LABORATÓRIO DE BIOLOGIA

Prof.ª Doutora Maria Luísa Valdeira

Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa

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Programa do Laboratório de Biologia
Neste Curso de Ciências Farmacêuticas na disciplina Laboratório de Biologia procuraremos ensinar os alunos a reconhecer e aplicar os conhecimentos da Biologia Celular Animal e Vegetal aprendidos nas aulas teóricas e práticas das diversas unidades programáticas, pretendendo que os estudantes interpretem os resultados duma forma crítica para assim poderem observar e ficar com um bom conhecimento das células procariotas e eucariotas animais e vegetais. Também vale a pena referir a utilidade da aplicação de princípios quantitativos da matemática e da física aos sistemas biológicos que deles necessitem. A natureza do trabalho laboratorial deve ser definida como sendo a prática da manipulação, perícia mental e estudo das diferentes metodologias para o estudo das diferentes células através da observação e da experiência de maneira que as hipóteses possam ser construídas e avaliadas sistematicamente para serem incorporadas nos princípios gerais. Assim, devem ser explicadas ao aluno uma variedade de experiências apropriadas ao seu “background” e desenvolvimento, nas áreas da ciência da Biologia Celular e Botânica Farmacêutica que lhes foram ministradas. A metodologia a usar no decorrer destas aulas será feita de acordo com os princípios enumerados a seguir: A importância do grupo de trabalho na investigação da biologia Vantagens e inconvenientes das técnicas usadas O uso de protocolo nos ensaios Organização do trabalho laboratorial Como trabalhar num laboratório de biologia Necessidade de controlos A importância de duplicados Abordagem dos métodos de apresentação dos resultados Bibliografia e relatório

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1 – MICROSCOPIA Microscópio óptico fotónico vulgar Modo de utilização. Iluminação de Köhler. Observação da diversidade celular comparando as células procariotas (bacilos e cocos) com as eucariotas (fungos, protozoários, tecidos animais e vegetais). Interpretação das imagens em microscopia fotónica Microscópio óptico invertido Observação de cultura de células animais e interpretação das imagens. Microscópio óptico de contraste de fase Modo de utilização. Observação de células animais vivas não coradas assim como, de células vegetais destacando a epiderme da página inferior de uma folha. Interpretação das imagens nesta microscopia. Coloração vital Realização de preparações de células vivas e sua observação antes e depois da coloração com diferentes corantes vitais tais como, azul de metileno, vermelho neutro e lugol entre outos. As células não coradas serão observadas no microscópio fotónico e no de contraste de fase e as coradas no microscópio fotónico vulgar. Preparações definitivas Realização de inclusões em parafina. Obtenção de cortes no micrótomo e sua colagem em lâminas. Coloração dos cortes com v´rios corantes tais como, hematoxilina - eosina e sua montagem definitiva.

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Micrometria e Cariometria Medição de células com uma ocular micrométrica utilizando primeiro um micrómetro objectivo. Cariometria: Determinação de áreas de núcleos celulares. Microscópio de fluorescência Modo de utilização. Observação de auto-fluorescência de componentes das células vegetais. Observação de núcleos, citoplasmas e RNA com coloração de laranja da acridina. Imunocitoquímica. Estudo dos componentes do citoesqueleto. Observação de microtúbulos com anticorpos anti-tubulina marcados com fluoresceína. Observação de microfilamentos com anticorpos anti-actina marcados com rodamina. Interpretação de imagens nesta microscopia. Microscópio Digital Demonstração da utilização. Observação em campo claro, contraste de fase, fluorescência, polarização, contraste interdiferencial e confocal de células animais e vegetais. Citoquímica dos diferentes componentes químicos celulares Ácidos nucleicos DNA em cortes histológicos pela reacção de Feulgen. DNA e RNA pela coloração do verde - metil - pironina. Lípidos Lípidos totais com os corantes Sudan III, tetróxido de ósmio e Sudan Black B. Lípidos não ácidos com o corante azul de nilo em células vivas e cortes histológicos.

finos contrastados. Peroxidases pelo método da benzidina. Cálcio e Ferro Cálcio com a coloração de Alizaran. vegetais e microorganismos infectando ou não. Proteínas Proteínas totais com o “fast green” ácido. segundo Alfert e Geschwind modificado por Deitch. azul de alcião e ácido periódico de Schiff (PAS) em cortes celulares e esfregaços de sangue fixados. Observação e interpretação de microfotografias de contrastação negativa Microscópio Electrónico de Varrimento Observação e interpretação de microfotografias de réplicas celulares .5 Polissacáridos Corantes: Lugol. 2 . Complexo de Golgi segundo o método de Ramon e Cajal. segundo Deitch Proteínas histónicas com o corante “fast green” alcalino.MICROSCOPIA ELECTRÓNICA Microscópio Electrónico de Transmissão Observação de grelhas para o respectivo microscópio com cortes ultra. segundo Prenant. as células hospedeiras. Citoquímica de organitos celulares nas células animais Lisosssomas com marcação da fosfatase ácida segundo Gömori. Mitocôndrias segundo o método de Régaud. Ferro com a coloração azul de Turnbull. Observação e interpretação de microfotografias de células animais.

Diferentes reacções de caracterização química dos seus principais constituintes: celulose. C e NOR Observação ao microscópio e de fotografias Estudo das leucemias 3 . O sistema plastidial Observação de diferentes tipos de plastos em microscopia óptica: cloroplastos. Realização de testes histoquímicos para a caracterização de alguns grupos de compostos do metabolismo secundário armazenados nos vacúolos: compostos fenólicos e alcalóides. Utilização do microscópio de fluorescência para a caracterização de conteúdos vacuolares.6 TÉCNICAS DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES CROMOSSÓMICAS Cultura celular Escolha de tecido. . lenhina. cutina e suberina. Sua aplicação à caracterização de fármacos de origem vegetal. Aplicações ao estudo de alguns fármacos de origem vegetal e seus adulterantes. cromoplastos.CÉLULA VEGETAL O estudo da célula vegetal e a sua importância em Botânica Farmacêutica. Colheita. A parede celular em microscopia óptica Composição química da parede celular primária e secundária. R. Cultura e meios de cultura e respectiva técnica Bandas Técnicas para as Bandas G. Técnicas para a sua observação. amiloplastos e leucoplastos. como auxiliar na caracterização de fármacos de origem vegetal e na detecção de adulterantes. O sistema vacuolar Os vários tipos de vacúolos e o seu conteúdo.

Importância da sua utilização como auxiliar na identificação de fármacos de origem vegetal e seus adulterantes. Observação microscópica de figuras das fases das duas divisões meióticas em anteras de vegetais. Utilização de monografias da Farmacopeia Portuguesa para estudo de microcaracteres da epiderme em fármacos de origem vegetal. . Importância destes caracteres em taxonomia e na identificação de fármacos de origem vegetal. através da consulta da Farmacopeia Portuguesa. visualização das diferentes bandas e observação dos cromossomas plumosos. Sua importância em Botânica Farmacêutica como auxiliar na caracterização de fármacos de origem vegetal e na detecção de adulterantes. Aplicações ao estudo de Fármacos de origem vegetal Observação e caracterização de alguns tecidos vegetais. Estudo do tecido epidérmico Observação de alguns microcaracteres a nível do tecido epidérmico: classificação de estomas e determinação do índice estomático. Cortes histológicos As estruturas primárias e secundárias de raíz. tricomas tectores e secretores. 4 – CICLO CELULAR EM CÉLULAS ANIMAIS E VEGETAIS Estudo do ciclo celular Observação microscópica de mitoses em células animais e vegetais. Histologia e Anatomia Vegetal. sua classificação e coloração. Observação microscópica de cromossomas em interfase Observação microscópica dos cromossomas gigantes das glândulas salivares da Drosophila. Observação de cortes histológicos de vários exemplares. caule e folhas em exemplares de monocotiledóneas e de dicotiledóneas.7 Observação de grãos de amido.

Vol. LUIZA. Theory and Practice of Histological BRYAN G. JEAN H. J. e STEVENS. La pratique de l analyse chromosomique. Cell Biology .8 Observação microscópica e fotográfica de cromossomas humanos em metafase cariotipo humano Observação microscópica e fotográfica das placas metafásicas marcadas por diferentes tipos de bandas. Práticas de Biologia Celular. COUTURIER. e VIDAL. IRL Press.. A practical approach. B. Brasil.I. Bibliografia ALLAN JONES. London. Inc. DUTRILLAUX. Lisboa. . M. W. JUDD. R. Lisboa. Edgard Blucher Ltda. BOWES. FRESHNEY. (1999). J. Academic Press.E. Sinauer Associates. Churchill Livingstone. PRIEST. 1977... III. Biologia Celular e Molecular. II. (1971). A..A laboratory hand book. São Paulo. Masson. (1977). CELIS. England. Apoptose Observação de preparações em microscopia óptica de células com figuras de apoptose. Nova Flora de Portugal. Plant Systematics: A Phylogenetic Approach. PEARSE. (1980). Practical Skills in Biology..G.Volumes I e II: Preparative and Optical Technology e Analytical Technology.. J. (1990). A. 1983 BENCROFT. ROB REED and JONATHAN WEYERS. A. FRANCO. Lisboa. Lea & Febiger. (1999). C.D. FARMACOPEIA PORTUGUESA. A Colour Atlas of Plant Structure. Azevedo. Massachussets. Longman Press. Medical Cytogenetics and Cell Culture. Manson Publishing. MELLO. at al. Publ. BENEDICTO. United Kingdom. INFARMED. I. (1998). (1985). Lidel Edições Técnicas. Histochemistry: Theorical and Applied. J. (1997) 6ª Edição. (1998). Techniques. Churchill Livingstone. (1986). Animal Cell Culture.

6th ed. o reconhecimento e interpretação de imagens de microscopia e análise crítica experimental.. A citoquímica de acidos nucleicos. O estudo da célula Vegetal. Schleiden. Porto Editora.9 RAVEN. observação de estruturas celulares em microscopia óptica e electrónica. metodologias utilizadas nos diferentes microscópios assim como. R. 1999. R. botânico e pelo zoólogo T. (1983). Virchow que sugeriu que todas as células são originárias doutras células pré. et al. – Biology of Plants. serão estudadas as técnicas experimentais mais importantes para o estudo das células. Conjuntamente.existentes. H. SALEMA. New York. H. Schwann reconheceram semelhanças entre células vegetais e animais e a TEORIA CELULAR foi proposta juntamente com R. EVERT. Atlas de Ultraestrutura Celular. a Histologia e Anatomia Vegetal com a Aplicação ao Estudo de Fármacos de origem Vegetal será um dos objectivos desta Licenciatura. P. F. lípidos e carbohidratos assim como. Ao objectivo da Biologia Celular alia-se o da aprendizagem das técnicas de manuseio de diferentes tipos de microscópios ópticos. Âmbito A descoberta e o estudo das células feita por M. E. & EICHHORN. Inc. S. . (1999). a micrometria de diferentes células ao microscópio óptico e electrónico dará base para o bom estudo do novo medicamento. O estudo e observação de culturas de células será determinante para os ensaios in vitro dos projectos científicos das ciências farmacêuticas. W. Freeman and Company / Worth Publishers.

são invisíveis à vista desarmada.10 INSTRUMENTOS DE ANÁLISE DE ESTRUTURAS BIOLÓGICAS MICROSCOPIA A microscopia tem a maior importância no estudo das células. O microscópio óptico usa a luz visível (radiação electromagnética com comprimento de onda compreendido entre 400 e 800 nm) . Muitas características importantes de interesse nos sistemas biológicos são demasiado pequenas para serem vistas a olho nu. Para observar objectos mais pequenos é necessário formar deles uma imagem ampliada. corantes.2mm. as suas estruturas subcelulares e ainda as suas moléculas. protocolos de coloração e técnicas de preparação para ajudar a esclarecer melhor a estrutura e função das células. Nos anos mais recentes. As estruturas celulares que necessitamos de estudar têm dimensões que. só podendo portanto. 1mm (milímetro) = 1 000 µm (micrómetro) = 1 000 000 nm (nanómetro) = 10 000 000 Å (Angstrom). Radiação electromagnética Os microscópios usam radiações electromagnéticas para formar imagens ampliadas dos objectos a observar. ser observadas com o microscópio. em regra. Os microscópios são os aparelhos utilizados para formar essas imagens. tem-se notado um grande desenvolvimento em microscópios. Descreveremos as capacidades e aplicações das várias técnicas de microscopia usadas para visualizar as células. O olho humano só consegue formar imagens de objectos com dimensões superiores a cerca de 0.

as imagens são ampliadas até dimensões que tornam a sua observação confortável. A ampliação da imagem produzida pelo sistema óptico.2 mm (resolução do olho humano). permite observar objectos de dimensões inferiores a 0. Exemplo: Para que um objecto no limite de resolução do microscópio óptico se torne visível é necessário ampliá-lo: 0. A ampliação útil é a ampliação necessária para que a imagem do objecto se torne visível. sendo de 0. por maior que seja a ampliação utilizada.2mm / 0.2mm=5. utilizando um factor de ampliação adicional de 1mm/0. podemos ampliá-lo até 1mm.11 O microscópio electrónico usa raios catódicos (feixe de electrões) cujo comprimento de onda é inversamente proporcional à voltagem de aceleração dos electrões usados no microscópio. O factor de ampliação adicional é a ampliação vazia. Vê-se assim que a ampliação útil de um microscópio óptico não excede as 1000x Tipos de microscópio O limite de resolução de um microscópio depende do comprimento de onda da radiação electromagnética usada para formar a imagem e de aberrações das lentes . Para uma observação confortável. A de um microscópio óptico é de 0.2 µm = 200 µm / 0.2mm. mas apenas até ao limite de resolução do sistema óptico. limite esse que se denomina resolução do sistema. Por exemplo. Para conforto do observador. para que atinja dimensões iguais ou superiores ao limite de resolução do olho humano.2mm e é limitada pelo comprimento de onda da luz visível.2 µm = 1000 x. a resolução do olho humano é de cerca de 0. Objectos menores que este limite não podem formar imagens.0037nm para uma voltagem de 100KV. . ou seja. Resolução e ampliação Há um limite mínimo para a dimensão dos objectos que podem ser observados com um determinado sistema óptico. e é determinada pela estrutura celular da retina.

o feixe de radiação é estático e irradia simultaneamente toda a área observável da amostra. o feixe possui dimensões muito reduzidas irradiando apenas um ponto da amostra. atravessa a amostra e penetra na objectiva. mas é usada principalmente nos microscópios de fluorescência. pode-se melhorar a resolução construindo microscópios que utilizem radiações de comprimento de onda menor que o da luz visível. A radiação ultra-violeta permite algum ganho de resolução. A . Os raios-X começam a poder ser usados com lentes especiais. irradiando em sequência todos os pontos do objecto (varrimento ou varredura). Os componentes principais do microscópio óptico são: • • • • • • • Fonte luminosa: Condensador Diafragmas de campo e do condensador Platina Objectiva Tubo Oculares MICROSCÓPIO ÓPTICO FOTÓNICO VULGAR No microscópio óptico de transmissão a luz emitida pela fonte luminosa e concentrada pelas lentes condensadoras. A imagem virtual situa-se à distância de 25cm do olho do observador. Nos microscópios mais comuns. ampliada. da imagem real produzida pela objectiva. Noutros aparelhos (microscópios de varrimento). A objectiva forma uma imagem real. e é dotado de um movimento relativamente àquela. também ampliada. A construção deste tipo de microscópios depende da capacidade de produzir lentes para a radiação em causa. e raios-gama não foram ainda usados por falta de dispositivos que possam funcionar como lentes. do objecto e as oculares formam uma imagem virtual. O microscópio óptico usa a luz visível como radiação electromagnética. e é a imagem que pode ser observada.12 Deste modo. Os raios catódicos (feixes de electrões) utilizam ++ e são usados nos microscópios electrónicos.

