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Diferencial de deteccin de Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Entamoeba y moshkovskii mediante un ensayo de una sola ronda de PCR ________________________________________________________
Las infecciones por Entamoeba spp. pueden resultar en una colonizacin inofensiva del intestino o una invasin de la pared del colon y el dao de los tejidos del husped tales como el hgado, los pulmones y el cerebro (amebiasis). En la mayora de los casos, un diagnstico clnico de la amebiasis puede ser confirmado y por lo general depende de la visualizacin de los parsitos por microscopa de luz de un frotis hmedo o muestras de colores. Este procedimiento es simple y barato, pero tiene varias limitaciones, tales como ser capaces de distinguir entre los quistes y trofozotos de la Entamoeba histolytica que causa enfermedad, la Entamoeba dispar especie no patognica, y la ameba Entamoeba anfizoicas moshkovskii, que ocasionalmente infecta a los humanos. Varias muestras a menudo tienen que ser solicitadas y examinadas, por la presencia de quistes de diferentes especies de Entamoeba, Iodamoeba o Endolimax puede hacer el diagnstico an ms difcil. Adems, con los informes de casos espordicos de infeccin humana con E. moshkovskii, y el reciente hallazgo de una alta prevalencia y la asociacin de E. moshkovskii con E. histolytica y E. dispar en los nios pequeos en Bangladesh; hacen que la diferenciacin de las tres especies en las muestras clnicas por otros medios, se conviertan de gran importancia tanto para el diagnstico y para estudios epidemiolgicos. A pesar de varios mtodos de PCR se han aplicado a la deteccin de E. histolytica y E. dispar en muestras de heces, no hay hasta ahora un caso de PCR que se utilice para la identificacin de E. moshkovskii en muestras de heces. PCR, junto con otros mtodos, como la PCR con el anlisis de los fragmentos de restriccin polimorfismo de longitud o riboprinting y la PCR con hibridacin reversa en lnea, tambin se ha utilizado para diferenciar E. moshkovskii de otras especies. La sensibilidad de estos mtodos para la deteccin de E. moshkovskii han demostrado ser superiores a la de la microscopa. Sin embargo, estos mtodos son todava relativamente muy largos y requieren de procedimientos adicionales y complejos, como la PCR, ensayos de endonucleasa de restriccin o hibridacin, para lograr su mayor sensibilidad.

Los mtodos basados en anticuerpos tambin han sido desarrollados para la diferenciacin de E. histolytica y E. dispar en muestras de heces, pero hasta ahora no de E. moshkovskii. Deteccin de anticuerpos contra las amebas en el suero de los pacientes se ha reportado que indicar una infeccin por E. histolytica. Sin embargo, con las pruebas serolgicas, puede ser difcil distinguir entre el pasado de las infecciones presentes en los individuos que emigran de o residen en zonas de endemicidad.

Hay una necesidad de herramientas ms sencillas y adecuadas para la identificacin de estas amebas en muestras clnicas, no slo con fines de diagnstico y gestin de la atencin Tatiana Estefania Venegas Gavilnez Paralelo P4 Grupo 4D

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al paciente, donde E. moshkovskii / E. dispar pacientes infectados pueden ser tratados innecesariamente con quimioterapia antiamebiano, sino tambin para una mejor comprensin de la epidemiologa de estos parsitos en la poblacin humana. En este estudio, el desarrollo de un ensayo de una sola ronda de PCR para la deteccin y el diagnstico diferencial de las tres especies de Entamoeba morfolgicamente idnticas se encuentran en los seres humanos, E. histolytica, E. dispar y E. moshkovskii, se llev a cabo. MATERIALES Y METODOS 1. Muestras de ADN. ADN aislado de axnicamente crecido E. histolytica HM-1: IMSS, E. dispar SAW 760, y E. moshkovskii. Fueron comparados por controles positivos utilizados en este estudio (ADNs de control). 2. Muestras clnicas. Un total de 30 muestras clnicas han sido identificadas en el E. baciloscopa positiva, incluyendo 27 muestras de heces y tres aspirados absceso heptico histolytica, individualmente se obtuvieron de 30 pacientes que precisaron atencin mdica por una variedad de razones en el Phramongkutklao y Ramathibodi hospitales de Bangkok, Tailandia. Todas las muestras fueron examinadas primero en los laboratorios de microscopa y posteriormente se utilizaron para evaluar el mtodo de PCR desarrollado en este estudio. Realizaron la extraccin de ADN directamente en muestras de heces mediante el uso de un taburete QIAamp DNA kit de extraccin (QIAGEN, Hilden, Alemania). El ADN extrado se almacen a -20 C hasta ms preguntas uso. 3. Diseo de cebadores. Los primeros diseados en base a la E. se reportaron histolytica, E. dispar y E. moshkovskii pequea subunidad rRNA secuencias de genes (GenBank adhesin no. X64142, Z49256, y AF149906, respectivamente). Las secuencias alineadas con Fueron Multialin (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html). La secuencia del cebador (ENTAF) se deriv de la regin central de la pequea subunidad rRNA genes que se conservan en las tres especies de Entamoeba, donde el reverso primers Ehr, EDR, y EMR, especfico para E. histolytica, E. dispar y E. moshkovskii, respectivamente, fueron diseados a partir de secuencias de la firma de las secuencias de rRNA de la subunidad pequea respectivos son especficas para que cada uno de los tres parsitos. 4. Amplificacin por PCR para el diagnstico diferencial. La reaccin de amplificacin por PCR se realiz en un volumen final de 50 l en 0,1 ml de tubos de PCR mediante el uso de un termociclador PX2 (ThermoHybaid, Reino Unido). Se han optimizado las condiciones de reaccin para combinar el primer Tatiana Estefania Venegas Gavilnez Paralelo P4 Grupo 4D

