Biologia do Desenvolvimento

QUINTA EDIÇÃO

Biologia do Desenvolvimento

QUINTA EDIÇÃO

Scott F. Gilbert
Swarthmore College

Tradução e Revisão
Adolfo Max Rothschild Zuleika Rothschild Francisco A. de Moura Duarte Maria Helena Corrêa Marques

A capa
FOTOGRAFIA DA CAPA: O mRNA para o Fator 8 de Crescimento

Fibroblástico pode ser detectado pela hibridização in situ da montagem total usando RNA marcado quimicamente que é complementar a essa mensagem. No embrião de pinto de 3 dias, a mensagem do Fgf8 é encontrada no ectoderma mais distal dos brotos dos membros, no limite entre o cérebro posterior e o cérebro intermediário, nos somitos, nos arcos branquiais do pescoço e na cauda em desenvolvimento. O FGF8 é importante para diversos processos desenvolvimentais e desempenha papéis críticos no crescimento dos membros e na padronização do desenvolvimento do cérebro. Capítulos 3, 7 e 18. (Fotografia cortesia de E. Laufer, C.-Y. Yeo e C. Tabin.)
FOTOGRAFIA DA CONTRACAPA: Fotografia de um embrião de pinto
Do original: Developmental biology, Fifth Edition Copyrigth ® 1997 by Sinauer Associates, Inc. Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) (Câmara Brasileira do livro, SP, Brasil) _____________________________________ Gilbert, Scott F., 1949Biologia do desenvolvimento / Scott F. Gilbert. -5. ed. -- Ribeirão Preto, SP : FUNPEC Editora, 2003. Título original : Developmental biology Vários tradutores e revisores. Bibliografia. ISBN 85-87528-61-0 1. Biologia do desenvolvimento I. Título. 03-4459 CDD-571.8 _____________________________________ Índices para catálogo sitemático: 1. Bilogia do Desenvolvimento: Ciências da vida 571.8 Direitos para a língua portuguesa cedidos pela Sinauer Associates, Inc. para a Fundação de Pesquisas Científicas de Ribeirão Preto que se reserva a propriedade desta tradução. Proibida a reprodução dos textos originais, mesmo parcial e por qualquer processo, sem autorização da editora.

de 20-21 dias nos estágios de “pipping” (bicando a casca internamente) e pré-eclosão. Note o revestimento peridérmico proeminente na extremidade do bico (dente do ovo), usado pelo pinto para fazer buracos na casca do ovo, a qual se tornou mais fina e mais quebradiça, como uma conseqüência da utilização de minerais pelo embrião para seu crescimento esquelético. Esse estágio desenvolvimental marca a transição do embrião em um pinto que respira ar. Capítulos 1 e 5. (Fotografia do International Poultry Journal, cortesia de R. Tuan.)

As páginas de título
PÁGINA ESQUERDA: A expressão gênica gera limites nos discos imagi-

nais da Drosophila. Os discos grandes e pequenos dentro da larva da mosca formam as asas e os halteres, respectivamente, no adulto. Nesse estágio, a proteína Apterous (vermelho) é expressa somente nos compartimentos dorsais; a proteína Cubitus interruptus (azul) marca os compartimentos anteriores (mas não os posteriores) (uma linha formando esse limite pode ser observada). A coloração verde (originária da proteína Vestigial) no interior demarca o limite entre o membro livre e a articulação ligando-o à parede torácica. Capítulo 19. (Fotografia cortesia de J. Williams, S. Paddock e S. Carroll.)
PÁGINA DIREITA: Expressão do gene paraxis no embrião de pinto no

estágio de 6 somitos. Hibridização in situ da montagem total usando RNA marcado com “digoxygenin” complementar a uma porção da mensagem paraxis do pinto mostra a expressão desse gene durante a formação do somito. A proteína Paraxis é importante no estabelecimento da estrutura desses grupos mesodérmicos. Capítulos 2 e 9. (Montagem fotográfica cortesia de R. Tuan.)

Para Daniel, Sarah, e David

Tabela de Conteúdos

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
Introdução ao desenvolvimento animal 1
O objetivo da biologia do desenvolvimento 1 Os problemas da biologia do desenvolvimento 2 Os estágios do desenvolvimento animal 3 Nossa herança eucariótica 5 Desenvolvimento entre eucariotos unicelulares 6
Controle da Morfogênese no Desenvolvimento em Acetabulária 6 Diferenciação em Ameboflagelados Naegleria 10 As Origens da Reprodução Sexual 12

1

Genes e desenvolvimento: Introdução e técnicas 35
As origens embriológicas da teoria dos genes 35

2

Núcleo ou Citoplasma: Qual Controla a Hereditariedade? 35 O Cromossomo X como uma Ponte Entre Genes e Desenvolvimento 37

A cisão entre a embriologia e a genética 38 Primeiras tentativas da genética do desenvolvimento Evidência para a equivalência genômica 40

39

Eucariotos coloniais: A evolução da diferenciação
As Volvocaceanas 16

16

Informações adicionais & Especulações
Sexo e Individualidade em Volvox 18 Diferenciação e Morfogênese em Dictyostelium 21

Metaplasia 40 Clonagem de Anfibios: A Restrição da Potência Nuclear 42 Clonagem de Anfíbios: A Pluripotência de Células Somáticas 43

Informações adicionais & Especulações
Clonando Mamíferos por Prazer e Lucro 45

Informações adicionais & Especulações
Evidência e Anticorpos 25 27

Informações adicionais & Especulações
Como o Grex Sabe Qual Lado Está Para Cima

Sobre E.coli e elefantes: O modelo operon Síntese diferencial de RNA 49

47

Hibridização de ácido nucléico Seqüenciamento de DNA 59

54
58

Padrões desenvolvimentais entre metazoários
Os Poríferos 29 Protostomatas e Deuterostomatas 30

28

Clonagem de DNA genômico 55 Hibridização de DNA: entre e intra espécies

Análise de mRNA através de bibliotecas de cDNA 61 Técnicas de localização de RNA 63
Hibridização In Situ 63 Transferências Northern 64

Tabela dos Conteúdos

vii

Encontrando mensagens raras pela reação da polimerase em cadeia 66 Determinando a função do gene: células e organismos transgênicos 69
Técnicas de inserção de DNA novo em uma célula 69 Camundongos quiméricos 70 Experimentos com genes com endereçamento (Gene targeting ou Knockout) 70

Identificando moléculas de adesão celular e seu papel no desenvolvimento 92 Caderinas 92 CAMs da superfamília de imunoglobulinas 95

Moléculas da junção celular: proteínas da junção em fenda 97 A base molecular da afinidade célula-substrato 99
Afinidade diferencial a substrato 99 A matriz extracelular 99 Receptores celulares para moléculas da matriz extracelular 104 Adesão diferencial resultante de sistemas de adesão múltipla 106

Determinando a função de uma mensagem: RNA antisense 73 Reinvestigação de velhos problemas com novos métodos 73 Uma conclusão e um alerta 75

Base celular da morfogênese: Afinidade celular diferencial 79
Afinidade celular diferencial 80
O modelo termodinâmico de interações celulares

3
84

Moléculas de receptores e vias de transdução de sinais 107
A via JAK-STAT 107 A via RTK-Ras 108

Informações adicionais & Especulações
Evidência para o modelo termodinâmico 87
88

Informações adicionais & Especulações
Mutações negativas dominantes em receptores 110 A via do inositol fosfato 111 Cruzamentos entre vias 112 A matriz extracelular e a superfície da célula como fontes de sinais críticos para o desenvolvimento 112 Interações recíprocas na superfície celular 113

A base molecular das adesões célula-célula Informações adicionais & Especulações

88

As classes de moléculas de adesão celular

Anticorpos monoclonais e genética reversa

89

Moléculas de adesão celular

92

PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Fertilização: Iniciando um novo organismo 121
Estrutura dos gametas
Espermatozóide O óvulo 125

4

Prevenção da Polispermia

140

Informações adicionais & Especulações
A Ativação do Metabolismo dos Gametas 147

121
121

Ativação do metabolismo do óvulo
Respostas precoces 149 Respostas tardias 151 Fusão do material genético

149

Reconhecimento do óvulo e do espermatozóide: Ação à distância 128
Atração do Espermatozóide 128 Ativação Espermática: A Reação Acrossômica no Ouriço-do-Mar 129

152

Informações adicionais & Especulações
A Não-Equivalência dos Pronúcleos de Mamíferos 154

Rearranjo do citoplasma do óvulo
Preparação para a Clivagem

156
158

Informações adicionais & Especulações
Ação à Distância: Gametas de Mamíferos 131
Reconhecimento do óvulo e espermatozóide: Contato de gametas 132 Reconhecimento Espécie-Específico em Ouriçosdo-Mar 132 Ligação de Gametas e Reconhecimento em Mamíferos 135

Clivagem: Criando multicelularidade 167
PADRÕES DE CLIVAGEM EMBRIONÁRIA 168 Clivagem holoblástica radial 169
A holotúria, Synapta Ouriço-do-Mar 170 Anfíbios 173 169

5

Fusão de gametas e a prevenção da polispermia
Fusão entre as membranas do óvulo e do espermatozóide 139

139

Clivagem holoblástica espiral

175

viii

Tabela dos Conteúdos

Informações adicionais & Especulações
Adaptação pela modificação da clivagem embrionária 178 Clivagem Holoblástica Bilateral 179

Mecanismos de gastrulação em aves

238

Gastrulação em mamíferos

242

Clivagem holoblástica rotacional
Compactação 181

180

Modificações para desenvolvimento dentro de outro organismo 242 Formação de membranas extra-embrionárias 245

Informações adicionais & Especulações
A Superfície da Célula e o Mecanismo de Compactação 184 Formação da massa celular interna 185 Fuga da Zona Pelúcida 185

Início do desenvolvimento vertebrado: Neurulação e ectoderma 253
FORMAÇÃO DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL Neurulação: aspectos gerais 254
186

7

254

Informações adicionais & Especulações
Gêmeos e células embrionárias precursoras

Clivagem Meroblástica

188

Clivagem discoidal 189 Clivagem Superficial 192

Informações adicionais & Especulações
Exceções, Generalizações, e Clivagem Parasítica da Vespa 195

Neurulação primária 255 A mecânica da neurulação primária 257 A formação da placa neural 257 Formação do assoalho da placa neural 258 A modelagem e dobramento da placa neural 259 Fechamento do tubo neural 260

Informações adicionais & Especulações
A modelagem dorsoventral do sistema nervoso 264

MECANISMO DE CLIVAGEM 196 Regulando o ciclo da clivagem

196
197

Neurulação secundária 264 Diferenciação do tubo neural

265
265

Fator promotor de maturação

Formação das regiões do cérebro

Informações adicionais & Especulações
MPF e Seus Reguladores 198

Informações adicionais & Especulações
Determinando as regiões do cérebro anterior e cérebro médio 268 Arquitetura de Tecido no Sistema Nervoso Central 270 Organização do cerebelo 272 Organização cerebral 274

O mecanismo citoesquelético da mitose 201 A formação de novas membranas 203

Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 209
Gastrulação em ouriço-do-mar 210

6

Tipos de neurônios 276 Desenvolvimento do olho em vertebrados

279

Ingresso do Mesênquima Primário 210 Primeiro estágio da invaginação do arquêntero 215 Segundo e terceiro estágios da invaginação do arquêntero 217

Dinâmica do desenvolvimento ótico 279 Diferenciação da retina neural 280

Informações adicionais & Especulações
Porque os bebês não enxergam bem Diferenciação do cristalino e da córnea 282 283

Gastrulação em peixes

218

A transição da blástula intermediária e a aquisição de motilidade celular 218 Formação das camadas germinais 220

A CRISTA NEURAL 284 A crista neural e seus derivados A crista neural do tronco 285

284

Gastrulação de anfíbios

221

Movimentos celulares durante a gastrulação de anfíbios 221 Posicionando o blastóporo 224 Movimentos celulares e a construção do arquêntero 226 Migração do mesoderma involutivo 229

Vias de migração das células da crista neural do tronco 285 A matriz extracelular e a migração da crista neural do tronco 287

Informações adicionais & Especulações
Análise das mutações que afetam o desenvolvimento das células da crista neural 290

Informações adicionais & Especulações
Reguladores moleculares do desenvolvimento: Fibronectinas e as vias da migração mesodérmica 230 Epibolia do ectoderma 232

A potência do desenvolvimento das células da crista neural do tronco 291
Diferenciação final das células da crista neural 292

A crista neural cefálica

293

Gastrulação em aves

233
233

Generalidades sobre gastrulação em aves

Vias migratórias das células da crista neural cefálica 293 Potência de desenvolvimento das células da crista neural cefálica 295

Tabela dos Conteúdos

ix

A crista neural cardíaca 296 A EPIDERME E A ORIGEM DAS ESTRUTURAS CUTÂNEAS
A origem das células epidérmicas Apêndices cutâneos 299 297

297

Conclusões

300

Início do desenvolvimento vertebrado: Mesoderma e endoderma 341

9

Especificidade axônica 307
A geração da diversidade neuronial 307
Especificação do Neurônio Motor de Vertebrado Especificação dos Neurônios Motores em Drosophila 310

8
308

MESODERMA 341 Mesoderma dorsal: A notocorda e a diferenciação dos somitos 341
Mesoderma Paraxial 341 Somitômeros e a Iniciação da Formação do Somito 343 Geração de Tipos de Células Somíticas 344 Miogênese: Diferenciação do Músculo Esquelético 347

Formação de padrões no sistema nervoso 312 Seleção de trajetórias: Orientação pela matriz extracelular 313
Orientação pelo Terreno Físico: Orientação por Contato 313 Orientação para Gradientes de Adesão: Haptotaxia 314 Condução por Sinais Migratórios específicos do Axônio: A Hipótese das Trajetórias Marcadas 315 Orientação pela Repulsão Específica de Cones de Crescimento 317

Informações adicionais & Especulações
Construção Muscular e a Família MyoD de Reguladores Transcricionais 349 Osteogênese: O Desenvolvimento dos Ossos 351

Informações adicionais & Especulações
Controle da Condrogênese na Placa de Crescimento 357

Mesoderma da Placa Lateral

358

Informações adicionais & Especulações
Sexo,Odor e Adesão Específica 319

Seleção de trajetória: Orientação por moléculas difusíveis 320 Sinais para condução múltipla 323
Neurônios Motores Vertebrados Axônios da Retina 325 323

Formação das Membranas Extra-Embrionárias 359 O Coração 361 Formação dos vasos sangüíneos

366

Informações adicionais & Especulações
Redirecionando o Fluxo Sangüíneo no Mamífero Recém-nascido 372

O Desenvolvimento de células sangüíneas

373

Seleções de alvos

326

Especificidades Adesivas em Diferentes Regiões do Tectum 328

Seleção de endereço: Desenvolvimento dependente de atividade 331 Sobrevivência diferencial após a inervação: Fatores neurotróficos 331 Informações adicionais & Especulações
Neurônios Fetais em Hospedeiros Adultos 334

O Conceito de Célula-tronco 373 Células-tronco Pluripotenciais e Microambientes Hematopoéticos 374 Desenvolvimento Osteoclástico 377 Locais de Hematopoiese 378

ENDODERMA 380 Faringe 380 O tubo digestivo e seus derivados

382
382

O desenvolvimento de comportamentos: constância e plasticidade 334

Fígado, Pâncreas e Vesícula Biliar O Tubo Respiratório 383

x

Tabela dos Conteúdos

PARTE III Mecanismo da Diferenciação Celular
Regulação transcricional da expressão gênica: Fatores de transcrição e a ativação de promotores específicos 391
Éxons e Íntrons 392 Estrutura e função do promotor
Estrutura do promotor 396 Função do promotor 397

10

Ruptura e reorganização de nucleossomos: o papel dos complexos de ruptura 436 Ruptura e reorganização de nucleossomos: o papel da competição de histonas 437

Regiões de controle de loco: transcrição do gene da globina 437 Informações adicionais & Especulações
Trocas no gene de globina 440

394

Metilação de DNA e atividade gênica

442

Informações adicionais & Especulações
RNA polimerase e os fatores trans-reguladores no promotor 399

Correlações entre metilação do promotor e inatividade gênica 442 Metilação e a manutenção dos padrões de transcrição 443

Estrutura e função dos intensificadores

402

Informações adicionais & Especulações
Metilação e impressão gênica 444

Necessidade de intensificadores 402 Função do intensificador: Modelos temporais e espaciais de transcrição 403

Fatores de transcrição: Os trans-reguladores dos promotores e dos intensificadores 404
Proteínas de homeodomínio 405 Os fatores de transcrição POU 406

Compensação de dosagem do cromossomo X de mamíferos 446 Informações adicionais & Especulações
O mecanismo de inativação do cromossomo X 449

Associação do DNA ativo com a matriz nuclear

451

Informações adicionais & Especulações
Regulação da transcrição dos genes de cadeia leve das imunoglobulinas 409 Fatores de transcrição básicos do tipo hélice-alçahélice 415

Ligação da cromatina ativa a uma matriz nuclear 451 Topoisomerases e a transcrição gênica 453 Isoladores e domínios 454 Resumo 455

Informações adicionais & Especulações
Regulando as proteínas bHLH miogênicas: Governando a troca entre proliferação e diferenciação de células musculares 416 Fatores de transcrição do zíper básico da leucina 416

Controle do desenvolvimento pelo processamento e tradução diferencial do RNA 461

12

Informações adicionais & Especulações
Armadilhas do intensificador: natural e experimental 418 Fatores de Transcrição Dedo de Zinco 420 Receptores Nucleares de Hormônios e Seus Elementos Responsivos a Hormônios 420

CONTROLE DO DESENVOLVIMENTO PELO PROCESSAMENTO DIFERENCIAL DE RNA 461 Controle do desenvolvimento precoce pela seleção de RNA nuclear 462 Os mecanismos de emenda de RNA: Spliceosomes 465 Emenda alternativa do RNA: Criando proteínas alternativas a partir do mesmo gene 466
Um gene, Muitas Proteínas Relacionadas 466 Processamento Alternativo de RNA e Determinação Sexual em Drosophila 468 Uso Disseminado do Processamento de RNA para o Controle da Expressão Gênica 471

Proteínas que dobram o DNA 423 Ativação dependente de contexto ou silenciamento 423 Regulação da atividade do fator de transcrição 425

Regulação transcricional da expressão gênica: A ativação da cromatina 431
Acessibilidade a fatores trans-reguladores Sítios hipersensíveis à DNAase I 434

11
431
432

Nucleossomos e a ativação da cromatina reprimida

REGULAÇÃO DA TRADUÇÃO DOS PROCESSOS DESENVOLVIMENTAIS 471 Mecanismos da tradução eucariótica 472 Controle da síntese protéica pela longevidade diferencial do mRNA 474
Degradação Seletiva de mRNAs 475

Controle da tradução de mensagens do oócito

476

Tabela dos Conteúdos

xi

Caracterização de RNAs Mensageiros Armazenados em Oócitos 477

Informações adicionais & Especulações
A Ativação do Genoma Embrionário 488

Informações adicionais & Especulações
Determinando o Destino Celular por Meio do mRNA Localizado do Oócito 480

Regulação dos genes da tradução em larvas e adultos 490
Determinação de Gametas em C. elegans 490 RNA Antisenso Natural 491 “Disjuntores” do Controle da Tradução 492 Editoração do RNA 493

Mecanismos para a regulação da tradução das mensagens dos oócitos 481
A Hipótese da Mensagem Materna Mascarada 482 A Hipótese da Cauda Poli(A) 483 A Hipótese da Eficiência da Tradução 486 Outros sistemas de ativação do mRNA: Mensagens sem “Cap” e Mensagens Seqüestradas 486

Controle da tradução e síntese protéica coordenada: Produção de Hemoglobina 494 Epílogo: Regulação Pós-tradução 497

PARTE IV Especificação do Destino Celular e os
Eixos Embrionários
Especificação celular autônoma por determinantes citoplasmáticos 505
Comprometimento celular e diferenciação Pré-formação e epigênese 507
Os Teratologistas Franceses 509

13
510

A genética da especificação axial em Drosophila 543

14

505

Especificações autônomas em embriões de tunicados

Resumo do desenvolvimento de Drosophila 543 AS ORIGENS DA POLARIDADE ÂNTERO-POSTERIOR 545 Visão Panorâmica 545 Os genes de efeito materno 546
Evidência Embriológica da Regulação da Polaridade pelo Citoplasma do Oócito 546 O Modelo Molecular: Gradientes Protéicos no Embrião Precoce 547

O determinante formador de músculos do crescente amarelo 511 Especificação citoplasmática das linhagens endodérmicas e epidérmicas e o eixo ânteroposterior 514

Informações adicionais & Especulações
Modelos de Gradientes da Informação Posicional 551 Evidência que o Gradiente da Proteína Bicoid Constitui o Centro de Organização Anterior 552 O Centro de Organização Posterior: Localizando e Ativando o Produto de nanos 556 O Grupo Gene Terminal 557

Localização citoplasmática em embriões de moluscos 515
O lóbulo polar 517

Especificação celular no nematódeo Caenorhabditis elegans 521
Controle maternal da identidade do blastômero: O controle genético das células progenitoras faríngeas de C. elegans 524 Regulação em C. elegans 527

Os genes da segmentação

559

Informações adicionais & Especulações
“Ser ou Não Ser: Esse é o Fenótipo” 529

Divisões celulares assimétricas no desenvolvimento tardio 530 Localização citoplasmática de determinantes de células germinativas 531
Determinação de células germinativas em nematódeos 531 Determinação da célula germinativa em insetos Componentes do plasma polar da Drosophila Determinação de células germinativas em anfíbios 536

Uma Visão Panorâmica 559 Os Genes de gap 561 Os Genes pair-rule 563 Os Genes de Polaridade Segmentar

565

Os genes de Seleção homeótica

569

532 534

Padrões de Expressão dos Genes Homeóticos 569 Iniciando os Padrões da Expressão dos genes Homeóticos 572 Mantendo os Padrões de Expressão dos genes Homeóticos 572 Os Elementos Cis-Reguladores e o Complexo Bithorax 574

Resumo

538

xii

Tabela dos Conteúdos

Informações adicionais & Especulações
Regulação Molecular do Desenvolvimento: As Proteínas do Homeodomínio 576

Indução de especificidade mesodérmica ventral e lateral 612

A criação da atividade do organizador

613
613

A GERAÇÃO DA POLARIDADE DORSOVENTRAL EM DROSOPHILA 577 A proteína Dorsal: Morfógeno para a polaridade dorsoventral 577
Translocação da Proteína Dorsal 577

Proteínas secretadas do organizador

Informações adicionais & Especulações
BMP4 e a lagosta de Geoffroy 616 Fatores de transcrição induzidos no organizador 619

Provendo o sinal assimétrico para a translocação da proteína Dorsal 578
Sinal do Núcleo do Oócito para as Células Foliculares 578 Sinalização das Células Foliculares para o Citoplasma do Oócito 580 O Estabelecimento do Gradiente da Proteína Dorsal 581

Informações adicionais & Especulações
Como o Organizador Neuraliza o Ectoderma? 621

A especificidade regional de indução

621
621

A determinação das diferenças regionais O modelo do duplo gradiente 623 Correlatos moleculares da caudalização neural 624

PRIMÓRDIOS DE ÓRGÃOS E EIXOS 585 O modelo de coordenadas cartesianas e a especificação dos primórdios dos órgãos 585 Resumo: Alguns princípios do desenvolvimento da Drosophila 586

Informações adicionais & Especulações
Sinais verticais e horizontais do organizador 626 Genes homeobox na especificação neural 628

Competência e cascatas indutivas 628

Especificação do destino celular por interações célula-célula progressivas 591
Desenvolvimento regulativo 591 Testando a teoria do plasma germinativo 592

15

Estabelecimento dos eixos corporais em mamíferos e aves 635
Iniciando o eixo ântero-posterior 635

16

August Weismann: A teoria do plasma germinativo 592 Wilhelm Roux: Desenvolvimento em mosaico 593 Hans Driesch: Desenvolvimento Regulativo 594 Sven Hörstadius: Potência e gradientes em oócitos 597 Formação de um organismo integrado: Restringindo a potência das células vizinhas 598

Estabelecendo um Centro de Nieuwkoop 635 Expressão Gênica em Tecidos Organizadores 636

Especificando o eixo ântero-posterior de mamífero: A hipótese do código Hox 637
Homologia dos Complexos de Genes Homeóticos entre Drosophila e Mamíferos 637 Expressão de Genes Hox no Sistema Nervoso Central e seus Derivados 638 Análise Experimental de um Código Hox: Gene Alvo 640 Transformação Parcial de Segmentos por Eliminação de Genes Hox Expressos no Tronco 642 Análise Experimental do Código Hox: Teratogênese do Ácido Retinóico 643 Evidência para um Código Hox da Anatomia Comparada 645

Regulação durante o desenvolvimento de anfíbios

600

Hans Spemann: Determinação progressiva das células embrionárias 600 Hans Spemann e Hilde Mangold: Indução embrionária primária 603

O centro de Nieuwkoop

606

A formação do centro de Nieuwkoop e a polaridade mesodérmica 606 A especificação da polaridade dorsoventral na fertilização 607

Informações adicionais & Especulações
Animais como Variações sobre o Mesmo Tema Desenvolvimental 646

A base molecular da indução mesodérmica

609

Estabelecendo a regionalização dorsal: o possível papel da β-catenina 609 O funcionamento do centro de Nieuwkoop: funções para Vg1 e Noggin 610

Eixos dorsoventral e esquerdo-direito em mamíferos e aves 647

Tabela dos Conteúdos

xiii

PARTE V Interações Celulares Durante a
Formação do Órgão
Interações proximais de tecidos: Indução secundária 655
Interações instrutivas e permissivas Competência e receptores 656 Fatores parácrinos 657 655

17
658

de crescimento dos fibroblastos como indutores do broto do membro 704 Indução da crista ectodérmica apical 704

Produção do eixo próximo-distal dos membros

706

Os Fatores de Crescimento Fibroblástico A família hedgehog 659 A família Wnt 660 A superfamília TGF-ß 661 Sinalização Justácrina 662

A crista ectodérmica apical: O componente ectodérmico 706 A zona progressiva: O componente mesodérmico 708 Genes Hox e a especificação do eixo próximodistal do membro 709 Interações entre a AER e a zona progressiva 711 Mutações nas interações entre a zona progressiva e a AER 711

Interações epitélio-mesênquima

663
663 666 667 668

Informações adicionais & Especulações
A regeneração dos membros da salamandra e a retenção do eixo próximo-distal 714

Especificidade Regional da Indução Especificidade Genética da Indução

Cascatas de indução embrionária: Indução do cristalino 667
Os Fenômenos da Indução do Cristalino A Base Celular da Indução do Cristalino Formação da Córnea 672

Especificação do eixo ântero-posterior dos membros 716
A zona de atividade polarizante 716 Sonic hedgehog como definidor da ZPA 717 Interações entre a AER e a ZPA para integrar crescimento e padrão 718 Especificando a ZPA 721

Formação de órgãos parenquimatosos 672
Morfogênese do Rim de Mamífero 673 Os Mecanismos da Organogênese Renal 676

Informações adicionais & Especulações
Diferenciação Coordenada e Morfogênese no Dente 682

A produção do eixo dorsoventral 721 Distinguindo o membro anterior do membro posterior 722 Informações adicionais & Especulações
Lições de limbless 724

Mecanismos de ramificação na formação de órgãos parenquimatosos 683
A Matriz Extracelular como um Elemento Crítico na Ramificação 684 Fatores Parácrinos Efetuando Padrões de Ramificação 686

Morte celular e a formação de dígitos 724 Informações adicionais & Especulações
Evolução do membro tetrápode 726

Indução ao nível de uma única célula

687

Indução Vulvar no Nematóide Caenorhabditis elegans 690

Interações celulares à distância: Hormônios como mediadores do desenvolvimento 733
Metamorfose: o direcionamento hormonal do desenvolvimento 733 Metamorfose anfíbia 734

19

Informações adicionais & Especulações
Interações Célula-Célula e Possibilidade na Determinação de Tipos Celulares 692

Desenvolvimento do membro de tetrápode 701
Padronização no membro 701 Formação do broto do membro 702

18

Controle hormonal da metamorfose de anfíbios 735 Respostas Moleculares aos Hormônios da Tireóide Durante a Metamorfose 740

Informações adicionais & Especulações
Heterocronia 743

Metamorfose em insetos

746
746

O campo do membro 702 Especificação dos campos do membro: Genes Hox e ácido retinóico 703 Crescimento do broto de membro precoce: fatores

Eversão e Diferenciação dos Discos Imaginais

Informações adicionais & Especulações
A determinação dos discos imaginais da perna e da asa 750 Remodelação do sistema nervoso 753

xiv

Tabela dos Conteúdos

Controle Hormonal da Metamorfose de Insetos
A biologia Molecular da Atividade da Hidroxiecdisona 757

754

Hermafroditismo

795
795

Hermafroditismo no Nematóide C. elegans Hermafroditismo em Peixes 797

Informações adicionais & Especulações
Controle ambiental sobre a forma e a função da larva 761

Determinação ambiental do sexo

798

Interações hormonais múltiplas no desenvolvimento da glândula mamária 762
Estágio embrionário Adolescência 765 Gravidez e lactação 762 765

Determinação Sexual Dependente de Temperatura em Reptéis 798 Determinação Sexual Dependente da Localização em Bonellia viridis e Crepidula fornicata 799

Resumo

800

Determinação do sexo 773
Determinação Sexual Primária 774 Determinação Secundária do Sexo 774 As Gônadas em Desenvolvimento 775

20

Regulação ambiental do desenvolvimento animal 805

21
806

Determinação cromossômica do sexo em mamíferos 774

REGULAÇÃO AMBIENTAL DO DESENVOLVIMENTO NORMAL Sugestões ambientais usadas pelos organismos para completar seus desenvolvimentos 806
A colonização larval 806 Refeições de sangue 808 Simbiose no desenvolvimento

Determinação sexual primária dos mamíferos: Genes cromossômicos Y para a determinação dos testículos 777
SRY: O Determinante Sexual do Cromossomo Y 778

808

Diferenças ambientais previsíveis como sugestões para o desenvolvimento 810
Sazonalidade e sexo: Afídios e Volvox Diapausa 812 810

Determinação sexual primária em mamíferos: Genes autossômicos na determinação de testículos 780
SOX9: Reversão Autossômica na Displasia Campomélica 780 SF1: A Ligação Entre SRY e as Trajetórias Desenvolvimentais Masculinas 780

Plasticidade fenotípica: Polifenismo e regras de reação 813
Polifenismo sazonal em borboletas 814 Polifenismo nutricional 816 Determinação sexual dependente do ambiente

Determinação sexual primária em mamíferos: Desenvolvimento ovariano 781
DAX1: Um Potencial Gene Determinante de Ovário no Cromossomo X 781 Wnt4a: Um Potencial Gene Determinante de Ovário em um Autossomo 781

817

Fatores ambientais imprevisíveis controlando o desenvolvimento animal 818
Defesas induzíveis contra a predação 819 Plasticidade fenotípica e mudanças no ambiente 820

Informações adicionais & Especulações
Assimilação Genética 821

Determinação sexual secundária em mamíferos
Regulação Hormonal do Fenótipo Sexual Testosterona e Diidrotestosterona 783 Hormônio Anti-Mülleriano 784 O Sistema Nervoso Central 785

782
782

A contínua plasticidade do desenvolvimento

822

O sistema imune: Desenvolvimento no adulto 822 Aprendizado: Um sistema nervoso adaptável ao ambiente 823

Informações adicionais & Especulações
O Desenvolvimento de Comportamentos Sexuais 787

DISTÚRBIOS AMBIENTAIS DO DESENVOLVIMENTO NORMAL Malformações e distúrbios 827 Agentes teratogênicos 828
Ácido retinóico como um teratogênico 829 Talidomida como um teratogênico 830 Álcool como um teratogênico 833 Outros agentes teratogênicos 835

827

Determinação sexual cromossômica em Drosophila 788
A Via do Desenvolvimento Sexual 788 O Gene Sex-lethal como o Pivô para a Determinação do Sexo 790 Os Genes transformer 793 doublesex: O Gene Comutador da Determinação Sexual 793 Genes-alvo para a Cascata de Determinação Sexual 794

Informações adicionais & Especulações
Estrógenos Ambientais 836

Interações genética-ambiental Resumo 837

837

Tabela dos Conteúdos

xv

A saga da linhagem germinativa 843
Migração das células germinativas 843
Migração das Células Germinativas em Anfíbios 843 Migração das Células Germinativas em Mamíferos 844

22

Mecanismos desenvolvimentais da mudança evolucionária 883
“Unidade de Tipo” e “Condições de Existência”
A Síntese de Charles Darwin 883 E. B.Wilson e F. R. Lillie 885

23
883

A evolução do desenvolvimento precoce: E. Pluribis Unum 885
A emergência dos embriões 885 Formação de um Novo Filo: Modificando os Caminhos do Desenvolvimento 887

Informações adicionais & Especulações
Teratocarcinomas e Células-Tronco Embrionárias 847 Migração de Células Germinativas em Aves e Répteis 848 Migração de Células Germinativas Primordiais em Drosophila 849

Modularidade: O pré-requisito para mudança evolutiva através do desenvolvimento 891
Modularidade 891 Dissociação: Heterocronia e Alometria Duplicação e Divergência 893 Co-opção 894 Progressão correlacionada 896 891

Meiose 850 Informações adicionais & Especulações
Grandes Decisões: Mitose ou Meiose? Espermatozóide ou Óvulo? 853

Restrições ao desenvolvimento

898

Espermatogênese

855
857

Espermiogênese

Informações adicionais & Especulações
Expressão Gênica Durante o Desenvolvimento do Espermatozóide 858

Restrições Físicas 898 Restrições Morfogenéticas 898 Restrições Filéticas 899 Evolução Conjunta do Ligante e Receptor: Isolamento Reprodutivo 901

Oogênese

860

Meiose oogênica 860 Maturação do Oócito em Anfibios 861 Conclusão da meiose: Progesterona e Fecundação 864 Transcrição Gênica em Oócitos 865 Oogênese Meroística em Insetos 867

O mecanismo genético do desenvolvimento da mudança evolucionária: Genes reguladores homólogos 902
Pax6 e o desenvolvimento do olho 902 BMP4 e a Morfogênese dos Membros 904 Genes Hox e a Evolução dos Vertebrados 905 Genes Hox e a Evolução dos Artrópodes 907 Caminhos homólogos do desenvolvimento 909

Informações adicionais & Especulações
A Origem dos Eixos Embrionários de Drosophila Durante a Oogênese 869 Oogênese em Mamíferos 870

Criando novos tipos de células: O mistério evolucionário básico 911 Uma nova síntese evolucionária 912

Informações adicionais & Especulações
O Reinício da Meiose nos Oócitos de Mamíferos 875

Fontes Para as Citações das Aberturas dos Capítulos C-1 Índice de Autores IA-1 Índice de Assuntos IA-2 Índice de Abreviaturas IA-3

Prefácio

O

s últimos anos do século 20 encontram a biologia do desenvolvimento retornando à posição que ela ocupou no início do século: a disciplina que unifica os estudos da hereditariedade, evolução e fisiologia. Em 1896, a primeira edição de B. Wilson do The Cell in Development and Inheritance anunciou “a verdade maravilhosa que uma única célula pode conter em seu interior sua extensão microscópica da soma-total da herança das espécies.” Hoje, a biologia do desenvolvimento está na vanguarda desse estudo de nossa herança natural. Nos seus aspectos moleculares, ela toca a química física na sua investigação dos mecanismos bioquímicos pelos quais proteínas diferentes são produzidas em células diferentes do mesmo genoma. Ela também está na liderança dos estudos evolucionários que procuram entender como mudanças macroevolucionárias ocorreram. Ela abriu recentemente uma área nova da biologia do desenvolvimento ecológico, onde mudanças ambientais são vistas criando alterações no desenvolvimento do organismo. Durante os últimos 3 anos, a biologia do desenvolvimento também expandiu para a medicina, fundindo-se com a genética clínica para criar uma ciência revitalizada da embriologia humana, uma ciência que já se tornou importante na explanação das malformações congênitas. A quinta edição do Biologia do Desenvolvimento foi revisada e reescrita para refletir essas revoluções que estão acontecendo. Aconteceram quatro mudanças importantes na estrutura do livro desde sua última edição. Primeiro, tornou-se impossível discutir os princípios fundamentais da embriologia sem o conhecimento da atividade gênica ou vias da transdução de sinais. Portanto, essa informação foi trazida dentro da seção introdutória do livro de modo que interações celulares, tais como fertilização e indução, podem ser apreciadas tanto no âmbito molecular quanto no morfológico. Segundo, novo interesse nos efeitos do ambiente no desenvolvimento normal e anormal conduziu a um novo capítulo. O Capítulo 21, “Regulação Ambiental do Desenvolvimento Animal,” diz respeito às vias pelas quais o meio ambiente afeta o fenótipo do organismo. Interesse na proteção ambiental e em controvérsias envolvendo a possibilidade de poluentes teratogênicos forçaram uma nova percepção das influências que o meio ambiente representa no desenvolvimento normal e anormal. Na verdade, os biologistas do desenvolvimento podem rapidamente encontrar-se à frente dos movimentos da conservação ecológica. As primeiras quatro edições deste livro buscaram integrar abordagens molecular, celular e orgânica à biologia do desenvolvimento; esta edição adiciona a dimensão ecológica. Terceiro, esta edição introduz novas ênfases nos papéis dos fatores parácrinos no desenvolvimento. Não somente os estudos da transdução de sinais estão colocados na seção introdutória deste livro, como a Parte V

Prefácio

xvii

da Quinta Edição inicia com uma visão geral das famílias do fator de crescimento fibroblástico, TGF-β, Wnt e Hedgehog dos fatores de crescimento e diferenciação. Quarto, este livro está conectado a um website onde estudantes e professores podem encontrar mais material em muitos tópicos selecionados. Tal material inclui (1) detalhes de experimentos que são extremamente especializados para serem colocados no texto, (2) informação histórica sobre áreas particulares da biologia do desenvolvimento e personalidades envolvidas, (3) implicações médicas de fenômenos particulares do desenvolvimento, (4) debates ou comentários em questões relevantes para o campo, e (5) atualizações do material do texto nessa área da biologia de crescimento cada vez mais rápido. Filmes e entrevistas gravadas estão incluídas e esses artigos de destaque poderão ser expandidos à medida que a tecnologia os tornar mais fáceis para serem usados. Esse website está conectado também a outros websites e podem ser usados para enriquecer a perspectiva de alguém sobre o que está acontecendo no desenvolvimento animal. A presença de um website nos permite manter o direcionamento deste livro às pessoas para as quais isso foi originalmente pretendido: estudantes dos últimos anos da graduação e do início da pós-graduação. Ele também me ajudou a não deixar o livro tornar-se um substituto para peso de papel. A visão de Roux foi que a biologia do desenvolvimento “algum dia constituiria a base de todas as outras disciplinas biológicas e, em continuada simbiose com essas disciplinas, desempenharia uma parte proeminente nas soluções dos problemas da vida.” Essas foram palavras audaciosas, até mesmo arrogantes há cem anos atrás; hoje, elas expressam uma aceitação amplamente sustentada. O desenvolvimento integra todas as áreas da biologia e desempenha um papel crucial em relacionar o genótipo ao fenótipo. O desenvolvimento pode ser estudado usando qualquer organismo e em qualquer nível de organização, de moléculas a filos. À medida que o campo continuar a se expandir e se aprofundar , uma palavra de advertência é requerida: a biologia do desenvolvimento não pode ser aprendida ou ensinada em um único semestre. Este texto é uma tentativa para prover cada pessoa com material suficiente para seu curso, mas um instrutor não necessita se sentir culpado por não determinar todos os capítulos, e os estudantes não necessitam se sentir privados se eles não lerem todos os capítulos. Isto é o começo do caminho, não sua conclusão.

Como usar o website
Qualquer pessoa pode entrar no website através de sua homepage [http://zygote.swarthmore.edu/index.html] ou através da sua lista de arquivos de capítulos localizada no [http://zygote.swarthmore.edu/info.html]. Alternativamente, nós colocamos acessos específicos endereçados em todo o livro onde quer que exista uma entrada relevante no momento da publicação. Todos esses endereços começam com [http://zygote.swarthmore.edu/] e são seguidos por um código dado no livro texto. Assim, a localização especificada na página 20 do livro é: http://zygote.swarthmore.edu/intro2.html Mais localizações estão sendo adicionadas no website, e essas podem ser acessadas entrando nos arquivos do capítulo. Em adição, clicando no botão “Outros Arquivos” abaixo de cada capítulo, as conexões para outros websites serão facilitadas. Divirta-se.

xviii

Prefácio

Agradecimentos
Esta edição, como suas precursoras, deve muito às sugestões e críticas dos estudantes em minhas classes de biologia do desenvolvimento e genética do desenvolvimento. O grupo de funcionários e docentes extremamente corporativo da Universidade Swarthmore também desempenharam papéis importantes na produção deste livro, e os bibliotecários da área de ciência E. Horikawa e M. Spencer merecem agradecimentos especiais por terem segurado volumes recentes na biblioteca enquanto eu estava escrevendo o livro. Os cientistas que revisaram estes capítulos forneceram enorme ajuda tanto na precisão técnica dos capítulos quanto nas sugestões para trabalho futuro. Esses investigadores incluem: S. Carroll, J. CebraThomas, E. M. De Robertis, S. DiNardo, E. Eicher, C. Emerson, G. Grunwald, D. J. Grunwald, M. Hollyday, L. A. Jaffe, W. Katz, R. Keller, K. Kemphues, D. Kirk, G. Martin, H. F. Nijhout, D. Page, R. Raff, R. Schultz, C. Stern, S. Tilghman, R. Tuan e M. Wickens. Eu também quero agradecer aos muitos cientistas que desviaram do seu caminho para ajudar a tornar esta edição melhor lendo porções específicas dos capítulos. Eles incluem: M. BronnerFraser, J. Fallon, N. M. Le Douarin, E. McCloud, J. Opitz, K. Sainio, H. Sariola, I. Thesleff e T. Valente. Se eu deixei alguém fora, por favor me desculpem. É desnecessário dizer que os julgamentos editoriais finais foram de minha responsabilidade. Meus agradecimentos especiais a Judy Cebra-Thomas que não somente me aconselhou em certos capítulos mas quem deu excelente ajuda durante meu período sabático permitindo-me terminar este livro. Agradecimentos também aos cientistas e filósofos, especialmente: C. van der Weele, R. Amundson, L. Nyhart, R. Burian, H. F. Nijhout, A. F. Sterling, K. Smith e A. I. Tauber, que participaram nos workshops de biologia do desenvolvimento da Sociedade Internacional para a História, Filosofia e Estudos Sociais da Biologia. Algumas das melhores críticas construtivas deste livro-texto vieram dessas pessoas. Andy Sinauer uma vez mais conseguiu reunir as mesmas e extraordinárias pessoas neste projeto, e foi um privilégio trabalhar com eles. Meus agradecimentos a ele e aos editores Nan Sinauer e Carol Wigg, coordenador de produção Chris Small, artistas John Woolsey e Gary Welch, designer Susan Schmidler, editor de texto Janet Greenblatt, e artista de layout Janice Holabird. As habilidades editoriais de Tinsley Davis são extremamente reconhecidas. Devido ao fato de que os prazos finais devem ser cumpridos e outro trabalho posto de lado, eu tenho que agradecer minha família por mais uma vez me permitir prosseguir com isso. Em particular, este livro nunca poderia ter sido completado se não fosse pelo encorajamento de minha esposa, Anne Raunio, que, como uma obstetra, gosta do lado mais prático da biologia do desenvolvimento. Meus agradecimentos a todos vocês.

SCOTT F. GILBERT 1 DE MARÇO DE 1997

Introdução à Biologia do Desenvolvimento
1 Introdução ao desenvolvimento animal 1 35 79 2 Genes e desenvolvimento: Introdução e técnicas 3 Base celular da morfogênese: Afinidade celular diferencial

I

.

Uma diferença marcante entre você e a máquina é que a máquina nunca é requisitada para uma função antes que esteja terminada. e a formação de um embrião é a tarefa mais árdua que alguém haverá de realizar. Paul Cezanne (ca. Esse quer saber como o genótipo XX produz um ser feminino e como o genótipo XY produz um ser masculino. ainda que sua aparência esteja sempre mudando.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 1 Introdução ao desenvolvimento animal 1 A natureza parece nunca mudar. O objetivo da biologia do desenvolvimento Para plantas e animais. é desenvolvendo um embrião. digerir alimentos antes que seus órgãos estivessem formados. e um fisiologista pode fazer perguntas sobre a função da globina no corpo. Diante de um problema. construir ossos a partir de uma massa e ordenar os neurônios antes mesmo de adquirir a capacidade de pensar. O embrião é o intermediário entre o genótipo e o fenótipo. um geneticista gostaria de saber como os genes globina são transmitidos de uma geração à outra. Dizer que mamíferos XX são geralmente fêmeas e mamíferos XY são geralmente machos.C. Todo animal tem que estar em funcionamento enquanto se auto-constrói. Da mesma maneira. Para se tornar um embrião. Enquanto a maior parte da biologia estuda a estrutura adulta e função. o biologista do desenvolvimento pergunta porque os genes globina se expressam somente nas hemácias e como essas se tornam ativas apenas em certas fases do desenvolvimento (ainda não sabemos as respostas). As questões levantadas por um biologista do desenvolvimento são freqüentemente questões mais ligadas ao vir a ser do que ao ser propriamente dito. a biologia do desenvolvimento encontra maior interesse nos estágios mais transitórios. Dizer que um inseto efêmero vive apenas um dia não significa nada para um biologista do desenvolvimento. Biologia do desenvolvimento é uma ciência excelente para pessoas que querem integrar diferentes níveis da biologia. mas passou outros 364 dias como um embrião e larva. 1900) Feliz é a pessoa que consegue discernir as causas das coisas. não explica a determinação sexual para um biologista do desenvolvimento. ou seja. Teve que respirar antes que tivesse pulmões. Biologia do desenvolvimento é a ciência do vir a ser. Virgílio (37 A. porque o inseto pode ser adulto apenas por um dia. Porém. entre os genes herdados e o organismo adulto. podemos estudá-lo a 1 . você teve que construir a si mesmo a partir de uma única célula. o único caminho para o desenvolvimento a partir de uma célula.) O CONCEITO DE EMBRIÃO é assombroso. É nosso dever como artistas transmitir juntamente com todos os seus elementos a emoção dessa permanente transformação. a ciência do processo.

e como são instruídos a se conectarem e ramificarem?) e. e assim por diante. Tradicionalmente. tem-se dado grande ênfase a um quinto problema: • O problema da evolução. seríamos considerados horrivelmente mal formados.. células gordurosas. Como diferenças na ativação do gene globina permitem o fluxo de oxigênio da mãe para o feto. Outra parte da emoção vem do papel unificador que a biologia do desenvolvimento assume nas ciências biológicas. O espermatozóide e o óvulo são células muito especializadas. Se cada célula de nossos braços tivesse realizado apenas mais uma série de divisões. a níveis celular e tissular (p. porque estamos apenas começando a entender o mecanismo molecular do desenvolvimento animal. e como esse ser adulto produz um outro ser? Cada espécie tem suas próprias respostas. células do sangue. poderíamos amarrar nossos sapatos sem nos abaixar. pesquisa do câncer. Assim. mas algumas generalizações podem ser feitas. Biologistas do desenvolvimento podem estudar qualquer organismo e todo tipo de célula. os olhos estão na nossa cabeça e não nos pés ou intestinos. mas como as células sabem quando devem parar de se dividir? Se cada célula de nossa face realizasse mais uma divisão celular. Essa geração de diversidade celular é chamada diferenciação. • O problema da morfogênese. teve um ancestral de cinco dedos. Como as células se auto-organizam e formam um arranjo correto? • O problema do crescimento. Como essas células são separadas para formar a próxima geração. A evolução envolve mudanças herdadas durante o desenvolvimento. pelo contrário. ex. ex. e como fatores ambientais acionam a diferenciação de mais hemácias?). Como vasos capilares são formados em cada tecido. Os problemas da biologia do desenvolvimento O desenvolvimento é realizado por duas funções principais: gera diversidade e ordem celular dentro de cada geração. Somente eles podem transmitir instruções para produzir um organismo de uma geração para outra. a níveis ecológicos e evolucionários (p. Parte dessa emoção vem dos assuntos estudados. biologia celular. O estudo do desenvolvimento tornou-se essencial para a compreensão de qualquer área da biologia. o ovo fertilizado. o que assegura a continuidade da vida que passa de uma geração à outra. Nossas células diferenciadas não são distribuídas aleatoriamente.2 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento níveis molecular e químico (p. Quando dizemos que o cavalo de um dedo só de hoje. Quais são as células capazes de produzir globina.células musculares. precisamos entender como esse mesmo conjunto de instruções genéticas pode produzir diferentes tipos de células. Essa criação de forma ordenada. estamos dizendo que mudanças no desenvolvi- . imunologia.. Como os genes globina são transcritos. Desde que cada célula do corpo contém o mesmo conjunto de genes. neurobiologia. neurônios. é chamada morfogênese. e como o mRNA da globina deixa o núcleo?). Uma única célula. até mesmo. A biologia do desenvolvimento está criando uma estrutura que integra a biologia molecular. e quais as informações no núcleo e no citoplasma que permitem tal funcionamento? Recentemente. fisiologia. a nível de órgãos ou sistema de órgãos (p. ex.. essas questões têm sido subdivididas em quatro problemas gerais da biologia do desenvolvimento: • O problema da diferenciação. Somos maiores do que um ovo. células epidérmicas. Esses órgãos estão dispostos de tal maneira que: dedos estão nas pontas e não no meio de nossas mãos. • O problema da reprodução. e como os fatores que ativam sua transcrição interagem uns com os outros e com o DNA?). ecologia. ex. linfócitos. Biologia do desenvolvimento é um dos campos que mais tem crescido e também um dos mais emocionantes da biologia. e biologia evolucionária. se desenvolve e gera centenas de células de diferentes tipos . existem duas questões fundamentais para a biologia do desenvolvimento: Como um ovo fertilizado origina um ser adulto. anatomia. são organizadas em intrincados tecidos e órgãos..

ou mesmo na vida adulta. porque a maioria dos organismos nunca pára de se desenvolver. mas cientistas são os que procuram descobrir como o desenvolvimento realmente ocorre. o organismo em desenvolvimento é conhecido como embrião. Essa fusão. Clivagem é uma série de divisões mitóticas extremamente rápidas. A vida de um novo indivíduo é iniciada pela fusão do material genético de dois gametas. a ciência começa com a curiosidade: “é graças a curiosidade que as pessoas começaram a filosofar. Como resultado da gastrulação. estimula o ovo a iniciar o desenvolvimento. produz as células da epiderme e do sistema nervoso. ao contrário. Em quase todos os casos. E ainda mais do que dissipar essa admiração.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 3 mento da cartilagem e dos músculos ocorreram ao longo de muitas gerações de embriões nos ancestrais do cavalo. significa “broto” ou “rebento” (a mesma raiz da palavra germinação). chamada fertilização. um em relação ao outro. O simples procedimento de se abrir um ovo de galinha a cada dia do seu período de incubação de três semanas proporciona uma notável experiência quando se observa desde uma fina camada de células até o total desenvolvimento da ave. Como mudanças no desenvolvimento criam novas formas de corpo? Quais modificações hereditárias são possíveis. ao fim da clivagem. o qual chamamos de desenvolvimento. eles geralmente formam uma esfera conhecida como blástula. O ectoderma. são formados por um processo relativamente lento de mudança progressiva. mas a maioria dos padrões de embriogênese compreende variações em quatro temas: 1.ovo fertilizado ou zigoto. Essas células são chamadas blastômeros e. Por todo reino animal existe uma incrível variedade de tipos embrionários. e nossa medula óssea sustenta o desenvolvimento de milhões de novos eritrócitos a cada minuto de nossas vidas. dadas as restrições impostas pela necessidade do organismo sobreviver enquanto se desenvolve? Os estágios do desenvolvimento animal De acordo com Aristóteles. produz o *Do Latim germen.” O desenvolvimento de um ser a partir do ovo tem sido motivo de admiração através da história da humanidade. Mas o desenvolvimento não cessa no nascimento. Qualquer um pode se admirar com esse fenômeno. a camada exterior. A cada dia nós repomos mais de um grama de células de pele (fazendo com que as células mais velhas se desprendam assim que nos movemos). os blastômeros passam por mudanças dramáticas quanto às suas posições. como a disciplina que estuda processos embrionários e outros do desenvolvimento. Organismos pluricelulares não se formam de imediato. Após a redução na taxa de divisão mitótica.1. que dividido através da mitose. . o embrião típico contém três regiões celulares chamadas camadas germinativas*. As principais características do desenvolvimento animal estão ilustrados na Figura 1. produz todas as células do corpo. camada interior. Aristóteles realizou esse procedimento e observou a formação dos principais órgãos. 2. onde o enorme volume citoplasmático do zigoto é dividido em numerosas células menores. Portanto. o endoderma. o espermatozóide e o óvulo. se referindo ao fato de que entre a fertilização e o nascimento. Os nomes das três camadas germinativas são do Grego: ectoderma de ektos (“fora”) mais derma (“pele”). o primeiro grande embriologista da história. o desenvolvimento de um organismo pluricelular começa com uma única célula . Ocorrência de clivagem imediatamente após a fertilização. Essa série de redistribuição de células é chamada de gastrulação. Os estágios subseqüentes do desenvolvimento são coletivamente chamados de embriogênese. novo conhecimento só faz aumentá-la. e a curiosidade permanece desde o início do conhecimento. nos últimos anos tem sido comum se falar em biologia do desenvolvimento. ainda que ordinário. mesoderma de mesos (“meio”) e endoderma de endon (“dentro”). O estudo do desenvolvimento animal tem sido tradicionalmente chamado de embriologia.

tendões. pulmões.4 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Espermatozóide Mórula Blástula Oócito Célula germinativa (“Germ plasm”) Oócito (gameta feminino) GAMETOGÊNESE Adulto sexualmente maduro Blastóporo Gônada Ectoderma Mesoderma Estágios larvais imaturos Endoderma Local das células embrionárias Blastocele Espermatozóide (gameta masculino) INCUBAÇÃO (NASCIMENTO) Figura 1. e o mesoderma. camada do meio. . fígado. e não é incomum o exterior de um órgão ser derivado de uma determinada camada e o interior de outra. músculos.1 Histórico do desenvolvimento de um representante animal. (Nos vertebrados. etc. tecidos conjuntivos (ossos. Muitos órgãos contêm células de mais de uma camada embrionária. dá origem a diversos órgãos (coração. Esse tubo originará o cérebro e a coluna vertebral). Estágios que vão da fertilização até o nascimento são coletivamente conhecidos como embriogênese. revestimento do tubo digestivo e órgãos associados (pâncreas. Uma vez que as três camadas embrionárias estão estabelecidas. que é completa no adulto sexualmente maduro. Gametogênese. As regiões responsáveis por produzir células embrionárias são mostradas em cores.). gônadas). Também durante a organogênese. rins. um sapo. a organogênese é iniciada quando uma série de interações celulares induzem as células ectodérmicas da porção mediana do dorso a formar o tubo neural. 3. Esse processo é chamado organogênese. as células interagem umas com as outras e se reorganizam para produzir tecidos e órgãos. começa em épocas diferentes. dependendo da espécie. vasos sangüíneos) e células sangüíneas.

onde se diferenciam em gametas. é dividido de tal forma que a seqüência completa de aminoácidos da proteína é derivada de segmentos descontínuos de DNA (Figura 1. a informação herdada necessária para o seu desenvolvimento e metabolismo se encontra codificada nas sequências de ácido desoxirribonucléico (DNA) dos cromossomos. a divisão celular não é mitótica. animais. geralmente. células eucarióticas sofrem mitose. Nos procariotos.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 5 algumas células sofrem longas migrações do seu lugar de origem até sua localização final. sendo destinadas à função reprodutiva. O DNA eucariótico reveste complexos protéicos específicos. Essas células são chamadas de células germinativas. Os cromossomos procarióticos normalmente são hélices duplas de DNA. Os procariotos (do grego karion. a estrutura de um gene eucariótico é mais complexa do que a de um gene procariótico. Os nucleossomos organizam o DNA em estruturas compactas e são importantes na designação de qual gene irá se expressar em qual célula.3). possuem um tegumento nuclear bem formado circundando os seus cromossomos. O DNA de um gene eucariótico que codifica uma proteína. As células germinativas finalmente migram para as gônadas. O DNA entre os segmentos freqüentemente contém seqüências que estão envolvidas na regulação do momento e lugar em que o gene é ativado. onde estão incluídas as arqueobactérias e as eubactérias. Ao invés disso. O desenvolvimento de gametas. Nossa herança eucariótica Os organismos estão divididos em dois grupos principais. e um simples protista eucariótico possui 10 vezes. . Na maturidade. A maior parte dos ossos de nossa face são provenientes de células que migraram ventralmente da região dorsal da nossa cabeça. significa “núcleo”). Cromossomos eucarióticos também são muito diferentes dos cromossomos procarióticos. Nas bactérias não existem histonas. Todas as outras células do corpo são chamadas células somáticas. dependendo apenas se as células possuem um envoltório nuclear ou não. ou mais. não se desenvolve o fuso mitótico e. compostos por proteínas histonas. Como observado na Figura 1. chamado de gametogênese. na qual o tegumento nuclear se parte e os cromossomos replicados são igualmente divididos entre as células filhas (Figura 1. Essa diferença fundamental entre os eucariotos e procariotos influencia a maneira como esses grupos organizam e utilizam seu material genético. 4. normalmente não é completado até que o organismo tenha se tornado fisicamente maduro. uma parte especializada do citoplasma do ovo dá origem às células que são precursoras dos gametas. Em ambos os grupos. O organismo adulto finalmente sofre envelhecimento e morre. Essas células migrantes incluem os precursores das células sangüíneas. e finalmente colocam os cromossomos em diferentes células filhas. pequenas e circulares consistindo de aproximadamente 1 milhão de pares de bases. Esses pontos de ligação são separados entre si pelo crescimento da membrana celular. não possuem um núcleo verdadeiro. As células eucarióticas geralmente possuem diversos cromossomos. chamados nucleossomos. Os eucariotos que incluem os protistas. em muitas espécies. Essa separação entre células somáticas (que dão origem a um corpo individual) e células germinativas (que contribuem para a formação de uma nova geração) é freqüentemente uma das primeiras diferenciações que ocorrem durante o desenvolvimento animal. os cromossomos filhos permanecem ligados a pontos adjacentes na membrana celular. também.2). não existe tegumento celular para se partir. células linfáticas. células pigmentadas e gametas. Além disso. plantas e fungos. A seqüência de aminoácidos de uma proteína procariótica é a reflexão direta da seqüência de DNA do cromossomo. a quantidade de DNA encontrada na maioria dos procariotos complexos. Mais ainda.1. os gametas podem ser liberados e participar de uma fertilização dando início a um novo embrião.

(B) Expressão de genes eucarióticos. e o DNA e a RNA polimerase necessária para a transcrição estão do outro. Os ribossomos. estão de um lado do envoltório nuclear. Quando o RNA mensageiro (mRNA) é produzido nos procariotos. Desenvolvimento entre eucariotos unicelulares Todos os organismos eucarióticos pluricelulares se desenvolveram de protistas unicelulares. Sendo assim. o uso da superfície da célula para mediar cooperação entre células individuais e as primeiras ocorrências de reprodução sexual. Algumas das melhores evidências para essa teoria vieram de estudos onde organismos unicelulares foram fragmentados em pedaços .2 (A) CÉLULA PROCARIÓTICA (B) CÉLULA EUCARIÓTICA Envoltório nuclear Resumo dos passos pelos quais as proteínas são sintetizadas a partir do DNA. Entre a transcrição e a tradução. Os genes são descontínuos e um envoltório nuclear separa o DNA do citoplasma. que são responsáveis pela tradução. Controle da Morfogênese no Desenvolvimento em Acetabulária Há um século. transcrição e tradução são eventos simultâneos e coordenados. Regiões codificadoras do DNA são colineares com o produto protéico. A regulação pela qual o mRNA pode passar para o citoplasma.4). (A) Expressão procariótica (bacteriana) do gene. Em ambos. nos procariotos. ainda não havia sido provado se o núcleo continha alguma informação hereditária ou de desenvolvimento. Gene DNA Éxon 1 Íntron 1 Éxon 2 Íntron 2 Éxon 3 Núcleo Transcrição Transcrição RNA nuclear mRNA Tradução Citoplasma mRNA Processamento de RNA mRNA Tradução mRNA Proteína Proteína Procariotos e eucariotos têm mecanismos diferentes de regulação do gene.6 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 1. Mas a existência de envoltório nuclear em eucariotos proporciona a oportunidade de se obter um tipo de regulação celular totalmente novo. ele é imediatamente traduzido em uma proteína enquanto o seu outro terminal está sendo transcrito do DNA (Figura 1. um novo nível de complexidade foi adicionado. Assim. É nesses protistas que as características básicas do desenvolvimento apareceram primeiro. torna a célula capaz de selecionar quais das mensagens recém-sintetizadas serão traduzidas. o DNA é transcrito por enzimas chamadas RNA polimerases para produzir RNA. o RNA transcrito deve ser processado para que possa passar através do envoltório nuclear. que é extremamente importante para o organismo em desenvolvimento. Eucariotos simples nos deram os primeiros exemplos da morfogênese direcionada pelo núcleo.

quase todas as partes morreram. Núcleo Cromossomos filhos Metáfase: Os cromossomos se alinham no equador da célula.5) O controle nuclear da morfogênese celular e a interação do núcleo e citoplasma estão muito bem demonstrados nos estudos da Acetabulária. Durante a interfase o DNA é duplicado em preparação para a divisão celular. o envoltório nuclear quebra e forma-se um fuso entre os dois centríolos. Telófase: Os cromossomos atingem os pólos mitóticos e a célula começa a invaginar. Interfase: DNA é duplicado em preparação para a divisão celular. O tamanho da Acetabulária e a localização do seu núcleo permitiram que pesquisadores Diagrama de mitose em células animais. Anáfase: Os cromossomos duplicados (chamados cromatídeos) são separados. Durante a prófase. Na metáfase. Cada pólo contém o mesmo número e tipos de cromossomos que continha a célula antes da divisão. o pedúnculo e o rizóide (Figura 1. Essa enorme célula individual (2 a 4 cm de comprimento) consiste de três partes: o disco reprodutivo.6A).3 nucleados e anucleados (revisão por Wilson. regenerando todo a complexa estrutura celular (Figura 1. os fragmentos que continham núcleo foram capazes de sobreviver. O núcleo individual da célula se localiza dentro do rizóide. os cromosssomos se alinham no equador da célula e se inicia a anáfase.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 7 Prófase: O envoltório nuclear quebra e um fuso se forma entre dois centríolos. Na telófase os cromossomos atingem os pólos mitóticos e a célula começa a invaginar. . No entanto. os cromossomos duplicados (cada duplicata de cromossomo é um cromatídeo) são separados. Figura 1. 1986). Cromatídeos do cromossomo Cromatina Nucléolo Região do centrômero Fuso em desenvolvimento Centríolos Áster Envoltório nuclear Nucléolo Envoltório nuclear rompe Prometáfase: Os cromossomos se ligam às fibras dos fusos. Quando vários protistas foram fragmentados. O rizóide está localizado na base da célula onde essa é presa ao substrato.

Hämmerling descobriu que quando um núcleo de uma determinada espécie era transplantado para o pedúnculo de outra. Além disso.6B). Assim. foi considerado que o núcleo era o controlador do desenvolvimento da Acetabulária. Transcrições de RNA mensageiro podem ser vistas dos dois lados. A. se o núcleo for removido da célula de Acetabulária em estágio inicial do desenvolvimento. o novo disco em formação finalmente assumia a forma associada com o núcleo do doador (Figura 1. Miller. de outra célula. contém informação genética que especifica as proteínas necessárias para a produção de um certo tipo de disco reprodutivo).) removessem o núcleo de uma célula e o substituísse por outro. ainda que o organismo irá morrer. Uma porção de DNA de Escherichia coli se estende horizontalmente por essa microfotografia eletrônica. A formação de um disco reprodutivo é um evento morfogênico complexo. J. Nos anos 30. da esquerda para a direita. essas duas espécies têm discos reprodutivos muito diferentes. Fragmento anucleado morre .8 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento DNA Ribossomos RNA Figura 1. e (2) o material contendo essa informação entra no citoplasma muito antes dessa produção ocorrer. indicando a direção da transcrição. que devem ser acumuladas em certa porção da célula e então organizadas em estruturas complexas específicas da espécie. mediterranea e A. Hämmerling tirou proveito dessa singular característica e trocou núcleos entre duas espécies morfologicamente distintas. Ribossomos se juntaram ao mRNA e estão sintetizando proteínas (que não podem ser vistas). O mRNA pode ser visto aumentando de tamanho. (Cortesia de O.4 Transcrição e tradução simultânea em procariotos. Fragmento anucleado morre Corte Núcleo Fragmento nucleado se regenera Corte Figura 1. O núcleo transplantado da célula realmente direciona a síntese de seu disco reprodutivo espécie-específico. crenulata. Os fragmentos anucleados sobrevivem por algum tempo. Como é mostrado na fotografia. envolvendo a síntese de um grande número de proteínas.5 Regeneração do fragmento nucleado do protista unicelular Stylonychia. Jr. mas finalmente morrem. A informação no citoplasma não será usada por várias semanas. antes de formar o disco reprodutivo. L. mas é uma tarefa que pode levar semanas para ser realizada. Esses estudos sugerem que (1) o núcleo contém informação específica sobre o tipo de disco reprodutivo produzido (isto é. um disco normal se formará semanas depois.

a parte intermediária do pedúnculo não formou o disco reprodutivo. é que o núcleo sintetiza um mRNA estável. A porção com o núcleo finalmente formou um novo disco. um novo disco pode ser formado após a eliminação da ribonuclease. Garcia e Dazy (1986) também demonstraram que a síntese da proteína é especialmente ativa no ápice da Acetabulária. crenulata Pedúnculo A.) Uma hipótese atual. (Fotografias cortesia de H.6 (A) Acetabulária mediterranea (esquerda) e A. inibe completamente a formação do disco reprodutivo quando adicionada à água marinha na qual cresce a Acetabulária. da mesma forma o fez a extremidade apical do pedúnculo. posicionado em estado dormente no citoplasma até a formação do disco reprodutivo. esse efeito é permanente. mediterranea Núcleos transplantados Núcleo Núcleo Rizóide Rizóide 1 cm Rizóide 1 cm A estrutura do disco reprodutivo é a do núcleo doador Figura 1.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 9 (B) Disco reprodutivo (A) Disco reprodutivo Pedúnculo A. Hämmerling fracionou uma Acetabulária jovem em diversas partes (Figura 1.7). proposta para explicar essas observações. Essa hipótese é amparada por uma observação publicada por Hämmerling em 1934. Fica claro pela discussão anterior. conforme esperado. que as instruções para a formação do disco reprodutivo se originavam no núcleo. Núcleos foram transplantados para fragmentos de rizóides anucleados. No entanto. sendo de alguma forma guardadas dormentes próximo à extremidade do pedúnculo. crenulata (direita). Muitos anos mais tarde. O rizóide contém o núcleo. Harris. crenulata estão sombreadas. Em células nucleadas. mediterranea não estão sombreadas. que a transcrição nuclear tem um papel importante na formação do disco reprodutivo da Acetabulária. (B) Efeitos da troca de núcleos entre duas espécies de Acetabulária. Em células anucleadas. no entanto. presumivelmente porque um novo mRNA é então produzido pelo núcleo. Ribonuclease. Hämmerling postulou (aproximadamente 30 anos antes de sabermos da existência do mRNA). não pode mais haver a formação do disco reprodutivo. Cada unidade é uma célula singular. Estruturas de A. uma vez que o RNA é destruído. uma enzima que cliva RNA. Kloppstech e Schweiger (1975) estabeleceram que o mRNA derivado do núcleo se acumula nessa região. Mas deve ser notado que o . Por isso. estruturas de A.

a expressão do disco reprodutivo é controlada não somente pela transcrição nuclear como também pelo controle de tradução do RNA citoplasmático. a ameba tem que criar centríolos para servir como corpos basais do flagelo (centros organizadores de microtúbulos). ao invés de existirem diversos tipos de células diferenciadas em um único organismo. esses são posteriormente arranjados para permitir o movimento flagelar. mesmo estando no citoplasma. que são usados para encontrar regiões mais abundantes em bactérias. essa célula única tem estruturas celular e bioquímica diferentes nos diferentes estágios de sua vida. das quais a mais abundante é a tubulina.10 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Disco reprodutivo e pedúnculo regenerados Extremidade apical do pedúnculo Porção central do pedúnculo Sem regeneração Rizóide e núcleo Regeneração total Figura 1. No entanto. alimentando-se de bactérias do solo e dividindo-se por cisão. Algo no citoplasma controla quando as mensagens devem ou não ser utilizadas. Diferenciação em Ameboflagelados Naegleria Um dos casos mais marcantes de “diferenciação” em protistas. Nesse organismo unicelular. gruberi é uma ameba típica. Portanto. O mRNA não é traduzido durante semanas.7 Habilidade regenerativa de diferentes fragmentos da A. a N. Fulton e Walsh (1980) mostraram que a tubulina dos flagelos de Naegleria não existe .9). o “desenvolvimento” é controlado em ambos estágios de transcrição e de tradução. de uma ameba para a de um flagelado (Figura 1.8). é aquele de Naegleria gruberi. Durante a maior parte do seu ciclo de vida. Os corpos basais e os flagelos são compostos de diversas proteínas. Diferenciação para a forma de flagelado ocorre aproximadamente em uma hora (Figura 1. assim como criar o próprio flagelo. Nessas condições. gruberi desenvolve rapidamente uma forma aerodinâmica e dois longos flagelos anteriores. Durante esse período. cada N. As moléculas de tubulina são organizadas em microtúbulos. Esse organismo ocupa um lugar especial na taxonomia protista porque pode mudar sua forma. mediterranea citoplasma também cumpre uma parte essencial na formação desse disco. quando as bactérias são diluídas (tanto pela água da chuva quanto pela água nos experimentos).

Existem em torno de 300 outras proteínas em cada flagelo. que é o agrupamento de moléculas de tubulina para a produção do flagelo.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 11 (A) (B) (C) (D) Figura 1. Tal controle pós-tradução. Então. (A) 0 minutos. Esse arranjo. Para mostrar isso. (C) 70 minutos. será discutido melhor mais tarde. mostrando síntese de nova tubulina. e esses por sua vez agrupados de forma ordenada.) . que o desenvolvimento em eucariotos unicelulares pode ser controlado nos estágios de transcrição. Em mamíferos. onde uma proteína não é funcional até que esteja ligada a outras moléculas. Vimos então. os pesquisadores manipularam transcrições em vários estágios com actinomicina D. linha inferior corada com um anticorpo fluorescente à proteína tubulina dos microtúbulos. Transformação de Naegleria gruberi da forma amebóide ao estado flagelado. Notamos também um outro processo que permanece extremamente importante no desenvolvimento de todos os outros animais e plantas. Walsh. não é somente a tubulina que produz o flagelo. e o movimento flagelar depende da orientação adequada dessas proteínas uma em relação a outra. pelo qual a tubulina é polimerizada em microtúbulos. esse antibiótico previne a síntese da tubulina. a tubulina ainda é produzida em tempo normal (aproximadamente 30 minutos mais tarde). Até mesmo processos celulares têm a sua própria “morfogênese” baseada em interações moleculares entre os fragmentos de proteína. mostrando flagelos maduros e forma aerodinâmica do corpo (de Walsh.8 em seu estágio de ameba. se a actinomicina D é adicionada 20 minutos após a diluição. Quando adicionada anteriormente à diluição do alimento. Portanto. tradução e pós-tradução. detectável para tubulina flagelar. cortesia de C. começando com uma nova transcrição no núcleo. 1984. é visto em toda a natureza. uma droga antibiótica que seletivamente inibe a síntese do RNA. parece que o mRNA para a tubulina foi produzido durante os primeiros vinte minutos após a diluição e usado logo em seguida. É produzida de novo (“desde o começo”). temos aqui um excelente exemplo de controle transcricional de um processo de desenvolvimento: O núcleo da Naegleria responde a mudanças ambientais sintetizando o mRNA para tubulina flagelar. 1984). ao passo que mRNA extraído de células diferenciadas continha muitas mensagens desse tipo (Walsh. Essa interpretação foi confirmada quando foi demonstrado que o mRNA extraído da ameba não continha mensagem alguma. emergência de flagelos visíveis (D) 120 minutos. No entanto. está evidente no flagelo do espermatozóide e nos cílios da medula espinhal e do trato respiratório. Linha superior corada com Iodo/Lugol. A transformação é iniciada pela eliminação do alimento (bactérias) da colônia de Naegleria. (B) 25 minutos. Mais ainda.

Cada macronúcleo (que controla o metabolismo do organismo) degenera enquanto o micronúcleo passa por meiose para produzir oito micronúcleos haplóides. C. Amebas que vinham crescendo em um meio enriquecido com bactéria são lavadas afim de se eliminar as bactérias no tempo 0. dos quais todos. O micronúcleo remanescente divide-se mais uma vez para formar um micronúcleo estacionário e um micronúcleo migratório. Protistas são também capazes de reorganizar genes sem reprodução.) a lin bu a tu e ç da m e co es r nt l a Sí a g e fl am o de rp r nç to s co ela ca o en al n t is de lag m ula m ve os e pa cél nda isí ão a f el r i m u v aç m ag gr s. o m or os A asai rred Fl o m p l el or f c ta b a F m ag se to Fl co co rp os 100 Porcentagem da população com flagelo 80 Células de corpo com forma flagelar 60 40 20 0 0 20 40 60 Tempo após suspensão (minutos) 80 100 Figura 1. e J. Quando dois paramécios se juntam. 1977.12 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 1. houve sexo. Aos 80 minutos. Cada micronúcleo migratório atravessa a ponte citoplasmática e se funde com o micronúcleo estacionário (“fertilizante”). criando um novo núcleo diplóide em cada célula.) As Origens da Reprodução Sexual A reprodução sexual é outra invenção dos protistas que teve um profundo efeito em organismos mais complexos. . se reproduzem por cisão. (Segundo Fulton. Essa transmissão é independente da reprodução. exceto um.9 Diferenciação do fenótipo flagelado em Naegleria. o pilus sexual está realçado por partículas virais que se ligam especificamente àquele estrutura. Esse núcleo diplóide se divide mitoticamente fazendo surgir um novo micronúcleo e um novo macronúcleo quando os dois parceiros se separam. eles se unem através de seus aparelhos orais formando uma conexão citoplasmática através da qual podem trocar material genético (Figura 1. mas o sexo é realizado através de conjugação. Os paramécios. (Cortesia de C. Jr. Brinton. não há discriminação nos genes quando uma ameba se divide ou quando uma hidra brota células para formar uma nova colônia.10). Algumas células de bactérias estão cobertas de numerosos apêndices (pilos) sendo capazes de transmitir genes para uma célula recipiente (sem pilos) através de um pilus sexual. degeneram. Carnahan. por exemplo. Nessa figura. Reprodução na ausência de sexo é uma característica de organismos que se reproduzem por cisão.10 Sexo em bactérias. praticamente toda a população desenvolveu flagelo. Ainda que não tenha ocorrido reprodução. Sexo envolve a combinação de genes de dois indivíduos distintos em um novo arranjo. Deve-se notar que sexo e reprodução são dois processos separáveis e distintos.11). A reprodução envolve a criação de novos indivíduos. As bactérias são capazes de transmitir genes de um indivíduo para o outro por meio dos pilos sexuais (Figura 1. Sexo sem reprodução também é comum entre os organismos unicelulares.

14. 1975). estão divididos em dois grupos de parceiros: mais e menos. Quando se encontram. Note que nesse tipo de reprodução sexual protista. o reconhecimento ocorre primeiro nas membranas flagelares (Figura 1. os indivíduos mais iniciam a fusão estendendo um tubo de fertilização. juntam-se os citoplasmas e seus núcleos se fundem para formar um zigoto diplóide. O primeiro é o mecanismo da meiose (Figura 1. Em Chlamydomonas. sexo e reprodução.12 mostra o ciclo de vida da Chlamydomonas. Goodenough e Weiss. 1985. Os indivíduos de cada espécie. pois cromossomos são realinhados durante as divisões meióticas onde mais indivíduos são formados. Seguindo-se à aglutinação. formando 8 núcleos haplóides por célula. O outro avanço é o mecanismo pelo qual os parceiros reprodutivos diferentes se reconhecem um ao outro.13).) A união desses dois processos distintos. Esse zigoto é a única célula diplóide do ciclo de vida e passará por meiose para formar quatro novas células de Chlamydomonas. 1975. é visto em eucariotos unicelulares. dois importantes avanços foram alcançados. pelo qual o complemento diplóide dos cromossomos é reduzido ao estado haplóide (discutido em detalhe no Capítulo 22).11 União de paramécios através da ponte citoplasmática. . A Figura 1.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 13 Micronúcleo Macronúcleo Fuso meiótico Ponte citoplasmática Dois paramécios formam ponte citoplasmática Micronúcleos passam por meiose. os gametas são morfologicamente idênticos e a distinção entre espermatozóide e óvulo ainda não aconteceu.. A aglutinação dos flagelos permite que regiões específicas das membranas celulares se juntem. Esses setores especializados contêm componentes reprodutivos específicos que permitem a fusão dos citoplasmas. Bergman et al. onde dois paramécios podem trocar material genético. (Strickberger. macronúcleos degeneram Todos menos um dos micronúcleos de cada parceiro degeneram Micronúcleo estacionário Micronúcleo migratório Micronúcleo restante se divide para formar um micronúcleo estacionário e um migratório Micronúcleos migratórios atravessam a ponte citoplasmática e fertilizam os micronúcleos estacionários do parceiro Núcleo diplóide se forma e sofre divisões mitóticas para gerar um novo macronúcleo e dois micronúcleos quando os paramécios se separam Figura 1. Aqui está uma reprodução sexual. Esse organismo é geralmente haplóide. Com a evolução da reprodução sexual. deixando cada um com genes que diferem daqueles com os quais iniciaram o processo. no entanto. em reprodução sexual. portando apenas uma cópia de cada cromossomo (como os gametas dos mamíferos).

Respeitando certas condições.13 Sumário da meiose. . Reagrupamentos cromossômicos podem ocorrer entre quatro cromatídeos homólogos nesse estágio. Rearranjos cromossômicos podem ocorrer entre os quatro cromatídeos homólogos neste momento. Durante a segunda divisão.12 Reprodução assexual (mitótica) Parceiro tipo mais (haplóide) Parceiro tipo menos (haplóide) Reprodução sexual em Chlamydomonas. os dois cordões podem se unir para produzir uma célula diplóide que pode sofrer meiose para formar quatro novos organismos haplóides. deixando cada nova célula com uma cópia de cada cromossomo. (Segundo Strickberger. O DNA e as proteínas associadas replicam durante a interfase. Após a primeira metáfase. podem se reproduzir assexuadamente quando separadas. com os cromatídeos ligados no centrômero) se alinham aos pares. Durante a prófase. ambas haplóides. MEIOSE I Envoltório nuclear Núcleo Cromossomos homólogos Cromatídeos homólogos Cromatina Interfase Prófase I precoce Meia prófase I Prófase I tardia Metáfase I O envoltório nuclear se rompe e cromossomos homólogos (cada cromossomo sendo duplo. 1985.14 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 1. os dois cromossomos homólogos originais são segregados em células diferentes. o envoltório nuclear se rompe e os cromossomos homólogos (cada cromossomo é duplicado.) Reprodução sexual Acasalamento Fusão citoplasmática Zigoto (diplóide) Maturação (meiose) Germinação Dois parceiros tipo mais e tipo menos Figura 1. Duas linhagens. com os cromatídeos juntos no centrômero) se alinham em pares. o centrômero se divide.

veremos que o reconhecimento e fusão de espermatozóide e óvulo ocorrem de uma maneira espantosamente semelhante a desses protistas. 1975. torcemse um em torno do outro. mitose e meiose são aperfeiçoadas. com permissão de U..000x) de uma ponte citoplasmática conectando os dois organismos. Eucariotos unicelulares parecem ter os elementos básicos do processo de desenvolvimento que caracterizam os organismos mais complexos: a síntese celular é controlada pela regulação transcricional.Tal cooperação intercelular se torna ainda mais importante com a evolução de organismos multicelulares. as estruturas de genes individuais e cromossomos são como serão através da evolução eucariótica. Goodenough. É interessante que o mecanismo usado para estender esse tubo .) Esse tubo conecta e se funde com um local específico no indivíduo menos. Os microfilamentos se estendem da célula doadora (abaixo) para a célula recipiente (acima).também é usado para estender processos do espermatozóide e óvulo do ouriço-do-mar. (B) Microfotografia eletrônica de transmissão (20.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 15 (A) (B) Figura 1. MEIOSE II Anáfase I Telófase I Os dois cromossomos homólogos originais são segregados em células diferentes Metáfase II Anáfase II O centrômero se divide Telófase II Cada nova célula tem uma cópia de cada cromossomo . Os flagelos que interagem.14 Microfilamentos Duas etapas do reconhecimento no acasalamento de Chlamydomonas. por tradução e pós-tradução. (A) Varredura por micrografia eletrônica (7000x) de par em acasalamento. (de Goodenough e Weiss. aderindo nas pontas (flexas). envolvendo a cooperação entre células individuais. e a reprodução sexual existe.polimerização da proteína actina . No Capítulo 4. 1975 e Bergman et al. existe um mecanismo para processar o RNA através da membrana nuclear.

Aqui todas as 64 células são originalmente similares. Pandorina. (C) Pandorina morum. Kirk. como o Chlamydomonas. e normalmente o faz. porém. Aqui. As células menores. Parece ter havido diversos caminhos pelo qual uma única célula evoluiu para uma disposição pluricelular. mas as posteriores desdiferenciam e rediferenciam como células assexuadas reprodutivas chamadas gonídios. as células da região anterior são restritas à uma função somática. Todas. Esse caminho para a multicelularidade pode ser visto em uma notável série de organismos pluricelulares. Os dois próximos gêneros da série volvocacea exibem um outro princípio importante do desenvolvimento: a diferenciação de tipos celulares em organismo individual. O primeiro caminho envolve a divisão ordenada da célula reprodutiva e a subseqüente diferenciação da sua progênie em diferentes tipos de células. coletivamente referidos como a família das Volvocaceas ou volvocaceanas. E. cada uma parecida ao protista unicelular Chlamydomonas. por exemplo. 50µm (Cortesia de D. (F) Volvox carteri. As células reprodutivas se diferenciam das células somáticas. Na Pleodorina californica.15). produzir um organismo novo completo por mitose (Figura 1.16 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Eucariotos coloniais: A evolução da diferenciação Um dos mais importantes experimentos da evolução foi a criação de organismos pluricelulares. A complexidade aumenta do Chlamydomonas unicelular ao Volvox pluricelular.15 Representante da ordem dos Volvocales.16 A. menos o Chlamydomonas. discutiremos apenas dois deles (veja o Capítulo 23 para uma discussão mais completa). a esfera contém 32 ou 64 células organizadas em um padrão regular. 25µm. (A) o protista unicelular Chlamydomonas reinhardtii. BD. 16 células formam uma esfera. as divisões celulares pelo qual uma única célula de volvocacea produz um organismo de 4 a 64 células ocorrem em uma seqüência muito rápida e com ausência de crescimento celular. são membros da família das Volvocaceas. somáticas. cada uma com seu próprio flagelo.) (A) (B) (C) (D) (E) (F) . Como ocorre na maioria dos embriões animais. Um único organismo de volvocacea do gênero Gonium (Figura 1. As Volvocaceanas Os organismos mais simples entre as volvocaceanas são reuniões ordenadas de numerosas células. somente aquelas Figura 1. um princípio muito importante tem-se desenvolvido: a divisão ordenada de uma célula para gerar um número de células que são organizadas de uma maneira previsível. e no Eudorina. Nos gêneros Pleodorina e Volvox. relativamente poucas células podem se reproduzir. Barra em A é de 5µm. (E) Pleodorina californica. (B) Gonium pectorale com oito células Chlamydomonas-símiles em um disco convexo. Nesses organismos. Em todos os gêneros já mencionados. Em um gênero relacionado. (D) Eudorina elegans.B). toda a célula pode. enquanto as células anteriores permanecem pequenas e biflageladas. F. lembram Chlamydomonas. consiste de uma placa plana contendo de 4 a 16 células. células destinadas a se tornarem gonídios são separadas no começo do desenvolvimento e nunca desenvolvem características somáticas.

no V. a reprodução sexual é isogâmica. essa separação de células germinativas das células somáticas no início do desenvolvimento é característica de muitos filos animais e será discutida em maior detalhe no Capítulo 13. a reação da fertilização se assemelha à do Chlamydomonas porque resulta na produção de um zigoto diplóide dormente. incluindo seu parente unicelular Chlamydomonas. (C) Volvox carteri maduro. Em P. Mas as volvocaceas maiores desenvolveram uma forma especializada de heterogamia. chamada oogamia. Ainda que as volvocaceas mais simples sejam consideradas organismos coloniais (porque cada célula é capaz de existência independente e perpetuação da espécie).1921. que envolve a produção de óvulos grandes e relativamente imóveis por um parceiro do acasalamento e espermatozóides pequenos e móveis pelo outro parceiro (veja Visões Colaterais & Especulações). Células germinativas (gonídia) começaram a se dividir em novos organismos.. são inteiramente especializadas para reprodução. se reproduzam predominantemente por meios assexuados. Kirk. Assim. em outros membros do gênero. [other. No entanto. uma típica colônia de 128 células tem 48 células somáticas e uma colônia de 64 células tem 24 células somáticas. e a relação do número de células somáticas para o número de células reprodutivas é normalmente 3:5. (A e B segundo Hartmann. também são capazes de reprodução sexual. capaz de sobreviver a condições ambientais severas. Quando as condições permitem aos zigotos germinar. californica. Isso é chamado heterogamia.assim como as várias espécies de volvocaceas coloniais . Em algumas espécies de Volvox. C de Kirk et al.16 (A) (B) (C) Reprodução assexuada nas volvocaceanas. são derivadas de células que originalmente parecem e funcionam como células somáticas antes de crescer e se dividir para formarem uma nova progênie. carteri. estrutura e motilidade. e possuem caminhos diferentes para desenvolver o óvulo ou o espermatozóide. Embora todas as volvocaceas. inativo.16C). já que os gametas haplóides que se encontram são similares em tamanho. 1982. Nos Volvox. as volvocaceas incluem os organismos mais simples que têm macho e fêmea distinguíveis.) células do lado posterior podem se reproduzir. (B) Cada uma das células de E.html#intro1] . eles primeiro sofrem meiose para produzir herdeiros haplóides dos dois parceiros em números iguais. As células reprodutivas nunca desenvolvem um flagelo funcional e nunca contribuem para motilidade e outras funções somáticas do indivíduo. Em muitas espécies de Chlamydomonas.gametas nadadores de diversos tamanhos são produzidos por parceiros de acasalamentos diferentes. e muito poucas células são capazes de produzir novos indivíduos. existe uma divisão do trabalho completa: as células reprodutivas que vão criar a nova geração são colocadas de lado durante a divisão das células reprodutivas que estão formando um novo indivíduo. Embora nem todos os animais separem suas células reprodutivas das células somáticas (e as plantas raramente o fazem). como o V. a colônia normalmente tem 128 ou 64 células. incluindo a ilustrada na Figura 1.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 17 Figura 1. Dessa maneira. No entanto. ambos requeridos para a perpetuação da espécie (Figura 1. Isso envolve a produção e fusão de gametas haplóides. A maioria das células são incapazes de se reproduzir. (A) Colônia madura de Eudorina elegans. Aqui vemos um gameta especializado para retenção de recursos nutricionais e de desenvolvimento e outro gameta especializado para transporte de núcleos. Em todas as volvocaceas. elegans se divide e produz uma nova colônia. em outras espécies de Chlamydomonas . quase todas células são somáticas.12. carteri temos um organismo verdadeiramente celular com dois tipos de células independentes e distintos (somático e reprodutivo). células reprodutivas como as da Pleodorina. cortesia de D.

) Maturação dos gonídios Expansão continuada da matriz extracelular Expansão continuada de juvenis Liberação de juvenis Morte de células somáticas . o volvox embrionário se inverte e é finalmente liberado do progenitor. enquanto a colônia juvenil amadurece. todas as células que estarão presentes no adulto. são potencialmente imortais.17). A morte chega para uma ameba apenas se ela é ingerida ou sofre um acidente fatal. Através de uma série de movimentos celulares semelhantes à gastrulação. pelo qual o embrião se vira com o lado certo para fora através de movimentos celulares que fazem lembrar movimentos de gastrulação no embrião animal (Figura 1. passam por senescência e morrem. Essa condição adversa é corrigida por um processo chamado inversão. nenhuma das duas células resultantes pode ser considerada ancestral ou progênie. (Segundo Kirk. incluindo nós mesmos.progenitores . quando isso acontece. No fim da clivagem. dispostas em umas das extremidades do interior. foram produzidas de cada um dos gonídios. As células somáticas do progenitor. o Volvox está entre os organismos mais simples a exibir a divisão de trabalho entre dois tipos de células diferentes.18 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Informações adicionais & Especulações Sexo e Individulidade em Volvox S imples como é. geneticamente programada. chamadas gonídios.17 Embriogênese Adulto com juvenis Adulto com gonídios maduros Expansão de adultos e juvenis Reprodução assexual em V. Um agrupamento de Figura 1.18). Quando as células reprodutivas (gonídios) estão maduras. Morte e Diferenciação Organismos unicelulares que se reproduzem através de uma simples divisão celular. Quando maduro. cada gonídio divide-se rapidamente 11 ou 12 vezes. da sua história de vida. Como já foi mencionado. carteri. Cada adulto assexuado é um esferóide contendo aproximadamente 2000 pequenas células somáticas biflageladas ao longo de sua periferia e por volta de 16 grandes células reprodutivas assexuadas. elas são parentes. entram em um estado semelhante à clivagem do desenvolvimento embrionário para produzir seres juvenis dentro do adulto. tais como as amebas. está entre os organismos mais simples a incluir a morte como uma parte regular. A ameba que vemos sob um microscópio não tem ancestrais mortos! Quando uma ameba se divide. Parte dessa divisão é assimétrica e produz as 16 células grandes que irão se tornar um novo conjunto de gonídios. Considere o histórico de vida do Volvox carteri quando se reproduz assexuadamente (Figura 1. Mas o embrião está “virado de dentro para fora”: seus gonídios estão do lado de fora e os flagelos de suas células somáticas estão apontando para o interior da esfera oca de células. Como conseqüência disso. a morte se torna uma parte essencial da vida para qualquer organismo pluricelular que estabelece divisão de trabalho entre células somáticas e células germinativas (reprodutivas). Porém. o Volvox compartilha muitos traços que caracterizam o ciclo de vida e histórico de desenvolvimento de organismos muito mais complexos. 1988. O ciclo sexual total dura dois dias. sem gonídios. a célula morta não deixa prole.

F.G).19). elas cometem suicídio. “Dessa maneira emerge”.19 “Células garrafas” próximas à abertura do fialoporo. As células se curvam e se reúnem em um dos pólos (C-E. Posteriormente. foi identificado um gene* específico que tem um papel importante regulando a morte das células (Kirk. cortesia de D. essas células somáticas morrem. Essas células permanecem estreitamente conectadas através de pontes citoplasmáticas próximas a seus ápices alongados.) (C) (H) das células que as produzem (Pommerville e Kochert. Quando as células mudam a sua forma. e as células serão capazes de se tornarem gonídios (D. carteri produzidos assexuadamente. 1982). as colônias juvenis são enzimaticamente soltas do progenitor e nadam livres. Kirk. ( Kirk et al. O que acontece às células somáticas do “progenitor” Volvox agora que as jovens “deixaram o lar”? Tendo produzido uma cria e sendo incapazes de uma nova reprodução. H-J). as células somáticas abandonam suas tendências suicidas.. Kirk.) . cortesia de D. 1982. comunicação pessoal). Mutações de perda da função impedirão a proteína de agir. todo o nutriente acumulado durante toda a vida. 1988). desse modo criando a tensão que causa a curvatura da lâmina celular interconectada. O embrião se utiliza desse buraco para fazer a inversão e depois o fecha. Além do mais. carteri.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 19 (A) (F) Figura 1. incluindo sua própria cria. um buraco (o fialoporo) abre-se no topo do embrião (A. (Kirk et al. “um dos grandes temas da vida no planeta Terra: Alguns morrem para que outros possam viver”. Kirk. (D) (I) (E) (J) células em forma de garrafa abre um buraco em um dos lados do embrião produzindo tensão sobre a camada de células interconectadas (Figura 1.. visualizado por microscopia diferencial de interferência. ganham a habilidade de se reproduzirem * Esse gene (regA) foi clonado e mostrou codificar uma proteína que age para reprimir (direta ou indiretamente) todos os genes cujos produtos são requeridos pela célula para se desenvolver como gonídio. Para ser mais exato. o embrião é uma esfera côncava de células conectadas. FJ são cortes sagitais através do centro do embrião. A-E são micrografias eletrônicas de varredura de embriões completos. 1982.18 (B) (G) Inversão dos embriões V. as células liberam para o uso de outras. sintetizando um conjunto de proteínas que causam a morte e a dissolução Figura 1. como assinala David Kirk. Antes da inversão.B. Em V. nessa morte. Em linhagens laboratoriais possuindo mutações desse gene.

20). Desenvolvimento sexual de gonídios Pacotes de espermatozóide Indutor sexual Espermatozóide Macho assexuado Gonídio Desenvolvimento embrionário modificado dos gonídios resultando em produção de gametas Macho sexuado Óvulos Indutor sexual Óvulo Fêmea assexuada Meiose e germinação Fêmea sexuada Zigotos . na natureza se reproduzem sexualmente uma vez por ano. produzindo zigotos inativos que sobrevivem ao calor e à seca do alto verão e ao frio do inverno. assim como o é para um camundongo ou o homem. carteri vive em pequenas poças rasas que temporariamente se enchem com as águas das chuvas da primavera e secam no calor do verão. Machos e fêmeas são indistiguíveis na sua fase assexuada. os gonídios de ambos parceiros passam por uma embriogênese modificada que leva à formação de óvulos nas fêmeas e espermatozóides nos machos. como Leeuwenkoek observou. indica que a morte das células tem um papel importante na sobrevivência do V. certamente que sim. O zigoto resultante tem paredes duras que podem resistir à seca. momentos antes das células somáticas do esferóide tipo-selvagem começarem a morrer. carteri. V. carteri sob condições naturais. Reprodução sexual em V. Esses volvox morreriam em minutos se a poça secasse. Ao alcançar a fêmea o pacote se rompe em espermatozóides individuais. No entanto. e uma nova geração geneticamente diferente é produzida. cada célula do mutante irá se dividir para formar ( regenerar) um novo esferóide que irá repetir esse ciclo do desenvolvimento potencialmente imortal.21 advento da inevitável morte natural no reino animal.20 Mutação de um único gene (chamado regenerador somático A) elimina a programação de morte em células V. uma geração de indivíduos morre. Como Hegner.20 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) assexuadamente e se tornam potencialmente imortais (Figura 1. pacotes de espermatozóide (contendo 64 ou 128 espermatozóides cada). as células somáticas desse mutante se rediferenciam como gonídios (B). mas o V. carteri é devido a uma proteína (B) Figura 1. Quando sua hora chegar. Volvox deve morrer.. calor e frio.Mas para o Volvox a morte parece inevitável. Quando os gametas estão maduros. carteri se reproduzindo assexuadamente a maior parte do tempo. carteri nada livremente. que podem fertilizar os óvulos. são liberados e nadam para as fêmeas. Quando o faz. carteri. Durante a maior parte desse tempo. reproduzindo-se assexuadamente.. Quando as chuvas da primavera fazem o zigoto germinar. Quando a proteína indutora sexual está presente. Quando a chuva enche esses pequenos reservatórios na primavera. V. porque teve filhos e não é mais necessário. [intro2. O fato desses mutantes nunca terem sido encontrados na natureza. vai para o fundo juntar-se a seus ancestrais. O naturalista Joseph Wood Krutch (1956) colocou isso de uma forma mais poética: A ameba e o paramécio são potencialmente imortais. os zigotos interrompem a sua dormência e criam uma nova geração para reproduzirem-se assexuadamente até que as águas ameacem secar novamente. escreveu. Finalmente. e tudo em nome do sexo. carteri é capaz de sobreviver se tornando sexual pouco antes da secagem das poças. sofrendo meiose para produzir machos e fêmeas haplóides que se reproduzem assexuadamente até o calor induzir novamente o ciclo sexual. o zoologista de Johns Hopkins. ”E pergunta: “Vale a pena?” Para Volvox carteri. “Esse é o primeiro Figura 1. Volvox recémeclodido carregando essa mutação (A) é indistinguível do esferóide tipo-selvagem. tomba em silêncio.html] Entra o sexo Mesmo o V. ano após ano? O estímulo para mudança do modo assexual para o modo sexual de reprodução em V. Como esses organismos tão simples prevêem a chegada de condições adversas com acuidade suficiente para produzir uma geração sexual no tempo certo.

21). e o grex se diferencia em um corpo de frutificação composto de células esporos e pedúnculo. porque células inicialmente iguais são diferenciadas em dois tipos alternativos de células. formam o pedúnculo tubular. Qual é a fonte dessa proteína indutora sexual? Kirk e Kirk (1986). Essa descoberta explica uma observação feita há quase 90 anos. Duas amebas podem fundir-se para criar uma célula gigante. Em adição a esse ciclo sexual. elevadas acima do pedúnculo. e por fim. Quando isso era feito. Essas se dispersam.1993). de que “na intensa radiação solar do verão de Nebraska. Observamos. se alimentando de bactérias e se reproduz por cisão binária. Quando tiver esgotado seu suprimento de comida. As células anteriores. Dictyostelium não é um fungo (como Neurospora). a migração cessa. também. As células do pedúnculo morrem. Volvox encontrou um meio de sobrevivência: usa o calor para induzir a formação de indivíduos sexuados cujo acasalamento produz zigotos capazes de sobreviver sob condições que matam o organismo adulto. Um outro tipo de organização multicelular derivada de organismos unicelulares é encontrada no Dictyostelium discoideum. 1908). se enquista em uma parede grossa e sofre divisões meiótica e mitótica. cada uma tornando-se uma nova mixameba. O pedúnculo começa na parte centro-anterior da célula. multiplicar-se. . Aqui se amontoam uma sobre a outra sob forma de um cone chamado de agregado apertado ou justo. que se dobra formando uma lesma migratória (com a ponta na frente). O grex começa a migrar (se o ambiente está escuro e úmido) com sua ponta anterior um pouco levantada. 1991). quando atinge uma área iluminada. Ainda que reservatórios temporários formados pela água das chuvas sequem sob o calor do verão. esporo e pedúnculo. nem é consistentemente pegajoso. Dictyostelium tem sido um maravilhoso organismo experimental para biologistas do desenvolvimento. uma ponta surge no topo desse monte. À medida que as células pré-pedunculares se diferenciam. A lesma (geralmente lhe é dado um título mais dignificado de pseudoplasmódio ou grex) mede normalmente de 2 a 4 mm de comprimento e é envolvida por uma bainha viscosa.22. Sendo a quantidade da proteína secretada por um indivíduo suficiente para iniciar o desenvolvimento sexual em mais de 500 milhões de volvox assexuados. Essa proteína é tão poderosa que concentrações menores que 6x10-17 fazem com que os gonídios sofram um padrão modificado de desenvolvimento embrionário que resulta na produção de óvulos ou espermatozóides. mas as células posteriores. É melhor considerá-lo como uma ameba social. carteri à temperaturas que poderiam ser encontradas em um reservatório raso durante o fim do verão. transformam-se em células-esporo. que digere todas as outra células do agregado. descobriram que o ciclo sexual poderia ser iniciado esquen- tando placas com V. dezenas de milhares dessas amebas se juntam para formar um fluxo corrente de células que convergem em um ponto central. enquanto as células prépedunculares começam a secretar um revestimento extracelular estendendo um tubo através do grex. uma solitária ameba haplóide (chamada myxamoebae ou “ameba social” para distingui-las de espécies de amebas que sempre permanecem solitárias) vive em troncos caídos. Os espermatozóides são liberados para nadar para a fêmea onde fertilizam os óvulos para produzir zigotos dormentes (Figura 1.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 21 sexual indutiva de 30-kDa. existe a possibilidade para sexo em Dictyostelium. formam vacúolos e aumentam de tamanho levando a massa de células pré-pedúnculo que havia ficado nos quatro-quintos posteriores do grex (Jermyn e Williams.. Diferenciação e Morfogênese em Dictyostelium O CICLO DE VIDA DO DICTYOSTELIUM. Volvox é capaz de aparecer. realizando uma orgia sexual reprodutiva em poças de água da chuva de apenas duas semanas” (Powers. Em seu ciclo vegetativo. É também um organismo onde células individuais se juntam para formar uma estrutura coesa composta por tipos de células diferenciadas. Subseqüentemente. Quando tiver ingerido todos seus vizinhos. um único volvox indutor pode converter um reservatório inteiro para a sexualidade. que o desenvolvimento está criticamente ligado ao ecossistema ao qual o organismo se adaptou para sobreviver. parecido com a formação de tecidos em organismos * Embora chamado coloquialmente um “fungo celular pegajoso”. as células somáticas dos volvox assexuados produziam a proteína sexual indutora. representando 15 a 20 porcento de toda população celular. novas mixamebas são liberadas. dependendo do sexo genético do indivíduo (Sumper et al.* O ciclo de vida desse organismo fascinante é ilustrado na Figura 1.

e forma-se um agregado de pseudoplasmódio. Essa substância foi posteriormente identificada como adenosina 3’. não é um simples movimento radial. 1970. Embora o movimento seja direcionado para um ponto central. Não há células “dominantes” que começam a secreção ou controlam as outras. O .22 Ciclo vital de Dictyostelium discoideum. A agregação é iniciada à medida que cada célula começa a sintetizar o cAMP. as células se juntam umas às outras para formar correntes.22 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Lesma (Pseudoplasmódio. esse pára de se movimentar e forma um corpo de frutificação que libera mais esporos.23A. Antes. 1972. e finalmente todas se juntam no centro. Bonner (1947) e Shaffer (1953) mostraram que esse movimento é devido à quimiotaxia: as células são guiadas para os centros de agregação por uma substância solúvel. ocorre agregação em pontos centrais. A agregação de milhares de amebas em um único organismo é um feito incrível de organização e convida à experimentação para resolver perguntas sobre os mecanismos envolvidos. Os números referem-se às horas decorridas desde que a diluição nutricional iniciou a seqüência desenvolvimental. cuja estrutura química está mostrada na Figura 1.. Bonner et al.. que podem reproduzir-se assexualmente para formar mais mixamebas haplóides. 1967. 1969). Finalmente.5’ monofosfato cíclico (cAMP) (Konijn et al. a células não respondem mais aos pulsos de cAMP por vários minutos. Antes. Tyson e Murray. AGREGAÇÃO DE CÉLULAS DE DICTYOSTELIUM. Em seguida. ou acompanhando a liberação de seu cAMP próprio (Robertson et al. 1989). essas convergem em correntes maiores. porém. Esse movimento cessa após aproximadamente 4 minutos. os locais de agregação são determinados pela distribuição das amebas (Keller e Segal. e em seguida recomeça. A medida que diminui o suprimento alimentar. Durante as 5 horas seguintes. mais complexos. as células são vistas mover-se por aproximadamente 20µm / min durante 100 segundos. grex) 15 h 14 h 16 h 17 h MIGRAÇÃO CULMINAÇÃO 20 h 12 h Esporos 23 h 10 h AGREGAÇÃO Mixamebas 9 h Corpo de frutificação 6 h Fluxos celulares maduro 24h Figura 1. A primeira pergunta é: O que induz a ameba a se agregar? Microcinematografia de espaçamento temporal mostrou que não ocorre movimento direcionado durante as primeiras 4-5 horas após carência nutricional. Células vizinhas respondem ao cAMP de duas maneiras: ou iniciando sua movimentação de acordo com as pulsações de cAMP. Esporos haplóides originam mixamebas.. 1975). Shaffer.

A matemática de tais reações de oscilação prevê que a difusão de cAMP seria inicialmente circular. a fosfodiesterase (Johnson et al.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 23 (A) Adenina (B) (C) (D) Figura 1. (B de Tomchick e Devreotes. O resultado é a espiral rotatória de cAMP e a migração vistas na Figura 1. C e D de Siegert e Weijer. No entanto. Raper (1940) e Bonner (1957) demonstraram que as células anteriores normalmente formam pedúnculo. Como células móveis e imóveis dispersam a luz diferentemente.D) Ondas espirais de amebas movendo-se em direção à fonte inicial de cAMP. a remoção cirúrgica da parte anterior da lesma não elimina a capacidade do grex formar um pedúnculo. as células que recebem a parte frontal da onda começam a migrar com uma velocidade diferente daquela das células atrás delas. (A) estrutura química do cAMP. cortesia de F. * A bioquímica dessa reação envolve um receptor que liga o cAMP. é iniciada movimentação em direção à fonte de cAMP. realiza-se transcrição específica de genes.23. Porém. que células anteriores virem células pedunculares e células posteriores virem esporos. É interessante que as mesmas fórmulas matemáticas predizem o comportamento de certas reações químicas e a formação de novas estrelas em galáxias espirais rotatórias (Tyson e Murray. (C. As ondas são mapeadas saturando-se papel de filtro com cAMP radioativo e colocando-o sobre uma colônia em agregação. (C) Essa microfotografia em campo escuro processada digitalmente mostra cerca de 107 células. as regiões de alta concentração de cAMP na cultura aparecem mais claras que aquelas de baixa concentração de cAMP. Siegert. enquanto as células remanescentes.) . 1981. assim como aqueles de seus vizinhos. O cAMP das células secretoras dilui o cAMP radiativo. as células que agora se encontram no final anterior após a cirurgia (e que originalmente estavam destinadas a formar esporos). De alguma maneira. 1989. Células centrais secretam cAMP em intervalos regulares. As bandas claras são compostas de células migratórias alongadas.23 resultado é uma onda giratória em espiral de cAMP. O cAMP recém-formado ativa seus receptores próprios. as células dão mais um passo para o centro. À medida que chega cada onda. agora formam o pedúnculo (Raper. Quimiotaxia de amebas de Dictyostelium devida à ondas espirais de cAMP. em geral estão destinadas a formar esporos.23B-D). é tomada uma decisão de modo tal. que se propaga através da população de células (Figura 1. a fotografia reflete movimento celular..* A diferenciação de amebas individuais em células pedunculares (somáticas) ou esporos (reprodutivas) é uma questão complexa. as bandas escuras são células que pararam de se mover e se arredondaram. (B) Visualização de várias “ondas” de cAMP no meio. Em vez disso. e cada secreção difunde para fora como um onda concêntrica. 1989). As células na área permanecem insensíveis às novas ondas de cAMP até que o cAMP ligado seja removido dos receptores por outra enzima da superfície celular. (D) As células formam correntes. Quando essa ligação ocorre. posteriores. e enzimas adenilciclases (que sintetizam cAMP a partir de ATP) são ativadas. Quando a radioatividade no papel é registada (colocando-o sobre filme de raiosX). Devreotes. 1940). 1989). Essa habilidade de células mudarem seus destinos desenvolvimentais. a espiral de movimento ainda pode ser vista movendo-se em direção ao centro. cortesia de P. à medida que o cAMP interage com as células que recebem e propagam o sinal.

comunicação pessoal). Dictyostelium evoluiu para três sistemas de adesão célula-célula regulados pelo desenvolvimento. A proteína ou grupo de proteínas que intervem no terceiro sistema pode existir somente em células pré-esporo e pode ser responsável pela separação de células pré-esporo de células pré-pedúnculo (Loomis. as células se tornam progressivamente mais adesivas. as células não irão aderir umas às outras e todo desenvolvimento subseqüente cessa.24 Células de Dictyostelium sintetizam um adesivo. No entanto. 1988). Como essas células individuais aderem entre si para formar um organismo coeso? Este é o mesmo problema que enfrentam as células embrionárias. células de Dictyostelium não aderem umas às outras. muitos dos princípios do desenvolvimento demonstrados por esse “simples” or- . e que são necessários para a morfogênese de células individuais para formar um organismo coerente. alcançando um patamar de coesividade máxima aproximadamente após 8 horas de inanição. inclusive naqueles dos mamiferos. Como veremos em capítulos subseqüentes. parece ser necessário para a retenção de um número de células suficientemente grande para a formação de grandes corpos de frutificação (Müller e Gerisch. é estabilizada por uma segunda molécula de adesão celular.. 1987. Células de Dictyostelium foram coradas com um anticorpo fluorescente que se liga à glicoproteína 24-kDa e foram em seguida observada sob luz ultravioleta. Assim. Enquanto estão crescendo mitoticamente em bactérias. quando a lesma estiver migrando. Porém. Loomis. é chamada regulação. Se essas células são tratadas com anticorpos que se ligam a essa proteína e a mascaram. e assim compensar por partes faltantes. células de metazoários também usam moléculas de adesão celular para formar os tecidos e órgãos do embrião. e os organismos multicelulares mais complexos não se formam pela agregação de células anteriormente independentes. uma vez que a divisão celular cessa.. 1978. Se apresentar defeitos ou estiver ausente nas células. No entanto. A adesão célula-célula é mediada por uma glicoproteína de 24. Um terceiro sistema de adesão é ativado tardiamente no desenvolvimento. 1988). lesmas pequenas se formarão. Knecht et al. e seus corpos de frutificação só atingirão aproximadamente um terço de seu tamanho normal. como mostrado aqui – 10 horas após o fim da divisão celular – amebas individuais são vistas apresentando essa proteína em suas membranas celulares e são capazes de aderir umas às outras.24. de acordo com sua localização dentro do organismo inteiro. Essa proteína é sintetizada a partir de mRNA recém-transcrito e fica localizada nas membranas celulares das mixamebas. Essa proteína não foi vista em amebas que tinham apenas parado de se dividir. o segundo sistema de adesão celular. Veremos esse fenômeno em muitos embriões.0000 Da (24-kDa) que está ausente em células em crescimento mas pode ser vista pouco depois dessa fase (Figura 1. Uma vez que essa agregação inicial tiver ocorrido. Dictyostelium é um “organismo multicelular em tempo parcial” que não forma muitos tipos de células (Kay et al. Assim. 1989). pouco após a inanição nutricional. glicoproteína 24-kDa. MOLÉCULAS DE ADESÃO CELULAR EM DICTYOSTELIUM. Essa glicoproteína de 80-kDa também é sintetizada durante a fase de agregação. Loomis.24 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 1. e a solução que evoluiu para os protistas é a mesma que aquela usada pelos embriões: moléculas de adesão celular reguladas pelo desenvolvimento.

Isolaram o gene para essa proteína e o modificaram de uma maneira a motivá-lo ser expresso continuamente. . Tais células agora aderiram umas às outras mesmo nos estados vegetativos. Vários tipos de evidência serão apresentados neste livro. Quando esses fragmentos ligantes de antígeno (chamados Fragmentos Fab) foram adicionados às células competentes para agregação. existe uma correlação entre a presença dessa glicoproteína da membrana celular e a capacidade de agregação. para demonstrar a presença de determinadas moléculas adesivas celulares no embrião em desenvolvimento. 1970). Assim. O primeiro e mais fraco tipo de evidência é a evidência correlativa. não trata de fatos. bloqueando sua função. Isso foi necessário porque o todo da molécula de anticorpo contém dois sítios ligantes de antígeno que iriam ligar-se artificialmente de maneira cruzada e aglutinar as mixamebas. A presença dessa proteína na membrana celular dessas células em divisão foi confirmada por marcação com anticorpos. Essa evidência de ganho-de-função é mais convincente que outros tipos de análise. são feitas correlações entre dois ou mais eventos. iniciados pela mesma causa subjacente. e infere-se que um evento estimule o outro. anticorpos marcados com fluorescência para uma certa glicoproteína de 24 kDa. presu– mivelmente por ligar–se a glicoproteína 24-kDa. Evidência correlativa dá um ponto de partida para investigações. A ocorrência simultânea dos dois eventos pode mesmo ser coincidência e os eventos não terem relação um com o outro. e nada mais. porém. Embora se possa inferir que a síntese dessa proteína causa a adesão das células. a glicoproteína 24-kDa nada tinha a ver com a adesão propriamente. da Silva e Klein (1990) e Faix e colaboradores (1990) obtiveram tal evidência para mostrar que a glicoproteína 80-kDa é uma molécula adesiva. Assim. o papel das proteínas da superfície celular para a coesividade celular pode ser visto através do reino animal. elas tinham ganho uma função adesiva somente por expressar essa glicoproteína em particular nas suas superfícies celulares. bloquear a glicoproteína também causaria a inibição da agregação celular. caçoando de tais inferências correlativas. Recentemente. recolocaram-no em mixameba bem-alimentada. é também possível que adesão celular leve as células a sintetizar essa nova glicoproteína. Esse tipo de evidência é chamado evidência-deperda-de-função. é possível que os anticorpos tenham matado a célula (o que poderia acontecer se a glicoproteína 24-kDa for um crítico canal de transporte). Informações adicionais & Especulações Evidência e Anticorpos A Biologia. ou que a adesão celular e a síntese da glicoproteína 24-kDa sejam eventos separados. Por exemplo. e moléculas indutoras da diferenciação estão agora começando a ser isoladas de organismos metazoários. o que normalmente não fazem. Se bem que mais forte que a evidência correlativa. Como exemplo. Nesse caso. Isso também impediria a adesão celular. a evidência perda-de–função precisa ser amparada por muitos controles demonstrando que agentes causadores de perda de função derrubam especificamente aquela função em particular. as células não puderam se agregar. o início do primeiro evento estimula um segundo e mesmo em situações onde nenhum desses eventos ocorre usualmente. Ou talvez. que usualmente não expressa essa proteína e não tem capacidade de adesão.* Como então ir para além da mera correlação? No estudo da adesão celular em Dictyostelium. ela ainda não exclui outras inferências. Aqui. mas não se pode afirmar com certeza que um evento estimula outro somente baseado em correlações. Knecht e colaboradores (1987) tomaram os anticorpos que ligam essa glicoproteína 24-kDa e isolaram seus sítios ligantes de antígeno (as partes da molécula do anticorpo que reconhecem o antígeno). não são todos de equivalente vigor.. não marcam células vegetativas em divisão. Experimentos semelhantes foram recentemente realizados em células de mamíferos (veja capítulo 3). esses mesmos anticorpos acham a proteína em membranas celulares de mixameba logo que as células param de se dividir e tornam-se competentes para agregar (veja Figura 1. crescendo vegetativamente. Ainda mais. O tipo mais forte de evidência é evidência-de-ganho-de-função. Como vimos.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 25 ganismo também aparecem em embriões de filos mais complexos. Assim. Usando uma técnica introduzida pelo laboratório de Gerisch (Beug et al. o próximo passo foi usar aqueles mesmos anticorpos para bloquear a adesão de mixamebas. trata de evidências. Os fragmentos de anticorpo impediram as células de aderir entre si. A habilidade de células individuais sentir um gradiente químico (como a resposta da ameba ao cAMP) é muito importante para a migração celular e morfogênese durante o desenvolvimento animal. Sies (1988) demonstrou uma notável boa correlação entre o número de cegonhas vistas na Alemanha Ocidental de 1965 até 1980 e o número de bebês nascidos durante esses mesmos anos.24). antes. Em seguida. tal como qualquer outra ciência. vamos usar a análise da adesão celular em Dictyostelium. mas é necessária para o funcionamento da verdadeira molécula adesiva (como através da estabilização de pro- * Em uma carta irônica. Aqui. teínas de membrana em geral).

cortesia dos autores.26 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento DIFERENCIAÇÃO EM DICTYOSTELIUM.) .. 1995). DIF parece ser necessário para a diferenciação da célula peduncular. as células pré-esporo perdem suas características de diferenciação (Figura 1. Os dois principais candidatos são o fator indutor de diferenciação (DIF) e o cAMP. (B) Grex semelhante corado após tratamento com enzimas que degradam cAMP.. Esse fator. é eficaz em concentrações muito baixas (10-10M).html#intro3] Embora DIF estimule amebas a tornarem-se células pré-pedúnculo. Uma determinada célula num embrião de vertebrado por exemplo. Não é visto produto pré-esporo específico. Todas as células do grex tornaram-se células pedunculares. quando lesmas são colocadas em um meio contendo uma enzima que destrói cAMP extracelular. A síntese desse lipídeo de baixo peso molecular é regulada geneticamente. 1995). (A) Grex (pseudoplasmódio) corado para presença de uma proteína pré-esporo específica (regiões claras). pois há cepas mutantes de Dictyostelium que formam somente o precursor de células-esporo e não de células pedunculares. parece induzir a diferenciação de um determinado tipo de célula.. 1989. (A) e (C) (B) mostram os efeitos de se colocar lesmas Dictyostelium em um meio contendo enzimas que destroem cAMP extracelular. Além disso. Altas concentrações de cAMP iniciam a expressão de mRNA pré-esporo específico. (A e B de Wang et al. vemos uma decisão dicotômica simples. pode tornar-se uma célula da epiderme ou um neurônio. células penduculares conseguem se diferenciar (Kay e Jermyn. induz a formação de células pedunculares. Como uma célula torna-se uma célula de pedúnculo ou uma célula de esporo? Embora os detalhes não sejam totalmente conhecidos o destino de uma célula parece ser regulado por certas moléculas difusivas.. O corante usado liga-se à parede de celulose das células pedunculares. (C) Amplificação maior de uma lesma tratada com DIF (na ausência de amônia).b). a diferenciação de células pré-esporo é mais provavelmente controlada por pulsos contínuos de cAMP.. e. As células freqüentemente selecionam um determinado destino desenvolvimental quando alternativas estão disponíveis. C de Wang e Schaap.25 Substâncias químicas que controlam a diferenciação em Dictyostelium. [other. em amebas agregadas. e novos mRNAs específicos pré-pedúnculo são encontrados no citoplasma celular (Williams et al. porque somente dois tipos celulares são possíveis. Morris et al. 1988a. 1988a. 1987). como a proteína de Volvox. DIF pode agir através da liberação de íons de cálcio de compartimentos intracelulares no interior da célula (Schaulsky e Loomis. A diferenciação em uma célula-pedúncu- lo ou em uma célula-esporo reflete um dos principais fenômenos da embriogênese: a seleção pela célula de uma trajetória desenvolvimental. Wang et al. 1985. tal como o fator indutor de sexo em Volvox.25. 1987). O mecanismo pelo qual DIF induz 20 porcento das células do plasmódio (grex) a tornar-se tecido peduncular ainda é controverso (veja Early et al. Quando DIF é adicionado a essas culturas de mutantes. 1983. Em Dictyostelium. Quando adicionado às amebas isoladas ou mesmo às células pré-esporo (posteriores). (A) (B) Figura 1. Schaap e van Driel.

Representação esquemática mostrando que células pré-esporo e pré-pedúnculo estão em geral misturadas no estágio precoce da agregação. com alguma células similares no posterior. Essas células são chamadas células pré-pedúnculo B (pstB). o grex se apóia em um dos terminais fazendo com que as células traseiras se tornem sua base. Cálice superior Células pré-pedúnculo A Células pré-pedúnculo B Células pré-pedúnculo AB Direção do movimento celular Células pré-esporo Pré-pedúnculo AB Guarda da retaguarda Pré-pedúnculo A Células pré-esporo Pré-pedúnculo AB Pré-pedúnculo B Disco basal interior Disco basal exterior Cálice Inferior Pré-pedúnculo AB Pré-pedúnculo B Agregado Grex Culminante precoce Culminante médio Pré-pedúnculo B Culminante tardio . Ao mesmo tempo. sintetizando componentes de uma nova matriz extracelular.. 1984. Esses pulsos são quimiotácticos para células pré-pedúnculo. (Segundo Harwood et al. Algumas células pstA migram para o tubo central de células pstB. tendem a permanecer na porção posterior (McDonald e Durston. Williams e colaboradores (1989) acharam que células pré-esporo e pré-pedúnculo podem ser diferenciadas em agregados precoces e que estão distribuídas de modo aleatório através desses montes hemisféricos. Esse trabalho foi confirmado e ampliado por Ohmori e Maeda (1987). A maioria das células pré-pedúnculo estão nos 20 porcento anteriores do grex. as células pstO. As células pré-pedúnculo A constituem a maior parte do anterior do grex. enquanto células pré-esporo permanecem no que se tornará a região posterior do grex. enquanto a maioria das células pré-pedúnculo são conhecidas como células prépedúnculo A (pstA) (Figura 1. Agrega as células umas às outras. de modo que atraem as células pré-pedúnculo para a ponta da agregado (Matsukuma e Durston. estão espalhadas de maneira esparsa através das células pré-esporo. mas não para células pré-esporo. a maioria das células pré-pedúnculo. que mostraram que células não-alimentadas durante a parte tardia do ciclo celular. respondem de maneira diferente ao cAMP e mostram adesividade muito mais alta que células jejuadas imediatamente após a mitose. Weijer et al. Takeuchi. as células pré-pedúnculo do posterior migram para formar o disco basal e os cálices do saco de esporos. as células pstA que tinham ficado na região posterior do Figura 1.26). para sua matriz extracelular. cessa de migrar e sofre a diferenciação final em esporos e pedúnculo. No centro da porção anterior do grex. Nos estágios precoces da culminação. o agregado tomba sobre um dos lados e forma o grex migratório. e quando entram em contato com o tubo central. há também algumas células pré-pedúnculo espalhadas através da parte posterior.. Durante esse processo (chamado culminação). Uma vez completo. Células pré-pedúnculo podem ser distinguidas pela sua secreção de proteína A da matriz extracelular para espaços intercelulares. 1986. Siegert e Weijer. Esse tubo se diferencia para tornar-se o pedúnculo. como podem células nos quatro-quintos posteriores da lesma se diferenciar em células-esporo. 1979. Células prépedúnculo B são vistas na parte central da porção anterior do grex. Assim. 1992). porém. enquanto amebas expostas à inanição durante o fim do ciclo. Dentro de cada agregado. um outro grupo de células pré-pedúnculo começa a secretar uma segunda nova proteína (proteína B). Outro grupo de células pré-pedúnculo.. As células novas são adicionadas à região anterior do tubo. e migram mais lentamente em direção ao anterior. migram ativamente para o anterior. 1991). enquanto células equivalentes do quinto anterior se tornam células pedunculares? A resposta pode estar na observação de que as células originais não são todas iguais. Quando o grex se encontra na luz solar. o AMP cíclico parece ter várias funções no desenvolvimento de Dictyostelium. mas se separam de modo que a maioria das células prépedúnculo se encontrem na parte anterior do grex. diferenciam-se em células pstB. forçando-o mais para dentro da estrutura culminativa.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 27 Informações adicionais & Especulações Como o Grex Sabe Qual Lado Está Para Cima S E TODAS AS AMEBAS do grex começarem no mesmo nível. Amebas sujeitas à inanição durante a parte precoce de seu ciclo celular tendem a se mover para a porção anterior do pseudoplasmódio. Essa migração provavelmente é devida a repetidos pulsos de cAMP que ain- da estão emanando da ponta apical do agregado.Portanto. as células prépedúnculo A do anterior migram para o centro e se tornam células pré-pedúnculo B. 1984). Mee et al. induz diferenciação de células pré-esporo e dirige a migração de células pré-pedúnculo para a parte anterior do agregado. Isso estende o pedúnculo até que esse eleve a caixa de esporos acima da superfície. as tendências para certos destinos foram estabelecidas até mesmo antes do grex começar a migrar.26 Regulação da diferenciação de células pedunculares durante a fase de culminação do crescimento de Dictyostelium. 1991.