O condensador está provido de um diafragma em forma de anel (diafragma anular) que produz um cone oco da luz que o atravessa. refracção. O feixe luminoso que atravessa a amostra é modificado por interacções com esta. podendo existir outros dispositivos no trajecto da luz que introduzam factores multiplicativos adicionais. diferença de fase etc.13 ampliação total é o produto dos factores de ampliação da objectiva e das oculares. que consistem na absorção de certos comprimentos de onda produzindo côr. O efeito de fase depende da interferência entre a imagem geométrica directa e a imagem difractada lateral. de onda S D. difracção. I S+D D Comp. MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE Ambos os microscópios usam a propriedade de dar contraste a estruturas biológicas transparentes à luz visível. Raios directos . Se os dois grupos de raios se somam em contraste brilhante ou negativo o objecto aparecerá mais brilhante que o meio. A luz que passa o objecto é desviada em relação à que passa directamente o meio que o rodeia. A luz ilumina o objecto e o que o rodeia. visto que fazem mudanças de fase e/ou atrasos nas radiações que atravessam essas estruturas. reflexão. pequenas mudanças de fase são transformadas em diferenças de amplitude (intensidade). Quando o contraste é positivo ou escuro os jogos de raios experimentam uma interferência substrativa sendo a imagem do objecto mais escura que o meio. Estas interacções vão-se traduzir na produção de diferenças de côr ou de intensidade luminosa na imagem do objecto. Raios difractados S. O microscópio de contraste de fase usa um condensador e objectivas especiais. Deste modo. que podem ser percebidas pelo olho humano.

Utilizando o dispositivo A. a luz directa é .14 I S S-D Comp. de onda D Para obter os dois tipos de contrastes o microscópio é provido de objectivas com dispositivos de fase específicos: CONTRASTE BRILHANTE vidro material retardante de fase material absorvente CONTRASTE ESCURO A) vidro material absorvente B) vidro material retardante de fase Conforme os fabricantes de microscópios o contraste escuro pode ser obtido com dois dispositivos diferentes (ver Figuras A e B).

Esta imagem tem um halo considerável em virtude dos efeitos de difracção. encontram-se no plano onde se forma a 1ª imagem dada pela objectiva. Aqui. mas tem a vantagem de fornecer dados quantitativos. Porque o atraso de fase é consequente da diferença entre o índice de refracção do meio e do objecto.15 levada ao foco da objectiva onde está colocada a placa de fase. Os raios da luz desviada do objecto que tinham sido atrasados comparativamente à luz da fonte luminosa passam sem alteração pela placa de fase. algumas das ondas de luz interferem entre si e o brilho é reduzido. Esta. Este microscópio. Os esquemas mostram a passagem da luz através da preparação. e porque o aumento refractivo é quase o mesmo para todas as moléculas . A microscopia de interferência tem por base princípios semelhantes ao microscópio de contraste de fase. enquanto que o microscópio de fase só revela variações acentuadas. Em seguida. A ocular recebe os dois conjuntos de ondas de luz para formar uma imagem altamente contrastada do objecto. permite a detecção de variações pequenas e contínuas de índice de refracção. tem uma ranhura em forma de anel que é coberta por uma fina camada de metal que tem por fim fazer avançar os raios da luz directa de um quarto de comprimento de onda e reduzir a sua intensidade. e os dispositivos de fase. as ondas de luz que passaram pelo objecto e aquelas que passaram pelo meio que o circunda.

Além de possibilitarem a resolução de certas . MICROSCOPIA DE FUNDO ESCURO No microscópio de fundo escuro. só a luz refractada ou difractada pela amostra entra nas lentes da objectiva para formar a imagem. medindo o atraso de fase. É usado na microbiologia. para detectar bactérias ou na autoradiografia. a luz é dirigida do condensador à amostra num ângulo oblíquo de maneira a que nenhuma luz incidente entre nas lentes da objectiva (criando um campo escuro se nenhuma amostra estiver presente).16 biológicas. A Figura mostra um esquema deste tipo de microscópio. Uma das grandes vantagens dos microscópios de contraste de fase. A quantificação do atraso de fase é feita usando um compensador que reduz o brilho do objecto a negro. Como muitos movimentos são demasiado lentos para observar em tempo real é útil fotografar (microcinematografia) ou filmar em sistema de vídeo. Nestas condições. A resolução não é muito boa. pode ser empregue no futuro com sistemas analisadores de imagem. mas com este método podemos observar objectos pequenos que refractam a luz incidente. Ultimamente. é possível avaliar a quantidade de massa seca por unidade de área do objecto. Embora o seu uso seja remoto. as câmaras de vídeo e a tecnologia associada do processamento de imagem têm tido maior impacto na microscopia óptica. mitose e migração celular. para detectar grãos de prata produzidos na emulsão fotográfica por radiação. interferência e de fundo escuro é que eles tornam possível a observação dos movimentos envolvidos em processos como.

Se tratarmos tecidos.17 imperfeições do microscópio. A fluorescência data de 1904 com Kohler e foi usada mais frequentemente com Coons que introduziu a técnica dos anticorpos fluorescentes em 1941. tais como a percepção de pequenas diferenças na intensidade da luz contra um fundo brilhante. bactérias com um corante fluorescente e as examinarmos ao microscópio com luz UV. com diâmetros de dimensão inferior ao λ da luz (0. Como resultado da absorção da luz. Como as imagens dadas pelas câmaras de vídeo são em forma electrónica. quer dizer. modificam o comprimento de onda destas radiações e tornam-se luminosas. absorvem a energia da luz e o seu estado electrónico é mudado para um estado excitado no qual a energia de cada molécula é maior do que o seu estado normal. resolveram de igual modo as limitações do olho humano. elas tornam-se luminosas e aparecem como corpos brilhantes num fundo escuro. isto é. Um dos exemplos é a observação de microtúbulos. Estas substâncias podem fazer parte da composição natural amostra ou ser introduzidas pelo processamento técnico como corantes. A fluorescência é um fenómeno óptico no qual a luz é absorvida por uma substância chamada fluoróforo e quase instantâneamente re-emitida com luz dum λ maior. O feixe luminoso tem no entanto um comprimento de onda apropriado (habitualmente na região azul ou ultravioleta) para excitar substâncias fluorescentes (fluorocromios) que se encontram na amostra. MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA É um microscópio de luz incidente (epi-iluminação). elas podem ser digitalizadas e processadas por um computador. Mecanismo da fluorescência Quando certas substâncias como o vidro. . como o microscópio de reflexão. atingir o limite de resolução teórico do microscópio óptico e aumentar o contraste das imagens. entra na objectiva para formar a imagem. A luz emitida pelos fluorocrómios excitados pelo feixe luminoso. células.025 µm) no microscópio de interferência assistido por um computador. são fluorescentes. as moléculas de fluoróforo tornam-se excitadas. Este facto tornou possível. gotas de gordura e diversos corantes são expostos às radiações UV.

Téc. Enzimaticamente No Quadro. No primeiro caso. No interior celular. podem ver-se os tipos de fluorescência e os materiais microscópio de fluorescência. No segundo. Feulgen Fluorocromia indirecta Mét.18 A energia excedente é dissipada em calor. Reac. mas também se usa para observações depois de tratamentos químicos. ex. Fluorescentes Fluorescência induzida Fluorescência do corante Imunofluorescência Fluorescência prod. Tipos de fluorescência do material biológico Tipos de fluorescência Autofluorescência Locais e Técnicas Fluorescência natural de substância(s) no tecido Drogas fluorescentes Substância no tecido convertida a fluorófero A. emitida em fluorescência. No terceiro. Quando surgem mudanças de excitação ou emissão do espectro de substâncias fluorescentes devido à sua união ao substrato. a reacção fotoquímica induzida pela luz apagar-se-á.coloração simples sem p. podemos encontrá-la nas fibras do tecido conjuntivo (colagénio e elastina) e nas lipofucsinas. trat. Esta técnica não é só utilizada quando se pretende detectar substâncias em concentrações mínimas. . também se podem obter informações a respeito da conformação das moléculas do substrato. Nos tecidos animais. a fluorescência ocorre. a luz é meramente absorvida sem fluorescência. a maior parte da autofluorescência é devida à presença do NADH unido a uma dehidrogenase mitocondrial. ou usada numa reacção fotoquímica. Químico B. a observar no Autofluorescência A autofluorescência é predominante nos tecidos vegetais. química seguida de coloração.

verde na sua forma ortocromática. A coloração do DNA com fluorcromos é importante. estão entre eles. Fluorescência induzida Algumas substâncias podem ser convertidas a fluorescentes por tratamento químico. A maioria dos corantes amarelos. Eosina e Fucsina Básica. DNA desnaturado e polissacáridos. Vermelho neutro. fluorescem com mais de uma cor. e vermelhos são de facto. cora o DNA. a mudança da ortocromasia para metacromasia envolve um aumento no pico de excitação (absorção) em direcção a curtos comprimentos de onda. e o brilho da fluorescência diminui. cora o RNA. . existe um correspondente aumento do espectro de emissão em direcção a grandes λ. (laranja de acridina e quinacrina. reacção de Feulgen. a cor emitida pela fluorescência muda para uma de λ maior. o mais conhecido é a Laranja de Acridina. Dos corantes fluorescentes metacromáticos. Primeiro. Fluorescência Metacromática Alguns fluocromos são metacromáticos. Brometo de etídio. e um decréscimo na absorção máxima.19 Todas as proteínas fluorescem quando são excitadas a 250-280 nm (UV). tirosina e fenilalanina. Fluorocromia Os corantes fluorescentes são conhecidos por fluorocromos em contraste com os que são visualizados no microscópio de luz que são chamados diacromos. Muitos corantes podem ser usados como diacromos e fluorcromos: Vermelho Congo. fluorescentes. etc. laranja. A fluorescência metacromática é devida à formação de dímeros e polímeros como resultado duma agregação das moléculas do corante. As gotas lipídicas também podem ser observadas no microscópio de fluorescência. Exº o formol reage com as ariletilaminas por reacções de condensação levando à formação de isoquinolinas e outros compostos fluorescentes. principalmente. devido aos estudos fluorimétricos. foi usada para o estudo da conformação do DNA. mas agora é utilizada para a quantificação do conteúdo em DNA. devido à presença do triptofano. e vermelho na forma metacromática. Usam-se Laranja de Acridina. Resumindo. Com os fluorcromos metacromáticos. Adicionalmente. assim como os diacromos. isto é.

As figuras 1 e 2 apresentam. O 1º emite luz amarela esverdeada quando é activado por luz de comprimentos de onda próprios. Pode empregar-se o isotiocianato de fluoresceína. dois corantes usados em imunoflorescência. O CH 3 CH 3 + N HO O H3 C N O CH 3 COO - COO - Fig. as estruturas da fluoresceína e tetrametilrodamina. 2 . Nesta posição vai ser formada uma ligação covalente entre o corante e a proteína ou outra molécula. Eles são adicionados às gamaglobulinas à custa de determinados radicais e tornam fluorescente o conjugado resultante. Quando se ligam a proteínas a ligação é feita ao grupo SH ou ao NH2.1 .20 Imunofluorescência Certos corantes fluorescentes podem utilizar-se para marcar os anticorpos do soro. Na zona sombreada é onde estão localizadas os grupos reactivos quimicamente. .Fluoresceína Fig.Tetrametilrodamina Fluorescência produzida enzimaticamente A actividade enzimática nas células (vivas ou fixadas) pode ser estudada em sistemas onde a enzima produz uma mudança de fluorescência pela acção num substracto ou co-enzima. respectivamente. enquanto que o 2º emite luz vermelha.

independentemente da direcção do plano de incidência. MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO Este método baseia-se no comportamento de certos componentes de células e tecidos. e é negativa no caso oposto. (Omega Optical Filter Set # XF71). num material anisotrópico a velocidade de propagação da luz polarizada varia. O microscópio de fluorescência tem grande sensibilidade tornando possível detectar pequenas quantidades de substância ou partículas de tamanhos abaixo da resolução do microscópio de luz.21 Microtubules Rat aortic smooth muscle cells stained with an anti-tubulin antibody and FITC-conjugated secondary antibody (green). Estas substâncias caracterizam-se por terem o mesmo índice de refracção em todas as direcções. a birrefringência é positiva se o índice de refracção for maior ao longo do comprimento da fibra. . porque apresenta dois índices de refracção diferentes. Se o material for isotrópico. a luz polarizada propaga-se através dele com a mesma velocidade. quando são observados com luz polarizada. A birrefringência (B) pode ser expressa quantitativamente como a diferença entre os dois índices de refracção (Ne – N0) associados com os raios de maior e menor velocidade. Photograph by Jim San Fillipo Aplicações As técnicas de fluorescência podem ser aplicadas a todas as espécies de material biológico. Este material também é chamado birrefringente. Nas fibras biológicas. Por outro lado. do que no plano prependicular. Podem ser visualizadas as mesmas preparações que no MO de luz e tem a vantagem de observar os corantes que absorvem na região do UV fluorescendo no visível. correspondentes a diferentes velocidades de transmissão.

pode ser acoplado a uma câmara de vídeo. ALINHAMENTO DOS MICROSCÓPIOS ÓPTICOS Focar a preparação e fechar o diafragma de campo ate observar um pequeno círculo. o feixe de radiação percorre a preparação. A área iluminada pode ser ajustada abrindo ou fechando o diafragma de campo.22 Na prática. mede-se o atraso (T) que a luz sofre num plano. O atraso está relacionado com a espessura do espécime (t) da seguinte maneira: B = Ne . O aparelho é usado para observar o fundo dos frascos de cultura de células. O microscópio de polarização. Microscópio invertido É um microscópio óptico de transmissão. tal como o microscópio de interferência. Só deve ser iluminada a área a observar abrindo o diafragma até que todo o campo esteja iluminado e não mais que isso. que não podem ser facilmente estudados com os microscópios normais. sendo produzido por um laser. que consistem de folhas polaróide ou de prismas de Nicol em calcite. relativamente à velocidade que a luz apresenta num plano perpendicular a este. em que as posições da objectiva e do condensador se encontram invertidas relativamente à platina. . com o microscópio de polarização. Manter o condensador nesta posição para a objectiva alinhada. Microscópio confocal Trata-se de um microscópio óptico que funciona em modo de varrimento. Centrar o círculo com os parafusos do condensador e deslocar o condensador na vertical para que os bordos do diafragma que delimitam o círculo fiquem perfeitamente focados. O polarizador monta-se por baixo do condensador e o analizador por cima da objectiva.N0 = T/ t O microscópio de polarização difere do microscópio vulgar pela presença de dois elementos de polarização: o polarizador e o analizador. Portanto o feixe luminoso irradia apenas um ponto da preparação. Do mesmo modo que no SEM. o que melhora consideravelmente o contraste e a qualidade de imagem.

A formação das imagens no microscópio depende de métodos de contrastação que introduzem nos cortes metais pesados que. . e que dados sobre a sua composição química se podem recolher por maniulação dos mecanismos de contrastação. MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE TRANSMISSÃO Interpretação da imagem em microscopia electrónica de transmissão As imagens observadas com um microscópio electrónico de transmissão (TEM — Transmission Electron Microscope) são imagens de cortes de objectos tridimensionais. dão origem à imagem. reduzindo a resolução. Nestas condições toda a abertura numérica da lente é aproveitada. Uma maior abertura do diafragma do condensador pode produzir maior intensidade luminosa. mas permite aumentar o contraste da preparação. que é directamente observável removendo a ocular e observando directamente o interior do tubo do microscópio. Em condições ideais. ao interagir com o feixe de electrões.23 O diafragma do condensador pode ser usado para regular o ângulo do cone de luz que entra na objectiva. O fecho do diafragma vai diminuir a abertura numérica da objectiva. este cone de luz deve iluminar toda a lente frontal da objectiva e não mais do que isso. A imagem do diafragma do condensador pode ser monitorizada no plano focal da objectiva. Em que medida é que a imagem produzida pelo método de contrastação corresponde à realidade estrutural. e toda a luz proveniente do condensador entra na objectiva. mas produz um fundo brilhante que impede a visualização de pequenos detalhes. Na interpretação destas imagens há que atender portanto a estes dois factores: 1. As condições de iluminação descritas designam-se por "iluminação de Koeller".

acetato de uranilo) e são usados para tratar as amostras não incluídas. As colisões dos electrões do feixe com os átomos da amostra processam-se segundo dois processos essenciais: 1) colisões dos electrões do feixe com os electrões dos átomos da amostra. Outros (acetato de uranilo. Alguns destes compostos funcionam também como fixadores (tetróxido de ósmio. O feixe de electrões. Que se pode inferir relativamente à estrutura do objecto tridimensional que se pretende compreender. Este mecanismo de formação do contraste tem importância sobretudo para o detalhe mais fino. atravessa a amostra interagindo com os seus átomos. este efeito pode-se obter ligando químicamente à amostra compostos com metais pesados. O contraste Para compreender a primeira questão é necessário conhecer o mecanismo da formação do contraste no TEM. do estudo das secçôes bidimensionais. os electrões do feixe não perdem energia. há uma maior fracção de electrões desviados e removidos do feixe. Consequentemente. que podem produzir contraste por interfência com os electrões do feixe que não sofreram colisões. Estas colisões reduzem a energia dos electrões do feixe. durante os passos de fixação. quando colidem com núcleos de átomos pesados. aquele que fica fora do material a observar. gerando regiões deficientes em electrões. citrato de chumbo) são usados para tratamento dos cortes finos (Fig. perto do limite de resolução do microscópio. A contrastação negativa (Fig. 2) colisões com os respectivos núcleos. o electrão do feixe transmite parte da sua energia ao electrão do átomo da amostra e é pouco desviado da sua trjectória. em termos qualitativos e quantitativos. .24 2. nas regiões da amostra onde há maior concentração de átomos pesados. mas são desviados da sua trajectória segundo ângulos elevados. Estes electrões podem ser selectivamente removidos pela introdução de diafragmas que só deixam passar os electrões não desviados (fig). isto é. dependente das colisões elásticas dos electrões do feixe com átomos pesados. Trata-se de uma colisão não elástica. No primeiro caso.1) mostra o contraste por um corante negativo. 2). acelerado por um potencial de várias dezenas de kilovolts (típicamente 60-80 KV em estudos de materiais biológicos). No segundo caso. Técnicas de contrastação Uma vez que o contraste que interessa obter é principalmente contraste de amplitude.

