O SEU GUIA PARA UM ENSAIO ELISA BEM SUCEDIDO

NDICE
Introduo
Programa de Desenvolvimento Programa de Controlo de Qualidade

Informaes Gerais
Antes de comear Informaes acerca do procedimento a ter com as amostras

Tcnicas
Lavagens Pipetagens

Se a sua questo acerca de...

Tratamento de amostras Preciso/Reprodutibilidade Curva Padro Efeito de margem Desvio Revelao do sinal

INTRODUO Na R&D Systems, o objectivo fornecer imunoensaios de qualidade que garantam a mais elevada performance. Os programas de desenvolvimento e de controlo de qualidade so concebidos por forma assegurar a mais elevada qualidade dos imunoensaios. Cada kit submetido a rigorosos testes de validao e estabilidade, por forma a assegurar que a preciso, fidelidade, sensibilidade e especificidade, e que os resultados obtidos sejam reprodutveis durante a validade do kit e de lote para lote.

Programa de Desenvolvimento
Seleco cuidadosa de pares de anticorpos para uma performance ptima. Microplacas revestidas com uma preciso com coeficiente de variao (CV) inferior a 10%. Reaces-cruzadas e interferncias testadas num painel de at 100 factores. Determinao da sensibilidade. Solues de diluio formuladas especialmente para aliviar interferncias devidas a fenmenos de matriz e interaces de anticorpos heteroflicos. Correlao com os standards NIBSC/WHO, quando disponveis. Optimizao da performance com todos os tipos de amostras.

Programa de Controlo de Qualidade

A preciso intra e inter-ensaio deve ter um CV inferior a 10%. Os controlos devem estar de acordo com as especificaes estabelecidas. Ligaes no-especficas, standard inferior e sinais de standard elevados devem estar de acordo com as especificaes estabelecidas. A sensibilidade, determinada pelo ensaio mltiplo do standard zero, enquadrase nos padres estabelecidos Os standards devem coincidir com os calibradores padro dentro das especificaes estabelecidas.

ANTES DE COMEAR As falhas dos imunoensaios podem ser atribudas a muitos factores. A maioria dos erros tcnicos podem ser evitados se o protocolo do kit for devidamente cumprido. Verificar a data de validade do kit, o qual no dever ser utilizado aps a expirao da data de validade indicada no rtulo. Verificar as condies de armazenamento de cada componente e assegurar que todos os componentes foram armazenadas de acordo com o indicado no protocolo do kit. Verificar se as solues dos reagentes apresentam sinais de instabilidade ou degradao (por ex., precipitao ou descolorao). Alguns reagentes, tais como as solues de diluio de calibrao ou as solues de diluio das amostras, podem estar desenhadas contendo precipitados. Misture todos os reagentes cuidadosamente, antes de os adicionar placa. Dependendo da natureza do precipitado, pode ser necessrio misturar continuamente enquanto se procede a adio placa. Assegurar que os tempos e temperaturas de incubao sejam cumpridos. No substituir reagentes dos kits ou misturar kits de diferentes lotes. Quando se misturam ou reconstituem solues proteicas, deve-se evitar a formao de espuma. Determine quais as amostras que vo ser ensaiadas e preserve a integridade das amostras utilizando tcnicas asspticas. Documente a configurao do ensaio antes de o iniciar. Reuna todo o material necessrio (ex. pipetas, pontas, tubos de ensaio, lavador, leitor de microplacas) antes de comear o ensaio.

Limpar a bancada onde o ensaio se ir efectuar. Se os controlos forem fornecidos com o kit, certifique-se que estes so sempre efectuados em cada ensaio. Se os controlos no forem fornecidos com o kit, existem controlos comercialmente disponveis. Contacte os servios Tcnicos.

TCNICAS DE LAVAGEM A correcta lavagem das microplacas um ponto crtico e muito importante no decorrer de qualquer ensaio ELISA. Uma lavagem eficiente da placa essencial. Quando diluir o tampo de lavagem concentrado, utilize gua desionizada ou destilada.

