Teoria de Biologia Molecular

Apontamentos por TIAGO MADEIRA
ndice
1 Aula: 07/09/2004 2 Aula: 09/09/2004 Sumrio: apresentao, programa da cadeira. Sumrio: Concl. da aula anterior. Enrolamento do DNA, sulcos, DNA binding proteins; tipos de conformaes do DNA. Enzimas de restrio e sistema de modificaorestrio. Sumrio: Dogma central da biologia. Estruturas formadas pelo RNA. Extenses ao dogma central e bases azotadas raras. Sumrio: Concluso da aula anterior. Ribossomas nos eucariotas e procariotas. Protenas; Genoma nos eucariotas e procariotas. Sumrio: Conceito de opero. Topoisomerases tipo I e tipo II. DNA eucaritico: cromatina, nucleossoma, etc. Nveis de enrolamento, histonas, telmeros. Sumrio: Protein coding genes; DNA altamente repetitivo (satlites e microsatlites); PCR e aplicaes. Sumrio: DNA genmico (cont.). Sondas; Tcnicas de hibridao (Southern, Northern e Western blotting); Clonagem, utilizando plasmdeos como vectores. Sumrio: Bibliotecas genmicas. Transposes e retrotransposes, simples e complexos. Sumrio: Retrotransposes (cont.). Replicao do DNA, fragmentos de Okasaki, DNA polimerases I e III. Sumrio: Modelos de replicao em eucariotas e procariotas; Replicao do DNA eucaritico (polimerases). Sntese das extremidades dos cromossomas (telomerase). Sequenciao de genoma; tcnica dos terminadores de cadeia Sumrio: Recombinao; modelos de recombinao (homloga), nomeadamente, modelo de Holiday; protena RecA. Transferncia de DNA. Insero de DNA a nvel de um cromossoma. Sumrio: Conjugao; plasmdeo F, integrao de um plasmdeo; sequncias de insero. Transfeco; via lisognica; Transduo e fago . Sumrio: Mutaes; bases moleculares; transies e transverses (substituies de bases); frameshift mutations. Protenas de fuso. Sumrio: Mutaes (cont.); mecanismos de reparao; Exciso; sistema AP, sistema MutHLS, sistema uvr e sistema SOS. Sumrio: Mutaes (concluso). Expresso gnica e regulao; promotores, TATA box. Terminadores (rho e no rho dependentes). Sumrio: Factores (concluso). Regulao da expresso gnica ao nvel da transcrio em procariotas; Opero lac, regulao positiva e negativa.
Pg. 4 Pg. 7
3 Aula: 14/09/2004 4 Aula: 16/09/2004 5 Aula: 21/09/2004
Pg. 11 Pg. 17 Pg. 22 Pg. 25 Pg. 28
6 Aula: 23/09/2004 7 Aula: 28/09/2004
8 Aula: 30/09/2004 9 Aula: 07/10/2004 10 Aula: 12/10/2004
Pg. 31 Pg. 34 Pg. 38
11 Aula: 14/10/2004
Pg. 43
12 Aula: 25/10/2004
Pg. 47
13 Aula: 27/10/2004
Pg. 53
14 Aula: 28/10/2004 15 Aula: 02/11/2004
Pg. 56 Pg. 63
16 Aula: 04/11/2004
Pg. 69

17 Aula: 05/11/2004 18 Aula: 09/11/2004 Sumrio: Revises relativas s mutaes, mecanismos de reparao, recombinao e transposes. Sumrio: Expresso gnica em eucariotas; factores gerais de transcrio, protenas activadores e enhancers. Modificaes pstranscricionais do RNA: capping e adenilao. Sumrio: Expresso gnica (concluso); Splicing, identificao de intres; tipos de splicing; spliceossoma; vias de splicing. Regulao. Promotores alternativos; splicing alternativo. Sumrio: Regulao da expresso gnica em eucariotas: exemplos, tipos de protenas e sua interaco com o DNA, protenas com funes de acetilao da cromatina e expresso diferencial de genes em Drosophyla melanogaster. Sumrio: Regulao da expresso gnica em eucariotas (concluso); nveis de controlo; regulao pstranscricional. Interferncia de RNA e estabilidade do mRNA. Sumrio: RNAi (concluso). Estabilidade do mRNA (concluso). Mtodos para visualizao de DNA, RNA e protenas. Sumrio: Traduo em eucariotas e procariotas: Iniciao, alongamento e terminao. Iniciao alternativa e IRES. Sumrio: Efeitos de determinados antibiticos; frameshift programado; slippage; bypass. Chaperes, Chaperoninas e folding das protenas. Clivagem proteoltica e transduo de sinal. Regulao da traduo. Sumrio: Regulao da traduo: IRES, poliadenilao; exemplos: progesterona e ferritina; Degradao de protenas: ubiquitinao. Estudo de protenas: SDSpage, Western Blotting e Gis 2D. Sumrio: Noo de ORF; Perfis de hidrofobicidade de protenas e relao com a sua localizao; Translocao cotraducional e pstraducional; SRP. Sumrio: Visualizao de clulas, estruturas subcelulares e protenas. GFP como forma de marcao, vantagens e desvantagens. FRET&FRAP.
Pg. 74 Pg. 77
19 Aula: 11/11/2004
Pg. 86
20 Aula: 16/11/2004
Pg. 93
21 Aula: 16/11/2004
Pg. 99
22 Aula: 23/11/2004 23 Aula: 25/11/2004 24 Aula: 30/11/2004
Pg. 105 Pg. 110 Pg. 117
25 Aula: 02/12/2004
Pg. 123
26 Aula: 07/12/2004 27 Aula: 07/12/2004
Pg. 132 Pg. 141
Biologia Molecular
Aulas tericas (T) 1 Aula: 07/09/2004 Sumrio: apresentao, programa da cadeira. Prof. Rita Zilho
Programa:
Molculas: DNA,RNA e protenas; Dogma central da biologia; Gentica de eucariotas e de procariotas; Organizao gentica; Replicao; Recombinao; Mutagnese e mecanismos de reparao; Trfego de protenas, ciclo celular e regulao, etc.
