TEMA 12: TIPOS DE FERMENTADORES Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez I.

INTRODUCCION El objetivo de la biotecnologa es obtener productos metablicos tiles a partir de materiales biolgicos. La biotecnologa comprende dos fases distintas: la fermentacin y la recuperacin de los productos. Para el cultivo de microorganismos en condiciones ptimas, as como para la produccin, por parte de los microorganismos, de los metabolitos o los enzimas deseados, deben ser desarrollados procedimientos de fermentacin como son el desarrollo de cepas mediante manipulacin gentica y/o la regulacin del metabolismo mediante la optimizacin del medio de cultivo as como el control adecuado de los factores fsico-qumicos que afectan al rendimiento de las fermentaciones industriales (02, T, pH, etc.). La recuperacin del producto o "procesamiento posterior" (del ingls downstream processing) conlleva la extraccin y purificacin de los productos biolgicos. La recuperacin en los procesos bioqumicos difiere de la recuperacin qumica, principalmente, en que los materiales biolgicos son frecuentemente mucho ms lbiles. Por lo tanto, la produccin de productos metablicos tiles a partir de microorganismos conlleva una ntima relacin entre la Ciencia y la Tecnologa. por un lado se deben desarrollar los microorganismos de inters industrial y por otro se debe asegurar que estos microorganismos puedan crecer en gran cantidad bajo aquellas condiciones que originen el mejor rendimiento posible del producto. A simple vista uno puede pensar que aquellas condiciones que se han encontrado ser las ms efectivas a pequea escala deberan ser igual de efectivas a larga escala y que para conseguir este objetivo nicamente es necesario usar un recipiente mayor con el correspondiente incremento de volumen del medio. Nada ms lejos de la realidad. Por ejemplo, se puede conseguir un buen crecimiento de un microorganismo aerobio en un matraz de 200 mL mediante agitacin en un incubador usando un rotor de 300 w. Si nosotros simplemente ampliamos este sistema, un nico fermentador de 10.000 litros requerira un agitador con un motor de 15 megawatios. Dicho motor debera ser tan grande como una casa y el calor generado durante la agitacin hervira a los microorganismos. En lneas generales, un proceso tpico de fermentacin comienza con la formulacin y esterilizacin del medio de cultivo as como la esterilizacin del equipamiento. Las clulas se crecen primero en un cultivo de mantenimiento (5 a 10 mL), posteriormente en un matraz (200 a 1.000 mL) y de ah en un prefermentador (10 a 100 L) para finalmente inocular el fermentador de produccin (1.000 a 100.000 L). Una vez que la fermentacin se ha completado, las clulas se separan del cultivo lquido. Si el producto es intracelular, se rompen las clulas, se eliminan los restos celulares y se recupera el producto del fluido libre de restos celulares. Si el producto es extracelular, se purifica a partir del sobrenadante libre de clulas. Hasta ahora hemos visto el desarrollo de las cepas as como el diseo de los medios de cultivo. A continuacin vamos a desarrollar los aspectos tecnolgicos de las fermentaciones.

II. DISEO Y FUNCIONAMIENTO DEL FERMENTADOR El estudio detallado del diseo de un fermentador cae fuera del objetivo de esta asignatura que se concentra en los principios biolgicos de la biotecnologa. Sin embargo, como la tecnologa de los procesos fermentativos es una amalgama de tcnicas biolgicas e ingeniera qumica, se hace necesario proporcionar un breve resumen de los tipos de fermentadores disponibles y de sus principales caractersticas. A continuacin paso a describir una lista de 13 puntos considerados como los criterios ms importantes para el diseo de un fermentador: 1.- El tanque debe disearse para que funcione aspticamente durante numerosos das, as como para las operaciones de ms larga duracin. 2.- Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireacin y agitacin para cubrir las necesidades metablicas de los microorganismos. 3.- El consumo de energa debe ser tan bajo como sea posible. 4.- Debe tener un sistema para el control del pH. 5.- El fermentador debe tener un sistema para la toma de muestras. 6.- Debe existir un sistema para el control de la temperatura. 7.- Las prdidas por evaporacin no deben ser excesivas. 8.- El diseo del tanque debe ser tal que las operaciones laborales durante el funcionamiento, recoleccin, limpieza y mantenimiento sean mnimas. 9.- El tanque debe ser verstil para la aplicacin de diversas modalidades de procesos. 10.- Las superficies internas del tanque deben ser lisas, utilizando, donde sea posible, soldaduras. 11.- La geometra del fermentador debe ser similar a otros tanques ms pequeos o mayores de la planta o a los de la planta piloto para poder reproducir procesos a diferentes escalas. 12.- deben emplearse los materiales ms baratos que proporcionen resultados satisfactorios. 13.- Debe existir un servicio adecuado de repuestos para el fermentador. El mantenimiento de un ambiente asptico y unas condiciones aerbicas son, probablemente, los dos puntos de mayor relevancia que hay que considerar. Los fermentadores ms ampliamente utilizados a nivel industrial estn provistos de mecanismos de agitacin, dispersin y aireacin as como de sistemas para el control de la temperatura, pH y formacin de espuma.