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adelante (ENTAF) con cada uno de los tres cebadores inversos (EHR, EDR, y RMS) en una sola mezcla de reaccin y bajo las mismas condiciones. La mezcla de reaccin contena 200 mM de cada trifosfato desoxinuclesidos, 0,1 mM de cada cebador de avance y retroceso, 6 mM MgCl 2, 0,5 U de Taq polimerasa, 1 tampn Taq y 10 l de las muestras de ADN extrado. Amplificacin de cada fragmento de ADN especfico de la especie se inici con una desnaturalizacin inicial a 94 C durante 3 minutos, seguido por 30 ciclos de 94 C durante 1 minuto, 58 C durante 1 minuto y 72 C durante 1 minuto, con la extensin final a 72 C durante 7 minutos. Productos amplificados se visualizaron con tincin con bromuro de etidio despus de electroforesis en geles de agarosa al 1,5%. 5. Determinacin de la sensibilidad y especificidad de los cebadores de PCR. Para determinar la sensibilidad de la prueba, las concentraciones de ADN de cada especie Entamoeba fueron preparados por diluciones en serie a partir de 5 ng a 0,6 pg de ADN. La prueba de sensibilidad se realiz utilizando los mismos protocolos descritos anteriormente. La mezcla de ADN de E. E. histolytica dispar y E. moshkovskii fue probado por cualquier reaccin cruzada o cross-Entre amplificacin de los primeros cebadores para las tres especies de Entamoeba. El ensayo tambin fue probado para especificidad frente a un panel de ADN genmico de diferentes bacterias y otros protozoos. Grupo I contena ocho ADN genmico Obtenidos a partir de diferentes organismos de la cultura, incluidas las lneas celulares humanas y de cultivos axnicos de una variedad de agentes patgenos conocidos a causado infecciones intestinales en los seres humanos:.. Escherichia coli, Salmonella spp, Shigella spp, Vibrio cholerae, Blastocystis hominis, Giardia lamblia y Cryptosporidium spp. ADN extrado de una muestra de heces libres de parsitos se utiliz como control negativo. Grupo II consisti en ADN extrado de ocho muestras de heces, cada una contiene de los siguientes parsitos: Entamoeba coli, Endolimax nana, Blastocystis hominis, Giardia lamblia o Cryptosporidium parvum. RESULTADOS Especficos de la especie de productos PCR. Mediante el uso de los cebadores diseados, E. histolytica primers (ENTAF / EHR) amplificacin de ADN de la HM-1: cepa del IMSS, pero no de E. dispar SAW 760 o E. moshkovskii Laredo, la E. dispar primers (ENTAF / RBS) y la E. moshkovskii primers (ENTAF / EMR) tambin mostr las particularidades espera. Amplificaciones produjo fragmentos de 166, 580 y 752 pb correspondientes a los productos esperados de E. histolytica, E. moshkovskii, y E. dispar, respectivamente. Resultados similares se observaron tambin cuando los cebadores para el E.histolytica, E. dispar y E. moshkovskii se mezclaron entre s y se amplifica en una sola reaccin. La amplificacin de los productos que se espera para el E. histolytica, E. dispar y Tatiana Estefania Venegas Gavilnez Paralelo P4 Grupo 4D

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E. Observ moshkovskii fue de nuevo (Fig. (Fig. 1, 1A, carriles 1 a 3), y la intensidad de cada fragmento se encontr que era similar a la obtenida con las reacciones por separado. Interferencias en la cruz o la amplificacin se observ cuando otros organismos fueron probados con tres Entamoeba cebadores especficos (Fig. 1A y B).

Resultados similares se observaron tambin cuando el ADN de E. histolytica, E. dispar y E. moshkovskii se mezclaron en una sola reaccin y se amplifica en el ensayo de PCR. La amplificacin de cada fragmento se corresponde E. histolytica, E.dispar y E. moshkovskii fue exitosa (Fig. (Fig.1b) 0.1 B). Las intensidades de todos los fragmentos correspondientes resultaron ser similares a la amplificacin de ADN de un individuo, como se ve en la figura Fig.1A.1A. No hay interferencia o cruce de amplificacin, se observ que se producen entre cada uno de los pares hacia adelante y atrs cebados hacia el ADN de las otras especies de Entamoeba.

