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COLESTEROL ENZIMTICO LQUIDO

FINALIDADE Sistema para determinao enzimtica do colesterol total no soro ou plasma. Somente para uso diagnstico in vitro. PRINCPIO O Colesterol no soro quantificado atravs das seguintes reaes enzimticas: Col. esterase 1- steres de colesterol + H2O Colesterol livre + cidos graxos Col. oxidase 2- Colesterol livre + O2 Colesterona + H2O2 Peroxidase 3- 2H2O2 + 4 aminoantipirina + Fenol 4-Antipirilquinonimina + 4 H2O O produto formado pela oxidao da 4-aminoantipirina (4-antipirilquinonimina) de colorao avermelhada e sua intensidade diretamente proporcional concentrao de colesterol no soro. A cor vermelha, formada pela reao, medida em espectrofotmetro ou fotocolormetro com absoro mxima em 510nm ou filtro verde. REAGENTES Reagente de Cor: Soluo tampo de Pipes 35mmol/L, pH 7,0, contendo Colato de sdio 0,5mmol/L, 4-Aminoantipirina 0,5mmol/L, Colesterol Esterase > 300U, Colesterol Oxidase > 204U e Peroxidase > 828U. Soluo Padro 200mg/dL: soluo aquosa estabilizada de colesterol. APRESENTAO Colesterol Enzimtico Lquido 200 Reagente de cor 2 x 100mL Soluo padro 200mg/dL 1x 3mL Colesterol Enzimtico Lquido 500 Reagente de cor 2 x 250mL Soluo padro 200mg/dL 1x 3mL NMERO DE TESTES Colesterol Enzimtico Lquido 200 Manual 100 testes (20L amostra/2mL Reag. de cor)
200 testes (10L amostra/1mL Reag. de cor)

BIOQUMICA CLNICA

Protocolos de automao encontram-se disponveis no site Doles ou atravs do Servio de Atendimento ao Consumidor. EQUIPAMENTOS E MATERIAIS NECESSRIOS NO FORNECIDOS Espectrofotmetro ou fotocolormetro capaz de medir a absorvncia em 510nm ou filtro verde. Tubos de ensaio. Pipetas graduadas. Pipetas semiautomticas 10L /20L. Ponteiras descartveis. Banho maria (370C). Cronmetro. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES Reagente de Cor: armazenar temperatura de 2-8oC, at a data de vencimento indicada no rtulo do frasco. Ao longo do tempo, a soluo pode adquirir tonalidade rsea, no interferindo nos resultados. Soluo padro 200mg/dL: armazenar temperatura de 2-8 oC. Estvel at a data de vencimento indicada no rtulo do frasco, se obedecidas as condies de armazenamento. CUIDADOS E PRECAUES COM O USO DOS REAGENTES Todos os reagentes so somente para uso diagnstico in vitro. Seu manuseio deve ser cuidadoso, evitando-se o contato com a pele e mucosas. Havendo contaminao acidental, lavar a rea afetada em gua corrente. O descarte do material utilizado dever ser feito obedecendo-se os critrios de biossegurana estabelecidos pelo laboratrio, de acordo com as normas locais, estaduais ou federais. O Reagente de Cor deve ser manipulado com cuidado, evitando a introduo de pipetas no mesmo. Pipetas contaminadas com detergentes podem levar deteriorao do mesmo.
Observar a simbologia constante nos rtulos do produto:

Irritante

Automtico (*)

800 testes

Colesterol Enzimtico Lquido 500 Manual 250 testes (20L amostra/2mL Reag. de cor)
500 testes (10L amostra/2mL Reag. de cor)

Automtico (*) 2000 testes (*) A quantidade de testes na automao varivel de acordo com o equipamento.

AMOSTRA Soro ou plasma (heparina) isentos de hemolise. Aps jejum de 12 a 16 horas, o sangue colhido com o mnimo de estase, devendo o soro ou plasma serem separados no mximo em duas horas aps a coleta. Quando refrigerada (2-8oC ), a amostra se conserva por 7 dias e 3 meses quando mantida a 10oC negativos.

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Todas as amostras biolgicas devero ser consideradas como potencialmente infectantes. PROCEDIMENTO TCNICO O Reagente de cor est pronto para uso, e deve estar temperatura ambiente no momento do uso. Identificar 3 tubos com B(branco), P(padro) e T(teste). Proceder como segue:
Branco Reagente de Cor Padro Teste 2mL Padro 2mL 20L Teste 2mL -

Fator (F) , desde que o valor encontrado seja inferior a 800mg/dL. O kit de Colesterol Enzimtico Lquido Doles, possui padro no intervalo de linearidade da metodologia adotada. O laboratrio deve realizar o ensaio com o padro que acompanha o kit e calcular seu Fator (F) de acordo com o exemplo mostrado abaixo. O fator dever ser refeito periodicamente e a cada lote do produto. Os padres utilizados na montagem da curva de calibrao so uma soluo aquosa de Colesterol cujas concentraes variam entre 100 e 1000mg/dL. Os mesmos foram rastreados frente a Cholesterol in Human Serum Standard Reference Material 1952 a NIST/CAP. CLCULOS Colesterol (mg/dL) = Exemplo: Leituras: Padro : 0,305 Teste : 0,160 Colesterol (mg/dL) = Absorvncia Teste Absorvncia Padro x 200