1990. nem se diferenciam em células do pedúnculo (Firtel e Chapman. e Harwood et al.. A amônia parece inibir a produção do pedúnculo pelos menos de duas maneiras.27 Uma hipótese para a iniciação coordenada da culminação e diferenciação de células pedunculares em Dictyostelium. A concentração mais alta de cAMP ativa a PKA. de onde podem ser dispersos pelo vento ou um animal que passa. os esporos são levantados 2 mm acima do solo. 1985.* A Figura 1. a culminação começa (Schindler e Sussman. Células pré-pedúnculo contendo PKA nãofuncional. migração de células pré-pedúnculo. O gatilho para a culminação parece ser a luz solar ou a baixa umidade. 1977. permitindo maior produção de cAMP nas células pré-pedúnculo. Finalmente. foi tomada a decisão de enfocar neste texto. Harwood et al. 1985). (Baseado em modelos de Bonner et al. apresenta diversos caminhos evolutivos ramificados. Inibe a ação de DIF (Wang e Schaap. 1992). a inclusão de um tratamento abrangente do seu desenvolvimento teria dobrado a extensão deste livro. A seqüência pela qual a formação de esporos é inibida. A luz solar dissipa a amônia na parte anterior do grex. 1983. A amônia é produzida copiosamente por lesmas migratórias e reprime a culminação. Esse cAMP é necessário para ativar a proteína quinase cAMP-dependente (PKA). o inibidor é inativo. 1991. 1992). A observação mais impressionante é que a vida não evoluiu segundo uma linha reta.27).. Harwood et al.28 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento grex migram para as bordas da região préesporo e diferenciam-se no invólucro dos esporos e disco basal (Williams e Jermyn. Para uma revisão. uma vez que os níveis de cAMP se elevam (pela remoção da amônia). 1992) Amônia Repressor ativo da diferenciação e de genes de migração peduncular PKA inativa cAMP PKA ativa Migração continuada do grex Luz solar Repressor inativo (fosforilado) Transcrição do gene da proteína B da matriz extracelular.. . No entanto. remove o inibidor permitindo assim. Essas células não migram para a região central anterior. Os dados sugerem que quando PKA é ativada. O inibidor fosforilado não pode mais inibir os genes pedúnculo-específicos. diferenciação e culminação peduncular Padrões desenvolvimentais entre metazoários Como o restante deste livro se ocupa do desenvolvimento de metazoários . e inibe a produção de cAMP nas células pré-pedúnculo (Schindler e Sussman. Sempre que a amônia estiver exaurida (quer naturalmente ou experimentalmente).. a PKA pode inativar o inibidor dos genes formadores do pedúnculo (Figura 1.4html] Figura 1. 1989). *Plantas passam por padrões igualmente complexos e fascinantes de desenvolvimento embrionário e pós-embrionário.animais multicelulares que atravessam estágios embrionários de desenvolvimento .. 1977. 1990).apresentaremos um visão panorâmica dos seus padrões desenvolvimentais. 1982. Newell e Ross. sugeriram que como a luz causa difusão mais rápida da amônia. Wang et al. No estado fosforilado. A amônia inibe a conversão de células pstA em pstB e proíbe a continuação da formação do pedúnculo cAMP (Gross et al. veja Singer. o progresso da culminação. Podemos ver que a maioria das espécies de metazoários pertence a um de dois principais ramos de animais: protostomatas e deuterostomatas..28 ilustra os principais rumos evolutivos do desenvolvimento metazoário. Experimentos recentes sugerem que esses dois fatores causam a difusão de amônia da lesma. Por isso. Bonner et al. que fosforila um inibidor da expressão gênica do pedúnculo. Harwood et al. 1997. o desenvolvimento dos animais. [intro. Portanto.. não está clara. 1992). Bonner e colaboradores (1985). o desenvolvimento das plantas difere significativamente daquele dos animais.. não fosforilam certas proteínas. passa a fosforilar um repressor que estava inibindo a expressão dos genes de diferenciação do pedúnculo.

os esquemas em geral são todos semelhantes ao mostrado aqui. que alguns taxonomistas sequer consideram-nos metazoários (chamando-os. porém.28 Principiais divergências evolucionárias em animais existentes. Um desses grupos é o Porífero (esponjas). ao menos. ambos passando por estágios embrionários. o arqueócito.) Os Poríferos Considera-se que os protistas coloniais deram origem.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 29 BILATERIA DEUTEROSTOMATAS PROTOSTOMATAS RADIATA PARAZOA Vertebrados Ascídios (Tunicados) Moluscos Equinodermos Artrópodos Anelídeos Nematelmintos Platelmintos Cnidários (Celenterados) Poríferos (Esponjas) Segmentados Não-segmentados Larva trocófora Clivagem em espiral gastrulação protostosomal da ma lo qu es ag em Li nh ag Clivagem radial gastrulação deuterostomal nh Li SIMETRIA BILATERAL Platelmintos primitivos (acelomados) SIM ET RA RIA DIA Larvas planulóides Protozoários coloniais primitivos Protistas flagelados Figura 1. pode se diferenciar em todos os outros Li L nh ag em ac elo Larva dipleura (tornária) ce ps eu do ce lo m ad em m ad a izo a . Esses animais desenvolvem-se de um modo tão diferente daquele de qualquer outro grupo de animais. mas um deles. a dois grupos de metazoários. “parazoários”). Uma esponja tem três tipos principais de células somáticas. (Outros modelos são possíveis.

têm uma extensa variedade de tipos de clivagem. Protostomatas e deuterostomatas diferem na maneira pela qual são clivados. os Bilaterias. admite-se que os arqueócitos móveis colecionam células de sua espécie. consistindo de células escassamente disseminadas em uma matriz gelatinosa. Porém. corais e hidras) e ctenóforos (medusas de crista). As células de uma esponja quando passadas por uma peneira. Se um único blastômero é removido de um embrião quadricelular de ouriço-do-mar ou camundongo. a maioria dos metazoários tem simetria bilateral. 1907). São por isso considerados sofrer clivagem espiral. têm maior capacidade de regular seu desenvolvimento do que os prostostomatas. Assim. Na maioria dos deuterostomatas. nos deuterostomatas (do Grego significando “boca depois”). Muitas espécies formam blástulas compostas por células que estão em ângulos agudos relativamente ao eixo polar do embrião. e os três-quartos restantes do embrião também irão se desenvolver . alguns traços embriológicos acentuam esse parentesco. a abertura bucal é formada depois da abertura anal. por ser desprovida de revestimento mesodérmico. mas não das outras (Turner. em alguns casos. Esponjas não contém mesoderma. na maioria dos deuterostomatas. artrópodos e vermes. enquanto prostostomatas em geral formam suas cavidades corpóreas tornando oco um bloco sólido de mesoderma (formação esquizelóide). Esses platelmintos foram os primeiros a ter mesoderma verdadeiro (embora não tivessem ficado ocos para formar uma cavidade corpórea). cada uma que se re-forma contém somente células de uma espécie (Wilson. a maioria dos deuterostomatas formam suas cavidades corpóreas a partir de bolsas mesodérmicas estendendo-se do intestino (formação enterocélica). Embora possa parecer estranho classificar seres humanos e cavalos no mesmo grupo que estrelas-do-mar e ouriços-do-mar. Alguns membros do grupo constituem os Radiatas.30 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento tipos. possuem uma cavidade corporal revestida por mesoderma. junto ou próximo da abertura intestinal. Também. incluem os filos dos moluscos. Os Radiatas incluem os cnidários (medusas. tal blastômero irá desenvolver-se em um organismo inteiro. Protostomatas e Deuterostomatas O outro grupo de metazoários emergindo dos protistas coloniais é caracterizado pela presença de três camadas germinativas durante o desenvolvimento. são assim chamados porque a boca é formada em primeiro lugar. produzida durante a gastrulação. Os filos nessa divisão incluem os chordatas e os equinodermos. 1997). assim chamados porque têm simetria radial tal como um tubo ou uma roda. Nesses animais. Ainda mais. esponjas são muito pouco parecidos com a maioria dos metazoários (veja Fell. podem regenerar novas esponjas a partir de células individuais. Protostomatas ao contrário. O ânus se forma mais tarde em outro local. o mesoderma é rudimentar. esses seres não têm tubo digestivo. os nematelmintos (e rotiferas) têm uma cavidade corpórea diferente daquela de todos os outros animais. tornadas ocas. Além disso. sistema circulatório. constituindo assim. A maioria dos filos são celomados. A cavidade corpórea desses animais se forma a partir de uma previamente sólida corda de células mesodérmicas. Protostomatas (do Grego. tal reagregação é espécie-específica: se células individuais de esponja de duas espécies diferentes forem misturadas. Nesses casos. nervos ou músculos. Em primeiro lugar. e foram considerados parecidos com as larvas de certos celenterados contemporâneos. A outra grande divisão dos Bilateria é a linhagem dos deuterostomatas. não havendo portanto verdadeiros sistemas de órgãos em Porífero. 1978). os blastômeros em estágio de clivagem. As diferenças entre as duas divisões de Bilateria estão ilustradas na Figura 1. Isso é chamado clivagem radial. Enquanto os platelmintos são desprovidos de celoma (cavidade corpórea). os blastômeros são perpendiculares ou paralelos uns aos outros. Porém. Pensa-se que todos os Bilateria descendam de um tipo primitivo de platelminto. apesar de passarem por estágios embrionários e larvais. deve-se mencionar que há muitas exceções a essas generalizações. Esses filos bilaterais são classificados como platelmintos. isto é. “boca primeiro”).29. protostomatas ou deuterostomatas.

Desenvolvimento enterocélico Celoma Blastocele Bolsa Intestinal Bolsas se destacam Mesoderma Intestino 3. ao mesmo tempo sendo suficientemente dura para proteger o embrião de agressões ambientais. O ovo amniótico permitiu aos vertebrados vagar pela terra longe de suprimentos de água existentes. na qual restos do metabolismo embrionário são coletados. Um dos maiores avanços evolucionários – o ovo amniótico – ocorreu entre os deuterostomatas.30). contém quatro bolsas: o saco vitelínico. Tendências principais dos prostostomatas e deuterostomatas.29 normalmente. Ainda. o âmnio. se a mesma operação fosse realizada em um embrião de lesma ou de verme. não sofrem regulação se os blastômeros são deles removidos. Ao passo que a maioria dos anfíbios é obrigada a voltar para a água para procriar e permitir o desenvolvimento de seus ovos. Esse tipo de ovo. o ovo amniótico carrega seu próprio suprimento de água e nutrientes. que armazena proteínas nutrientes. é considerado ter-se originado dos ancestrais anfíbios dos répteis. O ovo é fertilizado internamente e contém a gema para nutrir o embrião em desenvolvimento. tanto o blastômero isolado como os restantes se desenvolveriam em embriões parciais – cada um carente daquilo que foi formado a partir dos outros. Tendência à regulação Intestino Embrião de de 4 células Um blastômero excluído Desenvolvimento interrompido Embrião de de 4 células Um blastômero excluído Duas larvas normais se desenvolvem Figura 1. e os embriões de certos deuterostomatas.) . como os tunicados. a alantóide. Clivagem radial 2.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 31 (A) PROTOSTOMATAS 1. Assim. Tendência a não regulação Intestino Intestino 3. Clivagem espiral (B) DEUTEROSTOMATAS 1. a travessia final dos limites entre água e terra ocorreu com a modificação do estágio mais precoce do desenvolvimento – o ovo. Porém. Exceções à todas essas tendências gerais evoluíram secundariamente em certos membros de cada grupo. (A maioria dos vertebrados por exemplo. não tem uma formação estritamente enterocélica da cavidade corporal. que contém fluido banhando o embrião. A evolução dos organismos depende de alterações herdadas em seu desenvolvimento. Desenvolvimento semelhante de proteções do ovo permitiram aos artrópodes serem os primeiros invertebrados sobre a terra. há cerca de 255 milhões de anos. exemplificado pelo da galinha (Figura 1. Desenvolvimento esquizocélico Celoma Blastocele Mesoderma se divide Mesoderma 2. que interage com o ambiente externo. e o cório. O todo dessa estrutura está contido em uma casca que permite a difusão de oxigênio. seletivamente permitindo materiais chegar ao embrião.

1975. 9: 2709-2716. e a alantóide coleta resíduos nitrogenados que seriam perigosos para o embrião. P. Raunio (eds. M. Sinauer Associates. clivagem. 1947. EMBO J. A. J.30 Embrião Intestino Âmnio Cavidade amniótica Alantóide Cório Gema Saco vitelino (A) (B) Diagrama do ovo amniótico do pinto. A gema será finalmente rodeada pelo saco vitelínico que permite a entrada de nutrientes nos vasos sangüíneos. J. A role for cAMP-dependent protein kinase A in early Dictyostelium development. J. Rev. Spatial distribution of poly(A) + RNA and protein synthesis in Acetabularia mediterranea. and Weiss.. Firtel. Exp.. G. I. M. Cell Biol. Gilbert and A. LITERATURA CITADA Bergman. Gerisch. E. Genes Dev. F.. Flagellar membranes and the agglutination reaction. Konijn. acrasinase and the sensitivity to acrasin in Dictyostelium discoideum. A theory of the control of differentiation in the cellular slime molds. J. V. A. II. III.-C. 1970. U. W. Evidence for positional differentiation of prestalk celIs and for a morphogenetic gradient in Dictyostelium. 31: 597-629. O mesoderma extra-embrionário se estende do embrião para prover vasos sangüíneos para e de várias regiões fora do embrião. S. R. Berkley. Gametic differentiation in ChIamydomonas reinhardtii. gastrulação e construção do plano do corpo vertebrado. C. Alantóide A biologia do desenvolvimento proporciona um sortimento infinito de fascinantes problemas e animais. 1997. Gerisch. Capítulos posteriores se concentrarão nos mecanismos genéticos e celulares pelos quais ele é elaborado. and Cremer. 20: 72-87.. L. Gilbert. T. T. (B) Incubação de sete dias. Hall. C. S. A. J. . veja Gilbert e Raunio. 4:18-28. Specific inhibition of cell contact formation in Dictyostelium by univalent antibodies.. Exp. 1980. A. Cell adhesion transformed D. (A) Incubação de três dias. A. Cell wall lysis and microfilament associated mating structure activation in wild-type and mutant strains. E. Cell differentiation and flagellar elongation in Naegleria gruberi: Dependence on transcription and translation. K. O cório é derivado em parte do ectoderma e estende-se do embrião até a casca (onde irá trocar oxigênio e gás carbônico e obter cálcio da casca). 1977. Cell 58: 23-29. and Noegel. encontraremos apenas uma pequeníssima amostra deles. 1990. Porifera. Sunderland. Biol. Embryology: Constructing the Organism. servindo para ilustrar os princípios mais importantes do desenvolvimento animal (para uma cobertura mais completa da diversidade do desenvolvimento animal através dos filos. Beug. Gametic differentiation in ChIamydomonas reinhardtii. In S. A evolução do âmnio e das outras membranas extra-embrionárias constituiu uma grande linha divisória entre aqueles vertebrados cuja reprodução está ligada à água (anamniotas) e aqueles que podem se reproduzir em áreas secas (amniotas). Dev. and John. Fell. Sunderland.1997). Cell differentiation in Naegleria gruberi. U. 63: 147-158. B. 1986. L. No presente livro. Q. Dev. and Williams. 1990. Acrasin. Embryol. 1985. Coodenough. the sponges. Cell Res. aned Raunio. D. Biol. MA. M. um certo chauvinismo deuterostossômico pode ter ficado aparente. M. G. G. Bonner. A. 1975. H. MA. H. da Silva. Fulton. Early. Garcia. A origem das membranas será detalhada no capítulo 9. Rev. Zool. O âmnio prove o meio fluido no qual cresce o embrião. A. J. enquanto todo o oceano do desenvolvimento se estende à nossa frente. Evidence for the formation of cell aggregates by chemotaxis in the development of the slime mold Dictyostelium discoideum. 1957. P. 1995. Riedel.. J. and Chapman. J. Faix. R. J. Fulton. D. T. 67: 623-637. Mason. O’Keefe. discoideum cells: Expression of gp80 and its biochemical characterization. J.. Finalmente. T. Embora uma tentativa de cobrir as variações importantes que ocorreram no reino animal tivesse sido feita. Biol. pH affects fruiting and slug orientation in Dictyostelium discoideum. A. Embryology: Constructing the Organism. 85: 346-360. S. 1969. and Klein.. J. Cell Biol. T. 1990. 32: 232-246. G. Morphol. and Wolfe. C. Microbiol. Annu. and Dazy. 1997. A. and Martin. Bonner. and Walsh. investigaremos os estágios precoces da embriogênese animal: fertilização. A. Após uma breve visão dos princípios genéticos e celulares relevantes para a biologia do desenvolvimento. Cell 83: 91-99. J. Goodenough. 87: 207-213. Constitutive overexpression of the contact A glycoprotein enables growth-phase celIs of Dictyostelium discoideum to aggregate. Hay. Biol. Bonner. Exp. F.). Sinauer Associates... 106: 1-26. M. Jawitz. 67: 606-622. o endoderma se transforma no intestino e envolve a gema. Kempff. W. D. C. W. 140: 139-148.. Goodenough..32 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 1. mostrando o desenvolvimento das membranas envolvendo o embrião. Estamos apenas observando o conjunto das marés ao nosso alcance. Bonner. Abe.. Cell Biol..

1978. 1988a. 1983. Exp. The ontogeny and phylogeny of cellular differentiation in Volvox. M. Müllier. I. J. J.. and Kirk. R. Wang.. Development 111: 779-787. J. M. 1991. and Devreotes. G. L. 1978. A. Liss. A. 1989. 1967. Microbiol. M. H. McDonald. Kirk. Proc. N. 98: 449-456. P. M. J. Jr. and Weijer. Johnson.. 1982. Further studies on Volvox. K. Macmillan. Matsukuma. R. Mitochondrial DNA replication but no nuclear DNA replication during development. M. Digital image processing of optical density wave propagation in Dictyostelium discoideum and analysis of the effects of caffeine and ammonia. D. H.. Dictyostelium . Kay. and Devreotes.. 121: 277-283. Kay. J. Cell 69: 615-624. Cell sorting and pattern formation in Dictyostelium discoideum. K. F. Gerhart (ed. 1940. Mol. Nature 274: 445-447. M. K. R. Tortolo. Y. M. P. Intracellular pH and the control of cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Cell cycle phase in. K. A specific glycoprotein as the target of adhesion blocking Fab in aggregating Dictyostelium cells. 1989. and Kay. S. Takeuchi. Pupillo. M. Specificity of Embryological Interactions. M. J. Shaffer. 247-274. 1984. 26: 399-415. A. Acad. Masento. F. K. J. 1934. Keller. Science 231: 51-54. In S. P. Siegert. Hartmann. Sei. 128: 1639-1652. C. L. and CoukelI. 1981. Entwicklungsmech. Drage. Wílhelm Roux Arch. Wiley-Liss. Sponge cell adhesions. A. 56: 241-282. Soc. van der Meene. 1989. and Barkley. G. 1997. W.. Nature 332: 495. D. Pseudoplasmodium formation and organization in Dietyostelium discoideum. Harwood. J. J. Garrod (ed. P. Jermyn. Cell Res. F. and Durston. Physica D 49: 224-232. Driscoll. 1989. Science 175: 333-335. S. J. M.. Natl. 1908. and Murray. 116:161-169. Control of aggregation in Dictyostelium discoideum by an external periodic pulse of cyclic adenosine monophosphate. 43: 223-286. 1977. S. 1970. N. P. Development 106: 421-426. New York. 1979. New York. A. Berg. Über formbildended Substanzen bei Acetabularia mediterranea.. R. Pitt. J. H. W. Cell Res.. Cell-cell adhesion in Dictyostelium discoideum. Developmental Order: Its Origin and Regulation. Morphol. Nature 328: 811-814. E. M. M. Aggregation in cellular slime molds: In vitro isolation of acrasin. Berks. J. Powers. J. W. USA 92: 5660-5663. Nature 255: 549-552. Morris. pp. Jermyn. and Gocil. D. 1975. experimentelle Beiträge zum Be–fruchtungs-und Todproblem. and Loomis. Ammonia depletion and DIF trigger stalk cell differentiation in intact Dictyostelium discoideum slugs. Cell Sci. A new parameter for sex education. Bradbury. 4: 32-36. L.5' monophosphate waves in Dictyostelium discoideum: A demonstration by isotope dilution -fluorography. 1991. Kay. P. Trends Genet. K. J. Shaulsky. Development [Supp1.. J. Nature 303: 242-244. K. J. 64:722-732. G. Embryology: Constructing the Organism. Initiation of slime mold aggregation viewed as an instability. J. J. Soc. K. Exp. Gilbert and A. Subtelny and P. Hämmerling. G. 1982. van Driel. and Weijer. S. J. T. and Cohen. A. 1985. B. Cell Biol. 199-232. Kirk. Strickberger. Lilly. 22:11-18. Protistk. D. E. Sci. B. Hopper. 249-259.. 159: 388-398. 1993. Jr. and Loomis. Chemotaxis -associated properties of separated prestalk and prespore celIs of Dictyostelium discoideum. Evidence for involvement of the cell surface cAMP receptor. F 1982. T. J. 14: 39-45. H. A. and Durston.. Vaughan. and Traynor. D. F. Green (eds. Gundersen. J. T.5'-cyclic phosphate. and Sussman. Effects of senescence on somatic cell physiology in the green alga Volvox carteri. Sun. A.. Kloppstech.. B. A. Schindier. 1983. In S. 1956. Sies. Adenosine 3'. C. M. and Kochert..). R. Acad. 1995. MA. R. N. Micros. M. and Segal. Ohmori. F. Nature 171: 975. M. R. M. Bonner. 3rd Ed. Turner. P. 1991. Konijn. 1.. Analysis of optical density wave propagation anel cell movement in the cellular slime mould Disctyostelium discoideum. Knecht. Development [Supp1. Aerts. Green. S. WenzI. Taylor. Fuller. J. The acrasin activity of adenosine -3´. and Schweiger.. Mee. Polyadenylated RNA from Acetabularia. D. D. 1953.. with description of three new species. Cyclic AMP-phosphodiesterase induces dedifferentiation of prespore celIs in Dictyostelium discoideum slugs: Evidence that cyclic AMP is the morphogenetic signal for prespore differentiation. and Schaap. H.. K. Sumper. Houghton Mifflin. Elisha Mitchell Sci. L.. [pp. Cell Sci. Development 103: 611-618.. The Great Chain of Life.. 1921. 1986. Proc. Raunio (eds. M. 9: 549-559. Ammonia determines the choice of morphogenetic pathways in Dictyostelium discoideum. Embryo1. G. Simon. Spek. and Bryant. Pommerville. Am. Sunderland. L. Die dauernd agame Zucht von Eudorina elegans. and Peacey. C. Surface glycoprotein gp24 involved in early adhesion of Dictyostelium discoideum. Robertson. M. S. J.-N.). R. pp. Chemotactic cell sorting in Dictyostelium discoideum. Siegert. and Jermyn. A possible morphogen controlling differentiation in Dictyostelium. Biol. B. Ce11-Cell Interactions in Early Development. 1972. 1988. J. pp. Culmination in Dictyostelium is regulated by the cAMP-dependent protein kinase. Plant development. J. Theoret. F. An analysis of culmination in Dictyostelium using prestalk and stalk-specific cell autonomous markers. A. W.). ihre rãumliche und zeitfiche Verteilung und ihre Herkunft. Walsh. 93: 325-335. B. Trans. 1985. Nature 303: 244-245. Integrated morphogenetic behavior of cell sheets: Volvox as a model. Raper. C. Genetic analysis of the slug stage of Dictyostelium discoideurn. and van Driel. The induction of post-aggregative differentiation in Dictyosteiíum discoideum by cAMP. D. W. 28-29] Loormis. R. S. Biochem. D. Genet. Science 212: 443-446. Morphogen hunting in Dictyostelium. Cyclic AMP waves during aggregation of Dictyostelium amoebae. Differentiation 4:115-123. M. USA 58: 1152-1154. 1987. Alan R. R. Cell Differ. and Schaap. The cell cycle and sorting out behaviour in Dictyostelium discoideum. Chemical structure of the morphogen differentiation-inducing factor from Dictyostelium discoideum. Biol. D. J. Veron.1: 75-80. M. J. London. 1986. 12: 831-836. R. D. J. Krutch. and Schaap. J. 28: 141-175. 5O: 243-251. G. EMBO J. How a sex pheromone might act at a concentration below 10-16 M. 1989. S. 66: 196-204. Development 105: 569-574 Wang. and Ross. J. Genet. M. 1987. 1992. M. Viamontes. 1988. Arch.. R. J. Tomchick. T. Wang. J. W. G. 1988b. Biol. 1984. Shaffer. 1988. 131: 1-81. F.. Natl. G-protein-linked signal transduction systems control development in Dictyostelium. J. Boston. Sinauer Associates.1: 81-90. Heat shock elicits production of sexual inducer in Volvox. The developmental fate of Dictyostelium discoideum cells depends greatly on the cell-cycle position at the onset of starvation. P. Kirk. J. Schaap. Exp. and Gerisch. In J. G. Singer. Secretion of cyclic AMP induced by cyclic AMP in the cellular slime mold Dictyostelium discoideum. and Williams. R. Chapman and HalI. R. Synthesis and assembly of the cytoskeleton of Naegleria gruberi flagellates. and Williams. L. New York. 1975. NewelI. G.. M. R. A.. D. 1987. R. Tyson.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 33 Cross. W.). Org. and Maeda. A. Dev. Cell Biol. Dev. In D. Genetics.

1907. Ceccarelli. J.. Wilson. A.. McRobbie. Biol. Wilson. 1984. Cell sorting and positional differentiation during Dictyostelium morphogenesis. Duffy. In J..). Origins of the prestalk-prespore pattern in Dictyostelium development. Cell Res. Biol. K. P. A. K. Traynor.. Williams. B. G. A. G. pp. Williams. Gerhart (ed. A.. . New York. 1896. H. R.. 125:410-416. Berks. S. Dev. J. J. N. 1991. Lane. P.. Dev. G. Roelfsema. M. Harwood. R. Weijer. Wang. J. in sponges. 5: 245-258. S. McRobbie. J. and Jermyn.. and David. K.. Kay. and Schaap. New York. Cell 59: 1157-1163. H. C.. On some phenomena of coalescence and regeneration. Cell 49: 185-192. Exp. R. Zool. Wiley-Liss. V. 70: 133-145. and Jermyn. Mahbubani. Williams. and Jermyn. J. A. Kay..34 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento discoideum is correlated with the expression of cyclic AMP production. J. 1990.. of DIF provides evidence that DIF is a morphogen. detection and degradation. Involvement of cAMP signalling in cell sorting. R. Dependence of cell-type proportioning and sorting on cell cycle phase in Dictyostelium discoideum. Cytoplasmic acidification facilitates but does not mediate DIF-induced prestalk gene expression in Dictyostelium discoideum... Macmillian. Williams. T. 140: 182-188. C. DuschI. Ce11-Cell Interactions in Early Development. Early. 261-272. 1987. M. J. The Cell in Development and Inheritance. C. J. H.. G. Direct induction of Dictyostelium pre-staIk gene expression. D. 1989. D. K. E. Exp. A.

nem como eram levados a se expressarem. Dois jovens embriologistas americanos. Entretanto. ora em curso. elementos construtores de formas. na extensão em que estrutura pode ser expressa por informação. que viria a ser a pedra angular da genética moderna. um grupo de cientistas começou a estudar.controla a herança. As origens embriológicas da teoria dos genes Núcleo ou Citoplasma: Qual Controla a Hereditariedade? Mendel chamou-os Formbildungelementen. é na terminologia de Mendel que vemos como no século dezenove os conceitos de herança e desenvolvimento estavam intimamente entrelaçados. as técnicas da biologia molecular realizaram uma reaproximação entre embriologia e genética. estão sendo agora resolvidas por um conjunto de técnicas envolvendo síntese de ácidos nucléico e hibridização.Genes e desenvolvimento: Introdução e técnicas 2 O que gostaríamos de saber é se a estrutura é determinada diretamente pela informação codificada no DNA. Aqui Thomas Hunt Morgan (1926) estava verificando que o único caminho de genótipo para fenótipo. Na realidade.. porém. quando Morgan redefiniu a genética como a ciência que estuda a transmissão dos traços em oposição à embriologia. 35 . embriologia e genética não eram consideradas ciências separadas. por seu valor intrínseco. como ovos fertilizados davam origem a organismos adultos. Durante a última década. Divergiram na década de 1920. A teoria dos genes. teve origem em uma controvérsia no campo da embriologia. Edmund Beecher Wilson e Thomas Hunt Morgan (Figura 2. está todo o campo do desenvolvimento embrionário”. tornaram-se parte desse grupo de “embriologistas fisiológicos”. e os genes postulados. Porém. nós os chamamos de genes.. aos quais os caracteres se referem. cada um tornando-se partidário na controvérsia sobre qual dos dois compartimentos do ovo fertilizado . Em fins século XIX. CYNTHIA OZICK (1989) “E NTRE OS CARACTERES que fornecem os dados para a teoria. passava através de processos desenvolvimentais. Este capítulo procura situar essas novas técnicas dentro do contexto do diálogo. JONATHAN BARD (1990) Os segredos que me enlaçam e cativam são em geral segredos da hereditariedade: como uma semente de pêra vira uma pereira em vez de um urso polar. gravada no ovo. a ciência que estuda a expressão desses traços.o núcleo ou o citoplasma . No começo do século vinte. entre genética e embriologia. Questões do desenvolvimento animal que não poderiam ser consideradas há uma década. as observações de Mendel não indicaram onde na célula ficavam esses elementos hereditários. os dois campos se ligaram novamente a tal ponto que se torna necessário uma discussão prévia da genética molecular neste texto.1).

embora todo o núcleo de segmentação esteja presente. Wilhelm Roux e Theodor Boveri.) Quando Morgan e Wilson entraram nesse debate. ao contrário.1 (A) (A) E. mostrado aqui em aproximadamente 1899). T. que acreditavam que estruturas pré-formadas não poderiam causar tão enormes mudanças durante o desenvolvimento. Wilhelm His e seus colegas. Uma escola associada a Oskar Hertwig. Wilson (1856-1939. devido à perda de parte do citoplasma. (Wilson era também reconhecido como um dos melhores violoncelistas amadores do país. um embriologista cujo trabalho. B.. (A) cortesia de W. na fase precoce da embriologia e da determinação sexual.) (B) Thomas Hunt Morgan (1866-1945). Em 1897 Morgan relatou: Aqui. citoplasmas. Timmins. ele removeu citoplasma do récem-fertilizado ovo ctenóforo (geléia de crista). Bischoff. propunha que os cromossomos do núcleo continham os elementos construtores de formas.tomada em 1915. L. Allen. muito avançou as hipóteses cromossômicas do desenvolvimento.36 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (B) Figura 2. e não no núcleo. a disputa já estava bem ativa. Em seu experimento mais crucial. .. Parece não haver escape da conclusão que no citoplasma. Essa fotografia . (B) cortesia de G. que desenvolveu a teoria dos genes a partir da embriologia. N. Esse grupo era desafiado por Eduard Pflüger. está o poder de diferenciação dos estágios precoces do desenvolvimento. W. eles acreditavam que os padrões herdados de desenvolvimento eram causados pela criação de novas moléculas do gameta interativo. quando os elementos básicos da teoria dos genes estavam se encontrando – mostra Morgan usando uma lente manual para identificar moscas. Morgan aliou-se a esse último grupo e obteve dados que interpretou com sendo consistentes com o modelo citoplasmático da herança. produz-se embriões com defeito.

o fator controlador da herança. Wilson (1905) e Nettie Stevens (1905a. Morgan apoiou inteiramente o pedido de Stevens para fundos de pesquisa. O Cromossomo X como uma Ponte Entre Genes e Desenvolvimento Em adição à evidência de Boveri.” Fotografia tirada em 1908. já havia sido para ali secretado pelos cromossomos nucleares (Wilson. confirmando suas qualidades como as melhores possíveis. esses ovos formaram quatro pólos mitóticos e dividiram o ovo em quatro. Stevens (1861-1912). em vez de duas células (veja capítulo 4). realizando a pesquisa que correlacionou o número de cromossomos X com o desenvolvimento sexual. Parecia que uma estrutura nuclear. (B) Nettie M. mostrou que em 92 espécies de insetos (e um cordato primitivo).que a análise demonstra ser um composto químico toleravelmente bem definido. Wilson escreveu uma elogiosa carta de recomendação. E. Boveri então separou os blastômeros e demonstrou que cada célula se desenvolvia anormalmente e de maneiras diferentes por ter cada célula diferentes tipos de cromossomos. por isso. se não idêntica. Wilson (1895) não se esquivou das conseqüências dessa conclusão* Agora. a cromatina é sabida ser intimamente semelhante. Essa conjectura transforma-se em certeza quando nos voltamos para os fatos da maturação (meiose). Para uma análise mais detalhada das interações entre Morgan e Wilson que levaram à teoria dos genes. ** Wilson era um dos amigos mais íntimos de Morgan. Assim. (A) (B) Figura 2. e ainda procuramos sua determinação primária nas causas que residem mais profundamente. enquanto machos tinham somente um cromossomo X (XY ou XO). que considerava Stevens sua melhor estudante de pós-graduação. Na primeira clivagem. não fica atrás de qualquer outro de nosso tempo. Boveri declarou que cada cromossomo tinha uma natureza individual e o controle de diferentes processos vitais.. Boveri fertilizou óvulos de ouriço-do-mar com altas concentrações de seu espermatozóide e obteve ovos que haviam sido fertilizados por dois espermatozóides. Mesmo assim. composto de ácido nucléico (um complexo ácido orgânico rico em fósforo) e albumina. o cromossomo X. ao menos. 1894.2 A). Para Wilson (1905) “Os materiais citoplasmáticos parecem ser apenas o meio imediato ou a causa eficiente da diferenciação.b) demonstraram uma correlação crítica entre cromossomos nucleares e o desenvolvimento organizacional. fertilização e divisão celular. Todos convergem em direção da conclusão de que a cromatina é o elemento essencial para o desenvolvimento. nesse ínterim.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 37 Wilson.” Parte do maior apoio para a hipótese cromossômica da herança estava vindo dos estudos embriológicos de Theodor Boveri (Figura 2. 1978). E assim. 1904).2 O caráter singular do cromossomo foi mostrado por Boveri e Stevens. que treinou tanto com Boveri como com Morgan. Wilson pensou que o material formador de órgãos que Morgan havia removido do citoplasma de ovos de ctenóforo. [(A) cortesia de Baltzer.. estava controlando o desenvolvimento sexual** . Defendeu vigorosamente essa idéia em seu livro A Célula no Desenvolvimento e na Herança (1896). Stevens (Figura 2. B. se não o local da formação de energia.] . tornou-se o maior proponente do ponto de vista de que os elementos formadores se encontravam nos cromossomos nucleares. veja Gilbert (1978.estudante de Morgan.2B). o fator controlador dessa energia e. (A) Theodor Boveri (1862-1915) cujo trabalho Wilson (1918) comentou: “conseguiu a verdadeira fusão de citologia. Ambos estavam contra Morgan nessa questão. salientando a necessidade da presença do núcleo para regeneração dos protozoários (veja capítulo 1): Esse fato presume que o núcleo é. 1967. uma ex. vista aqui em 1904 quando era estudante de pósdoutorado. embriologia e genética – um feito biológico que. quando os estudos cromossômicos e embriológicos de Boveri estavam no seu apogeu.. (B) cortesia do Instituto Carnegie de Washington.. ser efetuada pela transmissão física de um dado composto químico do progenitor para a descendência. chegamos à notável conclusão que a herança pode. as fêmeas tinham dois cromossomos sexo-específicos em cada núcleo (XX). Morgan discordou da interpretação de que *Note-se que Wilson está escrevendo sobre unidades construtoras de forma na cromatina em 1896 – antes da redescoberta do trabalhos de Mendel ou do estabelecimento da teoria dos genes. talvez. à substância conhecida como nucleína. 1987) e Allen (1986). apesar de saber que ela seria uma rival na pesquisa (veja Brush. um pesquisador na Estação Biológica de Nápoles.

obviamente. Enquanto criava Drosophila para uma série de experimentos sobre evolução. Lederman. e na capacidade dos geneticistas de obter rapidamente resultados concretos e matematicamente verificáveis. (Como ele logo iria mostrar. como répteis). Porém. . cor do corpo. Se os embriologistas não olharem para a embriogênese em termos da atividade dos genes. os geneticistas o farão. forma das asas e sexo segregavam-se juntos com o cromossomo X.3). Morgan mostrou que os traços para ambos sexos e cor branca dos olhos estão correlacionados de alguma maneira com a presença de um dado cromossomo X. 1986. tornou-se disciplina autônoma. Os geneticistas teriam que produzir evidência que os genes controlam os estágios precoces da embriogênese. o que o levou a começar a visualizar os genes como fisicamente ligados um ao outro no cromossomo. em geral. Conforme proclamado por Richard Goldschmidt (1938). Morgan começou a obter várias mutações correlacionadas com o sexo. 1987. Embriologistas como Frank Lillie (1927). os embriologistas consideraram os geneticistas como irrelevantes e mal-informados. [gene1. organismos favorecidos. controlada por alguma substância citoplasmática determinadora do sexo. Gilbert. A genética havia sido. é a produção ordenada de um padrão e assim. 2. Hans Spemann (1938) e Ernest E. Hostilidade entre embriologia e genética também emergiu. Ao contrário. Conforme enunciado por Just (citado por Harrison. Os geneticistas teriam que explicar fenômenos como a determinação do sexo em certos invertebrados (e vertebrados.html] A cisão entre a embriologia e a genética A evidência de Morgan proporcionou uma base material para o conceito do gene. em 1911mostrou que fatores reguladores da cor dos olhos. Os geneticistas acreditavam que os embriologistas eram antiquados e que o desenvolvimento viria a ser inteiramente explicado como o resultado da expressão gênica. os embriologistas estavam interessados em saber como uma mosca forma o seu dorso e não no número de cerdas no seu dorso. Os geneticistas teriam que explicar como cromossomos – que eram considerados idênticos em cada célula do organismo – direcionam tipos diferentes e variáveis de citoplasmas celulares. evitou considerá-los ligados fisicamente. O embriologista Morgan tinha demonstrado que cromossomos nucleares eram responsáveis pelo desenvolvimento de caracteres herdados. revistas. vascularização alar). forma das cerdas. A “conversão” de Morgan para a hipótese cromossômica ocorreu depois de obter dados contrários às suas teorias (veja Allen. sociedades. Na década de 1930. uma ciência empírica sobre procriação de animais e plantas. 3. mutações ligadas ao X apareciam antes de mutações em outros cromossomos. Quase todos genes conhecidos na época afetavam a modelagem das etapas finais (cor dos olhos. porque defeitos no cromossomo X não são mascarados pelo cromossomo homólogo no macho. 1988). 1937). argumentaram que não poderia haver uma teoria genética do desenvolvimento até que ao menos três principais desafios fossem resolvidos: 1. Sapp. Movida pelo desejo de progredir no conhecimento da reprodução de animais e plantas (e seres humanos). ele considerou o conjunto de cromossomos como uma característica sexual secundária. Ross Granville Harrison (1937). entretanto. Reciprocamente.38 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento os cromossomos determinavam o sexo. 1978. a genética logo se tornou a ciência biológica predominante nos Estados Unidos (veja Allen. “O desenvolvimento. 1978. professorados e regras de evidência.) Em 1910. nos quais o ambiente determina o fenótipo sexual. Just (1939) (Figura 2. Morgan deu-lhe um fundamento científico. Paul e Kimmelman. em última análise. os genes controlam o padrão”. desenvolvendo seu vocabulário próprio. 1989).

não pareceria impróprio apontar para um perigo dessa ameaçada invasão.html] Primeiras tentativas da genética do desenvolvimento Porém. os embriologistas em geral não sentiram a necessidade de basear sua embriologia na ação dos genes. Várias tentativas foram feitas para sintetizar as duas disciplinas.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 39 (A) (B) Figura 2. mas sua primeira integração bem-sucedida veio no fim da década de . Numa retórica. Rejeitou a genética e enfatizou o papel da membrana celular na determinação dos destinos das células. (A) Frank Lillie encabeçou o Laboratório de Biologia Marinha em Woods Hole e foi um líder na pesquisa sobre fertilização e endocrinologia reprodutiva.) O debate tornou-se deveras veemente. Até que os geneticistas puderam demonstrar a existência de variantes herdadas durante a fase precoce do desenvolvimento e até que os geneticistas tiveram uma bemdocumentada teoria sobre como os mesmos cromossomos podiam produzir diferentes tipos de células. Woods Hole. (C) Ernest E. diferenciação e todos os processos desenvolvimentais são de fato realizados pelo citoplasma. Argumentaram que os geneticistas não possuíam um mecanismo para explicar como os mesmos genes nucleares podiam criar tipos celulares diferentes durante o desenvolvimento. Harrison (1937) alertou: Agora que a necessidade de relacionar os dados da genética com a embriologia está sendo usualmente reconhecida e a sede de conhecimento dos geneticistas começa a impeli-los em nossa direção. (B) Hans Spemann (à esquerda) e Ross Harrison (à direita) aperfeiçoaram operações de transplante para descobrir quando eram determinados os eixos do corpo e dos membros. por dirigir nossa atenção exclusivamente para o genoma. alguns cientistas acharam que nem a embriologia nem a genética estavam completas uma sem a outra. C cortesia do Laboratório de Biologia Marinha. (A cortesia de V.3 (C) Embriologistas tentaram impedir a genética de “conquistar” seu território na década de 1930. Já temos teorias que referem os processos do desenvolvimento à ação dos genes e consideram toda performance como nada mais que a consecução dos potenciais dos genes. Just fez descobertas cruciais sobre fertilização. Tais teorias são totais e demasiadamente unilaterais. Hamburger. refletindo as ansiedades políticas do fim da década de 1930. O prestígio do sucesso desfrutado pela teoria dos genes poderia facilmente tornar-se um obstáculo para a compreensão do desenvolvimento. enquanto movimentos celulares. B cortesia de T. Horder. [gene2.

Também analisava como esses genes podiam afetar os primórdios que dão origem a essas estruturas. Embora uma história completa do desenvolvimento precoce da genética do desenvolvimento ainda permaneça por ser escrita. 1993.que os genes atuam somente sobre a modelagem final do embrião e não sobre seus principais esquemas de construção – foi contrariada. Em vez disso. e Morange. um novo tipo de cientista era necessário. uma das principais objeções ao modelo genético do desenvolvimento levantadas pelos embriologistas . tentaram achar mutações que afetassem o desenvolvimento precoce e processos afetados por esses genes. a remoção da retina *As observações de Gluecksohn-Schoenheimer levaram 60 anos para ser confirmadas através da hibridização do DNA. No entanto. Gluecksohn-Schoenheimer e Waddington. Gluecksohn-Schoenheimer (1938) considerou que no trabalho com camundongos não era possível fazer o que os embriologistas experimentais deveriam estar fazendo . embora normalmente não expressos.* Além disso. Metaplasia A primeira evidência para equivalência genômica veio após a 2a Guerra Mundial. Harwood. Assim. Wilkinson e colaboradores (1990) acharam que “a expressão do gene T tem um papel direto nos eventos precoces da formação do mesoderma e na morfogênese da notocorda”. Gluecksohn-Schoenheimer (1938. 1996. [gene3. Ambos haviam sido treinados em embriologia na Europa e tinham aprendido genética nos Estados Unidos com estudantes de Morgan. Gluecksohn Waelsch) e Conrad Hal Waddington. os genes para os produtos desses outros tipos de células devem ainda estar presentes. Ao mesmo tempo. Burian et al.html] Evidência para a equivalência genômica Ainda permanecia uma outra grande objeção para uma embriologia baseada na genética: Como poderiam genes nucleares dirigir o desenvolvimento se os genes eram os mesmos em cada tipo celular? Essa equivalência genômica não estava provada mas era assumida (porque cada célula é o descendente mitótico do ovo fertilizado) e um dos primeiros problemas da genética do desenvolvimento era o de determinar se cada célula de um organismo tinha o mesmo genoma que outra. “parecia favorável para pesquisas sobre a ação desenvolvimental dos genes”. Keller.. Sander. o geneticista do desenvolvimento tem que estudar primeiro o desenrolar do desenvolvimento (isto é. 1988. Na salamandra. conforme proclamou corretamente. . por parte de dois embriologistas. o geneticista do desenvolvimento: Enquanto o embriologista experimental desenvolve um dado experimento e em seguida estuda seus resultados. A asa da Drosophila.40 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento 1930. Portanto. causavam desenvolvimento aberrante da porção posterior do embrião. e atribuiu os efeitos desses genes mutantes a defeitos no mesoderma axial que normalmente teriam ajudado a induzir o eixo dorsal. 1981. 1996. os resultados da perturbação do desenvolvimento) para depois. Salome Gluecksohn-Schoenheimer (agora S. quando o gene do T-locus foi clonado e sua expressão detectada pela técnica da hibridização in situ (discutida mais adiante neste capítulo). Gilbert. O estudo da regeneração do olho da salamandra demonstrou que mesmo células adultas diferenciadas podem reter o seu potencial de produzir outros tipos celulares. 1986. 1995. às vezes. mais informações sobre suas turbulentas origens podem ser encontradas em Oppenheimer.alterando a estrutura durante seu desenvolvimento e observando quais eram as conseqüências dessa operação. 1991. 1991. chegar a conclusões sobre a natureza do “experimento” realizado pelo gene. Drosophila. 1940) mostrou que mutações nos genes de Brachyury do camundongo. por parte de embriologistas que estavam estudando a regeneração de tecidos excisados. Waddington (1939) isolava diversos genes que causavam malformações alares na mosca das frutas.

W. Os núcleos do lado dorsal da íris começam a sintetizar quantidades enormes de ribossomos. esses melanossomos são ingeridos por macrófagos que entram no local da ferida). a se desdiferenciar expelindo seus melanossomos (os grânulos pigmentados que dão ao olho a sua cor. Uma vez formada uma nova lente. Essas células começam então a sintetizar os produtos diferenciados de células lenticulares.4). não havia perdido gene algum daqueles usados na diferenciação das células da lente. A formação da lente por células diferenciadas da íris representa metaplasia (ou transdiferenciação).4 Íris ventral Regeneração Wolffiana da lente da salamandra a partir da margem dorsal da íris. Yamada e seus colegas (Yamada. as proteínas do cristalino. Essas proteínas são fabricadas na mesma ordem que no desenvolvimento normal da lente. a lente normalmente se desenvolve a partir de uma camada de células epiteliais da cabeça. 18 e 30. 9. vista respectivamente nos dias 5. cortesia de R. 1954. 7. não-operado no estágio larval da salamandra Notophtalmus viridiscens. Como será visto em detalhe mais tarde. 1991). em seguida. A regeneração do tecido lenticular da íris (a assim chamada regeneração Wolffiana a partir da pessoa que primeiro a observou em 1894) foi intensamente estudada. (A) Olho normal. Esses eventos não são a via normal pela qual a lente dos vertebrados é formada. Reyer. a transformação de um tipo celular diferenciado em outro (Okada. e uma nova lente pode ser formada a partir das células da íris dorsal. Retina pigmentada Retina neural Íris dorsal Lente Figura 2. (B-G) Regeneração da lente. A nova lente estará completa no dia 30. 16. A íris da salamandra. uma série de acontecimentos leva à produção de uma nova lente a partir da íris (Figura 2. induzida pelas células retinais precursoras subjacentes. 1966. Dumont e Yamada.) (B) (C) (A) (D) (E) (F) (G) . (de Reyer. A íris dorsal continua a se dividir. as células do lado dorsal da íris cessam sua atividade mitótica. 1972) acharam que após a remoção de uma lente. portanto.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 41 neural promove sua regeneração a partir da retina pigmentada. e divisões mitóticas se sucedem. formando um globo de tecido desdiferenciado na região da lente removida. seu DNA se replica. As células da íris pigmentada começam.

5). O ovo hospedeiro é agora considerado estar ativado (as reações de fertilização necessárias para iniciar o desenvolvimento foram completadas) e enucleado. Se cada núcleo fosse idêntico ao núcleo do zigoto. A bela R. Em 1952.42 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Clonagem de Anfíbios: A Restrição da Potência Nuclear O teste definitivo sobre se. O que acontece quando núcleos de estágios mais avançados são transferidos para oócitos ativados e enucleados? Os resultados de King e Briggs (1956) estão delineados na Figura 2. 1966. Ocorre rearranjo citoplasmático interno e a finalização da meiose perto do pólo animal da célula. o ovo sofre todas as mudanças citológicas e bioquímicas associadas à fertilização.5 Procedimento para o transplante de núcleos da blástula para ovos ativados enucleados de Rana pipiens. As dimensões relativas do fuso meiótico foram exageradas para demonstrar a técnica.) Membrana cicatriza . o núcleo de uma célula diferenciada sofreu qualquer restrição funcional irreversível. a punção do oócito nesse local induz o fuso e seus cromossomos a fluir para fora do ovo (Figura 2. ou não. pipiens na fotografia foi derivada dessa maneira. Esse fuso meiótico pode ser facilmente localizado quando empurra os grânulos pigmentados do pólo animal. Quando um oócito de rã-leopardo (Rana pipiens) é perfurado com uma agulha limpa de vidro. (2) um método para isolar núcleos doadores intactos. houve um dramático decréscimo da capacidade dos núcleos derivados de estágios mais tardios direcionar o desenvolvimento direto até o estágio de Pólo animal Agulha de vidro Fuso meiótico isolado Micropipeta Fuso meiótico Grânulos pigmentados Remoção dos cromossomos e do fuso da célula Ovo ativado enucleado Extração e lise da célula doadora Núcleo doador inserido na célula enucleada Figura 2. DiBerardino e N. (3) um método para transferir tais núcleos para dentro do ovo sem danificar o núcleo ou o oócito. e o citoplasma do doador não parece afetar o resultado dos experimentos. Hoffner. três técnicas tiveram que ser aperfeiçoadas: (1) um método para enuclear ovos do hospedeiro sem destruí-los. seria o de conseguir que esse núcleo gerasse todo outro tipo de célula diferenciada no organismo. Enquanto a maioria dos núcleos da blástula podiam produzir girinos completos. Algum citoplasma acompanha o núcleo para seu novo lar. Briggs e King demonstraram que núcleos da célula da blástula podiam direcionar o desenvolvimento de girinos completos quando transferidos para o citoplasma do oócito. (Segundo King. fotografia cortesia de M. antes que tal experimento pudesse ser feito. o núcleo de cada célula deveria ser capaz de direcionar todo o desenvolvimento do organismo. quando transplantado para um ovo ativado enucleado. Porém. em primeiro lugar por Robert Briggs e Thomas King que combinaram a enucleação com a ativação do ovo. mas a razão do citoplasma doador para o receptor é somente de 1:105. Essas técnicas foram desenvolvidas na década de 1950.6. A passagem de um núcleo para o ovo é conseguida pela ruptura de uma célula doadora e transferência do núcleo liberado para o oócito por meio de uma micropipeta.

A abscissa representa o estágio no qual o núcleo doador (de R.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 43 Estágio desenvolvimental dos embriões e girinos dos quais foram retirados os núcleos to ca a ud l ía co Figura 2. células do sangue. Entre 276 núcleos transferidos. pipiens) foi isolado e inserido no oócito ativado e enucleado. transferia-se o núcleo da blástula para vários outros ovos). somente 10 (1. embora células de Xenopus tenham retido suas potências por um período de desenvolvimento mais longo (Prancha 1). A ordenada mostra a porcentagem desses transplantes capazes de produzir blástulas que podiam em seguida direcionar o desenvolvimento para o estágio do girino nadador (Segundo McKinnell. obtiveram resultados sugerindo que os núcleos de algumas células diferenciadas podem permanecer totipotentes. 1966). Além disso. núcleos das células intestinais dos girinos foram capazes de gerar todas linhagens de células – neurônios. células somáticas parecem perder sua capacidade de direcionar desenvolvimento completo à medida que se tornam definidas e diferenciadas. esses núcleos eram totipotentes (Figura 2. que podem migrar até o intestino. Em alguns casos. em lugar dos dois usuais). que os distinguia dos núcleos do hospedeiro. usando métodos ligeiramente diferentes de transplante nuclear na rã Xenopus. Gurdon havia transferido núcleos do endoderma intestinal de girinos Xenopus que se alimentavam. núcleos de células germinativas de girinos do estágio de broto caudal (que irão finalmente dar origem a um organismo completo após a fertilização). em função da idade do desenvolvimento nuclear. não foram usadas como fontes de núcleos. Transplantes seriados (que requeriam colocar um núcleo intestinal em um ovo e quando o ovo tinha se transformado em blástula. As exceções a essa regra mostraram ser muito interessantes. Esses núcleos doadores continham um marcador genético (um nucléolo por célula. nervos e assim por diante – de um girino vivente. Clonagem de Anfíbios: A Pluripotência de Células Somáticas John Gurdon e seus colegas. Gurdon também achou uma progressiva perda de potência no decorrer do desenvolvimento. é possível que alguns núcleos celulares diferenciados sejam diferentes de outros. 1956). 1962). Assim. sete desses girinos (de dois núcleos originais) se metamorfosearam em rãs adultas férteis (Gurdon e Uehlinger. foram capazes de direcionar desenvolvimento completo em 40 porcento das blástulas que se desenvolveram (Smith. não ocorreu desenvolvimento normal.4 porcento) promoveram o desenvolvimento até o estágio do girino que se alimentava. Porém. Quando núcleos de células somáticas de girinos no estágio de broto caudal foram usados como doadores. para ovos ativados enucleados. Porém. King e seus colegas criticaram esses experimentos assinalando que: (1) não haviam sido tomadas suficientes precauções para ter certeza que células germinativas primordiais.7). e (2) as células intestinais de um girino tão jovem poderiam não se qualificarem . 1978. aumentavam o rendimento para 7 porcento (Gurdon.) Girinos (Rana pipiens) nadando normalmente Horas a 18oC girino. e a progressiva restrição da potência nuclear durante o desenvolvimento parece ser uma regra geral.6 Porcentagem de embriões de transplantes nucleares que se desenvolvem normalmente á Bl st a ul ta r a di a ul pr G ec e oc a ul ta r a di N êu ru la G ás tr ás tr m ard co c om o s n t o c n e os iri m in G ati ir b G o br Gráfico de transplantes nucleares bem sucedidos.

Quando núcleos dessas células foram transferidos para oócitos ativados e enucleados de Xenopus. Por transplantes seriados. em outros casos. Um único núcleo derivado de uma hemácia de uma rã adulta (que nem se replica e nem sintetiza RNA) pode sofrer mais de 100 divisões após ser transplantado para um oócito ativado e. Em alguns casos não ocorre divisão. porém. em alguns casos o desenvolvimento do embrião é sustado.. ainda. 1975). Briggs.) Irradiação UV destrói comossomos do ovo Núcleo intestinal epitelial é inserido no ovo irradiado Micropipeta Núcleo intestinal Ovo receptor irradiado RESULTADOS Blástula Blástula Blástula Sem divisão Girino Girino (morre) Embrião anormal Rã adulta (Cepa 1 – nu) como um tipo de célula verdadeiramente diferenciada porque células de girinos que se alimentam ainda contêm plaquetas de gema (DiBerardino e King. 1968. reter a habilidade . 1978. 1977. e um núcleo intestinal de um girino marcado (1-nu) é inserido. nenhum dos transferidos de primeira geração progrediu além da formação do tubo neural. 2-nu) é irradiado para destruir os cromossomos maternos. Embora esses girinos tivessem morrido antes de atingir o estado alimentar. um único núcleo celular diferenciado ainda retinha potências incríveis. a proteína característica de células adultas da pele. pouco após a gastrulação.44 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 2. 1979).7 EXPERIMENTO Ovo não-fertilizado (cepa 2 – nu) Girino (cepa 1 – nu) Procedimento empregado para obter rãs maduras de núcleos intestinais de girinos de Xenopus. Gurdon e seus colegas cultivaram células epiteliais da membrana natatória de rãs adultas. Essas células mostraram estar diferenciadas. numerosos girinos foram gerados (Gurdon et al. cada uma continha queratina. Para responder a essas críticas. (Segundo Gurdon. 1967. McKinnell. porém. uma rã inteiramente nova é formada tendo um genótipo 1-nu. O ovo de tipo selvagem (2 nucléolos por núcleo.

1983). DiBerardino. e substituição por pronúcleos de outro (Figura 2. mesmo se rãs adultas pu- dessem ser geradas de núcleos diferenciados. 1989). Deve ter ficado óbvio da discussão precedente que clonar um indivíduo totalmente desenvolvido. o citoplasma do oócito humano pode não responder a sinais emitidos por um núcleo de uma célula em estágio avançado. Além das dificuldades éticas e técnicas do trabalho com o organismo humano. 1984). é uma formidável tarefa. a partir de células diferenciadas. se está pedindo ao núcleo para reverter para condições fisiológicas às quais ele não está acostumado. Além disso. se desenvolvem até o blastócito (blástula). Enquanto mais de 90 porcento dos zigotos enucleados do camundongo. Acredita-se que a espermina remova histonas da cromatina podendo “re-acertar” a atividade dos núcleos. 62 porcento daqueles núcleos que iniciaram desenvolvimento normal. prosseguiram até a geração de girinos normais.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 45 de gerar girinos natatórios (Orr et al. muitos genes não usados na pele ou em células sangüíneas. pela remoção de pronúcleos (haplóides) de espermatozóide e óvulo de um zigoto. foram tratados dessa maneira.. 1986. Similarmente. Transplante nuclear foi conseguido em camundongos. núcleos de embriões de 8 células . Primeiro. Em animais controle. enquanto alguns núcleos de células diferenciadas dividem-se raramente. Quando se transfere um núcleo de uma célula diferenciada para o citoplasma do oócito. essa habilidade não poderia ser extrapolada para células humanas. facilmente ver que o genoma da célula diferenciada é notavelmente potente em sua habilidade de produzir todos os tipos celulares do girino anfíbio. o estômago. tal núcleo pode no entanto instruir a formação de todos os órgãos do girino natatório. McGrath e Solter. Embora DiBerardino (1987) tenha observado que “até o presente. Segundo. os núcleos das células diferenciadas não foram capazes de gerar animais adultos quando colocados em células ativadas e enucleadas. Em outras palavras. mesmo existindo um debate sobre a totipotência de tais núcleos. nenhum dos núcleos conseguiu gerar tais girinos. Mesmo em anfíbios. Os núcleos da clivagem das rãs dividem-se rapidamente. no estágio de broto caudal. cada núcleo no corpo contém a maioria (se não todos) dos mesmos genes. existe pouca dúvida de que eles são extremamente pluripotentes.8. Assim. Os camundongos resultantes exibem o fenótipo do núcleo doador. Esses zigotos reconstruídos começam a se dividir e são então implantados no útero. Podemos olhar para esses experimentos de clonagem de anfíbios de duas maneiras. Informações adicionais & Especulações Clonando Mamíferos por Prazer e Lucro C LONAR SERES HUMANOS a partir de células previamente diferenciadas parece ser o objetivo de editores de jornais e novelistas. núcleo algum de uma célula documentadamente especializada. desenvolveu-se até esse estágio quando núcleos de embriões de 4 células foram transferidos para zigotos enucleados (McGrath e Solter. Quando núcleos do endoderma de girinos de Rana pipiens. recebendo pronúcleos de outros zigotos. se tanto. Assim. Falhas em replicar DNA rapidamente podem levar a quebras cromossômicas: tais anormalidades foram vistas em muitas células de girinos clonados. Algumas das diferenças entre os resultados dos laboratórios de Briggs e de Gurdon. nem de uma célula adulta tenha mostrado ser totipotente”. Certamente. ou o coração de um girino natatório. os genes para o desenvolvimento do girino completo não pareceram ter sido perdidos pelas células do endoderma. podem ser reativados para produzir os nervos. nem um único embrião (de 81). podem envolver diferenças na fisiologia do desenvolvimento das rãs Rana e Xenopus. Sally Hennen (1970) mostrou que o sucesso desenvolvimental de núcleos doadores pode ser ampliado tratando-se esses núcleos com espermina e resfriando os ovos para dar tempo ao núcleo de se adaptar ao citoplasma do ovo. reconhecer uma restrição geral de potência concomitante ao desenvolvimento.

Por isso. 1989). A membrana celular não está rompida. Tais experimentos provavelmente fracassam porque núcleos de blastômeros não funcionam de maneira normal no citoplasma zigótico.9). A pipeta de enucleação perfura a zona pelúcida (a proteína que envolve o ovo) e aspira a membrana celular adjacente e a área da célula contendo os pronúcleos. Células livre do calo continuam a se desenvolver em suspensão Floema de raiz Corte transversal da raiz Planta jovem Planta embrionária transferida para meio de cultura de agar Planta de cenoura madura no agar Planta de cenoura madura Proliferação de massa celular (calo) em meio de cultura de leite de coco . porcos e coelhos foram capazes de direcionar o desenvolvimento completo quando transplantados para oócitos ativados e enucleados (Prather et al. Esse fluido (é realmente o endosperma da semente do coco) contém os fatores e nutrientes necessários para o crescimento da planta e os hormônios exigidos para a diferenciação. Em contraste com núcleos de ouriços-do-mar ou anfíbios. Pequenos pedaços de floema são isolados da cenoura e rodados em grandes frascos contendo leite de coco.. a continuidade do citoplasma limitado pela membrana está indicada pela flexa. os núcleos dos blastômeros precoces do camundongo *Cada blastômero da massa celular interna é totipotente no sentido de reter sua capacidade de formar células de qualquer tipo no organismo. (C) Essa vesícula é misturada com vírus Sendai (que induz a fusão de membranas nucleares) e é inserida no espaço entre a zona pelúcida e o outro ovo enucleado.html] Clonagem de Plantas Somente nas plantas os núcleos de células diferenciadas de organismos adultos podem ser facilmente vistos como capazes de direcionar o desenvolvimento de outro organismo adulto. 1991). (A) A pipeta de enucleação é retirada e o citoplasma contendo os pronúcleos é removido do ovo. (B) A membrana celular forma uma vesícula ao redor dos pronúcleos no interior da pipeta de enucleação. cortesia dos autores. (Segundo McGrath e Solter.8 Procedimento para transferir núcleos para o ovo ativado enucleado de mamifero. Wilmut e colaboradores (1997) mostraram que é possível clonar um carneiro a partir de um núcleo de célula de glândula mamária adulta. 1988. Em 1958. Recentemente. C. núcleos de embriões pré-implantados de gado. (D) O vírus Sendai proporciona a fusão do ovo enucleado e os pronúcleos envoltos pela membrana. Stice e Robl. Esse resultado poderá ter importantes conseqüências agrícolas e legais (Prather. (cujas células são totipotentes) não dão suporte para o desenvolvimento total. incubado em colcemida e citocalasina para relaxar o citoesqueleto. mas não a placenta*) também não puderam apoiar o desenvolvimento. Um embrião de célula única. Nem todos blastômeros mamíferos são os mesmos. Usando modificações técnicas. 1987. os tecidos proliferam e formam uma massa e massa celular interna (os blastômeros que formam o embrião. permitindo que os pronúcleos (flexa) penetrem na célula.. a clonagem de Elvis Presley a partir de células diferenciadas não é algo com que possamos contar. F. Porém. é seguro com uma pipeta de sucção. Willadsen (1986) produziu carneiros de termo completo a partir de núcleos transplantados de blastômeros do estágio de 8 células. Os núcleos haplóides derivados do espermatozóide e do óvulo. as espécies mamíferas diferem muito em termos de temFigura 2. os núcleos vieram de embriões pré-implantados. Essa capacidade permite o aparecimento de gêmeos. Sob essas condições. Steward e seus colegas estabeleceram um processo pelo qual os tecidos diferenciados de raízes de cenouras podiam dar origem a toda uma nova planta (Figura 2. não se juntaram ainda. 1983. todavia. Willadsen.9 Experimento de Steward demonstrando a totipotência de células do floema da cenoura. em todos esses casos. Prather et al.46 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) (C) (B) (D) Figura 2. Essa habilidade foi dramaticamente demonstrada em células de cenouras ou tabaco. [gene4. 1989.) po de ativação e implantação uterina.

Steward. Além disso. ao menos. essa citação vem de Jacques Monod (1947). diferentes padrões ou configurações específicos. esse grupo de novas enzimas aparecem. quando encontram a lactose. O terceiro desafio . algumas dessas subunidades estão rearranjadas ou mesmo suprimidas do genoma. ou no mínimo. a bactéria Escherichia coli só sintetiza β-galactosidase e outras enzimas digestoras de lactose. Porém. ainda para ser preenchida. isso ainda deixa sem resposta outra grande questão levantada pelos embriologistas: Se o núcleo de cada célula no organismo tem os mesmos genes. do grego klon. adquirir a propriedade de confeccionar moléculas com novos. A partir desses nódulos. uma vez que a explicação geral para a expressão diferencial da expressão gênica foi estabelecida. Porém. Conforme veremos. colocados em um meio solidificado com agar. até agora não resolvido. . A continuação da rotação leva ao desbastamento de células individuais do calo para o meio de suspensão. o genoma é o mesmo de célula para célula no organismo. muitos biologistas concordaram que: a maior lacuna. Cada célula tem todas as subunidades gênicas das imunoglobulinas. porém. o resto da planta é capaz de se desenvolver. e os genes para as queratinas da pele podem ser encontrados em neurônios cerebrais. Curiosamente. a propagação vegetativa de plantas por corte (i. 1970). as plantas normalmente derivam seus gametas de células somáticas. Essas células dão origem a nódulos celulares semelhantes a raízes que continuam a crescer enquanto permanecem em suspensão. não é tão surpreendente que uma única célula de uma planta possa se diferenciar em outros tipos de células e formar um clone geneticamente idêntico (clone. dependendo da presença ou não de determinado composto (no caso. mas em linfócitos. como podem esses genes fazer com que essas células se tornem diferentes? *Pouco tempo após a 2a Guerra Mundial. *A grande exceção a essa regra da constância dos genes – os genes das imunoglobulinas – é discutida no Capítulo 10. Em micróbios.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 47 desorganizada chamada calo. Se a lactose está ausente do citoplasma. um geneticista microbiano trabalhando na síntese de enzimas adaptativas. que são proteínas que embora não sejam usualmente sintetizadas por bactérias ou levedos. Por exemplo. o modelo do operon demonstrou como uma substância do ambiente podia efetuar a expresão gênica diferenciada. significando “ramo”). o mesmo genoma pode produzir dois estados citoplasmáticos funcionalmente diferentes. com a introdução de lactose no citoplasma. Sobre E. regeneram as partes faltantes) é uma prática agrícola comum.. Mas. coli e elefantes: O modelo operon Na maioria dos casos estudados. Monod lançou a hipótese que o fenômeno da adaptação enzimática podia oferecer a solução para o problema de como genomas idênticos podem sintetizar diferentes moléculas “específicas”. Os genes para a proteína globina podem ser encontrados em células da pele.e. É o problema repetidas vezes declarado. essas enzimas não são sintetizadas. a lactose). entre dois campos da pesquisa em biologia é provavelmente aquela entre a genética e a embriologia. serão sintetizadas se os microorganismos encontrarem um novo substrato. 1964. formando uma planta de cenoura completa e fértil (Steward et al.a explicação de como o ambiente pode direcionar o desenvolvimento – foi prontamente compreendida. de como células com genomas idênticos podem se tornar diferenciadas. porções de plantas que quando nutridas. plantas e animais se desenvolvem de maneira diferente. Portanto. em contraste com anfíbios e mamíferos (nos quais as células germinativas são destacadas como uma linhagem distinta de células no início do desenvolvimento).

Waddington aprovou especialmente esse modelo porque significava que os genes não são apenas ativos. Estando presente. Em 1961. No entanto. Em sistemas indutivos.html] No fim da década de 1950. começa com um capítulo relacionando o modelo do operon de Jacob e Monod com o controle da expressão gênica no desenvovimento dos anfíbios. Essa redefinição focaliza a atenção para a relação entre os genes do núcleo e as propriedades do citoplasma. o gene torna-se capaz de transcrever mRNA. O livro de Waddington (1962). [gene5. em última análise. Eles conectaram seus resultados ao “problema fundamental da embriologia química que é a compreensão do porquê células dos tecidos não expressam constantemente todos os potenciais contidos em seu genoma”. Na próxima década. mas passar a ser considerado uma propriedade bioquímica de células individuais. as regras simples que esperavam encontrar. e apelaram para a unidade da natureza e. essa criatura microscópica. O microbiologista Sol Spiegelman (1947) declarou que a embriologia estava sendo prejudicada por sua própria terminologia. se alguém entender a bactéria. o indutor liga-se à proteína repressora alterando sua conformação de forma a impedir a ligação ao operador. Spiegelman via uma semelhança fundamental entre a indução de novos tipos celulares no embrião e a indução de novas enzimas em microorganismos. Muitos geneticistas microbianos explicitamente ligaram enzimas indutivas a conceitos embriológicos. que conclui: Na geração anterior.10). Dessa maneira. mostrou um caminho. A diferenciação deveria ser vista não em termos anatômicos. síntese de embriologia com genética por John Moore. Jacob e Monod enfatizaram que o mecanismo de controle do operon-símile pode ser parte da regulação gênica universal. que pode ser traduzido formando proteína. Em um importante trabalho de 1961. Muitos embriologistas. Esse é o termo técnico usado em embriologia para descrever a habilidade de uma célula produzir uma substância capaz de influenciar a diferenciação de outra. a síntese de uma enzima adaptativa em presença do seu substrato deveria ser discutida como uma “indução”. O problema da diferenciação não podia mais ser visto como uma propriedade estrutural dos tecidos. Além disso. dependendo da presença ou não do respectivo indutor. Novos Padrões na Genética e no Desenvolvimento. . O modelo do operon foi imediatamente introduzido nos textos de embriologia por cientistas que procuravam a síntese da genética com a embriologia. o mesmo genoma pode sintetizar diferentes enzimas. O agente molecular responsável deveria ser chamado “o indutor”.48 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Monod não foi o único cientista a achar que micróbios unicelulares poderiam explicar a diferenciação multicelular. enfatizando a complexidade do desenvolvimento e a diversidade da performance embriológica. à medida que eles avançam em sua ciência para além daquilo que cada um poderia ter conseguido isoladamente. 1979). mas reativos. Julgavam ser válida a extrapolação. Waddington considerou genes e citoplasma como mutuamente interativos. sem embrião próprio. coli (Figura 2. Como sugerido por Monod (veja Judson. Essa perspectiva foi também salientada em Hereditariedade e Desenvolvimento (1963). poucos embriologistas ou geneticistas teriam previsto que a síntese dos seus campos de trabalho teria se tornado possível por estudos com a bactéria Escherichia coli. um grupo de pesquisadores acreditava que micróbios eram um excelente (e facilmente estudado) modelo para diferenciação embrionária. poderá ser difícil perceber a diferença entre um geneticista e um embriologista. Com isso. uma proteína repressora codificada por genes liga-se ao sítio operador adjacente aos genes estruturais. Jacob e Monod sintetizaram dados sobre a indução da β-galactosidase levando à construção do modelo do operon. porém. Esse modelo postula que a pequena molécula do indutor causava a transcrição de diferentes genes em E. respondendo às mudanças no citoplasma. entenderá o elefante. permaneceram cépticos a respeito da extrapolação de bactérias a embriões. mas como “produção controlada de padrões enzimáticos únicos”. impedindo a ligação da RNA polimerase ao sítio promotor que inciaria a transcrição.

coli. Como bactérias eram os modelos para tal atividade. alterando sua forma. Os três postulados da expressão gênica diferencial eram os seguintes: . coli. expressão em geral significava transcrição de mRNA.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 49 (A) O operon lac Figura 2. (D) A solubilidade dessa proteína é demonstrada em estudos com o mutante de E. Quando células bacterianas haplóides com um gene indutor nãofuncional (i-) são tornadas parcialmente diplóides com o gene tiposelvagem (i+). (B) Quando a lactose não está disponível. Genes estruturais Lactose mRNA RNA polimerase β-galactosidase mRNA é transcrito Lactose combinando com o repressor. forma-se repressor tipo-selvagem capaz de tornar indutível o gene original da β-galactosidase. Porém. combina com a proteína repressora.10 Gene indutor Promotor Operador Genes estruturais para utilização da lactose (B) Quando não há lactose disponível Genes estruturais Proteína repressora produzidas por i liga-se a o (C ) Quando a lactose está disponível Não há transcrição de genes estruturais Regulação diferencial de genes em E. não há transcrição de RNA de β-galactosidase a não ser que a lactose esteja presente. uma proteína repressora produzida pelo gene i liga-se ao sítio repressor (o). emergiu na década de 1960 um consenso de que as células regulam seu desenvolvimento através da expressão gênica diferencial. baseado na evidência embriológica a favor da equivalência genômica e do modelo do operon de E. previne ligação a o (D) O repressor da lactose é solúvel Genes estruturais O gene i do tipo selvagem pode produzir repressor para ambos cromossomos que se ligam a o na ausência de lactose Genes estruturais Síntese diferencial de RNA A desejada unificação não ocorreu tão rapidamente como esperado por Moore. (A-C) No estado induzível de tipo-selvagem. fazendo começar a transcrição. o que faz com que a proteína não possa mais se ligar ao DNA operador . inibindo a transcrição pela RNA polimerase do promotor (p). coli. (C) Quando o indutor lactose está presente.

B de Burkholder. Os quatro cromossomos estão conectados em seus centrômeros. seu aparecimento mudava com o desenvolvimento dessas células (Figura 2. Em termos moleculares. Os genes não-usados das células diferenciadas não são destruídos ou mutados. ou mesmo mais hélices duplas paralelas de DNA em lugar de somente uma (Figura 2. Ainda mais.12). acharam regiões cromossômicas que estavam “estufadas”.13). e uma porção do RNA sintetizado é específica para aquele tipo de célula. tais células morrem sendo substituídas por células diplóides não politênicas agrupadas em certas regiões da larva (veja Capítulo 19). Beermann estudando o mosquito Chironomus e Becker (1959) estudando Drosophila. Beermann (1952) mostrou que o padrão de distribuição das bandas de cromossomos politênicos era idêntico ao longo da larva e que não se notavam perdas ou adições de qualquer região cromossômica quando diferentes tipos de células eram comparados (Figura 2. D. Prancha 31). A maior parte tem cromossomos politênicos. Burkholder. e crescem expandindo seu volume até 150 vezes. Após a eclosão. (A) Cromossomos politênicos de células da glândula salivar de Drosophila melanogaster. 3. 1976. Tais cromossomos sofrem replicação de DNA na ausência de mitose. Esses tufos apareciam em lugares diferentes nos cromossomos em cada tecido. aldeído oxidase (Aldox) e octanol desidrogenase (ODH) foram mapeados nas posições designadas nesses cromossomos. Só uma pequena porcentagem do genoma está sendo expressa em cada célula. Ursprung. retendo o potencial de serem expressos.) Aldox . (B) Fotografia ao microscópio eletrônico de uma pequena região de um cromossomo politênico de Drosophila. contendo portanto 512 (29). cortesia de H. formando um denso cromocentro. Porém. os DNAs de todas as células diferenciadas são idênticos. Essas células não sofrem mitose. Os dois primeiros postulados já foram discutidos. 1968. 2. O terceiro – que só uma pequena parte do genoma está ativo produzindo produtos específicos dos tecidos – foi primeiro testado em larvas de insetos. alguns tufos podiam ser Figura 2.11.000 células. uma larva de inseto tem duas populações celulares diferentes. (A de Ursprung et al. formadas por cerca de 10.50 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento 1.. Durante a metamorfose. cortesia de G.11 Cromossomos politênicos. Cada núcleo celular contém o genoma completo estabelecido no ovo fertilizado. As bandas escuras estão altamente condensadas comparadas com as regiões interbandas. Os genes estruturais para a álcool desidrogenase (ADH). 1024 (210).

Wensink. (B) De Barnett et al. esse tufo não existia nos não-produtores. Notar a constância do número de bandas nos diferentes tecidos. 1978).. Altos produtores tinham dois tufos (um em cada cromossomo homólogo). Os produtores tinham uma tufo grande (anel de Balbiani) em determinada banda. 1972. . Ashburner. apesar da proteína não ser aí sintetizada. O cruzamento de produtor com não-produtor resultou em larvas produzindo quantias intermediárias de proteína salivar. Duas espécies intercruzadas diferentes de Chiromonus foram encontradas: uma produzindo grande quantidade de proteína salivar e a outra não (Figura 2. Beermann concluiu que a informação genética necessária para a síntese dessa proteína salivar está presente nessa banda distal do cromossomo e que sua produção dependia de transformação em uma região estufada. e não-produtores nenhum tufo. Beermann (1961) apresentou evidências que esses tufos representam um afrouxamento localizado de cromossomos politênicos (Figura 2. Notar que o gene para a proteína está presente no cromossomo da glândula salivar. produtores intermediários tinham apenas um.14) e que são sítios de síntese ativa de RNA. 1966. Cruzando duas moscas híbridas. Os grãos escuros (flexa) mostram onde a mensagem da proteína radioativa da gema se ligou aos cromossomos. (A) Segundo Beermann. 1952.12 Identidade genômica em cromossomos politênicos. C. a capacidade de produzir proteína salivar segregou-se de forma Mendeliana: 1 alto produtor: 2 intermediários:1 não-produtor. fotografia cortesia de P. Ashburner e Berondes. (A) Glândula salivar (B) Túbulos de Malpighi Tecido retal Intestino Figura 2. (A) Uma região do conjunto cromossômico da mosca Chiromonus tentans.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 51 estimulados ou inibidos por certas mudanças fisiológicas causadas pelo calor ou por hormônios (Clever. 1980.15). (B) Hibridização do RNA de uma proteína da gema com um cromossomo da glândula salivar larval de Drosophila.

Outras bandas (71DE. (A de Grossbach. cortesia de U. Notar o estufamento e a regressão das bandas 74EF e 75B. (A) Fotomicrografia em contraste de fase. B segundo Beermann. 78D) estufam mais tarde. 1963) . (A. de preparações coradas. B mostra o isolamento de BR2 do cromossomo 4 de C. Transcrição de BR2 foi demonstrada incubando glândulas salivares isoladas com precursores de RNA (A) (B) Figura 2.14 Terminação proximal do cromossomo 4 da glândula salivar de Chiromonus pallidivitatus. tentans. (B) Diagrama da região passando por estufamento. 1975). mostrando o extenso tufo no cromossomo politênico. Ashburner. A Figura 2. Grossbach. O BR2 pode ser isolado por microdissecção devido seu tamanho excepcional. (C) larva de 115 horas.B) larva de 110 horas. (Cortesia de M. mostrando o enorme tufo BR2.E) estágio pré-pupa (após 4 horas). porém.52 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 2. e seus produtos podem ser analisados por autoradiografia (Lambert e Daneholt.16 A. a maioria não estufa de modo algum durante o período. (D.) (A) (B) (C) (D) (E) Prova adicional de que tufos cromossômicos produzem mRNA vem de estudos sobre tufos do anel de Balbiani (BR2) em Chironomus tentans. 1973.13 Seqüência de estufamentos de uma porção do cromossomo 3 da glândula salivar de Drosophila melanogaster.

15 radioativos. 1972. (C) Transcrição da região BR2 mostrado por uma auto-radiografia in situ após hibridização do BR2 RNA com a preparação cromossômica. BR2. mostrou que o DNA estufado (Puff de DNA) . 1977). em seguida. uma contendo BR2. Esse RNA era excepcionalmente grande – cerca de 50.16 (C) (A. O grande segmento de RNA radioativo. mostrando somente anéis de Balbiani 1. um RNA transcrito de uma banda específica de DNA. (A e B segundo Beermann.e nenhum outro local . (A) Cromossomo de uma célula produzindo uma secreção granular e mostrando um anel de Balbiani adicional [BR4(SZ)]. (C) Evidência genética que a síntese de uma importante proteína salivar depende da formação de tufos BR4(SZ). Lambert. fotografias cortesia de B.000 bases.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 53 BR4(SZ) Alto produtor Não-produtor BR2 Todos produtos intermediários BR1 BR3 Alto produtor (A) (B) (C) Produtores Intermediários Não-produtor Figura 2. Assim. (B) Cromossomo 4 de uma célula salivar. C de Lambert. Esse mesmo RNA pôde ser isolado de polissomos sintetizadores de proteínas. ser extraído da porção BR2 do cromossomo dissecado (Lambert. 1972). O cromossomo intacto 4 pode ser dividido em três regiões. especificamente hibridizado para a região BR2 do cromossomo. Produtores intermediários têm somente um cromossomo 4 com uma região estufada BR4(SZ) em cada célula salivar realizando a secreção. Larvas com altos níveis de secreções granulares têm células salivares glandulares com tufos BR4(SZ) em ambos cromossomos 4 (coloridos).tinha-o transcrito ativamente (Figura 2.) (A) (B) BR 2 Figura 2. O RNA radioativo pôde. Beermann.) . enquanto larvas sem essas secreções não têm tais tufos. 2 e 3 (BR1. indicando que é ativo na síntese protéica (Wieslander e Daneholt. BR3). 1961. pode posteriormente ser visto produzindo proteínas em ribossomos citoplasmáticos.B) Isolamento da região BR2 de Chironomus tentans por micromanipulação.16C). que estufa na glândula salivar larval. cortesia de W. Correlação de padrões de estufamento com funções especializadas nas células das glândulas salivares de Chironomus pallidivitatus. 1975. (A e B de Lambert e Daneholt.

precursores radioativos de DNA e a enzima viral transcriptase reversa. quando lhe é dado tempo suficiente para isso. RNA pode ser esperado hibridizar especificamente com o gene que o codifica. Para encontrar e analisar os genes que são responsáveis pelo desenvolvimento embrionário. Se presente em quantidades suficientemente grandes em comparação com o DNA. conseguido variando a temperatura ou as condições iônicas da solução em que ocorre a renaturação (Wetmur e Davidson.17 Hibridização de ácidos nucléicos.18). Esse problema foi superado isolando o RNA e fazendo uma cópia complementar de DNA (cDNA) na presença de precursores radiativos. RNA sintetizado a partir de uma região particular do DNA poderia ser esperado ligar-se à fita do qual foi transcrito (Figura 2. uma extensão curta de DNA (chamado de iniciador ou primer). se o DNA é cortado em pequenos pedaços e cada pedaço dissociado em duas fitas simples – desnaturado – cada fita na solução deverá achar e reunir-se com seu parceiro complementar. As condições de renaturação devem ser tais que ligação específica entre fitas complementares seja mantida e combinações não específicas sejam dissociadas. Por exemplo.54 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Portanto. não sendo necessário preocupar-se com a diluição (A) Condições de desnaturação (calor. se o DNA for separado em suas duas fitas. Para medir essa hibridização. uma das fitas de ácido nucléico (a sonda) é em geral marcada pela incorporação de nucleotídeos radioativos. Um problema técnico que inicialmente atormentou os estudos de hibridização de ácidos nucléicos foi a dificuldade em conseguir colocar quantidades suficientes de radioatividade na molécula de RNA. adicionar RNA (em grande quantidade em comparação com DNA) RNA hibridiza com uma fita de DNA .17). (B) RNA Desnaturar. 1968). novas técnicas tiveram que ser aperfeiçoadas. em geral. Hibridização de ácido nucléico Poucos genes puderam ser analisados como aqueles nos tufos politênicos de Chiromonus. essas devem se re-anelar sob condições adequadas de força iônica e tempo. Em células que sintetizam essa proteína. Assim. o gene está ativado. o RNA deve ficar capacitado a se ligar a genes que o codificam. álcali) Condições de re-anelamento Figura 2. em células que não usam essa proteína. Isso é. (A) Se a hélice de DNA for separada em duas fitas. A maioria das técnicas para análise de genes eucariotos baseia-se na hibridização de ácidos nucléicos. Essa técnica envolve fortalecimento de pedaços de fitas simples de RNA e DNA. o RNA irá substituir uma das fitas de DNA nessa região. não eram os genes causadores da diferenciação celular. De maneira semelhante. o gene permanece reprimido. O DNA é sintetizado in vitro. os tufos nos cromossomos salivares estão produzindo mRNA ativamente. Isso pode ser feito em tubo de ensaio contendo o RNA. E embora esses genes dos tufos eram ativos em células que já se haviam diferenciado (como aquelas da glândula salivar). De maneira semelhante. Essa enzima pode produzir DNA de um molde de RNA (Figura 2. para permitir a formação de híbridos de fitas duplas.

desnaturando o híbrido de dupla fita e clivando o RNA. dessa maneira.1 Sítio enzimático* Enzimas de restrição comumente usadas Derivação Reconhecimento e clivagem EcoRI BamHi HindIII SalI SmaI HhaI HaeIII AluI Escherichia coli Bacillus amyloliquifaciens Haemophilus influenzae Streptomyces albus Serratia marcescens Haemophilus haemolyticus Haemophilus aegyptius Arthrobacter luteus G AA T T C C T TAA G G G AT C C C C TAG G A AG CTT TTC GA A G TC GAC CAG C T G CCC GGG GGG CCC GCG C C GCG GG CC CC GG AGCT T C GA * Todos os sítios de reconhecimento de enzimas de restrição têm um centro de simetria. o DNA é clivado em cada sítio onde aparece a seqüência GGATCC. A primeira fase desse processo consiste no corte de DNA nuclear em pedaços distintos. Tabela 2. A maioria dos mRNA possui uma longa cadeia de resíduos de adenosina (AAAn) no terminal 3’ da mensagem (a ser discutida no Capítulo 12). por isso. A seqüência de dupla fita lida em uma direção é idêntica à seqüência lida da frente para trás na outra direção. A técnica principal para isolar e amplificar genes individuais é chamada clonagem de genes. quando DNA humano é incubado com a enzima BamHI (de Bacillus amyloliquifaciens. Transcriptase reversa mRNA cDNA Álcali cDNA Figura 2. transcreve uma fita de DNA complementar. Havia necessidade de uma técnica especial de amplificação gênica: Porque não é somente o núcleo. De modo geral. o DNA pode hibridizar tanto com o gene que produziu o RNA (embora a outra fita) e com o próprio RNA. essas endonucleases são enzimas bacterianas que reconhecem seqüências específicas do DNA e o clivam nesses sítios (Tabela 2. desde a década de 1970 a hibridização de ácido nucléico permitiu aos biologistas do desenvolvimento realizar o que Boveri aspirava: isolar e amplificar regiões específicas do cromossomo.html#gene6] mRNA Anelar iniciador mRNA Clonagem de DNA genômico Já em 1904 Theodor Boveri desesperava-se. começando no iniciador dT15. o pesquisador anela um iniciador consistindo de 15 resíduos de desoxitimidina (dT15) ao final 3' da mensagem. Nathans e Smith. Por exemplo. Além disso.19).18 Método para preparar DNA complementar (cDNA). O cDNA pode ser separado aumentando o pH da solução. mas certas partes de certos cromossomos de certas células que precisam ser isolados e coletados em quantidades enormes para análise. considerando que as técnicas de sua época nunca seriam suficientes para permitir-lhe estudar como os genes criam embriões. essa seria uma pré-condição para colocar o químico em uma posição a qual lhe permitiria analisar (o material hereditário) com mais minúcias que o morfologista. Os produtos são fragmentos de DNA de vários tamanhos. Entretanto. Transcriptase reversa em seguida. cepa H). nem mesmo cromossomos individuais. .[other.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 55 dos precursores radiativos. tornando-o extremamente útil para a detecção de pequenas quantidades de RNAs específicos. todos terminando com G em um dos lados e GATCC no outro (Figura 2. 1975). por incubação de DNA com uma endonuclease de restrição (geralmente chamada de enzima de restrição). Esses pedaços são freqüentemente chamados de fragmentos de restrição.1.

um vetor freqüentemente usado por biologistas moleculares (Vierra e Messing. Mesmo que as bactérias e os plasmídeos sejam misturados em condições que encorajam as bactérias a incorporar os plasmídeos.. 1978). ocasionando o fechamento do plasmídeo. Blattner et al. produzem colônias incolores no ágar. nem todas as bactérias incorporam um plasmídeo. Após a abertura. Os plasmídeos recombinantes putativos assim formados são então incubados com células de E. cada um contendo um único pedaço de DNA humano.19 é pUC18. independentemente do cromossomo bacteriano. Em seguida. replicadas em células bacterianas. o ágar também contém um corante chamado Xgal. e os filtros incubados em uma solução contendo o RNA radioativo (ou sua cópia de cDNA) do gene que se *O corante é 5-bromo-4-cloroindol.. Em muitos casos. Quando essas células são lisadas. (2) uma origem para a replicação de DNA. Mas nem todos plasmídeos incorporaram um gene estranho. coli. Ele contém (1) um gene resistente a drogas. Por exemplo. e (3) um poli-ligante. coli são cultivadas em ágar contendo ampicilina. ampicilina-resistente) sobrevivem.1973. Essas bactérias não vão produzir a cor azul do corante. Para evidenciar aquelas bactérias que incorporaram plasmídeos. O poli-ligante é suficientemente curto (e tem o número correto de pares de bases) de modo a não interferir com a atividade enzimática da β-galactosidase. as células tratadas de E. um pedaço curto de DNA artificial que contém os sítios enzimáticos de restrição para várias dessas endonucleases. Para distinguir entre colônias bacterianas que incorporaram DNA estranho e aquelas que não o fizeram. . São usados plasmídeos resistentes a drogas ou vírus especialmente modificados (que são muito úteis na clonagem de grandes fragmentos de DNA).Assim. se um plasmídeo não incorporou um fragmento de restrição ao sítio de enzima de restrição no poli-ligante. mas quando transformado pela β-galactosidase forma um precipitado azul *. ele pode ser misturado com os fragmentos de DNA humano. coli sensíveis à ampicilina e sem o gene da β-galactosidase. Usualmente esses vetores são moléculas circulares de DNA. o gene da β-galactosidase é destruído pela inserção. as fitas de DNA são separadas por aquecimento. Esses são chamados plasmídeos recombinantes ou.56 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento O próximo procedimento na clonagem do gene é incorporar esses fragmentos de restrição em vetores de clonagem. Esse vetor pode ser aberto por incubação com essa enzima de restrição. Colônias incolores são então selecionadas quanto a presença de um gene específico. permitindo ao plasmídeo replicar centenas de vezes em cada bactéria. o gene da β-galactosidase (lacZ) está funcional e a β-galactosidase resultante torna o corante azul. O processo total fornece plasmídeos bacterianos. O resultado é o aparecimento de “colônias azuis”. seu DNA adere aos filtros.1982). O processo de clonagem começa quando os fragmentos de restrição do DNA nuclear são misturados aos plasmídeos abertos pUC18 e a eles são ligados. A ß-galactosidase codificada pelo gene do plasmídeo cliva a galactose do corante permitindo que adquira a conformação azul. porque é possível que os “terminais adesivos” do sítio da enzima de restrição sofram uma renaturação entre si mesmos. se o plasmídeo incorporou um fragmento de DNA. O plasmídeo ilustrado na Figura 2. Somente aquelas bactérias que incorporaram um plasmídeo (com seu gene dominante. produzidos também por BamHI. O poli-ligante se situa dentro de um gene lacZ que codifica a ß-galactosidase de E. Entretanto. os pedaços do DNA cortado serão incorporados a esses vetores (porque seus terminais são complementares aos terminais abertos do vetor) e ligados covalentemente. Células de cada uma dessas colônias são colocadas em um finíssimo filtro de nitrocelulose ou nylon. colocando-os em uma solução contendo a enzima DNA ligase. um vetor pode ser construído contendo apenas um sítio sensível à BamHI. geralmente. e é azul a não ser quando está complexado com uma molécula como galactose. AmpR. DNA recombinante (Cohen et al. que torna a bactéria imune à ampicilina e permite ao pesquisador selecionar aquelas bactérias que incorporaram um plasmídeo. Esse composto é incolor.

O número de fragmentos aleatórios que devem ser clonados para a obtenção do gene desejado. a seqüência do mRNA ou gene não é conhecida.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 57 Sítio Hind III Sítio BamHI Sítio Eco RI Poli-ligante Plasmídeo cortado no gene lacZ Quebra endonucleolítica por BamHI Fragmentos de gene humano incubados e ligados em um plasmídeo Plasmídeo recombinante com gene lacZ interrompido DNA humano Quebra endonucleolítica por BamHI Mistura com bactérias (lacZ–. e incubando o DNA do plasmídeo com BamHI libera-se o fragmento de DNA extranho que contém o gene. Após a lise das colônias bacterianas no papel de filtro.000 colônias podem. tornando-os escuros quando o filme é revelado.19 Um protocolo geral para clonar DNA. Esse fragmento pode ser separado do DNA plasmídico. emitidos pelo RNA radioativo. aumenta com a crescente complexidade do genoma do organismo*. Meio contendo ampicilina “Colônias azuis” Aplicação das colônias “incolores” nos círculos do papel de filtro. Apesar desse procedimento parecer muito lógico e fácil. produzindo bilhões de bactérias. e somente aquele DNA deverá ser capaz de ligar o RNA radioativo ou a sonda de cDNA. As bactérias transcreverão o cDNA e o traduzirão em proteína. uma mancha escura é produzida sobre cada colônia contendo o plasmídeo recombinante que carrega o gene específico (veja Figura 2. Apesar que milhões de clones precisam ser selecionados. e os plasmídeos referidos como vetores de expressão. as proteínas aderem ao papel e podem ser identificadas por anticorpos dirigidos contra àquela proteína. sensibilizam os grãos de prata no filme. “Colônias incolores” quer clonar. Finalmente. coli por centrifugação.19). freqüentemente o número de colônias a serem selecionadas é astronômico. Os elétrons de alta energia. sensível à amp. devendo-se então estimar a seqüência a partir da seqüência de aminoácidos da proteína).) Figura 2. Isso é chamado clonagem de expressão. milhões de clones individuais devem ser selecionados. Essa colônia é então isolada e cultivada. ser selecionadas em uma única placa. somente aquelas áreas serão radioativas. Se o plasmídeo contém aquele gene. cada uma contendo centenas de plasmídeos recombinantes idênticos. Portanto. *Complexidade se refere ao número de diferentes tipos de genes no núcleo. permitindo ao pesquisador possuir microgramas de seqüências de DNA purificado contendo o gene específico. aproximadamente 100. agora. usando como exemplo a inserção de uma seqüência de DNA humano em um plasmídeo com um sítio sensível à BamHI. seu DNA deve estar no filtro. Outra maneira comum de selecionar os clones é usar um plasmídeo que tem seu sítio da enzima de restrição próximo a um vigoroso promotor bacteriano (tal como aquele para ß-galactosidase). A radioatividade nessas regiões é determinada por auto-radiografia. Filme sensível a raios-X é colocado sobre o papel tratado. Em alguns casos. Para detectar um gene específico de um genoma de mamífero. lisar para expor o DNA mRNA radioativo Papel de filtro incubado com mRNA radioativo do gene a ser clonado Preparação de auto-radiografia para indicar os clones bacterianos com fragmento de DNA que formou um híbrido com o DNA radioativo . Os plasmídeos recombinantes podem ser separados do cromossomo da E.

Papel de nitrocelulose (capaz de ligar DNA de fita única) foi colocado diretamente sobre o gel e coberto com múltiplas camadas de papel-toalha secas. podem ser usados para processos similares em outro organismo. foram tratados com uma enzima de restrição. DNA de numerosos organismos vertebrados e invertebrados. E. o papel de nitrocelulose e as toalhas por ação capilar.28). B. que foi em seguida submetido à uma corrente elétrica. o DNA é desnaturado em fitas únicas. o DNA deve ser colocado em uma superfície plana. Antennapedia. Lewis confirmou que alguns desses genes são responsáveis pela formação de partes básicas do corpo (veja Capítulo 14). os fragmentos menores movendo-se mais rapidamente do que os maiores. O tampão de transferência atravessa o gel. Filtro de nitrocelulose ou nylon Espaçadores Desnaturar fragmentos de DNA à fitas simples em álcali Papel-toalha Contatos de papel de filtro Peso Figura 2. O DNA também foi levado por esse fluxo de tampão. algumas vezes chamadas de transferências Southern devido a seu inventor. Mc Ginnis et al. Suporte Cuba com solução tampão Gel Colocar filtro de nitrocelulose ou membrana de nylon sobre gel: colocar papel-toalha e peso Digestão com restrição e eletroforese em gel de agarose Colocar gel no papel de filtro úmido entre 2 espaçadores . DNA é tratado com enzimas de restrição e os fragmentos resultantes são colocados em um gel e separados por eletroforese. encontramos que ela é inversamente proporcional à raiz quadrada da massa. levando junto o DNA. Após a desnaturação das fitas de DNA em álcali. 1986). Drosophila teve uma importância crítica na descoberta desses genes.20 Transferência Southern.. Isso é uma função da equação de energia cinética. Se o gene não está presente. a mosca desenvolve um conjunto extra de pernas saindo das cavidades orbitais (veja Figura 14. fragmentos menores adquirem uma maior velocidade que os maiores quando impulsionados pela mesma energia. Southern (1975). Portanto. O DNA de fita única é retido pelo papel de nitrocelulose. E. Uma das descobertas mais excitantes da moderna biologia do desenvolvimento foi verificar que genes usados para processos específicos de desenvolvimento em um organismo. M. Se o gene é expresso na cabeça (como sucede em um mutante específico). nos anos 60. Após fixar pelo calor os fragmentos de DNA no papel de nitrocelulose (de outra forma eles *Considerando a mesma relação carga/massa. e os fragmentos de DNA resultantes foram separados em uma eletroforese em gel.20. Um deles.58 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Hibridização de DNA: entre e intra espécies Clones podem ser selecionados por qualquer segmento de nucleotídeos radioativos. E=1/2 mv2. Iniciando com Morgan. Resolvendo para velocidade. e isso é feito por transferência. antenas crescem onde deveriam estar as pernas. Papel de nitrocelulose ou um filtro de nylon é colocado sobre o gel e o conjunto coberto com toalhas de papel. em seguida. mas foi detido pelo filtro de nitrocelulose. As misturas de fragmentos foram colocadas em fendas em um dos lados do gel. os genes clonados de um organismo podem ser sondados com cDNAs radioativos derivados do mRNA de outras espécies. assim. é um gene cujo produto protéico é essencial para inibir a formação de estruturas da cabeça no tórax. * Como a hibridização não pode ser feita dentro do gel. colocado sobre um papel de filtro saturado com tampão de alta força iônica. 1984. O tampão caminhou para cima através do gel e do filtro de nitrocelulose para as toalhas de papel. Holland e Hogan. Após a separação. Poderia tal gene existir em vertebrados? Evidências desses genes em vertebrados apareceram em transferências de DNA. As posições do DNA no papel diretamente refletem a posição dos fragmentos de DNA no gel. o DNA foi transferido do gel ao papel de nitrocelulose. O papel de filtro abaixo do gel estava em comunicação com o interior de uma cuba contendo tampão de alta força iônica. O gel é. esses genes foram mapeados e. Os fragmentos de DNA carregados negativamente migraram em direção ao pólo positivo. os pesquisadores retornaram o gel a um pH neutro e em seguida o colocaram sobre um papel de filtro úmido suportado por uma estrutura de plástico (Figura 2.

Seqüenciamento de DNA Dados de seqüência podem dar informações sobre a estrutura da proteína codificada e podem identificar seqüências regulatórias de DNA que certos genes têm em comum. muitos organismos contêm vários genes que formarão híbridos com esse fragmento gênico radioativo.23. o conjunto foi incubado com cDNA radioativo de uma porção do gene Antennapedia de Drosophila.1977) tornou-a um procedimento padrão em muitos laboratórios de biologia molecular. cortesia de W. No tubo com didesoxi-A.21) mostraram que mesmo vertebrados (camundongos. outro didesoxi-A e assim por diante. sugerindo que genes similares a Antennapedia existem nesses organismos. Os números ao lado das transferências indicam os tamanhos das bandas. por razões óbvias). a cadeia tem o potencial de parar toda vez que um G é inserido. Como veremos no Capítulo 16. sempre que a polimerase coloca um A na cadeia crescente. No início. Assim. também. Similarmente. existe a possibilidade de que um didesoxi-A seja colocado em lugar do desoxi-A. Não se espera que as seqüências de espécies tão diversas sejam perfeitamente idênticas e por essa razão o rigor da hibridização é diminuído trocando as soluções salinas. 2' e 3'. A simplicidade da técnica de seqüenciamento “didesoxi” de Sanger (Sanger et al... Um autoradiograma do papel de nitrocelulose mostrou onde o DNA radioativo encontrou seu semelhante. (de McGinnis et al. (Porque essas seqüências dos vetores são conhecidas. humanos e pintos) têm genes que hibridizam com essas seqüências. As estruturas dos desoxinucleotídeos e dos didesoxinucleotídeos estão representadas na Figura 2. Funde-se (anela-se) então um iniciador (primer) radioativo de DNA (aproximadamente 20 pares de bases) complementar ao DNA do vetor imediatamente 3' ao gene clonado. . Enquanto o desoxirribonucleotídeo não tem um grupo hidroxila (OH) no carbono 2' do seu açúcar. Essa secção radioativa do gene Antennapedia foi usada para selecionar uma biblioteca genômica de clones de DNA derivados do genoma dessas diferentes espécies.1984. pesquisadores encontraram clones contendo genes que se parecem com o Antennapedia. esses genes se mostraram extremamente importantes na formação do eixo do corpo dos vertebrados. iniciadores oligonucleotídicos podem ser facilmente sintetizados ou adquiridos comercialmente). em quilobases.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 59 Figura 2. Assim. o novo DNA será complementar ao gene clonado.21 Transferência Southern do DNA de vários organismos usando uma sonda radioativa do gene Antennapedia de Drosophila melanogaster. (O processo foi comparado à uma dança folclórica grega na qual uma pequena porcentagem dos dançarinos em potencial tem um braço em uma tipóia). entretanto.22). McGinnis. Os resultados desses experimentos (Figura 2.) Drosophila Besouro melanogaster 10 10 Galinha Camundongo Ubx ftz 10 10 3 3 3 3 Antp 1 1 1 1 se desprenderiam). O iniciador tem uma ponta 3' livre à qual mais nucleotídeos podem ser adicionados. usa-se um vetor contendo o gene clonado e se isola uma fita única do DNA circular (Figura 2. ele interrompe o crescimento da cadeia por não ter um grupamento 3' ao qual se ligaria um novo nucleotídeo. Autoradiografia mostra que os genes de Drosophila contêm várias porções que são como as do gene Antennapedia em termos de estrutura. quando a DNA polimerase está sintetizando DNA do iniciador. no tubo com didesoxi-G. Se isso acontecer. a cadeia pára. Coloca-se o DNA alvo e o iniciador juntamente com todos os quatro desoxirribonucleosídeos trifosfatos em quatro tubos de ensaio. mesmo que um didesoxirribonucleotídeo possa ser ligado a uma crescente cadeia de DNA pela DNA polimerase. Cada um dos tubos contém a subunidade polimerizante da DNA polimerase e um diferente didesoxinucleosídeo trifosfato: um tubo contém didesoxi-G. (Coloquialmente esse baixo rigor das transferências ao longo dos filos é chamado “transferências de zoológico”. o didesoxirribonucleotídeo não tem grupos hidroxila em ambos os carbonos.

Guild). A fotografia contém a região da auto-radiografia que mostra essa seqüência (Cortesia de G.22 O método didesoxi de seqüenciar DNA. (A) Estruturas dos dois tipos de nucleotídeos.23 Comparação entre desoxinucleotídeos e didesoxinucleotídeos. Adenina Adenina Base 1 Base 2 Adenina Desoxiadenosina trifosfato (açúcar desoxirribose) (A) Didesoxiadenosina trifosfato (açúcar didesoxirribose) (B) Figura 2.60 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Fita única desnaturada de DNA de plasmídeo recombinante Iniciador Subunidade polimerizante de DNA polimerase I de E. coli + dATP. (B) O terminal 3' de uma cadeia que terminou pela incorporação de um didesoxinucleotídeo não tem um grupo hidroxila 3' terminal para continuar a polimerização do DNA. A diferença é evidenciada em cores. . dCTP e dTTP Seqüência da fita do iniciador Seqüência complementar Fragmentos maiores Fragmentos menores Figura 2. dGTP.

Depois prepararam cDNAs marcados de cada uma das populações de mRNA. Podemos ter também uma biblioteca de oócitos vegetais de Xenopus. Isso os tornou clonáveis em vetores que foram abertos com a enzima de restrição EcoRI. os fagos que incorporaram o DNA (e assim destruíram o gene da ßgalactosidase) produzem placas incolores (Figura 2.24B). em gastrulação. Bibliotecas têm sido extremamente úteis no estudo de desenvolvimento como demonstram os esforços de Wessel e colaboradores (1989) em verificar diferenças nos RNAs de diferentes partes do embrião. Essas fitas de DNA podem ser inseridas em plasmídeos. A população de mRNA foi. O DNA foi misturado com os braços de um fago λ geneticamente modificado (veja Figura 2. usando precursores radioativos. Esse fago é construído de tal maneira que ao ser cultivado em uma placa de Petri.24C).24A. adicionando-lhes “finais” apropriados com DNA ligase. podemos transformar essa população de cDNA de fita única em outra contendo pedaços de cDNA com fitas duplas. Acoplando um fragmento GATCC/ G aos terminais rombudos desse pedaço de DNA cria-se um corte artificial de restrição BamHI.24B). Levando esse procedimento um passo à frente (com o auxílio de DNA polimerase e S1 nuclease). Os fragmentos de DNA radioativo resultantes serão separados por eletroforese. convertida em uma de cDNA pelo uso da transcriptase reversa (veja Figura 2. cada uma terminando com o resíduo A. Genes clonados dessa maneira são muito importantes porque eles não têm íntrons.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 61 Em cada tubo estão sendo feitas milhões de cadeias e por essa razão eles conterão uma população de cadeias. representando todos os genes ativos produzindo proteínas hepáticas embrionárias. Quando adicionados às células bacterianas. outras no último e algumas em sítios intermediários.19). algumas interrompidas no primeiro sítio possível. Wessel e colaboradores prepararam uma biblioteca de cDNA de embriões gastrulantes. isso é feito tomando os RNAs mensageiros de uma célula ou tecido e convertendo-os em fitas de DNA complementar. Usando polimerase I de E. o que permite a inserção em um vírus ou plasmídeo clivado por essa enzima (Figura 2. Tais coleções de clones derivados de mRNAs são freqüentemente chamadas de bibliotecas. foram gerados aproximadamente 4 milhões de fagos recombinantes. podemos “clonar” os mRNA de diferentes tipos de células e compará-los. cada um contendo um cDNA representando uma molécula de mRNA. podemos ter uma biblioteca de fígado de embrião de camundongo de 16 dias. No próximo passo. O próximo passo envolvia selecionar os fagos recombinantes. Lendo escada acima. as quais capturam as caudas de poli(A) das mensagens (veja legenda da Figura 2. Para encontrar mRNAs específicos do endoderma em ouriço-do-mar. ectoderma e endoderma. por exemplo. Assim. conterá cadeias com diferentes e distintos comprimentos. obtem-se a seqüência do DNA complementar àquela do gene clonado. do ouriço-do-mar. então. os cDNAs de fita dupla foram ligados a “finais” de EcoRI que estão disponíveis no comércio. O resultado é uma “escada” de fragmentos onde cada “degrau” é uma seqüência de nucleotídeos de comprimento diferente. Dessa forma. esses genes podem ser transcritos e em seguida traduzidos nas proteínas que codificam. Quais deles representariam mRNAs encontrados no endoderma e não em outras camadas celulares? Wessel e seus colegas isolaram populações de mRNAs do mesoderma. O tubo com didesoxi-A. coli o cDNA de fita única foi transformado em fita dupla.24A). Agora. possuíam três coleções de moléculas . representando mensagens presentes somente em uma parte específica daquela célula. O mRNA dessas amostras (a maior parte do RNA de células eucarióticas é ribossômico) foi isolado por passagem em esferas com oligo-dT. Como mostra a Figura 2. Análise de mRNA através de bibliotecas de cDNA Agora podemos retornar à especificidade da transcrição de mRNA: É possível isolar populações de mRNA que caracterizam certos tipos de células e estão ausentes em todas as outras? Para encontrar esses RNAs.

ligou somente cDNA radioativo produzido . Os filtros foram lavados para a remoção de cDNA radioativo não hibridizado. em gastrulação. cada uma representando a população de mRNA de uma das três camadas germinativas. Como resultado. mas não no ectoderma ou mesoderma. aquela mancha de DNA recombinante do endoderma deveria ser radioativa (pois foi ligado ao cDNA radioativo do endoderma). Um fago recombinante. mesoderma e ectoderma. mas muito pequeno para o empacotamento cDNA DNA polimerase I Região codificadora cDNA S1 nuclease Região codificadora Fita dupla cDNA Adicionar finais Bam HI cDNA do mRNA. do ouriço-do-mar foram cultivados e amostras de numerosas colônias— cada uma contendo milhares de fagos— colocadas em dois filtros de nitrocelulose (Figura 2. isso foi confirmado. mas o mesmo clone não deveria ser radioativo quando exposto a mRNA ectodérmico ou mesodérmico. secos e expostos em filmes para raios-X. Os fagos recombinantes representando os mRNAs do embrião.24D). o outro papel incubado com sondas radioativas para ambos. ligar Não é necessário para a replicação do fago Braços contêm todos os genes necessários para a replicação.62 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) Preparação de cDNA clonável Região codificadora mRNA Anela iniciador oligo (dT) (B) Inserção de cDNA de dupla fita no vetor viral (bacteriófago λ) DNA de fago λ BamHI Região codificadora mRNA Transcriptase reversa “Braço esquerdo” “Braço direito” cDNA mRNA Hidrólise alcalina cDNA de dupla fita preparado como descrito em (A) Inserir cDNA nos terminais do DNA do fago λ. O conjunto foi colocado em solução de álcali para a lise dos fagos e obtenção de DNA de fita única. agora clonado em vetores virais de cDNA radioativos. o DNA recombinante produzido daquela mensagem deveria ligar cDNA radioativo do endoderma e não deveria encontrar um mRNA em qualquer outro lugar. em particular. Um desses papéis de filtro foi incubado com cDNA radioativo feito a partir do mRNA total do endoderma. Se um mRNA estivesse presente no endoderma.

representava um mRNA encontrado no endoderma e não no mesoderma ou ectoderma. (C) Os fagos contendo o DNA recombinante lisarão E. coli formando placas. desenvolvido por Mary Lou Pardue e Joseph Gall (1970). Técnicas de localização de RNA Hibridização In Situ O processo de hibridização in situ. Esses filtros são então incubados com sondas radioativas (usualmente cDNA) de um tecido. (A) RNA mensageiro é isolado e feito seu cDNA. Se um clone específico é considerado interessante (por exemplo. o clone endoderma-específico que foi mencionado) ele é cultivado em . coli Incubar com sonda radioativa para endoderma Incubar com sonda radioativa para mesoderma e ectoderma Figura 2. (B) Os “genes” cDNA são inseridos em vetores especialmente modificados. Técnicas bioquímicas podem distinguir placas de fagos recombinantes daquelas que não têm o gene inserido. portanto. coli pelo fago Lise Placa Zona de lise indicando clones do fago Tratar filtros com solução alcalina para lisar os fagos e desnaturar o DNA liberado Camada de bactérias E. Sonda radioativa DNA de fago de fita única ligado ao filtro Preparação dos autoradiogramas Clone de DNA representando o mRNA encontrado no endoderma mas não no mesoderma ou ectoderma de mRNA do endoderma. bacteriófagos. Para a seleção da biblioteca diferencial de cDNA. discutida no texto. coli Filtros de nitrocelulose Infecção de E.24 Protocolo usado para organizar bibliotecas de cDNA. permitindo ao pesquisador procurar por um mRNA encontrado em um tipo de tecido mas não em outro. (D) As placas são transferidas para papel de nitrocelulose e tratadas com álcali para lisar os fagos e desnaturar DNA localmente.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 63 (C) Preparação da biblioteca de clones do fago (D) Seleção da biblioteca de fagos clonados Transferir alguns fagos para filtros de nitrocelulose Fago híbrido Adicionar à camada de células de E. nesse caso. que é em seguida transformado em dupla fita e adicionado de fragmentos finais de restrição. a mesma biblioteca de fagos foi selecionada com sondas radioativas de dois tecidos diferentes. O fago contendo esse gene pode agora ser cultivado em grandes quantidades e caracterizado. permite ao pesquisador visualizar as posições de ácidos nucléicos específicos dentro de células e tecidos.

o cDNA (e portanto o mRNA) se localiza de forma ainda mais precisa — entre a região do intestino posterior e o intestino médio no tubo endodérmico.64 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento grandes quantidades. Após eliminação do cDNA não fixado. A Figura 2. o conjunto é incubado em uma solução contendo um fragmento radioativo.26B mostra que a acumulação desse mRNA no estágio de prisma é restrita ao endoderma (Wessel et al.B mostra hibridização in situ usando o cDNA específico para células endodérmicas. se o mRNA para aquele gene está presente em um determinado estágio embrionário.25C mostra uma hibridização in situ. Hibridização in situ e transferências Northern fornecem as melhores evidências em favor da transcrição diferencial de RNA. ou brancas quando vistas com iluminação em campo escuro. Dessa maneira. Sargent e Dawid (1983) isolaram da gástrula de Xenopus um mRNA que não estava presente no ovo. Para isso eles extraíram o mRNA da gástrula e fizeram cópias cDNA dessas mensagens. diretamente acima de onde o cDNA radioativo foi ligado. Após transferência dos RNAs separados para o papel de nitrocelulose ou membrana de nylon. As manchas resultantes.26A mostra uma transferência Northern de desenvolvimento para a expressão de um gene endoderma-específico durante o desenvolvimento do ouriço-do-mar. A sonda reconhece o mRNA codificado pelo gene Brachyury (discutido na página 40). mono-fita. Enquanto transferências Southern transferem fragmentos de DNA do gel para o papel. Assim. transferências Northern (nome não se relaciona com o inventor) transferem RNA entre os mesmos suportes e da mesma maneira. torna-se necessário o uso de secções microscópicas extremamente finas. Esse é transformado em fita única e tornado radioativo. o cDNA radioativo se liga unicamente onde está presente o mRNA complementar. Uma técnica mais recente para hibridização in situ utiliza sondas que ligam reagentes coloridos. Trabalhando com sondas radioativas e emulsões. Por exemplo. em um embrião de camundongo com 10. Continuando a gastrulação. de DNA de um determinado gene. que sintetiza uma proteína necessária para a produção de células mesodérmicas na parte posterior do embrião de camundongo. realizada em montagem integral.1989). cientistas podem observar órgãos inteiros (e organismos) sem seccioná-los. parecem escuras quando visualizadas diretamente. Podemos ver que o mRNA para essa proteína endodérmica é inicialmente sintetizado durante o estágio de blástula mesenquimatosa e continuamente durante todo o resto do desenvolvimento. Esse DNA adere somente às regiões onde está localizado o RNA complementar. Se houvesse hibridização entre o mRNA dos oócitos e o cDNA da gástrula. significaria que o cDNA era derivado . Quando o cDNA radioativo é adicionado às células fixadas apropriadamente em lâminas de microscópio. e com uma visão de amplas regiões de expressão gênica. Assim. em um gel. A transcrição de certos genes pode ser específica para tecidos ou tempo. A distribuição temporal na transcrição de vários genes pode ser visualizada por transferência de mancha. A Figura 2. e o gene clonado é isolado tratando o vetor recombinante com enzimas de restrição. Autoradiogramas desse tipo.. A Figura 2. O cDNA encontra mRNAs somente no endoderma da gástrula precoce do ouriço-do-mar. onde vários estágios são comparados simultaneamente. o DNA radioativo se liga a ele e pode ser detectado por auto-radiografia. pode-se visualizar aquelas células (ou mesmo regiões dentro das células) que acumularam um tipo específico de mRNA. a lâmina é coberta com uma emulsão fotográfica transparente para auto-radiografia. no espaço e no tempo. Transferências Northern Podemos também determinar a expressão temporal e espacial de RNAs executando uma transferência de RNA (freqüentemente chamada transferência Northern). A transferência Northern na Figura 2. Os cDNAs da gástrula foram misturados com grandes quantidades de mRNA de oócitos. são denominados transferências Northern de desenvolvimento.5 dias.25A. O pesquisador pode extrair RNAs mensageiros do embrião em vários estágios de desenvolvimento e submetê-los à eletroforese lado a lado.

em fundo escuro. mostrando a localização de mRNA endodermaespecífico em embrião de ouriço-do-mar. estão nas Pranchas 22. e nesse estágio é encontrada na porção posterior do embrião. O cDNA radioativo usado como sonda foi preparado do gene clonado.25 Enzima fosfatase alcalina Corante (precipitado azul escuro) Núcleo Corante Anticorpo para biotina Biotina (incolor) Sonda complementar a mRNA de Brachyury tendo resíduos de biotina em suas uridinas mRNA de Brachyury Hibridação in situ. de um embrião de camundongo de 9.B) Fotomicrografias.. C do laboratório do autor.24). cortesia de G. Esse cDNA radioativo se liga ao mRNA do endoderma da gástrula precoce do ouriçodo-mar (A) e ao endoderma do intestino médio e posterior da gástrula tardia do ouriçodo-mar (B). Wessel. em montagem integral.) . (A.5-10. (C) Hibridização in situ. (A e B de Wessel et al. em montagem integral. Esses anticorpos foram ligados às enzimas do tipo fosfatase alcalina. feito a partir de mRNA endoderma-específico (veja Figura 2.5 dias corado para mRNA de Brachyury. Após eliminar a parte da sonda que não se ligou ao mRNA de Brachyury (e inativar qualquer atividade endógena de fosfatase alcalina do embrião). o embrião foi tratado com anticorpos para biotina. 23 e 25. de hibridação in situ.1989. Essa mensagem é transcrita em células formando novo mesoderma. Colorir para a presença de fosfatase alcalina permite que se determine a localização de um mRNA específico.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 65 (B) (A) (C) Figura 2. Fotografias coloridas da hibridização in situ. Embriões fixados foram incubados em uma sonda para mRNA de Brachyury (a fita antisense complementar ao mRNA) que foi sintetizada usando uridina biotinilada.