Avaliao: Consiste num exame terico (17,5 val.) e um exame terico-prtico (2,5 val.). A avaliao TP vai decorrer durante a 6 semana de aulas prticas. O exame terico ir incluir questes da TP, relativas s ltimas 6 semanas de aulas.
Exames: 1 chamada: 11 de Janeiro 2 chamada: 25 de Janeiro

Nota: na semana de 18 a 23 de Outubro no ir haver aulas tericas, tendo j sido agendadas aulas de substituio para 13 de Outubro (das 18.30 s 19.30) e tambm para 27 (ou eventualmente 29) de Outubro (18.30 s 19.30).
Apontamentos por TIAGO MADEIRA DNA

um polmero, o qual contm toda a informao gentica. constitudo por unidades repetidas, os nucletidos. Uma cadeia polinucleotdica consiste numa srie de ligaes entre diversos glcidos e grupos fosfato, no sentido 5 3, os quais formam uma espcie de suporte, do qual sobressaem as bases azotadas.
1. Nucletidos: so unidades constitudas por bases azotadas (purinas e pirimidinas), glcidos (nomeadamente pentoses, como a ribose e a desoxiribose1), e grupos fosfato. Os carbonos dos glcidos encontram-se numerados com linhas, para distinguir a nomenclatura destes da nomenclatura das bases azotadas! As bases azotadas so compostas por nitrognio e carbono (heterocclicas), podendo tambm ser agrupadas em purinas e pirimidinas.
Base Purinas Pirimidinas Adenina e Guanina Citosina Uracilo Timina
Nuclesido Adenosina e Guanosina Citidina Uridina Timidina
A ligao que se estabelece entre a ribose (no caso do RNA) e a base azotada (uma timina, por exemplo) denomina-se ligao glicosdica.
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Nuclesido: nome dado ao conjunto formado pela base azotada e o glcido.
Nota: difere da ribose pois falta-lhe um grupo O no C 2.

Nucletido: consiste num nuclesido ligado a um grupo fosfato, sendo que a ligao ocorre ao nvel do C5 do glcido (so steres de cido fosfrico e nuclesidos).
A sntese do DNA ocorre do carbono 5 para o carbono 3 do nucletido seguinte, sendo que se forma uma ligao fosfodiester. Actualmente coloca-se a questo da sntese no ser possvel no sentido contrrio (3 para 5) j que ainda no foi descoberta nenhuma enzima DNA polimerase que tenha a capacidade de a efectuar no referido sentido. Polaridade: a molcula de DNA apresenta uma certa polaridade dado a extremidade 5 diferir substancialmente da 3. Na extremidade 5 encontram-se um, dois, ou mesmo trs grupos fosfato, ao passo que na 3 se tem unicamente um grupo OH.
A molcula de DNA surge sob uma forma dupla hlice formada por duas cadeias polinucleotdicas. J o RNA , de forma geral, constitudo por uma cadeia polinucleotdica simples. Relativamente ao emparelhamento das bases azotadas, este sucede de forma muito especfica, sendo que a adenina emparelha com a timina (no caso do DNA) e a guanina com a citosina. As ligaes que unem estas bases so muito hidrfobas e denominam-se pontes de H. Entre a timina e a adenina estabelecem-se ligaes duplas e entre a guanina e a citosina, ligaes triplas. As cadeias polinucleotdicas na molcula de DNA emparelham de forma antiparalela.
Tambm as ligaes de Van Der Waals conferem estabilidade estrutura da molcula de DNA. Por fim, a molcula de DNA apresenta uma toro, no sentido dos ponteiros do relgio.

2 Aula: 09/09/2004 Sumrio: Concluso da aula anterior. Enrolamento do DNA, sulcos, DNA binding proteins; tipos de conformaes do DNA; desnaturao da molcula de DNA; enzimas de restrio, metilao das bases azotadas e sistema de modificao restrio.
A clivagem e ulterior adio de novos nucletidos ocorrem ao nvel do fosfato . Note-se que num trifosfato de nuclesido surge um conjunto de 3 fosfatos designados , e respectivamente, ligados ribose ou desoxiribose. Enrolamento da molcula de DNA: Right Handed: no sentido dos ponteiros do relgio ( conformao que apresenta este enrolamento d-se o nome de B) Counter clockwise: surge apenas em algumas conformaes e neste caso, j no existe um correcto emparelhamento da molcula.
Conformao B: Ao nvel da conformao B podem surgir regies mais ou menos pronunciadas s quais se d o nome de sulcos (em ING, Groove). Estes sulcos podem ser mais ou menos pronunciados, designando-se assim por sulco maior ou sulco menor, respectivamente. O estudo destes sulcos de grande importncia na medida em que ao nvel destas estruturas que se ligam as DNA binding proteins, as quais reconhecem sequncias de bases especficas, ligando-se a elas e influenciando processos como a recombinao, transcrio, entro outros. Por outro lado, tambm ao nvel do sulco maior que ocorre a metilao de diversas bases azotadas. Dimetro constante, na ordem dos 24 Angstrom Uma volta inteira da hlice engloba 10 nucletidos.
Existe uma correlao evidente entre a estrutura e a funo da molcula de DNA: o facto da molcula ser formada por uma dupla cadeia com o mesmo emparelhamento de bases, implica uma complementaridade e tambm a possibilidade de replicao do material gentico durante a diviso celular. A existncia de uma sequncia aleatria de bases explica tambm a grande variedade dos seres vivos; A ocorrncia de mutaes e a transmisso dessas mutaes s geraes futuras.

