Tecnologa del ADN recombinante y sus aplicaciones en la Medicina.

Objetivos de aprendizaje:
-Conocer y familiarizarse con los principios bsicos de la biologa molecular. -Aprender fundamentos de las tcnicas de rutina de biologa molecular. -Estudiar la secuenciacin de ADN y su aplicacin en el diagnstico clnico. -Comprender la tcnica de PCR conceptualmente y aplicaciones de la misma. -Conocer y comprender algunas aplicaciones mdicas de la investigacin de genes, estudio de enfermedades hereditarias, huella gentica, protenas recombinantes, animales transgnicos, terapia gnica.

Los instrumentos bsicos de la investigacin de genes.

En las ltimas dcadas la tecnologa de recombinacin del ADN tambin conocida como ingeniera gentica, o ms acertadamente recombinacin gentica in vitro, ha revolucionado la biologa. El campo de la salud es uno de los ms beneficiados con el desarrollo de esta tecnologa. Las investigaciones que se realizan en esta rea estn enfocadas a un diagnstico oportuno de enfermedades, as como su posible tratamiento a travs de la terapia con molculas recombinantes e introduccin de genes. Adems, la manipulacin de genes proporciona una herramienta fundamental para la eliminacin futura de enfermedades mortales para el hombre. Por estas razones resulta til que el mdico de asistencia est familiarizado con conceptos bsicos sobre biologa molecular, su aplicacin en la investigacin biomdica, y en especial con sus posibles aplicaciones clnicas, conceptos estos que aparecen cada vez con mayor frecuencia en toda la literatura biomdica, tanto bsica como clnica. El rpido progreso de la biotecnologa y, de hecho, su propia existencia, es el resultado de utilizar unas pocas tcnicas que se describen a continuacin.

Enzimas de restriccin:

El descubrimiento de las enzimas de restriccin ha permitido a los investigadores manipular segmentos discretos de ADN, facilitando enormemente el estudio de esta molcula de gran tamao. Las enzimas de restriccin, tambin llamadas endonucleasas de restriccin, reconocen secuencias de bases especficas en el ADN doble hlice y cortan en lugares concretos ambas hebras del dplex que contienen las secuencias reconocidas. Las enzimas de restriccin fueron obtenidas a partir de una gran variedad de procariontes. Su funcin biolgica en estos organismos consiste en eliminar mediante su actividad de endonucleasa ADN forneo que pudiera ingresar en una bacteria. El ADN del propio microorganismo no se destruye porque los sitios reconocidos por sus propias enzimas de restriccin se encuentran metilados. Las enzimas de restriccin reconocen secuencias especficas en el ADN de entre 4 a 8 pares de bases e hidrolizan un enlace fosfodister en cada hebra de la regin reconocida. Una caracterstica notable de estos sitios de corte es que casi siempre son palndromos, o una repeticin invertida, y los
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puntos de corte estn dispuestos simtricamente (Figura 1).

Figura 1: Los puntos de corte estn indicados por las flechas. El corte con Bam HI (izquierda) produce extremos simple cadena o adhesivos y el corte con AluI (derecha) produce extremos doble cadena o romos. En cada hebra, la enzima hidroliza el enlace fosfodister en el lado 3 del eje de simetra.

Se han purificado y caracterizado ms de 100 enzimas de restriccin. Se nombran con una abreviatura de tres letras que se refiere al organismo hospedador, por ej. Eco de Escherichia coli, Hin de Haemophilus influenzae, Hae de Haemophilus aegyptius, seguida, en su caso, de una indicacin de la cepa en cuestin y de un nmero romano (en el caso que se haya identificado ms de una enzima de restriccin de la misma cepa). Los cortes de estas enzimas pueden ocurrir en el centro mismo de la secuencia dejando lo que se conoce como extremos romos con ADN doble cadena, o extremos adhesivos si el corte ocurre corrido en una hebra y en la otra del ADN, dejando en este caso una porcin de hebra simple cadena. Las enzimas de restriccin se utilizan para hidrolizar molculas de ADN y proporcionan fragmentos especficos que se pueden analizar y manipular con ms facilidad que la molcula original. Adems, la cantidad de los fragmentos de ADN obtenidos luego del corte con una enzima de restriccin depender de la frecuencia de corte de dicha enzima ya que si su secuencia de reconocimiento se encuentra muchas veces repetida en el ADN, se generarn muchos fragmentos de restriccin de diferentes tamaos. Es importante destacar que a medida que el sitio de restriccin de una enzima tenga mayor nmero de pares de bases, la frecuencia de corte ser menor, ya que es menos probable que se combinen dichas pares de bases para formar la secuencia de reconocimiento y encontrarla en el ADN.

Tcnicas de transferencia o blotting:

Las tcnicas Southern blot y Northern blot se utilizan para separar y caracterizar ADN y ARN respectivamente. La tcnica de Southern fue desarrollada por Edwin Southern para separar ADN y por
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analoga la separacin de ARN se denomin Northern y la transferencia de protenas que se denomin Western blot. Estas tcnicas comienzan con una electroforesis en gel con el objetivo de separar las molculas por su tamao, posteriormente la transferencia a una membrana para finalmente identificar un fragmento especfico de ADN, una molcula de ARN particular o una protena de inters mediante la unin especfica de otra molcula de cido nucleico (sonda) para ADN o ARN o anticuerpo para protenas. La electroforesis en gel es una tcnica en la que se aplica un campo elctrico para separar molculas en base a su tamao y a su carga como ya fue explicado en la clase de separacin de protenas. Debido a que los cidos nucleicos contienen grupos fosfatos cargados negativamente, migran hacia el electrodo positivo (nodo) en un campo elctrico. El ADN cortado previamente por una o ms enzimas de restriccin o el ARN se siembra en un gel. Al aplicarse el campo elctrico los fragmentos se separan por tamao y luego pueden ser visualizados, detectndose hasta pequeas diferencias de peso molecular. Se utilizan dos tipos de geles: de poliacrilamida para separar fragmentos de hasta unos miles de pares de bases y geles de agarosa, ms porosos, para separar mezclas de fragmentos de hasta 20.000 bases (20 kilobases (kb)), utilizados para Southern blot. Una caracterstica importante de estos geles es su alta capacidad de resolucin, por ejemplo utilizando geles de poliacrilamida se pueden distinguir entre cientos de fragmentos de ADN que difieren en longitud por un nico nucletido (se utilizan para secuenciar ADN), mientras que los geles de agarosa sirven para separar fragmentos con mayores diferencias de tamao. Luego de la corrida electrofortica, los fragmentos de cidos nucleicos no se visualizan directamente sino que debe teirse el gel con bromuro de etidio; un agente que se intercala entre las bases de la doble hlice y que es fluorescente al ser irradiado con luz ultravioleta, de esta manera se observan los fragmentos de ADN de una intensa fluorescencia anaranjada cuando se expone el gel a luz ultravioleta. (Figura 2).

Figura 2: Electroforesis de cidos nucleicos en gel de agarosa, y tincin con Bromuro de Etidio de los fragmentos separados.

La transferencia consiste en el pasaje de los cidos nucleicos desde el gel donde se han separado por electroforesis hacia un papel o membrana de nylon. Esta transferencia ocurre por capilaridad donde el movimiento del buffer que embebe el gel transfiere las molculas de cido nucleico del gel a la membrana conservando la posicin de los fragmentos de ADN o ARN en la membrana. En el caso de Southern blot, las membranas deben ser luego sometidas a condiciones alcalinas para desnaturalizar las dos hebras y dejar al ADN como simple cadena. En el caso del Northern blot no es necesario este paso ya que el ARN es simple cadena. Un paso de gran importancia en estas tcnicas, al igual que en la tcnica de Western blot, es el bloqueo de la membrana de manera de evitar hibridaciones inespecficas producto de la gran afinidad de la membrana por los cidos nucleicos. Con este fin, en general se utiliza ADN de esperma de salmn o arenque. Cmo identificar especficamente un fragmento de inters en la membrana? Mediante el uso de sondas especficas. SONDAS: Una sonda es un fragmento de tamao variable (de pocos nucletidos como 50 pb hasta 2 kb) que puede ser ADN o ARN, que se une especficamente por complementariedad de bases a la
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secuencia que se encuentra en la membrana de nylon junto con cientos de fragmentos ms. Este evento de unin por bases complementarias se conoce como hibridacin. Se dice que la sonda hibrida con el fragmento especfico. Una caracterstica fundamental de la sonda es que lleva alguna marca para que pueda detectarse la unin y por ende, identificar la secuencia de inters a la cual se uni. Una de las tcnicas ms ampliamente utilizadas para marcar la sonda es la incorporacin de un nucletido radioactivo. Existen nucletidos comerciales marcados con fsforo radioactivo que al incorporarse en una sonda por diferentes tcnicas le permite ser detectada mediante la exposicin de la membrana a una placa autorradiogrfica (como la de los rayos X). En la placa se observan especficamente l o los fragmentos donde hibrid la sonda ya que la radiacin emitida en ese sitio vela la placa autorradiogrfica. Un concepto importante es que la sonda no tiene que ser necesariamente del mismo tamao del fragmento de inters, es suficiente que la sonda reconozca especficamente una porcin del fragmento de inters. Luego que la sonda ha hibridado con el fragmento de inters, debe lavarse la membrana para eliminar el exceso de sonda que no se hubiera unido especficamente y luego se visualiza la sonda por autorradiografa (Figura 3). Existen otras formas de deteccin de las sondas que no son radioactivas, algunas se marcan con grupos qumicos que luego se observan por fluorescencia.

