 715 Tata, J. R., 741, 742 Tauber, A. I., 596, 886 Tauber, M. J., 812 Taurog, A., 743 Tautz, D., 556, 563 Tavormina, P. L., 357 Taylor, M. A., 482 Tazi, J., 450 Teillet, M.-A., 258, 284, 286 Telfer, W H., 868 Telford, N. A., 490 Terasaki, M., 146, 147, 149 Terasawa, E., 786 Tessier-Lavigne, M., 320, 321, 322, 346, 629, 659 Thach, R. E., 472, 473 Thanos, D., 423 Thanos, S., 326 Thayer, M. J., 349 Thesleff, I., 102, 660, 682, 683 Theurkauf, W. E., 867, 868 Thiemann, O. H., 493 Thiery, J. P., 88, 230, 240, 289 Thigpen, A. E., 784 Thisse, B., 583 Thisse, C., 583 Thoenen, H., 332, 333 Thoma, F., 432 Thomas, H. E., 760 Thomas, J. D., 431 Thomas, K. R., 269 Thomas, L., 331 Thomas, N. S. B., 496 Thomas, W. A., 315 Thompson, J. V., 884 Thompson, W. J., 331 Thomsen, G. H., 611, 614, 619 Thomson, J. A., 774 Thomson, J. N., 524, 527 Thomson, K. S., 896 Thor, S., 647 Thorburn, A., 451 Thorogood, P., 284 Thorpe, W. H., 785 Thummel, C. S., 760, 761
Tian, M., 469, 471, 794 Tickle, C., 717, 719, 720, 763 Tiellet, M.-A., 677 Tilghman, S. M., 444 Till J. E., 374 Tilney, L. G., 124, 130 Timmins, W. N., 36 Tinbergen, N., 335 Ting-Berreth, S. A., 664 Tjian, R., 396, 401 Tkadlecek, L., 375 Tobin, C., 786 Tobler, H., 531 Todt, W. L., 721 Toivonen, S., 603, 614, 622, 623, 674 Tombes, R. M., 130 Tomchick, K. J., 23 Tomlinson, A., 688, 689 Toms, D. A., 830 Tonegawa, S., 410, 411, 412 Toole, B. P., 102, 106 Topper, Y. J., 762 Torres, M., 679 Torrey, T. W., 913 Tosney, K. W., 95, 309, 315, 323, 324, 325, 706 Townes, P. L., 80, 82, 83, 94 Trahey, M., 109 Tran, D., 784 Trefil, J. S., 276 Treisman, J., 405, 563 Treisman, R., 475 Trelstad, R. L., 784 Tremblay, P., 290 Trentin, J. J., 377 Trinkaus, J. P., 83, 191, 209, 219, 220, 221 Trudel, M., 392, 440 Truman, J. W., 754, 758 Trupp, M., 677 Tsuda, T., 366, 648 Tsukiyama, T., 436 Tsushida, T., 309 Tuan, D., 439 Tuan, R. S., 345, 353, 355, 356, 361 Tuana, N., 774 Tuchmann-Duplessis, H., 180 Tung, T. C., 513, 636 Turkington, R. W., 766 Turley, E. A., 106 Turner, A. M., 824 Turner, B. M., 436, 450 Turner, C. D., 734
Turner, D. L., 276, 281, 308, 311 Turner, F. R., 543, 544 Turner, P. R., 147 Turner, R. S., Jr., 30 Twitty, V. C., 313, 613 Tyler, A., 99 Tyler, M. S., 351, 545 Tyson, J. J., 22, 23 Ubbels, G. A., 158 Uehlinger, V., 43 Umek, R. M., 417 Umesono, K., 422 Urist, M. R., 352 Urness, L.D., 761 Ursprung, H., 50 Usheva, A., 400 Uzzell, T. M., 149 Vaahtokari, A., 659, 660, 682 Vachon, G., 573 Vacquier, V. D., 129, 130, 132, 133, 134, 135, 140, 143, 144, 153, 216 Vaidya, T. B., 350 Vainio, S., 102, 674, 679, 680, 682, 782 Vakaet, L., 234, 235 Valcrcel, J., 469, 793 Van Allen, M. I., 262, 263 Van Buskirk, J., 819 Van den Biggelar, J. A. M., 178, 518 van der Hoeven, F., 905 van der Ploeg, L. H. T., 442 van der Weele, C., 806, 814 Van Doren, 791 van Driel, R., 26 van Dyke, M. A., 577 van Eekelen, C. A. G., 452 van Essen, D., 688 van Heyningen, V., 676 van Leeuwenhoek, A., 121, 122 van Scott, E. J., 299 Van Straaten, H. W. M., 259 Van Valen, L. M., 893 van Venrooij, W. J., 452 van Wijngaarden, R., 740 Vani, K., 566 Vardy, P. H., 831, 832 Varley, J. E., 293 Varnum, S. M., 485 Vassalli, J. D., 484 Vassar, R., 299 Vastardis, H., 682
Vaux, D. L., 529 Vegeto, E., 874 Venkatesh, T., 90, 91, 688, 689 Venuti, J. M., 350 Verdonk, N. H., 518 Verrijzer, C. P., 400 Vesalius, A., 773, 774 Via, S., 814 Vierra, J., 56 Vikkula, M., 369 Villeponteau, B., 453 Vincent, J. P., 156, 157, 158, 225, 607 Vinson, C. R., 417 Vintenberger, P., 157 Visconti, P. E., 132 Vits, L., 96 Viviano, C. M., 715 Vodicka, M. A., 613, 620 Vogel, A., 711, 722 Vogel, K. S., 293 Vogt, W., 221 Volpe, E. P., 827 von Baer, K. E., 253, 254, 883, 884, 889, 900, 901 Von Kalm, L., 748, 749 von Kolliker, A., 122 von Krafft-Ebing, R., 319 von Mstermann, A. M., 247 von bisch, L., 215 von Wettstein, D., 851 von Woellwarth, V., 671 Vortkamp, A., 724 Vuorio, E., 100 Waddington, C. H., 40, 48, 238, 531, 605, 656, 821, 899, 914 Wadworth, W. G., 320 Wagenaar, E. B., 477 Wagner, G. P., 891 Wagner, T., 70, 780 Wagner-Bernholz, J. T., 572, 573 Wakahara, M., 607 Wake, D. B., 898 Wakimoto, B. T., 569 Wald, G., 735 Waldo, K. L., 285, 294 Walker, J., 482 Walker, M. D., 403 Wall, R., 442 Walsh, C., 10, 11, 274, 275 Walter, J., 328, 329
ndice de Assuntos
Termos definidos no texto esto indexados em negrito abdA. veja gene abdominal A abdB. veja gene abdominal B Abelhas, polifenismo nutricional, 816 abx. veja gene anterobithorax ac. veja gene achaete Acanthostega, 726 Accutane, 829 ACE. veja Adenilao, elemento controle Acetabularia, morfognese, 6-10 Acetilao na desagregao de nucleossomos, 436-437 na inativao do cromossomo X, 450 Acetilao de histonas, 436-437,450 Acetilcolina, 147,148,279,291 cido -aminobutrico, 279 cido flico, 263 cido hialurnico, 240,245,672,876 cido retinico (RA) como um teratgenio, 829-830 elementos responsivos ao DNA, 829 genes homeobox e, 628 na anlise do cdigo Hox, 641,643-645 na caudalizao neural, 625-626 na especificao do campo dos membros, 703-704 na especificao do eixo, 645 na polarizao dos membros, 720-721 na regenerao dos membros, 715 Acinos, 684 Acne cstica, 829 Acondroplasia, 109-110,357 Acron, 558 Acrossomo, 122-123,129-130,132,857 ACTH. veja Hormnio adrenocorticotrfico Actina, 15. veja tambm Microfilamentos em fuso de gametas, 139-140 em microespiges, 277 em microfilamentos do ovo, 126-127 em oognese merostica, 868 em processo acrossmico, 130 -actinina, 104 Actinomicina D, 740 Activina, 617,619 em assimetria esquerda-direita, 648-649 em ramificao do epitlio, 686 Adenil ciclase, 621 Adenosina 3,5 monofosfato cclico (cAMP), 22-23 na capacitao de espermatozide, 132 na descondensao da cromatina em espermatozide, 153 na diferenciao de Dictyostelium, 26-28 na neuralizao, 621 no reincio da meiose em ocitos, 875-876 Adeso. veja Adeso celular Adolescncia, desenvolvimento mamrio, 765 Aedes, 808 Aequorina, 144 AER. veja Crista ectodrmica apical Afdeos, partenognese, 810-811 Afinidade. veja Afinidade celular Afinidade celular diferencial, 80,82-88,99 matriz extracelular e, 99 micrmeros de ourio-do-mar, 212-214 modelo termodinmico, 84-88 neurnios e, 327-328 Afinidade celular diferencial, 80 experimentos de reagregao, 80,82-84 modelo termodinmico, 84-88 Agregao em Dictyostelium, 22-23 histiotpica, 84 Agregao histotpica, 84 Agrupamentos angiogenticos, 368 AIDS, 688,788 Alantide, 31,361,845 Albumina, 189,683 lcool desidrogenase-2, 837 lcool, como um teratognio, 828,833-835 Alelo Steel-Dickie (Sld), 846 Algas, em simbiose desenvolvimental, 808-809 Alometria, 891-893 Alternncia de geraes, 888 Aluno, 284 Alvolos, 383 Ambystoma, 703, 743 Amebas sociais, 21 Ameboflagelados, diferenciao, 10-11 Amelia, 830 Ameloblastos, 682 Amendoim, aglutininas, 289 AMH. veja hormnio anti-ducto Mlleriano Amgdalas, 380,786 Amiloride, 151-152 -aminolevulinato sintase (DALA sintase), 494 mnio, 31,186,243-244, 361 Amnia em diferenciao de Dictyostelium, 28 excreo de girinos, 735 Amphioxus, 169,888,911-912 Ampola, 132,180 Analogia, 727 Anatomia comparada evidncia para o cdigo Hox, 641,645-646 no desenvolvimento, 646-647 Andrgenos, sndrome de insensibilidade a, 763,783 Anel contrtil, 201 Anel de Balbiani 2 (BR2), 52-54 Anel germinativo, 220-221 Anencefalia, 262 Anfbio. veja tambm Metamorfose de anfbios; tipos especficos ativao do genoma embrionrio, 489 clulas garrafa em, 226-229 clivagem, 173-174 desenvolvimento autnomo, 603 desenvolvimento condicionado, 602-603 determinao progressiva em, 600-603 especificao de polaridade, 607-609 experimentos de clonagem, 42-45 experimentos de reagregao, 80,82-83 induo embrionria primria em, 603-605 induo especfica de regio, 621-623 migrao da clula germinativa, 843-844 modelagem mesodrmica em, 606-607 mrulas,173-174 neurulao, 255 oognese, 861-864 rearranjo no ovo, 156-157 Anfiregulina, 687 Angioblastos, 367-369 Angiognese, 369-370 Angiopoietina-1, 369 Animais, definio do gene Hox, 647 Aniridia, 827 Anormalidades congnitas cigarros e, 833,837 defeitos cardacos, 297 malformaes, 827 rupturas, 828 teratgenos e, 828-835 Anosmia, 319 Anticonvulsivos, em anormalidades congnitas, 833 Anticorpos, 822 especificidade axnica e, 316-317 linfcitos B e, 409 monoclonais, 89-91 regio constante, 409 regio varivel, 409 Anticorpos monoclonais, 89-91 especificidade axnica e, 316-317 Antidepressivos tricclicos, em anormalidades congnitas, 833
IA2 - 1
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ndice de Assuntos
Antidepressivos, em anormalidades congnitas, 833 Antgeno, 822 diferenciao, 89-90 histocompatibilidade principal, 248 Antgenos de diferenciao, 89-90 1-antitripsina, 398 Antp. veja gene Antennapedia Antro, 872 Anuros. veja Sapo nus, formao nos deuterostomatas, 218 Aorta, 363,369,370-371 Aparelho dendrtico, 272 Apndices cutneos, 299-300 induo especfica de regio, 663-664 Apo-B. veja Apolipoproteina B Apolipoproteina-B (Apo-B), 493 Apoptose. veja tambm Morte celular inibio, 677-679 na corda mamria, 763-765 Aprendizado, respostas neuroniais, 823-826 Araschnia, 814 Arbacia, 129-130 Arco digital, 726 Arcos articos, 366-367,370-371 Arcos Farngeos, 380 rea (zona) pelcida, 189,233 rea opaca, 189,233 em gastrulao de ave, 241 Arista, 753 Armadilha intensificadora, 418-419 Aromatase, 799 Aromatase P450, 787 Arquntero, 216 anfbio, 222,226-229 na prognese, 745 ourio-do-mar, 215-218 Arquecito, 29-30 Arquistriato, 823 Artria pulmonar, 370-371 Artria subclvia, 369,370 Artria umbilical, 370 Artrias vitelnicas, 370 Arthroleptella, 169 Artrpodos. veja tambm Drosophila evoluo, 907-909 Asa determinao do disco imaginal, 750-753 evoluo em insetos, 907-908 Ascdios, clivagem, 179 Asplachna, 819 Assimetria, no desenvolvimento do corao, 366,648-649 Assimilao gnica, 821-822 steres, 153,154 rearranjo do ovo e, 159 sulco de clivagem e, 202 Astrotactina, 273 Ativador plasminognio, 186,873 trio, desenvolvimento, 363-365 Autofosforilao, 108 Autoradiografia, 56,64 Autoregulao, na transcrio, 409 Aves. veja tambm pinto; pato centro de Nieuwkoop em, 636 clivagem, 189 colapsina, 322 comportamento especfico do sexo, 785
eixo dorso-ventral, 647-650 eixo esquerdo-direito, 647-650 fechamento do tubo neural, 260-262 mapa de destino, 234 migrao de clulas germinativas, 848-849 neurulao, 255 ovo, 189 Aves canoras comportamento especfico do sexo, 785 respostas neuroniais ao aprendizado, 823 Avestruz, assimilao gentica e, 821 Axonema, 123-124 Axnio, 276. veja tambm Neurnio; axnio Retiniano crescimento, 227-228 desenvolvimento dependente de atividade, 331 direcionamento, 313-314,320-322,323-326 especificidade adesiva, 328-331 especificidade, 312-313 fascculos, 316 haptotaxia e, 314-315 hiptese das trajetrias marcadas, 315-317 hiptese de quimioafinidade, 327-328 impulsos eltricos, 278 migrao, 307 N-CAM, 95-96 neurnios motores e, 323-325 neurotransmissores, 278-279 repulso especfica de cones de crescimento, 317-318 seleo de alvos, 326-328 teorias da formao, 276-277 Axnio retiniano, 824,845 especificidade, 325-326 formao de sinapse, 331 migrao, 314,315 seleo de alvos, 326-328 Azul do Nilo, 157,158,221 A23187, 145-146,150,348 Bao, unidades formadoras de colnias, 374-375 Bactrias como teratgenios, 835 em simbiose do desenvolvimento, 808 sexo em, 12 Bainha de mielina, 278 BamHI, 55,56,57 Banda germinativa, 545 Bauchstck (poro ventral), 601,607 Bauplan. veja Plano corporal BDNF. veja Fator neurotrfico derivado do crebro BFU-E. veja unidade formadora de rompimento de eritride bHLH. veja Hlice-ala-hlice bsica Bibliotecas, 61 Bicyclus, 815,822 Bifenis policlorinados (PCBs), 836 Bilateria, 30 Bindina, 132-135,149 atividade fusognica, 140 coevoluo e, 901-902 na espermatognese, 859 Biologia celular no desenvolvimento, 647 Biologia do desenvolvimento, 3 abordagens histricas, 883-885 definio, 1-2 problemas em, 2-3 Bivalente, 851
Blastema de regenerao, 87,714-716 Blastema, regenerao de, 87-88,714-716 Blastocele, 170 formao, 172-173 lmina extracelular em, 212-215 sapo, 174 Blastocisto, 182 tero e, 186 zona pelcida e, 185-186 Blastoderma celular, 193 de aves, 238 sincicial, 192-194 Blastoderma celular, 193 Blastoderma sincicial, 192-194 Blastodisco, 189,233-234 Blastmero, 3,170 anfbio, 226 comunicao clula-para-clula e, 178 molculas de adeso celular e, 174 polarizao de membrana, 184 Blastporo, 216 anfbio, 222-226 lbio dorsal, 222-224,264-265 lbio ventral, 224 neurulao secundria, 264-265 Blstula, 3,170 desenvolvimento evolutivo, 886 eclodida, 173 formao, 174 ourio-do-mar, 172-173,210 Blstula eclodida, 173 BMP. veja Protena morfogentica 2 do osso (BMP2) Boca, formao em deuterostomatas, 218 Bolitoglossa, 743-744 Bolsa bucal, evoluo e, 892-893 Bolsa dgua (bolsa amnitica), 186 Bolsa de chocar, 179 Bolsa de Rathke, 380 Bolsas Farngeas, 284,295,380 Bombyx, 813 Bonellia, determinao do sexo dependente da localizao, 799-800 Borboleta assimilao gentica e, 822 na evoluo, 907,909 polifenismo, 814-815 BR2. veja Anel de Balbiani 2 BR-C. veja gene Broad-complex BR-C. veja Protena Broad-complex Bromodeoxiuridina, 679 Brnquios, 383 Broto caudal, 241,265 Broto dos membros, 704. veja tambm Membro tetrpode formao do osso e, 353-354 formao, 702-706 mesnquima, 708,711,713 migrao de neurnio motor, 325 Broto uretrico, 674 crescimento continuado, 681 formao, 677 inibio da apoptose e, 678 na induo recproca, 675-676 Brotos mamrios, 762-763 btd. veja gene buttonhead bx. veja gene bithorax
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bxd. veja gene bithoraxoid C/EBP. veja Protena ligante do intensificador CCAAT cActRIIa. veja Receptor activin IIa Caderina, 92-95. veja tambm E-caderina; EP-caderina; N-caderina em compactao, 184 retiniana, 325-326 transduo de sinal e, 113 Caderina epitelial. veja E-caderina Caderina neural. veja N-caderina Caderina placentria. veja P-caderina Caenorhabditis, veja tambm Nematdeo determinao da clula germinativa em, 853-855 hermafroditismo, 795-797 induo vulvar, 690-691 Caf, em anormalidades congnitas, 833 Cafena, como teratgeno, 828 Calcificao, matriz ssea, 352 Clcio como fator citosttico, 200-201 ionforos, 145-146,150,348 na adeso celular, 92 na ativao do ovo, 147-151 na degradao de ciclina, 159 na diviso celular, 158-159 na fuso mioblstica, 348 na osteognese, 355-356 na reao acrossmica, 129,130,138 na reao do grnulo cortical, 144-146 ondas, 144-145 retculo endoplasmtico e, 146 via do inositol fosfato, 111-112 Clice ptico, 280 modelo, 667-668 Calmodulina, 864 Calo, 47 Calpana II, 864 CAM. veja Molculas de adeso celular Camada basal, 297 Camada cornificada, 297-298 Camada de Malpighi, 297-299 Camada envolvente (EVL), 190-191,219-220 Camada espinhosa, 297 Camada germinativa externa, 272 Camada germinativa, 3,220-221 Camada granular, 297-298 Camada granular interna, 272 Camada hialina, 143 na formao da blastocele, 172-173 na invaginao do arquntero, 216 ourio-do-mar, 212-213 Camada sincicial do vitelo (YSL), 190 na transio da blstula intermediria, 219-220 cAMP. veja Adenosina 3,5 monofosfato cclico na capacitao do espermatozide, 132 na diferenciao de Dictyostelium, 28 Campo formador dos membros, 702-704 Campo morfogentico, 702 Camundongo. veja tambm Camundongos transgnicos anlise do cdigo Hox, 640-645 anomalias induzidas pelo cido retinico, 829-830 anormalidades congnitas relacionadas ao lcool, 834-835 assimetria esquerda-direita, 648,649
ativao do genoma embrionrio, 490 clulas germinativas primordiais, 844-845 deficincia de Wnt7a, 722 derivados de clulas tumorais, 847-848 desenvolvimento da epiderme, 299 desenvolvimento da glndula mamria, 762-768 desenvolvimento das clulas sangneas, 374-375 desenvolvimento osteoclstico, 378 determinao do ovrio, 781-782 embries, 182 espermatognese, 858 experimentos de reagregao, 84 fertilina, 140 formao de membros, 709-711 formao do broto uretrico, 677 fuso mioblstica, 347 gene Hoxa-3, 70-73 gene Sry em, 779-780 gene ZP3, 74-75 genes MyoD, 349-350 impresso gnica em, 444-445 inativao do cromossomo X, 447-448 ligao de espermatozide, 135-139 mapa de destino, 244 mesoderma, 245 mutaes das clulas da crista neural, 290 mutaes de desmielinizao, 278 mutaes dwarf, 407 mutaes Fgf, 658 mutaes neurolgicas, 273 mutaes no colgeno, 357 mutantes pticos, 280 no-equivalncia do proncleo, 154-155 notocorda, 244 protenas TGF- em, 662 quimeras, 70-73,187-188,347,666-667 receptor do fator de crescimento do endotlio vascular, 369 reiniciao da meiose ooctica, 876 stios hematopoiticos, 379-380 transplante nuclear, 45-46 Camundongo branco, 846 Danforth short-tail, 676, 677 eyeless, 280 GDNF, 290 dwarf, 407 Jimpy, 278 Lethal-spotting, 290 Microphtalmia, 290 Piebald-lethal, 290 reeler, 273 Ret, 290 Silky, 290 Splotch, 290 staggerer, 273 Steel, 290,846 trembler, 278 waltzer, 273 Weaver, 273 White-spotting, 290 Camundongo quimrico, 70-73,187-188, 347,666-667 Camundongos transgnicos, 70 derivados de clulas tumorais, 847-848 desenvolvimento da epiderme em, 299 expresso da -globina em, 439
gene Sry em, 779-780 impresso gnica em, 439 Canais anelares, 867 Canal de sdio, em ocitos, 142 Canal ependimrio, 265 Canal neurentrico, 265 Capacitao, 125,131-132 Capilares. veja Vasos sangneos Caramujo, espiralamento em, 176-178 Carbamoilfosfato sintase, 741 Carcinoma clula basal, 660-661 teratocarcinoma, 847-848 Carcinomas de clulas basais, 660-661 Crdia bfida, 363 Cariocinese, 201 Cartilagem de Meckel, 895 formao, 352-354 no desenvolvimento dos membros, 722-723 ossificao, 354-356 pterigoquadrada, 906 Casaquisto, poluio teratognica no, 835 Casena, 476 sntese durante a lactao, 766-767 CAT. veja Cloranfenicol acetiltransferase Cateninas, 92 na formao do eixo dorsal, 609-610 Cauda, degenerao na metamorfose, 735-738 Cauda poli(A), 392 encurtamento diferencial, 475-476 mRNA de ocitos e, 480-481,483-486 no processamento do mRNA, 466 Caudalizao neural, 624-626 Cavalo, evoluo em, 892 Cavidade pericrdica, 362 Cavidade subgerminal, 189 Cavitao, 182,255 C-caderina, 94 cdc2 quinase, 198,482,485 cdc25 fosfatase, 199 cdk. veja Quinase dependente de ciclina cDNA, 54-55,61-63,64 Celoma, 358-359,744 Clula basal, sndrome de nevus, 661 C3H10T1/2, 349 com forma de cunha, 259-260 do vitelo, 190 Z1.ppp, 692 Z4.aaa, 692 Clula garrafa, 222-224 anfbios, 226-229 Clulas. veja tambm tipos especficos diferenciadas, 40-41 evoluo de, 886,911-912 sensibilidade DNase I, 433-434 Clulas adaxiais, 221 adepiteliais, 749 adrenomedulares, 286 ncoras, 690-691 bastonetes, 280 ciliadas, na evoluo, 886 conais, 280 da extremidade distal, 853 da glia de Mller, 281
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da zona marginal involutiva profunda, 229 da zona marginal no involutiva (NIMZ), 229 de Leydig, 777,783 de Schwann, 278,286,331,659 diferenciadas, transformaes em, 40-41 do cumulus, 126 endcrinas, expresso gnica em, 403 ependimrias, 276 epiteliais, 80,92 excrinas, expresso gnica em, 403 germinativas, 5,193,743 granulares, 272 granulosas, 777,872,875 neurosecretoras, 754 nutrizes, 867,868 plasmticas, 822 polares, 193 precursoras vulvares (VPC), 690-691 pr-esporo, 21,27 pr-pednculo, 21,27 profundas, 191,220 PstA, 27 PstB, 27 tecais, 777 -esporo, 21 -tronco embrionrias (ES cells), 188 -tronco hematopoiticas pluripotenciais, 347-377,378 Clulas B. veja linfcito B Clulas da crista neural, 257 compromisso posicional, 638 expresso de N-caderina, 94 gene Hoxa-3 e, 641 migrao, 285-290,293-295 potncia, 291-292,295-296 Clulas de Sertoli, 659,777 hormnio anti-duto Mlleriano e, 784 na espermatognese, 855 Clulas ES. veja Clulas-tronco embrionrias Clulas estromais Microambientes de indutivos hematopoiticos, 377 no desenvolvimento do rim, 681 Clulas germinativas primordiais (PGC), 843 de anfbios, 843-844 diapedese e, 848 em aves e rpteis, 848-849 em Drosophila, 849-850 em mamferos, 844-846 fator da clula-tronco e, 846 meiose, 850-852 na espermatognese, 855 teratocarcinoma e, 847-848 Clulas gliais formao, 270-272 interao com neurnios, 273 Mller, 281 precursores, 276 Clulas mesenquimatosas, 80 na formao do osso, 351-352 Clulas nervosas. veja Neurnios Clulas sangneas. veja tambm tipos especficos Clulas somticas, 5 pluripotncia em, 43-45 Clulas vegetativas de anfbios, 226 invaginao, 217 Clulas ventrais, translocao da protena