O gel foi transferido para papel tratado e os mRNAs aderidos ao papel. o cDNA radioativo daquele gene encontraria seu complemento nos mRNAs daquele estágio. DG39) são expressos imediatamente depois.. Encontrando mensagens raras pela reação da polimerase em cadeia A reação da polimerase em cadeia (PCR) é um método de clonagem in vitro que pode produzir enormes quantidades de um fragmento específico de DNA a partir de uma pequena quantidade de material de partida (Saiki et al. essas regiões laterais podem ser preparadas. Lytechinus variegatus. DNA de fita única derivado de um específico clone “gastrular”. Wessel. Essas moléculas híbridas com dupla fita foram removidas por filtração. (de Wessel et al. deixando uma população de cDNAs gástrula-específico. a ligação do cDNA radioativo foi observado por auto-radiografia.1985). Alguns genes (DG76. 1989. Sargent e Dawid usaram embriões. foi marcado radioativamente e incubado com os filtros. na fase de pré-implantação têm muito pouco mRNA e não se pode obter milhões desses embriões para estudo. Mostrou-se que esse mRNA é sintetizado durante o estágio de blástula do mesênquima e aumentado ao longo do desenvolvimento. Em seguida. após aproximadamente 7 horas. Nenhum deles é expresso antes da transição da blástula mediana em 7 horas. no filtro. Após eliminacão do cDNA não ligado. a clonagem de subtração gera um conjunto de clones estágio-específicos cujo mRNA é encontrado em alguns estágios. Embriões de camundongos. Como a seleção dupla de bibliotecas de cDNA. O uso de PCR para encontrar mRNAs raros está ilustrado na Figura 2. enquanto a atividade de outros (DG56. A transferência de manchas na Figura 2.66 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) Ovo Clivagem Blástula Blástula Mesenquimatosa Blástula precoce Blástula tardia Prisma Plúteo (B) Ectoderma / mesoderma Endoderma Figura 2. dos estágios de zigoto a broto caudal do girino e. enquanto outros (DG72. a população de DNAs de fita única é transformada em uma população de fita dupla. separadamente. DG21) é muito mais transitória. às quais são adicionados dois pequenos oligonucleotídeos iniciadores que são complementares a uma porção da mensagem procurada. mas não em outros. Os oligonucleotídeos foram preparados de forma a permitir uma hibridização com fitas opostas e lados opostos da seqüência alvo. Se fosse necessário saber se o embrião de camundongo na fase de pré-implantação contém o mRNA para uma proteína determinada. Usando DNA polimerase e S1 nuclease. DG81) são mantidos após a ativação. isolaram seus RNAs. a técnica do PCR permite encontrar essa mensagem com poucos embriões. Após a fixação (calor) dos RNAs no filtro. por exemplo. 1988).26 Transferência Northern para um gene específico no endoderma do ouriço-do-mar. que foi em seguida incubado com cDNA radioativo de um clone endoderma-específico. DG81) começam a ser transcritos na gástrula mediana. oócito e gástrula. pode amplificar uma única molécula de DNA por um fator de vários milhões em poucas horas e o faz em um tubo de ensaio. PCR. então o mRNA estava presente originalmente. Entretanto.28 mostra o esquema temporal de expressão para 17 genes que são ativos em vários estágios da gastrulação. O método padrão de clonagem usa microorganismos vivos para amplificar o DNA recombinante. escolhe-se um DNA para ser amplificado. RNA total do endoderma foi eletroforisado (pista 2) próximo ao mRNA do resto do ouriço-do-mar (pista1). (A) Transferência Northern de desenvolvimento. separam-se as duplas hélices do DNA. Esse método pode ser usado para clonar um gene específico ou para determinar se um gene específico está ativamente transcrevendo RNA em um determinado órgão ou tipo de célula. mRNA total (10 µg por estágio) foi submetido à eletroforese em gel de agarose. mostrando acumulação de mRNA de acordo com o estágio específico desse gene. . (Se a tentativa é isolar o gene ou mRNA para uma proteína específica de seqüência conhecida. mostrando que o mRNA está presente no endoderma (com algum mesoderma aderido) mas não no ectoderma.. por amplificar especificamente somente aquela mensagem. Os cDNAs foram transformados na forma de dupla fita (pela DNA polimerase) e inseridos em veículos de clonagem. Se um gene estava sendo transcrito em um determinado estágio. Essa técnica é denominada de clonagem de subtração. Ligação com cDNA radioativo detectou mRNA somente no endoderma. ou em alguns tecidos mas não em outros (Figura 2. seria muito difícil descobrir usando os métodos padrão de clonagem.27).. no entanto. Se os oligonucleotídeos reconhecem seqüências no DNA. Alguns genes (DG64. um milhão de vezes (Rappolee et al.29. Essa técnica tem sido extremamente útil em casos onde a quantidade de ácido nucléico para estudo é muito pequena. Os RNAs foram aplicados diretamente (sem prévia eletroforese em gel) a filtros de nitrocelulose de modo que cada filtro tinha RNAs de todos os estágios. Para isso. Os mRNAs de um grupo de células são purificados e convertidos a cDNA por transcriptase reversa. cortesia de G.) de um mRNA presente em ambos os estágios. (B) Transferência Northern no estágio de prisma.

Figura 2.) Blástula Estágio Clone Gástrula Nêurula Plasmídeo recombinante contendo DNA para mRNA específico para gástrula Broto de cauda Horas após a fertilização . cortesia de I. cDNA foi produzido para mensagens isoladas de gástrula e hibridizado com mRNA de oócitos. Acumulação específica de mRNA no citoplasma é registrada embebendo mRNA total. (de Jamrich et al. 1985.28 Colocar em veículo de clonagem Transferências de mancha no desenvolvimento mostram os tempos em que 17 genes de Xenopus estão transcrevendo ativamente.. Esses genes foram clonados fazendo o cDNA de fita dupla e adicionando ligantes para permitir sua inserção em veículos de clonagem. Justapondo essas tiras.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 67 Extrair mRNA Oócito mRNA total de oócito Hibridizar cDNA de gástrula que encontra mensagem complementar em mRNA de oócito cDNA de gástrula sem seqüência complementar a mRNA de oócitos Extrair mRNA Gástrula mRNA total de gástrula Fazer cDNA de mRNA cDNA de gástrula DNA polimerase S1 nuclease Figura 2. Dawid e M. Os cDNA de gástrula que não encontraram seqüências complementares nos mRNAs de oócitos. de genes em estágios embrionários. obtem-se um esquema temporal para a atividade de genes específicos. Sargent.27 cDNA de dupla fita específico de gástrula Adicionar ligantes Clonagem de subtração de genes de gástrula expressos diferencialmente em Xenopus laevis. A linha r5 representa um controle de RNA ribossômico que deve estar sempre presente. em papel de nitrocelulose e incubando a tira de papel com DNA radioativo derivado de um clone de cDNA específico de gástrula. eram produtos de genes ativos na gástrula mas não nos oócitos.

Se é conhecida apenas a seqüência da proteína codificada pela mensagem. sintetizando oligonucleotídeos que codificam o amino terminal da proteína e oligonucleotídeos complementares aqueles que codificam o carboxi terminal da proteína). cada fita de DNA sintetiza seu complemento. Dessa maneira. os iniciadores se hibridizarão aos seus terminais opostos. por sua vez. (Iniciadores específicos são produzidos com base na seqüência que se procura. Essas fitas são. a DNA polimerase pode sintetizar uma nova fita. . Para determinar se um tipo particular de mRNA está presente. Os finais 3' desses iniciadores estão face a face de modo que a replicação é através do DNA alvo. todo mRNA é convertido a DNA de dupla fita pela transcriptase reversa e DNA polimerase.68 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Finais da seqüência do polipeptídeo RNAs que codificam o amino terminal (iniciador 1) RNAs que codificam o carboxi terminal (iniciador 2) RNA iniciador 1 DNA alvo RNA iniciador 2 1 cópia Primeiro ciclo Aquecer a 95oC para desnaturar DNA. Esfriar a 37oC para permitir hibridização dos iniciadores a DNA Quando aquecido a 72o C. o número de fitas novas com a sequência entre os dois iniciadores aumenta exponencialmente. desnaturadas e os iniciadores são hibridizados a elas.) Usando DNA polimerase termoestável de T.29 Protocolo para a reação de polimerase em cadeia (PCR). taq polimerase estende fitas complementares a partir dos iniciadores 2 cópias Primeiro ciclo de sínteses resulta em duas cópias da seqüência alvo de DNA Desnatura DNA Hibridiza iniciadores Segundo ciclo Estende novas fitas de DNA 4 cópias Segundo ciclo de sínteses resulta em quatro cópias da seqüência alvo de DNA Figura 2. aquaticus. iniciando o ciclo novamente. Uma vez hibridizado o primeiro iniciador. Esse DNA é desnaturado e dois conjuntos de iniciadores são adicionados. prepara-se um conjunto de diferentes iniciadores. cada um possivelmente complementar ao DNA. Se a seqüência específica estiver presente.

A integração é consumada devido às duas seqüências idênticas (longas repetições terminais) nos terminais do DNA retroviral. Essas DNA polimerases podem suportar temperaturas próximas à ebulição e o PCR se utiliza dessa adaptação evolucionária. via elementos P. é uma polimerase de bactérias como Thermus aquaticus ou Thermococcus litoralis. Ritvos. Em Drosophila. O mRNA desses órgãos foi convertido em DNA e amplificado através de 20 ciclos de replicação. eles podem ser isolados. 1980). colocando-as em vetores de clonagem. o que é realmente crucial é conhecer a função daquele gene no desenvolvimento. onde a temperatura atinge valores próximos de 900C. Usando enzimas de restrição apropriadas. sendo necessário misturar o DNA com outro gene que permite a sobrevivência das raras células que o incorporaram. Outra técnica é a eletroporação. O DNA foi submetido sucessivamente à eletroforese e transferência Southern usando uma sonda radioativa para uma parte do gene de activina. Robins et al.. como na Figura 2. novos genes podem ser introduzidos na mosca. aquela região específica estará amplificada 220 vezes (um pouco mais de um milhão). Após vinte turnos..CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 69 Essa enzima não é a DNA polimerase normal de E. 1982). O segundo iniciador é adicionado e agora ambas as fitas podem sintetizar novo DNA. para a síntese de um fator de crescimento. Isso mostra que o mRNA original com essa seqüência estava presente na amostra. Evidência fornecida por PCR. Retrovetores virais infectam células de camundongo com eficiência próxima de 100%. Um método mais “natural” para introduzir genes na célula é colocar o gene clonado em um elemento transponível ou vetor retroviral. Retrovírus são vírus contendo RNA. Vetores retrovirais são produzidos removendo os genes do empacotamento viral (necessários para a saída dos vírus da célula) do centro de um retrovírus de camundongo. Essas seqüências de DNA. o pesquisador pode remover genes de um fago ou plasmídeo clonado e reinserir o gene em vetores retrovirais. ele pode se integrar ao DNA e prover o embrião de um novo gene (Spradling e Rubin. (Cortesia de O. Dentro da célula hospedeira eles produzem uma cópia de seu DNA (usando sua própria transcriptase reversa). Sucessivos ciclos de desnaturação e síntese amplificarão essa região do DNA de forma geométrica. Essa extração cria um sítio vazio onde outros genes podem ser colocados. Figura 2. mRNA de activina foi encontrado no ovário do camundongo adulto (como esperado) e também em vários órgãos embrionários. Esses são regiões móveis de DNA. que podem ser integrados no genoma. Quando o elemento P recombinado é injetado em um oócito de Drosophila.31). A possível função de activina nesses orgãos será discutida no Capítulo 17. tirando e repondo certos genes de células embrionárias. na qual uma solução contendo o gene clonado é cuidadosamente injetada no núcleo da célula (Capecchi. Essa é uma técnica especialmente útil para injetar genes em ovos recentemente fertilizados. pode-se usar essas cópias amplificadas para clonagem. A probabilidade de incorporação de tal fragmento de DNA no cromossomo é relativamente pequena. Em transfecção.30). activina. pois os núcleo haplóides do espermatozóide e do óvulo são relativamente grandes (Figura 2. Quando submetido à eletroforese esse fragmento amplificado é facilmente detectado. coli. Além disso. a cópia se transforma em dupla fita e se integra em um cromossomo do hospedeiro. de ocorrência natural.30 Ovário de rato Adulto Ovário de camundongo Rim de camundongo Rim de camundongo Salivares de camundongo Pâncreas de camundongo Pulmão de camundongo Embrião de 14 dias Sem adição de DNA Determinando a função do gene: células e organismos transgênicos Técnicas de inserção de DNA novo em uma célula Apesar de ser importante conhecer a seqüência de um gene e seu esquema temporoespacial de expressão. Ainda mais. de órgãos embrionários de camundongo. e genes clonados inseridos no centro do elemento P. Essas bactérias vivem em fontes de água quente (como aquelas do Yellowstone National Park) ou nos respiradouros térmicos de submarinos. Uma vez sintetizada a segunda fita. Uma técnica muito direta é a microinjeção.1981). Pedaços de DNA clonados podem ser modificados (se desejado). onde pulsos de alta voltagem “empurram” o DNA para dentro da célula. e colocados em células por vários meios. (A confirmação poderia ser feita por transferência Southern. Técnicas recentes permitem estudar a função do gene.1980. são elementos transponíveis de ocorrência natural que podem ser integrados como vírus em qualquer região do genoma da Drosophila. ela é separada de seu complemento por desnaturação em alta temperatura.) . o DNA é incorporado diretamente na célula por incubação em uma solução determinada onde a célula o incorpora. em condições de cultura onde as outras células são destruídas (Perucho et al.

As técnicas são similares àquelas que produzem camundongos transgênicos. Wagner. Assim. portanto.) Camundongos quiméricos As técnicas descritas têm sido usadas recentemente para transferir genes para todas as células do embrião de camundongo (Figura 2. . Um híbrido resulta da união de dois genomas diferentes dentro da mesma célula: o descendente de um genitor de genótipo AA e outro de genótipo aa é um híbrido Aa. que darão origem ao próprio embrião. Essas células podem ser isoladas do embrião de um camundongo e cultivadas. alguns de seus descendentes levarão. alguns dos seus gametas serão derivados da célula doadora. endereçar genes significa trocar alelos do tipo selvagem por outros mutados. Seria possível que Hoxa3 de maneira similar estaria regulando a expressão gênica espaço-específica nos mamíferos? Chisaka e Capecchi isolaram o gene Hoxa-3. Uma vez em cultura. mas em lugar de adicionar genes. 1968. A nova célula embrionária precursora (não somente o DNA. a proteína codificada por Hoxa-3 liga-se ao DNA. Se as células tratadas se tornaram parte da linha germinal do camundongo.70 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 2.1986). que formarão a porção fetal da placenta. Experimentos com genes com endereçamento (Gene targeting ou Knockout) A análise de embriões precoces de mamíferos foi durante muito tempo prejudicada pela dificuldade em criar e selecionar mutações que afetam a fase inicial do desenvolvimento embrionário.33). Camundongos com genes estáveis de outros indivíduos são chamados camundongos transgênicos. de modo a incorporar novo DNA.. O termo é apto: refere-se a um monstro mitológico com cabeça de leão.31 Injeção de DNA (de genes clonados) em um núcleo (neste caso. Uma quimera resulta quando células de constituição genética diferente aparecem no mesmo organismo. chamada de “Knockout”). Essas linhagens têm sido particularmente úteis na determinação das funções de regiões reguladoras que ladeiam os genes. Assim. e as células internas. mas a célula inteira) pode ser injetada em outro embrião de camundongo em fase precoce. uma cópia do gene inserido. Hoxa-3 é semelhante a vários genes de Drosophila que são conhecidos como controladores da expressão gênica de segmentos específicos no embrião precoce. cortaram-no com uma enzima de restrição e inseriram nesse sítio um gene para resistência à neomicina (Figura 2. em três gerações — o camundongo quimérico. no acasalamento produzirão 25% de embriões carregando duas cópias do gene inserido em cada célula de seu corpo (Gossler et al. corpo de bode e cauda de serpente. Quando cruzado com um camundongo do tipo selvagem. Chisaka e Capecchi (1991) usaram essa técnica para estudar a função do gene Hoxa3 no desenvolvimento do camundongo. Esse problema foi superado pela técnica chamada de endereçamento de genes (às vezes. mas outra porção de células é derivada também das células precursoras tratadas. Moustafa e Brinster. Durante o desenvolvimento do camundongo existe um estágio onde somente estão presentes dois tipos de células: as células externas. exatamente como sua correspondente na Drosophila. elas podem ser tratadas como descrito. Os descendentes heterozigotos. Esses genes mutantes Hoxa-3 foram eletroporados em células embrionárias precursoras que eram sensíveis à neomicina. Em outras palavras. destruindo a habilidade da proteína Hoxa-3 em se ligar a DNA. E.1981. a célula precursora tratada estará integrada no embrião do hospedeiro. se isolada. gerar todas as células do embrião (Gardner. um pronúcleo de um ovo de camundongo). porque cada uma delas pode. 1972). eles mutaram o gene Hoxa-3 pela inserção de um grande pedaço de DNA que continha um gene resistente à neomicina. está agora presente em ambas as cópias dos cromossomos dentro do genoma do camundongo. cortesia de T. o camundongo heterozigoto e o camundongo homozigoto — um gene que foi clonado de um outro indivíduo. O resultado é um camundongo quimérico*. Essas células internas são chamadas células embrionárias precursoras (células tronco).. * É crítico notar a diferença entre uma quimera e um híbrido. Algumas de suas células são derivadas das células embrionárias precursoras do hospedeiro. (de Wagner et al.32).

as enzimas envolvidas no reparo de DNA e replicação incorporam o gene mutante em lugar da cópia normal. mas aquelas que adquiriram resistência pelo gene incorporado sobrevivem. As células resultantes têm um gene Hoxa-3 normal e um Hoxa-3 mutado. parte dos descendentes serão heterozigotos ao alelo adicionado. mas tais células podem ser selecionadas cultivando as células precursoras em neomicina. As células precursoras heterozigotas são microinjetadas em um blastócito de camundongo e se integram nas células do embrião.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 71 Células embrionárias precursoras Trofoblasto Cultura de células embrionárias precursoras Gene clonado no vetor Mistura de células embrionárias precursoras com o gene clonado Seleção de células embrionárias precursoras que incorporaram o transgene Microinjetar células precursoras transgênicas no embrião hospedeiro Integração das células no hospedeiro Injetar no útero Camundongos quiméricos Figura 2. alguns dos descendentes serão heterozigotos Produção de camundongos transgênicos. e o camundongo quimérico é cruzado com um do tipo selvagem. Cruzando heterozigotos. Aqui. o gene Hoxa-3 mutado substituiu um alelo normal desse gene por um processo chamado recombinação homóloga. As células transgênicas são selecionadas e injetadas em um embrião hospedeiro de camundongo na sua fase precoce. Se as células precursoras doadoras contribuíram para a linha germinativa. Esse é um evento raro. . Aqui. pode ser gerada uma linhagem de camundongos que é homozigota ao alelo adicionado. das células precursoras. A maioria das células morre com a droga. Esse embrião é colocado no útero de um camundongo fêmea grávida e se desenvolve em um camundongo quimérico. as células embrionárias precursoras transgênicas se integram às celulas precursoras do hospedeiro. Essa seria uma linhagem transgênica. O gene adicionado (o transgene) pode ser de qualquer fonte eucariótica. Células embrionárias precursoras de um camundongo são cultivadas e o genoma alterado pela adição de um gene clonado.32 Camundongos transgênicos heterozigotos Camundongos transgênicos homozigotos Uma vez dentro do núcleo dessas células. O camundongo resultante é uma quimera composta de células do tipo selvagem do embrião hospedeiro e de células heterozigotas Hoxa-3. As quimeras são acasaladas com camundongos do tipo selvagem e se algumas das células doadoras se integraram à linhagem das células germinativas.

O camundongo resultante é uma quimera composta de tecidos Hoxa-3 heterozigotos e tecidos Hoxa-3 do tipo selvagem. Esses genes Hoxa-3 mutantes são eletroporados em células ES. Nesse caso o gene alvo é o Hoxa-3. As células são selecionadas pela sua resistência à neomicina. (B) Os genes Hoxa-3 clonados são cortados com uma enzima de restrição.72 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) Massa celular interna Blastócito neo r Cultura de células embrionárias precursoras (ES) Eletroporação Recombinação homóloga Célula precursora embrionária (B) gene Hoxa-3 Endonucleases de restrição gene neor gene Hoxa-3 mutado com o gene neor inserido Hoxa-3 Figura 2. onde recombinação homóloga troca o gene do tipo selvagem pela cópia mutada. e aproximadamente 25% de sua cria deve ser de homozigotos mutantes de Hoxa-3. e um gene neomicina-resistente é inserido na região que codifica o sítio de ligação da proteína ao DNA. (A) Células embrionárias precursoras (ES) são cultivadas a partir de uma massa celular interna. e aproximadamente 25% de seus descendentes devem levar duas cópias do gene mutado Hoxa-3. paratireóide e timo! Dessa maneira. Os animais heterozigotos podem ser cruzados entre si. Os animais heterozigotos podem ser cruzados entre si.33 Técnica de endereçamento de genes (gene targeting). [gene7. Esses camundongos mutantes homozigotos não possuem as glândulas tireóide. endereçando genes pode-se analisar as funções de determinados genes durante o desenvolvimento de mamíferos. e o blastócito é retornado ao útero. Cruzando os animais quiméricos com camundongos do tipo selvagem produz-se descendentes Hoxa-3 heterozigotos se as células ES contribuíram na linhagem germinativa. (C) As células ES heterozigotas selecionadas são inseridas na massa interna de células de um embrião do tipo selvagem. Seleção de células ES heterozigotas por sua resistência à neomicína (C) Injeção de células ES heterozigotas no blastócito Injeção dos blastócitos no útero Produção de camundongos quiméricos Heterozigotos Cruzamento de quiméricos com tipo selvagem Cruzamento de camundongos heterozigotos Hoxa-3¯/ Hoxa-3+ Heterozigotos Hoxa-3¯/ Hoxa-3¯ Homozigoto para o gene Hoxa-3.html] .

(A) Produção da mensagem antisense (neste caso. as larvas da mosca morrem pela falta dos segmentos torácico e abdominal anterior (Figura 2. A figura central é um embrião do tipo selvagem pouco antes de eclodir. e um dos maiores sucessos resultantes de clonagens e seqüenciamentos é a nova “anatomia” do gene eucarioto.) mRNA antisense Krüppel T7 RNA polimerase T3 promotor T3 RNA polimerase T7 promotor Embrião normal Embrião normal infectado com RNA “antisense” Krüppel .34 Reinvestigação de velhos problemas com novos métodos A união da embriologia com a biologia molecular está permitindo ao biologista do desenvolvimento uma nova apreciação de como trabalham os genes na construção de um organismo.34A). T3 polimerase permite a transcrição de mRNA de consenso. Os promotores reconhecem RNA polimerases diferentes (dos bacteriófagos T3 e T7. respectivamente). o promotor. Krüppel é crítico para a formação do tórax e do abdômen da mosca. de acordo com Rosenberg et al. mutante e o tratado com antisense. o promotor T3 está em orientação normal e o promotor T7 está revertido. injetado com a mensagem Krüppel antisense no estágio embrionário precoce..1985). Esses resultados foram confirmados quando RNA antisense foi produzido a partir do gene Krüppel de Drosophila. O transcrito complementar é chamado RNA antisense porque é o reverso da mensagem original. Acima está o mutante causado pela falta do genes Krüppel. Se esse gene está ausente. é sintetizado um transcrito que é complementar aquele natural (Figura 2. RNA antisense permite ao biologista do desenvolvimento determinar a função dos genes durante o desenvolvimento e analisar a ação dos genes em animais.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 73 Determinando a função de uma mensagem: RNA antisense Outro método para determinar a função de um gene é fazer cópias “antisense” de sua mensagem. Nesse caso. não possuem os segmentos torácico e abdominal anterior. Um sítio. Descreveremos a estrutura do gene com mais detalhe no Capítulo 10. (B. o RNA antisense se liga à mensagem normal. 1985. Ambos os embriões. em outro vetor. Mensagens antisense podem ser produzidas usando cDNA clonado e fazendo sua reclonagem em reverso. ao gene Krüppel da Drosophila) colocando o fragmento de cDNA clonado para a mensagem Krüppel entre dois vigorosos promotores. Figura 2. Quando grandes quantidades de RNA antisense são injetadas ou transfectadas em células contendo o mRNA normal desse gene.35). O promotor bacteriano iniciará a transcrição da mensagem na “direção errada” quando for incubado com RNA polimerase e nucleosídeos trifosfato.34B). Estamos em meio à uma revolução nos nossos conhecimentos sobre desenvolvimento. de outra forma isso seria inacessível à análise genética. mas é importante ressaltar que os genes eucariotos que codificam proteínas têm vários sítios regulatórios (Figura 2. Os promotores estão em orientação oposta com respeito ao cDNA do Krüppel. Abaixo está o embrião do tipo selvagem. está localizado diretamente a montante do gene (antes do início) e é (A) mRNA de consenso (sense) Krüppel (B) Embrião mutante Krüppel Producão de RNA antisense para examinar a função dos genes no desenvolvimento. próximo a um vigoroso promotor bacteriano. (B) Resultado da injeção da mensagem Krüppel antisense em um embrião precoce (estágio blastodérmico sincicial) de Drosophila antes que a mensagem Krüppel seja produzida. uma situação semelhante é criada quando grandes quantidades de RNA antisense contra a mensagem Krüppel são injetados em embriões precoces da mosca (Rosenberg et al. o ácido nucléico dupla-fita resultante é degradado (enzimas do citoplasma das células digerem ácidos nucléicos de fita dupla). como se houvesse uma mutação eliminatória para aquele gene. Isso causa uma depleção funcional da mensagem.. Dessa maneira. ao passo que T7 polimerase produz transcritos antisense.

que ZP3 é sintetizado em oócitos porque eles têm a proteína OSP-1 que se liga a certas seqüências de DNA que são parte de seu promotor (Schickler et al. aproximadamente 95 pares de bases a montante do sítio de início da transcrição. foi injetado em zigotos de camundongo para criar animais transgênicos. O intensificador freqüentemente está mais acima. então. a montante. Alguns promotores (como aqueles usados por produtos relacionados ao metabolismo geral da célula) não precisam ser ativados por intensificadores. Esses genes precisam ser ativados por fatores que se ligam ao intensificador e ao promotor. Figura 2. ZP3 é a principal proteína ligante de espermatozóide na superfície do óvulo de camundongo. a ligação de diferentes fatores de transcrição aos promotores e intensificadores de genes específicos é um dos mecanismos que controlam a produção de proteínas diferentes a partir de genomas idênticos. a montante.1992).) O gene recém-construído. (com 150 pares de bases) e o fundiram ao gene para a luciferinase de vaga-lume. está uma segunda região chamada intensificadora. a hibridização in situ localizou mRNA de luciferinase em um único tipo de célula. O promotor da maioria dos genes codificadores de proteínas é encontrado no terminal 5' (a montante) do gene.74 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento o sítio onde se liga a RNA polimerase. Em camundongos transgênicos fêmeas. Localizada em algum lugar dentro do gene (a jusante ou a montante. Proteínas que se ligam ao promotor e aos intensificadores interagem para regular a transcrição do gene.35 Estrutura básica de um gene regulado pelo desenvolvimento. consideraram que seqüências responsáveis por ativação oócito-específica podem existir até mais longe.36). Parece. 28 pares de bases a montante do sítio onde a transcrição do gene é iniciada. ou ainda em um íntron dentro do gene). (Não é necessário dizer que essa enzima produtora de luz não é encontrada em camundongos. levando em cada núcleo o gene luciferinase com a região regulatória ZP3. está localizado no promotor. Um exemplo é a ativação do gene para ZP3. Está sendo usada aqui como um “gene repórter” para monitorar onde o DNA a montante pode causar sua expressão.37). a seqüência de DNA com 150 pares de bases foi necessária e suficiente para ativar o gene (qualquer gene!) no oócito. o oócito (Figura 2. Eles usaram enzimas de restrição para isolar o DNA da região 5'. Como veremos no Capítulo 10. É uma glicoproteína sintetisada pelo oócito durante sua maturação em óvulo (Roller et al. conseqüentemente.. o sítio OSP-1. com a transcrição do gene pela RNA polimerase. mas pode ser encontrado dentro de um íntron ou no terminal 3'. Dentro dessa região de 150 pares de bases (de 99 a 86 pares de bases a montante do gene estrutural ZP3) existe a seqüência 5’-GATAA-3' que liga uma proteína chamada OSP-1. ela ativa o gene ZP3 ligando-se a essa sequência de DNA no promotor. contendo a região a montante do gene ZP3 ligada ao gene estrutural para luciferinase. Como hipótese. Assim. No momento.1989). Fatores protéicos que se ligam ao intensificador permitem sua interação com o promotor e. mas a maioria dos genes ligados ao desenvolvimento são ativados em tempos e células específicos. a montante do gene. GATAA.) Intensificador Promotor Éxon Íntron Éxon Íntron Éxon Intensificador “a montante do gene” Intensificador “a jusante” do gene . Uma transferência Northern mostra que o mRNA para essa proteína é sintetizado somente em oócitos em crescimento e não pode ser detectado em nenhum outro tipo de célula (Figura 2.. Um sítio intensificador sensível a estrogênios é encontrado no primeiro íntron do gene ZP3. O que permite a esse gene ser ativado somente nos oócitos? Lira e colaboradores (1990) isolaram o gene para ZP3. está sendo investigado como é regulado o gene codificador de OSP-1. (No exemplo ZP3. Como detalharemos no Capítulo 4. determinaram sua seqüência e encontraram um sítio promotor. OSP-1 é encontrada somente em oócitos em maturação.

(de Lira et al. a qual apareceu onde foi expressa sob a direção do promotor de ZP3. especialmente dentro dos oócitos. (de Roller et al. desenvolvimento em insetos dependente da dieta. RNA de vários tecidos (10µg por pista) e oócitos (125ng) foram submetidos à eletroforese e transferidos para papel de nitrocelulose. Oócito Ovário Cérebro Embrião de 13 dias Coração Intestino Uma conclusão e um alerta Depois de quase um século. cortesia de P.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 75 Figura 2. Wassarman). 1990. Em capítulos posteriores (especialmente Capítulo 21). quando luciferinase foi ligado ao promotor do gene ZP3.. estado amebóide e flagelado (Naegleria) e gonídios sexual e assexual (Volvox) é determinada pelo ambiente. permitindo que genes diferentes possam se tornar ativos em diferentes células.37 Hibridização in situ da expressão do gene repórter luciferinase. Rim Fígado Músculo Testículos Útero (A) (B) Figura 2. estamos começando a entender como as células regulam a expressão diferenciada de seus genes. Nesses casos o organismo herda a habilidade para responder aos sinais do ambiente. Um fragmento radioativamente marcado do gene ZP3 foi usado como sonda do mRNA. mas não é possível predizer o fenótipo a partir do genótipo.1989. cortesia de P. dos neurônios e linfócitos em mamíferos. Caso o tom celebratório deste capítulo deixou a impressão de que desenvolvimento é somente uma função da atividade gênica é necessário relembrar do Capítulo 1.. Esse conhecimento está ajudando a explicar como a informação herdada é utilizada para construir os planos básicos do corpo e os tipos específicos de células do organismo em desenvolvimento. A sonda radioativa era dirigida à mensagem luciferinase. veremos outros exemplos do controle ambiental do desenvolvimento: determinação de sexo temperatura-dependente em répteis. Wassarman. e a diferenciação. Entretanto. que a distinção entre talo e esporo (Dictyostelium). (B) Magnificação (160x) de dois folículos ovarianos contendo oócitos em maturação. uma palavra de alerta. (A) Visão do ovário inteiro (60x).36 Transferência Northern de RNA de ZP3 acumulado no camundongo. dependente de experiência.) . A mensagem ZP3 foi encontrada somente no ovário.

The isolation and characterization of Drosophila yolk protein genes. Ergebmisse über die Konstitution der chromatischen Substanz des Zelkerns. R. Gilbert (ed. Hist. T. 1987. A. 1968. Nature 350: 473-479. Acad. Can. Witkowski and C. Hennen. B. H. p p . In S. 1993. 219(6): 24-35. P. N. A Conceptual History of Modern Embryology. Biol. Thomas Hunt Morgan: The Man and His Science. 1959. 1967. Phylogenetic distribution of Antennapedia-like homeoboxes. Genomic potential of differentiated cells analyzed by nuclear transplantation. 1966. Proc. 1973. N. Genetics 25: 391-400. 1978. J. Induction and repression of a puff in Chironomus tentans. Gilbert. Pachl. G. In M. J. P. M. 1972. Biol. pp.). J. [p. Sarkar (ed. Quant. A. pp. Proc. F. USA 38:455-463. Wylie (eds. Enzyme adaptation and the entrance of molecular biology into embryology. The embryological origins of the gene theory. and Kemler. pp. Princeton University Press. Morphol.. Genetics 23: 573-584. 1904. Soc. Etkin (eds. 1937. J. Dumont. The Molecular Philosophy and History of Molecular Biology: New Perspectives. Genet. Puffing of polytene chromosomes. Gurdon. S. giant. In T. S. M. 1966. M. B. T. H. “Fertile” intestinal nuclei. R. Induction by ecdysone in salivary glands of D. 1978. Biol. Kluwer Academic Publishers. Chromosoma 5: 139-198. 1991. T. Ashburner. L. E. B. pp. [p. 1940. Science 202:1279-1283. 1952. Gardner. Benson and J. T. D. 1970. Cytological aspects of information transfer in cellular differentiation. J. Ein Balbiani -ring als Locus einer Speicheldrüsen -Mutation. 1978. Acad. 3: 23-28. Regionally restricted developmental defects resulting from targeted disruption of the homeobox gene box 1. Harwood. 27: 623-644. A. Burian. W. Acad. DiBerardino. Development and cellular differentiation of neural nuclear transplants of known karyotypes. Holland. D. Egg cytoplasm and gene control in development. J. I. 1962. 1973. D. Cell 21: 729-738. R. Dev. 1978. Grossbach. Embryol. 1980. 29:385-401. and the attempts to reconcile embryology and genetics. The University of Chicago Press. M. New York. J. 101-123. R. T. DiBerardino and L.. Briggs. Beermann. Princeton. NJ. Blattner. K. [Suppl.76 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento LITERATURA CITADA Allen. Science 85: 369-374. In R. Doetschman. Exp. S. S. New York. E. 1967. Laskey. S. and the embryological origins of the gene theory. 1986.. C. Gilbert. 123] Briggs. S. J. Gluecksohn-Schoenheimer. G. Gurdon. Chromosoma 12: 1-25. Clever.5. Natl. pp. 1989. A. J.. A. Cytol. 181-206. Gilbert. Physiological Genetics. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Beermann. Cohen. New York. 1961. . J. Nature 210: 1240-1241. W. Biol. Proc. B. Baltzer. (Trans. Cold Spring Harbor Symp.] 9: 107-127. W. Transplanted nuclei and cell differentiation. S. 1991. The effect of an early lethal (to) in the house mouse. Exp. R. N e w Yo r k . Dedifferentiation of iris epithelial cells. Int. In S. Vol. R. R. F. Am. Gurdon. Allen. D. In S. Developmental Biology: A Comprehensive Synthesis. Philadelphia. Am. Die Puffs der Speicheldrüsenchromosomen von Drosophila melanogaster. Chisaka. Zool. Chang. Styles of Scientific Thought: The German Genetics Community 1900-1933. 14:421-438. Gurdon. Am.). and Hogan. Gayon. R. S. Beermann. 316-395. A. Mouse chimeras obtained by the injection of cells into the blastocyst. USA 83: 9065-9069. A. Beobachtungen zum Verhalten des Puffmusters im Normalstamm und bei zwei Mutanten. 207-227. J. and Helling. In The Genetics and Biology of Drosophila. DiBerardino. C. DiBerardino. Chromosoma 38: 255-281. 15:102-128. Patterns of puffing activity in the salivary glands of Drosophila. Ashburner. J. Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frogs’ eggs.und lethal-giant Larvae. Theodor Boveri: Life and Work of a Great Biologist. Natl. Richard B. University of Pennsylvania Press. 1910-1935. R. 27: 797-806. Embryol. and Berondes. Boveri. Influence of spermine and reduced temperature on the ability of transplanted nuclei to promote normal development in eggs of Rana pipiens. Goldschmidt. Sci. R. U. J. E. 11: 307-351. Sci. B. Lond. Y. and Capecchi. Chromomerenkonstanz und spezifische Modifikationen der Chromosomenstruktur in der Entwicklung und Organdifferenzierung von Chironomus tentans. B. Gurdon. S. Cambridge University Press. A. Academic Press. 113-146. The American Development of Biology. Rudnick. Proc.. The developmental capacity of nuclei transplanted from keratinized cells of adult frogs. 34: 93-112. Morgan. H. 1968. Horder. Chromosoma 10: 654-678. Genomic activation in differentiated somatic cells. Goldschmidt. R. Dordrecht. and Uehlinger. Serfling. 1986. C. melanogaster cultured in vitro. 1978. In friendly disagreement: Wilson. M. Cloning human fetal g-globin and mouse a-type globin DNA: Preparation and screening of shotgun collections. and Wensink. Zool. R. M. and King.) University of California Press. Rev. M. J. Burkholder. pp. B. G. Genetics of cell type determination. Barnett. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. D. W. Embryology and its relations. 311-346. 0. Acad. and Zallen. F. Zool. McGraw-Hill. Nettie Stevens and the discovery of sex determination. Harrison. Transgenesis by means of blastocyst -derived stem cell lines. F. U. Gergen. 1991.F. [B] 198: 211-247. 1975. B. T. A Conceptual History of Modern E m b r y o l o g y. R. Sci. 10: 622-640. 38: 619-627. Boris Ephrussi and the synthesis of genetics and embryology. R. Morgan and the split between embryology and genetics. S. Nature 220: 596-597. Whole mount electron microscopy of polytene chromosome from Drosophila melanogaster. and King. Chicago. NatI. New York. J. Chromosome puffs and gene expressions in polytene cells. Becker. C. M. Sci. Dev. 1] Gossler. Boyer. Jena. E 1988. Cellular politics: Ernest Everett just. L. VI. Gilbert (ed. Berkeley. 1996. 1952. Am. F.). 1963. Proc. R. Induction and the origins of developmental genetics. Natl. 175-198. V. Cytol. 1977. P. G. Maienschein (eds. Gilbert. 1986.. H. 1980. J. 18: 67-77. T.. Cell 22: 479-488. R.). W. Korn. Nature 321: 251-253. Gluecksohn-Schoenheimer. T. The development of two tailless mutants in the house mouse. J. 2B. Biol. New York. Brush. 1979. The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelial cells of feeding tadpoles. and Reeves. J. 1987. 1938. Rainger.). Plenum. Plenum. A History of Embryology. 1938. 0. 1972. and Yamada. Isis 69: 132-172. Dev. Gustav Fisher. Gilbert. P l e n u m .. 1976. and eight others.). H.. USA 66: 630-637. Morphol. USA 70: 3240-3244. Capecchi. Sci.

Acad. TGF. Kurioiwa. J. Lillie. P. 1927. F. W. King. Wirz. A. Biol. K. J. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. McKinnell. 1990. H. R. Sims. Orr. Science 64: 361-368. Nuclear transplantation in early porcine embryos. T. Cold Spring Harbor Symp. Transdifferentiation. USA 87: 7215-7219. Induced chimaerism by transplanting embryonic cells into mouse blastocysts. T. A. Biol. Lira. Sander.. 1992.. News 33: 62-68. M. Gene expression during mammalian oogenesis and early embryogenesis: Quantification of three messenger RNAs abundant in fully grown mouse oocytes. Transforming DNA integrates into the host chromosome. and First. and Dawid. Transplantation of the nuclei of primordial germ cells into enucleated eggs of Rana pipiens. Kinloch. New York. Nuclear transplantation in the mouse embryo by microsurgery and cell fusion. USA 74:5463-5467.). In R. Mol. I. A. G. R. and Arnheim. L. Q.. L. 1982.-L. Southern. The genome of frog erythrocytes displays centuplicate replications. Mol. [p. 1981. G. Spradling. Morgan. 1987. 1-13. F. A. 1985.. L. 1975. DiBerardino. J. Cell 23: 29-39. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Pardue. and Daneholt. Prather. Regeneration in the lens in the amphibian eye. B. M. P. M. R. 1975. Natl. H. Yale University Press. Acad. Repeated DNA sequences in a Balbiani ring. 287. 1956. Robl. University of Pennsylvania Press. Zent. Embryonic Development and Induction. A. Biol. S. In S. Biol. B. and Wassarman. 1983. The role of genes in ontogenesisevolving concepts from 1883 to 1983 as perceived by an insect embryologist. Oxford University Press. Eyestone. F. Biochem. Proc. H.. 1900-1919. D. Cambridge. J. Horder. Biol. C. Chromosomal localization of mouse satellite DNA. M. J. Seifert. S. 3: 318-356. Minneapolis. M. M. Heredity and Development. and Solter. Mol. and Axel. and Kimmelman. Okada. McGrath.). 1989. J. University of Minnesota Press. Moustafa. M. W. E. T. M. Construction of the developmental gene concept.α and TGF. G. Brenner. Kinloch. Differentiation as the controlled production of unique enzymatic patterns. Hist. K. Ripley. Alan R. G. Witkowski and C. R. Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of DNA molecules. Annu. . Cambridge University Press. R. Schickler. Biol. 1995. and Briggs. The Theory of the Gene. Science 218:341-347. Philadelphia. H. Prather. New York. bl. Methods Cell Physiol. A. New Haven. N. Perucho. The Frog’s Egg. Science 222: 135-139. A homologous protein-coding sequence in Drosophila homeotic genes and its conservation in other metazoans. 2: 1-36. Science 226: 1317-1319. R. Growth in Relation to Differentiation and Morphogenesis. Oxford University Press. Lambert. Mark. 135]. Proc. Keller.). P. J.. Simon & Schuster. U. G. Brown (eds. Benson and J. Colorado University Press. Schultz. 1985. Just. M. Barnes. T. H.β genes in preimplantation mouse embryos. A. The Biology of the Cell Surface. Nuclear transplantation in amphibia. M. L..CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 77 Jacob. Genetic and physical linkage of exogenous sequences in transformed cells. M. Spemann. J. M.. H. A. J. Refiguring Life: Metaphors of Twentieth-Century Biology. E. D. and Coulson. Lira. Abbott (eds. Research note: Genes on chromosomes: The conversion of Thomas Hunt Morgan. Inability of mouse blastomere nuclei transferred to enucleated zygotes to support development in vitro. Cell 22: 309-317. and McKinnell. S. S. 1980. F.. J. Scharf. 1988. Sci. Sanger. H. Henderson.. 1956. Cloning: Nuclear Transplantation in Amphibia. 1970. Y. 1977. Cold Spring Harbor Symp. Wylie (eds. New York. 1985. S. Exp. J. S. Biol. 50: 31-35. M. 122:120-127. and Gall.). Rev. 1939. Mullis. 1954. F. Judson. In J. The phenomenon of enzymatic adaptation and its bearing on problems of genetics and cellular differentiation. Microanalysis of RNA from defined cellular components. D. Nathans. Nuclear transplantation in the bovine embryo: Assessment of donor nuclei and recipient oocyte. D. Zool. Roller. Robins. New York. [p. Rosenberg. pp. A. New Haven. and First. 1926. and Wigler. Biol. M.. T. L. Serial transplantation of embryonic nuclei.. Differential gene expression in the gastrula of Xenopus laevis. Morgan.. Hiraoka. Sapp. Reyer. 1984. A.. 1984. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. R. I.. Lederman.. Production of phenocopies by Kriippel antisense RNA injection into Drosophila embryos. Acad. A. Saiki. Science 220: 1300-1302. Faloona. 181: 193-202. 21: 271-289. Erlich. The crucial years: 1960-1980. 1989. and Smith. 1961.. Oppenheimer. W.. Yale University Press. Subtelny and U. p. 1978. 1991. 115:132-138. and Solter. Sci. A. pp. J. Smith. 1972. and Dawid. Lambert. 22: 163-176. Blakiston. E. R. 29: 1-46. and Brinster. B. R. S. King. 1966. D. A History of Embryology. The American Development of Biology.. R. 1975. A. 11: 223-289. S. Mortillo. 1987. New York. J. Monod. Methods Cell Biol. Developmental expression of PDGF. Hanahan. T. Kinloch. Science 230: 1350-1354. K. S. T. Natl. McGrath. USA 83: 1369-1373. Quant.. 0. C. Maienschein (eds. Garber. Rainger. Jäckle.. Oxford Universtiy Press. USA 54: 101-107. D. A. 98: 503-517. S. N. R. F. 1979. J. 1897. Jamrich. A. 44: 273-293. K. F. W. R.. J. S. Z. Philadelphia. McGinnis. J... I H. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Altered morphogenesis and its effects on gene activity in Xenopus laevis embryos. 363-395.. M. A. Biol. 1988. Lab. 1972. Sargent. Cambridge University Press. R. A mouse oocytespecific protein that binds to a region of mZP3 promoter responsible for oocyte -specific mZP3 gene expression. K. 281-310. Oxford. 1947.. Sci. M. D. and Gehring. Sargent. J. Paul. Rev. J. Natl. C. Macmillan. Spiegelman. Mendel in America: Theory and practice. E. 72: 65-75. Development 106:251-261. 1963. S. Walter Landauer and developmental genetics. An upstream region of the mouse ZP3 gene directs expression of firefly luciferinase specifically to growing oocytes in transgenic mice. and Monod. Reprod. pp. 1991. A. 1996. R. C. L. 1981. S. Liss. R. 1986. D. Rappolee. Proc. Science 241: 1823-1825. 1989. Sci. D. Horn. M. and Werb. B. 1938. Nicklen. Nuclear transplantation and embryo cloning in mammals. Preiss. D. Biol. Cell 37: 403-408. Sims. R. Reprod. B. F. Science 168: 1356-1358. and Wassarman. 1986. Growth Symp. Prather. Nature 313: 703-706. R. 41: 414-418. E. Beyond the Gene: Cytoplasm Inheritance and the Struggle for Authority in Genetics. A. J.. Li. N.. H.. 1947. 1983. J. and Knüpple. A. J. L. The Eighth Day of Creation. J. Quant. The gene and the ontogenetic process.. Danielli and R. and Wassarman. Natl. 236] Morange. Moore. 10: 17-47. Animal Res. Proc. Mol. R. Int. Acad. B. Cell Biol.. In T. D. Levels of Genetic Control in Development. R. D. B. 37: 859-866. B. N L. A. and Rubin.

Science 143: 20-27. Biol. USA 78: 6376-6380. and Messing. 1986. Exp. Wieslander.. 136: 526-538. Willadsen. Kind. [B] 175:1-30. The pUC plasmids. Lab. Science 160: 1075-1081. M. Washington. C. P. New York. Mapes. and Gault. Studies in Spermatogenesis with Especial Reference to the “Accessory Chromosome. S. and Daneholt. S. Steward. 14-36. Wilson. 1896. [p. C. H. Zool. Scholl. Sofer. D. Expression pattern of the mouse T gene and its role in mesoderm formation. Am. H. Am. L. E. B. F. Acad. From cultured cells to whole plants: The induction and control of their growth and morphogenesis. J. 73: 260-264. Wilmut. Goldberg. 1962. and Klein. 1997. D. pp. Demonstration of Balbiani ring RNA sequence in polysomes. E. E. 1990. 507-545. A. B. L. NatI. Microinjection of rabbit β-globin gene into zygotes and its subsequent expression in adult mice and offspring. 1904. J. Waddington. Acad. and Sullivan. W. T. 1989.. Steward.. G. 1905b.. B. B. J. Lect. S. Proc.78 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Stevens N.. G. 262] Wilson. J. J. M. E. L. Wilson. Schnieke. K. W. USA 25:299-307. Bot. A. Ursprung.C. New York.. Cloning of sheep and cow embryos. Nature 320: 63-65. Growth and division of freely suspended cells. Bhatt. 1939. and Campbell. A. Dev. 1905a. C. J. 45: 693-703. J. M. Lond. Marine Biol. J. 1905. Natl. N. Nuclear transplantation in sheep embryos. 1970. J. Jollick. Hoppe. Proc. Kent. Assay systems for the study of gene function. Wetmur. Waddington. Preliminary notes on the development of wings in normal and mutant strains of Drosophila. C. an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. J. 1: 1-72..” Carnegie Institute of Washington. New York. Columbia University Press. Macmillan. R. McWhir. T. Stevens. Growth and development of cultured plant cells. Soc.. C. Zool. Sci. Biol. The Cell in Development and Inheritance. Zool. J. H. Nuclear reprogramming in nuclear transplant rabbit embryos. H. 1982.. Gastrulation in the sea urchin is accompanied by the accumulation of an endoderm-specific mRNA. Hodinka. J. J. 0. 1966. 39: 657-664.F. Lennarz. T 1968. Exp. Woods Hole 2:1-14. Cell Biol. Stice. M. and Holsten. S. B. 1981. E. Biol. G. Kinetics of renaturation of DNA. E. M. Willadsen. Viable offspring from fetal and adult mammalian cells. R.. 1989. J.. Control of tissue specificity: The pattern of cellular synthetic activities in tissue transformation. and Smith. Growth and organized development of cultured cells. N. Biol. The mosaic theory of development. Sci. 2: 371-405. D. . 1895. 31:349-370. D. Macmillan. and Herrmann. D. I. [p. H. J.. I. M. F. 1894. Smith. 1964. M. Experimental studies on germinal localization. Wessel. Wagner. The chromosomes in relation to the determination of sex in insects.. S. I. Steward. H. Nature 343: 657-659. Vierra. 1968 . Wilkinson. Gene 19: 259-268. B. D. B. B. J. An Atlas of the Fertilization and Karyogenesis of the Ovum. M. 1988. 1977. K. Proc. Mapes. Nature 385: 810-813. 0. Mol. A study of the germ cells of Aphis rosae and Aphis oenotherae.. R.. D. Reprod. E. and Davidson. The germ regions in the egg of Dentalium. G. Yamada. 6:21-31. Science 22: 500-502. Wilson. W. 4] Wilson. and Robl. R. New Patterns in Genetics and Development. 1958. E. Genome 31: 956-962.

e como se formam órgãos em determinados locais? Olhos se desenvolvem na cabeça.c). Paul Weiss (1960) Eu fui criado terrivelmente e maravilhosamente. Sua padronização é inerente e primária. • Como células migrantes atingem seu destino. Desenvolvimento envolve não só a diferenciação celular. introduziremos as vias de mudança pelas quais as células do embrião em desenvolvimento criam órgãos funcionais do corpo. porque ela mesmo é parte integrante e majoritária daquela ordem. Nosso intestino. os vários tipos de células presentes na retina neural (as três camadas distintas de fotoreceptores. Neste Capítulo. e as células da retina raramente dividem-se após o nascimento. Existem quatro questões majoritárias participando do arcabouço de discussões sobre morfogênese: • Como se formam tecidos a partir de células? De que modo células da retina neural aderem a outras células da retina neural e não se associam às celulas da retina pigmentada ou da íris que estão próximas a elas? De que modo. A retina seria inútil se estivesse situada atrás de um osso ou outro lugar qualquer. mais ainda. se todas as células têm o mesmo potencial genético? Em alguns casos. os neurônios da retina devem penetrar no cérebro para inervar as regiões do córtex cerebral que analisam a informação visual. vemos um arranjo preciso e intrincado de muitos tipos diferentes de células. entretanto. a natureza só pode ser percebida pela mente humana. neurônios bipolares e células ganglionares) estão organizados para permitir que a retina seja funcional? • Como são os órgãos construídos a partir de tecidos? As células retinais do olho estão situadas atrás da córnea e da lente a uma distância exata.A base celular da morfogênese: Afinidade celular diferencial 3 Mas a natureza não é atomizada. e como é esse crescimento coordenado ao longo do desenvolvimento? As células do olho devem crescer juntas. U m corpo não é meramente uma coleção de tipos de células distribuídas ao acaso. mas em nenhum outro lugar. Além disso. e 79 . Quando observamos a anatomia detalhada de um tecido como a retina neural. onde a lente não pudesse nela focalizar os raios de luz. Como as células são instruídas para percorrer certas rotas e parar quando atingem uma região específica do corpo? • Como crescem órgãos e suas células. como o de precursores de nossas células pigmentadas. Salmo 139 (ca. mas também sua morfogênese em arranjos multicelulares tais como tecidos e órgãos. está constantemente descartando células e regenerando outras. Todas essas conexões devem estar precisamente ordenadas. 500 a. e a ordem subjacente à beleza é nela demonstrada. células germinativas e glândula supra-renal. O que impede a formação de um olho em outras partes do corpo. as células devem percorrer longas distâncias para alcançar seu destino final.

1 Sumário dos principais processos morfogenéticos em células mesenquimatosas e epiteliais ± . Neste capítulo veremos como superfícies de células adjacentes interagem durante o desenvolvimento. A morfogênese nessas duas classes de células se dá através de um limitado repertório de processos celulares: (1) direção e número de divisões celulares. E. cada um será detalhado em capítulos subseqüentes. (3) movimento celular. Se o número de células regeneradas fosse menor. A maneira pela qual esses processos se completam pode diferenciar entre células epiteliais e mesenquimatosas (Figura 3. eles prepararam suspensões de células isoladas provenientes de cada uma das três camadas germinativas dos anfíbios. Considerando a descoberta de que tecidos de anfíbios se dissociavam em células isoladas quando colocados em soluções alcalinas. ocorrem na superfície celular. logo após a formação do tubo neural. (4) crescimento celular. A superfície celular parece a mesma em todos tipos de células. mas a análise moderna da morfogênese se inicia com os experimentos de Townes e Holtfreter em 1955. fatores de crescimento e morfógenos. O segundo método involve contato entre superfícies de células adjacentes.2). Figura 3. Células podem seletivamente reconhecer outras. seriam produzidos crescimentos cancerosos. Observações sobre fecundação e desenvolvimento embrionário precoce feitas por E. O que controla essas diferenças na velocidade de crescimento? Todas essas perguntas se referem a aspectos do comportamento celular. Afinidade celular diferencial Assim como a demonstração da importância dos genes no desenvolvimento gerou desentendimentos entre pesquisadores. e muitos pesquisadores mais antigos pensavam até que a superfície celular não era uma parte vital da célula.80 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento ainda assim. e quando o pH era normalizado. sua velocidade mitótica é cuidadosamente controlada. o paradigma dominante na morfogênese envolve afinidade celular diferencial. Se mais células fossem regeneradas do que aquelas descartadas. Existem dois grupos principais de células no embrião: células epiteliais. Os eventos moleculares que intermediam o reconhecimento seletivo de células e sua transformação em tecidos e órgãos. Enquanto o paradigma dominante na genética do desenvolvimento é a expressão diferencial do gene. (5) morte celular. Townes e Holtfreter conseguiram observar o comportamento das células recombinadas (Figura 3. isoladas e funcionando como unidades individuais. e (6) mudanças na composição da membrana celular e da matriz extracelular. formando agregados em placas de Petri cobertas com agár. também se desenvolveu um debate sobre o papel da superfície celular na formação do embrião. A primeira é através de substâncias difusíveis que são sintetizadas por um tipo de célula e que mudam o comportamento de outros tipos celulares. o intestino não poderia digerir o alimento. Essas afinidades podem ser para superfícies de outras células ou para moléculas da matriz extracelular secretadas pelas células. Usando embriões de espécies que tinham células de diferentes tamanhos e cores. as células aderiam umas às outras. Just (1939) sugeriam que a superfície celular diferia em tipos diferentes de células. aderindo a algumas células ou migrando sobre outras. Duas ou mais dessas suspensões de células isoladas poderiam ser combinadas de várias maneiras. visando localizar as células em sítios apropriados dentro de tecidos e órgãos.1). (2) mudanças na forma das células. Essas substâncias incluem hormônios. e as células mesenquimatosas. Parecem existir duas vias principais pelas quais células se comunicam umas com as outras para que se efetue a morfogênese. fortemente ligadas umas às outras em camadas ou tubos.

PROCESSO CÉLULAS MESENQUIMATOSAS AÇÃO MORFOLOGIA EXEMPLO Condensação cartilagem Mesênquima se torna epitélio Mesêquina da cartilagem Divisão celular Mitose para produzir mais células (hiperplasia) Mesênquima dos membros Morte celular Célula morre Mesênquima interdigital Migração Célula se move em tempos e lugares determinados Mesênquima do coração Secreção de matriz e degradação Síntese ou remoção da camada extracelular Mesênquima da cartilagem Crescimento Células ficam maiores (hipertrofia) Células gordurosas CÉLULAS EPITELIAIS Dispersão Epitélio mesênquima (estrutura inteira) Degeneração do ducto Mülleriano Delaminação Epitélio mesênquima (parte da estrutura) Hipoblastos de de galinha Mudança de forma ou crescimento Células permanecem ligadas com alteração da morfologia Neurulação Migração celular (intercalação) Linhas do epitélio se fundem para formar menos linhas Gastrulação de vertebrados Divisão celular Mitose dentro da linha ou outra direção Gastrulação de vertebrados Secreção de matriz e degradação Síntese ou remoção da camada extracelular Formação de órgãos vertebrados Migração Formação de bordas livres Ectoderma de galinha .

Entretanto. cada tipo de célula se posicionava em sua própria região. Ou seja. quando as três camadas germinativas são misturadas entre si.82 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Células epidérmicas presuntivas Segregação de tipos de células Dissociação de células Reagregação espontânea Células da placa neural Seção através da bola de células segregadas Figura 3. O mesoderma também migra centralmente em relação ao intestino ou endoderma (Figura 3. a segregação celular resulta em uma camada epidérmica externa. As células epidérmicas presuntivas migram para a periferia.3B). Quando células axiais mesodérmicas (notocorda) são adicionadas à suspensão de células presuntivas. como antes. A superfície interna do ectoderma tem uma afinidade positiva pelas células mesodérmicas e uma afinidade negativa para o endoderma. o endoderma se separa do ectoderma e mesoderma e é então envolvido por eles (Figura 3. e na maioria dos casos.3D). as células epidérmicas foram encontradas na periferia do agregado e as células mesodérmicas no seu interior. as células da placa neural migram para o centro. que injetou células individuais de específicas camadas germinativas de volta na cavidade gastrular de anfíbio. epidérmicas e neurais. e uma camada de tecido mesodérmico entre eles (Figura 3. As células reagrupamse de tal forma que um tipo (aqui. as células têm a capacidade de distribuirem-se em suas próprias posições embriológicas. em lugar de permanecerem misturadas. Células epidérmicas presuntivas de embriões pigmentados e células da placa neural de embriões não pigmentados são dissociadas e misturadas entre si.3A).2 Reagregação de células da nêurula de anfíbios. De alguma maneira. os pesquisadores observaram que as posições finais das células reagregadas refletiam suas posições embriônicas. um tecido neural localizado centralmente. (Modificado de Townes e Holtfreter. Células endodérmicas encontram posições no endoderma do hospedeiro.3C). 1955. Tais afinidades preferenciais foram também observadas por Boucaut (1974). Ele verificou que essas células migram para sua camada germinativa apropriada. a epiderme presuntiva) cobre o outro. aderindo à sua superfície interna (Figura 3. Na sua configuração final. A mimetização da estrutura embrionária normal por agregados celulares também pode ser vista na recombinação de células da epiderme e da placa neural (Figura 3.) Os resultados de seus experimentos foram surpreendentes.3E). verificaram que células reagregadas se tornavam espacialmente segregadas. Holtfreter interpretou esse fato em termos de afinidade seletiva. o endoderma é interno e o mesoderma se situa na região entre eles. Assim. formando uma estrutura reminescente do tubo neural. o ectoderma está na periferia. Em nenhum caso as células permaneceram misturadas ao acaso. quando células epidérmicas (ectodérmicas) e mesodérmicas foram ajuntadas para formar um agregado misto. O mesoderma migra centralmente à epiderme. Em primeiro lugar. Em segundo lugar. um tipo de tecido envolvia o outro completamente. enquanto o mesoderma tem afinidades positivas para ambas as células. ectodérmicas e endodérmicas. enquanto que células ectodérmicas se localizam em seu .

os experimentos de Fink e McClay (1985) demonstraram esse comportamento no ouriço-do-mar. que mostrou uma clara correlação entre mudanças de adesão in vitro e o comportamento da célula embrionária. Cada célula tem também uma alta afinidade para a matriz extracelular (camada hialina) que cobre o embrião. células precisam interagir de forma diferente com outras populações celulares em tempos específicos. Assim. Isso deveria ser esperado. Essas mudanças de afinidade causam a perda de contato das células Distribuição e reorganização de relacionamentos embrionários espaciais em agregados de células embrionárias de anfíbios. Essas mudanças na afinidade celular foram dramaticamente confirmadas por Trinkaus (1963). Na blástula. (Modificado de Townes e Holtfreter. 1955. durante seu desenvolvimento. um grupo específico de células.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 83 Epiderme + mesoderma Mesoderma + endoderma Epiderme + Mesoderma + endoderma Placa neural + epiderme Placa neural + Mesoderma axial + epiderme Epiderme Endoderma Mesoderma Epiderme Epiderme Mesoderma Mesoderma (A) Mesoderma (B) Endoderma (C) Placa neural (D) Epiderme (E) Placa neural Figura 3. afinidade seletiva parece ser importante para fornecer informação posicional às células embrionárias. perde sua afinidade pelas células vizinhas e pela matriz extracelular externa. Mais recentemente. Entretanto. no pólo vegetal da blástula.4). e uma baixa afinidade para as proteínas dentro da cavidade embrionária (blastocele). pois células embrionárias não mantêm uma única relação estável com outras células.3 ectoderma. Para que ocorra o desenvolvimento.) . A terceira conclusão de Holtfreter e seus colegas foi que afinidades seletivas mudam durante o desenvolvimento. ao iniciar-se a gastrulação. enquanto adquire simultaneamente afinidade pelas fibrilas protéicas que forram a blastocele (Figura 3. todas as células parecem ter a mesma afinidade umas pelas outras.

84 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 3. 1962). A reconstrução de agregados de embriões tardios de aves e mamíferos foi obtida pelo uso da protease tripsina para dissociar as células entre si (Moscona. As células epidérmicas migram para a periferia. (B) Enquanto progride o desenvolvimento. devem agora aderir para formar os rudimentos do anel esquelético. (A) Na blástula do ouriço-do-mar. O modelo termodinâmico de interações celulares A células. cada célula tem alta afinidade por suas vizinhas e por seu substrato. com suas vizinhas e a migração para dentro da blastocele. e as dérmicas migram para o centro. Dessa maneira. a camada hialina. mas se movem ativamente para criar organização tissular. Essa reconstrução de tecidos complexos a partir de células únicas é chamada de agregação histotípica. Quando elas começam a formar esse esqueleto. Aumento de afinidade por fibrilas da bastocele. 1952). A Figura 3. Quando as células isoladas resultantes foram misturadas em um frasco e agitadas de modo que a força de cisalhamento destruísse adesões não específicas. 1987). que tinham sido “antisociais” entre si desde seu ingresso na blastocele. Malcolm Steinberg propôs um modelo que explicava o direcionamento da . O resultado é que essas células migram para a blastocele (flechas) e formarão o esqueleto. Quais forças dirigem o movimento celular durante a morfogênese? Em 1964.4 (A) Camada hialina Células da blástula (B) Sumário das modificações na adesão celular de células precursoras do esqueleto (encaixadas). Tais mudanças na afinidade celular são extremamente importantes nos processos da morfogênese. mudanças na superfície celular produzem um enfraquecimento das afinidades pelas células vizinhas e camada hialina e um aumento de afinidade pelas proteínas da cavidade interna da blastocele. onde elas formarão o esqueleto da larva. Em 72 horas. 1961. Essas células. suas propriedades adesivas terão que mudar novamente. então. a epiderme foi reconstituída. As células da pele são separadas por enzimas proteolíticas e depois agregadas em uma cultura rotatória. Giudice. Essas mudanças na adesão são específicas temporalmente e também específicas para as células precursoras esqueléticas (McClay e Ettensohn. não se distribuem ao acaso. as células se distribuíram de acordo com seu tipo celular. elas reconstruíram a organização do tecido original (Moscona.5 mostra a “reconstrução” do tecido da pele de um embrião de camundongo de 15 dias. Fibrilas da blastocele Alta afinidade por células vizinhas e camada hialina Decréscimo de afinidade por células vizinhas e camada hialina. formou-se uma camada de queratina e folículos de pêlo são vistos na região dermal.

Steinberg mostrou que certos tipos de células sempre migram para o centro quando combinadas com determinados tipos de células. completa com folículos de pêlo e camada queratinizada. células do coração migram internamente às células neurais da retina. tais interações obedecem a uma hierarquia (Steinberg. (C) Após dois dias.5 Epiderme Derme Reconstrução da pele a partir de uma suspensão de células de pele de um embrião de camundongo de 15 dias.8). (As células pigmentadas espalhadas são provavelmente células mortas).7). Os mesmos tipos de interações podem ser observados quando agregados esféricos de tecidos são colocados em contato. e células do coração migram centralmente em relação à retina pigmentada.) Folículo piloso primário distribuição celular baseado em princípios termodinâmicos.6 ilustra as interações entre culturas de células pigmentadas e células neurais da retina. já não se observa células pigmentadas da retina na periferia dos agregados. derme e folículos pilosos primários. células pigmentadas da retina migram internamente às células neurais da retina. são vistos agregados de células distribuídas ao acaso. uns com os outros. Se a posição final de um tipo de célula. Quando suspensões de células isoladas desses dois tipos são misturadas. Um dos tecidos finalmente envolve o outro. duas distintas camadas são vistas. (B) Em 19 horas. 1970). cortesia de P. após algumas horas. Armstrong. é interna em relação a um segundo tipo. Além disso. Moscona. interagem para formar um agregado com a menor energia livre interfacial (Figura 3. então a posição final de A será sempre interna a C. (de Monroy e Moscona. mas migram perifericamente quando combinadas com outras.6 Agregados formados pela mistura de células da retina neural (não pigmentada) de um embrião de galinha de 7 dias com células pigmentadas da retina (escuras). e a topografia final é independente das posições de partida (Figura 3. Essa observação levou Steinberg a propor que as células misturadas. (de Armstrong. (E) Nova diferenciação dos agregados (72 horas).CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 85 Figura 3. Usando células derivadas de tecidos embrionários tripsinisados.) (E) Folículos de pêlo . (C) Agregados após 24 horas. em dois dias. B. cortesia de A. C. elas formam agregados de células organizadas ao acaso. as células pigmentadas da retina não são mais vistas na periferia. a maioria das células pigmentadas da retina estão localizadas em uma massa central interna rodeadas pelas células da retina neural. (A) Seção através da pele embrionária. Em outras (A) (B) (C) (D) Derme Derme Epiderme Camada queratinizada (A) (B) (C) Figura 3. A. (D) Seção através de um agregado mostrando migração de células epidérmicas para a periferia. e a posição final de B é interna a um terceiro tipo. mostrando a epiderme. 1989. com as células pigmentadas localizadas internamente às células neurais da retina. Portanto. 1979. mostrando epiderme e derme reconstituídas. (B) Suspensão de células isoladas de pele tanto da derme como da epiderme. A Figura 3. (A) Cinco horas após a mistura das suspensões de células isoladas. B. Entretanto. Por exemplo.

se a conexão A-A tiver uma força muito maior do que a conexão A-B – em outras palavras. Na forma mais simples desse modelo.86 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 3. .8 Distribuição como um processo tendendo à estabilidade termodinâmica máxima. haverá uma completa separação. as células se rearranjam na forma termodinamicamente mais estável. reagregadas ou os tecidos são mantidos intactos e colocados em contato. originará diferentes números de contatos estáveis entre tipos de células. Se as células dos tipos A e B têm diferentes forças de adesão. Uma condição final idêntica é obtida. 1989. bem encaixados Dissociar os tecidos e reagregar Movimento do tecido B para envolver o tecido A Movimento das células A para dentro. ou a arquitetura celular que permite à substância ser concentrada diferencialmente. as células A e B não mostram basicamente nenhuma adesividade entre si – então as células A e B formarão agregados separados. o essencial é que tenham diferenças em suas forças de adesão. Se a força da conexão A-A é menor ou igual a da conexão A-B. e a mistura dos tipos de células será ao acaso. Células A localizadas centralmente às células B (A) DISTRIBUIÇÃO (B) AO ACASO (C) SEPARAÇÃO Figura 3. (De acordo com Armstrong. o agregado permanecerá com uma mistura de células ao acaso. as diferenças termodinâmicas poderiam ser causadas por vários tipos de moléculas de adesão. A posição final de agregados compostos de dois tipos de tecidos é independente de sua posição inicial. então. como é característico para óleo e água. se os tecidos são transformados em suspensões de células isoladas e. (B) Se a força das adesões A-B é maior ou igual à média das adesões homotípicas. e se a força da conexão A-A é maior do que aquela entre A-B ou B-B. As células mais adesivas se localizam centralmente. vai haver distribuição com centralização das células do tipo A. todas as células poderiam ter o mesmo tipo de “cola” distribuída na sua superfície. não vai haver distribuição. A quantidade desse produto da superfície celular. Finalmente. Alternativamente. o embrião precoce pode ser considerado como existindo em um estado de equilíbrio até que alguma mudança na atividade gênica altere as moléculas na superfície celular. Nessa hipótese.) Colocar tecidos juntos.7 Tecido A Tecido B Espalhamento de um tipo de célula sobre outro tipo. distante da periferia palavras. (A) Distribuição ocorre quando a força adesiva média entre diferentes tipos de células (ωab) é menor que a força adesiva média homotípica (A-A ou B-B) (ωaa. Os movimentos que ocorrem visam restaurar uma nova configuração de equilíbrio para as células. (C) Se as ligações A-B são muito mais fracas que a média das adesões homotípicas. ω bb). porque o sistema já atingiu o equilíbrio termodinâmico. Para que as células sejam distribuídas. Esse modelo termodinâmico é chamado hipótese da adesão diferencial.

Aqui. Blastemas do pulso. era muito difícil planejar experimentos para testar. O novo tecido do membro se inicia no local da amputação. Blastemas do mesmo nível fundiram em uma linha reta. 1983. (Um membro de cada par foi marcado com tritio para distinguílo do outro). Quando o membro é amputado no pulso. a tensão superficial de cada tecido poderia ser calculada em dines por centímetro. Como é armazenada essa “memória posicional”? Nardi e Stocum (1983) demonstraram que colocando junto dois blastemas de membros de salamandra com o mesmo nível de origem eles se fundem. na construção de novos órgãos. Parece que a distribuição pode ser explicada unicamente pelas tensões superficiais das células justapostas. em lugar disso. cotovelo e cúbito. então. Depois de três dias em cultura. [cell1. e mediram a tensão superficial dos tecidos em termos da habilidade desses em retornar à forma esferóide original. onde formou um pulso ao nível do tarso do pé. de membros anteriores. o blastema do pulso foi deslocado até o fim do membro posterior em regeneração. são colocados juntos em cultura. os agregados foram fixados e secionados. Quando os blastemas eram de diferentes níveis. estão surgindo evidências para essa hipótese em estudos de regeneração de membros na salamandra. Entretanto. refletem diferenças que são usadas pelo corpo.html] Até recentemente. in vivo. não é reformado o tecido do antebraço. entretanto. Parece. Membros de salamandra têm alguns atributos surpreendentes. uma massa de células desdiferenciadas (blastema regenerativo). essas propriedades são maiores no pulso e menores no antebraço. 1983). Foty e seus colaboradores encontraram uma completa correlação entre a tensão superficial do tecido e sua tendência de distribuir-se no centro ou na periferia de um agregado misto. Os blastemas de membro anterior migraram distalmente até o nivel correspondente do membro posterior do hospedeiro e regeneraram uma nova estrutura (Figura 3. Eles comprimiram amostras de tecido entre as placas de vidro de um tensiômetro.9 Distribuição quando blastemas de níveis iguais ou diferentes. Dessa maneira. (de Nardi e Stocum. esse modelo de distribuição celular. formando o resto do membro. Tecidos com uma maior tensão superficial sempre se localizavam internamente quando misturados com outros de menor tensão superficial. Crawford e Stocum (1988) conseguiram relacionar essa distribuição de células in vitro ao processo de regeneração de membro ao vivo. que as propriedades adesivas des- sas células formam um gradiente ao longo do eixo proximodistal. Blastema marcado Pulso Cotovelo Antebraço Figura 3. Quando um membro anterior é amputado no antebraço. quando os blastemas são de níveis diferentes. o toco remanescente forma na sua ponta. o tecido mais proximal (perto do corpo) envolverá o mais distal (Nardi e Stocum. in vivo.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 87 Informações adicionais & Especulações Evidência para o modelo termodinâmico E Blastema não marcado vidências recentes para a hipótese da adesão diferencial surgiram em pesquisa com o objetivo de responder duas questões: (1) pode o fenômeno da distribuição ser explicado pela tensão superficial gerada pela adesão celular?. Stocum.10). forma-se um blastema regenerativo parecido. o mais proximal (perto do corpo) envolve o mais distal.) Antebraço Cotovelo Pulso . vistas in vitro. Entretanto. do antebraço para baixo. o local “sendo conhecido” regenera somente o pulso e os dígitos. e (2) essa distribuição realmente ocorre durante o desenvolvimento? Foty e colegas no laboratório de Steinberg (1994) analisaram a tensão superficial interfacial em vários tecidos embrionários. o blastema do cotovelo se moveu ao nível do joelho e formou o resto do braço a partir desse ponto. mas nenhum envolve o outro (Figura 3. nesse caso. cotovelo ou antebraço foram enxertados na junção blastema-toco de um membro posterior regenerando a partir da meia coxa. o blastema proximal parecia tentar envolver as células mais distais. Esses dados sugerem que as hierarquias da distribuição celular. O blastema do antebraço imediatamente regenerou um membro completo a partir do nível da meia coxa. que se divide e diferencia formando um novo membro.9). cortesia de D.

Elas têm um papel crítico na separação de diferentes tecidos entre si. Essas proteínas participam da adesão célulacélula. Certas proteínas têm seus sítios ativos apontando para fora. cotovelo ao joelho. onde blastemas de membros anteriores em regeneração (em cores) enxertados em blastemas da coxa mediana (cinza) são deslocados para a região correspondente do membro posterior em regeneração (pulso ao tarso. Células eucarióticas são envolvidas por uma complexa borda molecular chamada membrana plasmática (ou celular). em direção a outras células. A membrana plasmática é uma bicamada fluida lipídica que contém proteínas capazes de interagir com o ambiente externo. Elas podem unir células em lâminas epiteliais e condensar células mesenquimatosas em agregados coesos. A superfície celular inclui a membrana plasmática. propiciam uma conexão importante entre o código genético unidimensional e o organismo tridimensional. o potencial genético pode se manifestar no processo mecânico da morfogênese. Os padrões locais de expressão dessas moléculas da superfície celular. 1985): • Moléculas de adesão celular. e permitem a separação espacial das lâminas epiteliais. Elas incluem componentes da matriz extracelular e seus receptores situados na superfície da célula. 1988. . distalmente daquele ponto.88 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 3. e as moléculas encontradas no espaços extracelulares.) Blastema de pulso Blastema de cotovelo Blastema de antebraço Blastema de coxa mediana Enxertar blastema no blastema em regeneração da coxa mediana Permitir crescimento externo dos enxertos A base molecular das adesões célula-célula As classes de moléculas de adesão celular A formação de tecidos e órgãos é mediada por eventos que ocorrem na superfície de células adjacentes. Essas moléculas fornecem vias de comunicação entre o citoplasma de células adjacentes e fornecem barreiras de permeabilidade e força mecânica às lâminas epiteliais. Moléculas de adesão a substrato permitem o movimento de células do mesênquima e neurônios. Modulando o aparecimento dessas moléculas. Essas moléculas permitem ligação das células às suas matrizes extracelulares. antebraço à coxa mediana) onde iniciam a formação do membro anterior. • Moléculas da junção celular. • Moléculas de adesão a substrato. as moléculas diretamente abaixo dela e a ela associadas.10 Distribuição in vivo. existem três classes de moléculas da membrana celular (principalmente proteínas) que estão particularmente envolvidas no controle de interações específicas com outras células (Edelman e Thiery. (de Crawford e Stocum.

e que mudam enquanto a célula se desenvolve. que foram mutados de modo a: (1) não sintetizar seus próprios anticorpos e (2) não ter a enzima de recuperação de purinas. Células do baço de um camundongo imunizado são fundidas com células mutadas de mieloma. selecionar anticorpos Cultivar clones de hibridomas individuais de poços positivos Secionar e cultivar clones cujos sobrenadantes testam positivo Figura 3. As células fundidas (hibridomas) crescem e se dividem. Linfócitos B normais também não dividem-se em cultura. sem enzima HPRT & Especulações Células de baço de camundongo Células de mieloma Fusão Seleção em meio HAT. por essa razão.11 Protocolo para preparar anticorpos monoclonais. cada um Imunização Células mutantes de mieloma. denominados antígenos de diferenciação (Boyse e Old. Esses componentes da membrana. uma droga que inibe a via de síntese de novo da purina. (de Yelton e Scharff. Esses clones são isolados e selecionados para o anticorpo efetivo. Após a fusão. Antígenos de diferenciação específicos podem atualmente ser identificados por anticorpos monoclonais (Figura 3. as células são cultivadas em um meio contendo aminopterina. Células B morrem nesse meio. de modo que eles morrem igualmente. mesmo contendo a enzima (HPRT) que lhes permitiria utilizar a hipoxantina do meio. células do mieloma não fundidas morrem por fome de purinas. são freqüentemente reconhecidos por antisoros e. sem a enzima HPRT. as células do mieloma só podem produzir nucleotídeos de purina de novo. porque possui a enzima de recuperação de purina do linfócito B e as propriedades de crescimento do tumor. hipoxantina fosforribosiltransferase (HPRT). 1980. aminopterina e timidina (HAT).CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 89 Informações adicionais Anticorpos monoclonais e genética reversa Monitoramento de modificações da membrana celular através de anticorpos monoclonais. Células são cultivadas em um meio contendo hipoxantina.) . Células de mieloma não fundidas não podem crescer nesse meio porque a aminopterina bloqueia a única via para sintetizar nucleotídeos purínicos.11). Assim. Geralmente. Os poços nos quais crescem os hibridomas são selecionados quanto à presença do anticorpo efetivo. sendo que cada linfócito B produz um único tipo de anticorpo. Elas não podem produzir nucleotídeos de purina usando a via de recuperação mediada por HPRT e a aminopterina bloqueia também a via de novo. tecido-específicos. e as células de poços positivos são semeadas em densidade suficientemente baixa para permitir que células individuais originem clones discretos. Mais ainda. Os hibridomas produzindo esse anticorpo podem ser cultivados e congelados. Devido a essa última alteração. Esses linfócitos são tornados “imortais” pela fusão com células cultivadas de linfócito B de tumores (mielomas). Os linfócitos B do camundongo começarão a produzir anticorpos contra cada um dos componentes estranhos dessas células. O produto da fusão do linfócito B e da célula do mieloma – o hibridoma – prolifera. esses anticorpos são produzidos injetando celulas estranhas em camundongos (ou células de camundongos de uma linhagem em animais de outra linhagem). 1969). não podendo usar as purinas do meio de cultura. Tal anticorpo é monoclonal. A expressão de componentes da membrana muda no espaço e no tempo. Diferentes tipos de células possuem componentes da superfície celular que são diversos.

Como está evidente nesta fotografia composta.12 mostra diferentes moléculas da superfície celular. A Figura 3. e outro antígeno. em diferentes camadas espaciais da retina neural de um pinto recém-eclodido. Grunwald. Célula epitelial não diferenciada Fotorreceptor Neurônio Neurônio sensorial fotorreceptor Vários antígenos não específicos 22C10 antígeno 24B10 antígeno 21A6 antígeno 28H9 antígeno Figura 3. o conhecimento de como a proteína 24B10 se expressa poderia dar indicacões sobre os mecanismos genéticos da diversidade neuronal. do disco mostram propriedades neuronais. seria interessante saber como seus genes são regulados.) desses hibridomas secreta o anticorpo específico do linfócito B. Por exemplo.) . e a proteína ligada à resina é eluída (por soluções salinas) e submetida à eletroforese em gel para separá-la de um possível Fotorreceptor maduro Figura 3. membranas celulares de diferentes tipos de células contêm moléculas diferentes. contêm moléculas diferentes. Assim. Enquanto se procede a diferenciação. elas expressam o antígeno 22C10.) O anticorpo se liga somente ao antígeno reconhecido originalmente. (D) Seção retinal marcada com anticorpo monoclonal fluorescente que reconhece antígeno em um subconjunto de processos em células nervosas nas camadas sinápticas externas e internas. o antígeno 21A6 é expresso em certas regiões de fotorreceptores em maturação. Esse antígeno é também encontrado em outros tipos de células neuronais. regiões da mesma membrana celular podem ser diferentes.12 Especificidade da superíficie celular da retina neural de galinha. Como podemos realizar essa “genética reversa” indo da proteína para o gene? Em primeiro lugar. as membranas dos axônios e da soma do nervo. (C) Seção retinal marcada com anticorpo monoclonal fluorescente que reconhece processos neuronais mas não corpos celulares na retina. por exemplo. é denominado anticorpo monoclonal.13 Mudanças temporais na membrana celular correlacionadas com a morfogênese de uma célula retinal fotorreceptora da Drosophila. A Figura 3. Na verdade. (Cortesia de G. a célula começa a expressar outra molécula da membrana. tendo um único linfócito B como sua fonte original. Da proteína ao gene Como antígenos de diferenciação são proteínas cuja expressão é regulada no tempo e no espaço.13). diferentes antígenos se expressam na membrana celular. 1975). O meio no qual estão crescendo os hibridomas é testado quanto à presença de anticorpos que se ligam à população original das células estranhas. demonstraram numerosos antígenos de diferenciação aparecendo em diferentes tempos e lugares durante o desenvolvimento. (B) Seção de retina marcada com um anticorpo monoclonal fluorescente que reconhece células retinais (mas não outras neuronais).13 mostra mudanças temporais na membrana celular de uma única célula epitelial de Drosophila enquanto ela se desenvolve em um fotorreceptor retinal. não diferenciadas. é característico de fotorreceptores retinais terminalmente diferenciados (Zipursky et al.. Anticorpos monoclonais foram obtidos após injetar camundongos com homogenatos de tecido da cabeça de Drosophila. Tais anticorpos. (Essa é uma coluna de imunoafinidade. Anticorpos monoclonais dirigidos contra tipos específicos de células. e como essas mudanças são freqüentemente correlacionadas com mudanças morfológicas específicas (como mostra a Figura 3.. Essa molécula é encontrada somente nos neurônios que se transformarão em fotorreceptores. e essas podem mudar durante a maturação da célula. o antígeno 24B10. Anticorpos monoclonais podem ser produzidos em grandes quantidades e podem reconhecer antígenos (proteínas. 28H9. as membranas de todas as células da retina neural não são iguais. Cada um dos anticorpos monoclonais reconhece uma molécula diferente na membrana celular. Assim que as células epiteliais. lipídeos e carboidratos) que são fracamente expressos (Köhler e Milstein.14).90 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Segmentos externos de fotorreceptores Somas de fotorreceptores (camada nuclear externa) Camada sináptica externa Camada nuclear interna (soma interneuronal) Camada sináptica interna Soma das células ganglionárias Axônios das células ganglionárias (A) (B) (C) (D) Mas logo em seguida. Nos estágios seguintes (aproximadamente 80 horas mais tarde). e um painel de anticorpos foi testado em células do disco imaginal do olho larval que se diferenciavam em estruturas do olho. 1885. (A) Fotografia de contraste de fase de uma seção da retina neural de um pinto recém-eclodido. (de Venkatesh et al. ligamos anticorpos monoclonais às particulas de resinas e passamos homogenatos de retina em colunas contendo esse material (Figura 3.1984).

. a proteína eluída da matriz do gel é parcialmente seqüenciada.TCC .CAG . na seção retinal 1 Cobrir partículas de resina com anticorpo monoclonal Localização de 24B10 por anticorpo monoclonal marcado com fluoresceína 2 Preparar coluna de imunoafinidade com partículas cobertas Figura 3. O oligonucleotídeo decodificado pela estrutura da proteína não precisa ser um par perfeito com a verdadeira seqüência.) 4 Depois que outros antígenos ( ) passam através da coluna. O DNA de Drosophila de cada clone positivo foi seqüenciado para verificar se esse complementava a seqüência da proteína original isolada pelo anticorpo monoclonal.AGG . essas sondas radioativas foram usadas para selecionar uma biblioteca de clones de DNA recombinante contendo regiões do genoma de Drosophila.AAC . Venkatesh et al.C T T .) 7 Usar essa sonda para selecionar a biblioteca de fago do genoma da Drosophila. 1985. A região do gel contendo a proteína é separada. (de Venkatesh et al. podemos ir de uma rara proteína identificada por um anticorpo monoclonal a um pedaço específico do DNA genômico. (Zipursky et al. separar por eletroforese em gel e corar gel para proteína • • Proteína purificada.14 3 Adicionar homogenato de retina contendo antígeno 24B10 ( ) e outros antígenos ( ) • • Homogenato retinal Protocolo para encontrar o gene que codifica a proteína identificada por um anticorpo monoclonal. antígeno 24B10 5 Eluir proteína purificada 24B10 do gel e seqüenciar o amino terminal Met-Glu-Glu-Thr-His-Tyr-Pro 6 Gerar uma seqüência mensageira possível e sintetizar uma seqüência complementar radioativa AUG . eluir material ( ) remanescente nas partículas..1984. Benzer.C T T .GAA . No caso da 24B10. seqüenciar o clone positivo TCC ATG T T C GAT CGC GAG ATG GAG GAG ACG CAT TAC CCG CCC TGC ACC TAC AAC GTG ATG TGC Ser Met Phe Asp Arg Glu Met Glu Glu T h r His Ty r P r o P r o Cys T h r Ty r Asn Val Met Cys Seqüência esperada 8 Isolar e caracterizar gene .CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 91 Anticorpo monoclonal ao antígeno 24B10 Juntar anticorpo marcado ao antígeno 24B10.GG contaminante.T T G . Por essa via. 1985.CC TAC . É necessário sintetizar oligonucleotídeos radioativos que se ligariam a uma seqüência de DNA capaz de codificar tal proteína.GTC ..GAA . fotografia cortesia de S.

92 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Moléculas de adesão celular Identificando moléculas de adesão celular e seu papel no desenvolvimento Os estudos de distribuição de Holtfreter e Steinberg não identificaram as moléculas envolvidas na adesão celular diferenciada. Várias moléculas de adesão celular (CAMs). cujas propriedades de adesão celular dependem de íons cálcio e as CAMs da superfamília de imunoglobulinas. A tarefa seguinte é identificar as moléculas mediadoras da adesão celular e descobrir como conseguem realizar esse feito. Os íons estabilizam as conformações adesivas de certas proteínas da superfície celular chamadas caderinas. como mostra a tabela abaixo.1 lista algumas CAMs recentemente descobertas. elas integram as células epiteliais em uma unidade mecânica. quatro classes principais de caderinas foram identificadas: Figura 3. Mais ainda. 1968. Contar células radioativas que aderiram ao agregado .16). os agregados foram colhidos. 1987).) Contagem das células radioativas que aderiram ao agregado Célula isotípica marcada com 3 H (cartilagem) Célula heterotípica marcada com 14 C (fígado) Agregado (cartilagem) Rotação por seis horas Células isoladas marcadas em suspensão* Tipo de agregado Cartilagem Fígado Músculo peitoral Cartilagem 100 10 38 Fígado 6 100 49 Músculo peitoral 48 0 100 * Porcentagem do número médio de células coletadas pelos agregados isotípicos. Caderinas Íons de cálcio são freqüentemente necessários para a adesão celular. incubando células de cartilagem marcadas com 3H e hepatócitos marcados com 14C em uma solução em rotação. Esses estudos indicaram que tipos diferentes de células podiam usar diferentes moléculas de adesão. Caderinas têm um papel crítico no estabelecimento e manutenção de conexões intercelulares. As células isoladas. cujos domínios de ligação às células se parecem aqueles de moléculas de anticorpos. Roth et al. Ele modificou o ensaio de agregação rotatório. O complexo caderina-catenina forma a clássica junção aderente que liga as células epiteliais entre si. Caderinas interagem com outras caderinas de células adjacentes e são ancoradas na célula por complexos de proteínas chamados cateninas (Figura 3. como as cateninas se ligam ao citoesqueleto de actina. são colocados em um frasco de cultura giratório contendo células isoladas do mesmo tipo (isotípico) e de tipos diferentes (heterotípico). (Dados de Roth. Experimentos similares estenderam essas conclusões às células do músculo e do fígado (Figura 3. 1971) demonstrou que diferentes tipos de células mostram uma adesão celular seletiva independente da distribuição das células. lavados e determinados os números de células isotípicas e heterotípicas que aderiram ao agregado. Roth (1968.15 Especificidade da associação célula-célula. foram identificadas e agrupadas em duas categorias gerais: as caderinas. Agregados coletores. foram previamente marcadas com diferentes radioisótopos. Após seis horas. A Tabela 3. contendo pequenos agregados de células de cartilagem não marcadas. e parecem ser cruciais para a segregação espacial de células e para a organização da forma animal (Takeichi. isotípicas e heterotípicas.. Em embriões de vertebrados.15). ele demonstrou que os agregados de cartilagem escolheram especificamente células de cartilagem. cada um consistindo de um tipo de célula. Medindo as células marcadas com 14C e 3H nesses agregados.

1989).. neurônios Neurônios de Drosophila Hepatócitos Linfócitos Indutor de células T • • E-caderina (caderina epitelial. P-caderina (caderina de placenta) parece ser expressa primariamente em células placentárias do embrião de mamífero. elas competem com as caderinas normais. caderinas que não têm o domínio extracelular podem interferir com o desenvolvimento. uvomorulina) N-CAM Ng-CAM (a. coração Placenta.k. lentes. rins. Caderinas estão associadas com três tipos de cateninas.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 93 Tabela 3. L1. A-CAM) P-caderina E-caderina (a.k. NILE) Neurofascina CAM-celular LFA-1 CD4 glicoproteína (HIV receptor) Tipo celular Nervos. L-CAM. Presumivelmente.16 Sítio de ligação de cálcio Membrana celular Cateninas Actina Representação esquemática da adesão celular mediada por caderina. rins Glia. epitélio Epitélio. É possível que a P-caderina facilita a conexão do trofoblasto com o útero. Caderina Ligação caderina-caderina Caderina . nervos.a. Mais tarde. mesmo no estágio de uma célula. que fazem contato com a parede uterina (as células trofoblásticas) e o próprio epitélio da parede uterina (Nose e Takeichi. ligando as cateninas disponíveis com seus domínios citoplasmáticos. A importância dessas interações para o desenvolvimento normal é vista na Figura 3. blástula de camundongo CAMs da super família de imunoglobulinas (cálcio-independente) Músculos.a. 1986). Sítios de fosforilação Reconhecimento do sítio de adesão Figura 3. também chamada uvomorulina e L-CAM) é expressa em todas as células embrionárias precoces de mamíferos. essa molécula é restrita a tecidos epiteliais de embriões e adultos.18. pois a P-caderina nas células uterinas é visualizada em contato com a P-caderina das células trofoblásticas de embriões de camundongos (Kadokawa et al.k. As cateninas podem se associar com o sistema de microfilamentos de actina. 1991). (de Takeichi.a.1 Classificação geral das principais moléculas de adesão celular (CAMs) Classe Caderinas (cálcio-dependente) CAM N-caderina (a.

Heasman et al. Todos esses experimentos foram realizados com células cultivadas. e os fibroblastos tratados passam a se ligar fortemente uns aos outros (Nagafuchi et al. elas tornam a expressar N-caderina (Hatta et al. e que a distribuição seria a esperada devido a essa diferença na expressão de caderinas. ao passo que a invaginante placa neural cessa a expressão de E-caderina. em uma camada única (Takeichi et al. mas passa a expressar N-caderina. Shimamura e H. C de Rutishauser. É intensamente expressa nas células do sistema nervoso central em desenvolvimento (Figura 3. Fibroblastos expressando E-caderina aderiram a outros contendo E-caderina..1988). Também. Em embriões nos quais a epiderme e o tubo neural expressam a N-caderina extra.1987). Takeichi..17. Takeichi (1987) demonstrou que células retinais expressam N-caderina e células hepáticas expressam E-caderina..5 dias. que não expressam habitualmente qualquer tipo de caderina.) N-caderina (caderina neural) é vista inicialmente nas células mesodérmicas no embrião em gastrulação enquanto elas perdem sua expressão de E-caderina. 1995). elas perdem a expressão de N-caderina (veja Figura 3. Expressão diferencial de caderina pode também explicar os dados de distribuição homotípica discutida anteriormente. Entretanto. migrando como células individuais (para formar células pigmentadas. Matsunami. os fibroblastos expressando E-caderina foram integrados nos túbulos epiteliais pulmonares (que expressam E-caderina). quando as células migrantes chegam ao seu destino e começam a se agregar entre si para formar gânglios nervosos. Essa ligação é chamada ligação homofílica. enquanto deixam o tubo neural. enquanto que os fibroblastos não tratados se associaram às células mesenquimatosas (que não expressam caderinas) (Nose et al.17. N-caderina é freqüentemente expressa em células que normalmente não a possuem. Hatta e Takeichi. Ele também sugeriu que as observações de Townes e Holtfreter poderiam ser. enquanto anticorpos para N-caderina foram marcados com um segundo tipo de corante (que emite sua cor em outros comprimentos de onda). Em seguida. 1986). Assim. quando tecido pulmonar embrionário foi dissociado e sua recombinação permitida na presença de fibroblastos levando E-caderina ou de fibroblastos sem tratamento. Mais ainda.. Lee e Gumbiner. da mesma forma. 1988. Suporte para essa idéia veio de estudos nos quais diferentes genes de caderina foram transfectados em fibroblastos de camundongo. veja também Capítulo 7). 1994. Os embriões que expressam N-caderina extra são muitas vezes caracterizados por amontoados de células e camadas tissulares engrossadas.94 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) (B) Ectoderma Crista Neural Células migratórias Tubo neural E-caderina N-caderina (C) Figura 3. Quando o mRNA para N-caderina de galinha é injetado em um dos dois blastômeros da primeira clivagem em embrião da rã Xenopus. Na verdade essas células começam a se portar como células epiteliais. o tubo neural não se separa da epiderme (Detrick • .. ligando-se ao mesmo tipo de caderina em outra célula. e anticorpos univalentes contra caderinas converterão um agregado de células tridimensional histotípico.1987). cortesia de M. inicialmente expressam N-caderina. Expressão de caderinas é freqüentemente correlacionada com agregação e dispersão. e se separarão de outras células contendo N-caderinas em suas membranas. a epiderme expressa E-caderina e as células da crista neural nenhuma das duas. Roth e colaboradores demonstraram que células de fígado tendem a coletar células de fígado e que células retinais coletam outras células retinais. Anticorpos para E-caderina foram marcados com um tipo de corante fluorescente (o qual fluoresce em um intervalo de comprimento de onda). • EP-caderina (C-caderina) é crítica na manutenção da adesão celular entre os blastômeros da blástula de Xenopus e é necessária para os movimentos normais de gastrulação (Figura 3. Caderinas promovem a aderência celular. Fotografias obtidas em diferentes comprimentos de onda. o tubo neural (que expressa N-caderina) se separa das células que se transformarão em epiderme (a qual expressa E-caderina).18. neurônios sensoriais e outros tipos de células). enquanto fibroblastos de P-caderina se ligavam a outros que expressavam P-caderina. mostram que o ectoderma externo expressa E-caderina predominantemente. Normalmente. Foi usada marcação imunofluorescente dupla para localizar E-caderina (A) e Ncaderina (B) na mesma seção transversal do cérebro posterior de um embrião de camundongo de 8. (Fotografias de K. estudos in vivo mostraram que caderinas podem ter um papel crítico nos fenômenos de distribuição ocorrendo dentro do embrião. 1979).17 Localização de duas diferentes caderinas durante a formação do tubo neural no camundongo. Células da crista neural (que estão na porção mais dorsal do tubo neural). Como foi discutido. explicadas por expressão diferencial de caderinas. Células expressando N-caderinas rapidamente se isolam de células N-caderina-negativas in vitro. células com E-caderina grudam em outras células que têm Ecaderina. ele expressa N-caderina. Recentemente. E-caderina é vista em suas superfícies celulares. quando genes ativados de Ecaderina são transfectados em fibroblastos de camundongo cultivados e neles expressos (usualmente eles não expressam essa proteína). (C) quando se forma o tubo neural.

N-CAM parece ser crítica para o empacotamento (fasciculação) de axônios para que se movimentem como uma unidade.. 1977) que levou ao isolamento de uma molécula de adesão de células neurais (N-CAM). 1990.1970).18 Importância de caderinas em manter a coesão entre células em desenvolvimento. (Os anticorpos bivalentes tiveram que ser quebrados. Assim. Uma situação similar parece ocorrer em insetos. 1990). tendo um papel principal na organização das células em tecidos. B de acordo com Kintner et al. Heasman e C. prepararam anticorpos contra Dictyostelium e os quebraram quimicamente de modo que somente suas regiões monovalentes ligantes de antígeno permanecessem – os fragmentos Fab. anticorpos foram usados inicialmente para identificar moléculas de adesão celular em Dictyostelium. Anticorpos à N-CAM podem quebrar essas ligações. Em embriões controle (direita).. 1992.. Esses outros membros da superfamília têm estruturas semelhantes às imunoglobulinas. porque de outra maneira eles poderiam artificialmente agrupar células e o efeito não poderia ser medido). Além disso.. provavelmente. uma “família”. as células internas permanecem juntas. essas glicoproteínas são chamadas CAMs da superfamília de imunoglobulinas*. 1994. Kintner.html] CAMs da superfamília de imunoglobulinas Como discutimos no Capítulo 1. Gerisch e colegas (Beug et al. e é mesmo possível que as imunoglobulinas sejam derivadas desse grupo de CAMs (Williams e Barclay...19).1988). (B) No estágio de quatro células.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 95 (A) (B) Figura 3. Essa estrutura extracelular com seus domínios globulares imobilizados por pontes dissulfeto.. as células centrais dispersam quando o hemisfério animal é removido. As CAMs da superfamília de imunoglobulinas podem ter um papel importante no desenvolvimento do sistema nervoso. Tosney et al. Isso levou à descoberta de uma glicoproteína de 80-kDa que é mediadora da adesão célula-célula durante a agregação no fungo pegajoso.. onde * A designação superfamília é freqüentemente usada porque as diferentes classes de moléculas de imunoglobulinas também constituem. N-CAM é necessária para uma ligação adequada de axônios às células musculares alvos (Covault e Sanes. 1989). 1988. Durante a neurulação as células com a proteína mutante não formam uma camada coerente. Assim.) et al. se assemelha à molécula de imunoglobulina. (de Heasman et al. (A) Quando oócitos são injetados com oligonucleotídeos antisense contra uma mensagem de caderina herdada maternalmente. A mesma estratégia foi usada por Edelman e seus colaboradores (Brackenbury et al. os blastômeros que formam o lado esquerdo do sapo são injetados com um mRNA para N-caderina que não tem a região extracelular da caderina. Fujimori et al. Landmesser et al. elas mesmas.1986). 1988. as caderinas estão. [cell2. mas não são exatamente família “próxima”. fotografias cortesia de J. . permitindo que os axônios se dispersem (Fraser et al. [cell3. Lander. 1986.html] N-CAM é um membro de uma classe de CAMs que não necessitam íons de cálcio e que têm uma estrutura semelhante (Figura 3.

a molécula de adesão celular de insetos. (A) Estrutura em andaime dos axônios fasciculados em um embrião de gafanhoto como visto em um microscópio de Nomarski. cortesia de C. 1994). Sua âncora na membrana pode ser a seqüência de aminoácidos de uma proteína transmembrana ou um lipídeo. enquanto o anticorpo em (C) se liga a uma glicoproteína de membrana dos mais longitudinais fascículos de axônios.20 as CAMs da superfamília de imunoglobulinas. A forma da molécula de IgM ligada à membrana tem duas cadeias pesadas. (A) N N N N N N ou N Domínios semelhantes à imunoglobulina Domínios semelhantes à fibronectina Extracelular ou Citoplasma CC IgM C N-CAM ou fasciclina II C L1 ou neurogliana N ou C Interações de N-CAM célula-célula Figura 3. (B. e mutações de L1 no homem causam um espectro de anomalias caracterizada por hidrocefalia. e duas cadeias leves. L1 é necessária para a produção de certos axônios (Lemmon et al. (B) Modelo para a adesão das CAMs da superfamília de imunoglobulinas. 1989). N-CAM é um polipeptídeo com cinco domínios. Expressão diferencial de CAM é crítica nos limites entre dois grupos de células. 1987. L1 é uma proteína transmembrana com seis domínios globulares. cada uma com cinco domínios. o corpo segrega diferentes células em diferentes regiões. Fasciclina II. ISN é um neurônio intersegmental e con é um neurônio conectivo. 1988).96 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 3. (A) Três membros da superfamília de imunoglobulinas. Note que o anticorpo marca somente uma porção de cada axônio. respectivamente. Células da notocorda não entram no tubo neural e nem células dermais trespassam para a epiderme. Expressão de fasciclina no sistema nervoso do gafanhoto em desenvolvimento. e neurogliana se assemelham a N-CAM e L1. (de Bastiani et al.C) Sistema nervoso embriônico como em (A).. Goodman..) (A) (B) (C) . mas marcado com anticorpos monoclonais feitos para as glicoproteínas fasciclinas da superfície celular.20) ajudam a migração de axônios (Harrelson e Goodman. Nesses lugares.. cada uma com dois domínios.19 (B) Moléculas de adesão da superfamília de imunoglobulinas. O anticorpo em (B) reconhece um subconjunto de axônios nas comissuras anterior e posterior. A com e P com são as comissuras anterior e posterior cujos axônios atravessam o segmento. As flechas mostram os mesmos locais em (B) e (C). retardamento mental e inabilidade em controlar movimentos dos membros (Vits et al. chamadas fasciclinas (Figura 3.

começam a expressar N-CAM e se juntam para formar um agregado (Figura 3. (C) Compartimento formado por proteínas da junção de fenda entre células que se comunicam umas com as outras. As células ectodérmicas estão ligadas entre si por E-caderina.22A. e pequenas moléculas (MW<1500) e íons podem passar livremente de uma célula para outra. como resultado de sua habilidade para expressar N-CAM. Essa segregagação pode ser conseqüência da diferença de CAMs nas populações adjacentes. Lo. cortesia de C.B). (A) Moléculas da junção celular: proteínas da junção em fenda Junções em fenda são regiões intercelulares especializadas onde células adjacentes se encontram entre 15-40 nm de distância. diferentes grupos de células se separam umas das outras. (A de Peracchia e Dulhunty. 1992. B de Sainio et al. Esse compartimento na gástrula de camundongo pode ser visto injetando o corante Lucifer Yellow em um célula e observando sua transferência a um pequeno grupo de células. 1988. Células assim ligadas são chamadas “acopladas”. C de Kalimi e Lo.21). E-caderina.21 Distribuição de diferentes CAMs em bordas tissulares. pelo menos alguns (B) (B) (D) Figura 3. 1985a. Edelman). enquanto as células mesenquimatosas. Finas conexões servem como canais de comunicação entre células adjacentes (Figura 3. (D) Estrutura da subunidade da junção em fenda. cortesia de C.b). cortesia de G. ou ambas as proteínas (Chuong e Edelman. Na maioria dos embriões. 1976. (de Chuong e Edelman. cortesia de K.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 97 Figura 3. Sainio. Por exemplo.22 Espaço intracelular (15-40 nm) Canais de comunicação Membranas celulares Conexões (A) (D) Proteínas das junções em fenda. 1986. Através do desenvolvimento da pena. 1985a.) . CAM-negativas anteriormente. (B) Micrografia fluorescente de junções em fenda em túbulo renal de embrião de camundongo de 17 dias. penas são induzidas quando células mesenquimatosas derivadas do mesoderma se agrupam para formar uma bola de células imediatamente abaixo da epiderme da pele da galinha.. Enquanto as células mesodérmicas se reúnem para induzir o broto das penas no ectoderma. as células mesenquimatosas recémagregadas expressam N-CAM (A) e as células ectodérmicas expressam E-caderinas (B) nas suas respectivas membranas celulares. Peracchia. D conforme Darnell et al.. (A) Micrografia eletrônica de uma fileira de junções em fenda ligando duas células justapostas.

dessa forma permitindo que íons e pequenas moléculas solúveis passem livremente entre eles. O lado formado pelo blastômero injetado não tem o olho e tem uma morfologia cerebral anormal. a comunicação entre células. 1987). (de Warner et al. foi injetado com (A) um anticorpo controle ou (B) um anticorpo contra a proteína da junção em fenda. 1984. Lee et al. Existem aproximadamente doze tipos de conexinas. Jongen e colaboradores (1991) observaram que em células acopladas por E-caderina.. Se a compactação for inibida por anticorpos contra proteínas da junção em fenda.. Os canais da junção em fenda são feitos de proteínas chamadas conexinas.22 C). no desenvolvimento normal. mas parcialmente sobrepostos.. Mesmo que a perda da proteína conexina-43 possa ser compensada em muitos tecidos. 1989).. essas oito células se movem juntas para formar um embrião compacto. o desenvolvimento posterior cessa.1995). Em cada célula. aquela célula não formará junções em fenda e não será incluída no embrião (Bevilacqua et al. depende da função de caderinas. Warner. esses camundongos têm respiração convulsiva. se os genes da conexina-43 forem derrubados por endereçamento de genes. [cell4.22D). cria “compartimentos” fisiológicos dentro do embrião em desenvolvimento (Figura 3.html] A membrana celular tem. Os diferentes tipos de proteína conexina têm papéis separados. permitindo que se juntem os citoplasmas de ambas as células (Figura 3. Seção de um girino de Xenopus no qual um dos blastômeros.23). vários mecanismos pelos quais pode fazer ligações com membranas de outras células. mediada por junções em fenda. Evidências sugerem que caderinas permitem não só o contato entre as células como também modificam as proteínas tipo conexina. no estágio de oito células. Mas. 1984). Os blastômeros tratados continuam a dividir-se. Podem ser usadas CAMs da superfamília de Figura 3. mas foi incapaz de se desenvolver de maneira normal (Warner et al. seis conexinas idênticas da membrana se agrupam para formar um canal transmembrana contendo um poro central. A progênie de tal célula não morreu. A importância de junções em fenda no desenvolvimento foi demonstrada em embriões de anfíbios e mamíferos (Warner et al. mas a compactação não ocorre (Lo e Gilula. agora não podia permitir a passagem de íons ou moléculas pequenas de uma célula à outra. cortesia de A. Entretanto. Ainda mais.) . 1979. e algumas podem ser reguladas por caderinas. A habilidade de células em formar junções em fenda com algumas células.. O complexo de junção em fenda de uma célula se conecta ao complexo de junção em fenda de outra célula. E. a progênie daquela célula que usualmente está ligada por junções de fenda. a proteína de junção em fenda conexina-43 é encontrada em quase todos os tecidos do embrião do camundongo em desenvolvimento. Autópsia desses animais mostra que o ventrículo direito – a câmara que bombeia sangue aos pulmões através da artéria pulmonar – está cheio de tecido que fecha a câmara e impede o fluxo de sangue (Reaume et al. parece que ela é crítica para o desenvolvimento normal do coração. os oito primeiros blastômeros são conectados entre si por junções em fenda.23 (B) Efeitos da junção em fenda no desenvolvimento. Se RNA antisense contra as mensagens da junção em fenda é injetado em um dos blastômeros de um embrião normal de camundongo. Quando anticorpos contra proteínas da junção em fenda foram microinjetados em uma célula específica de uma blástula de Xenopus de oito células. se tornam cianóticos e morrem. 1984). então. No embrião de camundongo.. o embrião ainda se desenvolverá. Apesar de frouxamente associadas entre si. e não com outras. os girinos que resultaram das blástulas tratadas mostraram defeitos especificamente relacionados ao destino desenvolvimental da célula injetada (Figura 3. Parece que a função da proteína conexina-43 pode ser assumida por outras conexinas. logo após o nascimento.98 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) dos blastômeros precoces estão ligados por junções em fenda. Por exemplo.

Trelsted. Durante a última década foi demonstrado que esse tipo de interação é muito importante para a migração celular. quando cessar a migração e qual rota tomar. e essas moléculas orientam a célula para quando e onde migrar. mas os principais parecem envolver substâncias na matriz extracelular.2). ela pode separar dois grupos adjacentes de células e prevenir qualquer interação. Essas moléculas interagem de modo a formar uma estrutura insolúvel que pode ter várias funções no desenvolvimento. [cell5. Cada tipo de célula migratória prefere certas combinações de moléculas da matriz a outras combinações. ou seja. Juntas. ou pode até induzir diferenciação em certos tipos celulares. pode interagir com seus substratos através do sistema chave-fechadura. Existem muitos sinais que o ambiente pode dar às células. a célula também pode se ligar a componentes específicos da matriz extracelular. depende da percepção de quando começar a migração.24. O relacionamento entre a proteína da membrana celular e a molécula da matriz seria semelhante aquele entre enzima e substrato ou anticorpo e antígeno. as células mesenquimatosas secretam uma frouxa lâmina reticular. Como já mencionado. essas camadas constituem a membrana basal da lâmina de células epiteliais. a matriz extracelular pode servir como o substrato no qual as células migram. Em algumas situações. por vezes. enquanto as células mesenquimatosas secretam a lâmina reticular feita primariamente de colágeno. (Cortesia de R. CAMs dependentes de cálcio e proteínas de junção.24 Lâmina basal Colágeno Localização e formação da matriz extracelular no embrião de galinha. Weiss (1945) e Tyler (1946) sugeriram que a célula. Epitélio Figura 3.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 99 imunoglobulinas. Em outros casos. proteoglicanos e glicoproteínas grandes que são chamadas moléculas de adesão a substrato (Tabela 3.html] A matriz extracelular A matriz extracelular consiste de macromoléculas secretadas pelas células no seu ambiente imediato. As células epiteliais formaram uma apertada camada extracelular chamada lâmina basal. Mas isso não esgota seu repertório. Agora voltamos nossa atenção para esses componentes. entre a membrana celular e a matriz extracelular. Um tipo de matriz é mostrado na Figura 3. A base molecular da afinidade célula-substrato Afinidade diferencial a substrato A migração de células.) . L. Existem três componentes principais na maioria de matrizes extracelulares: colágeno. uma lâmina de células epiteliais está adjacente a uma camada de tecido mesenquimatoso frouxo. A hipótese da afinidade diferencial a substrato postula que diferentes células reconhecem diferentes moléculas em várias matrizes extracelulares. A micrografia eletrônica de varredura mostra a matriz extracelular na junção das células epiteliais (acima) e mesenquimatosas (abaixo). Aqui. As células epiteliais sintetizam uma lâmina densa com base de glicoproteína. como a migração de pássaros e borboletas monarca.

Na lâmina basal predominam os proteoglicanos que formam uma peneira molecular além de propiciar suporte estrutural. MOLÉCULAS DE ADESÃO DE SUBSTRATO Laminina. A interconexão de proteína e carboidrato forma uma matriz semelhante a uma rede. e também está implicado na ramificação dos túbulos epiteliais nas glândulas salivares. Usualmente.100 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Tabela 3. enquanto tendões.3 lista os glicosaminoglicanos mais comuns. São tipos específicos de glicoproteínas nas quais: (1) o peso dos resíduos de carboidratos é muito maior do que o da proteína. que contêm predominantemente fibras de colágeno. e em muitos tipos de células móveis. a estrutura básica dos proteoglicanos é mostrada na Figura 3. Proteoglicanos sulfatados compreendem uma proteína linear interna à qual estão ligadas cadeias de um ou mais glicosaminoglicanos sulfatados (condroitina.25. colágeno IV e glicosaminoglicanos. Vasos sangüíneos apresentam colágeno Tipo III. condronectina e tenascina. A Tabela 3. pulmões e outros órgãos. e o Tipo IV é encontrado na lâmina basal produzida por células epiteliais (Vuorio. Um trímero de glicoproteína com sítios de adesão para a membrana celular. Colágenos proporcionam força e estabilidade aos tecidos. Elas incluem fibronectina. queratan e dermatan sulfato). um dos açúcares do dissacarídeo tem um grupo amino e a unidade repetitiva é chamada glicosaminoglicano (GAG). e V-XIII são também encontradas) que se organizam para formar fibrilas. Colágeno Tipo I.2 Principais constituintes da matriz extracelular Matriz extracelular mesenquimatosa Lâmina basal das células epiteliais COLÁGENOS Moléculas longas e delgadas (Tipo I é o mais comum. o componente funcional majoritário da lâmina basal. 1990. [cell6. Colágeno é importante para a formação da lâmina basal. PROTEOGLICANOS DA MATRIZ Ácido hialurônico e proteoglicanos sulfatados são freqüentes na lâmina basal. MOLÉCULAS DE ADESÃO DE SUBSTRATO Moléculas às quais células aderem permitindo-lhes que se movam. COLÁGENO IV Os componentes estruturais majoritários da lâmina basal. é macia. mas também é encontrado na notocorda e no corpo vítreo do olho. perfaz quase 90 porcento do colágeno do corpo. Colágeno é uma família de glicoproteínas contendo altas porcenta- gens de resíduos de glicina e prolina. são rígidos. especialmente em cartilagem. sua disponibilidade sugere que podem ter outras propriedades não conhecidas. Cartilagem. Colágeno Tipo II é mais evidente como secreção das células cartilaginosas. Existem numerosos tipos de colágeno servindo funções especiais. uma enorme molécula (108 Da) que liga grandes quantidades de água. Sua presença pode facilitar a passagem de produtos secretados pela lâmina. tendões e ossos. Ao contrário de outros colágenos.html] PROTEOGLICANOS. A consistência da matriz extracelular depende da relação entre colágeno e proteoglicanos. Proteoglicanos estimulam e modulam movimentos celulares. o proteoglicano envolve as células impedindo que elas se juntem (Figura 3. que é o principal suporte estrutural de quase todos os órgãos dos animais. Tipos II. . Lâmina basal pode conter fibronectina. Fonte: Adaptado de Bard. PROTEOGLICANOS DA MATRIZ Compostos de proteínas e dissacarídeos repetitivos (glicosaminoglicanos). suas fibrilas são como um fino “arame de galinheiro” e se organizam em um substrato semelhante a feltro. usualmente com 60-70 nm de diâmetro. Outros tipos de colágeno são encontrados ao longo do corpo. que tem uma alta porcentagem de proteoglicanos. heparan. tenascina. 1986).26). nidogen e outras glicoproteínas adesivas. encontrado nas matrizes extracelulares da pele. Quase metade das proteínas do corpo são constituídas de colágeno. COLÁGENO. III. Glicosaminoglicanos incluem ácido hialurônico. (2) os carboidratos são cadeias lineares compostas de dissacarídeos repetitivos.

Entretanto. artérias. 1981. Glicoproteínas ligantes estabilizam essas últimas associações. O dissacarídeo repetitivo do glicosaminoglicano (tal como condroitina sulfato. veja Tabela 3. para produzir as cadeias de proteoglicanos. corpo vítreo Cartilagem. córnea. algumas regiões de cada GAG podem ter sacarídeos ligeiramente modificados.25 Glicoproteínas ligantes Agregados de proteoglicanos A estrutura da subunidade e a montagem de um proteoglicano complexo. Essas cadeias podem ser conectadas por glicosamino-glicanos mais longos (mostrado aqui como ácido hialurônico) para produzir redes complexas. superfície celular a Essas são unidades repetitivas típicas desses glicosaminoglicanos. . córnea Pulmão. osso.3) se liga a um esqueleto protéico relativamente pequeno (colorido).3 Unidades dissacarídicas repetitivas de glicosaminoglicanos mais comuns encontradas em proteoglicanos da matriz Unidade dissacarídica repetitivaa Distribuição Glicosaminoglicano Ácido hialurônico Condroitina sulfato Dermatan sulfato Queratan sulfato Heparan sulfato Ácido glucurônico-Nacetilglucosamina Ácido glucurônico-Nacetigalactosamina sulfato [Ácido glucurônico ou idurônico] N-acetilgalactosamina sulfato Galactose-N-acetilglucosamina sulfato [Ácido glucurônico ou idurônico] N-acetilglucosamina sulfato Tecidos conjuntivos.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 101 Monômeros de proteoglicanos Pequenos glicosaminoglicanos (tal como condroitina sulfato) Proteína esqueleto Ácido D-glucurônico N-acetil-D-glucosamina Ácido hialurônico Ácido hialurônico Glicosaminoglicano Figura 3. artérias Pele. vasos sangüíneos Cartilagem. coração.) Tabela 3. (Modificado de Cheney e Lash.

sintetizada por fibroblastos. Mioblastos em cultura excluem pequenas partículas (nesse caso. condrócitos. eles reúnem células soltas para formar uma lâmina epitelial* (San Antonio et al. cortesia de B. 1989. tais como: fibronectina. de proteoglicanos. Matrizes extracelulares contêm uma va- riedade de outras moléculas especializadas. Bernfield e Sanderson. Uma maneira pela qual cadeias de glicosaminoglicanos.102 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) (B) (D) (C) Figura 3. .. de modo a ser possível a ligação com o receptor (Massagué. cortesia de N.. e isso concentra o fator de crescimento localmente. podem funcionar é reter e apresentar fatores de crescimento para receptores celulares. Níveis excessivos de glicose inibem a síntese do esqueleto de proteína do proteoglicano.1985). (B) quando os mioblastos são tratados com hialuronidase (a qual dissolve ácido hialurônico). Thesleff et al. as células produtoras de cartilagem. Leonard e colaboradores (1989) propuseram esse como um possível mecanismo para explicar problemas esqueléticos em crianças nascidas de mães severamente diabéticas.. Em alguns casos.) Proteoglicanos também são importantes como mediadores de conexões entre tecidos adjacentes em um órgão. Fatores de crescimento são proteínas semelhantes a hormônios que regulam mitose ou diferenciação quando se ligam a determinadas células.. Toole. Vainio et al. inibindo a formação da cartilagem. Uma função da fibronectina é servir como adesivo *Proteoglicanos de heparan sulfato são considerados como agregadores de condrócitos... proteoglicanos e células em uma estrutura ordenada. Essas glicoproteínas grandes provavelmente são responsáveis pela organização de colágeno. hemácias fixadas) em distância significante da borda celular. 1989. No órgão. (A-C de Orkin et al. o receptor celular para o fator de crescimento freqüentemente não liga o fator com grande afinidade.26 Capa de proteoglicanos envolvendo células móveis. das células de Schwann associadas (Ratner et al.1991). (D) Micrografia eletrônica de hialuronidato em solução aquosa mostra uma rede fibrilar ramificada. 1990). GLICOPROTEÍNAS EXTRACELULARES. proteoglicanos secretados por um tipo de célula são essenciais para o crescimento de células vizinhas. M. Axônios dos gânglios da raiz dorsal têm proteoglicanos de heparan sulfato entre suas proteínas da superfície celular. o fator é inicialmente ligado pelos carboidratos do proteoglicano. macrófagos e certas células epiteliais (como hepatócitos e amniócitos). (A) Capa de hialuronidato envolve mioblastos de galinha. Na verdade. 1982. 1985. muito grande (460-kDa). laminina e tenascina. 1991. D de Hadler et al. Yayon et al. células endoteliais.. a remoção desses proteoglicanos impede a proliferação ao seu redor. (C) A capa também desaparece quando os mioblastos cessam a divisão e se juntam enquanto se diferenciam. Fibronectina é um dímero de glicoproteína. Hadler. Entretanto. essa capa extracelular desaparece.1987.

o sítio RGD e o sítio de alta afinidade. Domínios ligantes de células para fibroblastos Sítio II ligante de heparina Sítio II ligante de fibrina . Se essa região for cortada e sofrer uma rotação. 1988a. B conforme Dufour et al. Lash. Heparan e heparan sulfato são nomes dados a glicosaminoglicanos similares encontrados na matriz extracelular ou na superfície da célula.27). É composta de três cadeias peptídicas. Tenascina (também chamada citotactina) se assemelha a fibronectina em mais ou menos metade Figura 3.1981). O colágeno ligado por laminina é do Tipo IV (específico para lâmina basal). glicosaminoglicanos e células. Outras regiões na fibronectina permitem ligações com colágeno. a fibronectina parece ter um papel principal na migração das células precardíacas para a linha mediana do embrião. que interagindo com as moléculas apropriadas produz um alinhamento adequado de células e sua matriz extracelular (Figura 3. a laminina tem um papel na montagem da matriz extracelular.b). ligando células a substratos. 1990).27 (A) (B) H 2N Domínio ligante de fibrina e heparina Domínio ligante de colágeno Sítio de alta afinidade Domínios para ligação de células da crista neural de aves RGDS CS1 COOH Fibronectina no embrião de galinha em desenvolvimento. as células precardíacas não migram para a linha mediana e desenvolvem dois corações separados. mudando a forma da célula e permitindo a migração celular (Hakomori et al. (A) Anticorpos fluorescentes para fibronectina mostram que a deposição de proteína no embrião de 24 horas se situa ao longo da lâmina basal de muitos órgãos.. e a região ligante de células da laminina reconhece principalmente células epiteliais e neurônios. Fibronectina também organiza a matriz extracelular por ter vários pontos de ligação distintos. Células da crista neural de aves têm outro sítio necessário para sua mobilidade em um substrato de fibronectina. Se embriões de galinhas são injetados com anticorpos à fibronectina. (A cortesia de J. (B) Estrutura e domínios de ligação na fibronectina.) *Heparina é uma porção de um proteoglicano de heparina secretada por mastócitos e basófilos. As “rodovias” pelas quais se movem certas células migratórias são pavimentadas com essa proteína.. pode se ligar ao colágeno. também migram sobre células que secretam fibronectina em suas superfícies (Heasman et al. ambos são essenciais para ligação da célula. e o movimento dessas células cessa quando a fibronectina é localmente removida. Como será visto em capítulos posteriores. Os retângulos representam domínios resistentes a proteases. precursoras de embriões do sapo. os precursores do coração. A migração de células mesodérmicas na gastrulação é vista na superfície de fibronectina em muitas espécies. Outros tipos de células. Anticorpos fluorescentes à fibronectina demonstraram um gradiente da proteína no caminho de migração entre o endoderma e o mesoderma.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 103 molecular em geral. tais como: colágeno e proteoglicanos. O domínio para a ligação de fibroblastos compreende duas unidades. Laminina é um componente principal da lâmina basal.. promovendo adesão celular e crescimento. Presume-se que os sítios de ligação para heparina sejam os mesmos que os para heparan sulfato (Bernfield e Sanderson. Em embriões de galinha. Nem todas grandes glicoproteínas celulares promovem adesão celular. fibronectina tem também um papel importante na migração celular. as células do coração seguem o gradiente para novas posições se afastando da linha mediana (Linask e Lash. como fibronectina.1984). A adesão de células epiteliais à laminina (na qual elas se assentam e usam) é muito maior do que a afinidade de células mesenquimatosas pela fibronectina (à qual elas devem se ligar e liberar se deverá haver migração). Como a fibronectina. 1988. como as células germinativas. e. heparina* e outras moléculas da matriz extracelular. migram na fibronectina para se mover das laterais do embrião para a linha mediana. Assim. as células precardíacas.

