UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA INDUSTRIAL
Profa. CRISTINA FERRAZ SILVA

APOSTILA DE AULA PRÁTICA

Atualizada em 2023

ALUNO: _____________________________________

Bioquímica

São Cristóvão

2023
 SUMÁRIO

Assunto página

Introdução ao laboratório 01

Preparo de meio de cultura e inoculação 06

Coloração de Gram 10

Preparo de solução tampão 12

Cromatografia 14

Caracterização da uréase 19

Índice de saponificação 22

Determinação de açúcares redutores 24

Fermentação alcoólica 27
AULA PRÁTICA 1: INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO

I. Instruções Gerais
O laboratório é um lugar para trabalho sério e não deve servir para experimentos não
programados. As orientações enumeradas a seguir devem ser obedecidas impreterivelmente:
1. Não é permitido comer ou beber dentro do laboratório.
2. É indispensável o uso de avental (jaleco ou guarda-pó), óculos de segurança, luvas, calçado
fechado e calça comprida.
3. Alunos com cabelo comprido devem mantê-lo sempre presos.
4. A leitura das práticas com antecedência proporcionará melhor aproveitamento das aulas.
5. Realize somente os experimentos indicados na aula. Não é permitido realizar aqueles não
autorizados.
6. Não troque os reagentes de uma bancada para outra.
7. Tendo qualquer dúvida, solicite ao professor os devidos esclarecimentos.
8. Cuidados especiais devem ser tomados durante o manuseio de ácidos e bases fortes e de
materiais biológicos.
9. Todos os reagentes (sem exceção) devem ser manipulados com luvas.
10. Comunique aos professores quando houver material quebrado na bancada ou aparelhos
danificados. Quando isto acontecer não utilize estes materiais. Se houver quebra de
material durante o experimento, comunique ao professor imediatamente.
11. Sempre confira o material recebido para a aula antes de iniciar o experimento. Avalie se
não estão danificados e se estão devidamente limpos.
12. Ao final de cada aula, limpe todo o material. Descarte os resíduos em frascos apropriados.
Lave sempre com água e sabão e por último passe sempre água destilada. As pipetas devem
ser colocadas dentro de cubas (lavadores de pipetas) com as pontas para baixo.

II. Instruções técnicas

1. Use sempre uma pipeta para cada reagente a fim de evitar contaminação.
2. Atenção para não trocar as tampas dos frascos de reagentes.
3. Para aquecer uma vidraria na chama direta (bico de Bunsen ou fogareiro) observe se o
tubo está seco externamente, caso contrário, seque-o antes de efetuar a operação.
Para que a vidraria seja uniformemente aquecido, prenda-o com pinças de madeira e
mantenha-o em constante agitação. Nunca dirija a boca da vidraria em sua direção ou
na dos colegas.
4. Espere que o vidro quente volte a esfriar antes de pegá-lo. Lembre-se, o vidro quente
parece frio.
5. Terminado o uso do bico de Bunsen ou fogareiro, verifique se as torneiras do gás estão
bem fechadas, evitando assim explosões e intoxicações.
6. Nunca deixe ou abra frascos de líquidos inflamáveis (éter, álcool, acetona, benzeno,
etc) nas proximidades de chamas.
7. Leia duas vezes os rótulos dos reativos antes de utilizá-los.
8. Nunca devolva restos de uma solução para o frasco-estoque, porque poderá estar
contaminada.
9. Antes de introduzir pipetas nas soluções, certifique-se de que estão limpas.
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10. Nunca insira pipetas e/ou conta-gotas diretamente nos frascos estoque das soluções.
Sempre coloque um pouco da solução em um béquer e pipete a partir daí.
11. Para preparar soluções de ácidos fortes (sulfúrico, clorídrico, nítrico, etc), verta sempre
o ácido sobre a água, nunca a água sobre o ácido.
12. Para o preparo das soluções alcalinas (NaOH, KOH, etc) tome bastante cuidado, pois a
dissolução de bases fortes em água é exotérmica. Mantenha o frasco em banho de gelo
e não aspire os vapores desprendidos.
13. Todo e qualquer reagente volátil deve ser trabalhado na capela.
14. Para verificar o odor de uma substância, nunca leve o frasco diretamente ao rosto.
15. Para o preparo de soluções-padrão utilize vidrarias volumétricas.
16. O uso das pipetas:
- Para volumes de 0 e 1 mL, use pipeta de 1 mL graduada.
- Entre 1 e 2 mL, use pipeta de 2 mL graduada.
- Entre 2 e 5 mL, use pipeta de 5 mL graduada.
- Entre 5 e 10 mL, use pipeta de 10 mL graduada.
O líquido no interior das pipetas forma menisco e a leitura deve ser na altura dos olhos. O
mesmo vale para balões volumétricos.
Para medir substâncias corrosivas ou tóxicas, obstrua a extremidade superior da pipeta com
um pouco de algodão ou use uma bureta que é mais seguro.
Jamais pipete com a boca, sempre use peras, pró-pipetas ou pipetas automáticas.
Quando pipetar sangue, soluções viscosas, ácidos concentrados ou soluções alcalinas
concentradas, lavar imediatamente com água o material utilizado.
Antes de iniciar aula prática, verifique se todo o material a ser utilizado está na bancada.

MATERIAL DO ESTUDANTE:
CADA ESTUDANTE DEVERÁ TRAZER PARA OS TRABALHOS PRÁTICOS:
1) Jaleco: não será permitida a presença do aluno em aulas práticas sem jaleco.
2) Óculos de proteção e luvas de borracha (luvas de limpeza).
3) Guia de aulas práticas (apostila): sem o qual o aluno não executará as práticas.
4) Pincel marcador: para marcar adequadamente a vidraria.

EXECUÇÃO DOS TRABALHOS PRÁTICOS:

a) A turma será dividida em cinco grupos (a depender do número de discentes matriculados na
turma) para a realização dos experimentos.
b) Os materiais de segurança pessoal e apostila são individuais.
c) Para a execução dos trabalhos práticos exige-se atenção, rigor técnico, responsabilidade e
disciplina.
d) Para maior eficiência é necessário que o aluno seja pontual, assíduo, ordeiro e tenha
conhecimento teórico prévio da prática a ser executada.
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MÉTODOS GERAIS DE LABORATÓRIO

PREPARO DE SOLUÇÕES:

a) Cálculo da Molaridade e % de soluções

(i) a solução molar é a qual 1 litro de solução contém o número de gramas igual ao seu peso
molecular.
Exemplo: para preparar 100 mL de uma solução 5M de NaCl = 58,456 (PM do NaCl) g x 5
moles x 0,1 litro = 29,29 g em 100 mL.

(ii) % de solução
Porcentagem (m/v) = massa (g) em 100 mL de solução
Porcentagem (v/v) = volume (mL) em 100 mL de solução
Exemplo: para preparar uma solução de agarose 0,7% em tampão TBE, pese 0,7 g de
agarose e adicione 100 mL de tampão TBE.

b) Preparo de soluções de trabalho a partir de soluções estoque concentradas

Soluções de uso comum, tais como HCl, NaOH, tampões, etc, fazem parte da rotina dos
laboratórios de biotecnologia, por isso, muitas vezes essas são preparadas em concentração mais
elevada e disponibilizadas como soluções estoque. Dessa forma, essas soluções são diluídas para
preparar as soluções de trabalho.
Ci.Vi = Cf.Vf
Onde:
Ci = concentração inicial ou concentração da solução estoque
Vi = volume inicial ou quantidade de solução estoque adicionada
Cf = concentração final ou concentração da solução desejada
Vf = volume final ou volume da solução desejada
Exemplo: É necessário preparar 100 mL de uma solução aquosa de NaOH 0,5M a partir de uma
solução estoque de concentração 5M. Portanto, é necessário adicionar 10 mL da solução estoque
em 90 mL de água.

