AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE REMOÇÃO DE TOLUENO EM ÁGUAS

RESIDUARIA SINTÉTICA POR FUNGO FILAMENTOSO

Nívea SANTOS (1); Raquel MARINHO (2); Zuleika BEZERRA (3); Kelly RODRIGUES (4);
Glória MARINHO (5)

(1) Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Ceará – IFCE, Av: Treze Maio nº 2081, 33073750 e-
mail: nivea.cefetce@yahoo.com.br
(2) Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Ceará – IFCE, e-mail: raquelmarinho@ifce.edu.br
(3) Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Ceará – IFCE, e-mail: zuleikabezerra@ifce.edu.br
(4) Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Ceará – IFCE, e-mail: kelly@ifce.edu.br
(5) Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Ceará – IFCE, e-mail: gloriamarinho@ifce.edu.br

RESUMO

É comprovado que a prática de refino de petróleo gera uma quantidade significante de resíduos
potencialmente poluidores. Quando lançados em corpos hídricos os efluentes das indústrias petrolíferas
causam grandes desequilíbrio ambiental, por transportarem compostos de difícil degradação. No intuito de
minimizar os impactos causados pelos despejos desses efluentes, torna-se prioritário estudar a
biodegradabilidade e a toxicidade de tais resíduos. A produção de enzimas extracelulares pelos fungos torna
viável a sua utilização em processos de tratamento biológico. Assim sendo o objetivo deste trabalho foi
estudar a remoção de tolueno de água residuária sintética por Aspergillus niger AN400A, em reatores em
batelada com aeração artificial. Para o estudo foram utilizados reatores em duplicata, sendo dois de controle
(RC), contendo apenas o efluente, dois reatores com o efluente mais a biomassa fúngica dispersam (RF) e
dois reatores contendo glicose (concentração de 0,5 mg/L) e fungo (RFG). Os tempos de reação investigados
correspondem a períodos de 0 hora, 1 dia, 5 dias, 10 dias, 15 dias e 25 dias. Para o acompanhamento do
processo foram analisadas as variáveis de: demanda química de oxigênio (DQO), pH (Potencial
Hidrogeniônico), sólidos suspensos voláteis (SSV) e tolueno. Não foi detectado picos de Tolueno no Método
de Cromatografia Líquida. Os valores de pH variaram entre 7 e 8 para quase todos os tempos de reação
estudados. Houve 56% de remoção de DQO no RFG e 41% no RF, ambos no 15º dia de reação. Os
resultados dos sólidos suspensos voláteis, 0,8 de mg de SSV/L para RF mg e 0,97 de SSV/L para RFG, que
representam o crecimento de biomassa, corroboram o melhor resultado de remoção de matéria orgânica
obtido no reator RFG, pois quanto maior quantidade de microrganismos maior será a requisição por
alimento, consequentemente maior a remoção de matéria orgânica da água residuária. Oportunamente, o
emprego da espécie Aspergillus niger AN400 sinaliza como uma tecnologia viável para o tratamento de
efluente de indústria petroquímica.
Palavras-chave: Aspergillus niger AN 400, tratamento biológico, tolueno, reatores em batelada.
1. INTRODUÇÃO

O tratamento de efluentes da indústria de petróleo é uma prática extremamente necessária, principalmente se

o destino final for o descarte no meio ambiente, tendo em vista o alto volume gerado, bem como sua
composição complexa, chegando mesmo a conter, em alguns casos, material radioativo (Vegueria et al.,
2002).

O processo de refinamento do petróleo utiliza 246 a 340 litros de água por barril de óleos crus (ALVA-
ARGÁEZ; KOKOSSIS; SMITH, 2007), isso gera uma quantidade de água quase duas vezes equivalente ao
volume de óleo processado. No processo de transformação do material bruto em outros produtos como
diesel, lubrificantes, gasolina etc (DUPUIT et al, 2007) é empregado para o refino uma grande variedade de
solvente com diferentes graus de solubilidade para a extração de substancias desejáveis (ALVA-ARGÁEZ;
KOKOSSIS; SMITH, 2007).

Segundo Alva Argáez; Kokossis e Smith (2007); Stepnowski et al (2002) e Stringfellow; Alvarez- Cohen
(1999) o processo de refino ou transformação do petróleo gera efluentes com grandes diversidades de
poluentes orgânicos e inorgânicos, onde inclui-se os hidrocarbonetos poliaromáticos e alifáticos, sulfetos,
cianetos, compostos fenólicos e amônia que podem ser tóxicos para muitos organismos e ter um grande
potencial cancerígeno (SANTAELLA et al, 2008). Mesmo quando presentes em concentrações inferiores às
letais os compostos tóxicos presentes nos despejos das refinarias de petróleo podem causar danos tanto à
biota aquática quanto a terrestre (SANTAELLA et al, 2008).