Dispositivo de lavagem ou pipeta multicanal

Assegure-se de que o seu dispositivo de lavagem tem boa presso ou que cada ponta da pipeta est a debitar correctamente. Verifique as strips na microplaca, por forma a assegurar que ficam bem seguras no suporte da placa. Numerar as strips pode ser uma prtica til, no caso destas se separarem durante a decantao. Primeiro, esvazie o contedo da placa por decantao. Encha cada poo com o volume de tampo de lavagem especificado no folheto informativo do produto. Se o protocolo exigir tempo de actuao, programar um despertador para o tempo total requerido para o tampo penetrar nos poos. Decantar os poos, invertendo a placa sobre papel absorvente. Repetir este processo, tal como indicado no folheto informativo. Aps a ltima decantao, remover o tampo de lavagem remanescente, invertendo a placa e batendo com esta sobre papel absorvente colocado numa superfcie dura. No deixar os poos a secar e proceder imediatamente ao prximo passo do folheto informativo do kit.

Dispensador mltiplo ou lavador automtico

Acoplar o dispensador ou o lavador automtico a uma fonte de vcuo apropriada (verificar as indicaes do produtor). Assegurar que cada canula ou ponta est a debitar e a aspirar correctamente. Primeiro, esvaziar o contedo da placa, por aspirao ou decantao. Encher cada poo com o volume de tampo de lavagem indicado no folheto informativo do kit. Se o protocolo exigir tempo de actuao, programar um despertador para o tempo total requerido para o tampo penetrar nos poos. Aspirar completamente os poos, assegurando-se de que no ficaram resduos de tampo de lavagem. No aspirar demasiado os poos, deixando o aparelho de aspirao permanecer nos poos aps a remoo do lquido. Repetir este processo, de acordo com o indicado no protocolo. Aps a ltima decantao, remover o tampo de lavagem remanescente, invertendo a placa e batendo com esta sobre papel absorvente colocado numa superfcie dura. No deixar os poos a secar e proceder imediatamente ao prximo passo do folheto informativo do kit. Lavagens demasiado rpidas ou lentas, aspirao ou lavagens incompletas e deixar os poos permanecer secos, so factores que afectam a preciso do ensaio.

TCNICAS DE PIPETAGEM Assegure-se de que todas as pipetas esto convenientemente calibradas. Para verificar a calibrao, pipetar 10 replicados de gua desionizada com o valor mnimo da pipeta (segundo o fabricante). O CV dos 10 replicados deve ser inferior a 2-3%. Repetir o processo usando o volume mximo da pipeta. Se os CVs forem superiores a 2-3%, repetir o procedimento. Se os CVs se mantiverem acima de 23%, a pipeta necessita de reparao antes do ensaio.

Modo de pipetagem positivo

Regule a pipeta para o volume desejado. Lave previamente a ponta da pipeta no reagente ou amostra. Pressione o embolo at primeira paragem. Puxe o lquido devagar, at que o embolo retorne posio superior. Nunca deixar o embolo saltar. Esperar um momento para que o lquido atinja o equilbrio volumtrico na ponta. Dispensar o lquido at primeira paragem e depois , com cuidado, at segunda. Segurar o embolo nesta posio at que a pipeta seja retirada do reservatrio/ poo, por forma a evitar voltar a puxar o lquido. Ao remover a ponta da pipeta do reservatrio/poo, faa deslizar a ponta no lado do reservatrio/poo para libertar qualquer lquido que possa estar no lado exterior da ponta.

Pipetagem inversa
Para reduzir erros provocados pela tenso superficial do lquido, este mtodo recomendado. Regule a pipeta para o volume desejado. Lave previamente a ponta da pipeta no reagente ou amostra. Pressione o embolo at segunda paragem. Puxe o lquido devagar, at que o embolo retorne posio superior. Nunca deixar o embolo saltar. Esperar um momento para que o lquido atinja o equilbrio volumtrico na ponta. Dispensar o lquido apenas at primeira paragem. Segurar o embolo nesta posio at que a pipeta seja retirada do reservatrio/ poo, por forma a evitar voltar a puxar o lquido. Ao remover a ponta da pipeta do reservatrio/poo, faa deslizar a ponta no lado do reservatrio/poo para libertar qualquer lquido que possa estar no lado exterior da ponta.

Pontas de pipetas
A chave para a preciso na pipetagem uma tcnica consistente. Velocidade consistente e suavidade durante a pipetagem, so essenciais. Evite movimentos bruscos quando puxa ou dispensa os lquidos. Verifique que a ponta da pipeta est colocada correctamente na pipeta e com presso adequada. Mude de ponta de pipeta entre cada amostra ou adio de reagente.