Outras conformaes: Conformao A: surge quando a % de gua circundante menor (do que o qu?); apresenta um sulco maior mais pronunciado, assim como um sulco menor mais reduzido; 11 nucletidos compem cada volta da hlice. In vitro surgem outras conformaes da molcula, como o caso da conformao Z: caracterstica de meios com elevada concentrao salina.
Nota: existem essencialmente dois tipos de ligaes na molcula de DNA, nomeadamente as pontes de H (ligaes muito hidrfobas) e tambm as ligaes de Van Der Waals, entre as bases emparelhadas.
Desnaturao da molcula de DNA

In vitro, a desnaturao da molcula de DNA pode ocorrer por aco de: 1. Calor (aumento de entropia) 2. Agentes qumicos, como solues alcalinas (com NaOH), solues cidas, ureia e tambm formamida. Tanto a formamida como a ureia, reagem com as molculas de H2O que circundam o DNA, sendo que as molculas de gua livres iro interferir com o emparelhamento das bases. J o NaOH altera o estado tautomrico das bases azotadas, provocando assim a ruptura das pontes de H que as unem. Nota: Quando o arrefecimento lento a molcula de DNA volta sua estrutura inicial, sendo que quando este rpido, as bases tendem a emparelhar de forma aleatria.
Quantificao de DNA
Espectrofotometria Permite determinar a concentrao de DNA em soluo. A absoro mxima (o pico de Abs.) ocorre aos 260 nm, sendo que superior absoro do RNA (single stranded) por razes obvias. O valor da absorvncia igual a 1 quando a concentrao de RNA igual a 40g/ml ou no caso do DNA, 50g/ml
Desnaturao cooperativa do DNA: ocorre quando 50% das cadeias se encontram separadas. temperatura a partir da qual isto sucede denomina-se melting temperature (Tm).

Gel de Agarose utilizado para visualizar a molcula de DNA. Ao aplicar uma diferena de potencial, a molcula ir migrar ao longo do gel, obtendo-se bandas; Ocorre uma migrao maior se a molcula for de dimenso reduzida; Faz-se variar a concentrao do gel de agarose com o intuito de reter molculas de maiores ou menores dimenses. A utilizao de um tampo deve-se necessidade de fornecer ies, gerando-se assim condutncia elctrica.
1. % Gel de agarose Vs. dimenso dos fragmentos 2. Velocidade de migrao Vs. dimenso dos fragmentos Brometo de Etdio: adicionado ao gel de agarose, para permitir uma ulterior identificao das bandas de DNA resultante do processo; o brometo de etdio emite radiao no comprimento de onda correspondente ao rosa/vermelho, quando irradiado com luz UV, num processo conhecido como fluorescncia. assim possvel determinar a concentrao de DNA atendendo intensidade da radiao emitida (?).
Enzimas de restrio
Correspondem a enzimas que cortam o DNA em sequncias especficas, no interior do DNA (as endonucleases de restrio!) . Como exemplo tm-se a BamHI, a EcoRI, entre muitas outras. A descoberta das enzimas de restrio deveu-se a um sistema apresentado pelos procariotas, denominado Sistema de modificao restrio. Este sistema permite ao organismo distinguir o DNA exgeno do DNA endgeno, evitando assim um ataque ao seu prprio DNA por parte destas enzimas de restrio. Uma das formas de evitar as enzimas de restrio consiste em metilar certas bases azotadas impedindo assim ao ataque por parte das endonucleases. O DNA exgeno (de forma geral nocivo para o organismo) no metilado assim digerido pelas enzimas de restrio. Na via metablica de sntese de uma enzima de restrio, ocorre tambm a sntese de uma DNA metilase que reconhece exactamente a mesma sequncia de bases da enzima de restrio, com o intuito de impedir a destruio do DNA do organismo em questo. Uma sequncia como 5 GAATTC 3 reconhecida pela EcoRI e tambm pela respectiva metilase, que impede a aco da primeira.

Nota: Certas endonucleases podem apresentar uma maior ou menor sensibilidade metilao! 1. Enzimas de restrio do tipo II Caracterizam-se por reconhecerem sequncias de corte com dupla simetria em torno de um dado ponto. Outro aspecto pende-se com o facto dessas sequncias serem lidas da mesma forma na cadeia superior (sentido 5 3) e na cadeia inferior (tambm no sentido 5 3). A estas estruturas d-se o nome de sequncias palindrmicas. (pode imaginarse como sendo uma capicua) Este tipo de enzimas funciona como um homodmero; Identificam sequncias contendo 4 a 8 pares de bases (pb) Podem tambm gerar trs tipos de extremidades diferentes (cegas, recolhidas ou projectadas).
As extremidades cegas ou rombas geram-se quando a enzima corta a direito (corte blunt). So tambm coesivas. Extremidades projectadas ou recolhidas surgem quando uma das cadeias se encontra projectada/recolhida, relativamente a outra.
Este tipo de cortes e respectivas extremidades importante no estudo do DNA recombinante, pois este s se forma se existir uma complementaridade de bases perfeita entre as extremidades.
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3 Aula: 14/09/2004 Sumrio: Dogma central da biologia. Estruturas formadas pelo RNA. Extenses ao dogma central e bases azotadas raras.
Dogma central da Biologia

Centra-se em 3 aspectos: Replicao: durante a qual ocorre a duplicao do material gentico.
DNA Transcrio mRNA
mRNA Traduo pptido
Segundo o dogma, o DNA no d directamente origem a protenas. Tem de ser primeiramente transcrito em mRNA, ou seja, RNA mensageiro. Esta molcula constitui assim um intermedirio na sntese proteica. 1. Transcrio: 2. Traduo Sucede uma alterao ao nvel da linguagem, da o nome deste processo. Cpia da informao contida no DNA A informao transcrita do DNA para o mRNA No ocorre uma alterao da linguagem pelo que este processo se denomina transcrio.