Um dos poluentes orgânicos da composição do petróleo são os hidrocarbonetos que estão presentes
tanto na composição da matéria orgânica animal como vegetal, isso lhes confere um grande
potencial como indicadores dos níveis do material, seja de origem natural ou antrópica (COIMBRA,
2007). Dentre os hidrocarbonetos existentes podemos citar benzeno, tolueno e xileno que são
relativamente solúveis em água e estão presentes em pequenas quantidades de hidrocarboneto
aromáticos polinucleares de alto peso molecular.

O tolueno é um solvente utilizado como matéria prima na produção de TNT (2,4,6 trinitrotolueno), ácido
benzóico, cloreto de benzila e TDI (tolueno diisocianato) é também muito usado na produção de tintas,
vernizes, adesivos, etc. Por ser um solvente altamente volátil pode ser encontrado após 10 segundo de
inalação pelo trato respiratório (ROBERTS et al, 2007: LEITE, 2003; BRUCKNER e WARREN 1996). Esse
composto é cancerígeno e sua presença em águas mesmo em baixas concentrações traz importantes riscos
ambientais.
O resultado dessa preocupação é o aumento nas pesquisas sobre processos biológicos e sobre
microrganismos capazes de degradar compostos do petróleo para com isso avaliar a biodegradação desses
tipos de compostos e assim ter um monitoramento eficiente e conseqüentemente proteger o ambiente de
potenciais contaminações. (PHELS e YOUNG, 2001).
Ultimamente os fungos têm sido muito empregados nos tratamentos biológicos, pois são seres capazes de
reciclar compostos como melanina, celulose, entre outros, que é de difícil degradação, removendo-os da água
e ainda se mostram bastantes versáteis no metabolismo de xenobióticos (PRENAFETA BOLDU, 2002).

Esses microrganismos crescem e sobrevivem em meios com elevadas concentração de compostos

recalcitrantes e utilizam os mesmos como fonte de energia (EGGEN; MAJCHERCZYK, 1998; ESPOSITO;
AZEVEDO, 2004; OLIVEIRA et al, 2006), produzem enzimas extracelulares oxidativas, que quebrar
compostos policíclicos aromáticos de cadeia longa em compostos assimiláveis ao seu metabolismo. A
intensidade dessa atividade aumenta com a adição de um substrato primário, de fácil assimilação, como a
glicose (SAMPAIO et al, 2004).

Segundo Eggen e Majcherczyk (1998), os fungos filamentosos são os mais eficientes na produção de
enzimas extracelulares oxidativas (proteases, celulases, ligninases, lactases, entre outras). Dentre eles, o
Aspergillus niger tem eficiência comprovada para degradação de compostos recalcitrantes em efluentes de
indústria farmacêutica, indústria de azeite de oliva, indústria de castanha de caju, cervejarias, refinarias de
petróleo e em água para remoção do pesticida agrícola paration (FÉLIX et al, 2006; FREITAS NETO et al,
2007; GARCIA et al, 2000; HERNÁNDEZ et al, 2006; MIRANDA et al, 1996; SANTAELLA et al, 2002;
SANTOS et al, 2006; VASSILEV et al, 1997), trabalhando em uma faixa ótima de pH entre 3,0 e 4,0
(GRIFFIN, 1994).

A capacidade de adaptação dos fungos confere aos mesmos inúmeras vantagens sobre as bactérias quando da
utilização em sistemas de tratamento de águas residuárias (SANTELLA, 2008).

Na busca de novas tecnologias de biorremediação, esta pesquisa propõe a utilização de fungos como
Aspergillus niger AN400 em reatores biológicos, operados em regime de batelada, visando à remoção de
matéria orgânica e compostos de difícil degradação de meio aquoso sintético, simulando água de refinaria de
petróleo contaminada por tolueno. Pois outras pesquisas mostram que a espécie Aspergillus niger possui uma
grande eficiência comprovada, para degradação de compostos recalcitrantes e remoção de DQO
(RODRIGUES, 2006).

2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Cultivo e produção dos esporos de Aspergillus niger AN400
Os esporos de Aspergillus niger AN400 foram cultivados, em placas de Petri estéreis (Figura 1), no
Laboratório de Tecnologia Ambiental (LATAM) do CEFETCE, contendo 15 mL de meio de cultura
Sabouraud, meio específico para crescimento dos fungos, sendo uma mistura de peptonas, agar-ágar, 2% de
dextrose e glicose, o qual foi previamente esterilizado a 122oC, durante, 15 minutos. Adicionou-se ainda às
placas, solução de Vischiniac (solução de nutrientes), na concentração de 1 mL/L de meio de cultura, como
fonte de nutrientes para os fungos (SAMPAIO, 2005).
Após a solidificação do meio de cultura, os esporos foram inoculados nas placas e estas foram mantidas sob
temperatura de 28oC por 7 dias.
A remoção dos esporos foi realizada com solução Tween 80, e a suspensão de esporos formada foi removida
com uso de pipeta automática, previamente esterilizada, e transferida para frasco de 200 mL, e mantida sob
refrigeração.