No pipete volumes inferiores aos aconselhados pelo fabricante. Isso iria provocar o decrscimo da preciso e reproductibilidade. Alguns lquidos tm tendncia para ficar agarrados s paredes interiores ou exteriores das pontas das pipetas. Para evitar variaes nos volumes dispensados causados por esta tenso superficial, efectue uma pr-lavagem da ponta da pipeta com a amostra ou reagente. Isto melhorar a preciso quando pipetar. Se o reagente a pipetar viscoso, espere um momento aps puxar o lquido, para permitir que o volume atinja o equilbrio, antes de remover a ponta da pipeta do reservatrio. Aps puxar o lquido para o interior da ponta, retire a ponta da soluo e limpe o exterior da ponta com um tecido sem pelos. Se aparecer uma bolha de ar na ponta enquanto puxa o lquido, debite o lquido de volta para o reservatrio e volte a pipetar o lquido a um ritmo mais lento. Se as bolhas de ar aparecerem uma segunda vez, substitua a ponta da pipeta. Se se formar espuma na ponta enquanto puxa o lquido, poder ser necessrio segurar a pipeta num ngulo pouco acentuado e puxar o lquido mais devagar. Utilize reservatrios separados para cada reagente.

TRATAMENTO DE AMOSTRAS

1- Armazenamento
Posso colher as minhas amostras antes do dia do ensaio? Sim, a no ser que o contrrio seja indicado pelo folheto informativo do kit. Se as amostras no puderem ser ensaiadas imediatamente, faa alicotas e guarde as amostras a < -20C ou de acordo com as instrues do folheto informativo do kit. Evitar congelamento-descongelamento repetidos. Para congelamento a <-20C, recomenda-se a utilizao de um congelador regulvel.

2- Preparao
Tenho que preparar as amostras pelo mtodo indicado no protocolo do kit? As preparaes recomendadas das amostras foram testadas para obteno de recuperao e performance ptimas, em cada ensaio. Recomenda-se que as preparaes sejam efectuadas de acordo com o delineado no protocolo do kit. Posso utilizar uma amostra de plasma, em vez da amostra recomendada?

Cada ensaio foi validado para o procedimento descrito. Certos anticoagulantes no so recomendados nalguns ensaios. Siga as instrues do kit. As plaquetas contm alguns analtos, pelo que se recomenda plasma pobre em plaquetas. Siga as instrues do kit relativas s colheitas apropriadas de amostras. Posso utilizar os meus prprios tampes/solues de diluio? Cada kit contm solues de diluio formuladas de modo a combinar com tipos especficos de amostras. Assegure que utiliza a soluo de diluio correcta para o tipo de amostra a testar. Siga as instrues do kit. Indicaes teis Determine quais as amostras a ensaiar e utilize tcnicas assticas durante a colheita e preparao. Se forem vrias as amostras a testar, mantenha as amostras separadas e claramente etiquetadas, para evitar contaminao cruzada. Antes do ensaio, centrifugue as amostras para retirar partculas. Transfira cada amostra para um novo tubo e misture para assegurar homogeneidade. Quando necessitar de agitar amostras, utilize um tubo cuja capacidade seja pelo menos 50% superior ao volume da amostra, para que possa ocorrer uma mistura adequada. No tenho soluo de diluio suficiente para todas as minhas amostras. Que posso fazer? fornecida soluo de diluio suficiente, se o protocolo fr seguido. Presume-se que todos os standards e amostras sejam testados em duplicado. Se no for sugerida uma diluio ou se for necessria uma diluio superior, calcule a quantidade de soluo necessria antes de efectuar o ensaio. Pode obter soluo adicional, se contactar os servios tcnicos.

3- Outras questes
Posso utilizar outro tipo de amostra diferente do recomendado no protocolo do kit? O kit foi validado para para os tipos de amostras listados no respectivo folheto informativo. Outros tipos de amostras, para alm das validadas, no foram testadas. Contacte os servios tcnicos para mais informaes.