Figura 3: Un fragmento de ADN o una molcula de ARN que contiene una determinada secuencia puede identificarse en una mezcla de fragmentos, si estos se separan por electroforesis y se transfieren a una membrana de nylon que se hibrida con una sonda marcada con
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P (fsforo radioactivo), complementaria a la secuencia que

se busca. El fragmento que contiene la secuencia buscada se visualiza despus por autorradiografa. Recordar: si se realiza un Southern blot, deben separarse las dos cadenas de ADN, mediante el agregado de medio alcalino (NaOH) para que la sonda hibride con la secuencia complementaria a una de las cadenas (figura modificada de Griffiths et al., 2000).

Blotting Tipo de blot Analiza: Procedimiento 1) Preparacin de la muestra Se corta en fragmentos Nada Nada Southern ADN Northern ARN Western Protenas

2) Separacin por electroforesis

Tamao

Tamao

Tamao o carga

3) Tratamiento del gel

Desnaturalizar el ADN con lcali

Nada

Nada

4)Transferir a una membrana

Por capilaridad

Por capilaridad

Campo elctrico

5) Identificar molculas de inters

Sonda de RNA radioactiva o ADN simple cadena

Sonda de RNA radioactiva o ADNsc

Anticuerpos marcados fluorescente o radioactivamente

Secuenciacin de ADN:

La secuenciacin de ADN se realiza por diferentes mtodos y su finalidad es la determinacin del orden de los nucletidos (A, C, G y T) en una molcula de ADN. La secuencia de ADN constituye la informacin gentica heredable del ncleo celular, los plsmidos (bacterias), la mitocondria y los cloroplastos (en plantas), que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. As pues, determinar la secuencia de ADN es til en el estudio de los procesos biolgicos fundamentales, en el diagnstico de enfermedades hereditarias y en la investigacin forense. El desarrollo de la secuenciacin del ADN ha acelerado significativamente la investigacin y los descubrimientos en biologa. Las tcnicas actuales permiten realizarla a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciacin a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Los mtodos de secuenciacin actuales se basaron en el mtodo de terminacin de la cadena desarrollado por Sanger en el ao 1977. Describiremos el mtodo de terminacin de la cadena, que es el actualmente utilizado. Se basa en el principio de que molculas de ADN simple cadena que difieren en longitud por apenas un solo nucletido pueden separarse unas de otras por electroforesis en geles de poliacrilamida. Esto significa que es posible diferenciar una familia de molculas, en representacin de todas las longitudes de 10 a 1500 nucletidos, en una serie de bandas. El principio clave del mtodo de Sanger es el uso de didesoxinucletidos trifosfato (ddNTPs) como terminadores de la
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cadena de ADN. Estos didesoxinucletidos terminan la elongacin de la cadena al carecer del grupo 3'OH que se necesita para la formacin del enlace fosfodister entre dos nucletidos durante la elongacin de la cadena de ADN. El mtodo clsico de terminacin de la cadena o mtodo de Sanger necesita una hebra molde de ADN simple cadena, un primer de ADN, una ADN polimerasa con nucletidos marcados radiactivamente o mediante fluorescencia y nucletidos modificados que terminan la elongacin de la cadena de ADN. La muestra de ADN se divide en cuatro reacciones de secuenciacin separadas que contienen los cuatro desoxinucletidos estndar (dATP, dGTP, dCTP and dTTP) y una ADN polimerasa. En cada reaccin se aade solo uno de los cuatro didesoxinucletidos (ddATP, ddGTP, ddCTP, o ddTTP). La incorporacin de un didesoxinucletido en la cadena naciente de ADN termina su extensin, lo que produce varios fragmentos de ADN de longitud variable. Los didesoxinucletidos se aaden en concentraciones lo suficientemente bajas como para que produzcan todas las posibilidades de fragmentos y al mismo tiempo sean suficientes para realizar la secuenciacin. Los fragmentos de ADN sintetizados y marcados son desnaturalizados por calor y separados por tamao (con una resolucin de un solo nucletido) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida urea. Cada una de las cuatro reacciones de sntesis se corre en carriles individuales (Carril A, T, G y C) de los geles de poliacrilamida, de acuerdo al didesoxinucletido aadido y se visualizan las bandas de ADN mediante autorradiografa o luz ultravioleta, y la secuencia de ADN se puede leer directamente a partir de la placa de rayos X o de la imagen del gel.

En la imagen A, la pelcula de rayos-X se expuso directamente al gel de modo que las bandas oscuras corresponden a los fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Una banda oscura en un carril indica un fragmento de ADN que es el resultado de una terminacin de la cadena tras la incorporacin de un didesoxinucletido (ddATP, ddGTP, ddCTP, o ddTTP). El nucletido terminal puede ser identificado de acuerdo al didesoxinucletido que se aadi en la reaccin que dio lugar a esa banda. Las
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posiciones relativas entre las cuatro calles se utilizan entonces para leer (de abajo a arriba) la secuencia de ADN como se indica. Como se muestra en el panel B, actualmente la alternativa es el marcado de los terminadores de la cadena, un mtodo conocido como "secuenciacin por terminador fluorescente". La mayor ventaja de este mtodo es que la secuenciacin se puede llevar a cabo en una sola reaccin, en lugar de en cuatro reacciones como en el mtodo del cebador marcado. En una secuenciacin por terminador fluorescente se marcan cada uno de los cuatro didesoxinucletidos que terminan la cadena con un colorante fluorescente diferente, con fluorescencias a diferentes longitudes de onda. Este mtodo es atractivo por su gran capacidad y rapidez y actualmente es el mtodo de referencia en la secuenciacin automatizada con analizadores de secuencia controlados por computadora

ADN producido por transcripcin reversa Los ARN mensajeros (ARN-m) transcriptos en un tejido determinado pueden ser usado como molde o templado por la enzima transcriptasa reversa, la cual produce una copia de ADN (ADN-c) del ARN. A diferencia de los fragmentos de ADN clivados a partir del genoma por enzimas de restriccin, el ADN producido por la transcriptasa reversa, debido a que usa ARN-m como templado, no contiene intrones. La transcriptasa reversa cataliza la sntesis en direccin 5' a 3' a partir de un oligo-dT como primer o iniciador.

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR): TCNICA: En 1984, Kary Mullis ide un ingenioso mtodo para amplificar secuencias especficas de ADN que se denomina reaccin en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR). Mediante esta tcnica se puede amplificar un segmento especfico de ADN hasta millones de veces en pocas horas in vitro, si se conocen las secuencias colindantes (flanqueantes) a esta secuencia blanco. La PCR se llevar a cabo agregando a un tubo a) una solucin que contenga molculas de ADN donde se encuentre la secuencia a amplificar, b) oligonucletidos entre 20 y 30 nucletidos que actuarn como cebadores (o primers) unindose especficamente a la secuencias colindantes con la secuencia blanco, c) los cuatro desoxirribonucletidos (dNTPs), d) un buffer que permita mantener el pH en el rango de 7,4 y e) una ADN polimerasa estable al calor. Cada ciclo de replicacin consiste en tres pasos:

a) Separacin de las hebras: Desnaturalizacin de la cadena de ADN. Las dos hebras de la molcula de ADN original se separan mediante calentamiento de la solucin a 95C durante 15 segundos. b) Hibridacin de los cebadores: La solucin se enfra rpidamente a 50-60C que es generalmente la temperatura que permite a cada cebador unirse con una hebra de ADN desapareada. Un cebador hibrida con el extremo 3 de la secuencia blanco en una hebra y el otro cebador hibrida con el extremo 3 de la secuencia en la hebra complementaria. No se formar nuevamente el ADN doble hebra inicial porque los cebadores estn presentes en exceso.
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c) Sntesis de ADN: A continuacin la solucin se calienta a 72C. La ADN polimerasa termoestable que se utiliza proviene Thermus aquaticus, una bacteria termfila que vive en aguas termales, por ello la temperatura ptima de la enzima es alrededor de 70 C y se llama Taq polimerasa (por Thermus aquaticus). La Taq polimerasa elonga ambos cebadores en la misma direccin de la secuencia blanco porque la sntesis de ADN se realiza en direccin 5 a 3 (repasar duplicacin de ADN). La Taq polimerasa puede ser activa an a temperaturas tan extremas como 95 C que es la temperatura del primer paso del ciclo de PCR lo cual permite que se puedan realizar hasta 35 ciclos consecutivos, sin necesidad de reponer ms polimerasa luego de este paso. Qu pasar si se usase una ADN polimerasa humana?