20L

Misturar por agitao e incubar durante 5 minutos em banho maria a 37oC ou 10 minutos temperatura ambiente (20 30C). Proceder leitura das absorvncias em espectrofotmetro ou fotocolormetro entre 490 - 510nm, zerando o aparelho com o branco. A cor desenvolvida permanece estvel por 30 minutos temperatura ambiente (20-30oC). CURVA DE CALIBRAO
Padro Absorvncia Conc. (mg/dL)

0,160 0,305

x 200 = 105mg/dL

Como a reao corada segue estritamente a lei de Beer, basta a determinao de um fator(F) para clculo dos resultados. Fator = 200 Absorvncia

1 2 3 4 5 6 7 8 9

0 0,151 0,302 0,604 0,755 0,906 1,057 1,208 1,370

-0 100 200 400 500 600 700 800 1000

Colesterol (mg/dL) = absorvncia Teste x F Para a determinao do fator, recomenda-se dosar em triplicata o padro, ler as absorvncias e tirar a mdia aritmtica das mesmas. Exemplo: Leituras: Padro : 0,305, 0,304, 0,306 Mdia aritmtica = Fator = 200 0,305 0,304 + 0,305 + 0,305 3 = 0,305

Obs.: No utilizar esta curva para determinar o resultado de seu ensaio. A curva de calibrao constituda pela relao grfica dos valores das absorvncias com os valores das concentraes, de um conjunto de solues padro. A curva de calibrao demonstra a linearidade da reao at uma concentrao de 800mg/dL A reao linear at 800mg/dL ( ver curva acima). Para valores acima, diluir a amostra com soluo fisiolgica e proceder a nova dosagem. Multiplicar o valor encontrado pelo fator de diluio. O clculo da concentrao do Colesterol srico pode ser feito utilizando-se de um

Fator = 655 Leitura do teste = 0,160 Colesterol (mg/dL) = 0,160 x 655,7 = 104,9mg/dL

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EXPRESSO DOS RESULTADOS EM UNIDADE S.I. Colesterol (mmol/L) = colesterol (mg/dL) x 0,02586 LIMITAES DO SISTEMA Para se obter timo desempenho do sistema, necessrio que o procedimento tcnico seja rigorosamente seguido conforme explicitado na instruo de uso. Alteraes no procedimento tcnico podem levar a resultados errneos. Algumas drogas podem elevar os nveis de colesterol, incluindo entre elas: os adrenocorticotrpicos (ACTH), esteroides anabolizantes, bloqueadores beta adrenrgicos, conticosteroides, epinefrina, contraceptivos orais, fenitona, sulfonamidas, diurticos tiazdicos. Algumas drogas podem reduzir os nveis de colesterol. Entre elas esto: alopurinol, andrgenos, captropril, clorofibrato, colchicina, eritromicina, isoniazida, lovastatina, inibidores da MAO, neomicina, niaciacina e nitratos. CONTROLE DE QUALIDADE DO SISTEMA 1- A limpeza e a secagem adequada do material a ser utilizado so de fundamental importncia para a estabilidade dos reagentes e obteno de resultados corretos. 2- A gua utilizada na limpeza do material deve ser de boa qualidade. 3- Colunas deionizadoras saturadas liberam ons diversos, aminas e agentes oxidantes que deterioram os reagentes. 4- As pipetagens devem ser precisas. 5- O nvel da gua do banho maria deve ser superior ao nvel dos reagentes nos tubos de ensaio. A temperatura (37 o C) deve ser rigorosamente observada. 6- O uso de soro controle de referncia deve ser uma prtica rotineira do laboratrio. Recomendase utilizar um soro controle com valor na faixa de normalidade (soro controle N - Doles) e outro soro controle de valor elevado (soro controle P - Doles) . VALORES DE REFERNCIA recomendado que cada laboratrio estabelea, na populao atendida, sua prpria faixa de valores de referncia. Em termos estatsticos, na populao brasileira adulta, ambos sexos, os nveis de colesterol situam-se na faixa de 150 - 240mg/dL. O colesterol e suas fraes so componentes lipdicos de maior importncia na evoluo do quadro de aterognese. Estudos mostram relao entre o aumento da incidncia de Doena Coronria Isqumica (DCI) e o aumento da taxa

de colesterol sanguneo, conceituando-se ento os grupos de risco. Como referncia, d-se valor no ao dado estatstico, mas sim aos nveis de colesterol srico que definam prognsticos: Colesterol mg/dL < 200 200 - 239 > 240

Desejvel Limtrofe Alto risco (DCI)