4- Valores das amostras

Ensaiei os controlos, mas estes esto fora dos limites. O que significa isto? Se ensaiou os controlos, a concentrao destes tem que se situar nos limites especificados. Se os valores dos controlos esto fora dos limites, o ensaio tem que ser considerado invlido. Assegure-se de que os controlos foram devidamente reconsttuidos. Posso utilizar os dados das amostras do kit como referencia? Os dados relativos s amostras fornecidos no folheto do kit, foram gerados a partir de uma populao muito limitada de individuos e devem ser apenas utilizados como orientaes gerais. Posso ler as minhas amostras fora da curva standard? No. Os valores das amostras devem ser determinados a partir da curva standard gerada em cada ensaio. Como posso determinar a concentrao das minhas amostras a partir de uma curva standard feita mo? Para determinar a concentrao de cada amostra, primeiro saiba qual o valor da absorvncia ou unidade relativa de luz (RLU) no eixo Y e projecte uma linha horizontal at curva standard. No ponto de interseco, projecte uma linha vertical ao eixo X e leia a concentrao correspondente. Como posso compensar a diluio ou a concentrao das minhas amostras? Se as amostras foram diludas, o valor lido a partir da curva standard deve ser multiplicado pelo factor de diluio. Se as amostras forem concentradas, o valor obtido a partir da curva standard deve ser dividido pelo factor de concentrao. Como posso converter o valor da minha amostra para unidades? Se o standard NIBSC/WHO estiver disponvl, haver uma equao de converso na seco Calibrao do folheto informativo do kit. Aplique o valor da amostra equao para converter pg/mL ou ng/mL em unidades. As minhas amostras geraram valores fora dos limites dinmicos do ensaio. Posso usar estes valores? recomendado utilisar apenas os valores das amostras que se situem dentro dos limites da curva standard utilizada. Os valores fora destes limites so geralmente no-lineares, o que pode conduzir a extrapolaes incorrectas. Amostras que originem valores superiores ao standard mais elevado, devem ser diludas e o seu ensaio repetido.

Se as amostras se situam abaixo do limite inferior do ensaio, a amostra deve ser considerada no-detectvel. A minha curva standard parecia boa, mas no obtive sinal na minha amostra quando esperava obter, porqu? A amostra poder no conter o analito. Um efeito de matrix poder ter mascarado a deteco. Assegure-se que a diluio recomendada foi efectuada de acordo com o protocolo do folheto informativo do kit. Se foi recomendada uma diluio, assegure-se que esta foi efectuada correctamente. Uma diluio exagerada pode levar a que a amostra caia abaixo do limite inferior da curva standard. PRECISO/REPRODUTIBILIDADE A preciso de um imunoensaio definida como a reprodutibilidade entre os poos de um ensaio (intra-ensaio) e entre ensaios (inter-ensaios). Baixa preciso, determinada por elevados CVs, muitas vezes causada por dois factores principais: tcnica de pipetagem e tcnica de lavagem.

1- Tcnica de pipetagem
Necessito misturar os reagentes nos poos? Sim, quando so pipetados vrios reagentes para um poo (por ex. diluente de ensaio e amostra). Pipetar reagentes e amostras para o centro de cada poo. Bater levemente na microplaca para assegurar a mistura dos reagentes. A minha amostra/reagente viscoso e no est a ser devidamente pipetada. O que posso fazer? Espere um momento para permitir que o volume atinja o equilibrio antes de remover a ponta da pipeta do reservatrio. Lave previamente a ponta da pipeta com o reagente para compensar a tenso superficial. Pistas para uma boa pipetagem Volumes inadequados ou desiguais nos poos, so uma boa indicao de que a pipeta necessita ser calibrada. Verifique o funcionamento da pipeta e recalibre se necessrio. Assegure-se que troca sempre de ponta de pipeta entre reagentes, standards e amostras para evitar carryover ou contaminao cruzada.

Assegure-se de que a ponta da pipeta est bem colocada. Uma ponta de pipeta mal ajustadapode no puxar ou debitar o volume com preciso. Ao remover a ponta da pipeta do poo, faa deslizar a ponta na beira do poo para remover qualquer lquido que permanea na parte de fora da ponta. Siga as instrues das Tcnicas de Pipetagem.

2- Tcnica de lavagem
Pistas para uma boa lavagem Se utilizar um lavador automtico, dispositivo de aspirao ou uma pipeta multi-canal, assegure-se sempre de que cada canula est a debitar ou a aspirar correctamente. Aps a ltima lavagem, decante qualquer Tampo de Lavagem remanescente, invertendo a microplaca contra papel absorvente, numa superfcie dura. Siga as instrues das Tcnicas de Lavagem. Lavar os poos muito depressa ou demasiado devagar, pode originar falta de preciso. No deixar que os poos permaneam secos. Proceder imediatamente ao passo seguinte do protocolo. Posso utilizar menos Tampo de Lavagem? Utilizar menos tampo de lavagem conduz frequentemente a maus CVs. Assegure-se que os poos so lavados com o volume especificado no protocolo do kit, para assegurar que cada poo devidamente lavado. Fiquei sem Tampo de Lavagem. Posso usar Tampo de Lavagem de outro kit? Nem todos os tampes de lavagem so identicos. Contacte a Assistncia Tcnica. Posso saltar o tempo recomendado no passo da lavagem? Nalguns ensaios recomenda-se um tempo entre lavagens. Saltar este passo ou diminuir este tempo pode originar baixa preciso. Siga sempre as instruces do kit para uma performance ptima. Posso reduzir o nmero de lavagens? Recomenda-se que o nmero de lavagens especificado no protocolo do kit seja cumprido. Modificar o nmero de lavagens pode afectar a preciso do ensaio.