Todos los componentes de la PCR se agregan por nica vez para dar inicio a la reaccin. Estos tres pasos constituyen un ciclo de PCR y se pueden llevar a cabo repetidas y consecutivas veces modificando nicamente la temperatura de la reaccin. Un ciclo de PCR duplica la cantidad de ADN, lo que produce un aumento de 2n de la cantidad de ADN original siendo n el nmero de ciclos que se llevan a cabo. La amplificacin es de un milln de veces despus de 20 ciclos y de mil millones de veces despus de 30 ciclos, los cuales se pueden llevar a cabo en menos de una hora (Figura 4).

Caractersticas importantes de la tcnica: No es necesario conocer toda la secuencia a amplificar, nicamente hay que conocer las secuencias que flanquean dicha secuencia. La regin a amplificar puede ser mucho mayor que los cebadores. Por PCR se pueden amplificar fragmentos tan grandes como 10 kb. No es necesario que los cebadores se ajusten perfectamente a las secuencias que flanquean el fragmento a amplificar. El uso de cebadores derivados de un gen de secuencia conocida hace posible la bsqueda de variaciones sobre el tema. Esta caracterstica es muy importante porque as se han descubierto por PCR familias de genes y relaciones evolutivas entre organismos. La PCR puede ser muy especfica en amplificar un nico fragmento de inters y no otros debido al rigor de la hibridacin de los cebadores a temperatura muy elevada (50-60C). Sin embargo, modificando la temperatura y concentraciones salinas del buffer se puede controlar el rigor de la amplificacin. La temperatura y las concentraciones salinas pueden determinar la especificidad de unin de los cebadores a sus secuencias complementarias. A altas temperaturas y altas concentraciones salinas (condiciones de alta rigurosidad) los cebadores solamente hibridan con secuencias totalmente complementarias y se amplifica un nico fragmento; si disminuye la temperatura o las concentraciones salinas (condiciones de baja rigurosidad), los cebadores comienzan a hibridar con secuencias que no son totalmente complementarias sino que tienen variaciones de algunas pares de bases.

APLICACIONES: La PCR permite acceder a la amplificacin de una secuencia que constituye menos de la millonsima parte del ADN total de un organismo superior. Es una tcnica sumamente sensible, se
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puede amplificar y detectar una nica molcula de ADN.

Figura 4: Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).

La PCR puede aportar una informacin muy valiosa en medicina: -Deteccin de bacterias y virus utilizando cebadores especficos. Por ejemplo, la PCR puede descubrir la presencia de virus latentes como los de la hepatitis B y C y el de inmunodeficiencia humano (HIV) en el genoma de los individuos infectados que no han desarrollado respuesta inmune
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a dichos patgenos, por lo cuales no puede ser detectado por ensayos con anticuerpos. La bsqueda de bacilos en muestras de tejido puede ser muy lenta y laboriosa pero con la PCR se pueden detectar con la presencia de solo 10 de estos microorganismos por cada milln de clulas humanas. Colaboracin con la medicina forense en la identificacin de personas permitiendo el reconocimiento de cadveres, parentescos biolgicos en casos de disputa de paternidad. Establecer grupos tisulares precisos en transplantes, amplificando secuencias de los HLA del donante y receptor para determinar compatibilidades. Deteccin de organismos transgnicos, por ejemplo productos de agricultura como soja o maz, para su comercializacin. Estudio de relaciones evolutivas entre los organismos ya que bajo ciertas circunstancias el ADN puede mantenerse intacto durante miles de aos o incluso ms tiempo.

PCR en tiempo real: La PCR cuantitativa, qPCR, Q-PCR (del ingls quantitative polymerase chain reaction) o PCR en tiempo real (del ingls real time PCR) es una variante de la PCR utilizada para amplificar y simultneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificacin de ADN. La PCR cuantitativa es la metodologa ms moderna para el estudio de la expresin gnica. Podemos clasificar las tcnicas de PCR en tiempo real segn el empleo de fluorocromos o bien de sondas moleculares dependientes de la secuencia. En las tcnicas basadas en fluorocromos se detecta la generacin exponencial de ADN de doble cadena empleando un fluorocromo que se une intercalndose a la molcula doble cadena y al estar unido produce fluorescencia. A medida que se amplifican las molculas de ADN aumenta el nmero de molculas del fluorocromo unidas. Un ejemplo de fluorocromo que permite esta deteccin es el SYBR Green, que, excitado mediante luz azul (max = 488 nm) emite luz verde (max = 522 nm). Posee la ventaja de requerir slo un par de cebadores para efectuar la amplificacin, lo que abarata su coste; sin embargo, slo es posible amplificar un producto en cada reaccin. La PCR en tiempo real se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado. Este termociclador es un aparato con capacidad para calentar y enfriar rpidamente las muestras, de modo que se aprovechen las cualidades fisicoqumicas de los cidos nucleicos y las enzimticas de la ADN polimerasa. La PCR en tiempo real permite cuantificar el nivel de producto obtenido en cualquier momento de la amplificacin mediante la seal de fluorescencia (en realidad, mediante su nivel sobre un umbral). Los valores de fluorescencia, expresados como logaritmos a fin de estudiar fcilmente la fase exponencial de amplificacin, que aparece como una lnea recta al representar grficamente el logaritmo de la fluorescencia frente al nmero de ciclo; este segmento, denominado segmento cuantificable, permite valorar la cantidad de ADN inicial. Cuantificacin y genotipado en clnica:
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Las virosis en humanos pueden ser debidas a infecciones por parte de patgenos concretos o a coinfecciones, y este hecho no slo puede dificultar el diagnstico mediante las tcnicas clsicas, sino que puede redundar en un distinto pronstico y en la necesidad de emplear una u otra quimioterapia. El empleo de la PCR en tiempo real posibilita tanto la cuantificacin como el genotipado (caracterizacin de la cepa) de virus como el HBV (virus de la hepatitis B). El grado de infeccin, cuantificado como las copias de genoma viral por unidad de tejido del paciente, es relevante en muchos casos; por ejemplo, la probabilidad de que el virus del herpes simple de tipo 1 se reactive est relacionada con el nmero de neuronas infectadas en los ganglios. Esta cuantificacin se realiza mediante retrotranscripcin o sin ella, en el caso de que los virus se integren en el genoma humano en algn momento de su ciclo, como en el caso del HPV (virus del papiloma humano), alguna de cuyas variantes est asociada con la aparicin de cncer de crvix.

Clonado de ADN La primera tcnica desarrollada para amplificar ADN en cantidad es conocida como clonado. Un fragmento de ADN obtenido a partir de un organismo (ADN forneo) es insertado en un vector (o transportador) compuesto de ADN, y la quimera as obtenida (ADN recombinante) es usada para transformar clulas hospedadoras. A medida que la clula hospedadora se divide, adems de replicar su propio ADN, ella tambin replica el ADN del vector, el cual incluye el ADN forneo. Subsecuentemente, se podran aislar cantidades relativamente grandes del ADN forneo. Si las clulas hospedadoras son bacterias, el primer paso en el procedimiento de clonado es insertar el ADN forneo dentro de un vector el cual pueda luego transportar este ADN dentro de la bacteria. Los vectores son unidades de ADN que pueden replicarse en forma autnoma y dentro de los cuales pueden insertarse otros fragmentos de ADN. Los vectores ms comnmente usados son plsmidos. Los plsmidos son molculas de ADN circular doble cadena extracromosomal que se encuentran en bacterias en forma natural. Los plsmidos naturales tienen la capacidad de replicarse autnomamente y nicamente dentro de la clula hospedadora adecuada. Estos vectores poseen un tamao pequeo que facilita su entrada a la bacteria y adems, habitualmente portan genes que le confieren al la misma resistencia a antibiticos como ampicilina. Estos plsmidos han sido modificados mediante ingeniera gentica y actualmente existen comercialmente una gran variedad de los mismos para distintos propsitos. Los vectores de clonado poseen una regin denominada sitio de clonado multiple que contiene sitios de corte de distintas enzimas de restriccin que permite la insercin del ADN forneo en esa regin del plsmido. Para insercin de un segmento de ADN forneo a un vector de clonado, dicho segmento de ADN y el plsmido deben ser clivados con la misma enzima de restriccin. En el proceso ms simple se usa una enzima de restriccin que produce extremos adhesivos tanto en el ADN forneo como en el vector. Estas regiones de ADN simple cadena complementarias pueden aparearse entre si. Una vez producido el apareamiento entre las bases se pueden unir ambas molculas covalentemente por la accin de la enzima ADN-ligasa. La nueva molcula de ADN producto de la unin de dos molculas de ADN de diferente origen
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se denomina ADN recombinante. Una vez obtenidas estas nuevas molculas para lograr su amplificacin, es decir obtener un mayor nmero de copias, se deben introducir a una clula hospedadora. El proceso mediante el cual se introduce un vector a una bacteria se denomina transformacin. Si se introduce un vector a una clula eucarionte este proceso es denominado transfeccin.

Figura 5: Vector plasmdico de clonado de ADN circular, con sus componentes bsicos; AmpR, resistencia a ampicilina para seleccin; Insert, sitio de clonado mltiple, con sitios de restriccin para varias enzimas de restriccin diferentes donde se inserta el fragmento de ADN de inters; T7, promotor que reconoce la ARN polimerasa II de Escherichia coli, EcoRI y PstI, sitios de corte para las respectivas enzimas de restriccin.