III. TIPOS DE FERMENTACIONES 1.- Fermentacin discontinua Una fermentacin discontinua (en batch) puede ser considerada como un "sistema cerrado". Al inicio de la operacin se aade la solucin esterilizada de nutrientes y se inocula con el microorganismo, permitiendo que se lleve a cabo la incubacin en condiciones ptimas de fermentacin. A lo largo de toda la fermentacin no se aade nada, excepto oxgeno (en forma de aire), un agente antiespumante y cidos o bases para controlar el pH. La composicin del medio de cultivo, la concentracin de la biomasa y la concentracin de metabolitos cambia generalmente como resultado del metabolismo de las clulas observndose las cuatro fases tpicas de crecimiento: fase de latencia, fase logartmica, fase estacionaria y fase de muerte. En los procesos comerciales la fermentacin frecuentemente se interrumpe al final de la fase logartmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la fase de muerte (metabolitos secundarios). 2.- Fermentacin alimentada (fed-batch) En los procesos convencionales discontinuos que acabamos de describir, todos los sustratos se aaden al principio de la fermentacin. Una mejora del proceso cerrado discontinuo es la fermentacin alimentada que se utiliza en la produccin de sustancias como la penicilina. En los procesos alimentados, los sustratos se aaden escalonadamente a medida que progresa la fermentacin. La formacin de muchos metabolitos secundarios est sometida a represin catablica (efecto glucosa). Por esta razn en el mtodo alimentado los elementos crticos de la solucin de nutrientes se aaden en pequeas concentraciones al principio de la fermentacin y continuan aadindose a pequeas dosis durante la fase de produccin. 3.- Fermentacin continua En la fermentacin continua se establece un sistema abierto. La solucin nutritiva estril se aade continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente de solucin utilizada de los nutrientes, con los microorganismos, se saca simultneamente del sistema. El objetivo fundamental de la industria de las fermentaciones es minimizar costes e incrementar los rendimientos. Este objetivo puede alcanzarse si se desarrolla el tipo de fermentacin ms adecuado para cada paso en particular. Si bien los procesos de fermentacin continua no se utilizan de forma general en la industria, debido fundamentalmente al mayor nivel de experiencia que se tiene en el crecimiento de clulas en fermentacin discontinua, el coste de produccin de biomasa mediante cultivo continuo es potencialmente inferior al de cultivo discontinuo. De este modo se han instalado plantas de produccin para la produccin continua de protena de origen unicelular a partir de n-alcanos, compuestos C1 y almidones.