3- Vrios
Posso utilizar o mesmo reservatrio para pipetar todos os meus reagentes?

No. Utilize recipientes separados para cada reagente para evitar contaminaes. Alguns analitos so muito susceptveis a contaminaes (por ex. Saliva, reagentes oxidveis, etc.). Consulte o folheto informativo do kit. Observe as precaues necessrias para proteger os reagentes do kit. Posso reutilizar o selante da microplaca? Um selante de placa usado pode conter resduos do passo anterior que pode contaminar o componente actual do poo, conduzindo a baixa preciso. Use um novo selante para a placa para cada incubao, tal como recomendado no folheto informativo do kit.

CURVA STANDARD

1- Preparao
Posso alterar a preparao dos meus standards? No. Reconstituir o standard com o volume apropriadode Diluente de Calibrao ou gua desionizada, tal como indicado no protocolo do kit. Quando misturar ou reconstituir standards, evitar sempre fazer espuma. Deixe sempre os standards a repousar durante pelo menos 5 minutos (ver folheto informativo do kit) aps reconstituio. Misture com cuidado antes de utilizar. Certifique-se de que todos os slidos ficaram bem dissolvidos, antes da utilizao. Quando preparar a curva standard, assegure-se que a diluio da srie de standards foi precisa. Mude sempre de pontas de pipetas entre diluies. Misture bem as solues antes da transferncia seguinte. Posso diluir os standards noutro meio que no o do Diluente de Calibrao? Outros meios podem conter substncias que afectam os resultados da curva standard. O meio pode ser ensaiado como amostra controlo. Quando reconstituir o standard ou preparar a curva standard, use o Diluente de Calibrao que representa mais aproximadamente o tipo de amostra. Consulte o folheto informativo do kit.

2- Tcnica
De que forma que a lavagem afecta a minha curva standard? A lavagem/aspirao incompleta de poos pode causar baixa preciso, a qual poder resultar em maus resultados na curva standard. Certifique-se de que o dispositivo de lavagem funciona correctamente e que os poos foram devidamente aspirados sem terem ficado a secar durante algum tempo. Consulte as Tcnicas de Lavagem.

De que forma que a pipetagem afecta a minha curva standard? Pipetagem inconsistente pode resultar em maus replicados entre poos, conduzindo a elevados Cvs e a uma m curva de calibrao. Uma pipeta mal calibrada pode originar erros de diluio durante a preparao da curva standard, o que pode causar desvios na curva ou gerar uma curva no-linear. Assegure-se de que a pipeta est a funcionar convenientemente. Volumes desiguais debitados em diferentes poos so um indicador de um possvel mau funcionamento de uma pipeta, ou incorrecta aplicao da sua ponta. Consulte as Tcnicas de Pipetagem.

3- Outros
O software do meu computador no consegue fazer a reduo recomendada dos dados. Posso utilizar outra? Sim, contudo cada ensaio foi optimizado utilizando um determinado tratamento dos dados, especificado no protocolo do kit. A utilizao de diferentes mtodos de tratamento dos dados. Pode originar um desvio aos resultados. Como alternativa ao software do computador, pode traar a densidade ptica dos standards no eixo Y versus a concentrao dos standards no eixo X. Os dados podem ser linearizados utilizando papel logartmico e pode ser aplicada uma regresso linear transformao logartmica. Se no tiver disponvel papel logartmico, linearize os dados traando o log das concentraes versus o log das D.O.. A melhor linha para o grfico, pode ser determinada por regresso linear. Como determino a concentrao da minha amostra a partir do meu grfico traado mo? Para determinar a concentrao de cada amostra, primeiro procure o valor da absorvncia ou RLU no eixo Y e trace uma linha horizontal a partir desse ponto at curva standard. No ponto de interseco, trace uma linha vertical at ao eixo X e leia a concentrao correspondente. Se as amostras tiverem sido diludas, a concentrao lida a partir da curva standard tem que ser multiplicada pelo factor de diluio. Posso usar a curva standard do folheto informativo do kit para ler as minhas amostras? No. As curvas standard que constam do folheto informativo do kit, so representativas de resultados tpicos. Por cada grupo de amostras ensaiado deve ser gerada uma curva standard. Posso alterar os tempos de incubao de acordo com o meu horrio? Alterar os tempos de incubao ou temperaturas, pode impedir que as reaces do ensaio atinjam o equilibrio ou desenvolvam em excesso, o que pode