Dorsal, 577 Clulas vermelhas do sangue controle da traduo em, 486-497 gene globina e, 438-439,440 linhagem, 375-377 Clulas-tronco, 373-374. veja tambm Clulas-tronco hematopoiticas pluripotenciais embrionrias, 188 epidrmicas, 298,300 restrita linhagem, 375 teratocarcinoma e, 847-848 Centrolo, espermatozide, 153 Centro de inativao do cromossomo X (XIC), 449 Centro de Nieuwkoop, 226,606-609 fatores de transcrio do organizador e, 619-620 iniciao em vertebrados, 635-636 na formao do organizador, 613 protena Vg1 e, 610-612 Centro organizador anterior, 552-556 Centrossomo, proncleo masculino, 154 Cerebelo, 266-267 organizao, 272-273 Crebro expanso de volume, 267 formao de regies, 265-269 organizao cerebelar, 272-273 organizao cerebral, 274-276 organizao tissular, 270-272 sensibilidade aos teratgenos, 828 sndrome alcolica fetal e, 834 Crebro, organizao, 274-276 Crvix, 784,870 5-cetoesteride redutase, 2,783-784 CFU-GM, 378 CFU-M,L. veja Unidade formadora de colnias das clulas mielides e linfides CFU-S. veja Unidade formadora de colnias do bao Chaetopterus, 210 Chironomus, 50-54 Chlamydomonas, 16 reproduo sexual, 13-15,17 Ciclina E, 200 Ciclinas, 159,199,200 na regulao do ciclo celular, 198-201 mRNA de ocito armazenado, 477-478 regulao traducional de, 485 Ciclo celular. veja tambm Diviso celular bifsica, 196-197 inibio em mioblastos, 350 na clivagem, 196-197 regulao, 198-201 Ciclo cervical, 871 Ciclo da uria, 735 Ciclo de clivagem, regulao, 196-201 Ciclo menstrual, 870-873 Ciclo ovariano, 871 Ciclo uterino, 871 Cicloheximida, 195 Cigarros, em anormalidades congnitas, 833,837 Clios, 173,886 Cinesina, 156,868 Cintura plvica, migrao de neurnios motores, 324-325 cis-reguladores, 395-396
atividade dependente de contexto, 424 complexo bithorax e, 574-575 genes das imunoglobulinas e, 412-413 Cistcitos, 867 Citidina desaminase, 493 Citocalasina B, 201,260,277 Citoesqueleto integrinas e, 104 mRNA seqestrado e, 487 na determinao do eixo, 553-554,869 na mitose, 201-203 na oognese merostica, 867-868 na vitelognese, 863 Citoplasma ciclo de clulas bifsicas e, 196-197 contedo de ovos, 125-126 migrao celular e, 209-210 na regulao de polaridade, 546-547 nas teorias da herana, 36-37 rearranjo no ovo, 156-159, 224-226,607 translocao da protena dorsal e, 580-581 Citoquinese, 201 Citosina, metilao, 442 Citotactina, 103-104 Citotrofoblasto, 245,248 Clmax metamrfico, 741 Clivagem, 3,167 discoidal, 169,188-192 equatorial, 169-170 espiral holoblstica, 175-178 espiral, 30 holoblstica bilateral, 179-180, holoblstica radial, 169-174 holoblstica rotacional, 180-188 holoblstica, 169 iniciao, 159 mamfero, 180-188 mecanismos, 196-204 meridional, 16 meroblstica, 169,188-195 modificaes adaptativas, 178-179 mRNA de ocitos armazenados e, 477 radial, 30 rearranjo do citoplasma, 158-159 relao de volume citoplasma-ncleo, 167-168 superficial, 169,189,192-195 transcrio e, 167-168 transio da blstula intermediria, 194-195 Clivagem discoidal, 169,188-192 Clivagem embrionria. veja Clivagem Clivagem equatorial, 169,170 Clivagem espiral, 30 Clivagem holoblstica, 169 bilateral, 179-180 espiral, 175-178 radial, 169-174 rotacional, 180-188 Clivagem meridional, 169 Clivagem meroblstica, 169,188-195 Clivagem radial, 30 Clivagem rotacional, 181 Clivagem superficial, 169,189,192-195 Clonagem DNA, 55-57,66,68-69 espermina e, 45 mamfero, 45-46 plantas, 46-47 pluripotncia em, 43-45
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restrio da potncia nuclear, 42-43 subtrao, 66 tcnicas, 42-45 vetores, 56 Clonagem de genes, 55 Clonagem de subtrao, 66 Cloranfenicol acetiltransferase (CAT), 403,555 Cnemidophorus, 861 CNTF. veja Fator neurotrfico ciliar Cobaia, induo especfica de regio, 623 Cclea, 836 Cdigo de terminao da traduo, 392 Coevoluo, 901-902 Colagenase, 106,186,737 no ciclo menstrual, 873 Colgeno, 99,100,345,682 anormalidades do esqueleto e, 357 mesnquima metanefrognico e, 679 na formao da crnea, 672 ramificao do tubo epitelial e, 684-686 Colapsina, 322 Colcho endocrdico, 363 Colchicina, 260,278 Colesterol, espermatozide, 132 Colias, 815 Coluna de imunoafinidade, 90 Coluna de Terni (CT), 309-310 Coluna motora lateral (LCM), 309,310 Coluna motora medial (MMC), 309,310 Compactao, 181-183 acaso e, 693 mecanismo, 184-185 Compartimentos, 751 Compensao de dosagem, 446 Competncia, 628-629,656-657 em zona de atividade polarizante,721 na induo do cristalino, 668,669 Complexo antennapedia, 569 Complexo bithorax, 569 reguladores cis, 574-575 represso de Antennapedia, 572 Complexo de genes achaete-scute, 585 Complexo de iniciao, 472 Complexo Hometico (Hom-C), 569 co-fatores, 577 homologia a genes Hox, 637-638 na evoluo de insetos, 907-909 regulao em Drosophila, 643 Complexo sinaptonemal, 851 Complexo SW1/SNF, 436 Complexos de ribonucleoprotena (RNP), 482 Comportamento especfico do sexo, 785-786 metamorfose de anfbios e, 740 Comportamento especfico do sexo, 785-786 hiptese da organizao/ativao, 787 homossexualidade masculina, 787-788 voluntrio, 787 Compresso, em discos imaginais, 750 Comprimento do dia crtico, 812 Comprimidos para controle da natalidade, 864 Conceito de limiar, 739 Condensao, em genoma do espermatozide, 859 Condrcitos hipertrficos, 354,356 Condrcitos, 345,353-356 Condrognese, 352,722-724 em anormalidades esquelticas, 357-358
talidomida e, 832 Condutividade, membrana, 203 Cone de crescimento, 277 hiptese da especificidade adesiva diferencial, 314-315 repulso especfica, 317-318 Cone de fertilizao, 139-140 Conexina, 98,680 Conjugao, 12 Contato, celular, 80 Contato placentrio, 246 Contracepo, 138,139,864 Contracepo imunolgica, 139 Contralateral, 825 Controle da herana, 35-37 Controle da traduo, 10 em eucariotos, 472-474 em hemcias, 496-497 em larvas e adultos, 490-493 em ocitos, 476-487 longevidade diferencial do mRNA e, 474-476 na produo de hemoglobina, 494-497 no desenvolvimento, 471-472 trocas, 492 Controle ps-traduo, 11 Controle transcricional, 11 Co-opo, no desenvolvimento, 894-896 Copidosomopsis, poliembrionismo, 195-196 Corao. veja tambm desenvolvimento do corao contrao, 363 embrionrio, 370,371 fator inibidor da leucemia e, 292 genes reguladores homlogos e, 904 sensibilidade aos teratgenos, 828 Corantes fluorescentes, 144 Corda mamria, 762-765 Cordo medular, 264 Cordo umbilical, formao, 246 Cordas sexuais, 775-776 corticais, 777 medulares, 777 Cordes sinciciais, 212 Cordomesoderma, 221,222,341 de aves, 236,237 na neurulao primria, 255 Crio, 31,182,246,361 em gmeos, 186 produo de hormnio, 247-248 Crnea diferenciao, 283-284 formao, 672 Corpo de Barr, 446 Corpo frutfero, 21 Corpo polar, 861 Corpora allata, 754,755 Corpus luteum, 874 Crtex neoplio, 274,276 Crtex visual, 824-825 Crtex, ovo, 126 Corticotrficos, 407 Coxa, 748 CPE. veja Elemento de poliadenilao citoplasmtica Crnio evoluo no, 892 formao, 351-352 Craniosinostomose, 658
Crassius, 820 Crepidula, determinao do sexo, 800 Crescente amarelo, 156 Crescente cinzento, 156,225-226,602 Crescente germinativo, 235-236,848 Criao, progresso correlacionada e, 896 Crista ectodrmica apical (AER), 704-705 interaes com ZPA, 718-721 mesnquima do broto dos membros e, 708,711,713 no crescimento prximo-distal, 706-708 Crista mamria, 762 Crista neural, 260 cardaca, 285,296-297 ceflica, 284,293-296,641,830 derivados, 284-285 mesenceflica, 291 mutaes no desenvolvimento, 290 na neurulao primria, 256 sacral, 284 sagal, 284 torcica, 291 tronco, 284,285-293 vagal, 291 Crista neural ceflica, 284 potencial de desenvolvimento, 295-296 teratognese de cido retinico e, 830 vias de migrao, 293-295 Crista neural craniana. veja Crista neural ceflica Crista neural do tronco, 284 diferenciao final, 292-293 matriz extracelular e migrao, 287-290 potncia desenvolvimental, 291-292 trajetrias migratrias, 285-287 Cristalinas, 283 Cristalino. veja tambm Induo do cristalino diferenciao, 283-284 fibras, 283 formao, 279-280 regenerao em salamandra, 40-41 Cromatdeos, na meiose, 850-852 Cromatina, 431 acessibilidade a trans-reguladores, 432-434 complexos de disrupo de nucleossomos, 436-437 descondensao no espermatozide, 153-154 em genes hometicos, 572 matriz nuclear e, 451-453 metilao, 444 na meiose, 851 nucleossomos em, 431-432 regies controladoras de locos, 437-441 stios hipersensveis DNase I, 434-436 topoisomerases e, 453-454 Cromossomos. veja tambm cromossomo X; cromossomo Y em forma de escova, 865 homlogos, 850-852 nas teorias da herana, 36-38 politeno, 50-54 sntese diferencial de RNA e, 51-54 teoria do plasma germinativo, 592 translocaes, 418-419 trissomia, 827 tufos (puffs), 51-54,757-758,759 Cromossomo X compensao de dosagem, 446-450 descoberta, 37
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ndice de Assuntos
elementos do numerador, 791 mutaes em Drosophila, 38 na determinao do sexo em Drosophila, 788-791 na determinao primria do sexo,774 no desenvolvimento do ovrio, 781 Cromossomo Y na determinao do sexo em Drosophila, 798-790 na determinao dos testculos, 777-780 na determinao primria do sexo, 774 Cromossomos politnicos, 50 ligao de hidroxiecdisona, 757-758,759 sntese de RNA e, 50-54 Cruzamento (crossing-over), 851-852 CSF. veja Fator citosttico CSF-1. veja Fator estimulante de colnias de macrfago Csx. veja Gene Cardiac-specific homeobox CT. veja Coluna de Terni CTD. veja Dominio carboxi-terminal Culminao, 27-28 Cumulus, 872 Cutcula, 746 Cyclopia, 828 Cytomegalovirus, 835 da. veja gene daughterless DAG. veja Diacilglicerol DALA sintase, 494 Danio clivagem, 189-192 desenvolvimento do corao, 191-192 Daphnia, 819 Dauerblstula, 597-598 DDE, 836 DDT, 836 Dedo de zinco, 420,577 em gene tra-1, 796 intensificadores responsivos a hormnios e, 422 Dedos, formao, 724-727 Defesa induzida por predador, 819-820 Delaminao, 209 Dendritos, 276 Dendrobates, comportamento, 740 Dente. veja Odontognese Dermamitomo, 324,345 Dermtomo, 345,346-347 Descondensao, 153-154 Desdiferenciao, 714 Desenvolvimento, 3 alometria e, 891-893 ambiente e, 75,827-837 autnomo, 603 condicional, 602-603 co-opo e, 894-896 cromossomo X e, 37-38 definido, 79 dependente, 602-603 direto, 743-745 dissociao e, 891-893 divergncia e, 893-894 duplicao e, 893-894 estgios, 3-5 genes reguladores homlogos e, 902-909 heterocronia e, 891 independente, 603 modulao do, 891 mosaico, 593,603
plasticidade do, 822-826 processamento diferencial de RNA e, 461 progresso correlacionada e, 896-897 regulativo, 591,602-603 restries no, 898-902 unidade em, 646-647 vertebrados, 254 vias homlogas, 909-911 Desenvolvimento autonmo, em anfbios, 603 Desenvolvimento condicional, em anfbios, 602-603 Desenvolvimento dependente, 602-603 Desenvolvimento direto, 743-745 Desenvolvimento do corao assimetria no, 366 conexinas e, 98 crista neural cardaca, 296,297 fibronectina e, 103 formao das cmaras, 363-366 fuso dos rudimentos, 361-363 peixes, 191-192 polaridade, 365-366 Desenvolvimento em mosaico, 593,597,603 Desenvolvimento independente, 603 Desenvolvimento ptico. veja Olho Desenvolvimento regulativo, 591,602-603 experimentos de isolamento no, 594-596 teoria do plasma germinativo e, 592-600 Desenvolvimento, transferncia Northern, 64,66 Desnaturao, 54 Destino celular. veja tambm Mapa de destino em embries de clivagem tardia, 598 mRNA localizado de ocito e, 480-481 Destino prospectivo, 595,602-603 Destino, perspectiva, 595,602-603 Determinao, 559. veja tambm Determinao do sexo acaso e, 692-693 dos eixos embrionrios, 224-226,238,480481,554 dos mioblastos, 349-351 em discos imaginais, 750-753 em induo do cristalino, 670-672 neuronial, 308-309 progressiva, 600-603 Determinao da pegada da DNAse, 555 Determinao do sexo comportamento especfico do sexo, 785-788 cromossmicos, 774-777 dependente da temperatura, 798-799,817-818 dependente do local, 799-800 desenvolvimento ovariano e, 781-782 desenvovlvimento das gnadas na, 775-777 determinao do testculo e, 777-781 em Drosophila, 468-471,788-795 em ginandromorfos, 789 em hermafroditas, 795-798 em mamferos, 774-778 em peixes, 818-819 emenda alternativa do RNA e, 468-471 genes autossmicos e, 780-781,790791,795-796 genes do cromossomo Y e, 777-780 partenognese, 810-811 perspectivas histricas, 773-774 primria, 774,777-781 regulamentao ambiental, 810-812
secundria, 774-775,782-788 Determinao do sexo em aligtor, 799 Determinao progressiva, em anfbios, 600-603 Determinao sexual primria, 774 Determinao sexual secundria, 774-775 Determinantes morfogenticos, 125,156,551 Deuterostomatas, 30 ativao do ovo, 149-151 formao da boca, 218 formao do nus, 218 padres do desenvolvimento, 30-32 Dfd. veja gene Deformed DHP. veja Ponto de articulao dorsolateral Diacilglicerol (DAG), 112,147 Diacinesia, 852 Diapausa, 755,812-813 Diapedese, 848 Dicloro difenil-tricloroetano (DDT), 836 Dictyostelium agregao, 22-23 ciclo vital, 21 diferenciao, 23,26-28 encurtamento diferencial da cauda poli(A) em, 475-476 molculas de adeso celular, 24-25 Dideoxinucleotdeos, 59-61 Diencfalo, 266,268 Dietilstilbesterol, 836 DIF. veja Fator indutor da diferenciao Diferenciao, 2 ameboflagelados, 10-11 definida, 47-48 em Dictyostelium, 23,26-28 em Volvocaceanas, 16-17 modelo operon e, 48 na induo do cristalino, 670-672 no dente de mamferos, 682 no desenvolvimento, 79 teoria do plasma germinativo e, 592 Digesto, em interaes clula-clula, 106-107 Dihidrotestosterona, na determinao do sexo, 783-784 5 -dihidrotestosterona, 783 Dinena, 123-124 Dioxina, 836 Diploteno, 852 Direcionamento da glia, 273 Direcionamento de contato, 313-314 Disco dos membros, 703 Disco imaginal da perna, 748,750-753 Discos imaginais, 746-753 Disjuntores, no controle da traduo, 492 Displasia campomlica, 780 Displasia tanatofrica, 357 Disrupo, 828 Dissociao, no desenvolvimento, 891-893 Divergncia, no desenvolvimento, 893-894 Diversidade, emergncia dos filos e, 888 Divertculo heptico, 382 Diviso Celular. veja tambm Ciclo celular; clivagem; mitose clulas do tubo neural, 270 em procariotos, 5 longevidade do mRNA e, 475 MPF e, 197 DMZ. veja Zona marginal dorsal DNA. veja tambm cDNA; sntese de DNA acessibilidade a trans-reguladores, 432-434
ndice de Assuntos
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clonagem, 55-57 determinao da pegada (footprinting) da DNAse, 555 elementos de resposta ao cido retinico, 829 elementos responsivos a hormnio, 420-423 em eucariotos, 5-6 em procariotos, 5-6 ensaio de transferncia de mobilidade, 414 enzimas reparadoras na meiose, 852 hibridizao, 54-55;58-59 matriz nuclear e, 451-454 metilao, 442-446 polimerase de reao em cadeia e, 66,68-69 recombinante, 56 regies controladoras de locos, 437-441 separao de fitas, 453-454 seqenciamento, 59-61 seqncias limitantes, 454 tcnicas de insero, 69-70 DNA complementar. veja cDNA DNA ligase, 56 DNA polimerase. 69 DNA recombinante, 56 DNA, protenas dobradoras de DNA, 423 DNAse I, 433-434 DNAse I, stios hipersensveis, 434-436,451 metilao, 444 regies de controle de locos e, 440,441 Dobradia cordoneural, 265 Dobras corpreas, 359 Dobras neurais, 257,258 Dobras transversais anteriores, 545 Dobras transversais posterior, 545 Doena de Alzheimer, 334 Doena de Hirschprung, 290 Doena de Minamata, 828 Doena de Parkinson, 332,334 Doenas neurodegenerativas, 333-334 Domnio, 454 Domnio carboxi-terminal (CTD), 400 Domnio de ligao de hormnio, 421 Domnio do trans-ativador, 404-421 Domnio ligante de DNA, 404,421 Domnio POU, 406-407 Dopamina, 279 Dorsal, definido, 341 dpp, veja gene decapentaplegic Drosophila. veja tambm Metamorfose de insetos ativao do genoma embrionrio, 489 clulas germinativas em, 849-850,855 ciclo de clivagem, 196 compensao de dosagem em, 446 complexos de ruptura nucleossmica, 436 compromisso do destino celular em, 559-561 determinao do sexo, 468-471,788-795 determinao dos eixos, 480-481,585 discos imaginais, 747-753 ecdise em, 756-757 encurtamento diferencial da cauda poli(A) em, 476 espaamento do neuroblasto, 692-693 especificao da glndula salivar, 585 especificao das clulas neurais, 585 especificao do neurnio motor, 310-312 espermatognese, 858-859 famlia da protena Hedgehog em, 659 fatores de transcrio, 400,401 formao de fotoreceptores retinianos, 688-690
formao do sistema nervoso, 545 gastrulao, 543-545 genes de efeito materno, 546-559 genes de segmentao, 559-569 genes Hom-C, em 643,905 genes seletores hometicos, 569-577 homologia do gene hometico, 616,637638,640 integrinas e, 104-105 mapa de destino, 582-585 muda, 747-748 mutaes do cromossomo X, 38 mutaes hometicas, 570-571 mutaes oculares, 688-690 na evoluo, 907-909 neurmeros, 647 oognese, 867-870 partenognese em, 861 periodicidade em, 546 plano corporal, 545-546 polaridade ntero-posterior, 545-577 polaridade dorso-ventral, 577-585 primrdios de rgos, 585 protenas do homeodomnio, 405 protenas Wnt em, 660 regulao desenvolvimental da quinase MPF, 199 Semaphorin II e, 321-322 seqncias limitantes em, 454 trajetria RTK-Ras em, 910-911 transio da blstula intermediria, 194-195 DSP1. veja Protena 1 de comutao dorsal Dsx. veja gene doublesex Ducto Mleriano, 775 atrofia, 783,784 desenvolvimento, 784 Ducto nfrico, 674 Ducto pronfrico, 673-674 Ducto Wolffiano, 674,777 desenvolvimento, 783,784 Dupla garantia, 627,668 Duplicao, no desenvolvimento, 893-894 Duto arterioso, 372 Dutos eferentes, 674,777 Dutos mamrios, 765 Ea. veja gene easter E-caderina, 93,184 mesnquima metanefrognico e, 679 na migrao celular, 240 na regulao da conexina, 98 Ecdise, 756-757 Ecdisona, 754,755-756 na captao da protena do vitelo, 870 no polifenismo, 814 Ecloso, 757 ECM18, 214 EcR. veja Receptor da ecdisona EcR. veja gene Ecdysone receptor Ectoderma, 3-4. veja tambm Crista ectodrmica apical anfbio, 222-224,232 ave, 241-242 na determinao neuronial, 308 na formao da crnea, 672 na formao da placa neural, 257-258 na induo do cristalino, 669-670 na neurulao primria, 255-257 na organognese, 255
na polarizao dorso-ventral dos membros, 721-722 vertebrado, 254 Editorao do RNA, 493 EDNH. veja Hormnio neurosecretor no desenvolvimento do ovo Eed. veja gene embyonic ectoderm development Efeito do lcool no feto, 833 eFGF, 625,628 EGF. veja Fator de crescimento epidrmico Egr-1, 420 EGTA, 150 eIF2. veja Fator 2 de iniciao eucaritica eIF4E. veja Proteina cap ligante Eixos. veja tambm Eixo ntero-posterior; Eixo Dorso-ventral animal-vegetal, 862 embrionrio, 224-226,238,480-481,869 esquerdo-direito, 647-650 na determinao dos discos imaginais, 751-753 prximo-distal, 706-716,752-753 Eixo A/P. veja Eixo ntero-posterior Eixo animal-vegetal, transporte de vitelogenina e, 862 Eixo ntero-posterior cido retinico e, 645 determinao, 224-225,238 em discos imaginais, 751 em oognese merostica, 869 especificao em mamferos, 637-647 genes de efeito materno e, 546-559 genes de segmentao e, 559-569 genes hometicos e, 569-577 iniciao em vertebrados, 635-637 modelo cartesiano coordenado, 585 mRNA de ocitos e, 480-481 na formao de membros, 716-721 viso panormica em Drosophila, 545-546 Eixo D/V. veja Eixo dorso-ventral Eixo dorso-ventral determinao, 224-225,238 em mamferos e aves, 647-650 especificao, 607-610 modelo em coordenadas cartesianas e, 585 na formao dos membros, 721-722 na oognese merostica, 869 nos discos imaginais, 751-752 protena dorsal no, 577-578 semelhana com a diferenciao de linfcitos, 582 sistema nervoso central, 264 translocao da protena dorsal, 578-585 Eixo esquerdo-direito, em mamferos e aves, 647-650 Eixo prximo-distal na formao de membros, 706-716 na regenerao de membros, 714-716 EKLF. veja Fator do eritride semelhante ao Krppel Elemento controle da adenilao (ACE), 484 Elemento de poliadenilao citoplasmtico (CPE), 484 Elemento transponvel, na insero do DNA, 69 Elementos responsivos a hormnios, 420-423 Eletroporao, 69 Eleutherodactylus, 169,744 ELF-1. veja Famlia ligante de Eph 1 Elongao, 474
