1 Faculdade de Medicina de Lisboa Ano lectivo de 2006-2007 LICENCIATURA EM MEDICINA/DISCIPLINA DE BIOLOGIA MOLECULAR DA CLULA EXAME DE 1 POCA

AVALIAO Exame:

Nome:___________________________________________________ Docente:___________________________ Turma Prtica:______

Contnua: Final:

Este exame tem a durao de 2h, com meia hora de tolerncia, sendo constitudo por 20 alneas de 1 valor cada.

1 Durante o estgio de investigao laboratorial, um aluno preparou meio de cultura contendo hidratos de carbono, aminocidos, vitaminas e sais minerais. Colocou este meio em dois tubos. Num dos tubos inocolou E. Coli, no outro inoculou clulas humanas. O que espera observar em cada tubo aps uma noite de incubao a 37C? Justifique. No tubo que contm E. Coli, ir haver crescimento da populao destas bactrias, uma vez que so organismos relativamente pouco exigentes relativamente ao meio de cultura necessrio para a sua replicao (apenas necessitam de nutrientes e temperatura adequada). No tubo que contm clulas humanas no haver crescimento, uma vez que a proliferao celular de clulas humanas requer no s a presena de nutrientes e temperatura adequada, mas necessita tambm de factores de crescimento que estimulem a diviso celular. (RSMA) 2 - Um mdico detecta nveis elevados de colesterol no sangue de uma criana com 10 anos. 2A - Que doena gentica pode estar na origem desta situao? Esta criana pode sofrer de Hipercolesterolmia Familiar. (MFC) 2B - Qual o gene que se encontra mais frequentemente mutado nesta doena? O gene que est frequentemente mutado nesta doena o que codifica o receptor das LDL. Assim, estas no so internalizadas e os nveis de colesterol no sangue mantm-se elevados. (MFC) 2C - Como se realiza o diagnstico gentico desta doena? Pode-se retirar uma amostra de sangue, isolar DNA (por exemplo de leuccitos), amplificar o gene do receptor das LDL, por PCR, sequenci-lo e detectar mutaes por comparao com bases de dados em que so descritas mutaes associadas doena. (MFC)

2 3A - D um exemplo de um anlogo de um componente do DNA usado em Medicina. AZT (anlogo do nucletido de timina). (MFC) 3B - Explique o seu mecanismo de aco e indique qual a doena que trata. O AZT usado como inibidor de transcriptase reversa do HIV (SIDA). O AZT semelhante, estruturalmente, ao nucletido timidina. Porm, no carbono 3, tem um grupo amina em vez do radical OH. Assim, impossvel que um nucletido se ligue ao AZT (a sntese 53). Como o AZT incorporado preferencialmente em relao timidina pela transcriptase reversa do HIV, ocorre a paragem da sntese do DNA viral. Assim o vrus no consegue infectar os linfcitos CD4+, cuja destruio provoca a SIDA. (MFC) 4A - Explique como se obtm um animal transgnico. Um animal trangnico um animal que foi manipulado genticamente ou seja tem um genoma que contm um gene extra que no pertence sua espcie. (PSPM). Podemos obter um animal trangnico de duas formas diferentes. Pode-se introduzir um gene estranho (de outra espcie) num dos pr-nucleos de zigotos recm-formados e transferir estes zigotos modificados para o tero de um animal pseudo-grvido, onde os embries se iro desenvolver. Alguns dos descendentes tero incorporado o gene estranho no seu genoma e sero trangnicos. Outra forma de obter trangnicos introduzir o gene estranho em clulas estaminais retiradas de um blastocisto, seleccionar as clulas que o incorporaram e introduzir de novo essas clulas num embrio em fase de blastocisto e implantar esse blastocisto modificado no tero de um animal pseudo-grvido. Os descendentes assim criados sero quimricos e do acasalamento destes iro surgir na gerao seguinte animais trangnicos. (MFC) Pg 140-141 4B - D um exemplo de uma investigao mdica em que se utilizou este tipo de experimentao. Existem vrias respostas correctas: Este procedimento pode ser usado para produzir protenas recombinantes com interesse teraputico em animais. Existem, por exemplo cabras modificadas genticamente, isto trangnicas, que produzem no seu leite protenas humanas com interesse teraputico como a antitrombina (usada em situaes de trombo-embolismo). (MFC). Um exemplo de investigao mdica em que se usou este tipo de experimentao foi a produo de ratinhos trangnicos na investigao sobre o cancro, nomeadamente na avaliao da importncia da activao de oncogenes ou inibio de oncossupressores na susceptibilidade ao cancro. Desenvolveram-se ratinhos trangnicos que expressam formas permanentemente activas do gene ras e de outros oncogenes e existem ratinhos trangnicos sem p53. Estes animais podem ser expostos agentes mutagnicos e dessa forma avaliar-se a importncia destes genes no desenvolvimento do cancro. (PSPM).