c) Passo a passo no preparo de soluções

(i) verifique no manual do laboratório as instruções específicas para o preparo da solução,
atentando para as instruções de armazenamento e precauções específcas da substância de
trabalho.
(ii) pese a quantidade da substância desejada usando um recipiente apropriado (béquer ou
papel para pesagem). Use uma balança analítica se a quantidade for menor que 0,1 g ou se a solução
se tratar de uma solução padrão.
(iii) adicione o solvente em uma quantidade menor do que a requerida para o preparo da
solução.
(iv) dissolva a massa da substância usando um bastão de vidro (bagueta) ou uma barra e
agitador magnéticos. Algumas substâncias precisam de aquecimento para melhorar a dissolução.
(v) após a dissolução do soluto, transfira a mistura para um cilindro graduado ou um balão
volumétrico e complete o volume com o solvente até atingir a quantidade requerida de solução
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final. Uma exceção ocorre no preparo de soluções contendo ágar e agarose, onde a solução será
preparada diretamente no frasco final.
(vi) se a solução precisa ser em um pH específico, calibre o peagâmetro com soluções
tampões frescas e siga as instruções de uso do equipamento.
(vii) se a solução desejada for estéril, use a autoclave a 1210C por 20 min. Algumas soluções
não podem ser autoclavadas, ou seja, quando for composta de substâncias termosensíveis, como
antibióticos e SDS. Neste caso, a solução pode ser esterilizada com filtro estéril 0,22 µm. Meios para
cultivo de microrganismos devem ser preparados com algumas horas ou até um dia antes do seu
uso, tempo esse necessário para que a solução atinja a temperatura ambiente e a existência de
contaminação seja detectada.
(viii) Meios sólidos para placas de Petri podem ser preparados, autoclavados e estocados
em recipientes adequados que evitem contaminação e evaporação. Quando necessário, o meio
sólido pode ser “derretido” usando um microondas.

EQUIPAMENTOS:

(a) Comentários gerais. Utilize o equipamento em boas condições de trabalho. Não utilize
nada (qualquer instrumento) se não estiver sido instruído quanto ao propósito de uso.
Reporte qualquer funcionamento estranho imediatamente, incluindo ruídos
exagerados, vazamentos, cheiro de queimado, etc. Execute a limpeza do equipamento
logo após o uso, incluindo o rotor de centrífuga.
Por favor, não disperdice material – use somente o que você necessitar. Caso o material
esteja acabando, notifique o instrutor antes do término do mesmo.
Ocasionalmente, se for necessário o uso de reagente ou equipamento de outro
laboratório, notifique o instrutor antes do uso.
(b) Micropipetadores. Muitos experimentos realizados em laboratório dependem da sua
habilidade em medir volumes acurados de soluções usando micropipetadores. A
acuracidade só pode ser alcançada com bom desempenho no uso de micropipetas e
com boa ordenação de trabalho. Antes de usar micropipetas, certifique-se do limite de
volume que as mesmas trabalham, ajuste o volume desejado, respeitando esses limites.
Coloque a ponteira adequada à micropipeta a ser utilizada. Siga as instruções
fornecidas pelo instrutor. Descarte a ponteira em local adequado e guarde a
micropipeta com o volume ajustado no máximo ou no mínimo, isso ajudará a mater a
micropipeta calibrada por mais tempo.
(c) Usando um peagâmetro. Moléculas e funções biológicas são muito sensíveis a
mudanças de pH e, por isso, tampões são usados para estabilizar o pH desses meios.
Um peagâmetro é um instrumento que mede a diferença de potencial entre um
eletrodo de referência e um eletrodo de vidro, frequentemente combinado. O eletrodo
de referência geralmente é AgCl2. A medida acurada do pH depende da calibração do
equipamento, do grau de carga estática e da temperatura da solução a ser medida.
Alguns peagâmetros possuem sensor de temperatura, o qual corrige o valor do pH
dependendo da temperatura da solução que está sendo medida.
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(d) Procedimentos de operação da autoclave. Todo o material deve ser colocado nos
cestos da autoclave. Todos os itens devem ser devidamente identificados quanto ao
conteúdo e o responsável pelo material autoclavado. Tenha certeza de que o material
colocado na autoclave não seja termolábel e seja resistente a pressão. As condições de
esterilização são de 1 atm e 1210C. O tempo de esterilização depende do volume do
material a ser autoclavado. Certifique-se de que a pressão está em zero antes de abrir
a autoclave.
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AULA PRÁTICA 2: PREPARO DE MEIO DE CULTURA

Pré-Relatório

a) O que é um meio de cultura?

b) Quais as características físico-químicas de cada meio de cultura?

c) Pesquise a formulação dos meios de cultura presentes no ensaio experimental e identifique qual
a fonte de carbono de cada um dos meios de cultura.

d) Qual a classificação dos meios de cultura quanto a sua composição e disponibilidade de nutriente
aos microrganismos?

e) O que é ágar e qual a sua função no meio de cultura? Ele pode ser utilizado como nutriente pelos
microrganismos?

Introdução

Os meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial de microrganismos. Estes meios fornecem

os princípios nutritivos indispensáveis ao seu crescimento.
Para crescer, todos os organismos necessitam de uma variedade de elementos químicos como
nutrientes. Estes elementos são necessários tanto para a síntese como para as funções normais dos
componentes celulares. Os principais elementos químicos essenciais presentes nos meios de
cultura são Carbono, Nitrogênio, Hidrogênio, Oxigênio, Enxofre e Fósforo, além de outros sais
geralmente requeridos em menor quantidade.
Para determinar as necessidades nutricionais de um microrganismo, são utilizados meios
quimicamente definidos, uma vez que se conhece a composição exata de tais meios. Entretanto,
para o cultivo de rotina no laboratório e o estudo dos microrganismos heterotróficos, são utilizados
meios de cultura complexos preparados a partir de produtos naturais (extrato de carne, peptonas,
extrato de levedura, etc).
Quando um meio solidificado é necessário para o crescimento ou estudo dos microrganismos,
um agente solidificante é adicionado ao meio líquido. O ágar (polissacarídeo complexo extraído de
alga marinha) que é utilizado em uma concentração em torno de 1,5% (p/v). O ágar não serve como
nutriente para a maioria dos microrganismos e não é metabolizado durante o crescimento.
Alguns meios de cultura são seletivos e diferenciais. Meios seletivos permitem o crescimento
de um tipo particular de microrganismo ou suprimem o crescimento de outros tipos de
microrganismos. Os meios diferenciais são usados quando querem diferenciar os vários tipos de
microrganismos, como por exemplo, a verificação de hemólise em placas contendo ágar sangue.

Objetivos
Preparar meios de cultura e esterilizar os mesmos em autoclave.
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Procedimento experimental

I. PREPARO DE MEIO DE CULTURA

GRUPO 1: Caldo Lactosado

Materiais:
1 béquer de 100 mL
1 proveta de 50 mL
5 tubos de ensaio
Algodão
Gaze
Barbante

Procedimento: Realizar os cálculos para a preparação de 50 mL do meio caldo lactosado. Em um

béquer de 100 mL, pesar a quantidade calculada do meio de cultura e adicionar o volume de água
previamente medido em proveta. Dissolver completamente o meio e distribuir o volume em 5
tubos de ensaio. Colocar o tampão de algodão em cada tubo. Esterilizar em autoclave a 1 atm e
1210C durante 15 minutos.

GRUPO 2: Nutriente Ágar

Materiais:
1 béquer de vidro de 50 mL
1 proveta de 50 mL
1 bastão de vidro
5 tubos de ensaio
Aquecedor elétrico
Algodão
Gaze
Barbante

Procedimento: Realizar os cálculos para a preparação de 30 mL do meio nutriente ágar. Em um

béquer de 50 mL, pesar a quantidade calculada do meio de cultura e adicionar o volume de água
previamente medido em proveta. Aquecer a mistura, mexendo eventualmente, até a completa
homogeneização do meio e distribuir em 5 tubos de ensaio. Colocar o tampão de algodão em cada
tubo. Após, esterilizar em autoclave a 1 atm e 1210C durante 15 minutos. Depois de retirar da
autoclave, inclinar os tubos na bancada e deixar o meio solidificar.