1987). duas proteínas que se ligam aos microfilamentos de actina. enquanto a integrina PS2 está na superfície superior do epitélio na asa presuntiva Figura 3. Cada molécula de integrina tem duas subunidades distintas.. Ambas as unidades α e β são necessárias para a ligação com fibronectina ou laminina.. a integrina se liga à talina e α-actinina. A importância de integrinas é dramaticamente ilustrada durante a embriogênese de Drosophila. como também proteínas do citoesqueleto dentro da célula. 1987). 1987. A integrina PS1 está situada na superfície basal do epitélio na asa presuntiva dorsal. outras são arrebanhadas e se desligam da tenascina (Figura 3.1990). Horwitz e colaboradores (1986.. No desenvolvimento da asa da Drosophila. 1988. Como as integrinas de vertebrados. O resultado mostra que fibronectina foi o substrato preferido no plástico da cultura de tecidos. fibronectina e laminina (Ruoslahti e Pierschbacher.. Receptores celulares para moléculas da matriz extracelular INTEGRINAS. serve como um sítio de ancoragem para os microfilamentos de actina que movimentam a célula. Spring et al. 1985). 1986) denominaram essa família de receptores protéicos como integrinas porque elas integram as plataformas intra e extracelulares permitindo que funcionem conjuntamente. as subunidades β são idênticas. Knudsen et al. fora da célula. 1993). Essa ligação dupla permite o movimento da célula pela contração dos microfilamentos de actina contra a matriz extracelular fixa (veja Wang et al.. Os principais receptores de fibronectina foram purificados usando anticorpos monoclonais que bloqueiam a ligação das células à fibronectina (Chen et al. enquanto que as células não aderiram ou migraram bem sobre a tenascina. enquanto α4β1 se liga somente à fibronectina. (Cortesia de M.. tenascinas parecem aumentar a síntese e secreção de proteases das células que nela se localizam (Werb et al.29). as integrinas de Drosophila são compostas de subunidades α e β que atravessam a membrana celular. É possível que essa protease quebre a ponte entre o receptor de fibronectina e o citoesqueleto (Beckerle et al. mas somente a unidade β conecta com o citoesqueleto interno. Hemler. Entretanto. podem ser continuamente quebradas e refeitas por uma protease que cliva talina e está especificamente localizada em sítios da membrana celular onde a integrina se liga ao substrato. Tipos diferentes de células podem ter diferentes moléculas de integrinas com diferentes afinidades por moléculas da matriz extracelular (Hemler et al. Ambas as características podem ser importantes na geração de vias para a migração celular. Chiquet. que se torna o lugar de ligação na célula para essas grandes moléculas. α e β. Fibroblastos foram adicionados às placas podendo aderir e migrar. 1990). mas as subunidades α são diferentes. Essas duas integrinas freqüentemente funcionam em conjunto efetuando adesão tissular e celular durante o desenvolvimento.104 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento do comprimento da molécula. Nas duas integrinas de Drosophila que são conhecidas. Durante a migração. diferentes células reagem de maneira diferente à tenascina. Diferentes quantidades relativas de fibronectina e tenascina podem gerar substratos de vários graus de adesividade. Tamkun et al. Dentro da célula. A habilidade de uma célula em ligar essas glicoproteínas adesivas depende da sua capacidade em expressar um receptor da membrana. BronnerFraser. Além disso. integrina se liga à seqüência arginina-glicina-aspartato (RGD) de várias proteínas adesivas em matrizes extracelulares. α2β1 se liga ao colágeno e laminina.. Foi observado que o complexo receptor de fibronectina é capaz não só de ligar fibronectina no exterior da célula..1985. No lado extracelular. e é encontrada transitoriamente em várias matrizes extracelulares durante o desenvolvimento embrionário. incluíndo vitronectina (encontrada na lâmina basal do olho).. Proteínas integrinas foram encontradas atravessando a membrana de numerosos tipos de células. 1987. Por exemplo. e na remodelação da matriz extracelular durante o desenvolvimento (Tan et al.28 Inibição de adesão celular por tenascina. e diferentes combinações binárias das subunidades α e β permitem que a integrina se ligue a determinadas moléculas extracelulares. 1989). duas lâminas epiteliais são aproximadas.28.) . as ligações unindo a unidade β da integrina ao citoesqueleto. Então. 1990). parece que o complexo receptor de fibronectina atravessa a membrana celular e une dois tipos de matrizes. dispostas em forma de letras. Fibronectina e tenascina foram colocadas em placas de cultura de tecidos. Algumas células aderem a ela. se liga à fibronectina da matriz extracelular (Figura 3. Wehrle e Chiquet. No lado citoplasmático.

1987. Devem existir muitas galactosiltransferases com afinidades para diferentes moléculas aceptoras. Enquanto o receptor integrina se liga a uma seqüência RGD na cadeia A de laminina.. e sua adesão à matriz extracelular representa uma catálise “frustrada” (Figura 3. As glicosiltransferases de membrana reconhecem o carboidrato receptor nas α Actinina Microfilamento de actina Figura 3. existe uma deficiência nos genes codificando a subunidade β das integrinas de Drosophila. cada uma específica para um dado açúcar e algumas mostrando também especificidade de substrato. galactosiltransferase é uma enzima capaz de transferir galactose de um molécula doadora ativada (UDP-galactose) a uma unidade aceptora. Essas enzimas ligadas à membrana são rotineiramente encontradas no retículo endoplasmático e nas vesículas de Golgi. Wilcox et al.1989). 1992. Algumas mutações de integrinas em Drosophila são letais. enquanto a afinidade por laminina de seu receptor epitelial é muito mais alta (Kd=2 x10-9 M). As fibras de actina irradiam da grade ordenada do citoesqueleto para o lamelapódio. (A) Imunofluorescência indireta corando os microfilamentos de actina de uma célula extendendo um lamelapódio. outro receptor protéico de laminina na membrana celular se liga a uma seqüência diferente (Y1GSR) na cadeia B1 (Graf et al. Yow et al. Galactosiltransferases são enzimas funcionais da membrana celular. Mutações nas integrinas produzem asas com regiões onde os dois epitélios se separam. Outro grupo de proteínas que pode aderir células a proteínas da matriz extracelular são as glicosiltransferases da superfície celular. e os músculos somáticos se contraem em esferas sem ligantes para a parede do corpo e do intestino (Leptin et al. porque integrina é necessária para anexar músculos à epiderme e à parede do intestino. Na ausência dessa subunidade. cortesia de E. como evidenciado por bolhas entre as duas lâminas (Brower e Jaffe. Durante a metamorfose. o carboidrato aceptor e o açúcar ativado.. O receptor usado pode ser importante em permitir que as células usem laminina ou como membrana basal (nesse caso a afinidade do receptor seria alta) ou como um substrato para a migração (na qual receptores de afinidade menor seriam usados).) . Assim. Integrinas não são as únicas moléculas capazes de se ligar à laminina e à fibronectina. nenhuma integrina se forma. e essas podem ser importantes para sua função (Horwitz et al.1989).. Existem numerosas glicosiltransferases. (B) Diagrama especulativo relacionando a ligação do citoesqueleto à matriz extracelular através da molécula de integrina. esses dois epitélios se encontram e aderem para formar a lâmina de duas camadas da asa. 1988).30). A integrina a3β1 de fibroblastos.29 Dupla função de integrinas ao se ligar com matrizes extracelulares e com o citoesqueleto interno. por exemplo. Os receptores têm afinidade diferente por laminina. 1989. (A de Lazarides.. tem uma afinidade relativamente baixa por laminina (Kd = 10-6 M). onde elas são responsáveis por adicionar resíduos de açúcar a peptídeos para produzir glicoproteínas. GLICOSILTRANSFERASES. Na mutação letal (1) myospheroid.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 105 (A) Fibronectina RGD Sítio de ligação de RGD Subunidade ß de integrina Extracelular Subunidade ß de integrina Sítios de ligação de cálcio Subunidade α de integrina Citoplasma α Actinina Vinculina Talina ventral. B conforme Luna e Hitt. A enzima necessita de dois substratos para completar a catálise.. 1985). 1976. Lazarides.

Terceiro. (B) Interação entre glicosiltransferases e o grupo carboidrato (aceptor) na glicoproteína da matriz extracelular. Essa degradação controlada de moléculas da matriz extracelular é completada por um conjunto de enzimas coletivamente chamadas de Metaloproteinases degradativas de matrizes (Matrisian. ocorre a adesão (considera-se que isso ocorra durante a fertilização). Segundo. II e III. os processos morfogenéticos de interação célula-célula são provavelmente realizados por combinações de moléculas de adesão celular. regressão da cauda do girino e formação de órgãos ramificados (tais como: glândulas salivares. Primeiro. Carson et al. 1979. (C) Marcação da glicosiltransferase da superfície celular.. As células também usam sistemas múltiplos para remodelar tecidos por digestão.b. Sato et al.31). Por exemplo. Essas metaloproteinases incluem: (1) colagenases que digerem colágenos dos Tipo I. 1980. e várias dessas enzimas interagem para amplificar a intensidade das enzimas digestivas (Figura 3. tanto adesão como catálise são observadas (Toole... essas adesões podem ser quebradas pela catálise. . (A) A reação padrão de glicosiltransferase. células podem ter muitos sistemas adesivos que lhes permitem ligar e/ou migrar em substratos específicos. Eckstein e Shur. C de Shur. Crescimento do osso. eles “digerem” seu caminho através do epitélio do útero e através de sua membrana basal de laminina. rins e pulmões) também requerem quebra da membrana basal.) proteínas da matriz extracelular tal como a laminina. 1977a. 1988. Em algumas instâncias (como fertilização no camundongo. fibronectina e colágeno Tipo IV (Behrendtsen et al. Turley e Roth. (A e B modificado de Pierce et al. especialmente das células mesodérmicas migratórias. A produção e degradação controlada da matriz extracelular é parte essencial do desenvolvimento normal. enquanto outras são secretadas diretamente pelas células para dentro da matriz que será dissolvida. (2) gelatinases que digerem elastina e colágenos IV e V. incubando seções microscópicas de um embrião de galinha de 10-somitos. 1993). as células ativam os genes para os inibidores dessas proteínas. 1977a. as células de fora do embrião (as células trofoblásticas) têm receptores para o colágeno e os proteoglicanos de heparan sulfato do endométrio uterino. 1976. Se o açúcar ativado está ausente. a fixação inicial do embrião de camundongo à parede uterina parece ser mediada por vários sistemas de adesão. 1992. fibronectina e laminina.30 Catálise cliva açúcar de NDP e o adiciona ao aceptor Interações da superfície celular através de glicosiltransferases. Algumas dessas enzimas estão ligadas à membrana celular. Shur. na qual um açúcar é transferido de um carregador nucleosídeo difosfato a um receptor. Dutt e colaboradores (1987) mostraram que as células trofoblásticas podem também aderir às células uterinas através das glicosiltransferases da superfície celular. onde a galactosiltransferase na membrana celular do espermatozóide interage com componentes carboidrato da matriz extracelular secretada pelo óvulo). Em células migratórias. 1994). Se o açúcar ativado está presente em pequenas quantidades. e interferência com essa ligação pode impedir a implantação (Farach et al.106 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) (B) Enzima glicosiltransferase NDP-açúcar + aceptor Glicosil transferase NDP + açúcar-aceptor Doador de açúcar ativado (NDP-açúcar) Aceptor insolúvel (C) Ligação Ligação de NDP-açúcar à glicosiltransferase Figura 3. quando embriões de mamíferos se embebem no útero. Shur. Quando o segundo substrato aparece. cortesia de B.1987. Adesão diferencial resultante de sistemas de adesão múltipla Apesar de estarmos discutindo sistemas de adesão como unidades separadas. Radioatividade insolúvel vista por radioautografia mostra que esse açúcar radioativo foi transferido às superfícies celulares. Isso causa adesão. Assim. com UDP-[3H] galactose. A ativação dos genes das metaloproteinases é realizada coordenativamente. Logo após a ativação das metaloproteinases. 1989). Kadokawa e colaboradores (1989) mostraram que Pe E-caderinas estão presentes tanto no tecido uterino como no trofoblástico no local da implantação. a adesão é crítica e a catálise não ocorre. a migração é permitida. 1992).. Por exemplo.. e (3) estromelisinas que digerem proteoglicanos.

Nesses casos.) Moléculas de receptores e vias de transdução de sinais Os destinos das células são freqüentemente determinados pelas interações em suas superfícies. a JAK. a fosforilação ativa um fator de transcrição. um certo fator de diferenciação se liga a seus receptores membrana-abrangente. inclusive a si mesmo. ser uma molécula difusível. Quando um ligante é acoplado na região extracelular. Mas como que certas interações na superfície da célula causam a transcrição de genes específicos dentro do núcleo? As vias entre a membrana celular e o genoma são chamadas vias de transdução de sinais. As STATs são fosforiladas pela forma ativa da uma família de quinases.1995. . ainda. Groner e Gouilleux. que cliva o plasminogênio dando plasmina. Se o sinal vem de células vizinhas difundindo-se de uma para outra é chamado parácrino. Várias vias foram descobertas. O receptor ativo pode agora catalizar reações que fosforilam outras proteínas. aqui serão mencionadas as principais. (Conforme Matrisian. elas parecem ser variações de um mesmo tema. sua forma muda e a porção citoplasmática passa a ter atividade enzimática. Uroquinase é um ativador de plasminogênio. uma região transmembrana e uma região citoplasmática. Os receptores ativados têm agora sua própria atividade quinásica e podem fosforilar certos STATs inativos. O ligante iniciador da reação pode estar ligado a uma célula ou matriz extracelular ou. e finalmente. 1996). fazendo com que esse se dimerize (que forme dímeros) (Figura 3. O tema é deveras elegante: cada receptor se estende através da membrana tendo uma região extracelular. 1992. induzindo sua dimerização. Esse fator de transcrição pode agora ativar (ou reprimir) um novo conjunto de genes. JAK-STA A via JAK-STAT No Capítulo 2 discutimos um conjunto de fatores de transcrição inativos até que um sinal de outra célula produz sua fosforilação.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 107 Procolagenase Plasminogênio Ativação transcricional Uroquinase Plasmina Colagenase Ativa Estromelisina Colagenase muito ativa Prostromelisina Figura 3. Essa atividade é usualmente a de uma quinase. Proteínas JAK estão ligadas a cada um dos receptores (em suas respectivas regiões citoplasmáticas). e agora ao serem aproximadas fosforilam o receptor em vários sítios. Esses fatores de transcrição são as proteínas STAT (transdutores de sinais e ativadores de transcrição) (Ihle. antes dormente. 1995).31 Cascata de ativação de metaloproteinases de membrana.. 1994. Os dímeros são a forma ativa dos STAT que são translocados para o núcleo onde se ligam às regiões específicas do DNA. Como veremos. Quando a molécula difusível vem do sangue é considerada um sinal endócrino. Plasmina ativa as formas precursoras de estromelisinas e colagenases produzindo uma mistura de enzimas muito ativa capaz de digerir matrizes extracelulares. onde uma molécula de receptor encontra seu ligante complementar. A via JAK-STAT é muito importante na diferenciação de células sangüíneas e na ativação do gene de caseína na produção de leite (Briscoe et al. que pode usar ATP para fosforilar proteínas.32).

Isso permite que a proteína se dimerize e seja translocada para o núcleo onde se liga a regiões específicas de DNA.33)—especificamente. GR é o glucocorticóide receptor. um peptídeo de 9 aminoácidos da glândula pituitária anterior. A tirosina fosforilada no receptor é reconhecida por uma proteína adaptiva (Figura 3. Uma proteína JAK específica (Jak2) está “atrelada” nesses receptores. Esses adicionam um grupo fosfato a um resíduo de tirosina (Y) de uma proteína STAT específica (nesse caso Stat5). ativando a quinase dormente desses receptores. vulvas de nematódeos e cânceres humanos chegaram à conclusão que estudavam o mesmo gene. O receptor tirosina quinase abrange a membrana e.32 Receptores de prolactina Prolactina A via JAK-STAT— nesse caso. sofre uma mudança conformacional que permite sua dimerização. Esses dímeros têm uma atividade quinásica latente. a proteína de tipo selvagem Ras está na sua forma inativa e ligante de GDP. as tirosinas fosforiladas são reconhecidas por uma porção da proteína adaptativa chamada domínio SH2. fatores de crescimento epidérmico e fatores de crescimento derivados de plaquetas. A Ras ligada a GTP é a forma ativa da proteína que transmite o sinal. a proteína STAT ativa a transcrição do gene de caseína. OCT1 um fator de transcrição geral. Pesquisadores estudando olhos de Drosophila. quando conectado com seu ligante. Assim. onde o receptor tirosina quinase liga seu ligante específico. e TBP o conjunto de proteínas responsável pela ligação de RNA polimerase. Após a transmissão. A via RTK-Ras começa na superfície celular. O gene de caseína é ativado durante a última fase do desenvolvimento da glândula mamária (lactogênica) e seu sinal é a secreção de prolactina. Quando os receptores são dimerizados. veja Groner e Gouilleux. Prolactina causa a dimerização dos receptores de prolactina nas células epiteliais do ducto mamário. Normalmente. a introdução de um ligante no receptor causa uma autofosforilação no domínio citoplasmático do receptor. as proteínas JAK fosforilam umas as outras e os receptores vizinhos. Quando ativada pelo receptor ligante-acoplado. Enquanto ligada ao receptor fosforilado pelo seu domínio SH2. a proteína adaptativa usa seu domínio SH3 para regular o ativador de uma proteína Ras G. a via de ativação do gene de caseína por prolactina. Essa catálise é ajudada pelo fator de troca guanina nucleotídeo. ela troca um fosfato de outro GTP para transformar o GDP ligado em GTP. As proteínas adptativas servem como uma ponte que liga a quinase fosforilada do receptor a um poderoso sistema intracelular de sinalização. Ligantes que se ligam a RTKs incluem fatores de crescimento fibroblásticos. o GTP é hidrolizado a GDP. Essa catálise é muito estimulada . (Para detalhes. Em combinações com outros fatores de transcrição (que presumivelmente esperavam sua chegada).108 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 3. ativada por mudança conformacional fazendo com que os receptores se fosforilem um ao outro em resíduos particulares de tirosina.) Receptores dimerizados ativos Extracelular Citoplasma Envoltório nuclear Núcleo Inicio da transcrição Promotor do gene de caseína -Ras RTK-R A via RTK-Ras A via de transdução de sinais RTK-Ras foi uma das primeiras vias a unir as várias áreas da biologia do desenvolvimento. 1995.

1994. A proteína Ras ativa associa-se com uma quinase chamada Raf. A proteína SH3 reconhece as fosfotirosinas e ativa as proteínas intermediárias (GRB2 e SOS).. Essa proteína de 120-kDa aumenta a atividade hidrolizante de GTP mais de 100 vezes. a proteína Ras não catalisa eficientemente a hidrólise de GTP permanecendo em sua configuração ativa (Cales et al. 1994). Gibbs et al. as quais ativam a proteína Ras G por permitir a fosforilação da porção GDP da Ras. Em humanos. A proteína Ras coloca a proteína inativa Raf na membrana celular onde ela se torna ativa (Leevers et al. Núcleo Modulação da transcrição pela complexação normal da proteína Ras à proteína ativadora de GTP-ase (GAP). mas atualmente é considerada como um conjunto maior de fatores de transcrição). A lesão genética parece estar no gene que . (MAP quer dizer proteína associada à mitose. que ao seu turno fosforila uma série de quinases. Essa última quinase fosforila os fatores de transcrição que especificam o destino da célula ou a proliferação. pode fosforilar a MAP quinase. e retorna a Ras à sua forma inativa (Trahey e McCormick. Dickson et al. o tórax e a cabeça crescem normalmente. as proteínas GAP estimulam a hidrólise dessa ligação fosfato. que ocorre em 1 entre 50. Ao mesmo tempo. mutações nessa via dão origem às formas mais comuns de nanismo. Sem a proteína GAP. essa via é reforçada pela liberação de íons cálcio.000 nascimentos. fosforilando certos fatores de transcrição (que podem penetrar no núcleo para mudar os tipos de genes transcritos) e certos fatores de tradução (que alteram o nível de síntese de proteínas). considera-se que a cascata ativa o fator de transcrição Sina (Sevenless-in-Absentia). A deficiência reside na proliferação mínima da cartilagem da placa de crescimento dos ossos longos. Isso causa a autofosforilação do receptor. Em olhos de Drosophila. por sua vez. A MAPKKK fosforila a MAPKK que. 1982). cuja presença é necessária para a diferenciação do fotorreceptor 7 (Carthew e Rubin..CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 109 Ligante Extracelular Citoplasma Receptor Figura 3. mutações no gene RAS estão relacionadas com uma grande proporção de tumores humanos (Shih e Weinberg. Por fim. mas os braços e as pernas são encurtados proximalmente. 1988.33 Ativação de eventos dependentes de cálcio e PKC Fator de transcrição ativo Fator de transcrição inativo A via RTK-Ras amplamente usada. McCormick. 1987. essa via é crítica em numerosos processos desenvolvimentais. Em muitos casos. a MAP quinase altera a expressão gênica. Realmente. incluindo acondroplasia.. A Ras ativa é capaz de ativar a proteína quinase C (PKC). Stokoe et al.. Aqui.. e as mutações que tornam o gene oncogênico inibem a ligação da proteína GAP. 1988). Como veremos mais tarde neste livro. por exemplo. 1992). A proteína Raf é chamada MAP-quinase-quinase-quinase (MAPKKK). O receptor tirosina quinase é dimerizado pelo ligante. 1990.1989).

Muitos compostos têm mais de uma função na célula. . e alguns “fatores de transcrição” podem ser utilizados para inibir a transcrição.19. 1996. As mutações nesse gene causam um fenótipo de ganho de função onde o mutante FGFR3 é ativo constitutivamente (isto é. Esse gene é expresso nas células da cartilagem em desenvolvimento na placa de crescimento dos ossos longos. Assim. Certos “fatores de crescimento” podem inibir o crescimento.34). 1994). e o que fazem depende do contexto da célula. Shiang et al. o efeito de FGF não é transmitido à célula. em um caso. Aqui vemos que moléculas de adesão celular podem ser usadas para transdução de sinais. 1996).110 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento codifica o receptor 3 do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR3) (Figura 9. O mutante dominante negativo não formará um dímero ativo. mesmo com um parceiro do tipo selvagem. Informações adicionais & (A) FGF Especulações Mutações negativas dominantes em receptores O significado funcional de uma molécula ligante pode ser verificado eliminando seu receptor. Os receptores FGF ativos. Esse heterodímero é inativo. o FGFR3 sinaliza o condrócito para parar de dividir e começar a diferenciação. Proteínas celulares não respeitam nossas fronteiras disciplinares. Realmente. Isso pode ocorrer em mutações naturais ou provocadas.. Amaya e colaboradores (1991) injetaram mRNA de uma forma mutante de um receptor FGF em embriões de duas células de Xenopus. Portanto. Uma maneira de fazer isso é criando mutações dominantes negativas de receptores. Nesse experimento. O receptor de FGF (FGFR) é uma RTK transmembrana. [cell7. sem a necessidade de ser ativado por um FGF)* (Deng et al. esses se dimerizam e seus dois domínios de proteína quinase se fosforilam mutuamente. quando presente em concentrações suficientemente altas. são dímeros de duas moléculas idênticas embebidas na membrana celular.34 Ensaio para receptor dominante negativo para a importância de um determinado receptor. Quando ativado por um FGF. 1994. Quando liga FGF. mesmo se o outro parceiro é do tipo selvagem. o receptor mutante compete com receptores FGF normais impedindo que suas proteínas sejam ativadas. Esse tipo de experimento será bem sucedido se a dimerização for crítica para a função do receptor.. (A) Quando dímeros de FGF se ligam à porção extracelular desses receptores. alguns fatores de transcrição podem ser usados para regular a tradução.html] * Nomes podem ser perigosamente ilusivos. (B) O receptor dominante negativo não tem o domínio da proteína quinase. acionam um sinal através do citoplasma.. Webster e Donoghue. Sem sinal Figura 3. Quando fosforilados. Essas blástulas não conseguem responder ao FGF (Figura 3. produz um dímero inativo. FGFR normal: FGF se liga causando dimerização do receptor de FGF (B) FGFR dominante negativo Receptor de FGF FGFR normal FGFR mutante Domínio da tirosina quinase Sinal Receptores sem domínios intracelulares são inativos Sem sinal Excesso do receptor mutante pode seqüestrar o receptor normal do fator de crescimento. embriões que não tinham receptores FGF funcionais tinham mesoderma posterior e lateral dramaticamente reduzido (Prancha 3). Rousseau et al.

A proteína quinase estimula o transportador sódio/hidrogênio a trocar íons hidrogênio celulares por íons sódio extracelulares. (B) Essa reação pode ser iniciada em dois pontos principais na membrana celular. Em segundo lugar. ambos necessitando de um aumento na concentração intracelular de íons cálcio. transformando PIP2 em DAG e IP3. etc). Essa ativação resulta na ligação de GTP à proteína heteromérica G e sua dissociação em subunidades ativas. Neste ínterim. Primeiro.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 111 A via do inositol fosfato Algumas vezes. (B) RECEPTORES LIGADOS À PROTEÍNA G RECEPTORES LIGADOS À TIROSINA QUINASE (PDGF. (A) A reação de fosfolipase C. A ativação da via do inositol fosfato promove mudanças drásticas na fisiologia da célula pela liberação de íons cálcio do retículo endoplasmático. a via pode ser ativada pela via RTK. Essas subunidades ativam enzimas fosfolipase C (PLC) que podem catalizar a formação de DAG e IP3. assim levando a um aumento do pH. Ligante Ligante Extracelular Citoplasma Proteína G Via IP 3 PATHWAY PKC Atividade celular e mitogênese MAP quinase Receptor IP 3 Retículo endoplasmático . a transdução de um sinal da superfície celular causa tantas mudanças.35 (A) Extracelular Fosfolipase C Citoplasma A via do inositol fosfato. Figura 3. a via é iniciada quando o receptor transmembrana ligado à proteína G é ativado pela introdução do ligante. IP3 pode se ligar a um receptor para liberar íons cálcio do retículo endoplasmático. que alterações na expressão do gene constituem somente um pequeno subconjunto do que faz o sinal. Essa via é extremamente importante na ativação do espermatozóide e do óvulo. DAG (em presença dos íons cálcio liberados) ativa a proteína quinase C. EGF.

finalmente produzindo c-Jun. A matriz extracelular e a superfície da célula como fontes de sinais críticos para o desenvolvimento Bissell e colegas (1982. as mudanças nos íons hidrogênio e cálcio. Esses receptores estão relacionados com outro tipo de proteína G. Portanto. Berridge.. é produzido pela ligação do receptor da célula T ao antígeno (Figura 3. Esses dois tipos de fosfolipase C podem clivar PIP2 em inositol 1. 1991. alteram não somente a transcrição de genes. as quais ativam outro conjunto de fosfolipase C.. Isso ativa a cascata Ras. algumas vezes chamado de receptores serpentina.5-trifosfato e diacilglicerol. onde dois sinais são necessários. mas também a tradução de mRNA e a replicação de DNA. efetuadas por essa via. Em alguns casos. Na verdade. Além de ativar a proteína Ras G. Fosfolipase C pode catalisar a hidrólise de fosfatidilinositol 4. O segundo sinal vem da glicoproteína B7 na superfície da célula que apresenta o antígeno.5-trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). Muitas vezes. 1996). pois entre elas existem ruas e avenidas que fazem as conexões entre elas. um fator de transcrição que se liga ao intensificador de IL-2 e ativa sua expressão (Liet al. especialmente aqueles do fígado e da glândula mamária. Estudos recentes mostraram que a ligação de integrinas à matriz extracelular . Quando o ligante liga-se ao seu receptor. 1995) propuseram que a matriz extracelular é capaz de induzir expressão gênica específica em tecidos em desenvolvimento. onde a indução de fatores de transcrição específicos dependem da ligação célula-substrato (Liu et al.1996). 1994). c-Fos. a transcrição de genes requer dois sinais. Streuli et al. também conhecida como fator de crescimento da célula T).. essas vias são apenas as principais estradas pelas quais se escoa a informação. Notenboom et al. O resultado é a elevação de íons intracelulares de cálcio e um aumento no pH intracelular. Um segundo ponto de iniciação é outra classe de receptores. Nishizuka. a matriz extracelular é uma fonte importante de sinais que podem ser transduzidos para o núcleo para dar expressão gênica específica. Martins-Green e Bissell. criando um fator de transcrição. as tirosina quinases ativadas podem interagir com um tipo de enzima. PLC-β1 e PLC-β2. Deve-se lembrar também que a célula tem numerosos receptores e está constantemente recebendo muitos sinais simultaneamente. DAG ativa a proteína quinase C. porque têm sete domínios transmembrana e “serpenteiam” através da membrana. 1993. esse ativa a proteína G. 1994). a proteína G heteromérica. Isso é visto durante o desenvolvimento de linfócitos. Shilling et al. ativador do gene c-fos que sintetiza c-Fos. mencionado anteriormente.5-bifosfato (PIP2) em dois segundos mensageiros: inositol 1. IP3 é capaz de abrir canais de cálcio do retículo endoplasmático. Esse sinal ativa uma segunda cascata de quinases. 1986.4. cada um produzindo um dos dois peptídeos de um fator de transcrição envolvido na produção de interleucina 2 (IL-2. que também tem um domínio SH2 que reconhece as tirosinas autofosforiladas).. onde a informação flui em conduítes únicos. onde duas vias reforçam uma a outra. 1994.112 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento A via pode ter dois pontos iniciais (Figura 3. ou seja. Elk-1. Cruzamentos entre vias Representamos as vias principais como se fossem cadeias lineares. Essa ativação dissocia a proteína G em suas subunidades. Os dois peptídeos. Essa comunicação cruzada pode ser vista na Figura 3. Um ponto de iniciação é o receptor tirosina quinase.36). liberando uma grande quantidade de íons cálcio no citoplasma. c-Fos e c-Jun. fosfolipase C (PLC1-y1. 1991. Montgomery et al. Um fator. que por sua vez ativa a bomba de proteína que troca íons sódio por íons hidrogênio (Swann e Whitaker. Cada passo é um ponto de regulação em potencial e um potencial ponto de interseção). (Essa pode ser a razão da existência de tantos passos entre a superfície da célula e o núcleo. podem produzir a proteína AP-1.35.4. 1986)..35. Como veremos em capítulos posteriores.. a presença de integrina ligada previne a ativação de genes que especificam a morte celular (Brooks et al.

formam o fator de transcrição AP-1 que pode ativar intensificadores específicos para a célula T como os que regulam a produção de interleucina 2. Essa indução recíproca é mediada por interações na membrana . como também pode estimular a interação da célula com o L1.. Interações recíprocas na superfície celular Quando duas células interagem durante o desenvolvimento. Williams et al. ativação transcricional e fenômenos de desenvolvimento característicos das respostas do FGF celular (Figura 3.. 1994b. 1995). 1994. O primeiro sinal dirige a síntese de uma subunidade do fator de transcrição AP-1.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 113 CÉLULA APRESENTADORA DO ANTÍGENO SINAL 1 Citoplasma SINAL 2 MHC II Antígeno Receptor da célula T B7 CD28 Extracelular Citoplasma RAF T-LINFÓCITO ELK-1 ativa transcrição de c-fos Intensificador de interleucina 2 Fator de transcrição AP-1 Núcleo Transcrição de IL-2 Figura 3. c-fos e c-jun. N-CAM e caderinas de uma célula vizinha (Bixby et al. 1995). Comunicação cruzada é quase certa acontecer quando as moléculas de adesão celular são também transdutores de sinais. Doherty et al. O primeiro sinal vem de receptores que ligam o antígeno apresentado na superfície das células B ou macrófagos. 1994a. O segundo sinal vem da ligação da proteína CD28 à proteína B7 que está na superfície da célula apresentante do antígeno. Clark e Brugge. As duas subunidades. Williams et al.. ambas são modificadas na maioria das vezes. causando a liberação de íons cálcio. pode estimular a via RTK-Ras.. A outra subunidade é sintetizada sob direção do segundo sinal.36 Dois sinais são necessários para efetuar a diferenciação de linfócitos T.37. Caderinas (mesmo as solúveis) podem dimerizar receptores FGF exatamente como os ligantes normais de FGF.

Os receptores FGF podem ser “seqüestrados” pelas moléculas de adesão e colocados juntos. genéticos e celulares no desenvolvimento animal. [cell8.114 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Citoplasma Molécula de adesão celular Receptor FGF Extracelular Citoplasma Sinal Figura 3. uma delas produz a proteína Hedgehog e a secreta. Em 1782. O peptídeo age na célula vizinha ocasionando a produção da proteína Wingless (Wnt). duas células (ou grupo de células) são adjacentes. Estamos agora no estágio onde podemos iniciar o estudo da embriogênese precoce e ver a integração entre os processos orgânicos. por sua vez. Estudos recentes mostraram que essa ordenação é devida às moléculas na superfície dessas células. 1994. Isso pode ser feito pela interação de moléculas de adesão opostas.37 Possíveis interações de moléculas de adesão celular com receptores de FGF. Niswander et al. Esse elemento podia imaginar que o corpo era formado por uma miríade de “pequenos corpos sensíveis” que se juntavam para formar um agregado. a adesão diferencial de um tipo de célula a uma matriz extracelular e a comunicação de sinais para a diferenciação e divisão celulares.. celular. como também. Em capítulos subseqüentes. veremos com mais detalhes essas interações morfogenéticas. 1995). subdivisões cerebrais e membros em mamíferos (Figura 3. Essas incluem adesão diferencial de uma célula a outras. Ingham.html] A superfície celular é um lugar extremamente importante para interações desenvolvimentais. Wilder e Perrimon. Uma via intensamente usada é o sistema Wingless-Hedgehog. 1994. O resultado é a estabilização de uma borda onde o tecido em um lado secreta proteína Hedgehog. estimulando-a a continuar a síntese de Hedgehog. ou “ligações cruzadas” de receptores de FGF das membranas celulares opostas podem ativar seus domínios quinase.38. A proteína Wingless. enquanto o tecido no outro lado produz Wingless. Essa borda é crítica na produção de segmentos e apêndices em Drosophila. . mas ele não podia imaginar como esse agregado poderia se tornar um animal. é também secretada e se liga à célula vizinha. Nessa via. o ensaista francês Denis Diderot pôs a questão da morfogênese no sonho febril de um físico.

Expression of fasciclin I and II glycoproteins on subsets of axon pathways during neuronal development in the grasshopper. Marshall. and Cheresh. Theoret. Development of cell-surface linkage complexes in cultured fibroblasts. and Julian. 1994. A. and Cremer. Bixby. L. and Sanderson. Development 114: 447-456. J. The cytoplasmic protein GAP is implicated as a target for regulation by the ras gene product. Heparan sulfate proteoglycan (perlecan) expression by mouse embryos during acquisition of attachment competence. Hasegawa. K. D. Neurosci. Cell 63: 561-577 Chen. Sci. M. Bernfield. J. Cell Biol.. [A] 327: 171-186. D. Snow. S. M. L. P. Metalloproteinases mediate extracellular matrix degradation by cells from mouse blastocyst outgrowths. M. 127: 1461-1475. L.. Cales. Harrelson.-P. que bloqueia a ação inibidora da quinase Zeste-white-3 sobre a proteína Armadillo (uma catenina). U. Behrendsten. 3: 269-289. 1977. Biol. Receptor Patched Proteína Hedgehog LITERATURA CITADA Ayama. J. and Erickson. M. Boucaut. and Müller. W. Some aspects of normal and abnormal cell surface genetics.. S. J. Étude autoradiographique de la distribution de cellules embryonnaires isolées. P. M.. 1989. 1982. Reisfeld. 21: 135-147. C. 1989. Tang. Briscoe. 1991. D. and Edelman. R.. A.-P. D.. Embryol. Immunological assay for molecules involved in cell-cell binding. C. A proteína Wingless é secretada por uma célula e se difunde a uma curta distância. J. Ca++ influx and neurite growthin response to purified N-cadherin and laminin. G. D. Specific inhibition of cell contact formation in Dictyostelium by univalent antibodies. J. Dev. Nature 342: 285-287. M. and Gay. J. Thiery. K. N. E. Brooks. G. Berridge. Loch-Caruso. and Old. Just another signalling pathway. Guschin. Syndecan. G. Bevilacqua. and Parry. Cell 66: 257-270. R. C. D. V. Abnormal development and dye coupling produced by antisense RNA to gap junction protein in mouse preimplantation embryos. M. C. Cell 48: 745-755. W. Biol. and Goodman.. J.. Essa proteína é secretada e ligada pela célula vizinha. M. Alexander. 1988. Proc. S. Tang. 1994. G. R. G. and Werb. 100: 1103-1114. 1974. M. D. Gerisch. E. Armstrong. 1992. and Jaffe. L. Brower. R. A. Hall. a gene required for the specification of R7 cell fate in the Drosophila eye. 127: 368-375. T. and Bookman. Armadillo (ß-catenina) wingless patched decapentaplegic engrailed hedgehog Proteína engrailed Proteína Smoothened Ci ativo Ci inativo Proteína G Interações recíprocas entre células na via wingless-hedgehog em Drosophila. a morphogenetically regulated cell surface proteoglycan that binds extracellular matrix and growth factors. Nature 332: 548-551. Dishevelled Quinase Zw3 Prot. Seven -in-absentia. Dev. Cell sorting out: The self-assembly of tissues in vitro.. J.W. F.. E. A.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 115 Receptor Frizzled Wingless / proteína Wnt Proteína DPP Figura 3. Urodele). 4: 1033-1035. J. A. 1990. A proteína Armadillo ativada induz a célula a transcrever o gene hedgehog (hh). P. 1987. B.. Lond.. Rev. 1985. Rosenfeld. Weinstock. Nature 361: 315-325. M.. Exp. 1989. Klier. 63: 147-158. Bissell. 1993. C. Soc.38 Prot. 1970. A. Res.. Rutishauser. J. and Rubin. A. G.M. C. Chem. M. and Kirschner. D. Acad.. . 99: 31-68. J. G. Carson. Biol. 1987. J. Grunwald. Boyse. Collagens support embryo attachment and outgrowth in vitro: Effects of the Arg-GlyAsp sequence. Burridge. D.. 0. Hasegawa.. T.. 1988. Distribution of tenascin during cranial neural crest development in the chick.. Hu.-P. J. Cell 51: 569-577. 1969. Carson. Z.. Morphol. and Croall. R. S. B. DeMartino. G. Carthew. I.. Cell Biol. USA 86: 5444-5448. H. Expression of a dominant negative mutant of the FGF receptor disrupts mesoderm formation in Xenopus embryos. R. Annu. 1988. M. Integrin α v β 3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels. Bronner-Fraser. How does the extracellular matrix direct gene expression? J. E. A célula vizinha liga a proteína Wingless originando a ativação da proteína. Montgomery. 24: 119-149. 1990. Mol. T. Beug. Biol. Genet. Inositol triphosphate and calcium signalling. H. J. Musci. Requirement for integrins during Drosophila wing development. Bastiani. Riedel. C. Ann. C. Trans. Hancock. T.. Rev... 252: 6835-6840. Beckerle. J. Ligando a proteína Hedgehog faz com que a célula transcreva o gene wingless e secrete a proteína.. 155: 97-106. Philos. M. 1994. and Yamada.. J. Biol. Biochem. Cell 79: 1157-1164. J. Biol.. and Hall. G. CRC Crit. P. Colocalization of calcium-dependent protease II and one of its substrates and sites of adhesion. M. Cell Res. 7: 7-50. 1993. Curr. Brackenbury. M. J. P. Kempff. Adhesion among neural cells of the chick embryo. Natl. transplantées dans le blastocèle chez Pleurodeles waltii Michah (Amphibien. R.

Cell 27: 437-447. D. Primordial germ cells of Xenopus embryos: The role of fibronectin in their adhesion during migration. Prolactinmediated gene activation in mammary epithelial cells. 8: 365-400.. Hedgehog points the way. Ectopic expression of N-cadherin perturbs histogenesis in Xenopus embryos.-P.. M. D. Jongen. Tang. Robey. Philadelphia.. A. Nermut. K. 1985. 1994. F. Miyatani.. D. Duggan. Development 110: 97-104. and Edelman.. and McClay. J. Neuron 14: 57-66. M. A pentapeptide from the laminin B1 chain mediates cell adhesion and binds to the 67000 laminin receptor. G. 1987. Regulation of connexin 43-mediated gap junction intercellular communication by Ca2+ in mouse epidermal cells is controlled by E-cadherin. 114: 545-555. N. E. and Steinberg.. J. and Steinberg. Biol. D. Ultrastructure of a hyaluronic acid matrix. E. P. 1991. L.. Dufour. M. L. B. Biochemistry 26: 6896-6900. Yamada. Development 102: 687-698. D. E. 1981. and Baltimore. J. Chuong. Kuo.. B. R. Spatial and temporal expression pattern of N-cadherin cell adhesion molecules correlated with morphogenetic processes of chicken embryos. C . S. K. J. R. T... A. A. 262: 3300-3309. C. Biol. R. P. Greggs. and Buck. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. A. D. J. R. Opin.. Dickson. M. Hadler. 1984. Genet. S. Biol. Pfleger. and other extracellular glycoproteins. Proc..). M. C.. Lett. Elsevier. H.. Proc. J. R. G. Extracellular Matrix Biochemistry. Duband. A. 1989. Goldstone.000 molecular weight β subunit.-M. S. 101: 1027-1043. R. 1987. Decker. E. 7: 2661-2671. C. Thomas. R. Chem. C. Cell Biol. W. 107: 241-255.. K. A. Buck. A. S. H. Lodish. 1994. and Carter. Gibbs. J. Yamada. E. S. 1990. 102: 716-730. Growth Diff. Fujimori... C. T. Fuketa. M. and Walsh. A soluble chimeric form of the Ll glycoprotein stimulates neurite outgrowth. K. Expression of cell adhesion molecules in embryonic induction. R.. N. Blackiston. Tang.... C. Dev. D... 1987. The cell substrate attachment (CSAT) antigen has properties of a receptor for laminin and fibronectin J.). H. and Scolnick. S. Beckerle. G. functions. Attachment. L. C. Liquid properties of embryonic tissues: Measurements of interfacial tensions. 123: 401-410. The Biology of the Cell Surface. Eckstein. M.. F. Duggan.116 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento C h e n e y. and Edelman. Sci. E. Curr. A.. and Leder. New York. C. A. and their role on leukocytes. G. Ras1 functions downstream of Rasl in the Sevenless signal transduction pathway Nature 360: 600-603. G. Cell 84: 331-334. Morphogenesis of adult feathers. Science 242: 700-708. 1982. Natt. C. 1994. E. 1939. Fibronectin. and Lo.. Annu. Obara. N. C.. Covault. 1988. Humphries. and Takeichi. C. Dickey. J. and Thiery. 31: 23-30. Picz and A. Dev. Communication compartments in the gastrulating mouse embryo. R. 1782. D. Biol. I. Biol.. VLA proteins in the integrin family: Structures. and Stocum. J. 107: 66-74. Hines. M. Integrin and signal transduction pathways: The road taken. and Burridge. Doubleday. M.. Farach. I. J. Expression of cell adhesion molecules in embryonic induction. D. Dev.. Dev. Cell 84: 911-921. P. and Thiery. Horwitz. W. Heasman. 1990. Swan.. Edelman. Retinoic acid coordinately proximalizes regenerate pattern and blastema differential affinity in axolotl limbs. and Sanes. F. Biol.. G. II. 1992. Alterations in the Xenopus retinotectal projection by antibodies to Xenopus N-CAM. Diversification within embryonic chick somites: Differential response to notochord. K. 114] Doherty. Kintner. 1995. Wynshaw-Boris. J. L. Detrick. J. C. USA 85: 5026-5030. Decker.. 1989. W. Cell Biol. Yoshidanaro.. Pfleger. I. G. Interaction of plasma membrane fibronectin receptor with talin-a actinin transmembrane linkage. Nature 320: 531-533. 1996. B. Y. and Brugge. 1988. M.. W. Hemler. M.. Ogle. 101: 2134-2144. Expression of Eand P-cadherin in mouse embryos and uteri during the periimplantation period. 1986. lhle. STATs: Signal transducers and activators of transcription. J. Reddi (eds. Development 120: 49-57. Foty.. 1987. Murray. Three cell recognition changes accompany the ingression of sea urchin primary mesenchyme cells. and Wylie. C. 81: 288-298. M. a n d L a s h . Chuong. Distribution of N-CAM in synaptic and extrasynaptic portions of developing and adult skeletal muscle. L. C. N. V. Neuron 4: 493-506. J. G. Laminin induces the stable expression of surface glycosyltransferases on lamellipodia of migrating cells. Molecular Cell Biology. M. Diderot. and Wylie. 1986. Hakomori. EMBO J. Fraser. Characterization of five distinct cell surface heterodimers each with a common 130. W. Wiley. 1987. 229-275. and Carson. A. Hatta. Dev. Dev. Ginsberg. Purification of ras GTPase activating protein from bovine brain. Sasaki. 129: 217-230.-M. E. Takagi. M. 1985b. M. Fibroblast growth factor receptor-3 is a negative regulator of bone growth. R. 1995. Harrelson. 1995.. K.. M. Restitution of whole larvae from disaggregated cells of sea urchin embryos. Chuong. P. 1985a. M. Fukuda. Scientific American Books. Acad.. laminin. S. 108: 2507-2517. Bowen (eds. 1985. G. C. S. Cell Biol. Williams. Kadokawa. and Williams. and Goodman. . J. and Gouilleux. NY [p. A functional test for maternally inherited cadherin in Xenopus shows its importance in cell adhesion at the blastula stage. Cell Biol. 5: 587-594. Lactosaminoglycans are involved in uterine epithelial cell adhesion in vitro. Nose. M. Y. Natl. spreading and locomotion of avian neural crest cells are mediated by multiple adhesion sites on fibronectin molecules. G. and Kleinman. Hemler. Cytokine receptor signalling. Allard.. Expression of N-cadherin adhesion molecules associated with early morphogenetic events in chick development. J . K. 119: 27-37. Clark. 5: 402-411. Dev. S. 1986.. J. Fujisawa. 1995. Hatta. Darnell. Forgacs. Deng. and Shur. 101: 1009-1026. Immunol. J. In K. D.. Cell Biol. pp. Forgacs. J. Sprenger.. G. The Cell in Contact: Adhesions and Junctions as Morphogenic Determinants. C. Zhou. M. Sci. Reprinted in J. Foty.. C. Kalimi.. J. C. D.. Regulation of embryonic cell adhesion by the cadherin cytoplasm domain. The effects of N-cadherin misexpression on morphogenesis in Xenopus embryos. 4:1-4. and Takeichi. Crawford. 1996. P. Acad. Sekiguchi. 1988. 1 9 8 1 . Scaber. J.. USA 79: 307-309. Science 268: 233-239. F A. New York. H. C. Carhart. 1996. 1990. P. A. 1988. Biol.-M. M. M. D. S. Dourmash. M. A. J. Rev. New York. Ingham. D. and Takeichi. Fink. 1988. and Schwartz. K. Nature 320: 447-449. Cell Biol. Development 122: 1611-1620.. Heparin/heparan sulfate is involved in attachment and spreading of mouse embryos in vitro. C. Curr. Dev. M.-P. R. and Carson. Graf. 1986. Takeichi. Huang. J. D. E.. K. T. Growth cone guidance in insects: FasciclinII is a member of the immunoglobulin superfamily. H. C. M. Martin. V. Physic. Biol. and Hafen. Dev.. R. Cell 69: 225-236..J. lhle. F. Cell Biol. 120: 215-227. Sigal. and Nakatsuji. J. 1985. The VLA protein family. and Edelman. B. D’Alembert’s Dream. D. J. Biol. 72: 2298-2301. Groner. D. M.. E. S. Giudice. K. and Kintner. Barzun and R. Morrison. 1992. Heasman. S. Horwitz. Rameau’s Nephew and Other Works (1956).-L. and seven others. Dutt. Nature 377: 591-594. H. Rev. Morphogenesis of nestling feathers. 1988. M. M . R. A. Pratt. B. 1962.. Garden City. F. Just.

1994. A matric metalloproteinase expressed on the surface of invasive tuomour cells. A.. 1988a. Development 122: 321-332. Bunge. F. M. and Lamers. A. 171: 363-373.. Lee. S. 6: 149-159. Nature 256: 495-497. L. C. F. E. Niswander. Science 267: 1831-1834. and seven others. Horwitz. Linask. Cell Res.. 1: 117-119. J. 1976. 1994. J.. L. V. F. Transformation of cell adhesion properties of exogenously introduced E-cadherin cDNA. E. Dev. Yasuda. R. M. 1989.. Y. J. McGuire.. Alan R. 1994. I. Cell Res. Science 240: 53-57. Trends Neurosci. P. Development 115: 827-837. 1985. Acad. Biol. U. J.. S. Ratner. NatI. Reisfeld. B. 1986. 1979. A. Lemmon. H. D. Moorman. and Roth. A. C. Cell Res. R. N. C. S. Gilula. CellECM interactions in development. A. Dev. Pierce.. Nature 370: 61-65. and Lash. S. M.. N. Extracellular signals that regulate liver transcription factors during hepatic differentiation in vitro. A. E. 1985. Biol. P. Cell surface glycosyltransferase activities.. 1987. 157: 218-226. Semin. Whaley. Rotation of the heartforming region during different stages and its effects. Sato H. R. Nishizuka. Massagué. Lehtonen. Liu. and Stocum. B. J. and Pierschbacher. Blocked signal transduction to the ERK and JNK protein kinases in anergic CD4+ T cells. 1987. Exp. M. D. J. M.. de Poer. P. L. 68: 202-219. 1961. 12: 189-195. 65: 1-47. A. D. Gilula.. S. A. A. D. Farr. Montgomery. J. 1995.... Integrin α v β 3 rescues melanoma cells from apoptosis in a threedimensional dermal collagen. Moscona. Ll-mediated axon growth occurs via homophilic binding mechanism.. Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems. Knudson. U. K. S. Nardi. K. and Mueller. M. M. E. McClay. T. Schultz. Monroy. W. S. C. R. Rutishauser. B. 1975. Linask.. Sci. Science 238: 491-497. Hall. R. 1985.. and Tickle. A. 1991.. 1971. D. C. 1992. Leonard. G. Nature 371. Jeffrey. L. II. 3: 535-539. R. 51: 525-535. and Takeichi. S. C. Leevers. and Toole. Nature 329: 341-343. Chicago. Studies and perspectives of protein kinase C.. Curr. and Marshall. Genetic Regulation of Development. Yamamoto. A. R. Acad. Sainio. Dev.. A. Turley. Mann. Cao. Requirement for Ras in Raf activation is overcome by targeting Raf to the plasma membrane. and Lagenauer. and Moscona. McCormick. M. and Lash. Cell Biol. M. J. W. 1979. D. and Hitt. A. 1976. A. M. F. The establishment of the hepatic architecture is a prerequisite for the development of a lobular pattern of gene expression. Rev.. Y. Surface properties of regenerating limb cells: Evidence for gradation along the proximodistal axis.. F.. A role for fibronectin in the migration of avian precardiac cells. E. A novel cadherin adhesion molecule: Its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos.. Cell 54: 993-1001. Liss. A. A.. T. Matrisian. L. 1989. C. S. 1986. F. G.. Abnormal ambient glucose levels inhibit proteoglycan core protein gene expression and reduce proteoglycan accumulation during chondrogenesis: Possible mechanism for teratogenic effects of maternal diabetes. 1987. W. A. and Gumbiner. D. L. A neuronal cell surface heparan sulfate proteoglycan is required for dorsal root ganglion neuron stimulation of Schwann cell proliferation. Cell 51: 851-860. Reaurne. Nature 371: 252-254. 1996. 1991. Dose-dependent effects of fibronectin antibody. A. Cell 56: 401-408. 1980. USA 86: 10113-10117. Mol. D. M. Int. Frenz. pp. K. Di Persio. Science 271: 1272-1274. University of Chicago Press. 1988. Bogaert. Acheson.. A helping hand from proteoglycans. M. and Warner. Li. A. A positive feedback loop coordinates growth and patterning in the vertebrate limb. Martin. 107: 527-530. and Cheresh. A. M. B. ras GTPase activating protein: Signal transmitter and signal terminator. A. Nagafuchi. K. J. A. D. K. Regulation of chondrogenesis by heparan sulfate and structurally related glycosaminoglycans. L. Gap junctional communication in the preimplantation mouse embryo. A.. and Takeichi. and Seiki. Dev. Landmesser. A role for fibronectin in the migration of avian precardiac cells. Roth. A monoclonal antibody identifies a glycoprotein complex involved in cell-substratum adhesion. K. 1995. 18: 602-631. 129: 315-323. A. Y. A. Gap junctional communication and compaction during preimplantation stages of mouse development. Biol. Cell Biol. An assay for intercellular adhesive specificity. Cell 18: 399-409. Köhler. Lazarides. N. Moscona. 1989. and Dulhunty. Bergman. and tropomyosin interaction in the structural organization of actin filaments in nonmuscle cells. Dev. M. and Tuan. Lee. Shirayoshi. Actin. R.. F. W. Cell Biol. Loss of hyaluronidate-clependent coat during myoblast fusion.. Ruoslahti. and Zaret. Distinct roles for adhesion molecules during innervation of embryonic chick muscle. 1987. Nose. E. . Dahm. 1988. Proc. N. 1983. and Saxén. 123: 17-24. Leptin. Exp. H. Introductory Concepts in Developmental Biology. 101: 744-754. J.. T. Dev. and Sunshine. 1968. 1995. P. Shinagawa. Loomis (ed. Rotation-mediated histogenetic aggregation of dissociated cells: A quantifiable approach to cell interaction in vitro. A. M. USA 91: 8856-8860. Natl. Peracchia. J. S. 130: 645-670. B. 1992. and Glaser. Differentiation 25: 27-31. J. M.. C. Studies on intracellular adhesive selectivity. The function of PS integrins during Drosophila embryogenesis. Takino. L. Biol. M. Nature 369: 411-414. D. E. Mutations in the gene encoding fibroblast growth factor receptor-3 in achondroplasia. Okazaki. Cell Biol. N. Lehmann. Cell 56: 5-8. and Wilcox. New York. BioEssays 14: 455-463.. E. Lander. E. 1952. J. Differential expression of gap junction mRNAs and proteins in the developing murine kidney and in experimentally induced nephric mesenchymes. The neural cell adhesion molecule (N-CAM) as a regulator of cell-cell interactions. Notenboom. 1987. Okada. M.). C. and Milstein. J. and Gilula.-H. The matrix-degrading metalloproteinases. B. M. Neuron 2: 1597-1603. Exp. J. In W. Gilbert. L. Cytol. 1996. M. Sci. Lo. Dev. Roth. and Newman. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. K. L. Cell Biol. Biol. a actinin. Nishi. Biol. Kumar. and Bissell. W.. 1989. Cell recognition during sea urchin gastrulation. Martins-Green. Rousseau. A. Biol. and Buck. Cell suspension from organ rudiments of chick embryos. Dev. Disruption of gastrulation movements in Xenopus by a dominant-negative mutant for C-cadherin.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 117 Knudsen. and Ettensohn. Nose. 1988. Biol. Mondino. Cell Biol. K. 22: 455-475. L.. and Takeichi.. 1994. C. J. A. Cytoskeleton-plasma membrane interactions. K. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. G. J-K. Macreery. Science 233: 305-312.. M. 70: 419-439. L. J.. A. 1994.. A. 1989). Luna. San Antonio. 609-612. C. and eight others. C. S. Science 258: 955-964. L. Low resistance junctions in crayfish: Structural changes with functional uncoupling. Proc. 11: 773-784. Nagafuchi. and Roseman. Paterson. Cardiac malformation in neonatal mice lacking connexin 43. 1992. Winston. Biol. 103: 2649-2658.. Orkin. A... 111-128. G. W. F. J. 1988b. 129: 324-329.. Understanding the molecules of neural cell contacts: Emerging patterns of structure and function. and Rutishauser.

J.. Turley. 1977b. Barondes (ed.. Constitutive activation of fibroblast growth factor receptor 3 by the transmembrane domain point mutation found in achondroplasia.. and Willems. 58: 23-29. 1989. A. D. R. A. L. Lee. 276-329.. in the development kidney. Van Camp. F. J. 173: 395-434. Zool.. A. E. Experiments on cell and axon orientation in vitro: The role of colloidal exudates in tissue organization. Epithelial-mesenchymal interactions regulate stage-specific expression of a cell surface proteoglycan. D.. Wilder. 1988. Hoffman. L. J. Biol. F. The part played by inositol trisphosphate and calcium in the propagation of the fertilization wave in sea urchin eggs. S. F. Wang. M. and Okada. E. Dev. Exp. N. E. and Damsky. 1979. 18: 234-241. P. Biol. Zool. H. and HoItfreter.. A cytoplasmic protein stimulates normal N-ras p2l. 1994a.. P. Adhesivity of blastula and gastrula cells in culture. EMBO J.. a glycoprotein involved in transmembrane linkage between fibronectin and actin. R. Ann. N. Biol. 1955. Evidence for both tyrosine kinase and G-protein-coupled pathways leading to starfish egg activation. Development 121: 477-488. Tan.. S. Shur. Horwitz. Development 107: 891-897. Rev. Wehrle. J. and Hancock.. 1989. Biol. Esko. Cell 36: 15-26. K. S. 58: 40-55. 1986. Tokunaga. M. P. 1991. B. J. 1970. 1977a. 6: 381-405. 321-434. Werb. Neuron 13: 583-594. Int. D. F. Klagsbrun. 1988. A. Two contrary functions of tenascin: Dissection of the active sites by recombinant tenascin fragments. S... GTPase. and Leptin. Isolation of a transforming sequence from a human bladder carcinoma cell line. Control of mammary epithelial differentiation: Basement membrane induces tissue specific gene expression in the absence of cell-cell interactions and morphological polarity J. Beck. B. 1987.). M. M. B. L. and Bernfield. S. J. D. Wilcox.. Sci. Toole. 124: 1029-1037. S. H. 134: 382-391. syndecan. and Benzer. Dev. New York. A. Directed movements and selective adhesion of embryonic amphibian cells. I. 32: 299-306. 70: 195-205. and Chiquet. and Chiquet-Ehrismann. P. Steinberg.. R. B. F. and Donoghue. Williams. and Scharff.. Cell-matrix interactions in tooth development. Neuronal Recognition. Townes. 0. and seven others. WaIsch. and Rutishauser... 1994. C. 1964. Tenascin is accumulated along developing peripheral nerves and allows neurite outgrowth in vitro. Streuli. Annu. Wilson. Science 260: 1124-1127. Cell surface glycosyltransferases in gastrulating chick embryos. Buck. T. Watanabe. P. M. 1994. The problem of adhesive selectivity in cellular interactions. T. E. Cadherin cell adhesion receptors as a morphogenetic regulator. Trends Genet. H.. The cellular basis of Fundulus epiboly. Trinkaus. 1980. and Jalkanen. J. 1986. C. J. K. J. Shur. Thesleff. DeSimone. G. Am. Asymmetric expression of somites of cytotactin and its proteoglycan ligand is correlated with neural crest cell migration.. 1982. Webster. Trends Neurosci. J. and Benzer.118 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Shiang. Landmesser. Takeichi. J. P. Schrander-Stumpel. 1991. Cadherins: A molecular family essential for selective cell-cell adhesion and animal morphogenesis. MASA syndrome is due to mutations in the LlCAM gene. N-CAM. Carroll. Yelton. and Ingber. J. 1945. Exp. Vits. Clin. J. M. 1994. Zool. 15: 520-527. R. and Weinberg. Regulation of extracellular matrix degradation by cell-extracellular matrix interaction. Bailey. Leder. M. M. and Barclay. M. and Roth. and Chen. Schwarz. L. Tyrosine kinase inhibitors can differentially inhibit integrin-dependent and CAMdependent neurite outgrowth. Natl. L. S. M. but does not affect oncogenic mutants. P. 162: 590-599. 1986. Science 251: 1451-1455. 68: 510-516. Dev. R. Takeichi. J. C. J. Trahey. Shih. Monoclonal antibodies. and Hynes. M. and McCormick. H. Spontaneous glycosylation of glycosaminoglycan substrates by adherent fibroblasts. 7: 513-532. Cadwallader. Dual functions of wingless in the Drosophila leg imaginal disc. Williams. and Jaffe. S. 1976. The functions of the PS integrins in Drosophila wing morphogenesis. Connective tissue diseases: Mutations of collagen genes. pp. In S. D. P. S. E. Development 110: 401-415.. Couke. S. Jr. 1989. Dev.. Mutations in the transmembrane domain of FGFR3 cause the most common genetic form of dwarfism. C. A.. Neuronal development in the Drosophila retina: Monoclonal antibodies as molecular probes. J. Locke (ed. Biol. The distribution of N-CAM in the chick hindlimb during axon outgrowth and synaptogenesis. A.). 1985. growth. 1984. 1979. 1993.. Cell 17: 109-115. Steinberg. Cell Biol. 1987. Crossin. Molecular analysis of the development of the compound eye in Drosophila. Escobodo. Williams. Proc. S. Tamkun. J.. A. USA 85: 6394-6398.. and differentiation. Dev.. S. 100: 353-386. 115: 1383-1395. and Whitaker. T. Science 238: 542-544. Cellular Membranes in Development. and Edelman. P.C. and Doherty. Swann. Muslin. Cell 46: 271-282. 1946. Tyler. Exp. H. M. A. J. Activation of raf as well as recruitment to the plasma membrane. M. Proc. M. Antibodies to gap junctional protein selectively disrupt junctional communication in the early amphibian embryo. U. 114: 468-481.. 8: 251-257.. 1991. 1989. C. J. M. Sci. Dev. M. Zipursky. C. 7: 408-413. 1990. M.. G. Biol.. Res. Dev. I. Nature Genet. Morphogenetic role of glycosaminoglycans (acid mucopolysaccharides) in brain and other tissues. Does differential adhesion govern self-assembly processes in histogenesis? Equilibrium configurations and the emergence of a hierarchy among populations of embryonic cells. . N. and N-cadherin. F. E. Dev. L. Acad. P. K. M. W. Immunol. D. 1984. S. and Doherty. Walsh.. E. Teplow. Guthrie. T. Biochemical evidence for a surface localization of endogenous glycosyltransferase activities. achondroplasia. W. Ozaki. Yow H. Dev. and Ornitz. 1996.. Venkatesh. B. Steei. K. S. Cell 29: 161-169. A. J. M. Cell Differ.. W. Jalkanen. 103: 2333-2342. Spring. J. Plenum. Patel. M. M. B. and Gilula. Warner. D.. Vainio. Experimental ma- nipulation of cell surface to affect cellular recognition mechanisms. L. Zipursky. Biol. Cell Biol. Weiss. S. L. New York. Vuorio. Wong. L. The immunoglobulin superfamily: Domains for cell surface recognition. Academic Press. Science 264: 1463-1467.. Acad. Cell 78: 335-342.. II. Fonda. Mechanotransduction across the cell surface and through the cytoskeleton.. Williams. P. Activation of the FGF receptor underlies neuriote outgrowth stimu lated by L1. Stokoe. and Bissell. D. Cell surface heparinlike molecules are required for binding of basic fibroblast growth factor to its high affinity receptor. G. D. 3: 213-217. Increased mRNA expression of a lamininbinding protein in human colon carcinoma: Complete sequence of a fulllength cDNA encoding the protein. Tosney. E. F. R. Macdonald. S. K. M.. S. 128: 53-120.. Z. 1987. R. Temporally and spatially specific patterns of four endogenous glycosyltransferase activities.. D. D. 1995. Furness. D. Symons... D. J. J. K. S. 1994b. Cell 59: 325-334. Yayon.-S. G. Butler. Cell 64: 841-849. Natl. B. Shilling.. Biol. Sci. USA 84: 7977-7981. 1990. Cell surface glycosyltransferases in gastrulating chick embryos. N. Tremble.. A. Nature 311: 127-131. Chen. E. Vainio. pp. Venkatesh. Structure of integrin. An auto-antibody concept of cell structure. G. 1986. A. DiAntonio. Growth 10 (Symposium 6):7-19. M. 33: 91-95. In M. N. C. K. 1963. Lehtonen. 1994. Cell Biol. S. D. Takeichi. and Perrimon. L.

Padrões de Desenvolvimento 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 5 Clivagem: Criando multicelularidade 121 167 209 II 253 341 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 7 Início do desenvolvimento vertebrado: Neurulação e ectoderma 8 Especificidade axônica 307 9 Início do desenvolvimento vertebrado: Mesoderma e endoderma .

.

posteriormente chegou a acreditar que cada espermatozóide continha um embrião pré-formado. e o espermatozóide retorna a mensagem ativando o metabolismo do óvulo necessário para o início do desenvolvimento. sempre sexo. e a segunda é a de iniciar no citoplasma do ovo aquelas reações que permitem o desenvolvimento. acreditou inicialmente que ele continha animais parasitas vivendo em seu interior (daí o termo espermatozóides. realiza duas atividades separadas: sexo (a combinação de genes derivados dos dois pais) e a reprodução (criação de novos organismos). A SCHOPENHAUER (CITADO POR C. temos que considerar as estruturas do espermatozóide e do óvulo – dois tipos de células especializadas para a fertilização. em última análise. sempre distinção. portanto. Somente um espermatozóide pode. porém. Saindo da obscuridade iguais opostos avançam. sejam elas cômicas ou trágicas.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 121 Fertilização: Iniciando um novo organismo 4 Desejo e desejo e desejo Sempre o desejo procriativo do mundo. a primeira função da fecundação é a de transmitir genes dos pais para a prole. é na realidade mais importante que todas as outras finalidades na vida humana. • Regulação da entrada do espermatozóide para o interior do óvulo. Embora os detalhes da fecundação variem de espécie para espécie. o microbiologista holandês que co-descobriu o espermatozóide em 1678. Anton van Leeuwenhoek. Porém. Ele se volta para nada menos que a composição da próxima geração. de quatro atividades principais: • Contato e reconhecimento entre espermatozóide e óvulo. Assumiu originalmente que esses nada tinham a haver com a reprodução do organismo onde se encontravam. Na maioria dos casos. Assim. Estrutura dos gametas Existe um diálogo complexo entre óvulo e espermatozóide. • Ativação do metabolismo do ovo para começar o desenvolvimento. Sempre uma criação de vida. WALT WHITMAN (1855) F ERTILIZAÇÃO (FECUNDAÇÃO) é o processo pelo qual duas células sexuais O objetivo final de todas as intrigas amorosas. A fecundação. significando “animais do esperma”). Sempre uma tessitura de identidade. os eventos da concepção consistem. isso assegura que o espermatozóide e o óvulo sejam da mesma espécie. Espermatozóide Foi somente no século XIX que o papel do espermatozóide na fertilização tornou-se conhecido. O óvulo ativa o metabolismo do espermatozóide que é essencial para a fecundação. Isso é geralmente conseguido com a permissão de somente um espermatozóide entrar no óvulo e a inibição da entrada de qualquer outro. fecundar um óvulo. Sempre substância e aumento. antes de investigar esses aspectos da fecundação. 1871) (gametas) se fundem para criar um novo indivíduo com potenciais genéticos derivados dos dois genitores. • Fusão do material genético do espermatozóide e do óvulo. DARWIN. Leeuwenhoek (1685) escreveu que 121 . em geral.

Acreditava que o espermatozóide excitava o desenvolvimento do óvulo de maneira semelhante aquela pela qual o ímã comunica sua presença ao ferro. como seus óvulos eram abundantes e transparentes. que o fluido viscoso retido pelo papel de filtro. Kolliker ridicularizou a idéia que o sêmen poderia ser normal e ainda assim tolerar a presença de um número enorme de parasitas. von Kolliker descreveu a formação do espermatozóide a partir de células contidas em testículos adultos. porém. demonstraram a entrada do espermatozóide no óvulo e a união de seus núcleos. Por mais que tentasse. Spallanzani demonstrou que sêmen filtrado de rã. espermatozóides eram sementes (tanto sperma como sêmen significam “semente”). o outro co-descobridor do espermatozóide.html] A primeira evidência sugerindo a importância do espermatozóide na reprodução veio de uma série de experimentos realizados por Lazzaro Spallannzani em fins de 1700.122 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 4. Dumas afirmaram que os espermatozóides não eram parasitas. Somente em 1876. era perfeito para isso. ele estava voltando a uma noção da procriação enunciada por Aristóteles 2000 anos antes. desenhou uma figura do que pretendia encontrar: um ser humano pré-formado (“homúnculo”) dentro do espermatozóide (Figura 4. e que a fêmea meramente proporcionava o solo nutriente no qual as sementes eram plantadas. Leeuwenhoek era continuamente desapontado em suas tentativas de achar um embrião pré-formado nos espermatozóides. deixando somente certas organelas modificadas para exercer a função espermática (Figura 4. Essa crença de que o espermatozóide continha um organismo embrionário inteiro. Oscar Hertwig e Hermann Fol. Na parte frontal desse núcleo haplóide comprimido está a vesícula acrossômica. por isso. Hertwig repetidas vezes observou o espermatozóide entrando no óvulo e viu a união dos núcleos dessas células. Notaram a existência universal de espermatozóides em machos sexualmente maduros e sua ausência em indivíduos imaturos ou idosos. um sistema de propulsão para movimentar o núcleo. e a união dos gametas do ouriço-do-mar permanece como um dos exemplos de fertilização melhor estudado. A fertilização estava finalmente reconhecida como a união de espermatozóide e óvulo. A combinação das melhores lentes de microscópio e da teoria celular. J.1 A criança humana pré-formada no espermatozóide. levaram a uma reapreciação da função espermática. mas sim os agentes ativos da fertilização. era o agente da fertilização. pode . Mas ainda assim. A maior parte do citoplasma do espermatozóide é eliminada durante o amadurecimento.2). que os “animais espermáticos” eram parasitas. A maioria dos investigadores consideravam o espermatozóide como sem importância (Veja Pinto-Correia. Prevost e J. Eles propuseram que o espermatozóide penetra o óvulo e contribui materialmente para a geração seguinte. livre de espermatozóide. Após misturar espermatozóide e óvulo em suspensões. Durante o transcorrer do amadurecimento. também.html] Cada espermatozóide consiste de um núcleo haplóide. negou que haveria qualquer contato físico entre espermatozóide e óvulo. Hertwig procurou um organismo adequado para observações microscópicas detalhadas e descobriu que o ouriço-do-mar Mediterrâneo. 1997. independentemente. [fert1. mesmo sob alto aumento. Nicolas Hartsoeker. Concluiu. contendo enzimas que digerem proteínas e açúcares complexos.1). Essas assertivas não foram em geral levadas em consideração até a década de 1840. L. o núcleo haplóide se torna muito aerodinâmico e seu DNA altamente comprimido. para detalhes sobre essa extraordinária história). e não o espermatozóide. os convenceram que “existe uma íntima relação entre sua presença nos órgãos e a capacidade fecundadora do animal”. nunca recebeu muita aceitação. derivada do aparelho de Golgi. conforme representada por Nicolas Hartsoeker (1964). Não somente era freqüente na região e sexualmente maduro a maior parte do ano. não fecundava óvulos. porque implicava num enorme desperdício de vida em potencial. Toxopneustes lividus. Fol fez observações semelhantes e detalhou o mecanismo de penetração do espermatozóide. B. Essas observações. quando A. Ele acreditava. Sob esse aspecto. e um saco de enzimas que permitem a entrada do núcleo no óvulo. acopladas à conhecida ausência de espermatozóides na mula estéril. Em 1924. [fert2. Notou também que apenas um espermatozóide era visto penetrar em cada óvulo e que todos os núcleos do embrião derivavam dos núcleos fundidos por ocasião da fertilização.

Os flagelos são estruturas complexas. A sua principal porção motora é chamada axonema. um espermatozóide é capaz de viajar por longas distâncias agitando o seu flagelo. As mitocôndrias (pontos abertos) agrupam-se ao redor do flagelo perto da base do núcleo haplóide e são incorporadas na parte mediana do espermatozóide.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 123 ser considerado como uma vesícula secretória modificada. Em ouriços-do-mar e várias outras espécies.2 e 4. 1955. tais como os ouriços-do-mar. outras proteínas também são críticas para a função do flagelo. Os meios pelos quais o espermatozóide é impulsionado variam de acordo com o modo pelo qual a espécie se adaptou às condições ambientais. Um modelo tridimensional de um microtúbulo completo está apresentado na Figura 4. (Segundo Clermont e Leblond. Essas enzimas armazenadas são usadas para lisar os invólucros externos do óvulo. O centríolo produz um longo flagelo na parte que virá a ser a extremidade posterior do espermatozóide. O citoplasma remanescente é descartado e o núcleo se condensa.3C. a tubulina. o reconhecimento mútuo entre espermatozóide e óvulo envolve moléculas desse processo acrossômico. A força para a propulsão do espermatozóide é proporcionada pela dineína.3B). Realmente. O centro do axonema consiste de dois túbulos centrais rodeados por uma fileira de nove duplas de microtúbulos.) . contendo 13 protofilamentos. os quais consistem exclusivamente da proteína dimérica. Em muitas espécies. Em algumas espécies (como o nematelminto parasitário Ascaris). e o aparelho de Golgi forma a vesícula acrossômica na futura extremidade anterior. Aqui vemos os 13 protofilamentos interligados. porém. o acrossomo e o núcleo constituem a cabeça do espermatozóide. O tamanho do espermatozóide maduro foi aumentado em relação às outras figuras.2 Axonema Mitocôndrias Centríolo Núcleo Membrana plasmática Vesícula acrossômica Porção mediana Pescoço Cabeça do espermatozóide A modificação de uma célula germinativa para formar um espermatozóide de mamífero. uma proteína apensa aos microtúbulos (Figura 4. o espermatozóide viaja por movimentação amebóide de extensões lamelipodiais da membrana celular. só um microtúbulo está completo. existe uma região de moléculas globulares de actina entre o núcleo e a vesícula acrossômica. Na maioria das espécies. Embora a tubulina seja a base da estrutura do flagelo.3B). o outro tem forma de C e tem apenas 11 protofilamentos (Figura 4.3). Juntos. Um axonema é formado pelos microtúbulos que emanam do centríolo na base do núcleo do espermatozóide (Figuras 4. Essas proteínas são usadas para estender um processo de forma semelhante a um dedo durante os estágios precoces da fertilização. A dineína hidrolisa moléculas de ATP e pode converter a energia química liberada em Golgi remanescente Centríolo Flagelo Centríolo Flagelo Vesícula acrossômica e grânulo Núcleo Mitocôndrias Cauda Microtúbulos Porção final Aparelho de Golgi Mitocôndrias Figura 4.

Phillips. mostraram que essa mesma proteína estabiliza os microtúbulos flagelados impedindo seu espalhamento. mostrando o arranjo “9 + 2” dos microtúbulos e outros componentes flagelares. onde dobra e aperta a cromatina em agregados. (B) Diagrama interpretativo do axonema.) (A) (C) (B) Membrana plasmática Trave radial Cabeça da trave Nexina Subfibra A Subfibra B Microtúbulo central MICROTÚBULO DUPLO Braço interno de dineína Braço externo de dineína AXONEMA energia mecânica que propulsiona o espermatozóide. 1996).. No entanto. e têm 50 porcento de probabilidade de ter o coração do lado direito de seu corpo (Afzelius.2). 1976)..124 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 4. Multigner e colaboradores (1992). Outra importante proteína flagelar parece ser a histona H1. Essa proteína é geralmente vista dentro do núcleo. susceptíveis à infeções brônquicas (cílios respiratórios imóveis). (A) Seção transversal do flagelo de um espermatozóide mamífero. 1975. A segunda (“B”) porção da dupla contém somente 11 (ocasionalmente 10) protofilamentos. A primeira (“A”) porção do par duplo é um microtúbulo normal compreendendo 13 protofilamentos. Essa energia pemite o deslizamento ativo das duplas externas de microtúbulos. Como sua espessura diminui na direção apical. (C) Um modelo tridimensional do microtúbulo “A”. O diagrama esquemático mostra a associação de protofilamentos de tubulina em um microtúbulo duplo. M. 1977. (A cortesia de D. As subunidades α-tubulina e β-tubulina são semelhantes. Asai. A importância da dineína pode ser avaliada em indivíduos com a síndrome genética chamada de tríade de Kartagener.3 O aparelho de movimentação do espermatozóide. Em muitas espécies (notavelmente mamíferos) uma densa camada de fibras se interpôs entre a bainha mitocondrial e o axonema. Esses indivíduos não têm dineína em suas células ciliadas e flageladas. o que as torna estruturas imóveis. Essa camada fibrosa enrijece a cauda do espermatozóide. Machos com essa doença são estéreis (espermatozóide imóvel). sugerindo que é extremamente adequado na transmissão de energia para a movimentação.. cortesia dos autores. C de Amos e Klug. O arranjo “9 + 2” dos microtúbulos com os braços de dineína foi conservado nos axonemas em todo o reino eucarioto. 1973. não idênticas. porém. e o microtúbulo pode mudar de tamanho polimerizando e despolimerizando subunidades de tubulina em qualquer um dos lados. B segundo De Robertis et al. mostrando o axonema central e as fibras externas. levando o flagelo a se curvar (Ogawa et al. A energia para mover o flagelo e assim impulsionar o espermatozóide vem dos anéis de mitocôndrias localizadas na região do pescoço do espermatozóide (veja Figura 4. e Tilney et al. as fibras provavelmente previnem que a cabeça . 1974.

corpo gorduroso) e viajam através do sangue materno para o ovo. • Fatores morfogenéticos. Sintetiza ou absorve proteínas. Após sua expulsão para a luz dos túbulos seminíferos. esse mRNA permanece dormente até após a fertilização (veja Capítulo 12). as mensagens para proteínas sintetizadas durante o desenvolvimento inicial já estão acondicionadas no oócito. O óvulo em desenvolvimento tem mecanismos especiais para sintetizar ribossomos. RNAs. O embrião precoce precisa produzir muitas de suas próprias proteínas.000 vezes aquele do espermatozóide. gametas femininos das aves são enormes células singulares que se tornaram entumecidas pela acumulação de gema. Essas moléculas dirigem a diferenciação celular em certos tipos de células. o óvulo tem ainda um notável reservatório citoplasmático acumulado durante seu amadurecimento. As células embrionárias precoces precisam de um certo suprimento armazenável de energia e aminoácidos. Será longo o período a transcorrer antes do embrião ser capaz de se alimentar ou obter alimento de sua mãe. ocorre um surto de síntese protéica pouco após a fecundação. Os espermatozóides liberados durante a ejaculação podem se mover.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 125 do espermatozóide balance abruptamente. Esse armazém citoplasmático inclui proteínas. Mesmo óvulos com gema relativamente esparsa são comparativamente grandes. O óvulo Todo o material necessário para o começo do crescimento e desenvolvimento tem que estar armazenado no óvulo maduro. o óvulo em desenvolvimento (chamado de oócito antes de tornar-se haplóide) não somente conserva seu material. Assim. Essa mobilidade é conseguida através de mudanças no sistema gerador de ATP (possivelmente através da modificação da dineína). em algumas espécies. quando discutirmos a diferenciação das células germinativas. . Parecem estar localizadas em diferentes regiões do óvulo e se segregam em células diferentes durante a clivagem (veja Capítulo 13). 1994). Na maioria dos organismos. A síntese protéica é conseguida pelos ribossomos e tRNA. mais de 10. Esses estágios finais do amadurecimento espermático (chamado capacitação) não ocorrem antes do espermatozóide ter permanecido no interior do trato reprodutivo feminino durante um certo tempo. O volume do óvulo do ouriço-do-mar é de aproximadamente 2 x 10-4 µm3. Muitas proteínas da gema são sintetizadas em outros órgãos (fígado. substâncias químicas protetoras e fatores morfogenéticos:* • Proteínas. que atuam como reservatórios de alimento para o embrião em desenvolvimento. Assim. Em muitas espécies isso é conseguido pelo acúmulo de proteínas na gema do ovo. assim como os vários componentes do óvulo maduro. Enquanto o espermatozóide eliminou a maior parte do seu citoplasma. a diferenciação do espermatozóide não se completa nos testículos. mas ainda não têm a capacidade de se ligar ao óvulo e fertilizá-lo. os espermatozóides são armazenados no epidídimo. o espermatozóide sofreu extensa modificação para assegurar a passagem de seu núcleo para o óvulo. assim como de alterações da membrana plasmática que permitem que ela se torne mais fluida (Yanagimachi. enquanto o espermatozóide e o óvulo têm componentes nucleares haplóides iguais. onde adquirem a capacidade de se mover. A síntese e a colocação desses materiais será tratada no Capítulo 22.000 a 50.000 tipos diferentes de mRNA. Porém. preexistentes no óvulo. como a gema. Estima-se que os óvulos do ouriço-do-mar contêm de 25. • RNA mensageiro. * Os conteúdos do óvulo variam muito de espécie para espécie.4 mostra seus tamanhos relativos. • Ribossomos e tRNA. mas continua a acumulá-lo ativamente. A representação do óvulo do ouriço-do-mar e do espermatozóide na Figura 4. e certos oócitos de anfíbios produzem até 1012 ribossomos durante a prófase meiótica. Assim. Entretanto.

Essa membrana deve regular o fluxo de certos íons durante a fertilização e deve ser capaz de se fundir com a membrana plasmática do espermatozóide. O citoplasma nessa região é mais duro que o citoplasma interno e contém altas concentrações de moléculas globulares de actina. 1991). Em algumas espécies (por exemplo. e o espermatozóide penetra antes das divisões meióticas estarem completas.6). Nos mamíferos. estar equipado para enfrentar esses fatores. [fert3. O espermatozóide dos mamíferos tem que passar por essas células para fertilizar o óvulo*. (Segundo Epel. 1977.html] Dentro desse enorme volume de citoplasma reside um grande núcleo. as coberturas extracelulares do óvulo estão divididas em duas regiões: A zona pelúcida e o cumulus. O embrião não pode fugir de predadores ou movimentar-se para um ambiente mais seguro.5. Durante a fertilização.126 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 4. Acima da membrana plasmática está o envoltório vitelínico (Figura 4. por isso. as células do cumulus (Figura 4. A camada cumular representa células foliculares ovarianas que estavam alimentando o óvulo quando da sua liberação do ovário.4 Estrutura do óvulo do ouriço-do-mar durante a fertilização. são as células mais internas do cumulus. O estágio do núcleo do óvulo no momento da entrada do espermatozóide está ilustrado na Figura 4.7). • . Em outras espécies (incluindo muitos vermes e a maioria dos mamíferos). O envoltório vitelínico é essencial para a ligação espécie-específica do espermatozóide. Envolvendo o citoplasma está a membrana plasmática do óvulo. o núcleo já é haplóide no momento da fertilização. Imediatamente abaixo da membrana plasmática do óvulo está uma fina casca (de aproximadamente 5µm) de um citoplasma gel-símile chamado de córtex. o núcleo do óvulo ainda é diplóide.) Envoltório vitelínico Camada gelatinosa Espermatozóide Membrana plasmática Grânulo de gema Grânulo cortical Mitocôndria Núcleo Substâncias químicas protetoras. O termo corona radiata refere-se àquelas células foliculares imediatamente adjacentes à zona pelúcida. O óvulo do mamífero é também rodeado por uma camada de células. essas moléculas polimerizam-se *Em mamíferos. Essa esteira é suplementada por extensões de glicoproteínas da membrana plasmática e pontes proteináceas vitelínicas que aderem a esteira à membrana (Mozingo e Chandler. o envoltório vitelínico é uma matriz extracelular separada e grossa chamada zona pelúcida. Muitos óvulos contêm filtros ultravioleta e enzimas de reparos de DNA que os protegem da luz solar. necessitando. a gema de óvulos de aves contém até mesmo anticorpos. ouriços-do-mar). O componente principal desse envoltório forma uma esteira fibrosa sobre o óvulo. alguns óvulos contêm moléculas que predadores potenciais acham desagradáveis.

g. Schroeder.6 A superfície do óvulo do ouriço-do-mar.) Microvilosidades Envoltório vitelínico (A) (B) Grânulo cortical Figura 4. 1979. veja também a Figura 4.4 e 4. (de Schroeder. Ainda.6. Essas estruturas Estágios de maturação do óvulo no momento da entrada do espermatozóide em diferentes animais. mostrando microvilosidades e a membrana plasmática.. Um grânulo cortical aparece diretamente abaixo da membrana plasmática do óvulo. que estão estreitamente cobertas pelo envoltório vitelínico. e são também usados para estender a superfície do óvulo para o interior das microvilosidades. anêmonas) Ouriços-do-mar Figura 4. dentro desse córtex estão os grânulos corticais (veja Figuras 4. (B) Microfotografia eletrônica de transmissão de um ovo não-fertilizado. cortesisa de T. A membrana plasmática está exposta onde o envoltório vitelínico foi retirado. E. Microfilamentos são necessários para a divisão celular.5 para formar longos fios de actina conhecidos como microfilamentos. 1965.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 127 Vesícula germinal Corpos polares Pronúcleo feminino Oócito primário jovem Os vermes anelídeos Dinophilus e Sacocirrrus O verme poliqueta Histriobdella O platelminto Otomesostoma O onicóforo Peripatopsis Oócito primário totalmente crescido O nematelminto Ascaris O mesozoário Dicyema A esponja Grantia O verme poliqueta Myzostoma O verme concha Nereis O molusco Spisula O verme equiuróide Urechis Cães e raposas Primeira metáfase Segunda metáfase Meiose completa O verme nemerteano Cerebratulus O verme poliqueta Chaetopterus O molusco Dentalium O verme central Pectinaria Muitos insetos Estrela-do-mar O anfioxo Branchiostoma Anfíbios Mamíferos (maioria) Peixes Cnidários (e. (A) Micrografia eletrônica de varredura de um óvulo antes da fertilização. (Segundo Austin.) . que ajudam a entrada do espermatozóide para dentro da célula (veja Figura 4.6).19).

Muitos tipos de óvulos têm uma geléia no exterior do seu envoltório vitelínico (Figura 4. Em 1978. As enzimas e os mucopolissacarídeos atuam na prevenção da entrada de outros espermatozóides no óvulo após a entrada do primeiro. produzida durante a meiose. Miller demonstrou que os óvulos do cnidário Orthopyxis caliculata não somente secretam um fator quimiotático mas também regulam o período de sua liberação. Essa. Yoshida et al. esse ambiente é compartilhado com outras espécies que podem liberar suas células sexuais no mesmo período. Reconhecimento do óvulo e do espermatozóide: Ação à distância Muitos organismos marinhos liberam seus gametas para o ambiente.000 grânulos corticais. e 2) que mecanismo inibe o espermatozóide da estrelado-mar tentar fertilizar os óvulos do ouriço-do-mar? Dois mecanismos principais evoluíram para resolver essas dificuldades: atração e ativação espécie-específica do espermatozóide. No entanto. Atração do Espermatozóide A atração espécie-específica do espermatozóide (um tipo de quimiotaxia) foi documentada em numerosas espécies. moluscos. glicoproteínas adesivas e proteína hialina. 1985. (A) O ovo do hamster. O óvulo. Além das enzimas digestivas. também está dentro da zona pelúcida. é uma célula especializada para receber o espermatozóide iniciando o desenvolvimento. Oócitos em desenvolvimento. um oócito de camundongo é mostrado em relação ao cumulus. ou óvulo.128 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Cumulus Óvulo Zona pelúcida (A) (B) Figura 4.7 Óvulos de hamster imediatamente antes da fecundação. mas é principalmente usada para atrair ou ativar o espermatozóide.. Essa rede de glicoproteínas pode ter numerosas funções. os grânulos corticais também contêm mucopolissacarídeos. equinodermos e urocordados (Miller.4). cada óvulo do ouriço-do-mar contém aproximadamente 15. incluindo cnidários. Esse ambiente pode ser tão pequeno quanto uma poça de maré ou tão grande como o oceano. sendo organelas derivadas do Golgi contendo enzimas proteolíticas. enquanto cada espermatozóide contém uma vesícula acrossômica. Além disso. Uma célula do corpo polar. (Cortesia de R. em . Partículas de carbono coloidal (tinta Nanquim) são excluídas pela matriz de hialuronidase. está envolvida por células do cumulus. e as proteínas hialinas e adesivas envolvem o embrião precoce providenciando apoio aos blastômeros do estágio de clivagem. Esses organismos enfrentam dois problemas: 1) Como podem espermatozóides e óvulos se encontrarem quando em concentrações tão diluídas.) ligadas à membrana são homólogas à vesícula acrossômica do espermatozóide. 1993). (B) Em menor aumento. portanto. por sua vez. Yanagimachi. está encaixado na zona pelúcida.

40 e 90 segundos após a injeção. um peptídio de 14 aminoácidos chamado resact foi isolado da geléia do óvulo do ouriço-do-mar Arbacia punctulata (Ward et al. o espermatozóide geralmente nada em círculos de aproximadamente 50 µm de diâmetro. 1993). cortesia de V. Isso aumenta a concentração de GMP cíclico do óvulo (Shimomura et al. Vacquier.) . Se uma quantidade mínima de resact for introduzida na gota. Também pode ser ativada artificialmente pelo aumento da concentração de cálcio na água do mar. Porém. Ward e Kopf.8 vários estágios de amadurecimento. 1985.9. Ativação Espermática: A Reação Acrossômica no Ouriço-do-Mar Uma segunda interação entre espermatozóide e óvulo envolve a ativação do espermatozóide pela geléia do óvulo. mostrando espermatozóide nadando em círculos estreitos antes da adição de resact. 1986) e pode nadar através de um gradiente crescente de concentração desse composto até alcançar o óvulo. 1963).CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 129 (A) (B) (C) (D) Figura 4. Os mecanismos de quimiotaxia são diferentes em outras espécies (veja Metz. 1993). 1985. Colwin e Colwin. Assim. esses oócitos não controlam somente o tipo de espermatozóide que atraem.. ou mesmo em certas espécies. (de Ward et al. Esses peptídios (mais de 70 foram isolados de diferentes espécies de ouriços-do-mar) causam aumentos dramáticos e imediatos da motilidade espermática e do consumo de oxigênio (Hardy et al. A posição da micropipeta está indicada em (A). mais espermatozóide é recrutado para dentro do crescente agrupamento. Espermatozóide de A. Quando ela liga o resact ao lado externo da célula. e espermatozóides foram adicionados a uma certa distância dos óvulos. À medida que o resact continua a difundir-se. Uma dessas moléculas quimiotáticas. (A) Uma fotografia de 1 segundo.. pelo contato com o próprio óvulo. é colocada em uma lâmina de microscópio. mas também o momento em que o atraem.. Um nanolitro de uma solução 10-nM de resact é injetado em uma gota de 20ml de suspensão de espermatozóide. D. Resact difunde facilmente na água do mar e tem um profundo efeito quando adicionado a uma suspensão de espermatozóide de Arbacia. mesmo em concentração muito baixa (Figura 4. foram fixados sobre lâminas microscópicas. Quimiotaxia do espermatozóide em Arbacia. em segundos o esperma migra para a região da injeção e ali se congrega. (B-D) Exposições semelhantes de 1 segundo mostrando a migração do espermatozóide para o centro do gradiente de resact 20. punctulata liga resact a receptores na sua membrana celular (Ramarao e Garbers. Na maioria dos invertebrados marinhos. que parece ativar a ATPase da dineína estimulando a agitação da cauda no espermatozóide (Cook e Babcock. o espermatozóide migrava em sua direção. 1978. O receptor para resact é uma proteína transmembrana. resact causa uma mudança conformacional que ativa a atividade de guanidil ciclase no lado citoplasmático.. contendo espermatozóide de Arbacia. 1986). pela geléia que envolve o óvulo. punctulata e não atrai espermatozóide de outras espécies. Bentley et al. Miller encontrou que quando o espermatozóide era adicionado a oócitos que ainda não haviam completado sua segunda divisão meiótica. Quando uma gota de água do mar.8). essa reação acrossômica tem dois componentes: a fusão da vesícula acrossômica com a membrana plasmática do espermatozóide (uma exocitose que resulta na liberação dos componentes da vesícula acrossômica) e a extensão do processo acrossômico (Figura 4. A reação acrossômica pode ser iniciada pela geléia do óvulo solubilizada. 1994). Resact é específico para A. 1985). após o término da segunda divisão meiótica e os óvulos estarem prontos para ser fertilizados.. Resact também age como um peptídio ativador de espermatozóide. não havia atração de espermatozóide pelos óvulos.

Realmente. Decker e W. punctulata) (Summers e Hylander. González-Martínez et al. L. (Segundo Summers e Hylander.b).9). a geléia do óvulo pode prover reconhecimento espécieespecífico em algumas espécies. A exocitose da vesícula acrossômica é causada por uma fusão. J. * Tais reações exocitóticas podem ser vistas na liberação de insulina das células pancreáticas e na liberação de neurotransmissores de terminais sinápticos. A energia gerada é usada primordialmente para motilidade flagelar (Tombes e Shapiro. mediada pelo cálcio. Os espermatozóides dos ouriços-do-mar Arbacia punctulata e Strongylocentrotus drobachiensis reagem somente com a geléia de seus próprios óvulos. o espermatozóide de S.. Levine et al. 1978). A seqüência desses eventos está esquematizada na Figura 4. Schackmann e Shapiro. A exposição do espermatozóide do ouriço-do-mar à geléia do óvulo também ocasiona a rápida utilização de ATP e um aumento de 50% da respiração mitocondrial. No entanto. da membrana acrossômica com a membrana plasmática adjacente do espermatozóide (Figuras 4. Keller e Vacquier... Essa protrusão se origina da polimerização de moléculas globulares de actina em filamentos de actina (Tilney et al.. Portanto. mas não em outras.) Em ouriços-do-mar. (D) Enquanto as moléculas de actina se agregam para produzir microfilamentos. 1979. Os fatores da geléia do óvulo que iniciam a reação acrossômica em ouriços-do-mar são muitas vezes muito específicos. purpuratus também pode ser ativado pela geléia de Lytechinus variegatus (mas não de A. há uma fusão mediada pelo cálcio entre a vesícula secretória e a membrana celular. 1978). Em todos os casos. Lennarz. Estudos recentes de reações acrossômicas em ouriços-do-mar e mamíferos (Florman et al.. A reação acrossômica é considerada ser iniciada por um oligossacarídeo ligado a uma proteína na geléia do óvulo que permite a entrada de cálcio na cabeça do espermatozóide (SeGall e Lennarz. 1974. 1970. 1985). causam a despolarização da membrana que poderia abrir canais de cálcio voltagem-dependentes de maneira reminescente à transmissão sináptica.10). 1995). Essa exocitose permite que a vesícula acrossômica libere seu conteúdo na cabeça do espermatozóide*.130 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Membrana acrossômica Enzimas acrossômicas Membrana do espermatozóide Actina globular Bindina Microfilamentos de actina Núcleos Figura 4.9. 1967. Fotografias reais da reação acrossômica no espermatozóide do ouriço-do-mar são mostradas em seguida. 1975).9 Reação acrossômica em espermatozóide de equinoderma. o contato com a geléia do óvulo causa a exocitose da vesícula acrossômica e a liberação de enzimas digestoras de proteínas que podem digerir um caminho através da geléia de revestimento até a superfície do óvulo (Dan.9 e 4. As proteínas que atracam os grânulos corticais à membrana celular também parecem ser homólogas àquelas usadas na ponta do axônio (Bi et al. o processo acrossômico se estende para fora. (A-C) A porção da membrana acrossômica diretamente abaixo da membrana do espermatozóide funde-se com essa liberando o conteúdo da vesícula acrossômica. 1994 a. a semelhança entre a exocitose da vesícula acrossômica e a exocitose da vesícula sináptica pode ser bastante profunda. 1981. 1992. Franklin. . fotografias por cortesia de G. A segunda parte da reação acrossômica envolve a extensão do processo acrossômico (veja Figura 4. 1992) sugerem que quando os receptores para os ligantes ativadores do espermatozóide ligam essas moléculas.

000 espermatozóides chegam perto do óvulo. (A) Micrografia de transmissão eletrônica de um espermatozóide de hamster passando pela reação acrossômica. Primeiro.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 131 Membrana celular do espermatozóide Membrana acrossômica Fusão entre a membrana celular do espermatozóide e a membrana acrossômica adjacente Núcleo Centríolo Figura 4. 1948. vacas e seres humanos dentro de 30 minutos após a deposição. a membrana da célula espermática .) Informações adicionais & Especulações Ação à Distância: Gametas de Mamíferos MUITO DIFÍCIL estudar as interações que podem estar ocorrendo entre gametas de mamíferos antes do contato espermatozóide-óvulo. Embora seja relativamente fácil mimetizar as condições rodeando a fertilização do ouriço-do-mar (usando água do mar natural ou artificial). Espermatozóide mamífero recém-ejaculado é incapaz de sofrer a reação acrossômica sem ter residido por algum tempo no trato reprodutivo feminino (Chang. 1987). 1991). se confiar somente no poder de seus flagelos” (Storey. hamsters. Um motivo óbvio para isso é que a fertilização ocorre dentro dos ovidutos femininos. Austin. As alterações moleculares que explicam a capacitação ainda são desconhecidas (veja Yanigamachi. B.. Enquanto a motilidade espermática é necessária para que o espermatozóide do camundongo. 1951. segundo Yanagimachi e Noda. Corselli e Talbot. 1960. 1994). Os espermatozóides que não foram capacitados são “segurados” na matriz cumular. contendo espermatozóides em diferentes estágios de amadurecimento. onde ocorre a fecundação (Ralt et al. Dos 280 x 106 espermatozóides humanos normalmente ejaculados para o interior da vagina. ainda não conhecemos os componentes dos vários ambientes naturais encontrados pelo espermatozóide dos mamíferos em sua viajem ao encontro do óvulo. A membrana acrossômica pode ser vista formando vesículas. Há muita controvérsia em relação ao deslocamento do espermatozóide mamífero até o oviduto. a motilidade espermática provavelmente é um fator de menor importância para entrar no oviduto. (A de Meizel. 1995). 1952).10 Reação acrossômica em espermatozóide de hamster. não atingindo assim o óvulo (Austin. 1976) e pode ser mimetizado in vitro pela incubação de espermatozóide em meios de cultura de tecidos (contendo íons de cálcio. O espermatozóide é encontrado no oviduto de camundongos. e a possibilidade que o óvulo possa estar atraindo o espermatozóide por quimiotaxia. Como menos de 1 em 10. Translocação e Capacitação O trato reprodutivo de mamíferos femininos exerce um papel muito ativo no processo de fertilização. somente 200 atingem a região ampolar do oviduto. É mais provável que o espermatozóide seja transportado para o oviduto por meio da atividade muscular do útero. Um segundo motivo para essa dificuldade é que a população de espermatozóide ejaculada para o interior da fêmea é provavelmente muito heterogênea. mas existem quatro conjuntos de alteraçõess moleculares que podem ser importantes. é difícil analisar aquelas molé- É culas que permitem aos espermatozóides nadar em direção ao óvulo e serem ativados. Meizel. bicarbonato e soroalbumina) ou em fluido dos ovidutos. (B) Diagrama interpretativo de micrografias eletrônicas mostrando a fusão de membranas acrossômica e celular na cabeça do espermatozóide. a capacitação e as reações de hiperativação que parecem ser necessárias em algumas espécies para ligá-lo ao óvulo. um período “demasiadamente curto para ser atingido até mesmo pelo espermatozóide mais olím- pico. cortesia de S. uma vez no oviduto encontre o ovo. 1970. Esse requisito para capacitação varia de espécie para espécie (Gwatkin. cobaia.

observaram que parte do espermatozóide mudou sua direção de movimentação. Deve-se notar que “o prêmio da corrida não vai sempre para o mais rápido”. Wilson e Oliphant. No entanto. e duas proteínas encontradas tanto no soro como no trato reprodutivo feminino (albumina e proteína 1 de transferência lipídica). Em 1977. passando a nadar com maior velocidade e gerando maior força. certas proteínas são fosforiladas por um caminho cAMP-dependente. A proteína acrossômica mediando esse reconhecimento é chamada bindina.. cobaias e algumas variedades de camundongos) passam do útero para os ovidutos. aquele espermatozóide pode ter poucas chances de fertilizar o óvulo. Esses estudos não eliminam a possibilidade de que o efeito fosse devido a uma estimulação geral do movimento ou do metabolismo do espermatozóide. A concentração de colesterol no espermatozóide é diminuída durante a capacitação do espermatozóide em várias espécies (Davis. Essa proteína é capaz de se . Vacquier e colaboradores isolaram essa proteína insolúvel. o óvulo humano secrete um fator quimiotático somente quando estiver capacitado para a fertilização. Isso significa que o espermatozóide fertilizador poderia demorar até seis dias para fazer a jornada. Realizando um experimento semelhante aquele descrito anteriormente com ouriços-do-mar. Suarez e colaboradores (1991) mostraram que enquanto essas reações não são conducentes a viagens em fluidos de baixa viscosidade. Zeng et al. certas proteínas ou carboidratos na superfície do espermaozóide são perdidos durante a capacitação (Poirier e Jackson. parecem ser muito adequadas para o movimento linear do espermatozóide no fluido viscoso que poderá encontrar no oviduto. o fluido demonstrasse habilidade quimiotática (P < 0. Esses fatores podem influenciar a motilidade espermática assim como a capacitação. Ralt e colaboradores (1991) testaram essa hipótese usando fluido de folículos humanos cujos óvulos estavam sendo usados para fertilização in vitro. Reconhecimento do óvulo e espermatozóide: Contato de gametas Reconhecimento Espécie-Específico em Ouriços-do-Mar Uma vez que o espermatozóide do ouriço-do-mar tiver penetrado na geléia do óvulo.11). o potencial da membrana do espermatozóide é dramaticamente reduzido (de cerca de – 30 para –50 mV. e em quase todos os casos. Feito isso. Por exemplo. É possível. Especulou-se que o óvulo (ou. o óvulo só era fertilizável se.. quando os espermatozóides de certos mamíferos (especialmente hamsters. A microinjeção de outras soluções não teve esse efeito.. 1981. adquirem competência. ainda é incerto se esses eventos são independentes um do outro e até que ponto cada um deles produz capacitação do espermatozóide. 1988. o folículo ovariano no qual o óvulo se desenvolve) pode estar secretando substâncias quimiotáticas que poderiam atrair o espermatozóide em direção ao óvulo durante os últimos estágios da migração (veja Hunter. os autores microinjetaram uma gota do fluido folicular em uma gota maior da suspensão de espermatozóides.. 1987). Em segundo lugar. do acrossomo de Strongylocentrotus purpuratus. portanto. Quando os espermatozóides atingem a ampola. Visconti et al. que é necessária tanto para a aquisição de competência como para a fosforilação de tirosino-quinases. mais provavelmente. 1981). fatores solúveis no oviduto também podem prover o componente direcional do movimento do espermatozóide. passando a migrar ao encontro da fonte de fluido folicular. É possível que o trato reprodutivo feminino estimule a adenilciclase do espermatozóide a produzir mais cAMP e que esse ative a proteína quinase que inicia a cascata de fosforilação. dependendo da sua localização dentro do trato reprodutivo. terminando no dia da ovulação. essas investigações revelaram uma correlação fascinante: o fluido de somente a metade dos folículos testados mostrou um efeito quimiotático. porém com uma melhor probabilidade de sucesso do que aquele que chegou dias antes. Lopez et al. 1989a. ficam “hiperativados”. Em terceiro lugar. isso pode permitir que algum espermatozóide chegue mais tarde. de 30. Hiperativação e Quimiotaxia As diferentes regiões do trato reprodutivo feminino podem secretar fatores diferentes. Um importante passo do reconhecimento espécie-específico ocorre nesse ponto. 1985. 1995a. É possível que essas entidades perdidas durante a capacitação estivessem bloqueando locais de reconhecimento para as proteínas que se ligam à zona pelúcida. Eisenbach (1995) propôs a hipótese pela qual a capacitação é um acontecimento transitório.. O AMP cíclico pode induzir artificialmente a competência através da proteína quinase cAMP-dependente (PKA). e somente se. Wilcox e colaboradores (1995) acharam que quase todas os engravidamentos humanos resultam de relacionamento sexual durante um período de seis dias. Embora algum espermatozóide possa alcançar a região ampolar do oviduto (onde ocorre a fertilização) dentro de meia hora após a relação sexual. mas se aí ficam por um período demasiadamente longo.0001). regionalmente específicos. O espermatozóide pode também ter diferentes prazos de sobrevivência. o processo acrossômico do espermatozóide faz contato com o envoltório vitelínico do óvulo (Figura 4. que tal como certos óvulos de invertebrados. 1995). Porém.132 PARTE II Padrões de Desenvolvimento pode se alterar. e que é dada ao espermatozóide uma janela de competência relativamente breve. Em quarto lugar.b). perdem-na.500Da. 1989). durante a qual pode ter sucesso na fertilização do óvulo. 1992). mudando sua composição de lipídios. foram verificadas remover colesterol do espermatozóide humano (Langlais et al. terminando na fosforilação e ativação das proteínas envolvidas na ligação do espermatozóide à zona pelúcida e mediando a exocitose da vesícula acrossômica (Leyton e Saling. Ravnik et al. Além de aumentar a atividade do espermatozóide.

Usando técnicas imunológicas. As partículas de bindina estavam invariavelmente nos lugares onde dois óvulos se encontravam.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 133 Figura 4. os recipientes foram fotografados. Esse achado implica na existência de (A) BINDINA DO ESPERMATOZÓIDE S. mas não aqueles de Arbacia puctulata. (de Epel. Epel. fransciscanus Sem aglutinação Aglutinação .11 Contato do processo acrossômico do espermatozóide do ouriço-do-mar com uma microvilosidade do óvulo. Moy e Vacquier (1979) demonstraram que a bindina está especificamente localizada no processo acrossômico. 1977).12 ligar a óvulos desgeleificados de S. purpuratus S.25 ml de suspensão a 2% (volume/ volume) de óvulos. B de Glabe e Lennarz. 1977. 1977. a bindina isolada dos acrossomos de S. 1977. purpuratus (Figura 4.13). exatamente onde deve estar para o reconhecimento espermatozóide-óvulo (Figura 4. purpuratus OVOS DESGELEIFICADOS Partículas de bindina Aglutinação Sem aglutinação Óvulos S. Purpurata aglutina seus próprios óvulos desgeleificados. D. fransciscanus (B) Aglutinação espécie-específica por bindina de óvulos desgeleificados . cortesia dos autores. Ainda mais. Após 2-5 min de agitação branda. Estudos bioquímicos mostraram que as bindinas de espécies proximamente relacionadas de ouriço-do-mar são mesmo diferentes. cortesia de F.) Figura 4. purpuratus marcadas por fluorescência.) S.12. Collins e D. Vacquier e Moy. (A baseado em fotografias de Glabe e Vacquier. (B) Fotomicrografia de fluorescência de óvulos de S. (A) aglutinação promovida pela adição de 212 µg de bindina em um recipiente plástico contendo 0. Cada bindina somente se ligou a seus próprios óvulos. 1979. sua interação com óvulos é relativamente espécie-específica (Glabe e Vacquier. purpuratus ligados entre si por partículas de bindina de S. 1979). Glabe e Lennarz.

o espermatozóide foi tratado com anticorpos de porco capazes de ligar-se a anticorpos de coelho. Glabe. Dessa maneira.. B de Foltz et al. 1979. (C) Localização de bindina no processo acrossômico na junção do espermatozóide com o óvulo. Vacquier. Quando a bindina estava presente. (B) ligação do espermatozóide de S. (B e C de Moy e Vacquier.200x).14 A. os anticorpos do coelho permaneciam ligados ao espermatozóide.13 Localização de bindina no processo acrossômico. Os anticorpos do coelho foram produzidos contra a proteína bindina. (A) a técnica de localização imunoquímica coloca um anticorpo de coelho nos lugares onde a bindina está exposta.) (B) . e esses anticorpos foram incubados com espermatozóide que tinha sofrido a reação acrossômica.134 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) DAB + H2O2 Precipitado denso Anti-bindina de coelho (B) Precipitado DAB Imunoglobulina porcina anti-coelho conjugada com a enzima peroxidase (C) Membrana vitelínica do óvulo Acrossomo Núcleo Processo acrossômico Bindina Espermatozóide Figura 4. Peroxidase catalisa a formação de um precipitado escuro de diaminobenzidina (DAB) e água oxigenada. L. (A) Micrografia eletrônica de varredura do espermatozóide do ouriço-do-mar ligado ao envoltório vitelínico de um óvulo. a ligação do espermatozóide não se dá sobre a superfície inteira do óvulo. Depois de todo anticorpo não-ligado ser removido por lavagem. cortesia de V. O precipitado só se forma onde há bindina. purpuratus a partículas de polistireno que foram cobertas com a proteína purificada do receptor de bindina. que saturaram óvulos de ouriço-do-mar com espermatozóide.) receptores espécie-específicos de bindina no envoltório vitelínico. Esses anticorpos de porco haviam sido ligados covalentemente à enzima peroxidase. (B) Localização de bindina no processo acrossômico após a reação acrossômica (33. D. J. Mesmo (A) Figura Figura 4. Perez e W. moléculas de peroxidase foram colocadas em todos os lugares onde havia bindina. Como pode ser visto na Figura 4. Lennarz. 1993. Tais receptores também foram sugeridos pelos experimentos de Vacquier e Payne (1973).14 Receptores de bindina no óvulo. (A cortesia de C.

A ligação de espermatozóide à zona é relativamente. Assim.. ativação e adesão do espermatozóide à superficie do óvulo.14B). parece haver espaço no óvulo para mais cabeças de espermatozóide.. cortesia dos autores. de 83-kDa.. A região ligante de bindina se estende para o espaço extracelular e provavelmente se torna um componente do envoltório vitelínico. ZP1 e ZP2. 1986). 1980. Florman e Storey. 1978. Um grande complexo de glicoproteínas dos envoltórios vitelínicos de óvulos de ouriço-do-mar foi isolado e mostrou ligar bindina radioativa de maneira espécie-específica (Glabe e Vacquier. B de Bleil e Wassarman. purpuratus. Bleil e Wassarman (1980. Assim. Essa matriz de glicoproteínas é sintetizada e secretada pelo oócito em crescimento. e a ligação do espermatozóide do camundongo à zona dessa espécie pode ser inibida pela incubação prévia de espermatozóide com glicoproteínas da zona.) Ligação do espermatozóide (%) ZP3 sem carboidratos (A) Equivalentes da zona pelúcida por µl (B) . 1979. Essa glicoproteína é também capaz de competir com óvulos pelo espermatozóide da mesma espécie. o espermatozóide se liga a ele e não irá fertilizar os óvulos. 1993). não irá interferir com a fertilização de outros ouriços-do-mar relacionados. que é o competidor ativo nesse ensaio de inibição. porém. 1984). As outras duas proteínas da zona. Cherr et al. espécie-específica (especificidade por espécie não deveria ser um grande problema quando a fertilização ocorre internamente). concentrar suas enzimas proteolíticas diretamente no ponto de fixação à zona pelúcida. (A segundo Bleil e Wassarman. Isto é. purpuratus é misturado com o receptor de bindina de envoltórios vitelínicos de S. porém não absolutamente.15). 1985. Esses receptores de bindina se agregam em complexos. reconhecimento espécieespecífico dos gametas do ouriço-do-mar ocorrem ao nível da atração. 1986. (A) ensaio de inibição mostrando a diminuição específica da ligação do espermatozóide do camundongo às zonas pelúcidas quando espermatozóide e zonas são incubados com aumentos crescentes da porção carboidrato da glicoproteína ZP3. [fert4.15 Ligação do espermatozóide à zona pelúcida.. e tem dois papéis importantes durante a fertilização: liga o espermatozóide. O receptor isolado de S. 1986. (B) Ligação de ZP3 marcada radioativamente a espermatozóide capacitado do camundongo. purpuratus. 1988) isolaram da zona pelúcida do camundongo uma glicoproteína ZP3. Rossignol et al. indicando haver um número limitante de locais ligantes de espermatozóide. ZP3 também inicia a reação acrossômica após os espermatozóides terem se ligado a ela. ZP3 é a proteína específica na zona pelúcida à qual se liga o espermatozóide do camundongo.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 135 a níveis saturantes de espermatozóide (aproximadamente 1500). e centenas deles são provavelmente necessários para amarrar o espermatozóide no óvulo (Figura 4. e Florman e Wassarman. Figura 4. indicada por essa figura. se espermatozóide de S. A zona pelúcida tem nos mamíferos um papel análogo aquele do envoltório vitelínico nos invertebrados. ZP3 radiativamente marcada ligou-se às cabeças do espermatozóide do camundongo que tinha acrossomos intactos. O espermatozóide do camundongo pode. e inicia a reação acrossômica após essa ligação (Saling et al. Ainda mais. dessa forma. não puderam competir pela ligação do espermatozóide (Figura 4. 1982. A importância da porção carboidrato de ZP3 é também. Esse receptor de bindina é uma glicoproteína transmembrana com quase 1300 aminoácidos (Foltz et al.html] Ligação de Gametas e Reconhecimento em Mamíferos ZP3: A PROTEÍNA LIGANTE DA ZONA PELÚCIDA DO CAMUNDONGO.

a galactosil-transferase e a quinase do receptor da zona. ligando Zona pelúcida Óvulo Espermatozóide ZP3 (proteína ligante de espermatozóide) na Zona ZP3 Proteínas candidatas a ligação à zona no acrossomo N-acetil glicosamina Galactose Membrana celular do espermatozóide GALACTOSILTRANSFERASE Ligação cruzada ativa proteínas G Ativação de síntese de IP3 na membrana acrossômica SP 56 (proteína periférica da membrana) P95 Ativação de tirosinoquinase Regulação de canais iônicos ou síntese de IP3 Figura 4. Parece que cada uma delas tem papéis específicos.136 PARTE II Padrões de Desenvolvimento O mecanismo molecular pelo qual a zona pelúcida e o espermatozóide do mamífero se reconhecem mutuamente está sendo estudado. A proteína ZP3 da zona pelúcida liga espermatozóide. Esses pesquisadores posteriormente isolaram essa proteína. A hipótese corrente sobre a ligação dos gametas de mamíferos postula um conjunto de proteínas do espermatozóide capazes de reconhecer regiões específicas de carboidratos na zona ZP3 do óvulo (Florman et al. Uma proteína crítica ligante da zona do espermatozóide parece ser a proteína que especificamente se liga aos resíduos de galactose de ZP3.16: Snell e White. Saling. Os detalhes ainda terão que ser elucidados. 1989). 1984. A remoção desses grupos de carboidratos ligados por treonina ou serina suprime a habilidade de ligar o espermatozóide. (Segundo Snell e White. Há uma controvérsia significativa sobre a questão de se todas as três proteínas no espermatozóide são necessárias para ligação à zona. e milhares desses sítios podem ser necessários para prevenir que essas duas células se separem. Se essa galactose terminal for removida ou modificada quimicamente.. Wassarman..16 Liberação de Ca++ Reação acrossômica Ligação de espermatozóide à zona pelúcida do camundongo: alguns possíveis participantes. Como é a zona capaz de ligar e conservar esses espermatozóides contorcedores? Parece que ZP3 pode ligar-se a pelo menos três proteínas adesivas na membrana do espermatozóide. Essas três proteínas são: a proteína ligante de galactose. os espermatozóides se aproximam paralelamente ao plano da superfície da zona e aí são ativamente fixados (Baltz et al. 1988). A PROTEÍNA LIGANTE DE GALACTOSE 56-KDA (SP56). mas um tanto sobrepostos na adesão do espermatozóide e na reação acrossômica. 1996). Há evidência da ligação de três proteínas espermáticas – a galactosiltransferase da superfície. 1985. 1987.) . Florman e Wassarman. Bleil e Wassarman (1980) mostraram que um dos carboidratos críticos da glicoproteína ZP3 é o grupo galactose terminal. Na realidade. O espermatozóide do camun- dongo não “fura” para chegar ao interior da zona. Essa ligação induz a reação acrossômica através da ativação do fluxo de cálcio. PROTEÍNAS DE ADESÃO ESPERMATOZÓIDE-ZONA. 1996. sp56 e P95 – à ZP3. a atividade ligante de espermatozóide é perdida. e quais as suas respectivas funções (veja Figura 4.

. ligava-se a resíduos de galactose. Bookbinder et al. mas não se ligou a partículas recobertas com ZP2 em experimento semelhante. Miller et al. (2) remoção de resíduos de N-acetilglicosamina de ZP3. 1992).17. porém um peptídio de 56kDa. Os embriões bicelulares (aqui marcados por asteriscos) são controles internos mostrando não ocorrer ligação. ela não pode catalisar a reação porque o segundo reagente está faltando. A função enzimática dessa enzima de 60-kDa seria a de catalisar a adição de um açúcar galactose (de UDP-galactose) para uma cadeia de carboidrato terminando em um açúcar N-acetilglicosamina (veja Capítulo 3). não há resíduos de UDP-galactose no trato reprodutivo feminino. cortesia de J. 1995.) ser importante para ligação espermatozóides-zona é a enzima da membrana celular do espermatozóide. UDP-galactose. exatamente como qualquer enzima se ligaria a um substrato. fazendo migrar as proteínas extraídas em um gel. e (4) colocação de um excesso de galactosiltransferase no meio (a enzima em excesso iria ligar-se à zona e inibir o espermatozóide de se ligar) (Lopez et al.. 1985. indicando que sp56 se liga aos óvulos. 1990). diretamentre acima do acrossomo. Não se vê sp56. GALCTOSILTRANSFERASE. (C ) Na presença de sp56. 1992).b. A proteína sp56 liga-se à zona pelúcida de ovos não-fertilizados (porém não dos fertilizados). ou pela adição do segundo reagente. A pista 2 mostra o resultado positivo obtido quando o ovo não-fertilizado é pré-incubado com sp56. Bleil.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 137 Figura 4. as proteínas isoladas da membrana de espermatozóides de camundongo (Bleil e Wassarman... passando em seguida. (3) adição de anticorpos que bloqueiam a atividade da galactosiltransferase. glicosiltransferase. (de Bookbinder et al. Nacetilglicosamina:galactosiltransferase. o espermatozóide foi impedido de se ligar à zona. poderíamos esperar que a ligação óvulo-espermatozóide seria inibida ou pela inibição da enzima. . Essa enzima. A maioria das proteínas passou pela coluna. bloqueando a ligação espermatozóide-óvulo (Figura 4. sugerindo fortemente ser um receptor de espermatozóide ligante à entidade terminal de galactose na glicoproteína ZP3. No entanto. Assim. A Segunda proteína do espermatozóide que parece Sp56 purificada liga-se à zona pelúcida e inibe a ligação de espermatozóide a óvulos de camundongo. No laboratório de Shur foi demonstrado que esse receptor para a zona é uma enzima que reconhece o açúcar N-acetilglicosamina na ZP3 (Shur e Hall. Se essa hipótese estiver correta. (O anticorpo reconhece a forma não-reduzida de sp56. 1995). e sondando para a presença de sp56 com anticorpo marcado. 1988). Isso é exatamente o que Shur e colaboradores acharam ser o caso. A agregação dessas galactosiltransferases ocasiona a ativação de uma proteína G que pode ser importante na iniciação da reação acrossômica (Gong et al. 1995). membranas de espermatozóide de camundongo irão transferir um açúcar de UDP-galactose especificamente para ZP3 (Miller et al. 1985. A pista 4 mostra o controle quando sp56 purificada é feita migrar no gel. A ligação espermatozóide-zona foi bloqueada por: (1) adição de UDPgalactose. Portanto. as enzimas (no espermatozóide) ficam ligadas a seus substratos (na zona). 1982a. (B) Espermatozóide ligando-se normalmente a ovos não-fertilizados de camundongo (aproximadamente 76 espermatozóides por óvulo). Shur e Neely. está embebida na membrana plasmática do espermatozóide. Embora a enzima possa se ligar aos resíduos de proteínas da zona. A pista 1 é o resultado da lise de ovos não-fertilizados.D. Lopez et al. Além disso. com seu sítio ativo apontando para fora. Essa proteína foi encontrada exposta na membrana espermática. transferindo o gel.. por essa coluna. A pista 3 mostra os resultados negativos obtidos quando sp56 foi adicionada a embriões bicelulares. que migra em 40 kDa). ligou-se às partículas recobertas com ZP3..17 ZP3 à uma coluna de afinidade.. (A) Ligação de sp56 à zona pelúcida de ovos não-fertilizados. a galactosiltransferase da superfície do espermatozóide parece reconhecer um grupo carboidrato na proteína ZP3 da zona pelúcida do camundongo.

ligação secundária à zona é considerada ser mediada pela proteína PH-20.18 Diagrama da estrutura fibrilar da zona pelúcida do camundongo. por lise. É ali que estão localizadas as proteínas ligantes de ZP3 e. Durante a reação acrossômica. Essa atividade é estimulada quando a proteína liga ZP3. Quando essa proteína da membrana acrossômica interna foi injetada em cobaias macho ou fêmea. 1988). formando uma esteira de malhas. sendo depois convertida na enzima ativa que digere localmente a zona pelúcida. Enquanto espermatozóide com acrossomo intacto não irá se ligar à ZP2 glicoproteína. 1987. É possível que a proacrosina se ligue à zona. No espermatozóide porcino. 1989). anticorpos contra a proteína ZP2 não irão impedir a ligação do espermatozóide com acrossomo intacto à zona. O espermatozóide humano tem uma proteína semelhante. 1994. há muito tempo conhecida por estar envolvida na digestão da zona pelúcida. Na cobaia. Não é conhecido quais das proteínas do espermatozóide do camundongo se ligam à ZP2. ocasionalmente ainda ligadas por ZP1 (Figura 4. mas pode envolver a trajetória IP3 (Florman. Isso implica que a proteína de 95-kDa é uma tirosina quinase de receptor. 1988). 1988). Esse tipo de ligação abre os canais de cálcio. INDUÇÃO DA REAÇÃO ACROSSÔMICA EM MAMÍFEROS POR ZP3. como também bloqueou a adesão espermatozóide-zona in vitro. A estrutura da zona consiste de unidades repetitivas de ZP3 e ZP2. de mover-se mais para perto do óvulo. Além disso. Em camundongos. 1992b). O soro sangüíneo dessas cobaias estéreis tinha uma concentração extremamente alta de anticorpos para PH-20. Suarez e Dai. Proacrosina torna-se a protease acrosina. 1989. como ocorre a reação acrossômica nos mamíferos? A reação é induzida pela porção protéica de ZP3 (Endo et al. inibem a ligação do espermatozóide à zona pelúcida humana.. Filamentos principais da zona pelúcida são compostos por dímeros repetitivos das proteínas ZP2 e ZP3.) . Uma das proteínas liberadas é a protease que especificamente altera ZP2 (Moller e Wassarman. e que pode iniciar a reação acrossômica através da fosforilação das suas proteínas alvo (veja Capítulo 3). o espermatozóide deve permanecer ligado à zona para abrir. ligação secundária à zona parece ser mediada por proacrosina.. O anti-soro de cobaias esterilizadas por injeções de PH-20 não só se ligou especificamente a essa proteína. e a ZP3 humana estimula a atividade da quinase. sugerindo possível uso como contraceptivo (Burks et al. a parte anterior da membrana plasmática do espermatozóide é solta (veja Figura 4.. 1995). 1992). 100% desses animais tornaram-se estéreis por vários meses (Primakoffet al. Após a entrada de espermatozóide de camundongo no óvulo. os grânulos corticais do ovo liberam seu conteúdo. Uma vez que o espermatozóide capacitado ligou-se à zona pelúcida. enquanto o sítio intracelular tem atividade enzimática de tirosina quinase (Leyton et al.html] LIGAÇÃO SECUNDÁRIA DO ESPERMATOZÓIDE À ZONA PELÚCIDA.. Além disso. parece que uma ligação secundária à zona é conseguida por proteínas na membrana acrossômica interna que se ligam especificamente a ZP2 (Bleil et al.1989a). O sítio extracelular liga especificamente ZP3. Isso inibe outros espermatozóides. O mecanismo pelo qual age o ZP3 e a subseqüente exocitose do acrossomo permanece controversa.10).138 PARTE II Padrões de Desenvolvimento RECEPTOR DE QUINASE DA ZONA (ZRK). cujo acrossomo já reagiu. Esses filamentos estão ocasionalmente ligados por ZP1. proacrosina é também uma proteína ligante da fucose que mantém a conexão entre espermatozóide que reagiu com acrosina e a zona pelúcida (Jones et al.. transferem sua ligação com ZP3 para as moléculas adjacentes de ZP2. O efeito ZP1 ZP2 ZP3 Resíduos de carboidratos Figura 4. mas irão inibir a fixação do espermatozóide que já tenha reagido. [fert5. ainda assim. e ZP3 parece atuar perfazendo ligação cruzada com seus receptores na membrana espermática. um caminho através dela.18). Uma terceira proteína espermática que se liga à zona pelúcida do camundongo parece ser uma proteína transmembrana de 95-kDa com dois sítios funcionais. No entanto. aumentando a concentração do íon no espermatozóide (Leyton e Saling. Parece que os espermatozóides com acrossomo que reagiram.. 1995). o espermatozóide cujo acrossomo reagiu o fará. (Segundo Wassarman. peptídios sintéticos que mimetizam o domínio extracelular (que liga ZP3) dessa proteína. Leyton e Saling.