A intensidade e/ou côr do ponto imagem são moduladas pelo sinal recolhido pelo detector. etc. que é essencialmente um microscópio electrónico de reflexão. de alta energia (electrões retrodifundidos). e a interacção do feixe com a amostra gera sinais que podem ser medidos por detectores apropriados. e são as alterações produzidas no feixe por interacção com esta que vão ser convertidas na imagem. que é um microscópio óptico funcionando também em modo de reflexão (fazendo uso principalmente de técnicas de imunofluorescência). As implementações actualmente mais importantes em biologia são o microscópio electrónico de varrimento (SEM – scanning electron microscope). Estes sinais podem ser medidos por detectores apropriados.A interação do feixe de electrões com a amostra gera um conjunto de sinais em que se contam electrões secundários. electrões retrodifundidos. A imagem forma-se ponto por ponto em tubos de raios catódicos nos quais o feixe de electrões se move de um modo sincronizado com o movimento do feixe de radiação do microscópio de modo que a cada ponto do objecto corresponde um ponto da imagem. raios-X. O feixe percorre sistemáticamente toda a amostra por um processo de varrimento. nos microscópios de varrimento o feixe irradia apenas um ponto da amostra. A resolução deste tipo de aparelhos depende principalmente do tamanho da área do objecto irradiada pelo feixe O modo de varrimento pode ser implementado quer em microscopia de transmissão quer em microscopia de reflexão quer óptica quer electrónica. e o microscópio confocal. Estes sinais. repectivamente para electrões de baixa energia (electrões secundários). e raios-X. SEM Funcionamento do instrumento No microscopio electrónico de varrimento o feixe de radiação é um feixe de electrões que é focado num ponto da amostra pelas lentes electromagnéticas do microscópio.25 Microscopia electrónica de varrimento Enquanto que nos microscópios de transmissão convencionais o feixe irradia toda a amostra. são . Merece também referência o microscópio electrónico de varrimento-transmissão (STEM – Scanning-transmission electron microscope) que é um microscópio electrónico funcionando em modo de transmissão.

Preparação das amostras para o SEM Uma vez que interessa estudar a superfície de amostras inteiras. Como as amostras são observadas no vácuo do microscópio. permitindo a observação de amostras não desidratadas. não sendo importante que o feixe de electrões seja capaz de a atravessar uma vez que os sinais recolhidos dizem respeito. A intensidade da emissão depende da natureza química da amostra. apenas à interacção com a superfície da amostra. A secagem é habitualmente o passo mais delicado. Imagens produzidas pelos electrões secundários Trata-se do modo de observação mais utilizado no SEM. Portanto estes instrumentos estão particularmente adaptados ao estudo das superfícies das amostras e não da estrutura interior. próxima da pressão atmosférica.26 convertidos pelo detector em correntes eléctricas de maior ou menor intensidade que vão modular a intensidade do feixe de electrões que forma a imagem no tubo de raios catódicos. os fenómenos de tensão superficial exercem forças capazes de destruír a maior parte da estrutura biológica observável. uma vez que no seu decurso. de um modo tão fiel quanto possível. em regra. elas têm de ser fixadas e secas. As amostras estudadas no SEM são amostras espessas. como dentes inteiros. Modernamente têm vindo a ser desenvolvidos microscópios electrónicos de varrimento “ambientais” nos quais a câmara que contém a amostra pode ser mantida a uma pressão elevada. Os metais. os métodos de preparação têm por objectivo preservar as superfícies. que . Estes electrões são ejectados direccionalmente em função da topografia da amostra. Os electrões secundários são os electrões ejectados dos átomos da amostra pelas colisões não elásticas com os electrões do feixe. estas podem ser cortadas ou fracturadas de modo a expôr o interior. Para evitar estes efeitos recorre-se à secagem por métodos de ponto crítico ou a partir de líquidos de tensão superficial muito baixa. Quando se torna necessário estudar o interior das amostras.

27 possuem electrões mais fracamente ligados. Técnicas especiais de microscopia electrónica Técnicas citoquímicas para localização de polissacarídeos e ácidos nucleicos. através de sucessivas colisões elásticas com os átomos da amostra são desviados do seu trajecto o suficiente para se libertar da amostra e re-entrar no vácuo da câmara de observação (retro-difusão). caso dos compostos orgânicos. o método é ideal para revelar a topografia das superfícies. A sua emissão é também direccional como a dos electrões secundários. A autorradiografia. Os métodos citoquímicos para detecção de actividades enzimáticas. Por este motivo. No entanto trata-se de electrões que penetram na amostra a maior profundidade e que são deflectidos mais intensamente nas regiões de maior densidade de massa (à semelhança do que se passa no mecanismo de formação de contraste do TEM). a intensidade do sinal reflecte não apenas a topografia da amostra como a sua composição química. Digestões enzimáticas em cortes ultrafinos para localização de proteínas e lípidos. Portanto. Por este motivo. a criomoldagem e a coloração negativa. a intensidade do sinal recolhido é maior para os pontos das superfícies viradas para o detector. desviados por colisões elásticas. . Como se trata de electrões do feixe de radiação do microscópio. emitem melhor que as substâncias em que os electrões se ligam mais firmemente aos átomos. Técnicas de imunocitoquímica. Como o detector se localiza num dos lados da câmara de observação. a superfície das amostras é recoberta com finas películas metálicas. a sua energia é muito maior que a dos electrões secundários. Imagens produzidas pelos electrões retrodifundidos Estes electrões são os electrões do feixe que.

Breve história 2. . 1.28 Fotografia de E.Tipos de células: Culturas primárias. linhas celulares e células híbridas. são chamados os estudos in vitro e são feitos em culturas de tecidos. caracterização e diferenciação. Biologia das células em cultura: sua origem. Possibilidade de fazer crescer em laboratório células animais e vegetais.Diferenças entre a cultura de procariotas e eucariotas 8. Estas células têm vantagem para alguns estudos e sobre isso falaremos. 6. 5. Cultura de tecidos é a arte de manter e crescer células vivas ou tecidos num meio artificial controlado. Coli num SEM CULTURA DE TECIDOS A Biologia Celular faz crescer células em condições artificiais para os seus ensaios. 4. 3 Importância e aplicações.Curva de crescimento das células eucariotas 7.Meios de cultura: composição e importância.

a modulação do ciclo celular. estas são colocadas numa placa de Petri ou num frasco de plástico próprio ou de vidro tratado. Contudo. assim como de células tumurais. juntamente com o meio de cultura contendo os respectivos nutrientes.Ensaios para antibióticos. são referidos outros usos em processos biológicos e químicos: . Os sistemas de cultura celular in vitro têm dado possibilidade aos investigadores de estudarem o crescimento e diferenciação celular. porque permitem melhorar e esclarecer mecanismos e factores celulares até agora desconhecidos) e as manipulações genéticas com vista ao estudo da estrutura e expressão génica.Produção de produtos farmacêuticos . as interacções vírus-célula (muito importantes. como elas crescem. A possibilidade de estudar células depende da maneira como elas podem crescer e ser manipuladas em laboratório. embriões ou células tumurais. quais as suas necessidades e como é que morrem.Testes de toxicidade e diagnóstico de doenças Metodologia Depois da dispersão dum tecido nas suas células componentes. Importância e aplicações Em primeiro lugar. Embora o protocolo da cultura de células não seja tão fácil como o que diz respeito à cultura de bactérias. Além destas aplicações. quais os factores que as estimulam ou inibem.29 Começou a ser realizada em 1800 com o exame in vitro de orgãos e tecidos do corpo que podem ser mantidos fora do corpo.Investigação sistemática e taxonómica .Testes de diagnóstico clínico . química orgânica e alimentos . aminoácidos. o crescimento viral. já se faz por rotina a cultura de tecidos animais e vegetais. é importante referir o desejo dos investigadores de estudar as próprias células. vacinas. Os tipos de células mais utilizadas são: fibroblastos. células epiteliais. em condições especiais muitas células especializadas podem ser postas . vitaminas. isto é.Produção energética e fermentação .

tal como no animal normal. ~ . transfectandoas. A linha celular é clonal quer dizer. Eagle estudou o crescimento de duas estirpes celulares: HeLa e fibroblastos de rato. pois muitas das células deverão ser de origem tumural e ficarão imortais. Eagle foi variando os componentes do meio. Para saber quais os nutrientes específicos para o crescimento celular. temos as culturas primárias e as linhas celulares. Em 1955. estas células foram colocadas a crescer num meio formado por uma mistura de sais. O maior problema com as culturas de tecidos primárias é o facto de. Isto significa que se as colocarmos num meio favorável elas continuarão a proliferar criando uma linha celular. vitaminas e soro de bovino. Harry Eagle descreveu o primeiro meio sintético que permitiu o crescimento celular. aminoácidos.As linhas celulares podem ser obtidas depois da trituração de um tumor e observação das células que ficaram aderentes à placa de Petri.30 em cultura levando os investigadores ao estudo das suas propriedades de diferenciação. Também é possível transformar células primárias em imortais. carbohidratos. soro e extractos embrionários. Resumindo. As culturas primárias consistem na manutenção de células normais ou tecidos que são obtidos duma fonte viva num sistema in vitro. Os meios de cultura começaram por ser o plasma.Claro que para os tecidos sobreviverem intactos devem ser seccionados finos de modo a promoverem as trocas de gás e eliminarem os resíduos. Para isso. O meio descoberto por Eagle é ainda hoje o meio base de todas as culturas de células (ver o Quadro). as células só se poderem dividir um número de vezes antes de ficarem quiescentes. que um largo número de células foi originado apenas de uma célula. As linhas celulares são armazenadas na American Type Culture Collection.

2 cavalo a 10% para todas as culturas stock .02 Tirosina Valina Contaminação Consiste no crescimento de microorganismos (fungos ou bactérias) indesejáveis à cultura de células.NaH2PO4 .2 Ácido 10-3 0.05 Nicotinamida 0.1 0. isto significa que as células cresceram.05 Colina 10-3 KCl Glutamina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina 0.1 0.1 Biotina 10-3 NaCl Cistina 0. H2O 10.31 Meio base de Eagle Vitaminas (mM) (mM) Arginina 0.005% 10. as células utilizam os nutrientes do meio e os resíduos aparecem modificando muitas vezes o pH do meio.2 Tiamina 3 pantoténico CaCl2 1 -3 10 MgCl2 0. Depois de três dias. Ao longo do tempo. se as células não cresceram 70-80% da confluência ( quando não existe nenhum intervalo entre elas.005% 20 Vermelho fenol 0. 2.2 Soro de bovino ou 0.NaHCO3 0. neste ponto as células deixam de crescer).5 1010-4 Riboflavina 0.aminoácidos Sais (mM) Outros 100 Glucose 5 mM 5 Penicilina 0.05 Fenilalanina Trionina Triptofano 0.005% 1 Estreptomicina 0. Crescimento celular Quando se começa com metade do número de células a cobrir o frasco de cultura e posteriormente se observa o frasco todo coberto. então pode-se substituir parte ou a totalidade do meio por meio fresco aquecido.2 Piridoxal 0.0 Ácido fólico 3 3 L.

Cada vez que se passa as células é considerado uma passagem. Mecanismo de coloração para a microscopia óptica vulgar A maioria das células e tecidos no seu estado natural contêm pouco pigmento para a absorção da luz. ácidos nucleicos. é necessário. designam-se por reacções citoquímicas. existe um número finito de passagens. o componente marcado deverá desaparecer. e permitem revelar. Métodos citoquímicos e imunocitoquímicos A aplicação de compostos químicos com metais pesados pode ser feita por intermédio de reacções químicas que apresentem especificidade para componentes químicos presentes nas amostras. Para as células primárias normais. de um modo específico ou preferencial. não se devem fazer muitas passagens para não alterar a linha celular original porque com o tempo as células tendem a duplicar parte ou a totalidade dos cromossomas e consequentemente alterar os genes que exprimem. . Devido à possibilidade de. Após o tratamento enzimático. têm de ser empregues métodos para a coloração das células e das suas estruturas. Normalmente são translúcidas à luz e por essa razão não é possível ver muitos detalhes. enquanto as imortalizadas continuam a crescer. elaborar controles que garantam que a marcação observada é específica. a presença de componentes químicos nas amostras. Estas reacções de que são exemplo as reacções derivadas da reacção de Feulgen para contrastação do DNA ou PAS para contrastação dos glúcidos. por pouca especificidade dos métodos químicos que podem marcar várias substâncias (muitas vezes devido a impurezas dos reagentes difíceis de controlar). Contudo. os citoquímicos. Consequentemente.32 Quando as células atingem a confluência. com enzimas que removem selectivamente os compostos que se pretende identificar. Para esse fim podem-se usar neste caso digestões enzimáticas. Então. como em todas as experiências científicas. como glúcidos. Falaremos de técnicas para a observação dos componentes celulares e de outros. etc. para a observação dos seus componentes químicos. elas proliferam até que se faça novamente a sub-cultura. usualmente são removidas do frasco com tripsina e colocadas num novo frasco numa concentração celular mais baixa.

Exemplos. • Retire a preparação do Microscópio e coloque uma gota de um corante vital num bordo da lamela para que a solução entre por capilaridade. • Retire uma lamela com monoestrato celular Vero da caixa de Petri e monte-a na lâmina e observe ao Microscópio. indiferentes e metacromáticos.3 Uso de mordentes e diferenciadores. Vermelho neutro.4 Classificação dos tipos de coloração: coloração vital e pós-vital. Este trabalho tem como objectivo observar células vivas coradas com diferentes tipos de corantes vitais. noção de ponto isoeléctrico das proteínas.1 Outro tipo de corantes: neutros.33 1. Células Vero. Coloração progressiva e regressiva. Lâminas de vidro . Estas células são de linha contínua fibroblástica de rim de Cercopithecus aethiops (macaco “African Green”). Lugol. Este meio foi suplementado com 10% de soro de vitela recém nascida e 50µg/ml de gentamicina. 2. 2. A penetração é mais rápida. Scotland). Método das colorações combinadas. Material Microscópio. Papel de filtro. .2 Inversão da coloração 2. anfotéricos. directa e indirecta. Tipos de corantes: ácidos e básicos – mecanismo de coloração. COLORAÇÃO VITAL EM CULTURA DE TECIDOS E CÉLULAS VIVAS As células Vero foram obtidas da American Type Culture Collection e cresceram em monocamada no meio Eagle modificada por Dulbeccu (Gibco. Pipeta Pasteur. 2. Pinça Reagentes Azul de metileno. Mecanismo de produção de cores: noção de grupo cromóforo e auxócromo 2. Soro fisiológico TÉCNICA • Coloque uma gota de Soro fisiológico numa lâmina limpa. Azul de tripano.

extrair o líquido que sobra. Cobrir com a lamela contendo o filme de corante.34 se do lado oposto aquele em que pôs a gota.. Isto dá-nos uma indicação do que ocorre a nível dos vacúolos digestivos. Este corante é também utiizado como indicador de pH: cor de laranja a pH alcalino. específica para mitocôndrias. . Dependendo do organismo e do seu estado fisiológico. vermelho-cereja a pH neutro e azul a pH ácido. outros organelos celulares começam também a receber o corante. Células de cultura sem coloração Verde de Janus É uma coloração vital. com o auxílio de papel de filtro. após alguns minutos esta solução cora as mitocôndrias de azul escuro ou verde. esperar 1 a 2 minutos e observar ao microscópio. À medida que os organismos vão morrendo. pelo que é importante ter em consideração o aspecto da preparação antes da coloração (exame a fresco). que têm um pH ácido Imagem de células Vero sem col. o. Protocolo: Retirar uma gota da suspensão celular e colocar sobre a lâmina. Coloração com Vermelho neutro: Esta solução cora ligeiramente os núcleos e outras inclusões. • Visualizar ao m. como os fagolisossomas. Registar as observações.