3 5 - Porque motivo o DNA genmico das bactrias no digerido pelas enzimas de restrio presentes nestas clulas? O DNA genmico das bactrias no digerido pelas enzimas de restrio porque as sequencias reconhecidas por estes enzimas, sequncias de restrio esto metiladas. (PFAP)

6 - Em mdia, as sequncias intergnicas no genoma humano so maiores, iguais ou menores do que as sequncias correspondentes no genoma das leveduras? Justifique. Em mdia, as sequncias intergnicas no genoma humano so maiores do que as sequncias correspondentes no genoma das leveduras. Isto acontece porque o nosso genoma tem um maior nmero de sequncias no codificantes (nas quais se incluem as sequncias intergnicas) que o genoma da levedura. O genoma da levedura apresenta uma muito maior densidade de genes que o genoma humano. Esta economia de espao no genoma parece ser uma caracterstica do genoma de seres simples como os procariotas e os eucariotas simples como as leveduras. (JSC)

7 - Quais as possveis consequncias da deleco de um nico nucletido na regio codificante de um gene humano? A deleco de um nico nucletido leva a que haja um frameshift na leitura da sequncia de nucletidos a partir do ponto do nucletido eliminado, ou seja, aquando da expresso desse gene para produo proteica, os codes a partir do ponto de deleco sero, possivelmente, todos diferentes dos originais, o que leva produo de uma protena mutada (em que todos os aminocidos para a frente do ponto de deleco sero diferentes da sequncia normal, excepto nos codes que codifiquem o mesmo aminocido). Dependendo do nmero/relevncia para a protena dos aminocidos que diferem, esta protena pode ter uma funcionalidade reduzida ou at mesmo ser no-funcional. (RSMA)

4 8 - Porque motivo a descoberta dos intres mereceu o Prmio Nobel da Fisiologia ou Medicina em 1993? Porque veio mudar a ideia de que as sequncias codificantes dos genes eram contnuas, pois entre elas existem sequncias no codificantes os intres. Aps a transcrio do RNA estas sequncias so eliminadas splicing. Na sequncia da descoberta do mecanismo de splicing tambm se descobriu o splicing alternativo, que tem como consequncia a possibilidade de a partir de um gene, se poderem sintetizar diferentes protenas. Foi posto em causa o dogma central da Biologia Molecular de 1 gene, 1 RNAm, 1 protena, o que mereceu a atribuio do Prmio Nobel. (NAGSE)(JPML) 9 - Explique o mecanismo pelo qual o gene que codifica a apolipoprotena B d origem a duas formas distintas de protena, uma expressa no fgado, outra no intestino. Este facto deve-se edio do RNA mensageiro que codifica a apolipoprotena B no intestino por desaminases. Estas enzimas removem um grupo amina da base C, tornando-a num U que codifica um codo STOP prematuro, levando perda de um domnio funcional na protena ApoB no intestino. (RMOSC)

10 Descreva uma experincia que permita traar o percurso de uma glicoprotena transmembranar, desde a sua gnese at ao seu destino final na clula. O primeiro passo seria escolher uma clula que produzisse activamente essa glicoprotena transmembranar colocando a respectiva clula num meio que respondesse a todas as suas necessidades nutricionais, colocaria aminocidos radioactivos no meio de cultura. Idealmente, se possvel, o melhor a fazer seria escolher apenas um aminocido radioactivo que existisse em grande proporo nessa protena (no domnio transmembranar) como aminocidos hidrfobos, a fim de facilitar os passos consequentes da actividade experimental e evitar possveis confuses com a restante sntese proteica que, inevitavelmente tem de ocorrer na clula. Aps determinado tempo no meio que contm os aminocidos radioactivos (~5minutos) colocaramos a clula num meio sem radioactividade. Posteriormente, procederamos a vrias leituras de registo da radioactividade na clula espaados no tempo (ex. de 10 em 10 minutos) podendo o intervalo ser menor na fase inicial de actividade a fim de controlarmos com rigor o trajecto intracelular desta protena, desde a sua sntese em ribossomas associados ao retculo endoplasmtico rugoso, passando pelo aparelho de Golgi e chegando, finalmente sua localizao final na membrana plasmtica. Na impossibilidade dos aminocidos hidrfobos distinguirem a nossa glicoprotena das restantes protenas transmembranares, esta teria de ser detectada atravs do uso de um anticorpo especfico. VMEP

