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Prtica 2- PCR e Anlise de DNA por eletroforese em gel de agarose Grupo 3- 06/10/11

C O N C L U S O A a u l a f o i s a t i s f a t r i a , p o i s c o n s e g u i m o s r e a l i z a r

Prtica 2- PCR e Anlise de DNA por eletroforese em gel de agarose Grupo 3- 06/10/11

Introduo
PCR uma tcnica, descrita em meados da dcada de 80, por Mullis e colaboradores (Mullis & Faloona, 1987), que permite obter in vitro vrias cpias de um determinado segmento de DNA. Devido sua especificidade e sensibilidade, a PCR um mtodo importante para o diagnstico de fungos. Existem vrios exemplos de testes baseados em PCR desenvolvidos para a deteco de fungos em plantas, alimentos e em patologia mdica. A PCR pode ser utilizada para detectar grupos de linhagens, patgenos, espcies ou taxa superiores. Para a deteco de um dado fungo em qualquer tipo de amostra necessrio se ter primers que propiciem a amplificao de um gene ou segmento especfico daquela espcie ou daquela funo que se deseja identificar. O fato de que algumas impurezas presentes na amostra de DNA podem, eventualmente, inibir a ao da DNA polimerase, exige-se cautela com resultados falso negativos. Em funo disso, aconselhvel o uso de um par de primers, que atue como controle da qualidade da reao. Ou seja, o uso e duas reaes, uma contendo o DNA da amostra e todos os reagentes para PCR , e outra reao, controle negativo, contendo todos os reagentes para reao de PCR menos o DNA da amostra. A obteno de segmentos amplificados normalmente obedece s seguintes etapas: a) extrao de DNA molde, isto , que contm a regio a ser amplificada, b) escolha do segmento a ser amplificado e obteno de primers especficos para o reconhecimento desse segmento, c) amplificao que dar origem a vrias cpias, fazendo-se uso de um termociclador, aparelho capaz de controlar e alternar a temperatura durante o perodos programados de tempo para o nmero apropriado de ciclos de PCR , geralmente entre 30 e 40 ciclos. Os ciclos da Reao em cadeia da polimerase decorrem em trs estgios que se repetem um nmero especfico de vezes: 1. Desnaturao das fitas de DNA ocorre a 94C durante 5 minutos desnaturao da fita dupla de DNA.

Prtica 2- PCR e Anlise de DNA por eletroforese em gel de agarose Grupo 3- 06/10/11 2. Hibridizao ou Annealing hibridizao dos primers com a cadeia de DNA previamente desnaturada em sequncias especficas e complementares. A escolha criteriosa dessa temperatura permite que os primers se liguem sequencia alvo com maior especificidade. 94 C- 30seg Desnaturao 50C - 30seg Anelamento 72C 1 min Extenso 3. Extenso Final amplificao do DNA (formao do amplicon) E , por fim,d) a anlise do produto de reao. Esta pode ser feita atravs de eletroforese em gel de poliacrilamida posteriormente corado pela prata ou em gel de agarose, corado por brometo de etdio. Em qualquer uma delas, o material amplificado visualizado como uma banda, a ser analisada de acordo com o seu peso molecular. A eletroforese consiste na separao de molculas ionizadas, de acordo com suas cargas eltricas e pesos moleculares em campo eltrico. Molculas orgnicas como RNA, DNA e protenas so separadas pela migrao destas em um gel durante a aplicao de um potencial eltrico. O princpio da eletroforese utilizada para separao de DNA, por exemplo, baseia-se na carga total negativa do DNA (conferida pelos grupamentos fosfatos). Sendo assim, as molculas de DNA tendem a migrar em direo ao plo positivo (ctodo). Nessa tcnica utilizada uma cuba com dois compartimentos, eletrodos, soluo salina para conduo de eletricidade. Entre os compartimentos da cuba encaixado o gel que deve ficar submerso. Pequenos poos so feitos no gel durante sua preparao com pentes. As amostras so pipetadas nesses poos. Essas amostras devem ser previamente misturadas a um corante, chamado gel loading buffer. Esse corante uma soluo composta de azul de bromofenol (e/ou xileno cianol) e glicerol e utilizado para aumentar a densidade das amostras, impedindo que elas saiam dos poos, alm de dar a colorao que serve como indicador do progresso eletrofortico. Para a migrao, aplicase voltagem e corrente eltrica ao sistema. A distncia que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicao, comparada com a distncia que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo

Prtica 2- PCR e Anlise de DNA por eletroforese em gel de agarose Grupo 3- 06/10/11 gel. Esses fragmentos so os ladders (marcadores de peso molecular), misturas de segmentos de DNA de tamanhos variveis e equidistantes entre si, e que so aplicados em um poo no gel no incio do processo. A eletroforese pode ser conduzida em soluo com gradiente de densidade ou em diferentes meios suporte, tais como papel de filtro, slica gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida, entre outros. O suporte deve ser qumica e fisicamente inerte, de modo a no interferir na mobilidade das molculas. No caso de eletroforese em gis, existem dois modelos bsicos: baseada em gis de agarose ou em gis de poliacrilamida. As duas substncias formam tramas de poros de tamanhos variveis, possibilitando a separao dos fragmentos, que ter sua eficincia dependente da concentrao do polmero e da intensidade da voltagem e amperagem aplicada. Em qualquer um dos casos, estas substncias so dissolvidas numa soluo tampo eletroltica, obrigatoriamente a mesma que recobrir o gel na cuba de eletroforese e possibilitar a passagem de corrente eltrica (Tampo de Corrida). Para eletroforese de DNA, normalmente utiliza-se o TBE (Tris-Borato EDTA) e o TAE (Tris-Acetato EDTA). Os gis de agarose so, geralmente, corados com solues de brometo de etdio (EtBr), uma substncia intercalante que revela os cidos nucleicos ao fluorescer sob luz ultravioleta. Concentraes de at 1ng de DNA podem ser visualizadas por exame direto do gel na luz ultravioleta.

Objetivo
Amplifcar um fragmento de DNA correspondente ao gene da lipase de Rhizopus sp., utilizando o DNA genmico como molde. Aps separar os fragmentos de DNA de acordo com seu tamanho e visualizar amplicons gerados pela PCR por eletroforese em gel de agarose.

Metodologia
Para a PCR preparou-se duas reaes, uma contendo o DNA genmico de

Prtica 2- PCR e Anlise de DNA por eletroforese em gel de agarose Grupo 3- 06/10/11 Rhizopus sp. e a outra como controle negativo (com os mesmos reagentes da primeira reao mas sem o DNA genmico de Rhizopus sp.). Em um eppendorf para primeira reao colocou-se os seguintes reagentes na respectiva ordem: 12,4 L de gua destilada 2,0 L de tampo da Taq DNA-polimerase (10x) 0,6 L de MgCl2 (50mM) 1,0 L de dNTP's (10mM) 1,0 L de primer LipDir ( iniciador 5'- 300 ng/L) 1,0 L de primer LipRev (iniciador 3'- 300 ng/L) 1,0 L de DNA genmico de Rhizopus sp. (~50ng/L) Taq DNA-polimerase (5 U/L) Para a segunda reao (controle negativo) em um eppendorf foram colocados os mesmos reagentes, com as mesmas quantidades, porm no lugar do DNA genmico de Rhizopus sp. colocou-se gua. Sendo assim a quantidade de gua no controle negativo foi de 13,4 L ( 12,4 L+ 1,0 L). Aps colocou-se as reaes em um termociclador, para a reao de PCR.

Preparou-se uma amostra com o produto da reao de PCR, juntamente com 0,5 L de tampo de amostra, para posterior visualizao do resultado da PCR em eletroforese em gel de agarose. O tampo de amostra foi preparado com glicerol e brometo de etdeo 1mg/ml. Para a eletroforese, utilizou-se para o tempo de corrida aproximadamente 1L de TBE 1X. Para preparao do gel de agarose 0,8% , adicionou-se em um erlenmeyer 1,6 g de agarose , 200mL de gua destilada e 0000 de soluo de TBE. A soluo do erlenmeyer foi aquecida no forno micro-ondas at completa solubilizao. O frasco deve ser agitado a cada 1 minuto durante o aquecimento para evitar o transbordamento. Aps a solubilizao, a soluo de agarose foi resfriada por alguns minutos e adicionou-se 20 L de uma soluo de brometo de etdeo 1mg / ml. Depois agitou-se a soluo e verteu-se a soluo sobre uma placa molde de gel com pente j montado.