conduzir a alteraes da configurao da curva. Siga sempre os tempos e temperaturas recomendados. Posso gerar apenas uma curva standard quando ensaio simultaneamente vrias microplacas? Quando so ensaiadas amostras em vrias placas, deve-se fazer uma curva standard em cada placa. A variabilidade de placa para placa ocorre frequentemente devido a erros tcnicos ou diferentes condies de incubao/ambientais entre as placas. As amostras devem ser determinadas a partir de uma curva standard efectuada exactamente nas mesmas condies das amostras ou os valores podero ser invlidos. A minha curva standard ficou horizontal ou no-linear. O que pode ter acontecido? H muitos factores que podem estar na origem destes problemas. Os factores seguintes so os mais comuns: Certifique-se que foram efectuadas as diluies correctas. Consulte o folheto informativo do kit. Assegure-se de que foram usados os comprimentos de onda e respectivas correes apropriados. Os standards e as amostras devem ser adicionados aos poos no espao de 15 a 20 minutos (salvo indicao contrria contida no folheto informativo do kit). Verifique se o background elevado. Certifique-se de que a placa foi lavada correctamente. Uma lavagem inadequada pode originar uma curva standard horizontal com sinal muito elevado. Consulte as Tcnicas de Lavagem. Leia sempre a placa dentro da janela de leitura indicada no folheto informativo do kit. Ler uma placa fora dos tempos de leitura sugeridos, pode levar a resultados falsos. Se o standard mais elevado estiver a originar leituras acima dos limites do leitor de microplacas, assegure-se que os standard foram correctamente reconstituidos e que os tempos de incubao e temperaturas foram respeitados. Teste sempre os standards em duplicado para se assegurar da preciso.

Se os controlos foram ensaiados, a concentrao dos controlos deve situar-se dentro dos limites especificados. Certifique-se que os reagentes no foram contaminados durante a preparao do ensaio ou na incubao.

Para uma curva standard horizontal com muito pouco sinal pode ser uma indicao de que o conjugado enzimtico ou substrato no est a funcionar bem. Para testar a performance destes componentes consulte, frente, Desenvolvimento de Sinal Falha de performance no conjugado ou substrato. Devido s limitaes de muitos luminmetros, recomenda-se que os standards sejam ensaiados em duplicado, do mais elevado para o mais pequeno, comeando com o standard mais elevado nos poos A1 e A2.

EFEITO DE MARGEM O efeito de margem definido como uma diferena bvia entre o sinal dos poos exteriores da microplaca em comparao com o sinal dos poos interiores, e em geral atribudo a dois factores:

1- Temperatura
So realmente importantes as condies a que incubo a minha microplaca? Sim. Incubar a microplaca num local em que h variaes de temperatura em redor da superfcie de trabalho, pode originar um efeito de margem. Siga sempre as temperaturas de incubao recomendadas. Evite efectuar o ensaio num local em que a temperatura tenha tendncia para variar muito. Se tiver disponvel, incube a microplaca num ambiente controlado, como um incubador. Todos os reagentes devem estar temperatura ambiente antes de serem usados ( salvo indicao em contrrio). Consulte o folheto informativo do kit. Verifique a temperatura da bancada em que o ensaio vai ser realizado. Se no obtiver curva, a superfcie bancada pode estar muito mais fria que a temperatura do ar.

2- Selantes das placas

No fim do perodo de incubao, notei que o selante da microplaca levantou num dos lados. Como pode isto afectar os meus resultados? Os selantes que no so aplicados correctamente podem conduzir a um efeito de margem. Os poos exteriores que no esto cobertos, podem estar expostos a condies ambientais, como correntes de ar e de temperatura, contaminao do conjugado ou substrato, ou evaporao de reagentes. Certifique-se sempre que o selante aderiu devidamente microplaca, pressionando firmemente o selante ao longo dos bordos da placa.

DRIFT OU DESVIO

O drift define-se como uma alterao notria no sinal, quer do lado direito para o lado esquerdo da microplaca, ou do topo para o fim da microplaca.