MARCADO DE LOCI EN CROMOSOMAS ESPECFICOS:

Varios mtodos son tiles para asignar genes o marcadores a los cromosomas individuales, uno de ellos es la hibridacin in situ. Si el gen est clonado y est disponible, se puede utilizar para realizar una sonda marcada para la hibridacin in situ. Si los cromosomas individuales del set genmico son identificables mediante su patrn de bandas, tamao, relacin de los brazos, o alguna otra caracterstica citolgica, puede ser localizado el nuevo gen en un cromosoma si hibrida con el. Las sondas ms comnmente utilizadas son radioactivas o fluorescentes. En la tcnica de hibridacin in situ fluorescente (FISH; fluorescent in situ hibridization), la sonda complementaria al gen en estudio se marca con un reactivo fluorescente y una preparacin de cromosomas parcialmente desnaturalizados se incuba con la sonda. La sonda se une al cromosoma in situ y la localizacin del fragmento clonado se revela como una seal fluorescente (Figura 6).

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Figura 6: Anlisis de FISH de cromosomas de tres especies diferentes de plantas. Las sondas usadas eran complementarias a regiones codificantes para ARN ribosomal en azul (para el 5S), en rosa (para el 18S, 5,8S y 26S) y en verde una secuencia especfica de las dos especias de arriba.

FISH de interfase El anlisis de FISH se puede usar sobre clulas en interfase para determinar el nmero de copias de uno o varios cromosomas, as como para detectar algunas reorganizaciones especficas que son caractersticas de ciertos tipos de cncer. La ventaja principal del FISH de interfase es que se puede realizar muy rpidamente si es preciso, normalmente en 24 horas, porque no requiere crecimiento de las clulas. Un buen ejemplo es el ensayo de aneuploida, que se realiza sobre clulas del fluido amnitico cuando hay una fuerte indicacin clnica de una de las trisomas ms comunes. Se desnaturalizan los ncleos de la muestra, se hibridan con sondas especficas para los cromosomas 13, 18, 21, X e Y, y habitualmente en 24 horas se dispone de los resultados. La prueba de aneuploida suele incluir tambin una citogentica de rutina para confirmar los resultados.

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Figura

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Esta

prueba de aneuploida muestra un feto femenino con trisoma 21. El ncleo de la izquierda se ha hibridado con sondas diseadas para los cromosomas 13 (verde) y 21 (rojo), y tiene claramente tres seales rojas. El ncleo de la derecha se ha hibridado con sondas diseadas para los cromosomas 18 (azul claro), X (verde) e Y (rojo). Puesto que muestra dos seales verdes y ninguna roja, es femenino.

Tomado de http://biomodel.uah.es/citogene/dynacare/intfish.htm

POLIMORFISMOS DEL ADN Los polimorfismos en el genoma sirven como base para el uso de tcnicas de ADN recombinante en el diagnstico de enfermedades. Los polimorfismos son variaciones en las secuencias de ADN. En el genoma humano pueden encontrarse millones de diferentes polimorfismos. Los primeros en ser identificados involucraban mutaciones puntuales, la sustitucin de una base por otra. Estudios posteriores han mostrado que deleciones e inserciones tambin son responsables de variaciones en las secuencias de ADN. Algunos polimorfismos que ocurren dentro de la regin codificante de genes y otros que se encuentran en regiones no codificantes estrechamente relacionadas a genes estn involucrados en la etiologa (causa) de enfermedades heredables. El anlisis de ADN hace posible examinar variaciones entre individuos y entre especies en su secuencia de ADN. Hay dos niveles en los cuales los estudios pueden ser realizados. Estudiar la variacin en sitios reconocidos por enzimas de restriccin, llamado RFLP, tcnica que est en desuso actualmente y en un nivel ms preciso, mtodos de secuenciacin del ADN que permiten que la variacin del ADN sea observada base por base. La secuenciacin es el mtodo de eleccin en la actualidad para analizar regiones del ADN, zonas de genes, regiones no codificantes, vectores etc.

Aplicaciones de las tcnicas de secuenciacin en el diagnstico de enfermedades hereditarias.

La Poliposis adenomatosa familiar (PAF) es una enfermedad autosmica dominante, que es clsicamente caracterizada por el desarrollo de cientos a miles de adenomas en el colon y el recto durante la segunda dcada de la vida. PAF tiene una incidencia de 1/8,300 nacimientos, y se manifiesta
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por igual entre ambos sexos. La PAF compone menos del 1% de los casos de cncer colorrectal. Casi todos los pacientes desarrollan cncer colorrectal (CCR) si no se identifican y son tratados en una etapa temprana. Las manifestaciones extracolnicas tales como plipos gstricos, duodenales e intestinales, osteomas, tumores desmoides, quistes epidermoideos, tumores del S.N.C., fibromatosis difusa, hipertrofia del epitelio pigmentario de la retina (H.E.P.R.) y tumores malignos que fueran descriptos por distintos investigadores como sndromes individuales, conocidos por el nombre de quien los describiera (Sme. De Gardner, Turcot Saint Despress), son debidos al crecimiento desordenado de otros tejidos, a causa de que la mutacin es heredada u ocurre durante la concepcin, estando presente en el ncleo de todas las clulas del organismo. La severidad del compromiso duodenal puede ser clasificada de acuerdo al nmero de plipos, el tamao, la histologa y el grado de displasia. En 1925 Lockhart Mummery reconoci una predisposicin hereditaria en la aparicin de plipos y cncer en la poliposis adenomatosa familiar. En los 80 se identific la localizacin del gen responsable y en 1991 se identificaron las bases moleculares de la P.A.F. Esta es causada por mutaciones en un gen supresor tumoral localizado en el cromosoma 5q21. La P.A.F. tiene una penetrancia cercana al 100%. La progenie de un paciente con poliposis tiene una posibilidad del 50% de heredar el gen defectuoso. El gen APC codifica para una protena de 2843 aminocidos y produce un ARN mensajero de 8,9 Kb dividido en 15 exones. La protena APC tiene mltiples dominios que median la oligomerizacin como la unin a una variedad de protenas intracelulares, las cuales tienen importantes roles en la adhesin celular, la transduccin de seales, y la activacin de la transcripcin. Otras caractersticas son: - Las mutaciones pueden ocurrir en varias localizaciones dentro del gen APC. - Las dos mutaciones ms comunes son en los codones 1061 y 1309, se describe un nuevo sitio con alta probabilidad de mutaciones en la ubicacin 1465. - Las mutaciones del APC patognicas resultan en un codn stop prematuro por alguno de estos mecanismos: sustitucin, delecin o insercin de nucletido. Hoy en da, una serie de pruebas genticas estn disponibles para analizar las mutaciones en el gen APC. El mtodo ms utilizado actualmente es la secuenciacin directa del gen APC. Cuando una mutacin especfica causante de la enfermedad se identifica, se debe realizar la prueba gentica a todos los parientes de primer grado. Miembros de la familia con un resultado negativo para la mutacin detectada en el paciente no necesitan ms investigacin y su seguimiento es el mismo de la poblacin en general. La informacin gentica no es solo relevante para el paciente afectado, sino tambin para la familia inmediata y sus futuros descendientes. La prevencin del cncer y el mantener una buena calidad de vida de estos pacientes son los objetivos principales. Por eso el diagnstico precoz a travs del anlisis de la secuencia del gen logr extender y mejorar la calidad de vida de estos pacientes. Tambin es relevante el conocimiento de que tipo de mutacin presentan los pacientes ya que ayuda a predecir la severidad de la enfermedad, dado que la ubicacin de la mutacin puede afectar la funcin de la protena de diferente manera.
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Farmacogentica

Es una ciencia que estudia las variaciones heredadas en los genes que dictan la respuesta a frmacos y explora las maneras que estas variaciones se pueden utilizar para predecir si un paciente tendr una buena, mala o ninguna respuesta a una determinada droga. Hay una diferencia entre farmacogentica y farmacogenmica? Farmacogenmica se refiere al estudio general de todos los muchos diversos genes que determinan comportamiento a una droga. La farmacogentica refiere al estudio de las diferencias heredadas (variaciones) en el metabolismo y respuesta a una droga. La distincin entre los dos trminos se considera arbitraria y ahora los dos trminos se utilizan alternativamente. Para entender mejor la importancia de esta nueva rama de la ciencia les describiremos un ejemplo.