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As protenas so formadas por uma sequncia de aminocidos e no por uma sequncia de bases.
Particularidades da expresso gnica: 1. Durante a sntese do mRNA, ocorre um afastamento das cadeias de DNA, para ento a RNA polimerase actuar. 2. Ao nvel da cadeia codificante (sense), os genes so sempre lidos de 5 para 3; um gene s pode ser transcrito numa cadeia com este sentido! 3. cadeia complementar da cadeia codificante d-se o nome de cadeia molde ou non sense. 4. A sequncia do mRNA tambm 5 3, sendo idntica cadeia codificante. Nota: A cadeia molde tambm apresenta expresso de genes.
Pontos de Regulao
Os pontos de regulao da expresso gnica ocorrem sobretudo ao nvel dos dois processos centrais: a transcrio e a traduo. Esta regulao pode tambm ser feita de forma positiva ou negativa. Outro ponto de controlo surge ao nvel do mRNA, dado este ser muito lbil e portanto facilmente degradado por ribonucleases (in vivo). Nos eucariotas, os processos de transcrio e traduo so espacialmente separados, sendo que a traduo ocorre no citoplasma, ao passo que a transcrio se d ao nvel do ncleo.
Extenses ao dogma:
1. O produto final da expresso gnica nem sempre uma protena. Por vezes, o mRNA pode originar rRNAs, as quais aps adquirirem uma estrutura tridimensional se tornam activas. 2. O prprio RNA pode igualmente apresentar a capacidade de replicar. 3. Por vezes pode suceder o caso de o RNA dar origem a DNA, num processo muito comum em vrus da famlia retroviridae, denominado transcrio reversa. Forma-se uma molcula hbrida, constituda pelo molde de RNA e o DNA neossintetizado e ulteriormente, por um processo enzimtico, forma-se a dupla cadeia de DNA, o qual ser integrado no genoma da clula infectada.
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4. Os pries constituem outro aspecto que ter de ser integrado no dogma: os pries so basicamente protenas que ao sofrerem modificaes (por mutao por ex.) vm a sua conformao alterada e adquirem a capacidade de alterar outras protenas. 5. Existe outro tipo de RNA, o snRNA ou small nuclear RNA que apresenta igualmente capacidade cataltica, podendo efectuar o chamado splicing. Nota: Ainda no foi efectuada a sntese de DNA ou RNA partindo de protenas, constituindo este facto uma das j diversas forbidden arrows (setas proibidas).
Estruturas Secundrias e Tercirias

Por complementaridade de bases, tanto o DNA como o RNA podem formar este tipo de estruturas. Stem loops: ou hastes, de cadeia simples com uma zona em que ocorre emparelhamento de bases. Hairpin
tRNA
O tRNA apresenta 3 stem loops. Para alm disso, as extremidades do anticodo so 3, assim como a extremidade de ligao do aminocido. Quando um tRNA transporta um aminocido designa-se aminoacil tRNA, sendo que existem cerca de 20 tRNA aminoaciltransferases (so sintetases) especficas para cada tRNA, as quais acoplam o aminocido extremidade especfica. A extremidade 3 qual se liga o aminocido tem sempre a mesma sequncia de bases, CCA (lidas de 5 para 3), variando de acordo com cada aminocido a restante sequncia de bases do tRNA. Outras sequncias podem tambm ser reconhecidas pela sintetase, nomeadamente ao nvel do stem loops.
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Nota: Como foi dito, existe uma sintetase por cada aminocido, a qual reconhece duas extremidades (x e y por ex.) ao nvel do tRNA (anticodo). No que trata sequncia ACC, esta acoplada ao tRNA por intermdio de uma enzima, a tRNA nucleotidil transferase.
tRNA activado: (ou charged) nome dado estrutura formada pelo tRNA e pelo respectivo aminocido.
A difraco de raio X permitiu igualmente determinar outras conformaes, nomeadamente estruturas tridimensionais para o tRNA, como a estrutura em L (contrastando com a estrutura em folha de trevo ou cloverleaf normalmente atribuda a esta molcula).
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A capacidade do anticodo do tRNA reconhecer mais do que um codo para alem do especfico implica um tipo de emparelhamento designado como sendo non standard. A hiptese que est em linha de conta com este facto tem como nome de Wobble hypothesis Existe assim uma divergncia entra a 1 base do anticodo e a 3 do codo de emparelhamento, da qual resulta ento o emparelhamento no standard ou wooble.
Codes stop
So sequncias reconhecidas pelos factores de terminao da traduo.
O codo AUG muito particular dado corresponder unicamente a um aminocido, a metionina, sendo igualmente sinnimo de iniciao de traduo. Outros codes, como o GUG e o UUG, so tambm codes de iniciao, porm, se se encontrarem inseridos no meio do gene adquirem um significado diferente, dando origem a aminocidos diferentes, que no a metionina. Nota: existem certas bases que surgem com frequncia no tRNA, resultantes da modificao destes durante o processamento. Ex. pseudouridina e inosina (s aparece no anticodo).
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Bases Raras: 1. Bases metiladas 2. Formas tautomricas (ou ionizadas) de diversas bases normais. Estas alteraes podem levar a erros de emparelhamento e ulteriores mutaes.