GRUPO 3: Ágar Batata Dextrose (PDA)

Materiais:
1 Erlenmeyer de 250 mL
1 proveta de 100 mL
5 placas de Petri
Algodão
Gaze
Barbante
Papel de embrulho (autoclavar placas)
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Procedimento: Realizar os cálculos para a preparação de 100 mL do meio PDA. Em um erlenmeyer

de 250 mL, pesar a quantidade calculada do meio de cultura, adicionar o volume de água
previamente medido em proveta, inserir o tampão de algodão ou estopa e cobrir o tampão com o
papel de embrulho. Embalar as 5 placas de Petri vazias com o papel de embrulho. Esterilizar o meio
contido no erlenmeyer e as placas de Petri em autoclave a 1 atm e 1210C durante 15 minutos.
Depois de sair da autoclave, as placas e o meio autoclavados devem ser levados à câmara de fluxo
laminar e o meio distribuído em cada placa de Petri na quantidade aproximada de 20 mL. Aguardar
a solidificação do meio e inverter as placas de forma que o meio fique para cima.

GRUPO 4: Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB)

Materiais:
1 Erlenmeyer de 250 mL
1 proveta de 100 mL
5 placas de Petri
Algodão
Gaze
Barbante
Papel de embrulho (autoclavar placas)

Procedimento: Realizar os cálculos para a preparação de 100 mL do meio EMB. Em um erlenmeyer

de 250 mL, pesar a quantidade calculada do meio de cultura, adicionar o volume de água
previamente medido em proveta, inserir o tampão de algodão ou estopa e cobrir o tampão com o
papel de embrulho. Embalar as 5 placas de Petri vazias com o papel de embrulho. Esterilizar o meio
contido no erlenmeyer e as placas de Petri em autoclave a 1 atm e 1210C durante 15 minutos.
Depois de sair da autoclave, as placas e o meio autoclavados devem ser levados à câmara de fluxo
laminar e o meio distribuído em cada placa de Petri na quantidade aproximada de 20 mL. Aguardar
a solidificação do meio e inverter as placas de forma que o meio fique para cima.

GRUPO 5: Caldo Verde Brilhante

Materiais:
1 béquer de 100 mL
1 proveta de 50 mL
5 tubos de ensaio
Algodão
Gaze
Barbante

Procedimento: Realizar os cálculos para a preparação de 50 mL do meio caldo verde brilhante. Em

um béquer de 100 mL, pesar a quantidade calculada do meio de cultura e adicionar o volume de
água previamente medido em proveta. Dissolver completamente o meio e distribuir o volume em
5 tubos de ensaio. Colocar o tampão de algodão em cada tubo, cobrir os tampões com o papel de
embrulho. Esterilizar em autoclave a 1 atm e 1210C durante 15 minutos.

Depois de preparados os meios de cultura, cada grupo deve incubar os meios por 24h a 370C em
estufa bacteriológica para atestar a esterilidade dos mesmos.
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AULA PRÁTICA 3: TÉCNICAS DE SEMEADURA

Pré-Relatório

a) Por que os meios de cultura precisam estar esterilizados antes da semeadura?

b) O que se entende por “colônia” de microrganismo?
c) Como pode ser obtida uma cultura pura de bactéria?
d) Na prática, o que se entende por micélio?
e) Como diferenciar uma bactéria de uma levedura e de um bolor?

Introdução
O processo de inoculação de microrganismos consiste em adicionar estes em um meio de
cultura para verificar seu crescimento.
Ao se inocular um microrganismo em um meio de cultura adequado para o seu crescimento
in vitro, esse microrganismo inicia o seu desenvolvimento nesse meio. A inoculação correta da
amostra é um dos passos mais importantes na identificação de um microrganismo de interesse,
seja ele um contaminante (patógeno) ou não. A inoculação pode ser feita por meio de alças de
inoculação devidamente esterilizadas ou swabs. Os meios devem estar devidamente esterilizados
e isentos de qualquer contaminante, para isso devem ser sempre examinados antes da inoculação.
Os microrganismos são semeados em meios líquidos ou em meios sólidos. Após a
inoculação de bactérias em placas ou tubos, devidamente rotulados, devem ser colocados em
incubadora a 370C por 24 ou 48 horas. Quando ocorre o crescimento de bactérias em um meio
sólido, as bactérias são representadas em padrões característicos denominados colônias, as quais
compreendem grandes grupos de células. Em meios líquidos, o crescimento mostra-se evidente
pela existência de turvação do líquido. A semeadura realizada no formato de estrias é feita a fim de
que se consiga o isolamento dos organismos, ou seja, a obtenção de colônias isoladas. Como cada
espécie possui um tipo morfológico colonial diferente, deve ser feita a análise quanto à elevação, à
forma, ao tamanho, às bordas e à pigmentação das colônias. Em um meio de cultura, um único tipo
de colônia observado é denominado cultura pura. Se forem observados vários tipos de colônias,
denomina-se cultura mista.
Os fungos filamentosos quando semeados em meios sólidos formam estruturas visíveis na
superfície denominadas micélio. Em meios líquidos, os fungos também promovem a turvação do
meio. Depois de semeados, os fungos filamentosos ou bolores são incubados na ordem de dias até
que se observe o aparecimento de micélio. As leveduras, fungos unicelulares, crescem e se
reproduzem mais rapidamente do que os bolores, pois são mais eficientes na realização de
alterações químicas, devido a sua maior relação de área/volume. O isolamento de colônias de
leveduras em meio de sólido permite realizar estudos das características morfológicas de cada
espécie.
Há várias técnicas de inoculação de microrganismos. Algumas são utilizadas para exames
qualitativos e outras, para estudos quantitativos.

Objetivos
Realizar inoculação em meios de cultura líquidos e sólidos, em placas e tubos de ensaio,
verificando a presença ou ausência de crescimento microbiano.
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Procedimento experimental

I. SEMEADURA EM MEIO LÍQUIDO

1. Flambar a alça de inoculação até o metal atingir o rubro e, a seguir, deixar esfriar próximo da
chama do bico de Bunsen;

2. Pegar o tubo a ser inoculado (contendo o meio de cultura esterilizado) e identificá-lo;

3. Pegar o recipiente contendo a amostra com os microrganismos, agitar ou homogeneizar a
amostra;
4. Inserir a alça de inoculação na amostra formando um filme na extremidade da alça;
5. Com a outra mão, pegar o tubo a ser inoculado (contendo o meio esterilizado), retirar o tampão
e flambar a boca do tubo na chama do bico de Bunsen;

6. Inserir a alça contendo os microrganismos da amostra no tubo contendo o meio de cultura

líquido;

7. Flambar a boca do tubo inoculado e recolocar o tampão;

8. Flambar a alça até o metal atingir o rubro;
9. Levar o tubo inoculado para incubação em estufa;
10. Avaliar o resultado na próxima aula.

II. SEMEADURA EM MEIO SÓLIDO EM TUBO (ÁGAR INCLINADO)

1. Seguir as etapas 1 a 5 descritas no item I (acima);

2. Inserir a alça contendo os microrganismos da amostra no fundo do tubo e semear o meio

realizando movimentos em zigue-zague ao longo de todo o meio sólido, até próximo da boca do
tudo de ensaio;
 11

III. SEMEADURA DE MEIO SÓLIDO EM PLACA (ESGOTAMENTO)

Esta técnica é usada fundamentalmente para se obter (isolar) culturas puras de amostras que
contenham microbiota mista, sendo igualmente útil para o estudo da morfologia colonial. A
superfície do ágar nas placas deve ser lisa e úmida, porém sem umidade excessiva, uma vez que
isso poderia ocasionar um crescimento confluente.
A técnica de esgotamento em placa consiste em depositar sobre um ponto da superfície do
meio uma alíquota do material e depois espalha-lo em dois ou três setores, com o auxílio de alça
de inoculação, sem recarregá-la, de modo a obter quantidades progressivamente menores do
material, e assim formando colônias perfeitamente isoladas.