5 11 - Descreva a estrutura e funes dos peroxissomas. Os peroxissomas so organelos citoplasmticos pequenos que tm como funo a realizao de uma srie de reaces metablicas. So constitudos por uma membrana com protenas transmembranares que permitem a passagem das peroxinas (protenas do peroxissoma) para o seu interior. O peroxissoma forma-se atravs da juno entre uma vescula proveniente do RE (com as protenas Pex3 e Pex19) com as peroxinas produzidas por ribossomas livres no citoplasma. Estas vesculas podem-se fundir com outras, originando peroxissomas maiores. Os peroxissomas tm diversas funes. Uma delas a ocorrncia de reaces de oxidao de diferentes substncias: aminocidos, cido rico, cidos gordos e metanol por aco de oxidases. Nestas reaces produzse perxido de hidrognio (H2O2) que txico para as clulas. A enzima catalase decompe o H2O2 ou ento este utilizado para oxidar outras substncias. Para alm disso, nos peroxissomas tambm ocorre a biossntese de colesterol, de dolicol, cidos biliares (no fgado), do aminocido lisina e plasmalognios. (CMSP)

12 - Um doente apresenta acumulao de glucocerebrosidos nos lisossomas. 12A - Qual o tipo celular e rgos mais afectados? Justifique. O tipo de clulas mais afectado so os macrfagos e os rgo mais afectados so o fgado e o bao. Tal deve-se ao facto de os macrfagos serem clulas fagocitrias que fagocitam tanto clulas estranhas ao organismo como clulas do prprio organismo que esto envelhecidas. Os principais intervenientes na degradao destas estruturas so os lisossomas, dado que so eles que possuem as enzimas hidroliticas. No entanto, quando h deficincia na enzima glucocerebrosidase, esta no consegue actuar o que promove uma acumulao de glucocerebrsidos no lisossomas, aumentando estes de tamanho. Como a actividade dos macrfagos maior no fgado e no bao estes vo ser os rgo mais afectados, notando-se um considervel aumento do seu tamanho.(ACNB)

12B - Qual o tratamento para esta doena? Esta doena, caracterizada pela acumulao de glucocerebrosidos nos lisossomas, tem a designao de doena de Gaucher, sendo uma doena gentica que leva no produo, ou produo no funcional da enzima glucocerebrosidase. Esta enzima pode ser administrada aos doentes por via endovenosa, utilizando-se uma teraputica enzimtica de substituio com glucocerebrosidase recombinante. A enzima recombinante produzida em grande escala recorrendo-se para tal a linhas celulares eucariotas (clulas CHO) sendo depois purificada. A internalizao da enzima administrada est assegurada porque os receptores de manose-6-fosfato no se encontram unicamente na membrana do lisossoma, mas tambm na membrana plasmtica. Assim, estes ltimos receptores podem reconhecer a enzima recombinante administrada, internalizam-na por vesculas de endocitose que depois de se fundirem aos endossomas, se dirigem para os lisossomas onde so activas. (PCOC)

6 13 Considere uma forma mutada da protena ciclina B. Como consequncia da mutao, a protena ciclina B deixa de ser degradada. 13A - Em que fase do ciclo celular a ciclina B normalmente degradada? A ciclina B normalmente degradada na mitose, durante a anafase. (AMRO) 13B - O que espera observar em clulas que exprimem esta forma mutada da ciclina B? Justifique. A degradao da ciclina B responsvel por vrios processos que ocorrem na mitose levando ao final desta fase. Com uma forma de ciclina B permanentemente activa esta fase no seria terminada correctamente, j que a degradao da ciclina B que, ao inactivar a cdk1, necessria ao incio da citocinese. Assim, estas clulas ficariam com a mitose interrompida ou mal terminada, no se dando a diviso das duas clulas filhas (citocinese). (MIBRS)

14 - O Herceptin um medicamento recente, muito eficaz no tratamento de certos tipos de cancro da mama. Explique que tipo de teste deve ser feito para identificar os doentes a tratar com este medicamento. O Herceptin corresponde a um anticorpo monoclonal que se vai ligar ao erbB2, um receptor que est sobre-expresso em alguns casos de cancro da mama. Sendo assim, apenas vai ser eficaz nestes casos. Para detectar os doentes que apresentam esse tipo de mutao podemos recolher algumas clulas do tumor e avaliar a quantidade de mRNA presente que codifica a protena erbB2. Para isso podemos recorrer ao Northern blotting e verificar a intensidade de hibridao comparando com a de clulas normais. Caso a intensidade fosse elevada, significaria que a protena era muito expressa e que o Herceptin poderia ser um bom medicamento. (BLSM) (PS: Tambm aceite Western blotting, hibridao in situ, imunocitoqumica).

= FIM =

Nota: as respostas apresentadas no sero perfeitas mas foram escolhidas entre as melhores dos exames corrigidos.