1980. J. Epel. A superfície do óvulo está coberta de pequenas microvilosidades. cortesia de G. 1960. Ainda assim. Os animais foram temporariamente esterilizados por esses anticorpos. certos antígenos do espermatozóide apresentam um padrão semelhante de localização no espermatozóide. 1983). esses experimentos mostram que o princípio da contracepção imunológica está bem fundamentado.19 Varredura ao microscópio eletrônico da entrada do espermatozóide em óvulo de ouriço-do-mar. D cortesia de F. A entrada do espermatozóide no óvulo do ouriço-do-mar está ilustrada na Figura 4. Longo. Schatten. porém. As proteínas da zona pelúcida humana e suas funções ainda não foram estabelecidas tão claramente como no camundongo. Schatten e Schatten. (A-C de Schatten e Mazia. a fusão espermatozóide-óvulo parece causar a polimerização da actina e a extensão de várias microvilosidades para formar o cone de fertilização (Summers et al. (D) Micrografia de transmissão ao microscópio eletrônico da internalização do espermatozóide através do cone de fertilização. 1980). Fusão de gametas e a prevenção da polispermia Fusão entre as membranas do óvulo e do espermatozóide O reconhecimento do espermatozóide pelo envoltório vitelínico ou zona é seguido pela lise da porção do envoltório ou zona na região da cabeça do espermatozóide (Colwin e Colwin. Essa lise é seguida pela fusão da membrana espermática com a membrana do óvulo.) (C) (D) . (A) Contato da cabeça do espermatozóide com microvilosidades do óvulo através do processo acrossômico.19. 1976.. O análogo humano da proteína PH-20 não é ainda conhecido. A homologia entre óvulo e espermatozóide é novamente (A) (B) Figura 4. (B) Formação do cone de fertilização. 1975. (C) Internalização do espermatozóide no óvulo. após os quais a fertilidade foi restabelecida.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 139 contraceptivo perdurou por vários meses.

1979). Blobel et al. tal como as proteínas fusogênicas virais.140 PARTE II Padrões de Desenvolvimento demonstrada. 1986).. todas as regiões do óvulo são capazes de se fundir com o espermatozóide. No ouriço-do-mar. A mais comum é a de impedir a entrada de mais de um espermatozóide no óvulo. mitocôndrias. O núcleo e a cauda do espermatozóide passam pela ponte citoplasmática. Glabe (1985) mostrou que a bindina do ouriço-do-mar promove a fusão de vesículas fosfolipídicas e que. efetivada por uma mudança elétrica na membrana plasmática do óvulo. a bindina contém uma longa região de aminoácidos hidrofóbicos perto do terminal amino. Prevenção da Polispermia Assim que um espermatozóide tiver penetrado o óvulo. causada pela exocitose dos grânulos corticais. mas três vezes.20). sendo possível que a bindina também seja uma dessas proteínas. 1992. mediar a união das duas membranas (Almeida et al. Após a junção.html] As espécies desenvolveram maneiras de prevenir a união de mais de dois núcleos haplóides. A fertilina do camundongo tem regiões hidrofóbicas semelhantes às das proteínas fusogênicas virais. em seguida. que fora tão necessária para conseguir a penetração. 1994). a capacidade de fusão da membrana do óvulo. restaurando o número de cromossomos apropriado para a espécie. 1970). Evidência atual sugere que a fertilina do camundongo liga-se à integrina α6β1 da membrana assumindo-se que a região hidrofóbica da fertilina pode. centríolo e flagelo podem penetrar no ovo.. a fertilização por dois espermatozóides resulta em um núcleo triplóide.. um núcleo haplóide do espermatozóide e um do óvulo se combinam para formar o núcleo diplóide do ovo fertilizado (zigoto). Proteínas como a HA do vírus da influenza e a proteína F do vírus Sendai promovem a fusão celular.. torna-se um risco. Em abalones. qualquer espermatozóide que penetra o óvulo. Como não há mecanismos para assegurar que cada uma das quatro células receba o número e o tipo apropriado de cromossomos. Algumas células receberiam cópias extra de certos cromossomos e outras células não os teriam. No ouriço-do-mar. O centríolo. no qual cada cromossomo está representado não duas. provindo do espermatozóide. O óvulo do ouriço-do-mar tem dois mecanismos que evitam a polispermia: uma reação rápida. . em várias outras espécies.21). parece se prolongar pela polimerização da actina. freqüentemente mediado por proteínas “fusogênicas” específicas. A fusão é um processo ativo. podese encontrar material do espermatozóide na membrana do óvulo (Gundersen et al. existem regiões especializadas na membrana para o reconhecimento e fusão com o espermatozóide (Vacquier. tal como o processo acrossômico.. em vez de um fuso mitótico bipolar separar os cromossomos em duas células. Quando as membranas se fundem. As proteínas fertilinas da membrana do espermatozóide dos mamíferos são essenciais para fusão espermatozóide-óvulo (Primakoff et al. como o centríolo se divide para formar os dois pólos do aparelho mitótico. esses serão distribuídos de maneira desigual. pode prover um núcleo haplóide e um centríolo para o óvulo. Myles et al. porque o cone de fertilização transitório. Theodor Boveri demonstrou em 1902 que tais células ou morreriam ou se desenvolveriam anormalmente (Figura 4. o núcleo. Na monospermia normal. e uma reação mais lenta. aqui. 1995). a lisina que dissolve o envoltório vitelínico também demonstrou ter atividade fusogênica (Hong e Vacquier. Pior ainda. 1987. A entrada de múltiplos espermatozóides – polispermia – conduz à conseqüências desastrosas na maioria dos organismos. na qual somente um espermatozóide penetra o óvulo. como na maioria dos animais estudados. se dividirá para formar os dois pólos do fuso mitótico durante a clivagem. que é alargada pela polimerização da actina. além de uma seqüência que sugere ligação com uma integrina da membrana do óvulo. [fert6. No ouriço-do-mar. os cromossomos triplóides se dividiriam em quatro células. Yanagimachi e Noda (1970) mostraram que processo semelhante ocorre na fusão de gametas de mamíferos (Figura 4.

O oposto acontece com os íons potássio. é conseguido pela mudança do potencial elétrico da membrana do óvulo. 1970.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 141 (A) (B) (C) Zona (E) Membrana acrossômica interna Núcleo Segmento equatorial do acrossomo Figura 4. 1919). O bloqueio rápido à polispermia.20 Entrada de espermatozóide no óvulo do hamster dourado. mas também por sua capacidade de resistir a uma ulterior fusão imediatamente após a entrada de um espermatozóide (Just. Yanagimachi. (B) Vista próxima da ligação espermatozóide-zona.) O BLOQUEIO RÁPIDO DA POLISPERMIA. (E) Diagrama da fusão do acrossomo do espermatozóide e membranas plasmáticas com as microvilosidades do óvulo. que constantemente inibe a entrada de sódio no . 1994. (D) Micrografia eletrônica de transmissão. (Segundo Yanagimachi e Noda. A membrana celular do óvulo é notável não somente por sua habilidade de se fundir com a membrana espermática. A água do mar tem uma alta concentração do íon sódio. Essa provê uma barreira seletiva entre o citoplasma e o ambiente exterior. uma diferença especialmente pronunciada para os íons de sódio e potássio. do espermatozóide fundindo em paralelo a membrana do plasma do óvulo. ao passo que o citoplasma do óvulo tem relativamente pouco sódio. (A) Micrografia eletrônica de varredura do ato da fusão. O ponto “calvo” (sem microvilosidades) é o local abandonado pelo corpo polar. Essa condição é mantida pela membrana celular. Yanagimachi. a concentração iônica do óvulo difere muito daquela do ambiente. (C ) Micrografia eletrônica de transmissão mostrando a cabeça do espermatozóide atravessando a zona. fotografias cortesia de R.

Se os íons de sódio não forem suficientes para ocasionar um deslocamento positivo do potencial de membrana. Jaffe. Não é conhecido como diferenças no potencial de membrana atuam sobre o espermatozóide bloqueando a segunda fecundação. (D) Na anáfase da primeira divisão. Carroll e Epel (1975) demonstraram que a . (E) Quatro células contendo números e tipos diferentes de cromossomos são formadas. e usualmente expresso como –70 mV porque o interior da célula está carregado negativamente em relação ao exterior. (B. Não é conhecido como a ligação ou a entrada do espermatozóide sinaliza a abertura dos canais de sódio. podemos medir a constante diferença potencial da membrana plasmática do óvulo. trazendo a diferença de potencial para +20 mV (Figura 4. causando a morte prematura do embrião (F). O bloqueio rápido é transitório. Os autores isolaram do espermatozóide de Urechis (um verme equiuróide marinho) uma proteína cromossômica capaz de abrir canais de sódio de óvulos de Urechis. 1976). porém. e divisão dos dois centríolos espermáticos para formar quatro pólos mitóticos. 1986). A abertura dos canais de sódio no óvulo. 1983). Essa curta mudança de potencial não é suficiente para prevenir a polispermia de maneira permanente. 1989). 1980). o potencial da membrana muda para um nível positivo (Longo et al. O bloqueio rápido da polispermia podia também ser evitado baixando-se a concentração do sódio da água (Figura 4.) Fusão pronuclear (B) 1a clivagem (C) (D) (E) (F) oócito e impede o escoamento de íons de potássio para o ambiente. 1979.142 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) Oócito Pronúcleos do espermatozóide Centrossomo do espermatozóide Figura 4. Jaffe e seus colaboradores mostraram que a polispermia podia ser induzida quando óvulos foram supridos artificialmente com uma corrente elétrica que mantinha negativo o seu potencial de membrana. 1980).. cada um contendo 18 cromossomos. morte do embrião tros) têm um segundo mecanismo para assegurar que múltiplos espermatozóides não penetrem no citoplasma do óvulo (Just. C) Os 54 cromossomos se distribuem aleatoriamente nos quatro fusos. Quando tais óvulos são expostos a essa proteína. O BLOQUEIO LENTO DA POLISPERMIA.html] Dentro de 1-3 segundos após a ligação do primeiro espermatozóide. ocorre a polispermia (Gould-Somero et al. Um pequeno influxo de íons de sódio no óvulo é permitido. [fert7. regulada pela carga elétrica transmembrana (Iwao e Jaffe. (Segundo Boveri. a fertilização podia ser inteiramente prevenida conservando tal potencial positivo (Jaffe. Esse potencial de repouso da membrana é geralmente cerca de 70 mV. Muito provavelmente.21 Pronúcleos do oócito Desenvolvimento aberrante de um óvulo de ouriço-do-mar fecundado por dois espermatozóides. 1991) forneceram o que poderá ser uma pista importante para a compreensão desse processo. parece ser causada pela ligação do espermatozóide ao óvulo. os cromossomos duplicados são arrastados para os quatro pólos.22B-D). (A) Fusão de três núcleos haplóides. 1919).22 A). sendo a inserção desse componente na membrana do óvulo. 1907. não pode se fundir com membranas com um potencial de repouso positivo. Quando inserimos um eletrodo no óvulo e colocamos um outro fora do oócito. Gould e Stephano (1987. a mudança da velocidade do influxo de sódio e do potencial de membrana resultante são muito parecidos com aqueles produzidos pelo espermatozóide vivo. Embora o espermatozóide possa se fundir com membranas tendo um potencial de –70 mV. Reciprocamente. o potencial de membrana do óvulo do ouriço-do-mar somente permanece positivo por cerca de um minuto. mas provavelmente não na maioria dos mamíferos (Jaffe e Cross. Óvulos do ouriço-do-mar (e muitos ou- Células em desintegração.. o espermatozóide conduz um componente (possivelmente uma proteína fusogênica carregada positivamente). Um bloqueio elétrico à polispermia também ocorre em rãs (Dross e Elinson. provavelmente.

a diferença de potencial através da membrana celular do óvulo é de aproximadamente –70 mV. A. Mozingo e Chandler. dessa forma. forma uma capa em volta do óvulo (Hylander e Summers. Enzimas liberadas modificam os receptores de espermatozóide da . Essas enzimas dissolvem os postos vitelínicos que conectam as proteínas do envoltório vitelínico à membrana celular. 1978). 1991). As primeiras são proteases. De 1 a 3 segundos após o espermatozóide fertilizante ter entrado em contato com o óvulo. (B) Ovos controle desenvolvendo-se em Na+ 490 mM. secionando o receptor de bindina e todo espermatozóide a ele ligado (Vacquier et al. O processo se inicia cerca de 20 segundos após a fixação do espermatozóide e se completa ao fim do primeiro minuto da fertilização.. mucopolissacarídeos liberados dos grânulos. Diretamente abaixo da membrana do óvulo do ouriço-do-mar existem 15. a hialina.24). cada um com 1 um de diâmetro (veja Figura 4. uma peroxidase.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 143 Figura 4. fotografias cortesia de L.23 e 4. (C) Polispermia em ovos fertilizados em Na+ 120 mM (colina foi substituída por sódio). porém. Como mostra a Figura 4. Glabe e Vacquier. produto dos grânulos corticais. 1973. o potencial se desloca na direção positiva. o envoltório vitelínico se expande e passa a ser chamado de envoltório de fertilização (Figuras 4. 1977. Essa remoção é conseguida pela reação dos grânulos corticais. a reação granular não cria um envoltório de fertilização. o envoltório de fertilização começa a se formar no local da entrada do espermatozóide e continua sua expansão ao redor do óvulo. uma quarta proteína granular. os espermatozóides são liberados. liberando seu conteúdo para o espaço entre a membrana e a esteira fibrosa das proteínas do envoltório vitelínico.) [Na+] (mM) Porcentagem de ovos polispérmicos (B) (C) (D) polispermia ainda pode ocorrer se os espermatozóides ligados ao envoltório vitelínico não forem removidos de alguma maneira. 1982). Uma terceira proteína. 1980. o efeito é o mesmo. Outras proteínas. Com a entrada do espermatozóide.22 Adição de espermatozóide (A) Segundos Potencial de membrana de óvulos de ouriço-do-mar antes e após a fertilização. que fornece apoio para os blastômeros durante a clivagem.23. um bloqueio mecânico mais lento da polispermia que se torna ativo cerca de 1 minuto após a primeira ligação bem sucedida espermatozóide-óvulo. produzem um gradiente osmótico que permite a entrada da água no espaço entre a membrana celular e o envoltório e. À medida que esse envoltório se forma.000 grânulos corticais. Jaffe. (de Jaffe. enrijece o envoltório de fertilização através de ligações cruzadas entre resíduos de tirosina em proteínas adjacentes (Foerder e Shapiro. (A) antes da adição do espermatozóide.6B). Em mamíferos. Os ovos de Lytechinus foram fotografados durante a primeira clivagem. Há várias proteínas associadas com esse processo de exocitose de grânulos corticais. Finalmente. esses grânulos se fundem com a membrana plasmática do óvulo. (D) Tabela mostrando a elevação da polispermia com o decréscimo da concentração do íon sódio. A célula estende microvilosidades alongadas cujas extremidades se ligam a essa camada hialina.

Assim. Nessas concentrações. (B. iniciado no ponto de entrada do espermatozóide. Durante essa reação. tanto ZP3 como ZP2 são modificadas. Essa modificação é chamada reação da zona. pode ser monitorada visualmente pelo uso de corantes luminescentes (isolados da água-viva luminescente) como a aequorina ativado pelo cálcio. CÁLCIO COMO O INICIADOR DA REAÇÃO GRANULAR CORTICAL . propuseram que os grânulos corticais do óvulo do camundongo contêm uma enzima que corta os resíduos terminais de açúcares de ZP3. começando no ponto de entrada do . Florman e Wassarman (1985).) (C) (D) zona pelúcida de maneira que esses não mais podem ligar-se a espermatozóide (Bleil e Wassarman. A liberação de cálcio armazenado na região intracelular. causando exocitose de seu conteúdo (veja Figura 4. (de Vacquier e Payne. 1973. uma onda de exocitose se propaga ao redor do corte até o lado oposto do ovo. 1980). a concentração intracelular de cálcio do ovo aumenta muito. O meca- nismo da reação dos grânulos corticais é semelhante aquele da reação acrossômica. e o excesso de espermatozóide é removido. Esses corantes emitem luz quando ligam íons livres de cálcio. D. Vacquier. Espermatozóide foi adicionado a óvulos de ouriço-do-mar.144 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 4. A Prancha 12 mostra a notável onda de liberação de cálcio que se propaga através do óvulo do ouriço-do-mar.C) 25 e 35 segundos após a inseminação. (A) Dez segundos após a adição de espermatozóide. 1993) demonstraram que após a fertilização. as membranas corticais se fundem com aquelas do ovo.24). Esses grânulos corticais contêm N-acetilglicosaminidases capazes de clivar N-acetilglicosamina de cadeias de carboidrato de ZP3. Os óvulos são injetados com o corante e fecundados. um envoltório de fertilização se forma em volta do óvulo. (D) O envoltório de fertilização está completo. Miller e colaboradores (1992. ZP2 é cortada pelas proteases granulares perdendo também sua habilidade de ligar espermatozóide (Moller e Wassarman. e a suspensão foi fixada em formaldeído para evitar futuras reações. ou de corantes como fura-2. Após a fertilização. ZP3 não serve como substrato para a ligação de galactosiltransferase. com isso liberando espermatozóide ligado à zona e evitando a fixação de mais espermatozóide. cortesia de V.23 (A) (B) Formação do envoltório de fertilização e remoção do excesso de espermatozóide. o espermatozóide não pode mais iniciar ou manter sua ligação à zona pelúcida e é rapidamente descartado. o resíduo de N-acetilglicosamina é removido. 1989). Após a fusão dos grânulos corticais ao redor do ponto de entrada do espermatozóide. esses foram vistos rodeando o óvulo.

(B. 1977. 1965. a grosso modo.. A droga A23187 é um ionóforo que transporta íons de cálcio através de membranas. os íons livres de cálcio são re-seqüestrados pouco após sua liberação. a liberação de cálcio pode ser vista começando em dois pontos separados da superfície celular (Hafner et al.. causando a entrada de água e tumefação do espaço entre o envoltório vitelínico e a membrana celular. A colocação de . em 30 segundos no ovo do ouriço-do-mar. O mecanismo dessa onda será discutido logo adiante (veja Informações adicionais & Especulações. cortesia de D. Vários experimentos demonstraram que íons de cálcio são responsáveis diretos pela propagação da reação cortical e que são armazenados dentro do próprio óvulo. 1979. Como documentado pelas fotografias. Gilkey et al. Ao contrário. Chandler. A total liberação de íons de cálcio é completada. página 147). Quando dois espermatozóides entram no citoplasma do óvulo.. E. B-E de Chandler e Heuser. permitindo a esses cátions atravessar barreiras antes impermeáveis.C) Micrografias eletrônicas de transmissão e de varredura do córtex de um ovo não fertilizado de ouriço-do-mar. (A segundo Austin.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 145 Membrana plasmática (i) do óvulo Microvilosidade Envoltório vitelínico Figura 4. (A) Diagrama esquemático mostrando os eventos levando à formação do envoltório de fertilização e a camada hialina.. a liberação de cálcio inicia-se de um lado da célula e termina do outro.24 Grânulo cortical (ii) Espermatozóide supranumerário no envoltório vitelínico (B) Enzimas proteolíticas e mucopolissacarídeos são liberados (iii) (C) Exocitose de grânulos corticais. Hafner et al. 1988). Outras enzimas liberadas dos grânulos corticais endurecem o envoltório vitelínico (agora o envoltório de fertilização) e liberam espermatozóide a ele ligado. Mucopolissacarídeos liberados pelos grânulos formam um gradiente osmótico. E) Micrografias eletrônicas de transmissão e varredura da mesma região de um ovo recém-fertilizado. os íons de cálcio não se difundem simplesmente através do óvulo a partir do ponto da entrada do espermatozóide. (D. À medida que os grânulos corticais sofrem exocitose. 1988). liberam proteases que cortam as proteínas que ligam o envoltório vitelínico à membrana celular. 1978.) Microfilamentos Hialina (D) Espermatozóide é liberado (iv) Envoltório de fertilização Camada hialina (A) Membrana celular (E) espermatozóide um feixe de luz atravessa a célula (Steinhardt et al. mostrando a elevação do envoltório de fertilização e os pontos nos quais os grânulos corticais fundiram com a membrana plasmática do ovo (flechas em D).

cujos óvulos sofrem uma reação granular cortical. 1985). causando assim uma onda libertadora do íon cálcio e exocitose granular cortical. 1992. cortesia de F. 1976. Finalmente. 1981. leva à reação granular cortical e à elevação do envoltório de fertilização. (B) Retrato de um óvulo inteiro corado por anticorpos fluorescentes para os canais de liberação de cálcio. Fulton e Whittingham. Os anticorpos mostram esses canais no retículo endoplasmático cortical. O bloqueio à polispermia em hamsters parece ser controlado somente pela liberação de sítios que ligam o espermatozóide na zona pelúcida (Miyazaki e Igusa. répteis e salamandras. Gardiner e Grey. Luttmer. Coelhos. cortesia de S. mesmo na ausência de íons de cálcio na água do mar. Variações em estratégias preventivas da polispermia existem em toda a natureza. somente um núcleo haplóide de espermatozóide pode fundir-se com o núcleo haplóide do óvulo. Uma vez iniciada. 1985. camundongo e rã.) (A) (B) . a polispermia é minimizada pelo pequeno número de espermatozóides que atingem o local da fecundação (Braden e Austin. 1991). Luttmer e Longo. o retículo endoplasmático cortical fica 10 vezes mais abundante durante o amadurecimento do óvulo e desaparece localmente dentro de um minuto após a ocorrência da onda de exocitose em qualquer região do córtex. Nos óvulos ricos em gema de certas aves. 1986).25. e ninguém iria disputar o seu grau de sucesso. O grânulo é visto rodeado pelo retículo. no entanto. (A) O retículo foi corado com ósmio-iodeto de zinco para permitir a visualização por micrografia de transmissão eletrônica. Cálcio livre é capaz de liberar cálcio seqüestrado de seus locais de armazenamento. certos mamíferos têm defesas para a polispermia sobre as quais pouco sabemos. esse retículo é pronunciado no córtex e rodeia os grânulos (Figura 4. Jaffe (1983) compara esse retículo endoplasmático seqüestrador de cálcio. Os íons de cálcio internos são armazenados no retículo endoplasmático do óvulo (Eisen e Reynolds. Portanto. 1985). Longo. De uma maneira desconhecida. Qualquer que seja o mecanismo. 1983. todos menos um são induzidos a se desintegrar no citoplasma após a fusão do pronúcleo do óvulo com um dos pronúcleos do espermatozóide (Ginzburg. Estudos posteriores (Hollinger e Schuetz. a liberação de cálcio é autopropagada. Kline. Steinhardt e Epel. Figura 4.25 Retículo endoplasmático rodeando grânulo cortical no óvulo de ouriço-do-mar. 1974. A23187 provoca a liberação de íons de cálcio já seqüestrados em organelas dentro do óvulo (Chambers et al. 1988) mostraram que o íon de cálcio inicia reações granulares corticais quando injetado em ovos de ouriço-domar. Hamaguchi e Hiramoto. Na rã Xenopus. 1985. se apoiam num bloqueio da polispermia a nível da membrana. Jaffe e Gould. 1978. Nos mamíferos. Elinson.. J. No ouriço-do-mar e na rã. vários espermatozóides realmente penetram o citoplasma do óvulo. (A de Luttmer e Longo.146 PARTE II Padrões de Desenvolvimento ovos não-fertilizados de ouriço-do-mar em água do mar contendo A23187. 1985. Terasaki e Sardet. 1981.. ao retículo sarcoplasmático do músculo esquelético ou cardíaco. 1954). 1974). B de McPherson et al.

O outro segundo mensageiro. Canais de cálcio respondendo ao IP3 foram encontrados no retículo endoplasmático do óvulo. Xu e colaboradores (1994) mostraram que o bloqueio da mediação por IP3 da saída de cálcio. o primeiro caminho se inicia pela ligação de um ligante extracelular (como a acetilcolina ou a serotonina) à uma proteína receptora transmembrana. 1986. 1986. que também é usado na proliferação e diferenciação celular.5-bifosfato (PIP2) em dois segundos mensageiros: inositol 1.. A questão então é: o que inicia a produção de IP3? Há dois caminhos que parecem estimular a liberação de cálcio: aquele do receptor ligado à proteína G. tanto DAG como IP 3 estão envolvidos nas ativação do óvulo. 1990). Esses receptores da superfície . 1986. trifosfato (IP3) é o evento primário para a liberação de íons cálcio do seu local de armazenamento intracelular. e esse pode continuar a onda. A ligação de íons de cálcio a esses receptores libera mais cálcio. impede todos os aspectos da ativação do óvulo pelo espermatozóide incluindo exocitose granular. O IP3 formado no local da entrada do espermatozóide é considerado ligar-se a esses receptores de IP3 no retículo endoplasmático. Esse receptor ativa a proteína G (veja Figuras 3. Uma vez liberados.. 1986). Em primeiro lugar. Terasaki e Sardet. confirmando que IP3 estimula a liberação de cálcio armazenado. Eles injetaram mRNA para o receptor de serotonina ou de acetilcolina em óvulos de rã.. IP 3 é também capaz de liberar íons de cálcio em óvulos de vertebrados. e quando injetaram ativadores da proteína G nesses óvulos. conforme demonstrado por Kline e colaboradores (1988. 1993). percepção sensorial e liberação de neurotransmissores (Berridge. Ayabe et al. O outro caminho é o do receptor da tirosinoquinase em cascata. 1992). [fert8. 1992. levando à sua dissociação em subunidades.35).. é considerado ativar a proteína quinase C (PKC) da membrana.. que uma proteína G pode estar envolvida na regulação de íons seqüestrados de cálcio.. os grânulos corticais se fundem com a membrana celular na presença de concentrações altas de cálcio. 1995). Mohri e colaboradores (1995) mostraram que o cálcio liberado por IP3 é necessário e suficiente para liberação de cálcio. então a mesma proteína G poderia ser ativada por um neurotransmissor se o ovo contiver um receptor para neurotransmissor capaz de ativar a proteína G. Como se pronunciou um investigador (Berridge. 1991). que é transferida do citosol para a membrana plasmática do ovo pouco após a fecundação. 1986). Tal ativação foi inibida por quelantes de cálcio. Conforme apresentado no Capítulo 3. Como em ouriço-domar IP3 também parece mediar a liberação de cálcio de sítios no retículo endoplasmático (Lechleiter e Clapham. respondem com uma onda de exocitose que segue os íons de cálcio. Shen e Burgart. 1985).33 e 3.. Kline et al. Essa cataliza a hidrólise de fosfatidilinositol 4. A etapa regulatória chave é a ativação da fosfolipase C. 1991).4. A proteína que faz a troca Na + /H+. os íons de cálcio podem difundir diretamente. que produz esses dois compostos.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 147 Informações adicionais & Especulações A Ativação do Metabolismo dos Gametas S e a liberação do íon cálcio é necessária para ativação do oócito. portanto. IP3 injetado pode liberar íons cálcio seqüestrados no óvulo e muitos outros tipos de células (Swann e Whitaker. 1991). 1986. 1984. No interior da membrana plasmática esse receptor é ligado à proteína trimérica G. Eles levantaram a hipótese que se essa proteína mediar a fertilização por ser ativada por um receptor ligante de espermatozóide. A libertação de íons cálcio e a reação dos grânulos corticais rapidamente seguem a formação ou injeção de IP3 (Whitaker e Irvine. Furuichi et al. Nishizuka. Essa onda de íons de cálcio é propagada por toda célula. O bloqueio da PKC em óvulos de ouriços-do-mar inibe a alcalinização do citosol observada durante a fertilização normal (Shen e Buck. Dados recentes sugerem que produção do inositol 1. secreção hormonal. crescimento celular. a ligação do espermatozóide a um receptor na membrana celular do óvulo pode mudar a sua conformação de modo a ativar a proteína G e iniciar a cascata (Figura 4. como o espermatozóide motiva essa liberação? Realmente não se sabe. ainda permanece algo misterioso”. 1993): “Exatamente como o espermatozóide dispara o processo explosivo da liberação do cálcio no óvulo. O resultado disso é a elevação de cálcio e do pH intracelulares. 1995). e pode ser responsável pela ativação da proteína que troca íons de sódio por íons de hidrogênio (Swann e Whitaker.. recrutamento de mRNA e recomeço do ciclo celular. Olds et al. O primeiro é capaz de abrir canais de cálcio. 1993). Os efeitos mediados por IP3 podem ser abortados pela pré-injeção de agentes quelantes de cálcio no óvulo (Turner et al. e o bloqueio do seu receptor em óvulos de hamster impede a liberação de cálcio no ato da fertilização. Jaffe e seus colaboradores encontraram a proteína G em óvulos de ouriço-do-mar e rã. Assim. ligando-se a mais receptores e assim por diante. ocasionando uma liberação local de cálcio (Ferris et al. largamente conhecido como liberadora de íons de cálcio na contração muscular. 1986.. 1992. Busa et al. DAG. Existem várias maneiras pelas quais isso pode acontecer. o aumento na concentração de IP 3 intracelular é visto ocorrer dentro de 10 segundos após a fecundação de ovos do ouriço-do-mar (Ciapa e Whitaker. também necessita de íons cálcio para sua atividade.5. como o EGTA.4. ou facilitar a liberação de mais íons de cálcio de receptores sensíveis ao cálcio localizados no retículo endoplasmático (McPherson et al. Miyazaki et al. causaram exocitose granular na ausência de espermatozóide (Turner et al.5 trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). 1989. capazes de ativar um conjunto de enzimas chamadas de fosfolipase C. e na exocitose de grânulos corticais.. Berridge. começando no ponto da entrada do espermatozóide.26A). DAG estimula a troca de prótons que permite o efluxo de íons de hidrogê- nio das células. 1989.html] Parece.

148 PARTE II Padrões de Desenvolvimento celular foram sintetizados e foram detectados na membrana celular do óvulo... (A) Trajetória do fosfatidilinositol mediado pela G-proteína. 1994) demonstram que a ativação do receptor da tirosinoquinase também produz IP3 e ativa a onda de cálcio e a reação granular cortical (Figura 4. 1992.26b). Quando. PDGF foi adicionado à água banhando os óvulos. Shilling et al. 1994. Evidências recentes (Moore et al. 1993). (B) Trajetória do receptor da tirosinoquinase (RTK).. Experimentos semelhantes mostraram que quando neurotransmissores ativam o caminho da proteína G–IP3 em oócitos de camundongo. Moore et al.. são induzidos os eventos da fertilização (Williams et al. (D) Trajetória na qual a G proteína ou tirosinoquinase ativadas na membrana espermática ativam trajetórias no óvulo. CAMINHOS ANTERIORES À FUSÃO DO ESPERMATOZÓIDE (A) Espermatozóide (B) (C) Fosfolipase C (PLC) Receptor G-proteína Receptor de Tirosinoquinase Receptor de IP3 Tirosinoquinase Retículo endoplasmático APÓS A FUSÃO DO ESPERMATOZÓIDE (D) Fator solúvel do óvulo Fatores solúveis do Espermatozóide G-proteína Receptor de IP3 Retículo endoplasmático .. o receptor PDGF foi sintetizado e incorporado nas membranas celulares desse organismo. Entretanto. Quando o mRNA para o receptor dessa quinase (o receptor para o fator de crescimento derivado das plaquetas. (C) Trajetória da tirosinoquinase citoplasmática. Quando o mRNA continha um ponto de mutação que impedia Mecanismos possíveis da ativação do óvulo. Yim et al. Os óvulos puderam ser “fertilizados” por serotonina e acetilcolina e foi observado a reação cortical. esses apresentaram aumento de cálcio intracelular livre. a cascata ligada à proteína-G não é o único caminho capaz de gerar IP3 (veja Capítulo 3). 1994. Alguns se desenvolveram em larvas.26 PDGF) foi injetado em oócitos de estrela-do-mar. (E) Trajetórias de ativadores solúveis. Figura 4. exocitose de grânulos corticais e síntese de DNA. após a maturação dos oócitos.

Terasaki e Sardet.1). assim. mas à fusão das membranas do óvulo e do espermatozóide. não pode se desenvolver sozinho. A salamandra prateada (Ambystoma platineum) é uma espécie híbrida que consiste somente de fêmeas. chamada oscilina. localizada no escasso citoplasma da cabeça do espermatozóide (Figura 4. 1983. Assim. Mc Culloch e Chambers (1992) obtiveram evidência eletrofisiológica que a ativação dos óvulos do ouriço-do-mar não ocorre até depois da junção do espermatozóide com o óvulo.. essa função desenvolvimental da fertilização está totalmente divorciada da função genética.26 E). recrutamento de mRNA e retomada do ciclo celular) não são observados. Esse ovo. tanto o caminho ligado ao receptor proteína-G como aquele do receptor da tirosinoquinase. nenhuma dessas reações ocorreu (Shilling et al. os outros parâmetros da ativação do óvulo (exocitose dos grânulos. criar IP3 e induzir o fluxo de cálcio no óvulo. rãs. por não ter semelhante em outras proteínas transmembrana. Parrington e colaboradores (1996) isolaram uma proteína de 33-kDA. iniciado pelo influxo de sódio na célula. O receptor da bindina não oferece pistas para explicar como ocorre essa ativação. . a bindina meramente liga o óvulo ou. não contribui com material genético (Uzzell. tais como: peixes. Outra possibilidade é que a ativação do caminho do IP3 não é devida à ligação do espermatozóide e óvulo. No entanto. as proteínas G da membrana espermática ou as tirosinoquinases (ativadas pela geléia do óvulo para iniciar a reação acrossômica) ativem a cascata polifosfoinositídica para liberação de cálcio do óvulo. 5 segundos após ligar a bindina. Eles sugerem que os componentes ativadores do óvulo se localizam na membrana ou no citoplasma do espermatozóide. e o bloqueio lento. As respostas do óvulo ao espermatozóide podem ser divididas em “precoces” que ocorrem em poucos segundos após a reação cortical e “tardias” que acontecem vários minutos após o inicio da fertilização (Tabela 4. parecem ser capazes de ativar essa fosfolipase. pode interagir com a tirosinoquinase plasmática tal como aqueles que medeiam a liberação de cálcio durante a ativação de células T (Figura 4. porém.. Não é conhecido qual o papel que essa proteína pode ter na fisiologia da ativação do óvulo. aciona um conjunto de eventos metabólicos pré-programados. talvez. *Em certas salamandras. a ativação é acompanhada pela liberação de íons de cálcio do retículo endoplasmático.26 D.. 1964).* O óvulo do ouriço-do-mar maduro é uma célula metabolicamente lenta. 1994). Ativação do metabolismo do óvulo Embora a fertilização seja freqüentemente descrita como mero meio de junção de dois núcleos haplóides. jeffersonianum).) Ainda outra possibilidade é que o agente ativo na liberação de cálcio ligado venha do citosol do espermatozóide. ouriços-do-mar e mamíferos. ela tem um papel igualmente importante na iniciação de processos que iniciam o desenvolvimento. Cada uma produz um ovo com um número não-reduzido de cromossomos. O espermatozóide desse macho somente estimula o desenvolvimento do ovo. É até mesmo possível que por ocasião da fusão das membranas. Para detalhes desse complexo mecanismo de procriação veja Bogart et al. resultando na onda de cálcio varrendo o óvulo (Jaffe. porém. Isso sugere que o receptor de bindina ligado. 1993). reativada pelo espermatozóide. Esses eventos acontecem no citoplasma e ocorrem sem o envolvimento dos núcleos. Respostas precoces O contato entre o espermatozóide do ouriço-do-mar ativa dois principais bloqueios à polispermia: o bloqueio rápido. (No cenário apresentado na Fi- gura 4.26 C. 1989. iniciado pela liberação intracelular de íons de cálcio. Essa ativação é apenas o estímulo. A ativação de todos os óvulos parece depender do aumento da concentração de íons livres de cálcio dentro do óvulo. A microinjeção dessa proteína em óvulos de camundongo pode iniciar liberação de cálcio.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 149 o receptor interagir com a fosfolipase C. 1994). Em deuterostomatas. como lesmas e vermes. ao menos parte do cálcio geralmente entra no óvulo vindo de fora. motive a fosforilação de proteínas necessárias em fases mais avançadas do desenvolvimento. Hall et al. fica fosforilado em um dos seus resíduos tirosina citoplasmáticos (Abassi e Foltz. Em protostomatas. a salamandra prateada copula com o macho da salamandra Jefferson (A. 1991).

Uma delas é a ativação da enzima NAD+ quinase. o aumento do pH intracelular. nem reinício da divisão celular (Kline.150 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Tabela 4. descondensação do espermatozóide. Outro efeito dessa mudança se refere ao consumo de oxigênio. o surto de utilização de oxigênio e o aumento da síntese de proteína e DNA são todos gerados com sua seqüência própria. 1989). A elevação do envoltório de fertilização. 1995. e muito desse “surto respiratório” é usado para cruzamento ligado da membrana de fertilização. punctulata (18-20oC) e L. Steinhardt e Epel (1974) acharam que quantidades micromolares do ionóforo A23187 induzem no óvulo a maioria das respostas características de um ovo fertilizado normalmente. Na maioria desses casos. . Reciprocamente. mudança do potencial da fertilização. a mudança de NAD+ em NADP+ pode ser importante na construção de novas membranas exigidas durante a clivagem. Essa ativação acontece na ausência total de íons de cálcio na água do mar.5 min 2-12 min 2-12 min 5-10 min começa em 5-10 min começa em 5-10 min 20-40 min 60-80 min 85. que converte o NAD+ em NADP+ (Epel et al. óvulos podem ser ativados artificialmente na ausência de espermatozóide por procedimentos que liberam cálcio livre no oócito. 1985.1 Evento Eventos da fertilização do ouriço-do-mar aproximado Tempo aproximado após a inseminaçãoa Ligação espermatozóide-óvulo Elevação do potencial de fertilização (bloqueio rápido da polispermia) Fusão das membranas espermatozóide-óvulo Primeira detecção de aumento de cálcio Exocitose das vesículas corticais (bloqueio lento da polispermia) Ativação da NAD quinase Aumento de NADH e NADPH Aumento do consumo de O2 Entrada do espermatozóide Efluxo de ácido Aumento de pH (permanece alto) Descondensação da cromatina do espermatozóide Migração do núcleo do espermatozóide para o centro do óvulo Migração do núcleo do óvulo para o núcleo do espermatozóide Ativação da síntese protéica Ativação do transporte de aminoácidos Iniciação da síntese de DNA Mitose Primeira clivagem O segundos dentro de 1 sec dentro de 6 sec 6 sec 15-60 sec começa em 1 min começa em 1 min começa em 1 min 1-2 min 1-5 min 1.95 min Principais fontes: Whitaker e Steinhardt. Essa liberação de cálcio é essencial para a ativação do desenvolvimento do embrião. a Tempos aproximados baseados em dados de S. variegatus (22-24oC). o NADPH ajuda na regeneração da glutationa e de ovotiois (ovothiols) que podem ser cruciais para remoção de radicais livres que poderiam de outra maneira prejudicar o DNA do ovo e do embrião precoce (Mead e Epel. Se o quelante de cálcio EGTA for injetado no óvulo do ouriço-do-mar. L. A . Essa mudança pode ter importantes conseqüências para o metabolismo lipídico.27). 1995). A enzima responsável por essa redução do oxigênio (para água oxigenada) também é dependente de NADPH (Heinecke e Shapiro. 1988). o desenvolvimento cessa antes da primeira mitose porque os ovos ainda são haplóides e desprovidos do centríolo espermático necessário para a divisão. Por último. Assim.. pictus (16-18oC). purpuratus (15-17oC). assim os tempos apresentados referem-se à essa espécie. não ocorre exocitose dos grânulos corticais. pois NADP+ (mas não o NAD+) pode ser utilizado como coenzima para biossíntese lipídica. 1981). A contagem de tempo para os eventos dentro do primeiro minuto é melhor conhecida para Lytechinius variegatus. Mohri et al. Essa liberação de cálcio ativa uma série de reações metabólicas (Figura 4.. Um surto de redução de oxigênio é visto ocorrer durante a fertilização.

(Segundo Epel. 1978). a síntese protéica falha. As respostas tardias da fertilização produzidas por essas alterações iônicas. 1980). não há um aumento dramático na síntese protéica imediatamente em seguida à fertilização. O surto de síntese de proteína ocorre vários minutos após a entrada do espermatozóide e não depende da síntese de novo RNA mensageiro (Figura 4. actinas e fatores morfogenéticos que são utilizados durante o desenvolvimento precoce.) Aumento do pH intracelular Respostas tardias Pouco tempo após o aumento dos níveis de íons cálcio. Em seu lugar. Tal surto de síntese protéica pode ser induzido pelo aumento artificial do pH citoplasmático por íons amônio (Winkler et al. não há elevação do pH após a fertilização. 1980. 1985). Similarmente no camundongo. incluindo a síntese de proteínas e de DNA (Winkler et al. o pH intracelular também aumenta. Jaffe. 1982). comunicação pessoal. os movimentos dos pronúcleos do óvulo e do espermatozóide são prevenidos. tubulinas. e a divisão celular não ocorre (Dube et al. a síntese de proteína nova utiliza mRNAs já presentes no citoplasma do oócito (muito mais sobre isso será mencionado no Capítulo 12). Quando ovos recém-fertilizados são colocados em soluções contendo baixas concentrações de íons de sódio e amiloride (uma droga que inibe a troca Na+/H+). 1980 e L. *Novamente. No óvulo muito menor do camundongo.27 Troca Na+/H+ Modelo de um possível mecanismo de ativação do óvulo do ouriço-do-mar. agentes que bloqueiam o aumento do pH inibem eventos da fertilização tardia como a síntese de DNA e proteína. .8 a 7. ocasionando enormes mudanças na fisiologia do ovo (Shen e Steinhardt. a variação espécie-para-espécie está à solta. < [H+] ajam em conjunto para fornecer o espectro completo dos eventos da fertilização. Esses RNAs incluem aqueles que codificam proteínas como histonas. A. causando uma troca 1:1 entre íons de sódio da água do mar e os íons hidrogênio do óvulo*.. O aumento do pH intracelular começa com o segundo influxo de íons de sódio. e movimentos citoplasmáticos de material morfogenético Figura 4.2.28).. replicação de DNA. Whitaker e Steinhardt.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 151 Influxo de Na+ Alteração do potencial da membrana Bloqueio rápido da polispermia Ativação da NAD+ quinase Ligação e/ou fusão de espermatozóide à membrana celular do óvulo Conversão de NAD+ em NADP+ Bloqueio lento da polispermia Formação da camada hialina Produção de IP3 Ativação de fosfolipase C Liberação de Ca2+ Exocitose de grânulos corticais Estimulação de proteína G ou de tirosinoquinase? Produção de diacil-glicerol Ativação de proteíno-quinase C Estimulação de síntese protéica. incluem a ativação da síntese de DNA e da proteína. Acredita-se que essas duas condições iônicas (> [Ca2+].. Essa perda de hidrogênio faz o pH elevar-se de 6. Reciprocamente.

152 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 4. assim. 1972. inativa. 1964. não é visto em embriões crescendo em actinomicina). o núcleo do espermatozóide descondensa para formar o pronúcleo masculino. um inibidor da transcrição. Após a fusão das membranas do espermatozóide e do óvulo. Assim. o pronúcleo masculino sofre uma dramática transformação. mitocôndrias derivadas do espermatozóide são encontradas em organismos em desenvolvimento ou em adultos (Dawid e Blackler. Dentro do citoplasma do óvulo. Reciprocamente. o núcleo do espermatozóide penetra o óvulo perpendicularmente à superficie do óvulo. a síntese protéica ocorre sem nova transcrição dos núcleos do zigoto ou embrião.000 mitocôndrias são derivadas do espermatozóide (Gyllensten et al. B segundo Humphreys. a compacta cromatina do espermatozóide ao citoplasma do óvulo (Longo e Kunkle. Em ouriços-do-mar. o genoma mitocondrial é transmitido principalmente pelo parente materno. 1991). 1978). Essa troca permite a descondensação da cromatina do espermatozóide. o núcleo do espermatozóide e seu centríolo se separam das mitocôndrias e do flagelo. são trocadas por proteínas derivadas do citoplasma do óvulo. (A) Síntese protéica em óvulos do ouriço-do-mar Arbacia punctulata fertilizada na presença ou ausência de actinomicina D. O envoltório pronuclear forma vesículas com pequenos pacotes.. em quase todos os animais estudados (o camundongo sendo a principal exceção). Um segundo surto de síntese protéica ocorre durante os estágios medianos de blástula. Giles et al. 1980). Uma vez dentro do óvulo. expondo. poucas. 1971. e isso representa tradução de mensagens recém-transcritas (e.. embora cada gameta contribua para o zigoto com um genoma haplóide. O núcleo do óvulo sendo haplóide é chamado de pronúcleo feminino. As proteínas que prendem a cromatina no seu estado condensado.) Incorporação de valina[14C] na proteína/mg proteína (cpm x 10-3) água do mar normal Água do mar tratada por actinomicina Horas após a fertilização Porcentagem de ribossomos em polissomos Tempo de desenvolvimento (horas) Fusão do material genético Em ouriços-do-mar. o centrossomo necessário para a produção do fuso mitótico das divisões subseqüentes é derivado do centríolo espermático (Sluder et al. com isso. (B) Aumento na porcentagem de ribossomos recrutados para polissomos durante as primeiras horas do desenvolvimento do ouriço-do-mar. A mitocôndria e o flagelo se desintegram dentro do óvulo. (A segundo Gross et al. 1993). a descondensação parece ser iniciada pela fosforilação de duas .. Durante as primeiras horas. especialmente durante o primeiro ciclo celular. Em camundongos estima-se que 1 em cada 10..28 Surto de síntese protéica na fertilização emprega mRNA armazenado no citoplasma do oócito. 1989. se tanto. portanto.

) Essas quinases fosforilam vários resíduos básicos das histonas espermatozóideespecíficas interferindo. B cortesia de F. O pronúcleo do espermatozóide está rodeado por microtúbulos do seu áster. (Tais proteino-quinases cAMP-dependentes foram mencionadas no Capítulo 1. (B) Fusão de pronúcleos no ovo do ouriço-do-mar.html] Depois que o espermatozóide do ouriço-do-mar entra no citoplasma do óvulo. 1980. Esse processo começa quando o espermatozóide entra em contato com uma glicoproteína na geléia do óvulo que eleva o nível da atividade proteinoquinase cAMP-dependente.20). 1983. a glutationa reduz essas ligações de dissulfeto. 1877). cortesia dos autores. sendo depois reconstruído por vesículas coalescentes. 1981. 1985). e considerou-o feliz indicação de uma fertilização bem-sucedida (Hertwig. [fert9.) *Quando Oskar Hertwig observou esse arranjo radial de ásteres de espermatozóide no seu recém-fertilizado ovo de ouriço-do-mar. Essa deficiência causa a falência da migração pronuclear e a interrupção do desenvolvimento.. Esse afrouxamento é considerado facilitar a substituição das histonas espermatozóide-específicas por outras histonas que haviam sido estocadas no citoplasma do oócito (Poccia et al. o centríolo espermático age como um centro organizador de microtúbulos. o pronúcleo masculino gira 180o fazendo com que o centríolo fique entre o pronúcleo do espermatozóide e o pronúcleo do óvulo. Uma vez descondensado. que se ligam fortemente ao DNA. essas proteínas nucleares estão firmemente compactadas através de ligações dissulfeto. Em seguida. Longo. A iniciação da síntese de DNA pode ocorrer no estágio pronuclear (durante a migração) ou depois da formação do núcleo zigótico. Mais recentemente. 1971. o processo da migração pronuclear dura aproximadamente 12 horas. Bestor e Schatten. O espermatozóide do mamífero entra quase tangencialmente à superfície do óvulo em vez de aproximá-la perpendicularmente.19).29 histonas espermatozóide-específicas. 1980. 1986). 1980. contatam o pronúcleo feminino. comparado com menos de uma hora no ouriço-do-mar. A fusão forma o núcleo zigótico diplóide (Figura 4. . permitindo o desdobramento da cromatina do espermatozóide (Calvin e Bedford. Simerly e colaboradores (1994) descobriram que certos tipos de infertilidade em homens eram devidos a defeitos na capacidade do centrossoma formar esses ásteres microtubulares. Green e Poccia. (A de Hamaguchi e Hiramoto. J. 1981).CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 153 (A) (B) Pronúcleo do óvulo Ponte internuclear Tempo (seg) Pronúcleo do espermatozóide Figura 4. O DNA do núcleo espermático é ligado por proteínas básicas chamadas protaminas. e funde com numerosas microvilosidades (veja Figura 4. Em mamíferos. Uma vez no óvulo. Kvist et Eventos nucleares na fertilização do ouriçodo-mar. com sua ligação ao DNA (Garbers et al. o DNA pode iniciar a transcrição e a replicação. chamou-o de “sol dentro do ovo”. Esses microtúbulos se estendem através de todo o óvulo. (A) Migração dos pronúcleos do óvulo e do espermatozóide em um ovo de Clypeaster japonicus. desse modo.. e trazem os dois pronúcleos um para perto do outro (Hamaguchi e Hiramoto. Porter e Vacquier. O núcleo do espermatozóide mamífero também se parte quando sua cromatina descondensa. estendendo seus próprios microtúbulos e integrando-os com os microtúbulos do óvulo formando um áster*.

Um dos princípios fundamentais da genética Mendeliana é que os genes derivados do espermatozóide são funcionalmente equivalentes aqueles derivados do óvulo. Assim. Nessas situações. Assim. A habilidade de desenvolver um embrião sem contribuição espermática é chamada partenogênese (do grego. mas no estágio bicelular (Figura 4.30 C). Os mamíferos. Evidência para a não-equivalência dos pronúcleos mamíferos vem também de tentativas de conseguir que óvulos se desenvolvam na ausência de espermatozóide. Entulho no espaço perivitelínico são os corpos polares em degeneração. Após penetrar no óvulo. todo o genoma é derivado do espermatozóide (Jacobs et al. se dividem e têm um número normal de cromossomos. 1980. apresentam um desenvolvimento anormal. produz . Esses tumores parecem tecido placentário.. (B) Aposição dos pronúcleos do espermatozóide e do óvulo. Ohama et al. [fert10. em lugar de produzir um núcleo zigótico comum (como acontece na fertilização do ouriço-do-mar).154 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) (C) Figura 4. (de Bavister.. replicando seu DNA ao longo do trajeto. D. no entanto. O pronúcleo masculino dos mamíferos aumenta enquanto o núcleo do oócito completa sua segunda divisão meiótica (Figura 4. a cromatina condensa-se para formar cromossomos que se orientam num fuso mitótico comum.) al. cada pronúcleo migra ao encontro do outro. No entanto.html] Informações adicionais & Especulações A Não-Equivalência dos Pronúcleos de Mamíferos G ERALMENTE ASSUME-SE que machos e fêmeas portam genomas haplóides equivalentes.30 A). Os óvulos de muitos invertebrados e de alguns vertebrados são capazes de se desenvolver normalmente na ausência do espermatozóide se o óvulo for ativado artificialmente. Não há desenvolvimento normal quando o genoma inteiro vem do parente masculino. 1980). A maioria dessas molas se desenvolve de um espermatozóide haplóide ferti- lizando um óvulo no qual o pronúcleo feminino está ausente. o ovo se transforma numa massa de células placentosímiles. os cromossomos do espermatozóide se duplicam restaurando seu número diplóide. No entanto. No encontro. cortesia de B. ao mesmo tempo suprimindo a formação do segundo corpo polar. não apresentam a partenogênese. A colocação de oócitos de camundongo em um meio de cultura que artificialmente ativa o oócito. Então. Bavister.30B). significando “nascimento virgem”). A primeira evidência dessa não-equivalência veio de estudos de um tumor humano chamado mola hidatidiforme. os dois envoltórios nucleares se desintegram (Figura 4. a contribuição do espermatozóide para o desenvolvimento parece dispensável. um núcleo zigótico verdadeiro em mamíferos é visto primeiro não no zigoto. 1980. 1981). estudos recentes mostram que em mamíferos o genoma derivado do óvulo pode ser funcionalmente diferente e ter papel complementar durante certos estágios do desenvolvimento. porém. Aqui vemos uma situação em que as células sobrevivem. (C ) Estágio bicelular mostrando duas células de tamanhos iguais com núcleos bem definidos. O centrossomo que acompanha o pronúcleo masculino produz seus ásteres (principalmente a partir de proteínas armazenadas no oócito) e contata o pronúcleo feminino. (A) Entrada de espermatozóide na célula e tumefação do pronúcleo do espermatozóide..30 Movimento pronuclear em hamster. Em vez de formar um embrião.

se o mesmo alelo mutante for herdado do pai. tanto pronúcleos maternos como paternos são necessários para o desenvolvimento completo dos mamíferos. os alelos derivados do macho e da fêmea são equivalentes e são ativados no mesmo grau em cada célula. Aqui estamos tratando de exceções a essa regra Mendeliana. 1991). nos mamíferos existem importantes diferenças funcionais entre eles. enquanto o alelo materno é ativo (Barlow et al. incluindo corações latejantes. Aqui. embora os dois pronúcleos sejam equivalentes em muitos animais. enquanto em outras célu- Figura 4.. o fator de crescimento insulina-símile II (IGF-II) promove o crescimento de órgãos embrionários e fetais. cortesia dos autores. Além de serem menores e em deterioração.2 Experimentos de transplantes pronucleares Classe de zigotos reconstruídos Operação Número de transplantes bem-sucedidos Número de sobrevivente Bimaternal Bipaternal Controles Fonte: McGrath e Solter. . A hipótese que pronúcleos masculinos e femininos são diferentes. Embora ocorra a clivagem embrionária. naturalmente. observam-se profundas diferenças entre os embriões normais e os partenogenéticos. Assim. 1983. Porém. Portanto. os embriões bimaternos ou bipaternos cessam o desenvolvimento ao mesmo tempo que camundongos partenogenéticos.. o desenvolvimento não continua e no dia 10 ou 11 (metade do tempo da gestação). Como certos genes importantes para o desenvolvimento somente são ativos quando provindos do espermatozóide e outros tais genes só são ativos quando vêm do óvulo. os embriões partenogenéticos também tinham placentas muito menores. (Os dois pronúcleos podem ser diferenciados nesse estágio. podem ser construídos zigotos com dois pronúcleos masculinos ou dois femininos.) Assim.) las somente o alelo de genes derivado paternalmente é funcional. o camundongo terá crescimento prejudicado (DeChiara et al.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 155 ovos diplóides de camundongo cuja herança deriva somente do óvulo (Kaufman et al. 1984. (Na maioria dos genes. ao passo que alguns ovos controle (contendo um pronúcleo masculino e um feminino de zigotos diferentes) que sofreram tal transplante se desenvolvem normalmente (Tabela 4. porque o feminino fica debaixo dos corpos polares. 1984). irá se desenvolver até o tamanho normal (já que o alelo derivado maternalmente não é expresso). A razão para essas mortes embrionárias é que em algumas células somente o alelo de certos genes derivado da mãe é ativo. Ainda mais.) Por exemplo. McGrath e Solter. nenhum desse tipos de ovos Tabela 4.. 1991). As diferenças entre os alelos ativos e inativos são consideradas ser causadas por modificações do DNA que ocorrem de maneira diferente nos núcleos do óvulo e do espermatozóide (serão discutidos posteriormente no Capítulo 11).31 (A) Embriões controle e (B) partenogenéticos (dois pronúcleos femininos) de camundongos no 11 o dia de gestação. o alelo de IGF-II derivado paternalmente é ativo em todo o embrião. Os camundongos estavam se desenvolvendo na mesma fêmea. músculos. se um camundongo herda um alelo mutante IGF-II de sua mãe. 339 328 348 0 0 18 se desenvolvem até o nascimento. esqueleto e órgãos. porém. Nem no homem nem no camundongo o desenvolvimento pode ser completado com cromossomos derivados somente do óvulo. (de Surani e Barton. O padrão oposto de expressão alélica se encontra para um dos receptores de IGF-II. 1977). 1983. o gene paterno para o receptor é mal transcrito.31). esses deteriorando e ficando grosseiramente desorganizados (Figura 4.20). ao passo que o alelo derivado maternalmente é em geral inativo (exceto em algumas células neurais).. também ganha apoio de experimentos de transplante pronuclear (Surani e Barton. Pronúcleos recém-fertilizados de machos ou fêmeas podem ser removidos e adicionados a outros ovos recém-fertilizados. Surani et al. Essas células se dividem para formar embriões com medula espinhal. Em embriões de camundongos. 1986.

as inclusões lipídicas migram com ele. Como veremos nos capítulos 13 e 14.32A. tipo gema. (Segundo Conklin. Roegiers et al. Em algumas rãs (como Rana). em direção ao ponto de entrada do espermatozóide (Manes e Elinson. respectivamente. Esse determinantes. Ancel e Vintenberger. Movimento citoplasmático também é visto em óvulos de anfíbios. Durante a meiose. (A) Antes da fertilização. (C) À medida que o pronúcleo do espermatozóide migra para o pólo animal em direção ao pronúcleo do óvulo. Dentro de 5 minutos após a entrada do espermatozóide. Speksnijder et al. o crescente cinzento demarca a região onde se iniciará a gastrulação em embriões de anfíbios. Vincent et al. Quando o pronúcleo masculino migra do pólo vegetal para o equador da célula. (D) A posição final dos citoplasmas amarelo e claro. Originalmente. Um citoplasma cinzento central está envolvido por uma camada cortical contendo inclusões lipídicas amarelas. 1905. 1905).156 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Rearranjo do citoplasma do óvulo A fertilização pode iniciar deslocamentos radicais nos materiais citoplasmáticos do óvulo.33). Essa região tem sido referida como o crescente cinzento (Roux. 1948). Como veremos em capítulos subseqüentes. a desintegração nuclear libera uma substância clara que se acumula no hemisfério animal (superior) do óvulo.. quando o faz. o citoplasma cortical (externo) se desloca cerca de 30° relativos ao citoplasma interno. Figura 4. um único espermatozóide pode entrar em qualquer lugar do hemisfério animal. no lado oposto do ponto de entrada do espermatozóide.32B).) Pólo animal Citoplasma Cortical amarelo Núcleo do oócito Material do núcleo do oócito Gema cinzenta Citoplasma claro (A) Cório Pólo vegetal (B) Pronúcleo do Citoplasma espermatozóide amarelo (C) Pronúcleo do espermatozóide Citoplasma amarelo (D) Crescente amarelo Material da gema . o citoplasma interno claro e o cortical amarelo migram para o hemisfério vegetal (inferior) do óvulo. marcam os locais onde as células dão origem ao mesênquima e aos músculos. o citoplasma do óvulo freqüentemente contém determinantes morfogenéticos que ficam segregados em células específicas durante a clivagem. 1986). o óvulo é radialmente simétrico em torno do eixo animal-vegetal. Após a entrada do espermatozóide.. que se estende do pólo vegetal ao equador (Figura 4. tem aparência cinzenta. porém. os citoplasmas amarelo e claro os acompanham. O arranjo espacial correto desses determinantes é crucial para o desenvolvimento adequado. Essa migração forma um crescente amarelo.32 Rearranjo citoplasmático no óvulo do tunicado Styela partita. citoplasma cortical amarelo rodeia citoplasma cinzento. esse rearranjo na orientação pode ser visualizado pela presença de grânulos pigmentados citoplasmáticos. Esse citoplasma subjacente. altera o padrão citoplasmático do óvulo. (B) Após a entrada do espermatozóide. uma região do óvulo que antes estava coberta pelo citoplasma cortical escuro do hemisfério animal fica agora exposta (Figura 4. localizado perto do equador. 1995). 1990. dessa maneira. o citoplasma cortical amarelo e o citoplasma claro derivado da degradação do núcleo do oócito escorrem vegetativamente em direção ao espermatozóide. O ovo não-fertilizado desse animal está apresentado na Figura 4. Em algumas espécies. certas propriedades às células que os incorporam. 1989. em última análise.. Esses rearranjos do citoplasma do oócito são muitas vezes cruciais para a diferenciação nas etapas seguintes do desenvolvimento. O movimento dessas regiões citoplasmáticas depende de microtúbulos que são gerados pelo centríolo e por uma onda de íons de cálcio que contraem o citoplasma do pólo animal (Sawada e Schatten. 1980. Um exemplo é o óvulo do tunicado Styela partita (Conklin. 1987. Na rã. por isso. trazendo o citoplasma amarelo para a área onde mais tarde células musculares irão se formar na larva tunicada. ao longo do futuro lado posterior do embrião. contém grânulos pigmentados difusos e. conduzem à ativação ou repressão de genes específicos conferindo.

Danilchik e Denegre 1991) marcaram plaquetas da gema . 1991b). Os rastros dos microtúbulos são primeiramente vistos imediatamente antes do começo da rotação. esses microtúbulos se desviam do ponto de entrada do espermatozóide.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 157 (A) Ponto de entrada do espermatozóide (B) Crescente cinzento Córtex Citoplasma interno Zona de deslizamento Figura 4. Quando o ovo foi mantido em sua posição por inclusão em gelatina. O espermatozóide entrou por um lado e seu núcleo está migrando para o interior. Tratamento do ovo com colchicina ou radiação ultravioleta interrompe a formação desses microtúbulos. tornado pesado pelas plaquetas de gema. A força motriz para a rotação é possivelmente.. e que o centríolo espermático direciona sua polimerização. Elinson e Rowning. nas quais não se vê um crescente cinzento. (B) Quando está aproximadamente em 80% de seu caminho na primeira clivagem. Esse movimento foi demonstrado por Vincent e seus colaboradores (1986). Ao atingir o córtex vegetal. O movimento do citoplasma cortical relativo ao citoplasma interno causa profunda movimentação nesse último. Tal como a dineína e a miosina. podemos assim mesmo. permanece estabilizado por gravidade. subcortical. na direção da rotação citoplasmática. a superfície do ovo é considerada girar enquanto o citoplasma subcortical.34). com um hemisfério animal altamente pigmentado e um hemisfério vegetal transparente. e desaparecem quando esse movimento cessa (Figura 4. fazendo com que cresçam para o interior da região vegetal do ovo. Houliston e Elinson (1991a) acharam que esses rastros eram formados por microtúbulos derivados do espermatozóide e do óvulo. Essa ATPase está localizada nos microtúbulos vegetais e nas membranas do retículo endoplasmático cortical (Houliston e Elinson. A posição descentralizada do centríolo espermático quando esse inicia a polimerização microtubular. com isso parando as rotações citoplasmáticas. Essa rotação é importante porque a gastrulação irá começar na região oposta ao ponto de entrada do espermatozóide onde ocorre o maior deslocamento do citoplasma.33 Reorganização do citoplasma no ovo recém-fertilizado da rã. o citoplasma cortical gira cerca de 30 o em relação ao citoplasma interno. observar a rotação do citoplasma cortical em relação à camada interna. Usando anticorpos ligantes desses microtúbulos. O ovo tem simetria radial em torno do seu eixo animal-vegetal. Esses investigadores imprimiram uma grade hexagonal de corante (Azul Nilo) sobre o citoplasma abaixo do córtex enquanto aplicavam outro tipo de corante (uma lectina ligada à fluoresceína) à superfície do ovo. proporciona direção à rotação.) Em rãs como Xenopus. não inclusos. Em ovos normais. em direção ao pólo vegetal.35. 1988). O córtex está representado como o de Rana. O motor para esses movimentos citoplasmáticos em ovos de anfíbios parece ser um conjunto de microtúbulos paralelos que ficam entre os citoplasmas interno e cortical do hemisfério vegetal. 1989. (A) Corte transversal esquemático de um ovo na metade do primeiro ciclo de clivagem. fornecida pela ATPase cinesina. a cinesina pode fixar-se às fibras e produzir energia pela hidrólise de ATP. (Segundo Gerhart et al. os pontos de Azul Nilo puderam ser vistos rodar de 30° em relação às manchas da lectina fluorescente (Figura 4.

fotografias cortesia de J. Gerhart.) com Azul Nilo e observaram seu movimento por microscopia fluorescente (o corante ligado emite fluorescência vermelha). é agora um embrião bilateralmente simétrico. e as posições originais de alguns dos pontos marcados na superfície celular com fluoresceína (círculos em A). (B. O local no ovo designando a futura superfície dorsal do embrião está marcado com um D. o citoplasma presumivelmente do lado dorsal do embrião.. Preparação para a Clivagem O aumento dos níveis de íons livres de cálcio intracelular também inicia a movimentação de aparelhagem para a divisão celular. O ovo foi embebido em gelatina.. Gerhart et al. 1975. a massa do citoplasma central do ovo flui do presumível lado ventral (abdome).34 Rotação do citoplasma subcortical relativa ao citoplasma de superfície da célula. (D) Sumário desses movimentos na região vegetal (inferior) do ovo. dependendo do estágio de meiose em que . 1983).C) Com o progredir do primeiro ciclo. (A) Um ovo recentemente fertilizado foi marcado com uma grade hexagonal de corante Azul Nilo (que cora os lípidios nas plaquetas de gema). 1986. para o futuro lado dorsal (posterior) do embrião (Prancha 7). Durante a parte intermediária do primeiro ciclo celular. esses movimentos citoplasmáticos iniciam uma cascata de eventos que determina o eixo dorso-ventral da rã. O mecanismo iniciador da clivagem provavelmente difere entre espécies. (de Vincent et al. C. Realmente. é distintamente diferente daquele do provável lado ventral. os pontos do citoplasma subcortical mudaram de aproximadamente 30 o em relação à superfície externa imobilizada do ovo.158 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) (C) (D) Figura 4. os microtúbulos paralelos que permitem esses rearranjos parecem estender-se ao longo do futuro eixo dorso-ventral (Klag e Ubbels. Como veremos nos Capítulos 6 e 15. O ponto de entrada do espermatozóide está marcado com um S. O que havia sido um embrião radialmente simétrico. Ao fim da primeira divisão.

O palco está preparado para o desenvolvimento de um organismo multicelular. Biol. Mouse egg integrin a α P β functions as a sperm receptor. a posição da primeira clivagem não é aleatória.. os íons de cálcio também parecem iniciar a degradação da ciclina (Watanabe et al. em todas as espécies estudadas. cortesia de R. and Klug. R. os ciclos de divisão celular podem se reiniciar. D. a primeira clivagem secciona o ovo em imagens duplicadas em um espelho. 1: 310-311. L. J.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 159 Figura 4. Nature 170: 326. 1974. ao longo do futuro eixo dorso-ventral. A coordenação do plano de clivagem e dos rearranjos citoplasmáticos é provavelmente mediada pelos microtúbulos do áster do espermatozóide (Manes et al. 1994.] 31: 1-182. De maneira semelhante. 1985). 1996. 1952. e a sua degradação permite às células voltarem para interfase. 1948. 1976. Cell Sci. os microtúbulos despolimerizam. Functional and molecular diversity of dynein heavy chains. o ritmo das divisões celulares é regulado pela síntese e degradação de ciclina. E.. Biol. . R. The “capacitation” of mammalian sperm. B. (de Elinson e Rowning. Almeida. Reprod. R. A. Science 193: 3173-19.html#fert13] LITERATURA CITADA Abassi. J. A human syndrome caused by immotile cilia. 1991). Dev. Ancel. A. Além de suas outras atividades. C. P. 1995. o DNA está se replicando e novas proteínas estão sendo sintetizadas. Portanto. 164: 430-443. Desse estágio em diante. o citoplasma se rearranja. No entanto. and Foltz. A clivagem tem uma relação especial com essas regiões citoplasmáticas. K. Capacitation and the release of hyaluronidase. A. cada divisão em um lado do sulco de clivagem tem uma imagem em espelho do lado oposto. Semin. A. [fert11. (B) Antes da rotação citoplasmática (cerca de metade do ciclo) nenhum arranjo pode ser visto. Afzelius. Amos. [other. Tyrosine phosphorylation of the sperm receptor at fertilization. mas tende a ser especificada pelo ponto de entrada do espermatozóide e a subseqüente rotação do citoplasma do ovo. A ciclina mantém as células em metáfase. Austin. Elinson. Bull. and ten others.35 (B) Arranjo paralelo de microtúbulos se estendem ao longo do hemisfério vegetal. Fert. Uma vez degradada a ciclina. Recherches sur le determinisme de la symmetrie bilatérale dans l’oeuf des amphibiens. Gerhart et al. C. o crescente cinzento é seccionado pelo sulco da primeira clivagem em ovos de anfíbios. A. Austin. Belg. 7: 311-320. 1978. (A) Arranjo paralelo de microtúbulos vistos na segunda parte do primeiro ciclo celular por anticorpos fluorescente à tubulina. Cell 81: 1095-1104. [Suppl. Biol. C. Assim. Em embriões tunicados.. 1960. Cell Dev. Fr. and Vintenberger. os pronúcleos se encontram. Asai.html]. 1988. 1981. Arrangement of subunits in flagellar microtubules. Elinson.) (A) (C) ocorre a fecundação. perto do fim do primeiro ciclo celular . J. 14: 523-549. Y. (C) No término da rotação do citoplasma. P.

C. Acrosome reaction and lysins. M. A. Tissue. P. Jena Z. J. and Elinson. W. 1979. 1981. and Steinhardt. B. Timing of fertilization in mammals: Sperm cholesterol/ phospholipid ratio as determinant of capacitation interval. 1905. R. I. The activity of sea urchin eggs by the divalent ionophores A23187 and X 537A. Ayabe. D. 1972. 237-367. 54: 643-654. J. J. 1967. Chem. H. Monroy (eds. Boveri. Ferguson. Identification of a secondary sperm receptor in the mouse egg zona pellucida: Role in maintenance of binding of acrosome-reacted sperm to eggs. Davis.. R. L. T. P. Nat. and Garbers. The mouse insulinlike growth factor type-2 receptor is imprinted and closely linked to the Time locus. and Efstradiatis. D. and Wassarman. F. G. Willier and J. Selective modulation by cGMP of the K+ channel activated by speract. Cell Biol. E. and Leblond. G. Cell 20: 873-882. L. C. B. T. and Blackler. 1965.] 13: 65-75. J. B. N. 83: 91-108. T. Cell Biol. 44: 22-32. M. and Whitaker. Turck. E. Carballacla. 122: 227-242. and White. Vol. M. A. P. Clermont. H. G. P. Academic Press. Antitubulin immunofluorescence microscopy of microtubules present during the pronuclear movements of sea urchin fertilization.. C. Eisen. and Reynolds.-Q. 1988. Proc. and Schweifer. N. Bleil. F. 114:119-131. R.M. P.. C. Fertil. 1985. In C. Formation of sperm entry holes in the vitelline membrane of Hydroides hexagonis (Annelida) and evidence of their lytic origin. Bookbinder.. Cell 45: 281-288. Bavister. Joseph. 1981. J. 1980. A. J. P. Recent progress in the study of early events in mammalian fertilization. Membrane fusion during secretion: Cortical granule exocytosis in sea urchin eggs as studied by quick-freezing and freeze fracture.. Biol. Danilchik. Die Entwicklung dispermer Seeigeleier. The mechanics of sperm-egg interaction at the zona pellucida. Colwin. 1985. Pressman. Chandler. 1986. 1960. Nature 349: 84-87. Characterization of Ca2+ release from intracellular stores. R. J.. R. D. Development 121: 2233-2244. P. Dev. Lambert. Deep cytoplasmic rearrangements during early development in Xenopus laevis. Johnson. 1993. Biol. C. A.. Dev. Bleil. Carroll. and Wassarman. E. Regulation of mouse egg activation: presence of ryanodine receptors and effects of microinjected ryanodine and cyclic ADP ribose on uninseminated and inseminated eggs. Sci. 195: 347-351.. M. Dev. J. On multipolar mitosis as a means of analysis of the cell nucleus. Stöger.160 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Austin. 22: 385-402.. K. and Cone. Biochem. Cheng. Bi. and Bleil. Bleil. M. USA 78: 7560-7564. D. Inositol triphosphate and calcium signalling. and Katz. 100: 1522-1527. T. S. Bestor. 1991. Chang. J.. 1995. DeChiara. Cell Biol. Bogart. M. H. Kopf. T. Dev. P. The number of sperm about the eggs in mammals and its significance for normal fertilization. J. 1951. (Translated by S. Dube. Formation of disulfide bonds in the nucleus and accessory structures of mammalian spermatozoa during maturation in the epididymis. V. E. Colwin. J. USA 85: 6778-6782. J. D. Biophys. 7: 315-320. and Schatten. Activation of frog (Xenopus laevis) eggs by inositol triphosphate. L. Biol. D. Robertson. The orientation and celllineage of the ascidian egg. Burks. Galactose at the nonreducing terminus of Olinked oligosaccharides of mouse egg zona pellucida glycoprotein ZP3 is essential for the glycoprotein’s sperm receptor activity. M. Metz and A. Cross. Cell 64: 849-859. Proc.. New Jersey. 1955. A. C. and Epel. In vitro studies of the golden hamster sperm acrosomal reaction: Completion on zona pellucida and induction by homologous zonae pellucidae. M. J. F. R. 75:187-198. New York. Saito. P. Englewood Cliffs. Foundations of Experimental Embryology. Bleil. 1980. D. D.. D. Interaction of a tyrosine kinase from human sperm with the zona pellucida at fertilization. Primakoff. Bentley. Calvin. R. Y. G. 1902. 1989.. K.and species-specific expression of sp56. J. S. W. Corselli. Dawid. Mammalian sperm and egg interaction: Identification of a glycoprotein in mouseegg zonae pellucidae possessing receptor activity for sperm. W. B. J. Natl. Sources and sinks for the calcium release during fertilization of single sea urchin eggs. Temperature and sperm incorporation in polyploid salamanders. 29: 152-161. Elinson. Saunders.). J. L. New York. Sci. P. R.. Bleil. D. F.. Cell Biol. Greve. H. and Wassarman. T. Schmidt. 1986. pp. Acad. M. and Talbot. 1971. Development Ill: 845-856. D. 1980. H. Gluecksohn-Waelsch. 1988. Busa. L. Williamson. 1974. Isolation and biological activity of the proteases released by sea urchin eggs following fertilization. 1988. 88: 80-91.. The acrosome reaction and its changes in early stages of fertilization.. M. M. Reprod.) In B. and De Robertis. Cherr. 6th Ed. J. Ein Beiträge zur Befruchtungslehre und zur Theorie des Kernes. D. Calcium-mediated exocytosis is required for cell membrane resealing. 1975.. Braden. E. 1990. [Suppl. and Colwin. 1975. Phila.. Herrmann. A . P. . A potential fusion peptidle and an integrin domain in a protein active in spermegg fusion. J. 96: 229-253. A. L. J. Fertilization. Biophys. Katz. 60: 126-132. I. Cook. E. J. Science 269: 86-87. D. 1974. M. Nature 356: 248-251. PrenticeHall.. Dev. P. K. 131:1747-1758. Autoradiographic visualization of the mouse egg’s sperm receptor bound to sperm. B. 43: 1-292. P. 1907. Wolfsberg. Dev. R. Naturwiss. 1985. Biol. Philadelphia. and Heuser. I. C. and Wassarman. Science 246: 1032-1034. D. R. FEBS Lett. 7: 543-551. Dan. J. 1986. 102:1363-1371. Cell Biol. J.A. and Rose. Acad.. C. B. Barlow. H. J. D. Anat. Oppenheimer (eds. 1986. 1. D. Growth Differ. Biol. Zellenstudien VI. Natl. E. Meizel. Berridge. M. B.). Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. 13: 5-119. Baltz. Nature 361: 315-325. Sci. Biochem. Shimomura. Parental imprinting of the mouse insulinlike growth factor II gene. Cell Biol. J. N. Biophys. F. Proc. Biol.. W. M. Sci. J. A. J. I. 268: 22402-22407. Saez. J. D. Retention of a functional resact receptor in isolated sperm plasma membranes. De Robertis. and Denegre. B. D. Conklin. Aust. J. USA 87: 5563-5567. J. G. K. monkey. M. H. Acad. Spermiogenesis of man. 1987. 1995. P. The hierarchy of requirements for an elevated pH during early development of sea urchin embryos. G. D. and Licht. Nall. Cell 40: 657-666. G. L. Sci. Identification of a ZP3-binding protein on acrosomeintact mouse sperm by photoaffinity crosslinking. J. and Schultz. and Babcock. Acad. Role of the gamete membranes in fertilization in Saccoglossus kowalevskii (Enteropneustra). Science 269: 83-86. J. Two phases of inositol polyphosphate and diacylglycerol production at fertilization. Dev. J. and Epel. 1954. E. Commun. C. Cell Biology. a mouse sperm fertilization protein. Alderton. and Wassarman. J.. T. and Saling. 1995. Res. Blobel. H. A fast block to polyspermy in frogs mediated by changes in the membrane potential. Boveri.. P. and Colwin. J. F. M. and Nuccitelli. L. 1992. A. Biol. M. and Austin. 1963. Moore. Hafner. Cytol. P. M. H. M. Chambers. Maternal and cytoplasmic inheritance of mitochondria in Xenopus. 19: 477-500. 1993. J. T. M. G. 28: 376-385. G. S. Nature 168: 697-698. 100: 677-682. S. H. E. L. Ciapa. M. Fertilization. 1995. 1991.. B. C. In vivo penetration of hamster oocyte-cumulus complexes using physiological numbers of sperm. Biol.. 1991.. Dev. Biol. and other animals as shown by the “periodic acidSchiff” technique. and Bedford. Am. R. Myles. J.

Furuichi. A. Endeavour N. New York. G. M. Nature 342: 87-89. G. M. S. D. pp. D. Proc. pp. S.. Reprod. W. G. Cell Biol.. D. X. 1986. Interaction of the sperm adhesive protein. F. H. Biol. K. Nature 352: 255-258. Miyawaki. 1978. and Lennarz. Mouse gamete interactions: The zona pellucida is the site of the acrosome reaction leading to fertilization in vitro.). K. 1977. D. Ridgway. pp.. G. M. Biol. Gerhart. Wharton. M. Corron. Paternal inheritance of mitochondrial DNA in mice. Garbers. Egg surface glycoprotein receptor for sea urchin sperm bindin. T. L. 100: 800-806. 1987. Glabe.. and Snyder. M. Cell Biol. Black. Speciesspecific agglutination of eggs by bindin isolated from sea urchin sperm. P. R. H. Structural characterization. Wada. with phospholipid vesicles. and Whittingham. 1985. L. Zool. and Schultz. Mlékovsky and V. 1981. Y. Sci. T.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 161 Eisenbach. B. 1980. Cytol. . 1984. J. Cortical rotation of the Xenopus egg: Consequences for the anterioposterior pattern of embryonic dorsal development. E. Morales. Kim.. and Shapiro. Raft (eds. Gwatkin. C. Endocrinol. P. 1980.H. C.. Fertilization and the role of the acrosomal reaction in non-mammals. Cell Biol. D. 165: 152-164. 146: 509-518. Acad. J. M. Gén. L. Florman. G. Gimlich. C. 108: 235-245.4. Nicolson (eds. R. Gould. Activation of a G protein complex by aggregation of β -1. Elinson. D.. C.. Foltz. 1985. D. 237(5): 128-138. Cell Biol. Science 259: 1421-1425. S. 261-286. D. 113: 207-217. R. Jeffery and R. Ferris. 1980.. R. N. Biol. W. Int.. Gundersen. Urechis caupo. 1979. M. and Holland. S. B.. Medill. Dev. 29: 1211-1220. Tubb. 1877. H. Epel. 76: 448-466. Nature 342: 32-38. A transient array of parallel microtubules in frog eggs: Potential tracks for a cytoplasmic rotation that specifies the dorso-ventral axis. M. Regulation of sea urchin sperm cAMP-dependent protein kinases by an egg associated factor. D. Acad. M. G. C. Gross. B. K. 1985. Blanc. Gould. 150: 193-202. M. 1991. W. and Stephano. and Wallace. A. J. 1978. 1995. and Wassarman. Gilkey. G. Effects of phorbol ester on mouse eggs: Dissociation of sperm receptor activity from acrosome reaction-inducing activity of the mouse zona pellucida protein. Florman. Space. Evolution and Morphogenesis. 1989. Dev. D. In W. Yoshikawa. Dubois. L. Nature 273: 149-151... Epel. Sperm surface proteins are incorporated into the egg membrane and cytoplasm after fertilization. S.. M. 1970. W. pictus sea urchin sperm. C. D.. H. J.. A. T. M. and Vacquier. G. and Mikoshiba.. Proc. T. M. L. 1978. Dev. Sea urchin egg receptor for sperim: Sequence similarity of binding domain to hsp70. D. and Shapiro. Sci. Dev. Z. 1-53. Activation of voltagedependent calcium channels of mammalian sperm is required for zona pellucida-induced acrosomal exocytosis. and Wilson. Bindin induces the fusion of mixedphase vesicles that contain phosphatidylcholine and phosphatidylserine in vitro. J. L. A.4. R. Biol. G. K. Science 235: 1654-1656. D. and Rowning. Arch. V. 1983. 1989. S. E.5-trisphosphatebinding protein P400. S. D. Glabe.4-galactosyltransferase on the surface of sperm. Dev. 1982. Maeda. Ginzburg. Changes in levels of polymeric tubulin associated with activation and dorsoventral polarization of the frog egg.. H. B. 1985. 91:121-130.]: 37-51. 106: 243-255. H. Proc. Dev. Prague. A.. D. Sci. M. Maternal inheritance of human mitochondrial DNA. 1987. Dev. Guerrero. Dev. B... G..] 2:159-176. and Stewart. 96: 1159-1163. Acad. Cell 41: 313-324. de la Torre. Liss. Malkin.. J. Patton. M. Phylogenetic changes in the type of fertilization. and Kopf. 1985. I. 1986. L. Cell 23: 543-549. J. M. A depolarization can trigger Ca2+ uptake and the acrosome reaction when preceded by a hyperpolarization in L. R. Proc. 1983. 1976. Peptides from sperm acrosomal protein that activate development. Rev. D. Curr. 1989... New York. and Pattern in Embryonic Development. Acad. B.. R. and Babcock. Sequential focal and global elevations of sperm intracellular Ca2+ are initiated by the zona pellucida during acrosomal exocytosis. Elevation of sperm adenosine 3':5'monophosphate concentrations by a fucose sulfate-rich complex associated with eggs. Novák (eds. J. Garbers. Florman. Time. Exp.. Kopf. Opin. J. Partin. Gerhart. Tubb. C. USA 51: 407-414. A. J. Ubbels. 83: 595-604. and Darszon. H. Membrane junctions in Xenopus eggs: Their distribution suggests a role in calcium regulation. Reprod. 1977. J. Fertilization. L. W. Phosphorylation of sea urchin sperm H1 and H2B histories precedes chromatin decondensation and H1 exchange during pronuclear formation. Cann. Elinson. Biol. Development 1989 [Suppl. L. B. P. G. Poste and G. Calmodulin activates NAD kinase of sea urchin eggs: An early response. Roberts. Science 269: 1718-1721. Activation of mammalian oocytes by intracellular injection of calcium. Gardiner. R. R. D. B. L.). Natl. Purified inositol 1. Sperm changes enabling fertilization in mammals. 1981. Gould-Somero. Cell Biol. and Lennarz. 4: 26-31. S.. In J. P. 109: 224-233. D. A. S. L. and Moyer. Biol. Primary structure and functional expression of the inositol 1. González-Martfnez. Fol. L. 101: 59-100. C.5trisphosphate receptor mediates calcium flux in reconstituted lipid vesicles. V. Elsevier North-Holland. Nature 292: 511-516. Giles. USA 75: 881-885. Jaffe. R. T. Natl. Alan R. Biol. The Cell Surface in Animal Embryogenesis and Deveopment. Doniach. 22: 526-532.. Dev. C. Jaffe.. Y. and Kirschner. E. Kopf. Biol 123: 574-577 Epel. Sur le commencement de I’hémogénie chez divers animaux.. Rowning.. I. A. G. Gerhart. 1988. L. Endo. S. G. Natl. M. Green.. H. and Cheung. Franklin. D. S. bindin. [Suppl. Josefson. F. 459-466. ZP3. A reinvestigation of the role of the grey crescent in axis formation in Xenopus laevis. Biol.. Hara. T. 1995. E. Natl. G. and Olson. O-linked oligosaccharides of mouse egg ZP3 account for its sperm receptor activity. J. K.. Huganir. and Storey. U. Sci. 6: 145-169. and Grey. J. Wallace. 1964. M. Templates for the first proteins of embryonic development. and Shur. In G. Reprod. R. 1992. H. E. Speciesspecific sperm adhesion in sea urchins: A quantitative investigation of bindin-mediated egg agglutination. Oryzias latipes. 1995. J. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka. Control of polarity in the amphibian egg. E. A. II. H. The program of fertilization. Academia. Release of ovoperoxiclase from sea urchin eggs hardens fertilization membrane with tyrosine crosslinks. A. Bechtol.. M. S. G. and Wassarman. P. USA 74: 4214-4218. L... Florman. Biol. Fertilization in amphibians: The ancestry of the block to polyspermy.. Gyllensten. M. Electrically mediated fast polyspermy block in eggs of the marine worm. Danilchik. R.S. and Poccia.. Electrical response of eggs to acrosomal protein similar to those induced by sperm. Enzymatic dissection of the functions of the mouse egg’s receptor for sperm. Fertilization. 1979. and Scharf. P. 1983. Foerder. Nature 267: 836-838. and Reynolds. Biol. R. Dev. Sci. Dev. and Vacquier. Biol. Gong. USA 77: 6715-6719. J. L. Miller. 128:185-197. Biol. G. Fulton. Elinson. B. J. P. Biol. 152: 304-314. and Stephano. Glabe.. 82: 426-440. Black. J. 1993. J. R.). Florman. D. Diabetes 2: 468-475. 1992. Supattapone. 1977. Glabe. R. Am. 1991.

Biol. 1993.C. 1983. Dev. Dev.. 149-184. and Migeon. 1988. Molecular Biology of Membrane Transport Disorders. Shaper. Luttmer. Development 112:107-117. Mandel. L. Nobiling. In S. 108: 2163-2168. C. L. 1992. Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with Fura-2. D. G. S. A. 1919. Reprod. 1980. G..). R. A. and Longo. Evidence for the involvement of microtubules. M. 1989a. M. 1978. pp. J. Molecular mechanisms of intracellular calcium excitability in X. 16:185-224. H. Egg membranes during fertilization. J. Langlais. E. Dev. Bayna. 116: 143-159. 1985. 1989. P. Kvist. Morphol. 1980. Hartsoeker. and Terhorst. and Saling. Biol. Biol.. E. 134: 446-451. 36: 1-10. Leeuwenhoek. Essai de dioptrique. L. P. and Jaffe. Linn. 134: 171-179. Hong. “Cleavage” and cortical granule breakdown in Rana pipiens oocytes induced by direct microinjection of calcium. R. Biol.E. 26: 201-208. and Schatten. J. Houliston.. Ultrastructural and morphometric observations of cortical endoplasmic reticulum in Arbacia. Dev. C. A. 12. Hamaguchi. Biol. H. McCulloh. Jacobs. Activation of sea urchin eggs by microinjection of calcium buffers. A. L. In A. L. D. Science 241: 464-467. 9: 271-277. and kinesin in cortical rotation of fertilized frog eggs. Dev. C. L. and Ubbels. Soc. R. Pawley. Cell Res. Kline. Cytoskel. M. and Gould.. 1991. L. Growth Differ. The intrinsic mechanism of chromatin decondensation and its activation in human spermatozoa. Plenum. Evidence that the voltage-dependent component in the fertilization porcess is contributed by the sperm. 63: 299-306. Hylander. Zool.. Maue.. Monroy (eds. B. 1994b. Carbohydrate-binding properties o boar sperm proacrosin and assessment of its role in sperm-egg recognition and adhesion during fertilization. Sci. G. Proc. D. H. Just. M. 36: 551-556. V. V. M. B. und Theilung des theirischen Eies. Normal postimplantation development of mouse parthenogenetic embryos to the forelimb bud stage. van. Cell Biol. Nlinked oligosaccharides of sea urchin egg jelly induces the sperm acrosome reaction. 1971. Differentiation 3: 15-20. Biol. Electrical polyspermy block in sea urchins: Nicotine and low sodium experiments. 114: 1017-1028. Hamaguchi. 0. M. . Kopf. Biol. D. M. S. Academic Press.. Cell Biol. Bull.. Schultz et al. N. 1989. C. Reconstitution of T cell receptor ζ -mediated calcium mobilization in nonlymphoid cells.. Longo. G.. A.. 1975. and Clapham. 1877. E. and Shur. Dev. Current Topics in Developmental Biology. Patterns of microtubule polymerization relating to cortical rotation in Xenopus laevis eggs. Dev. Letter to the Royal Society of London. Identification of sterol acceptors that stimulate cholesterol efflux from human spermatozoa during in vitro capacitation. Respiratory oxygen burst of fertilization. J. and Roberts. Electrical properties of vertebrate oocyte membranes. Measurements of messenger RNA entering polysomes upon fertilization in sea urchins. Dev. and Surani. Fertilization events induced by neurotransmitters after injection of mRNA into Xenopus eggs.. and Chambers. S. R. D. J. 1978. Dev. and Vacquier.. T. 1983. and Fodor. Sancho. Biol. B. 1988.. and Nilsson.. NY. Growth Differ. Biol. A. 189: 73-76. R. A. R. The isolation of acrosome-reaction-inducing glycoproteins from sea urchin egg jelly. L. 1694. R. Wilhelm Roux Arch. G. Dev. D. exocytosis. 1980. and Shapiro. 1976. Cell Motil. Fertilization process in the heart-urchin. Cell 69: 283-294. I. Jaffe. 1994a. T. Longo. T. P. L. Klag. and Saling. G. and Schuetz. laevis oocytes. Exp. G.. Growth Differ. Vol. 1685. P. J. 1985. Sci. Houliston. J. Quoted in E. 118: 155-166. J. F. L. 162: 304-312. D. D. Evidence of an acrosin-like enzyme in sea urchin sperm. Hunter. Y. 1991a. Kramp. L. Dev. 1988. M. Surface changes at fertilization: Integration of sea urchin (Arbacia punctulata) sperm and oocyte plasma membranes. Jaffe. 1977.. Beiträge zur Kenntniss der Bildung. M. USA 86: 1259-1263. P. 1985. Muncy. D. Images and ideas: Leeuwenhoek’s perception of the spermatozoa. Spisula. USA 93: 1164-1169. M. (eds. Dev. Science 261: 915-918. D. D. Cell Biol. L. and Elinson. and Vacquier. J. 1991b. 93: 368-380. endoplasmic reticulum.. Jaffe. Kline. Keller. Transformation of sperm nuclei upon insemination. G. B. Manes. Cell 57: 1123-1130. Kaufman. B. A. L. and mouse eggs. J. Levine. T. Ovarian programming of gamete progression and maturation in the female genital tract. E. Regulation of mouse gametic interaction by a sperm tyrosine kinase. Jaffe. Bunch. Cell Biol. 27: 349-359. A..).. Natl.P.. 20: 185-201. New York. C. F. Wilson. B. Brown. Regional morphological and cytochemical differentiation of the fertilized egg of Discoglossus pictus (Anura). Growth Differ. Dev. and Vacquier. and Saling. Biol. and Summers. 1980. R. Hardy. J. Paris. 95 kd sperm proteins bind ZP3 and serve as tyrosine kinase substrates in response to zona binding. Growth Differ. Clypaester japonicus. Dev. and Cross. Leyton. 95: 117-124. Afzelius. and Kunkle. Natl. A. F. B. Iwao. G. J.. Befruchtung. Jaffe. 22: 543-554. Biol. Acad. H. Leguen. Fast block to polyspermy in sea urchins is electrically mediated.. L. 143: 218-229. A. Longo. Evidence for the involvement of a pertussis toxin-insensitive G-protem in egg activation of the frog Xenopus laevis. R. 3: 223-250. E. R. and Hiramoto. Biol. V. Polyspermypreventing mechanisms. S. Lynn. Hall. Kline. and Elinson. Hertwig. Sprenkle. Ultraviolet light inhibits gray crescent formation in the frog egg. 1989b. F. D. E. Harumi. L. Correlative ultrastructural and electrophysiological studies of sperm-egg interactions of the sea urchin Lytechinus variegatus. J. and Jaffe. Sem. 71: 395-401. K. Y. E. C. Humphreys. B. K. 1983. Kan. 1986. L. Raymond. L. A.. A. P. Jaffe.. The fertilization reaction in Echinarachinus parma. M. Barton. Proc. Sea urchin sperm receptors for egg peptides. R. Biochemistry 25: 543-549. Dev. Walsh. D. 1994. L. F. 1976. Biol. T. L. Dev. Leyton. 22: 503-507. Nature 265: 53-55. J. Gamete Res. J. Fusion of liposomes induced by a cationic protein from the acrosomal granule of abalone spermatozoa. A. L. L. U. J. Jones. Rosenshein. J. N. 1989. F. 22: 517-530. Development 102: 781-792. and Elinson. 1988. Simoncini. observed with a differential interference microscope. 99: 265-276. M. Hist. 101: 1501-1510. Y. Bleau. N. Jahr. 126: 346-361. 1988. E. S. G. 1986. D. 30: 50-54. Nature 286: 714-716. R. Petzelt. 1981. D. An ultrastructural and immunocytochemical localization of hyaline in the sea urchin egg. Receptor function of mouse sperm surface galactosyltransferase during fertilization. Hollinger. H. Acad. 1: 347-452. A. 1982. 1992. 367-378. K. 1996. Keller.. Ruestow. Leyton. F. A. E. Litoff.. K.. Dev. and Lancaster. 1980. Biol. 5: 217-224. Biol. Shaper. P. W. and formation of pronuclei.162 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Hafner. N. J. and Hiramoto. Heinecke. Lechleiter. and Garbers. Evidence that aggregation of mouse sperm receptors by ZP3 triggers the acrosome reaction. H. W. Nature 261: 68-71. F. W.. Fert. A. L. 1986. S. L. Calcium-dependent events at fertilization of the frog egg: Injection of a calcium buffer blocks ion channel opening. H. A. Sources of calcium in egg activation: A review and hypothesis. Moscona and A.. W. pp. Biol. D. Mechanism of origin of complete hydatidiform moles. M. Lopez. J. Kado. J. and Jaffe. Granger.

Proc. 1981. 1. 275-337. L. Characterization of the sperm receptor on the surface of eggs of Strongylocentrotus purpuratus. Beiträge zur Entwicklungsmechanik des Embryo. F. N. P. L. Ramarao. B. Jr. and Lai. 1984. Ralt. R.. Evidence for the existence of two assembly domains within the sea urchin fertilization envelope. Chem. 29: 157-212. Reprod. Egg cortical granule N-acetylglucosaminidase is required for the mouse zona block to polyspermy. M. and Mikoshiba. Parrington. E. the mammalian sperm acrosome reaction. and Shur.5trisphosphate receptor in fertilized hamster eggs. Sperm and egg receptors involved in fertilization. 116: 111-1121. Calcium os cillations in mammalian eggs triggered by a soluble sperm protein. H. P. Miller. Biol. Biology of Fertilization. Kopf. McPherson. I. Development 121: 3457-3466. 1981. C. L. Nakanishi. Science 233: 305-312. J. R. Blobel. Dev. Gamete Res. A.4galactosyltransferase and egg-coat ZP3 mediates sperm-egg binding. 13: 31-44. D. 1979. 1981. Wilhelm Roux Arch. P. Nature 290: 702-704. W. E. L. A. Multigner.. Moller. 1994. J. S.. Vol. Nakade. G. R M. Pinto-Correia. Dev. J. T. T. Zool.4. D.). P. X.. 1997. M. V. Imaging protein kinase C activation in living sea urchin eggs after fertilization.. S. Stabilization of sea urchin flagellar microtubules by histone H1. J. 1984. W. S. University of Chicago Press. 1988. Mohri. C. L. J. and Hagiwara.. L. Swann. Biol. K. R. G. B. Mathews. Cell Biol. P. G. Mammalian sperm interaction with extracellular matrices of the egg. S. E. and Barbieri. and Chambers.. Cortical localization of a calcium release channel in sea urchin eggs. Biol.. F. J. V. Hyatt. 205: 385-392. 172: 139-157. Purification and characterization of a human follicular fluid lipid transfer protein that stimulates human sperm capacitation. Sci. A. J. Sperm chemo-orientation in the metazoa. Zygote 3: 95-99. Heparin and pentosan polysulfate. Macek. Nakada. 209: 229-238. 2.L.. Isolation and characterization of two proteinase inhibitors from the male reproductive tract of mice. K. Metz.. Block of Ca2+ wave and Ca2+ oscillation by antibody to the inositol 1. and Garbers. 1824. Curr. 1887. Biol. A. Natl. and Kopf. Natl. Academic Press. C. Proc. K. Miller. T. 11: 339-388. Sperm attraction to a follicular factor(s) correlates with human egg fertilizability.. R. R. D. 1989. J. and thirteen others. and Vacquier. Imaizumi. 99:137-175. Cell 37: 179-183. L. D. F. L. Identification of dynein as the outer arms of sea urchin sperm axonomes. Effect of sperm-induced activation current and increase of cytosolic Ca 2+ by agents that modify the mobilization of [Ca 2+] i I. Ivonnet. An ultrastructural study of epididymal mouse spermatozoa binding to zonae pellucida in vitro: Sequential relationship to acrosome reaction. Fully effective contraception in male and female guinea pigs immunized with the sperm protein PH-20. Monroy (eds. Y. Perreault.. K. Olds. Sci. Dev. 1991.. Dev. Orthopyxis caliculata. 1989. 1993. F. J. Nature 335: 543-546. Myles. Yuzaki. Primakoff.. 1992. Dev. I. 1985. S. W. Gagnon. and Schatten. Fukada Y. Ohama. L. D. S.. Sowinski. Cell Biol. Nature 360: 33-39. G. White. 104: 141-149. D. Sci. The importance of hydrolytic enzymes to an exocytotic event. B. Kobayashi. W. R. Schultz. Porter.. Biol. P. M. Formation of the amphibian gray crescent: Effects of colchicine and cytochalasin-B. Okamoto. D. D. 59: 125-157. M. D. J. 132: 331-342. Sesay.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 163 Manes. and A... Identification and purification of a sperm cell surface protein with a potential role in sperm-egg membrane fusion.. Biol. Cell Biol. Dorsselaer. 1995. J. Decker. Deuxieme mémoire sur la génération. H. 260: 8390-8396. Gong. 1991. Moy. P. 1989. D. Exp. 1985. and Chambers.. Exp. Anat. E. Moore. and Primakoff. McPherson. D. Ogawa. B. Ann. G. Nature 357: 589-593. K. M. J. Roux. K. H.. Shevchenko V. S. C. Development 120: 3313-3323. Lathrop. 146: 148-157. G. Beakers and breakers: how fertisation in the laboratory differs from fertisation in nature. 125: 181-186. J. Metz. Mead.. Roles of heteromeric and monomeric G proteins in sperm-induced activation of mouse eggs. Complete mouse egg activation in the absence of sperm by stimulation of an exogenous G proteincoupled receptor. Dev. Gen. P.. Nature 292: 551-552. Kajii. Natl. Top. L. and Storey. and Igusa. C. E. 104: 308-321. Reprod. Biol. P.. 116: 203-212. McGrath. Zarutskie. Kimmel. 1986. Effects of cytoskeletal inhibitors on ooplasmic segregation and microtubule organization during fertilization and early development in the ascidian Molgula occidentalis. Miyazaki. 1995. McDougall. Biol. J.. Mohri. and Longo. and Slott. G. 185: 99-104. Immunoperoxidase localization of bindin during the adhesion of sperm to sea urchin eggs. and Jackson. B. 1992. Curr. and Vacquier. C.. Salik. 1995. Mozingo. Prevost. C.. Tsukahara. Phosphorylation of sperm histone HI is induced by the egg jelly layer in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Identification of a binding site in the disintegrin domain of fertilin required for sperm-egg fusion. J. 159: 669-678. Woolman. P. Mikrosk. van and Job. E. Meizel. Miller. Dev. G. Site-specific agglutination and the timed release of a sperm chemoattractant by the egg of the leptomedusan. K. R. The Ovary of Eve: Eggs and Sperm and Preformation. G. 1984. Nature 379: 364-368. USA 91: 4195-4198. Dev. V. P.. W. G. 1977. Proc. B. B. G. 132: 103-112. J. Nishizuka. Arch. L. J. 1979. P. Poirier. and Krystal. Miller. 4: 555-569. Dispermic origin of XY hydaticliform moles. and Muller. S... Physiol. McCulloh. Y. 1978. Chicago. P. K. D. Ayabe. Roegiers. Dev. 172: 675-682. and eight others. Cowan. Characterization of a proteinase that cleaves zona pellucida glycoprotein ZP2 following activation of mouse eggs. 1992. Rev. Biol. 1992. 1993. Biol. M. Studies and perspectives of protein kinase C. 1996. and Wassarman. D. 1986. L. pp. Receptor-mediated regulation of guanylate cyclase activity in spermatozoa. Saling. Sci.. 47: 1126-1133. Fusion of membranes during fertilization. In C.. Importance of glutathione in the acquisition and maintainance of sperm nuclear decondensing activity in maturing hamster oocytes. Rossignol. M. USA 74: 5006-5010. K. and Schultz. 1992. M. 1988. Saling.-I. and Dumas. P. New York. D. Poccia. Elinson.. Zool. K. and Tredick-Kline. D. and Mohri. USA 88: 2840-2844. S. H. Biol. 1987. Science 257: 251-255. 12:107-148. Acad.. L. Biol. B. Dev. Completion of mouse embryogenesis requires both the maternal and paternal genome.. K. and Myles. S. Dev. J.. 1995. Primakoff. S. T. H. M. Dev. J. Earles. M. Oxford Rev.. Ravnik. D. 123: 1431-1440. 1994. and Sardet. Top. 1978. Moore.. Acad. D. Biol. M. Dev. and Chandler. E. D. Biol. Barbee. D. D. 1992. Visconti. Fertilization potential in golden hamster eggs consists of recurring hyperpolarizations. 1981. Decker. and Lennarz. and Shur. Campbell. and Solter. Nat. Biol. H... Miyazaki. C. T. J. 82: 287-296. Transitions in histone variants of the male pronucleus following fertilization and evidence for a maternal store of cleavagestage histones in the sea urchin egg. C. D. and Epel. D. Complementarity between sperm surface β-1. J. Shirakawa.. . Acad. The sperm entry point defines the orientation of the calcium-induced contraction wave that directs the first phase of cytoplasmic reorganization in the ascidian egg. A. 2: 129-149. T.. Sawada. Biol. S. 1978.. Biol.

M. G. Biol.. The paternal inheritance of the centrosome. J. 70: 306-326. Tombes. L. 1989. L. J. D. M. Suarez.. USA 71: 1915-1919. Storey. 1979. Intracellular calcium reaches different levels of elevation in hyperactivated and ac rosome-reacted hamster sperm. and Jaffe. and Payne. Carroll. Cell Biol. N. A. Williams. An ultrastructural analysis of early fertilization in the sand dollar. L. Suarez. and Garbers. 58: 185-196. Nat. Dev. G. B. L.. J. 1990.. 95: 574-579. Surface activity at the plasma membrane during sperm incorporation and its cytochalasin-B sensitivity: Scanning electron micrography and time-lapse video microscopy during fertilization of the sea urchin Lytechinus variegatus. B. J.. F. Schatten. Jaffe. G. Cell 41: 325-334. J.. Cell Biol. Terasaki. R. 110: 1589-1598. 1974. R. Exp. and Schatten. and Lennarz. 15: 523-551. 1973. H. Sluder. L. 1985. Kinematics of gray crescent formation in Xenopus eggs. L.. T. V. Steinhardt. Biol. E.. J. R. A. Protease release from sea urchin eggs at fertilization alters the vitelline layer and aids in preventing polyspermy.. M.. Acad. and Kopf. W. 1990. Role of Ca 2+ and H + in the assembly of actin and in membrane fusion in the acrosomal reaction of echinoderm sperm. Development 121: 1129-1137. The functional anatomy of the echinoderm spermatozoon and its interaction with the egg at fertilization. Biol. Centrosome inheritance in starfish zygotes II. Acad. W. and Barton. B. S. Cell Biol. and Jaffe. Bailey. S. Summers. P. Dev. Res. P. Shen. 1977. Dev. 1979. Science 222: 1034-1036. C. and White. 82: 227-235. J. A. 1975. and Schatten. and Burgart. Interactions between gametes leading to fertilization: The sperm’s eye view. 81: 145-154. Dev..5-trisphosphate and GTP-binding protein. 7: 927-942. Dev. L. B. Cell Res. in humans. E.. Miller. 1986.164 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Schackmann. J. Nature 272: 253-254. 103: 2333-2342. Davison.. Covalent coupling of a resact analogue to guanylate cyclase. Schatten. 1988. K. Am. and partial characterization of mouse sperm β 1. D. Cell Tiss. V. Zool. G. Escobodo. Cell Biol. Dev. C. Microtubules: Evidence for 13 protofilaments. The molecules of mammalian fertilization. T. P. Hylander. Owen. Cell Res. Relations of the diploid and triploid species of the Ambystoma jeffersonianum complex. Fujiwara. 1974. M. Miller. W. L. G.. Exp. D. M. Biol. 115: 1031-1037. Schatten. E. Evidence for the function of hyperactivated motility in sperm. 42: 325-333. Andrew. A partial sequence of ionic changes associated with the acrosome reaction of Strongylocentrotus purpuratus. D. J. D. B. 1991. Exp. Surani. 98: 325-337. and the implications for infertility. L. F. Plasma membrane association. K. 1976. 44: 375-381. Cell 45: 127-136. Exp. Uzzell. L.. 77: 536-560. G. 261: 15778-15782. Colwin L H. Natl.. S. C. J. Cell Biol. and Powell. Evidence for both tyrosine kinase and Gprotein-coupled pathways leading to starfish egg activation. Biol. J. F. Visconti. Vacquier. Summers. The interaction of sea urchin gametes during fertilization. Am.. T. 1977. F. M. R. Dev. Summers. Capacitation of mouse spermatozoa I. H. C. J. and Gerhart. Dev. and Snyder.. B. Barton. G. Sci. A. and Moy. 140: 272-280. D. Development of gynogenetic eggs in the mouse: Implications for parthenogenetic embryos. D. Muslin. Nuclear transplantation in the mouse: Hereditable differences between parental genomes after activation of the embryonic genome. Shur. Polymerization of actin. Shur. W. 59: 267-275. Cell 85: 629-637. and Colwin. R. Sluder. B. 1978. G.. Metabolite channeling: A phosphocreatine shuttle to mediate high-energy phosphate transport between sperm mitochondrion and tail. and Hylander. Echinarachnius parma. H. T. and Sardet. 80: 111-119. 150: 343-368. B. Vacquier. The activation wave of calcium in the ascidian egg and its role in ooplasmic segregation. Kiehart. C.. D.. H. The penetration of the spermatozoan through the sea urchin egg surface at fertilization: Observations from the outside on whole eggs and from the inside on isolated surfaces. USA 74: 2456-2460. C. A role for mouse sperm surface galactosyltransferase in sperm binding for the egg zona pellucida.. 1978.. and Hylander. Cell Biel. J. Biol.. Biol. L. D. R. Surface area change at fertilization: Resorption of the mosaic membrane. J. Biol. H. Demonstration of calcium uptake and release by sea urchin egg cortical endoplasmic reticulum. Species-specificity of acrosome reaction and primary gamete binding in echinoids. P. D. K. S. Sperm surface galactosyltransferase activities during in vitro capacitation. A. D. J. and Lewis. and Primakoff. Proc. S. Biol. A. 155: 58-67. L. 1964. Sci. 1: 1-10. C.. Med. Dev. 1975. 1982b. 1.A. P. Moore. and Fein. 1986. and Whitaker. Direct measurement of intracellular pH during metabolic depression of the sea urchin egg. 113: 484-500. A. J. 1991. Mol. L. Olds-Clarke. Proc. Dangott. K. V D. 96: 63-68. Steinhardt. D. and Hall. and ten others. M. S. J. R. D. G. F. 71: 33-48. R. J.. 102: 70-76. S. 1987. M. J. 1986. A. Dev. Sardet. L. K. Dev. A. and Epel. and Reider. S. M. Jaffe. 1981. Shen. Speksnijder. and Tilney. Simerly. J. 131: 567-579. Activation of sea urchin eggs by a calcium ionophore. D. K. R. 127: 330-340. and Dai. and Steinhardt. N. 1994. IV. and Norris. Reprod. and Epel. Biol. C.. J. Tegner. A.. Zool. B. Methods for quantitating sea urchin sperm in egg binding. J. SeGall. and Shapiro. and Neely. Snell. The Sciences 23(5): 28-35. The displacement of subcortical cytoplasm relative to the egg surface. J. W. M. S.. and Hall. Cell Res. Katz. Vacquier. C. Shimomura. G. Copeia 1964: 257-300. 1983. Shur. Schroeder. R. D. M. and Mazia.4. 95: 567-573. 1980. Fert. Selective suppression of the maternal centrosome during meiosis. J. G. Cell Biol. 1995a. Vacquier. S. S. G. L. 162: 590-599. 1973. B. Bryan. P. J. Isolation of bindin: The protein responsible for adhesion of sperm to sea urchin eggs. M.. F. 1982a. Bush. Turner. 1983. 1973. Dev. D. Biol. L. Zucker. G. Biol. Shen. G. and Buck. D. A synthestic peptide of the pseudosubstrate domain of protein kinase C blocks cytoplasmic alakalinization during activation of the sea urchin egg. P. D. Chem. Tilney. 1986.. Swann. 120: 577-583. D. Cell Res. Murphy. 1986. H. L. D.4-galactosyltransferase. Biol. G. and Shapiro.2Diacylglycerols mimic phorbol 12-myristate 13acetate activation of the sea urchin egg. 19: 839-849. Chemical characterization of the component of the jelly coat from sea urchin eggs responsible for induction of the acrosome reaction. Chem. 1979. 1995. Cell. . A. the cell’s microtubule-organizing center. Lewis. Cell Biol. S. R.. 1996. L. The energetic egg. H. V. E. 1994. purification. 1993. Mooseker. Oster. 78: 435-449. S. Vincent. J. Reprod. B. E. A cholera toxin-sensitive G-protein stimulates exocytosis in sea urchin eggs. Reprod. Centrosome inheritance in starfish zygotes: Selective loss of the maternal centrosome after fertilization. G. Natl. J. Physiol. and Schatten. 263: 17706-17714. R. 1995. M.. G. J. Biol. The part played by inositol trisphosphate and calcium in the propagation of the fertilization wave in sea urchin eggs. X. G. Sardet. Pan. 1986. J. Intracellular calcium release at fertilization in the sea urchin egg. M. Tilney. R. Turner. Correlation between capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. J. Dev. Surani. S. Regulation of cortical vesicle exocytosis in sea urchin eggs by inositol 1. Shilling.

Role of G proteins in mouse egg activation: Stimulatory effects of acetylcholine on the ZP2 to ZP2f conversion and pronuclear formation in eggs expressing a functional ml muscarinic receptor. R.). M. Dev. 128: 429-462. Ionic regulation of egg activation. A. N. N. M. Z. A. Anat. 1994. D. 151: 288-296. R. Williams. The Physiology of Reproduction.. R. 1991. Weinberg. 1989. Xu. Biol. R. S. R. A. Science 235: 553-560. 37: 159-169. Whitaker. survival of pregnancy. Am. 1994. Molecular events mediating sperm activation. D. Wassarman. 101: 2324-2329. K. Nature 312: 636-639. Timing of sexual intercourse in relation to ovulation: Effects on the probability of conception... S.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 165 Visconti. M. Q. Development 120: 1851-1859. P. Highly polarized EGF receptor tyrosine kinase activity initiates egg activation in Xenopus.. L. L. 1970. H. In E. Cell Biol.. E. L. J. Biol. Schultz. 158: 9-34. Knobil and J. and Vacquier. M. and Steinhardt. 1984. E. Ward. R. Opresko.. G. F. L. N. J.. Clark. Raven Press. 1995. 1995. D. Med. Steinhardt. J. 333: 1517-121. M. and Noda. Biol. D. Dev. Yanagimachi. G.. S. Wassarman. Y. 1987. Reprod. 162: 41-55. C. L. 1993. Mammalian fertilization. W. . D. Biol. 1982. Wiley. and Irvine. S. J. von Kolliker. C. Electron microscope studies of sperm incorporation into the golden hamster egg. and seven others. and Kopf. Nature 287: 558-560. and the sex of the baby. G. Grainger. 1987. C. Winkler. nebst einem Versuch Über Wesen und die Bedeutung der sogenannten Samenthiere. Independent inactivation of MPF and cytostatic factor (Mos) upon fertilization of Xenopus eggs. Zeng.4. P. L. Biol. M.5-trisphosphate-mediated Ca 2+ release in early and late events of mouse egg activation. 2nd Ed. D. R. Brokaw. Beiträge zur Kenntnis der Geschlectverhdltnisse und der Samenflüssigkeit wirbelloser Thiere. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. R. Involvement of inositol-1. Sperm membrane potential: Hyperpolarization during capacitation regulates zona pellucida-dependent acrosomal secretion. G. 1985.. M. Inabar. Rev. Development 121: 1139-1150. Yanagimachi. Ikawa. and Florman. J. Whitaker. Wilcox. Biophys... 1980. Yirn. Y. a pepticle from the egg jelly layer.. R. 1992. 1841. Neill (eds. Biol. Sci. 1994. 1995b. Berlin. V. K. Sperm chemotaxis during the process of fertilization in the ascidians Ciona savignyi and Ciona intestinalis. Nature 352: 247-249. Garbers. Dual ionic controls for the activation of protein synthesis at fertilization. The biology and chemistry of fertilization. 1993. Fertilization in mammals.5-triphosphate microinjection activates sea urchin eggs. D. and Minning. Dev. Y. NY.. M. Capacitation of mouse spermatozoa II. and Nuccitelli.4. Dev. Isolation and biochemical characterization of the subunits of the rabbit sperm acrosome stabilizing factor. 15: 593-666. Engl. Chemotaxis of Arbacia punctulata spermatozoa to resact. and Morisawa. Am. Hunt. G. J. Ward. N. Yoshida. J. H. and Kopf. 157: 497-506. E. 256(6): 78-84. M. Watanabe. Kopf. Wilson. M. and Sagata. T. P. and Schultz. 171: 554-563. and Oliphant. Inositol 1. and Baird. C. Dev. R.

.

Durante a clivagem embrionária. e assim por diante. enquanto a clivagem dos núcleos ocorre numa razão tão rápida nunca vista antes (nem mesmo em células de tumor). sem o aumento do seu volume. o volume citoplasmático não aumenta. Antes. daí se divide. E. O genoma zigótico transmitido por mitose para todas as outras células. não funciona em embriões com clivagem precoce. o embrião pode dividir-se apropriadamente até mesmo quando produtos químicos são usados para inibir a transcrição. Esse crescimento produz um aumento total de células enquanto mantém uma razão relativamente constante entre volume nuclear e volume citoplasmático. Uma conseqüência dessa divisão rápida é a razão do volume citoplasmático/nuclear se tornar cada vez menor assim que a clivagem progride. do qual existe um período de crescimento celular entre as mitoses: a célula se expande para quase o dobro de seu volume. Poucos. Essa divisão do citoplasma do ovo.000 células em apenas 43 horas.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 167 Clivagem: Criando multicelularidade 5 Para nossa limitada inteligência. GARRETT HARDIN. no entanto. mRNAs são produzidos mais tarde durante a clivagem. o enorme volume do citoplasma zigótico é dividido cada vez mais em células menores. A célula. não há aumento do volume embrionário durante a clivagem. pode parecer simples dividir um núcleo em partes iguais. a fertilização é o passo inicial do desenvolvi- 167 . (1923) Deve-se mostrar o máximo respeito por tudo que cresce exponencialmente. Em muitos tipos de embriões. uma série de divisões mitóticas pelo qual o enorme volume do citoplasma do ovo é dividido em numerosas pequenas células nucleadas.000 células. em estágio de clivagem. O primeiro ovo é dividido ao meio. (1968) mento. isso começa por um processo chamado clivagem. manifestadamente. não importa o seu tamanho. inicia agora a produção de um novo organismo multicelular. pode ser dividido em 37. é acompanhada pela abolição do período de crescimento entre as divisões. se alguns. em oitavos. por exemplo. ocorre a cada dez minutos por mais de duas horas. A mitose na Drosophila. O zigoto. 1953). Isso difere da maioria dos casos de proliferação de células. B. WILSON. com o seu novo potencial genético e com sua nova disposição do citoplasma. Essas células em estado de clivagem são chamadas de blastômeros. a diminuição da razão entre os volumes citoplasmático e nuclear é crucial na N OTÁVEL COMO SÓ ELA É.1 mostra o logaritmo de números celulares em um embrião de rã representado graficamente em função do tempo de desenvolvimento (Sze. A Figura 5. em seguida em quartos. Ela ilustra uma evidente descontinuidade entre clivagem e gastrulação. abriga uma opinião muito diferente. Na maioria das espécies (mamíferos sendo a principal exceção) a velocidade da divisão celular e a colocação dos blastômeros um em relação ao outro estão completamente sob controle das proteínas e dos mRNAs armazenados no oócito pela mãe. Também em muitas espécies. Em todas as espécies de animais conhecidas. Esse aumento em número de células pode ser apreciado comparando a clivagem com outras fases do desenvolvimento. e em apenas 12 horas forma algo em torno de 50. Um ovo de rã.