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4 Aula: 16/09/2004 Sumrio: Concluso da aula anterior. Ribossomas nos eucariotas e procariotas. Protenas; Genoma nos eucariotas e procariotas. Nota: Durante o processo de electroforese: Ctodo + OH- (anies) Wooble: quando o emparelhamento com a 3 base do codo loose; esta ligao no to forte quanto a ligao ao nvel da primeira base. nodo -
Existem 61 codes aos quais correspondem 31 molculas de tRNA, pelo que se ocorrem uma alterao no emparelhamento, esta alterao nem sempre resultar numa mutao. tRNA isoaceitadores: apresentam o mesmo anticodo mas possuem na sua estrutura nucletidos diferentes; so tambm reconhecidos pela mesma sintetase, e levam a cabo o transporte do mesmo nucletido. Ribossomas
Podem ser encarados como sendo fbricas moleculares com funes enzimticas muito importantes, providenciando todos os passos necessrios sntese proteica. Os ribossomas so igualmente responsveis pela criao das ligaes peptdicas. Nota: A sequncia de bases a nvel do rRNA varia de organismo para organismo Os ribossomas so constitudos por: 1. RNA ribossomal 2. Protenas ribossmicas Nos procariotas, existem trs sequncias diferentes de RNA ribossomal, as quais so classificadas de acordo com a sua velocidade de sedimentao durante o processo de centrifugao: 1. Subunidade 5S 2. Subunidade 16S (tambm designada subunidade menor) 3. Subunidade 23S (ou subunidade maior)
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A subunidade 16S de grande importncia pois possui na sua estrutura uma regio que emparelha com o mensageiro, sendo que quanto maior a afinidade com este, mais eficiente se torna a sntese proteica.
RBS ou SD: (ribossome binding site) local a montante do codo de iniciao, no sentido 3 para 5 (mRNA) portanto, ao qual se liga o ribossoma.
Aps a ligao do ribossoma ao mRNA, aplicando nucleases possvel determinar as sequncias protegidas atravs da ligao: A sequncia AUG corresponde ao codo de iniciao (aminocido metionina), situado na regio codificante, e na sequncia leader tem-se ento o RBC, a montante de AUG. Esta sequncia, tambm designada por ShineDalgarno formada por cerca de 10 bases (como AGGAGG).
Protenas
O facto da carga dos aminocidos ser diferente entre os ditos muito importante na constituio de protenas A polinereidade entre as sequncias de bases a nvel do DNA e a sequncia de aminocidos deve-se existncia de codes especficos que os especificam (passe a redundncia).
Uma sequncia de bases, como AUG AAT, d origem a uma sequncia de aminocidos. De notar que a leitura das bases do mRNA feita de forma sequencial.
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Estrutura das protenas:
As protenas apresentam, de um modo geral, 4 tipos de estruturas:
1. Estruturas primrias 2. Estruturas secundrias 3. Estruturas tercirias 4. Estruturas quaternrias A uma estrutura de energia mnima formada por uma protena d-se o nome de estado nativo.
Chaperones: protenas (?) que auxiliam o correcto enrolamento da protena. No entanto, nem todas as protenas requerem chaperones. Modificaes ps traducionais: correspondem a diversas alteraes qumicas que ocorrem aps a sntese da protena, podendo ser responsveis pela sua correcta funo. Ex. Fosforilao, etc. Estas alteraes podem nem sempre ocorrer aps a traduo! Quando se torna necessrio degradar uma protena, esta marcada, de forma geral, por ubiquitinao.
Inseridos nas estruturas tercirias e quaternrias surgem diferentes domnios. Um domnio corresponde a um enrolamento particular (do qual resulta tambm uma conformao particular), responsvel por uma determinada funo (podem ser hlices ou tambm folhas ).
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Motivos: 1. Hlice, loop, hlice: protenas com este tipo de estrutura podem ligar-se ao DNA e ter funes ao nvel da replicao, da traduo, transcrio e regulao da expresso gnica etc. 2. Dedos de zinco: ligao ao DNA 3. coiledcoiled : surgem em protenas fibrosas. 4. Fecho de leucinas: as protenas com este motivo podem ligar-se ao DNA, ao nvel do sulco menor.
Genoma
1. Procariotas 2. Eucariotas (molcula (2 ou mais) de DNA linear ou unimrico). Procariotas No existe compartimentao; de uma forma geral, o genoma nos procariotas surge sob a forma de molculas de DNA circular Plasmdeos: so molculas de DNA extracromossmico com a capacidade de replicar independentemente do DNA cromossomal.
Os plasmdeos podem apresentar igualmente certos genes que conferem vantagens adaptativas a esses organismos, como sendo resistncia a determinadas substncias (antibiticos por exemplo). O genoma do organismo, nos procariotas corresponde ao conjunto formado pelo DNA cromossomal e o DNA plasmdico. Existem excepes como no caso da espiroqueta Borrelia burgdorferi, causadora da doena de Lyme, que apresenta um cromossoma linear mais 17 a 18 molculas circulares e lineares. Eucariotas Nos eucariotas, as molculas de DNA encontram-se subdivididas em cromossomas. Em determinados organitos surge tambm DNA, nomeadamente nos cloroplastos e nas mitocndrias, determinante em algumas snteses.
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Apontamentos por TIAGO MADEIRA Dimenso dos genomas

Plasmdeos Vrus Procariotas Eucariotas 1 Kb at 250 Kb 100 Kb at 1 Mb 1 Mb at 10 Mb 10 Mb at 1000 Mb
O DNA eucaritico apresenta cerca de 30 000 genes, surgindo desta forma um paradoxo, designado paradoxo C: existe uma clara falta de relao entre o nmero de genes e a complexidade do genoma. Em S. cerevisae existem 5800 genes, contrastando com os 140 que estavam previstos. Nos organismos de menores dimenses existe necessidade de uma maior economia de espao. Desta forma, surgem por vezes genes mais prximos uns dos outros. Ex. No mRNA no existem intres. A densidade de genes por Mb aumenta igualmente medida que a dimenso do organismo diminui (como obvio, no ser de todo linear). Podem surgir genes sobrepostos ou overlapping genes.