Figura 1 – Cultivo dos esporos de aspergillus niger AN400

2.2. contagem dos esporos

A suspensão de esporos foi descongelada e agitada para melhor homogeneização. A contagem dos esporos
foi efetuada em microscópio óptico, com aumento de 40 vezes, retirando-se do frasco 50 µL da suspensão de
esporos, a qual foi diluída em solução Tween 80, na diluição de 1:20. Em seguida foram removidos 20 µL da
suspensão de esporos e transferido para câmara de Neubauer para contagem.
A partir da concentração resultante da suspensão mãe de esporos (2,9 x 109 esporos/mL), foram calculados
os volumes a serem adicionados aos reatores, na concentração de 2 x 106 esporos/mL.

2.3. Água sintética

A água sintética residuária utilizada era composta por água de torneira, acrescida de 1 ml/L de Vischiniac
(solução de nutrientes), 0,05 g/L de cloranfenicol e tolueno na concentração de 100 mg/L.

2.4. reatores em batelada

Foram utilizados 30 reatores de vidro constituídos de frascos cilíndricos, com tampa rosqueável e com
volume total de 2,5 L, e volume útil de 1,5 L. Os quais foram previamente desinfetados com ácido clorídrico
3 M.
Para a concentração de tolueno estudada (100 mg/L), formou-se um grupo de reatores em duplicata
composto por: 2 reatores de controle (RC), contendo apenas a água sintética residuária; 2 com água sintética
residuária e fungos (RF) e 2 com água sintética residuária, fungos e 0,5 g/L de glicose (RFG), como
mostrados na Figura 2.
Os reatores com fungo e os com fungo e glicose continham biomassa dispersa. Foram testados os seguintes
tempos de reação: 0 hora, 1dia, 5 dias, 10 dias, 15 dias e 25 dias.

Figura 2 – Reatores em batelada com biomassa dispersa2.5. Variáveis

As variáveis analisadas foram: DQO (demanda química de oxigênio), concentração de tolueno, pH

(potencial hidrogeniônico), SSV (sólidos suspensos voláteis) de acordo com APHA (1998), exceto tolueno,
cuja determinação foi realizada por cromatografia liquida (HPLC Gilson mod. 321, equipado com detector
UV-VIS), coluna Varian Microsorb – MV 100-5 C18 250 x 4.6 mm, sistema isocrático com fase móvel
metanol/água (60:40 v/v), λ = 260 nm, Q = 0.075 mL/min e volume de injeção de 50 µL.

3. RESULTADOS E DISCUSSÕES

3.1. Potencial Hidrogeniônico (pH)

A figura 3 representa a variação de pH nos reatores operados em batelada. Observou-se que houve uma
diminuição em todos os reatores, porém nos reatores com glicose os valores de pH foram menores, isso
ocorreu devido a maior produção de ácidos orgânicos a partir do consumo de glicose (ASSAS et al, 2002).
 8

7,5
variação de pH

6,5
0 5 10 15 20 25 30

Tempo reacional (dias)

RC RF RFG

Figura 3- Valores do pH nos reatores biológicos RC, RF e RFG para cada tempo de reação
investigados.

De acordo com Assas et al (2002) o tratamento de efluente da industria de azeite de oliva utilizando
Geotrichum candidum foram obtidos resultados semelhantes onde atribuí a essa diminuição de pH
a geração de ácidos orgânicos. Ao utilizar reatores com Aspergillus ninger e Fusarium sp Rodrigues
et al (2004) também obtiveram redução inicial de pH, sendo que essa redução de pH foi mais rápida
nos reatores com glicose quando comparados aos demais reatores, resultante de uma atividade
microbiana mais intensa. Valores de pH baixos são resultados da atividade metabólica do
Aspergillus ninger. Em tratamento biológico, o pH da água residuária a ser tratada deve ser
controlado, para que a atividade dos microrganismos mantenha-se em um nível ótimo.

O pH ótimo para o desenvolvimento dos fungos encontra-se na faixa entre 4 e 6 (Griffin,1994) porém, a
maioria dos fungos filamentosos tolera variações de pH entre 2,0 e 9,0. Os valores de pH mais adequados
para a atividade de Aspergillus niger são aqueles próximos de 4 (DACERA; BABEL, 2008; KYRIACOU et
al, 2005; Mishra; Lata, 2004).