(Segundo Sze.) Clivagem Gastrulação Horas a 150C regulagem do tempo da ativação de certos genes. ainda que a clivagem comece logo após a fertilização e termine assim que o embrião atinja um novo equilíbrio entre o núcleo e o citoplasma. a razão da clivagem diminui. PADRÕES DE CLIVAGEM EMBRIONÁRIA Clivagem é um processo muito bem coordenado e é regulado pelas leis genéticas. concentrado em uma extremidade do ovo) Centrolécito (vitelo concentrado no centro do ovo) .1 Log10 do número de células por embrião Formação de novas células durante o desenvolvimento precoce da rã Rana pipiens. A quantidade e distribuição de vitelo determina onde a clivagem pode ocorrer e o tamanho relativo dos blastômeros. a divisão celular ocorre nesse pólo de uma forma mais rápida do que a do pólo oposto. nematelmintos. O pólo rico em vitelo é chamado de pólo vegetal. os blastômeros tornam-se móveis e os genes nucleares começam a ser transcritos.168 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 5. O padrão da clivagem embrionária de uma dada espécie é determinado por dois parâmetros principais: (1) a quantidade e a distribuição de proteína do vitelo dentro do citoplasma e (2) aqueles fatores no citoplasma do ovo que influenciam no ângulo do fuso mitótico e na determinação do tempo de sua formação. anelídeos. porque o tempo dessa transição pode ser mudado experimentalmente alterando na célula a razão da cromatina para o citoplasma (Newport and Kirschner.1 Classsificação dos tipos de clivagem Padrão de clivagem Holoblástica (clivagem completa) Posição do vitelo Isolécito (oligolécito) (vitelo escasso. Quando um pólo do ovo é relativamente livre de vitelo. a concentração de vitelo no Tabela 5. 1982a. A essa altura. a transcrição de novas mensagens só é ativada após 12 divisões. na rã Xenopus laevis.b). 1953. distribuído por igual) Simetria de clivagem Radial Espiral Bilateral Rotacional Radial Bilateral Discoidal Superficial Animais representativos Equinodermos. Por exemplo. Amphioxus Maioria dos moluscos. aves Maioria dos artrópodos Meroblástica (clivagem incompleta) Mesolécito (moderadamente telolécito) Telolécito (vitelo denso. É sabido que algo no ovo está sendo titulado pela recém-produzida cromatina. platelmintos Ascídios Mamíferos Anfíbios Moluscos cefalópodos Répteis. peixes.

holoblástica espiral. é ilustrada na Figura 5. Ao contrário. adotam uma outra estratégia: a placenta. Esse tipo de clivagem é característico de equinodermos e do protocordato Amphioxus. como em zigotos de insetos. holoblástica bilateral e clivagem holoblástica rotacional.) No entanto. A terceira divisão é equatorial: as hastes mitóticas de cada blastômero estão agora em posição . se torna a primeira diferenciação do embrião mamífero separando as células que irão formar a placenta. nos quais muito pouco vitelo está presente. tais como as Eleutherodactylus e a Arthroleptella não passam pelo estágio de girino. como os ouriços-do-mar.1 fornece a classificação dos tipos de clivagem e mostra a influência do vitelo no padrão e na simetria da clivagem. Animais desenvolvidos sem grandes concentrações de vitelo. O vitelo é uma extraordinária adaptação que permite ao embrião se desenvolver na ausência de uma fonte externa de alimentação. 1947). O núcleo do zigoto é freqüentemente deslocado em direção ao pólo animal. normalmente formam o estágio larval muito rapidamente. Na ausência de grandes quantidades de vitelo. Existem também padrões herdados de divisões celulares que são adicionados às restrições do vitelo. o vitelo é somente um fator influenciando o padrão de clivagem em uma espécie. Para esse fim. ou superficial. Synapta A clivagem padrão da holotúria. No outro extremo estão os ovos dos insetos. respectivamente. Synapta digita. dependendo onde o depósito de vitelo estiver localizado. assim como de rãs e salamandras. meridional e perpendicular uma com a outra. Os sulcos da segunda clivagem estão no ângulo reto dos sulcos da primeira clivagem. A correlação entre grandes concentrações de vitelo e a falta do estado larval é conhecida em algumas espécies de rãs. criando duas células filhas do mesmo tamanho. como veremos adiante. ao mesmo tempo. Nesse tipo de clivagem os sulcos têm orientação paralela e perpendicular ao eixo animalvegetal do ovo. como nos ovos das aves. Algumas rãs tropicais. O sulco da clivagem não chega a penetrar na porção de vitelo do citoplasma. A maior parte do seu volume celular é vitelo. A Tabela 5. Embriões de mamíferos. Esse estágio larval pode se alimentar por si só.2. Zigotos contendo grande acúmulo de proteína vitelínica sofrem clivagem meroblástica. Essa clivagem é conhecida como meridional porque passa pelos dois pólos como um meridiano no globo. significando que o sulco da clivagem se extende por todo o ovo. Esse órgão fornece alimento e oxigênio para o embrião durante sua longa gestação. o vitelo inibe a clivagem. onde somente uma porção do citoplasma é clivado. quatro tipos principais de clivagem podem ser observados: holoblástica radial. Dessa maneira. que também não possuem uma grande quantidade de vitelo. o desenvolvimento continua com a larva nadando livre. as primeiras duas divisões são. o eixo da primeira haste mitótica é formado perpendicularmente ao eixo animal-vegetal do ovo. eles provém seus ovos com quantidades enormes de concentração de vitelo (Lutz.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 169 pólo animal é relativamente baixa. Os ovos não necessitam ser colocados na água porque o estágio de girino foi eliminado. No geral. Isso pode ser prontamente observado em ovos isolécitos. répteis e aves. Clivagem holoblástica radial Clivagem holoblástica radial é a forma mais simples de clivagem de se entender. Após a união dos pronúcleos. O vitelo deve ser o suficiente para nutrir esses animais. A holotúria. de um lado (telolécito) ou no centro do citoplasma (centrolécito). Os dois sulcos da clivagem aparecem simultaneamente em ambos blastômeros e também passam pelos dois pólos. sendo que eles se desenvolvem sem um estágio larval ou placentário. (Isso será discutido mais adiante no Capítulo 19. o primeiro sulco da clivagem passa diretamente através dos pólos animal e vegetal. Em zigotos com relativamente pouco vitelo (ovos isolécitos e mesolécitos) a clivagem é holoblástica. Clivagem meroblástica pode ser discoidal. peixes. mas continuam perpendiculares ao eixo animal-vegetal do ovo.

Summers et al. os eventos são bem diferentes. separando os dois pólos um do outro (Figura 5. A qualquer momento durante a clivagem da Synapta. no entanto. com divisões meridionais alternando com divisões equatoriais. um embrião seccionado através de qualquer meridiano produz a imagem refletida de duas metades. e a cavidade central é referida como blastocele. e o sulco resultante da clivagem separa os dois pólos um do outro. A primeira e a segunda clivagem são similares as da Synapta. produzindo uma blástula com 128 células. 1982. levando à formação de uma blástula oca. A quarta divisão é meridional novamente. Esse tipo de simetria é característico de uma esfera ou cilindro e é chamada de simetria radial. sofre uma clivagem equatorial desigual para produzir no pólo vegetal quatro células grandes.3). conforme mostrado no corte (último painel). Ouriço-do-Mar Ouriço -do-Mar O ouriço-do-mar também apresenta clivagem holoblástica radial. Os macrômeros se dividem meridionalmente. 1993). A camada vegetal. Sucessivas divisões produzem embriões de 64. (Segundo Saunders. Dessa maneira. para criar uma esfera oca composta de uma única camada de células. a terceira clivagem é equatorial. os macrômeros. produzindo quatro fileiras de 8 células cada. cada qual com o mesmo volume.170 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 5. no entanto. Essas células são chamadas mesômeros. ambas são meridionais e perpendiculares em relação a outra. Os embriões resultantes consistem de blastômeros dispostos em fileiras horizontais ao longo de uma cavidade central. Todos os sulcos de clivagem da sexta divisão são equatoriais. Na quarta clivagem. produzindo um pequeno grupo abaixo da camada maior. Cada blastômero na metade animal do embrião está agora diretamente acima do blastômero da metade vegetal.128 e 256 células. uns em direção aos outros. a sétima clivagem é meridional. Synapta tem clivagem holoblástica radial. Os micrômeros também se dividem. Essa esfera oca é chamada de blástula.2 Pólo animal Clivagem holoblástica no equinodermo Synapta digita. os oito mesômeros se dividem para formar duas camadas “animais”.4. As quatro células da camada animal se dividem meridionalmente em oito blastômeros. mas com algumas importantes modificações. Assim que a célula com 16 embriões clivar.) Plano de clivagem meridional Plano de clivagem equatorial Pólo vegetal Metade Animal Pólo animal Metade Vegetal Blástula oca (aberta por corte) Pólo vegetal paralela ao eixo animal-vegetal. Em ambos os pólos do embrião. enquanto a quinta divisão é equatorial. . os micrômeros (Figura 5. uma se equilibrando em cima da outra. an1 e an2. e quatro pequenas. formando uma camada de oito células abaixo de an2. produzindo duas fileiras de 8 células cada. dividindo o embrião em oito blastômeros iguais. os blastômeros se movem. Similarmente..

(Fotografia cortesia de G. ainda ocorreria no tempo apropriado. Os pólos vegetais dos embriões são visualizados por baixo.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 171 (A) Pólo animal Figura 5. (C) O estágio de 4 células. (A) A localização e orientação do fuso mitótico na parte baixa das células vegetais são visualizadas com luz polarizada no embrião vivo. os macrômeros centrais e dos micrômeros vegetais em ângulo para o centro. ou colocando-os em água do mar hipotônica. colocados assimetricamente.3 Pólo vegetal Mesômeros Metade animal an 1 an 2 derivados derivados veg1 veg2 Clivagem no ouriço-do-mar. a clivagem desigual (quarta) que forma os micrômeros. (B-D) Fotomicrografias de embriões vivos do ouriço-do-mar Lytechinus pictus.) Metade vegetal (B) Micrômeros Macrômeros (C) (D) Em 1939. sacudindo os ovos. visão de cima para baixo do pólo animal. (A) Planos de clivagem nas primeiras três divisões e formação de camadas particulares de células nas divisões 3-6. Watchmaker. Inoué. Sven Hörstadius realizou um experimento simples demonstrando que o controle do tempo e colocação de cada clivagem de ouriço-do-mar é independente de clivagens preexistentes. Sendo assim. (B) A clivagem através desses fusos. (D) O estágio de 32 células. Hörstadius concluiu que existem três fatores que determinam a clivagem em um embrião de 8 células: (1) existem mudanças progressivas no citoplasma. a segunda e terceira clivagens. Figura 5.4 (A) (B) Formação de micrômeros durante a quarta divisão de embriões de ouriços-do-mar. produziu micrômeros e macrômeros. (B) O estágio de 2 células. Ele demonstrou que se inibisse a primeira. 1982.) . (de Inoué. mostrado sem a membrana de fertilização para permitir a visualização dos mesômeros do pólo animal. cortesia de S.

B). No desenvolvimento do ouriço-do-mar. C de Dan-Sohkawa e Fujisawa. a blástula permanece como uma camada unicelular grossa. Durante esse período. Dan-Sohkawa a Fujisawa (1980) analisaram esse método em embriões de estrela-do-mar e mostraram que o fechamento da cavidade esférica é contemporânea com a formação de junções apertadas entre os blastômeros.) algum tempo após a fertilização. Essas junções unem as células frouxamente conectadas num tecido epitelial onde a blastocele é isolada do ambiente externo (Figura 5. exercendo pressão nos blastômeros para se expandirem. que direcionam os fusos formados para uma certa direção. Essa pressão também alinha o longo eixo de cada célula para que a divisão nunca seja para dentro da blastocele. as células não têm alternativa a não ser a de se expandir. Wolpert e Gustafson (1961) e Wolpert e Mercer (1963) propuseram que a pressão da blastocele não é necessária para se conseguir esse efeito. as células formam uma esfera oca circundando a blastocele central (Figura 5. (C) Junções apertadas (flecha) formando– se entre células de uma blástula de equinodermo com 1024 células. todas as células são do mesmo tamanho.5C). Isso criaria uma expansão adicional fazendo com que a população fosse orientada somente para um plano. Em um trabalho recente (Ettensohn e Ingersoll.172 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Cílio Blastocele (A) Blástula jovem (B) Blástula mais velha com placa vegetal achatada e tufo ciliar (C) Figura 5. mostrando uma camada única de células arredondadas rodeando uma grande blastocele. Dando prosseguimento a sua divisão. a camada celular é expandida e se afina.5 Blástulas de ouriço-do-mar. Nessa altura. 1992) concluíram que é provável que ambos .1973). Esse fluido absorve grandes quantidades de água por osmose. Certamente. as células da blástula tardia mostram diferenças de forma à medida que as células da placa vegetal se alongam. então a expansão da blastocele cessa (Adelson e Humphreys. cortesia dos autores. seu fluido torna-se espesso. os contatos entre as células são estreitados.5A. Já que o blastômero secreta proteína na blastocele. (B) Com a contínua divisão. o estágio de blástula começa na fase de 128 células. 1980. Duas teorias surgiram para explicar a concomitante proliferação de células e formação da blastocele. e se a adesão de células da camada hialina é inibida por anticorpos para a hialina. Eles enfatizaram o papel de adesividade das células entre si e a camada hialina. Nesse estágio. Eles mostraram que enquanto permanecessem fortemente atracadas na camada hialina. Dan (1960) conjeturou que o motivo maior dessa expansão é o influxo de água na cavidade da blastocele. (A) Esquema de um corte controle através de uma blástula precoce de ouriço-do-mar. Durante esse tempo. 1973. a camada hialina é vital para expansão da blastocele. e (3) deve haver algum mecanismo pelo qual o material formador de micrômeros seja ativado no tempo correto (Hörstadius. 1988). (2) deve haver material formador de micrômero no citoplasma vegetal. Toda a célula está em contato com o fluido proteináceo da blastocele e com a camada hialina dentro do envoltório de fertilização. os micrômeros tendo diminuída sua divisão celular e clivando menos freqüentemente. (A e B segundo Giudice. Essa expansão cria a blástula ao invés do contrário.

(Segundo Carlson. mostrando a primeira clivagem em um ovo de rã. Anfíbios Clivagem na maioria dos embriões de rãs e salamandras é radialmente simétrica e holoblástica. antes da primeira divisão ter dividido o citoplasma vegetal. Sulcos de clivagem. mais lenta (Figura 5. (Cortesia de W. da qual sua forma é vagamente reminiscente). que é concentrado no hemisfério vegetal. Humphreys. desse modo.7).8B mostra que enquanto o sulco da primeira clivagem ainda está tentando clivar o vitelo citoplasmático do hemisfério vegetal. a segunda clivagem já começou próxima ao pólo animal.02-0. e outra de macrômeros. No estágio de 128 células a blastocele se torna aparente e o embrião é considerado uma blástula. Na salamandra axolotle.8C). A células da blástula desenvolvem cílios em sua superfície externa (Figura 5. o sulco da clivagem se estende através do hemisfério animal a uma velocidade próxima de 1mm/min.7 Crescente Cinzento (E) (F) (G) (H) Blastocele Clivagem de um ovo de rã. no entanto. Embriões anfíbios contendo de 16 a 64 células são freqüentemente chamados mórulas (do Latim “amora”. as células da parte animal do embrião sintetizam e secretam uma enzima de eclosão que lhes permite digerir a membrana fertilizante (Lepage et al. No entanto. 1992). Logo após. O ovo do anfíbio. 1977). Podemos notar as dobras nos sulcos da clivagem e a diferença entre os sulcos nos hemisférios animal e vegetal. como na clivagem do equinodermo. designados por números romanos. próxima ao pólo animal. a primeira divisão começa no pólo animal e vagarosamente se estende até a região vegetal (Figura 5.8A é uma varredura no microscópio eletrônico. Durante a clivagem precoce. enquanto que em estágios mais tardios. estão enumerados por ordem de aparecimento. por causa do vitelo vegetalmente colocado. (D-H) No final. 1981. Figura 5. O sulco da clivagem seciona o crescente cinzento e depois diminui para menos de 0. J.. B) O vitelo vegetal impede a clivagem fazendo com que a segunda divisão comece na região animal do ovo.) (A) (B) (C) (D) Figura 5. (C) A terceira divisão é deslocada em direção ao pólo animal. A Figura 5. enquanto a região vegetal contém uma pequena quantidade de grandes macrômeros carregados de vitelo (ver Figura 5. Essa clivagem está em ângulos retos em relação à primeira. o embrião se torna uma blástula eclodida livre para nadar. A terceira clivagem. Ele divide o embrião de rã em quatro blastômeros animais pequenos (micrômeros) e quatro grandes blastômeros (macrômeros) na região vegetal. é equatorial. A Figura 5. como era de se esperar.) . o hemisfério vegetal contém blastômeros mais longos e mais escassos que os da metade animal. Esse vitelo. e é também meridional. Sendo assim.6).6 Células ciliadas da blástula. contém muito mais vitelo. esse sulco da clivagem em ovos anfíbios é muito mais próximo do pólo animal.7). Essa clivagem holoblástica desigual estabelece duas regiões embrionárias principais: uma de divisão rápida de micrômeros. Assim que a clivagem progride. é um impedimento à clivagem.03mm/min ao se aproximar do pólo vegetal (Hara.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 173 mecanismos expandem a blastocele. Cada célula desenvolve um único cílio. (A. a adesão à camada hialina parece ser o fator mais importante. a pressão osmótica também parece exercer o seu papel. a região animal se torna abarrotada com numerosas células pequenas. causando a rotação da blástula dentro do envoltório de fertilização.

1994). Isso resulta na obliteração da blastocele (Figura 5. Kalt. A blastocele provavelmente presta duas principais funções no embrião das rãs: (1) é uma cavidade que permite migração celular durante a gastrulação. 1971. Biedler. que posteriormente se desenvolve na blastocele.9). a formação da blastocele foi traçada desde o primeiro sulco de clivagem. numerosas células com moléculas de adesão mantêm as células juntas. e (2) previne células que estão abaixo interagir prematuramente com as células de cima. (A de Beams e Kessel. Uma das mais importantes dessas moléculas é a EPcaderina. R. que são adjacentes aos precursores do endoderma.9 Formação da blastocele num ovo de rã. mostrando a discrepância de tamanho entre as células animais e vegetais aparecendo após a terceira divisão. Kalt (1971) demonstrou que na rã Xenopus laevis o primeiro sulco da clivagem se alarga no hemisfério animal para criar uma pequena cavidade intercelular que é isolada do ambiente externo por junções intercelulares muito apertadas (Figura 5.. cortesia dos autores.10). (A) Primeiro plano de clivagem mostrando uma pequena fenda. Como o tecido mesodérmico é normalmente formado dessas células animais. (C) Quarta clivagem (16 células). a blastocele aparece para prevenir o contato do endoderma com células destinadas para dar origem à pele e aos nervos.) (A) (B) . (B) Segunda clivagem (4 células). 1976. (de Kalt. Essa cavidade se expande durante clivagens subseqüentes para se tornar uma blastocele. Sendo assim. (A) Primeira clivagem.) (B) (C) Na realidade.174 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) Figura 5. e se essa mensagem é destruída (injetando no oócito oligonucleotídeos antisense complementares para esse mRNA). essas células animais se tornaram mesoderma ao invés de ectoderma. Enquanto essas células estão dividindo-se. parece plausível que células vegetais influenciam células adjacentes para se diferenciar em tecidos mesodérmicos. a EP-caderina não é produzida e a adesão entre os blastômeros é dramaticamente reduzida (Heasman et al. B e C cortesia de L. O mRNA para essa proteína é fornecido no citoplasma do oócito.8 Pregas Sulco de clivagem Micrografias ao microscópio eletrônico da clivagem de um ovo de rã. Quando Nieuwkoop (1973) tirou células do topo da blastocele de um embrião de salamandra aquática e colocou-as junto a células do vitelo vegetal na base da blastocele. cortesia de M. (B) embrião de oito células mostrando uma pequena blastocele (flecha) na junção de três planos de clivagem. Figura 5.

as mesmas células foram vistas no mesmo lugar e o seus destinos. criando um relacionamento espiral característico da clivagem. os ovos não se dividem em paralelo ou em orientações perpendiculares ao eixo animal-vegetal do ovo. formando a disposição “espiral” de blastômeros filhos. fotografia. Primeiro. elas assumem o empacotamento com a orientação termodinamicamente mais estável.11). Difere da clivagem radial em muitas maneiras. produzindo quatro grandes macrômeros (marcados A. parecido com o de bolhas de sabão adjacentes (Figura 5. C e D). uma característica que permite serem individualmente identificados.13 retratam a clivagem de embriões de moluscos. Em muitas espécies. Em cada sucessiva clivagem. Observando o embrião pelo pólo animal. O arranjo termodinâmico maximiza o contato e é muito reminiscente daquele de embriões que se clivam em espiral. Quando os destinos das células individuais em embriões de anelídeos. mas (B) não pelos controles. vermes nemertinos e todos os moluscos. Cada quarteto sucessivo de micrômeros é deslocado para a direita ou para a esquerda de seu macrômero irmão. foram idênticos (Wilson. platelmintos turbelários e moluscos foram comparados. de preferência. Na terceira clivagem. Na realidade. a clivagem se dá em ângulos oblíquos. Terceiro. o macrômero A dará origem a duas células filhas. Isso faz com que micrômeros alternados se formem obliquamente para a esquerda e para a direita do seu macrômero. B.10 Depleção de EP-caderina mRNA no oócito de Xenopus. As Figuras 5. as células se tocam entre si em mais lugares do que em embriões clivados radialmente. A blastocele é obliterada em embriões depletados de EP-caderina. cada macrômero origina um pequeno micrômero no seu pólo animal.) Clivagem holoblástica espiral Clivagem espiral é característica de vermes anelídeos. os blastômeros são de tamanhos diferentes (D sendo o maior). resultando na perda de adesão entre os blastômeros e na obliteração da blastocele.11 Diagrama mostrando o arranjo de quatro e oito bolhas de sabão num prato ligeiramente côncavo.12 e 5. Na maioria das espécies. as partes superiores do eixo mitótico parecem alternar entre o sentido horário e o anti-horário. prevenindo a expressão da EPcaderina. 1898). Na quarta clivagem. Oligonucleotídeos antisense complementares à mensagem da EP-caderina foram injetados no embrião unicelular. de uma maneira geral. (Segundo Morgan. 1994. exceto cefalópodos. os micrômeros estão à direita do seu macrômero (olhando para o pólo animal).CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 175 (A) (B) Figura 5. macrômero 1A e micrômero 1a. platelmintos turbelários. embriões de clivagem espiral normalmente realizam menos divisões antes de começar a gastrulação. tornando possível saber o destino de cada célula da blástula. C e D se comportam similarmente.. Segundo. Heasman. As blástulas então produzidas não têm blastocele e são chamadas de estereoblástulas. (de Heasman et al. 1927. uma disposição indicando uma espiral dextra (oposta à sinistra). As duas primeiras clivagens são quase meridionais. produzindo o primeiro quarteto de micrômeros.) . cortesia de J. As células B. Figura 5.

os macrômeros já se dividiram em células grandes e pequenas orientadas espiralmente. Isso foi descoberto analisando mutações da espiral do caracol. ocasionalmente. em espécies em que a espiral abre para a direita.12 Clivagem em espiral do molusco Trochus vista do pólo animal (A) e de um lado (B). A orientação da clivagem plana para a esquerda ou para a direita é controlada por fatores citoplasmáticos dentro do oócito. Em B.) . permitindo a identificação de cada célula. e o micrômero 1a se divide para formar mais dois micrômeros. cortesia dos autores. o macrômero 1A se divide para formar o macrômero 2A e o micrômero 2a. Os fusos mitóticos. ainda são encontrados mutantes. Todavia. 1986. A clivagem é dextra. 1a1 e 1a2. Exemplificando.176 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) Vista do pólo animal (B) Vista lateral Figura 5.13 Clivagem espiral do caracol Ilyanassa. (de Craig e Morrill. esquematizados nos estágios precoces. Figura 5. as células derivadas do blastômero A estão coloridas. (B) Metade da quarta clivagem. Mais clivagens irão produzir blastômeros 3A e 3a a partir do macrômero 2A. dividem as células desigualmente e em ângulo aos eixos vertical e horizontal. Normalmente. O blastômero D é maior que os outros. e micrômeros. enquanto outros têm sua abertura para à esquerda. Alguns caracóis têm sua espiral aberta à direita da concha. PB é o corpo polar. se dividem para produzir células tais como as 1a21 e 1a22. Crampton (1984) analisou os embriões desses caracóis aberrantes e observou que sua clivagem precoce difere da normal. como por exemplo o 1a2. serão encontrados alguns indivíduos com a abertura espiral para a esquerda. (A) estágio de 8 células. a rotação da espiral é a mesma para todos os membros de uma determinada espécie.

1930). mas pelo genótipo da mãe do caramujo. No caracol Limnaea peregra a maioria dos indivíduos são espiralados para a direita. exibindo abertura esquerda.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 177 (A) Enrolamento sinistrogiro (B) Enrolamento dextrogiro Figura 5.14.. 1927. Na Figura 5. já que sua progênie irá formar os órgãos mesodérmicos) é diferente nos dois tipos de espirais dos embriões. A origem do enrolamento para direita e para a esquerda do caracol pode ser reconhecida pela orientação do fuso mitótico na segunda clivagem.14 Olhando do pólo animal de caracóis enrolados para a direita e para a esquerda. graças a uma orientação diferente do aparelho mitótico nos caracóis com enrolamento sinistrogiro. Geralmente. A direção da abertura na espiral da concha do caracol é controlada por um único par de genes (Sturtevant. No entanto. Caramujo fêmea do tipo dd pode produzir somente herdeiros de espiral sinistra. Um indivíduo Dd irá se espiralar tanto para a direita quanto para a esquerda dependendo do genoma de sua mãe. Esses acasalamentos mostraram que existe um alelo D “dextrogiro” que é dominante em relação ao alelo d “sinistrogiro”. foram encontrados e acasalados com caracóis tipo-selvagem. Esses cruzamentos produzem o seguinte quadro: . mesmo quando o genótipo dos herdeiros é Dd. Boycott et al. a direção da clivagem não é determinada pelo genótipo do caracol em desenvolvimento. (Segundo Morgan. os dois caracóis são formados com seus corpos em lados diferentes da abertura da espiral. Todas as subseqüentes divisões em embriões de espiral para a esquerda são imagens espelhares daqueles embriões com espirais dextras. Raros mutantes. Os caracóis sinistrogiros e dextrogiros se desenvolvem como imagens espelhares uma da outra.) A orientação das células após a segunda clivagem estava diferente (Figura 5. 1923.14). podemos notar que a posição do blastômero 4d (o qual é muito importante.

Às vezes. somos capazes de identificar uma modificação da embriogênese que impediu o organismo de sobreviver diferentemente em ambientes hostis.15). no qual o fenótipo se desenvolve. descoberta por Frank Lillie em 1898. Essas larvas (chamadas gloquídias) assemelham-se a pequenas armadilhas para urso. porque os adul- tos são sedentários e as larvas que nadam livremente seriam sempre carregadas correnteza abaixo.html] Outra descoberta emocionante com relação a clivagem dos moluscos está na comunicação entre os blastômeros. Quando Freeman e Lundelius (1982) injetaram no ovo de mães dd. Uma dessas modificações. aparecem junções de fenda na superfície dessas células. os embriões resultantes apresentaram espirais para a direita. Nos moluscos de blastômeros de igual tamanho no estágio de quatro células*. daremos no Capítulo 16 mais informações sobre embriões de moluscos com blastômeros de tamanhos desiguais. a divisão desse Unio é tal que o blastômero 2d fica com a maior parte do citoplasma (Figura 5. no entanto. Essas ostras. 1983. incluindo uma glân- dula capaz de produzir uma concha maciça. Nessa altura. Unio e seus aparentados vivem em locais de água corrente. a disposição do fuso mitótico motiva a maioria do citoplasma D penetrar no blastômero 2d (B). Essa célula se divide para produzir a maior parte das estruturas larvais.178 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Os fatores genéticos envolvidos no enrolamento do caracol são trazidos ao embrião no citoplasma do oócito. resolveram esse problema efetuando duas modificações no seu desenvolvimento. é causada pela alteração do padrão típico da clivagem espiral na família unionídeo das ostras. Esse blastômero grande 2d se divide (C). É o genótipo do ovário. a célula 4d produzida pelos macrômeros 3D não produz mesoderma (van den Biggelaar e Guerrier.) (A) (B) (C) (D) . As correntes criam um problema para a dispersão das larvas. Imagens ao microscópio eletrônico mostram que nesse momento. que determina em que direção a clivagem vai ocorrer. uma pequena quantidade de citoplasma proveniente de caracóis com espirais dextras. Injetando corantes de baixo peso molecular. (Segundo Raff e Kaufman. No entanto. Após formação do embrião de 8 células (A).15 Formação de larvas de gloquídia pela modificação da clivagem em espiral. para finalmente originar a grande concha “armadilha de urso” da larva (D). ou o blastômero 2D é a maior célula no estágio embrionário. *Não se preocupe. possuem pêlos sensíveis que permitem as válvulas da concha fecharem-se abruptamente quando tocadas pelas guelFigura 5. ou todos os macrômeros são iguais em tamanho. Sem esse contato. 1979). Ao contrário da maioria das ostras. Informações adicionais & Especulações Adaptação pela modificação da clivagem embrionária E VOLUÇÃO é causada pela alteração hereditária do desenvolvimento embrionário. A primeira altera a clivagem embrionária. pequenas moléculas são capazes de difundirem-se entre os macrômeros 3D e os micrômeros centrais. de Laat e colegas (1980) demonstraram que na hora do contato (e não antes). a determinação de que a célula que originará a célula precursora mesodérmica será alcançada entre a quinta e a sexta clivagem. Na típica clivagem dos moluscos. [cleave1. Isso confirma a observação que mães do tipo selvagem estavam colocando um fator em seus ovos que estava ausente ou defeituoso nas mães dd. o macrômero 3D se estende para dentro entrando em contato com os micrômeros do pólo animal. Citoplasmas de caracóis com espiral esquerda não afetaram os embriões com a espiral direita.

No estágio de 32 células.) imitam o comportamento e a forma de pequenos peixes nadando. essas se tornam fracionadas em células diferentes. (B) embrião de oito células. Como foi mencionado no capítulo 4. 1981. (Fotografia.) (D) (A (B) (C) Ectoderma Ectoderma neural Músculo Mesênquima Pólo vegetal Notocorda Endoderma Pólo vegetal Vista do pólo vegetal . Pode ser visualizado como duas metades de 4 células. aquelas contendo citoplasma amarelo se transformam em células mesodérmicas. Durante as três próximas divisões. daqui em diante.16 Peixe falso sobre o molusco unionídeo lampsilis ventricosa. o tipo de citoplasma que a célula recebe determina seu destino.) (Segundo Balinsky. partita) contêm regiões citoplasmáticas coloridas. certos tunicados (incluindo S. O fenômeno mais admirável nesse tipo de clivagem é que o primeiro plano de clivagem estabelece o único plano de simetria no embrião. mas ao contrário da primeira divisão. 1969). podem se espalhar correnteza acima. cortesia de J. as células Figura 5. desenvolveram uma mancha preta em forma de olho (ocelo) de um lado e uma nadadeira do outro. Dessa maneira. mostrando os blastômeros e os destinos das várias células. Outras espécies. através de metamorfose. como a primeira divisão. Cada divisão sucessiva orienta-se em relação a esse plano de simetria. O “peixe” visto na Figura 5. H. a bolsa da cria e o manto do molusco. mas sim a bolsa de criação e o manto abaixo dela. transformarse em moluscos adultos. a modificação de padrões de comportamentos já existentes permitiram moluscos unionídeos sobreviver em ambientes hostis. (C. não passa através do centro do ovo. as gloquídias são liberadas da bolsa de criação da fêmea e meramente aguardam um peixe passar. tal como a Lampsilis ventricosa. separando o embrião do que será o seu futuro lado direito e esquerdo. Em algumas espécies. Para tornar a ilusão mais completa. Durante a clivagem. a forma da bolsa de criação (marsúpio) e as ondulações do manto Figura 5. Welsh. o molusco despeja as gloquídias da bolsa de criação. (A) Ovo não-clivado. Dessa maneira. cada divisão no lado direito do embrião tem uma divisão espelhar do lado esquerdo. Além do mais. D) Vistas de embriões mais tardios do pólo vegetal.16 Simetria bilateral em um ovo de tunicado. Células recebendo citoplasmas claros se tornam ectoderma. Styela partita. Muitos moluscos desenvolvem um manto fino e saliente em volta da concha circundando a bolsa de criação. na verdade. e o meio embrião formado de um lado da primeira clivagem é a imagem espelhar do meio embrião do outro lado. Em vez disso.17 mostra a clivagem padrão de um tunicado.16 não é um peixe real. Elas “pegam uma carona” com o peixe até estarem prontas para cair e. mostrando os destinos das várias regiões citoplasmáticas. (As regiões do citoplasma destinadas a formar determinados órgãos estão marcadas em A e são codificadas por cor em todo o diagrama. A Figura 5. uma pequena blastocele se forma e começa a gastrulação. Clivagem Holoblástica Bilateral Clivagem holoblástica bilateral é encontrada primariamente nos ascídios (tunicados). ela cria duas grandes células anteriores (blastômeros A e D) e duas pequenas células posteriores (blastômeros B e C). Quando o peixe que estiver ao alcance for atraído. Em alguns unionídeos. A segunda clivagem é meridional. Cada lado tem agora um blastômero grande e um pequeno. O “peixe” é. aumentaram as chances de suas larvas encontrarem um peixe realizando outra modificação no seu desenvolvimento (Welsh.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 179 ras ou barbatanas dos peixes que por ali estiverem passando. as diferenças no tamanho e na forma destacam a simetria bilateral desses embriões.

e é provável que a zona evite a adesão das células em clivagem de se colarem ao oviduto. os cílios no oviduto empurram o embrião em direção ao útero. A segunda diferença fundamental é a singular orientação dos blastômeros dos mamíferos um em relação ao outro. Normalmente. e a primeira clivagem começa um dia depois.. O destino de cada célula do embrião precoce de Styela tem sido acompanhado e será discutido em detalhe no Capítulo 13. o desenvolvimento dos embriões dos mamíferos se completa dentro de outro organismo ao invés de um ambiente externo. Os ovos de mamíferos estão entre os menores do reino animal. eles serão divididos pelo sulco da primeira clivagem em metades direita e esquerda do embrião. a primeira clivagem ocorre durante essa jornada. em lugar de viajar para o útero. tornando difícil a obtenção de material para estudos bioquímicos. 1972.18 Desenvolvimento de um embrião humano desde a fertilização até a implantação. Esses plasmas coloridos estão localizados bilateralmente em volta do plano de simetria e. A clivagem nos mamíferos está entre as mais lentas do reino animal – de 12 a 24 horas de separação. assim. a terceira divisão irá repartir essas regiões citoplasmáticas. já que a clivagem nos mamíferos é completamente diferente de outros padrões de divisão celular embrionária. A primeira é relativa a lentidão das divisões.18). A segunda clivagem motiva o provável mesoderma se posicionar nas duas células posteriores. A primeira clivagem é uma divisão meridional normal. praticamente invisível. Com todas essas dificuldades. de modo que as células formadoras do mesoderma são confinadas aos dois blastômeros vegetais posteriores. por exemplo.180 PARTE II Padrões de Desenvolvimento que incorporam inclusões ardósia se tornam endoderma e as células cinza claro. Clivagem holoblástica rotacional Não é surpresa alguma que o estudo da clivagem em mamíferos tenha-se tornado um desafio. A fertilização ocorre na ampola do oviduto. (Segundo TuchmannDuplessis et al. Também. A compactação em embriões humanos ocorre no dia 4. Existem várias características da clivagem dos mamíferos que as distinguem de outros tipos de clivagem.) Oviduto Mórula Blastocisto Ovário Estágio precoce da implantação Fertilização Ovulação . A meiose é então completada. na Estágio de 2 células Útero Primeira clivagem Zona pelúcida Figura 5. no entanto. zigotos de mamíferos não são produzidos em números comparáveis aos embriões do ouriço-do-mar ou de rãs. o tubo neural e a notocorda. E como uma barreira final. enquanto o provável tubo neural e cordomesoderma serão formados pelas duas células anteriores. Só recentemente foi possível a duplicação de algumas dessas condições internas e observar o desenvolvimento in vitro. tornando difícil seu manuseio experimental. Enquanto isso. valeu a pena esperar o conhecimento da clivagem de mamíferos. sendo seu volume menor de um milésimo do ovo de Xenopus. O zigoto humano. menos de 10 ovos são ovulados por uma fêmea em um determinado tempo. tem somente 100 µm de diâmetro. O oócito dos mamíferos é liberado pelo ovário e varrido pelas fímbrias até o oviduto (Figura 5. região próxima ao ovário. quando ele está no estágio de 10 células. Mais adiante. e as células do cordomesoderma são restritas as duas células vegetais anteriores. O ovo “eclode” da zona quando alcança o útero.

(C) início do estágio de 8 células. Esse tipo de clivagem é chamada de clivagem rotacional (Gulyas. a mudança do controle maternal para o zigótico ocorre no estágio de duas células (Piko e Clegg. No camundongo e na cabra. Como mostra a Figura 5. blastômeros mamíferos. cortesia de J. formam um arranjo solto com espaço suficiente entre eles. Também.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 181 Plano de clivagem II Plano de clivagem I Plano de clivagem IIA Plano de clivagem I Figura 5. atravessando o estágio de 8 células. 1982. sendo o responsável pela produção de proteína necessária para a clivagem. os blastômeros passam (A) (B) (C ) Figura 5.19). Dessa maneira. não formam a estrutura blastocística característica dos mamíferos. diferente dos outros genomas animais. o genoma mamífero é ativado durante a clivagem precoce.19 Comparação da clivagem precoce (A) em equinodermos (clivagem radial) e (B) em mamíferos (clivagem rotacional). (D) Estágio de 8 células compactado.20 (D) (E) (F) Clivagem de um único embrião de camundongo in vitro.20. Os blastômeros de mamíferos não se dividem ao mesmo tempo. (F) Blastocisto. (E) Mórula. mas freqüentemente contêm números ímpares de células. G. 1975). no entanto. Detalhes sobre a clivagem dos nematóides serão fornecidos no Capítulo 13.) . Seguindo a terceira clivagem. (Segundo Gulyas. 1975. Nematóides também têm uma forma rotacional de clivagem. Prather 1989). (A) estágio de 2 células. Mulnard. (B) estágio de 4 células. porém.html] Compactação Talvez a diferença mais crucial entre a clivagem de mamífero e todos os outros tipos envolva o fenômeno da compactação. A terceira principal diferença entre a clivagem nos mamíferos e a da maioria dos outros embriões é marcada pela falta de sincronização das divisões precoces.) Plano de clivagem IIB (A) EQUINODERMO (Ouriço-do-mar) (B) MAMÍFERO (Coelho) segunda clivagem um dos dois blastômeros se divide meridionalmente e o outro se divide equatorialmente (Figura 5. (de Mulnard. embriões de mamíferos não aumentam por igual do estágio de 2 para 4 e para 8 células. [cleave2. 1967.

Ao invés disso. durante um processo chamado cavitação. Essa mórula consiste de um pequeno grupo de células internas rodeadas por um grupo maior de células externas (Barlow et al. Esse pacote é estabilizado por junções apertadas que se formam entre as células. células do trofoblasto não são capazes de produzir células do próprio embrião.. O cório permite ao feto conseguir oxigênio e nutrientes da mãe. De repente. a célula do trofoblasto secreta um fluido para dentro da mórula para criar a blastocele.23)..20C. mas também sintetizam proteínas diferentes nesse estágio do desenvolvimento precoce.23). Essas células não aparentam ser somente diferentes das células do trofoblasto. Essa estrutura é chamada blastocisto e é outro marco da clivagem de mamíferos.. 1986. formam o tecido do cório. A massa celular interna fica posicionada de um lado do anel de células do trofoblasto (veja Figuras 5. fazendo com que a mãe não rejeite o embrião como faria com um órgão transplantado. desse modo. . Fleming. (Cortesia de C. se amontoam. a parte embrionária da placenta. permitindo pequenas moléculas e íons passarem entre elas. 1987). Ziomek. Dessa forma. a mórula não tem uma cavidade interna. alantóide e âmnio. a distinção entre os blastômeros do trofoblasto e da massa celular interna representa o primeiro evento diferenciado no desenvolvimento dos mamíferos. No entanto. (A) nãocompactados e (B) compactados. Esse grupo de células não produz estruturas embrionárias.22 e 5. Essas células geram a massa celular interna que dará origem ao embrião.21). suplementada por células divididas do trofoblasto durante a transição para o estágio de 32 células (Pedersen et al. Elas são necessárias para implantar células do embrião na parede uterina (Figura 5. formando uma bola compacta de células (Figuras 5. Também secreta hormônios para que o útero da mãe retenha o feto e produza reguladores de resposta imune. acompanhada da bolsa com vitelo. selando o interior da esfera (Figura 5. 5. 1987. As células no interior da esfera formam junções com espaços. Durante o estágio de 64 células. No entanto. maximizando seu contato com outros blastômeros.D e 5. As células do embrião compactado se dividem para produzir uma mórula de 16 células. Fleming. nenhuma delas contribuindo para células do outro grupo (Dyce et al.22). A maior parte dos descendentes das células externas se tornam células do trofoblasto (trofectoderma).20. 1987). Inicialmente. a massa celular interna (aproximadamente 13 células) e as células do trofoblasto se tornam camadas de células separadas.) por uma mudança espetacular em seu comportamento.21 Micrografia ao microscópio eletrônico de embriões de camundongos de 8 células.182 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) Figura 5.1972). O embrião do camundongo é derivado dos descendentes das células internas do estágio de 16 células.

Basal: Na+. 1992. ZO-1. Golgi Junções apertadas entre células exteriores Junções de fendas entre células interiores (D) 32 células: transporte vetorial de fluido. Apical: microvilosidades. K+ . (D) blastocisto de 32 células.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 183 (A) Estágio precoce de 8 células: não-polar.B) embrião de 8 células. correntes iônicas.22 Compactação e formação do blastocisto de camundongo. Basolateral: adesão de E-caderina. Apical: transportadores e canais Microvilosidades Massa celular interna (ICM) Blastocele Trofoblasto E-caderinaDesmossomos Direção da corrente iônica Na+. Basolateral: desmossomos. junções de fendas.ATPase.ATPase Junções de fendas Proteínas da membrana apical Desmossomos Lisossomos secundários Golgi Filamentos de citoqueratina Microtúbulos e actina citoplasmática Junções apertadas (ZO-1) (ZO-1) + cingulina Actina cortical Microvilosidades Mitocôndrias . endossomos. O lado direito detalha as mudanças associadas com o amadurecimento do trofoblasto. Basal: lisossomos. (C) mórula de 16 células. K+ . vesículas lipídicas. cingulina. porém com efeitos de contato local Figura 5. O lado esquerdo representa o organismo inteiro ou sua visão em corte. mitocôndria. (Figuras à direita segundo Fleming. actina citoplasmática. actina cortical.) (B) Compacto de 8 células: polar. (A. Microtúbulos acetilados. microtúbulos Apical Junções apertadas Lateral Basal (C) 16 células: Adesão basolateral intensificada. laminina.

por meio de reorganização do citoesqueleto.. que reconhece a classe das glicoproteínas. A porção de carboidrato dessa glicoproteína pode ser essencial para o seu funcionamento. a E-caderina se torna restrita aqueles sítios da membrana celular que estão em contato com os blastômeros adjacentes. na metade do estágio de 8 células. desses componentes no estágio de 8 células. As microvilosidades.24 Polarização de componentes da membrana em blastômeros de camundongo durante o estágio de 8 células. sintetizada no estágio de 2 células é distribuída uniformemente por toda a membrana celular. Similarmente diacilglicerídeos podem momentaneamente provocar a compactação de embriões de 4 células. (B) Implantação inicial do blastocisto no útero de um macaco Rhesus.) bém conhecida como uvomorulina). Uma dessas marcações. cada um dos oito blastômeros interage com os seus vizinhos para sofrer polarização da membrana. 1983.22. marcando certas moléculas da superfície celular com corantes fluorescentes. (B) Distribuição heterogênea. Esses resultados sugerem que a ativação da proteína quinase C pode iniciar a compactação mudando a localização da E-caderina. no mínimo.) (A) (B) Informações adicionais & Especulações A Superfície da Célula e o Mecanismo de Compactação C OMPACTAÇÃO CRIA AS circunstâncias que trazem á tona a primeira diferenciação no desenvolvimento de mamíferos: a separação do trofoblasto da massa celular interna. Johnson et al. (A de Fleming et al. Se um blastômero for separado do resto do embrião perde sua polarização. polar. Anticorpos para essa molécula causam a descompactação da mórula (Figura 5. 1986). 1967. essas glicoproteínas são aleatoriamente distribuídas por toda a membrana (Figura 5.. Experimentos recentes mostraram que a via do fosfatidilinositol também pode ser importante para inicializar a compactação. essas moléculas são encontradas predominantemente nos pólos mais distantes do centro do agregado (Figura 5.. a membrana celular pode também ser modificada durante a compactação. extendidas . Componentes diferentes da superfície das células migram para regiões diferentes da célula (veja Figura 5. (A) Blastocistos de camundongo entrando no útero. B de Levy et al. Como isso é feito? Existe uma crescente evidência que a compactação é realizada por intermédio de eventos que ocorrem na superfície das células dos blastômeros adjacentes. Chester Reather. Fotografias cortesia dos autores. sendo a tunicamicina (droga que inibe a glicosilação das proteínas) também é capaz de prevenir a compactação. Proteínas específicas da superfície celular cumprem o seu papel na compactação. A polarização da membrana é influenciada por interações célula a célula porque acontece somente quando a célula está em contato. 1990). (A) Distribuição homogênea. E-caderina (tam- (A) (B) Figura 5. 1986. com a ocorrência da compactação. não-polar. No entanto. com um outro blastômero.184 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 5. Ziomek e Johnson.. 1980).25. a E-caderina acumula-se especificamente nas junções entre os blastômeros (Winkel et al. Uma dessas moléculas. de componentes da membrana marcados com concanavalina A fluorescente no estágio de 4 células. Se embriões de 4 células de camundongo forem colocados em um meio contendo drogas que ativam a proteína quinase C. 1986. B cortesia da Carnegie Institution of Washington. No entanto. (A de Rugh. No primeiro estágio da compactação. fotógrafo. Isso pode ser observado. Peyrieras et al. E finalmente. ocorre compactação prematura. mostra que no estágio de 4 células.24B). uma glicoproteína adesiva de 120-kDa.. Quando isso ocorre.24A).23 Implantação de blastocistos de mamíferos no útero.

) Formação da massa celular interna O processo crucial para o precoce desenvolvimento dos mamíferos é a criação da massa celular interna distinta do trofoblasto. Ziomek. morfologia ou potência de qualquer um dos blastômeros. enquanto que as células do lado de dentro formariam o embrião (Tarkowski e Wróblewska. não existem diferenças óbvias na bioquímica. não está totalmente certo como esses eventos se relacionam um com o outro. 1977). as proteínas bombeiam sódio para a cavidade central. Essas microvilosidades podem ser os sítios onde a E-caderina está funcionando para mediar adesão intercelular.. Durante esse período. o blastocisto se expande dentro da zona pelúcida (a matriz extracelular do óvulo foi essencial para a ligação do espermatozóide durante a fertilização). (B) Proliferação sem compactação ocorrendo na presença de anticorpos contra a E-caderina. Até o estágio de 8 células. é chamada de ectópica ou * As células internas mostraram virem mais freqüentemente da primeira célula a se dividir no estágio de 2 células. Sutherland et al. (Fotografias cortesia de C. (A) Compactação normal ocorrendo em ausência do anti-soro.22.*Hillman e colegas (1972) mostraram que quando cada blastômero de um embrião de camundongo de 4 células é colocado na superfície externa de uma massa de blastômeros agregados. dilatando a blastocele (veja Figura 5.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 185 por actino-filamentos. No entanto. promotora da adesão. é essencial que a zona pelúcida previna o blastocisto de aderir às paredes do oviduto. Como a célula é direcionada para um ou outro desses caminhos? Como a célula é informada que dará origem a uma porção do mamífero adulto ou que dará origem a um singular tecido de sustentação que será descartado no nascimento? As observações de embriões vivos sugerem que essa importante decisão está meramente no fato de a célula estar no lugar certo na hora certa. Dessa maneira. aparecem na superfície de células adjacentes. rumo ao útero. . 1983). a opção da célula transformar-se em trofoblasto ou embrião depende se essa célula era externa ou interna após a compactação. 1977.25 Prevenção da compactação por anti-soro contra a glicoproteína da superfície celular. existem evidências crescentes de que a compactação é causada por mudanças na arquitetura da superfície celular dos blastômeros. Wiley. unindo uma célula à outra. Essa acumulação de íons de sódio permite que a água entre por osmose. muitos investigadores descobriram que as células que estavam do lado de fora formariam o trofoblasto. a compactação forma células internas ou externas com propriedades muito diferentes. As membranas celulares das células trofectodérmicas contêm uma bomba para o sódio (a Na+/K+-ATPase) de frente para a blastocele. as células externas transplantadas somente darão origem ao tecido trofoblasto. e essas células se dividem de tal modo que elas estão soltas dentro dos blastômeros agregados (Graham e Kelly. Quando tal aderência acontece em humanos. Essa célula normalmente produz o primeiro par de blastômeros a alcançar o estágio de 8 células.1990). E-caderina. Marcando os vários blastômeros.. O achatamento dos blastômeros um contra o outro pode. dessa maneira. 1982. ou como são coordenados e integrados na cadeia de eventos que causa a compactação. Sutherland e Calarco-Gillam. (A) (B) Figura 5. Pelúcida Fuga da Zona Pelúcida Enquanto o embrião está se movendo através do oviduto. portanto. No entanto. Borland.1967. 1984). ter acontecido em virtude do encolhimento do blastômero através da despolimerização da actina (Pratt et al. Portanto.

o âmnio. também contribuem para um novo embrião. 1976. Camun- . 1996). 1989). (Fotografia de Mark et al. fibronectina e laminina. a massa celular interna tem sido referida. Isso foi primeiramente demonstrado em 1952. ao passo que. e tais recémnascidos correm o risco de serem gêmeos ligados (“Siameses”). a estripsina. os embriões resultantes deveriam ter um cório e dois âmnios (Figura 5. Se a separação do embrião acontecesse após a formação do cório. Uma vez que a massa celular interna (ICM) se separou do trofoblasto. estromelisina e ativador de plasminogênio.26). No nono dia. às vezes. protegendo-o da dessecação e movimentos bruscos (veja Capítulo 6). O restante dos gêmeos idênticos compartilham do mesmo cório.html] A habilidade de produzir um embrião completo. o trofoblasto secreta outro conjunto de proteases. o embrião humano já completou a construção de uma outra camada extra-embrio- nária. 1983). de alguma forma. a partir de células que normalmente iriam produzir somente uma porção. Isso acontece em aproximadamente dois terços dos casos de gêmeos humanos idênticos. porque a implantação do embrião no oviduto pode causar uma hemorragia com perigo de morte. Gêmeos fraternos são o resultado de dois eventos separados de fertilização. ácido hialurônico e receptores heparan sulfato. Esse tecido forma a bolsa amniótica (ou bolsa de água). cortesia de E. Já que seus blastômeros podem gerar qualquer tipo de célula no corpo. no quinto dia (Figura 5.. 1986. Gardiner e Rossant (1976) também mostraram que se as células da massa celular interna (mas não células do trofoblasto) são injetadas no blastocisto.26 Blastocisto de camundongo eclodindo da zona pelúcida.27A). As células do trofoblasto contêm os elementos que irão se juntar ao colágeno uterino. como pluriblasto (Johnson e Selwood. indicando que a separação ocorreu antes da formação do tecido trofoblasto. Gêmeos idênticos são provavelmente produzidos pela separação de blastômeros precoces ou mesmo pela separação da massa celular interna em duas regiões no mesmo blastocisto. [cleave3. quando Seidel destruiu uma célula de um embrião de coelho e demonstrou que a célula remanescente poderia produzir o embrião por inteiro.1989). Gêmeos humanos são classificados em dois grandes grupos: gêmeos monozigóticos (um ovo ou idênticos) e gêmeos dizigóticos (dois ovos ou fraternos). trigêmeos ou um monstro de múltiplas cabeças. Uma vez na célula epitelial uterina. dissociam uma da outra. Essas enzimas digestoras de proteínas digerem a matriz extracelular do tecido uterino. Lacy. Yamazaki e Kato. gêmeos idênticos são formados de um único embrião cujas células. Regulação é também vista na habilidade que dois ou mais embriões precoces têm para formar um camundongo quimérico ao invés de gêmeos. fibronectina. ele deve “livrar-se” da zona pelúcida para que possa aderir à parede uterina. no quinto dia. laminina.. O epitélio uterino “agarra” o blastocisto em uma matriz extracelular contendo colágeno. [cleave4. 1985. eles sintetizam o proteoglicano heparan sulfato dramaticamente no momento anterior à implantação (veja Carson etal. Quando o embrião alcança o útero.27B). Isso significa que a divisão do embrião aconteceu após o nono dia..27C). Uma protease semelhante à tripsina. localizada na membrana celular lisa a matriz fibrilar da zona pelúcida (Perona e Wassarman. incluindo colagenase. Uma pequena porcentagem de gêmeos idênticos nascem com um único cório e âmnio (Figura 5. as células da ICM constituem um “grupo de equivalência” onde cada célula da ICM tem a mesma potência (nesse caso. Cerca de 33 % dos gêmeos idênticos têm dois córios completos e separados.) gravidez tubária. Informações adicionais & Especulações Gêmeos e células embrionárias precursoras A S CÉLULAS PRECOCES do embrião podem substituir uma à outra e compensar uma célula ausente. Uma vez fora.. no entanto. é chamada de regulação e é discutida no Capítulo 15. o blastocisto pode fazer contato direto com o útero. O blastocisto do camundongo se livra da zona pelúcida perfurando um pequeno buraco e se espremendo através dele enquanto se expande (Figura 5. após a formação do trofoblasto.html] Casos de gêmeos idênticos ocorrem em aproximadamente 25% dos nascimentos humanos. cada célula pode originar todos os tipos de células do embrião. menos o trofoblasto). Brenner et al.186 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figure 5. envolvendo o embrião com fluido amniótico. no nono dia. Essa condição é especialmente grave. sugerindo que a separação ocorreu dentro da massa celular interna. impedindo o blastocisto de cobrir a si mesmo com a parede uterina (Strikland et al. e seus respectivos destinos serão determinados por interações entre os seus descendentes. mas antes da formação do âmnio.

que estavam se desenvolvendo ao mesmo tempo.ou 8-células) de embriões que foram agregados artificialmente para formar um embrião composto. . porém. (C) Cisão após a formação do âmnio conduz a gêmeos em um saco amniótico. Existe até evidência que embriões humanos podem formar quimeras (de la Chappelle et al. a ninhada era um de cada cor. Quando um quimérico (preto/marrom/branco) fêmea de camundongo acasalava com um macho de pelugem de cor branca (recessivo). A explicação mais simples para tal fenômeno é que esses indivíduos resultaram da agregação de dois embriões. resultando em gêmeos que têm sacos amnióticos individuais.) dongos quiméricos são o resultado de duas ou mais clivagens precoces (normalmente 4. Esses indivíduos têm dois tipos de células diferentes (XX e XY) dentro do mesmo corpo. cada uma com o seu conjunto de características genéticas.1974. Essa hipótese tem sido confirmada. cada blastômero da massa celular interna deve ser capaz de produzir qualquer célula do corpo. Se essa explicação estiver correta. (B) A cisão ocorre após a formação da trofectoderma. Mayr et al. e um único cório. Como é mostrado na Figura 5. permanecem indiferentes e continuam a se dividir em cultura (Evans e Kaufman.28B). (A) A cisão ocorre antes da formação da trofectoderma. De acordo com nossas observações sobre formação de gêmeos e camundongos quiméricos. Quando blastômeros de linhagem preta e branca são agregados o resultado é normalmente um camundongo malhado (Figura 5. de modo que cada gêmeo tem o seu próprio cório e âmnio.27 Diagrama mostrando a relação entre a formação de gêmeos monozigóticos humanos e as membranas extra-embrionárias. porém.28A.29) e que o camundongo resultante pode ter a cor da pelugem de três linhagens diferentes (prancha 21).. (Segundo Langman. Além disso. então dois gêmeos fraternos se fundem para criar um único indivíduo composto. Quando as massas celulares internas são isoladas e crescem sob certas condições. os descendentes quiméricos têm algumas células de cada embrião. antes da formação do âmnio. compartilhando um cório. um macho e outro fêmea. e terá importantes conseqüências no estudo do desenvolvimento dos mamíferos. Quando nascem. eles mostraram que cada um dos três embriões deram origem a precursores dos gametas. 1981. as zonas pelúcidas de dois embriões geneticamente diferentes são removidas e os embriões são unidos para formar um blastocisto em comum.1979). Isso é prontamente observado quando os blastômeros agregados vêm de uma linhagem que difere na cor da pelugem.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 187 Embrião Saco vitelínico Âmnio 2 Córios (A) 2 Âmnios Massa celular interna 1 Cório (B) Embrião bicelular Blastocele 2 Âmnios 1 Cório (C) 1 Âmnio Cório Figura 5. Esses blastocistos preparados são implantados no útero da mãe adotiva.. Markert e Petters (1978) mostraram que embriões precoces de 8-células podem se unir para formar uma mórula compactada comum (Figura 5.

Genes clonados podem ser inseridos dentro de seu núcleo. Martin.188 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) Figura 5. (de Markert e Petters. ou genes existentes podem ser mutados. Essa técnica se tornou extremamente importante para determinar a função dos genes durante o desenvolvimento de mamífero.29 Agregação e compactação de três embriões de camundongo. hospedeiro e doador.) (A) Blastocisto Blastocistos implantados na mãe de criação 1981. Células de três diferentes embriões (A) são agregadas para formar uma mórula (B) que sofre compactação para formar um blastocisto único (C). Essas células são chamadas de células-tronco embrionárias (células ES). Na clivagem .28 Pronase Zona pelúcida Blastômeros Produção de camundongos quiméricos. Quando essas células ES são injetadas nos blastocistos de um outro gene de camundongo. Embriões de camundongos geneticamente distintos (aqui aqueles com diferentes cores do pêlo) no início do estágio de 8 células são isolados dos ovidutos dos camundongos e reunidos após remoção de suas zonas pelúcidas por ação de enzimas proteolíticas. exceto em uma pequena porção do citoplasma do ovo. concentrações de vitelo cumprem um papel importante na clivagem celular. Em parte alguma isso está tão aparente como nos tipos de clivagem meroblástica. cortesia de C. 1978. Como foi mostrado no capítulo 2. (B) Um camundongo adulto quimérico mostrando contribuições dos embriões pigmentados (pretos) e não-pigmentados (brancos).) Clivagem Meroblástica Como já foi mencionado anteriormente. para formar um única mórula compactada. 1981). O embrião resultante tem células vindas de ambos tecidos. As células formam um blastocisto composto. as grandes concentrações de vitelo proíbem a clivagem no seu todo. Markert. (A) Procedimento experimental para a produção de camundongos quiméricos. que é implantado no útero de uma mãe de criação. (Fotografia cortesia de B. no estágio de 8 células. Mintz. essas células podem ser alteradas na placa de Petri. O camundongo quimérico resultante é mostrado na Prancha 21. (B) (B) (C ) Figura 5. elas podem integrar a sua massa celular interna hospedeira. Aqui.

uma região de citoplasma ativo de aproximadamente 2-3mm de diâmetro no pólo animal do ovo. têm embrião transparente que se desenvolve fora da mãe (uma característica importante para a microscopia). Quando uma galinha se considera pronta para botar um ovo. 1956). 1992. apresentando como característica a forma semelhante ao girino (veja Granato e Nüsslein-Volhard. (de Eyal-Giladi et al. Daí por diante. O anel periférico das células blastodérmicas que não são descartadas constituem a zona opaca. (Sc é a cavidade subgerminal. gwm é a margem da parede germinal).. Langeland e Kimmel. Eyal-Giladi. essa camada celular está incompleta. 1997). Ademais. O primeiro sulco de clivagem aparece centralizado no blastodisco. esse contém duas camadas de células: a superior epiblasto e a inferior hipoblasto. logo após a galinha ter botado o ovo. o peixe zebra. na realidade. 1996. Detalharemos a formação do hipoblasto no próximo capítulo. criado quando uma célula blastodérmica absorve fluido da albumina (“branco do ovo”) e secreta-o entre si e o vitelo (New.30 mostra a clivagem de um ovo de ave. Eyal-Giladi. as células mais profundas do centro do blastoderma são descartadas para criar uma zona pelúcida unicelular (as células descartadas parecem morrer). e é produzido um blastoderma formado por uma única camada de células. a divisão celular é limitada a um pequeno disco de citoplasma sem vitelo no topo de um monte formado por vitelo. Essas células permanecem ligadas com junções apertadas (Bellairs et al. para que 24 horas após a fertilização. peixes e répteis. Esses peixes têm grandes crias.000 células. clivagens equatoriais e verticais dividem o blastoderma em um tecido de cinco a seis camadas celulares. permitindo que a clivagem ocorra somente no blastodisco. Dessa maneira. procriam o ano inteiro. PEIXES. o blastoderma já contém 60.) . e pode ser criado para que mutantes possam ser protegidos e propagados. Observações da clivagem de ovos de peixe através de micrografia ao microscópio eletrônico Blastoderma Figura 5. Os ovos de peixes com muito vitelo desenvolvem-se similarmente aos das aves. Entre o blastoderma e o vitelo existe um espaço chamado cavidade subgerminal. Entre elas está a blastocele. Figura 5. Nos últimos anos.31). Essas células serão acrescidas por aquelas células hipoblásticas (hyp) que migraram anteriormente da foice de Koller para formar a camada inferior (hipoblástica). já que as células permanecem contínuas ao vitelo subjacente. eles se desenvolvem rapidamente. Os sulcos de clivagem não penetram no vitelo. Nesse estágio.1975.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 189 discoidal. as células da clivagem precoce são. 1991). Num primeiro instante.31 Formação de um embrião do pinto com duas camadas. se tornou o organismo favorito para quem deseja estudar o desenvolvimento dos vertebrados. o vitelo centralizado permite a clivagem somente na borda periférica do ovo. mostra uma camada superior consistindo de um epiblasto central que irá entrar nas células da foice de Koller (ks) e na zona marginal posterior (mz). são facilmente mantidos. A Figura 5. o embrião já tenha formado a maior parte de seus tecidos e órgãos primordiais. Danio rerio. Na clivagem superficial. contínuas nas suas bases.30 Clivagem discoidal em um ovo de galinha. Porque essas clivagens não se estendem para o vitelo citoplasmático. vista do pólo animal. A massa do oócito é Sulcos de clivagem tomada pelo vitelo. Certas células do epiblasto caem (delaminam) da camada superior para formar ilhas de polinvaginação (pi) com 5 a 20 células cada. com a divisão celular ocorrendo somente no blastodisco do pólo animal.. Clivagem discoidal Clivagem discoidal é uma característica de aves. e outras clivagens se seguem para criar um blastoderma de camada única. AVES. Algumas dessas células são delaminadas em cavidades subgerminais para formar uma segunda camada (Figura 5. Essa seção sagital próxima à margem posterior. cortesia de H.

de uma bela maneira. divisões com clivagens precoce seguem um padrão altamente reprodutível de clivagem meridional e equatorial. Expandindo vegetalmente. com periodicidade de aproximadamente 15 minutos cada. a natureza incompleta da clivagem discoidal (Figura 5. veja Figura 5. criando uma região celular acima do vitelo denso. (de Beams e Kessel. BD significa a região do blastodisco. A YSL é formada no nono ou décimo ciclo. formando um monte celular situado no pólo animal de uma grande célula de vitelo.) (E) (F) de varredura mostram. ficando à frente da margem do blastoderma. desaceleração das divisões celulares e o movimento celular é evidente (Kane e Kimmel. A função da YSL ainda não foi esclarecida. para formar a YSL externa (Figura 5.33A). Essas divisões são rápidas. Essas são as células mais superficiais do .B). 1993). Como nos embriões de anfíbios e de ouriços-do-mar. Começando por volta da décima divisão. A segunda população celular distinguida na transição da blástula intermediária é a camada envolvente (EVL. para formar a YSL interna e parte dos núcleos se moverá vegetalmente. Em (A).33A. Neste ponto.32). 1976. duas populações de células podem ser distinguidas. todas as células mantêm conexões abertas umas com as outras e com a célula de vitelo subjacente para que células de tamanho moderado (17-kDa) passem livremente de um blastômero ao outro (Kimmel e Law. A primeira é a camada de vitelo sincicial (YSL). o blastoderma envolve a célula do vitelo. 1985). pode ser detectado o início da transição da blástula intermediária: começa a transcrição do gene zigótico. As primeiras 12 divisões ocorrem sincronicamente. quando as células da parte vegetal do blastoderma se fundem com a célula do vitelo adjacente. Isso produz um anel de núcleos com essa parte do citoplasma da célula do vitelo localizado bem embaixo do blastoderma.32 Clivagem discoidal em um peixe-zebra.190 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) (C) (D) Figura 5. cortesia dos autores. Inicialmente. parte do vitelo sincicial se moverá para baixo do blastoderma.

. uma proteção extra-embrionária cobrindo o que se pensa ser descartado mais tarde durante o desenvolvimento. permitindo que um mapa do destino possa ser traçado (Figura 5. A vista lateral é mostrada. (A) antes da gastrulação. A EVL finalmente forma a periderme. O destino da célula blastodérmica parece ser fixado pouco antes do começo da gastrulação.as células precursoras do coração (Stainer et al. Lee et al. 1990). 1987. mostrando a YSL. cortesia do autor. Esse comportamento pode ser observado em algumas das primeiras células a terem seu destino estabelecido . e os estudos de linhagem celular (onde um corante fluorescente não difusível é injetado em uma das células e os descendentes daquela célula podem ser seguidos) mostram que existe muita mistura de células durante a clivagem. e não todos os destinos dos órgãos estão identificados (para clareza). Microtúbulos se estendem através do citoplasma vitelínico e da região externa do YSL.33 (C) Pólo animal Nariz. determinando em seguida.) Pólo vegetal blastoderma. 1996... A superfície animal do vitelo é achatada e contém os núcleos do YSL.. Os destinos das células blastodérmicas precoces não estão determinados. qualquer célula pode dar origem a uma variedade imprevisível de descendentes de tecido (Kimmel e Warga. O mapa é gerado injetando células com corante de alto peso molecular. células em regiões específicas do embrião originam certos tecidos de uma maneira altamente previsível. 1993. Helde et al. das quais surgirá o embrião propriamente dito. 1994). B de Trinkaus. (C) Mapa do destino das células profundas depois que a mistura de células cessou. O processo pelo qual a célula contribui para o tecido envolve uma narrativa progressiva de possíveis destinos para o desenvolvimento de uma determinada célula. (B) Estágio tardio de blástula. Nesse período. e a EVL é uma cobertura epitelial fina composta apenas de uma camada de células. Entre a EVL externa e a YSL interna estão as células profundas. Os núcleos dessas células são derivados de células da margem do blastoderma. que liberou seus núcleos para o citoplasma vitelínico. quais órgãos as células carregadas de corante geraram.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 191 (A) Blastoderma Camada envolvente (EVL) Células profundas (B) YSL interna Núcleos sinciciais do vitelo YSL externa Microtúbulos Célula do vitelo Figura 5. 1993. Kimmel et al. 1994). . olho Epiderme Crista neural Ventral Somito do músculo Prônefron Intestino Cérebro Medula espinhal Mesoderma Cabeça Dorsal Notocorda Sangue Nadadeiras Coração Músculo Ectoderma Faringe Fígado Margem do blastoderma Célula do vitelo Endoderma A blástula do peixe–zebra.33C. (A e C segundo Langeland e Kimmel. células profundas estão rodeadas pelo EVL. Além do mais.

as células marcadas formam descendentes que podem popular tanto a aurícula como o ventrículo. em média. Núcleos (enérgides) Enérgides migram para a periferia Células polares Blastoderma celular Células polares . em parte. células da blástula intermediária podem contribuir para a progênie de ambos. a meio caminho entre os pólos dorsal e ventral. (Segundo Stainier et al.192 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 5. podem dar origem às células que povoam ambos. onde uma grande quantidade de vitelo centralizada confina a clivagem para a borda citoplasmática do ovo. A clivagem de um ovo de inseto é mostrada na Figura 5.35. 8 minutos cada. O em- Clivagem superficial em embrião de Drosophila. embora o blastoderma celular se forme 3 horas mais tarde.B).) Ventral Dorsal Célula do vitelo Saco vitelínico Figura 5. Depois o núcleo migra para a periferia do ovo. Se a injeção em tais células for feita em um estágio mais tardio da blástula. 256 núcleos são produzidos por uma série de divisões nucleares durando. Se a célula estiver perto da margem. 1993. seus descendentes irão popular uma câmara somente. Injeção de um único blastômero na blástula precoce (estágio de 256-512 células) com rodamino-dextrano. Clivagem Superficial A maior parte dos ovos dos insetos passa por clivagem superficial. O núcleo do zigoto sofre várias divisões mitóticas dentro da parte central do ovo. o endocárdio e o miocárdio (Figura 5. átrio e ventrículo do coração..34A. Os tempos são representativos. os descendentes de uma célula somente serão capazes de povoar subcompartimentos específicos de tecido. Um dos detalhes fascinantes desse tipo de clivagem é que as células não se formam até que os núcleos tenham se dividido. Na Drosophila. o numeral abaixo de cada embrião indica o número de núcleos presentes. a progênie da célula está restrita a formar parte do coração. Por exemplo. O numeral acima de cada embrião corresponde ao número de minutos decorrido após a deposição do ovo. Nesse estágio. onde as mitoses continuam. Um pouco mais tarde. Mais tarde ainda. embora com uma velocidade diminuída. Células polares (que formarão as células germinativas) são vistas no estágio de 512 núcleos. já que a duração de cada ciclo de divisão depende.34 (A) (B) Mapa do destino das células profundas da blástula do peixe-zebra. da temperatura em que o ovo está sendo incubado.35 Células individuais que margeiam na metade do caminho as futuras superfícies dorsal e ventral de um embrião em estágio de meia clivagem. os descendentes de qualquer célula podem povoar somente o miocárdio ou o endocárdio.

conseqüentemente. Após as membranas e sua actina terem passado o nível do núcleo..36 Membrana vitelínica Alongamento nuclear e celularização do blastoderma de Drosophila. 1994). Isso forma o blastoderma celular. Aqui a velocidade da invaginação aumenta. Quando o núcleo alcança a periferia durante o décimo ciclo da clivagem. isso não significa que o citoplasma seja uniforme. Dessa maneira. a criação do blastoderma celular envolve uma interação delicada entre microtúbulos e microfilamentos. Como qualquer outra formação celular. Aqueles núcleos migrando para o pólo posterior do ovo logo ficam envolvidos pelas novas membranas celulares para formar o pólo de células do embrião. 1993. Essas células dão origem às células germinativas dos adultos. Na Drosophila. 1971.) . [cleave5. significando que todas clivagens nucleares estão contidas em um único citoplasma. entre os núcleos. Após as células polares terem sido formadas. Karr e Alberts (1986) mostraram que cada núcleo dentro do blastoderma sincicial está contido dentro de seu próprio pequeno território de proteínas citoesqueléticas. a segunda fase da celularização ocorre. (Segundo Fullilove e Jacobson. A primeira fase da celularização do blastoderma é caracterizada pela invaginação das membranas celulares e sua rede de actina subjacente nas regiões entre o núcleo. Nenhuma membrana celular existe a não ser a do próprio ovo. Esse processo é inibido por drogas que bloqueiam os microtúbulos.36). Foe et al. essa camada é composta por aproximadamente 6000 células e é formada 4 horas após a fertilização.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 193 brião é chamado agora de blastoderma sincicial. cada núcleo fica cercado por microtúbulos e Superfície do ovo Fuso mitótico Sulco de clivagem Áster Núcleo Canal do sulco Microtúbulos Figura 5. separando cada núcleo somático para uma única célula (Figura 5. um dos primeiros eventos do desenvolvimento dos insetos é a separação das futuras células germinativas do resto do embrião.html] Embora os núcleos se dividam originalmente dentro de um citoplasma em comum. e o complexo de actino-membranas começa a apertar o que será o terminal basal da célula (Schejter e Wieschaus. a membrana do oócito dobra-se para dentro. com todas as células arranjadas como uma cobertura de camada única envolvendo o núcleo do ovo.

A transcrição desses núcleos (que começa por volta do décimo primeiro ciclo) é muito intensificada.) microfilamentos. o tempo necessário para completar cada uma das próximas quatro divisões se torna gradualmente maior. A divisão final do blastoderma. 1982a. antes da celularização.e. Enquanto os ciclos de 1 a 10 duram 8 minutos cada. 1986. o ciclo 13. a décima quarta. foi secionado e corado triplamente. cortesias de T. Dessa maneira. leva 25 minutos para se completar. Edgard et al. então seria possível acelerar a celularização amarrando (ligando) algum citoplasma. a duração dos ciclos 11 a 14 em embriões do tipo selvagem. Edgard e seus colegas compararam o desenvolvimento inicial de embriões de Drosophila do tipo selvagem com os do mutante haplóide. . em relação a do tipo selvagem. L. com defasagem de uma divisão celular. Os embriões haplóides de Drosophila têm a metade da cromatina a cada divisão celular. e o ciclo 14 é assincrônico. estrela-do-mar e Drosophila) aparenta sofrer efeito da razão da cromatina para o citoplasma (Newport e Kirshner. 1989). Tais transições também são vistas nos embriões de inúmeros vertebrados e de filos invertebrados. (B) Microfilamentos foram identificados usando anticorpo fluorescente para actina. (C) Microtúbulos foram reconhecidos por um anticorpo fluorescente para tubulina. Daqui para frente. após 13 divisões). em comparação com os do tipo selvagem. 1986). o último ciclo no blastoderma sincicial. sinalizando o fim do período de clivagem. O controle dessa desaceleração mitótica (em embriões de Xenopus. Além do mais. A desaceleração da divisão celular da Drosophila e o aumento concomitante na transcrição do RNA é freqüentemente referido como transição da blástula intermediária (midblastula transition). fazendo com que os núcleos se dividam em um volume menor.194 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) (C) Prófase 12 Núcleos Microfilamentos Microtúbulos Figura 5. em um determinado ciclo. os embriões haplóides seguem um padrão similar aos embriões do tipo selvagem.37 Localização do citoesqueleto em volta de núcleos no blastoderma sincicial de Drosophila. A Figura 5. O núcleo e suas ilhas citoplasmáticas associadas são chamados enérgides. Após o núcleo alcançar a periferia. Domínios do citoesqueleto podem ser vistos em volta de cada núcleo. os embriões haplóides passaram por uma divisão extra. ouriço-do-mar. Se essa defasagem fosse devida ao fato dos mutantes haplóides terem uma razão de cromatina para o citoplasma de metade. (de Karr e Alberts. enquanto outro grupo leva 175 minutos (Foe. (A) Os núcleos foram localizados por um corante que se liga ao DNA. Esses investigadores descobriram que enquanto embriões do tipo selvagem formam sua camada celular imediatamente após a décima terceira divisão.37 mostra o núcleo e seu microfilamento essencial e os domínios do microtúbulo na prófase da décima segunda divisão mitótica. Karr. o padrão mitótico do embrião foi acelerado. Um embrião de Drosophila entrando na prófase da décima-segunda divisão mitótica. Alguns grupos de células completam esse ciclo em 75 minutos. porém. Quando essa ligação foi realizada. O embrião de Drosophila forma células no ciclo 14 (i.. corresponde aos ciclos 12 ao 15 em embriões haplóides. um embrião haplóide no oitavo ciclo celular tem a mesma quantidade de cromatina quanto um embrião do tipo selvagem no sétimo ciclo.

Pelo contrário. as divisões daqui para frente se tornam assincrônicas. o maior compêndio do desenvolvimento de insetos (Embriologia dos insetos e Miriápodes. Insetos são um excepcionalmente bemsucedido e espalhado subfilo. (A segundo Cruz. No entanto. que isso não reflete necessariamente as condições do mundo natural. a transição da blástula intermediária é induzida precocemente em Xenopus. Com o desenvolvimento do ovo hospedeiro (normalmente de uma mariposa). as células do embrião parasita dividem-se repetidamente para se tornar uma massa de células não diferenciadas chamadas poligerme. A fotografia é de um hospedeiro recémaberto. A Drosophila ganhou proeminência somente depois que se fez necessário relacionar fenômenos embriológicos com genes particulares. o mesmo acontece com o ovo do parasita. Kimelman et al. freqüentemente reflete quais animais são mais acessíveis para o estudo e mais facilmente domesticados para o laboratório. a iniciação da transcrição pode ser induzida prematuramente aumentando artificialmente a duração do ciclo celular. permanecendo frouxamente atada ao cérebro e traquéia larvais (Figura 5. Generalizações. atacam a larva de Trathala dentro do mesmo hospedeiro. a poligerme em crescimento fica suspensa no hospedeiro. 1987). Experimentos de ligação sugerem que o tempo de duração da transição dessa blástula intermediária também é função da razão volumes cromatina/ citoplasma (Newport e Kirschner.) Mórula de 4 dias Ovo (A) Poligerme precoce Esôfago Corpo gorduroso do hospedeiro Poligerme (B) Poligerme em expansão . Figura 5.b). 1986. Em 1941.38 Olho/cabeça da lagarta hospedeira Desenvolvimento de vespas parasitárias (Encyrtidae).000 espécies de insetos conhecidas. tanytmemus deposita seu ovo den- tro do ovo de uma outra espécie. e o camundongo e o homem são os únicos mamíferos cujos desenvolvimentos são usualmente estudados. O desenvolvimento de anfíbios é geralmente representado pelo Xenopus laevis. e Clivagem Parasítica da Vespa O QUE CONSIDERAMOS “normal” e o que marginalizamos como “exceções”. Quando cicloheximida (um inibidor da síntese protéica) atrasa a divisão celular. o ovo da vespa divide holoblasticamente. e uma explosão de transcrições ocorre em Drosophila (Edgard et al.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade é alcançada quando existe um núcleo para cada 61 µm3 de citoplasma. ao invés de diferenciar o eixo do corpo. O desenvolvimento da vespa parasita Copidosomopsis tanytmemus difere marcadamente daquele da Drosophila canônica. uma desaceleração similar na taxa mitótica é observada após a décima segunda divisão celular.. enquanto o ovo do hospedeiro começa o seu desenvolvimento no padrão superficial usual. nossas discussões de desenvolvimento animal são freqüentemente dificultadas por certos organismos em particular. Cruz. 1986a. embora haja mais de 800. Não é necessário dizer. Similarmente. (B) Larvas precoces de um gênero relacionado. (A) Clivagem holoblástica do ovo de Copidosomopsis tanytmenus produz uma poligerme de células não-diferenciadas.38A. 1986a). não sendo surpreendente encontrar uma grande variabilidade no seu desenvolvimento. Johannsen e Butt) sequer mencionava essa espécie em seu índice. a fêmea C. 1981. B de Cruz. Drosophila e Xenopus. 195 Informações adicionais & Especulações Exceções. Em duas semanas. Pentalitomastix.. a maior parte dos biologistas do desen- volvimento conhecem apenas o desenvolvimento de uma espécie: Drosophila melanogaster. 1982a. Em Xenopus. Em ambos. cortesia de Y. Como muitas outras espécies parasitárias. Cruz. Aqui também. Ademais.

a poligerme se divide em dúzias (às vezes milhares. São essencialmente um conjunto de mandíbulas móveis. Tal ciclo de vida incomodava Charles Darwin. de cerca de 10 porcento do número total de embriões. Newport e Kirschner. literalmente por comer o seu corpo. morrendo assim que as larvas normais se formam. Quando oócitos normais são estimulados por progesterona. 1982a).. além de sua utilidade de provocar noções de desconforto no que se refere a ordem natural e natureza da “individualidade”. que se desenvolvem em uma semana. 1964). como têm muito pouca estrutura e não sofrem metamorfose. Um grupo menor. 1981. vão até o embrião hospedeiro matando as larvas parasitas de outros indivíduos (de espécies diferentes e de outros clones da mesma espécie). as vespas parasitas podem ter conseqüências econômicas importantes. em uma cena recordando o filme Alien. quando aumentam. Após outros 5 ou 6 dias. que rotineiramente forma numerosos embriões. se tornam larvas precoces (Figura 5. I MECANISMO DE CLIVAGEM Regulando o ciclo da clivagem O ciclo celular das células somáticas é funcionalmente dividido em quatro estágios (Figura 5. Xenopus divide-se sincronicamente em um ciclo celular bifásico: S para M e M para S (Figura 5. cujos ovos formam quádruplos idênticos. são detidos na primeira prófase meiótica. deve também nos encorajar a apreciar a plasticidade da natureza. Em 40 dias. provocam a abertura e a saída do hospedeiro. Enquanto elas vivem. (Poliembrionia é característica de certos grupos de insetos e certas espécies de mamíferos. A habilidade de um inseto se formar de um embrião por clivagem holoblástica. desencorajando generalizações precipitadas sobre um completo subfilo de organismos. Essa habilidade que um ovo tem para se transformar em uma massa de células. Oócitos normais de Xenopus.. No entanto. cordões nervoso e hemolinfa.) Nas primeiras 12 divisões. os novos adultos perfuram o tegumento do hospedeiro e. 1986b. fazendo-o questionar o conceito de uma divindade benigna conhecida por todos. tais como o tatu de nove bandas. temos o intervalo da pré-replicação (G1). retomam sua divisão meiótica e param na metáfase da segunda meiose. no entanto. dependendo da espécie) de discretos grupos de células. Grbic and Strand.39A). Essas larvas não se reproduzem. Com a morte das larvas precoces (e suas presas). São incapazes de se dividirem. 1977. Esses adultos freqüentemente co- pulam (a maioria das vezes sobre o corpo do hospedeiro morto). seguido pela mitose. Se o núcleo de células não divididas (como neurônios) são colocados no citoplasma de oócitos tratados com progesterona. a divisão celular pode ser muito simples. Macrocentrus grandii é uma vespa poliembrionária que parasita a broca Européia do milho. as larvas precoces são formas predatórias que eliminam possíveis competidores (Cruz. Após a mitose (M). no entanto. Cada um desses grupos se torna um embrião! A vespa poliembrionária Copidosoma floridanum produz até 2000 indivíduos de um único ovo fertilizado (Grbic et al. (Embriões de Xenopus adicionam essas fases ao ciclo celular. intestinos. gônadas. 1992). Em 1860 ele escreveu ao biologista americano Asa Gray: “Eu não consigo me convencer de que o benevolente e onipotente Deus tenha planejado e criado a Ichneumonidae com a expressa intenção delas se alimentarem dentro dos corpos vivos de lagartas”. em seguida acontecendo a síntese do DNA (S). começa a se alimentar vorazmente dos órgãos da larva hospedeira.. glândulas de seda. Em blastômeros de clivagem precoce. 1996). e o hospedeiro é um pouco mais do que um saco de pele segurando cerca de 70 larvas pupantes de vespa. Após o período da síntese. Drosophila adiciona G2 durante o ciclo 14 e G1 durante o ciclo 17. a larva normal emerge da sua primeira mudança de pele. Blastômeros precoces de ouriço-do-mar não têm G1 replicando o seu DNA durante a última parte (telófase) da mitose prévia (Hinegardner et al. A progressão dessas fases é regulada por fatores de crescimento. gordura corporal. é chamada de poliembrionia.38B). acham um novo hospedeiro para depositar os seus ovos e morrem logo em seguida. algum tempo após a décima segunda clivagem. Laskey et al. a criação parasita já se alimentou dos músculos do hospedeiro. temos o intervalo pré-mitótico (G2). também param a divisão.39B. Em outras palavras. Se os núcleos de células divididas forem transplantados para esses oócitos. Os fatores que regulam esse ciclo bifásico estão localizados no citoplasma. Os núcleos de Xenopus e Drosophila eliminaram as fases G1 e G2 durante a clivagem precoce. também iniciam a divisão e param . Elas não só se desenvolvem precocemente.196 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Com o crescimento.) A maior parte desses embriões de vespa parasita se desenvolvem em larvas normais que levam aproximadamente 30 dias para se desenvolver.

Fator promotor de maturação Alguns dos fatores que governam a síntese do DNA e a divisão celular foram identificados. Dessa maneira. Quando o MPF é microinjetado nessas células. 1969. A atividade do MPF de blastômeros precoces de rãs é maior durante M e não detectável durante S. mesmo na ausência de núcleos ou centríolos. Células que estão se diferenciando são geralmente “removidas” do ciclo celular e estão numa fase G1 estendida chamada G0. Seus envoltórios nucleares se partem e suas cromatinas condensam-se em cromossomos. A Mitose (M) é seguida por uma condição de “interfase”. mesmo na ausência de síntese protéica. Masui e Markert. Durante essa fase S. (A segundo Nigg.) na metáfase (Gurdon.1984). tendo somente dois estados. As células em clivagem pode ficar presas na fase S. O fator induzido por progesterona que permite o núcleo do oócito retomar suas divisões é uma fosfoproteína de duas subunidades chamada de fator de promoção da maturação (MPF. O MPF foi primeiro descoberto como o principal fator responsável pela retomada das divisões celulares meióticas no ovo ovulado de rã (Smith e Ecker. Se fragmentos clonados de DNA são injetados nesses embriões anucleados. regulando o ciclo bifásico dos blastômeros precoces de Xenopus. 1995. Esse mesmo fator continua realizando o seu papel após a fertilização. Esse último período é subdividido em fases G1. . também conhecida como fator promotor da mitose. responsáveis para progressão através do ciclo celular..CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 197 (A) Ciclina B (B) Ciclina D Ciclina A Ciclina E Ciclina A Figura 5.39 Ciclos celulares de células somáticas e blastômeros precoces. Karsentiket al. Após uma hora. o MPF é degradado e os cromossomos retornam à fase S. a capacidade de divisão celular é regulada pelo citoplasma. S (síntese) e G2. Newport e Kirschner (1984) demonstraram que a replicação do DNA (S) e mitose (M) são dirigidas somente pelo ganho ou perda de atividade do MPF. S e M. elas entram em M. Gerhart e colegas (1984) mostraram que o MPF sofre mudanças cíclicas nos níveis de atividade nas células mitóticas. (B) Ciclo celular bifásico mais simples dos blastômeros precoces de anfíbios. sua replicação sofre o controle desse ciclo (Hara et al. Harland e Laskey. Essa ciclicidade também é observada em blastômeros anucleados. O citoplasma de oócitos estimulados com progesterona ainda passam por contrações corticais periódicas (característica da divisão). são mostradas no seu ponto de regulação do ciclo celular. 1971). 1980. o MPF existe em estado inativo. 1968).. 1980. As ciclinas e suas respectivas quinases. incubando-as com um inibidor de síntese protéica. (A) Ciclo celular de uma célula somática típica.

p34.40 O desenvolvimento da regulação do ciclo celular na embriogênese de Drosophila. 1985. e nos próximos 15 minutos.. 1990). pode prevenir divisões da célula até depois dos cromossomos terem-se separado. quando ativada. 1988.. a degradação das proteínas do cordão comanda nova síntese a partir do núcleo. Outro alvo é o envoltório nuclear. Quinze minutos após a adição do MPF. A MPF quinase purificada já foi mostrada fosforilar esses envoltórios nucleares de proteínas. Pré-MPF acumula mas não é ativado até que a fosfatase cordão cliva os fosfatos T-14 e Y-15 da cdc2 quinase. Um terceiro alvo parece ser a RNA polimerase (Cisek e Corden. o mRNA materno para ciclina desapareceu. Portanto. A forma ativa parece ser fosforilada Figura 5. Além disso. Um quarto alvo da quinase parece ser a subunidade reguladora de miosina citoplasmática. e realizar sua despolimerização in vitro (Peter et al.. e a fosforilação da RNA polimerase pode ser a responsável pela inibição da transcrição durante a mitose. A inibição dessa miosina durante os estágios iniciais da mitose. Ward e Kirschner. À medida que a ciclina é degradada. as três proteínas principais (as lâminas) do envoltório nuclear se tornam hiperfosforiladas. que se liga ao DNA. Um desses alvos é a histona H1. A proteína p34 pode existir em formas fosforiladas e desfosforilada. a atividade da MPF quinase permanece constante e as divisões celulares prosseguem tão rapidamente quanto funcionam as enzimas e os substratos. sua síntese (de mRNA estocado no citoplasma) torna-se limitante no ciclo 8. (A) Ciclina e proteína cdc25 (cordão) são abundantes antes da fertilização. O mecanismo que relaciona a atividade do MPF com o término da síntese de DNA e a iniciação da citocinese estão sendo investigados. Arion et al. De fato. sintetizada pelo gene cdc2 da levedura (Dunphy et al.) Regulado zigoticamente Regulado maternalmente Ciclina maternal e proteínas de cordão presentes MPF ativo Proteína Ciclina Ciclina Ciclina Proteína maternal de cordão presente Ciclina Ciclina mRNA Ciclina Degradação Pré-MPF Ciclina Síntese de ciclina (zigótica) Desfosforilação cdc 25/cordão fosfatase (zigótica) MPF ativo Ciclina Síntese de ciclina MPF ativo Ciclina Degradação da ciclina Mitose Quinase ativa de proteínas maternas (limita substrato) Ciclo Divisões nucleares Mitose Ciclo dirigido pela tradução de nova ciclina de mRNA materno Mitose Ciclo dirigido pela cdc25/fosfatase de cordão Mitose . (Segundo Edgar et al. A pequena subunidade de MPF é uma proteína quinase que. 1992).. Gautier et al. 1988). No ciclo 14. Dessa forma. 1988). durante os primeiros sete ciclos celulares.. CDK) MPF tem uma subunidade grande e outra pequena. A fosforilação dessa proteína pode levar à condensação cromossômica. pode fosforilar uma variedade de proteínas. 1987). 1989).198 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Informações adicionais & Especulações MPF e Seus Reguladores A pequena subunidade do MPF: A cdc2 Quinase (QuinaseCiclina-dependente. o gene humano que codifica a proteína correspondente à pequena subunidade do MPF de Xenopus pode ser inserido no genoma da levedura e causar divisão nos mutantes de levedura deficientes em cdc2 (Lee e Nurse. 1990.. ela se torna inativa e incapaz de funcionar como uma ATPase dirigindo os filamentos de actina envolvidos na divisão celular (Satterwhite et al. e deve ser sintetizado de genes nucleares. o envoltório se despolimerizou e está se desfazendo (Miake-Lye e Kirschner. 1994. MPF funciona adicionando grupos fosfatos às proteínas específicas. Quando essa proteína é fosforilada. A pequena subunidade de MPF tem sido notavelmente conservada através da evolução e é quase idêntica àquela da fosfoproteína indutora de mitose.

. não realizarão a divisão (Figura 5. (A) Figura 5. e se sua transformação em proteínas é seletivamente inibida. Isso é conseguido pelo aparecimento da fosfatase cdc25 (Edgar e O’Farrell.. A Fosfatase cdc25: Iniciadora de Mitose A mitose se inicia com uma abrupta desfosforilação de todas essas subunidades MPF quinase na posição 15. 1989). 1988). Edgard e O’Farrel (1989) mostraram que aquelas células que se dividem estão sintetizando a sua própria fosfatase cdc25. e a seqüência de sua proteína codificada foi considerada muito semelhante às proteínas ciclina B encontradas em numerosos animais (Goebl e Byers. A síntese da ciclina do mRNA armazenado no oócito armazenado se torna o passo limitante para a mitose. de cordão) é inicialmente sintetizada pelo mRNA armazenado no oócito durante os 13 primeiros ciclos celulares. 1989. um embrião de estágio tardio 14 é corado com uma seqüência nucleotídica radioativa que especificamente reconhece e liga o mRNA cordão (visto aqui como pontos brancos na auto-radiografia). Lee et al. Durante os ciclos 8-13. 1986). Jessus e Beach. Esse gene foi clonado. A proteína ciclina B combina com a quinase cdc2 do MPF para criar o comple- xo MPF. (C) Anticorpos para a proteína ciclina A mostram que ela é degradada após a mitose e não é vista nas regiões que contêm a proteína de cordão. Solomon. tirosina-15 (Y15) e treonina-161 (Figura 5. O suprimento de moléculas MPF potencialmente funcionais (pré-MPF) acumula durante o período tardio de S. 1991.. Na Drosophila. sintetizam mRNA string. existe uma maturação desenvolvimental da regulação da quinase MPF ativa (veja Figura 5. mas fosforilações nos T-14 e Y-15 a inibem. a ciclina começa a ser degradada na metáfase. 1988. Dessa maneira. Essa fosfatase (que tem sido encontrada em inúmeros organismos) é ela própria regulada pelo desenvolvimento. o MPF ativo permanece em níveis altos. 1994).40. 1989.) (B) (C) . (de Edgar e O’Farrell. A. Edgard et al. 1983. Essa degradação e a necessidade de re-sintetizar essa proteína explicariam a mudança de controle citoplasmático para controle nuclear da divisão como visto no ciclo 14. a fosfatase cdc25 (produto do gene string.. quando fosforilada nessas posições a quinase permanece inativa. (A) Nesse exemplo. Dessa forma. As proteínas ciclina B em células em estágio de clivagem mostram um comportamento periódico. A fosforilação no T-161 é necessária para a atividade do MPF. A maior subunidade do MPF: Ciclina Então. a acumulação gradual do MPF é convertida em uma breve explosão de atividade quinase que inicia a mitose. cortesia de B. (B) Um embrião ligeiramente mais velho é corado com anticorpos fluorescentes para tubulina para mostrar os microtúbulos dos fusos mitóticos. pensou-se que qualquer regulador da proteína da levedura teria contrapartida no embrião animal. Swenson et al. 1989.40). uma proteína 56-kDa chamada p56cdc13. 1992). Ciclinas são freqüentemente codificadas pelo mRNA armazenado no citoplasma do oócito. e o núcleo divide-se tão rapidamente quanto as enzimas sintetizadoras de DNA permitem. como é regulado o MPF? Desde que a clivagem de Xenopus parecia ser regulada por uma proteína similar àquela que regula a divisão celular da levedura. enquanto aquelas que não são capazes de se juntar a esse ciclo. durante o pró- ximo ciclo. 1993). 1992. A ciclina permite a subunidade quinase cdc2 tornar-se fosforilada nos resíduos treonina-14 (T14). Solomon et al. No entanto. o complexo pré-MPF armazenado no ovo é desfosforilado em T14 e Y-15 pelo recém-traduzido cordão (cdc25) da proteína. Na ovulação. Uma comparação da microfotografia de fluorescência com a auto-radiografia obtida da ligação da sonda radioativa mostra que somente aquelas células capazes de se dividirem.41).. a célula não entrará em mitose (Minshull et al.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 199 em treonina-161 (T-161) e desfosforilada em tirosina-15 (Y-15).. Gautier et al. se o núcleo não transcrever seu próprio cordão mRNA. o cordão mRNA materno é degradado. Edgar. Ambas condições são importantes para a atividade da quinase (Gould e Nurse. Em Drosophila. levando a flutuações periódicas de atividade MPF-quinase. potencialmente funcional. acumulando durante a fase S e sendo degradada durante a mitose (Evans et al. A degradação do cordão da oócito-proteína leva à parada do ciclo celular na interfase do ciclo 14. Durante os primeiros sete ciclos nucleares.41 Correlação da expressão do gene string (cordão) com a divisão celular em embriões de Drosophila.. porém. Um dos principais reguladores da proteína MPF de levedura é o produto do gene cdc13. as células não se dividirão.

Pior.) Entrada de espermatozóide.. permitindo a ocorrência de síntese do DNA. Os papéis de algumas dessas quinases foram determinados (como mostra a Figura 5. 1994). Embriões de Drosophila adicionam um estágio G2 antes da mitose.42 Níveis do fator promotor de amadurecimento (MPF) durante o desenvolvimento precoce da rã Xenopus laevis. mas a própria montagem do fuso é necessária para o funcionamento apropriado da ciclina B (Minshull et al. quando as células saem normalmente do ciclo para começar a se diferenciarem. e a mitose pára. A fase G1 é adicionada ao ciclo 17 quando ciclina E se torna o fator limitante para a replicação do DNA. 1989). e somente uma rodada de replicação é normalmente permitida durante a divisão celular (Chong et al. Dessa forma. de Nooij et al. 1994). uma das mais críticas é a ciclina E/cdk2. A regulamentação do desenvolvimento dessa proteína é uma fase crítica no desenvolvimento da Drosophila. expressam a proteína Dacapo. Nesse conjunto.39). ciclina E/cdk2 é crítica para a habilidade da célula entrar na fase S. O sinal normal de maturação é o hormônio progesterona. Isso é o que acontece. um inibidor de ciclina E/cdk2 (Lane et al.. Pensa-se que a ciclina E controla a síntese do DNA. A mitose passou do controle citoplasmático para o nuclear. seríamos muito maiores do que agora. que mantém o oócito preso na metáfase da segunda divisão meiótica (Figura 5.) Se ciclina E é induzida ectopicamente. aumento de Ca2+ livre. [cleave6. se a degradação da ciclina for prevenida. durante o desenvolvimento do oócito da rã. as ciclinoenzimas D/cdk4. O sistema ciclinaquinase parece coordenar esses eventos.. As moléculas que mediam essas trocas estão agora sendo estudadas. ciclinas e quinases ciclina-dependentes são alvos e causadores da regulação.42). Em embriões precoces. Outras ciclinas e quinases ciclinadependentes MPF é o primeiro membro descoberto de uma família de proteínas diméricas que têm estruturas muito similares. Madine et al. que continuam a produzir DNA na ausência de divisão celular. fazendo com que a mitose não comece até que o DNA tenha começado a replicarse. e parece agir bloqueando a degradação da ciclina (veja o Capítulo 22). 1995). e Pontos de Controle para Divisão Celular: DNA e Fusos O ciclo celular exige uma excepcional intricada coreografia da citocinese. que quando dependente do MPF é chamada cdk1. 1994). O oócito maduro da rã cessa a divisão celular produzindo uma proteína chamada fator citostático (CSF). 1995. Essa proteína contém os produtos dos genes c-mos e cdk-2. Fator Citostático A síntese e a degradação do MPF leva a ciclagem das células. Primeiro.. Cada uma dessas proteínas contém uma ciclina e uma quinase ciclina-dependente. imagine se a divisão da cartilagem não fosse coordenada com a divisão da pele e dos vasos sangüíneos. imagine que essa desregulação ocorresse em somente uma de nossas pernas. inativação de CSF Estímulo para amadurecimento (progesterona ou MPF) Alta Atividade de MPF Baixa CSF estabiliza MPF Oócito Imaturo Meiose I Meiose II Oócito maduro Primeira clivagem Segunda clivagem . a maioria das células param no G1 desse ciclo. Pelo menos outras sete quinases ciclina-dependentes estão envolvidas em células maduras de vertebrados. não entrando no período de síntese do DNA.. o crescimento das células continua sem controle externo. Certamente. 15 e 16 são iniciadas somente quando essa pré-MPF é desfosforilada nas posições T14 e Y-15 pela proteína cordão.6 cumprem um papel crucial no desenvolvimento. Segundo. levando à deficiência dessa proteína no ciclo 17. e as células do intestino. controlam a dicotomia entre a divisão e a diferenciação celular. A mensagem para ciclina é degradada durante o ciclo 16.200 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Grandes concentrações de pré-MPF se acumulam. e mais de uma dúzia de ciclinas foram identificadas. quando a proteína de cordão se torna limitante no ciclo 14. Nesses casos.html] começo da mitose. A regulação desses eventos é coordenada através de hormônios e fatores de crescimento que. Em diversos tipos de células. aparentemente. as células retidas sofrem uma nova rodada de síntese de DNA (Knoblich et al. a fibra do fuso mitótico não pode formar até a ciclina B/cdk1 sinalizar o Figura 5. por fim. que estimula a ovulação dos oócitos e o início da meiose. Também parece haver retroalimentação entre a cromatina replicante e as quinases ciclina-dependentes. seus mRNA sendo fornecidos pelo oócito e traduzidos através de todos os primeiros 15 ciclos de divisão. o MPF permanece ativo e a célula é travada na metáfase (Murray et al. 1996). Entre essas enzimas. Essa proteína é derivada de transcrição nuclear ao final de cada período G2. 1996. a ciclina E é derivada dos genes zigóticos. regulam as ciclinas que controlam a passagem através dos ciclos das células. Em células maduras de vertebrados. e se desenvolve um tumor. Aí começam a diferenciar-se. A regulação das ciclinas é uma função crítica no desenvolvimento. fosforilando certos fatores de transcrição que regulam as transcrições das proteínas necessárias para a replicação do DNA (Duronio e O’Farrell. Enquanto MPF (ciclina B/cdk1) é crítica para a entrada na mitose (M). No entanto. 1989. (As exceções são as células precursoras dos nervos que continuam a proliferar. montagem de fusos e metabolismo celular.. quando a ciclina se torna ativa sem regulação externa ou quando ciclinas se tornam estimuladas por proteínas mutantes. Por exemplo. (Segundo Murray e Kirschner. As mitoses para as divisões 14. MPF permanece ativo. Ainda pior. Se os fusos são formados incorretamente. Uma vez que a ciclina não é degradada. replicação de DNA. imagine as células da cartilagem de nossas pernas sofrendo mais uma divisão celular. a ciclina B cessa seu funcionamento.. ciclina E e cdk2 estão sempre presentes.

elas são. portanto. mesmo quando a clivagem é bloqueada (Lillie. se interrompido. a divisão mitótica do núcleo. e o fuso é interno ao anel contrátil. É responsável por exercer a força que separa o zigoto em blastômeros. . que inibe a formação e a organização de microfilamentos no anel contrátil. Dessa maneira.. a citocinese pára. a divisão da célula. A liberação de íons de cálcio durante a fertilização ativa a protease que especificamente inativa o CSF (Watanabe et al. que por sua vez é baseada nos ritmos cíclicos da síntese e degradação da ciclina. incluindo a osmorregulação e o transporte de íons e nucleosídeos.43B). Whittaker. o anel de microfilamentos pode ser visto formando uma banda cortical distinta de 8-10 µm de espessura (Figura 5.2 apresenta uma comparação desses sistemas de divisão. nocodazola Citocalasina B Processo Cariocinese Citocinese Agente mecânico Fuso mitótico Anel contrátil Localização Citoplasma central Citoplasma cortical a Como foi verificado que a colchicina inibe independentemente várias funções da membrana. Enquanto os íons de cálcio estão ocupados desligando a mitose. separadas por condições naturais ou experimentais. A Tabela 5. interrompendo a clivagem sem parar a cariocinese (Schroeder. O sulco da clivagem finalmente seciona o plano da mitose criando. 1979). O agente mecânico da citocinese é o anel contrátil de microfilamentos feitos de actina (o mesmo tipo de proteína que alonga os microvilos do óvulo e o processo acrossômico do espermatozóide). enquanto a clivagem continua. dois blastômeros geneticamente equivalentes. O mecanismo citoesquelético da mitose Clivagem na verdade é o resultado de dois processos coordenados. Outra maneira de induzir esse estado é tratar os embriões com a droga citocalasina B. com seus microtúbulos compostos de tubulina (o mesmo tipo de proteína componente do flagelo do espermatozóide). Em alguns momentos. 1987). Quando o CSF é degradado. 1972). Tabela 5.2 Cariocinese e citocinese Principal composição protéica Microtúbulos de tubulina Microfilamentos de actina Principal droga disruptora Colchicina. O segundo processo é a citocinese. Sob o microscópio eletrônico. Esse anel contrátil existe somente durante a clivagem e se estende por 0. onde o ovo do ouriço-do-mar é mostrado passando pela primeira clivagem. os sinais da fertilização que ativam a proteína quinase C estão estabelecendo condições de interfase: descondensação da cromatina e reforma do envoltório nuclear (Bement e Capco. a cariocinese ocorre diversas vezes antes da citocinese. Esse aperto dos anéis de microfilamentos cria o sulco da clivagem. 1991). Em seguida. O relacionamento e coordenação entre os dois sistemas durante a clivagem é representado na Figura 5. Embora a cariocinese e a citocinese sejam normalmente coordenadas. Nos ovos dos insetos. O primeiro desses processos cíclicos é a cariocinese. às vezes. Schroeder (1973) propôs um modelo de clivagem em que o anel contrátil parte o ovo como um “fecho de bolsa” apertando o ovo. e a célula pode retornar à fase S. o núcleo continua a se dividir e expressar proteínas reguladoras do desenvolvimento. nocodazol tornou-se a principal droga usada para inibir processos mediados por microtúbulos (veja Hardin. a ciclina pode então ser degradada. os ritmos da divisão celular são controlados pela atividade do MPF.43A. 1902.1µm para o centro do ovo. Os microfilamentos de actina são encontrados no córtex do ovo ao invés do citoplasma central. cujo agente mecânico é o fuso mitótico. O fuso mitótico e o anel contrátil estão perpendiculares um com o outro. 1991). assim.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 201 o oócito permanece na metáfase. um dos efeitos da liberação de íons de cálcio na fertilização é de iniciar a degradação da ciclina e permitir que a célula comece a replicação do DNA.

Clivagem normal ocorre somente se um par de ásteres está presente (Wilson. mesmo na ausência de núcleo. (B de Bonder et al. Dessa maneira. 1927) fizeram observações semelhantes com embriões de ouriço- .. Raff e Glover (1989) mostraram que no embrião de Drosophila. 1991). Esses ásteres (Figura 5. 1987. Pflüger (1884) descobriu que quando um zigoto de rãs é levemente comprimido entre duas placas de vidro. e ovos polispérmicos (obtendo centríolos de cada espermatozóide) formam sulcos de clivagem múltiplos no mesmo ovo (veja Figura 4. al. se os centríolos migram ao pólo posterior.43 (A) Microfilamentos (anel contrátil) (B) Papel dos microtúbulos e microfilamentos na divisão celular. as direções das primeiras três clivagens são todas perpendiculares ao plano das placas. eles podem formar células polares. Os cromossomos estão sendo arrastados para os centríolos por microtúbulos. é como a citocinese e a cariocinese são coordenadas entre si.) Centríolo Cromossomo (C) Microtúbulos Um dos mais intrigantes problemas não resolvidos da clivagem embrionária. Em estudos mais recentes. 1901). Ambos. Pesquisas in vitro sugerem que a replicação do DNA pode controlar a fosforilação da subunidade quinase cdc2 do MPF e que essa fosforilação pode controlar a habilidade da actina de se contrair (Smythe e Newport. (B) Localização de microfilamentos da actina no sulco de clivagem. 1988. Marcação fluorescente dos microfilamentos de actina mostra o anel contrátil no sulco da primeira clivagem (flecha) de um ovo de ouriço-do-mar na telófase. (A) Diagrama da telófase da primeira clivagem..202 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 5. O número e o local desses sulcos de clivagem parecem ser controlados pelos ásteres dos microtúbulos. No entanto. enquanto o citoplasma está sendo apertado pela contração dos microfilamentos.43C) são “raios” microtubulares que se estendem dos pólos do fuso mitótico para a periferia da célula. O segundo tipo de evidência ligando os ásteres com a formação do sulco de clivagem vem de experimentos nos quais a direção de clivagem é mudada pela colocação do ovo sob pressão.20). 1992). essas observações podem não ser consistentes com as observações feitas em células embrionárias precoces (Ferrell et al. (C) marcação fluorescente da tubulina mostra os ásteres microtubulares de um ovo de ouriço-do-mar durante a telófase da primeira clivagem.. C de White et. Driesch e Morgan (revisto por Morgan. parece que os ásteres são elementos sine qua non da clivagem.

mesmo na ausência de um fuso mitótico entre eles. Ao passo que a membrana original tem uma região cortical pigmentada associada a ela. Na próxima divisão (C. cortesia de R. cria-se uma célula com forma de ferradura. contém as membranas âncoras para o anel subjacente de microfilamentos corticais. suas interações causam a formação de um sulco de clivagem.45A mostra o primeiro sulco da clivagem de um zigoto pigmentado de rã. é formada uma célula binucleada. Rappaport. 1961. deslocando os fusos mitóticos para os lados das células. na borda do sulco. Entre elas há uma grande região desprovida de rótulo radioativo (Figura 5. Na próxima divisão. Dessa maneira. em forma de ferradura.44 do-mar. a nova membrana é branca. O sulco de clivagem resultante se estende somente enquanto a bola não aparece do outro lado. dois aparelhos de fuso se formam entre quatro ásteres. Byers e Armstrong especulam que o domínio da membrana intensamente marcada. a membrana do sulco é um mosaico de diferentes partes. Novamente nós observamos que a divisão celular pode ocorrer sem divisão nuclear enquanto os ásteres estiverem presentes. a membrana da superfície externa do embrião e a membrana da borda principal do sulco de clivagem são altamente marcadas (mostrando serem as regiões originais da membrana). Isso demonstra claramente que se os dois ásteres estiverem próximos um do outro. uma bola de vidro foi usada para deslocar os ásteres do centro da célula em direção à periferia.B) Pela interrupção de um sulco de clivagem com uma bola de vidro. Essa nova membrana tem também propriedades de condutividade elétrica diferentes daquelas da membrana original. cria-se um novo sulco de clivagem. mas são gerados três sulco de clivagem! Cada braço da ferradura tem o seu próprio fuso mitótico e sulcos de clivagem como esperado. A borda do .44C). apesar de não haver fuso mitótico que o atravessa. mas um terceiro sulco aparece entre os dois ásteres no topo da ferradura (Figura 5. Byers e Armstrong (1986) radiorotularam componentes de membrana de ovos de Xenopus recém-fertilizados e seguiram a redistribuição dessas moléculas através da clivagem. o plano da terceira clivagem (que é normalmente paralelo ao equador do oócito) foi deslocado em 90o. por auto-radiografia. Rappaport (1961) estendeu esse tipo de experimento. Durante a primeira clivagem. Dessa maneira. Dessa maneira. (A. Serão essas membranas recém-sintetizadas ou são meras extensões da membrana celular do oócito? A resposta é que provavelmente ambos mecanismos contribuem para as membranas celulares internas.44. mas a maior parte da membrana do sulco é derivada de regiões que são inacessíveis aos marcadores de superfície. A membrana da parte onde o sulco termina é derivada de uma superfície externa preexistente do ovo. A Figura 5. pode-se alterar a direção do sulco de clivagem. com a mudança do local do fuso mitótico.D). Em ambos os casos.) A formação de novas membranas Nossa última consideração sobre clivagem embrionária envolve a formação de novas membranas celulares. Criação de um novo sulco de clivagem pelo deslocamento dos ásteres.45B). Embriões de anfíbios fornecem evidências que novos componentes da membrana estão sendo sintetizados durante a clivagem precoce. (de Rappaport. marcada.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 203 Zigotos (A) (B) Sulco de clivagem normal (C) Sulco extra de clivagem extra (D) Bola de vidro deslocando o aparelho mitótico Ásteres Interrupção do sulco de clivagem Fuso Figura 5. Na Figura 5.

cortesia dos autores. J. 3: 848-859. Rev. Chong. A. and Gross.. B de Byers e Armstrong. Danilchik. J. Letter to Asa Gray. 1988.-P. Adler. Ann. A. 1989. [p. Bement. Trans. Owen. Lond. 1988. Hymenoptera). 27: 432-445. Nature 339: 679-684 Craig. M. and Kessel. Development 104: 391-402. 1981. cdc2 is a component of the M phasespecific histone H1 kinase: Evidence for identity with MPF. 1996. 1974.204 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) Nova membrana não-pigmentada (B) Figura 5. 5: 699-711. E.. Sci. M. 1996). N. E.105] de Laat. Cruz. Int. D. R. Vol. J. D. dispostos radialmente. Cisek. B. A. Dev. Pensa-se que esses microtúbulos poderiam fornecer um caminho para o movimento de vesículas das membranas em direção ao lugar onde são inseridos na membrana (Danilchik e Funk. S. and Morrill. R. Rappolee. Pedersen. Genes Dev. A sterile defender morph in a polyembryonic hymenopteran parasite. Mammals 1: 31-67. Dev. and Fujisawa.. Khoo. P. and Armstrong. Boycott. Parallel pathways of cell cycle control during Xenopus egg activation. Darwin (ed. W. L. H. Z. J. M. Dev.. Henson. CO. W. 1972. and Blow. J. Bonder. B. Cotran. The Life and Letters of Charles Darwin. F. 1986. Patten’s Foundations of Embryology. M. Cellular arrangements and surface topography during early development in embryos of Ilyanassa obsoleta.. H.. M. 8: 167-170. Carlson. mas seus respectivos citoplasmas podem diferir significativamente. and Graham. Nature 294: 446-447. Int. The inheritance of sinestrality in Limnaea peregra (Mollusca: Pulmonata). Embryol. B. A. B. D. Reversal of cleavage in a sinistral gastropod. W. Crampton. Phosphorylation of RNA polyrnerase by the murine homologue of the cell-cycle control protein cdc2. D. Cada célula pode ter os mesmos genes nucleares. DNA synthesis in the preimplantation mouse embryo. Cell dynamics of the blastulation process in the starfish. 1860. Introduction to Embryology. L. L. R. M. M. 64: 279-290. C. 1986. Abstracts of the Sixth InternatI. 2. T. 1. Cruz.. Philadelphia. S. McGraw-Hill. Xenopus Conference. J. 1960.. J. R. 1986b. R. A nova membrana aparece clara porque não tem esses grânulos. 1991. 1980. G. D. também contém microtúbulos curtos.. Cell Biol. 5th Ed. Soc. Proc. Sea urchin morphogenesis and cell-hyalin adhesion are perturbed by a monoclonal antibody specific for hyalin. May 22. J. Reprod. and Beach. 1995. 1989. Am. J. No próximo capítulo veremos como esses blastômeros se locomovem e interagem um com o outro para iniciar a estrutura do corpo. Wind Rivers Lodge. Ann. Cell 55: 371-378. C. 1977. Actin in cytokinesis: Formation of the contractile apparatus. and Funk. H. 1981. Soc.Y.. Tang. Beams. Carson. Entomol. M. Acad. Borland. T. K. Estes Park. J. Am. Zool. J. J. J. Development of the polyembryonic parasite Copidosomopsis tanytmemus (Hymenoptera: Encyrtidae). C. C. 77: 328-339. M. G.. M. C.) sulco em embriões precoces de Xenopus. L. N. J.). J. and Julian. 79: 121-127. New York. Sci.. New York. R. Fishkind. The defender role of the precocious larvae of Copidosomopsis tanytmemus Caltagirone (Encyrtidae. and Begg. Biol. A superfície celular foi radiativamente marcada antes da divisão. Zool. and Werb. Brenner. 237: 309-318. H. Dan-Sohkawa. C. 1975. Asterina pectinifera. Genes for extracellular matrix-degrading metalloproteases and their inhibitor. Exp. Saunders. A. Mahbubani.. Cytol. Morphol. D. 1860. M. Nature 375: 418-421. Appleton. Cruz. Invert. Purification of an MCM-containing complex as a component of the replication licensing system. Freeze-fracture replication of junctional complexes in unincubated and incubated chick embryos. 1993.45 Formação de novas membranas na primeira clivagem do ovo de Xenopus.. and Capco. Acad. Darwin. 1974. and Bluemink. 1986. Meijer. Garstang.. P. Y. Cell Tissue Res. J.. D. LITERATURA CITADA Adeslon. Diver. Dan. P. 155: 97-106. 1976. G. Cytoembryology of echinoderms and amphibia. and Turner. Biol. Dev. 1894. Cytokinesis: A comparative study of cytoplasmic division in animal cells. Sci. Brizuela. P. D. R. Arion. Barlow. Transport processes in the mammalian blastocyst. and Humphreys. Heparan sulfate proteoglycan (perlecan) expression by mouse embryos during acquisition of attachment competence. Esses processos de clivagem dividem o citoplasma do zigoto em numerosas células.Y. (A) A membrana antiga tem grânulos de pigmento. Y. Natl. TIMP. P. 162: 235-252. USA 88: 5172-5176. 1930. Bellairs. Membrane protein redistribution during Xenopus first cleavage. [B] 219: 51-131. are expressed during early mammalian development. J. 1986a. 102: 2176-2184. Sci. H. L. In F. 9: 321-367. R. D. E. A. Y. 9: 209-228. 1981. C. (B) Auto-radiografia de proteínas de membrana no sulco da primeira clivagem. (A de Laat e Bluemink. New membrane formation during cytokinesis in . Byers. Philos. Breathnach. 1988. D. and Corden. Balinsky. J. A. S. Exp. M.

and Martin. Cell 21: 761-771.. M. R. pp. J. is necessary for timely exit from the cell cycle during Drosophila embryogenesis. M. B. H. C. 6: 461-468. N. Embryol. J. Cyclin in fission yeast. 1982. R. Embryol. Wu. Mitotic domains reveal early committment of cells in Drosophila embryos. C. Archenteron elongation in the sea urchin embryo is a microtubule independent process. Quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse embryo. Evans. P. P. and Kirschner. P. Helde. 1977. 1989. S. Development 120: 1503-1515. Fleming. Gurdon..) Epithelial Organization and Development. Acad. Cell 67: 197-211. Pratt. Academic Press. Dev. B. Determination during embryogenesis in mammals. Tilikainen. 1986. Lohka. J. 1939.. Rantanen. J. 45-57. Cell cycle tyrosine phosphorylation of p34cdc2 and a microtubule associated protein kinase hornologue in Xenopus oocytes and eggs.. MPF regulation during the embryonic cell cycles of Drosophila. Qasim. J. T. 14: 132-179. W. and Edgar. C.. A. 181: 73-87. M. Org. J. Exp. Hara. and Maller. J. Proc. K. Purified maturationpromoting factor contains the product of Xenopus homolog of the fission yeast cell cycle control gene cdc2. J. New York. B. M.. J. P. Experimental Embryology of Echinoderms. D. R. A functional test for maternally inherited cadherin in Xenopus shows its importance in cell adhesion at the blastula stage. 1973. W. A. P. Establishment in culture of pluripotent cells from mouse embryos. Tyrosine phosphorylation of the fission yeast cdc2 protein kinase regulates entry into mitosis. 1988. J. C. Edgar. T. K. 111-134. Hara.. A. 20: 401-414. Genet. Biol. K. and Feldman. B. H. Marcel Dekker. Schroder. Gautier. Eyal-Giladi. C. Odell. E. T. Tertoelen. 1992. 1988. 8: 440-453. Dacapo. Opin. and Nurse. Sibling rivalry and brood sex ratios in polyembryonic wasps. M. L. V. Fleming. W. B. J. Alexander (eds. Development 120: 49-57.. J.). Cyclin: A protein specified by maternal mRNA in sea urchin eggs that is destroyed at each cleavage division. C. Gen. 1992. Developmental control of a GI-S transcription program in Drosophila. 1987. R. In E.. and Strand. 98: 1247-1255. Cell 54: 739-740. M. Cell 54: 423-431. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF. 121: 253-262. Fleming. and Rossant. S. M. Early fusion of two human embryos? Ann. The generation of cell surface polarity in mouse 8-cell blastomeres: The role of cortical microfilaments analyzed using cytochalasin D. C and van der Biggelaar.. II. I. and Lundelius. Biol. A. A. Developmental Biology of the Sea Urchin Embryo. Duronio.. Nature 292: 154-156. New York. and Kelly. F. M. I P. M.. Development 107: 1-25.. 191: 69-83. J.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 205 normal and cytochalasin B-treated eggs of Xenopus laevis.K.. J. The effects of spatial arrangement of cell determination during mouse development. P. H. and Graham. A. 28: 263-278.. Ciba Found. 1983. M. Hillman. Morphogenesis of the sea urchin embryo. Heasman. de la Chappelle. Entwicklungsmech. Fullilove. C. and Maro B. 1991. Natl. Eyal-Giladi. F. J. I. and Hunt. Nurse. Cell. and Ingersoll. 1987. Biol. N. 40: 5-18. 189-262. Giudice. J. Distel. C.. 3: 143-166. and Nüsslein-Volhard. B. G. pp. Nuclear elongation and cytokinesis in Drosophila montana. Goodall.J.). Graham. Hörstadius. J. P. Nature 342: 39-45. B. L. Dev. 1972.. A. Cretekos. D. Edgar. Development 122: 795-804. Yoshidanaro. 193: 235-248. and O’Farrell. M. J. Solomon. B. S. Cold Spring Harbor Press. S.. R. E. M. and O’Farrell.. and Kaufman. E. Dev. Clarendon Press. M. Interactions between embryonic cells during early de- velopment of the mouse. 1994. Ettensohn. 95: 169-191. Hinegardner. 1973. T. 38: 63-75. 1980. Cell 33: 389-396. Dyce. London. 1964. M. The posterior section of the chick’s area pellucida and its involvement in hypoblast and primitive streak formation. and Kirschner. A. M.. Chapman and Hall. J.. Goebl. M. 1968. . Exp. W. P. R. T. Morphol. Wu. Cell Biol. 1996. M. Regulated replication of DNA microinjected into eggs of X. Letendre. C. The early embryonic development of the chick. R. P. and Grunwald. F. L. and Schubiger. C. The mechanics of sea urchin development.. A cyclin-dependent kinase inhibitor.. Goldstone. A cytoplasmic clock with the same period as the division cycle in Xenopus eggs. The developmental genetics of dextrality and sinistrality in the gastropod Limnea peregra. P. Development 116: 819-830. Ginsberg. Edgar. laevis.A. D. S. Rev. D. and O’Farrell. E. Cell 87: 1237-1247. J. V.. B. Cell 44: 365-372. a cytoplasmic regulator of mitosis. N. Gautier. Electrophysical observations. P. F. George.. 1989. 1994. Gergart. Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula. Zool. J. S. J. Changes in somatic nuclei inserted into growing and maturing amphibian oocytes.. E. Academic Press. 1971. Foe. Hörstadius.. Crit. Bazan. M. Genes Dev. Morphol. B. Science 265: 517-520. J.. Harland. G. H. 1974. 1976. C. 1977. Exp. Thomasson. M. Gerhart. Evans. P. Rosenthal. Symp. Biol. 1980. and Jacobson. Nature 287: 546-548. studied by operative methods. Rossomondo and S.. J. 60: 529-540. 1989. J. Embryol... Morphogenesis. Dunphy.. Youngblom. T. Carroll. 119: 520-531. Nature 360: 254-256. Hum. P. Cell Interactions in Differentiation. C. G. Bate. Trophectoderm biogenesis in the preimplantation mouse embryo. J.. Dorresteijn.. and Byers. Gulyas.. A. and Laskey. R. J. L. J. New York. Wilson. Norbury. J. Intercellular communication patterns are involved in cell determination in early muscular development. Freeman.. 1996. M.). C. A. Curr. A. Gardiner.. 1986. B. and Strand. In The Development of Drosophila melanogaster. Nagy. In M.. Mol. Debby. J. 1992.. A. Cell Res. and Fleming. Cell Biol. Polyernbryonic development: insect pattern formation in a cellularized environment. Kiehle. 1991. Exp. 1975. Dev. Cell 57: 177-187. Wilhelm Roux Arch. R. Morphol. Cell cycle control by the nucleo-cytoplasmic ratio in early Drosophila development. Foe.. S.C. K. W. cdc25 is a specific tyrosine phosphatase that directly activates p34cdc2. 1994. and Harel. 1987. Dev. The DNA synthetic period during early development of the sea urchin egg. Brizuela. Grbic. Sci. G. Saxén and L.. Gould. Fishing for genes controlling development. E. Oxford. pp. S. Biol. Pickering. Weiss (eds. P. Cold Spring Harbor. Granato. 36: 53-61. F. 26: 560-577. Ferrell. and Newport. D. de Nooij. 1992. Duronio. The cleavage pattern of the axolotl egg studied by cinematography and cell counting. Poultry Biol. Booher. and Kirschner. G. E. Tydeman... Wilhelm Roux Arch. T. 1991. M. M. and Hariharan. 1994. 1988. Do trophectoderm and inner cell mass cells in the mouse blastocyst maintain discrete lineages? Development 100:685-698. Fleming. K. 1994. 1984. and Robson. A. W. T. and Wylie. J. 1980. H. (ed. A reexamination of the cleavage patterns in eutherian mammalian eggs: Rotation of the blastomere pairs during second cleavage in the rabbit. Rev. (ed. Sherman. USA 77: 462-466. Biol. Rao. an epigenetic process. Cell dynamics of an M-phase-specific cytoplasmic factor in Xenopus laevis oocytes and eggs. Sanger. 11: 1965-1971. Sprenger.. Grbic. Mitosis and morphogenesis in the Drosophila embryo: point and counterpoint. Genetic control of cell division patterns in the Drosophila embryo. Leopold. G. M.. Exp. de Laat. 1996. F. Cell 54: 433-439. H. G. Hardin. Niemi. D. J. 1981. E. In T. Beach. L. KarkinenJaaskelainen.