NOTA: s sequncias codificantes num intro d-se o nome de snRNAs
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5 Aula: 21/09/2004 Sumrio: Conceito de opero. Topoisomerases tipo I e tipo II. DNA eucaritico: cromatina, nucleossoma, etc. Nveis de enrolamento, histonas, telmeros. O arranjo dos genes nos organismos eucariotas significativamente diferente comparativamente aos procariotas. Nestes ltimos, a compactao de genes de longe superior (maior densidade gnica) e os genes surgem por vezes sob a forma de operes. Opero: um transcrito de DNA cujos genes esto sujeitos mesma regulao; conjunto de genes que pertencem a um s transcrito.
Trs genes podem assim originar um transcrito, o qual origina trs protenas diferentes, sendo que os trs genes no podem ser transcritos separadamente uns dos outros. Em E. coli, cujo genoma j se encontra totalmente sequenciado, torna-se mais fcil prever quais sero as sequncias codificantes. Aos genes potencialmente codificantes d-se o nome de ORFs ou open reading frames
Organizao do genoma
Nos procariotas, o DNA cromossomal adquire uma conformao circular. O prprio DNA pode superenrolar-se, dobrando-se. Existem dois tipos de enzimas que promovem o enrolamento do DNA: Topoisomerases do tipo I Topoisomerases do tipo II: deste tipo de enzimas faz parta a DNA girase.
O DNA dos procariotas contm igualmente protenas que influenciam o enrolamento do DNA (bending), as HLPs ou histone like proteins. Por vezes surge nas bactrias uma estrutura constituda por protenas e ramos de DNA independentes. A esta estrutura d-se o nome de nucleide A estrutura do DNA no esttica, apresentando um grande dinamismo. Existem zonas no DNA, nas quais a dupla hlice se desenrola e se afasta, permitindo assim o acesso de diversas protenas, referentes maquinaria celular. DNA eucaritico
O DNA eucaritico encontra-se organizado em cromossomas. A aplicao de um corante durante a diviso celular denota a existncia de bandas mais escuras relativas a outras mais claras. s
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bandas mais claras deu-se o nome de eucromatina e s mais escuras heterocromatina. A cromatina assim o principal constituinte dos cromossomas Concentraes salinas baixas levam ao desenrolamento do DNA (facto observado ao microscpio electrnico)
Determinao da estrutura do nucleossoma: possvel aplicando um tratamento com nucleases. 1. Um tratamento no muito rigoroso leva a uma degradao das protenas, surgindo bandas de DNA com 200 a 400 pbs As setas indicam as zonas onde ocorre clivagem. A degradao das protenas deixa tambm o DNA que se encontrava envolto nelas e portanto protegido, intacto. As bandas que surgem, com elevado peso molecular, indiciam que a clivagem ocorreu apenas entre o DNA e os nucleossomas. 2. Um tratamento com nucleases mais fortes resulta numa srie de bandas com 146 pb. Denta forma se infere que o DNA foi totalmente clivado e que os 146 pb resultantes correspondem s bases que do a volta ao nucleossoma.
O nucleossoma assim um tetrmero, formado por duas histonas H3 e duas histonas H4. A sequncia de aminocidos muito conservada em procariotas. Histona H1: (constituda por vrias histonas) apresenta uma variabilidade relativamente grande quando comparada com as outras. Esta histona cela o DNA em torno de cada um dos nucleossomas. As histonas, de um modo geral, so protenas muito ricas em Lisinas e Argininas, aminocidos de carga positiva (+), pelo que interagem de forma muito estvel com os fosfatos de carga negativa das bases.
Nveis de enrolamento (ao nvel do DNA) 1. Dupla hlice (nucleossoma): 11 nm 2. Estrutura solenide: nucleossomas uns sobre os outros. So as extremidades N terminal dos aminocidos que compem as protenas histnicas que so responsveis por este enrolamento; Os grupos NH2 interagem com a histona 1 de outros nucleossomas
Protenas scaffold ou esqueleto: formam uma estrutura sobre a qual assenta o enrolamento da cromatina. HMPs: so protenas responsveis pelos estados de condensao da cromatina; o seu nome, high mobility proteins, deriva da sua elevada mobilidade electrofortica.
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Protenas histnicas: podem ser de 5 tipos: H1, H2A, H2B, H3 H4
Relativamente s protenas scaffold, existem locais aos quais este tipo de protenas se pode ligar, denominados MARS (de matriz) e SARS, de sequncia. Protenas a nvel do telmero e do centrmero (regies nos cromossomas dos eucariotas) O centrmero uma estrutura importante nos eucariotas e constitudo essencialmente por sequncias repetidas ou repetitivas de DNA, tambm chamado DNA alfide ou mais vulgarmente, microssatlites. O DNA repetitivo pode, no entanto, tambm apresentar sequncias codificantes! A localizao do centrmero tambm utilizada para classificar os cromossomas: 1. Metacntricos: com o centrmero no meio do cromossoma. 2. Acrocntricos 3. Holocntricos (com vrias regies telomricas) 4. Telocntricos Outra estrutura importante o Cinetocoro. Este faz parte do centrmero e constitudo por DNA e protenas, sendo que a esta estrutura que se ligam as fibras (microtbulos) do fuso acromtico durante a diviso celular.