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ndice de Assuntos
dos discos imaginais, 749-750 em. veja gene empty spiracles Embrio, 3. veja tambm Pinto; Clivagem; Drosophila; Camundongo; Xenopus ativao genmica, 488-490 clivagem, 158-159 desenvolvimento evolutivo, 885-890 destino celular no, 598 destino celular tardio, 598 determinao axial, 224-225,238,480-481 nurula e, 254 periodicidade no, 548 potencial da membrana no, 238 regulao, 186-188 simetria, 157-158 sistema circulatrio, 366,370-371 tipos celulares, 80 tunicado, 159 Embrio de codorna formao da placa do assoalho neural, 258-259 ilhas de sangue no, 368 Embriognese, 3-5 traos maternais no, 476-477 Embriologia estudo de defeitos em, 593 experimentos de isolamento na, 594-596 leis gerais, 253-254 mecnica do desenvolvimento e, 593 modelo operon, 48 na biologia evolutiva, 884 na taxonomia, 884 regulao ambiental e, 805-806 relao com a gentica, 38-40 teoria dos genes e, 35-38 Emenda alternativa do RNA, 466-471 Emys, 798-799 Endereamento de genes (gene targetting), 70-73 na anlise do cdigo Hox, 640-643 Endocrdio, 363 Endoderma, 4,380-384 anfbio, 222-224 avirio, 235-238 mamfero, 244,245 na induo mesodrmica, 606 vertebrado, 254 Endoderma do saco vitelnico, 243 Endomtrio, 245 Endonuclease de restrio, 55 Endotelina-3, 290,293 Enrgdes, 194 Enhanceosomes, 423 Ensaio de proteo de ribonuclease, 465 Ensaio de transferncia de mobilidade, 414 Entelechy, 596 Envoltrio vitelnico, 126,132-135,241 Envoltrio de fertilizao, 143 Enzima de Ecloso, 173 Enzima de manuteno Purina, 89 Enzima de restrio HpaII, 445 Enzima de restrio MspI, 445 Enzima de Restrio, 55 Enzimas. veja tambm tipos especficos digestivas, 106-107 eclosivas, 173 restritivas, 55 Enzimas adaptativas, 47 Enzimas proteolticas, na metamorfose de anfbios, 736-737
EP-caderina, 94,174 Epndima, 271 Epiblasto, 189,220-221,233 de aves, 233-234,239-240 de mamfero, 243-245 Epibolia, 209 controle citoplasmtico, 210 microtbulos e, 220 na gastrulao de anfbio, 222-224,232 na transio da blstula intermediria, 218-220 no ectoderma de ave, 241-242 Epiderme apndices, 299-300 desenvolvimento, 297-299 ferimento, 714 na neurulao primria, 256,257-258 nos discos imaginais, 748-750 Epiderme do ferimento, 714 Epiddimo, 125 Epfises, 357-358 Epimiocrdio, 363 Epinefrina, 279 Epitlio olfatrio, 319 Epitlio pancretico, 383 Equinoderma, clivagem, 169 Equivalncia genmica, evidncia para a, 40-47 Eritroblasto, 377 Eritride. veja tambm Clula sangnea vermelha, 375,377 gene globina e, 438-439,440 unidade formadora de ruptura, 375 Eritropoietina, 375 Esc. veja gene extra sex combs Esclerose lateral amotrfica, 333 Esclertomo, 284,324-325,345 gerao, 346-347 Escroto, 783 Escudo embrionrio, 220-221 Especificao, 559 condicional, 591 dependente, 591 homloga, 753 Especificao axial. veja eixo nteroposterior; eixo Dorso-ventral Especificao condicional, 591 Especificao dependente, 591 Especificao homloga, 753 Espermateliose, 857-858 Espermtides, 856,859 Espermatcitos, 856,859 Espermatcitos primrios, 865 Espermatcitos secundrios, 856 Espermatognese, 855-859 gene desert hedgehog e, 659 Espermatognia, 855-856 Espermatognia intermediria, 856 Espermatognia tipo A1, 855 Espermatognia tipo A2, 855 Espermatognia tipo B, 856 Espermatozide. veja tambm Espermatognese ativao do vulo, 147-149 ativao, 129-130 atrao, 128-129 capacitao, 125,131-132 centrolo, 153 conceitos iniciais do, 121-122 condensao no, 859 de mamfero, 131-132
determinao em hermafroditas, 853-855 diferenciao, 122-123,125 fuso com o vulo, 139-140 hiperativao, 132 humano, 131,138,858 impresso em, 445-446 ligao secundria zona pelcida, 138-139 polaridade do vulo e, 225 preveno da poliespermia, 140-144 proncleo, 152-154 propulso, 123-124 reao acrossmica, 129-130,138-139 translocao, 131-132 Espermina, na clonagem de anfbio, 45 Espermiognese, 857-858 Espcula, formao, 214-215 Espinha bfida, 262 Espirais destra, 175 em caramujos, 176-178 Espiral destra, 175 Espiralamento em lesmas,176-178 Esplancnopleura, 360 Esponjas, padres de desenvolvimento, 29-30 Esqueleto. veja tambm Osso; Osteognese anormalidades, 357-358 expresso do gene Hox e, 642-643 gerao, 351 precursores, 345 sensibilidade a teratgenios, 828 Esqueleto axial expresso do gene Hox e, 642-643 precursores, 345 Esquizoencefalia, 647 Estgio bipotencial, 775 Estgio dictiado, 871 Estgio indiferente, 775 Estereoblstula, 175 Estereotropismo, 313-314 Estomodeo, 380 Estradiol, 787 Estrato crneo, 297-298 Estrato germinativo, 297 Estripsina, 186 Estro, 870 Estrgeno, 765 ambiental, 836-837 comportamento especfico do sexo e, 786 fetal, 787 na determinao do sexo, 784,798-799 na maturao dos folculos, 875 na ovulao, 870 na regulao do ciclo menstrual, 872-874 produo de IL-6, 378 receptores na epfise, 357-358 regulao da prolactina, 407-409 Estrgenos ambientais, 836-837 Estroma primrio, na formao da crnea, 672 Estromelisina, 106,186 Estruturas anlogas, 727 Estruturas homlogas, 727 na teologia natural, 883 Etanol. veja lcool Eucariontes, 5-6 estrutura gentica, 74 genoma, 454 traduo em, 472-474
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Eucariotos coloniais. veja Dictyostelium; Volvocaceas Eucariotos unicelulares diferenciao, 10-11 morfognese, 6-10 reproduo sexual, 12-16 Eucromatina, 446 Eudorina, 16 Euprymna, 808 Euscelis, 809 Everso, dos discos imaginais, 749-750 Evidncia correlativa, 25 Evidncia de ganho-de-funo, 25 Evidncia de perda-de-funo, 25 Evidncia, tipos, 25 EVL. veja Camada envolvente Evoluo assimilao gentica e, 821-822 de novos tipos celulares, 911-912 em insetos, 907-909 enfoques histricos, 883-885,912-914 genes hox e, 905-907 genes reguladores homlogos e, 902-909 membros de tetrpodes e, 726-727 modularidade desenvolvimental e, 891-897 neotenia e, 743 no desenvolvimento precoce, 885-890 restries desenvolvimentais e, 898-902 sistema circulatrio e, 366-367 trajetrias desenvolvimentais homlogas e, 909-911 Exd. veja gene Extradenticle Exocitose grnulos corticais, 143,144,146 vescula acrossmica, 130,132 xon, definio, 466 xons, 392-394,466 Experimentos de eliminao (knockout), 70-73 na formao dos membros, 709-711 Experimentos de isolamento, 594-596 Experimentos de reagregao, 80,82-84 Experimentos imperfeitos, 593,596 Expresso do gene haplide, 859 Expresso gnica. veja tambm Transcrio; fatores de transcrio em espermatognese, 858-859 em genes hometicos, 403,569-573,572 em mutantes sem membros (limbless), 724 em organizador de mamferos, 636-637 genes Hox, 642-643 haplide, 859 pancretica, 403 processamento diferencial de RNA e, 471 Extenso convergente, 217,231 Face. veja Processo facial Famlia de protenas Wnt, 346,626,628,660661,680 na induo do mesoderma dorsal, 611 na formao do eixo dorsal, 609-610 Famlia ligante de Eph 1 (ELF-1), 328-331 Farngula, 900 Farmacuticos, uso de promotores, 398 FAS. veja Sndrome alcolica fetal Fasciclina I, 316 Fasciclinas, 96,318 Fascculos, 316 Fase folicular, 872 Fase luteal, 874
Fase pr-vitelognica, 861 Fase proliferativa, 872 Fase vitelognica, 861 Fator bsico do crescimento de fibroblasto (FGF2), 619,658 em anormalidades do esqueleto, 357 em cultura de clulas mesenquimatosas, 681 em vasculognese, 368 na caudalizao neural, 625 na induo do cristalino, 672 na miognese, 350 na organognese do rim, 678 na proliferao de clulas germinativas, 847 na regenerao de membros, 715 regulao, 492 Fator citosttico (CSF), 200-201,864 Fator da clula-tronco, 290,846 Fator da glndula mamria (MGF), 766-767 Fator de coagulao sangnea IX, 418 Fator de crescimento autcrino, 298 Fator de crescimento da cmara anterior, 672 Fator de crescimento da glia (GGF),715 Fator de crescimento de queratincito (KGF), 299 Fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), 148-149 Fator de crescimento do endotlio vascular (VEGF), 369 Fator de crescimento do nervo (NGF), 332,656 Fator de crescimento dos hepatcitos (HGF), 677,682 Fator de crescimento epidrmico (EGF), 580 no desenvolvimento mamrio, 765 Fator de crescimento fibroblstico (FGF), 292,357,658,702 em formao da AER, 706 embrionrio, 625 especificidade no alvo retiniano, 327 na caudalizao neural, 625 na comptncia neuronial, 656 na induo do broto dos membros, 704 na induo do mesoderma, 612 no crescimento do broto dos membros, 711 receptores, 658 zona de progresso e, 708 Fator 1 de crescimento fibroblstico (FGF1) na induo do cristalino, 672 na sndrome de Pfeiffer, 357 Fator 2 de crescimento fibroblstico (FGF2). veja Fator bsico do crescimento de fibroblasto Fator 3 de crescimento fibroblstico (FGF3), 682 em acondroplasia, 357 Fator 4 de crescimento fibroblstico (FGF4), 659 em mutantes sem membros (limbless), 724 na odontogense, 682 na polarizao de membros, 721,722 Fator 5 de crescimento fibroblstico (FGF5), 332 Fator 7 de crescimento fibroblstico (FGF7), na ramificao epitelial, 687 Fator 8 de crescimento fibroblstico (FGF8), 268,704 emenda alternativa do RNA, 468 no crescimento do broto do membro, 711 no mutante limbless, 724
Fator de crescimento II semelhante insulina (IGF-II), 155,444 Fator de crescimento semelhante insulina (IGF-I), 355 Fator 2 de emenda (SF2), 466 Fator de eritride semelhante ao Krppel (EKLF), 441 Fator de espalhamento, 240,637 Fator de inibio da leucemia (LIF), 292,847 Fator de iniciao eucaritica 2 (eIF2GTP), 472,474,494-496 Fator de remodelagem do nucleossomo (NURF), 436 Fator de transcrio AML1, 379-380 Fator de transcrio NTF-1, 401 Fator de transcrio SCL, 375 Fator de transcrio Sp1, 401 Fator de troca de nucleotdeo de guanina, 108-109 Fator determinante do sexo do cromossomo Y (SRY), 423 Fator esteroidognico 1 (SF1), 780-781 Fator estimulador de colnias de macrfagos (M-CSF, CSF-1), 377 Fator indutor de diferenciao (DIF), 26 Fator neurotrfico ciliar (CNTF), 332-333 Fator neurotrfico derivado da glia (GDNF), 290,292,332,677 Fator neurotrfico derivado do crebro (BDNF), 292,332 Fator promotor da maturao (MPF) em ocitos de anfbios, 864,866-867 na regulao de cdc25 fosfatase, 199 no ciclo celular, 197 subunidade grande, 198-199 subunidade pequena, 198 Fator promotor da mitose. veja Fator promotor da maturao Fator- transformador do crescimento (TGF-), 298 Fator-1 transformador do crescimento (TGF-1), 686 Fatores ambientais desenvolvimento e, 75 determinao do sexo em Drosophila e, 795 formas larvais e, 761-762 na determinao do sexo, 798-800 na diapausa, 755 na neotenia, 743 Fatores associados das protenas ligantes de TATA (TAFs), 400-401 Fatores de crescimento. veja tambm Tipos especficos Fatores de crescimento e diferenciao (GDFs), 657-663 Fatores de transcrio, 396. veja tambm Tipos especficos; Trans-reguladores atividade dependente de contexto, 423-424 competio com histonas, 437 domnio do ativador, 399 especfica de eritrides, 440 hormnio esterides como, 420-423 induzida por organizadores, 619-620 inibidores da cromatina, 431-432 Pax6, 282 proteinas de dobramento do DNA, 423 regulao dos, 425-426 rompimento de nucleossomos e, 432-434
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Fatores endcrinos, 658 Fatores neurotrficos, 331-334 Fatores parcrinos, 657-663,686-687 Fenda ceflica, 545 Fenda primitiva, 234 Fenitona, em anormalidades congnitas, 833 Ferritina, 492 Fertilizao, 3 ativao do metabolismo dos gametas, 147-152 coevoluo e, 901-902 definio, 121 descoberta, 122 fuso de gametas, 139-140 fuso nuclear, 152-154 ligao de gametas, 132-139 mamferos, 135-139,153-154,180 meiose ooctica e, 864 no-equivalncia, 154-155 preveno da poliespermia, 140-146 rearranjo do ovo na, 156-159 reconhecimento de gametas, 128-132 sntese de DNA na, 151-152 Feto lcool e, 833-835 estrgeno e, 787 hemoglobina e, 372,437,440-441 oxigenao, 372 -fetoprotena, 787 FGF acdico. veja Fator 1 de crescimento fibroblstico FGF. veja. Fator de crescimento fibroblstico FGFR3. veja Receptor 3 do fator de crescimento fibroblstico Fibras, no cristalino, 283 Fibronectina, 102-103 emenda alternativa do RNA em, 468 integrinas e, 104-105 mesnquima metanefrognico e, 679 na condrognese, 722-723 na fuso mioblstica, 347 na migrao celular, 240,362-363 na migrao das clulas germinativas, 844,846 na migrao do mesnquima primrio, 214 na migrao mesodrmica, 230-231 somitmeros e, 344 Fgado, 382 na formao do sangue, 379-380 ramificaes no, 683-684 Filo. veja Filos Filopdios, 210 elongao do arquntero e, 217-218 em axnios, 277-278 em migrao do mesnquima primrio, 214 formao de espculas e, 215 Filos, emergncia evolucionria, 887-890 Fmbrias, 180 Fissuras, na ramificao do tubo epitelial, 684-686 Flagelos, 10-11,123-124 Fluido amnitico, 244 Fluidos, leis do movimento, 367 Focomelia, 830 Foice de Koller, 233,234,605 Folculos, 777 cabelo, 299-300 hormnios e, 777,870,872-874,875 maturao, 875 na ativao do grupo de genes terminais, 557-558
na determinao do eixo embrionrio, 554 na ovulao, 870,871-874 na reiniciao da meiose ooctica, 875 quimiotaxia e, 132 translocao da protena Dorsal e, 578-581 Folistatina, 617,624,649 Forame oval, 372 Formao do mamilo, 763 Formao do padro, 701-702 Formiga, polifenismo nutricional, 816-817 Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2), 112,147,184 Fosfolipase C, 112,147,149 Fosforilao, regulao de fatores de transcrio, 424-425 Fosvitina, 862 Fotoperodo na diapausa, 812 na partenognese de afdeos, 811 Fotoreceptores, 280 em neonatos, 282 induo clula-para-clula em, 688-690 Fotossntese, na simbiose desenvolvimental, 808-809 Fragmentos de restrio, 55 Fronteira metencfalo-mesencfalo, 268 FSH. veja Hormnio folculo estimulante Ftz. veja Gene fushi tarazu Ftz. veja Protena Fushi tarazu Fungos, genes homeobox, 647 Fura-2, 144 Fuso de gametas, 139-140 Fuso mittico ciclina B e, 200 sulco de clivagem e, 202-203 Fusossomo, 867 Gafanhoto, movimento axnico, 315 GAG. veja Glicosaminoglicano GAGA, fator de transcrio, 436 -galactosdeo, 56 Galactosiltransferase, 105-106,136,137 Gametas, 3. veja tambm vulo; Espermatozide ativao metablica, 147-152 atrao, 128-129 em hermafroditas, 490-491 estrutura, 121-128 fuso, 139-140,152-154 mamferos, 131-132 no equivalncia, 154-155 preveno da poliespermia, 140-146 reao acrossmica em, 129-130 reconhecimento, 128-139 Gametognese, 5,483 Gnglios, 280 entricos, 284 parassimpticos, 284 raiz dorsal, 284,287,292 retinianos, 325,328-331,825 simpticos, 284,287,292 talidomida e, 831 Gnglios da raiz dorsal, 284,287 precursores, 292 talidomida e, 831 Gnglios retinianos, 825 diferenciao, 325 especificidade adesiva, 328-331,825 Gnglios simpticos, 284,287
diferenciao, 292 GAP. veja Protena ativadora de GTP-ase Gstrula, desenvolvimento evolucionrio, 886 Gastrulao, 3,209-210 crescente cinzento em, 602 desenvolvimento evolucionrio, 886 Drosophila, 543-545 em anfbios, 221-232 em aves, 233-242 em peixes, 218,221 em mamferos, 242-248 gradiente de maturidade, 237 ourio-do-mar, 210-218 peixes, 218-221 GATA-1, 440 Gato, padro neuronial do sistema visual, 824-826 Gd. veja Gene gastrulation defective GDF. veja Fatores de crescimento e diferenciao GDNF. veja Fator neurotrfico derivado da glia Gelatinase, 106 Gelia cardaca, 363 Gelia do ovo, 128 na reao acrossmica, 129-130 Gema, 31,125 absoro de protena, 870 cerco, 237-238 distribuio, 168-169 importncia evolucionria, 169 intensificador de protena, 404 prognese e, 745 Gmeos fraternos, 186 idnticos, 186 unidos, 186 Gmeos conjugados, 186 Gmeos dizigticos, 186 Gmeos monozigticos, 186 Gmeos siameses, 186 Gene(s).veja tambm Genes autossmicos; Expresso gnica; Transcrio acesso a trans-reguladores, 432-434 autossmicos, 447 dorsalizao, 578 em efeitos teratognicos, 837 emenda alternativa do RNA e, 468-471 especficos para o fgado, 417-418 estrutura, 74,392 xons, 392-394 experimentos de eliminao, 70-73 identificao com anticorpos monoclonais, 90-91 impresso, 444-446 intensificadores, 402-404 interaes com sntese de protenas, 426 metilao de DNA e, 442-446 modelo operon, 47-48 na determinao do sexo, 777-781 promotores, 394-401 regulao, 6,391 seqncias de limite, 454 sntese diferencial de RNA e, 49-54 sntese em linfcitos B, 410-415 tcnicas de insero, 69-70 transcrio, 392-394,431-432 ventralizao, 578 Gene abdominal A (abdA), 569,572,575
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abdominal B (abdB), 569, 572, 575, 637, 638, 647 achaete (ac), 585 actin, 611 Antennapedia (Antp), 58-59 anterobithorax (abx), 574-575 apo-B, 493 apterous, 751-752 arista-less, 752 armadillo, 565 BDNF, 292 bicoid, 478 bithorax (bx), 574-575 bithoraxoid (bxd), 574 BMP4, 616,724 BMP7, 616 boule, 858 Brachyury, 64 Broad-Complex (BR-C), 758-759,760 buttonhead (bth), 555-556 cactus, 577 Cardiac-specific homeobox (Csx), 904 CAT, 403,452-453 caudal, 643 cdc2, 198 cdc13, 199 Cdx1, 643 cerberus, 618-619 c-fos, 475 chordin, 614 c-myc, 418-419,445 cornichon, 580 cortex, 480 cubitus interruptus, 565 Cyllla, 465 da ovalbumina, 442 daughterless (da), 791 DAX1, 781 DAZ, 858 deadpan, 791 decapentaplegic (dpp), 573,578,584,616 Deformed (Dfd), 569,638,640,647 desert hedgehog (dhh), 659 disheveled, 565 Distal-less (Dll), 573,752 Dlx3, 715 dorsal, 577-578 dorsalin, 264 doublesex (dsx), 793-794 E74, 761 E74B, 760 E75, 761 E78, 761 easter (ea), 581 Ecdysone receptor (EcR), 758,760,761 embryonic ectodermic development (eed), 643 empty spiracles (ems), 555-556 Emx, 647 EMX-2, 647 engrailed, 565-569 engrailed-2, 268-269,627 even-skipped, 564 extra sex combs (esc), 643 Extradentcule (Exd), 577 exuperandia, 553 eyeless, 903 fem, 796,854 fem-3, 491
fog, 854 fringe, 753 fused, 565 fushi tarazu (ftz), 560,565,575 gastrulation defective (gd), 581 giant (gt), 561-563 Globina, 442-443 -globin, 863 glp-1, 478,853-854 goosecoid, 611,614,619,637 grauzone, 480 gurken, 554,580,869 H19, 445-446 hairy, 564 hedgehog (hh), 566-568,660,718 her, 796 hid, 761 HNF3, 637 Hoxa-2, 642 Hoxa-3, 70-73,295 HPRT, 448-450 hsp, 436 hsp70, 454 huckbein, 561 hunchback (hb), 405-575 Igf-2, 444 Igf-2r, 444,445-446 indian hedgehog (ihh), 659 Interferon (INF), 423 intersex (ix), 790 intra-abdominal (iab), 575 inversion of embryonic turning (inv), 648 knirps (kni), 556,561-563 krox-20, 627 krppel (Kr), 73,560,561-563 L71, 761 labial (lab), 569,637,638,647 lefty, 648 lethal of scute (lsc), 585 Lim-1, 268,637 Lmx1, 722 15-lox, 497 Luciferinase, 74 mog, 854 MRF4, 349 msx-1, 397-398,264,714,715 MT-1, 397-398 myf5, 349 MyoD, 349-350,416,442 myogenin, 349 nanos, 478,556 Netrin, 320 nodal, 636-637,648-649 noggin, 611,614,616,620 Notch, 692-693 Notch-1, 344 nudel (nd), 580-581 openbrain, 263 optomotorblind, 752 orthodenticle(otd), 555-556,620,647 oskar, 480,556,869 Otx-2, 268,647 Paraxis, 344 patched, 660-661 Pax2, 680 Pax3, 263,264 Pax6, 282,902-903 PAX6, 827,903
pdx-1, 383 pipe (pip), 580-581 Pit-1, 407-409 posterobithorax (pbx), 574 proboscipedia (pb), 569,638 prolactin, 407-409 Proliferin, 423-424 radical fringe, 706 Ras, 109 Rb97D, 858 reaper, 761 rGH, 397-398 rhomboid, 583-585 roughex, 858 runt, 564,791 salm, 572-573 screw, 616 scute (sc), 585 serrate, 753 Sex comb reduced (Scr), 569,585 Sex-determining region of the Y (SRY), 778-780 Sex-letal (Sxl), 469 Sf1, 780 shaker, 467 Siamois, 610-611 sisterless, 791 situs inversus viscerum (iv), 648 Small eyes, 903 snail, 578,583-585 snake (snk), 581 sonic hedgehog (shh), 263,648-649,659,718 SOX9, 780 spe-11, 859 Spec1, 465 staufen, 480,556 string, 199 swallow, 480,553 tailless, 561,563,575 teashirt, 577 TGF -, 299 tinman, 903-904 Toll, 581 torpedo, 580 torso, 557 torsolike, 558 transformer (tra), 468-469,789-790 transformer-1 (tra-1), 468-469 transformer-2 (tra-2), 469,490-491,789-790 tudor, 556 twist, 351,583-585 twisted, 578 Ultrabithorax (Ubx), 569,571,572,573,616 ultraspiracle (usp), 760 unc, 320 valois, 556 vasa, 556 vestigal, 751,753 Vg1, 478,863 Vitellogenin, 444 v-myc, 418 windbeutel (wind), 580-581 wingless (wg), 566,660,753 Wnt, 268,269,677,680,724,781-782 Wnt7a, 721-722,724 WT-1, 420,677 wuwen, 850 Xbra, 620 Xcat2, 863