Symp. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Xu. and Maro. J. Richardson. Newport. C. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II.A. D. M. J. S. Masui. Adaptation in cleavage. and Scherson. Cell 30: 675-686. C. 1992. C. A. Development 108: 581-594. In Biological Lectures of the Marine Biological Laboratory of Woods Hole. 1986. Perona. Lillie. K. Embryol. K. Cell 10: 237-243. Parker.). W. 1. J. and Fishman. Biol. A. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Goodall. D. 1984. D. Translation of cyclin mRNA is necessary for extracts of activated Xenopus eggs to enter mitosis. L. and Vaessin. Zool. Stainier. Nature 277: 210-211. and Kimmel. 1984. Lehner. Exp. Cold Spring Harbor Symp. Wilhelm Roux Arch. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Human chimaera detectable only by investigation of her progeny. 43-67. Mouse blastocysts hatch in vitro by using a trypsin-like proteinase associated with cells of mural trophectoderm. 1985. 1982b. M. B. 1902. 1970. and Schnedl. Cell 68: 323-332. M. B. M. and morphogenetic action. W. and Kirschner. M. Sunderland. Cell Biol. J. J. Y. and Kirschner. Murray. Boston. Martin. cdc25 encodes a protein phosphatase the dephosphorylates p34cdc2. L. H.. Langman. Organization of the cytoskeleton in early Drosophila embryos. Cell Biol. Donoghue. C.. Sauer. J.. D.. Wu. Mayr.D. Exp. Madine. Lee. and Petters. P. H. H. Ginn. 102: 1494-1509. as studied by the injection of centrosomes and nuclei into Xenopus eggs. BioEssays 17: 471-480. A. and PiwnicaWorms. N. Induction of early mitotic events in a cellfree system. 26: 37-49. Mintz. S. 1994. A. Pausch. Pedersen. Y. A. 1986. 108: 86-93. Blow. 1986. 1994. and Kirschner. K. Regulation of the cell cycle during Xenopus laevis development. R. In S. and Kirschner. M. W. pp. 1985. 1989. Johnson. H. and Morris. 1971. R. W. Cyclin-dependent protein kinases: key regulators of the eukaryotic cell cycle. M. Formation of the yolk syncytial layer. Development 120: 3361-3366. J. Solomon. Green (eds. K. Minshull. 1990. and Alberts. Endocardial progenitors are sequestered within the heart field. a cyclin-dependent kinase inhibitor. Cell 79: 475-486.. II. [Suppl. R. The events of the midblastula transition in Xenopus are regulated by changes in the cell cycle. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. Cell lineage of zebrafish blastomeres. MCM3 complex required for cell cycle regulation of DNA replication in vertebrate cells. Cardiovascular development in the zebrafish. Sardet. B.. B. W. M. 8: 759-764.. C. R. 1898. Dev. A role for cytoplasmic determinants in the development of the early mouse embryo. The interconversion of metaphase and interphase microtubule arrays. Morgan. W. pp. R. F. M. R. Alan R. spatial organization. Lane. and Murray. Assembly of SV40 chromatin in a cellfree system from Xenopus eggs. Williams & Wilkins. T. L. Development 119: 447-456. 14: 477-499. Int. Dev. C. Biol. M. Fert. D. and Law. and Lacy. Cell 77: 107-120. T. E. Lee. 1995. 124: 269-280.. J. H. Jan. J. Jessus. M. The role of self-assembly in the generation of biologic form. C. Exp. Copeia 4: 242-252. Biol.. C. Light microscopic observations. and Kimmel. Kane. 1989. Karr. H. A. 95: 213-237. M. Origin of the inner cell mass in mouse embryos: Cell lineage analysis by microinjection. Dacapo. 1978. E.]: 97-117. R. M. K. 1992. Dev. The nomenclature of early development in mammals.-Y. M. Mills.. Mark. 1987. Fleming. Signorelli. 1989. Control of the onset of transcription. and Markert. and Kirschner. Origin and organization of the zebrafish fate map.. Subtelny and B. 1971. J. Baltimore. A. Minshull. M. T. Nature 339: 275-280. M. Y N. J. Nature 339: 280-286. Cell 37: 731-742. Tonks. Kimelman. 150: 23-32. Sinauer Associates. D. M. 1981.206 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Inoué. and Hunt. M.. Adv. P. K. Trends towards non-aquatic and direct development in frogs.E. and Kirschner. Sun. B. 1941. J.. and Laskey. The relationship between cleavage and blastocoel formation in Xenopus laevis.. Indeterminate cell lineage of the zebrafish embryo. 1986. Embryology of Insects and Myriapods.B. R. 1993. The midblastula transition in zebrafish. M.. W.F. 43: 221-227. Clonal expression in allophenic mice. Developmental Order: Its Origin and Regulation. Joharnnsen. J. The timing of compaction: Control of a major developmental transition in mouse early embryogenesis. Lee. Johnson. R. B. and Schilling.. The embryology of fish. Cell 48: 399-407. Kimmel. Saint. R. M. and Beach. Manufactured hexaparental mice show that adults are derived from three embryonic cells. Kalt. Quant. I. T. 114: 42-52. Differentiation without cleavage in the egg of the annelid Chaetopterus pergamentaceous. B. Cell 41: 165-175.. G. D. R. 1996. Morphol. Lillie. Mol. Science 202: 56-58. W.. Dev. Sauer. Biol. T. Cyclin E controls S phase progression and its downregulation during Drosophila embryogenesis is required for the arrest of cell proliferation. Newport. Embryology: Constructing the Organism. 117: 581-595. Johnson. stops cell proliferation during Drosophila development. Newport. F. F.. Wallace. Mills. R. .. Nature 335: 251-254. A. Cell Biol. Miake-Lye. 1996. Chisholm. and Batakier. Entwicklungsmech. and Warga. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. P. Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea urchin embryo. Mulnard. Kimmel. New. Warga. McGrawHill. O. 1982. Oscillation of MPF is accomplished by periodic association between cdc25 and cdc2-cyclin B. C. Nieuwkoop. M. R. Cell 3: 73-84. M. T. J. Langeland. New York. Levy. J. C. E. R. Morphol. N.. Reprod. Experimental Embryology. The “organization center” of the amphibian embryo: Its origin. W. D. (Liege) 78: 107-138. Jones. 1981.. Weinstein. J.. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. and Selwood. Lepage. Org. Liss. Biol. Characterization and timing of cellular changes at midblastula stage. 9: 15. M. H. Morphol.). B. Sci. 1927. Acad. F. 1986.. Embryol. Maller. 177: 129-146. F.. Cell 56: 947-956.. R. T. G.. An inserted mutation in a transgenic mouse line results in developmental arrest at day 5 of gestation. USA 78: 7634-7638. C. M. Markert. R. J. E. W. J. 1987. J. Nature 375: 421-424. Ogg. Cell 30: 687-696. L.. C. Arch. Morphol. The formation of subblastodermic fluid in hens’ eggs. A. and Nurse. W. Morphogenet.. S.. and Gache. A. Knoblich. Columbia University Press. 1987. Natl. J. R. Medical Embryology. 98: 1730-1745. R. F. Embryol. B. M. 50: 453-463. Embryol. and Houliston. V. Cell 87: 1225-1235.. C. II. Biol. Dev. 1994. Kirschner. Lutz. H.H. In S. H. 1973. A. Dev. M. C. Complementation used to clone a human homologue of the fission yeast cell cycle control gene cdc2+. M. 4th Ed. K. 10: 1-39. W. H. Exp. W. Analyse microcinematographique du developpement de l’oeuf de souris du stade II au blastocyste. C. 1995. 1985. Kimmel. 1997. 1977. Raunio (eds. 1947. and Wassarman. Exp. 1979. NY. Hubble. and Butt. Biol. Soc. Newport. T. A. W. J. Nigg. D. 35-76. L. Proc. Biol. R. 1992. Khoo. Murray. P. 1967. MA.. and Lehner. 1956. M. J. Laskey. L. H. Karsenti. 1982a.. J. New York. Gilbert and A.. P. and Kirschner. W.

M. B. R. J. R. Hyafil. Cell lineage and ancestral reminiscences. J. F. Smith. 1983. 1884. The yolk syncytial layer of Fundulus: Its origin and history and its significance for early embryogenesis. Science 58: 269-270. pp. Some phenomena of fertilization and cell division in etherized eggs. Cell Biol. J. 13: 353-395. and Fordham. R. 1993. and Haegel. Y.. M. C. P. 21-42. 1989. Kirschner... Naturwissenschaften 39: 355-356. Acad. J.. K. 1952.). 1990. D. 1982. Solomon. Wiley. Sturtevant. R. E. Dorée. In H. Cell 54: 738-739. J. M. J. Scherson. van den Biggelaar. R. Biol. not nuclei. W. Activation of protein kinase C triggers premature compaction in the 4-cell stage mouse embryo. 29-51. Academic Press. Yamazaki. Embryos. Raff. Y. Hunt. and Kaufman. R. 1961. A. Biol. Zool. S. E. Cell 57: 611-619. D. and Sherman. 1988. W. J. Exp. Tarkowski. Schejter. Watanabe. Cytoplasmic determinants of tissue differentiation in the ascidian egg. Exp. Cell surface interactions induce polarization of mouse 8-cell blastomeres at compaction. E. Embryol. Dev. J. Subtelny and 1. and Stonebraker. Cell 75: 373-385. E. R. Amos. M. Exp.. USA 80: 6274-6277.. 1969. Farrell. Jr. 89: 362-378. A. 1993. and Jacob. Prather. NatI. Am. Lohka. Mussels on the move. K. Nuclear transfer in mammals and amphibia. 18: 155-180. Arch. 5: 180-186. II. R. Cell Res. J. Biol. and Guerrier. T. 122: 577-601. H. W. C. Inner cell allocation in the mouse morula: The role of oriented division during fourth cleavage. E. H. A. M. Cell Biol. 1979. 1976. Exp. H. 1969. Dorsoventral polarity and mesentoblast determination as concomitant results of cellular interactions in the mollusc Patella vulgata. and vital role in cleaving Arbacia eggs. and cell arrangements during and following fourth cleavage period in the sea urchin. 1990. Cell 9: 231-240. Cyclin in fission yeast. D. In Biological Lectures of the Marine Biological Laboratory of Woods Hole. 53: 419-434. B. R. G. Trinkaus. Growth Diff.. M. G. 105: 330-342. Ziomek. Nature 352: 247-249. 1983. Cell Biol. M. Wilson. Konigsberg (eds.. Biol. G. J. H. E. J. Sze. Genes. E. and Sagata. 1972. 13: 687-696. 19: 281-309. 105: 41-48. R. David. Dev. J. and Johnson. E. 1923. 1989. volumetric changes. Reeve. Activation of the various cyclin/cdc2 protein kinases. Peyrieras. P. pp. K. C. Morphol.. 118: 595-605. 1990. L. C. M. Biol. M. Wolpert. Identification of cell cycle-regulated phosphorylation cites on nuclear lamin C. A. D. of the Drosophila embryo. 1980. D. L. Swenson. 1991. Reich. Die Entwicklungspotenzen einer isolierten Blastomere des Zweizellenstadiums im Säugetierei. Inheritance of direction of coiling in Limnaea. Rugh. C. C. B. Proc. Pratt. T. Smythe. Org. 1993. M. Wilhelm Roux Arch. Schatten (eds. 1989. M. 1993. Strickland. Piston. Determining its brief existence. 1990. M. M. Ginn. and Clegg. 1967. Ges. Nakagawa. Bottleneck acts as a regulator of the microfilament network governing cellularization. Springer-Verlag. I.. Ward. 70: 113-132. Zool. L. Y. Exp. K. P. Morrill. Uvomorulin: A non-integral membrane protein of early mouse embryo. Satterwhite. 1972. J. Dev. Zool. Cisek. 1986. Exp. 30: 280-300. P. K. and Evolution: The DevelopmentalGenetic Basis of Evolutionary Change. III. Sutherland.. 265: 258-284. 1984. New York. initiate pole cell formation in Drosophila embryos.H. and Glover.. Role of the oocyte nucleus in the physiological maturation in Rana pipiens. Biol. 323-340. W. Illustrated Human Embryology. Quantitative changes in total RNA. N. Cell constriction: Contractile role of microfilaments in division and development.... Uber die Einwirkung der Schwerkraft und anderer Bedingungen auf die Richtung der Zeiltheilung. New York. M. T. L. E.. 148: 81-89. T. Piko. Biol. K. 1901. An electron microscope study of the development of the blastula of the sea urchin embryo and its radial polarity. G. Morphol. L. V. Winkel. Schroeder. 1983. J. Curr. . and Beach. Lytechinus variegatus. A. Rappaport. Dev. L. Wolpert. Cell 47: 861-870.. L. Physiol. New York. I. New York. Ikawa. Solomon . S. cytokinesis. The contractile ring. Boston. B. J. Welsh. E. Seidel. Cell Biol. Marko. E. 249: 347-349. In S. W. B.. L. M. Determinants of Spatial Organization. 1993. A. New York. J. 1982. G. Lee. Analysis of compaction in the preimplantation mouse embryo. M. Coupling of mitosis to the completion of S phase in Xenopus occurs via modulation of the tyrosine kinase that phosphorylates p34cdc2. Development 119: 31-40. II... Cell 61: 561-577. E. 35: 41-57. Experiments concerning cleavage stimulus in sand dollar eggs. 1953. Ziomek. Stainier. 1987.. 1973. Exp. Raff. Dev. Academic Press. Zool. J. 100: 327-338. L. and Calarco. Burgess. Compaction of the mouse embryo: An analysis of its components. J. L.. Sutherland. total poly(A). 1963. R. T. Hist. H. Ferguson. Entwicklungsmech. Changes in the amount of deoxyribonucleic acid in the development of Rana pipiens. F. A. M. W.. Leith. J. P. and Nuccitelli. F. M. The effect on cleavage of artificial obliteration of the first cleavage furrow. Developmental Biology. E. T. Centrosomes. Wilson. J. and Wieschaus. T. G. The Mouse. Saunders.. Studies in the cellular basis of morphogenesis of the sea urchin embryo: The formation of the blastula. Macmillan. E. N. D. Independent inactivation of MPF and cytostatic factor (Mos) upon fertilization of Xenopus eggs. 1982. L. Vol. Ploegh. L. White. Cell 21: 935-942. Dev. K. and Pollard. A. 1. J. 3: 4. and Newport. J. J. and Ruderman. Macmillan. Development of blastomeres of mouse eggs isolated at the 4. A. M. and Wróblewska. Takeichi. 1979. T. The clam embryo protein cyclin A induces entry into M phase and the resumption of meiosis in Xenopus oocytes. Wilson. Whittaker. D. Z. Embryol.). D. and Kirschner. Summers.. Sci. 1992. A. The Molecular Biology of Fertilization. pp.. In vitro disassembly of the nuclear lamina and M phasespecific phosphorylation of lamins by cdc2 kinase. 1967. Minneapolis. P. and Calarco-Gillam. and ribosomes in early mouse embryos. 138: 1-15. Sites of zona pellucida shedding by mouse embryo other than mural trophectoderm. M. Experiments in cytology. Tuchmann-Duplessis. J. J. Plasminogen activator in early embryogenesis: Enzyme production by trophoblast and parietal endoderm. Cardiovascular development in the zebrafish. 78: 56-59. E. D.and 8-cell stage. Myocardial fate map and heart tube formation. and Ecker. J. Louvard. 1992. Pflüger. H. Opin. Zool. Cell 68: 787-797. Dev. and Mercer. J. and Johnson. Cell Res.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 207 Peter. W. Speed. T. K. P. Schroeder. 25: 374-382. and Fishman. A stereometric analysis of karyogenesis. 1961. 1898. An evaluation of confocal versus conventional imaging of biological structures by fluorescence light microscopy. and Nigg. Dev. 137: 13-25. Labbé.. Cell 61: 591-602. R. Nat. C. Schatten and G. H. and Gustafson. Y.. 68: 462-471. N.. Phosphorylation of myosin-II light chain by cyclin-p34cdc2: A mechanism for the timing of cytokinesis. and Kato. Exp. Booher. Cavitation in the mouse preimplantation embryo: Na/K ATPase and the origin of nascent blastocoel fluid.

.

mas é a gastrulação que é verdadeiramente a parte mais importante de nossa vida. essas células recebem novas posições e novos vizinhos. Os movimentos da gastrulação envolvem o embrião inteiro. • Involução.. e é estabelecido o multifacetado plano do corpo do organismo. Ao considerarmos gastrulação em diferentes tipos de embrião. A blástula consiste de numerosas células. e migrações celulares em uma parte do organismo gastrulante devem estar intimamente coordenadas com outros movimentos ocorrendo simultaneamente. devemos levar em conta as seguintes questões (Trinkaus.Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 6 Meu querido amigo. • Ingresso de células. Não ousaríamos sequer conceber as coisas que são meros detalhes da existência. • Delaminação. Mesmo que o padrão de gastrulação seja extremamente variado em todo o reino animal. de modo a se espalhar na superfície interna das células externas remanescentes. O movimento de camadas epiteliais (usualmente de células ectodérmicas) que se espalham como uma unidade e não individualmente. reorganizam as células da blástula. geralmente. A separação de uma camada celular em duas ou mais camadas mais ou menos paralelas. 1984a): • Qual é a unidade da atividade migratória? É a migração dependente do movimento de células individuais. Durante a gastrulação. CONAN DOYLE (1891) Não é o nascimento. o palco está montado para as interações desses tecidos recémposicionados. A internação ou movimento de interiorizarão de uma camada externa em expansão.. O dobrar para dentro de uma região de células. de maneira semelhante à cavidade formada quando se empurra com o dedo a superfície de uma bola de borracha macia. envolve os seguintes tipos de movimentos: • Epibolia. As células que formarão os órgãos endodérmicos e mesodérmicos são trazidas para dentro do embrião. as três camadas germinativas – ectoderma externo. A migração de células individuais da camada superficial para o interior do embrião. ao passo que as precursoras da pele e do sistema nervoso são distribuídas na superfície externa. Ainda. para envolver as camadas mais profundas do embrião. endoderma interno e mesoderma intersticial – são produzidas inicialmente durante a gastrulação. A gastrulação. ou são as células parte de uma camada migrante? Por mais extraordinário que possa parecer. LEWIS WOLPERT (1986) G ASTRULAÇÃO é o processo pelo qual movimentos altamente integrados de células e tecidos. relativamente poucos mecanismos estão envolvidos. o casamento ou a morte. Assim. propriedades migratórias regionais podem ser totalmente controladas por fatores citoplasmáticos que 209 .. cujas posições foram estabelecidas durante a clivagem.. A. dramaticamente. a vida é infinitamente mais complexa do que qualquer coisa que a mente humana possa imaginar. • Invaginação.

F. a epibolia pode ser (pelo menos em alguns aspectos) independente das células que formam a região migratória. Muitos eventos do desenvolvimento precoce ocorreram mesmo na ausência de células. de uma maneira muito parecida à epibolia das células do hemisfério animal durante o desenvolvimento normal. óvulos do anelídeo Chaetopterus e suprimir sua clivagem. observaremos os vários padrões de gastrulação encontrados em equinodermos. e os cílios se diferenciaram nas partes apropriadas do ovo. 9 horas).2. partenogeneticamente. ao contrário uma cena típica é aquela em que um pobre coitado está debruçado sobre este texto às 2. Essas células apresentam movimentos de vibração em suas superfícies internas. As 64 ou mais células mesenquimatosas primárias do ouriço-do-mar são as descendentes dos quatro blastômeros que se formaram pela quarta clivagem assimétrica. anfíbios. 9-10 horas). estendendo e contraindo longos e finos processos (30x5 µm) chamados filopódios. o citoplasma claro externo migrou para baixo em direção à região vegetativa.2 mostram o destino das várias regiões do zigoto enquanto ele se desenvolve através da clivagem e da gastrulação na larva pluteus. O citoplasma do zigoto se separou em regiões definidas. característica dos ouriços-do-mar. No centro dessa placa vegetativa achatada. ou são os dois movimentos independentes? • Existe uma expansão ativa do tecido total. Lembre-se do alerta feito pelo pesquisador de gastrulação. Por exemplo. examinando desesperadamente as figuras para ver se ele ou ela podem entender o que está se passando”. durante a gastrulação. o seu hemisfério vegetal começa a se espessar e achatar (Figura 6.1 e 6. ou é a margem limitante que se expande e arrasta o resto da camada celular. . Ainda mais. Gastrulação é (como diz Wolpert na citação no começo deste capítulo) a época mais importante da sua vida. Ray Keller (comunicação pessoal) “Estudantes NÃO deveriam ler esse material apressadamente. O destino de cada camada pode ser visto através de seus movimentos durante a gastrulação. As Figuras 6. conseqüências de mudanças nas propriedades da superfície celular. No *A discussão da gastrulação de Drosophila será transferida para o Capítulo 14.30 horas da madrugada com uma xícara de café. Vale a pena examiná-la criticamente e apreciá-la vagarosamente. ou às forças extrínsecas que a estendem ou a distorcem? É essencial conhecer a resposta a essa pergunta se queremos entender como os vários movimentos celulares da gastrulação são integrados. Logo após a eclosão da blástula da membrana de fecundação. Essas células são chamadas de mesênquima primário e são derivadas dos micrômeros. R. um aglomerado de pequenas células começa a se modificar. Lillie (1902) conseguiu ativar. As células então se dissociam da monocamada epitelial e ingressam na blastocele (Figura 6. Essas células derivadas de diferentes regiões do zigoto têm tamanhos e propriedades diferentes. Gustafson e Wolpert (1961) usaram filmes com exposição contínua para seguir os movimentos microscópicos das células mesenquimatosas dentro da blastocele.210 PARTE II Padrões de Desenvolvimento são independentes da celularização. tais como adesividade ao substrato ou a outras células? Considerando essas questões. Ingresso do Mesênquima Primário FUNÇÃO DAS CÉLULAS PRIMÁRIAS DO MESÊNQUIMA. Isso ocorreu precisamente no momento em que ocorreria a epibolia durante a gastrulação. estão as células involutivas puxando as células epibolizantes para baixo em sua direção. peixes. • A expansão ou dobramento de uma camada celular deve-se a fatores intrínsecos próprios. Gastrulação em ouriço-do-mar A blástula do ouriço-do-mar consiste de uma única camada de mais ou menos 1000 células.2. passivamente? • São as mudanças na forma e na motilidade celular. aves e mamíferos*. quando ela ocorre no contexto da formação do eixo. Assim.

(I) Blástula com mesênquima primário. (H) Blástula tardia com tufo ciliar e placa vegetal achatada. 12 hs. Figura 6. (J) Gástrula com mesênquima secundário. O tempo mostra a duração do desenvolvimento a 25oC.5 hs. (N) Fotomicrografia de uma larva pluteus viva de ouriço-do-mar. seguindo o destino das camadas celulares da blástula. 9. (L.1 Desenvolvimento normal do ouriço-do-mar. 10 hs. Watchmaker.5 hs. (A-F) Clivagem até o estágio de 60 células (omitindo o estágio de 2-células).) . Os destinos do citoplasma zigótico podem ser seguidos pelas variações no sombreamento.) (Vista ventral) (N) Boca Bastonetes esqueléticos Ânus 9 hs. 10.5 hs. 11 hs. 13.M) Larva pluteus. (G) Blástula precoce com cílios.5 hs. 17 hs. 13 hs. (Cortesia de J.2 15 hs. Seqüência completa da gastrulação em Lytechinus variegatus. Morrill. N cortesia de G. (A-M segundo Hörstadius.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 211 Animal (A) (B) (C) Mesômeros (D) (E) (F) (G) Macrômeros Vegetal Tufo ciliar (I) Mesênquima secundário Mesênquima primário Endoderma invaginante Micrômetros veg1 veg2 (K) Estomodeu (boca) Envoltório ectodérmico Bastonetes esqueléticos (mesoderma) Intestino (endoderma) (L) (Vista lateral) (H) (J) (M) Figura 6. (K) Larva em estágio prismático. 11. 18 hs. 1939.

um padrão similar de ligação. todas as fotografias. 1992) sugerem que a migração inicial das células mesenquimatosas primárias é dirigida pela parede da blastocele e pelas fibrilas paralelas do material da matriz extracelular que invadem a blastocele. essas células tornam-se localizadas dentro da provável região ventrolateral da blastocele. ativamente produzindo e quebrando conexões filopódicas com a parede da blastocele. ao longo da superfície interna da blastocele. à lâmina basal e a outras células. cortesia dos autores. Os micrômeros da blástula mostram. As células mesenquimatosas primárias parecem migrar ao longo da superfície da blastocele e são envolvidas no emaranhado dessas fibrilas (Figura 6. Em 1985. Originalmente todas as células da blástula estão ligadas pela sua superfície externa à camada hialina e sua superfície interna ligada à lâmina basal secretada pelas células (veja Capítulo 3). . (D) Colocação das células mesenquimatosas primárias na larva precoce de Lytechinus variegatus.1).3). as células mesenquimatosas primárias se fundem em cordões sinciciais.4). 1985.212 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) Figura 6. IMPORTÂNCIA DA LÂMINA EXTRACELULAR NO INTERIOR DA BLASTOCELE. B e C de Morrill e Santos. (A) Células mesenquimatosas primárias da gástrula precoce se alinham e se fundem para depositar a matriz da espícula de carbonato de cálcio. Estudos mais recentes (Cherr et al. Fink e McClay verificaram que os futuros ectoderma e endoderma (descendentes dos macrômeros e mesômeros. o padrão de ligação dos micrômeros muda na gastrulação. mas aderem fracamente à lâmina basal (Tabela 6. Gustafson e Wolpert (1967) propuseram um modelo no qual o ingresso dos micrômeros se dá através de modificações de sua adesão a outras células e às matrizes extracelulares que os rodeiam. Finalmente. que formarão o eixo das espículas de carbonato de cálcio do esqueleto larval (Figura 6. cada célula tem outra célula como vizinha.) (C) Agregados Ventrolaterais começo. onde considera-se que sua aderência seja maior. Cadeia dorsal (D) Cadeia ventral Espícula Os eventos que se dão no citoplasma e na superfície celular são fundamentais para o ingresso e a migração das células mesenquimatosas primárias. Na sua lateral. em relação à camada hialina..3 Formação dos cordões sinciciais por células mesenquimatosas do ouriço-do-mar. Fink e McClay confirmaram as especulações de Gustafson e Wolpert. Aqui. A metade animal e todo o arquêntero foram removidos. (A e D de Ettensohn. 1990. as células parecem se movimentar ao acaso. Entretanto. respectivamente) se ligam fortemente entre si e à camada hialina. originalmente. medindo as forças de adesão dos blastômeros de ouriço-do-mar. (C) Anel de células mesenquimatosas em volta do arquêntero (intestino primitivo). (B) microfotografia eletrônica de varredura de espículas formadas pela fusão das células mesenquimatosas primárias para formar os cordões sinciciais.

atraídos pela lâmina basal. Cherr. As fibrilas da matriz extracelular da blastocele ficaram paralelas ao eixo animal-vegetal e estão intimamente associadas com as células mesenquimatosas primárias. enquanto que sua afinidade aos componentes da lâmina basal e matriz extracelular aumenta 100 vezes.8 x 10-5 1. as precursoras do mesênquima primário perdem sua afinidade a essas estruturas (para aproximadamente 2% do valor original). (B..2 x 10-7 5. As modificações na afinidade celular foram Tabela 6. Essa mudança na afinidade faz com que os micrômeros percam suas ligações com a camada hialina externa e com as células circundantes e. ou monocamadas celulares.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 213 (A) (B) Figure 6. A força de deslocamento é calculada pela força centrífuga necessária para remover as células teste do substrato. (A) Células mesenquimatosas primárias enredadas na matriz extracelular da gástrula precoce de Strongylus centrotus. cortesia de G.5).0 x 10-5 Lâmina basal 5.0 x 10-7 Fonte: Segundo Fink e McClay. 1985. lâmina basal extracelular.C) migração de células mesenquimatosas em estágio de gástrula. 1992. As placas foram invertidas e centrifugadas a várias forças para deslocar as células.2 x 10-7 5. . (de Cherr et al.8 x 10-7 1. migram para o interior da blastocele (Figura 6.8 x 10-5 1.0 x 10-5 4.5 x 10-5 5.4 Fotografias ao estéreo-microscópio eletrônico de varredura de células mesenquimatosas primárias dentro da matriz extracelular de fibrilas da blastocele. a Células testadas foram colocadas em placas contendo hialino.1 Afinidades de células mesenquimatosas e não-mesenquimatosas aos componentesa celulares e extracelulares Força de deslocamento (em dinas) Tipo celular Micrômeros em estágio de 16 células Células mesenquimatosas em estágio migratório Ectoderma e endoderma gastrular Hialino Monocamadas de células gastrulares 6.) (C) Enquanto outras células mantêm sua forte ligação à camada hialina e às células vizinhas.

uma vez dentro da blastocele. B. O segundo grupo de moléculas consiste de proteoglicanos sulfatados encontrados na superfície das células mesenquimatosas ingressantes (veja Capítulo 3.. Uma é a fibronectina. Em dois sítios perto do futuro lado ventral da larva. Bloquear ECM18 com anticorpos previne tanto a migração mesenquimatosa primária quanto a invaginação secundária do endoderma (Berg et al. há uma alta concentração de material da lâmina extracelular ao redor das células mesenquimatosas primárias ingressantes (Galileo e Morrill. 1972. Se a síntese (ou sulfatação) desses proteoglicanos é inibida. Cherr et al. As células mesenquimatosas primárias se organizam em forma de anel em uma posição específica ao longo do eixo animal-vegetal. é encontrada nas matrizes extracelulares das células da blastocele e é expressa somente durante a gastrulação.. ECM18. 1985. Essas células perdem suas afinidades pelo hialino e por seus blastômeros vizinhos enquanto adquirem afinidade pela lâmina basal. . 1985). ele não podia entender o porquê. incluindo aquela da blastocele do ouriço-do-mar (Wessel et al. uma grande glicoproteína (400-kDa). Três proteínas parecem ser importantes nessa migração. 1985). 1985. Morrill e D. Na época.214 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Matriz extracelular fibrilar Blastocele Lâmina basal Células Mesenquimatosas primárias (A) Camada hialina Cílios (B) (C) (D) (E) Figure 6. pode estar guiando as células em sua migração. Fink e McClay mostraram que durante a gastrulação. as células mesenquimatosas primárias parecem migrar ao longo da matriz extracelular da parede da blastocele.4. Porém. A terceira proteína. Se um micrômero marcado de outro embrião é injetado na blastocele em gastrulação de um embrião de ouriço-do-mar. extendendo seus filopódios a sua frente (Galileo e Morrill.. esses sinais de orientação não são suficientes. ele migra para o local correto *Em um dos primeiros experimentos em embriologia química. 1996). Lane e Solursh. Flaherty. pois os micrômeros “sabem” quando parar seu movimento e formar espículas perto do equador da blastocele. Karp e Solursh. (F) Montagem de micrografia eletrônica de varredura mostrando o ingresso de células primárias de Lytechinus variegatus. 1974. a afinidade dos micrômeros por essa molécula específica aumenta dramaticamente.6. 1987). as células mesenquimatosas entram na blastocele. Karp e Solursh. ao longo do eixo animal-vegetal.3). 1992). Curt Herbst (1904) observou que embriões de ouriço-do-mar não gastrulavam adequadamente quando colocados em água do mar que não continha íons sulfato.) (F) correlacionadas com modificações nas moléculas da superfície celular que ocorreram durante esse período (Wessel e McClay. (F cortesia de J. Sugiyama. 1991). A orientação das fibrilas. (A-E) Diagramas interpretativos descrevendo alterações nas interações adesivas nas presumidas células mesenquimatosas primárias (cor). Blastômeros não-mesenquimatosos retêm suas originais afinidades pelo hialino e células vicinais. que é um componente comum das lâminas basais. Como mostra a Figura 6. Além disso.. muitas dessas células mesenquimatosas primárias se agrupam para iniciar a formação de espículas (Figura 6. 1984).5 Ingresso de células mesenquimatosas primárias. mas não continuam a migrar* (Figura 6. Anstrom et al.

a partir do ectoderma (Malinda et al.6 Efeito da privação de sulfato no movimento do mesênquima primário do ouriço-do-mar Lytechinus. Solursh. (A) Gástrula normal.7 Videomicrografia de Nomarski mostrando um filopódio longo e fino estendendo-se de uma célula mesenquimatosa primária até a parede ectodérmica da gástrula. 1986). mudanças importantes estão ocorrendo nas células que permanecem na Figura 6. 1995. esses parecem explorar e sentir a parede da blastocele (Figura 6. Considera-se que essa informação posicional é fornecida pelas futuras células ectodérmicas e suas lâminas basais (von Übisch.. (de Miller et al. Em lugar disso.. cortesia de M. Miller e colegas (1995) observaram a existência de filopódios extremamente delgados (0. 1939. 1980). McClay. essas repetirão os estágios iniciais de sua migração. Esses filopódios contêm actina e não são considerados como locomotores. 1974. Se células mesenquimatosas primárias de embriões mais velhos são injetadas em gástrulas mais jovens.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 215 (A) (B) Figura 6. Primeiro estágio da invaginação do arquêntero Enquanto se forma o anel de células mesenquimatosas primárias no pólo vegetal da blastocele. elas atrasarão sua diferenciação. Essas extensões delgadas podem ser responsáveis pela captação de sinais modeladores dorsoventral e animal-vegetal. da mesma maneira que os filopódios nas pontas dos cones de crescimento axonal.) e contribui para a formação das espículas embrionárias (Prancha 35). (B) Gástrula anormal formada quando embriões são cultivados em água do mar livre de sulfato.7). normalmente (Ettensohn. 1995). 1990). Os filopódios mesenquimatosos estendem-se através da matriz extracelular e contatam diretamente a membrana celular das células ectodérmicas.3 µm de diâmetro) no mesênquima esqueletogênico (skeletonogenic). fotografia cortesia de D. formando um anel mesenquimatoso e o esqueleto. assim como um filopódio mais curto estendendo-se para dentro do ectoderma. migrarão como as células mais jovens e serão incorporadas normalmente no mesênquima do hospedeiro. (de Karp e Solursh. Harkey e Whiteley.) . são considerados como sensores do ambiente. Somente células mesenquimatosas primárias (e não outros tipos de células ou partículas de látex) são capazes de responder a esses sinais modeladores (Ettensohn e McClay. Além disso. se todas as células mesenquimatosas do hospedeiro são removidas antes da injeção de células mesenquimatosas mais velhas.

não entumece. Microvilosidades da placa vegetal estendem-se através da camada hialina e seu citoplasma contém vesículas secretoras que armazenam um proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG). portanto. A região invaginada é chamada de arquêntero (intestino primitivo) e sua abertura no pólo vegetal chamada de blastóporo.8B. 1991). ao qual está fixado. No estágio de blástula. (A) Figura 6. enquanto a lâmina externa. Essas células permanecem ligadas umas às outras e à camada hialina do ovo. e uma interna.) (B) (C) Células da placa vegetal empurradas para cima Blastocele interior Células de placa vegetal Camada hialina Lâmina interna Lâmina externa Microvilosidades Vesículas secretoras com proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG) CSPG secretado para a lâmina interna absorve água. na verdade. Um pouco mais tarde. repentinamente. Figura 6. também.5-11. (A) Invaginação da placa vegetal de Lytechinus variegatus vista por micrografia eletrônica de varredura da superfície externa da gástrula precoce. Essa molécula higroscópica (absorvente de água) incha a lâmina interna mas não a externa. cortesia de J.5 horas. causando tumefação . B. 10.. A camada hialina é.. as fibropelinas já formaram um envoltório.8 Invaginação da placa vegetal. 1993. Isso causa o envergamento da camada hialina (Figura 6. que a placa vegetal se dobra para dentro e se estende por um quarto ou até a metade do seu caminho para a blastocele (veja Figura 6. Isso ocasiona a curvatura para dentro do envoltório hialino e do epitélio a ele ligado. a invaginação cessa. São secretadas desses grânulos após a liberação da proteína hialina pela exocitose granular cortical. (C) Os grânulos de armazenamento secretam o proteoglicano para dentro da lâmina interna da camada hialina.216 PARTE II Padrões de Desenvolvimento placa vegetativa. composta de proteínas fibropelinas* (Hall e Vacquier. sobre a superfície do embrião. formada de duas lâminas: uma externa. Então.C). 1982. Morrill e C segundo Lane et al. Quais forças atuam para invaginar essas células? Lane e colaboradores (1993) mostraram que o envergamento é semelhante aquele produzido pelo aquecimento de uma faixa bimetálica. Verifica-se. O blastóporo está claramente visível. uma *Fibropelinas são armazenadas em grânulos secretores dentro dos oócitos. Bisgrove et al. 1985. (A de Morrill e Santos.8A). e se movem para ocupar os vazios deixados pelo ingresso do mesênquima. formada primariamente de proteína hialina. (B) a camada hialina consiste de lâminas internas e externas. diretamente abaixo delas. O proteoglicano absorve água e entumece a lâmina interna. As células da placa vegetal (e somente essas células) secretam um proteoglicano de condroitina sulfato na lâmina interna da camada hialina. a placa vegetal se achata ainda mais.2. tipo rede.

Após uma breve pausa.9). o arquêntero precoce tem 20 a 30 células ao redor de sua circunferência. que se formam na ponta do arquêntero e lá permanecem (veja Figura 6.9 blastóporo Rearranjo celular durante a extensão do arquêntero em embriões de ouriço-do-mar. Esse fenômeno. ao mesmo tempo. Figura 6. Durante essa fase. 13 horas.10 (A) (B) Estágio de gástrula intermediária do ouriçodo-mar Lytechinus pictus. 1990. 1991). 1985. o arquêntero se estende dramaticamente. levá-lo adiante é chamado extensão convergente. mostrando extensões de filopódios do mesênquima secundário estendendo-se da ponta do arquêntero até a parede da blastocele. Em pelo menos algumas espécies de ouriço-do-mar. (B) Cabos de filopódios conectando a parede da blastocele à ponta do arquêntero. as células do arquêntero se reorganizam migrando umas sobre as outras e sofrendo um achatamento (Ettensohn. Mais tardiamente na gastrulação.10).CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 217 Gastrulação precoce Gastrulação tardia Figura 6. Nessa espécie.) segunda força resultante dos movimentos das células epiteliais adjacentes à placa vegetal. A tensão nos cabos pode ser avaliada pela tração exercida sobre a parede da blastocele no ponto de fixação. (A) Células mesenquimatosas estendendo filopódios da ponta do arquêntero. (Fotografias cortesia de C. Essa última fase é iniciada pela tensão propiciada pelas células mesenquimatosas secundárias. Hardin e Cheng. 1986). (Segundo Hardin. No processo de extensão. Para produzir essa extensão.. Segundo e terceiro estágios da invaginação do arquêntero A invaginação das células vegetais ocorre em três estágios discretos.2. Os filopódios se estendem dessas células através do fluido da blastocele e fazem o contacto com a superfície interna da Figura 6. ocorre um terceiro estágio no alongamento do arquêntero. o largo e curto intestino rudimentar é transformado em um tubo longo e delgado. algumas vezes triplicando seu comprimento.2. começa a segunda fase da formação do arquêntero. onde células se intercalam para estreitar o tecido e.) . pode facilitar essa invaginação puxando para dentro a camada envergada (Burke et al. 12 horas. o arquêntero tem uma circunferência constituída de somente 6 a 8 células. Figura 6. Clones marcados fluorescentemente podem ser vistos estendendo-se apicalmente. Ettensohn. mas não são formadas novas células (veja Figura 6.

Esse movimento não é devido a um arrastão ativo dos blastômeros. peixes tetraplóides entram um ciclo antes (Kane e Kimmel. de modo que o contato com a região se tornou mais eficiente. se contraem. as células secundárias mesenquimatosas continuaram sua exploração até que finalmente se afastaram do arquêntero e encontraram o tecido alvo. como células migratórias livres. Mais tarde.11). eles permanecem ligados naquele local. tocam a parede da blastocele ao acaso e. 1990). Pelo contrário. Na fase inicial. o movimento é propiciado pela expansão autônoma da camada sincicial do vitelo (YSL) “dentro” do citoplasma do hemisfério animal. o blastóporo marca a posição do ânus. onde proliferam para formar os órgãos mesodérmicos (veja Figura 6. A camada envolvente (EVL) está . a MBT parece ser regulada pela relação entre cromatina e citoplasma. que existe uma região alvo destinada a se transformar na região ventral da larva. Com a gástrula contraída de modo a impedir que os filopódios jamais atingissem a área “alvo”. Mas. ou existe um alvo específico no hemisfério animal que precisa estar presente para que a ligação ocorra? Existe alguma região da parede da blastocele que é predestinada a se tornar o lado ventral da larva? Estudos de Hardin e McClay (1990) mostram que existe um “alvo” específico para os filopódios do hemisfério animal. Essa transição da blástula intermediária (MBT) também é evidente em rãs e em Drosophila.2. Schroeder. as divisões celulares perdem sua sincronia. quando os filopódios atingem uma região específica da parede. Hardin (1988) removeu as células mesenquimatosas secundárias com um laser. como é característico para os deuterostomatas. em seguida. 1956. Os filopódios se ligam à parede nas junções entre as células do blastoderma e. Como discutido no Capítulo 5. Onde o arquêntero contata a parede se formará. Peixes haplóides entram na MBT um ciclo mais tarde. se retraem. os filopódios continuaram a se estenderem e a se contraírem ao tocar a parede daquela região. as células se movem sobre a superfície do vitelo envolvendo-o completamente (Figura 6. então. 1993). uma boca que se fundirá a ele formando um tubo digestivo contínuo. e como conseqüência o arquêntero só pode se alongar aproximadamente em dois terços do seu comprimento total. que difere de outras regiões. que é reconhecida pelas células mesenquimatosas secundárias e que posiciona o arquêntero na região onde se formará a boca. embora em velocidade menor do que nos controles. 1981). em seguida. arrastando o arquêntero para cima. se achatam contra essa região e puxam o arquêntero em direção a ela. Parece que alguma coisa na cromatina está “removendo por titulação” alguma substância (até agora desconhecida) do citoplasma. Gastrulação em peixes A transição da blástula intermediária e a aquisição de motilidade celular Durante o décimo ciclo de clivagem do peixe-zebra. Quando algumas células mesenquimatosas secundárias foram deixadas. Somente quando os filopódios encontraram o “alvo” é que cessaram os movimentos. um papel essencial em elevar o arquêntero até a parede da blastocele durante a última fase da invaginação. Quando o topo do arquêntero encontra a parede da blastocele nessa região. podem os filopódios mesenquimatosos secundários se ligar a qualquer parte da parede da blastocele. Os filopódios das células mesenquimatosas secundárias se estendem. finalmente. Quando Hardin e McClay comprimiram o outro lado da parede da blastocele. As células mesenquimatosas secundárias têm. O primeiro movimento celular é a epibolia das células blastodérmicas sobre o vitelo. Assim. o alongamento continuou. Entretanto. novos genes são expressos e as células se tornam móveis. Parece então. as células mesenquimatosas secundárias se dispersam no interior da blastocele. 13.5 horas). as células blastodérmicas internas se movem para o exterior e se intercalam com as células mais superficiais (Warga e Kimmel.218 PARTE II Padrões de Desenvolvimento parede da blastocele (Dan e Okazaki.

e Langeland e Kimmel.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 219 (A) 30% DE EPIBOLIA (4.3 HS) Região do tronco fortemente ligada à YSL e é arrastada junto com ela.7 HS) Camada envolvente Camada profunda Camada sincicial do vitelo Ventral Dorsal Pólo animal Figura 6. e radiação ou drogas que . (D) Com 90 porcento de epibolia. 1995. 1992).11 Movimentos celulares durante a gastrulação do teleósteo Danio rerio. neuroectoderma Pólo vegetal Mesendoderma: precursores para mesoderma e endoderma Endoderma (90% EPIBOLIA (9 HS) Coto caudal Posterior Pólo animal 1 SOMITO (10. A expansão de YSL tem como base uma rede de microtúbulos em sua estrutura. Quando isso é feito. entre o ectoderma e o endoderma. (C) Detalhe da região marginal. 1984b.0 HS. as células blastodérmicas retornam ao topo do vitelo enquanto YSL continua sua expansão ao redor da célula do vitelo (Trinkaus.) Célula do vitelo Núcleo do vitelo Pólo vegetal (B) ESCUDO (6. 1997. (B) Formação do hipoblasto. o mesoderma pode ser visto rodeando o vitelo. As células mais profundas do blastoderma enchem o espaço entre a YSL e a EVL enquanto a epibolia se desenvolve. (A) O blastoderma com epibolia 30 porcento completa. Isso pode ser demonstrado cortando a ligação entre YSL e EVL. por involução de células na margem do blastoderma em epibolização ou por delaminação de células do epiblasto.) (C) Pólo animal Ingresso celular Epiblasto Hipoblasto Escudo Hipoblasto Camada envolvente Epiblasto Dorsal Células em involução Células em nãoinvolução Sinais indutores mesodérmicos e dorsais Camada sincicial do vitelo Grânulo do vitelo Ventral Sinal indutor mesodérmico Pólo Vegetal (D) Pólo animal Mesoderma dorsal Camada envolvente (E) Anterior Pólo animal Região cefálica Camada envolvente Somito #1 Ventral Dorsal Ventral Dorsal Mesoderma Ectoderma. (E) Término da gastrulação. (Segundo Driever.

12). Ho. epiblasto e hipoblasto.C) Extensão convergente do cordomesoderma é mostrada por aquelas células exprimindo o gene no tail (sem cauda). enquanto as células realizam a epibolia em torno do vitelo. o hipoblasto. Esse escudo é funcionalmente equivalente ao lábio dorsal do blastóporo de anfíbios. 1995). o escudo embrionário (Figura 6. se intercalam no futuro lado dorsal do embrião. e é composto de uma camada superficial. as células profundas de ambos.12 Convergência Involução Epibolia Célula do vitelo Convergência e extensão no peixe-zebra.) (B) (C) (D) (E) . Assim. a intercalação estende o cordomesoderma em direção ao pólo animal. 1936. mas ocorre na margem inteira. (É possível que ambos os mecanismos ocorram com diferentes maneiras de formar o hipoblasto predominando em espécies diferentes. A involução começa na futura porção dorsal do embrião. para formar um espessamento localizado. Esse espessamento é chamado de anel germinativo.220 PARTE II Padrões de Desenvolvimento impedem a polimerização de tubulina inibem a epibolia (Strahle e Jesuthasan. Formação das camadas germinais Depois que as células blastodérmicas cobrem aproximadamente a metade da célula do vitelo do peixe-zebra (e mais cedo em ovos de peixes com vitelos maiores) um espessamento ocorre ao longo de toda a margem. convergência e extensão trazem células do hipoblasto e epiblasto para o lado dorsal para formar o escudo embrionário. Dentro do escudo. 1996). Solnica-krezel e Driever. A epibolia estende o blastoderma sobre o vitelo. (de Langeland e Kimmel. 1993. pois ele pode organizar um eixo embrionário secundário quando transplantado a um embrião hospedeiro (Oppenheimer. seguida por sua migração para o pólo animal (veja Figura 6. veja discussão de gastrulação em anfíbios). e uma camada interna. um dos lados do blastoderma se torna visivelmente mais grosso do que o outro. Alguns laboratórios alegam que o hipoblasto é formado pela involução das células superficiais abaixo da margem. Experimentos com marcação de células indicam que o lado mais delgado marca o sítio da futura superfície dorsal do embrião (Schmidt e CamposOrtega. elas também estão involuindo nas margens e convergindo anteriormente e dorsalmente em direção (A) Pólo animal Extensão Escudo embrionário Figura 6. (B.E) Extensão convergente de células mesodérmicais adaxiais (marcadas pela sua expressão de gene snail para flanquear a notocorda.11). Não entendemos como é produzido o hipoblasto. 1992. um gene que é expresso pelas células da notocorda. 1997. (A) Vista dorsal de movimentos de convergência e extensão durante a gastrulação do peixe-zebra. o epiblasto. (D. Durante a migração.) Uma vez formado o anel. Outros laboratórios alegam que essas células hipoblásticas ingressam para formar o hipoblasto (veja Trinkaus. 1994). a involução ou o ingresso geram o hipoblasto.

foram revisadas na década passada.C).CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 221 (A) Vidro para segurar o embrião (B) Manchas de corante no embrião (C) Discos de ágar com corante Lábio dorsal do blastóporo Embrião Figura 6. Lundmark. Esse é o cordomesoderma. Os movimentos de cada grupo de células coradas foram acompanhados através da gastrulação. trazer para dentro aquelas áreas destinadas a formar os órgãos endodérmicos. conceitualmente. O resto do epiblasto se torna a pele do peixe. As células adjacentes ao cordomesoderma. são as precursoras dos somitos mesodérmicos (Figura 6. os quais coram mas não danificam as células embrionárias. as células adaxiais. então. a maior parte de nossas teorias relacionadas aos mecanismos do movimento no desenvolvimento. Se abrirmos.12B. envolver o embrião com células capazes de formar o ectoderma e colocar as células mesodérmicas no lugar apropriado entre elas. (A) Método de Vogt para marcação de células específicas da superfície embrionária com corantes vitais.13 Coloração vital de embriões de anfíbios. o mapa de destino resultante se parece muito com aquele do embrião do peixe-zebra quando metade do vitelo estava coberto pelo blastoderma (Langeland e Kimmel. 1983. daremos ênfase ao seu processo de gastrulação. Movimentos celulares durante a gastrulação de anfíbios As blástulas de anfíbios têm as mesmas tarefas que seus companheiros. Os movimentos pelos quais isso é conseguido podem ser visualizados pela técnica de coloração vital. a pesquisa mais intensa se concentrou em Xenopus. uma blástula de Xenopus no pólo vegetal e esticarmos a abertura em um anel marginal. ou seja. (E) Embrião de tritão dissecado no plano mediano para mostrar células coradas no interior. 1992).12D. As células hipoblásticas do escudo embrionário convergem e se estendem anteriormente. Nos últimos anos. como vermelho neutro ou sulfato de azul do Nilo.13). (E) Gastrulação de anfíbios O estudo da gastrulação em anfíbios é ao mesmo tempo uma das mais antigas e uma das mais novas áreas da embriologia experimental. o primórdio da notocorda (Figura 6. O mapa de destino do peixe-zebra. mesmo considerando que gastrulação de anfíbios foi estudada extensamente no século passado. (B-D) Vistas da superfície do corante em embriões sucessivos. Vogt (1929) saturou fragmentos de ágar com corante. Espécies diferentes empregam diferentes maneiras para atingir o mesmo objetivo (Smith e Malacinski. O estudo da gastrulação em anfíbios foi complicado pelo fato de existir mais de um tipo de gastrulação nos anfíbios.) Secção em plano de visão (E) (D) ao escudo embrionário (Trinkaus. A convergência e a extensão no epiblasto traz as células presuntivas do cérebro de todo o epiblasto para a linha média dorsal onde formam a quilha neural. 1997). não é tão diferente daquele da rã ou outros vertebrados (como logo veremos). 1986). (Segundo Vogt. Esses fragmentos corados de ágar foram pressionados contra a superfície da blástula e uma parte do corante foi transferida para as células contatadas (Figura 6. equinodermos e peixes. portanto. e . 1929. finalmente estreitando-se ao longo da linha dorsal média do hipoblasto.E).

Mapas de destino (A) de células exteriores e (B) interiores indicam que a maioria dos derivados mesodérmicos são formados de células interiores. o lábio do blastóporo passa a ser composto de células que involuem para dentro do embrião. As primeiras células que compõem o lábio dorsal são as células garrafa que invaginam para formar a borda anterior do arquêntero. elas se dirigem para dentro e migram ao longo da superfície interna das lâminas celulares externas. Enquanto isso. uma “espinha dorsal” mesodérmica transitória que é essencial para o início da diferenciação do sistema nervoso. Essas células formarão a notocorda. Quando as células marginais migratórias chegam ao lábio dorsal do blastóporo. na região equatorial (marginal) do embrião. mas o contacto com a superfície externa é mantido por um delgado filamento semelhante a um pescoço (Figura 6.222 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 6. O corpo principal de cada célula é deslocado na direção interna do embrião. as futuras células endodérmicas locais invaginam dando lugar à formação de um blastóporo em forma de fenda. logo abaixo do equador na região do crescente cinzento (Figura 6. os precursores da notocorda e do mesoderma são encontrados em ambas. bem como os processos de formação das células garrafa e involução continuam no blastóporo. enquanto que o ectoderma e endoderma se originam da camada superficial do embrião. mas na zona marginal próxima ao equador da blástula. Nesse ponto. Os precursores da notocorda e outros tecidos mesodérmicos estão localizados abaixo da superfície.15). À medida que as novas células migram para dentro do embrião. conforme se encontrem nas camadas profundas ou superficiais do embrião (Figura 6. Nessa vista lateral. (Segundo Keller. Em Xenopus. o lábio do blastóporo se expande lateral e ventralmente. Esses mapas foram recentemente confirmados e ampliados por técnicas de microscopia eletrônica de varredura e de injeção de corantes (Smith e Malacinski. a gastrulação na rã não começa no pólo vegetativo. A gastrulação em embriões de rã é iniciada no futuro lado dorsal do embrião. ao contrário da gastrulação em ouriço-do-mar. onde se encontram os hemisférios animal e vegetal. Em urodelos (salamandras. os precursores mesodérmicos existem somente na camada profunda. as células endodérmicas não são tão grandes e nem tão ricas em vitelo como os blastômeros do pólo vegetativo. A próxima fase da gastrulação envolve a involução das células da zona marginal. Estudos com corantes vitais de Løvtrup (1975. mais tarde. 1976) mostraram que as células da blástula de Xenopus têm diferentes destinos. Essas células.14). Entretanto. Enquanto essas primeiras células passam para o interior do embrião.) Mesoderma lateral Blastóporo Somitos (B) INTERIOR Notocorda Blastóporo os resultados sumariados em mapas de destino. se tornam as células faríngeas do intestino anterior. o ponto em que se forma o lábio dorsal do blastóporo está indicado por uma flecha. como na gastrulação do ouriço-do-mar. uma invaginação de células inicia a formação do arquêntero. O blastóporo em expansão . Lundmark. tornando-se os precursores do mesoderma da cabeça. as células que constituem o lábio do blastóporo estão constantemente mudando. tais como: Triturus e Ambystoma) e em algumas rãs sem ser o Xenopus. Aqui. Dessa forma. nas células da superfície e nas células marginais profundas (Purcell e Keller.14 Epiderme Placa neural Endoderma acima do blastóporo Endoderma abaixo do blastóporo (A) EXTERIOR Mapas do destino da blástula da rã Xenopus laevis. 1993). As próximas células involuindo para o embrião. Essas células modificam sua forma dramaticamente. são as células cordomesodérmicas. a blastocele é deslocada para o lado oposto ao lábio dorsal do blastóporo. 1976. através do lábio dorsal do blastóporo. Essas células garrafa revestem o arquêntero inicial. Assim. enquanto as células do pólo animal sofrem epibolia e convergem no blastóporo. 1979) e de Keller (1975. 1986).16). 1983. Landstrom Løvtrup.

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 223 Pólo animal (AP) Arquêntero Blastocele Células superficiais Células profundas Pólo vegetal Lábio dorsal do blastóporo Blastocele deslocada (B) (C) Mesoderma Endoderma (A) Mesoderma dorsal Ectoderma Arquêntero Notocorda Mesênquima Ectoderma Notocorda Lábio lateral do blastóporo Lábio dorsal do blastóporo Lábio dorsal do blastóporo Lábio lateral do blastóporo Endoderma (D) Ectoderma Endomesoderma anterior (E) Tampo do vitelo Lábio ventral do blastóporo (F) Mesoderma ventral Figura 6. Células de garrafa da margem movem-se para o interior para formar o lábio do blastóporo. B e C. mostrando a extensão das células-garrafa do blastóporo. e precursores mesodérmicos involuem sob o teto da blastocele. (C) Detalhe da região onde as células do hemisfério animal estão involuindo através do lábio do blastóporo. e as células migram dos lábios lateral e ventral do blastóporo para dentro do embrião. que irá mudar à medida que a gastrulação prossegue. As células do hemisfério animal migram em direção da região vegetal. (A) Diagrama de células de uma seção da gastrulação do embrião da salamandra. 1943.) Figura 6.) (C) Célulasgarrafa Blastóporo . micrografias de varredura eletrônica cortesia de C. o endoderma foi internalizado. (E. 1986.D) Gastrulação intermediária. Phillips. Os principais movimentos celulares estão indicados por flechas. O arquêntero se forma e desloca a blastocele. As seções são cortadas através da metade do embrião. e as células superficiais do hemisfério animal estão coloridas para permitir o seguimento de sua movimentação. (B) Visão de superfície de um lábio dorsal precoce do blastóporo de Xenopus. AP marca a posição do pólo animal.15 Movimentos celulares durante a gastrulação da rã. (A segundo Holtfreter. o embrião fica envolvido pelo ectoderma.F) Perto do fim da gastrulação. movendo o blastóporo para região próxima do pólo vegetal.B) Gastrulação precoce.16 (A) (B) Estrutura do lábio do blastóporo. (C. e as células mesodérmicas se posicionaram entre o ectoderma e o endoderma. e são posicionadas de modo que o pólo vegetal seja inclinado na direção do observador e ligeiramente para a esquerda. (Segundo Keller. a blastocele é obliterada. (A. A diferença de tamanho entre os blastômeros animais e vegetais está claramente aparente.

Naquele ponto. ântero-posterior e direito-esquerdo ainda não foram determinados. Posicionando o blastóporo Tendo visto os aspectos gerais da gastrulação em anfíbios. e as células mesodérmicas serão formadas a partir do citoplasma interno. enquanto o citoplasma cortical gira 30o na direção do hemisfério animal (para cima) em direção ao ponto de entrada do espermatozóide (veja Figura 4. Números ii-v correspondem às Figuras 6. lateral e ventral. Os eixos dorsoventral (dorso-frente). No Capítulo 4 discutimos a rotação do citoplasma cortical relativo ao citoplasma interno no ovo da rã. A superfície do hemisfério animal se transformará nas células do ectoderma (pele e nervos). Quando o lábio ventral completa o círculo. um lábio ventral sobre o qual passam células precursoras adicionais. o blastóporo forma uma anel ao redor das grandes células endodérmicas que permanecem expostas na superfície do pólo vegetativo.224 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) i Lábio dorsal ii iii Obturador do vitelo Lábio do blastóporo Lábio lateral iv v Lábio ventral Obturador do vitelo Figura 6. finalmente.17 Epibolia do ectoderma. o endoderma torna-se progressivamente internalizado. cortesia de B.34). todos os precursores endodérmicos foram trazidos para o interior do embrião. 1975. (B de Balinsky. . Esse pedaço remanescente de endoderma é chamado de rolha ou obturador do vitelo. Com a formação do lábio ventral. ele também é finalmente internalizado (Figura 6. ao redor do equador. respectivamente. mesodérmicas e endodérmicas. porém. isso nada diz sobre qual parte do ovo formará a frente e qual as costas. O citoplasma interno permanece orientado em relação à gravidade devido a sua densa acumulação de vitelo. podemos agora nos ocupar de cada passo em detalhe. Na verdade. Os eixos dorsoventral e ântero-posterior são especificados pelo deslocamento do citoplasma do zigoto durante a fecundação. Balinsky. Assim. (A) Movimentos morfogenéticos de células migrando para o interior do blastóporo e em seguida sob a superfície. o hemisfério vegetal formará as células do intestino e órgãos associados (endoderma). O óvulo tem uma polaridade ao longo do eixo animal-vegetal. O destino geral dessas regiões pode ser previsto antes da fecundação.) como um “crescente”. A gastrulação não existe como um processo independente na vida do animal. as camadas germinativas podem ser mapeadas no óvulo. (B) Mudanças na região ao redor do blastóporo quando se formam sucessivamente os lábios dorsal.17). I. desenvolve lábios laterais e.15B-E. o ectoderma envolveu a superfície e o mesoderma foi colocado entre eles. a preparação para a gastrulação já pode ser visualizada no preciso momento da fusão óvulo-espermatozóide.

Esses movimentos citoplasmáticos ativam o citoplasma oposto ao ponto de entrada do espermatozóide. o outro eixo se forma onde o citoplasma dirigido pela centrifugação interage com os componentes do pólo vegetal. ativam algum componente do citoplasma vegetal. Gimlich e Gerhart (1984) realizaram uma série de experimentos de transplante que confirmaram Normal Porcentagem de embriões Girada Ângulo do lábio do blastóporo do ponto de entrada de espermatozóide Figura 6. Além disso. se essa rotação cortical é bloqueada.. Kirschner e Gerhart. A direção do movimento citoplasmático determina qual lado será o dorsal e qual será o ventral. Quando foi permitido que os ovos centrifugados se desenvolvessem em água normal.) . A entrada do espermatozóide foi marcada com corante. 1987). mas em seguida imobilizaram os ovos em gelatina e os centrifugaram levemente. A hipótese de Black e Gerhart (1986) é que tal produção de gêmeos é causada pela formação de duas áreas de interação: um eixo se forma onde a rotação cortical normal deu origem às interações citoplasmáticas no pólo vegetal da célula.. A direção preferencial fornecida pelo ponto de entrada do espermatozóide pode ser sobrepujada por um redirecionamento mecânico da relação espacial entre os citoplasmas cortical e subcortical. a iniciar a gastrulação (Figura 6. com o ponto de entrada do espermatozóide virado para cima. A discussão precedente sugere que deve ser possível ter dois sítios de iniciação de gastrulação se houver a combinação de rotação orientada pelo espermatozóide com uma rotação do ovo artificialmente induzida.. 1986).. em ovos dispérmicos existe uma única direção de rotação. Gêmeos também podem ser produzidos em gravidade normal.18). o lado oposto.18 Relação entre o ponto da entrada do espermatozóide e o lábio dorsal do blastóporo em ovos de rã normais e naqueles que sofreram rotação. Mesmo que o espermatozóide não seja necessário para induzir esses movimentos no citoplasma do ovo. 1981.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 225 Essa rotação faz com que o eixo animal-vegetal da superfície do ovo se desloque 30o relativo ao eixo animal-vegetal do citoplasma interno. foram inclinados em 900.18). Enquanto que o óvulo era radialmente simétrico em relação ao eixo animal-vegetal. Entretanto. Se um ovo artificialmente estimulado é anucleado. A possibilidade de se obter dois lábios funcionais dos blastóporos também sugere que não há nada especial a respeito do crescente cinzento.. mas é a rotação citoplasmática que é essencial para o futuro desenvolvimento. 1981. ele é importante na determinação da direção dessa rotação. colocando o lado do ovo onde penetra o espermatozóide voltado para cima. de modo que o citoplasma interno se movesse para o ponto de entrada do espermatozóide. partindo da metade do primeiro ciclo de clivagem. 1986). interações essas que.) O espermatozóide parece fornecer um sinal espacial que orienta a rotação autônoma do citoplasma. Dessa maneira. 1981. após remover o envoltório de fertilização (Gerhart et al. apareceram dois sítios de gastrulação. Na verdade. não há o desenvolvimento dorsal. onde se inicia a gastrulação. 50-80 minutos após a fertilização. Quando se impede a rotação do ovo (por imersão em um polissacarídeo que provoca o colapso do espaço perivitelino entre o ovo e o envoltório de fertilização) ele pode sofrer uma rotação de 90o de modo que o eixo animal-vegetal fique horizontal e não vertical e o ponto de entrada do espermatozóide voltado para cima (Gerhart et al. provavelmente. O citoplasma interno também se move. o ovo fecundado agora tem um eixo dorsoventral e é bilateralmente simétrico (tem lados direito e esquerdo). Ovos de Xenopus foram fertilizados. 1981). onde se observa pela primeira vez o início da gastrulação. 1981. O lado pelo qual entra o espermatozóide marca a futura superfície ventral do embrião. e microscopia de fluorescência de embriões precoces mostrou que os padrões citoplasmáticos das células presuntivas dorsais são diferentes daqueles das células presuntivas ventrais (Prancha 7). Cooke. Quando ovos fecundados são inclinados dessa maneira por trinta minutos. levando ao aparecimento de larvas gêmeas ligadas (Figura 6. e o embrião morre como uma massa de células ventrais (primariamente intestinais) (Vincent e Gerhart. os fatores indutores da gastrulação parecem ser criados pelas interações dos citoplasmas animal e vegetal. a rotação cortical ainda se dá no tempo correto. desgeleificados e colocados em Ficoll para desidratar o espaço perivitelino. o citoplasma gira de tal maneira que quase todos os embriões iniciam a gastrulação no mesmo lado da entrada do espermatozóide (veja Figura 6. Os ovos sofreram rotação. um novo estado de simetria é adquirido. (De fato. Vincent et al. (Segundo Gerhart et al.19). marca o futuro dorso (costas) do embrião (Gerhart et al. a direção desse movimento é imprevisível. Black e Gerhart (1985) permitiram a rotação inicial orientada pelo espermatozóide.

criado pelo deslocamento de material citoplasmático. de outra maneira. dirige o posicionamento do blastóporo acima de um conjunto de blastômeros vegetais e oposto ao ponto de entrada do espermatozóide. 1944) observou que as células garrafa de gástrulas precoces de salamandra poderiam aderir às lamínulas de vidro e guiar o movimento das células ligadas a elas. Figura 6. no estágio de 64 células.226 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) Figura 6.20A). Movimentos celulares e a construção do arquêntero O INÍCIO DA GASTRULAÇÃO. Holowacz e Elinson (1993) observaram que o citoplasma cortical. provavelmente orientados pela entrada do espermatozóide. enquanto seus terminais internos (basais) se expandem. Eles demonstraram que em um embrião de Xenopus. Johannes Holtfreter (1943. era capaz de induzir a formação de eixos secundários quando injetado em células vegetativas ventrais. (B) Esses ovos desenvolvem dois eixos completos.20B). (Cortesia de J. no momento da primeira clivagem. Essa assimetria cria uma distinção dorsoventral no ovo que. e não no crescente cinzento. esses três blastômeros. podem também induzir uma invaginação secundária e um eixo quando transplantados para o lado ventral de um embrião normal. Gerhart. no estágio de 64 células.19 Blastóporos gêmeos produzidos pela rotação de ovos desgeleificados de Xenopus com o lado ventral para cima (ponto de entrada do espermatozóide).) a hipótese de que os fatores que iniciam a gastrulação originalmente estão no citoplasma profundo das células vegetativas dorsais. na superfície dorsal da blástula. originando a forma característica de “garrafa”. que formam girinos gêmeos. As superfícies externas (apicais) dessas células se contraem dramaticamente. (A) Dois blastóporos são instruídos para formar: o original (oposto ao ponto de entrada do espermatozóide) e o novo. então. que os rearranjos internos do citoplasma. Parece. no estágio de 64 células. Nem o citoplasma cortical de células animais e nem o citoplasma profundo das células ventrais puderam induzir esses eixos. essas células parecem ter um papel ativo nos movimentos iniciais da gastrulação. não irradiado (Figura 6. Até mais convincentes foram os experimentos . os três blastômeros vegetais mais dorsais são capazes de induzir a formação do lábio dorsal do blastóporo e de um eixo dorsal completo em embriões hospedeiros irradiados com luz ultravioleta (que. situados abaixo da região do prospectivo lábio dorsal. Na salamandra. O comprimento apical-basal dessas células aumenta bastante. em última instância. penetra no interior do embrião. As moléculas que podem estar envolvidas na formação do sítio vegetal de iniciação da gastrulação (o “centro de Nieuwkoop”) serão discutidas no Capítulo 15. Além disso. ligados ventralmente. das células vegetativas dorsais do embrião de Xenopus. não seriam capazes de iniciar a gastrulação. Esse pequeno grupo de blastômeros vegetais permite a invaginação de células marginais adjacentes e a formação do eixo mesodérmico dorsal do embrião. A gastrulação em anfíbios é iniciada quando um grupo de células endodérmicas marginais. são responsáveis pela distribuição assimétrica de fatores subcelulares.

Experimentos de transplante demonstrando que as células vegetativas. Um zigoto irradiado sem tal transplante não sofre gastrulação normal. Mais ainda. Sendo assim.21). (Segundo Gimlich e Gerhart. Quando as células da zona marginal dorsal foram removidas e colocadas no prospectivo tecido endodérmico interno. são responsáveis pelo início da gastrulação. nos quais células da zona marginal dorsal (que dariam origem ao lábio dorsal do blastóporo) foram combinadas com o tecido endodérmico interno.21 Um implante de células de anfíbios da região do lábio dorsal do blastóporo submerge para dentro de uma camada de células endodérmicas e forma um sulco do blastóporo.) . ao se aprofundarem. (B) Formação de um novo local para gastrulação e eixo corporal pelo transplante das células vegetativas. criaram uma depressão reminiscente do blastóporo precoce. mais dorsais.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 227 (A) Ponto de entrada do espermatozóide DOADOR NORMAL RECEPTOR IRRADIADO POR UV DOADOR NORMAL (B) RECEPTOR NORMAL Ponto de entrada do espermatozóide Ponto de entrada do espermatozóide UV Sem transplante Transplante Peça embrionária ventral carente de eixo corporal Novo local de gastrulação e forma de eixo corporal Figura 6. 1984. 1944. de outro embrião de 64 células. para uma cavidade criada pela remoção de um número semelhante de células vegetais. abaixo das regiões do futuro lábio dorsal do blastóporo. (Segundo Holtfreter. no estágio de 64 células. de um embrião de 64 células. (A) Salvamento de embriões irradiados pelo transplante de blastômeros do segmento mais dorsal (cor) de um embrião.20 de recombinação de Holtfreter. para região vegetal mais ventral.) Implante Células endodérmicas Sulco no blastóporo Figura 6. Holtfreter sugeriu que a habilidade de invaginar com profundidade para dentro do endoderma é uma propriedade inata das células da zona marginal dorsal. as células precursoras do blastóporo formaram células garrafas e se aprofundaram abaixo da superfície do endoderma interno (Figura 6.

alongando e estreitando o mesoderma axial. E. 1981. (C) Os precursores do mesoderma anterior conduzem o movimento do mesoderma para dentro da blastocele. Na NIMZ (zona marginal não involutiva) e parte superior da IMZ.22 A. células profundas (mesodérmicas) estão se intercalando radialmente. (F) Intercalação como em (D). arrastando as células superficiais e as células garrafa por involução. intercalação medianolateral das células produz tensões que arrastam a IMZ por cima do lábio. O mesoderma move-se na direção ao pólo animal. Keller e seus orientados (Keller. enquanto empurra as células vegetativas para dentro (Figura 6. (A) Estrutura da zona marginal involutiva (IMZ) antes da gastrulação. elas não são essenciais para a continuação da gastrulação. empurrar as células vegetais permite a esses precursores da mesoderme anterior contatar o lado de (A) Endoderma Intercalação radial de células profundas Células marginais superficiais Célulasgarrafa Futuro mesoderma anterior Lábio dorsal do blastóporo Blastóporo Morfologia de mudanças das células profundas Células garrafa (E) Precursores do mesoderma cefálico do endoderma da faringe Células garrafa re-espalhadas IMZ superficial movendo-se em direção do pólo animal Endoderma Intercalação medianolateral (F) Ectoderma Precursores do mesoderma cefálico do endoderma da faringe Pólo animal Blastocele O lábio se extende lateral e vegetalmente (B) (C) (D) Células marginais profundas Células garrafa Futuro mesoderma posterior IMZ profunda Figure 6. as células marginais profundas se achatam.228 PARTE II Padrões de Desenvolvimento A situação no embrião da rã é um pouco diferente. Wilson e Keller. 1988. (E) À medida que continua a gastrulação. é a constrição das células que puxa a zona marginal na direção vegetativa. Esse estreitamento de várias camadas em poucas outras causa extensão na direção lábio do blastóporo. Hardin e Keller. olhando da superfície dorsal para baixo em direção do lábio dorsal do blastóporo. e as células previamente superficiais formam a parede do arquêntero. (D) Ocorre intercalação radial (interdigitação) das células profundas da IMZ. A forma peculiar de garrafa dessas células é necessária para iniciar a gastrulação. R. O estiramento da zona marginal permite a expansão do ectoderma em direção ao pólo vegetal e o envolvimento do embrião.) . a intercalação medianolateral continua. A IMZ profunda consiste do futuro mesoderma anterior e do futuro mesoderma posterior.B). 1988) mostraram que apesar das células garrafa terem um papel na iniciação da involução da zona marginal ao adquirem a forma de garrafa. (Segundo Hardin e Keller. configurando uma fita estreita de células achatadas. 1991. (B) Constrição das células garrafa arrasta o futuro mesoderma anterior para cima e gira a IMZ para fora. Imediatamente acima do lábio.22 Modelo integrativo dos movimentos celulares durante a gastrulação precoce de Xenopus.

a expansão convergente também continua a estreitar e encompridar a zona marginal involutiva. 1986). Portanto. as células garrafa do Xenopus não são mais necessárias. a notocorda localizada centralmente se separa do mesoderma somítico em ambos os lados. A remoção das células garrafa não afeta a involução das células profundas ou das células superficiais da zona marginal para dentro do embrião. Essa intercalação estende ainda mais a IMZ vegetalmente. mas a remoção das células marginais dorsais profundas e sua substituição por células do hemisfério animal (que normalmente não sofrem involução) interrompe a formação do arquêntero. 1977. A IMZ contém o prospectivo teto endodérmico do arquêntero na sua camada superficial (IMZS) e as prospectivas células mesodérmicas.15 e 6. A porção dorsal das células marginais não-involutivas expande-se mais rapidamente que a porção ventral. 1991). Entretanto.22F) que integra várias correntes mesodérmicas para formar um longa e estreita banda. as várias camadas de células IMZ profundas se intercalam radialmente para formar uma fina e larga camada. O movimento das células garrafa mais profundamente dentro do embrião depende da sua ligação às células profundas subjacentes. Quando as células garrafa são removidas após sua formação. Esse processo é dirigido pela contínua intercalação mediolateral de células ao longo do eixo ântero-posterior. após começar esses movimentos. Mais ainda. Essa extensão convergente do mesoderma parece ser autônoma. Keller. . O fator principal no movimento das células para dentro do embrião parece ser a involução das células marginais subsuperficiais mais do que as superficiais.22E). a força motivadora para essa involução parece vir da camada profunda de células marginais. Quando as células profundas atingem o lábio do blastóporo. estreitando ainda mais a banda. 1980. 1981.22 (D-F) esboça o comportamento dessas células da zona marginal involutiva (IMZ) em sucessivos estágios da gastrulação em Xenopus (Keller e Schoenwolf. Durante a gastrulação. incluindo aquelas da notocorda na sua região profunda (IMZD).22C-E). A FORMAÇÃO DO MESODERMA DURANTE A GASTRULAÇÃO DE XENOPUS A Figura 6. ainda que as células garrafa possam ser responsáveis pela indentação inicial. e as células sofrem elongação separadamente (Wilson e Keller. Pouco antes de sua involução através do lábio do blastóporo. porque os movimentos dessas células ocorrem mesmo se essa região do embrião é isolada do resto (Keller. Parece que essas células subsuperficiais ou células da zona marginal involutiva profunda se viram para dentro e migram em direção ao pólo animal. formando o teto do arquêntero (Figuras 6. a involução. a formação do blastóporo e o fechamento continuam. 1988). Durante o terço médio da gastrulação. as células superficiais se espalham se dividindo e achatando. a intercalação radial e mediolateral da camada de células profundas parece ser responsável pelo movimento contínuo do mesoderma para dentro do embrião. Assim a corrente mesodérmica continua a migrar em direção ao pólo animal e a camada superposta de células superficiais (incluindo as células garrafa) são passivamente puxadas em direção ao hemisfério animal. o pólo animal e as células da zona marginal não-involutiva (NIMZ) expandem-se por epibolia cobrindo todo o embrião.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 229 baixo dos precursores mesodérmicos posteriores e começar a migrar no teto da blastocele (Hardin e Keller. ao longo das superfícies internas das células profundas remanescentes (Figura 6. No fim da gastrulação. Migração do mesoderma involutivo Com o progresso dos movimentos mesodérmicos. elas involuem para dentro do embrião e iniciam um segundo tipo de intercalação. 1988). que estão migrando ativamente. Hardin e Keller. a lâmina em expansão do mesoderma converge em direção à linha mediana do embrião. Ao mesmo tempo. Essa intercalação causa uma extensão convergente ao longo do eixo mediolateral (Figura 6. e que a camada superficial forma o revestimento do arquêntero unicamente porque ela está ligada às células profundas. A parte anterior dessa banda migra em direção ao hemisfério animal.

Thiery.-P. causando o movimento dos lábios do blastóporo em direção ao lado ventral.23 Fibronectinas e gastrulação de anfíbio. yp.C) e anormal (D. O endoderma é derivado das células da IMZS que formam o revestimento do teto do arquêntero e das células vegetativas sub-blastoporais que se tornam o assoalho do arquêntero (Keller. (ar. enquanto a blástula gastrulando normalmente foi injetada com a solução controle.) (A) (B) (C) (D) (E) . bc. blastocele. Enquanto essas células mesodérmicas. e os precursores nãoinvoluídos do mesoderma permanecem na superfície. 1986). uma vez que se encontram no interior do embrião? Na salamandra. Boucaut e J. ossos e partes de vários outros órgãos) entra através dos lábios ventral e lateral para criar o manto mesodérmico. tendo fixado à fibronectina sintética. cortesia de J. ec. mesoderma. (B) Seção durante gastrulação intermediária.230 PARTE II Padrões de Desenvolvimento assim.. (D. obturador do vitelo. Pouco antes da gastrulação. Informações adicionais & Especulações Reguladores moleculares do desenvolvimento: Fibronectinas e as vias da migração mesodérmica C omo é que as células involutivas são informadas para aonde ir. endoderma. 1984. mes. C. sangue.) (A de Boucaut et al.. parece que os precursores mesodérmicos involutivos migram em direção ao pólo animal em uma rede de fibronectina secretada pelas células do teto da blastocele. blastóporo. A blastocele em (D) e (E) foi injetada com o fragmento ligante à célula de fibronectina. arquêntero. 1985. bl. onde os precursores mesodérmicos. ectoderma. en.E) Os estágios finais da gastrulação detida. B-E de Boucaut et al. O arquêntero não se forma. o resto do mesoderma do corpo (o qual forma o coração. não conseguem reconhecer a via de migração normal forrada de fibronectina. dão origem ao mesoderma dorsal axial.E) da salamandra. (C) O obturador do vitelo ao fim da gastrulação. entrando através do lábio dorsal do blastóporo. os rins. o ectoderma presuntivo do teto da blastocele secreta uma matriz extracelular que contém fibrilas de fibronec- Figura 6. (B-E) Micrografias ao microscópio eletrônico de varredura de gastrulação normal (B. (A) Imunofluorescência revela uma rede fibrilar de fibronectina na superfície basal de prospectivas células ectodérmicas forrando o teto da blastocele do embrião da salamandra.

Boucaut e colaboradores injetaram grandes quantidades de um pequeno peptídio contendo essa seqüência na blastocele de embriões de salamandra. As fibrilas de fibronectina são necessárias para que as células mesodérmicas da cabeça se achatem e estendam largos processos (lameliformes) na direção da migração (Winklbauer et al. Figura 6. Entretanto. A importância dessas fibrilas de fibronectina é também vista em híbridos interespecíficos que se detém na gastrulação. pouco antes do início da gastrulação.24B). 1991. as células das DMZ não migraram ao acaso. formando uma massa celular convoluta. Isso é precisamente o que ocorreu (Figura 6. com o seu próprio eixo perpendicular aquele da matriz. 1985). a subunidade αv da integrina é progressivamente perdida das membranas das células do blastômero. Boucaut et al. perpendicular àquele da matriz. deixando sua matriz extracelular. e a flecha branca representa seu eixo blastóporo-pólo animal. Nakatsuji et al. após 2 horas. Além disso. além disso. morrem durante a gastrulação porque não secretam essas fibrilas de fibronectina. a extensão convergente empurra as células migratórias para cima. Entretanto. Winklbauer e Keller. Seria possível às células desse explante migrarem na matriz. Parece então..24A). mas migraram em direção ao pólo animal da matriz extracelular que havia sido absorvida no plástico (Figura 6. e particularmente seu componente fibronectina. O mesoderma involutivo parece migrar nessas fibras de fibronectina. e se migrassem o fariam em uma direção particular? Foi verificado que as células migraram. Em vez disso. entre duas espécies de sapos. Shi e colegas (1989) removeram os tetos da blasto- cele de gástrulas precoces de salamandra e os depositaram em recipientes de plástico com suas matrizes extracelulares tocando o plástico (Figura 6. 1991). (A) Explantes do teto da blastocele do blastóforo (BP) para o pólo animal (AP) foram dissecados de embriões de salamandra em estágio precoce de gastrulação e colocados em placas plásticas. Um explante menor da zona marginal dorsal foi removido de outra gástrula precoce e colocado sobre a matriz com seu próprio eixo blastóporo-pólo animal. Se a fibronectina for sintetizada mas não organizada nessas fibrilas. Isso foi confirmado pela síntese química de uma “falsa” fibronectina que pode competir com a genuína da matriz extracelular.) .23B-E). foi então colocado sobre essa matriz. (de Shi et al.. as células mesodérmicas dorsais vão aderir à superfície basal do ectoderma presuntivo. A matriz extracelular contendo fibronectina. e o tecido foi então removido. A migração mesodérmica pode ser também interrompida pela microinjeção de anticorpos contra fibronectina ou contra a subunidade β1 de integrina que funciona como parte do receptor de fibronectina (D’Arribère et al. pouco antes e durante a gastrulação. Um explante menor de uma gástrula precoce. então as células ligadas a esse fragmento solúvel de peptídio. Se a fibronectina fosse essencial para a migração celular. em lugar da fibronectina real ligante de células. A matriz extracelular aderiu à placa. fotografia cortesia dos autores. A linha pontilhada indica a borda original do explante.. Parece então. Alfandari e colegas (1995) mostraram que logo após a fecundação. o explante foi removido. Impossibilitadas de encontrar sua “estrada”..24 (B) AP A direção da migração das células da zona marginal dorsal (DMZ) depende da orientação da matriz extracelular do teto da blastocele. em direção ao pólo animal. é importante na migração das células mesodérmicas durante a gastrulação em anfíbios. Células se ligam a uma certa região da proteína fibronectina que contém uma seqüência de três aminoácidos (Arg-Gly-Asp. permite a ligação das células mesodérmicas à rede de fibronectina e. a fibronectina parece delinear os limites dentro dos quais esses movimentos podem ocorrer. a subunidade αv é expressa na superfície das células mesodérmicas migratórias.. Considera-se que as células mesodérmicas aderem à fibronectina através da αvβ1 proteína integrina (Alfandari et al. Delarue e colegas (1985) mostraram que certos híbridos inviáveis.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 231 tina (Figura 6. 1984. 1988. os precursores mesodérmicos permaneceram fora do embrião.23A. as células mesodérmicas deveriam cessar sua involução. mas se organiza em pequenos aglomerados fibrilares. (B) Células da DMZ do explante migraram para o pólo animal da matriz. Outros pequenos peptídios sintéticos (incluindo outros fragmentos da molécula de fibronectina) não impediram a migração. deveriam parar. mas não migrarão (Winklbauer e Nagel. RGD). 1990). Não foram vistas células migratórias ao longo do lado de baixo do ectoderma. que a síntese desse receptor de fibronectina pode sinalizar o tempo para o mesoderma começar e continuar a migração.. parece fornecer sinais para a direção da migração celular. e que a migração podia ser inibida por anticorpos que impedem que a célula (A) Pólo animal reconheça a fibronectina. 1989. 1996). que a matriz extracelular do teto da blastocele. 1995). contendo células da DMZ. A fibronectina das gástrulas de Xenopus não forma grades complexas. Em Xenopus. O eixo do blastóporo ao pólo animal foi marcado e.

A primeira indicação de gastrulação envolve a invaginação local das células garrafa do endoderma na zona marginal. as células precursoras ectodérmicas epibolizam vegetalmente por divisão celular e pela integração de camadas celulares previamente independentes.5 representam gástrulas progressivamente mais avançadas. involuem para se juntar à corrente de células mesodérmicas dentro do embrião. mostrando as mudanças na forma e arranjo das células. Ao mesmo tempo. Keller. 1988). em tempo e lugar precisamente definidos. A maior parte das células da região marginal. Em seguida. Essas células involutivas. três rodadas de divisão celular aumentam o número de camadas de células profundas no hemisfério animal. O resultado dessas expansões é a epibolia das células superficiais e profundas do pólo animal e regiões marginais não involutivas sobre a superfície do embrião (Keller e Danilchik. por extensão convergente. começa a formação do arquêntero. completa integração de numerosas células profundas em uma camada também ocorre. e o prospectivo cordomesoderma atrás delas.232 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Epibolia do ectoderma Enquanto a involução está ocorrendo no lábios do blastóporo.25). se dá provavelmente pelo mesmo mecanismo. a involução das células marginais através do lábio do blastóporo. na porção dorsal do embrião. os precursores ectodérmicos estão se expandindo sobre todo o embrião. na margem anterior do manto mesodérmico. cortesias de R. Keller (1980) e Keller e Schoenwolf (1977) usaram microscopia eletrônica de varredura para observar as modificações tanto nas células superficiais como nas células profundas das regiões animal e marginal. se estreita e se alonga posteriormente. E. estágios 10-11. Ao mesmo tempo. migram ao longo da superfície interna do teto do blastóporo. como mencionado anteriormente.25 Micrografias eletrônicas de varredura do teto da blastocele de Xenopus. ainda que mudanças na forma celular parecem ter um papel mais importante do que no hemisfério animal. A camada mais superficial se expande por divisão e achatamento celular. Gastrulação no Xenopus é uma orquestração de vários eventos distintos. O mecanismo principal de epibolia na gastrulação do Xenopus parece ser um aumento no número de células (através de divisão). (de Keller. O resultado desses movimentos celulares é o posicionamento adequado das três camadas germinativas em preparação para sua diferenciação em órgãos do corpo. Os estágios 8 e 9 são de blástula. Durante a gastrulação precoce. acoplado a uma concomitante integração de várias camadas profundas em uma só (Figura 6. 1980.) . Estudos moleculares (a serem discutidos no Capítulo 15) estão começando a nos dar pistas relacionadas a mecanismos pelos quais as células são informadas de como começar e finalizar essas migrações Estágio Figura 6. O espalhamento de células nas zonas marginais dorsal e ventral.

devido a seu contato com o vitelo. O blastoderma de duas camadas (epiblasto e hipoblasto) tem as camadas unidas na margem da área opaca.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 233 Gastrulação em aves Generalidades sobre gastrulação em aves A clivagem em embrião de aves cria um blastodisco acima de um enorme volume de vitelo. as células da margem da área pelúcida parecem opacas. veremos que embriões de mamíferos .26 e 5. uma lâmina de células da margem posterior do blastoderma (crescente de Koller e a zona marginal atrás dele) migra em direção anterior para se juntar às ilhas de polinvaginação e formar o hipoblasto secundário (Eyal-Giladi et al. logo veremos que existem numerosas similaridades entre a gastrulação em aves e as gastrulações que já estudamos. À medida que o hipoblasto se move no sentido anterior. Essa massa subjacente e inerte de vitelo impõe várias restrições aos movimentos celulares. Blastoderma Epiblasto Anterior Zona marginal posterior Área opaca Espaço subgerminativo Vitelo Células do hipoblasto delaminando-se do epiblasto Área pelúcida Figura 6.por isso. . Assim.que não tem vitelo. FORMAÇÃO DO HIPOBLASTO E EPIBLASTO.26 Área opaca Área opaca Epiblasto Blastocele Células do hipoblasto migrando de células profundas da região posterior Formação do blastoderma de duas camadas do embrião da galinha. para formar ilhas de células sob o epiblasto. Essa camada inferior tornase o hipoblasto.33). a estrutura do blastodisco das aves não é diferente da blástula de anfíbios ou equinodermos. formam a área opaca (Figura 6. Realmente. células do epiblasto se agregam na região anterior à foice de Koller para formar a linha primitiva. Em contraste. As primeiras células hipoblásticas delaminam individualmente.. As células centrais do blastodisco das aves são separadas do vitelo por uma cavidade subgerminativa e parecem mais claras . certas células migram individualmente para a cavidade subgerminativa.retém movimentos de gastrulação muito parecidos com aqueles dos embriões de aves e répteis. Pouco tempo depois. à primeira vista. para formar as ilhas de polinvaginação (hipoblasto primário). Enquanto a maioria das células permanece na superfície formando o epiblasto. ser muito diferente daquela do ouriço-do-mar ou da rã. um arquipélago de aglomerados desconectados contendo cada um de 5 a 20 células (veja Figuras 6. Células da margem posterior (células de foice de Koller e células marginais posteriores) produzem uma população de células que migra abaixo do blastodisco e incorpora as ilhas poli-invaginadas. Além disso.26). A camada superior é o epiblasto.1992). e a gastrulação em aves parece. e o espaço entre as camadas é uma blastocele. o centro do blastodisco é chamado de área pelúcida.

Assim. especialmente o saco vitelínico e o pedúnculo.27B.. Corantes vitais e transplantes de células radioativas foram úteis no mapeamento de tendências prioritárias. e serve como um blastóporo. células entrando no embrião de aves o fazem individualmente. existe uma significante extensão convergente enquanto a linha primitiva progride anteriormente. Células migrando através do nódulo de Hensen passam para dentro da blastocele. Mesmo que células em uma região específica da gástrula tendam a se transformarem em tipos específicos de células. e pela migração de células da região lateral do epiblasto posterior em direção ao centro (Figura 6.234 PARTE II Padrões de Desenvolvimento O mapa de destino para o embrião de aves é restrito ao epiblasto. Transplantar células marcadas geneticamente. as células do hipoblasto formam porções da membrana externa.28). Em lugar de formar uma lâmina de células fortemente organizadas. De maneira similar ao blastóporo de anfíbios. Além disso. [gast1. o hipoblasto não contribui com células para o embrião em desenvolvimento (Rosenquist. 1991). Todas as três camadas germinativas do embrião propriamente dito (mais uma quantidade considerável de membrana extra-embrionária) são formadas das células epiblásticas. A estrutura majoritária característica da gas- trulação em aves. Enquanto as células convergem para formar a linha primitiva.. répteis e mamíferos é a linha primitiva. essa se estende na direção da futura região da cabeça. migram anteriormente formando o intestino anterior. O centro desse nódulo contém uma depressão em forma de funil (algumas vezes chamada cova primitiva). Esses mapas integram vários tipos de mapeamento. Enquanto as células entram na linha primitiva. a fenda primitiva é análoga ao blastóporo de anfíbios. tais como células de codorna colocadas em embriões de galinha. Em lugar disso. 1972). se forma uma depressão na linha. imediatamente anterior ao crescente de Koller (Figura 6. Na ponta anterior da linha primitiva há um espessamento regional de células chamado nódulo primitivo ou nódulo de Hensen. as células do epiblasto começam a migrar sobre os lábios dessa e para dentro da blastocele (Figura 6. na direção anterior. 1992). 1966. Ou seja.html] Tão logo se forma a linha primitiva. células passando através das porções laterais da linha primitiva dão origem à maioria dos tecidos endodérmicos e mesodérmicos (Schoenwolf et al. Como pode ser visto nessas figuras. contornou o problema de difusão. A elongação . a linha primitiva tem uma população celular se modificando constantemente. 1992).27A). Bellairs. na região posterior do embrião. pois com esses métodos se marcam grupos de células que se difundem ao prosseguir o desenvolvimento. 1984.27. a população ingressante cria um mesênquima fracamente conectado. o uso de vírus ou corantes fluorescentes permitiu aos pesquisadores acompanhar células individuais através do desenvolvimento (Schoenwolf. que liga a massa do vitelo ao tubo digestivo endodérmico. Ao mesmo tempo. Mapas de destino de epiblasto de galinha estão representados na Figura 6. através da qual as células passam para a blastocele. ela se move anteriormente e se contrai para formar a linha primitiva definitiva. À medida que a área espessada se estreita. 1986. Recentemente. Essa depressão é chamada fenda primitiva.27C-E). Esse espessamento é causado pelo ingresso de células mesodérmicas do epiblasto para dentro da blastocele. não se forma um verdadeiro arquêntero na gástrula de aves. elas ainda podem produzir diferentes tipos celulares se transplantadas a uma outra região do embrião. O nódulo de Hensen é o equivalente funcional do lábio dorsal do blastóporo de anfíbios. mas ainda assim marcava aglomerados relativamente grandes de células. Eyal-Giladi et al. FORMAÇÃO DA LINHA PRIMITIVA. Em contraste com o mesoderma de Xenopus. o qual migra como lâminas de células para a blastocele. as células do hipoblasto secundário estão continuando a migrar da margem posterior do blastoderma. através do qual as células migratórias passam para a blastocele. Essa linha é visível inicialmente como um espessamento de uma camada de células do epiblasto. Vakaet. o mesoderma da cabeça e a notocorda. Essa linha se estende em 60-75% do comprimento da área pelúcida e marca o eixo ântero-posterior do embrião (Figura 6.

(A-E) Visão dorsal da formação e alongamento da linha primitiva. (D) 10-12 horas e (E) 1516 horas. novamente. musculatura) Placa lateral (incluindo o coração) Extra-embrionária Área pelúcida Área de engrossamento do blastoderma Área opaca Área pelúcida Posterior (C) (D) (J) Linha primitiva tomando forma (E) Nódulo de Hensen Área pelúcida Área opaca Anterior Processo cefálico (F) (K) Figura 6. 1946. O blastoderma é visto em (A) 3-4 horas.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 235 (A) Anterior (B) Área opaca (I) Ectoderma Endoderma Mesoderma Axial Paraxial (vértebras. 1985. As primeiras células a migrarem através da linha primitiva são aquelas destinadas a se transformarem no intestino anterior. (F-H) A formação da notocorda e somitos mesodérmicos à medida que a linha primitiva regride é mostrada em (F) 19-22 horas. Essa situação. O movimento precoce das células epiblásticas HNK-1+ é mostrado por flechas. especialmente Spratt. MIGRAÇÃO ATRAVÉS DA LINHA PRIMITIVA: FORMAÇÃO DO ENDODERMA E MESODERMA. (B) 5-6 horas. Extensão convergente é mostrada na linha mediana.27 Nódulo de Hensen Sulco primitivo (G) Borda anterior do mesoderma Ectoderma da dobra cefálica Dobra neural Somito Notocorda (H) Dobra cefálica Intestino anterior Movimentos celulares da linha primitiva do embrião de galinha. o crescente germinativo. essas células migram anteriormente e finalmente deslocam as células do hipoblasto na porção anterior do embrião. e Balinsky. (G) 23-24 horas e (H) no estágio de quatro somitos. e as células precursoras endodérmicas ingressam mais rapidamente que as células precursoras mesodérmicas. não forma estruturas . 1975. (C) 7-8 horas. é similar àquela vista nos anfíbios. (Adaptado de várias fontes. rins. Essa região. As células hipoblásticas estão confinadas a uma região na porção anterior da área pelúcida. I-K segundo Vakaet. Uma vez dentro da blastocele.) Nódulo de Hensen Placa segmental Linha primitiva da linha primitiva parece ser coincidente com a migração em direção anterior dessas células do hipoblasto secundário. (I-K) Mapas do destino do epiblasto em dois estágios da gastrulação.

das células migratórias e das duas camadas originais do blastoderma.28 (A) Migração de células endodérmicas e mesodérmicas através da linha primitiva. Solursh. 1975. que mais tarde migram através dos vasos sangüíneos até as gônadas.236 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 6. Essa camada origina as porções mesodérmicas do embrião e das membranas extra-embrionárias. (B) Estereograma de um embrião gastrulante de galinha. 1996). estendendo seus terminais apicais para transformarem em células garrafa. A camada inferior se transforma em um mosaico de células hipoblásticas e endodérmicas. as células continuam a migrar para dentro. essas células se separam em duas correntes. Após 22 horas de incubação. assim como a maioria das membranas extra-embrionárias (o hipoblasto forma o restante). (A de Solursh e Revel. Essas células permanecem entre o endoderma e o epiblasto para formar as células do mesoderma da cabeça e do cordomesoderma (notocorda) (veja Psychoyos e Stern. . Essas células de ingresso precoce se moveram todas anteriormente. apesar das células presuntivas mesodérmicas continuarem a migrar para o interior por um tempo mais longo. a maior parte das células presuntivas endodérmicas estão no interior do embrião. a fim de formar o processo cefálico (Figura 6. Uma corrente se move mais profundamente e encontra o hipoblasto em sua região mediana. porém. (A) Micrografia eletrônica de varredura mostra células epiblásticas passando para a blastocele. mais ou menos a meio caminho entre o hipoblasto e o epiblasto. mas não se movem tão ventralmente como as células presuntivas endodérmicas do intestino anterior. cortesia de M. as células hipoblásticas finalmente se separam para formar uma camada abaixo daquela do endoderma e contribuem para o saco vitelínico. mostrando a relação da linha primitiva. 1978. Essas células de movimento profundo dão origem a todos os órgãos endodérmicos do embrião. Quando entram na blastocele. A segunda corrente migratória se espalha através da blastocele como uma camada frouxa.) (B) Nódulo de Hensen Linha primitiva Epiblasto Blastocele Hipoblasto Endoderma Células migratórias (mesênquima) embrionárias. As próximas células que entram na blastocele através do nódulo de Hensen (e o primeiro quarto anterior da linha primitiva) também se movem anteriormente. através da porção lateral da linha primitiva.29). deslocando as células hipoblásticas para os lados. Enquanto isso. B segundo Balinsky. mas contém os precursores das células germinativas. empurrando para cima a região medianoanterior do hipoblasto.

Ela deixa em seu lugar o eixo dorsal do embrião e o processo cefálico. a porção remanescente (posterior) da notocorda é estabelecida. Enquanto continua o ingresso do mesoderma. (E) Regressão da linha primitiva. Linask.29). a linha primitiva começa a regredir. (B) Estágio de dois somitos (25 horas).CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 237 Endoderma faríngeo Processo cefálico (notocorda anterior) Ilhas de sangue Dobra cefálica Intestino anterior Sulco neural Nódulo de Hensen Linha primitiva Área pelúcida Somito Linha primitiva Área opaca (A) (B) (C) Linha de referência Regr es da li s ã o p r i m nha itiva Borda posterior da área pelúcida Horas (D) (E) Figura 6.) Alongamento da notocorda . células ectodérmicas migraram para fora do blastodisco para envolver o vitelo por epibolia. Nesse ponto. células da porção anterior já estão começando a formar órgãos. o epiblasto é composto inteiramente de células ectodérmicas presuntivas. A linha primitiva está regredindo. deixando a notocorda em seu rastro. os embriões de aves (e mamíferos) exibem um distinto gradiente de maturidade de desenvolvimento ântero-posterior. Ao mesmo tempo que o nódulo avança posteriormente. Enquanto células das porções posteriores do embrião estão gastrulando. Pelos próximos dias. (A) A linha primitiva totalmente estendida (24 horas). 1947. O enclausuramento do vitelo (novamente reminiscente da epibolia do ectoderma de anfíbios) é uma tarefa de Hércules. formando a região anal. Ainda mais. para uma posição mais posterior (veja Figura 6. Enquanto as células presuntivas do mesoderma e do endoderma se moviam para dentro. a linha primitiva regrediu até a porção caudal do embrião. O processo cefálico (notocorda anterior) pode ser visto estendendo-se a partir do nódulo de Hensen. O tempo representa as horas decorridas após atingir o comprimento máximo em aproximadamente 18 horas.29 Agora começa uma nova fase da gastrulação. o nódulo regride para sua posição mais posterior. Como uma conseqüência desse processo de gastrulação em duas etapas. enquanto a notocorda anterior empurra para cima o processo cefálico que estava embaixo. que dura 4 dias para ser completada e envolve a produção contínua de novo Gastrulação do embrião de galinha de aproximadamente 24 até perto de 28 horas. (C) Estágio de quatro somitos (27 horas). (Fotografias cortesia de K. Finalmente. a ponta anterior estará mais avançada no seu desenvolvimento (podese dizer que teve uma “vantagem” inicial) do que a porção posterior. movendo o nódulo de Hensen de uma posição próxima do centro da área pelúcida. os precursores ectodérmicos proliferavam para se tornar a única população de células remanescente na camada superior. (D) Após 28 horas. E segundo Spratt. Anteriormente vê-se o endoderma faríngeo. Vários pontos da linha foram acompanhados após atingir seu comprimento máximo.

o ectoderma envolveu o vitelo. O controle desse campo parece residir na zona marginal posterior. enquanto o óvulo está lentamente rolando oviduto abaixo. se uma zona marginal posterior é colocada em um embrião que retém sua margem posterior original (Figura 6. cada parte vai formar seu próprio embrião (Spratt e Haas.30C). a região onde começa a formação do hipoblasto. 1981) consideravam que o hipoblasto induzia à formação da linha primitiva e a contemplava com uma polaridade ânteroposterior. As células posteriores formarão o hipoblasto e. e outro lado frente ao fluido do espaço subgerminativo positivo e ácido. Khaner (1995) girou o epiblasto com relação ao hipoblasto. Khaner e Eyal-Giladi (1989) verificaram que na transposição da zona marginal posterior para uma área marginal lateral (Figura 6. os eixos ântero-posterior e dorsolateral são determinados antes da gastrulação. o rasgo posterior cicatriza e duas linhas primitivas aparecem.30A). mas é deslocado para cima pelo vitelo mais denso. o endoderma substituiu o hipoblasto e o mesoderma se posicionou entre essas duas regiões. A porção mais alta do blastodisco se transforma na ponta caudal (rabo) do blastoderma. somente a margem posterior original do hospedeiro forma o hipoblasto que está subjacente à linha primitiva. Mecanismos de gastrulação em aves O PAPEL DO HIPOBLASTO E A FORMAÇÃO DOS EIXOS EMBRIONÁRIOS.238 PARTE II Padrões de Desenvolvimento material celular e a migração das células ectodérmicas presuntivas ao longo da superfície inferior do envoltório vitelínico. ele gira a uma velocidade de 10 a 15 revoluções por hora. 1988).* *Pesquisadores anteriores (Waddington. 1971). Isso cria dois lados para as células: um lado frente à albumina negativa e básica. 1932. A conversão de um blastoderma radialmente simétrico em uma estrutura simétrica bilateral é determinada pela gravidade. se uma região posterior é reciprocamente transposta com uma região lateral (Figura 6. Similarmente. Azar e Eyal-Giladi. evitarão que qualquer célula. e aquele frente ao espaço subgerminativo se torna o ventral. somente se forma uma linha primitiva e ela provém da região posterior original. Portanto.5) acima do blastodisco e o espaço subgerminativo ácido (pH 6.5). cada uma tendo sua zona marginal. a parte onde começa a gastrulação (Kochav e Eyal-Giladi. O lado frente à albumina se torna o dorsal. 1960). Entretanto. Água e íons de sódio são transportados da albumina através das células para dentro do espaço subgerminativo criando uma diferença de potencial de membrana de 25 mV através da camada de células (positivo no lado ventral das células). Assim. em diferentes estágios do desenvolvimento da galinha. O eixo dorso-ventral (costa-frente) é crítico para a formação do hipoblasto e para o contínuo desenvolvimento do embrião. Enquanto o óvulo rola oviduto abaixo. se o blastoderma é separado em partes. O citoplasma que deverá se tornar a camada celular está sempre girando para baixo. abaixo do disco. Khaner e Eyal-Giladi sugerem que as células da zona marginal formam um gradiente de atividade cujo pico está na ponta posterior. não está em cima do vitelo. e mostrou que o epiblasto inicia a formação da linha primitiva e mantém sua polaridade independentemente da orientação do hipoblasto. mas um pouco deslocado para o lado. Esse eixo é estabelecido quando as células em clivagem do blastoderma. Essas células marginais posteriores não só contribuem com as células indutoras do hipoblasto. forme hipoblastos próprios. com menos atividade. Isso pode ser revertido ou invertendo o gradiente de pH ou invertendo a diferença de potencial através da camada de células (revisão em Stern e Canning. chegando ao fim da gastrulação em aves. . Assim. ao mesmo tempo.30B). como também impedem que outras regiões marginais induzam seus hipoblastos. produzem uma barreira entre a albumina básica (pH 9. Entretanto. O blastoderma do embrião de galinha age como um sistema único integrado para formar um único embrião.

1989.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 239 EXPERIMENTO (A) Anterior Zona marginal Área opaca Epiblasto RESULTADOS INTERPRETAÇÃO Posterior (B) Cicatriz Linhas primitivas (C) Figura 6. nãodiferenciado. Pelo contrário. Evidências dos estudos de Stern e Canning (1990) sugerem que o epiblasto não é um tecido homogêneo. como foi assumido por muito tempo. É provável que o tecido marginal posterior secrete uma substância que atrai as células que expressam HNK-1. As células expressando HNK-1 ingressam individualmente na blastocele e migram para a região posterior. produzirão o endoderma e o mesoderma. Esses estudos mostram que certas células. e nenhuma célula expressando HNK-1 formará derivados ectodérmicos.) . As células expressando HNK-1.30 ACUMULAÇÃO CELULAR NA LINHA PRIMITIVA. uma forma sulfatada do ácido glucurônico). Quando a linha chega ao seu comprimento quase total. citado em Stern. que se juntam na margem posterior. enquanto o tecido marginal anterior secreta uma molécula repelente (Jephcott e Stern. o embrião não formará mesoderma nem endoderma. 1991). Esse rudimento de linha sofre um processo de extensão convergente que o estreita e alonga. as Experimentos de Khaner e Eyal-Giladi demonstrando que a porção posterior da zona marginal (PMZ) contribui para as células indutoras da linha primitiva do hipoblasto e impedem outras regiões marginais de criarem seus próprios hipoblastos. (Segundo Khaner e Eyal-Giladi. parece haver diferenciação nas células epiblásticas mesmo antes que a formação da linha primitiva se inicie. Se as células HNK-1 são seletivamente destruídas (por anticorpos). dispersas ao acaso no epiblasto. para formar o rudimento inicial da linha primitiva. podem ser distinguidas por uma molécula específica na superfície celular (HNK-1. enquanto ainda estão no epiblasto. Essas células HNK-1 positivas interagem com as células do epiblasto acima delas.

e agindo através da cascata da proteína G. um polímero linear de ácido glucurônico e N-acetilglicosamina (veja Figura 3. o movimento dessas células está ligado. 1995). 1982). onde reveste a superfície das células que estão chegando.35).240 PARTE II Padrões de Desenvolvimento células HNK-1 positivas dissolvem a lâmina basal do epiblasto central para formar uma canal através da linha primitiva. contribuir (junto com as células HNK-1 positivas) para os mesoderma e endoderma embrionários. O fator de espalhamento é secretado somente no nódulo de Hensen. as células se separam e migram lateralmente ao longo da membrana basal do epiblasto.. Fisher e Solursh (1977) mostraram que quando esse material é digerido (injetando a enzima hialuronidase na blastocele). em gastrulação precoce. Portanto. as células mesenquimatosas se aglomeram e não conseguem migrar adequadamente. Na verdade. na vizinhança do nódulo (Streit et al. Quando se implantam resinas contendo o fator de espalhamento abaixo do epiblasto de embriões de galinha. FORMAÇÃO SECUNDÁRIA DA NOTOCORDA. Isso se estende posteriormente para o “broto da cauda” do embrião (incluindo os somitos 28-50) (Le Douarin et al. fosforila as β-cateninas que ancoram as E-caderinas à membrana celular (Hartmann et al. Movimento dentro da blastocele amniota é feito por células individuais. Enquanto a porção anterior da notocorda é formada pelo ingresso de células através do nódulo de Hensen e a subseqüente migração anterior. Dentro da linha. o ácido hialurônico começa a se acumular precisamente no momento em que as primeiras células entram na blastocele. Polissacarídeos extracelulares podem também ter um papel importante nessa migração. O fator de espalhamento se liga a receptores tirosina quinase em células adjacentes. pouco antes da formação da linha primitiva e desaparece na região da linha. a destruição da lâmina basal e a liberação dessas células do epiblasto pode ser realizada por uma proteína de 190-kDa chamada fator de espalhamento (Stern et al. assim. e não por uma camada epitelial. Não existe evidência clara de que essa fibronectina é essencial para o direcionamento do movimento celular que afasta as células lateralmente da linha primitiva. Muito estudos têm mostrado que o ácido hialurônico é importante para manter as células mesenquimatosas migratórias separadas umas das outras. Essa camada rica em fibronectina aparece na superfície inferior das células da camada de cima. 1996). Na ausência de E-caderina funcional. não através do nódulo de Hensen). mais uma vez. Um desses complexos polissacarídeos é o ácido hialurônico. mas não parecem dirigir o movimento dessas células (Fisher e Solursh. Ácido hialurônico e outros polissacarídeos facilitam a migração de células individuais (veja Capítulo 3). nódulo de Hensen. Isso permite que células do epiblasto (que nunca expressaram HNK-1) sejam recrutadas para a linha que está se estendendo anteriomente e. esse polímero pode expandir em até 1000 vezes o seu volume original. provavelmente devido a sua capacidade de se expandir em água. células de aves passando pelo blastóporo sofrem uma constrição no seu terminal apical e se tornam células garrafa (Figura 6. o ácido hialurônico pode ser um fator importante para manter as células mesenquimatosas dispersas durante sua migração. As células..28). e tem sido implicado na dissociação de células nessa região e na indução do tecido neural a partir do epiblasto. rica em fibronectina (Duband e Thiery. assegurando que a migração continue. a notocorda posterior é formada de maneira diferente. 1979). Esse composto é produzido pelas células ectodérmicas e se acumula na blastocele. novas regiões da linha primitiva podem ser induzidas. uma vez liberadas da linha primitiva. 1994). são achatadas e passam a fazer parte de uma corrente de células migratórias independentes. . a lâmina epitelial se desmonta naquela região e as células se tornam mesênquima. Após o somito 17 (da galinha).. Em ambiente aquoso. O ácido hialurônico é capaz de manter as células separadas. à presença de uma rede de fibronectina na lâmina basal extracelular das células do epiblasto. 1990). Na ponta anterior do canal. como na gastrulação de anfíbios. Além disso. entram na blastocele. a notocorda se forma pela condensação de tecido mesodérmico que ingressou através da linha primitiva (isto é.. Mas.

CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 241 EPIBOLIA DO ECTODERMA. o blastoderma se espalha somente quando as margens estão se expandindo. O resultado é uma vesícula fechada. pois podem estender longos processos citoplasmáticos (500µm) em direção ao envoltório vitelínico. mais uma vez. Existe também uma relação específica entre as membranas celulares das células marginais e a superfície inferior da membrana vitelínica. como certas células são destinadas a se tornarem células do hipoblasto. causou retração dos filopódios das células marginais e parou a migração do blastoderma. New (1959) demonstrou que o blastoderma isolado se estende normalmente sobre o envoltório vitelínico isolado. As células marginais são inerentemente diferentes das outras células blastodérmicas. não sabemos ainda como se forma a cavidade subgerminativa. Durante a gastrulação. no qual Boucaut e colaboradores injetaram o composto sintético contendo a seqüência do sítio de ligação à fibronectina (RGD).) . (Segundo New. a superfície superior da área opaca adere fortemente à superfície inferior do envoltório vitelínico e se espalha ao longo dessa superfície interna. Lash e colegas aplicaram a seqüência RGD ao envoltório vitelínico enquanto as células migravam sobre ele. e Spratt (1963) demostrou que esse espalhamento não ocorre com outros substratos. É interessante observar que somente as células marginais (isto é. Esse tratamento quebrou especificamente o contato entre as células marginais e o envoltório vitelínico. na blastocele de salamandra. ou como as células são designadas aos seus respectivos destinos. Se as células marginais são removidas. como a linha primitiva se estende e se retrai. Gary Figura 6. Recentemente. enquanto suas vizinhas não o fazem. Assim. as bordas do blastoderma se curvam para dentro de modo que as células marginais da camada superior estão. New (1959) mostrou que quando o blastoderma é colocado sobre o envoltório vitelínico de forma invertida (camada profunda em contato com o envoltório vitelínico). a epibolia do ectoderma cessa. em contato com a superfície vitelínica (Figura 6. Existem várias linhas de evidência indicando que as células marginais da área opaca são os agentes da epibolia ectodérmica. (B) Quando as camadas profundas são colocadas em contato com o envoltório vitelínico. Essas observações sugerem que o envoltório vitelínico é essencial para a extensão da lâmina celular. Nas aves. as células precursoras do ecto- derma se expandem externamente para envolver o vitelo. como no experimento discutido anteriormente. (A) Quando um blastoderma de galinha é colocado no envoltório vitelínico. elas continuam a migrar sozinhas. quando as células marginais são isoladas do resto do blastoderma. quando o fazem. Identificamos muitos dos processos envolvidos na gastrulação de aves. como certas células expressam HNK-1. 1959. com os precursores em contato com a superfície vitelínica. parece que as células precursoras do ectoderma são levadas junto com as células ativamente migratórias da área opaca (Schlesinger. Então. Esses filopódios alongados são considerados o aparelho locomotor das células marginais. A maioria das células blastodérmicas aderem frouxamente. Em primeiro lugar. Essas células estão ligadas entre si por ligações firmes e migram como uma unidade. O mesmo comportamento é visto em cultura de células.31 Endoderma Presuntivo (camada profundas) (A) Ectoderma Presuntivo Envoltório Vitelínico (B) Propriedades migratórias dos precursores ectodérmicos de galinha. como células expressando HNK-1 migram para a margem posterior e como lá interagem com as células do epiblasto. as células da área opaca) se ligam firmemente à superfície vitelínica. a camada blastodérmica se enrola para permitir que as células da camada superficial possam aderir e migrar sobre a camada vitelínica. mas não individualmente. as células marginais migram e cobrem o envoltório vitelínico com ectoderma. Segundo.31). mas ignoramos como esses processos são realizados. 1958). Lash e seus colaboradores (1990) expandiram esses resultados mostrando que a fibronectina está presente na superfície interna do envoltório vitelínico.

suplementado por células mesodérmicas derivadas da massa celular interna. Essa evolução ensejou uma dramática reestruturação da anatomia materna (tal como a expansão do oviduto para formar o útero) como também o desenvolvimento de um órgão fetal capaz de absorver os nutrientes maternos. A massa celular interna nos mamíferos pode ser visualizada como assentada sobre uma bola imaginária de vitelo. Gastrulação em mamíferos Aves e mamíferos são descendentes de espécies de répteis. não é surpreendente que o desenvolvimento de mamíferos se dá paralelamente ao dos répteis e aves. e Bianchi et al. que evoluíram como uma adaptação a ovos com vitelo.. (Segundo Luckett. O que é surpreendente é que os movimentos de gastrulação de embriões de répteis e aves. é certo dizer que o que sabemos sobre gastrulação e neurulação em aves é consideravelmente menos do que ainda resta conhecer”.242 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Schoenwolf (1991) comentou: “ A despeito de tudo que foi escrito. 1978. Modificações para desenvolvimento dentro de outro organismo Em lugar de desenvolver-se isoladamente dentro do ovo. 1993. seguindo instruções que parecem mais apropriadas a seus ancestrais. Esse órgão fetal -a placenta.é derivado primariamente de células trofoblásticas embrionárias. O embrião mamífero obtém seus nutrientes diretamente da mãe e não depende de vitelo armazenado. TECIDOS EMBRIONÁRIOS Ectoderma embrionário Epiblasto embrionário Mesoderma embrionário Epiblasto Linha primitiva Massa celular interna Ectoderma amniótico Endoderma amniótico Hipoblasto Blastocisto Endoderma extra-embrionário Envoltório vitelínico Mesoderma extra-embrionário TECIDOS EXTRA-EMBRIONÁRIOS Trofoblasto Citrofoblasto Sinciciotrofoblasto Figura 6. são mantidos mesmo na ausência de grandes quantidades de vitelo no embrião mamífero.) .32 Diagrama esquemático mostrando a derivação de tecidos de embriões humanos e do macaco rhesus. a maioria dos mamíferos evoluiu para uma admirável estratégia de desenvolvimento dentro da própria mãe. Portanto.

33C e 6. Essas células se separam da massa celular interna para revestir a cavidade da blastocele onde elas originam a endoderme do saco vitelínico. e Larsen. que cobre a massa de células internas. O trofoblasto se divide no citotrofoblasto que forma as vilosidades. as quais formam o revestimento do âmnio (Figuras 6.) As origens dos tecidos mamíferos precoces estão sumariadas na Figura 6. 7 dias Revestimento uterino Capilar maternal Epitélio uterino (endométrio) Massa celular interna Blastocele Trofoblasto (B) 8 dias Sinciciotrofoblasto proliferando no tecido uterino Epiblasto Cavidade amniótica Blastocele Trofoblasto (C) 9 dias Lacunas trofoblásticas (D) 10-11 dias Cavidade amniótica Lacunas trofoblásticas (suprimento de sangue materno) Epiblasto Hipoblasto Trofoblasto Cavidade Amniótica Blastocele Sinciciotrofoblasto Formação de mesoderma extraembrionário Retículo extra-embrionário Figura 6. formando. O trofoblasto em alguns mamíferos pode ser dividido em trofoblasto polar. semelhante aquele visto em embriões de aves. é agora chamado de epiblasto. e o sinciciotrofoblasto que irá ingressar no tecido uterino. e o trofoblasto mural.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 243 (A) Blastocisto. Uma . Como em embriões de aves. com isso.33).33 Formação de tecido no embrião humano entre 7 e 12 dias. 1993. (D) O endoderma extra-embrionário forma o saco vitelínico. acima do hipoblasto. O mamífero adulto se forma das células do epiblasto embrionário. essas células não produzem partes do organismo neonato. que não o faz. (A. (C) Ao mesmo tempo o epiblasto se divide em ectoderma amniótico (que rodeia a cavidade amniótica) e epiblasto embrionário.B) Blastocisto humano imediatamente antes da gastrulação. O tecido da massa celular interna remanescente. As células do epiblasto são separadas por pequenas fendas que coalescem para separar o epiblasto embrionário das outras células do epiblasto. (Segundo Gilbert.32. A primeira segregação de células dentro da massa celular interna envolve a formação do hipoblasto (algumas vezes chamado endoderma primitivo) (Figura 6. o envoltório vitelínico primitivo e um blastodisco de duas camadas (epiblasto e hipoblasto). 1989. A massa celular interna delaminam células hipoblásticas que forram o trofoblasto.34).

e por baixo do epiblasto estão sobrepostas na visão da superfície dorsal. 1993.). de muitas maneiras.244 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 6. enquanto impede a sua dessecação. as células do epiblasto deixam de expressar E-caderina. de maneira diferente da formação da notocorda da galinha (Jurand. enquanto no dia 16. o epiblasto ingressante é considerado substituir as células hipoblásticas (que contribuem ao forro do saco vitelínico). semelhante ao epiblasto de ave. 1993). 1994). (A) Embrião humano e conexões uterinas após 15 dias de gestação. Aos dias 14 e 15. o embrião foi cortado sagitalmente através da linha mediana. o mesoderma e o endoderma de mamífero migram através da linha primitiva.35). Elas formam a notocorda convergindo mediamente e se dobrando em uma direção dorsal com afastamento do teto do intestino. Na formação da notocorda do camundongo.. Enquanto penetram a linha. . Na representação superior. Como as células do epiblasto de galinha. ele se enche com uma secreção chamada fluido amniótico. (Segundo Larsen. portanto.34 (A) Sinciciotrofoblasto Mesoderma Extra-embrionário Estrutura do âmnio e movimentos celulares durante a gastrulação humana. (B) Os movimentos das células epiblásticas para dentro da linha primitiva e o nódulo de Hensen.. 1974. Sulik et al. As células migrando através do nódulo de Hensen dão origem à notocorda. as células ingressantes se espalham como um leque para formar a camada mesodérmica. Disco germinativo bilaminar Cavidade amniótica Epiblasto Sulco primitivo Saco vitelínico Hipoblasto (B) 14-15 dias Cavidade amniótica Sulco primitivo Nódulo de Hensen Epiblasto Sulco Primitivo Hipoblasto 16 dias Saco vitelínico Endoderma Mesoderma Mesoderma extra-embrionário Endoderma vez completado o revestimento do âmnio. a representação inferior olha de cima para baixo sobre a superfície dorsal do embrião. Essas células podem ser vistas como uma banda de células pequenas e ciliadas se estendendo para cima do nódulo de Hensen (Figura 6. O epiblasto embrionário parece conter todas as células que vão dar origem ao próprio embrião e é. que serve como absorvente de choques para o embrião em desenvolvimento. as células devem se integrar no endoderma do intestino primitivo. que mantém as células unidas.36). e elas migram como células individuais (Burdsal et al. Kirstie Lawson e seus colegas (1991) marcaram células individuais do epiblasto com peroxidase de rabanete (horseradish) o que lhes permitiu construir um detalhado mapa de destino do epiblasto de camundongo (Figura 6.