Cobrir com a lamela contendo o filme de vermelho neutro.Dependendo do organismo e do seu estado fisiológico. esperar 1 a 2 minutos e observar ao microscópio.35 Protocolo: Retirar uma gota da infusão e colocar sobre a lâmina. Coloração com verde Janus É uma coloração vital específica para mitocôndrias. À medida que os organismos vão morrendo. células azuis correspondem a células mortas. Logo. • Observar ao mcroscópio Coloração com azul de tripano O método de exclusão do Azul de Tripano baseia-se no princípio de que células viáveis apresentam membranas intactas. TÉCNICA • Retirar uma gota da suspensão celular e colocar sobre a lâmina. A diferença entre o número total de células e o o número de células mortas será o número de células viáveis numa dada amostra da nossa cultura Coloração com azul de metileno . após alguns minutos esta solução cora as mitocôndrias de azul escuro ou verde. Registar as observações.enquanto que membranas metabolicamente inactivas de células mortas (não viáveis) não conseguem evitar a penetração do corante na célula. outros organelos celulares começam também a receber o corante. pelo que é importante ter em consideração o aspecto da preparação antes da coloração (exame a fresco). • Colocar gota do corante e esperar 1-2 minutos. que evitam a entrada do corante.

Azul de Tripano FUNDAMENTO DO PROCESSAMENTO DE CÉLULAS E TECIDOS PARA OBSERVAÇÃO AO MICROSCÓPIO ÓPTICO Existem muito poucas células suficientemente finas para serem visualizadas directamente ao microscópio (algas. Este processamento envolve vários passos: fixação. protozoários.e outras) são suficientemente espessos para permitir a passagem da luz. exame a fresco e vital . Estes passos serão estudados assim como. rim. sangue e cultura de tecidos). impregnação e corte feito em micrótomo. Vermelho neutro Co. Preparações extemporâneas. cérebro. a maioria dos tecidos (fígado. desidratação. os tecidos devem ser seccionados em fatias muito finas depois de previamente processados para impedir a danificação das células. algumas das modificações introduzidas na estrutura e composição das células. Então.36 Col.

Perfusão. . Vantagens e inconvenientes dos diferentes tipos de fixação Qualidades dos fixadores e soluções tampão. de corrediça e de congelação.). Conceito e métodos. agentes oxidantes. putrefacção e fermentação.podem arquivar-se documentos dos trabalhos realizados. materiais biológicos fixados e cortados em fatias finas (cortes). Um dos exemplos. é o esfregaço. . Também se usam células fixadas sem serem submetidas ao “corte”. em conjunto com o exame a fresco. para serem observadas. Tipos de fixação: química e física. agentes desnaturantes de proteínas. etc.permite exames mais demorados. Método dos cortes Fixação. Estes são atravessados pela luz e podem ser corados para introduzir contraste e diferenciação entre as estruturas celulares.podem confrontar-se antigas e novas preparações. .37 Estudo post-mortem. EXAME DE PREPARAÇÕES FIXADAS Introdução Sempre que possível usam-se. Vantagens e inconvenientes. . Classificação de fixadores químicos (aldeídos. Esfregaços de bactérias e sangue. O exame de cortes permite a conservação dessas preparações o que traz algumas vantagens: . Opacidade. Autólise.podem repetir-se as observações sempre que se deseje. Desidratação Diafanização Impregnação e Inclusão Microtomia: Micrótomo de Minot.

colocando-o numa placa metálica aquecida. coloca-se uma gota de água estéril contendo as bactérias e faz-se um esfregaço que seca ao ar para depois ser fixado pelo calor. então. O extracto sofre oxidação em hemateína que é um cromogénio ácido com pequena afinidade ou especificidade. as estruturas acidófilas são chamadas eosinófilas. A eosina é um corante sintético aniónico ou ácido. Quando a eosina é utilizada para a coloração de um tecido. leva-se a outra segundo um determinado ângulo a tocar o sangue e espalha-se o sangue até à outra extremidade da lâmina (ver na Figura). Depois de se ter colocado a gota de sangue na extremidade de uma lâmina. coloca-se uma gota com uma lanceta estéril e posteriormente é feito o esfregaço. Como se sabe todos os corantes sintéticos são derivados do benzeno. Depois o esfregaço está preparado para ser corado. .38 Esfregaços (bactérias e sangue) Por cima de uma lâmina. No caso do sangue. a eosina e com um corante catiónico ou básico. Esfregaço de sangue Para a execução da técnica de observação de material biológico em “corte” são realizados vários passos dos quais se destacam: A coloração com um corante aniónico ou ácido. Neste caso são necessárias 2 lâminas. O sangue é seco e depois corado. um mordente é essencial para a conversão deste corante a base podendo ligar-se fortemente aos ácidos nucleicos. a hematoxilina. é uma maneira de fazer contrastes de coloração necessários para um estudo morfológico. A hematoxilina é um corante natural extraído do tronco da árvore: Campechium Hernatoxylin encontrada na América Central e do Sul.

Anestesiar o animal com éter.39 1 . se iniciam uma série de processos destrutivos intracelulares de natureza enzimática. que consiste em passar o fixador na corrente sanguínea do animal antes da remoção dos orgãos.extracção de moléculas intra. e tem como objectivo preservar a estrutura dos tecidos o mais possível à existente in vivo.Fixação 2.autólise (acção enzimática).e extracelulares. A fixação pode ser feita por perfusão. Introdução A fixação dos tecidos deve ser feita imediatamente a seguir à paragem da circulação para prevenir a decomposição postmortem. podem produzir-se modificações nos tecidos em consequência da: . em certos casos. Técnica de perfusão Além da fixação por imersão das peças no líquido fixador emprega-se. deixando o coração a descoberto. assim. 2 . A fixação consiste em mergulhar fragmentos celulares ou tecidulares em soluções químicas orgânicas ou inorgânicas.1. a fixação por injecção do líquido nos vasos do animal. em que se pretende actuar mais directamente. 1 . . Portanto. Também se pode fazer colheitas com animais vivos. Estas são feitas por métodos endoscópicos ou cirúrgicos (biópsias). aquosas ou não. precipitando-as o menos possível. . tendo em conta que após a morte do ser vivo. . A maioria dos fixadores são soluções que exercem a sua actividade principalmente ao nível dos complexos proteicos da célula. Logo que se coloca um fragmento de tecido num fixador a morte das células não é instantânea e. que podem ou não precipitar ou coagular as proteínas.actividade microbiana.Colheita do material biológico A colheita deve ser feita o mais rapidamente possível. isto é. 2 .alterações osmóticas. .Abrir o tórax. é necessário escolher um fixador que mantenha a estrutura das proteínas próxima da original. a autólise. tendo a vantagem de reduzir artefactos resultantes do manuseamento dos tecidos a fixar.

Introduzir o catéter no ventrículo esquerdo penetrando na aorta ascendente. dá resistência ao tecido para as operações subsequentes da técnica de inclusão e prepara a coloração. 4 . . tais como. Essas enzimas digerem e alteram a célula introduzindo aspectos que não existiam “in vivo” e que resultam das técnicas usadas e da própria morte celular. etc. retracções ou remoções celulares. . . não produzem tumefacções.putrefacção.40 3 .Manter as estruturas o mais possível iguais às que existiam in vivo. Qualidades de um bom fixador Um fixador tem propriedades fixantes.Cortar a veia cava inferior para aspirar o sangue e abrir imediatamente a perfusão (fixadores mais usados: fixador de Bouin.deve preparar o tecido para não ser alterado pelos processos que se seguem: . isto é.tem bom poder de penetração e por isso mata o tecido rapidamente. Objectivos Os objectivos da fixação são: .autólise. degradação proteica por acção de microorganismos (bactérias.).O tempo deve ser de 15-20 minutos e o volume deve ser 20 vezes superior ao do sangue do animal. . . um bom fixador é aquele que: . 2. 6 . .quando se difunde pelas células do tecido não deve remover nem arrastar certos constituintes das mesmas. Portanto.Fechar as artérias mamárias e passar um laço no pedículo do coração.fermentação e lipólise. . . processo precoce que resulta da acção de enzimas proteolíticas das próprias células (lisossomas rompem-se e libertam as enzimas). Também se observam nos fixadores propriedades conservantes. destroem os microorganismos evitando a sua proliferacção e inactivam as enzimas hidrolíticas. 2. formol e álcool a 70º) para que este fluxo substitua o do sangue.facilitar certas colorações.Dar resistência à peça para suportar as operações subsequentes na técnica da inclusão. fungos. para que cortes finos sejam possíveis. isto é.Impedir a: .começar o processo de endurecimento das peças. 5 .A fixação tem ainda duas funções acessórias: .2. glúcidos ou lípidos.3. degradação dos lípidos e dos glúcidos por acção de microorganismos.

Claro que.Utilizar tecidos vivos logo após a morte.4. Mecanismo da fixação. inclusão.não causa retracção dos tecidos. corte. . parece que alguns fixadores têm a propriedade de formar "cross links" entre as proteínas formando um gel e idealmente . .revela todos os organitos da célula sem os mascarar.Remoção do fixador por lavagem com meios determinados pelo fixador. 3 .1.Pequenos blocos de tecido são colocados numa quantidade de fixador seleccionado o mais rapidamente possível depois da colheita. 2 . porque o formol é extraído mais depressa em álcool.deve permitir usar várias técnicas de coloração (no entanto. 2.preserva os fenómenos de osmose. 2 . Técnica de fixação 1 .Havendo paredes contrácteis no tecido ou órgão a fixar (ex. 2.5. os tecidos devem ser lavados em água corrente de 1 a 24 horas para remover a coloração amarela deixada pelo dicromato de potássio. .Utilizar fragmentos pequenos (± 2 cm de comprimento e 4-5 mm de espessura) para que o fixador fixe igualmente à periferia e no interior do tecido. 2.desidratação. Embora os detalhes não sejam conhecidos.41 . 5 . o tempo da fixação depende do tamanho e da densidade da peça a fixar e da temperatura a que se processa a fixação. . a coloração de detalhes celulares específicos como o aparelho de Golgi ou as mitocôndrias requerem fixadores especiais. o tecido deve ser lavado rapidamente em água e ser transferido para o álcool a 70º. 2. Quando se usa o formol como fixador. Proteínas Na fixação dos tecidos as reacções mais importantes são aquelas que estabilizam as proteínas.6.O tempo de fixação deve ser calculado em função dos resultados de uma boa fixação. Regras gerais para uma boa fixação 1 . Intestino). devem ser fixados os dois topos para impedir a contracção. assim como citoquímicas específicas de enzimas.diafanização. coloração e montagem. durante 6-48 horas a 4ºC. Nas fixações em Líquido de Zenker.6.O volume do fixador deve ser em média 20 vezes maior do que a peça a fixar. 4 .).

. As proteínas solúveis são fixadas a proteínas estruturais. . Características: . e a dupla ligação é atacada. . . . O formol também pode reagir com ligações duplas etilénicas nas cadeias de lípidos insaturadas. reage com os ácidos gordos insaturados durante a fixação. sendo formados 1:3 glicóis e 1:3 dioxanas. como a que está na reacção anterior.irrita as mucosas. Formol As reacções do formol com as proteínas tecidulares são numerosas e complexas. não dissolve as gorduras pois.42 conservando-as como se encontravam in vivo. são desfeitas por hidrólise.é um bom fixador. A reacção mais frequente é a formação do composto metilol.CH2O(OH) Este composto é reactivo e pode condensar-se com um átomo de Hidrogénio para formar uma ponte metilénica (-CH2.a sua reacção é lenta e pode ser reversível com um excesso de água nas primeiras 24 h e depende do pH sendo mais rápida a pH alcalino. Aldeídos (Formaldeído ou formol.6.1.usa-se dissolvido em água a 5 ou 10%. .é ideal para microscopia óptica.presta-se a cortes por congelação.): R. . danifica pouco e é barato.preserva mal a estrutura das proteínas. RH + CH2O R. ficando assim insolúveis e deste modo dão uma força mecânica à estrutura total permitindo os passos subsequentes no processo de inclusão. . Glutaraldeído e Acroleína) A formação de "cross links" entre os grupos terminais das proteínas são devidas a estes fixadores.CH2(OH) + HR’ R–CH2 –R’ + H2O Estas pontes metilénicas. 2. não deve acontecer na imunocitoquímica e trabalhos de microscopia electrónica de alta resolução.tem uma boa penetração.é simultaneamente um agente conservante. A desnaturação das proteínas causada pela fixação não é muito importante nas observações de rotina mas. .1.

pois consegue manter melhor que o glutaraldeído a antigenicidade das proteínas. Características: .penetra mais dificilmente do que o formol nos tecidos a fixar. .CHO. .43 . após a adição do aldeído.é sempre utilizado em microscopia electrónica. .a sua reacção é reversível e também depende do pH sendo mais rápida a pH alcalino. é um aldeído bifuncional que é capaz de fazer um maior número de “cross links” do que o formol. 2 e 3).é um dos fixadores eleitos para a imunologia. H2C = CH.causa uma perda de ± 30% da estrutura em hélice das proteínas. 2 .Formação de cross-links com o As reacções do glutaraldeído (Figs. O aldeído acrílico ou acroleína. Acroleína A acroleína penetra rapidamente o tecido preservando a morfologia e actividade enzimática. Glutaraldeído COH COH H C O H C O (CH 2) 2 Proteína (CH2 ) 2 CH2 + N (CH2 ) 3 (CH2 ) 2 C H O H N + CH2 Proteína (CH2 ) 2 C O Fig.desnatura um pouco as proteínas e enzimas. . com as proteínas são análogas às do formol.Estrutura do glutaraldeído glutaraldeído Fig. 3 . .é mais rápido e eficaz na sua acção que o formaldeído. . Reage de maneira semelhante ao formol com as proteínas. ficando completas ao fim de 30 minutos. um aldeído bifuncional.

os álcoois conservam a estrutura secundária das proteínas. .muito caro. No entanto. 2.removem histonas.1.2. .tem fraca penetração.1.6.devido a ser um coagulante enérgico e rápido do citoplasma (sem o retrair) e de se reduzir ao contactar com as gorduras dando uma cor característica. Segue-se um processo de polimerização.o tetróxido de ósmio (OsO4) forma “cross links” com as proteínas. Agentes oxidantes (Tetróxido de ósmio. 2.44 A acroleína reage com os grupos -OH e -NH das proteínas para formar CH2=CH-CH-N-. .altera-se facilmente. . Características: . recomenda-se o seu uso em histologia.6.podem causar retracções. álcool metílico e álcool etílico) Álcool metílico e álcool etílico Os álcoois reduzem a constante isoeléctrica das proteínas causando a sua precipitação próximo ou nos seus pontos isoeléctricos. permanganato de potássio e dicromato de potássio) Tetróxido de ósmio Características: . . É usado especificamente para preservar o glicogénio. OH Também reage com ácidos gordos e com as duplas ligações dos alcenos. O álcool absoluto é ocasionalmente usado como fixador porque desidrata. . importantes na manutenção da sua estrutura terciária. . . Agentes desnaturantes de proteínas (Ácido acético.alteram a estrutura terciária das proteínas fazendo com que haja ruptura das pontes hidrofóbicas. ou submentendo-as ao seu vapor.pode empregar-se imergindo as peças no líquido.3. A alteração da estrutura das proteínas causada pelo metanol e etanol é devida à disrupção das suas ligações hidrofílicas.