A presença de glicose influenciou no aumento da concentração de biomassa no interior dos reatores

RFG o que é evidenciado pelo aumento de sólidos suspensos voláteis (SSV) e consequentemente a
produção de ácidos orgânicos foi maior nos mesmo, onde foram registrados os menores valores de
pH, como resultado da intensa atividade microbiana (FADIL et al 2003).
Segundo Wheller et al. (1991), o gênero Aspergillus niger desenvolve-se bem em faixas de pH variando
entre 3,30 e 7,50.
Segundo Coral et al. (2002) constatou-se em seu estudo que a enzima carboximetil celulase, produzida pela
espécie Aspergillus niger Z10, teve ótima atividade numa ampla faixa de pH entre 3 e 9, sendo seu maior
pico de atividade nos valores de pH 4,4 e 7,5.
3.2. Sólidos suspensos volatéis (SSV)
Houve aumento significativo de crescimento de biomassa nos reatores com fungo (RF) atingindo 0,8 mg/L e
nos com fungo e glicose (RFG), 0,9 mg/L de SSV com cinco dias de reação. Nestes reatores também houve
uma diminuição dos valores, apresentando-se com 0,4 mg/L no RF e 0,8 mg/L no RFG ao final do
experimento (Figura 4). Essa diminuição da biomassa após alcançar um crescimento máximo ocorreu,
provavelmente, devido à exaustão de nutrientes no meio (RODRIGUES, 2006).
É possível que, a presença de glicose tenha promovido uma adaptação do fungo à água residuária, o que
possibilitou melhores condições para que o crescimento da biomassa fosse maior no reator com fungo e
glicose do que no reator com fungo (DAMASCENO, 2008).
1

0,9

0,8

0,7

0,6
SSV mg/L

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tempo reacional (dias)

RC RF RFG

Figura 4 – Variação de SSV nos reatores biológicos RC, RF e RFG para cada tempo de reação
investigados.

3.3. Demanda química de oxigênio (DQO)

Os valores de DQO iniciais foram de: 72,9 mg/L para o reator C; 139,4 mg/L para o reator F; 432,6 mg/L;
864,7 mg/L para o reator FG. O melhor resultado de remoção de matéria orgânica dos reatores F foi
sinalizado no 15º dia de reação totalizando 41 % e dos reatores FG no 15º dia de reação com 56%.
Tabela 1 – Eficiência de remoção de DQO (%) nos reatores biológicos RC, RF e RFG para cada tempo
de reação investigados.

Tempos de Reação
Reator 1d 5d 10d 15d 25d

C 112 199 51 45 45

F 37 16 7 41 34

FG 49 33 25 56 58

Rodrigues (2006) diz que a glicose por ser um composto mais facilmente degradado, resulta em um aumento
mais rápido da biomassa, e, conseqüentemente, da eficiência de remoção de matéria orgânica, devido seu
maior consumo pela população microbiana. Como está evidenciado nos resultados da Tabela 1.
Neste e em outros trabalhos, comparou-se o tratamento de águas residuárias com e sem a adição de glicose
(substrato) sobre a eficiência do tratamento observando-se que a biodegradação de matéria orgânica foi mais
significativa quando do uso deste sacarídeo. Rodrigues (2006) relata remoções de DQO de 27% sem o uso da
glicose e 100% com a utilização do substrato primário, e Félix et al. (2006) conseguiu valores de 59% sem
glicose e 82% com glicose. Segundo os autores acima Griffin (1994) e Esposito e Azevedo (2004), a adição
de glicose favorece o metabolismo fúngico aumentando a eficiência de remoção de matéria orgânica.
Mishra e Lata (2004) que estudaram a influência do pH na remoção de DQO de água residuária de indústria
alimentícia, tratada com Aspergillus niger e Aspergillus foetidus, concluíram que houve maior remoção de
DQO em pH 6,0, embora houvesse maior atividade amilolítica em pH 4,0.

3.4. Tolueno
A análise foi realizada, mas não foi detectado picos de tolueno.

4. Conclusões
A glicose foi importante no inicio do crescimento dos fungos, para a adaptação dos microorganismos à água
residuária com tolueno. A comunidade microbiológica formada, na fase do experimento, em reator em
batelada utilizando micélio fúngico, com predomínio da espécie fúngica Aspergillus níger AN 400, mostrou-
se viável à remoção de DQO. A presença do substrato teve influência na remoção de DQO, obtendo
resultados positivos. Em relação à detecção de tolueno, possivelmente, ocorreu a adsorção do composto nos
frascos onde se armazenou as amostras para posterior análise, ou por se tratar de um composto volátil e com
parcial solubilidade em água, a aeração artificial pode ter contribuído para que este tenha se volatilizado,
ocorrendo assim à impossibilidade de sua detecção.

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AGRADECIMENTO
Agradeço à Professora Glória Marinho pela orientação, ao LATAM (Laboratório de Tecnologia Ambiental),
local onde foi realizado o experimento.