. Formação de membranas extra-embrionárias Enquanto o epiblasto embrionário está apresentando movimentos celulares reminiscentes daqueles vistos na gastrulação de répteis e aves. (de Sulik et al. Em alguns casos. 1991. C.35 (A) Mapa do destino do embrião do camundongo. Schoewolf. as células extra-embrionárias estão produzindo os tecidos distintivos dos mamíferos que permitem ao feto sobreviver dentro do útero materno. enquanto que o tipo de célula multinucleada forma o sinciciotrofoblasto. no estágio de epiblasto. o epiblasto do camundongo é firmemente curvado. de modo que o sangue materno possa banhar os vasos sangüíneos fetais. cortesia de K. 6 dias após a fertilização. 1994. não do trofectoderma. Apesar da aparência normal das células trofoblásticas iniciais no camundongo e no homem. as linhagens não se separaram umas das outras. Assim. 1977). flanqueadas pelas células endodérmicas maiores do intestino primitivo.) (Segundo Lawson et al.5 dias vista pelo microscópio eletrônico de varredura.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 245 Figura 6. O (B) Anterior Âmnio Ectoderma Mesoderma Endoderma Notocorda Mesoderma extra-embrionário Linha primitiva Posterior Tubo neural presuntivo Mesênquima Endoderma Notocorda presuntiva Figura 6. Como nos embriões de aves. clones de células dão origem a descendentes em mais de uma camada embrionária ou para ambos os derivados. 1993) que a substituição das células hipoblásticas pelos precursores endodérmicos ocorre nos dias 14-15 da gestação. posição similar que ocupam no epiblasto de galinha. Considera-se (Larsen. (B) Mapa do destino de um epiblasto de 7 dias na gastrulação precoce. O tipo inicial de célula trofoblástica constitui uma camada chamada citotrofoblasto. elas dão origem a uma população de células onde a divisão nuclear se dá em ausência de citocinese. Notar que ao contrário dos epiblastos da galinha e humano.. enquanto que a migração de células formando o mesoderma não começa antes do dia 16. as células migrando entre as camadas de hipoblasto e epiblasto parecem estar envolvidas em ácido hialurônico cuja síntese se inicia durante a formação da linha primitiva (Solursh e Morriss. embrionário e extra-embrionário.) Cone ectoplacentário do trofoblasto Cavidade amniótica Epiblasto Útero Endoderma visceral Endoderma parietal Saco vitelínico Trofoblasto Os precursores ectodérmicos estão localizados anteriormente à linha primitiva completamente estendida. Os endodermas parietal e visceral são derivados do hipoblasto. (B) Formação da notocorda pela dobra dorsal das pequenas células ciliadas. mas enquanto o mesoderma de galinha se forma de células posteriores ao fim da linha.) . o mesoderma de camundongos se forma de células anteriores à linha primitiva. As células presuntivas da notocorda são pequenas células ciliadas na linha mediana. (A) A superfície ventral do embrião de 7.36 Tubo neural Notocorda (A) (B) Formação da notocorda no camundongo. (A) O estágio do ovo cilíndrico. As células citotrofoblásticas humanas também contêm enzimas proteolíticas que lhes permitem entrar no útero e remodelar os vasos sangüíneos uterinos. (O mapa do destino do camundongo foi achatado e deve ser visto como enrolado para cima com a linha primitiva nas bordas. O citotrofoblasto adere à parede uterina (endométrio) através de uma série de moléculas de adesão que foram discutidas no Capítulo 3. Sulik e G.

entram em contato com o sinciciotrofoblasto. F. O órgão completamente desenvolvido. supre essa área com vasos sangüíneos que. Reather. A atividade proteolítica cessa após a décima segunda semana de gestação (Fisher et al. consistindo de tecido trofoblástico e mesoderma contendo vasos sangüíneos. 1993). como também as vilosidades que se projetam da superfície externa do cório.* [gast2. por fim. Estudos recentes com embriões humanos e de macaco rhesus sugerem que o saco vitelínico (e portanto o hipoblasto) é a fonte desse mesoderma extra-embrionário (Bianchi et al. por sua vez. O embrião encontra-se envolvido pelo âmnio e protegido pelo cório.37 mostra as relações entre os tecidos embrionários e extra-embrionários de embrião humano de 6 semanas. é chamado cório e esse se funde com a parede uterina para formar a placenta. e seus vasos sangüíneos podem ser vistos estendendo-se para dentro das vilosidades coriônicas. ou tão intimamente integrado que os dois tecidos não podem ser separados sem causar dano para a mãe e para o feto em desenvolvimento (como na placenta decídua da maioria dos mamíferos. suas estruturas extra-embrionárias são distintas. O útero. O estreito pedúnculo de conexão do mesoderma extra-embrionário que liga o embrião ao trofoblasto forma os vasos do cordão umbilical. Pouco depois. 1991). a placenta tem uma porção materna (o endométrio uterino que é modificado durante a gravidez) e um componente fetal.. (Instituto Carnegie de Washington. mas ainda passível de separação (como na placenta de contato no porco). É muito arriscado extrapolar fenômenos de desenvolvimento de um grupo de mamíferos para outro. mas pobre ciência: a placenta é de vaca. e as membranas extra-embrionárias se formam de maneira diferente nas diferentes ordens de mamíferos (veja Cruz e Pedersen. o tecido mesodérmico se estende para fora do embrião em gastrulação (veja Figura 6. Até Leonardo da Vinci errou (Renfree. A esfera à direita do embrião é o saco vitelínico. 1982). Essas vilosidades contém os vasos sangüíneos e *Existem numerosos tipos de placenta. Assim.html] A Figura 6. cortesia de C..) . que se junta às extensões trofoblásticas e dá origem aos vasos sangüíneos que levam nutrientes da mãe para o embrião.246 PARTE II Padrões de Desenvolvimento tecido do sinciciotrofoblasto parece promover a progressão do embrião para dentro do útero.37 Embrião humano e placenta após 40 dias de gestação. o cório. Esse pode estar fortemente justaposto ao tecido materno. Os vasos sangüíneos se estendendo do cório ao embrião e desse ao cório são facilmente observados. Figura 6. 1989). incluindo o homem). Mesmo que o camundongo e o homem gastrulam e implantam da mesma maneira.33). Seu extraordinário desenho do feto humano dentro da placenta é excelente arte. O embrião está deitado dentro do âmnio.

html#gast4] O trofoblasto é necessário para a aderência e entrada do embrião nos tecidos uterinos. a difusão de substâncias solúveis pode ocorrer através das vilosidades (Figura 6. é também um órgão endócrino. e essas vilosidades terciárias estão aptas a trazer nutrientes e oxigênio da mãe para o embrião. a mãe proporciona nutrientes e oxigênio ao feto. Nos primatas. No fim da terceira semana. Artérias umbilicais Veia umbilical Âmnio Vilosidades coriônicas Cório (porção fetal da placenta) Células trofoblásticas Porção maternal da placenta (células deciduais) Para a mãe Da mãe Veia maternal Artéria maternal permitem ao cório ampliar a área exposta ao sangue materno. uma parte desse mesoderma extra-embrionário produziu vasos sangüíneos. os ovários podem ser removidos depois do primeiro terço da gravidez.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 247 Para o feto Do feto Do feto Figura 6. Assim. e o feto envia seus produtos descartáveis (principalmente dióxido de carbono e uréia) para a circulação materna. e o cório permite troca de gases e nutrientes entre a mãe e o feto. as vilosidades secundárias. 1956). A progesterona placentária é também usada pela glândula supra-renal fetal como um substrato para a produção de hormônios corticosteróides biologicamente .39). A porção sinciciotrofoblástica do cório produz três hormônios essenciais para o desenvolvimento dos mamíferos. sem danos para o desenvolvimento do feto. porque o cório tem capacidade para produzir os esteróides necessários para manter a gestação (Zander e von Münstermann. apesar de não haver fusão dos sistemas circulatórios materno e fetal. [other. Dessa maneira. ele produz a gonadotrofina coriônica. Primeiro.38 Relação entre as vilosidades coriônicas e o sangue materno no útero.38). As estruturas resultantes. Os vasos sangüíneos das vilosidades coriônicas são formados do mesoderma extra-embrionário que penetra nos pequenos montes de tecido citotrofoblástico chamados vilosidades primárias (Figura 6. se formam na segunda semana de gestação. Mas o cório tem uma importância até maior. um hormônio peptídico que é capaz de induzir outras células da placenta (e do ovário materno) a produzir progesterona. A progesterona é o hormônio esteróide que mantém a parede uterina espessada e cheia de vasos sangüíneos.

Como então. Uma pessoa com um sistema imune normal reconhece e rejeita células estranhas dentro do seu corpo. 1989. como também outras considerações ambientais. Assim. Cada grupo tem o problema de trazer as células precursoras do mesoderma e do endoderma para dentro do corpo. Dadas as diferentes quantidades e distribuições de vitelo. pode o feto humano permanecer 9 meses dentro do corpo da mãe? Porque a mãe não rejeita imunologicamente o seu feto. 1996). aves e mamíferos.39 Desenvolvimento das vilosidades coriônicas em humanos. apesar de haver diferenças entre os movimentos na gastrulação de embriões de ouriço-do-mar. As células citotrofoblásticas também contêm uma forma de antígeno de histocompatibilidade principal. (B) Vilosidade secundária formada quando o mesoderma extra-embrionário subjacente penetra na vilosidade primária.248 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) Vilosidade primária Endométrio Espaço entre vilosidades Sinciciotrofoblasto Citotrofoblasto Mesoderma extraembrionário (B) Vilosidade secundária Endométrio Casca citotrofoblástica Sinciciotrofoblasto Espaço entre vilosidades Citotrofoblasto Capilares das vilosidades (C) Vilosidade terciária Figura 6. Ele pode secretar proteínas solúveis que bloqueiam a produção de anticorpos. As glicoproteínas responsáveis por essa rejeição são chamadas de antígenos de histocompatibilidade principais e. o pai e a mãe. mas também a regulação das relações endócrinas e imunológicas entre a mãe e o feto. certos mecanismos são comuns a todos. que parece proteger o embrião de ser reconhecido pelo sistema imune da mãe (Carosella et al. pronto para a formação dos primeiros órgãos. Além disso. Esse hormônio é responsável pelo desenvolvimento do seio materno durante a gestação. Tais vilosidades secundárias juntam-se às vilosidades adjacentes para formar a casca citotrofoblástica que irá ancorar as vilosidades ao endométrio. 1996. formam-se capilares que irão se conectar aos ramos da artéria e veia umbilicais. anfíbios. O palco está.) Mesoderma extra-embrionário importantes. Pazmany et al. Uma criança expressa antígenos de histocompatibilidade principais de ambos. como ela rejeitaria um órgão daquela criança? Parece que o cório desenvolveu vários mecanismos pelos quais ele pode inibir a resposta imune contra o feto (Chaouat. diferem de indivíduo a indivíduo. 1990). observamos uma série incrivelmente bem coordenada de movimentos celulares pelos quais os blastômeros do estágio de clivagem são rearranjados e começam a interagir com seus vizinhos. agora.. permitindo a produção de leite mais tarde. . (C) dentro do mesoderma extra-embrionário. assim. provavelmente. Estudos recentes indicam que o cório pode ter ainda outra função. O terceiro hormônio produzido pelo cório é a somatomamotropina coriônica (freqüentemente chamada lactogênio placentário). esse fato é demonstrado pela rejeição a transplantes de pele e de órgãos de indivíduos geneticamente diferentes. e envolver o embrião com precursores ectodérmicos. (Segundo Gilbert. (A) Vilosidade primária composta de tecido citotrofoblástico encaixado no sinciciotrofoblasto.. [gast3. e pode promover a produção de certos tipos de linfócitos que impedem a resposta imune normal dentro do útero. cada tipo de organismo foi capaz de desenvolver uma maneira de conseguir esse objetivo. e o corpo da mãe rejeitará a pele ou órgãos de seus descendentes porque eles contêm antígenos derivados do pai. as funções da placenta incluem não só suporte físico e troca nutricional. que é a de proteger o feto da resposta imune da mãe. específico da placenta.html] Na gastrulação.

Nature 292: 511-516. 1975.. D.. Yamada. J. R. Genet. B. Cherr. Biol. H. A reinvestigation of the role of the grey crescent in axis formation in Xenopus laevis. E. Dev. Amphibian early development. J. A. Johnson. Boulekbache. J. Development 116: 819-830. E. Thiery. P. Interaction of epiblast and hypoblast in the formation of the primitive streak and the embryonic axis in chick. Biol. 146: 542-557. J. G. Parks. Gastrulation in the sea urchin embryo is accompanied by the rearrangement of invaginating epithelial cells. Biol. and Pedersen. Gimlich. L. Embryol. Role of secondary mesenchyme cells in the formation of the primitive gut in sea urchin larvae. Dausset. Cell Biol.-C. 1986. J.. HLA-G revisited. Yamada. Hara. 1977. T. and Gerhart. Cell Biol.-C. Dev. J. J. 147-204. C. K. R. Chen. Fisher. Cooke. 99: 1822-1830. Tech. C. 42: 442-498. Biol. Embryol. and Jackson.. K. E. R. and Damsky. Saunders. Cold Spring Harbor Press. J.. Cui. and Gerhart. Biol. Biol. 42: 195-207. Fink. and Kirschner. S. Patterns of cells and extracellular material of the sea urchin Lytechinus variegatus (Echinodermata. Echinoidea) embryo. and Eyal-Giladi. B. T. 1995. Adhesive and dlegradative properties of the human placental cytotrophoblast cells in vitro. 126: 182-194. 1986.. Sexton.. B. Early cellular interactions promote embryonic axis formation in Xenopus laevis. J. Bellairs. G. E. W. Philadelphia. P. a primary mesenchyme lineage-specific cell surface protein of the sea urchin embryo. L. K. and Thiery. III. M. BioScience 36: 541-549. D. K. Ettensohn. Aimar. Grahl. 1987. J. S. M.-Y. 5: 610-618. In Animal Applications of Research in Mammalian Development. and Darribère. J. 4th Ed. 1985. G. 1995. M. Biol. An extracellular matrix molecule that is selectively expressed during development is important for gastrulation in the sea urchin embryo. Anat. H. Myers. 1982. Chin. University of Washington Press. A. Morphol. and Pedersen. W. Boca Raton. and Boucaut. Burke. 1989. Exp. D’Arribère. Cyto-embryological studies of sea urchins. Dev. 140: 261-271. D’Arribère. T. C. R. 194: 275-280. Res. L. 146: 89-99.. Bull. Biol. Guida. 1986.-C... Boucaut. 1992. Biol. W. Cruz. J. Evidence for the role of fibronectin in amphibian gastrulation. 117: 380-391. Carosella.. A. M. Rev. M. A. and Gerhart. 116: 228-240. J.. and Morrill. T. and Solursh. Johnson. 1991 Cell movements during the initial phase of gastrulation in the sea urchin embryo. Bianchi.]: 211-227. J. A. Dan. Ubbels. Dev. S. Yamada. T. N. Tarpey. Biol. Development 122: 703-713. Li. G. S.. W.. Origin of extraembryonic mesoderm in experimental animals: Relevance to chorionic mosaicism in humans. Azar. 24: 64-79. Localization and expression of msp130. T. Immunol.. Y. 1985. D. . D. Boucaut. A. A. R. D. Biol. H. 1982. Gerhart. 1991. 1986. 107: 66-74. S. FL. High frequency twinning of Xenopus laevis embryos from eggs centrifuged before first cleavage. J. Axis formation in zebrafish. Hall. L.-C.. Embryol. 185: 387-402. M. Introduction to Embryology. K. Embryol. 1989.. L. The apical lamina of the sea urchin embryo: Major glycoprotein associated with the hyaline layer. H. R. H. Yamada. Dev. Med. Ettensohn. Guo-Yang. R. R. Microsc. L. Glycosaminoglycan localization and role in maintenance of tissue spaces in the early chick embryo. J. Aoyama. 1985. J. Berg. Exp. 1992. and Kirszenbaum. D’Arribère. Exp. G. J. from hatched blastula to late gastrula. 46: 542-550. I. Seattle. 1990.. L. Z. 22: 11-22. Origin of embryonic and extraembryonic cell lineages in mammalian embryos. Enders. and Okazaki. 1961.. Biol. 1991. H. The 140-kD fibronectin receptor complex is required for mesodermal cell adhesion during gastrulation in the amphibian Pleurodeles waltii. Am. 1985..-C. 94: 337-350. K. J. and Boucaut. Embryol. Opin. Biol. M. J. J. The regulation of primary mesenchyme cell patterning. P. T. Dev. Ettensohn. T. Dev.. R. Dev. and McClay. The primitive streak. J. 112: 383-390. Black. M. 109: 891-902. Bisgrove. and seven others. Eyal-Giladi. and Raff. 49: 295-306. 1979. D. H. Cell Biol. and Vacquier.. G. J. M. M. R. CRC Press. D. Morphol. S.D.. 1993. 104: 117-130. C. W. as revealed by hypoblast rotation experiments. 174: 1-14. The posterior section of the chick’s area pellucida and its involvement in hypoblast and primitive streak formation.. L. 1996. A. Balinsky. Wilkins-Haug. Gustafson. Larjava.-P. 1986. T. L. products of an EGF repeatcontaining gene. S. The regulation of primary mesenchyme cell migration in the sea urchin embryo: Transplantations of cells and latex beads. E. Chaouat. C. M. K. G. J. Biol. Nature 319: 60-63. J. J. Anstrom. and Wolpert.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 249 LITERATURA CITADA Alfandari. Dev.. Experimental control of the site of embryonic axis formation in Xenopus laevis eggs centrifuged before first cleavage. J. Influence of local environment on the organization of mesenchymel cells. 1956. Fisher. 1993. Permanent distortion of positional system of Xenopus embryo by brief early perturbation in gravity. Dev. Driever. Cold Spring Harbor. Development 101: 255-265. A. H. Fibropellins. Cellular movement and contact in sea urchin morphogenesis.. 1981. Development 118: 829-844. and Wolpert. 1981. Zhang.. 108: 310-324.. Appearance and distribution of fibronectin during chick embryo gastrulation and neurulation. 1967. Exper. 1990. Biologically active synthetic peptides as probes of embryonic development: A competitive peptide inhibition of fibronectin function inhibits gastrulation in amphibian embryos and neural crest cell migration in avian embryos. The Immunology of the Fetus. D. Cell Res. J. A. C. K. B. Damsky. and Hay. Poole. D’Arribère. K. D’Arribère. D.. 110: 29-42. V. J. In vivo analysis of integrin β 1 subunit function in fibronectin matrix assembly. Duband. C. J. and Solursh. Pictorial Human Embryology. Preservation and visualization of the sea urchin blastocoelic extracellular matrix. and Thiery.A.. 1988. Black. E. J.. D. 170: 249-261. Today 17: 407-409. and Morrill. Dev. Q Thiery. Morphol. Dev. Fisher. Biol. and Raff. and Harel. Morphol. J. D. K. and McClay. T. M. 1985. Baldwin. 1984. Galileo. R. Bursdal. Dev. D. Dev. Leaf. A.. M. Genet. Whittaker.. L. pp. N. Biol. S. Gustafson. Andrews. Bufonid nucleocytoplasmic hybrids arrested at the early gastrula stage lack a fibronectin-containing fibrillar extracellular matrix... 1990. 110: 1813-1823. P. Exp. Three cell recognition changes accompany the ingression of sea urchin primary mesenchyme cells. Dev. 61: 133-141. J. and Wessel. Y. Debby. D. D. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak. A. Integrin av subunit is expressed on mesodermal cell surfaces during amphibian gastrulation. DeSimone. and Boucaut.. T. J. Delarue. form a unique extracellular matrix structure that surrounds the sea urchin embryo. Gilbert. C. 1996.. Curr. K. R. Morphol. S. C. C. D. Gerhart.. C. Summers. E.. 89 [Suppl. 1984. Wilhelm Roux Arch. Black. Studies on the cellular basis of morphogenesis in sea urchin embryos: Directed movements of primary mesenchyme cells in normal and vegetalized larvae. 89: 168-178. 1985. K.

1992: 65-73. M. Development 119: 447-456. 54: 113-130. F. C. Am.). Semin. S. A. In Gilbert. and Catala.). 1992. Embryol. J. Dev. Wilhelm Roux Arch. and Cheng. Spatial and temporal changes in the amphibian egg. R. and Keller. The zebrafish midblastula transition. J. 1990. Biol. H.17: 306-520. 1: 335-345. Bilateral symmetry in the chick embryo determination by gravity. 2. Ho. Primary mesenchyme cell migration requires a chondroitin sulfate/ dermatan sulfate proteoglycan. Prospective areas and morphogenetic movements of the superficial layer. D. R. and arrangement as related to gastrulation in Xenopus laevis. B. contact. L.. 94: 261-318. and Elinson. Keller. A role for regulated secretion of apical matrix during epithelial invagination in the sea urchin. II. Chem. Kochav. Karp. Fibronectin visualized by scanning electron microscope immunocytochemistry on the substratum for cell migration in Xenopus laevis gastrulae. I. K. 1993. 1988. M. G. M. Coordinative effect of induction and inhibition. J. Biol. J. and Raunio. The cellular basis of epiboly: An SEM study of deep cell rearrangement during gastrulation of Xenopus laevis. Morphol. Khaner. Dev. Keller.. A study of the mechanics of gastrulation: Part II. Kane. 269: 21936-21939. studied by operative methods. and Wylie. H. E. J. G. 1985. 1995. M. J. Morphol. and Solursh. and Gerhart. L. 1988. Vital dye mapping of the gastrula and neurola of Xenopus laevis. W. S. A. A. M. ihre Rolle und Vertretbarkeit. J. J. Dev. L. J. Entwicklungsmech. J. Zool. R. In L. Langeland. M. Keller. pp. The role of secondary mesenchyme cells during sea urchin gastrulation studied by laser ablation. Holtfreter. and Danilchik. P. Wilt. M. I. Natl. Science 171: 1027-1029. Exp. Jurand. Wilhelm Roux Arch. Luckett. Anat. New York. and McClay. M. Keller. H. Browder (ed. Differentiation without cleavage in the egg of the annelid Chaetopterus pergamentaceous. Plenum. C.W. Biol. Biol. 1976. 1974. R. 53: 473-479. R. MA. Rev. E. Proc. W. J. 32: 1-33. 51: 118-137. J. 1993. In R. 60: 201-243. Hardin. Grapin-Botton. J. Lawson. 143: 389-397. A. J. W. Exp. Biol. W. M. C. The rotated hypoblast of the chicken embryo does not initiate an ectopic axisin the epiblast. 1971. the cell surface. Koehl. T. Gosfield. Wilhelm Roux Arch. Nakatsuji. C. Dev. Exp. E. 1939. F. J. Regional expression. 1978. Org. J. 7: 146-164. Ostrovsky. Sawyer and R. 95: 171-212. 139: 407-416. Lφvtrup. G. 1986. Fraser. Development 103: 193-209. A study of the mechanics of gastrulation: Part I. 1991. Acid mucopolysaccharide metabolism. Morphol.. Embryol. D. Dev. Dev. 1994. 1990.. Hörstadius. 0. N. D. 241-327. Churchill Livingston. E. R. Dynamic activity of the filopodia of sea urchin embryonic cells and their role in directed migration of the primary mesenchyme in vitro. 1985. K. J. Can. Biol. Isolation. 14: 477-499. USA 92: 10733-10737. Smolira. 1993.. K. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. R. Sunderland. Fisher. Lane. 112: 276-283. Harkey. Über die zur Entwicklung des Seeigellarven notwendigen anorganischen Stoffe. Zool. Development 103: 317-324. 97: 47-62. E. 14: 132-179. 172: 552-566. Fate maps and gastrulation in amphibia: A critique of current views. 182: 165-186. Patterning of the neural primordium in the avian embryo. 72: 409-437. 1997. D. C. A. Biol. and Birchmeier.. Target recognition by the archenteron during sea urchin gastrulation. Holowacz. and Keller. Le Douarin. Dev. 216: 81-101. Biol. Development 103: 211-230. and primary mesenchyme cell activity in the sea urchin embryo. Development Suppl. Human Embryology. R. Keller. Miller. 134: 206-214. Lytechinus variegatus. Dev. D. 1981. Biol. and Solursh. S. Holtfreter. J. S. 1993. Roles of bilateral zones of ingressing superficial cells during gastrulation of Ambystoma mexicanum. 1974. 1989. C. A. 1990. 1936. Some aspects of the development of the notochord in mouse embryos.. A. Keller. Biol. The mechanisms and mechanics of archenteron elongation during sea urchin gastrulation. 1902. A. Dev. The behaviour and function of bottle cells during gastrulation of Xenopus laevis. A. Landstrom. J. The Cellular and Molecular Biology of Invertebrate Development. Khaner. C. E. Lash. J. Vital dye mapping of the gastrula and neurula of Xenopus laevis. and Whiteley. Dev. Keller. Morphol. B. and Solursh. 1904. 1944. 42: 222-241..250 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Hardin. Exp. E. M. Zool. Hardin. Fate maps and cell differentiation in the amphibian embryo: An experimental study. R. 1943. Biol. T. Oppenheimer. is inactivated by UV irradiation of the oocyte. M. Biol. Zool. and Kimmel. pp. 1981. C. K. C. 115: 490-501. Malinda. Biol. Hartmann. Biol. S. 142: 87-105. A. Meneses. H. Morphol. J. M. B. Semin. F. 0. Exp. 1986. R. 1980. Dev. Hardin. (eds. Karp. Four-dimensional microscopic analysis of the filopodial behavior of primary mesenchyme cells during gastrulation in the sea urchin embryo. 1985. culture and differentiation of echinoid primary mesenchyme cells. 1995. Exp. Wilhelm Roux Arch. Embryol. Dynamics of thin filopodia during sea urchin gastrulation. J. Development 121: 2505-2511 Morrill. Adhesive properties and expansion of the chick blastoderm. J. Transplantation experiments on developing teleosts (Fundulus and Perca). M. Developmental Biology: A Comprehensive Synthesis. Embryology: Constructing the Organism. 1988. Embryol. III. and McClay. and Ettensohn. 1995. R. University of South Carolina Press. The embryology of fish. G. and Kimmel. Aca Sci. J. Kirschner. and Eyal-Giladi. C. Lane. Lillie. A. Dev. and Santos. Herbst. Biol. W. R. D..). Development 117: 1049-1060. M. The cellular basis of amphibian gastrulation. A scanning electron micrographical overview of cellular and extracellular patterns during blastulation and gastrulation in the sea urchin. The motility signal of scatter factor /hepatocyte growth factor mediated through the receptor tyrosine kinase Met requires intracellular action of Ras. M. R. An SEM study of cellular morphology. Development 113: 891-911. D. Zool. C. Dev. C. 1975. Embryol. 1975. Biol. J. 1979. R. 1977. Exp. R. Exp. The chick’s marginal zone and primitive streak formation. Scharz. Entwicklungsmech. M. Prospective areas and morphogenetic movements in the deep layer. Weidner. Migration of chick blastoderm under the vitelline membrane: The role of fibronectin. Exp. 152: 59-98. New. P. S. J. Y. Larsen. The mechanics of sea urchin development. Dev. Vol. Origin and differentiation of the yolk sac and extraembryonic mesoderm in presomite human and rhesus monkey embryos. R. 189: 111-122. N. Cell movements and cell fate during zebrafish gastrulation. G. Dev. 41: 110-123. pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis.. Hardin. E. J. and Schoenwolf. Biol. R. 3-33. . New York. 1996. Context-dependent cell behaviors during gastrulation. 1959. BioScience 31: 381-388. 107: 264-268. 7: 157-167. C. M. 1980. Showman (eds. and Pedersen. which induces dorsal axis formation in Xenopus. A. and Lφvtrup. An experimental analysis of the role of bottle cells and the deep marginal zone in the gastrulation of Xenopus laevis. U. R. and Eyal-Giladi. Development 119: 277-285. M. 1986. Cortical cytoplasm. Sinauer Associates. J. Lundmark. 1991. Org. and Bellairs. I.

W. D. Role of the substratum. J. Griffin (eds. C. C. Clark. 120: 384-706. Jr. 1966. E. B. Alan R. 57: 75-86. L. G. Formation of the primitive streak in the explanted chick blastoderm marked with carbon particles. R. L. 1990. 1996. Molecular Determinants of Animal Form. Keller. K. A scanning electron microscope study of cell shape and cell appendages in the primitive streak region of the rat and chick embryo.. 1992. J. Development 117: 307-317. 1947. M. D. R. G. 99-109. Dev. G. Schoenwolf. K.. and Revel. 1994. 1996. Biol. New York. Gastrulation: Movements. micromeres. D. Dev. 1994. Perryman. Psychoyos. and Gerhart. Development 121: 813-824. C. C. 1-28. Dehart. Differentiation 11: 185-190. and a urodele. M.. G. and Morriss.). 1993. Strahle. J. C. Garcia-Martinez. Mechanisms of Fundulus epiboly–a current view. D. and Jesuthasan. Fibronectin. 1993. E. Dynam. Growth Differ. C. Mesoderm movement and fate during amphibian gastrulation and neurulation.. and Gerhart. Cell rearrangement during gastrulation of Xenopus: Direct observation of cultured explants. Englewood Cliffs. Dev. Renfree. M. D. Biol. 38: 31-110. the YSL transition. and Stern. M. Spratt. 1991. 98: 250-254. T. M. R. M.. Ireland. Aparicio. B. Short (eds. Zool. Schroeder. T.. Sequential expression of germ layer specific molecules in the sea urchin embryo. Dev. Vrablic. 1989. supracellular continuity. Biol. Stern. 193: 235-248. 1984. S. Zool. Philos. Warga. Rev. L. J. 1987. and Keller. R. 1972. Shi. T. 111: 451-463. Smith. In C. J. T. Stern. Zool. Epithelial scatter factor and development of the chick embryonic axis. W. S. Davis. Gestaltungsanalyse am Amphibienkeim mit ortlicher Vitalfarbung. H. Development 122: 1523-1534. W. Dev. Entwicklungsmech. Development from primitive-streak stages to stage 12... 1990. Philos. Stern. 1988.. von Übisch. P. M. Keimblattchimarenforschung an Seeigellarven. pp. Jr. 138: 223-258. Biol.. C. Schoenwolf. and Keller. Dorsoventral polarity of the zebrafish embryo is distinguishable prior to the onset of gastrulation. A radioautographic study of labeled grafts in the chick blastoderm. Edelman (ed. NJ. 1984. Austin and R. Am. Dev. Mesoderm formation in the chick embryo revisited. and Diaz. 1996. and Molecules. Xenopus laevis. Spratt. Ambystoma mexicanum. C.). Soc. Endoderm movements in the chick embryo between the short streak and head process stages. N. and McClay. C. R. Wilson. N. J. F. 1986. Carson. and Canning. 1994. M. Glycosaminoglycan synthesis in rat embryos during the formation of the primary mesenchyme and neural folds. Johnson. D. Thery. 1995. 7: 51-63. G. Cambr. C. R. S.L. Vakaet. V. Carnegie Inst. 177: 356-370. M. J. L. A different type of amphibian mesoderm morphogenesis in Ceratophrys ornata. Clark. D. and differential growth in morphogenetic cell movements. Gastrulation: Movements. Schmidt. Soc.. Development Suppl. 1946. 201: 260-278. C. C. R. Dev. Am. Biol. Experiments in the development of chick and duck embryos cultivated in vitro. M. Waddington. Patterns. Ireland. Initiation of mesodermal cell migration and spreading relative to gastrulation in the urodele amphibian Pleurodeles walti. H. Jr. P. M.P. P. Exp. 1992. J. pp. D’Arribère. K. 103: 235-245. 1992: 75-80. Stern. J. Nature 343: 273-275. Trinkaus. E. S. 145: 97-138. Embryonic and Fetal Development. Wilhelm Roux Arch. and Campos-Ortega. and primary mesenchyme. J. Org. C. Trinkaus. [B] 13: 221. 1984a. C. Zool.. 104: 69-100. N. Solnica-Krezel. Development 110: 1271-1284.. Liss. Contrib. pp. Vogt. and Gherardi. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen’s node during gastrulation. Biol. D. H. P. Ultraviolet irradiation impairs epiboly in zebrafish embryos: evidence for a microtubule-dependent mechanism of epiboly. and the onset of gastrulation in Fundulus. 1939. and Strominger. 1991. I. G. J. M. Exp. J. D.. J. 1985. Zool. G. Origin of cells giving rise to mesoderm and endoderm in chick embryo.-C. T. A. J. ValésGómez. Gastrulation in birds: A model system for the study of animal morphogenesis. U. 1978. and Boucaut. Cell movements in the epiblast during gastrulation and neurulation in avian embryos. Trinkaus. In G. and F. Exp. D. Wessel. J. 177: 413-426.. Sugiyama. G. Sulik. Development 112: 289-300. 1983. J. and Kimmel. Jr. Jr. Biol. Vakaet.). Vincent. 2nd Ed. 24: 673-688. Science 274: 792-795. T.. 123: 526-539. Integrative mechanisms in development of early chick blastoderm. and F. D. J. B. N. 24: 555-562. D. L. Implantation and placentation. V. R.. Development 108: 569-580. Microtubule arrays of the zebrafish yolk cell: organizationand function during epiboly. Spratt. 180: 95-104. Zool. 103: 259-304. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. and Haas. 1985. Biol. and Stoker. 1981. Marchase. Ingression during early gastrulation of Fundulus. J. Exp. Purcell. G. J. Reyburn. Biol. H. Protection from natural killer cellmediated lysis by HLA-G expression on target cells. 29-41. and gastrulation in Xenopus. H. R. New York. Regression and shortening of the primitive streak in the explanted chick blastoderm. and Keller. Gray. Occurrence of mucopolysaccharides in the early development of the sea urchin embryo and its role in gastrulation. T. pp. Jr. Solursh. Patterns. Morphogenetic movements and fate maps in the avian blastoderm. C. Stem. Griffin (eds. Trans. K. M. II. 1958. Dev. Solursh. J.. 1977. and Driever. W.. Gesteland.. Cambridge University Press. B. Kinematics of gray crescent formation in Xenopus eggs. R. Subcortical rotation in Xenopus eggs: An early step in embryonic axis formation. Dev. In R. Sharpe. The origin of the mesoderm in an anuran. Biol. Ontogeny of the basal lamina in the sea urchin embryo. Plenum. Streit A. New York. 1972. Oster. W. 1960. Winklbauer. C. 14: 62-73. B. Wash. M.. 1932..T.. 1982. E. Exp. Dev. The midblastula transition. Lond.. Herrick. Cells into Organs: The Forces that Shape the Embryo.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 251 Pazmany. 1963. and Molecules. R. Vincent. D. R. Mandelboim. Cambridge. and Schoenwolf. G. Cell movements during epiboly and gastrulation in zebrafish. Keller. S. Development 120: 2443-2455. Schlesinger. P. Development 119: 451-453. and Malacinski. 0.-L. Wessel. Plenum. 161: 141-151. 113: 484-500. . Displacement of subcortical cytoplasm relative to the egg surface. Zool.. 14: 88-103.). 1996. Wilhelm Roux Arch. G. Morphogenesis of the murine node and notochordal plate. G. 1984b. mesoderm migration. Development of a “primitive” sea urchin (Eucidaris tribuloides): Irregularities in the hyaline layer. Regulated potentiality of separate parts. In R. Bull.M. The initiation of gastrula ingression in the chick blastoderm. D. and Canning. Trinkaus. 1991. Rosenquist.. Biol. W. Experientia 44: 651-657. Gherardi. P. C. 203: 374-380. 1990. PrenticeHall. Rosenquist. 26-69. L. Dev. Development 105: 351-363. The structural significance of the avian yolk in embryogenesis. Spratt. Dynam. Biol. M. 1929. Embryol.. Teil Gastrulation und Mesodermbildung bei Urodelen und Anuren. Dev. Dev. and McClay. E. B.

M. III. and Angres. M. Progesteron in menschlichem Blut und Geweben. In R. A. Biol. Winklbauer.. R. Wochenschr. 1991. 1956. C.252 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Winklbauer. and Molecules. Selchow. 147-168. W. 1991. B. Nagel. Zander.). and F. Keller. Directional mesoderm cell migration in the Xenopus gastrula. Mesodermal cell migration in the Xenopus gastrula. Griffin (eds. . and Nagel. 148: 573-589. Stoltz. Patterns. Plenum. Jr. Gastrulation: Movements. R. H.. 34: 944-953.. Clark. M. and von Miinstermann. A. Klin. pp. J. Dev. New York.

As fendas viscerais em embriões de aves e mamíferos não se parecem em detalhe às fendas das guelras de peixes adultos. chamando umas às outras. era a floresta que se estendia a minha frente naquele momento: o sistema nervoso central. ou o pêlo. 3. ordem e. As pessoas deveriam vagar o dia inteiro. 4. essa se divide em duas.1). o mais eminente embriologista de sua época*. pequenas aves ou mesmo mamíferos”. Assim. medulas espinhais e rins pronéfricos. Somente mais tarde se desenvolvem as escamas de peixes. RITA LEVI-MONTALCINI (1988) * K. asas e braços se tornam evidentes. Eles podem ser lagartos. garras e unhas dos mamíferos. se afasta mais e mais deles. o desenvolvimento precoce de membros é essencialmente o mesmo em todos os vertebrados. notocordas. depois quatro. 1. o embrião precoce de um animal superior nunca é como um animal inferior. maravilhadas. Enquanto peixes preservam e elaboram essas fendas tornando-as verdadeiras guelras. além de contribuir para o progresso conceitual aqui descrito. falando de nada exceto da célula. depois oito e assim por diante e. LEWIS THOMAS (1979) E M 1828 KARL ERNST VON BAER. elas se parecem às fendas viscerais de peixes embrionários e outros vertebrados embrionários. Somente mais tarde no desenvolvimento que as características especiais da classe. se você quiser se maravilhar. Você inicia como uma única célula derivada da união entre um espermatozóide e um óvulo. o ovo de mamífero e o ovo humano. aves e mamíferos) são muito semelhantes logo após a gastrulação. A Figura 7. von Baer descobriu a notocorda. as penas das aves. von Baer estabeleceu quatro generalizações. enquanto acordadas. espécie aparecem (veja Figura 7. em um certo estágio aparece uma única célula. Caracteres menos gerais são desenvolvidos a partir dos mais gerais. No momento. anunciou: Eu tenho dois pequenos embriões preservados em álcool. répteis. E. mas somente como seu embrião precoce. não consigo determinar o gênero ao qual pertencem. em lugar de passar através de todos os estágios adultos de outros animais. os mamíferos as convertem em estruturas tais como os tubos de Eustáquio (entre o ouvido e a boca). Inicialmente todos os vertebrados têm o mesmo tipo de pele. Da mesma maneira. Todos os vertebrados em desenvolvimento (peixes. finalmente. Cada embrião de uma dada espécie. anfíbios. até finalmente aparecerem os caracteres mais especializados. 2. ilustradas aqui com alguns exemplos de vertebrados. Ao contrário. as escamas de répteis. As características gerais de um grande grupo de animais aparecem no embrião mais cedo do que os aspectos especializados. De seu estudo detalhado sobre o desenvolvimento da galinha e da comparação de tais embriões com embriões de outros vetebrados. Somente mais tarde é que diferenças entre pernas. A mera existência de tal célula deveria ser uma das coisas assombrosas da Terra. Seu trabalho será mais discutido no Capítulo 23. é este processo.1 permite-nos apreciar seu dilema e ilustra as quatro leis gerais da embriologia propostas por von Baer. Von Baer verificou que diferentes Ainda mais atraente do que a mata virgem. 253 . que esqueci de identificar.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 253 Início do desenvolvimento vertebrado: Neurulação e ectoderma 7 Porque a verdadeira maravilha. Todos os embriões de vertebrados têm arcos de guelras. cuja descendência total é o cérebro humano.

pensa. sua ordem. realmente. os embriões se tornam reconhecíveis como membros de sua classe. FORMAÇÃO DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL Neurulação: aspectos gerais “Talvez a mais intrigante de todas as perguntas é se o cérebro é suficientemente poderoso para resolver o problema da sua própria criação. sua espécie. uma revisão de pesquisa sobre desenvolvimento do cérebro de mamíferos. Embriões humanos nunca passam por estágios equivalentes a um peixe ou uma ave adultos. e o mesoderma forma o tecido conjuntivo. odeia. nenhum deles passando pelos estágios dos outros. o endoderma forma os sistemas respiratórios e digestivos. O ectoderma forma a pele e os nervos. e coordena nossos processos corporais conscientes ou inconscientes é indubitavelmente o mais desafiante dos enigmas do desenvolvimento. sua família e. uma rã ou uma galinha. Von Baer também reconheceu que existe um modelo comum para todo o desenvolvimento de vertebrados: as três camadas germinativas originam diferentes órgãos. finalmente. este. Uma combinação de abordagens genéticas. o coração. ama. .254 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 7. lembra. Mais tarde. Embriões precoces de vertebrados mostram aspectos comuns ao subfilo inteiro. recentemente. os embriões de mamíferos e outros divergem.” Assim Gregor Eichele (1992) terminou. e essa derivação dos órgãos é constante se o organismo é um peixe. Neste capítulo acompanharemos o desenvolvimento precoce do ectoderma. celulares e orgânicas está fornecendo uma compreensão preliminar de como a anatomia básica do cérebro se torna ordenada. (de acordo com Romanes. as células do sangue.1 Ilustração das leis de von Baer. troca. I II III Peixe Salamandra Tartaruga Galinha Porco Boi Coelho Homem grupos de animais compartilham aspectos comuns durante o desenvolvimento embrionário precoce e que esses aspectos se tornam mais e mais característicos da espécie à medida que progride o desenvolvimento. 1901). O Capítulo 9 acompanhará o desenvolvimento precoce dos órgãos endodérmicos e mesodérmicos. embriões humanos inicialmente compartilham características comuns com embriões de peixes e aves. A construção de um órgão que reconhece. Com o progresso do desenvolvimento. engana a si mesmo. o sistema urogenital e partes da maioria dos órgãos internos. e o capítulo seguinte enfocam a formação do sistema nervoso nos vertebrados.

1937. 1993). Nessa interação. é construído por neurulação secundária (Pasteels. 1991b). que o recobre. Em camundongo (provavelmente no homem. M. e um embrião sofrendo essas transformações é chamado nêurula. as porções anteriores do tubo neural são construídas por neurulação primária. a criação de tecidos e órgãos específicos. uma camada mesodérmica intermediária e um ectoderma externo.. placa neural. (HF. Catala et al. (B) Fotomicrografias de neurulação em um embrião de galinha de 2 dias. o cordomesoderma estimula o ectoderma. mesencéfalo. a gastrulação cria um embrião com uma camada endodérmica interna. nódulo de Hensen. é chamado neurulação. (C) Formação do tubo neural vista em seções transversais do embrião de galinha na região do futuro mesencéfalo (setas em B). 1996). que se diferenciará em cérebro e medula espinhal.) (Fotomicrografias. Em neurulação primária. processo cefálico. invaginar e a se destacar da superfície formando um tubo oco. Em anfíbios. As células ectodérmicas estão representadas como precursoras da crista neural (preto) ou como precursoras da epiderme (cor). Existem dois caminhos principais para a formação do tubo neural. mas o tubo neural caudal é derivado de neurulação secundária (Gont et al.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 255 O processo pelo qual o embrião forma o tubo neural. ao passo que o tubo neural. HN. Neurulação primária Em vertebrados. a se proliferar. prega cefálica. o tubo neural se origina de um sólido cordão de células que se embebe no embrião e subseqüentemente se torna oco (forma uma cavidade) para formar o tubo neural (veja Schoenwolf. A interação entre o mesoderma dorsal e o ectoderma que a ele se sobrepõem é uma das interações mais importantes em todo o desenvolvimento de tetrápodes. HP. o rudimento do sistema nervoso central. Cada fotografia em C corresponde à outra acima dela. Os eventos da neurulação primária estão no (A) Placa neural Prega neural (B) (C) Crista neural Figura 7. também). porque ela inicia a organogênese. caudal ao par somito 27 (isto é. (A) Diagrama representativo da formação do tubo neural. cortesia de R. 1984. O quanto essas formas de construção são usadas depende da classe de vertebrados. NP. a neurulação secundária começa aproximadamente ao nível do somito 35 (Schoenwolf. como o Xenopus..) Epiderme Tubo neural . Na neurulação secundária. Em aves. 1993). A neurulação em peixes é exclusivamente secundária. o cordomesoderma estimula o ectoderma acima dele a formar o tubo neural oco. a maior parte do tubo neural do girino é produzida por neurulação primária. tudo posterior aos membros posteriores).2 Neurulação em anfíbios e amniotas. Nievelstein et al. Nagele. O ectoderma se dobra no ponto mais dorsal.. formando a epiderme externa e um tubo neural interno conectados pelas células da crista neural.

as células pigmentadas da pele e vários outros tipos de células. as quais migram da região de conexão entre o tubo neural e a epiderme. extensão e levantamento da placa neural. o ectoderma original é dividido em três conjuntos de células: (1) o tubo neural posicionado internamente. mostrando em cada caso nêurulas precoce (esquerda). Durante a neurulação primária. que inicia a neurulação na região dorsal do embrião. (D) Simulação computadorizada em três dimensões da constrição.2. de cima para baixo.256 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 7. e (3) as células da crista neural. e irão gerar os neurônios periféricos e a glia. 1975.3 Quatro vistas da neurulação em um embrião de anfíbio. Neste capítulo estamos considerando a resposta dos variados tecidos ectodérmicos. 1976. Placa neural Notocorda Notocorda Arquêntero Mesoderma Notocorda Mesoderma Cavidade do intestino Tubo neural Cavidade do intestino Endoderma Mesoderma Epiderme Endoderma Endoderma Epiderme Epiderme Notocorda Prega neural Epiderme (B) SEÇÃO SAGITAL Arquêntero Resto da blastocele Placa neural Notocorda Prega neural Placa neural Prega neural Blastóporo Blastóporo Cavidade do intestino Tubo neural Cavidade do intestino Mesoderma Endoderma Epiderme Mesoderma Endoderma Mesoderma Epiderme Endoderma Divertículo do fígado Tubo neural Placa neural (C) VISTA DA SUPERFÍCIE DORSAL Prega neural Placa neural Prega neural Pregas neurais fundidas Blastóporo Blastóporo (D) SIMULAÇÃO COMPUTADORIZADA DA DEFORMAÇÃO DA LÂMINA DE ECTODERMA (LINHA C) . será detalhada no Capítulo 15. D de acordo com Jacobson e Gordon. (A-C de acordo com Balinsky. (B) A mesma seqüência olhando a superfície dorsal do embrião inteiro. (2) a epiderme da pele posicionada externamente. O fenômeno de indução embrionária. média (centro) e tardia (direita).) Placa neural Prega neural (A) SEÇÃO TRANSVERSAL diagrama da Figura 7. (A) Seção transversal no centro do embrião. que formará o cérebro e a medula espinhal. (C) Seção sagital pelo plano mediano do embrião.

Em geral. Tanto as regiões da cabeça como as do tronco. 1989.4 O processo de neurulação primária em embriões de rã está descrito na Figura 7. Como resultado dessa indução neural. enquanto se move. a qual se transformará em epiderme.) .4).. enquanto as células destinadas a formar a epiderme se tornam mais achatadas. Catala et al.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 257 (A) Formação das pregas neurais (B) Elevação das pregas neurais (C) Epiderme presuntiva Placa neural presuntiva Zona de transição Placa neural Notocorda Formação de cunha Formação de sulco Epiderme Notocorda Ancoragem Figura 7. (4) o dobramento da placa neural para formar o sulco neural. (B) Enquanto as células da linha média da placa neural (células da placa do assoalho) são ancoradas à notocorda. aves e mamíferos (Galera. as pregas neurais são elevadas. A cabeça. Esses movimentos parecem continuar enquanto a epiderme. o tronco e a cauda formam. 1991a. dividindo os futuros lados direito e esquerdo do embrião (veja Figuras 7. (2) a formação do assoalho da placa neural. enquanto um sulco neural. discussão posterior neste capítulo). 1995. 1996): (1) a formação da placa neural..3 e 7. (A) Formação das pregas neurais ocorre quando as células epidérmicas presuntivas se movem para dentro. na direção da linha média do embrião. criando assim. As células da placa neural e as células da epiderme possuem seus próprios movimentos intrínsecos (Moury and Schoenwolf. sua região do tubo neural de maneira a refletir a relação da notocorda com o ectoderma que a ela se sobrepõe. As células ectodérmicas da linha média tornamse alongadas. As pregas neurais migram em direção à linha média do embrião. O alongamento das células ectodérmicas dorsais causa a elevação dessas regiões neurais presuntivas acima do ectoderma circundante. as células da placa neural presuntiva se distinguem do ectoderma circundante. (De acordo com Moury e Schoenwolf. sofrem variantes da neurulação primária. mas espacialmente e temporalmente se superpondo estágios (Schoenwolf. (C) Nas três regiões de articulação (no ponto de articulação mediano MHP e nos dois pontos de articulação dorsolateral a -DLHP). as bordas da placa neural se engrossam e se movem para cima formando as pregas neurais. e esse processo pode ser dividido em cinco estágios distintos.4).3 e parece ser similar em anfíbios. resultando na justaposição das pregas neurais.aparece no centro da placa. puxa com ela a placa neural. cada um. 1995). Logo após. 1992. Até 50% do ectoderma está incluído nessa placa. a placa neural. finalmente se fundindo para formar o tubo neural abaixo do ectoderma sobreposto. A primeira indicação que uma região do ectoderma está destinada a se tornar tecido neural é uma mudança na forma celular (Figura 7. e (5) o fechamento do sulco neural para formar o tubo neural. se movendo para o meio. em forma de -U. A formação da placa neural A formação da placa neural como uma região distinta de outras células ectodérmicas será discutida em detalhe nos Capítulos 8 e 15. Keller et al. (3) a modelagem da placa neural. As células da porção mais dorsal do tubo neural se tornam as células da crista neural. A mecânica da neurulação primária A neurulação ocorre com algumas variações em diferentes regiões do corpo. répteis. as células da placa neural mudam seu comprimento e sofrem uma constrição nos seus ápices. Representação esquemática do dobramento do epitélio durante a neurulação na galinha. Se a epiderme ao redor da placa neural é isolada. considera-se que o mesoderma dorsal subjacente (em colaboração com outras regiões do embrião) sinaliza às células ectodérmicas acima dela para se desenvolverem em células colunares da placa neural (Smith e Schoenwolf. Essa epiderme presuntiva empurra a placa neural abaixo dela. 1971).

sugere que o assoalho do tubo neural do tronco tem uma outra origem .) (B) Célula de galinha Célula de codorna . Melanócitos de codorna. as pregas neurais. Esses movimentos da placa neural e da epiderme originam as pregas neurais. Formação do assoalho da placa neural Anteriormente. suas células mais centrais se localizariam no fundo do tubo.4. suas células convergem e se estendem para formar uma placa mais delgada. originários da crista neural. Le Douarin e Teillet.que se origina em parte do nódulo de Hensen e é “inserido” no centro da placa neural. em direção à área onde estava a placa neural). 1995).258 PARTE II Padrões de Desenvolvimento as células se movem em direção ao centro (ou seja. Esses movimentos coordenados finalmente causarão a elevação e o dobramento do tubo neural (veja Figura 7. se tornariam as porções mais dorsais do tubo neural. Segundo. entretanto. As células de galinha e codorna. o tubo neural dorsal anterior da codorna substituiu uma região equivalente da galinha no embrião de 12-somitos. considerava-se que somente as células da linha média da placa neural formavam a placa do assoalho do tubo neural. Isso cria uma grande massa que se cora intensamente e é facilmente distinta da heterocromatina difusa da galinha. no fechamento da placa para formar o tubo neural. Se a placa neural é isolada. As partes mais periféricas. Para acompanhar as células embrionárias individuais do nódulo eles usaram o sistema de quimera galinha-codorna. as células se integram no embrião e participam da construção dos órgãos adequados. Primeiro. 1996.. Nas quimeras. (A) Duas quimeras galinha-codorna e uma galinha controle 4 dias após a eclosão. ela formará pequenas pregas neurais em cultura). (B) Uma região do embrião contendo tanto células de codorna (com sua cromatina altamente condensada) como células de galinha (com sua cromatina mais difusa). 1995. têm duas diferenças críticas. ao nível do enxerto. Evidência recente. Provavelmente é assim que se forma a região da cabeça. Embriões de galinha e codorna se desenvolvem de maneira muito semelhante (especialmente no desenvolvimento precoce). migram para as penas da cabeça. Ou seja. Le Douarin.5 Uma quimera galinha-codorna. Jacobson e Moury. e quando porções do embrião de codorna são enxertadas em uma região equivalente do embrião de galinha. o ectoderma é “torcido” e logo a epiderme presuntiva começa a recobrir a placa neural. O enxerto pode ser feito enquanto o embrião ainda está dentro do ovo. existem alguns antígenos que são específicos para a (A) Figura 7. tendo uma porção do seu corpo composta de células de codorna (Figura 7. se a “região de transição” contendo os dois tecidos é isolada. Inicialmente. mas não se fundem para formar um tubo neural. cortesia de N.5. Le Douarin. e o pinto que eclode é uma “quimera”. Esse modelo foi proposto por Catala e colaboradores (1995) baseado nos seus dados e em estudos anteriores de vários laboratórios. M. 1973). (Realmente. entretanto. (de Le Douarin et al. na codorna a heterocromatina do núcleo está concentrada ao redor dos nucléolos. fotografias. Moury e Schoenwolf. 1969.

Nas páginas 144 e 146 daquele livro (e reproduzido aqui na Figura 15. Esses pesquisadores removeram o nódulo de Hensen e o término caudal da notocorda em alongação de embriões de galinha com 6-somitos (1. 1996). Em aves e mamíferos. As células MHP ficam ancoradas à notocorda. Portanto. Daquele nível até a cauda. associadas com a placa neural. (B) Análise do eixo quimérico (marcado com antígeno específico para a codorna) mostrando células de codorna na notocorda (flecha) e placa do assoalho (cabeças de flecha). tanto a notocorda como a placa do assoalho foram compostas de células de codorna. Dessa maneira. o enxerto do lábio dorsal do blastóporo é mostrado como dando origem ao mesoderma dorsal (notocorda e somitos) e à placa do assoalho do tubo neural. elas alongam e estreitam a placa neural (veja Figura 7. se localizavam mais em direção à cauda do que o próprio nódulo. É interessante notar que (como previsto pela regressão do nódulo. de galinha. * A idéia de que a notocorda e a placa do assoalho são derivadas da mesma população de células é de apreciação recente. discutida no Capítulo 6) a placa do assoalho e as células da notocorda. o nódulo de Hensen contém as células necessárias para a formação da placa do assoalho caudal e da notocorda. 1988. 1996. as células da placa neural sofrem uma extensão convergente pela intercalação de várias camadas de células no meio de poucas camadas (Jacobson e Sater.6). mas esse fenômeno já havia sido documentado em um famoso livro de embriologia. a placa neural começa a dobrar-se mesmo quando ainda está sendo modelada. (B de Catala et al. abaixo delas.6 A placa do assoalho do tubo neural do tronco da galinha é derivado do nódulo de Hensen.. 1991a. Na galinha. A modelagem e dobramento da placa neural Forças intrínsecas à placa neural estão envolvidas na sua modelagem. 1989). na sua maioria. O livro Indução embrionária e desenvolvimento de Hans Spemann em 1938 tem uma ilustração do famoso experimento de enxerto de Spemann e Mangold. Endoderma dorsal Figura 7.. fotografia. mesmo quando a população celular é.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 259 (A) Somito 6 (B) Tubo neural Somito Nódulo de Hensen Codorna Galinha codorna e não são encontrados em células da galinha. As paredes do tubo neural foram produzidas da placa neural da galinha (Figura 7.uma ectodérmica e uma do nódulo de Hensen.7).* O tubo neural tem duas fontes distintas .12). cortesia de N. Schoenwolf e Alvarez. as células provocam um estreitamento da placa neural. Ao se tornarem mais colunares. essas células da linha mediana da placa neural são chamadas células do ponto de articulação mediano (MHP) e são derivadas da placa neural imediatamente anterior ao nódulo de Hensen e da sua linha média anterior (do nódulo de Hensen) (Schoenwolf.3c). Os dois fenômenos permitem distinguir células individuais de codorna. Catala et al. Tanto em anfíbios como amniotas. O dobramento da placa neural é conseqüência de forças intrínsecas e extrínsecas às suas células.) . Le Douarin. (A) Esquema da operação pela qual o nódulo de um embrião de galinha de 6-somitos é substituído pelo seu correspondente de codorna. M. mas a modelagem mais importante da placa é produzida pelas suas células da linha mediana que se situam diretamente acima da notocorda. As células da placa do assoalho se inserem na parte central do ectoderma dorsal e somente mais tarde é que a notocorda se separa da placa do assoalho pela formação de uma membrana basal entre elas (Figura 7.5 dias) e os substituiram com seus equivalentes de codorna.b.

Essas regiões são chamadas pontos de articulação dorsolateral (DLHPs). Depois da formação inicial de sulcos. entretanto. cortesia de N. tanto microtúbulos como microfilamentos estão envolvidos nessas transformações. (de Catala et al. as dobras aderem umas às outras e as células das duas partes se reúnem. 1980. Fechamento do tubo neural O tubo neural se fecha ao se aproximarem os pares de dobras neurais na linha média dorsal.) originando uma articulação em forma de sulco na linha média dorsal. Se pequenos pedaços da placa neural são isolados do resto do embrião (incluindo o mesoderma) eles tendem a se enrolar para fora (Schoenwolf. As células laterais à MHP não sofrem essas mudanças (Figuras 7. as células nessa junção formam as células da crista neural. as células da crista esperam até que o fechamento ocorra (Nichols. inibe o alongamento dessas células.260 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Placa neural Poço do nódulo de Hensen Articulação cordoneural Figura 7. Karfunkel. 1991). 1983). Smith e Schoenwolf. Essas células aumentam sua altura e adquirem a forma de cunha. Alvarez e Schoenwolf. forças extrínsecas também estão em ação. 1991a). enquanto citocalasina B.4 e 7.. a formação de cunha (Burnside. as células da crista neural cranial (que formam as estruturas da face e do pescoço) migram enquanto as dobras neurais estão se elevando (ou seja. Erickson e Weston. A colchicina. Essas células são induzidas pela notocorda a diminuir sua altura e adquirir a forma de cunha (van Straaten et al. Mas em aves. as células da crista neural não migram da região dorsal até que o tubo neural tenha sido fechado naquele local. fotografia. fornecendo mais uma força motora para o dobramento da placa neural (veja Figura 7. um inibidor de polimerização de microtúbulos.. um inibidor da formação de microfilamentos. Nos pontos de articulação dorsolateral.8). 1987). M. Le Douarin. Essa transformação (modelagem como cunha) está intimamente ligada às modificações da forma celular. duas outras regiões de articulações formam sulcos próximos à conexão da placa neural ao restante do ectoderma. enquanto que na região da medula espinhal.C. Logo após.7 O nódulo de Hensen contribui tanto para a notocorda como para a placa do assoalho neural. assim. 1988. 1989). antes do fechamento do tubo). Esse movimento da epiderme presuntiva e a ancoragem da placa neural ao mesoderma subjacente deve ser também importante para assegurar que o tubo neural se dobre para dentro do embrião e não para fora. a placa neural se dobra ao redor dessas regiões com articulações. e estão ancoradas ao ectoderma da superfície da prega neural. Em mamíferos. 1971. Nagele e Lee. 1996. impede a constrição apical dessas células impedindo. Seção através do nódulo de Hensen no estágio do somito-6. Em algumas espécies. . mostrando que esse contribui para a camada superior das células embrionárias. 1973. O ectoderma superfícial do embrião de galinha empurra na direção central do embrião. Cada uma delas age como um eixo que dirige a rotação das células ao seu redor (Smith e Schoenwolf. Enquanto isso. 1981. 1992). 1972.4 B.

enquanto as células epidérmicas achatadas são trazidas à linha média do embrião. W. Isso pode ser melhor observado naqueles vertebrados (como aves e mamíferos) cujo eixo corporal se alonga antes da neurulação. As células que eram a placa neural estão agora dentro do embrião.) A formação do tubo neural não ocorre simultaneamente ao longo do ectoderma. Tosney. (Fotografias.9 detalha a neurulação em um embrião de galinha com 24 horas. enquanto as células da placa neural. (A) Sulco neural rodeado por células mesenquimatosas.8 Micrografia eletrônica de varredura da formação do tubo neural no embrião de galinha. A neurulação na região cefálica (cabeça) está bastante adiantada. As células MHP formam uma articulação no fundo do tubo. A Figura 7. (C) A formação do tubo neural é completada. e o tubo neural é ladeado pelos somitos mesodérmicos e no fundo limitado pela notocorda. Essas três articulações podem ser vistas como sulcos. A epiderme presuntiva se localiza acima do tubo. ligadas à área basal do ectoderma da superfície formam as regiões de articulações dorsolaterais. cortesia de K.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 261 (A) (B) (C) Figura 7. (B) Células neuroepiteliais alongadas formam um tubo. A regionalização do tubo neural também ocorre como resultado de mudanças na forma . enquanto a região caudal (rabo) do embrião está ainda gastrulando.

Na ponta cefálica (onde se formará o cérebro) a parede do tubo é larga e grossa. 1993. Aqui. o tubo neural permanece um simples tubo que se afina em direção à cauda. 1949. As porções cefálicas estão terminando a neurulação enquanto as porções caudais estão ainda gastrulando. As duas pontas abertas do tubo neural são chamadas neuróporo anterior e neuróporo posterior.262 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 7. se inicia em vários locais ao longo do eixo ântero-posterior (Golden e Chernoff. cuja severidade depende de quanto da medula espinhal permanece aberta.10). Vários defeitos no tubo neural são causados pelo não fechamento em alguns segmentos (Figura 7. Na parte caudal à região da cabeça. 1971. de acordo com Huettner.) Prega neural Notocorda Espaço subcefálico Celoma extraembrionário Prega lateral do corpo Região pericárdica do celoma Vitelo aderente ao endoderma Sulco neural Prega neural Placa neural Endoderma do intestino médio Somito Divergência das pregas neurais Sulco neural Intestino Mesoderma extraembrionário Vitelo Prega neural Placa neural Endoderma Porta intestinal anterior Somito Mesoderma intermediário Mesoderma somático Celoma Mesoderma esplâncnico Nó de Hensen Poço primitivo Ilhota sagüínea Mesoderma Linha primitiva Sulco primitivo Margem primitiva Posterior do tubo. uma série de inchaços e constrições definirão os vários compartimentos do cérebro. Falha no fechamento na região posterior do tubo neural humano aos 27 dias (ou a ruptura subseqüente do neuróporo posterior logo em seguida) resulta na condição denominada espinha bífida.. Falha no fechamento do . O fechamento do tubo neural nos mamíferos. entretanto. Van Allen et al.9 Ectoderma da cabeça Mesênquima Anterior Ectoderma do blastoderma Estereograma de um embrião de galinha de 24 horas. 1993). diversamente da galinha. (de Patten.

O desenvolvimento do cérebro anterior fetal cessa.4mg diários de folato para reduzir o risco de defeitos do tubo neural durante a gravidez (Milunsky et al.* Foi estimado que aproximadamente 50% dos defeitos do tubo neural poderiam ser evitados se as mulheres grávidas tomassem suplementos de ácido fólico (vitamina B12).. [ecto1. são essenciais para a formação do tubo neural de mamíferos. Fujimori et al. 1990. CDC. A região do neuróporo anterior está se fechando. . sonic hedgehog e openbrain. (B) Vista dorsal de um embrião humano em neurulação. a separação do tubo neural da epiderme presuntiva é dramaticamente impedida (Detrick et al. o cérebro anterior permanece em contato com o líquido amniótico e em seguida degenera. Pax3.. 1993. e o Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos da América recomendam que todas as mulheres em idade fértil tomem 0. anencefalia. e a abóboda do crânio não se forma. Defeitos de fechamento do tubo neural podem freqüentemente ser identificados durante a gravidez por vários testes físicos e químicos. Essas anormalidades não são raras em humanos. originalmente expressam E-caderina. anterior e posterior.. No homem. 1990). Ambos neuróporos. Certos genes.17). um dia depois. 1996... *Colesterol parece ser necessário para a autoclivagem da proteína Sonic hedgehog. (C) Regiões de fechamento do tubo neural postulado por evidência genética (superimposta ao corpo do recém-nascido).) tubo neural anterior resulta em uma condição letal.html] O tubo neural finalmente forma um cilindro fechado que se separa do ectoderma da superfície. As células que se tornarão o tubo neural. (D) Anencefalia devido a falta de fusão da placa neural na região 2. mas elas param de expressar essa proteína ao se formar o tubo e. 1996). Como resultado.. 1992). (C-E de acordo com Van Allen et al. Czeizel e Dudas. Mutações da Sonic hedgehog podem impedir o fechamento do tubo neural em camundongos e no homem (Chiang et al.. a porção ativa da Sonic hedgehog é sua região N-terminal. 1996). 1996). Aqui. sintetizam N-caderina e N-CAM (veja Figura 3. em vez disso. (E) Espinha bífida devida a falta de fusão na região 5 (ou pela falta de fechamento do neuróporo mais posterior). Se o ectoderma da superfície passar a expressar N-caderina (injetando mRNA de N-caderina em uma das células do embrião de Xenopus de duas cabeças). pois estão presentes em aproximadamente um em cada quinhentos nascimentos viáveis. os dois tecidos não aderem mais um ao outro.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 263 (A) Prega neural Intumescência pericardíaca Placódio ótico Somitos Ectoderma da superfície Crista neural (B) Neuróporo anterior Intumescência pericardíaca (C) (D) (E) Tubo neural Somitos Borda cortada do âmnio 22 dias Sulco neural 23 dias Neuróporo posterior Normal Anencefalia Espinha bífida Figura 7. Considera-se que essa separação é mediada pela expressão de diferentes moléculas de adesão celular.10 Neurulação em embriões humanos. Essa região é clivada da molécula precursora em uma reação que requer colesterol como um cofator (Porter et al. 1989. mas fatores da dieta como colesterol e ácido fólico parecem ser críticos. enquanto o neuróporo posterior permanece aberto. Roessler et al. iniciando a neurulação. estão abertos ao líquido amniótico. 1992. certas síndromes envolvendo falhas no fechamento do tubo neural foram relacionadas às mutações na síntese de colesterol (Kelley et al. (A) Seções dorsal e transversal de um embrião humano de 22 dias.. O fechamento do tubo neural humano envolve uma complexa interação entre fatores genéticos e ambientais.

1993. além de promover a expressão de outros genes dorsalmente específicos (Figura 7. neurônios motores também serão formados.. Pax3 e msx1 da porção ventral do embrião.. Sonic hedgehog também funciona reprimindo a expressão de genes como dorsalin. (de Yamada et al.. as células do lábio dorsal do blastóporo continuam a crescer . (A) Diferenciação de neurônios motores é vista nos neurônios ventrolaterais. Figura 7.7B. Em ambos os casos. (C) Expressão de BMP7 enquanto o tubo neural se fecha.) (E) (A) Conjunto secundário de neurônios motores Placa do assoalho ventral doada por outro embrião Sinais dorsais (D) Inibição dos sinais dorsais por Sonic hedgehog Neurônios motores Indução de neurônios motores ventrolaterais Placa do assoalho ventral Neurulação secundária A neurulação secundária envolve a formação do cordão medular e seu subseqüente esvaziamento interno formando o tubo neural. Essa proteína induz certas células do lado ventrolateral do tubo neural a expressar genes que as transformam em neurônios motores (Figura 7. ele está recebendo sinais de dois outros conjuntos de tecidos. Esses sinais são instruções para que o tubo neural tenha uma determinada polaridade dorsoventral. esse tipo de neurulação é geralmente identificado na formação das vértebras lombar e da cauda. O destino dorsal do tubo neural é determinado pelas proteínas morfogenéticas do osso. ventralmente produzido pela Sonic hedgehog. Essas proteínas são expressas na epiderme dorsal presuntiva (Figura 7..264 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Informações adicionais & Especulações A modelagem dorsoventral do sistema nervoso E NQUANTO O TUBO NEURAL está sendo formado.11B. a neurulação secundária pode ser vista como continuação da gastrulação. Ericson et al.11A. 1993. 1995. fotografias. se as células da placa do assoalho ou as células que expressam o Sonic hedgehog são transferidas para uma posição lateral. Liem et al. Prancha 32). (E) Resumo das interações pela quais Sonic hedgehog promove o desenvolvimento de neurônios motores e inibe sinais de dorsalização. Liem et al. (B) BMP4 expresso na epiderme dorsal presuntiva durante a formação do tubo neural. O papel dessas proteínas foi confirmado por experiências in vitro nas quais tubos neurais isolados foram expostos a produtores desses sinais (Yamada et al. cortesia de K.. O tubo neural ventral parece ser modelado pela proteína Sonic hedgehog originária da notocorda e das células da placa do assoalho (veja Figura 7. Na rã e na galinha. 1996). Esses genes seriam expressos normalmente ao longo do tubo neural mas são inibidos pelo sinal.Liem. 1995).11D). Entretanto.C) e foi demonstrado que elas contrariam o efeito da Sonic hedgehog (permitindo a expressão de genes como (B) msx1 e Pax3 na porção dorsal do tubo neural). provavelmente BMP4 e BMP7.11 (C) A modelagem dorsoventral do tubo neural.

em um girino linear com 9mm de comprimento. e contém precursores da porção mais posterior da placa neural e a porção posterior da notocorda. nos concentraremos no desenvolvimento daquele que supostamente faz o Homo sábio. Gont et al. A parte proximal do canal neurentérico.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 265 Notocorda Blastocele Placa neural presuntiva Movimentos de extensão posterior Medula espinhal Canal ependimário Intestino Assoalho Te t o Notocorda Articulação cordoneural Parede posterior Movimentos involutivos Ectoderma (A) (B) Lábio dorsal tardio (articulação cordoneural) (C) Ânus Canal neurentérico Figura 7. A ponta da cauda é um descendente direto do lábio dorsal do blastóporo. na ponta do lábio. Diferenciação do tubo neural A diferenciação do tubo neural nas várias regiões do sistema nervoso central ocorre simultaneamente de três maneiras diferentes.12 Movimentos celulares durante a neurulação secundária em Xenopus. e as células que revestem o blastóporo formam o canal neurentérico. Finalmente. essa estrutura não é uma massa não diferenciada de células. O crescimento dessa região converte a gástrula aproximadamente esférica. (de Gont et al. o lúmen do tubo neural) (Figura 7. parte do qual se torna o lúmen do tubo neural secundário. já tem células com um destino determinado. A região em crescimento. a população celular da parede do tubo neural se rearranja para formar as regiões funcionalmente diferentes do cérebro e da medula espinhal. as próprias células neuroepiteliais se diferenciam em numerosos tipos de neurônios e células de suporte (gliais) presentes no corpo. em lugar de involuir para o embrião (Figura 7. Catala e colaboradores (1995) mostraram que o broto de cauda precoce. e essa região contém as células que dividem-se para formar ambas. 1. é chamada articulação cordoneural (Pasteels. Como se dá na rã. . O tubo neural se forma à medida que a corda medular produz pequenas cavidades. A involução cessou e ambos.) ventralmente. mas como o cérebro humano é provavelmente a matéria mais organizada do sistema solar e o órgão mais interessante do reino animal.12A. Formação das regiões do cérebro O desenvolvimento precoce da maioria dos cérebros de vertebrados é parecido.(B) Movimentos do lábio dorsal do blastóporo nos estágios de gástrula tardia/ gástrula precoce.13). A nível de tecido. (A) Involuçào da mesoderma no estágio de gástrula média. 1993. no nível celular. Exatamente como no Xenopus. o ectoderma e o mesoderma do lábio tardio do blastóporo se movem posteriormente. (C) Estágio de girino precoce.2mm de diâmetro.B).. que se fundem umas às outras (Figura 7. o tubo neural e seu lúmen se expandem e se contraem para formar as câmaras do cérebro e a medula espinhal.. a notocorda e a corda medular. 1937). Enxertando pequenas regiões do broto da cauda da codorna no broto da cauda da galinha. 1993). enquanto que a porção distal se torna o canal ependimário (isto é. onde as células revestindo o blastóporo formam o canal neurentérico. Na galinha.12C. Em nível anatômico macro. funde com o ânus. essas células se movem posteriomente. Como o broto da cauda da rã. os tecidos localizados posteriomente ao neuróporo recentemente fechado são chamados de broto da cauda. existe uma articulação cordoneural.

a porção mais anterior está sofrendo mudanças drásticas. formados pelas paredes e cavidades do cérebro. O metencéfalo dá origem ao cerebelo. Entretanto. (D) Lumens coalescem para formar o canal central do tubo neural.Fibras nervosas entre o cérebro e o cerebelo (somente mamíferos) . 1995. A direita estão os derivados em adultos.Centro reflexo de atividades involuntárias . cortesia de N. sono e regulação respiratória 5 vesículas primárias Hipocampo Cérebro .Centro de retransmissão para neurônios ópticos e auditivos . (C) Formação de cavidades do tubo neural e formação da notocorda.) (B) (C) Notocorda O tubo neural precoce de mamíferos é uma estrutura reta.266 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) Figura 7. cérebro médio (mesencéfalo) e cérebro posterior (rombencéfalo).Associação Metencéfalo Cérebro posterior (Rombencéfalo) Medula espinhal Medula . O cérebro posterior (rombencéfalo) desenvolve um modelo segmentado que especifica os lugares de onde se originam certos nervos.) Derivados Adultos Lobos olfativos .Visão . O telencéfalo formará os hemisférios cerebrais.. mesmo antes que a porção posterior do tubo se forme. As três vesículas cerebrais primárias são subdivididas enquanto o desenvolvimento continua. cujos neurônios dão origem aos nervos que regulam os movimentos respiratórios. (A) A formação do cordão medular na ponta mais caudal do broto da cauda da galinha. Cerebelo Mielencéfalo Ponte .Temperatura. a parte do cérebro responsável pela coordenação dos movimentos. Alargamentos periódicos chamados rombômeros dividem o (D) Figura 7.14 Desenvolvimento precoce do cérebro humano. M. O cérebro anterior se subdivide no telencéfalo anterior e o diencéfalo mais caudal. lobos ópticos e tectum.13 Formação do tubo neural secundário no embrião de galinha de 25-somitos. (De acordo com Moore e Persaud. O mesencéfalo não se subdivide e seu lúmen se tornará o aqueduto cerebral. gastrointestinais e cardiovasculares.Fibras nervosas entre os cérebro anterior e posterior. O rombencéfalo se subdividirá em um mielencéfalo posterior e um metencéfalo mais anterior. (de Catala et al.Glândula pineal . Le Douarin. Quando se fecha a ponta posterior do tubo neural. (B) Cordão medular pouco mais anterior no broto da cauda. e o diencéfalo formará o tálamo e o hipotálamo e também a região que recebe os impulsos neurais da retina. Na verdade. O mielencéfalo vai dar origem à medula oblongata (Bulbo). fotografias.Cheiro 3 vesículas primárias Parede Cavidade Telencéfalo Cérebro anterior (Prosencéfalo) Cérebro médio (Mesencéfalo) Diencéfalo Retina Epitálamo Tálamo Hipotálamo Mesencéfalo Cérebro médio .14): cérebro anterior (prosencéfalo). postura e equilíbrio.Armazenamento de memória . o tubo neural se expande em três vesículas primárias (Figura 7. 1993. Nessa região anterior. dilatações secundárias -as vesículas ópticas. a própria retina é uma derivação do diencéfalo.Coordenação de movimentos musculares complexos .se estendem lateralmente de cada lado do cérebro anterior em desenvolvimento.

enche a região do cérebro mas não passa para a região espinhal.) (A) (B) (D) Figura 7. (A) Corante injetado na porção anterior do tubo neural de galinha de 3 dias. 1989. (de Lumsden e Keynes. r2. produzindo uma constrição no tubo. Desmond e Field. onde os primeiros neurônios aparecem nos rombômeros de número par. na base do cérebro (Figura 7. Considera-se que essa rápida expansão é causada por uma pressão fluida positiva. o cérebro da galinha aumenta a uma velocidade muito menor e contém um número menor de células. r4 e r6 (Figura 7. Essa oclusão (que também ocorre no embrião humano) efetivamente separa a região cerebral presuntiva da futura medula espinhal (Desmond.15. (Cortesia de M. aqueles do r4 formam o sétimo nervo cranial (facial) e o oitavo (vestibuloacústico). mas isso parece não acontecer.) . Neurônios foram visualizados pela marcação com anticorpo para proteínas de neurofilamentos. 1992). após aumento inicial do cérebro. Neurônios dos gânglios r2 formam o quinto nervo cranial (trigêmeo). mas não com células de rombômeros adjacentes (Guthrie e Lumsden. 1989). extensão e no fato de que isso resulta primariamente em um aumento de tamanho de cavidade e não de crescimento de tecido. aberto para mostrar as paredes laterais.16 Oclusão do tubo neural para permitir a expansão da futura região do cérebro. keynes. 1991). o nono nervo cranial (glossofaríngeo) nasce do r6. o volume do cérebro expande 30 vezes entre os dias 3 e 5 do desenvolvimento. Schoenwolf e Desmond. (D) A reabertura da oclusão. 4 e 6 podem ser identificados pela alta densidade de axônios nesse estágio precoce do desenvolvimento. normais. o tecido dorsal circundante empurra para dentro. permite a passagem do corante da região do cérebro para a da medula espinhal.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 267 rombencéfalo em compartimentos menores. (B. cada rombômero tem um destino de desenvolvimento diferente. 1986. rápida. Os rombômeros representam “territórios” separados de desenvolvimento onde células de cada rombômero podem se misturar livremente dentro dele. Além disso. exercida contra as paredes do tubo neural pelo fluido no seu interior. 2 4 6 Figura 7. enquanto as pregas neurais vão fechando a região entre o cérebro presuntivo e a medula espinhal.html] A expansão do cérebro embrionário precoce é notável em sua velocidade.C) Seção do tubo neural da galinha na base do cérebro (B) antes da oclusão e (C) durante a oclusão. [ecto2. Em embriões de galinha.15 O cérebro posterior (Rombencéfalo) de um embrião de galinha de 2 dias. Desmond e Schoenwolf. Se for removida a pressão do fluido na porção anterior de um tubo neural assim ocluído. Seria de se esperar que essa pressão do fluido fosse dissipada pela medula espinhal. dos ventrículos cerebrais. cortesia de A. Isso foi extensivamente estudado na galinha. 1982). Lumsden e Keynes. 1984. Rombômeros 2. A região ocluída do tubo neural abre novamente após a expansão inicial. Desmond. Na verdade.16. quando comparado com embriões controles.

onde se expressa o gene Otx2. (de Shawlot e Behringer. Acampora et al. Shawlot e Behringer. os embriões parecem normais (Figura 7. As partículas .. Marin e Puelles. os detalhes da especificação do cérebro posterior e da medula espinhal pelo gene Hox serão discutidos no Capítulo 16. quando transplantaram partículas contendo FGF8 para o diencéfalo ou o rombencéfalo.19A. Os limites prosoméricos coincidem com os limites de expressão de vários genes que são considerados importantes na especificação neural.) 1994. 1995). Aqui não se verifica uma fronteira morfológica. pois tecidos em ambos os lados do enxerto são induzidos (Figura 7. Mais ainda. Os genes Lim1 e Otx2 são expressos por esses tecidos mesodérmicos anteriores. 1995. A borda p2/p3 é considerada a fonte da proteína Sonic hedgehog. um filhote do tipo selvagem está na parte de cima. Rubenstein e Puelles (1994) propuseram que o cérebro anterior é composto por seis regiões neuroméricas chamadas prosômeros. Quando tecido da junção mesencéfalo médio e anterior é transplantado ao diencéfalo ou rombencéfalo.19B). A maioria dos mutantes Lim1 morrem antes do nascimento. Bally-Cuif e Wassef. A área limite mesencéfalo/metencéfalo é positiva para a expressão dos genes Fgf8 e Wnt1. Se um deles não está presente. Partículas controle embebidas em salina não mostraram essa duplicação. Essa interface corresponde a uma zona limitans e é também a fonte de Sonic hedgehog. Dois camundongos com “knockout” de Lim1 estão na parte de baixo da figura. Na parte caudal. As pinas do ouvido (flechas) são as estruturas mais anteriores nesses mutantes. 1994). (de acordo com Bally-Cuif e Wassef. mas ela é marcada pela porção mais posterior. Se a junção for girada pode se dar uma “triplicação”. As regiões dos cérebros anterior e médio são definidas pelo mesoderma subjacente e pela notocorda anterior. A interface p2/p3 pode ser crítica na modelagem da região do cérebro anterior. Uma das regiões críticas para o desenvolvimento do cérebro médio é a borda entre o metencéfalo/mesencéfalo que normalmente dará origem aos tecidos do istmo. Crossley e colegas (1996) verificaram que esse tecido formador de istmo secreta FGF8.268 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Informações adicionais & Especulações Determinando as regiões do cérebro anterior e cérebro médio A identidade ântero-posterior de cada vesícula do cérebro de mamíferos é especificada durante a gastrulação pelo mesoderma precordal e pela notocorda. em relação ao rombômero 2.18. ele induz as células que o rodeiam a desenvolver destinos mesencefálicos (no diencéfalo) ou cerebelares (no rombencéfalo) (Figura 7.) Figura 7. Prosencéfalo Mesencéfalo Mes/Met limite Metencéfalo Rombencéfalo Medula espinhal En (Engrailed) Wnt1 Fgf8 (Fator de crescimento do fibroblasto) shh (Sonic hedgehog) Figura 7. 1994). por interações a nível do ectoderma. Somente as moléculas principais envolvidas na especificação dos cérebros anterior e médio serão aqui discutidas. eles obtiveram duplicadas as mesmas estruturas do cérebro médio. Rubenstein e Puelles. Essa especificação parece ser estabilizada no estágio de placa neural. o embrião não forma o cérebro anterior ou o médio. uma proteína difusível considerada indutora de modelagem durante a gastrulação e formação de membros (Figura 7. Eles também são considerados como limitantes de respostas a certos estímulos externos. Essa região indutora mes/met parece ser controlada pelo fator de crescimento de fibroblasto 8 (FGF8). 1995.17.17 Fenótipo sem cabeça de camundongo deficiente em Lim1. cortesia dos autores. 1995. Os prosômeros p1-p3 correspondem ao diencéfalo e os prosômeros p4-p6 ao hipotálamo (ventralmente) e ao telencéfalo (dorsalmente).18 Estrutura neuromérica do cérebro com superposição dos hipotéticos eventos indutivos.

cb. camundongos deficientes em Wnt1 não possuem a região do cérebro médio e nem o cerebelo (McMahon e Bradley. P2. Thomas e Cappecchi. ist. 1990). como o tectum óptico. Mesmo que o cerebelo não expresse genes Wnt1.19 (A) Mesencéfalo Diencéfalo Mes/Met limite Cérebro médio e cerebelo Tectum A região da junção mesencéfalo/metencéfalo (“mes/met”) pode agir como um indutor do desenvolvimento do cérebro médio e da expressão “engrailed” quando rodada ou transplantada a outras regiões do cérebro. Wnt1 e Engrailed são considerados importantes na formação do cerebelo. griseum tectale. 1996). Wnt1 parece manter a expressão do gene Engrailed nas células precursoras cerebelares. istmo. segmento talâmico dorsal. 1994.. 1990. ot. Esses três genes são normalmente expressos na região do istmo. torus semicircularis: P1. terceiro nervo cranial ou oculomotor.html] Figura 7. Danielian e McMahon. cerebelo. IV. TS. tectum óptico. [ecto3.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 269 com FGF8 também induziram a expressão de três genes nos tecidos circundantes Wnt1. quarto nervo cranial ou troclear.) Região expressando En Telencéfalo En (Engrailed) Wnt1 Fgf8 (Fator de crescimento do fibroblasto) Cérebro posterior (B) Diencéfalo Mesencéfalo ist/cb istmo/ cerebelo Rombencéfalo Metencéfalo Cérebro médio Rombencéfalo Cerebelo Peça invertida Indução da estrutura mesencefálica Duplicação e polarização relativa ao tecido cerebelar En mais próximo Mesencéfalo Diencéfalo Diencéfalo Mesencéfalo Eixo longo Rombencéfalo Rombencéfalo . (B de acordo com Rubenstein e Puelles. A polaridade postulada é representada por flechas. Engrailed-2 e o próprio Fgf8. 1994. (A) O transplante da junção mes/met induz a expressão do gene engrailed e das estruturas do cérebro médio e cerebelo em posições ectópicas. (B) Rotação da junção mes/met causa “triplicação” de certas estruturas. III. permitindo a sua proliferação (Dickinson et al. segmento pre-tectal. Abreviações: gt.

Tosney. certas células não mais incorporam esses precursores de DNA. Figura 7. 1977. Células com aniversários mais tardios. se diferenciar na periferia do tubo neural (Fujita. Se células em divisão são marcadas com timidina radioativa em um único estágio de seu desenvolvimento e seus descendentes são identificados no córtex externo do cérebro adulto. Essa divisão é a ultima do neurônio e é chamada de “aniversário” do neurônio. (A de acordo com Sauer. adjacente ao lúmen. mostrando células em diferentes estágios do ciclo celular.270 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Tecido Arquitetura de Tecido no Sistema Nervoso Central Os neurônios do córtex cerebral estão organizados em camadas. Nesses casos. Marcação em diferentes pontos do desenvolvimento mostra que células com aniversários mais precoces migram distâncias mais curtas.) (A) Estágio do ciclo celular (B) Lúmen do tubo neural . agora. Durante o desenvolvimento precoce de mamíferos. mas como seus núcleos estão em diferentes alturas. recém-formado. B. enquanto a outra célula filha se afasta (Chenn McConnell. formado por uma única camada de células. tem-se a impressão que a parede do tubo neural é composta por diversas camadas de células. 1966. da borda luminal até a borda externa. Células mitóticas são encontradas próximo ao centro do tubo neural. 1995). cada uma tendo diferentes funções e conexões. indicando que não estão mais participando da síntese de DNA e da mitose. Essas células neurônicas e da glia podem. Diferentes neurônios e células gliais têm seus aniversários em tempos diferentes. Sauer (1935) e outros mostraram que essas células estão presentes na parede do tubo neural continuamente. A diferenciação que se segue depende da posição que esses neurônios ocupam uma vez fora da região de células em divisão (Letourneau. (B) Micrografia eletrônica de varredura de um tubo neural de galinha. Essa população de células divide-se rapidamente. cortesia de K. a célula adjacente ao lúmen fica ligada à superfície ventricular. mostrando a posição do núcleo de uma célula neuroepitelial como função do ciclo celular. 100% das células do tubo neural incorporam timidina radioativa ao DNA (Fujita. migram através dessas camadas para formar as regiões superficiais do córtex. 1964). Logo em seguida. O tubo neural original é composto de um neuroepitélio embrionário.20 Seção esquemática do tubo neural de um embrião de galinha. 1991). e o núcleo migra luminalmente enquanto a mitose continua (Figura 7. Isso acontece quando a célula se divide “verticalmente” em lugar de “horizontalmente”. Jacbson. A síntese de DNA (fase S) ocorre quando o núcleo está na borda externa do tubo. 1935. isso significa que os neurônios tiveram que migrar para sua posição cortical a partir do neuroepitélio embrionário. A mitose ocorre no lado luminal da camada celular. 1968).20). Jacobson.

criando portanto uma zona marginal pobre em células. dando-lhes uma aparência esbranquiçada. os neuroblastos ou glioblastos em migração formam uma placa cortical contendo seis camadas. A massa cinzenta (manto) gradualmente adquire uma estrutura com forma de borboleta rodeada pela massa branca. ambas são envolvidas por tecido conjuntivo. e a camada marginal. a zona do manto. Essa camada se torna progressivamente mais espessa à medida que mais células do neuroepitélio embrionário são adicionadas. A porção dorsal recebe estímulos dos Figura 7. como massa branca. manto e marginal. Essa nova camada é chamada zona do manto (ou intermediária) e o epitélio embrionário é agora chamado de zona ventricular (e. mais tarde. o epêndima é a única fonte de neurônios e células gliais. Seção de um tubo neural humano de 5 semanas.21 Diferenciação das paredes do tubo neural. Assim.aparece para dividi-lo em duas partes. (De acordo com Jacobson. 1991. as células migratórias formam uma segunda camada ao redor do tubo neural original. um sulco longitudinal -sulcus limitans. epêndima) (Figura 7. contendo 3 zonas: ependimária. a do manto e a marginal é mantido durante todo o desenvolvimento. dorsal e ventral.) .CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 271 Placa cortical (CP) Zona intermediária (I) Medula espinhal Camada ependimária (E) Zona ventricular germinal (V) Camada granular externa (EG) Lâmina dissecans (L) Zona marginal (M) Camada granular (GL) Zona subventricular (S) Camada das células de Purkinje (P) “Camada molecular” de axônios das células granulares Cerebelo Tubo neural Camada molecular Neocórtex Córtex cerebral Massa branca Enquanto as células adjacentes ao lúmen continuam a se dividirem. No córtex cerebral (linha inferior). No cerebelo (linha do meio) uma segunda camada mitótica. À medida que o tubo neural amadurece. Os neurônios fazem conexões entre si e emitem axônios se afastando do lúmen. As células da zona do manto se diferenciam em neurônios e células gliais. contendo os corpos celulares. Neuroblastos dessa camada migram de volta para a zona intermediária para formar as células do grânulo. é freqüentemente referida como massa cinzenta. axonal. O esquema básico de três camadas: a ependimária. se forma na região mais remota do epêndima.21). Células gliais cobrem muitos desses axônios da zona marginal com bainhas de mielina. Na medula espinhal e no bulbo (linha superior). tanto na medula espinhal como no bulbo. a camada granular externa.

neuroblastos. (E) Um segmento da medula espinhal com suas raízes sensoriais (alar) e motoras (basal). Na parte interna da camada estão os neuroblastos pós-mitóticos que são os precursores dos neurônios mais importantes do córtex do cerebelo. Alguns neurônios penetram a massa branca para diferenciarem-se em aglomerados de neurônios chamados núcleos. em divisão. incluindo os notáveis e grandes neurônios de Purkinje.22 Neurônio de associação Raiz dorsal Desenvolvimento da medula espinhal humana.272 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) (C) (D) Epiderme Região presuntiva basal Região presuntiva alar Sulcus limitans (E) Gânglio da raiz dorsal Nervo espinhal Neurônio sensorial Neurônio somático motor Figura 7. e o teto e o assoalho se tornam distintos. 1993. Para . o crescimento diferencial e a morte celular seletiva produzem modificações no modelo de três camadas. (De acordo com Larsen. enquanto a porção ventral está envolvida na realização de várias funções motoras (Figura 7.22). os neuroblastos proliferam. o tubo neural se diferencia nas zonas ependimária. mais do que qualquer outro neurônio estudado. as células neurônicas precursoras. No limite externo da camada embrionária externa (na espessura de uma ou duas células). formando uma nova zona embrionária. que se espalha como um leque sobre o corpo celular em forma de bulbo. Uma célula de Purkinje típica pode formar até 100. próxima ao limite externo do tubo neural.000 sinapses com outros neurônios. a camada ependimária original do cerebelo origina uma grande variedade de neurônios e células gliais. camada embrionária externa. Organização do cerebelo No encéfalo. que são os únicos neurônios que liberam impulsos para fora do córtex cerebelar. Enquanto os condroblastos da região esclerótoma do somito formam as vértebras espinhais. servindo como uma estação de retransmissão entre as camadas externas do cerebelo e outras partes do encéfalo. as células granulares. Enquanto isso. Cada núcleo desempenha o papel de uma unidade funcional. O desenvolvimento de uma organização espacial é crítico para o funcionamento correto do cerebelo. B). (A-D) O tubo neural é funcionalmente dividido nas regiões dorsal (alar.) Camada marginal Camada do manto Camada ependimária (ventricular) neurônios sensoriais. Essas células neuronais pré-granulares migram de volta para a massa branca do cerebelo em desenvolvimento para produzir células neurônicas granulares em uma região chamada camada granular interna. a migração celular. A) e ventral (basal. especialmente no cerebelo e no cérebro. Além disso. migram para a superfície externa do cerebelo em desenvolvimento. do manto e marginal. Cada neurônio de Purkinje também emite um axônio delgado que se comunica com outras células nos núcleos cerebelares profundos. separadas pelo sulcus limitans. Cada um deles tem um enorme aparelho dendrítico. Todos os impulsos regularão a atividade da células de Purkinje.

O neurônio mantém sua adesão à célula da glia através de várias proteínas. 1991). A análise de mutações neurológicas no camundongo poderá. Se a astrotactina na célula nervosa é mascarada pelo seu respectivo anticorpo. Através do córtex. Ela atinge velocidades de 60 µm/hora em sua migração nos prolongamentos gliais. [ecto4. Rakic. as células adequadas devem se diferenciar no tempo e local adequados. cortesia de M. Como isso acontece? Um mecanismo considerado importante para posicionar neurônios jovens dentro de encéfalo de mamíferos em desenvolvimento é o direcionamento glial (Rakic. Por razões óbvias essas mutações são identificadas na língua inglesa com nomes como weaver. A interação neuroglial consiste em uma complexa e fascinante série de eventos. No cerebelo. 1990. Hatten.html] Figura 7. B de Gregory et al.pode ser facilmente reconhecido. Hatten. (A) Diagrama com um neurônio cortical migrando em um prolongamento da célula glial. 1975.) (B) (A) Processo condutor do neurônio (C) Neurônio em migração Processo da célula glial . os neurônios parecem caminhar no “monotrilho da glia” para seu respectivo destino. 1973. (A de acordo com Rakic. C de Hatten. 1988. staggerer e waltzer. a mais importante sendo uma proteína de adesão chamada astrotactina. envolvendo reconhecimento recíproco entre a glia e o neuroblasto (Hatten. 1972. Komuro e Rakic. 1990. Muitos dos mutantes cerebelares foram encontrados porque o fenótipo de tais mutantes . 1975).principalmente a inabilidade de manter o equilíbrio ao andar . a célula nervosa não adere ao prolongamento da glia (Edmondson et al.html]. (B) Micrografia eletrônica da região onde a soma do neurônio adere ao prolongamento glial. fornecer conhecimentos novos sobre os mecanismos de ordenação espacial.. reeler. os precursores das células granulares caminham nos longos prolongamentos da glia de Bergmann (Figura 7. 1992).23 Migração neurônica em prolongamentos gliais. Rakic e Sidman. Fishell e Hatten. 1990).23. [ecto5. em breve. Mais de 30 mutações conhecidas afetam o arranjo de neurônios cerebelares.. 1988.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 273 que isso aconteça. A extremidade anterior do neurônio apresenta várias extensões filopódicas. (C) Fotografias seqüenciais de um neurônio migrando em um prolongamento de glia cerebelar.

Uma única célula germinativa pode produzir neurônios (e células gliais) Figura 7. horizontalmente o córtex cerebral está organizado em mais de 40 regiões que regulam. a maioria dos neurônios recém. Assim como no córtex cerebelar. Primeiro. Cada camada do córtex cerebral é diferente da outra em relação às suas propriedades funcionais. Por exemplo. verificou-se que as células mais fortemente marcadas eram aquelas que estavam na fase S do seu último ciclo de divisão. Essas células migraram para várias regiões e foram detectadas por autoradiografia de cortes microscópicos.gerados migram radialmente.timidina Camadas corticais Massa branca Camada ventricular Dias de gestação Nascimento . existe um grande número de movimentos celulares que misturam a descendência de várias células precursoras. 1974. ao longo dos prolongamentos da glia. anatomica e funcionalmente.) Injeções de [3H] . Nem a organização vertical e nem a horizontal são especificamente clonadas. Na verdade. Rakic. Essa nova zona de manto é chamada córtex do neopáleo. os seus tipos de neurônios e os conjuntos de conexões que produzem. neurônios da camada 4 recebem seu principal estímulo do tálamo (a região que se forma do diencéfalo).274 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Organização cerebral A disposição em três zonas é também modificada no cérebro. 1974). Após sua mitose final. os neurônios com os “aniversários” mais cedo formam a camada mais próxima do ventrículo. Esse córtex se estratifica em seis camadas de corpos celulares e a forma adulta desses neurônios do neopáleo só se completa na metade da infância. enquanto neurônios da camada 6 do córtex auditivo (localizado mais anteriormente que o córtex visual) projetam axônios ao núcleo médio geniculado do tálamo. Isso forma um gradiente de desenvolvimento “ao avesso” (ou “invertido”) (Figura 7. Segundo. para fora da zona ventricular (ependimária) e formam a placa cortical abaixo da pia-mater do cérebro. Por exemplo.24 “Gradiente invertido” na formação do córtex cerebral no macaco rhesus. que é organizado de duas maneiras distintas.21).24. Os “aniversários” dos neurônios corticais foram determinados injetando [3H]-timidina endovenosamente nos animais em determinados tempos de gestação. Após o nascimento dos animais. a organização vertical é feita em camadas que interagem entre si (veja Figura 7. enquanto os neurônios na camada 6 enviam sua maior produção de volta para o tálamo. O tempo de gestação no macaco rhesus é de 165 dias. processos distintos. Os neurônios mais jovens estão na periferia do tubo neural (De acordo com Rakic. Os neurônios subseqüentes caminham distâncias maiores para formar as camadas mais superficiais do córtex. de maneira análoga ao cerebelo. A figura representa a posição desses neurônios indicados no córtex visual. neurônios da camada cortical 6 do córtex visual projetam axônios para o núcleo lateral geniculado do tálamo. Certos neuroblastos da zona do manto migram na glia através da massa branca para dar origem a uma segunda zona de neurônios.

mas as células corticais progenitoras tardias dão origem somente a neurônios da camada superior (camada 2) (Frantz e McConnell. Nem todos os neurônios migram radialmente. se as células são transplantadas antes de sua divisão final (na metade da fase S). 1988). seus neurônios migram (com os neurônios do hospedeiro) para a camada 2.) em qualquer das camadas corticais (Walsh e Cepko.25). aproximadamente 12% deles migraram lateralmente de uma região funcional do córtex para outra. O’Rourke e seus colegas (1992) marcaram neurônios jovens com corante fluorescente e seguiram sua migração através do cérebro.1991. Os destinos de células progenitoras mais velhas são mais determinados. As células cerebrais corticais progenitoras precoces têm o potencial para transformarem-se em qualquer neurônio (nas camada 2 ou 6. (B) Precursores neuronais “tardios” (aniversários no dia pós-natal 1) migram mais adiante para as camadas 2 e 3. para qual camada a célula migrará) é feita durante a divisão celular final.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 275 (A) [3H]-timidina no dia embrionário 29 (C) (D) Migração neural do hospedeiro Migração neural do hospedeiro Camadas corticais Porcentagem de neurônios marcados com [3H]-timidina Camada intermediária Massa branca Camadas corticais [3H]-timidina no dia pós-natal 1 Camada ventricular Célula glial Destino condicionado ao hospedeiro quando transplantado na fase S. Mas. Figura 7. após sua última fase S mitótica. Essas observações estão de acordo com aquelas de Walsh e Cepko (1992). Enquanto mais ou menos 80% dos jovens neurônios migraram radialmente em processos gliais. Eles descobriram que os descendentes neurais de . que infectaram células ventriculares com um retrovírus e conseguiram corar essas células e seus descendentes após o nascimento. (A) Precursores neuronais “precoces” (aniversários no dia embrionário 29) migram para a camada 6. (D) Se esses precursores são transplantados antes ou durante sua última fase S. os neurônios que eles formam migram para a camada 6. (C) Quando os precursores precoces (vermelho) são transplantados em zonas ventriculares mais velhas. cujos neurônios migratórios estão formando a camada 2 após sua última divisão. mantêm seu destino e migram somente para a camada 6. (De acordo com McConnell e Kaznowski. elas não têm destino fixo e podem migrar para a camada 2 (Figura 7. Células transplantadas de cérebros jovens (onde elas formariam a camada 6) para cérebros mais velhos. como é que a célula reconhece a camada na qual deve entrar? McConnell e Kaznowski (1991) mostraram que a determinação da identidade laminar (isto é. 1996). Ainda não conhecemos a natureza da informação transmitida à célula ao ser fixado o seu destino.25 Massa branca Camadas corticais Determinação de identidade laminar em cérebro de doninha. por exemplo). Destino independente da célula quando transplantada após última fase S. da zona ventricular para a placa cortical. Entretanto.

ou soma. Esse padrão de conexões neurais (sinapses) permite ao córtex humano funcionar como o centro para o aprendizado. não pode se mover em resposta a um pensamento. assim a espécie humana dá à luz após 9 meses. Baseado em critérios morfológicos e de comportamento. e eles especulam que a inteligência humana vem da estimulação do sistema nervoso que está se formando durante aquele primeiro ano. 1975). 1945) sugeriu que. a gestação humana deveria durar 21 meses em lugar de 9. O cérebro é bastante plástico e o desenvolvimento do córtex neopáleo humano é particularmente notável a esse respeito. Enquanto os dendritos são freqüentemente numerosos e não se extendem muito além do corpo da célula nervosa. Alguns neurônios desenvolvem somente alguns dendritos. usadas para captar impulsos elétricos são chamadas dendritos (Figura 7.26). os axônios podem se alongar por vários centímetros. cada neurônio cortical desenvolve um número suficiente de dendritos (ou superfície dendrítica) para acomodar até 100. Durante esse ano. o córtex cerebral humano não tem conexões neurônicas na 12a semana de gestação (e.000 conexões com outros neurônios. Quando neurônios do córtex do cérebro anterior foram transplantados para a região que formaria o corpo estriado.276 PARTE II Padrões de Desenvolvimento uma única célula ventricular estavam dispersos através das regiões funcionais do córtex. O cérebro humano continua a se desenvolver na velocidade do desenvolvimento fetal. A atividade elétrica mensurável. característica de células neurais (o padrão do eletroencefalograma. Entretanto. mas uma das coisas maravilhosas. somos essencialmente fetos extra-uterinos. em média. . Portmann (1941. Existe uma grande variedade de tipos de neurônios e células gliais (como fica evidente pela comparação entre uma célula granular relativamente pequena e o enorme neurônio de Purkinje). pois sua cabeça não passaria pelo canal do parto. nos Estados Unidos. a respeito do primeiro ano de vida do ser humano. precisam transmitir suas mensagens por um longo caminho até a * Ao contrário do que afirma um filme antiaborto. talvez ela devesse aceitar a aquisição do padrão de EEG como o começo da vida humana. 1995). nem mostrar consciência ou medo). ou EEG) é verificada inicialmente aos 7 meses de gestação. Considera-se que a diferenciação dessas células precursoras é principalmente determinada pelo ambiente no qual elas entram (Rakic e Goldman. 1982) e que. Os receptores da dor no dedo grande (hálux) do pé. uma determinada célula precursora pode formar ambos. Aquelas células que permanecem como componentes integrais do revestimento do tubo neural se transformam em células ependimárias. Considera-se que chegando a seu destino final. em pelo menos alguns casos. Portanto. 1987). é o aumento do número dessas regiões receptivas nos neurônios corticais. raciocínio e memória. mesmo após o nascimento (Holt et al. neurônios e células gliais (Turner e Cepko. aceito que a definição de morte é a perda do padrão de EEG. As delgadas extensões das células. essas células adquiriram a morfologia do estriado (Fishell. Montagu (1962) e Gould (1977) sugeriram que durante o primeiro ano de vida.* Tipos de neurônios O cérebro humano consiste de mais de 1011 células nervosas (neurônios) associadas com mais de 1012 células gliais. nenhuma mulher poderia dar à luz um feto de 21 meses. Outra característica importante de um neurônio em desenvolvimento é seu axônio (às vezes chamado um neurito). e a desenvolver a capacidade de expressão simbólica. Muito poucos dendritos são encontrados em neurônios corticais no nascimento. portanto.000 outros neurônios. as células produzem moléculas adesivas específicas que as organizam e as agrupam como núcleos cerebrais (Matsunami e Takeichi.. bem como a produção de respostas a estímulos interpretados. O neurônio cortical. Essas células podem dar origem a precursores de neurônios e células gliais. Morowitz e Trefil (1992) sugeriram provocativamente que tendo a sociedade. 1995). amplamente divulgado. enquanto outras células (como os neurônios de Purkinje) desenvolvem extensas áreas para interações celulares. a especificação de funções determinadas pelas áreas corticais ocorre após a neurogênese. comparada com outros primatas. por exemplo. se conecta com 10.

Dentro do próprio axônio. acreditava que numerosas células neurais se ligavam umas às outras. mas vai “abrindo caminho” ao longo do substrato. A bainha de mielina que promove o isolamento do axônio é formada pelas células de Schwann adjacentes.27). 1975. Essas microespículas contêm microfilamentos. Na virada do século vinte. Em 1907. o suporte estrutural é . o descobridor do nódulo embrionário. nesse estágio. Wilhelm His (1886) e Santiago Ramón y Cajal (1890) postularam que o axônio era. as microespículas de actina são destruídas.) Cone do axônio Segmento inicial do axônio Chegada de impulsos via axônios de outros neurônios CONDUTOR Nó de Ranvier Impulso nervoso Célula de Schwann Bainha de mielina EFETOR Músculo esquelético medula espinhal. Esse prolongamento do nervo é liderado pela ponta do axônio.. O que Harrison viu foi a emergência de axônios como projeções dos neuroblastos. 1988). admitia que o axônio se formava ao redor de fibras citoplasmáticas pré-existentes entre as células. Esse cone não progride em linha reta. alongando a 56 µm/hora. Um dos conceitos fundamentais da neurobiologia é que o axônio é uma extensão contínua do corpo da célula nervosa. Harrison isolou uma porção de um tubo neural de um girino de rã de 3mm. para formar um axônio. Ele colocou esses neuroblastos em uma gota de linfa de rã sobre uma lamínula e a inverteu sobre outra lâmina com depressão.26 RECEPTOR Diagrama de um neurônio motor. em forma de cadeia. Schwann. uma projeção (apesar de extremamente grande) do corpo celular (soma). Tratando os neurônios com citocalasina B. (De acordo com Bloom e Fawcett. um dos fundadores da teoria celular. chamada de cone de crescimento (Figura 7. O cone de crescimento se move por elongação e contração de filopódios afilados. na verdade. logo após o fechamento do tubo neural. inibindo seu avanço ulterior (Yamada et al. Ross Harrison demonstrou a validade da teoria da projeção com um elegante experimento que foi a pedra fundamental tanto da ciência do desenvolvimento neurobiológico como da técnica de cultura de tecidos. de modo a poder observar o que se passava nessa “gota pendente”. 1971. não há uma diferenciação visível dos axônios. várias teorias competiam para explicar a formação de axônios. Forscher e Smith. Impulsos recebidos pelos dendritos e o neurônio estimulado podem transmitir impulsos elétricos através do axônio (que podem ter 60 a 90 cm de comprimento) para o tecido alvo. orientados paralelamente ao eixo longo do axônio (essa é uma situação similar àquela dos microfilamentos filopódicos das células mesenquimatosas secundárias em equinodermos). Hensen.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 277 Dendritos Figura 7. chamados microespículas.

as células de Schwann não conseguem produzir um determinado componente protéico da bainha de mielina.278 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Microespículas (A) Cone de crescimento (B) (C) Figura 7. dendritos. o neurônio em desenvolvimento retém as mesmas cartacterísticas que foram observadas nas regiões de articulação dorsolateral do tubo neural. paralisia e vários outros problemas de saúde. B e C de Forscher e Smith. produz. cortesia dos autores. uma célula glia chamada célula de Schwann realiza essa mielinização.) fornecido por microtúbulos. Essa membrana especializada é chamada bainha de mielina.27 Microespículas de actina em cones de crescimento de axônios como vistos por (A) microscopia eletrônica de transmissão. 1988.28). em outro mutante de camundongo.. uma membrana especializada que é rica em proteína básica mielina e se espirala ao redor do axônio central (Figura 7. Além da função estrutural na migração de axônios. no sistema nervoso central é isolado em intervalos por processos que se originam de um tipo de célula glial chamada oligodendrócito. Assim. cada filopódio faz a amostragem dos microambientes e manda sinais de volta para o corpo da célula (Davenport et al. e o axônio se retrairá se for colocado em uma solução de colchicina. de onde são focalizados nos axônios. então. (B) microscopia de contraste da interface diferencial e (C) microscopia de fluorescência com anticorpos fluorescentes à actina.. Como veremos no Capítulo 8. a saber. O axônio também precisa ser especializado na secreção de neurotransmissores específicos nos pequenos espaços (fendas sinápticas) que separam o axônio da superfície da célula alvo (soma. mas normal no sistema nervoso central. alongamento por microtúbulos e modificações da forma apical pelos microfilamentos. 1964. ou o axônio de um neurônio receptor ou um . Usualmente esses impulsos vão dos dendritos à soma do nervo. (No sistema nervoso periférico. Henry e Sidman. enquanto o periférico não é afetado (Sidman et al. Como na maioria das células migratórias. o sistema nervoso central é deficiente em mielina. Explorando o ambiente à frente do cone de crescimento. 1989). Neurônios transmitem impulsos elétricos de uma região a outra. 1993). Os axônios não crescerão se o cone de crescimento não conseguir avançar (Lamoureux et al. jimpy. os filopódios têm também uma função sensorial. 1988). e a desmielinização das fibras nervosas está associada à convulsões.1979. o axônio. No mutante trembler do camundongo. os filopódios exploratórios do axônio aderem ao substrato e exercem uma força que puxa o resto da célula para frente. os filopódios são as organelas fundamentais envolvidas na determinação do caminho do neurônio.. Todas fotografias. (A de Letourneau. Para impedir a dispersão do sinal elétrico e facilitar a sua condução. debilitantes ou mortais. Um oligodendrócito se enrola ao redor do axônio em desenvolvimento.) A bainha de mielina é essencial para uma adequada função neural. fazendo com que a mielinização do sistema nervoso periférico seja deficiente. Ao contrário.

Os placódios mais anteriores são os dois placódios olfativos que formam os gânglios dos nervos olfativos. nem todas as partes do ectoderma da cabeça formam os cristalinos. serotonina. A ativação dessa habilidade * As induções que permitem a formação do olho serão detalhadas no Capítulo 17.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 279 Figura 7. *Mas. (A) No sistema nervoso periférico. dopamina. e o cristalino deve ter uma relação precisa com a retina. Os principais órgãos do sentido da cabeça se desenvolvem a partir das interações do tubo neural com uma série de espessamentos epidérmicos chamados de placódios ectodérmicos cranianos. o desenvolvimento neurônico envolve diferenciação tanto estrutural como molecular. Raine. a mielinaçào é realizada por prolongamentos de oligodendrócitos. cujos neurônios formam o gânglio acústico que nos permite ouvir. focalizaremos o olho porque esse órgão. ácido γ−aminobutírico. ou algum outro neurotransmissor. 1989). Alguns neurônios são capazes de sintetizar e secretar acetilcolina. precisa se desenvolver com uma coordenação exata. mais que qualquer outro do corpo. Desenvolvimento do olho em vertebrados O indivíduo conhece seu ambiente pelos seus órgãos sensoriais. se invaginam para formar o labirinto do ouvido interno. no sistema nervoso central. Os placódios auditivos. Essa interação induz o ectoderma da cabeça à formação de lentes (cristalino) (Saha et al. Cada neurônio precisa ativar aqueles genes responsáveis pela produção de enzimas capazes de sintetizar seus neurotransmissores. Dinâmica do desenvolvimento ótico A história do desenvolvimento ótico começa na gastrulação.) Nó de Ranvier Axônio MIELINIZAÇÃO NO SISTEMA NERVOSO PERIFËRICO Célula de Schwann (A) (B) Célula de Schwann Axônio (C) sítio receptor em um órgão periférico). octopamina. (Fotografia cortesia de C. quando o endoderma involutivo e o mesoderma interagem com o adjacente. prospectivo ectoderma da cabeça.. . as células de Schwann se enrolam ao redor do axônio. norepinefrina. (C) Micrografia de um axônio envolvido pela membrana de mielina de uma célula de Schwann. da mesma maneira. (B) O mecanismo desse enrolamento leva à produção de um enorme complexo de membrana. Portanto. responsáveis pelo sentido do olfato.28 Célula oligodendroglial Axônio MIELINIZAÇÃO NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL Mielinação nos sistemas nervosos central e periférico. S. Nessa parte. enquanto outros desenvolvem vias enzimáticas para sintetizar e secretar epinefrina.

o placódio do cristalino causa. as vesículas ópticas não fazem contato com a superfície e a formação do olho cessa (Webster et al. R. Hilfer. a conexão entre o cálice óptico e o cérebro é reduzida.280 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Ectoderma da cabeça Vesícula óptica primária Parede do cérebro anterior Camada pigmentada Camada neural Cristalino Vesícula do cristalino Vesícula óptica Placódio do cristalino (A) Embrião de 4-mm (B) Embrião de 4.C) O ectoderma sobreposto diferencia-se em células do cristalino enquanto as vesículas ópticas se dobram sobre si mesmas e os placódios do cristalino se tornam vesículas do cristalino. Diferenciação da retina neural Como os córtices cerebral e cerebelar. Essas protuberâncias continuam a crescer lateralmente ao tubo neural e estão ligadas ao diencéfalo por pedúnculos ópticos. os corpos celulares das células ganglionárias e os interneurônios bipolares que transmitem o .. Por exemplo. além das células da crista neural.5-mm (C) Embrião de 5-mm (D) Embrião de 7-mm Figura 7. cortesia de K. 1964. a retina neural se desenvolve em uma sucessão de camadas com diferentes tipos de neurônios (Figura 7. Tosney. Subseqüentemente.29C). Os axônios das células ganglionares da retina neural se encontram na base do olho e se dirigem para baixo. Ao mesmo tempo.) latente na formação do cristalino e o posicionamento do cristalino em relação à retina é realizado pela vesícula óptica.29). que podem sintetizar sua própria melanina). À medida que a invaginação continua. (Ilustrações superiores de acordo com Mann. As células da camada externa produzem pigmentos e finalmente se transformam na retina pigmentada (um dos poucos tecidos. (A) A vesícula óptica evagina do cérebro e contata o ectoderma sobreposto. enquanto o cristalino é internalizado. as duas camadas do cálice óptico começam a se diferenciar em direções diferentes. no mutante de camundongo. essa se espessa formando o placódio do cristalino.29 Desenvolvimento do olho de vertebrado. Coletivamente. A necessidade de um contato íntimo entre as vesículas ópticas e o ectoderma superficial é comprovada experimentalmente e em certos mutantes. quando essas vesículas atingem o ectoderma da cabeça. As células da camada interna proliferam rapidamente e dão origem a uma variedade de glia. (C) A vesícula óptica se torna a retina neural e pigmentada. de maneira recíproca. O pedúnculo é então chamado nervo óptico. eyeless.30). (B. as vesículas ópticas têm início como duas protuberâncias nas paredes laterais do diencéfalo em embriões de 22 dias (Figura 7. neurônios ganglionários. modificações na vesícula óptica que sofre uma invaginação formando um cálice óptico de parede dupla (veja Figura 7. pelo pedúnculo óptico. cortesia de S. (D) A vesícula do cristalino induz o ectoderma sobreposto a se tornar córnea. No homem. Essas camadas incluem as células fotorreceptoras sensíveis à luz e à cor (bastonetes e cones). micrografias A-C de Hilfer e Yang. tornando-se alongada e estreita. essas constituem a retina neural. interneurônios e neurônios fotorreceptores sensíveis à luz. Uma vez formado. 1980. D. 1984).

Os axônios das células ganglionares se reúnem para formar o nervo óptico que entra no cérebro. Turner. (de Turner e Cepko.B) Separação inicial de neuroblastos dentro da retina.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 281 Bastonetes e cones dos fotorreceptores Camada neuroblástica externa Corpos celulares dos fotorreceptores Camada plexiforme externa Camada dos nervos bipolares Camada neuroblástica interna Camada plexiforme interna Camada de células ganglionares (A) Células ganglionares (B) Fibras do nervo óptico (C) (D) Luz estímulo elétrico dos bastonetes e cones às células ganglionárias. (B) Células coradas formando uma banda através da retina neural. um neurônio bipolar (bp).) (B) Figura 7. no fundo do olho. da retina neural. fotografia cortesia de D. (A) Figura 7. estriado. Esse vírus continha um gene da β-galactosidase (não presente na retina do rato) que seria expresso somente nas células infectadas. bem como neurônios amácrinos (sem grandes axônios) e neurônios horizontais que transmitem impulsos elétricos no plano da retina. um neurônio bipolar e uma célula glia (Müller). Mostrou-se que (Turner e Cepko. As identidades dessas células foram confirmadas por microscopia de contraste Nomarski. Após um mês ou 6 semanas. 20 µm). (A. o olho é removido e a retina é corada para β-galactosidase.31 Cristalino 4-6 semanas Remova a retina. (D) Uma apresentação funcional dos principais caminhos dos neurônios na retina. (A e B segundo Mann. Neurônios da retina se distribuem em camadas funcionais durante o desenvolvimento. existem numerosas células gliais de Müller que mantêm a integridade da retina. Essa análise foi feita usando uma técnica engenhosa para marcar as células geradas por uma célula precursora específica. Grunwald. A coloração pode ser vista em cinco bastonetes. 1964.30 Desenvolvimento da retina humana. (C) As três camadas de neurônios na retina adulta e as camadas sinápticas entre elas.) . as retinas foram removidas e coradas para detectar a presença de β-galactosidase. Além disso. (A) Técnica pela qual um vírus contendo um gene de βgalactosidase funcional é injetado na parte dorsal do olho para infectar algumas das células precursoras da retina. A Figura 7. Ratos recém-nascidos (cujas retinas ainda estão se desenvolvendo) foram injetados. incluindo 5 bastonetes (r). um neurônio terminal (t) e células gliais de Müller (mg).31 mostra uma fita de células derivadas de uma célula precursora infectada. Somente os descendentes das células infectadas deveriam ser coradas de azul. A formação desse tecido altamente estruturado é um dos problemas mais intensamente estudado em neurobiologia do desenvolvimento. A luz atravessa as camadas até ser recebida pelos fotorreceptores. (Barra de escala. Nos estágios iniciais do desenvolvimento da retina. 1987) uma única célula precursora do neuroblasto retinal pode dar origem a pelo menos três tipos de neurônios ou dois tipos de neurônios e uma célula glia. fotografia cortesia de G. a divisão celular de uma camada embrionária e a migração e morte diferencial das células resultantes formam o padrão laminar. Os axônios dos fotorreceptores fazem sinapse com neurônios bipolares que transmitem a despolarização para os neurônios ganglionares. fixe e core e analise os clones Retina Epitélio pigmentado Determinação da linhagem de uma célula precursora na retina do rato. 1987. com um vírus que se integra ao seu DNA. Um mês após a infecção dos ratos.

e os fotorreceptores desenvolvem tanto seus segmentos externos (que captam a luz) quanto os seus axonais Figura 7. Hendrickson. Durante esse tempo..5µm de diâmetro. Glaser et al.282 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Muitas células do cérebro anterior expressam um fator de transcricão chamado Pax6. Essa proteína parece ser especialmente importante para o desenvolvimento da retina. pode ser um denominador comum para células fotorreceptoras em todos os filos. a densidade em cones nessa região aumenta de 18 fotorreceptores para 42 por 100 µm. 1994. a camada plexiforme externa (OPL). A Figura 7. O axônio delineado em (C) é na realidade mais curto que o normal. permitindo que a sinapse com o neurônio bipolar possa ser mostrada na figura. 1992. Seções de microscopia de luz foram fotografadas e um cone em cada retina delineado para clareza. Esse gene será mais discutido no Capítulo 23. A retina neonatal tem receptores fracamente diferenciados.. 1994). os olhos parecem ser os mais sensíveis à sua falta. A flecha aponta para a membrana limitante externa. O gene Pax6 tem provavelmente muitos papéis.) (A) (B) (C) . Quiring et al. mas a que mais chama a atenção é a imaturidade dos fotorreceptores da retina.32 destaca as diferenças entre os fotorreceptores em retinas neonatal e adulta. Essa pode ser a razão pela qual os bebês apenas respondem a estímulos visuais quando esses são trazidos próximo às suas faces. que originalmente serviu como borda para os axônios da retina. cortesia de A. A sinapse é formada no pedículo sináptico do cone (CP). (B) Neonato 5 dias após o nascimento. O epitélio pigmentado (PE). (de Yuodelis e Hendrickson. enquanto homozigotos nas mesmas espécies (e na Drosophila) não têm olhos (Jordan et al.. No homem e no camundongo. Desenvolvimento de cones fotorreceptores na região central da retina humana. Informações adicionais & Especulações Porque os bebês não enxergam bem ecém-nascidos humanos não têm boa visão. (A) Feto de gesta