1- Preparao do ensaio
Comecei a preparar o meu ensaio e fui interrompido. Como que isto poder afectar os meus resultados? A interrupo da preparao de um ensaio pode levar a um padro de desvio na microplaca. Certifique-se que todos os standards e amostras estejam preparados antes de comear a pipetar. Pipete sempre os reagentes para a microplaca no espao de 15 a 20 minutos (salvo indicao em contrrio do protocolo do kit). Necessito de uma pipeta multicanal? Quando debita reagentes como o substrato, conjugado ou Diluentes de Ensaio, prefervel usar uma pipeta multicanal ou de repetio.

2- Reagentes
O que acontece se no aquecer os meus reagentes? Reagentes frios podem levar a diferenas de temperatura entre poos, o que pode causar uma variao de sinal ao longo da placa. Os reagentes devem ser sempre aquecidos at temperatura ambiente antes de serem utilizados, excepto indicao contrria do folheto informativo do kit. Cada ensaio foi optimizado para os tempos e temperaturas de incubao indicados. Reagentes frios geralmente necessitam de um aumento dos tempos de incubao. Siga sempre os tempos e temperaturas de incubao recomendados.

3- Selantes das microplacas

Necessito utilizar os selantes da microplacas? Siga as instrues do folheto informativo do kit. Se o protocolo do ensaio recomenda a utilizao do selante da microplaca, verifique se esse selante aderiu correctamente aos bordos da microplaca. Se o selante da microplaca levantou nalgum local, pode-se verificar uma diferena no sinal.

4- Tempo de leitura
Como que as definies do luminmtero influenciam os meus resultados? Nos ensaios quimioluminescentes, ler a mais de ou igual a 2.0 segundos/poo produzir um desvio, por causa da diferena entre o tempo de leitura do primeiro e do ltimo poo. Durante a reaco do substrato, a peroxidase de rbano reciclada at no haver mais substrato disponvel. medida que o tempo passa, menos substrato est disponvel e a produo de luz ser afectada. Programe o luminmetro para um tempo de leitura de1.0 segundo/poo.

5- Incubao
Posso alterar os tempos de incubao de acordo com o meu horrio? A alterao dos tempos ou temperaturas de incubao podem impedir que o ensaio atinja o ponto de equilbrio, ou que este seja ultrapassado. Siga sempre os tempos e temperaturas de incubao recomendadas. Se estiver a realizar vrios ensaios em simultneo, aconselhvel cronometrar cada placa individualmente para evitar uma incubao excessiva ou insuficiente.

DESENVOLVIMENTO DO SINAL O desenvolvimento do sinal pode ser afectado por diversos factores: substrato, incubao conjugado ou problema do substrato, comprimento de onda, e instrumentos.

1- Substrato
Posso alterar a preparao do substrato? Se a soluo substrato requer mistura, assegure que o volume correcto de cada reagente do substrato adicionado e misturado cuidadosamente. A soluo substrato j misturada deve ser usada no espao de 15 minutos (at 4 horas nos ensaios quimioluminescentes). Se o substrato for misturado cedo demais, a cor pode comear a desenvolver-se no reservatrio. Se o subtrato fr liofilizado ou usadas tabletes, dissolva completamente com o volume de diluente apropriado, tal como indicado no folheto informativo do kit. Misture cuidadosamente e utilize no espao de tempo indicado no protocolo do kit. Preciso pipetar o meu substrato por alguma ordem em especial? Os reagentes devem ser empre pipetados na mesma ordem ao longo do ensaio. Ensaios de alta sensibilidade utilizam um sistema de amplificao. O amplificador deve ser adicionado aos poos aps a incubao do substrato e pipetado na mesma ordem que o substrato. Aps pipetar o substrato para os poos, bata levemente na microplaca para misturar bem. possvel contaminar o Substrato? Sim. Se o ensaio utilizar um conjugado marcado de fosfatase alcalina ou de peroxidade de rbano, deve-se ter cuidado para evitar contaminao do substrato

durante o ensaio. A contaminao do substrato pode originar valores que excedem os limites do leitor da placa. Evite contacto com metais ou reagentes oxidantes. Use um recipiente de reagente novo. Tenho que incubar o Substrato no escuro? No, mas evite colocar a placa sob luz directa durante a incubao.