O sucesso da semeadura está em:

Grande número de estrias
Não perfurar o meio
Não voltar a alça pela parte já estriada
Pegar pequena quantidade de material para semear (flambar a alça após o primeiro
estriamento).
 12

PRÁTICA 4: MÉTODO OU COLORAÇÃO SIMPLES

Pré-Relatório
a) Qual a função do corante azul de metileno nessa prática?
b) Quais as características microscópicas dos bolores e da levedura de pão que serão utilizados
nessa prática?
c) Qual o nome científico da levedura de pão?
d) Quais as aplicações industriais da Saccharomyces cerevisiae e do Penicillium?

Introdução

Para melhor visualizar os microrganismos no microscópio ótico, é necessária a utilização de

corantes que evidenciam algumas de suas estruturas e auxiliam na identificação de sua morfologia.
Para evidenciar estruturas gerais, utiliza-se a coloração simples, a qual contrasta apenas o
corpo do microrganismo. Já para distinguir estruturas específicas, utiliza-se coloração diferencial,
composta por mais de um corante, o que possibilita sua separação em grupos ou espécies.

Objetivos
Confeccionar lâminas coradas – coloração simples.
Avaliar a morfologia de microrganismos.
Manusear o microscópio ótico.

Procedimento Experimental
Material:
Lâminas de vidro
Alça de inoculação
Bico de Bunsen
Álcool 70%
Papel toalha
Azul de metileno
Óleo de imersão
Microscópio

Preparo do esfregaço:

a) Flambar a alça até o rubro;

b) Colocar uma gota de água destilada no centro da lâmina e adicionar, usando uma alça de
inoculação, a cultura microbiana a ser analisada;
 13

c) Espalhe a cultura no centro da lâmina com movimentos circulares, intercalando a passagem da

lâmina na chama do bico de Bunsen;

d) Flambar a alça até o rubro;

d) Após fixação da amostra na lâmina, siga a aplicação do corante.

Coloração simples:

a) Cobrir o esfregaço com azul de metileno durante 1 minuto;

b) Lavar novamente com água da torneira;
c) Enxugar a lâmina entre papel de filtro sem esfregar;
d) Adicionar uma gota de óleo de imersão e examinar.

Uso do microscópio ótico

1- Verificar a voltagem e ligar o microscópio na energia;
2- Acender a lâmpada do sistema de iluminação;
3- Abrir totalmente o diafragma e colocar o sistema condensador diafragma na posição mais
elevada, permitindo maior iluminação;
4- Movimentar o revólver, colocando em posição a objetiva de menor aumento (10x);
5- Colocar a lâmina na platina, com a preparação para cima, fixando-a a platina;
6- Movimentar o charriot, fazendo com que o esfregaço fique em baixo da objetiva;
7- Com o parafuso macrométrico, elevar a platina ao máximo, observando que a platina não toque
na lâmina ou lamínula, pois poderá quebrá-la;
8- Focalizar a preparação para a obtenção de uma imagem nítida, movimentando o botão
macrométrico para baixo até que se possa visualizar a imagem;
9- Limpar a objetiva de maior aumento (100x) a qual foi utilizada com óleo de imersão usando álcool
e um papel macio ou algodão.
 14

PRÁTICA 5: MÉTODO OU COLORAÇÃO DE GRAM

Pré-Relatório
a) O que é lugol e qual a sua função na coloração de Gram?
b) Explique o fundamento da coloração de Gram. Por que algumas bactérias coram de vermelho e
outras de roxo?
c) Na prática, em qual etapa ocorre a diferenciação entre as bactérias Gram – e Gram + ?

Introdução

O método de Gram ou coloração de Gram é uma técnica de coloração de preparações

histológicas para observação ao microscópio óptico. Esse método é utilizado para corar
diferencialmente microrganismos com base na composição química e integridade da sua parede
celular. Consoante a cor que adquirem, são classificados em gram positivos (roxo) ou gram
negativos (vermelho). Tal método se deve ao médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram
(1853-1938). Geralmente as bactérias "gram negativas" são mais patogênicas, possuindo ainda
lipopolissacarídeos na sua membrana exterior, que agravam a infecção.

Na técnica de Gram, bactérias são coradas com um corante violeta especial. A bactéria que
assim obtiver uma cor roxa será gram positiva e a que obtiver coloração rósea, gram negativa. A
gram positiva ganha coloração roxa porque sua camada mais externa, a parede celular, formada
por peptidoglicano, absorve a tinta. Já a gram negativa é rósea porque, apesar de também ter
parede celular, esta fica abaixo de uma membrana adicional, parecida com a membrana plasmática,
típica deste grupo de bactérias, logo não ocorrendo absorção.
 15

Objetivos
Confeccionar lâminas coradas – coloração diferencial (Gram).
Avaliar a morfologia de microorganismos.
Manusear o microscópio ótico.

Procedimento Experimental
Material:
Lâminas de vidro
Alça de inoculação
Bico de Bunsen
Álcool 70%
Papel toalha
Cristal violeta
Lugol
Solução álcool/acetona
Fucsina
Óleo de imersão
Microscópio

Preparo do esfregaço:

a) Colocar uma gota de água destilada no centro da lâmina e adicionar, usando uma alça
bacteriológica, a cultura microbiana a ser analisada;
b) Espalhe a cultura no centro da lâmina com movimentos circulares, intercalando a passagem da
lâmina na chama do bico de Bunsen;
c) Após fixação da amostra na lâmina, siga a aplicação dos corantes.

Coloração de Gram:

a) Preparar uma lâmina fixada e corar com cristal violeta por 1 minuto.
b) Lavar ligeiramente com água;
c) Cobrir com lugol durante 1 minuto;
d) Descorar com solução de álcool/acetona;
e) Lavar com água;
f) Cobrir com fucsina durante 30-60 segundos;
g) Lavar e enxugar sem esfregar;
h) Observar com imersão e descrever os resultados observados.
 16

AULA PRÁTICA 6: PREPARO DE SOLUÇÃO TAMPÃO

Pré-Relatório
a) Apresente as dissociações que ocorrerão no tampão a ser preparado pelo seu grupo.
b) Demonstre os cálculos dos pHs teóricos para cada uma das combinações da Tabela utilizando a
equação de Henderson-Hasselbalch. Caso o tampão do seu grupo tenha mais de um pKa, justifique
a escolha do pKa foi usado no cálculo.

Introdução

Tampão é uma solução aquosa que resiste a mudança de pH após adição de pequenas
quantidades de ácido (H+) ou base (HO-). Um sistema tampão consiste de um ácido fraco (doador
de prótons) e sua base conjugada (aceptor de prótons). A capacidade tampão de um sistema é
máxima quando a concentração de ácido é exatamente igual a concentração da sua base conjugada.
Atualmente, o conceito de tampão é aplicado nas diversas áreas do conhecimento.
Bioquímicos utilizam tampões devido às propriedades de qualquer sistema biológico ser
dependente do pH. A atividade catalítica das enzimas, por exemplo, é fortemente influenciada pelo
pH e desta forma o controle biológico do pH das células e fluidos biológicos é de importância vital
para o metabolismo e atividade celular.
Além disso, em química analítica e industrial, o controle adequado do pH pode ser essencial
na determinação das extensões de reações de precipitação e de eletrodeposição de metais, na
efetividade de separações químicas, nas sínteses químicas em geral e no controle de mecanismos
de oxidação e reações eletródicas.
A relação quantitativa entre pH, ação tamponante de uma mistura de ácido fraco e sua base
conjugada é dada pela equação de Henderson-Hasselbach. O pH de uma solução tampão pode ser
estimado pela equação de Henderson-Hasselbalch, que é uma forma rearranjada da expressão de
equilíbrio de ionização de um ácido fraco (HA) ou de hidrólise de um ácido conjugado (BH+) de uma
base fraca (B). Respectivamente, representamos os equilíbrios químicos destas soluções tampão
pelas equações químicas:
HA(aq) + H2O(l) H3O+(aq) + A– (aq)
BH+(aq) + H2O(l) H3O+(aq) + B(aq)

Equação de Henderson-Hasselbalch

Objetivos
Preparar soluções tampão e verificar a capacidade tamponante. Calcular o pH, a concentração de
ácido fraco e sua base conjugada envolvidos na preparação de sistemas tampão. Conhecer a faixa
de capacidade tamponante dos tampões acetato, fosfato, citrato-fosfato e carbonato.
 17

Procedimento Experimental
Material por grupo:
2 béqueres de 100 mL
2 balões volumétricos de 100 mL
2 frasco para armazenar solução
2 espátulas
Etiquetas (rótulos)
Balança analítica
Procedimento:
Grupo 1: Preparar 100 mL de solução de acetato de sódio 0,4M e 100 mL de solução de ácido acético
0,4M.