é formado um grupo dimercaptide: RSH + HgCl2 RSHgCl + HCl RSHgCl + RSH (RS)2Hg + HCl Também existe evidência da reacção do cloreto de mercúrio com os grupos disulfureto formando produtos de reacção que podem variar com o pH da solução. Contudo.1. Os glicolípidos acídicos (gangliosidos e sulfatídeos) e os glicolípidos neutros (cerebrósidos) são também moderadamente hidrofílicos. ou alternativamente ligados a bases por ligações amida.6.6. Classificação de lípidos Os lípidos mais complexos consistem de ácidos gordos ligados a álcoois (glicerol) por ligações éster.2. Adicionalmente eles podem conter bases orgânicas. fosfato e grupos hidroxilo). devido à sua estrutura molecular e depois da determinação das suas propriedades físicas e químicas 2. ácido fosfórico e açúcares.1. Agentes de Mecanismo desconhecido (Cloreto de mercúrio e Ácido pícrico) Cloreto de mercúrio Com este fixador existe um número relativamente grande de resíduos de aminoácidos a reagir (tiol.6. A reacção deste fixador com o grupo tiol tem merecido mais atenção. Mostra-se o uadro. Os fosfolípidos com grupos básicos e polares fosforilados são hidrofílicos.2. Mecanismo de fixação dos lípidos Os lípidos têm sido demonstrados em secções de tecido desde 1896 com os corantes Sudan.4. As propriedades de superfície dos lípidos determinam a sua permeabilidade aos reagentes aquosos ou aos solventes orgânicos. os lípidos individualizados só recentemente foi possível observá-los. 2. A distinção mais útil do ponto de vista histoquímico é o facto de serem hidrofóbicos ou hidrofílicos. Como se mostra. Os não combinados (colesterole ácidos gordos livres) e os simples ésteres têm uma preponderância de grupos não polares e são hidrofóbicos. amino. . com as características que influenciam a histoquímica dos lípidos.45 2. imidazol.

Com ácido neuramínico Nacetil (ácido siálico). álcoois polihídricos e várias bases nitrogenadas. HIDROFÍLICOS. Com base glicerol Fosfatidil serina Fosfatidil etanolamina b. HIDROFÓBICOS. II. LÍPIDOS POLARES 1. Birrefringente à luz polarizada. São básicos e com ligação éster. Solúveis em água. FOSFOLÍPIDOS Fosfatidil colina-Lecitinas a. Ésteres de cerebrósidos. Com base esfingosina Esfingolípidos 2.e Tri . Um ácido gordo saturado liga-se à esfingosina por uma ligação amida mais fosforil colina. Têm uma hexose (glucose) ligada à ceramida. Ésteres Ponto de fusão depende do grau Ésteres do colesterol Mono. Básicos. Acídicos. HIDROFÓBICOS. Ligação éster.Di . Acídicos. LÍPIDOS NÃO POLARES Membro Características que influenciam a histoquímica Ponto de fusão e Sudanofilia dependente do n. Não sudanofílico. Ácidos gordos 1. HIDROFÓBICOS. Muito Acídicos.º de duplas ligações. Neutros. longas cadeias de ácidos gordos. Ligação éster. Fosfolípidos com ácido fosfórico. Lípidos não conjugados Colesterol 2. GLICOLíPIDOS Cerebrosidos Sulfatidos Gangliosidos .46 Classe I. Básicos.glicéridos de saturação dos constituintes dos ácidos gordos.

se um grupo etilénico oxidado estiver à disposição e então. forma-se um diéster. CH O HO CH CH O Os O CH O CH O OsO 2 + CH O HO CH CH O Formação do diéster Em microscopía electrónica observa-se a deposição do ósmio nas micelas lipídicas no local dos grupos polares e não no local original de reacção ou seja. Na figura indica-se os dois locais possíveis da deposição do ósmio. e os únicos reagentes capazes de os fixar são o tetróxido de ósmio e o ácido crómico. CH + O O CH O OsO 2 CH O CH OsO 2 A outra porção livre na molécula pode reagir.47 2.2. Agentes oxidantes Os lípidos insaturados reduzem o OsO4 formando compostos negros. Fixação de lípidos A melhor maneira de os fixar é através da congelação. . no interior hidrofílico das micelas.6.2. mas ambos alteram a sua reactividade química.

Carnoy: . ácido acético (fixa bem o núcleo pois penetra bem) (6:3:1). . Mecanismo de fixação dos ácidos nucleicos Muitos fixadores têm sido usados para fixar ácidos nucleicos. O etanol e metanol são usados para fixar DNA e RNA e produzem-lhes pouca alteração apesar de os precipitarem. .é um fixador ácido bom para os cromossomas. . A presença de sais na reacção é essencial para obter a máxima precipitação.6. . mas relativamente poucos reagem com estas moléculas.é um bom penetrador.3.é constituído por: álcool absoluto.48 Grupos polares Ι Deposição intramicelar 45 Aº Ι P Deposição polar 45 Aº 2.extrai as histonas. Outro fixador utilizado é o Carnoy. clorofórmio (fixa bem o citoplasma).

a não ser que as peças sejam muito pequenas. . . Flemming: . é uma regra a ter em conta.6.é um fixador universal compatível com a maior parte dos corantes.fixador do sangue ou doutros esfregaços. .5g). trióxido de crómio (15g).4.é utilizado para fixar o núcleo. pois se o excedermos. Na altura de utilizar. Zenker: . . . . 2. núcleos e glicogénio. órgãos linfóides. Misturas de fixadores Nem todos os fixadores apresentam as mesmas capacidades. Bouin: . .a fixação pode durar de 24 h a 3 . . ácidos nucleicos e glicogénio. ácido acético cristalizável (1g) e água destilada (100ml).49 .é um bom fixador para estudos citológicos de glândulas.muito bom para estudos citológicos. Por vezes. . o ideal é fazer misturas de fixadores.em regra só ficam bem fixadas as partes superficiais.fixador universal.tempo de fixação: 10 min.é constituído por: formol a 40 %. solução aquosa saturada de ácido pícrico e ácido acético glacial (25:75:5). A presença de ácido acético atenua tal inconveniente.excelente fixador citológico mas de fraca penetração por causa do ácido ósmico.fixa proteínas e ácidos nucleicos.é necessário ter cuidado com o tempo de fixação.bom fixador para o tecido nervoso. acrescenta-se 5ml de ácido acético.é utilizado para fixar núcleos e tecido conjuntivo. . .utilizado para a fixação de lípidos.8 dias.passar logo por álcool absoluto e incluir. extrai o RNA e depois o DNA. Uns conservam bem as estruturas do núcleo outros. determinadas formações do citoplasma. . . Álcool-formol (9:1): . Álcool-éter em partes iguais .é constituído por: tetróxido de ósmio (4g). sublimado de cloreto de mercúrio (5g) e água destilada (95 ml).é constituído por: dicromato de potássio (2. .

que permite passar directamente do fixador para a parafina sem os intermédios ordinários. a dioxana.a composição química mantém-se. celoidina ou outra substância de inclusão são miscíveis em água. .6.5 cm e o tempo médio da desidratação é de 1 hora. as peças são imersas em azoto líquido (-160 a 190 º C) para serem dessecadas no vácuo a temperaturas da ordem dos 30 . Este processamento consiste em passar o material fixado por álcoois de concentrações crescentes desde 70° até ao absoluto. As vantagens são: . . o tecido mantém-se congelado a baixa temperatura (-20 a -60ºC) num reagente que dissolve os cristais de gelo (etanol ou acetona). O etanol é o mais usado por não ser tóxico e ser rápido na acção.Desidratação A desidratação consiste na remoção da água livre ou possível de extrair do tecido fixado por acção do álcool. cloreto de platina.5.não causa retracção dos tecidos. . espessura e do tipo de tecido.50 NOTA: os fixadores que permitem obter boas fixações da estrutura citoplasmática ou são muito caros (por conterem ácido ósmico. O tempo da permanência em cada um dos álcoois depende do volume.a fixação é homogénea.5. Congelação e dessecação Este método consiste numa rápida congelação dos tecidos.5.) ou requerem técnicas demoradas. etc. . deve-se ao facto de que nem a parafina.40º C. Nestas condições o gelo dos tecidos sublima ao estado gasoso e produz-se a desidratação. Mecanismo de fixação por meios físicos 2. seguida de desidratação no vácuo a baixas temperaturas. 2.6.a estrutura conserva-se com raras modificações produzidas pelos cristais de gelo. Existe uma substância. . As vantagens são semelhantes ao método anterior. . 3 . 2.não há extracção de moléculas solúveis. Inicialmente.a fixação é rápida.6.2.1. A espessura ideal de tecido deve ser de 0. A razão deste passo. Congelação e substituição Neste caso.

mas sim em xilol. mas não quebradiça. Quando a peça é introduzida no xilol fica com um aspecto mais claro e translúcido.A inclusão é fácil e rápida. A parafina e a celoidina são substâncias que penetram homogeneamente na célula na forma líquida e que depois de solidificarem a tornam rígida. . O xilol vai ocupar o espaço vazio anteriormente ocupado pela água. O tempo de infiltração depende do volume. O tempo de diafanização é de 30 min a 2h. mas dura aproximadamente 1 hora e 30 min. Faz-se na estufa.1.Obtenção de cortes suficientemente finos e seriados. A razão deste passo deve-se ao facto da parafina não ser solúvel em álcool.51 4 .Impregnação Substitui-se o xilol pela parafina ou celoidina. 6. ao mesmo tempo que o xilol vai evaporando a parafina ocupa os lugares deixados pelo xilol dando consistência ao meio celular depois de retirado da estufa. 5 .60°C. 6 . 6.1.Conservação dos blocos por período indefinido.Inclusão Este passo consiste na infiltração no tecido duma substância de suporte para que seja possível cortar o tecido em fatias finas de modo a observá-las ao microscópio. espessura e do tipo de tecido.1 .Diafanização Consiste na passagem dos blocos de tecido fixados e desidratados por uma substância diafanizadora. . .Parafina A parafina é sólida à temperatura ambiente e aquecida a 45 . É insolúvel na água e quase insolúvel no álcool e é solúvel no xilol. acetona e éter de petróleo. ∗ polimerização (plástico). substância que por sua vez se dissolve no álcool. torna-se líquida. Os blocos diafanizados devem ser imersos num banho de parafina e serem mudados pelo menos duas vezes para novos banhos para remover o xilol que está presente nos tecidos. ∗ evaporação do solvente (celoidina). A conversão pode ser feita por: ∗ cristalização por arrefecimento (parafina). Vantagens . As substâncias a ser usadas devem ser convertidas rapidamente do estado líquido ao sólido e quando líquidas devem penetrar nos interstícios do tecido. normalmente o xilol.

52 6.1.2. Desvantagens - Não se deve sobreaquecer a parafina porque torna difícil a obtenção de bons cortes; - O prolongado tratamento dos tecidos com esta substância de inclusão, endurece-os; - Só dá bons resultados com peças pequenas; - Endurece demasiado certos tecidos e órgãos (músculo, pele); - Retrai mais ou menos os tecidos. 6.1.3. Técnica de inclusão com parafina 1 - Funde-se a parafina; 2 - Bafeja-se os quadros de Leuckart para a parafina não aderir (Actualmente usam-se cassetes de plástico); 3 - Tira-se a peça do banho de impregnação e posiciona-se com pinças de inclusão, dentro do molde; 4 - Deita-se a parafina líquida, mas não a ferver; 5 - Deixa-se solidificar à temperatura ambiente ou arrefecendo com água. No final da inclusão obtemos um bloco de parafina dentro do qual está incluída a peça. 6.1.4. Artefactos introduzidos pela inclusão em parafina - Remoção de constituintes: ∗ lípidos; ∗ glicogénio. - Precipitação; - Pregas; - Estrias causadas pela faca do micrótomo. Micrótomo de Minot

Micrótomo de Minot • Colher pequenos fixar 24 h em 10% fragmentos de um orgão e de formol em tampão

53 fosfato com pH neutro. • Desidratar com álcool 70º 12 h e mudar para o álcool absoluto duas vezes, a primeira 2h e a segunda 3 h. • Fazer dois banhos de xilol, o primeiro 2 h e o segundo 90 min. • Fazer o 1º banho de parafina numa estufa à temperatura do seu ponto de fusão (60º) 16h. Pode ou não ser feito um 2º banho de parafina nas mesmas condições 5h. • Fazer as inclusões em parafina em moldes de latão (Leuckart) ou em cassetes. 7 - Corte Os blocos com as inclusões devem ser cortados em micrótomos, depois de talhados em pirâmides quadrangulares, segundo secções específicas, que podem ser transversais ou longitudinais. As secções podem ter 5-10 µm de espessura. em fatias finas e regulares para serem estudados por transparência. 7.1. Equipamento necessário - Micrótomo; - Banho maria a 45º C, para suportar os cortes; - Placa aquecida, para secar os corte; - Pinça; - Escova para limpar a face do micrótomo; - Lâminas; - Água albuminosa (meio de colagem); - Cubos de gelo. 7.2. Tipos de micrótomos Faca de Valentim: - dupla faca com 2 lâmininas, em que o afastamento das duas lâminas é graduado e dá-se por meio de um parafuso. Corta o órgão por 2 planos muito próximos, sendo a largura do corte dependente da distância entre as duas lâminas. Mícrotomo de Minot: - representado na figura, é caracterizado por ter a faca fixa, sendo o suporte com o bloco que se desloca verticalmente, é mais cómodo e o mais usado. Micrótomo de Corrediça: - o suporte da faca (trenó ou corrediça) move-se numa goteira horizontal ou plano inclinado e o suporte do bloco é elevado a cada corte. Micrótomos de congelação e criostatos: São aparelhos utilizados para fazer os cortes mantendo a congelação e têm a vantagem de fazer cortes de boa qualidade. As suas principais vantagens são: O corte de peças não

54 destrói substâncias que se pretendem observar e também se usam quando é necessário uma observação rápida (ex. exames extemporâneos operatórios). 7.3. Técnica do corte 1 - Resfriar o bloco e talhá-lo; 2 - Fixação do bloco no suporte do micrótomo; 3 - Orientação do bloco e da faca, regulação da espessura dos cortes; 4 - Execução dos cortes, que se recolhem à superfície da água a 45 º C: 5 - Colagem dos cortes (água albuminosa ou gelatina); 6 - secagem na estufa das lâminas ou lamelas com os cortes colados. Talha-se o bloco debastando-o pouco a pouco por todos os lados, tirando assim sucessivas camadas de parafina. O suporte do bloco é móvel segundo as 3 dimensões no espaço o que permite orientá-lo de modo que a face superficial do bloco fique num plano vertical nos micrótomos de Minot e horizontal nos de corrediça. Orientada a peça, fixa-se solidamente a sua posição, por meio de parafusos, a faca é também solidamente fixada ao suporte e este ao aparelho. Uma vez acertado o aparelho para a espessura que se deseja, começa-se a cortar a peça. A cada movimento sai um corte e o que se lhe segue vem colar-se-lhe pela aresta vizinha, constituindo-se assim fitas ou ténias de cortes. 8 – Colagem A colagem assegura um perfeito estendimento dos cortes, de modo a que não fiquem dobras ou rugas. Meio de colagem → água albuminosa diluída: ∗ clara de ovo (50 ml); ∗ glicerina (50 ml); ∗ salicilato de sódio. Mistura-se, filtra-se e coloca-se uma gota antes de pôr a secção do corte. 8.1. Técnica de colagem 1 - Coloca-se algumas gotas do meio numa lâmina; 2 - Coloca-se o corte em cima da lâmina; 3 - Com agulhas e com calor moderado estica-se o corte; 4 - Escorre-se o excesso de água não deixando sair o corte;

55 5 - Leva-se a secar na estufa a 45º C. A seguir resumem-se os passos para a observação do material biológico em cortes de inclusões em parafina.