Lucia es una nia de siete aos quin ha sido diagnosticada de leucemia. Su doctor quiere comenzar la quimioterapia cuanto antes. El purinethol es una droga comn de quimioterapia que trabaja incorporndose a las clulas cancerosas en activa divisin y luego produce su muerte celular. Esta droga fue utilizada por primera vez hace 30 aos. Mientras que la mayora de los pacientes fueron beneficiados por el uso de esta droga, los doctores saban que el tratamiento produca un riesgo de muy importante y los efectos secundarios eran a veces fatales en ciertos pacientes. No fue hasta los aos noventa que los doctores comenzaron entender porqu estos pacientes respondan tan negativamente a la droga. El misterio fue descubierto cuando los cientficos comenzaron a mirar como la droga era metabolizada en el cuerpo. Descubrieron que la enzima TPMT es responsable de metabolizar y de inactivar la droga Purinathol. Encontraron que en la poblacin variaban los niveles de la actividad enzimtica de TPMT. Dado que el Purinethol es una sustancia txica es importante que permanezca solamente en el cuerpo por una cantidad de tiempo limitada, afectando principalmente a las clulas cancerosas y no a las clulas normales. Por lo tanto, antes de prescribir la droga, es crtico que los doctores sepan si un paciente tiene suficiente actividad de TPMT para hacer inactivo con eficacia el Purinethol. Si los pacientes no pueden inactivar eficientemente el Purinethol sufrirn efectos secundarios txicos. El 89% de los nios poseen la capacidad de inactivar la droga txica eficientemente, mientras el 11% de los nios tienen una variante de TPMT con menor eficiencia de inactivacin de la droga sufriendo en consecuencia efectos secundarios severos si se les administra la dosis completa del tratamiento de Purinethol. Sin
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embargo, se beneficiarn de una dosis mucho ms baja. El 0.33% de nios que tienen la variante de menor actividad, y la sustancia txica puede persistir en el cuerpo de estos nios durante mucho mas tiempo por lo que sufrirn efectos secundarios severos o fatales si se les administra cualquier dosis de Purinethol. Saber qu variante gentica de TPMT posee el paciente influenciar el tratamiento enormemente. Para determinar la dosificacin de Purinethol que Lucia necesitar, su doctor recoge una muestra de ADN de su sangre y la enva a un laboratorio. El laboratorio realizar una prueba de diagnstico basada en el estudio de secuencias del ADN para determinar qu variante de TPMT tiene Lucia. El doctor recibe los resultados de la prueba, que demuestran que Lucia tiene la enzima con actividad parcial. Con este conocimiento l puede comenzar con confianza el tratamiento de Lucia, utilizando una dosificacin reducida de Purinethol. La historia de Lucia ilustra apenas una manera en que la farmacogentica puede ser utilizada en la clnica. La farmacogentica tambin ayuda a elegir la droga adecuada para un determinado paciente de una diversidad de distintos tratamientos. Por otro lado ayuda a determinar el riesgo de un paciente frente a un determinado tratamiento y a disear en funcin de esta informacin una estrategia para tratar la enfermedad.

DETECCION DE POLIMORFISMOS QUE CONTIENEN REGIONES ALTAMENTE VARIABLES

El ADN humano contiene algunas secuencias que estn repetidas en tndem un nmero variable de veces en ciertos loci dispersos en el genoma de diferentes individuos. Esas regiones se llaman regiones hipervariables porque contienen un nmero variable de repeticiones en tndem (variable number of tandem repeats, VNTRs) o bien minisatlites de ADN. Los VNTRs en humanos son secuencias de 1-5 kpb (kilopares de bases) que consisten en un nmero variable de unidades repetitivas de 15 a ms de 100 pb de longitud en los diferentes genomas de los individuos. El total del ADN es cortado con enzimas de restriccin que reconocen sitios que flanquean la regin VNTR, sin cortar dentro de los VNTRs, y se obtienen fragmentos que contienen esos loci, los cuales difieren en tamao de un individuo a otro, dependiendo del nmero de repeticiones que estn presentes. Los fragmentos de diferentes tamaos pueden ser separados por electroforesis en gel mediante la tcnica de Southern blot. Las sondas usadas para identificar esos fragmentos de restriccin se unen a la secuencia que est repetida o a una secuencia cercana a sta (Fig. 8). Dada la enorme variabilidad en el nmero de repeticiones en tndem de un individuo a otro, el grupo de fragmentos que aparece en la autorradiografa del Southern blot es altamente personalizado. Los patrones de fragmentos de restriccin producidos a partir de esos loci pueden usarse para identificar individuos de manera tan segura como la tradicional huella digital. En efecto, esta tcnica de fragmentos de restriccin suele ser llamada como la huella digital de ADN (DNA fingerprint) y es ampliamente usada en anlisis forense. Por este mtodo pueden determinarse relaciones familiares, y puede usarse para ayudar a incriminar o no a sospechosos en casos policiales. En investigaciones criminales, pueden usarse muestras de sangre o semen, hasta diminutas muestras de tejido como clulas del folculo piloso en el extremo de un nico pelo. Las secuencias de VNTRs se amplifican por la
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tcnica de PCR. Se realiza el DNA fingerprint y se comparan los patrones los resultados obtenidos a partir de la evidencia y de una muestra tomada del sospechoso. Individuos que estn estrechamente relacionados genticamente tendrn patrones de fragmentos de restriccin que son ms similares que aquellos que estn ms distantemente relacionados. Slo gemelos monocigticos tendrn patrones idnticos. Una de las primeras sondas que detectaron los VNTRs humanos fue obtenida en 1985 a partir de una cudruple repeticin de una secuencia de 33 pb encontrada dentro del primer intrn del gen de la mioglobina. Una vez que los VNTRs se clonaron y secuenciaron, se encontr que la razn de la hibridacin de la sonda a los VNTRs era una secuencia central (core) de 13 pb comn a todas las repeticiones y a la sonda. Las secuencias flanqueantes a ese core, no eran necesariamente similares.

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Figura 8: Obtencin de un DNA fingerprint, utilizando una sonda para VNTR: Panel a). La sonda utilizada reconoce una secuencia interna de 13 pb presente en los VNTR Panel b): En este diagrama se observa tres cromosomas somticos homlogos conteniendo VNTRs para cada individuo (I, II, III). El tamao de los fragmentos depende del nmero de repeticiones que ellos contengan. Se realiza un Southern-blot utilizando la sonda indicada en a) y se visualizan los fragmentos de restriccin producidos a partir del material genmico de los individuos (A, B y C).

Aplicaciones de la huella gentica: La huella gentica se utiliza en la medicina forense, para identificar a los sospechosos con muestras de sangre, cabello, saliva o semen. Tambin ha dado lugar a varias exoneraciones de condenados. Igualmente se utiliza en aplicaciones como la identificacin de los restos humanos, pruebas de paternidad, la compatibilidad en la donacin de rganos, el estudio de las poblaciones de animales silvestres, y el establecimiento del origen o la composicin de alimentos. Tambin se ha utilizado para generar hiptesis sobre las migraciones de los seres humanos en la prehistoria.

Muestras de referencia Para la identificacin del ADN se debe realizar una extraccin de ADN que puede proceder de sustancias tales como:

-Artculos personales (por ejemplo cepillo de dientes, maquina de afeitar). -Banco de muestras (como un banco de esperma o la biopsia de un tejido). -Parientes de sangre. -Restos humanos previamente identificados. -Algunas muestras de referencia son recolectadas con un hisopo bucal.

Existe adems otra clase de secuencias repetitivas de ADN dispersas, los microsatlites (short tandem repeats, STRs) que contienen repeticiones ms cortas, de 2 a 5 pb. Existen literalmente cientos de sistemas de STRs que han sido mapeados en todo el genoma humano. Varios STRs fueron investigados para su aplicacin en tests de identificacin de humanos. Estos STRs fueron encontrados en casi todos los cromosomas en el genoma y pueden ser amplificados usando una variedad de cebadores por el mtodo de PCR. La comunidad de ADN forense se ha volcado primariamente hacia el anlisis de las repeticiones de 4 pb que son amplificadas por PCR con mayor fidelidad que las repeticiones dinucletidicas aunque tambin se usan repticiones tri y pentanucleotdicas. Al examinar mltiples STR loci, se puede obtener un alto grado de discriminacin entre individuos dada la enorme variedad de alelos presentes en una poblacin.

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Short Tandem Repeats (STRs)

AATG

7 repeticiones 8 repeticiones La regin repetida es variable entre muestras mientras que las regiones laterales donde se unen los cebadores para la PCR son constantes. Homocigota = Ambos alelos tienen el mismo nmero de repeticiones Heterocigota = Los alelos son distintos y pueden ser diferenciados

Ventajas de los STRs sobre los VNTRs

El studio de STRs por PCR presenta varias ventajas sobre las tcnicas convencionales de Southern blot de los VNTRs. Los alelos discretos de los STRs pueden ser obtenidos dado su tamao ms pequeo pudindose diferenciar los fragmentos de ADN por una nica base, adems puede usarse menor cantidad de ADN inclusive ADN degradado. Por lo tanto, la integridad y cantidad de muestra es un problema menor al utilizar los mtodos de tipificacin por basados en PCR que con los mtodos convencionales de obtencin de fragmentos de distintos tamaos como los VNTRs. Para revisin del uso de STRs en identidad gentica, se puede acceder a:

http://www.promega.com/pnotes/58/5189c/5189c.html.

Vicky Tim era una joven de 21 aos que condujo hasta el supermercado para comprar ciertos ingredientes que necesitaba para preparar la cena de ese da. Cuando no hubo regresado dos horas despus, su padre fue hasta el supermercado a buscarla. Encontr su auto estacionado en la puerta, pero Vicky no estaba, y llam a la polica. Se realiz una bsqueda en las inmediaciones y el cuerpo de Vicky se encontr en un rea boscosa cercana al edificio. Ella haba sufrido abuso sexual y muri por estrangulacin. Los mdicos de la polica tomaron muestras de semen del fluido vaginal, de la sangre que se hallaba debajo de las uas de la vctima y de sangre de la propia vctima. Los testigos identificaron a varios hombres que haban hablado a Vicky durante el tiempo que ella estuvo en el supermercado. Se obtuvieron muestras de ADN de los sospechosos y se utilizaron para el anlisis de huellas digitales de ADN.