2- Incubao
Posso alterar a incubao? Cada ensaio foi optimizado para as temperaturas e tempos de incubao indicados. Alterar tempos e temperaturas de incubao, pode originar desenvolvimento de sinal muito fraco ou muito elevado. Se efectuar ensaios mltiplos ao mesmo tempo, faa a cronometragem do tempo para cada placa individualmente para para evitar uma incubao excessiva ou insuficiente. Como que a temperatura afecta o meu sinal? Quer a fosfatase alcalina, quer a peroxidade de rbano, so enzimas sensveis temperatura. As unidades da densidade ptica (D.O.) ou unidades relativas de luz (RLU) podem variar com alteraes da temperatura. Evite que a incubao das placas ocorra em reas onde as condies ambientais variem muito (por exemplo, com calor ou vento, em parapeitos de janelas onde a temperatura e a luz podem variar bastante ao longo do ensaio).

3- Problema com o conjugado ou substrato

Para assegurar que conjugados de enzimas e substratos funcionem correctamente: Em ensaios colorimtricos: Misturar iguais volumes de conjugado e soluo substrato (nos kits de alta sensibilidade, adicionar iguais volumes de conjugado e substrato. Aps 1 minuto, adicionar um volume igual de amplificador). A cor deve desenvolverse imediatamente. Se a cor no se desenvolver, verifique se os componentes foram guardados nas temperaturas indicadas, no esto contaminados e esto dentro do prazo de validade. Em ensaios quimioluminescentes: Adicionar 10 l conjugado a 190 l de substrato. Verifique a produo de luz usando um luminmetro. Se no se produziu luz, verifique que os componentes foram guardados temperatura correcta, no esto contaminados, e se se encontram dentro do prazo de validade.

4- Comprimento de onda
Necessito usar correco do comprimento de onda? Para ensaios colorimtricos, sim. Este procedimento corrigir imperfeies pticas da placa. O que posso fazer se o meu leitor de placas no tiver a correo do comprimento de onda disponvel? Ler a placa em ambos os comprimentos de onda e subtrair as leituras da correco do comprimento de onda s leituras do comprimento de onda primrio. Esta subtraco corrigir o efeito das imperfeies pticas na placa. O meu leitor de placas no tem o filtro recomendado para a correco do comprimento de onda. Posso substituir? Sim, desde que o comprimento de onda escolhido seja superior ao recomendado para a correco do comprimento de onda. O meu leitor de placas no tem o filtro recomendado para a leitura primria do comprimento de onda. Posso substituir? O comprimento de onda da leitura primria determinado pelo substrato usado e respectivo pico de absorvncia da cor resultante. Leia sempre nos comprimentos de onda recomendados. Se no fr de todo possvel, escolha o comprimento de onda mais prximo; Contudo pode haver uma variao significativa do sinal.

5- Instrumentos
Porque que as minhas Unidades Relativas de Luz (RLUs) no so comparveis s do folheto informativo do kit? Os RLUs podem variar significativamente entre luminmetros, pois os produtores no standardizaram a medio das unidades de luz. Os valores que derivam dos RLUs devero ser comparveis. Use os settings para o luminmetro sugerido ou settings equivalentes se usar um luminmetro diferente. Alterar os parmetros pode originar uma diferena no sinal. Leia dentro da janela de tempo sugerida. Os ensaios quimioluminescentes so cinticos e no so parados. O sinal varia com a janela de tempo de leitura.

6- Outros
Segui o protocolo mas no obtive sinal. O que pode ter acontecido? Adicionou o reagente de stop placa? Nos ensaios colorimtricos que utilizam substrato com HRP, a adio da soluo stop altera a cor do substrato. O comprimento de onda recomendado est optimizado para esta cor. Misture os reagentes dos poos, batendo levemente na placa. Quando adcionar a soluo stop, a cor muda de azul para amarelo (se fr um substrato HRP). O substrato pode mudar para verde se os reagentes no forem misturados nos poos. Os reagentes podem ter sido adicionados pela ordem errada. No lavar a placa aps a adio da soluo substrato. Verifique que o standard adicionado quando fizer as diluies em srie para a curva standard. Se o sistema substrato usar dois componentes, estes tm que ser misturados. Consulte as instruces do kit relativamente sua preprao. Verifique se os settings do leitor da placa esto correctos. Verifique se os reagentes, standards e amostras foram corectamente preparados e adicionados aos poos de acordo com o protocolo do kit. Nos kits de alta sensibilidade (HS), verifique se os foram utilizados os diluentes apropriados para reconstituir o substrato e o amplificador.

O que poder causar rudo de fundo elevado (NSBs)? Alterar tempos ou temperaturas de incubao. Lavagem inadequada. Contaminao de componentes. Contaminao da placa durante a incubao Reutilizar os selantes das placas, recipientes ou pontas de pipetas, pode originar contaminaes.