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR Sensibilidad de la prueba PCR.

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La sensibilidad de este ensayo se evalu mediante una serie de muestras de ADN doble diluido en serie que contiene concentraciones conocidas de E. histolytica, E. dispar y E.moshkovskii ADN. Los resultados mostraron que el ensayo es capaz de detectar los pequeos de la E. 19 pg E. histolytica moshkovskii ADN (Fig. 2A y C, carril 9) y de 9,5 pg de E. dispar de ADN (Fig. (Fig.2b, 2B, carril 10). El nivel mnimo de deteccin del ensayo sugiere que es lo suficientemente sensible para la identificacin exacta de las tres especies en las muestras clnicas.

Especificidad de la prueba PCR. En el contrainterrogatorio de amplificacin se observ cuando los iniciadores mixtos fueron probados contra el ADN humano (Fig. (Fig. 1, 1, calle 4) o en contra de cualquier ADN genmico o heces infectadas contienen diferentes patgenos bacterianos o protozoos (Fig. (Fig. 1A, 1A, carriles 5 a 11, y B, carriles de 4 a 10 y 13). Por el contrario, las muestras de heces de dos pacientes infectados tailandesa, ya sea con E. histolytica o E. dispar, los confirmados por otro estudio microscpico y dos ensayos de PCR (12, 15), fueron amplificados con xito. En las bandas de amplificacin cruzada o adicional se observaron (Fig. (Fig.1b, 1B, carriles 11 y 12). Por otra parte, libres de parsitos muestras de materia fecal que result negativa para los quistes de Entamoeba trofozoito y confirmado por el examen microscpico y negativos para todas las especies de Entamoeba (15) revelan que el producto de PCR En las mismas condiciones (Fig. (Fig. 1, 1A, carril 12). Tatiana Estefania Venegas Gavilnez Paralelo P4 Grupo 4D

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TABLE 1. Summary of PCR results for E. histolytica, E. dispar, and E. moshkovskiia

Primers Entam 1 and Entam 2c P11 and P12d P13 and P13d EntaF and EhRe EntaF and EdRe EntaF and EmRe
a

Specificity All Entamoeba species E. histolytica E. dispar E. histolytica E. dispar E. moshkovskii

Product size (bp) 550 101 101 166 752 580

Detection rateb (%) 25/30 (83.3) 4/30 (13.3) 6/30 (20) 4/30 (13.3) 6/30 (20) 0/30 (0)

Shown are results from PCR using primers EntaF and EhR, EdR, and EmR compared with results from other PCR assays. b Number of positive samples/number of total samples. c PCR method of Verweij et al. (15). d PCR method of Tachibana et al. (12). e PCR method developed in this study.

Mediante el uso de la PCR desarrollada en este estudio, hemos logrado identificar las especies presentes en un total de 10 de las 30 muestras clnicas analizadas: 4 fueron positivos para E. y 6 para E. histolytica dispar (Fig. (Fig. 3, 3, carriles de 4 a 13). Los mismos resultados se obtienen cuando se describi anteriormente especficos de E. histolytica y E. dispar cebadores especficos utilizados fueron (12). En la amplificacin de E. moshkovskii se observ ningn ejemplar.

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR CONCLUSION

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El fin de esta investigacin se encamina a actualizar los avances en el diagnostico especifico de las diferentes clases de Entamoeba, y asi de esta manera unificar mundialmente diagnosticos y tratamientos especficos para esta parasitosis, que es un problema de salud publica que puede ser mejorado. Este estudio tambin ayuda a obtener un diagnostico certero y asi evitar el uso indiscriminado de antimicrobianos, que provocan la resistencia parasitaria. Entiendo que el ensayo de una sola ronda de PCR fue desarrollado para la deteccin y el diagnstico diferencial de las tres especies de Entamoeba encuentra en los seres humanos, Entamoeba moshkovskii, Entamoeba histolytica y Entamoeba dispar son morfolgicamente idnticas tanto los trofozotos como los quistes. Un cebador conservado se deriva de la mitad de los genes de la subunidad pequea rRNA, y de esta manera disea secuencias a partir del cebador inicial. Se hallan diferencias especficas para cada una de estas tres especies de Entamoeba. BIBLIOGRAFIA http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1594701/?tool=pmcentrez http://bases.bireme.br/cgibin/wxislind.exe/iah/online/?IsisScript=iah/iah.xis&src=google&base=LILACS&lang=p &nextAction=lnk&exprSearch=497277&indexSearch=ID Parasitosis Humanas; David Botero, cuarta edicin http://translate.google.es

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