IA2 - 12
ndice de Assuntos
Xenopus nodal-related-3 (Xnr3), 627 Xist, 449 XlHbox, 627 Xlsirt, 863 Xol-1, 796 Xotx2, 620 Xwnt, 611,863 zerknllt (zen), 578,584 zeste white-3, 565 ZP3, 74-75 Gene Antennapedia (Antp), 58-59,569,640, 751,907,909 mutaes, 570-571 na especificao homloga, 753 na regulao gnica, 572-573 Gene bicoid, 478 determinao de eixo, 480-481,548-550,869 mutaes, 552 no desenvolvimento anterior, 552-553 Gene Brachyury, 64 na induo mesodrmica, 611,612 Gene caudal, 643 na determinao do eixo, 481,548-550,554 Gene decapentaplegic (dpp), 573,578,584,616 regulao do, 577 Gene Distal-less (Dll), 573,752 na evoluo, 908-909,911-912 no polifenismo da borboleta, 815 Gene doublesex (dsx) na determinao do sexo em Drosophila, 793-794 Gene empty spiracles (ems), 555-556 mutaes de perda-de-funo, 647 Gene engrailed, 565-569 em trajetrias desenvolvimentais homlogas, 727 mutaes, 560 na determinao do disco imaginal, 751 Gene Globina metilao, 442-443 transcrio, 437-441 troca no, 440-441 Gene -globin, 863 promotor, 396 transcrio, 437-441 Gene Hoxa-2, 642 na evoluo, 906 Gene Hoxa-3, 70-73,295 no destino da clula da crista neural craniana, 641 Gene hunchback (hb), 405-575 na ativao dos genes gap, 561-563 na determinao do eixo ntero-posterior, 480-481,548-550 no centro organizador anterior, 554-555 no centro organizador posterior, 556-557 Gene myogenin, 349 regulao mltipla do, 425 Gene nanos, 478,556 na determinao do eixo ntero-posterior, 480-481,548-550 na determinao dos eixos do ocito, 869 Gene Notch, em espaamento neuroblstico, 692-693 Gene Proliferin, regulao dependente de contexto do, 423-424 Gene Sex-letal (Sxl), 469 mutaes perda-de-funo, 789-790
processamento diferencial de RNA e, 791-792 razo cromossomo X-para-autossomo e, 790-791 Gene sonic hedgehog (shh), 263,648-649, 659,718 na evoluo, 727 na metamorfose, 741 na polarizao dos membros, 721 no mutante limbless (sem membros), 724 ZPA e, 718 Gene transformer (tra), 468-469,789-790 em determinao do sexo em Drosophila, 793 Gene transformer-1 (tra-1), 468-469 na determinao da clula germinativa, 854 na determinao do sexo em Caenorhabditis, 796 Gene transformer-2 (tra-2), 469,490-491, 789-790 alelos sensveis temperatura, 794-795 na determinao do sexo em Drosophila, 793 Gene Ultrabithorax (Ubx), 569,571,572,573,616 cis-reguladores, 574 na evoluco, 907 Genes Autossmicos, 447 controladores da determinao sexual, 796 de cadeia leve, 410 de cadeia leve, 410 de cadeia pesada, 411-412 de efeito materno, 546,560 de efeito paterno, 859 de polaridade segmentar, 546,565-569 de segmentao, 559,559-561 dorsalizantes, 578 especficos do fgado C/EBP e, 417-418 fgf, 269,658,706,721 Gap, 546,560-561,572 Homeobox, 628 Hometicos, 546,569 Hox, 625,628 Hoxa, 642,644,710-711 Hoxb, 295,644,721 Hoxc, 723 Hoxd, 644 Imunoglobulina, 402 islet-1, 310 LIM, 310 lin, 491,692 Neurognicos, 311 pair rules, 546,560-561,563-565,572 pair-rule primrios, 564-565 pair-rule secundrios, 565 Proneurais, 311 Realizadores, 572-573 reguladores homlogos, 902-909 sdc, 796 seletores, 752 seletores hometicos, 569. tbx, 723 Ventralizantes, 578 yolk protein, 444,794-795 Genes Autossmicos, 447 na determinao do sexo, 780-781,790791,795-796 Genes de efeito materno, 546,560 evidncia embriolgica, 546-547 gradientes de protena e, 547-550 grupo terminal, 557-559
no centro organizador anterior, 552-556 no centro organizador posterior, 556-557 Genes Homeobox em plantas e fungos, 647 na induo neural, 628 Genes Hometicos, 546,569. veja tambm Complexo hometico; Genes Hox cis-reguladores, 574-575 cromatina em, 572 expresso, 569-573 homologia em, 637-638 mutaes, 570-571 seqenciamento de genes e, 573 Genes Hox, 625,628 anlise experimental, 640-645 anatomia comparada e, 641,645-646 evoluo de artrpodos e, 907-909 evoluo de vertebrados e, 905-907 expresso no tronco, 642-643 grupo parlogo, 638 homologia aos genes de Drosophila, 640 homologia aos genes Hom-C, 637-638,905 na definio de animais, 647 na especificao do campo dos membros, 703-704 na induo especfica de regio, 665-666 no eixo prximo-distal dos membros, 709-711 no sistema nervoso, 638-640 regulao de, 643 teratognese de cido retinico e, 830 Genes Hoxa, 642,644,710-711 na regenerao de membros, 715 Genes Hoxd, 644 na evoluo dos membros, 726 na polarizao dos membros, 720-721 no mutante limbless (sem membros), 724 Genes Imunoglobulina anticorpos e, 409 cadeia leve, 410 cadeia pesada, 411-412 cis-reguladores, 412-413 intensificadores, 402-403 metilao, 444 regies associadas matriz e, 453 silenciadores e, 454 trans-reguladores, 413-415 Genes pair-rule primrios, 564-565 gap, 561-563 pair-rules, 563-565 polaridade segmentar, 565-569 Genes seletores hometicos, 569. veja tambm Genes hometicos Gentica do desenvolvimento, 39-40 no desenvolvimento, 647 relacionada embriologia, 35,38-40 teoria do gene, 35-38 Gentica do desenvolvimento, 39-40,391 Genitlia desenvolvimento na Drosophila, 794 externa, 783-784 maturao, 319 sensibilidade a teratgenos, 828 Genitlia externa, sensibilidade a teratgenos, 828 Genoma ativao no embrio, 488-490 condensao, 859 domnios, 454
ndice de Assuntos
IA2 - 13
isoladores, 454 Gestao, humana, 276 GGF. veja Fator de crescimento da glia GHF1. veja Pit-1 Ginandromorfos, 789 Gines (rainha em potencial), 816-817 Girino. veja tambm Metamorfose de anfbios campo dos membros, 703-704 excreo de amnia, 735 Glndula mamria adolescente, 765 embrionria, 762-765 na gravidez e lactao, 765-768 Glndula paratireide, 380 Glndula pituitria, 380,786 gene Pit-1 e, 407 hormnio luteinizante e, 787 no ciclo menstrual, 871,872 Glndula salivar especificao em Drosophila, 585 protena BR-C e, 758-759 Glndula tireide, 380 Glndulas sebceas, 300 Glia de Bergmann, 273 Glicoprotenas extracelulares, 102-104 integrinas, 104-105 proteoglicanos, 90,100-102 Glicosaminoglicano (GAG), 100,345,685 Glicosiltransferases, 105 Globina, controle traducional da, 494-497 -globina, longevidade de mRNA, 475 Gloqudias, 178-179 Glutationa, 151,154 GM-CSF, 377 GnRH. veja Hormnio liberador de gonadotrofina Goldberg-Hogness box (seqncia TATA), 396 Gnadas desenvolvimento, 319,775-777 em heterocronia, 743 estgio indiferente, 775 fatores de transcrio dedo de zinco e, 420 hermafroditas, 853-855 Gonadotrofinas corinica, 247 na reiniciao da meiose ooctica, 875-876 no ciclo menstrual, 870,872-874 Gonadotrofos, 407 Gonadotropina corinica (hCG), 827 Gondios, 18 Gonium, 16 Gonocoristismo, 797 Gradientes adesivos, migrao de axnios, 314-315 Grnulos corticais, 127-128 exocitose, 143,144,146 na vitelognese, 862-863 Grnulos secretores, na formao da crnea, 672 Gravidez desenvolvimento mamrio na, 765-768 Gravidez ectpica, 186 Gravidez tubria, 186 Grex, 21,27-28 Grupo box de alta mobilidade (HMG), 779 Grupo de equivalncia, 186,690 Grupo terminal do gene, 557-559 Grupos parlogos, 638
GSK-3. veja Quinase 3 da sntese de glicognio gt. veja gene giant Guelras, na evoluo de vertebrados, 895-896 GVBD. veja Quebra da vescula germinativa Haliotis, 807 Haptotaxia, 314-315 Haste de conexo, 246 hb. veja gene hunchback HCG. veja Gonadotropina corinica Hlice-ala-hlice bsica (bHLH), 415-416 Helocidaris, 745 Hemangioblasto, 367-368 Hematopoiese, 374-377,378-380 Heme, na regulao da produo de hemoglobina, 494-496 Hemisfrio animal, 156 derivados, 224 destino de clulas no, 598 Hemisfrio ectodrmico apical, 714 Hemisfrio pigmentado animal, 229 Hemisfrio vegetal, 156 derivados, 224 Hemisfrios cerebrais, 266 Hemofilia B, mutaes C/EBP, 418 Hemoglobina adulta, 372 fetal, 372,437,440-441 na metamorfose de anfbios, 735 produo, 494-497 tipos, 437 Hemoglobina de Adulto, 437 Hemoglobina embrionria, 437 Hemoglobina fetal, 372,437,440-441 Hereditariedade, controle da, 35-37 Hermafroditismo, 795 determinao de clulas germinativas, 853-855 determinao de gametas e, 490-491 em Caenorhabditis, 795-797 em peixes, 797-798 protndrico, 797-798 protognico, 797 sncrnico, 797 Herpes, 853 Heterocromatina, 446 na meiose, 852 Heterocronia, 743-745,891 Heterogamia, 17 HGF. veja Fator de crescimento de hepatcitos hh. veja gene hedgehog Hialuronidase, 672 Hibridizao cidos nuclicos, 54-55 DNA, 58-59 Hibridizao do cido nuclico, 54-55 Hibridizao in situ, 63-64 Hibridoma, 89 Hidrocele, 744,745 Hidroxiecdisona genes Broad-complex e, 758-759 ligao ao DNA, 757-758 receptores, 758,759-761 20-hidroxiecdisona, 749,754-756 na diapausa, 813 na incorporao de protenas do vitelo, 870 HIM. veja Microambientes indutivos hematopoticos Himenptera, partenognese em, 861
Hiperestriato, 823 Hipoblasto, 189,220-221,690 de aves, 233-234,238 de mamferos, 243 primrio, 233 secundrio, 233 Hipometilao, 442 Hipotlamo, 268,319,786 comportamento sexual e, 787 no ciclo menstrual, 872 Hiptese da adeso diferencial, 86 Hiptese da afinidade diferencial de substrato, 99 Hiptese da cauda poli(A), 483-486 Hiptese da eficincia da traduo, 486 Hiptese da especificidade da adeso diferencial, 314-315 Hiptese da mensagem maternal mascarada, 482-483 Hiptese da quimioafinidade, 327-328 Hiptese da seleo clonal, 822 Hiptese das vias marcadas, 315-317 Hiptese do cdigo Hox, 637-647 Hiptese do sinal gradativo na induo da vulva, 691 Hipoxantina fosforibosiltransferase (HPRT), 89,448,450 Histoblastos, 748 Histocompatibilidade, antgenos principais, 248 Histonas, 5,124,399,431 acetilao, 436-437 na estrutura de nucleossomos, 432 HLH, fator de transcrio hlice-lao-hlice, 791 HNK-1, 239-240 hnRNA, 462 hnRNA-A1, 466 Holocomplexo, 441 Hom-C. veja Complexo hometico Homeobox, 576 Homeodomnio, 576 Homeose, induzida por cido retinico, 641 Homologia de membros e nadadeiras, 726-727 em genes hometicos, 637-638 em genes reguladores, 902-909 entre genes Hox e Hom-C, 905 nas vias de desenvolvimento, 727,909-911 Homlogos, 616 Homossexualidade, 787-788 Hormnio, 658,733. veja tambm Tipos especficos como fator de transcrio, 420-423 corinico, 247-248 da placenta, 247-248 em epfises, 357-358 estrgeno ambiental, 836-837 na determinao secundria do sexo, 775, 782-788 na estabilizao de mRNA, 476 na formao de ossos, 355 na metamorfose de anfbios, 735-743 na metamorfose de insetos, 749,754-761 na ovulao, 870 no desenvolvimento da glndula mamria, 762-768 Hormnio adrenocortocotrfico (ACTH), 407 Hormnio anti-duto Mlleriano (AMH), 775,784
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ndice de Assuntos
aromatase e, 799 ativao, 780 clulas de Sertoli e, 777 Hormnio da diapausa, 813 Hormnio da ecloso, 756 Hormnio desencadeador de ecdise, 756 Hormnio ecdisteroidognico ovariano (OEH), 808 Hormnio folculo estimulante (FSH) no ciclo menstrual, 870,872-874 na maturao de folculos, 875 Hormnio Juvenil, 754,755-756 na absoro da protena do vitelo, 870 na diapausa, 813 na partenognese, 811 no polifenismo nutricional, 816-817 Hormnio liberador de gonadotrofina (GnRH), 319 Hormnio luteinizante (LH), 319,787 na maturao folicular, 875 no ciclo menstrual, 870,872-874 Hormnio neurosecretrio do desenvolvimento do ovo (EDNH), 808 Hormnio protracicotrfico (PTTH), 754,755-756,813 Hormnios esterides como fatores de transcrio, 420-423 folculos e, 777 Hormnios glicocorticides, 420-424 Hormnios peptdicos, 754 Hormnios sexuais em epfises, 358 sistema nervoso central e, 785-788 HPFH. veja Persistncia hereditria da hemoglobina fetal HPRT. veja Hipoxantina fosforibosil-transferase HRI. veja Protena inibidora responsiva ao heme Humano anormalidades congnitas, 297,827-837 ciclo menstrual, 870-873 defeitos do tubo neural, 262-263 deficincia da protena TBX5, 722 desenvolvimento do cabelo, 300 determinao do sexo, 778-780,781,782-784 epfise, 357-358 espermatozide, 131,138,858 fatores de transcrio, 400-401 fertilizao, 132 formao do crebro, 265-269 fotoreceptores em neonatos, 282 gene Hoxd13, mutao de perda-de-funo, 710-711 gestao, 276 impresso gnica, 444-445 inteligncia, 276 morte celular programada, 783 mutaes das clulas da crista neural, 290 mutaes do gene patched, 660-661 mutaes EMX-2, 647 oognese, 860,870-876 placenta, 246 quimeras, 187 regulao do gene da globina, 440,441 sindactilia, 724-725 Hyalophora, 755,813 Hyla, 819-820 I-B, 414-415,582 iab. veja gene intra-abdominal
Ichthyostega, 726 Id. veja Inibidor da diferenciao Idade celular, na determinao de neurnios, 309 IFN. veja gene Interferon IGF-II. Veja Fator II de crescimento semelhante insulina ihh. veja gene indian hedgehog IL-3. veja Interleucina 3 IL-6. veja Interleucina 6 Ilhas de polinvaginao, 233 Ilhas de sangue, 367-369 Ilhota-1, 309 Imago, 748 IMZ. veja Zona marginal involutiva INAH. veja Ncleo intersticial do hipotlamo anterior Inativao do cromossomo X, 446-448 mecanismo, 449-450 Induo, 605. veja tambm Induo embrionria primria; Induo especfica de regio broto dos membros, 704 cascatas, 629,667 clula-para-clula, 687-693 cristalino, 667-672 definida, 48 especificidade gentica na, 666-667 mesodrmico, 606,609-612,614 modelo seqencial, 691 na ramificao epitelial, 683-687 negativa, 599-600 neural, 257,621-624,626-627,628 no desenvolvimento evolutivo, 886-887 recproca, 113-114,675-676 secundria, 628-629,655 Induo clula-a-clula. veja Induo Induo do cristalino base celular, 668-672 formao da crnea, 672 modelo do clice optico, 667-668 Induo embrionria primria, 603-605 atividade organizadora na, 613-621 base molecular, 609-612 centro de Nieuwkoop e, 606-609 especificidade regional, 621-628 Induo especfica de regio caudalizao neural, 624-626 determinao de diferenas regionais, 621-623 em interaes epitlio-mesnquima, 663-666 modelo de duplo gradiente, 623-624 Induo negativa, 599-600 Induo neural, 257 especificidade regional, 621-623 genes homeobox e, 628 modelo do gradiente duplo, 623-624 sinais planares e, 626-627 Induo recproca, 113-114, 675-676 Induo secundria, 628-629,655. veja tambm Interao proximal Inervao neurnio motor e, 313 sobrevida diferencial na, 331-334 Informosomos, 482 Ingresso, 209 na formao do hipoblasto, 220 no mesnquima primrio, 210 nos micrmeros do ourio-do-mar, 212-215 Inibio lateral, 311,691
Inibidor da diferenciao (Id), 415-416 Inibidor da metaloprotease (TIMP), 737 Iniciao, 472 Iniciador (primer), 55 Inositol 1,4,5-trifosfato (IP3), 112 na ativao do ovo, 147-149 na fuso de gametas, 149 na reao acrossmica, 138 Insetos. veja tambm Metamorfose de insetos clivagem, 192-195 diapausa, 812-813 evoluo, 907-909 oognese, 867-870 Instar, 747 Integrinas, 104-105 v1, 231 na fuso de mioblastos, 347 nas clulas-tronco epidrmicas, 298 transduo de sinais e, 112-113 Inteligncia, humano, 276 Intensificador de glicocorticide, 435-436 Intensificador negativo, 396 Intensificadores, 74,395-396,402-404 armadilha intensificadora, 418-419 no cncer, 418-419 responsivos a hormnios, 420-423 sinergismo e, 408-409 stios hipersensveis DNase I e, 435-436 Interao. veja tambm Interao proximal instrutiva, 655-656 permissiva, 656 Interao proximal, 655-656 competncia e, 656-657 epitlio-mesnquima, 663-667 fatores parcrinos, 657-663 na formao do dente, 682-683 na induo clula-para-clula, 687-693 na induo do cristalino, 667-672 na ramificao epitelial, 683-687 no desenvolvimento do rim, 673-681 Interaes clula-clula acaso e, 692-693 blastmeros e, 178 digesto, 106-107 polarizao da membrana e, 184 tipos, 80 Interaes epitlio-mesnquima, 663-667 Intercinese, 852 Interleucina 3 (IL-3), 377 Interleucina 6 (IL-6), 378 Interneurnios, 280 Intervalo da pr-replicao, no ciclo celular, 196 Intervalo pr-meitico, no ciclo celular, 96 Intestino simbiose do desenvolvimento e, 810 Intestino anterior, 235 Intestino primitivo, 216,380 ntrons, 392-394,466 Inv. veja gene inversion of embryonic turning Invaginao, 209 na gastrulao de Xenopus, 232 no arquntero do ourio-do-mar, 215-218 Invertebrados movimento axnico, 315-317 partenognese, 154-155 Involuo, 209 clulas da zona marginal e, 222-224 na gastrulao de anfbio, 229-231
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IA2 - 15
na gastrulao de Xenopus, 232 on hidrognio. veja pH Ionforo, clcio, 145-146,348 IP3. veja Inositol 1,4,5-trifosfato Ipsilateral, 825 IRE-BP. veja Protena ligante responsiva ao ferro ris, 284 aniridia, 827 Isocitrato desidrogenase, 347 Isogamia, 17 Isolamento reprodutivo, 901-902 Isolantes, 431,454 Istmo, 268-269 iv. veja gene situs inversus viscerum ix. veja gene intersex JAK quinases, 107-108, trajetria JAKSTAT, 107-108 Junes aderentes, 92 Junes em fenda, 97-99 em blastmeros, 178 em ocitos, 875 Keratella, 819 KGE. veja Fator de crescimento de queratincito kini. veja gene knirps Kr. veja gene Krppel lsc. veja gene lethal of scute lab. veja gene labial Lbio dorsal do blastporo, 222-224 na induo embrionria primria, 603-605 na iniciao da gastrulao, 602 sinais planares do, 627 Lactao, 765-768 Lactotrofos, 407 Lamina B1, 452 Lmina basal, 99 afinidade de micrmero, 212-214 Lmina extracelular, na blastocele do ouriodo-mar, 212-215 Lmina reticular, 99 Laminina, 103 formao de sinapse, 331 integrinas e, 104-105 migrao axnica, 314-315 migrao de axnios retinianos, 325,326 Lampsilis, 179 Lanternas, vaga-lume, 754 Lanugo, 300 Larvas colonizao, 806-808 controle traducional em, 490-493 em evoluo, 890 em taxonomia, 884 fatores ambientais e, 761-762 precoces, 196 segmentos, 559-561 Larvas Pluteus, 744-745,821 Larvas precoces, 196 L-CAM, 93 LCR. veja Regio controladora de loco LEF-1. veja Protena intensificadora de linfcito Lei de Murray, 367 Lei de Poiseuille, 367 Leptoteno, 851 Lesma marinha, colonizao larval, 807 Leucemia, induzida por translocao, 418-419 Levedo, gene cdc2, 198 LH. veja Hormnio luteinizante LIF. veja Fator inibidor da leucemia
Ligao homoflica, 94 Ligao homoflica, 94 Ligante, em co-evoluo, 901-902 Limnaea, 177-178 Linfcito. veja tambm Linfcitos B gerao, 374,375 via de diferenciao, 582 Linfcito B criao de genes de cadeia leve, 410-411 criao de genes de cadeia pesada, 411-412 fatores de transcrio, 412-415 hiptese de seleo clonal, 822 protenas-anticorpos e, 409 sntese de anticorpos monoclonais, 89-90 troca de classe, 411 Linfcito T, 410-411 Linfoma de Burkitt, 419 Linha primitiva, 234 acmulo celular na, 239-240 em mamferos, 244-245 formao, 234-235 migrao celular na, 235-238 organizador mamfero e, 636-637 Lipovitelina, 862 15-lipoxigenase (15-LOX), 497 Lisossomos, na metamorfose de anfbio, 736 LMC. veja Coluna motora lateral Lbulos, 684,685 Lordose, 786,787 15-LOX. veja 15-lipoxigenase Lula, simbiose de desenvolvimento na, 808, 809-810 Luteotropina, 874 Lymantia, 813 Lytechinus, 130 Macaco. veja Macaco Rhesus Macaco Rhesus, padronizao neuronial do sistema visual, 824-825 Macrocentrus, 196 Macrmero, 170 Malformaes, 827-828 Mamfero(s) gametas, 131-132 ativao do genoma embrionrio, 490 circulao embrionria, 370-371 clivagem, 180-188 clonagem, 45-46 colapsina em, 322 compactao em, 181-183 desenvolvimento da crista neural, 295 desenvolvimento da glndula mamria, 762-768 desenvolvimento do ouvido mdio, 894-896 determinao sexual, 774-788 eixo dorso-ventral, 647-650 eixo esquerdo-direito, 647-650 especificao do eixo ntero-posterior, 637-647 fechamento do tubo neural, 260,262 fertilizao, 135-139,153-154,180 gastrulao, 242-248 hemoglobina, 372 hiptese da cauda poli(A), 484 homologia do gene hometico, 637-638 inativao do cromossomo X, 446-450 induo embrionria primria em, 605 mapa do destino, 244 migrao da clula germinativa, 844-846