Grupo 2: Preparar 100 mL de fosfato de sódio monobásico 0,15M e 100 mL de solução de fosfato
de sódio dibásico 0,15M.

Grupo 3: Preparar 100 mL de solução de citrato de sódio 0,15M e 100 mL de ácido cítrico 0,15M.

Grupo 4: Preparar 100 mL de ácido cítrico 0,06M e 100 mL de solução de fosfato de sódio dibásico
0,06M.

Grupo 5: Preparar 100 mL de solução de carbonato de sódio 0,12M e 100 mL de solução de

bicarbonato de sódio 0,12M.

A) PREPARO DAS SOLUÇÕES TAMPÃO

Material por grupo:

6 béqueres de 50 mL
2 pipetas graduada de 10 mL
1 pipeta graduada de 1 mL
Potenciômetro
Soluções padrões de calibração (pH 4 e pH7)

a) Preparar os tampões de diferentes valores de pH de acordo com a tabela abaixo:

Béquer Ácido Base pH medido [H+]a [HO-]a pH calculadob
01 2 mL 18 mL
02 5 mL 15 mL
03 10 mL 10 mL
04 15 mL 5 mL
05 18 mL 2 mL
a
Calcular a concentração molar do ácido e da base em cada tampão e anotar nas colunas da tabela.
b
CALCULAR O pH TEÓRICO DAS SOLUÇÕES TAMPÃO EMPREGANDO A EQUAÇÃO DE HENDERSON-
HASSELBACH.
 18

Dados: Ácido acético pKa= 4,73

Ácido fosfórico pKa1= 2,14; pKa2= 7,2; pKa3= 12,4
Ácido cítrico pka1= 3,01; pka2= 4,75; pka3= 5,41
Ácido carbônico pka1= 6,4; pka2= 10,3

b) Após a calibração do potenciômetro com os tampões de referência pH 4,0 e pH 7,0 medir o pH

de cada uma das cinco soluções tampão preparadas.

B) VERIFICAÇÃO DA CAPACIDADE TAMPÃO

a) Em um béquer adicionar 20 mL de água destilada, medir o pH. Adicionar 1 mL de HCl 0,1N e

medir o pH resultante.
b) Adicionar 1 mL de HCl 0,1N no tampão de béquer 03 e medir o pH resultante. Repetir a operação
até observar a mudança do pH do meio.
c) Comentar os resultados.
 19

AULA PRÁTICA 7: CROMATOGRAFIA

Pré-Relatório
a) Escrever a fórmula e a classe dos aminoácidos estudados nessa prática.
b) Qual a previsão da coloração dos aminoácidos na reação com a ninhidrina?
c) Ordene os aminoácidos do menor valor de Rf para o maior.
d) Qual a aplicação industrial do ácido glutâmico/glutamato?

Introdução

Cromatografia é uma técnica utilizada para analisar, identificar ou separar os componentes de

uma mistura. A cromatografia é definida como a separação de dois ou mais compostos diferentes
por distribuição entre fases, uma das quais é estacionária e a outra móvel.
A mistura é adsorvida em uma fase fixa, e uma fase móvel "lava" continuamente a mistura
adsorvida. Pela escolha apropriada da fase fixa e da fase móvel, além de outras variáveis, pode-se
fazer com que os componentes da mistura sejam arrastados ordenadamente. Aqueles que
interagem pouco com a fase fixa são arrastados facilmente e aqueles com maior interação ficam
mais retidos.
Os componentes da mistura adsorvem-se com as partículas de sólido devido a interação de
diversas forças intermoleculares. O composto terá uma maior ou menor adsorção, dependendo das
forças de interação, que variam na seguinte ordem: formação de sais > coordenação > pontes de
hidrogênio > dipolo-dipolo > Van der Waals.
Dependendo da natureza das duas fases envolvidas têm-se diversos tipos de cromatografia:
- sólido-líquido (coluna, camada fina, papel);
- líquido-líquido;
- gás-líquido.

CROMATOGRAFIA EM PAPEL DE FILTRO

Este é o tipo que será utilizado na aula prática. Usualmente, trabalha-se com papel Whatmann,
com a devida especificação (número 4, por exemplo).

Para efeito de facilidade vamos enumerar alguns termos de uso corrente:

a) Cromatografia - consta de papel devidamente tratado, ou seja, cortando de acordo com as

dimensões da câmara onde será colocado, no qual fizemos “manchas” de soluções padrões ou de
soluções problemas.

b) Câmaras cromatográficas - são os recipientes, hermeticamente fechados, onde os

cromatogramas serão desenvolvidos;

c) Linha básica - é a linha traçada, geralmente a três centímetros do bordo inferior do papel, sobre
o qual distribuímos as “manchas” de solutos.
 20

Alguns cuidados que devem ser tomados:

a) antes de ser iniciar o processo cromatográfico, a câmara, contendo a mistura de solvente, já deve
estar saturada de seus vapores,

b) o solvente não deve correr até o bordo superior do papel (cuidado com o tempo de
processamento) e nem tampouco uma pequena distância.
Os tipos de câmara cromatográfica variam de tamanho e forma, desde as mais bem
trabalhadas, até a um simples tubo de ensaio, proveta ou béquer.
As modalidades de cromatografia em papel são as mais variadas possíveis. Temos
cromatografia ascendente e descendente, mono e bidimensional, vertical e horizontal.

Cálculo de Rf ( Fator de Retenção)

Imaginemos o seguinte diagrama

limite até onde o solvente

atingiu

sentido em que b’
o cromatograma
foi desenvolvido d
a’

c’

a b c linha básica

Chama-se de Rf a relação existente entre a distância percorrida pelo soluto (até o centro da
mancha), pela distância total percorrida pelo solvente.

Assim: Rfa = a’/d Rfb = b’/d Rfc = c’/d

Os valores de Rf fornecem uma orientação quanto à distribuição dos solventes ao longo do

papel.

Solventes usados em cromatografia:

De acordo com as substâncias a serem cromatografadas, utilizamos os mais diversos solventes.

 21

Fenol - Água (80: 20)

Usado para cromatografia de aminoácidos. Pode-se inclusive adicionar 40 mg de 8-
hidroxiquinolina de 1 ml de NH4OH concentrado por 100 ml de solvente.

Butanol: H2O (4: 1)

Também empregado na cromatografia de aminoácidos, açúcares etc.

Benzol: butanol: Piridina: H2O (5: 3: 3: 1)

Modos de revelação

a) Pelo uso da luz ultra-violeta: empregado quando os compostos possuem núcleo que revelam o
comprimento de onda no U.V;

b) Uso de reagentes: comumente utiliza-se para açúcares e imersão na seguinte solução: 1 ml de

anilina + 1g de difenilamina + 100 ml de acetona + 10 ml de H2PO4 a 85%.

Para aminoácidos pulveriza-se o papel com solução de ninhidrina a 0,3% em álcool (usado
nesta aula)

Para ácidos orgânicos pulveriza-se o papel com a seguinte solução: 1g de xilose + 3 ml de água
+ 1 ml de anilina + 100 ml de álcool metílico.