Aunque muchas fermentaciones para la produccin de metabolitos funcionan bien como procesos continuos, slo unos pocos procesos han resultado tiles para la aplicacin prctica por varias razones: a.- Muchos mtodos de laboratorio operan continuamente durante solamente 20 a 200 horas; para que sea de utilidad industrial el sistema debe ser estable durante al menos 500 a 1.000 horas. b.- Mantener las condiciones estriles a escala industrial a lo largo de un largo perodo de tiempo es difcil. c.- La composicin de los sustratos debe ser constante a fin de obtener una produccin mxima. La composicin de las soluciones de nutrientes industriales son variables (lquido de maceracin del maiz, peptona, etc.) lo que puede originar cambios en la fisiologa de la clula y disminuir la productividad. d.- Cuando se utilizan cepas de alto rendimiento se producen mutantes degenerados, los cuales pueden crecer en cultivo continuo ms deprisa que las cepas de produccin por lo que el rendimiento disminuye con el tiempo ya que cada vez son menos clulas las que sintetizan el producto de inters. 4.- Reactores de enzimas o clulas inmovilizadas Consiste en pasar el medio fresco a travs de un biorreactor en el que por diversas tcnicas hemos inmovilizado clulas (o enzimas). En el biorreactor se producen las transformaciones bioqumicas que deseamos y recuperamos el producto transformado tras su paso por la columna. Con este sistema se eliminan los problemas de desequilibrio (estabilidad) del sistema continuo clsico y adems el producto resultante est libre de clulas. Presenta el inconveniente de que no todos los microorganismos pueden inmovilizarse. Existen tres mtodos de inmovilizar las clulas: a.- Asociacin fsica mediante resinas de intercambio inico. La unin se puede romper fcilmente. b.- Unin covalente mediante glutaraldehido, tolueno, di-isocianato, iodo acetil celulosa. Unin fuerte aunque inactivacin. c.- Atrapamiento mediante colgeno, gelatina, agar, alginatos, poliacrilamida, poliestireno. Es el mtodo ms utilizado en inmovilizacin de clulas; para ello se mezclan las clulas con el polisacrido lquido y posteriormente se deja enfriar para que solidifique. Finalmente se fragmenta o granula y se empaqueta en una columna.

IV. FACTORES FISICO-QUIMICOS QUE AFECTAN AL RENDIMIENTO DE LAS FERMENTACIONES INDUSTRIALES 1.- Oxgeno 2.- Temperatura 3.- pH 1.- Oxgeno Uno de los factores ms crticos en la operacin de fermentacin a gran escala es el suministro de un intercambio de gases adecuado. El oxgeno es el sustrato gaseoso ms importante para el metabolismo microbiano y el anhdrido carbnico es el producto metablico ms importante. El oxgeno no es un gas muy soluble ya que una solucin saturada de oxgeno contiene aproximadamente 9 mg / L de este gas en agua. debido a la influencia de los ingredientes del cultivo, el contenido mximo de oxgeno realmente es ms bajo de lo que debera ser en agua pura. El suministro se logra pulverizando aire en el fermentador durante el proceso. La ley de Henry describe la solubilidad del oxgeno en soluciones de nutrientes en relacin a la presin parcial del oxgeno en la fase gaseosa: P0 C = -----H

En esta ecuacin C es la concentracin de O2 de la solucin de nutrientes a saturacin, P0 es la presin parcial del gas en la fase gaseosa y H es la constante de Henry que es especfica para cada tipo de gas. A medida que aumenta la concentracin de O2 en la fase gaseosa, aumenta la proporcin de O2 en la solucin de nutrientes. En consecuencia, la presin ms alta de O2 se consigue durante la aireacin con oxgeno puro. Comparado con el valor obtenido al utilizar aire (9 mg O2/L), en agua se disuelven 43 mg O2/L cuando se utiliza oxgeno puro. Otra caracterstica es que a medida que aumenta la temperatura desciende la solubilidad del oxgeno. Una vez disuelto el O2 ste tiene que transferirse desde la burbuja de gas a cada clula individual. Para ello deben ser superadas varias resistencias parcialmente independientes: a.- La resistencia dentro de la pelcula de gas a la interfase. b.- La penetracin de la interfase entre la burbuja de gas y el lquido. c.- Transferencia desde la interfase al lquido. d.- Movimientos dentro de la solucin de nutrientes. e.- Transferencia a la superficie de la clula.

En las fermentaciones que se llevan a cabo con organismos unicelulares como bacterias o levaduras, el factor ms importante que controla la velocidad de transferencia es la resistencia en la interfase entre la burbuja de gas y el lquido. Las clulas microbianas prximas a la burbuja de gas pueden absorber directamente el O2 a travs de la interfase aumentando la transferencia del gas a estas clulas. En los aglomerados de clulas o en las bolitas de micelio, la transferencia de gas dentro del aglomerado puede ser un factor limitante.