no-equivalncia de proncleos, 154-155 odontognese, 682 oognese, 870-876 organizador em, 636-637 origens dos tecidos, 242-245 padronizao neuronial do sistema visual, 824-826 preveno da polispermia, 146 reao do grnulo cortical em, 143-144 stios hematopoiticos, 379-380 Mandbula co-opo evolucionria e, 894-896 progresso correlacionada e, 896-897 Manduca, metamorfose, 753-754,756 Manto mesodrmico, 230 MAP. veja protena associada mitose Mapa de destino do disco da perna de Drosophila, 748 em aves, 234 mamferos, 244 peixes, 221 rombmeros, 267 salamandra, 222 Xenopus, 221,222 MAR. veja Regio associada matriz Mariposa chifruda do tabaco. veja Manduca Mariposas, oognese, 867-870 Marspio (bolsa de criao), 179 Massa celular interna, 182,185,186-188 Matria branca, 271 Matria cinzenta, 271 Matriz do cumulus, 131 Matriz extracelular, 99 colgeno, 99,100 crescimento axnico e, 313-319 glicoprotenas, 102-104 mesnquima metanefrognico e, 679 migrao da clula neural do tronco e, 287,290 na sntese da casena, 767 proteoglicanos, 99,100-102 ramificao do tubo epitelial e, 684-686 receptores celulares, 104-106 repulso especfica do cone de crescimento, 317-318 transduo de sinal e, 112-113 Matriz nuclear fixao da cromatina, 451-453 topoisomerases e, 453-454 MBT. veja Transio da blstula intermediria M-CSF. veja Fator estimulador de colnias de macrfagos Mecnica do desenvolvimento, 593 Medula espinhal leses, 334 migrao do neurnio comissural, 320 organizao embrionria, 271-272 Medula supra-renal, 284,293 Medula, organizao embrionria, 271-272 Medulla oblongata, 266 MEF2A, 351 Megoura, 811 Meiose, 13 em clulas germinativas primordiais, 850-852 reiniciao em ocitos, 864-865,875-876 Melanina, 280 Melancitos, 284 cabelo, 300 diferenciao, 293
IA2 - 16
ndice de Assuntos
migrao, 285-286 Meltrinas, 348 Membrana. veja tambm Potencial de membrana condutncia, 204 polarizao, 184 sntese, 203-204 Membrana basal, 99 Membrana celular. Veja Membrana plasmtica Membrana cloacal, 382 Membrana corioalantica, 361 Membrana plasmtica, 88,126. veja tambm Potencial da membrana interaes recprocas, 113-114 na fuso de gametas, 139-140 Membranas extraembrionrias, formao em mamferos, 245-248 Membro anterior, distinto do membro posterior, 722-723 Membro posterior, distinto do membro anterior, 722-723 Membro tetrpode diferena membro anterior/membro posterior, 722-723 eixo prximo-distal, 706-716 eixo ntero-posterior, 716-721 eixo dorso-ventral, 721-722 evoluo de, 726-727 formao do broto do membro, 702-706 formao dos dedos, 724-727 padro de formao em, 701-702 regenerao, 714-716 talidomida e, 830-833 Membros. veja tambm Broto dos membros; Membro tetrpode condrognese em, 722-723 evoluo, 904-905,908-909 genes reguladores homlogos e, 904-905 homologia s nadadeiras, 726-727 regenerao, 87-88,714-716 restrio morfogentica na formao, 898-899 talidomida e, 830-833 Memria, 826 Menidia, 818,821 Mensageiros secundrios, 112,147 Mercrio, como um teratgeno, 828 Merognias, 597 Mesencfalo, 266 determinao, 268-269 Mesnquima. veja tambm Mesnquima metanefrognico cabea, 341 crista ectodrmica apical e, 708,711,713 cultura de, 681 facial, 295 induo da ramificao epitelial, 683-687 ingresso na gastrulao em ourio-do-mar, 210-215 mamrio, 763-765 Mesnquima metanefrognico, 674 apoptose e, 677-679 converso em epitlio, 679-680 formao, 676-677 na induo recproca, 675-676 Mesnquima primrio, 210-215 induo negativa e, 600 Mesnquima secundrio, elongao do arquntero, 217-218 Mesoderma, 4. veja tambm Mesoderma
dorsal; Mesoderma da placa lateral de anfbios, 222-224,229-231,606-607 de aves, 235-238 de mamferos, 245 de vertebrados, 254 esplncnico, 358 formao em Xenopus, 229 induo especfica de regio, 665-666 induo, 606,609-612,614 involuo, 229-231 migrao, 230-231 modelagem em anfbios, 606-607 no segmentado, 343 protena Dorsal e, 583-585 regies, 341 zona de atividade polarizante, 716-717 Mesoderma da placa lateral, 341,358 na formao da membrana extra-embrionria, 359-361 no desenvolvimento de vasos sangneos, 366-373 no desenvolvimento do corao, 361-366 regies, 358 Mesoderma drmico, na metamorfose de anfbios, 738 Mesoderma dorsal desenvolvimento do osso, 351-358 diferenciao do msculo esqueltico, 347-351 formao de somitos, 343-344 gerao de tipos de somitos, 344-347 induo, 610-612 na organognese, 255 paraxial, 341,343 protena Noggin e, 617 Mesoderma dorsal somtico, 341 Mesoderma esplncnico, 358 Mesoderma intermedirio, 341 Mesoderma lateral, induo, 612 Mesoderma no segmentado, 343 Mesoderma Paraxial, 341,343 Mesoderma parietal, 358 Mesoderma posterior, induo, 612 Mesoderma precordal, 268 Mesoderma somtico, 358 Mesoderma ventral, induo, 612 Mesoderma ventrolateral, induo, 612 Mesoderma visceral, 358 Mesmero, 170 Mesonefros, 674 na induo do broto de membro, 704 talidomida e, 832 Metaloproteinase, 106-107,737 Metaloproteinases degradantes da matriz, 106-107 Metalotionena 1, 397-398 Metamorfose, 773-774 anfibios, 734-742 conceito de limiar, 739 heterocrnica e, 742-745 inseto, 746-762 Metamorfose de insetos atividade da hidroxiecdisona, 757-761 controle hormonal, 754-757 discos das asas, 750-753 discos imaginais, 746-753 fatores ambientais, 761-762 sistema nervoso, 753-754 Metamorfose em Anfbios,
conceito limiar, 739 degenerao da cauda, 735-738 heterocronia e, 743-744 hormnios da tireide e, 735-742 mudanas de comportamento, 740 mudanas morfolgicas gerais, 734-735 mudanas neuroniais, 739-740 Metamorfose hemimetbola, 746 Metamorfose holometbla, 746 Metanefros, 674 na induo recproca em, 676-681 Metaplasia, 40-41 Metaptergio, 726 Metazorios, 28-32 Metencfalo, 266 Metilao cap 5, 486-487 citosina, 422 DNA, 442-446 na inativao do cromossomo X, 450 5-metilcitosina, 442 Metotrexato, em anormalidades congnitas, 832-833 MGF. veja Fator da glndula mamria MHP. veja Ponto de articulao mediano Microambientes indutivos hematopoiticos (HIM), 377 Microespculas, 277 Microfilamentos em cunha celular, 260 em neurnios, 278 enrgides e, 194 na compactao, 184-185 na oognse merostica, 868 na vitelognese, 863 no anel contrtil, 201 no blastoderma celular, 193 ovo, 127 Microinjeo, 69 Micrmero, 170 na gastrulao do ourio-do-mar, 212-215 Micropinocitose, 862 Microtbulos em flagelos, 123 em microespculas, 277-278 enrgides e, 194 na cunha celular, 260 na epilobia, 220 na fuso nuclear de gametas, 153 na oognese merostica, 867-868 na sntese da membrana, 204 na vitelognese, 863 no blastoderma celular, 193 no rearranjo do ovo, 157,159 sulco de clivagem e, 202 Microvilosidades, 139,153 na compactao, 184-185 Mielencfalo, 266 Mieloma, 89 Mifepristona (RU486), 874 Migrao. veja Migrao celular Migrao celular afinidade diferencial de substrato e, 99 axnios e, 307,313-314,320-322 clulas cardacas presuntivas, 362-363 clulas da crista neural ceflica, 293-295 clulas da crista neural do tronco, 285-290 clulas do mesnquima primrio, 210-215
ndice de Assuntos
IA2 - 17
clulas germinativas, 843-850 fatores citoplasmticos, 209-210 fibronectina e, 103,204,230-231,240, 362-363 na gastrulao de Xenopus, 232 na linha primitiva das aves, 235-238 neurnios do cerebelo, 272-273 neurnios do crebro, 274-276 quimotaxia em, 320-322 Migrao de clulas germinativas em anfbios, 843-844 em aves e reptis, 848-849 em Drosophila, 849-850 em mamferos, 844-846 teratocarcinoma e, 847-848 Mioblasto, 347-348 determinao, 349-351 inibio do ciclo celular e, 350 metilao do gene e, 443-444 Miognese, 347-348,415-416 Miogenina, 349 Mitomo, 345-346 Miotubos, 347 MIS. veja Substncia inibidora Mlleriana Mitocndria herana materna, 152 na vitelognese, 863 Mitose, 5 mecanismos citoesquelticos, 201-203 MPF e, 197 no ciclo celular, 196 regulao, 198-201 Mixamebas, 21 MMC. veja Coluna motora medial Modelo de coordenadas cartesianas, primrdios dos rgos, 585 Modelo de induo seqencial, na induo vulvar, 691 Modelo de no-equivalncia, 691 Modelo operon, 47-48 Modelos de gradiente, informao posicional e, 551 Modularidade, no desenvolvimento, 891 Mola hidatidiforme, 154 Molculas da juno celular, 88,97-99 Molculas de adeso celular (CAM), 2425,92. veja tambm N-CAM blastmeros e, 174 caderinas e, 92-95 classes, 88 no fechamento do tubo neural, 263 sndrome alcolca fetal e, 834-835 superfamlia de imunoglobulinas e, 95-97 talidomida e, 831 transduo de sinais e, 112-113 Molculas de adeso da clula neural, 95 Molculas de adeso de substrato, 88 Molusco clivagem, 175-178 colonizao larval, 806-808 Molusco bivalve Hiptese da mensagem materna mascarada, 482 mRNA de ocito armazenado, 477 Monospermia, 140 Morfognese, 2 afinidade celular diferencial na, 80,82-88 em Acetabularia, 6-10
na formao dos membros em tetrpodes e, 701-702 no dente de mamfero, 682 no rim, 673-676 problemas na, 79-80 processos celulares e, 80 Morfognese do desenvolvimento. veja Morfognese Morfologia, no desenvolvimento, 647 Morte. veja tambm Morte celular Morte celular. veja tambm Apoptose em metamorfose de anfbio, 735-739 na formao de dedos, 724-727 neurnios e, 331-334 Mrulas, 173-174,182 Mosca boss, 688-690 Mosca bride of sevenless (boss), 688-690 Mosca preta, colonizao larval, 808 Mosca rough (ro), 688-690 Mosca sevenless (sev), 688-690 Mosquitos, refeies de sangue, 808 Movimento celular. veja tambm Tipos especficos fatores citoplasmticos, 209-210 na linha primitiva das aves, 235-238,239-240 no arquntero de anfbios, 226-229 tipos, 209 transio da blastula intermediria (MBT), 218-220 MPF. veja Fator promotor da maturao MRF4, 349 mRNA. veja tambm mRNA de ocitos anlise com bibliotecas de cDNA, 61-63 degradao seletiva, 475-476 em Acetabularia, 9 longevidade diferencial, 474-476 na determinao do sexo em Drosophila, 791-794 na metamorfose, 740-742 ovo, 125 protenas mascaradas, 482-483 reao em cadeia da polimerase e, 66,68-69 mRNA do ocito caracterizao, 477-479 de anfbios, 865-867 na determinao dos eixos, 480-481 na transio para o genoma embrionrio, 488-490 regulao da traduo, 481-487 sem cap, 486-487 seqestrado, 487 Mucopolissacardeos, 143 Muda, 746-748 hidroxiecdisona e, 754-755 hormnio juvenil e, 756 imaginal, 747-748 Muda imaginal, 747-748 Msculo. veja tambm Miognese compromisso celular, 349-351 diferenciao, 347-348 formao de sinapses, 331 inervao, 323-325 precursores, 345-346 Msculo epaxial, 346 Msculo esqueltico, diferenciao, 347-348 Msculo hipaxial, 346 Msculos dos membros inervao, 323-325
precursores, 345 Msculos vertebrais, precursores, 345-346 Mutao eudiplopodia, 713 Mutao polydactylous, 711,713 Mutante limbless, 705,713,724 MyoD. veja Protena 1 determinante do mioblasto Myrmica, 817 N-acetilglucosamina na zona pelcida, 137 nos grnulos corticais, 144 NAD+ quinase, 150 Nadadeiras, homologia aos membros, 726-727 NADPH, 150-151 Naegleria, 10-11 centro organizador posterior e, 556-557 na determinao do eixo ntero-posterior, 480-481,548-550 Nanismo, 658 N-caderina, 94,287-288 em somitmeros, 344 na condrognese, 353 no fechamento do tubo neural, 263 N-CAM, 95 migrao de axnios retinianos, 325-326 na condrognese, 353 na emenda alternativa do RNA, 467 nd. veja Gene nudel Nefro, 674,675-676,680-681 Nematide. veja tambm Caenorhabditis hermafroditismo, 795-797 migrao axnica, 320 mRNA de ocitos e determinao de eixo, 481 RNA antisenso em, 491-492 Nemoria, 814,819 Neotenia, 743 Nervo ptico, 280 Netrin-1, 320,321 Netrin-2, 320 Neuralizao. veja tambm Induo neural organizador na, 621 protena Noggin e, 616-617 Neuroblastos, 272,310-312,585 Neuroepitlio, 265 germinativo, 270-271 Neurognese, 307 Neurmeros, 647 Neurnio. veja tambm Axnio apoptose e, 331-334 axnios e, 276-279 dendritos e, 276 especificidade, 312-313 fatores neurotrficos, 331-334 formao, 270-272 hiptese da quimoafinidade, 327-328 identidade laminar, 274-275 interao com a glia, 273 na metamorfose de anfbios, 739-740 na metamorfose de insetos, 753-754 na organizao do cerebelo, 272-273 na organizao do crebro, 274-276 na regenerao do membro, 715 na trajetria visual, 824-826 precursores, 276 respostas ao aprendizado, 823-826 retiniano, 280-282 talidomida e, 831 tipos, 276-279,280-281
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ndice de Assuntos
Neurnio simptico, competncia, 656 Neurnios adrenrgicos, 291 Neurnios amcrinos, 281 Neurnios colinrgicos, 291,292-293 Neurnios comissurais, 320 Neurnios horizontais, 281 Neurnios motores determinao, 308-309 em vertebrados, 323-325 especificao em Drosophila, 310-312 especificidade de direo, 309-310 inervao, 313 pools, 309 sinais de mltiplo direcionamento, 323-325 Neurnios olfatrios, 319 Neurnios Purkinje, 272,273 Neurnios sensoriais, 286 Neurnios simpticos, 286 Neuropatias perifricas, 334 Neurporo, 262 Neurporo anterior, 262 Neurporo posterior, 262 Neurotransmissores, 278-279 Neurotrofina 3 (NT- 3), 332,347 Nurula, 254 na evoluo de planos corporais, 901 Neurulao, 254-255 primria, 255-264 secundria, 255,264-265 Neurulao primria, 255 ectoderma e, 255-257 fechamento do tubo neural, 260-264 mecansmo, 257 placa neural e, 257-260 Neurulao secundria, 255,264-265 NFB, 582,414-415 NF-mNR, 454 NF-E2, 440 NGF. veja Fator de crescimento de nervos NGFR. veja Receptor do fator de crescimento de nervos Nicotina, como teratgeno, 828 NIMZ. veja Clulas da zona marginal no involutiva Ninfa, 746 N de esmalte, 682 Ndulo de Hensen, 234,240,244,362 na assimetria esquerda-direita, 648-649 na especificao do campo dos membros, 703 na formao do tubo neural, 258,259 na induo embrionria primria, 605 organizador mamfero e, 636,637 Ndulo primitivo, 234 Norepinefrina, 279,291 Norma de reao, 614 Notocorda, 222 de aves, 236,237,240-241 em mamferos, 244 formao, 259 interao instrutiva e, 655 na determinao de neurnios, 308 na padronizao do crebro, 268 ncleos pulposos, vestgios da notocorda, 346 primrdios em peixes, 221 protena Noggin e, 616-617 sonic hedgehog e, 618 NPM-1. veja Protena 1 da matriz nuclear nRNA, 462-465
NT-3. veja Neurotrofina-3 Ncleo do zigoto, 153-154 Ncleo geniculado lateral, 824-825 Ncleo intersticial do hipotlamo anterior (INAH), 787-788 Ncleo, protena dorsal e, 578-580 Ncleos pulposos, 346 Ncleos, neuroniais, 272 Nucleossomo, 5,431 complexos de ruptura, 436-437 em stios hipersensveis DNase-1, 435 estrutura, 431 inibio da transcrio, 431-432 metilao, 444 na inativao do cromossomo X, 450 ruptura nas regies promotoras, 433 Nudibrnquios, colonizao larval, 807-808 NURF. veja Fator de remodelagem do nucleossomo Obturador do vitelo, 224 Oct1, 406 Oct2, 406,414,415 Oct4, 486 Octa box (seqncia), 406,412 Octopamina, 279 Odontoblastos, 682 Odontognese, 682 OEH. veja Hormnio ecdisteroidognico ovariano Olho. veja tambm Induo do cristalino diferenciao da crnea, 283-283 diferenciao do cristalino, 280-282 diferenciao neural da retina, 280-282 dinmica do desenvolvimento, 279-280 fator de crescimento da cmara anterior e, 672 genes reguladores homlogos e, 902-903 na metamorfose de anfbios, 739-740 padronizao neuronial, 824-826 regenerao em salamandras, 40-41 Oligodendrcitos, 278 Omatdio, 688 Oncogene, 418 Ocito, 125. veja tambm vulo; mRNA do ocito; oognese determinao axial em, 480-481,546-547, 554,869 gene ZP3, 74-75 maturao em anfbios, 861-864 potencial da membrana e, 141-142 primrio, 860 secundrio, 861 trmino da meiose em, 864-865,875-876 transcrio em, 865-867 translocao da protena dorsal, 578-581 Ocito primrio, 860 Ocito secundrio, 861 Oogamia, 17 Oognese, 860-861 concluso da meiose em, 864-865,875-876 em anfbios, 861-864 em mamferos, 870-876 na determinao dos eixos, 869 partenogentica, 861 transcrio de genes em, 865-867 Oognese merostica, 867-870 Oognia, 860 Opsina, 735 Organismos amonotlicos, 735
Organismos transgnicos experimentos com, 70-73 tcnicas, 69-70 Organismos ureotlicos, 735 Organizador, 605 centro de Nieuwkoop e, 613 em mamferos, 636-637 fatores de transcrio e, 619-620 induo especfica de regio e, 621-623 mapa de destino do, 613 na neuralizao, 621 propriedades, 613 protenas difusveis e, 613-619 sinais planares do, 626-627 Organizador Spemann-Mangold, 606-609 Organognese, 4-5,255 rim, 676-681 rgo primordial, modelo cartesiano coordenado, 585 rgo vomeronasal, 319 rgos. veja rgos parenquimatosos rgos endcrinos, crion, 247-248 rgos parenquimatosos desenvolvimento do rim, 673-681 mecanismos de ramificao nos, 683-687 Oscilina, 149 Ossificao endocondral, 351,352-356 Ossificao intramembranosa, 351-352 Ossificao, 351-356 Osso. veja tambm Esqueleto crescimento de vasos sangneos, 370 desenvolvimento, 351-358 medula, 377 Osso alisfenide, 902 Osso bigorna, 895,906 Osso hiomandibular, 895 Osso martelo, 895 Ossos longos, formao, 353-356 Osteoblasto, 352,355 Ostecito, 352 Osteoclasto, 356 desenvolvimento, 377-378 Osteognese, 351-358 Osteonectina, 682 Osteoporose, na ps-menopausa, 377-378 otd. veja Gene orthodenticle Ourio-do-mar ativao do ovo, 149-152 ativo do genoma embrionrio, 489 atrao do espermatozide, 129 blstula, 172-173 clivagem, 170-173 coevoluo em, 901-902 descoberta da fertilizao em, 122 desenvolvimento em mosaico, 597 destino celular, 598 experimentos de isolamento em, 594-596 experimentos de reagregao em, 83-84 formao da boca, 218 formao da espcula, 214-215 formao do nus, 218 fuso de gametas, 139-140,152-154 gastrulao, 210-218 induo negativa, 600 mRNA seqestrado do ocito, 487 mRNAs especficos do endoderma, 61-63 ondas de clcio, 144-145 plasticidade fenotpica, 821
ndice de Assuntos
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preveno da polispermia, 140-144 processamento de RNA em, 465 prognese e, 744-745 reao acrossmica, 130 reconhecimento de gametas, 132-135 seleo de RNA nuclear em, 462 Ouvido desenvolvimento, 295 evoluo em mamferos, 894-896 Ouvido mdio, 380 evoluo, 894-896 Ovrio desenvolvimento, 777,781-782 no ciclo menstrual, 872 Oviduto, 180,784 translocao de espermatozide, 131-132 Ovo amnitico, 31 Ovo centrolcito, 169 Ovo isolcito, 169 Ovo mesolcito, 169 Ovo telolcito, 169 Ovos, 777 Ovothiol, 151 Ovulao, 864,870-873 vulo, 125,693 merostico, 867 quimiotaxia, 132 vulo. veja tambm Ocito; oognese ativao metablica, 147-152 atrao do espermatozide, 128-129 aves, 189 clara, 189 contedos citoplasmticos, 125-126 determinao em hermafroditas, 853-855 distribuio do vitelo, 168-169 eixo vegetal-animal, 862 estrutura, 126-128 formao, 359-361 fragmentos, 597 fuso com espermatozide, 139-140 hemisfrios, 156 impresso gnica no, 444-445 polaridade, 224-226 preveno da polispermia, 140-146 prognese e, 745 proncleo, 152-154 protena, 125 quimiotaxia e, 132 reao acrossmica e, 129-130 reao granular cortical no, 143-144 rotao citoplasmtica, 156-159,224-226,607 simbiose desenvolvimental e, 808-810 tipos, 169 p21, 350 p34, 198 p53, 424 p56cdc13, 199 Pncreas, 382-383 expresso gnica no, 403 ramificao no, 683-684 Papila drmica, 300 Paquiteno, 851 Paramcios, conjugao, 12 Parasegmentos, 559-561,566 Parazoa, 29 Partenognese, 154-155,810-811,861 Pato expresso de BMP4, 904-905
formao digital, 724-725 Pax6, 282,672 pb. veja gene proboscipedia pbx. veja gene posterobithorax P-caderina, 93 PCBs, 836 PCR. veja Reao de polimerase em cadeia PDGF. veja Fator de crescimento derivado das plaquetas Pednculo, 21 Pednculos pticos, 280 Peixe zebra clivagem, 189-192 desenvolvimento do corao, 191-192 especificidade do axnio, 317 gastrulao, 218-221 mapa do destino, 221 Peixes centro de Nieuwkoop em, 635-636 clivagem, 189-192 determinao do sexo, 818-819 hermafroditismo, 797-798 neurulao, 255 rins, 673 Peixes telesteos, 635-636 Pele, induo especfica de regio, 663-664 Penas, desenvolvimento, 97 Pnis, 783 Pepino marinho, clivagem, 169-170 Peptdeo ativador de espermatozde, 129 Periderma, 191,297 Periodicidade, embrio de Drosophila, 546 Perodo de susceptibilidade, 830 Peristeo, 352 Peromelia, 830 Peroxidase, na reao do grnulo cortical, 143 Persistncia hereditria da hemoglobina fetal (HPFH), 440-441 Pesticidas, anormalidades congnitas e, 836-837 PGC. veja Clulas germinativas promordiais PH na ativao do ovo, 151-152 no controle da traduo do mRNA do ocito, 486 PH-20, 138-139 Pharynx, 380 Pheidole, 817 Pieris, 815 Pikaia, 887-888 Pilus sexual, 12 Pinto assimetria direita-esquerda, 648 centro de Nieuwkoop em, 636 crista neural, 286-287,288-289,293,295-296 especificidade de axnio retiniano, 328-331 expanso do volume cerebral, 267 expresso de BMP4, 904-905 expresso de MyoD, 350-351 fechamento do tubo neural, 261-262 formao da placa do assoalho neural, 258-259 formao de dedos, 724-725 fuso mioblstica, 347 induo regional especfica em, 664 mutaes no desenvolvimento dos membros, 705,711,713 neurnios motores, 309,324-325 neurulao secundria, 264-265 osteognese, 355