Objetivos

Aprender sobre as técnicas cromatográficas;

Entender o processo de separação da cromatografia em papel;
Calcular e interpretar os resultados dos valores de Rf de cada substância analisada no
cromatograma.

Procedimento Experimental
Material por grupo:
Papel de filtro
Aminoácidos padrões
Câmara cromatográfica (ou béquer 250 mL + vidro de relógio)
Capilares de vidro
Ninhidrina a 0,3% em solução alcoólica
Solução Butanol: H2O (4: 1)
Estufa ajustada (60 – 65 0C)
Tesouras

1) Preparação do papel de filtro

Examinar a câmara cromatográfica e planejar as dimensões do papel. Tome muito cuidado
para não tocar o mesmo com os dedos, visto que há contaminação com aminoácidos da mão. Cada
grupo montará um cromatograma.
 22

2) Padrões de aminoácidos: arginina, ácido glutâmico, leucina e prolina

Preparar padrões de aminoácidos 0,01 M e guardá-los no congelador.
Cada grupo receberá três padrões diferentes com a finalidade de comparar estas três manchas
com as produzidas pela amostra problema (esta será fornecida pelo professor).

Montagem do cromatograma
Traçar a linha de base de acordo com as dimensões do papel adaptado ao tamanho da cuba.
Adaptar o cromatograma à câmara tomando sempre o cuidado de não tocá-lo com os dedos.
Distribuir as soluções a serem analisadas nos pontos marcados no papel para a aplicação das
amostras.
Em seguida, fazer a aplicação dos padrões e da amostra problema usando capilares de vidro.
Secar as manchas (sem soprar) conforme instruções dadas pelo professor.
Deixar o cromatograma correndo até que o solvente atinja um pouco abaixo do bordo superior
do papel.
Em seguida, retire o papel da cuba e deixe secar. Após a secagem, pulverizar ninhidrina a 0,3%
em solução alcoólica. Levar o cromatograma à estufa à temperatura de 60 – 65 oC (ou a uma chapa
de aquecimento) até aparecimento de manchas coloridas.

Determinação do Rf:
Marcar o limite até onde o solvente atingiu (front).
Medir a distância da linha básica até o “front” (d), marcar o centro das manchas A, B, C e D.
Verificar as distâncias dA, dB, dC, e dD, que vão desde a linha básica até o centro de A, B, C e D.
Calcular os Rfs:

dA dB
Rfa = Rfb =
d d

Calcule os Rfs de cada aminoácido, avalie os resultados e compare com os dados do pré-relatório.
 23

AULA PRÁTICA 8: CARACTERIZAÇÃO DA UREASE

Pré-Relatório
a) Qual é a reação catalisada pela urease?
b) Qual é a fonte de urease utilizada nos experimentos?
c) Como pode ser evidenciada a natureza proteica da enzima?
d) Explique o uso do indicador ácido-base vermelho de fenol no teste de atividade da enzima?
e) Qual é a justificativa para se empregar um tampão diluído (1 mM) na incubação para medida da
atividade de urease?
f) Explique o que ocorrerá quando a enzima for previamente fervida?
g) Qual o efeito do mercúrio sobre as enzimas?

Introdução

As enzimas, como todas as proteínas, são sintetizadas pelas células e constituem catalisadores
muito mais eficientes do que os catalisadores inorgânicos.
Os catalisadores são substâncias que aceleram a velocidade de uma reação química, sem serem
consumidos no processo. Embora toda a estrutura da molécula seja necessária para o papel
catalítico, a ligação com o substrato dá-se apenas numa porção bem definida da enzima – o sítio ou
centro ativo, formado por alguns resíduos de aminoácidos presentes na cadeia polipeptídica, que
se aproximaram devido aos dobramentos inerentes da estrutura terciária. Portanto, a estrutura e
a forma do centro ativo são uma decorrência da estrutura tridimensional da enzima e podem ser
afetadas por quaisquer agentes capazes de provocar mudanças conformacionais na estrutura
protéica, como variação de pH, temperatura, compostos orgânicos como uréia, etc.
A urease ocorre em algumas bactérias e plantas e pode facilmente ser extraída de soja (Glycine
max). A urease catalisa a hidrólise da uréia em amônia e dióxido de carbono.

H2N
C=O + H2O → CO2 + 2 NH3
H2N

Uréia → dióxido de carbono + amônia

Em meio aquoso:
2 NH3 + 2 H2O → 2 NH4OH (hidróxido de amônio)

CO2 + H2O + NH4OH → (NH4)2CO3 + 2 H2O (carbonato de amônio)

Somando-se as reações, tem-se:

(NH2)2CO + 2 H2O → (NH4)2CO3

uréia carbonato de amônio

A atividade da enzima pode ser verificada pela formação de carbonato de amônio, que é um
sal de caráter básico e cuja presença pode ser revelada por meio de um indicador ácido-base como
 24

vermelho de fenol. O indicador passa de cor amarela em meio ácido ou neutro para cor vermelha
em meio básico.
A enzima é específica para o substrato uréia, não utilizando um composto estruturalmente
análogo como a tiouréia.
NH2
C=S tiouréia
NH2

Como a urease contém grupos sulfidrila, a enzima é inibida por íons de metais pesados como
sais de mercúrio em concentrações reduzidas (10-4 mmol/L).

Objetivos
Demonstrar a natureza protéica da enzima;
Determinar qualitativamente a atividade enzimática;
Mostrar desnaturação protéica;
Exemplificar inibição enzimática;
Demonstrar a especificidade da ação enzimática.

Procedimento Experimental

REATIVOS
Solução de urease
Ácido nítrico concentrado
Tampão fosfato 1 mmol/L, pH 7,0
Tampão fosfato 1 mmol/L, pH 7,0, contendo 1 % de uréia
Tampão fosfato 1 mmol/L, pH 7,0, contendo 1 % de tiouréia
Reativo do biureto
Cloreto de mercúrio a 0,01%
Vermelho de fenol

Material:
10 tubos de ensaio + galeria (estante de tubos de ensaio) para cada grupo
1 pipeta graduada de 2 mL
1 pipeta graduada de 1 mL
3 pipetas graduadas de 5 mL
3 conta-gotas
Béquer de vidro de 600 mL
Aquecedor elétrico

PREPARO DOS REATIVOS

1. Reativo do biureto: dissolver 1,5 g de sulfato de cobre pentaidratado e 6 g de tartarato
duplo de sódio e potássio em 500 mL de água destilada. Adicionar cuidadosamente 300 mL
de hidróxido de sódio a 10 g% (p/v) com constante agitação e completar o volume para 1 L
com água destilada.
 25

2. Preparo da solução de vermelho de fenol: dissolver 0,1 g de vermelho de fenol em 250 mL

de água destilada alcalinizada com 2,82 mL de NaOH 0,1 mol/L.
3. Extração de urease de soja: pesar 15 g de farinha de soja e colocar em erlenmeyer de 250
mL. Adicionar 100 mL de glicerol a 75% em água. Arrolhar o erlenmeyer e agitar a suspensão
com a mão por 15 minutos. Colocar no refrigerador até o dia seguinte. Filtrar o extrato
glicericerinado através de gaze espremendo levemente com um bastão. A solução de
urease assim obtida é estável por cerca de seis anos quando conservada em refrigerador.

CARACTERIZAÇÃO DA ENZIMA
I. Reação do Biureto
Em um tubo marcado “A”, colocar 2 gotas da solução de uréase e juntar 2 mL de do reativo de
biureto. Misturar. Em um tubo marcado “B”, colocar 2 gotas de água destilada e 2 mL do reativo de
biureto. Misturar. Comparar a cor nos dois tubos e concluir o resultado.