PROTOCOLO GERAL PARA COLORAÇÂO DE HEMATOXILINA-EOSINA EM CORTES HISTOLÓGICOS INCLUIDOS EM PARAFINA

Células coradas com hematoxilina-eosina. As áreas escuras têm basofilia, núcleo (nucléolos e heterocromatina) e as mais claras (rosa) fundamentalmente citoplasma. 1. DESPARAFINAÇÃO Deitar xilol sobre o corte histológico durante 10 min. 2. HIDRATAÇÃO Cobrir a lâmina com alcoól 100º durante 3 min. Proceder da mesma forma com a série descendente de alcoois e finalmente com a água destilada durnte 1 min. 3. COLORAÇÃO Cobrir a lâmina com HEMATOXILINA – 10 min Lavar com H2O corrente (3 mudanças) Diferenciar com HCl 1% - 5 sec. Passar em H2O corrente (2 mudanças) Corar com eosina – 2 min. 4. DESIDRATAÇÃO

56 Cobrir a lâmina sucessivamente com uma série ascendente de alcóois até ao álcool absoluto. . used especially in histology and cytology. DIAFANIZAÇÃO E MONTAGEM Cobrir a lâmina com xilol e depositar uma gota de meio de montagem e cobrir o corte com uma lamela. COLORAÇÃO Cobrir a lâmina com 10 gotas de 2. This is one of the two "cornerstone" dyes for all H & E techniques.5% de carbonato de sódio e 1 gota de 1% AZUL DE TOLUIDINA durante 2 min. MONTAGEM Depositar uma gota de meio de montagem e cobrir o corte com uma lamela. the nuclei come out dark blue and the cytoplasm and nucleoli. When used in conjunction with eosin. o. the other being Eosin. em cada álcool. Rotular. red.3 Nuclear stain. 3 min. 5. DIAFANIZAÇÃO Cobrir a lâmina com xilol (2 mudanças). RESULTADOS e OBSERVAÇÃO Visualizar ao m. Rotular. 1 min. ´ Hematoxylin (Ehrlich's) C16H14O6 MW: 302. 7. 4. DESPARAFINAÇÃO E HIDRATAÇÃO Deitar xilol sobre o corte histológico durante 5 min e depois cobrir a lâmina com alcoól 100º durante 3 min e finalmente com água destilada durante 1 min. núcleos azuis e citoplasma rosa. 3. 6. 2. Mayer’s Hematoxylin PROTOCOLO GERAL PARA COLORAÇÂO COM AZUL TOLUIDINA EM CORTES HISTOLÓGICOS INCLUIDOS EM PARAFINA 1. em cada álcool. DESIDRATAÇÃO E DESIDRATAÇÃO Lavagem 3 vezes com água destilada e desidratação com uma série ascendente de alcóois até ao álcool absoluto.

tornando-os visíveis. Protocolo: Negro de Sudão/ Propileno glicol: Negro de Sudão 0. o azul de toluidina são azuis ortocromáticos. Estes são então corados de vários tons de cinzento-escuro. o. O citoplasma violeta é metacromático porque a polimerização de uma molécula de coloraçao com certas estruturas resulta num determinado comprimento de onda de emissão alterado. contudo podem estar agregadosmem dímeros ou polímeros. que absorvem a um baixo comprimento de onda e aparecem vermelho metacromático.57 5. Os sinais de metacromasia são a mudança do espectro de aborção de certos corantes básicos quando estão unidos a polímeros polianiónicos como nucleoproteína. azul muito escuro e preto. OBSERVAÇÃO Visualizar ao m. 7 gm Propileno glicol 100 ml . O Negro do Sudão é uma susbstância não polar que se dissolve nos lípidos. COLORAÇÕES CITOQUÍMICAS LÍPIDOS − Coloração Negro de Sudão Esta coloração é utilizada para corar todos os tipos de lípidos. Os corantes de tiazina tais como.

Lavar bem em água destilada 3. Agitar 7 min em Negro de Sudão 5. Arrefecer e filtrar novamente por um filtro de vidro de meio poroso com sucção 1. Monte uma lamela por cima do corte histológico com liquído de montagem aquoso PROTOCOLO GERAL PARA COLORAÇÂO DE SUDAN BLACK B EM CORTES HISTOLÓGICOS INCLUIDOS EM PARAFINA FUNDAMENTO: O Sudão Black B é um corante básico e combina-se com grupos acídicos em compostos lipidicos e também fosfolípidos. e agitar constantemente. 3 min em Nuclear fast red 8. TÉCNICA • • • • • Desparafinação e hidratação até alcoól a 70º do corte histológico Cubra a lâmina com o corante Sudan Black durante a noite à temperatura ambiente Lave e diferencie em alcoól a 70º o corte histológico até ver o fundo cinzento claro Lave com água da torneira Monte uma lamela por cima do corte histológico com liquído de montagem aquoso OBSERVAÇÃO DE LÍPIDOS EM CORTES HISTOLÓGICOS (SUDÃO III) Observação de lípidos em cortes efectuados em sementes. Aquecer até 100ºC durante poucos minutos. Montar em glicerina 10. Lave e diferencie em alcoól a 70º o corte histológico até ver o fundo cinzento claro 14. Lavar bem em água destilada 7. Colocar 3 min em 85% de propileno glicol 6. Desparafinação e hidratação até alcoól a 70º do corte histológico 12. Cubra a lâmina com o corante Sudan Black durante a noite à temperatura ambiente 13.58 Dossolver Negro de Sudão em Propileno glicol lentamente. Fixar cortes de congelação em 10% de formol 2. cada 5 min em l propileno glicol 4.Faça um corte muito fino na semente em estudo com o auxílio de um bisturi. Lavar bem em água corrente e destilada 9. 11. Passar duas vezes. A coloração dos lípidos é feita com Sudão III (corante específico) TÉCNICA 1. Lave com água da torneira 15. Visualizar ao m. o. Filtrar em papel de filtro Whatman ≠ 2. .

Lavar em água 7. Corar 15 min numa solução de azul-de-Nilo 1%. 5.Coloque um pouco de água destilada num vidro de relógio e com o auxílio de um pincel lave o corte.Em seguida coloque um pouco de Sudão III noutro vidro de relógio e deixe o corte corar mergulhado no corante durante 3 a 5 minutos. para retirar o excesso de corante. fazer a inclusão em parafina e cortar secções com espessura de 5µm.59 2. Montar Resultados: Os lípidos de natureza não ácida coram de rosa e os ácidos coram de azul assim como outros componentes cels bioquimicamente de natureza não lipídica . Lavar em água 5. Col Sudam III COLORAÇÃO DE AZUL-DE. 3. O verde-metilo é um corante catiónico que se liga de um modo específico ao . Fixar o material biológico em formol a 10%. COLORAÇÃO VERDE DE METILO – PIRONINA Fundamento: DNA + RNA Coloração Verde-Metilo Pironina O método do verde-metilo pironina utiliza a elevada taxa de carga negativa dos ácidos nucleicos. 4. Os cortes são desparafinados 3.Finda a coloração lave o corte. 2. 4.Observe entre lâmina e lamela. Diferenciar rapidamente em ácido acético a 1% 6. passando-o por água destilada contida num vidro de relógio.NILO PARA LÍPIDOS NÃO ÁCIDOS 1.

. ..Água destilada 2. Lavar com água destilada.Verde de metilo-pironina (20 minutos) 3..1M pH4. uma vez que este método de coloração está sujeito a artefactos....... Passar por xilol. Concentração da ribonuclease: 1 mg/ ml 1 para água destilada a 40 . Montar.... COLORAÇÃO DE DNA – REACÇÃO DE FEULGEN 1.. DESPARAFINAÇÃO Deitar xilol sobre o corte histológico durante 3 min.Bálsamo 9...Tampão acetato 0. DESIDRATAÇÃO E MONTAGEM Cobrir os cortes sucessivamente com a série ascendente de álcoois (70º.Butanol terciário (4 mudas) 7.. Técnica: 1. Passar os cortes por 3 tinas contendo água sulfurosa durante 2 min. A existência de lâminas de controlo é importante para a interpretação dos resultados. por extracção enzimática ou ácida. 4. 95º e 100º) durante 3 min.5 g) 6.. A execução e os resultados desta técnica dependem em grande parte da utilização de condições cuidadosamente controladas de pH da solução e da concentração dos dois corantes.Verde de metilo.0.Duas lâminas: 1 para a ribonuclease a 40 . um ou ambos os ácidos nucleicos devem ser removidos.. 2.60 DNA e portanto é adequado à coloração de núcleos.5 g 4. 3.. Nas lâminas de controlo.Purificar com clorofórmio e juntar Pironina Y (0.. tanto em células vivas como em material fixado. durante 4h seguida de verde de metilo-pironina. durante 4h seguida de verde de metilopironina..100 ml 5..... Lavar com água destilada..... COLORAÇÃO Colocar os cortes numa tina de coloração com o reagente de Schiff durante 1 h... HIDRÓLISE Colocar os cortes em ácido clorídrico normal à temperatura de 60º durante 10 min.4. A pironina é um corante vermelho cuja especificidade para o RNA não é tão elevada e portanto algumas proteínas podem de igual forma corar...Xilol (2 mudas de 10 minutos cada) 8.

Assim. Elementos que contenham DNA são corados de vermelho-púrpura. OBSERVAÇÃO E RESULTADOS Os núcleos celulares e o contorno nucleolar apresentam-se rosa resultante da presença de DNA.Montar com DXP. lavando bem o xilol 3 – Deixar secar ao ar 4 – Mergulhar 1 min o corte na sol. RESULTADO DA COLORAÇÃO: As proteínas ricas em triptofano coram de azul ( grânulos azuis ) Os núcleos coram de rosa vivo pela Safranina . O método de Feulgen é sem dúvida o mais largamente utilizado e o mais quantitativo de todos os métodos citoquímicos. 2 – Passar por etanol absoluto. Nesta técnica. 8 – Lavar o excesso de corante em H2O dest.61 5. da qual resultam aldeídos reactivos que sãoposteriormente demonstrados pelo reagente de Schiff. 6 – Lavar em H2O dest. A intensidade da coloração é proporcional à concentração de DNA da nossa amostra. em 100 ml de etanol absoluto e 50 ml de H2O dest. A ligação purina-ribose não é afectada pela hidrólise e consequentemente o RNA não é demonstrado por esta técnica .Deitar xilol sobre o corte histológico durante 10 min. É um procedimento específico de demonstração de desoxirribose. de Safranina de 1 gr. utiliza-se uma hidrólise ácida com HCl 1N a 60 °C para quebrar a ligação purina-desoxirribose. 7 – Contrastar os núcleos durante 1 min corando-os numa sol. De DMAB a 5% em HCl conc. é possível efectuar observações morfométricas e micro-fotométricas e determinar as quantidades de DNA no núcleo das células. COLORAÇÃO DE DIMETILAMINOBENZALDEÍDO/ NITRITO PARA PROTEÍNAS COM TRIPTOFANO 1 . 9 – Passar por 2 banhos de Etanol Absoluto 10 – Passar pro acetona (para fixar o corante nuclear e não desaparecer com o tempo) 11 – Clarificar em xilol 12. 5 – Oxidar o corte 1 min em nitrito de sódio a 1% em HCl conc.

Corar com a solução fast green a pH 2.7 0. MÉTODO DE VON KOSSA PARA A COLORAÇÃO DO CÁLCIO Fundamento: As secções de tecido são tratadas com solução de nitrato de prata.62 COLORAÇÃO DAS PROTEÍNAS TOTAIS POR FAST GREEN ÁCIDO SEGUNDO DEITCH Procedimento 1. passando a castanho com o correr do tempo o que evidencia a presença de peroxissomas. recém-preparado.1g 100ml EVIDENCIAÇÃO DE PEROXIDASES PELO MÉTODO DA BENZIDINA. 3. Desidratar em três banhos de butanol. recém-preparado. a frio. a 90ºC.7. Lavar os cortes durante 1 min. SEGUNDO PRENANT 1. montar e observar ao microscópio óptico. e a seguir várias vezes em água destilada. durante 15 min. durante 30 min. 2. 6. Resultados As proteínas totais coram de verde Solução Corante Fast green Ácido acético a 1% pH 2.5 com algumas gotas de ácido acético durante 3 min. . Secar. 3. o cálcio é reduzido pela luz forte e substituido com depósitos de prata visualizados como prata metálica.O local de actividade das peroxidades aparece em cor azul. Mergulhar os cortes em água oxigenada durante 3 min. Mergulhar as secções de tecido cortadas no criótomo numa solução saturada de benzidina acidificada a pH 4. Tratar os cortes com ácido tricloroacético a 5%. 2. em solução de ácido acético a 1%. 4. Diafanizar em xilol e montar com entellan. 5. Mergulhar as lâminas em ácido tricloroacético a 5%.

RESULTADO DA COLORAÇÃO: Os sais de cálcio ficam negros. Se fôr necessário deixar mais tempo até o cálcio ficar negro. 4 – 5 min com uma solução a 5% de tiosulfato de sódio.A. Lavar com água corrente. 5 – Lavar uma vez em H2O corrente e outra em H2O dest.red para o núcleo. os núcleos vermelhos e os citoplasmas rosa. EVIDENCIAÇÃO DE POLISSACÁRIDOS EM ESFREGAÇO DE SANGUE REACÇÃO DO ÁCIDO PERIÓDICO DE SCHIFF (P. Passar a lâmina por 3 tinas contendo água sulfurosa durante 2 minutos em cada.63 1 – Desparafinar e hidratar com H2O dest. diafanizar e montar uma lamela em meio de montagem. 3) COLORAÇÃO Colocar a lâmina numa tina de coloração com o reagente de Schiff durante 20 minutos. 2 – 1 h com uma solução de 5% de nitrato de prata em frente de uma lâmpada de 60-watt.S) TÉCNICA: 1) FIXAÇÃO Deitar alcool metílico sobre a lâmina durante 10 minutos 2) OXIDAÇÃO Colocar a lâmina numa tina de coloração com ácido periódico a 1% durante 15 minutos.Lavar em H2O corrente. na estufa a 37ºC. 8 – Desidratar. 3 – Lavar três vezes com H2O dest. . 6 – Contrastar 5 min fast. 7 .