Telmero Estrutura indicativa do final do cromossoma, constituda por sequncias repetitivas. Estas estruturas possuem protenas associadas, as quais controlam o nmero de repeties e previnem a degradao do DNA. Uma srie de HMPs especficas so as CRCs ou complexos remodeladores da cromatina. Estes tm como funo expor regies do DNA (desenrolamento controlado do DNA), para facilitar a transcrio. Outra forma de promover o acesso ao DNA, descontraindo a cadeia dupla acetilar os resduos de lisina. A acetilao deste aminocido provoca uma anulao da sua carga (inicialmente positiva)
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6 Aula: 23/09/2004 Sumrio: Protein coding genes; DNA altamente repetitivo (satlites e microsatlites); PCR e aplicaes. Os genes codificantes, de acordo com o dogma originam protenas, podendo igualmente originar RNAs funcionais, com aco cataltica, que no fazem parte da classe das protenas. DNA repetitivo Ex. ATATATAT O nome de satlite dado a este DNA resulta do resultado obtido aps a separao deste DNA relativamente ao DNA dito cromossomal: Surge primeiramente uma grande banda, correspondente ao DNA cromossomal, rodeada por diversas bandas mais pequenas, como se de um satlite se tratassem. Da o nome de DNA satlite, satlites ou microssatlites. Uma caracterstica deste DNA dito satlite consiste na grande amplitude de variao apresentada pelo seu teor G+C (guanina/citosina), sendo que este pode ser muito baixo, relativamente ao DNA cromossomal ou por outro lado, muito superior. Esta discrepncia resulta sobretudo do tipo de repeties que este DNA apresenta (do tipo AT ou GC por exemplo).
Velocidade de renaturao A velocidade de renaturao est directamente relacionada com: 1. Dimenso do genoma: quanto maior o nmero de pares de bases, maior o tempo que estas demoraram a renaturar. 2. Concentrao de DNA: quanto maior a concentrao de DNA, maior a velocidade de renaturao. 3. Presena de sequncias altamente repetitivas: a existncia deste topo de sequncias facilita a renaturao, tornando-a mais rpida e eficiente.
A anlise do genoma por partes, com base na velocidade de renaturao muito importante pois permite determinar zonas no DNA onde determinadas sequncias se repetem, em maior ou menor nmero. No que diz respeito ao DNA repetitivo, este pode ser de dois tipos diferentes: 1. Repeties dispersas: as sequncias que se repetem encontram-se separadas por sequncias no repetitivas. Ex. Retrotransposes, LINEs, SINEs e transposes. 2. Repeties agrupadas: repeties seguidas umas s outras em tandem. Ex. Minissatlites, microssatlites e DNA alfide.
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O DNA altamente repetitivo surge cerca de 106 vezes num s genoma; comparativamente ao DNA moderadamente repetitivo, este s apresenta 103 cpias por genoma (tambm conhecidos por famlias gnicas). sim o DNA de cpia nica, aquele que transcrito e traduzido Como exemplo de DNA repetitivo existem as sequncias Alu.
Nos eucariotas ainda no foi encontrado qualquer indcio da existncia de operes. Existem, no entanto, famlias multignicas responsveis por uma funo semelhante. Os RNAs ribossomais so sintetizados partindo de uma s famlia gnica! O RNA precursor encontra-se alinhado na sequncia de RNAs ribossomais e ir ser clivado e processado. S ulteriormente que se formam os diferentes RNAs ribossomais (5S, 68S, etc.)
Um tipo de RNAs os snoRNAs ou small nucleolar RNAs so responsveis pelo processamento dos RNAs ribossomais. Os snoRNAs ligam-se ao RNA precursor por complementaridade de bases. Guias de RNA: assinalam as regies onde dever ocorrer o processamento do RNA precursor Nota: os snoRNAs so tambm responsveis pelo processamento de alguns snRNAs (envolvidos no splicing). A sucesso de DNA repetitivo varia de pessoa para pessoa, pelo que pode ser utilizado como marcador gentico Sequncias que se seguem umas s outras: VNTRs ou variable number tandem repeats
PCR
Tcnica tambm conhecida como polymerase chain reaction e de uso generalizado no campo de gentica molecular. Esta tcnica tem como objectivo amplificar determinadas sequncias especficas de DNA previamente isolado Quando se d polimerizao, possvel escolher at onde e desde onde que quer que esta ocorra. Isto conseguido de duas formas: 1. A colocao especfica do primer 2. controlo do tempo durante o qual o PCR ocorre
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O ciclo: 1. Em primeiro lugar, necessrio desnaturar a cadeia de DNA (que dupla...), e de seguida adicionar dois primers oligonucleotdicos (ou seja, tambm SS), um dos quais complementar da cadeia alvo e o outro da cadeia complementar, e tambm DNA polimerase. 2. Aps o annealing dos primers, ou seja, o emparelhamento destes, inicia-se a actividade da DNA polimerase, que a partir deles, sintetiza uma nova cadeia complementar das duas cadeias em questo. Deste primer extension, levado a cabo pela DNA polimerase, resultou efectivamente uma cpia do fragmento de DNA inicial. 3. Repetindo o processo, obtm-se mais cpias do DNA inicial, com a amplificao do gene que se deseja. A beleza desta tcnica que em cada ciclo se duplica literalmente a quantidade de DNA original.
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7 Aula: 28/09/2004 Sumrio: DNA genmico (cont.) Sondas; Tcnicas de hibridao (Southern, Northern e Western blotting); Clonagem, utilizando plasmdeos como vectores. DNA genmico Existem igualmente molculas de DNA em diversos organitos e no exclusivamente no ncleo da respectiva clula. A estrutura desse DNA pode ser circular, linear ou os dois tipos podem mesmo coexistir. A quantidade de informao presente nesse DNA depende essencialmente de: 1. N. De molculas por organito 2. Dimenso das molculas 3. N. De genes em cada uma das molculas 4. Organizao de cada um dos genes Este DNA pode conter informao relacionada com a sntese de determinados aminocidos, rRNAs, tRNAs e tambm para a sntese de protenas relativas a processos especficos do organito em questo. Existem ainda casos em que a protena no fica totalmente funcional aps a sntese. Esta protena pode representar apenas uma de muitas subunidades de uma protena maior, sendo que, por questes de regulao (?) as restantes subunidades sero sintetizadas no ncleo. No que trata aos rRNAs foi descoberta uma caracterstica interessante: existem grandes semelhanas entre rRNAs, tanto de cloroplastos, mitocndrias e bactrias. Daqui se infere uma das teorias mais cleres da biologia, a Teoria endossinbionte. Tero as bactrias sido parasitas/mutualistas de organismos ancestrais? Como j foi dito, a tcnica de PCR permite amplificar sequncias especficas do DNA, permitindo igualmente aceder directamente ao genoma. Existem no entanto, outras formas de se mapear o genoma.