Las huellas dactilares de ADN resultaron un importante avance en medicina forense. Antes del desarrollo de esta tcnica, la identificacin de delincuentes era mucho menos cientfica. Igualmente,
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debe aclararse que esta metodologa ha sido discutida en algunos mbitos por problemas en las interpretaciones estadsticas. Es absolutamente necesario que se tengan en cuenta todos los controles, incluyendo muestras de ADN de la vctima, no slo del sospechoso. Otro cuestionamiento a esta tcnica, es que dada la gran amplificacin obtenida por PCR se pueden amplificar cantidades mnimas de ADN contaminante de una fuente no relacionada con el caso. Los resultados obtenidos de las muestras tomadas de los sospechosos fueron comparados con el del ADN obtenido de una muestra de sangre tomada de la vctima (Fig. 9; carril 1). Aunque slo se pudieron obtener pequeas cantidades de dicha muestra del cuerpo de Vicky, la cantidad de ADN pudo ser amplificada por PCR. Los resultados, usando una sonda que reconoce una de las secuencias repetitivas del ADN humano, se muestran en la Figura 9.

1- A qu se debe que en los distintos individuos aparezcan fragmentos distintos marcados si se utiliza la misma sonda? 2- Cul de los sopechosos le resultara culpable? 3- Por qu se analiza tambin el ADN de la vctima?

1-Muestra de sangre de la vctima

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Figura 9: Anlisis de los VNTRs realizado con las distintas muestras obtenidas en la escena, el carril 1 muestra los fragmentos de VNTRs obtenidos de la muestra de sangre tomada de la vctima. Las muestras obtenidas se amplificaron por PCR y se sometieron a Southern blot utilizando una sonda que reconoce una secuencia de 13 pb comn a todos los VNTRs presentes en el genoma humano.

USO DE TECNICAS DE ADN RECOMBINANTE PARA LA PREVENCIN Y TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES

Produccin de Protenas Teraputicas:

Con el desarrollo de mtodos que permiten la transferencia de genes especficos de una clula a otra, y la induccin de la expresin de los mismos en el nuevo hospedador, la industria farmacutica ha adquirido una gran potencialidad. Algunas compaas farmacuticas han empezado ya la produccin de polipptidos humanos por bacterias o levaduras. Un ejemplo de estos polipptidos producidos son hormonas como la insulina, hormona del crecimiento, glucagon, interferon, factores de la coagulacin, factor VIII, etc. Estos productos se encuentran comnmente en venta en las farmacias y son producidos por tcnicas de biotecnologa. El primer paso para lograr esta produccin de protenas es el clonado de un cDNA a un vector de expresin. Un vector de expresin es un plsmido que adems de contener las caractersticas anteriormente mencionadas debe tener adems las secuencias que permitan la transcripcin y traduccin del ADN insertado en dicho vector permitiendo de esta manera la expresin de la protena. Para realizar la expresin de una protena humana en una clula o sistema procarionte como la Escherichia coli (E. coli) se necesita obtener la secuencia codificante de dicha protena. Esto se puede realizar mediante la tcnica de RT-PCR que consiste en transcripcin reversa y PCR. Se realiza la produccin del ADNc por transcripcin reversa y mediante cebadores especficos se amplifica por PCR la secuencia del ADNc de la protena de inters. Por qu no podemos utilizar la secuencia completa del gen de la protena? Porque las bacterias no realizan splicing y no podran remover los intrones y empalmar los exones de un transcripto primario. La secuencia codificante o gen de inters debe ser insertado en el vector adyacente (ro abajo) a un promotor procarionte como puede ser el promotor T7 que ser reconocido por la ARN polimerasa T7 de la bacteria y resultar en una alta produccin de la protena de inters en la bacteria, que luego podr ser purificada e identificada. Cmo podemos identificar las bacterias que contienen el plsmido recombinante y expresan la protena de inters? Podemos crecer distintas colonias de bacterias y aislar las protenas analizando la expresin de nuestra protena de inters mediante Western blot. Una vez identificadas estas bacterias las mismas pueden ser utilizadas para producir la protena en gran escala. La misma ser purificada del resto de las protenas bacterianas mediante tcnicas de purificacin.

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La aplicacin de las tcnicas de ADN recombinante a la fabricacin de insulina ha disminuido sustancialmente el precio de dicha hormona. La insulina que era utilizada corrientemente en la terapia de la diabetes se extraa del pncreas de vacas o cerdos. Dicha insulina difiere ligeramente en su secuencia de aminocidos de la insulina humana, y aunque la mayora de dichas insulinas controlan los principales sntomas del diabtico, pueden presentarse efectos secundarios, como el deterioro renal y de la retina; y generar alergias u otro tipo de reacciones inmunolgicas Esta metodologa se utiliz para la produccin de la hormona del crecimiento humana (hGH) (Figura 10) y de interferones. La deficiencia en hormona del crecimiento hipofisaria conduce a una forma de enanismo que puede tratarse por administracin de la hormona. Dicha hormona es caracterstica de cada especie; la fuente de la que se la obtena anteriormente eran cadveres humanos. Su escasa disponibilidad, an a pesar de sus muchas aplicaciones clnicas, ha constituido un factor condicionante del desarrollo de la investigacin sobre la misma.

Primer aminocido de la hGH madura Remocin de codones para los aminocidos 1-24

Codn stop

Corte con EcoRI

Aislar el fragmento de ADN que codifica para los aminocidos 24-191 Oligonucletido sinttico para los aminocidos 1-24 Ligar

Metionina iniciadora

Corte con HindIII Ligar

Vector de expresin

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Metionina iniciadora Promotor

Secuencia de la hGH

Figura 10: Expresin de la hormona de crecimiento humana (hGH) en E.coli. La secuencia humana es removida permitiendo que la protena sea producida por las clulas bacterianas. El producto contiene una metionina bacterial extra

La hGH se utiliza en la clnica para tratamiento de desordenes de crecimiento en nios y deficiencia en el crecimiento en adultos. En los aos recientes, las terapias de reemplazo con hGH ha mostrado efectos en pacientes deficientes incluyendo disminucin de grasa corporal, aumento de masa muscular, densidad sea, niveles energticos, y mejora de la funcin del sistema inmune. Aunque la hGH se ha obtenido en cantidad exitosamente en organismos procariontes, la bioactividad obtenida de esta manera ha sido escasa. Por lo tanto, las protenas que necesitan modificaciones posttraduccionales necesarias para su actividad biolgica (glicosilacin, fosforilacin, etc.) o alguna conformacin particular no pueden ser producidas en bacterias, y se debe utilizar sistemas eucariontes para su produccin. Los vectores de expresin utlilizados en este caso difieren en que las secuencias promotoras que regulan la transcripcin son de origen eucarionte. En este caso pueden utilizarse clulas de levaduras, algas, plantas, insectos, gusanos de la seda (Bombix mori) y mamferos.

Protenas humanas ms complejas han sido producidas en clulas de mamfero en cultivo. El gen del Factor VIII, una protena involucrada en la coagulacin de la sangre, est alterado en individuos con hemofilia. Antes de que se dispusiera de Factor VIII por ingeniera gentica, muchos hemoflicos murieron de SIDA o hepatitis debido a que ellos contrajeron la enfermedad por transfusiones con sangre contaminada o con Factor VIII aislado a partir de sangre contaminada. El activador del plasmingeno tisular (TPA) es una proteasa presente en la sangre que convierte el plasmingeno en plasmina, una proteasa que a su vez cliva a la fibrina, y disuelve los cogulos de sangre. El TPA recombinante, producido en cultivos de clulas de mamfero, se administra frecuentemente durante o inmediatamente luego de un ataque cardaco para disolver los trombos que ocluyen las arterias coronarias.
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Vacunas:

Antes del advenimiento de la tecnologa de ADN recombinante, las vacunas se hacan a partir de agentes infecciosos los cuales eran previamente destruidos o atenuados (alterados de tal manera que no podan multiplicarse en un individuo inoculado). Ambos tipos de vacunas eran potencialmente peligrosas debido a que podan estar contaminadas con el agente infeccioso vivo. En efecto, en un pequeo numero de casos, la enfermedad fue causada por la vacunacin. Debido a que el sistema inmunitario humano responde a protenas antignicas de la superficie de un agente infeccioso, se hizo muy atractiva la posibilidad de producir esos antgenos por tcnicas de ADN recombinante. Por estas tcnicas, las protenas pueden producirse completamente libres del agente infeccioso y usarse en la vacuna, as se elimina todo riesgo de infeccin. La primera vacuna recombinante que fue producida de forma satisfactoria fue la vacuna contra el virus de la hepatitis B. La primera vacuna disponible contra la hepatitis B contena virus de Hepatitis B (HBV) muerto qumicamente inactivado. El virus haba sido obtenido de sangre de individuos que se saba eran portadores de HBV. Ms tarde, se usaron vacunas en las que el virus permaneca vivo pero haba sido alterado como para que no se multiplicara ms en el individuo inoculado (atenuado) Ambas vacunas, la de virus inactivado y la de virus atenuado, son potencialmente peligrosas porque pueden estar contaminadas con HBV infectivo. Las nuevas vacunas, comercializadas desde 1987, fueron obtenidas por tcnicas de recombinacin de ADN. Ya que esta vacuna consiste nicamente en la protena de superficie del virus, antgeno contra el cual responde el sistema inmune, no hay riesgo de infeccin por HBV. El virus contiene un antgeno de superficie (HBsAg, llamado tambin antgeno australiano) cuyo ADN ha sido aislado. Pero debido al hecho de que la protena est glicosilada, no puede ser producida en Escherichia coli (debido al hecho de que las bacterias no poseen organelas subcelulares, no pueden glicosilar protenas). Por lo tanto, se utiliza un sistema de expresin en levaduras (clula eucarionte) para producir la forma glicosilada de la protena. La protena viral, separada de una pequea cantidad de protenas de levadura, se utiliza como vacuna en la inmunizacin contra el virus causante de la hepatitis B.