Lavar em água destilada Secar. 7. para fins de diagnóstico. 3. 4. 4. Lavar muito bem em água destilada. 5. A coloração PAS é utilizada para a demonstração de membranas basais e mucosubstâncias secretadas pelo epitélio de vários órgãos. montar e observar. . 3.4. A técnica mais utilizada na histoquímica de hidratos de carbono é a reacção ácido periódico − Schiff que é positiva para estruturas contendo hexoses neutras e/ou ácidos siálicos. Lavar rapidamente em água destilada Incubar 1-2 dias em nitrato de prata a 1. Lavar em água corrente. 5. 6.5% Lavar em água destilada Incubar durante 12 h numa solução recém preparada de água destilada com 2% de hidroquinona. 2. Os cortes de congelação são incubados em água destilada a 37º durante 6h com 2% de β. Secar entre papel de filtro. PROTOCOLO GERAL PARA EVIDENCIAÇÃO DO COMPLEXO DE GOLGI. 4) COLORAÇÃO DE CONTRASTE Cobrir a lâmina com hematoxilina durante 5 minutos. que oxida a ligação carbonocarbono. É uma técnica usada. Tratar os cortes 2% de nitrato de cobalto. 0. COLORAÇÃO DA FOSFATASE ALCALINA – EVIDENCIAÇÃO DO COMPLEXO DE GOLGI (GOMORI) 1. os quais reagem com o reagente de Schiff. Lavar muito bem em água destilada. Fixar o material biológico 8.glicerofosfato de sódio.64 Lavar com água destilada. formando a cor magenta.15% de sulfato de sódio e 15 ml de formol.24 horas em água destilada com 1% de nitrato de uranilo e 15 ml de formol. 2. SEGUNDO RAMÓN E CAJAL 1. Mergulhar os cortes durante 2 min em 2% de sulfato de amónio. 2% de nitrato de cálcio e 1% de cloreto de magnésio a pH 9. Secar. por exemplo. em biópsias de fígado e rim. Observar ao microscópio. formando aldeídos. No método de PAS as secções são tratadas com ácido periódico.

que reagem com nitrato de chumbo. Pela acção da enzima ocorre a hidrólise do glicerofosfato. Numa segunda fase do método processa-se à imersão dos cortes numa solução de sulfato de amónio. arrefecida. Este método é muito utilizado para localizar lisossomas. formando fosfato de chumbo insolúvel. que são partículas do citoplasma ricas em fosfatase ácida.0. COLORAÇÃO DA FOSFATASE ÁCIDA – EVIDENCIAÇÃO DO LISOSSOMA Um dos métodos para demonstrar a actividade da fosfatase ácida é o método de Gomori. A solução é aquecida gentilmente. que se precipita no local onde há actividade enzimática. que consiste em incubar cortes de tecidos fixados em formol numa solução contendo glicerofosfato de sódio e nitrato de chumbo em tampão pH 5. filtrada e guardada no frigorífico. PROTOCOLO Soluções “stock”: A) Stock HCl-Pararosanilina • Pararosanilina 1g • Água destilada 20ml • HCl concentrado 5ml A Pararosanilina é dissolvida na água destilada e o HCl é adicionado. que transforma o precipitado incolor de fosfato de chumbo num precipitado negro e electrão-denso de sulfatode chumdo. Lavar bem em água destilada. B) Nitrito de sódio • • Nitrito de sódio 2g Água destilada 50ml .65 6. com liberação de ioes fosfato.

vermelho . C) Tampão acetato de sódio • • • Acetato de sódio (3H2O) 3.4 ml • Nitrito de sódio (40 mg/ml) (B) 0.7-5. com 2% de verde de metilo (A hematoxilina pode ser usada como alternativa) 4. Ajuste o PH a 4. Monte as secções em DPX Resultado Actividade da fosfatase ácida .4 ml e armazenada no congelador. Este fosfato é para guardar no congelador em aliquas de 0.4 ml • Adicione a Pararosanilina gota a gota ao nitrito de sódio descongelado até que a solução esteja descorada.88 g Àgua destilada 200 ml D) Fosfato de Naftol • • Fosfato de Naftol 58 mg Dimetil formamida 5 ml.5 ml Preparação da solução de incubação: • Pararosanilina .Lave 5 – Desidrate “clear”. Protocolo: 1 -Incubação dos cortes histológicoa 10 a 60 min a 37 ºC 2 -Lave bem em água destilada e “tap” água 3 -Coloração 15 a 30 seg.6 ml • Misture estas soluções e adicione a solução de nitrito de sódio/pararosanilina.88 g Barbitone de sódio 5.HCl (A) 0. • Fosfato de naftol (D) • Tampão acetato (2 ml) • Àgua destilada 6.66 A solução pode ser preparada na altura ou separada em alíquotas de 0.0 “titter” e use imediatamente.

Hidratar (álcool 100°→ 2 minutos. . .Lavar rapidamente em água.Lavar em álcool 100° (2x).Diferenciar em álcool ácido 5 segundos .Fixar o esfregaço com a solução de álcool/ácido acético durante 15 minutos. escorrer o excesso. -Deixar secar ao ar 1 hora. etc.Lavar em álcool 100° (2x).-Comparar os diferentes tipos de Papanicolaou O método de Papanicolaou é uma técnica de rotina largamente utilizada pelos patologistas clínicos para reconhecer células derivadas de tumores malignos.Clarear em xilol (3x). .67 COLORAÇÕES CITOLÓGICAS Coloração de Giemsa Acoloração de Giemsa apresenta-se como um método histomorfológico convencional que tem uma grande variedade de aplicações. . por exemplo). Esta coloração permite observar a forma e dimensão das células e fornece uma boa visualização da morfologia nuclear e da presença no citoplasma de grandes quantidades de ribonucleoproteínas ou de depósitos de queratina ou muco. inclusões virais. -Fixar 2 a 3 minutos com etanol a 95 °C. álcool 70°→ 2 minutos.Corar com Laranja G 10 segundos.bservar a preparação ao microscópio e registar as observações. -Corar 10 minutos com a solução de May-Grunwald e lavar com água destilada.Montar com DPX. . Material biológico: Esfregaço de sangue Procedimento: -Efectuar um esfregaço. deixar secar ao ar. .Observar ao microscópio e registar as observações. . .Efectuar um esfregaço da mucosa oral. . . Material biológico: Esfregaço da mucosa oral Procedimento: . Corar 10 minutos com a solução de Giemsa (1:6) e lavar com água destilada.Azular em água corrente . .Corar com hematoxilina 4 minutos. .Corar com hematoxilina-eosina 2 minutos. tecidos hematopoiéticos (sangue e medula óssea. . água → 2 minutos. álcool 50°→ 2 minutos. como a coloração de protozoários.Álcool 100° (2x).

Giemsa MICROMETRIA E CARIOMETRIA A micrometria consiste em fazer medições de preparações microscópicas com o microscópico óptico.Micrómetro objectivo: lâmina na qual está gravada uma escala milimétrica em centésimos de milímetro (parte inferior da Figura). Col.Micrómetro ocular: corresponde à escala utilizada para fazer medições microscópicas (parte superior da Figura). .68 . . Há 2 micrómetros: .

Cobrir a lâmina com a solução de lugol . A reacção positiva ou negativa é uma resposta à presença ou ausência de componentes polissacáridos específicos nas paredes celulares das bactérias. e coloca-se na platina do microscópico a preparação.Lavar cuidadosamente com água destilada . misturar. Coloração de Gram A coloração de Gram é um método no qual se baseia a distinção entre bactérias Gram positivas (+) e Gram negativas (-).Cobrir a lâmina com a solução de safranina .Cobrir a lâmina com a solução de violeta de cristal – deixar actuar l' .Diferenciar com solução diferenciadora . Fazer um esfregaço (figura 1) e deixar secar ao ar. Calcula-se o valor do coeficiente micrométrico. lavar com solução de lugol . Material biológico: Esfregaço da mucosa oral Procedimento: Utilizar um palito para "raspar" ao longo do sulco gengival (espaço entre a superfície do dente e as gengivas). 0 esfregaço tem de estar virado para cima! Deixar arrefecer e corar Coloração: .69 Para determinar as dimensões de um objecto microscópico. Colocar uma gota de tampão fosfato numa lâmina limpa e adicionar a amostra do líquido cravicular retirado da boca. Remove-se este último. ou seja o valor de cada divisão da escala do micrómetro ocular.deixar actuar l' .deixar actuar l' .Retirar o excesso de corante. calcula-se o nº de divisões do micrómetro ocular que correspondem a um determinado nº de divisões do objectivo. Determina-se o nº de divisões da escala do micrómetro ocular. Cariometria consiste na determinação da superfície nuclear. Atenção: Não sobreaquecer a lâmina. Fixar o esfregaço passando a lâmina rapidamente por uma chama 3 vezes.Lavar cuidadosamente com água destilada .

Lavar cuidadosamente com água destilada . 3. Imunofluorescência Directa e Indirecta.peroxidase. Colar os cortes semi. com auxílio de um agitador magnético.Imagem com contrastaçãonegativa de vírus .peroxidase em microscopia óptica e electrónica.70 . 2.Registar as observações. PREPARAÇÃO DO MATERIAL BIOLÓGICO PARA MICROSCOPIA ELECTRÓNICA INCLUÍDO EM EPON PARA COLORAÇÃO Remoção do Epon 1. Lavar muito bem em etanol absoluto e depois em água. Fig 1. Mergulhar a lâmina na solução até o Epon dissolver (cerca de 10 min ou mais). Corar com a técnica pretendida.Deixar secar .Observar ao microscópio com objectiva de imersão (100 x) . 5. Preparação da solução b) Dissolver pastilhas de hidróxido de sódio em etanol absoluto. Localizaçäo dos anticorpos anti . Nota: Bactérias Gram +: azul-violeta Bactérias Gram –: rosa a vermelho IMUNOCITOQUÍMICA 1. 4. 2.Observaçäo de diferentes cortes histológicos mostrando várias proteínas marcadas com anticorpos anti . O uso da ferritina em microscopia electrónica. c) Esperar dois ou três dias até a solução ficar castanha e filtrar. até à saturação.finos e deixar secar até ficarem bem colados. 3.

nomeadamente quando se destina a uma cultura celular. Emboraa taxa de divisão celular seja baixa nos linfócitos circulantes. os tecidos que se encontram espontaneamente em divisão como é o caso da medula óssea. Iremos pois. recorremos a eles unicamente em casos particulares. fazem. CULTURA CELULAR 1. vários agentes mitogénicos podem estimilá. Contudo. nomeadamente à medula óssea quando se trata de doentes leucémicos.se igualmente culturas celulares a partir de fibroblastos.71 Fig. Com efeito. 1. Podemos referir. a cultura de sangue periférico é o método mais frequentemente usado na detecção laboratorial de anomalias cromossómicas. abordar alguns passos destas técnicas.los a sofrer divisão. verificou-se ser o tecido sanguíneo aquele que mais facilmente proporciona o material necessário para uma cultura celular. para qualquer tipo de colheita.se aproximadamente 3 cc de sangue periférico com uma seringa heparinizada. até há relativamente pouco tempo. Quando necessário.1Escolha do tecido Para se observar cromossomas em mitose é necessário um tecido a partir do qual se obtenham com facilidade células em divisão. as quais são contudo. Como é evidente. em primeiro lugar. bastante mais complexas 1.2 Colheita Colhem. Entre os outros. levando à detecção de numerosas alterações cromossómicas numéricas e estruturais e tornando possível em muitos casos um diagnóstico laboratorial seguro que.Endocitose de vírus mediada por receptores TÉCNICAS DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES CROMOSSÓMICAS stas técnicas têm vindo a ser aperfeiçoadas ao longo dos tempos e são de enorme importância para a obtenção de um cariotipo. era difícil de fazer. é imprescindível que se trabalhe com assépsia. tecido testicular e tecidos neoplásicos.3 Cultura e meios de cultura . 1. 2.

As culturas são feitas em frascos de vidro esterilizados contendo todos os componentes indicados. Em casos particulares.075M que fica a actuar durante 4 min em banho-maria a 37º C. O agente mitogénico mais usado é a fitohemaglutinina (PHA).antibióticos (estreptomicina e penicilina) . A primeira centrifugação. Para cada caso são feitos habitualmente dois frascos que são mantidos numa estufa a 37ºC durante 72 horas. Este é posto cuidadosamente em suspensão para se fazer o choque hipotónico com aproximadamente 6 ml de KCl 0. Seguem-se 2 ou 3 lavagens com fixador (centrifugação. o RPMI 1640. Foi descoberto por Hsu em 1952 e constitui uma etapa decisiva pois provoca um aumento do volume celular que tem como efeito a rotura das membranas e consequente dispersão dos cromossomas.4Técnica Hora e meia a duas horas antes do termo da cultura. A partir desta altura não são necessários cuidados especiais de assépsia. o Ham F 10. 1. Podemos nomear entre outros. obtendo-se neste caso um menor número de mitoses. visto ser probre em ácido fólico. Do outro fazem-se as lâminas (de 6 a 8). Ao meio de cultura adiciona-se ainda: . o McCoy. igualmente. Em cada um deita-se aproximadamente 0.agente mitogénico. o Earle. Completa-se então a adição de 5 ml de fixador. de modo a obter-se um depósito o mais limpo possível.72 Há diversos meios de cultura. Este tempo pode prolongar-se sem inconvenientes por mais 24 horas e pode. O sobrenadante é rejeitado por aspiração com pipeta de Pasteur. extraída do feijão encarnado (Phaseolus vulgaris). assim como as seguintes. deixando-se sempre uma pequena quantidade acima do depósito. Este tratamento é um dos passos essenciais da técnica. podem utilizarse outras lecitinas mitogénicas como a concanavalina A e o pokeweed.São ricos em aminoácidos. o TC 199. para serem utilizados consoante o que se pretende observar com mais pormenor. como factor de crescimento . adiciona-se colchicina a cad frasco (6 gotas) a fim de se fazer parar as mitoses em metafase. Deitam-se então umas gotas de fixador (mistura de metanol e ácido acético glacial na proporção de 3:1) após o que se agita rapidamente para evitar a formação de grumos. faz-se durante 5 min a 1500 r/m. Este último é o meio de cultura adequado para salientar afragelidade do cromossoma X.3 cc de sangue. Este tem de ser preparado pouco antes de se usar e é mantido no congelador. alguns com característicasbastante diferenciadas. Na última lavagem deve-se conservar aproximadamente 4 a 5 mm de sobrenadante para se fazer as lâminas.soro de vitela fetal ou soro humano. ser reduzido de 24 horas. glúcidos e vitaminas. Os tubos são novamente centrifiugados para separação do meio hipotónico que será aspirado com a pipeta de Pasteur. e específica para o linfócito T. Termina aqui a primeira parte da técnica. rejeição do sobrenadante e adição de fixador) a fim de se eliminar os restos de hemoglobina e outros resíduos que estejam em suspensão. No fim do tratamento pela colchicina o conteúdo dos frascos é transferido para tubos de centrífuga. Um dos tubos fica geralmente de reserva e é guardado no congelador. . Os tubos ficam no congelador durante aproximadamente 30 min para fixação dos cromossomas.

tornou-se possível verificar se há falta ou excesso de material genético. após coloração específica e observação da fluorescência por eles emitida (bandas Q).tratamento hipotónico. Para fazer as lâminas põe-se o depósito em suspensão com a pipeta e deita-se a cada uma 3 gotas. por ex) à experiência adquirida por cada técnico. As técnicas principais designam-se por uma letra relacionada com o método utilizado ou com a região do cromossoma que põem em evidência. seguido de coloração por Giemsa (bandas R e bandas C).acção inibidora do fuso acromático pela colchicina. b) tratamento térmico dos cromossomas em meio salino. o que se tornava praticamente impossível se se tratava de pequenas diferenças. a uma altura aproximada de 4 cm.V. c) digestão enzimática dos cromossomas seguida de coloração por Giemsa (bandas G). Antes de terem sido descobertas as técnicas de obtenção de bandas. Este continua a ser o corante mais utilizado pois permite a observação das bandas induzidas pela maior parte dos diversos métodos. etiquetam-se e guardam-se numa caixa à temperatura ambiente durante aproximadamente 1 semana para se proceder à técnica das bandas G. . cromossomas em metafase: . na medida erm que cada cromossoma apresenta um conjunto típico de bandas. . São zonas do cromossoma que. BANDAS 2. as lâminas eram simplesmente coradas. com relativa facilidade. . pelo que se torna fácil distingui-las.1 Aspectos gerais Dá-se a designação de bandas a estruturas postas em evidência nos cromossomas mitóticos ou meióticos.73 As lâminas de que nos servimos têm que ser cuidadosamente lavadas. pois são o único meio que permite distinguir inequivocamente os cromossomas com maiores semelhanças. de forma a que quando vão ser utilizadas possam ficar completamente cobertas por uma fina camada de água. Há vários métodos de obtenção de bandas. se paresentam com diferentes intensidades. após coloração. na maior parte das vezes por Giemsa a 4%. Deixam-se secar ao ar.acção mitogénica da fitohemaglutinina no linfócito T. através de um conjunto de processos.. As técnicas de obtenção dos diversos tipos de bandas revelaram-se de primordial importância. Os pormenores da técnica variam de laboratório para laboratório e as causas desta variação vão desde as características climéticas do país (como temperatura e humidade) e das condições ambientais criadas dentro do laboratório (existência ou não de ar condicionado. alternadamente claras e escuras. Os mais comuns baseiam-se em: a) irradiação dos cromossomas com U. Antes de passar à técnica das bandas é importante recordar as 3 etapas fundamentais cuja descoberta permite obter hoje. Além disso. 2.