II. Teste de atividade da enzima

Utilizar dois tubos de ensaio e marcar “A” e “B”. No tubo A colocar 3 mL de tampão fosfato 1
mmol/L, pH 7,0, contendo 1% de uréia e 2 gotas de urease. No tubo B (branco) colocar 3 mL de
tampão fosfato 1 mmol/L pH 7,0, sem uréia e 2 gotas de urease. Em ambos os tubos adicionar uma
gota de solução de vermelho de fenol. Agitar e observar se há mudança de cor em 5 minutos, sendo
que a reação processa-se melhor a 370C. Concluir o resultado.

III. Efeito do calor

Em um tubo de ensaio colocar 2 mL de água destilada e 2 gotas de urease. Agitar e ferver
durante 15 minutos. Adicionar 3 mL de tampão fosfato 1 mmol/L, pH 7,0, contendo 1 % de uréia, e
1 gota da solução de vermelho de fenol. Misturar e aguardar 15 minutos. Observar e comparar o
resultado com aquele do teste II.

IV. Efeito de sais de mercúrio

Em um tubo de ensaio colocar 2 mL de água destilada, 2 gotas da solução de urease, agitar e
juntar cuidadosamente 3 gotas de cloreto de mercúrio a 0,01%. Agitar e adicionar 3 mL de tampão
fosfato 1 mmol/L, pH 7,0, contendo 1% de uréia e 1 gota da solução de vermelho de fenol. Misturar
e aguardar 5 minutos. Comparar o resultado com aquele do teste II.

V. Especificidade da enzima
Utilizar dois tubos e marcar “A” e “B”. No tubo A colocar 3 mL de tampão fosfato 1 mmol/L,
pH 7,0, contendo 1% de uréia e 2 gotas de urease. No tubo B juntar 3 mL de tampão fosfato 1
mmol/L, pH 7,0, contendo tiouréia e 2 gotas de urease. Em ambos os tubos adicionar 1 gota da
solução de vermelho de fenol. Agitar e aguardar 5 minutos. Comparar o resultado com aquele do
teste II.

Compare os resultados obtidos na prática com os dados do pré-relatório.

 26

AULA PRÁTICA 9: EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ÓLEO DE COCO

Pré-Relatório
a) Como é realizada a extração comercial de óleo de coco?
b) Quais as características físico-químicas desejadas para que o óleo de coco seja comercializado?
c) O que é índice de saponificação e o que essa análise representa no controle de qualidade de
óleos e gorduras?
d) Qual o rendimento médio da extração de óleo de coco e quais as variáveis que influenciam nesse
rendimento?

Introdução

O coco é o fruto de Cocus nucifera (família Arecaceae), uma árvore originária da Ásia. Como
matéria-prima para diversas indústrias (alimentos, cosmética, têxtil), o coco cumpre um importante
papel socioeconômico. A polpa do coco seco ou copra contém mais de 60% de óleo que pode ser
extraído por diversos métodos. Além de rico em ácido láurico, o óleo de copra não sofre degradação
a altas temperaturas.
O índice de saponificação é o número mg de hidróxido de potássio (KOH) necessário para
saponificar 1 g de gordura ou óleo. A reação de saponificação (Figura 7.1) pode estabelecer o grau
de deterioração e a estabilidade, verificar se as propriedades dos óleos estão de acordo com as
especificações e identificar possíveis fraudes e adulterações. O índice de saponificação é um indício
da quantidade relativa de ácidos graxos de alto e baixo peso molecular. O valor encontrado para o
índice de saponificação correspondente a uma dada massa de lipídios que varia inversamente com
a massa molar dos resíduos de ácidos graxos. Na reação representada na Figura 7.1, três moléculas
de KOH são necessárias para neutralizar 3 ácidos graxos liberados pela hidrólise dos triacilgliceróis,
não importando o tamanho da cadeia dos ácidos graxos. Os lipídios possuem duas frações a
saponificável e a insaponificável. A fração insaponificável é constituída pelas vitaminas
lipossolúveis, pró-vitaminas, esteroides e outros compostos.

Figura 7.1: Reação de saponificação de um triacilglicerol.

Objetivos
Extrair e caracterizar o óleo de copra (polpa do coco).

Procedimento Experimental
Material:

Coco seco, béquer de vidro, forno de micro-ondas, faca de bom corte, liquidificador, funil, garrafa
plástica, balão e elástico, tesoura, coador, bacia.
 27

1 Erlenmeyer de 250 mL, Bureta, Proveta de plástico de 50 mL, 2 conta-gotas, Solução de KOH
alcoólica, Banho-maria fervente, Solução de HCl 0,5 mol.L-1, Fenolftaleína.

Procedimento:

Extração do óleo de coco

1. Furar os “olhos” do fruto para retirar a água.
2. Abrir os cocos.
3. Retirar e picar a polpa em pequenos pedaços.
4. Bater a polpa com a água do próprio coco no liquidificador até que se forme uma pasta.
5. Espremer esta pasta em uma bacia, separando a massa do leite de coco.
6. Com um funil, transferir o leite de coco para uma garrafa plástica e deixar em local escuro por
cerca de 48 horas (Fermentação).
7. Colocar a garrafa na geladeira, onde o óleo de coco e a polpa formarão uma camada sólida na
parte superior.
8. Com uma tesoura, abrir a garrafa e retirar a mistura sólida de óleo e polpa.
9. Aquecer até o óleo ficar líquido, “fritando” a parte da polpa que sobrou.
10. Filtrar o óleo, separando-o da polpa.
11.Conservar ambos os produtos na geladeira.

Caracterização do óleo de coco

1. Calcular o rendimento (V/m% e m/m%) do procedimento;

2. Determinar o ponto de fusão do óleo extraído;
3. Determinar o índice de saponificação
O índice de saponificação é expresso em mg de KOH necessário para neutralizar os ácidos
graxos de 1 g de gordura ou óleo.
Em um erlenmeyer de 250 mL rigorosamente limpo e seco, pesar cerca de 1 g de lipídio. Em
seguida, adicionar 20 mL de KOH alcoólica. Levar o sistema ao banho-maria fervente por 20
minutos. Retirar do banho e titular ainda quente com HCl 0,5 mol.L-1 usando 2 gotas de fenolftaleína
como indicador.
Realizar uma prova em branco usando 20 mL de KOH alcoólica aquecido (cerca de 5 minutos
no banho-maria fervente) e titular com HCl 0,5 mol.L-1, usando a fenolftaleína como indicador.

Cálculo

I.S. = (VB – vA).MKOH.56,1 / m(g)

VB = mL de HCl gasto na titulação do branco
VA = mL de HCl gasto na titulação da amostra
m = massa da amostra (g)
MKOH = molaridade do KOH (0,5 mol.L-1)

Como o índice de saponificação é expresso em mg de KOH, a fórmula já contém as transformações

do volume e da massa.
 28

A Codex Alimentarius, 2005 fornece os seguintes valores de I.S.:

Produto Índice de saponificação

Óleo de soja 189-195
Óleo de milho 187-193
Óleo de girassol 188-194
Óleo de amendoim 188-195
Óleo de arroz 181-189
Óleo de algodão 189-198
Azeite de oliva 186-196
Azeite de dendê 195-205
Gordura de coco 250-264
Gordura do leite 219-234

Compare os resultados encontrados na prática com os dados do pré-relatório e com o Codex

Alimentarius. Justifique as diferenças e interprete.
 29

AULA PRÁTICA 10: DETERMINAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES

Pré-Relatório
a) O que é um açúcar redutor?
b) Descreva a reação entre um AR e a solução de Fehling que ocorrerá nos ensaios experimentais.
c) Qual a diferença entre AR e ART em uma amostra?
d) Qual a importância de saber os valores de AR e ART de um produto?

I- PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE FEHLING

Materiais:
sulfato de cobre
tartarato duplo de sódio e potássio
hidróxido de sódio
sacarose previamente seca em estufa
ácido clorídrico concentrado
1 pipeta de 2 mL
3 espátulas
2 balões volumétricos de 50 mL por grupo
1 balão volumétrico de 200 mL (ou 250 mL) por grupo
1 proveta de 50 mL por grupo
2 pipetas de 5 mL graduadas para cada grupo
1 erlenmeyer de 250 mL por grupo
1 bureta de 25 mL por grupo com suporte
4 béqueres de 600 mL
Aquecedor elétrico
Papel medidor de pH
Pérolas de vidro
Azul de metileno
1 conta-gotas

SOLUÇÃO A:
Dissolver 3,46 g de sulfato de cobre em água destilada, e completar o volume a 50 mL.