progresso correlacionada em, 896-897 quimeras, 258-259,666-667 RNA antisenso em, 492 sistema circulatrio, 363,367-368,370-371 stios hematopoiticos, 378-379 Pip. veja gene pipe PIP2. veja Fosfatidilinositol 4,5-bifosfato Pit-1, 406-409 PKA. veja Protena quinase dependente de cAMP PKC. veja Protena quinase C Placa do assoalho neural formao, 258-259 na determinao neuronial, 308-309 Placa neural, 257 formao, 257-258 formato e dobramento, 259-260 na induo do cristalino, 669-670 na neurulao primria, 257-260 Placa oral, 380 Placa segmental, 343 Placa vegetativa, 210,215-218 Placas do crescimento epifisrio, 354 nas anormalidades do esqueleto, 357-358 Placenta, 169,182 circulao e troca de nutrientes, 246-247 contato, 246 crescimento de vasos sangineos, 370 formao, 242,246 inibio da resposta imune, 248 produo de hormnio, 247-248 Placenta decdua, 246 Placdios, 279-280 Placdios auditvos, 279 Placodios do cristalino, 280 Placodios ectodrmicos cranianos, 279 Placides olfatrios, 279 Plano corporal alometria e, 891-893 Drosophila, 545-546 na evoluo, 887-890,901 Plantas clonagem, 46-47 genes homeobox, 647 precocenos, 762 Plaquetas do vitelo, 862 Plasmas, coloridos, 179-180 Plasmdeo, clonagem de genes, 56-57 Plasticidade fenotpica, 813-818,820-821 Plsticos, estrgenos ambientais em, 836 Platelmintos turbelrios, clivagem, 175 Platelmintos, predadores da mosca preta, 808 Pleodorina, 16-17 Plexo, 324 PLF. veja Proliferina Pluriblasto, 186 Pluripotncia. veja tambm Potncia nas clulas da crista neural do tronco, 291-292 nas clulas somticas, 43-45 nas clulas-tronco da epiderme, 300 p-nonilfenol, 836 Polaridade. veja tambm Eixos; Regulao da polaridade desenvolvimento do corao, 365-366 especificao em anfbios, 607-609 nos discos imaginais, 751 ovo, 224-226 Poliadenilao. veja tambm Cauda poli(A)
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ndice de Assuntos
elemento de poliadenilao citoplasmtico, 484 no controle da traduo do mRNA de ocitos, 485-486 Poliembrionrio, 195-196 Poliespenia, 366 Poliespermia, 140 bloqueio lento, 142-144 bloqueio rpido, 141-142 preveno em mamferos, 146 Polifenismo, 813 em borboletas, 814-815 induzido por predadores, 819-820 nutricional, 816-817 Polifenismo induzido por predador, 819-820 Polifenismo nutricional, 816-817 Poligerme, 195 Polissomo, 474 Plo animal, 168,479 Plo vegetal, 168,479 Poluio, efeitos teratognicos, 828,835,836-837 Ponto mediano de articulao (MHP), 259-260 Pontos de articulao dorsolaterais (DLHPs), 260 Pools neuroniais, 309 Porco, placenta, 246 Porfiropsina, 735 Porfero, padres de desenvolvimento, 29-30 Potssio neurnios e, 786 ocitos e, 141-142 Potncia. veja tambm Pluripotncia massa celular interna e, 186-188 nas clulas da crista neural ceflica, 295-296 nas clulas da crista neural do tronco, 291-292 no desenvolvimento evolucionrio, 886-887 nuclear, 42-43 prospectiva, 595,602-603 restrio, 598-600 Potncia nuclear, restrio, 42-43 Potncia prospectiva, 595,602-603 Potencial de membrana em embrio de aves, 238 em ocitos, 141-142 em repouso, 142 na capacitao de espermatozide, 132 Potencial de repouso da membrana, 142 pp39mos, 864,876 Precis, 907,908 Precocenes, 762 Prmio Nobel, 548,600 Primeiro corpo polar, 861 Proacrosina, 138 Probscide, em Bonellia, 799-800 Procariotos, 5-6 Processamento diferencial do RNA emenda alternativa e, 465-471 gene Sex-lethal e, 791-792 na determinao do sexo em Drosophila, 468-471 na expresso gnica, 471 no desenvolvimento, 461 seleo de RNA nuclear em, 462-465 Processo acrossmico, 123,129-130 Processo da cabea, 236,237 Processo facial
desenvolvimento, 293-296 sndrome alcolica fetal e, 834 Processo frontonasal, 295 Sndrome alcolica fetal e, 834 Proeritroblasto, 375 Prognese, 743-745 Progesterona, 874 na meiose do ocito, 864 placentria, 247 Progresso correlacionada, 896-897 Projeo retinocortical, 824 Projeo retinotectal, 327 Projees ipsilaterais, 740 Prolactina na metamorfose de anfbios, 736,742 na sntese da casena, 476,766-767 Proliferina (PLF), 370 Promotores, 74,394-395 em genes pair-rule, 564 estrutura, 396 falta de elementos TATA, 401 funo, 397-398 metilao, 442-443 ruptura de nucleossomos nos, 433 sinergismo e, 408-409 uso em produtos farmacuticos, 398 Proncleo, 152-154 mRNA seqestrado e, 487 no equivalncia em mamferos, 154-155 Proncleo feminno, 152-154 Proncleo masculino, 152-154 Pr-pernas, 907,908-909 Prosencfalo, 266 determinao, 268-269 sndrome alcolica fetal e, 834 Prosmeros, 268 Prostaglandina, no ciclo menstrual, 873 Prstata, 783 Protaminas, 154 Protease, acrosina, 138 Protease, na reao do grnulo cortical, 143 Protena. veja tambm Tipos especficos como fatores de crescimento, 102 gradientes, 551 junes de fendas e, 97-99 na adeso espermatozide-zona, 136-138 ovo, 125 sntese, 151-152,426,472-476 Protena Antennapedia, homeodomnio, 576 Apterous, 752-753 Armadillo, 566 associada mitose (MAP), 109 ativadora de GTP-ase (GAP), 108-109 BF2, 681 Bicoid, 401,405,546 Brachyury, 637 Broad-Complex, 758-759 Bruno, 869 cactus, 581-582 cap ligante (eIF4E), 472 Caudal, 481,546 Cerberus, 618-619 Chordin, 308,614,616,617,619,624 c-mos, 864 c-Myc, 418-419 1 comutadora dorsal (DSP1), 584 CPEB, 485
c-Ret, 677 1 da matriz nuclear (NMP-1), 452,454 da superfamlia TGF-, 610,661-662 Daughterless, 791 Decapentaplegic, 310,585,616,662 1 determinante do mioblasto (MyoD), 346,349-351 D-Frizzled-2, 566 Disheveled, 566 Distal-less, na determinao do disco imaginal, 750 Dorsal, 577,585 Dorsalin, 661 Doublesex, 404 E12, 415 E47, 415 E74A, 761 E74B, 760-761 Engrailed, 330-331,566 Even-skipped, 564 Extradenticle, 577 F, 140 FEM, 796 FEM-3, 491 Flectina, 648,649 FRGY2, 483 FTZ-F1, 761 Fushi tarazu, 565,566,572,576 G, 108 G heteromrica, 112 G trimrica, 147 Gastrulation-defective, 581 Giant, 564 GLP-1, 481 Goosecoid, 614,619-620,636,637 Gurken, 554,869 HA, 140 Hedgehog, 114,556-568,659 HER-1, 796 Hialina, 128,143 HNF3, 636,637 Hoxb-8, 721 Hunchback, 546,572 inibidora responsiva ao heme (HIR), 495 intensificadora de linfcito (LEF-1), 423 Krox-20, 420 Krppel, 420,572 L1, 834-835 ligante da seqncia TATA (TBP), 399-401 ligante de galactose, 136-137 ligante de metil-CpG, 444 ligante do intensificador CCAAT (C/EBP), 417-418 ligante responsiva ao ferro (IRE-BP), 492 Lim-1, 636,637 Mad, 418 Mei-S332, 852 Mix 1, 614 morfogentica do osso (BMP), 264, 293, 352,662 morfogentica 2 do osso (BMP2), 682 morfogentica 3 do osso (BMP3), 682 morfogentica 4 do osso (BMP4), 264,308,616,662 morfogentica 7 do osso (BMP7), 264,617 morfogentica 8B do Osso (BMP8B), 858 Myf5, 346,349 Nanos, 546
ndice de Assuntos
IA2 - 21
Nodal, 662 Noggin, 308,614,616-617,619,624 Notch, 311,416 Nudel, 581 Odd-skipped, 566 Oskar, 480,869 OZ1, 488-489 Pax2, 679-680 PBX1, 577 Pelle, 581-582 Pipe, 581 Pumilio, 550-556 quinase C (PKC), 147 quinase dependente de cAMP (PKA), 490,869 Rad51, 852 Radical fringe, 705-706 Raf, 109 relacionada Proliferina (PRP), 370 repressora Mad-Max, 418 RGD, 627 Sex comb reduced, 577 Sexual indutiva, em Volvox, 20-21 Short-gastrulation (Sog), 310,616 Slug, 287 Smaug, 480 Snail, 583-584,585 Sonic hedgehog, 264,268,346,618,659,702 Sptzle, 581 SRY, 780-782 Syndecan, 679 Toll, 581-582 Torso, 557 Torsolike, 558 TRA-1, 797 TRA-2, 490-491,793,796 Twist, 350,583-584 Ultrabithorax, 573,576,577 UNC-6, 320-321 Vg1, 610-612,619,636 Vox, 614 Windbeutel, 581 Wingless (Wg), 114,566,568 Wnt7a, 702,722 WT-1, 420,424,676 Xnot2, 614 XOL-1, 796 Xom, 614 Xvent-1, 614 Zeste, 566 Protena Bicoid, 401,405,546 centro organizador do anterior e, 552-556 determinao do eixo, 480-481,548-550 genes terminais e, 558 homeodomnio, 576 na ativao do gene gap, 561 na regulao do gene pair-rule, 564 Protena Caudal, 481,546 centro de organizao posterior e, 550, 556-557 homeodomnio, 576 na ativao do gene gap, 562 Protena Decapentaplegic, 310,585,616,662 na determinao dos discos imaginais, 750, 751,752-753 na formao de fotoreceptores, 688 Protena Dorsal, 577,585 gradiente, 581-585
mapa do destino de Drosophila e, 582-585 sinalizao assimtrica e, 578-581 translocao, 577-578 Protena Doublesex, 404 na absoro de protenas vitelnicas, 870 nas cascatas da determinao do sexo, 794-795 Protena G em colonizao de larvas, 807-808 heteromrica, 112 na reao acrossmica, 137 produo de IP3 e, 147-149 protena Ras G, 108-109 receptor, 147-149 trimrica, 147 Protena Hedgehog, 114,556-568,659 na determinao dos discos imaginais, 751,752 na formao do fotoreceptor, 688 nas trajetrias desenvolvimentais homlogas, 727 Protena Hunchback, 546,572 centro organizador anterior e, 555-556 distribuio, 564 na ativao dos genes gap, 561-563 na determinao do eixo ntero-posterior, 480-481,550 na regulao dos genes pair-rule, 564 Protena Krppel, 420,572 atividade dependente de contexto, 424 distribuio, 564 na regulao dos genes pair-rule, 564 Protena L1, sndrome lcolica fetal e, 834835 Protena morfogentica 2 do osso (BMP2) na odontognese, 682 na polarizao dos membros, 719,721 Protena morfogentica 4 do osso (BMP4), 264,308,616,662 na apoptose dos membros, 725 na evoluo, 904-905 na formao muscular, 346,347 na induo mesodrmica, 612,614 na odontognese, 682 Protena morfogentica 7 do osso (BMP7), 264,617 na odontognese, 682 na organognese renal, 678 Protena Nanos, 546 centro organizador posterior e, 556-557 na determinao do eixo ntero-posterior, 480-481,548-550 Protena Nodal, 662 de mamferos, 636,637 na assimetria esquerda-direita, 649 Protena quinase C (PKC), 147 na compactao, 184 na neutralizao, 621 Protena quinase dependente de cAMP (PKA), 490,869 na capacitao de espermatozide, 132 na diferenciao de Dictyostelium, 28 Protena Sonic hedgehog, 264,268,346,618,659,702 na assimetria esquerda-direita, 649 na especificao do neurnio motor, 308-309 na evoluo, 726-727 na induo especfica da regio, 665 na polarizao dos membros, 718-721,722
na ramificao epitelial, 687 Protena Wingless (Wg), 114,566,568 na determinao do disco imaginal, 750, 751,752-753 Protenas de adeso espermatozide-zona, 136-138 Delta, 311 do homeodomnio, 405,576-577 dobradoras de DNA, 423 Fertilinas, 140 Fibropelinas, 216 Fusognicas, 140 Gap, 583 LIM, 309-310 LIN, 491,690-691,692 Mascaradas, 482 Miognicas bHLH, 349,351 Msx, 682 Polycomb, 572 Smad, 661-662 Transformadoras, 794 Trithorax, 572 Protenas Gap, controle dos genes pair-rule, 563-565 Protenas Hometicas, genes realizadores e, 572-573 Protenas mascaradas, mRNA de ocitos e, 482-483 Protenas transformadoras, na determinao do sexo em Drosophila, 794 Proteoglicanos na camada hialina, 216 na migrao do mesnquima primrio, 214 Proteoglicanos de sulfato de condroitina, 216 Proteoglicanos sulfatados, migrao do mesnquima primrio, 214 Protistas. veja tambm Eucariotos unicelulares como teratgenos, 835 Protostomatas, 30 na ativao do ovo, 149 padres do desenvolvimento, 30-32 PRP. veja Protena relacionada proliferina Pseudoplasmdio, 21 Psorase, 299 PTTH. veja Hormnio protracicotrfico pUC18, 56 Pulmes, 383 Pupa, 747 em diapausa, 813 na Drosophila, 757 Puprio, 757 Pycnoscelus, 861 Pyrrhocoris, 761-762 Quebra da vescula germinativa (GVBD), 864 Queratina, 297-299 Quiasma ptico, 326,825 Quiasmata, 852 Quilha neural, 221 Quimeras camundongo, 70-73, 187-188,347,666-667 e especificidade gentica da induo, 666-667 humanas, 187 pinto, 258-259,666-667 saco vitelnico, 378-379 Quimiorepulso na especificidade axnica da retina, 328-331
IA2 - 22
ndice de Assuntos
na migrao axnica, 321-322 Quimiotaxia, 22 na fertilizao, 128-129,132 na migrao axnica, 320-322 Quimotripsina, 403 Quinase. veja tambm Tipos especficos famlia JAK, 107-108 Quinase 3 da sntese de glicognio (GSK-3), 609-610 Quinase II dependente de calmodulina, 864 Quinase dependente de ciclina, 198,200,864 Quinase do fator promotor de maturao, 199 Quinases do receptor Eph, 328-331 Quinina, como um teratgeno, 828 RA. veja cido retinico Radiao, como um teratgenio, 835 Radiata, 30 RAGS. veja Sinais de direcionamento repulsivos aos axnios Ramificao, em rgos parenquimatosos, 683-687 Rana. veja tambm Sapo crescente cinzento, 156-157 induo do cristalino, 667-668 oognese, 861-862 potncia nuclear, 42-43 RAR. veja Receptor do cido retinico Rato comportamento especfico do sexo, 786,787 funes de promotores no, 397-398 respostas neuroniais ao aprendizado, 824 Rato canguru, evoluo e, 892-893 Reao acrossmica, 129-130,131,138 Reao de polimerase em cadeia (PCR), 66,68-69 Reao do grnulo cortical, 143-144 clcio e, 144-146 Receptor IIa da activina (cActRIIa), 648-649 Receptor da ecdisona (EcR), 758,759-761 Receptor da endotelina-B, 290 Receptor da Transferina, 492 Receptor de bindina, 135 Receptor do cido retinico (RAR), 829 Receptor 1 do fator de crescimento de fibroblsticos de Xenopus (XFGFR1), 428 Receptor 3 do fator de crescimento fibroblstico (FGFR3), 110 Receptor do fator de crescimento do nervo (NGFR), 680-681 Receptor do hormnio da tireide (TR), 714 Receptor GNDF, 677 Receptor relacionado protena G, 147-149 Receptor retinide (RX), 741 Receptor tirosina quinase (RTK), 108 migrao de clulas da crista neural, 289 Produo de IP3, 148-149 Receptor tirosina quinase Ret, 290 Receptores veja tambm Tipos especficos na co-evoluo, 901-902 na determinao de competncia, 656-657 Receptores celulares. veja tambm Tipos especficos glicosiltransferases, 105-106 integrinas, 104-105 matriz extracelular e, 104-106 serpentina, 112 vias de transduo de sinais e, 107-114
Receptores do fator de crescimento hematopoitico, 377 Receptores serpentina, 112 Recombinases, 411-412 Rede testicular (rete testis), 777 Refeies de sangue, 808 Regenerao membro, 87-88,714-716 no tecido neural, 315 olho, 40-41 Regenerao neural, 315 Regio 3 no traduzida (3UTR), 392,475 hiptese da cauda poli(A), 483-484 na determinao de gametas de nematide, 490-491 no RNA de ocitos, 480-481 Regio AGM, 379 Regio associada matriz (MAR), 431,452-453 Regio controladora de loco (LCR), 431,437-441 stios hipersensveis DNase-1, 440-441 trans-reguladores e, 439 trocas de globina e, 441 Regio mesodrmica intermediria, 358 Regio promotora, 392 Regras da construo morfogentica, 898-899 Regulao, 24 da expresso gnica. veja Transcrio; Fatores de transcrio embrio, 186-188 no desenvolvimento de anfbios, 600-605 Regulao ambiental agentes teratognicos e, 828-835,837 assimilao gentica e, 821-822 estrgenos ambientais e, 835-837 na determinao do sexo, 817-818 na diapausa, 812-813 na embriologia histrica, 805-806 nas defesas induzidas por predadores, 819-820 nas malformaes, 827-828 no aprendizado e, 823-826 para completar o desenvolvimento, 806-813 plasticidade fenotpica e, 813-818,820-821 sazonalidade, 810-812 sistema imune e, 822 Regulao da polaridade citoplasma do ocito e, 546-547 gradientes proticos, 547-550 grupo de genes terminais, 557-559 protena Bicoid, 552-556 protena Nanos, 556-557 RNA em, 547 Regulao ps-traduo, 497-498 Relao cromossomo X-para-autossomo, 468,469 em Caenorhabditis, 795-796 gene Sex-lethal (Sxl)e, 790-791 na determinao do sexo em Drosophila, 789-791 Relao de volume cromatina-citoplasma, embriognese, 194 Relao do volume citoplasma-ncleo, na embriognese, 194 Repolho de gamb (skunk cabbage), 828 Repressores, inibio de, 617 Reproduo assexuada, Volvox, 18-19
Reproduo sexual, 12-15 tipos, 17 Reproduo, definida, 12 Rpteis determinao do sexo dependente de temperatura, 798-799 migrao da clula germinativa, 848-849 Resact, 129 Respirao anaerbica, condrcitos hipertrficos, 356 Resposta imune, na gastrulao de mamferos, 248 Restries filticas, 899-901 Restries fsicas, 898 Restries no desenvolvimento, 898-902 Retardo mental, sndrome alcolica fetal e, 833 Retculo endoplasmtico armazenamento de clcio, 146 em clulas da glndula mamria, 766 Retculo endoplasmtico rugoso, nas clulas da glndula mamria, 766 Retculcito, 377 Retina.veja tambm Axnio retiniano antgenos de diferenciao e, 90 induo clula-para-clula na, 688-690 Retina neural, 280-282 Retina pigmentada, 280 Reverso sexual, genes autossmicos e, 780 Rhodinus, 754,808 Ribonucleoprotenas nucleares pequenas. veja snRNP Ribonucleotdeo, redutase, 477 Ribossomo no ovo, 125 pequeno, 472-474 Rim fatores de transcrio dedo de zinco, 420 mesonfrico, 674 morfognese, 673-676 organognese, 676-681 Rim mesonfrico, 674 RNA. veja tambm Processamento diferencial de RNA; Tipos especficos cauda poli(A), 466 edio, 493 emenda alternativa, 466-471 hibridizao, 54-55 matriz nuclear e, 452 mecanismos de emenda, 465-466 modificaes nucleares, 393-394 na regulao da polaridade, 547 polimerase, 399-401,452 seleo nuclear, 462-465 sntese, 49-54, 375,377,865-867 tcnicas de localizao, 63-66 transferncia, 64,66 transporte na oognese merostica, 868 RNA antisenso, 73,491-492 RNA mensageiro. veja mRNA RNA nuclear heterogneo. 462. veja hnRNA RNA nuclear pequeno. veja snRNA RNA nuclear. veja nRNA RNA polimerase I, 399 RNA polimerase II, 399-401 RNA polimerase III, 399 RNP. veja Complexos de ribonucleoprotena Rodopsina, 735 Rombencfalo, 266,267
ndice de Assuntos
IA2 - 23
Rombmeros, 267,293,638-640 Rotferos, polifenismo induzido por predadores, 819 rRNA, em ocitos de anfbios, 866 RTK. veja Receptor tirosina quinase Rubola, 835 RX. veja Receptor retinide Saco amnitico, 186 Saco vitelnico, 31,361 quimeras, 378-379 Sacos areos, 383 Salamandra ativao do genoma embrionrio, 489 clulas garrafa, 226-229 clivagem, 169,173 determinao progressiva em, 600-603 diferenciao da crista neural, 293 disco dos membros, 703 induo especfica de regio, 621-623 inervao dos neurnios motores, 313 mapa de destino, 222 migrao da crista neural, 288 migrao das clulas germinativas, 844 mutante o, 489 neotenia na, 743 prognese em, 743-744 quimeras, 666 regenerao do olho na, 40-41 regenerao dos membros, 87-88,714-716 Salamandra aqutica (Newt) cromossomos em forma de escova, 865 determinao progressiva em, 600-603 induo especfica de regio, 621 inervao do neurnio motor, 313 Salamandra axolotle. veja Salamandra Sangue, leis de movimento, 367 Sanguessuga, sistema nervoso, 316-317 Sapo migrao da clula germinativa no , 843-844 plasticidade fenotpica, 820 Sapo. veja tambm Metamorfose anfbia; Xenopus anormalidades congnitas relacionadas poluio, 836 blastocele, 174 clivagem,169,173 crescente cinzento, 156-157 estudos de defeitos em, 593 migrao de clulas germinativas em, 843-844 neurulao primria em, 256-257 neurulao secundria em, 264-265 oognese, 861-864 polifenismo induzido por predadores, 819-820 potncia nuclear, 42-43 quimeras, 666 seleo de alvos de axnios retinianos em, 326-328 Sapo leopardo (Rana pipiens), potncia nuclear, 42-43 Sazonalidade, na regulao desenvolvimental, 810-812 sc. veja gene scute Scaphiopus, 819 Scleraxis, 352 Scr. veja gene Sex comb reduced Scr. veja Protena Sex comb reduced Sebo, 300 Segmentos, larvas, 559-561 Seio venoso, 363
Seleo natural, 883-884 Semaforina I, 318 Semaforinas, 318,321-322 Seqncia (box) HMG, 423,779 Seqncia de capeamento, 392,393-394 Seqncia lder, 392 Seqncia TATA (TATA box), 396,399 seqenciamento de genes, genes hometicos e, 573 Seqenciamento dideoxi, 59-61 Seqenciamento, DNA, 59-61 Seqncias limitantes, 454 Serotonina, 147,148,279 Serpentes, falta de membros, 713 Servanus, 797 Sexo em bactrias, 12 definido, 12 SF1. veja Fator esteroidognico 1 SF2. veja Fator de emenda 2 Silenciador, 396,454 Simbiose, desenvolvimento, 808-810 Simetria. veja tambm Assimetria; Eixos embrio, 157-158 Simetria radial, blstula, 170 Sinais endcrinos, 107 parcrinos, 107 Sinais de direcionamento repulsivos aos axnios (RAGS), 328-331 Sinais planares, na induo neural, 626-627 Sinalizao justcrina, 662-663 Sinapse, 331 Sinciciotrofoblasto, 245-246 Sindactilia, sndrome, 724-725 Sndrome alcolica fetal (FAS), 833-835 Sndrome de Angelman, 445 Sndrome de DiGeorge, 641 Sndrome de Down, 827 Sndrome de Holt-Oram, 722 Sndrome de Kallmann, 319 Sndrome de Lesh-Nyan, 448 Sndrome de Pfeiffer, 357 Sndrome de Waadenburg, 290 Sndrome Prader-Willi, 445 Sntese de DNA, ciclina E e, 200 em clulas do tubo neural, 270 MPF e, 197 na fertilizao, 151-152 no ciclo celular, 196 Sistema circulatrio desenvolvimento, 361-373 embrionrio, 370-371 fetal, 372 placentrio, 246-247 Sistema digestivo, em induo especfica de regio, 664-665 Sistema imune induo clula-para-clula no, 688 plasticidade do desenvolvimento do, 822 Sistema nervoso. veja tambm Sistema nervoso central formao de padres, 312-313 formao em Drosophila, 545 genes Hox e, 638-640 na metamorfose de anfbios, 739-740 na metamorfose de insetos, 753-754 N-CAM e, 95-96