Prtica 2- PCR e Anlise de DNA por eletroforese em gel de agarose Grupo 3- 06/10/11 Aguardou-se a gelificao a tempera ambiente por 30 minutos. O gel preparado foi removido da placa e envolvido em um filme plstico para posterior utilizao. Colocou-se o gel de agarose na cuba de eletroforese, submergindo-o no tampo de corrida. Aplicou-se as amostras preparadas anteriormente no gel com o auxilio de uma micropipeta, sendo que na primeira caneleta aplicou-se o marcador de peso molecar ( DNA clivado com ECORI e Hind III) submetendo-as eletroforese a uma voltagem de 100V por aproximadamente 30 minutos. Aps os 30 minutos visualizou-se as amostras de DNA resolvidas eletroforeticamente colocando o gel sobre transluminador com iluminao ultravioleta.

Resultados e Discusso
A Reao em Cadeia da Polimerase dividida em 3 estgios: desnaturao,annealing ou hibridizao e extenso. - Desnaturao: A temperatura elevada (geralmente >90C) separa a cadeia dupla de DNA em dois filamentos, sendo este processo conhecido como desnaturao. Os dois filamentos ou cadeias de DNA so mantidos juntos por ligaes de hidrognio que, por serem relativamente fracas, quebram-se a altas temperaturas, ao passo que as ligaes entre as molculas de fosfato e desoxirribose, por serem ligaes covalentes mais fortes, permanecem intactas. -Annealing ou hibridizao: Os primers marcam as extremidades da sequncia alvo: estes iniciadores so curtas sequncias sintticas de nucleotdios, entre 20 e 30 bases.Numa reao de PCR so includos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida durante o passo de desnaturao. O incio da sequncia de DNA alvo marcada pelos primers que se hibridizam com a sequncia complementar. Temperatura de annealing ou hibridizao: normalmente encontra-se entre 40 C e 65 C, dependendo do comprimento dos primers e da sua sequncia. A escolha criteriosa desta temperatura permite que estas sequncias iniciadores se liguem sequncia alvo com elevada especificidade.

Prtica 2- PCR e Anlise de DNA por eletroforese em gel de agarose Grupo 3- 06/10/11 Extenso: Aps a ligao dos primers s sequncias complementares de DNA, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72 C e a enzima Taq DNA- polimerase replica a cadeia de DNA. A Taq polimerase uma polimerase de DNA termoestvel recombinante do organismo Thermus aquaticus, que, ao contrrio de outras polimerases, se mantm ativa a temperaturas elevadas. O processo de sntese iniciado numa zona com cadeia dupla (onde esto ligados os primers), incorporando os nucleotdios complementares sequncia alvo e utilizando os dNTPs em soluo. A extenso inicia-se sempre na extremidade 3 do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples. A Taq DNApolimerase sintetiza exclusivamente na direo 5 para 3. Aps 30 ciclos da PCR (nmero de ciclos utilizados para a maioria das reaes), um nico fragmento gnico apresentar mais de 1 000 000 000 de cpias. As cadeias de DNA amplificadas so denominadas Amplicons. Aps a realizao da PCR, os produtos da reao foram analisados por eletroforese. Uma PCR bem-sucedida revelar uma banda no gel de agarose que dever estar na regio equivalente ao peso molecular do inserto (1Kb). A localizao dos fragmentos no gel feita pela comparao com o DNA ladder (padro de peso molecular). Pela observao do gel da aula prtica percebe-se que no houve amplificao, uma vez que que no houve corrida da reao de PCR.

Concluso
Conclui-se que provavelmente o fato de no ter ocorrido amplificao do fragmento de DNA correspondente ao gene da lipase de Rhizopus sp., seja devido erros na mquina para realizao de PCR ( termociclador), j que outras PCRs realizadas anteriormente, na mesma mquina com os mesmos reagentes, tenham dado resultados esperados, aps visualizao por eletroforese em gel de agarose.

Bibliografia

Prtica 2- PCR e Anlise de DNA por eletroforese em gel de agarose Grupo 3- 06/10/11 Eletroforese. Disponvel em: <http://web.cena.usp.br/apostilas/Figueira/2008/Apostila %2006%20Eletroforese.doc> Acesso em 01 de outubro de 2011. Gentica molecular. Disponvel em: <http://genetica.ufcspa.edu.br/biomedic/conteudo/genetica_molecular/eletroforese.pdf>.Ac esso em 01 de aoutubro de 2011.