SIGNIFICADO CLNICO Aterosclerose um fenmeno degenerativo que compromete as artrias de grande e mdio calibre de nosso organismo. Inicia-se precocemente e na sua evoluo tem papel importante fatores raciais e principalmente alimentares. Sua expresso anatmica a diminuio da luz vascular com srias consequncias quando as leses se localizam ao nvel das artrias cerebrais ou coronarianas. Grande quantidade de lipdeos com predominncia de colesterol esto presentes ao nvel das leses. Estudos de Framinghan mostram uma correlao direta entre os nveis sanguneos de colesterol e leses aterosclerticas. Na patogenese da Doena coronariana isqumica (DCI), tem papel importante o colesterol. O National Cholesterol Education Program(NCEP) advoga os seguintes valores referenciais para colesterol sanguneo em adultos com mais de 20 anos:
Desejvel Limtrofe Colesterol (mg/dL) 200 200-239 Alto risco/DCI

>240

Aumentos secundrios do colesterol so encontrados no hipotiroidismo, diabete no controlada, sndrome nefrtica (glomerulonefrite crnica membranosa), cirrose biliar e por vezes aumentos discretos na gravidez. Hipocolesterolemia pode ser detectada nos estados de desnutrio, hipertiroidismo, anemia perniciosa e doenas hepticas que evoluam com quadro de insuficincia funcional do rgo. CARACTERSTICAS DO DESEMPENHO Foram realizados 40 dosagens em amostras cujo teor de colesterol se situava no intervalo de 119,9 a 468mg/dL. Estes ensaios foram realizados em paralelo com um produto de referncia. A comparao do kit de Colesterol Lquido Doles (Y) com o produto de referncia (X), deu origem seguinte equao de regresso linear: Y= 21,75 + 0,89X, sendo o coeficiente de correlao ( r ) = 0,96. Testes mostram uma recuperao de 99 +1,6%.

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Repetitividade: Foram realizadas 20 dosagens sucessivas, com 3 amostras obtendo-se os seguintes resultados:
Amostra 1 Concentrao (mg/dL) Amostra 2 Amostra 3

97,64 1,05
1,08

196,78 2,05
1,04

408,32 4,09
1,00

Desvio Padro
Coeficiente de Variao (%)

Reprodutibilidade: foram realizadas 20 dosagens durante 20 dias consecutivos em 3 amostras obtendo-se os seguintes resultados:
Amostra 1 Concentrao (mg/dL) Amostra 2 Amostra 3

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA Trinder. P.: Ann, Clin.Biochem., 6,24; l969. D.Braham e P. Trinder: Analyst 97; 1972. Allain,C.C.; Poon, L.S;: Clin. Chem. 20:470; 1974. Henry, J.B.; Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 19a ed, 214-215, 1996. Cockayne, S; Anderson S.C; Clinical Chemistry: Concepts and Applications, 173 - 174, 1993. Pesce, A.J.; Kaplan, L.A.; Methods Clinical Chemistry, 1156-1178, 1987. Tibrcio, H.M., Controle Interno da Qualidade Analtica, 1aed. maro/1995. Doles: dados de arquivo. TERMOS E CONDIES DE GARANTIA DA QUALIDADE DO PRODUTO As garantias do fabricante ao consumidor seguem estritamente as relacionadas na Lei no 8.078, de 11 de setembro de 1.990 - Cdigo de Defesa do Consumidor. Os reagentes que compem este sistema para diagnstico so garantidos na sua performance, reprodutibilidade e qualidade at a data de vencimento. Os produtos que apresentarem problemas tcnicos comprovados sero substitudos, sem nus para o consumidor. Doles Reag. Equip. para Laboratrios Ltda. CNPJ: 01.085.513/0001-05 Rodovia BR 153, Km 493, Lt.07 Conjunto Palmares. CEP: 74775-027 Goinia - GO Brasil e-mail: doles@doles.com.br M.S.: Reviso: no 10231810076 17 (04/2010)

117,64 1,58 1,34

208,33 2,55 1,22

345,05 3,86 1,12

Desvio Padro Coeficiente de Variao (%)

Especificidade: a presente metodologia especfica para a dosagem do colesterol total. Os mtodos enzimticos so mtodos de referncia e de primeira escolha para determinao do colesterol total, com boa preciso. Sensibilidade: a absorvncia encontrada de 0,002 corresponde a, aproximadamente, 1mg/dL de concentrao de colesterol, quando a leitura realisada em espectrofotmetro com banda espectral inferior a 7nm, passagem de luz de 10mm, em 510nm. A sensibilidade do sistema est estritamente relacionada com a sensibilidade do aparelho utilizado no laboratrio. Diluio da Matriz: estudos sucessivos de diluio da matriz mostraram que no h interferncia na sensibilidade diagnstica da presente metodologia. Substncias interferentes: substncias redutoras como o cido ascrbico e bilirrubina podem interferir na determinao do colesterol, pois os mesmos consomem o perxido de hidrognio, produzindo resultados falsos. A bilirrubina interfere quando presente em concentraes superiores a 15mg/dL, podendo haver um decrscimo de 5% do valor do colesterol. Amostras turvas que contenham triglicrides elevados, pode interferir com a presente metodologia. A presena de cido rico em concentraes anormais elevadas no interfere na determinao do colesterol total pelo mtodo enzimtico.

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