Algunas protenas obtenidas por tcnica de ADN recombinante utilizadas en la medicina:

Productos
Anticoagulantes, TPA

Usos
Activa plasmina, una enzima involucrada en la disolucin de los trombos, por lo tanto efectivo en el tratamiento de pacientes con afecciones cardacas o circulatorias en general. Promueve la coagulacin deficiente en pacientes hemoflicos; su uso elimina los riesgos de infeccin generados por mltiples transfusiones. Son factores de crecimiento del sistema
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Factores de la coagulacin, Factor VIII

Factores estimulantes de colonias (CSF)

Eritropoyetina

Factores de crecimiento

Hormona de crecimiento humana (hGH) Insulina humana Interferones Interleuquinas

Anticuerpos monoclonales (mAbs)

Superxido dismutasa (SOD)

Vacunas

inmune que estimulan la produccin de leucocitos, usados para tratar deficiencias inmunolgicas y contra infecciones. Estimula la produccin de eritrocitos; usado para tratar anemias en pacientes con enfermedades hepticas. Estimula la diferenciacin y crecimiento de varios tipos celulares, usado para promover curacin de heridas. Usada para tratar el enanismo Usada para tratar diabetes Interfieren con la replicacin viral, usados para tratamiento de algunos tumores. Activan y estimulan diferentes clases de leucocitos; posibles usos en infeccin con VIH, cncer y deficiencias inmunolgicas. Especificidad de unin, usados en: tests diagnsticos, transporte dirigido de drogas, toxinas o compuestos radioactivos como terapia antitumoral. Previene dao tisular de las especies reactivas del oxgeno cuando el tejido brevemente se somete a bajo oxgeno para luego aumentar abruptamente como en cirugas. Protenas derivadas de la cpside viral efectivas en alertar al sistema inmune pero ms seguras que las tradicionales a virus inactivado.

Tomado del Lehninger Principios de Bioqumica David L. Nelson y Michael M. Cox

ANIMALES TRANSGENICOS

Normalmente, en los organismos superiores animales o vegetales la informacin gentica se transmite por mecanismos de reproduccin sexual; es lo que se conoce como transmisin gentica vertical. Sin embargo, hace ya unos veinte aos se logr obtener los primeros ratones transgnicos mediante transferencia gnica por inyeccin directa de ADN extrao en un cigoto obtenido por fecundacin in vitro (Figura 11); es decir, se trataba de una transmisin gentica horizontal, tambin llamada transgnesis. Dado que el cigoto se hace transgnico inicialmente, el ADN extra pasa a las clulas germinales y luego es transferido a la progenie derivada de estas clulas comportndose como un gen nuclear regular. Al igual que ocurre en plantas, los animales son manipulados no slo para mejorar la calidad del animal mismo, pero tambin para ser productores convenientes de una protena particular como se explica ms adelante en granjas farmacuticas. La generacin de animales transgnicos es esencial para el estudio in vivo de la funcin de genes durante el desarrollo, organognesis y el envejecimiento. Tambin permite la evaluacin de estrategias teraputicas en modelos de enfermedades humanas, as como la investigacin de la progresin de
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la enfermedad de una manera que no sera posible en seres humanos. Dentro de las aplicaciones comerciales se incluyen la preparacin de protenas recombinantes, la proteccin de animales contra una enfermedad, y la introduccin de nuevos rasgos genticos.

Figura 11: Esquema de la introduccin del gen de la hormona de crecimiento de rata en ratones. Se microinyectaron copias de un plsmido de ADN recombinante que contena el gen de la hormona de crecimiento de rata a vulos fertilizados de ratn, que se implantaron en madres adoptivas. Algunos de los ratones de la descendencia contenan el gen forneo integrado en su propio genoma y expresaron una cantidad mucho mayor de lo normal de la hormona de crecimiento razn por la cual crecieron mucho ms que sus compaeros de camada de tamao normal.

Se han producido animales transgnicos en una gran variedad de especies. Dentro de los vertebrados, se han desarrollado en especies de peces, anfibios, aves y mamferos. Algunas especies de invertebrados incluyen algunos ampliamente utilizadas en investigacin, tales como los artrpodos Drosophila melanogaster, y el nematodo Caenorhabditis elegans.

Objetivos y aplicaciones:

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La Biotecnologa incluye cualquier tcnica que utilice organismos vivos o parte de los organismos para fabricar o modificar productos, mejorar plantas o animales o desarrollar microorganismos para usos especficos. La potencialidad de la biotecnologa estriba en producir cantidades ilimitadas de: Substancias de las que nunca se haba dispuesto con anterioridad. Productos que se obtenan en pequeas cantidades. Abaratamiento de los costos de produccin. Mayor seguridad en los productos obtenidos. Nuevas materias primas, ms abundantes y menos caras.

Dentro de este contexto general, la Biotecnologa ha incorporado la transgnesis animal con los siguientes fines: Mejora de caracteres productivos Resistencia a enfermedades Modelos animales de enfermedades humanas (por ejemplo, ratones knockout). Animales transgnicos como biorreactores para la sntesis de protenas de alto valor (protenas teraputicas): Las "granjas farmacuticas" o "granjas moleculares" Donacin de rganos: Xenotransplantes

Disrupcin o reemplazo de genes en ratones: Knockout

A partir de la disrupcin de genes en levaduras, se ha ganado invalorable informacin sobre el rol de un gen especfico a travs de su reemplazo por una copia mutada. Estas versiones llamadas organismos knockout pueden presentar fenotipos modificados que luego pueden ser examinados. Por ejemplo, se han creado los ratones knockout que carecen de las enzimas vitales de reparacin del ADN con el objetivo de estudiar si este fenotipo causa un incremento en la tasa de aparicin de tumores. Brevemente, se prepara un vector de ADN que contenga el gen de inters clonado e interrumpido in vitro por la insercin, por ejemplo, del gen de neomicina (que codifica para la resistencia al antibitico neomicina), se genera entonces un gen mutado artificialmente. Cabe aclarar que las clulas de mamfero no poseen gen de resistencia a neomicina. El gen de resistencia a antibitico se usar luego como un marcador que indica que el vector de ADN ha sido captado por las clulas y se ha insertado en el cromosoma del hospedador. Luego se introduce el vector en clulas aisladas de un embrin de ratn. Cuando ocurre la recombinacin homloga, las regiones que contienen el gen interrumpido toman el lugar del gen original. Para detectar las clulas que portan el gen mutado se colocan las clulas en un medio de cultivo conteniendo las drogas seleccionadas, por ej. en este caso, un compuesto anlogo a neomicina. Este compuesto es letal para las clulas que no tienen el gen de resistencia a neomicina funcional y entonces se eliminan las clulas en las cuales no ha habido integracin del vector. Las clulas seleccionadas se inyectan en un embrin temprano (blastocisto) y se implantan en
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una madre sustituta. La progenie resultante ser heterocigota que luego se cruzar para la obtencin de la segunda generacin entre los cuales habr homocigotas para el gen mutado.

Granjas farmacuticas

La Biotecnologa ha aplicado estas tcnicas experimentales de transgnesis y ya hoy se estn estableciendo las primeras granjas farmacuticas en las que se cran ovejas, cabras, vacas o cerdos transgnicos que producen en su leche protenas teraputicas humanas. La manipulacin gentica de un mamfero domstico transgnico consiste, en primer lugar, en preparar el fragmento de ADN que contiene el gen humano, unindolo a otro fragmento de ADN correspondiente a un elemento regulador (promotor) procedente de un gen que promueve la sntesis de una protena de la leche (por ejemplo, la -lactoglobulina, la casena, etc.). De esta manera se asegura que el gen humano slo se expresar en las clulas de las glndulas mamarias del animal transgnico (oveja, cabra, vaca, cerdo) obtenido tras la inyeccin del ADN manipulado en el proncleo masculino de un cigoto producido por fecundacin in vitro. (Figura 12). Se ha conseguido que la leche de las hembras transgnicas contenga protenas teraputicas humanas ( -1-antitripsina, protena C, factor VIII de coagulacin, antitrombina III, etc.) que pueden luego ser fcilmente separadas de las restantes protenas propias del animal. Es importante sealar que el animal transgnico no se ve perjudicado en su desarrollo porque el gen humano slo se expresa en las clulas de las glndulas mamarias debido al regulador especfico al que se lo ha asociado y, por tanto, en las restantes clulas del animal no se sintetiza la protena humana al estar silenciado el gen humano. Tambin se utilizan vacas con el objetivo de obtener leche maternizada, suprimiendo mediante la tcnica de "knockout" del gen de la -lactoglobulina de la leche de vaca para imitar a la leche humana que no la tiene. En argentina, en el ao 2002 se logr clonar por primera vez tres terneras transgnicas que producen hormona de crecimiento humana, vital para tratar a las personas que padecen enanismo.