respostas neuroniais ao aprendizado, 823-826 sanguessuga, 316-317 Sistema nevoso central. veja tambm Sistema nervoso desenvolvimento do olho, 279-284 diferenciao do tubo neural, 265-276 hormnios sexuais e, 785-788 modelagem dorso-ventral, 264 neurulao e, 254-265 tipos neuroniais, 276-279 Sistema nervoso perifrico, parassimptico, 287 Sistema respiratrio, induo especfica de regio, 664-665 Sistema visual, padronizao neuronial do, 824-826 Sistema Wingless-Hedgehog, 114 Snk. veja gene snake snRNA, 465 snRNP, 465-466 Sdio ativao do ovo, 151-152 em ocitos, 141-142 Sog. veja Protena short gastrulation Soma, 276 Somatomatropina, corinica, 248 Somatopleura, 360 Somatotrofos, 407 Somitmeros, 343-344 Somitos, 341,343-347 SP56, na adeso espermatozide-zona, 136-137 Sparus, 797-798 Spisula. veja Molusco bivalve Spliceosome, 465-466 SRY. veja Fator determinante do sexo do cromossomo Y Sry. veja gene sex-determining region of the Y STAT. veja Transdutores e ativadores de sinais da transcrio Strongylocentrotus, 130,133,135 Styela, 179-180 Substncia inibidora Mlleriana, 661,775 Substncias difusveis, 80 Sulco de clivagem, fuso mittico e, 202-203 Sulco genital, 775,780,781 Sulco laringotraqueal, 383 Sulco morfogentico, 688 Sulco neural, 257 Sulco ventral, 543-545 Sulcus limitans, 271-272 Superfamlia das imunoglobulinas CAMs, 92,95-97,319 Superfamlia de receptores do homnio esteride, 741 Surfactante, alveolar, 383 Sxl. veja gene Sex lethal Synapta, clivagem, 169-170 T3. veja Triiodotironina T4. veja Tiroxina TAFs. veja Fatores associados protena TATA-ligante Tlamo, 274 -talassemia, 473 Talidomida, 830-833 Talina, 104 Taninos, em polifenismo, 814 Taricha, 313 Tarso, 748 Taxonomia, formas larvais e, 884
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ndice de Assuntos
TBP. veja Protena ligante de TATA Tectum ptico, 325-327 especificidade adesiva, 328-331 Telencfalo, 266,268 Telson, 552,557,558 Temperatura na determinao do sexo de afdeos, 811 na determinao do sexo de Volvox, 812 na determinao do sexo, 795,798-799, 817-818 no polifenismo de borboletas, 815 Tenascina, 103-104 Tenso superficial, de tecido, 87 Teologia natural, 883 Teoria do gene, embriologia e, 35-38 Teoria do plasma germinativo, 592-593 desenvolvimento em mosaico e, 593 desenvolvimento regulador e, 594-596 gradientes de ocitos e, 597-598 restrio de potncia na, 598-600 Teratocarcinoma, 847-848 Teratognese, na anlise do cdigo Hox, 643-645 Teratgenos, 828,829-830,835 cido retinico, 829-830 lcool, 833-835 estrgenos ambientais, 836-837 talidomida, 830-833 Teratologia, 828 Terminao, 474 Termodinmica, em afinidade celular diferencial, 84-88 4-tert-pentilfenol, 836 Testculos genes autossmicos e, 780-781 genes do cromossomo Y e, 777-780 tbulos mesonfricos em, 674 Testosterona, 775 clulas de Leydig e, 777 comportamento especfico do sexo e, 785-786 na degenerao da corda mamria, 763-765 na determinao do sexo, 783-784 receptor, 783 Ttrade, 851 Tetrodotoxina, 313,331 TFIIA, 399,420,437 TFIIB, 399,424 TFIID, 399-401 na disrupo do nucleossomo, 436-437 TFIIE, 399-400,424 TFIIF, 399-400 TFIIH, 399-400 TGF-. veja Fator- transformador de crescimento TGF-1. veja Fator-1 transformador de crescimento Thais, 819 Thermococcus litoralis, 69 Thermus aquaticus, 69 Timo, 380 TIMP. veja Inibidor da metaloproteinase Tireide, hormnio estimulador da (TSH), 743 Tireide, hormnios na metamorfose de anfbios, 735-742 Tirosina quinase do receptor LET-23, 690 Tirotrtrofos, 407 Tiroxina (T4), 735,743 Topoisomerase II, 453-454
Totipotncia clonagem de Xenopus, 43-45 nas clulas germinativas primordiais, 846 Toupeiras com bolso, evoluo e, 892-893 Toxoplasma, 835 Toxopneustes, 122 TR. veja Receptor do hormnio da tireide tra. veja gene transformer tra-1. veja gene transformer-1 tra-2. veja gene transformer-2 Traduo, 392,472. veja tambm Controle da traduo em eucariotos, 6 em procariotos, 6 mecanismos, 472-474 na regulao do desenvolvimento, 471-472 Trajetria do inositol fosfato, 111-112 Trajetrias da transduo de sinais Comunicao cruzada em 112 trajetria do inositol-fosfato, 110-112 trajetria JAK-STAT, 107-108 trajetria RTK-Ras, 108-110 Transcrio, 392-394. veja tambm Fatores de transcrio autoregulao, 409 compensao de dosagem do cromossomo X, 446-450 de genes da -globina, 437-441 durante a clivagem, 167-168 em Acetabularia, 9-10 em eucariotos, 6 em genes da imunoglobulinas, 409-415 em ocitos, 865-867 em procariotos, 6 especfica da clula, 403 especfica do tecido, 402-403 fatores trans-reguladores, 399-401 inibio, 431-432 intensificadores, 402-404 matriz nuclear e, 451-454 metilao do DNA e, 442-446 na metamorfose, 741 na regulao da diviso celular, 418-419 na transio da blstula intermediria, 194-195 promotores, 394-401 sinergismo em, 408-409 topoisomerases e, 453-454 Transcrio gnica, transferncia de mancha, 64,66 Transcriptase reversa, 55 Transdiferenciao, 41 Transdutores e ativadores de sinais da transcrio (STAT), 107-108 Transfeco, 69 Transferncia de mancha, 64,66 Transferncia de RNA, 64,66 Transferncia Northern, 64,66 Transferncia Southern, 58-59 Transferncias de DNA, 58-59 Transferina, 715 Transio da blstula intermediria (MBT), 194-195 ativao do genoma embrionrio e, 488-490 ativao e represso do gene na, 437 movimentao celular na, 218-220 Translocaes, em leucemia, 418-419 Transplante nuclear, em camundongos, 45-46 Transplantes heteroplsticos, 604-605
Trans-reguladores, 395-396 armadilhas de intensificadores e, 418-419 dedo de zinco, 420 domnios, 404,421 genes das imunoglobulinas e, 413-415 hlice-ala-hlice bsico, 415-416 POU, 406-409 protenas do homeodomnio e, 405 regio controladora de locos e, 439 responsivos a hormnios, 420-423 RNA polimerase e, 399-401 ruptura de nucleossomos e, 432-434 stios hipersensveis DNase-I e, 435-436 ziper bsico de leucina, 416-418 Traquia, 383 Trato ptico, 326 Treponema, 835 Trade de Kartagener, 124 Triiodotironina (T3), 735,737,739,741,743 Trimetadiona, em anomalidades congnitas, 833 Tripsina, 84 Trissomia, 827 Triturus, 865 induo embrionria primria em, 603-605 induo especfica de regio em, 621 tRNA, 472,474 em ocitos de anfbios, 866 ovo, 125 Troca de classes, 411 Trocanter, 753 Trofoblasto, 182 de mamferos, 245-247 formao, 185 implantao no tero, 186 P-caderina e, 93 Trofoectoderma, 182 Trompas de eustquio, 380 Tronco arterioso, 363,371 Tronco, expresso do gene Hox, 642-643 -tropomiosina, 467 TSH. veja Hormnio estimulador da tireide Tubo de fertilizao, 15 Tubo digestivo, 380 derivados, 382-383 Tubo neural, 254-255,258 defeitos, 262-263 diferenciao, 265-276 diviso celular no, 270 eixo dorso-ventral, 264 fechamento, 260-264 formao, 258-259 neurulao primria e, 256,260-264 Tubo respiratrio, 380 derivados, 383 Tubos epiteliais, mecanismos de ramificao, 683-687 Tubulina, 10-11. veja tambm Microtbulos em flagelos, 123 na epilobia, 220 na espermatognese, 858-859 Tbulos renais, 673-674 Tbulos renais pronfricos, 673-674 Tbulos seminferos, 777 na espermatognese, 856-857 Tufos (puffs) de cromossomos, 51-54, 757-758,759 Tulerpedon, 726 Tumor de Wilm, 420
ndice de Assuntos
IA2 - 25
Tumores. veja tambm Carcinoma angiognese e, 370 gene Ras e, 109 verruga hidatidiforme, 154 Tnica albuginea, 777 Tunicados, clivagem, 179 Tunicamicina, 184 U2AF, 465-466,469 793 Ubs. veja gene Ultrabithorax UDP-galactose, 137 UNC-86, 406 Unidade de tipo, 883-884 Unidade formadora de colnias do bao (CFU-S), 374-377 Unidade formadora de colnias em clulas mielides e linfides (CFU-M,L), 375-377 Unidade formadora de rompimento de eritride (BFU-E), 375 Unio, 178-179 Urechis, 142 Ureteres, 674 Uretra, 783 Urodeles. veja tambm Salamandra mapa de destino, 222 tero, 784 blastocisto e, 186-187 3 UTR. veja Regio 3 no traduzida Uvomorulina, 93,184 Vaga-lume, metamorfose, 754 Vasculognese, 367-369 Vaso deferente, 674,777 Vasos sangneos. veja tambm Sistema circulatrio angiognese, 369-370 na circulao embrionria, 370-371 na migrao da clula germinativa primordial, 848-849 represses sobre a formao, 366-373 vasculognese, 367-369 VEGF. veja Fator de crescimento do endotlio vascular Veia umbilical, 370 Veias onfalomesentricas, 368 Veias vitelnicas, 363,368 Velo, 300 Ventrculos, desenvolvimento, 363-365 Veratrum, 828 Vermelho neutro, 221 Vermes aneldeos, clivagem, 175 Vermes Nemertea, clivagem, 175 Vertebrados amniotas, 361 co-opo evolucionria e, 894-896 desenvolvimento do olho, 279-284 famlia de protenas Hedgehog em, 659 formao de membros, 898-899 genes Hox e, 638-640,905-907 iniciao do eixo nterior-posterior, 635-637 neurnios motores, 308-310,323-325 Vertebrados amniticos, 361
Vrtebras, genes Hox e, 645-646 Vescula acrossmica, 122-123,129-130,132 Vescula biliar, 382 Vescula germinativa, 485,861 Vesculas da matriz, 356 Vesculas pticas, 266,280 na induo do cristalino, 667-668,671 Vespa parastica, poliembrionria,195-196 Vestbulo, na prognese, 745 Vestimentifera, 890 Vetores clonagem, 56 retrovirais, 69-70 Via da quinase Ras-MAP, 690 Via da tirosina quinase, ativao do ovo, 149 Via RTK-Ras, 108-110,910-911 Vibrio, 808 Vis, na induo do cristalino, 668,669 Vilosidades corinicas, 246-247 Vilosidades primrias, 247 Vilosidades secundrias, 247 Vilosidades tercirias, 247 Vrus, como teratgenos, 835 Vrus da Mielocitomatose, 418 Vrus influenza, protena HA, 140 Vrus Sendai, protena F, 140 Vitamina A, 829 Vitamina B12, 263 Vitelognese, 862-863 Vitelogenina, 808,862 na oognese merostica, 869-870 Volvocaceanas, 16-17 Volvox, 16-17 determinao do sexo sensvel temperatura, 81 protena indutora do sexo, 20-21 reproduo assexuada, 18-19 Vulva, induo clula-para-clula, 690-692 Warfarina, em anormalidades congnitas, 833 wind. veja gene windbeutel Wrasse, determinao do sexo, 818-819 XANF-1, 619 Xenopus. veja tambm Metamorfose em Anfbios ativao do genoma embrionrio, 488-489 atividade do organizador, 613-621 clulas garrafa em, 226-229 ciclo de clivagem, 196 experimentos de clonagem, 43-45 expresso da N-caderina, 94-95 formao da blstula, 174 formao do mesoderma, 229,609-612 gastrulao, 221-232 hiptese da cauda poli(A), 485-486 hiptese da mensagem materna mascarada, 482-483 homlogos aos genes de Drosophila, 616 induo do cristalino, 668-671 induo embrionria primria, 606-609 induo especfica de regio, 621-628 localizao do mRNA armazenado, 479 mapa de destino, 221,222
migrao da clula germinativa em, 844 projeo retinotectal, 327 rearranjos no ovo, 157 retculo endoplasmtico cortical, 146 RNA de ocitos, 866 sntese de membrana, 203-204 transcrio no zigoto, 168 transferncias de manchas, 64,66 transio da blstula intermediria, 194-195 XFGFR1, veja Xenopus receptor-1 do fator de crescimento fibroblsticos X-gal, 56 XIC. veja Centro de inativao do cromossomo X Xisto de Burgess, 887 Xnr3. veja gene Xenopus nodal-related-3 YSL Externa, 190 YSL interna, 190 YSL. veja camada sincicial do vitelo YY1, 454 YY1/ NF-E1, 452 zen. veja gene zerknllt Zigoteno, 851 Zigoto, 3 Ziper bsico da leucina, 416-418 Zona de atividade polarizante (ZPA), 716-717 especificao, 721 interaes com AER, 718-721 sonic hedgehog e, 717-718 Zona de progresso, 708,711,713 Zona de reao, 144 Zona do manto, 271 Zona do receptor quinase (ZRK), 136,138 Zona intermediria, 271 Zona limitans, 268 Zona marginal, 222-224,271 dorsal, 231 em clulas involutivas profundas, 229 na gastrulao de ave, 241 no involutiva, 229-230 posterior, 238 Zona marginal dorsal (DMZ), 627 migrao in vitro, 231 Zona marginal involutiva (IMZ), 229 Zona marginal posterior (PMZ), 238 Centro de Nieuwkoop, 636 Zona necrtica anterior, 724 Zona necrtica intergdigital, 724 Zona necrtica anterior, 724 Zona necrtica posterior, 724 Zona pelcida. 126,132 adeso do espermatozide e, 135-139 blastocisto e, 185-186 ligao secundria do espermatozide, 138-139 protenas, 865 reao do grnulo cortical e, 143-144 Zona ventricular, 271 Zonas necrticas, 724 ZP1, 138 ZP2, 138, 144 ZP3, 135-138,144 ZRK. veja Zona do receptor quinase
ndice de Abreviaturas
ACE, Adenylation control element, 484 ACTH, Adrenocorticotropic hormone, 407 ADH, Alcohol dehydrogenase, 50 AER, Apical ectodermal ridge, 705 Aldox, Aldehyde oxidase, 50 AMH, Anti Mllerian duct hormone, 775 AP, Animal pole, 223 BDNF, Brain-derived neurotrophic factor, 292 bFGF, Basic fibroblast growth factor, 293 BFU-E, Burst-forming unit, erythroid, 375 bHLH, Basic helix-loop-helix, 415 BMP2, Bone morphogenetic protein 2, 293 BMP4, Bone morphogenetic protein 4, 346 BMP7, Bone morphogenetic protein 7, 293 BMPs, Bone morphogenesis proteins, 661 BR2, Balbiani ring 2, 52 bZip, Basic leucine zipper, 416 C/EBP, CCAAT enhacer-biding protein, 417 cActRIIa, Activin receptor IIa, 648 cAMP, Cyclic adenosine 3,5-monophosphate, 22 CAMs, Cell adhesion molecules, 92 CAT, Chloranphenicol acetyltransferase, 403 CDK, Cyclin-dependent kinase, 198 cdk2, Cyclin-dependent kinase 2, 864 cDNA, Complementary DNA, 54 CFS, Cytostatic factor, 864 CFU-E, Colony-forming unit, erythroid, 375 CFU-M,L, Colony-forming unit of the myeloid and lymphoid cells, 375 CFU-S, Colony-forming unit of the spleen, 375 CNS, Central nervous system, 318 CNTF, ciliary neurotrophic factor, 332 CP, Cone synaptic pedicle, 282 CPE, Cytoplasmic polyadenylation element, 484 CSF, Cytostatic factor, 200 CSPG, Chondroitin sulfate proteoglycan, 216 CT, Column of Terni, 309 CTD, Carboxy-terminal domain, 400 DAB, Diaminobenzidine, 134 DAG, Diacylglycerol, 112 DDT, Dichloro-diphenyl-trichloroethane, 836 DHT, Dihydrotestosterone, 775 DIF, Differentiation-inducing-factor, 26 DLHP, Dorsolateral hinge positions, 260 dMP2, Dorsal midline precursor neuron, 315 DMZ, Dorsal marginal zone, 231 DRG, Dorsal root ganglia, 287 DSP1, Dorsal switch protein 1, 585 EcR, Ecdysone receptor, 758 EDNH, Egg development neurosecretory hormone, 808 EEG, Electroencephalogram, 276 EGF, Epidermal growth factor, 580 EGFR, Epidermal growth factor receptor, 765 EKLF, Erythroid krppel-like factor, 441 ELF-1, Eph ligand family 1, 328 elF2-GTP, Eukaryotic initiation factor 2, 472 elF4E, Cap-binding protein, 472 EPO, Erythropoietin, 376 ERE, Estrogen-responsive element, 408 ES, Embryonic stem cells, 72 EVL, Enveloping layer, 190 FAS, Fetal alcohol syndrome, 833 FGF, Fibroblast growth factor, 656 FGF2, Basic fibroblast growth factor, 368 FGF5, Fibroblast growth factor 5, 332 FGF8, Fibroblast growth factor 8, 268 FGFR3, Fibroblast growth factor receptor 3, 110 FSH, Follicle-stimulating factor, 870 G1, Prereplication gap, 196 G2, Premitotic gap, 196 GAG, Glycosaminoglycan, 100 GAP, GTPase-activating protein, 109 G-CSF, Granulocyte colony stimulating factor, 376 GDFs, Growth and differentiation factors or paracrine factors, 657 GDNF, glial-derived neurotrophic factor, 677 GGF, Glial growth factor, 293 GM-CSF, Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, 376 GnRH, Gonadotropin-releasing hormone, 319 GRE, Glucocorticoid (and progesterone)-responsive element, 421 GSK-3, Glycogen synthase kinase 3, 609 GVBD, Germinal vesicle breakdown, 864 gwm, Germ wall margin, 189 hCG, Human chorionic ganadotropin, 827 HF, Head fold, 255 HGF, Hepatocyte growth factor, 677 HIMs, Hematopoietic inductive microenvironments, 377 HLH, Helix-loop-helix, 791
IA3 - 1
IA3 - 2
ndice de abreviaturas
HN, Hensens node, 255 hnRNA, Heterogeneous nuclear RNA, 462 HOM-C, Homeotic gene complex, 637 HP, Head process, 255 hpf, Hours past fertilization, 726 HPFH, Hereditary persistence of fetal hemoglobin, 440 HPRT, Hypoxanthine phosphoribosyltransferase, 89 HRI, Heme-responsive inhibitor protein, 495 hyp, Hypoblast cells, 189 ICM, Inner cell mass, 186 Id, Inhibitor of differentiation, 415 IGF-1, Insulin-like growth factor 1, 355 IGFII, Insulin-like growth factor, 155 IgM, Immunoglobulin, 96 IL, Interleukin, 376 IL-6, Interleukin 6, 378 IMZ, Involuting marginal zone, 228 INAH, Interstitial nuclei of the anterior hypothalamus, 787 IP3, Inositol 1,4,5-triphosphate, 112 IRE-BP, Iron-binding regulatory protein, 492 ISN, Intersegmental neuron, 96 JH, Juvenile hormone, 755 KGF, Keratinocyte growth factor, 299 ks, Cells of Kollers sickle, 189 LCRs, Locus control regions, 431 LH, Luteinizing hormone, 870 LIF, Leukemia inhibition factor, 292 LMC, Lateral motor column, 309 MARs, Matrix-associated regions, 431 MBT, Midblastula transition, 489 M-CSF, Macrophage colony stimulating factor, 376 METRO, Message transport organizer, 864 MGF, Mammary gland factor, 766 MHP, Medial hinge point cells, 259 MIS, Mllerian-inhibiting substance, 775 MMC, Medial motor column, 309 MPF, Maturation-promoting factor, 197 MTB, Midblastula transition, 218 mtlrRNA, Mitochondrial large ribosomal RNA, 534 MW, Molecular weight, 410 mz, Marginal zone, 189 N-CAM, Neural cell adhesion molecule, 95 NGF, Nerve growth factor, 293 NGFR, Receptor for nerve growth factor, 680 NIMZ, No involuting marginal zone, 228 NMP-1, Nuclear matrix protein 1, 452 NP, Neural plate, 255 nRNA, Nuclear RNA, 462 NT-3, Neurotrophin 3, 332 NT-4/5, Neurotrophin 4/5, 332 NURF, Nucleosome-remodeling factor, 436 ODH, Octanol dehydrogenase, 50 OEH, Ovarian ecdysteroidogenic hormone, 808 OPL, Outer plexiform layer, 282 OS, Outer segments of the photoreceptor, 282
PB, Polar body, 176 PCR, Polymerase chain reaction, 66 PDGF, Platelet-derived growth factor, 148 PE, Pigment epithelium, 282 Pgc, Pollar granule component, 535 PGCs, Primordial germ cells, 843 pi, Polyinvagination islands, 189 PIP2, Phosphatidylinositol 4,5-biphosphate, 112 PKA, Protein kinase A, 554 PKC, Protein kinase C, 147 PLF, Proliferin, 370 PMC, Primary mesenchyme cells, 213 PMZ, Posterior part of the marginal zone, 239 PNS, Peripheral nervous system, 285 pstA, Prestalk cell A, 27 pstB, Prestalk cell B, 27 pstO, Prestalk cell O, 27 PTTH, Prothoracicotropic hormone, 754 PVC, Posterior vegetal cytoplasm, 515 PZ, Progress zone, 709 RAGS, Repulsive axon guidance signal, 328 RARs, Retinoic acid receptors, 829 rGH, Rat growth hormone gene, 397-398 RTK, Receptor tyrosine kinase, 108 Sc, Subgerminal cavity, 189 SCF, Stem cell factor, 376 SF1, steroidogenic factor 1, 780 SF2, Splicing factor, 466 SG, Sympathetic ganglia, 287 SH2, Src-homology- 2, 911 snRNAs, Small nuclear RNAs, 465 snRNPs, Small nuclear ribonucleo-protein particules, 465 SRY, Sex-determining region of the y, 779 STAT, Signal transducers and activators of transcription, 107 TkB, Inhibitor of kappa, 414 TAFs, TATA-binding protein-associated factors, 400 TBP, TATA-binding protein, 399 TF, Transcription factor, 434 TGF-, Transforming growth factor , 298 TGF-1, Transforming growth factor 1, 686 THS, Thyroid-stimulating hormone, 743 THS-RF, Thyrotropin-releasing hormone, 744 TR, Thyroid hormone receptor, 741 TRE, Thyroxine-and retinoic-acid-responsive element, 421 tRNA, Transfer RNA, 472 tRNAi, Initiator transfer RNA, 472 3UTR, 3Untranslated region, 475 VEGF, Vascular endothelial growth factor, 369 VPCs, Vulval precursor cells, 690 XIC, X chromossome inactivation center, 449 Xnr1, Xenopus nodal-related-1, 617 Xnr3, Xenopus nodal-related-3, 627 YSL, Yolk syncytial layer, 190 ZPA, Zone of polarizing activity, 717 ZRK, Zona receptor kinase, 138
FUNPEC - Editora
Prof. Dr. Francisco A. Moura Duarte Prof. Dr. David De Jong Supervisora de Produo Eneida Oliveira Banks Revisora Tcnica Editor Associado Editor Chefe
Marina Guaraldo Villa Cl Engenheiro de Sistemas Domingos Yamada Computao Grfica
Jos Meneghette Jnior Diane Evelin Piazentim Coordenador de Produo Grfica e Diagramao Edmundo Cruz Canado