SOLUÇÂO B:
Dissolver 17,3 g de tartarato duplo de sódio e potássio (sal de Rochelle) em água destilada,
adicionar 10 mL de uma solução contendo 5 g de hidróxido de sódio e completar o volume a 50 mL.

SOLUÇÃO PADRÃO DE GLICOSE:

Preparar 100 mL de uma solução padrão de glicose, de forma que Cada mL desta solução
corresponda a 0,005 g de glicose.

PADRONIZAR A SOLUÇÃO DE FEHLING COM A SOLUÇÃO PADRÃO DE GLICOSE:

Transferir com uma pipeta volumétrica, 5 mL da solução A e 5 mL da solução B para um
erlenmeyer de 250 mL, formando 10 mL da solução de Fehling. Colocar uma barra magnética em
cada erlenmeyer e aquecer a solução. Titular a quente usando como indicador o azul de metileno
para confirmar o ponto de virada.
 30

II - DETERMINAÇÃO DE REDUTORES TOTAIS EM UMA AMOSTRA

Materiais:
Suco de fruta industrializado (caixinha)
Conta-gotas
1 béquer de 50 mL por grupo
1 balão volumétrico de 250 mL (ou 200 mL) por grupo
1 bureta de 25 mL por grupo
2 pipetas graduadas de 5 mL por grupo
1 erlenmeyer de 250 mL por grupo
Barra magnética
1 aquecedor elétrico ou chapa de aquecimento por grupo
Azul de metileno

PARTE 1: DETERMINAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES (AR)

PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO AMOSTRA:

Adicionar 10 mL do suco de fruta em um balão volumétrico de 100 mL. Completar o volume do
balão utilizando água destilada. Agitar por inversão, liberando a pressão. Passar a solução para uma
bureta.

TITULAÇÃO A QUENTE:
Transferir para um erlenmeyer de 250 mL com auxílio de pipetas volumétricas, 5,0 mL da
solução A e 5,0 mL da solução B, formando 10 mL do reativo de Fehling. Colocar pérolas de vidro
no erlenmeyer e aquecer a solução até a ebulição.
Proceder à titulação gota a gota, mantendo a mistura em ebulição. Próximo do
desaparecimento da cor azul do sulfato de cobre, interromper a titulação e adicionar 2 a 3 gotas de
azul de metileno.
Manter a ebulição e completar a titulação até a mudança da cor azul para vermelho tijolo
(Ponto de Viragem), tempo estimado de 1 min. Colocar mais uma gota do indicador para confirmar
a viragem e anotar o volume gasto na bureta.

PARTE 2: DETERMINAÇÃO DOS AÇÚCARES REDUTORES TOTAIS (ART)

Materiais:
Suco de fruta industrializado (caixinha)
Conta-gotas
1 béquer de 50 mL por grupo
1 balão volumétrico de 250 mL (ou 200 mL) por grupo
1 bureta de 25 mL por grupo
2 pipetas graduadas de 5 mL por grupo
1 erlenmeyer de 250 mL por grupo
HCl concentrado
1 pipeta graduada de 1 mL
Papel medidor de pH
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NaOH
Barra magnética
1 aquecedor elétrico ou chapa de aquecimento por grupo
Azul de metileno

PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO AMOSTRA

Adicionar 5 mL do suco de fruta em um balão volumétrico de 100 mL, juntar 50 mL de água
destilada. Adicionar 1 mL de HCL concentrado. Aquecer a mistura por 10 min a 75 oC. Arrefecer e
neutralizar a solução usando hidróxido de sódio. Completar o volume do balão com água destilada.
Passar a solução para uma bureta.

TITULAÇÃO A QUENTE:
Proceder conforme técnica descrita no procedimento da determinação de AR.

Calcular o valor de açúcares redutores e expressar em termos de % de glicose. O mesmo fazer para
os açúcares redutores totais. Comparar com os valores informados no produto analisado.
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AULA PRÁTICA 11: FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA COM LEVEDURAS

Pré-Relatório
a) Descreva o caminho bioquímico da sacarose presente no caldo de cana até a formação do etanol
pela levedura.

Introdução

A fermentação alcoólica decorre da via catabólica da frutose-1,6-bifosfato, degradativa da

glicose. Esta degradação serve a todos os seres vivos, com exceção de algumas bactérias, para a
obtenção de energia e síntese de biomoléculas para construção da célula.
A degradação da glicose, a glicólise, transcorre nas células fermentativas e naquelas que
utilizam o açúcar até CO2 e ácido pirúvico. A descarboxilação do ácido pirúvico a acetaldeído e a
redução deste a etanol, a fermentação alcoólica, ocorre nas leveduras (Saccharomyces cerevisiae)
e em alguns actinomicetos. No entanto, as leveduras podem também degradar o ácido pirúvico
para obter energia metabolicamente utilizável, liberando CO2 e H2O através do ciclo dos ácidos
tricarboxílicos.
O etanol, também chamado álcool etílico ou simplesmente álcool, obtido por fermentação
pode competir como carburante com a gasolina, sendo obtido por via biotecnológica pouco custosa
a partir de matérias-primas baratas. Por exemplo, no Brasil utiliza-se a cana de açúcar em grande
escala, não só para a obtenção de açúcar, mas também para empregar diretamente na fermentação
alcoólica. O etanol assim obtido é misturado a 75% (v/v) de gasolina para o emprego como
combustível de motores de explosão, contribuindo para o melhor desempenho da gasolina. Os
resíduos que contém açúcar podem ser fermentados para obtenção de energia.
A utilização do álcool combustível automotivo no Brasil ganhou importância na década de 70
com o lançamento do Programa do Álcool (Proálcool), criado pelo decreto 76.593/75, cuja
finalidade estratégica foi substituir parte da gasolina consumida no mercado interno, reduzindo,
assim, as importações de petróleo.
Atualmente a produção de álcool no Brasil se faz quase que exclusivamente por fermentação
de mosto, constituído por caldo de cana ou melaço, ou ainda por misturas destes dois
componentes. Alguns macronutrientes e/ou micronutrientes também são adicionados ao mosto, a
fim de complementar as deficiências do meio, quanto a certos elementos indispensáveis às
leveduras para uma máxima transformação dos açúcares. O microrganismo agente da fermentação
mais utilizado é um fungo leveduriforme, S. cerevisiae.
A reação genérica que melhor representa a formação de etanol através de fermentação pela
levedura S. cerevisiae é:
C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2

Objetivos
Produzir etanol por via biotecnológica usando levedura de panificação.

Procedimento Experimental

I. Preparar a solução a fermentar:

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Cada grupo deve trazer para o laboratório 200 a 250 mL de caldo de cana-de-açúcar extraído
no dia ou no máximo no dia anterior e acondicionado em geladeira.
Colocar a solução em um vaso de volume apropriado, fechar o vaso com um sistema que libere
os vapores durante a fermentação.
Medir o teor de açúcares através do 0Brix conforme descrito no item II (abaixo).
Adicionar 0,2 g de levedura e agitar suavemente a mistura.
Incubar a mistura de fermentação a temperatura ambiente e acompanhar o processo
fermentativo até a estabilização do 0Brix.
Determinar o teor de etanol produzido conforme descrito no item III (abaixo).

II. Determinação do 0Brix

Determinar o valor do 0Brix usando um refratômetro antes e durante o processo fermentativo.
A fermentação será finalizada quando o valor do 0Brix estabilizar (máxima variação admitida = 0,2).

III. Determinação da produção de etanol

Destilar 50 mL do produto fermentado e analisar o produto da destilação quanto ao conteúdo
de etanol usando um ebuliômetro.