Por ltimo indicar la concentracin crtica de oxgeno que es el trmino utilizado para expresar el valor de la velocidad especfica de absorcin de oxgeno que permite la respiracin sin impedimentos. Esta concentracin crtica de oxgeno suele tener unos valores concretos para cada microorganismo oscilando de forma general entre el 5% y el 25% de los valores de saturacin de oxgeno en los cultivos. 2.- Temperatura La temperatura es otro de los parmetros esenciales para el xito de una fermentacin. Los microorganismos que crecen a una temperatura inferior a la ptima tienen retardado su crecimiento y por lo tanto reducida la produccin celular, es decir su productividad. Por otro lado, si la temperatura es demasiado alta, pero no letal, se puede inducir una respuesta de estrs al choque trmico con la consiguiente produccin de proteasas celulares que ocasionan una disminucin en el rendimiento de los productos proteicos. A fin de obtener rendimientos ptimos, las fermentaciones deben ser llevadas a cabo en un margen estrecho de temperatura y a ser posible constante. La velocidad de produccin de calor debida a la agitacin y a la actividad metablica de los microorganismos no se ve compensada por las prdidas de calor que resultan de la evaporacin, por lo que se debe recurrir a sistemas de refrigeracin. Dentro de stos, los ms utilizados en las fermentaciones industriales son las camisas de agua. 3.- pH La mayor parte de los microorganismos crecen ptimamente entre pH 5,5 y 8,5. Pero durante el crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares son liberados al medio, lo que puede originar un cambio del pH del medio de cultivo. Por lo tanto se debe controlar el pH del medio de cultivo y aadir un cido o una base cuando se necesite para mantener constante el pH. Por supuesto que esta adicin del cido o base debe ser mezclada rpidamente de tal manera que el pH del medio de cultivo sea el mismo en todo el fermentador. V. AGITACION Y MEZCLADO La agitacin es la operacin que crea o que acelera el contacto entre dos o varias fases. Una fermentacin microbiana puede ser considerada como un sistema de tres fases, que implica reacciones lquido-slido, gas-slido y gas-lquido.

1.- La fase lquida contiene sales disueltas, sustratos y metabolitos. Puede existir, en algunos casos, una segunda fase lquida si existe un sustrato inmiscible en agua como por ejemplo los alcanos. 2.- La fase slida consiste en clulas individuales, bolitas de micelio, sustratos insolubles o productos del metabolismo que precipitan. 3.- La fase gaseosa proporciona un reservorio para el suministro de oxgeno, para la eliminacin del CO2 o para el ajuste del pH con amonio gaseoso.

Una adecuada agitacin de un cultivo microbiano es esencial para la fermentacin ya que produce los siguientes efectos en las tres fases: 1.- Dispersin del aire en la solucin de nutrientes. 2.- Homogeneizacin, para igualar la temperatura, pH y concentracin de nutrientes, en el fermentador. 3.- Suspensin de los microorganismos y de los nutrientes slidos. 4.- Dispersin de los lquidos inmiscibles. Bajo estas premisas se podra concluir que cuanto mayor sea la agitacin, mejor ser el crecimiento. Sin embargo, la agitacin excesiva puede romper las clulas grandes e incrementar la temperatura lo que ocasiona un descenso en la viabilidad celular. Por lo tanto, se debe conseguir un balance entre la necesidad del mezclado y la necesidad de evitar el dao celular. Los diferentes tipos de agitacin que se utilizan en las fermentaciones se incluyen dentro de las siguientes clases: 1.- Agitadores rotativos, los cuales tienen un sistema interno mecnico de agitacin. 2.- Columnas de burbujas, la agitacin se realiza mediante la introduccin de aire a sobrepresin. 3.- Sistema aero-elevado (airlift), que pueden tener un circuito interno o externo. La mezcla y circulacin de los fluidos son el resultado de las corrientes de aire introducido, las cuales causan diferencias en la densidad dentro de las diferentes partes del fermentador. De estos tres tipos el ms utilizado es el primero ya que es ms flexible en las condiciones de operacin, es ms fcil de conseguir comercialmente, provee una eficiente transferencia de gases a las clulas y es el tipo con el que se tiene ms experiencia.