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Biologia do Desenvolvimento

Para Daniel, Sarah, e David

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Genes e desenvolvimento: Introduo e tcnicas 35

Eucariotos coloniais: A evoluo da diferenciao

Informaes adicionais & Especulaes

Informaes adicionais & Especulaes

Informaes adicionais & Especulaes

Informaes adicionais & Especulaes

Sobre E.coli e elefantes: O modelo operon Sntese diferencial de RNA 49

Hibridizao de cido nuclico Seqenciamento de DNA 59

Padres desenvolvimentais entre metazorios

Clonagem de DNA genmico 55 Hibridizao de DNA: entre e intra espcies

Anlise de mRNA atravs de bibliotecas de cDNA 61 Tcnicas de localizao de RNA 63

Tabela dos Contedos

Base celular da morfognese: Afinidade celular diferencial 79

Molculas de receptores e vias de transduo de sinais 107

Informaes adicionais & Especulaes

Informaes adicionais & Especulaes

A base molecular das adeses clula-clula Informaes adicionais & Especulaes

As classes de molculas de adeso celular

Anticorpos monoclonais e gentica reversa

Molculas de adeso celular

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Informaes adicionais & Especulaes

Ativao do metabolismo do vulo

Reconhecimento do vulo e do espermatozide: Ao distncia 128

Informaes adicionais & Especulaes

Rearranjo do citoplasma do vulo

Informaes adicionais & Especulaes

Clivagem: Criando multicelularidade 167

Fuso de gametas e a preveno da polispermia

Clivagem holoblstica espiral

Tabela dos Contedos

Informaes adicionais & Especulaes

Mecanismos de gastrulao em aves

Clivagem holoblstica rotacional

Informaes adicionais & Especulaes

Incio do desenvolvimento vertebrado: Neurulao e ectoderma 253

Informaes adicionais & Especulaes

Clivagem discoidal 189 Clivagem Superficial 192

Informaes adicionais & Especulaes

Informaes adicionais & Especulaes

MECANISMO DE CLIVAGEM 196 Regulando o ciclo da clivagem

Neurulao secundria 264 Diferenciao do tubo neural

Fator promotor de maturao

Formao das regies do crebro

Informaes adicionais & Especulaes

Informaes adicionais & Especulaes

O mecanismo citoesqueltico da mitose 201 A formao de novas membranas 203

Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias 209

Tipos de neurnios 276 Desenvolvimento do olho em vertebrados

Dinmica do desenvolvimento tico 279 Diferenciao da retina neural 280

Informaes adicionais & Especulaes

Informaes adicionais & Especulaes

Informaes adicionais & Especulaes

A potncia do desenvolvimento das clulas da crista neural do tronco 291

A crista neural ceflica

Generalidades sobre gastrulao em aves

Tabela dos Contedos

A crista neural cardaca 296 A EPIDERME E A ORIGEM DAS ESTRUTURAS CUTNEAS

Incio do desenvolvimento vertebrado: Mesoderma e endoderma 341

Especificidade axnica 307