Introduz-se a lâmina na tina controlando-se o tempo com um cronómetro. mas há também um método térmico para as conseguir. As condições atmosféricas. Há também 2 tipos principais de bandas para a heterocromatina: a) bandas C (centrómero) b) bandas NOR (região dos organizadores nucleolares) 2. e a idade das lâminas têm grande influência. para lâminas com a mesma idade. isto é. b) Bandas R (reverse) Coram o restante da eucromatina. A eucromatina é pois. findos os quais se passa a lâmina por água corrente. quando a atmosfera está mais seca a tripsina precisa de mais tempo para actuar. tanto mais que se verificam ainda variações de caso para caso.2 Técnica das bandas G Esta é a técnica de rotina utilizada neste laboratório. a concentração é de 250 mg de tripsina em pó em 100 ml de tampão fosfato de pH= 7. Todos os métodos de bandas são de difícil realização porque não há necessidade de obter de antemão o tempo exacto durante o qual se deve fazer actuar os seus agentes indutores. Dest modo. Para lâminas com uma semana. é por tentativas que se obtém tempo de actuação necessário. faz-se actuar a tripsina de 10 seg a 1 min. (1971) e a Seabright (1971). lava-se 2 vezes em soro fisiológico e cora-se numa solução de Giemsa a 4% durante 10 min. o memso acontecendo para lâminas mais velhas. particularmente a humidade.74 É este último o método utilizado neste laboratório para obter bandas G. coloca-se uma tina de lâminas de forma alta com 90 ml de uma solução de tripsina em soro fisiológico na proporção aproximada de 1:2. havendo outros que preferem fazer habitualmente bandas R. têm uma topografia coincidente e coram aproximadamente 50 % da eucromatina. Deixa-se secar e monta-se uma lamela por cima. . neste caso a tripsina. o que significa que têm uma localização inversa das anteriores.0. isto é. Pelo método proteolítico (enzimático) esta técnica deve-se a Dutrillaux e col. Seguidamente. Há dois tipos principais de bandas para a eucromatina: a) Bandas Q (quinacrina) e bandas G (Giemsa) Têm a mesma localização. evidenciada pela alternância das bandas Q ou G e R. apresentam-se claras quando as anteriores são escuras e viceversa. Em banho-maria a 37º C. Assim.

b) Bandas Q Deve-se a Caspersson e col. É o caso.75 2. (1970). apresentam um padrão inverso do das bandas G e só se utilizam neste laboratório em casos particulares. (1975) e por um método de precipitação do nitrato de prata devido a Bloom e Goodpasture (1976). (1971). É um método por tratamento térmico. visto que com este método as extremidades dos cromossomas se apresentam bem coradas. da inversão pericêntrica do cromossoma 9. Os cromossomas apresentam-se uniformemente pálidos e só as referidas regiões coram fortemente. Certas regiões heterocromáticas brilham intensamente. pelo menos parcialmente. se houver inversão pericêntrica ela passa. c) BANDAS C Devem-se fundamentalmente a Arrighi e Hsu (1971) e Yunnis e col. A coloração é feita com uma solução de mostarda de quilacrina e a observação é feita num microscópio de fluorescência. Tudo deste cromossoma tem particular interesse este tipo de bandas. é possível observar os polimorfismos resultantes da variação da heterocromatina. A coloração faz-se com Giemsa a 4% e as metafases apresentam-se bastante pálidas. nomeadamente se existe qualquer dúvida referente a uma zona terminal clara. O padrão das bandas é igual ao das bandas G e apresentam-se alternadamente escuras e brilhantes. 3.OBSERVAÇÃO AO MICROSCÓPIO E FOTOGRAFIA A observação das lâminas faz-se em fundo claro. visto a heterocromatina se situar na parte proximal do braço longo do cromossoma. na parte distal do braço longo do cromossoma Y e nos braços curtos dos cromossomas acrocêntricos. pelo que com este tipo de bandas se visualiza com facilidade uma alteração muitas vezes difícil de diagnosticar apenas com bandas G. para o braço curto. Deste modo. sobretudo a região distal do braço longo do cromossoma Y. relativamente frequente. por vezes. desnaturação a 87º C e deve-se fundamentalmente a Dutrillaux e Lejeune (1971). d) BANDAS NOR Podem ser postas em evidência por um método de desnaturação (bandas N) devido a Funaki e col.3 Outros tipos de bandas a) Bandas R Como já se disse. A fluorescência do seu braço é. na parte proximal dos braços longos dos cromossomas 1. Neste último. assim como certo tipo de anomalias. Com efeito. de tal modo intensa que ele pode ser reconhecido mesmo em núcleos interfásicos. Coram especificamente a heterocromatina constitucional que está localizada nas regiões centrométricas. 9 e 16. As metáfases são procuradas com a objectiva de ampliação 10x e analisadas e fotografadas com a objectiva de imersão de . os grãos de prata concentram-se nos braços curtos dos cromossomas acrocêntricos.

Chicago (1966). O essencial das regras adoptadas foi agrupado num volume (ISCN. As alterações que podem surgir são muito variadas e. Num deles adiciona-se de imediato a colchicina que fica a actuar durante meia hora. A determinação do tempo de actuação da tripsina é extremamente demorada e penosa e as bandas raramente ficam nítidas. Assim. Faz-se a análise directa de 10 a 20 metafases. Na fotografia. variando apenas o tempo do choque hipotónico que aumenta para 6 minutos. o outro frasco fica a incubar 24 horas após o que se procede da mesma forma. faz-se um exame directo e um outro após 24 horas de incubação na estufa a 37° C. no sangue periférico cultivado sem agente mitogénico. nalguns casos. em regra.1 ml de medula. contudo. A aneuploidia (desvio do número normal de cromossomas) é bastante frequente. as maiores dificuldades. essencialmente. 1978) e é utilizado na generalidade dos laboratórios. no que se refere à medula. As oculares são de 12. fotografam-se geralmente 4. além do reduzido número de metafases.5x o que equivale a dizer que observamos com uma ampliação de 1250x. Como é lógico. ser superior a 100. a arrumação dos cromossomas não apresenta qualquer dificuldade. Os principais critérios para essa ordenação são o tamanho relativo e a posição do centrómero. É o posterior exame ao microscópio que apresenta. Observam-se também com frequência cromossomas anómalos que possuem uma morfologia diferente da dos cromossomas . É feito na medula óssea e . à sua má qualidade. em caso de aplasia medular. Actualmente. podendo. É precisamente ao resultado da ordenação dos pares de cromossomas que se chama cariotipo. Dentre as melhores metáfases observadas. Com efeito. apresentando pequenas variações relacionadas com o tipo de tecido (medula óssea) e com o número de leucócitos. a quantidade de sangue a cultivar deverá ser inferior à que se utiliza nos casos em que o número de leucócitos é normal. ESTUDO DAS LEUCEMIAS Este estudo é particularmente difícil devido não só ao reduzido número de metáfases que habitualmente se consegue obter como. Em cada frasco com meio de cultura e soro deita-se 0. verificando-se muitas trissomias. os cromossomas apresentam-se com uma mapliação de aproximadamente 2800x. os cromossomas apresentam-se. muito pequenos e juntos. A técnica é em tudo semelhante à já descrita.76 ampliação 100x. não constantes. No caso do sangue periférico faz-se uma cultura de apenas 24 horas quando o número de leucócitos é superior a 100000 e de 48 horas se esse número oscila entre 50000 e 100000. Como se disse. Quando se encontra alguma alteração o número de metáfases analisadas aumenta. visto ela estar espontaneamente em divisão activa. uma vez que a descoberta das bandas veio permitir a sua rigorosa identificação. O resto da técnica é praticamente igual. mesmo tratando-se de um mosaico (existência num indivíduo de mais do que uma linha celular) há a garantia de não passar despercebida qualquer anomalia. consoante os casos. A partir das fotografias ampliadas recortam-se então os cromossomas que são arrumados segundo critérios bem determinados estabelecidos em diversas reuniões internacionais: Denver (1961). e contam-se os cromossomas de mais 30 ou 40. Desta forma. Paris (1971) e Estocolmo(1977). grande parte das vezes.

Como por exemplo temos o chamado cromossoma de Filadélfia (Ph 1) que constitui das alterações mais frequentes e também mais procuradas devido ao seu importante valor diagnóstico na leucemia mieloide crónica. Encontram-se Nas células epidérmicas das pétalas de algumas flores. As clorofilas a e b são os pigmentos predominantes nestes plastos. central ou excêntrica. Existem sobretudo em caules subterrâneos. Visualmente. de uma translocação entre este cromossoma e o 9 (por vezes o 8). a amilose e a amilopectina. Os leucoplastos são plastos incolores. Os cloroplastos existem nas células fotossintéticas. através da consulta da Farmacopeia Portuguesa. .77 normais e a que se chama cromossomas marcadores. ORGANITOS CELULARES VEGETAIS. as quais são denominadas estrias ou camadas. Determinadas inclusões celulares. no pericarpo de certos frutos e em raízes. Basicamente é constituído por uma mistura de dois polissacáridos. Sua utilização como auxiliar na identificação de fármacos de origem vegetal. A observação microscópica de um grão de amido pode revelar a presença de um ponto ou ranhura simples ou cruzada. em função da sua importância na identificação de fármacos de origem vegetal. xantofilas ou licopenos. é o que se verifica com o amido. cromoplastos. merecem um estudo detalhado. não possuem pigmentos. conferindo-lhes uma cor laranja. formações estas denominadas hilo. Circundando o hilo pode-se observar ou não uma sucessão de zonas claras e zonas escuras. leucoplastos e amiloplastos. acumulando-o em grãos de vários tamanhos. bolbos e tubérculos. Os plastos são organitos celulares com uma estrutura e função específica. Trata-se. Identificação e caracterização de grãos de amido. amarela ou vermelha. Os cromoplastos são plastos pigmentados. respectivamente. raízes tuberculosas e sementes. apresenta-se como uma delecção do cromossoma 22. O amido é um polímero de condensação da glicose formada nas plantas durante a fotossíntese. Os amiloplastos são organitos celulares especializados no armazenamento de amido. ricos em carotenos. Existem em epidermes de órgãos expostos à luz e em algumas raízes. APLICAÇÕES AO ESTUDO DE FÁRMACOS DE ORIGEM VEGETAL O SISTEMA PLASTIDIAL Observação de diferentes tipos de plastos em microscopia óptica: cloroplastos. conferindo-lhes uma cor verde. porém.

. originando compostos de inclusão nos quais a cor varia do azul ao arroxeado.O. CROMOPLASTOS E AMILOPLASTOS. a estrutura. Registe eventuais alterações.C. Registe a forma das células e tenha especial atenção ao tipo de plastos nelas existentes. Pelo método de irrigação coloque lugol na preparação anterior. .) 3 – lâminas e lamelas 4 – bisturi 5 – pinça 6 – pincel Reagentes: 1 – água destilada 2 – solução de lugol Métodos: 1. Faça uma preparação e observe ao M. Destaque um dos seus filídeos. Zea mays e Triticum aestivum Material de apoio: 1 – lupa 2 – microscópio óptico composto (M. Consultar a Farmacopeia Portuguesa para as descrições dos amidos observados na aula. LEUCOPLASTOS. O iodo forma um complexo com a amilose. 2.. Destaque um fragmento da epiderme da página inferior da folha de um Pteridófito. TIPOS DE PLASTOS: CLOROPLASTOS. bem como a centricidade ou não das camadas. São características importantes na identificação de amidos: a forma. da acordo com o tamanho da cadeia polissacarídica. quando tratados pelo lugol diluído. Os grãos de amido adquirem cor azul-arroxeada característica. Faça o esquema com a respectiva legenda. monte em água destilada e observe ao M.O.O.1.78 A posição e a forma do hilo são importantes na identificação do grão de amido.C. o tipo de hilo e o estado de agregação. GRÃOS DE AMIDO E A SUA IMPORTÂNCIA NA IDENTIFICAÇÃO DE FÁRMACOS Material vegetal: 1 – filídeo de briófito 2 – folha de pteridófito 3 – raíz de Daucus carota 4 – baga de Lycopersicum esculentum 5 – tubérculo de Solanum tuberosum 6 – cariopses e/ou farinha de Oryza sativa. Observe à lupa os exemplares de um Briófito. 1.C.

Monte em água destilada e observe ao M. Monte em água destilada e observe ao M.O.bisturi e pinça 4 . dimensões relativas. no tubérculo de Solanum tuberosum L. o mais fino possível.o. 6. (T. retire um fragmento de mesocarpo (polpa) e esmague--o levemente. Monte em água destilada entre lâmina e lamela e observe ao m.1 .C. Faça o esquema com a respectiva legenda. 1.. Repita o teste do lugol para esta preparação. Zea mays L. e Triticum aestivum L. pétalas e pericarpos de frutos de várias espécies Material de apoio: 1 ..microscópio óptico (m. proveniente de cariopses de Oryza sativa L..C. 5. 6.1. Pelo método de irrigação coloque lugol na preparação anterior.O..4 .3 . o mais fino possível. 1.) 2 .pincel Reagentes: 1 .folhas. 5. entre lâmina e lamela. De uma baga de Lycopersicum esculentum Mill. Faça a preparação do material em água destilada e observe ao M..Faça o esquema com a respectiva legenda. Registe o tipo de plastos que observa neste orgão.1.água destilada 2 .reagente a designar A . Anote os tipos de grãos de amido observados para cada material e refira a sua forma. Faça o esquema com a respectiva legenda.5 . na raiz de Daucus carota L. localização do hilo e faça os respectivos esquemas.amónia 3 .Destaque a epiderme inferior do material vegetal ao seu dispor.. 4. Tem ao seu dispor material em pó.O.O.Observação de vacúolos corados naturalmente 1.CONTEÚDO VACUOLAR DISSOLVIDO 1. VACÚOLOS. O CONTEÚDO VACUOLAR E A SUA IMPORTÂNCIA NA IDENTIFICAÇÃO DE FÁRMACOS DE ORIGEM VEGETAL Material vegetal: 1 . o.). Alguns amidos utilizados na Farmacopeia Portuguesa distinguem-se pelos seus caracteres particulares. Obsrve ao M.Caracterize o tipo de vacúolos encontrado.79 2. .C. 1. assim como o tipo de substância neles armazenada e a forma de armazenamento.1. e faça o registo do tipo de plastos que encontra neste orgão.lâminas e lamelas 3 .Pelo método de irrigação introduza amónia como novo meio de montagem. 3.2 . Registe eventuais alterações e o tipo de plastos observados. Registe eventuais alterações..Registe eventuais alterações. vulgare Vill.C. bem como a substância e a forma sob a qual aí se encontra armazenada. Faça um corte longitudinal. Faça o esquema com a respectiva legenda. Faça um corte transversal. 1.

registe eventuais alterações interpretando o que observa tendo em atenção o tipo de vacúolos observados e a natureza do seu conteúdo. 2. pertencentes às classes Monocotiledoneopsida e Eudicotiledoneopsida. Observe ao m.2 . atendendo ao tipo de conteúdo vacuolar encontrado. 2 – Recorrendo a um quadro ou a um esquema proceda à distinção entre os diferentes orgãos e estruturas dentro de cada classe.Monte o outro pedaço de epiderme entre lâmina e lamela tendo como meio de montagem água destilada. IMPORTÂNCIA NA IDENTIFICAÇÃO DE FÁRMACOS DE ORIGEM VEGETAL MATERIAL: Tem ao seu dispor preparações definitivas de cortes transversais de raízes. 3 – De que modo é que a identificação dos diferentes tecidos e orgãos pode ser útil na identificação de fármacos.. fazendo ainda a interpretação do que observa.CONTEÚDO VACUOLAR NÃO DISSOLVIDO 3. no material vegetal ao seu dispor.Monte agora o primeiro pedaço de epiderme. tendo como meio de montagem a mesma solução onde permaneceu anteriomente. faça os respectivos esquemas com legenda. caules e folhas de alguns exemplares de Anthophyta. Observe ao m.1 . Monte em água destilada entre lâmina e lamela e observe ao m. Coloqueo em contacto com o reagente disponível. o. Faça o esquema com a respectiva legenda e registe a sua observação. faça o esquema com a respectiva legenda.Faça um corte transversal. 1 – Através da sua observação ao m.3 . .Proceda ao esmagamento de um pedaço de folha do material vegetal ao seu dispor.Observação de vacúolos com inclusões 3.80 2. o. o. o.1 .CONCLUSÕES Atendendo às várias observações feitas tire uma conclusão geral quanto à natureza do conteúdo vacuolar e a sua importância na identificação de fármacos. C . 2.Destaque um pedaço de epiderme inferior do material vegetal ao seu dispor. o. o mais fino possível. Faça o esquema com a respectiva legenda e registe a sua observação.Observação de vacúolos não corados naturalmente 2. 4 . B .. Monte em água destilada entre lâmina e lamela e observe ao m. HISTOLOGIA – ANATOMIA VEGETAL.

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