Figura 12: Microinyeccin de ovocitos fecundados

Un animal puede llegar a producir no menos de un gramo de esa protena transgnica por litro
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de leche secretada lo que equivale a cinco kilos de esta protena en su leche por ao.

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Una vez que se tiene el animal transgnico, es posible obtener otros idnticos a partir de la clonacin. De esta forma se puede conservar y multiplicar alguna caracterstica beneficiosa. En los prximos aos se esperan avances en estos desarrollos biotecnolgicos. En Argentina, ya se obtuvieron descendientes de Mansa, una dinasta de animales transgnicos que integran el "tambo farmacutico".

TERAPIA GENICA.

La terapia gnica se define como la transferencia in vivo o ex vivo de una secuencia gentica para reemplazar material gentico defectuoso o conferir una nueva actividad a la clula. Al principio se pens que la terapia gnica era un procedimiento apropiado slo para el tratamiento de enfermedades de origen hereditario, pero actualmente est en experimentacin en enfermedades cardiovasculares, SIDA, cncer, autoinmunidad y otras patologas. Esta terapia ha tenido resultados buenos en animales de laboratorio, y la bioseguridad de la transferencia gentica ha sido comprobada, dependiendo del tejido afectado. En humanos, ha tenido algunos logros en patologas asociadas al pulmn y a tumores de piel, pero la gran mayora de tratamientos se encuentran en fase experimental en animales de laboratorio y en pacientes en los que otros tratamientos no fueron efectivos. Igualmente, esta nueva terapia abre nuevos interrogantes ticos y sociales.

Para introducir eficientemente el gen bueno dentro de las clulas, pueden usarse retrovirus (virus con ARN) o adenovirus (virus con ADN lineal doble cadena). Se observ que las transfecciones con adenovirus eran transitorias, por lo que se necesitaba que el paciente realice el tratamiento en forma diaria o cada 2 o 3 das. En cambio, las transfecciones con retrovirus fueron ms permanentes, fundamentalmente porque son ms hbiles para escapar a la respuesta inmune. Actualmente se estn utilizando virus HIV como vectores, sustituyendo genes infectivos y algunos genes de la cpside, pero en este caso las restricciones deberan ser ticas. El objetivo de esto es liberar al marcador vrico a una zona particular en una embrin o en una persona infectando as un nmero limitado de clulas, a partir de la cual se obtendr un clon de clulas que contenga el marcador vrico integrado. Tambin se est experimentando con liposomas, formados por lpidos cargados positivamente que pueden interaccionar con las cargas negativas de la membrana celular y entrar. Se probaron diferentes sistemas de transferencia ADN-liposomas en pacientes mediante catteres, pero se encontr que tenan baja eficiencia de transfeccin y alta toxicidad. Todos los sistemas enumerados hasta ahora logran insertarse en cualquier clula, ya que no tienen receptores especficos. Actualmente se estn desarrollando diferentes sistemas de transferencia con receptores, para tratar un solo tipo celular, pero como deben incorporarse diferentes seales (seal
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para evadir los lisosomas despus de la entrada a la clula, seal para atravesar los poros nucleares, etc) dentro del vector sinttico, la eficiencia de transfeccin es muy baja. Los criterios seguidos en general pueden resumirse: 1- las investigaciones estn restringidas a clulas somticas. As pues los individuos transferir a su descendencia las modificaciones genticas adquiridas. 2- el riesgo de la aplicacin de la tcnica tiene que ser largamente superado por los beneficios a obtener. Existe una posibilidad inherente de que el ADN se integre en un gen funcional llevando a la inactivacin de dicho gen. De tratarse de un gen relacionado con la proliferacin celular podra producirse una clula cancerosa. 3- La enfermedad en estudio debe ser el resultado de la alteracin de un nico gen. no pueden

La terapia gnica no es un campo nuevo, ya que ha venido desarrollando durante dcadas. A pesar de los esfuerzos de los investigadores de todo el mundo, la terapia gnica ha visto slo un xito limitado. La terapia gnica slo funcionar si somos capaces de entregar un gen normal para un gran nmero de clulas - por ejemplo, varios millones - en un tejido. Y tienen que ser las clulas correctas, en el tejido correcto. Una vez que el gen llegue a su destino, debe ser activado, producir la protena codificada por el gen. La entrega y activacin del gen son los mayores obstculos que enfrentan los investigadores de terapia gnica. La orientacin de un gen a las clulas correctas es crucial para el xito de cualquier tratamiento de terapia gnica. Igualmente importante, sin embargo, es asegurarse de que el gen no est incorporado en las clulas equivocadas. La entrega de un gen en el tejido malo sera ineficaz y podra causar problemas de salud para el paciente. Por ejemplo, la orientacin inadecuada puede incorporar el gen teraputico en la lnea germinal de un paciente. Si esto sucede, el paciente podra transmitir el gen introducido a su descendencia. Las consecuencias seran variar, dependiendo del tipo de gen introducido. Por otro lado, los vectores utilizados deben ser capaces de escapar del sistema inmune. De lo contrario, puede causar enfermedades graves o incluso la muerte. La historia de Jesse Gelsinger ilustra este reto tambin. Gelsinger, que tena un trastorno heptico raro, participaron en un ensayo de terapia en 1999 del gen de la Universidad de Pennsylvania. l muri de complicaciones de una respuesta inflamatoria poco despus de recibir una dosis de vector adenovirus experimental. Su muerte se detuvo todos los ensayos de terapia gnica en los Estados Unidos por un tiempo, lo que desat un debate muy necesario sobre la mejor manera de regular los ensayos experimentales y de informe de los problemas de salud en pacientes voluntarios. Tambin hay que tener en cuenta que para ser efectiva la terapia el gen debe integrarse al genoma de las clulas en el tejido blanco, pero puede ocurrir que dicha insercin altere la expresin de algn otro gen en forma colateral por ejemplo, si se inserta en un sitio y afecta la expresin de un gen supresor de tumores, las clulas portadoras podran expresar la protena de inters pero a la vez adquirir un fenotipo proliferativo y eventualmente tumoral.
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Ejercicios:

1) Dos bebs del mismo sexo (B1 y B2) nacieron el mismo da en el mismo hospital. Debido a que se sospech que los mismos fueron accidentalmente cambiados en la nursery del hospital, se llev a cabo un test gentico basado en fragmentos de restriccin del ADN que exhiben polimorfismo debido a que contienen un nmero variable de tandems repetidos. Se obtuvieron muestras de sangre de los padres y de los bebs, se extrajo el ADN y se amplific por PCR. El ADN luego fue tratado con la enzima de restriccin Ban I y se separaron los fragmentos obtenidos por electroforesis en gel de agarosa. Los resultados de un Southern blot son los mostrados ms abajo. Para revelar los fragmentos se us una sonda radioactiva que se une a una secuencia dentro de los fragmentos Ban I que exhiben polimorfismos. Basados nicamente en este test, quines son, con mayor probabilidad, los padres del beb B1 y quines los del beb B2? (MA es una de las madres y PA es su marido y MB es otra de las madres y PB su marido).

MA

PA

B1

B2

MB

PB

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2) Se ha encontrado una enfermedad relacionada con el gen X que codifica para la enzima Z. La causa de dicha enfermedad es la ausencia de la actividad de Z. Se hicieron pruebas a distintos individuos utilizando diferentes tcnicas de biologa molecular: southern y northern blot utilizando una sonda marcada que es el ADNc especfica para el gen X y western blot utlizando anticuerpos especficos para la enzima Z. En el anlisis de Southern blot primero se realiz digestin del ADN con la enzima de restriccin EcoRI. El individuo A es el control normal que no presenta la enfermedad. El individuo B no presenta.sntomas pero algunos de sus hijos presenta la enfermedad. El individuo C y D presentan la enfermedad. a) Explique porqu el individuo B no presenta sntomas. b) Sugerir posibles defectos que lleven a la enfermedad en el individuo C y D a partir de los resultados obtenidos. Justifique su respuesta.

En el grfico se representan las autorradiografas de las distintas tcnicas. A, B, C y D corresponde a los carriles de las muestras de los correspondientes pacientes.

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D
Peso molecular

Southern blot

5 Kb 4 Kb 1 Kb

A
Northern blot

3 Kb

A
Western blot

43 kDa

20 kDa

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