Testes de Hibridao
Quando o DNA desnaturado, passando a cadeia simples, pode ser utilizado para hibridar com outras molculas de DNA de cadeia simples, ou mesmo RNA, cuja sequncia seja complementar ou quase complementar da cadeia inicial. primeira cadeia d-se o nome de sonda de cidos nucleicos ou mais simplesmente sonda. Este processo de hibridao pode ser de grande utilidade, permitindo encontrar sequncias semelhantes em diferentes elementos genticos ou ento para precisar a localizao de um determinado gene.
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Uma tcnica deste gnero foi desenvolvida por E. M. Southern e consiste basicamente na hibridao de sondas com fragmentos de DNA previamente separados por electroforese em gel. 1. Em primeiro lugar, os fragmentos de DNA no gel so transferidos para uma membrana e desnaturados. 2. Esta membrana ento exposta a uma sonda marcada, permitindo assim que esta emparelhe com os fragmentos de DNA caso existam nesse DNA sequncias complementares. Note-se que os fragmentos se encontram fixos membrana para impedir que se volta a formar a dupla hlice inicial. 3. possvel detectar os locais de hibridao procurando por assinaturas da sonda. As sondas podem ser marcadas radioactivamente ou utilizando compostos que emitam tipos particulares de luz. As sondas podem ser de DNA, de RNA e tambm anticorpos (no caso de Western blotting ou imunoblot). Se a cadeia que se coloca na membrana for de RNA, independentemente da sonda ser de DNA ou RNA, a tcnica tem outro nome: Northern blotting.
Engenharia gentica
Utilizao de um plasmdeo como vector Consiste basicamente em pegar num fragmento de DNA extrado do gel e lig-lo ao vector, obtendo uma molcula de DNA recombinante No entanto, necessrio utilizar enzimas de restrio com ateno. Se as duas extremidades do inserto forem iguais s do plasmdeo (mesmo sendo coesivas), corre-se o risco de gerar um vector diferente daquele que se pretendia, pois existem duas possibilidades de insero, a 3 5 e a contrria.
Ao utilizar duas enzimas de restrio diferentes, como a EcoRI e a HindIII por exemplo, gera-se um inserto com duas extremidades diferentes, pelo que se forma apenas um vector. A este tipo de clonagem d-se o nome de clonagem dirigida. Nota: uma outra desvantagem derivada da utilizao de insertos com extremidades idnticas a possibilidade do prprio inserto autoligar, inviabilizando assim a insero para uma ulterior formao de um vector.
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Transformao: insero de DNA numa bactria.
Inactivao de um gene por Knockout: Consiste em inserir uma sequncia de nucletidos, quebrando o sense do gene. Aps a insero do vector pode ocorrer um de trs casos: 1. O DNA no entrou efectivamente na clula
2. O DNA clonado autoligou, no tendo ocorrido inserto. 3. Clonagem bem sucedida. Testar uma clonagem bem sucedida: ver pg. 309, Brock.
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8 Aula: 30/09/2004 Sumrio: Bibliotecas genmicas. Transposes e retrotransposes, simples e complexos. Biblioteca genmica: uma representao em vectores (clones) do genoma.
Os clones so ulteriormente ordenados utilizando digestes parciais com diversas enzimas de restrio. Uma biblioteca genmica no pode ser formada atravs de DNA plasmdico pois os plasmdeos de grandes dimenses so instveis. Biblioteca cDNA: ou tambm DNA complementar, sendo constitudo a partir de mRNA e contm apenas o DNA codificante.
Transposes
So parte integrante do genoma (grande parte 50% do DNA genmico humano repetitivo) So relquias dos elementos mveis, que se vo transpondo ao longo do tempo.
Dentro deste DNA mvel existem duas classes distintas: 1. Classe I 2. Classe II O DNA mvel pode ser constitudo por DNA que se transpe directamente ou por outro lado, ser constitudo por DNA que se transpe atravs de um intermedirio de RNA (retrotransposo), utilizando a transcritase reversa, a qual faz a passagem de RNA para DNA. Classe II Sequncia que tem a capacidade de se transpor deixando uma cpia ou sem deixar cpia.
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A transposase, ao cortar a nvel das repeties directas, origina extremidades coesivas. Se o corte for ao nvel das repeties invertidas, a enzima d origem a extremidades cegas. Existem locais preferenciais para a insero dos transposes, nomeadamente regies ricas em Gs e Cs ou As e Ts. No entanto esta insero no deixa de ser maioritariamente aleatria.
Nota: O plasmdeo F apresenta sequncias de insero IS idnticas a muitas outras de diversas bactrias, o que permite uma transposio por recombinao homloga com o gene da dada bactria. Transposes compostos: transposes no qual um dos elementos IS que apresenta genes codificantes para a transposase se encontra inactivado por mutao. Desta forma se previne a transposio s da sequncia que ladeia o transposo, sendo transposta a totalidade da sequncia.
A nvel da sequncia IS podem existir outras sequncias inseridas que conferem resistncia a determinados antibiticos: cassetes. IS ou insertion sequences: formadas por inverted repeats ou IRs e por genes que codificam para a transposase.
Transposo simples: no apresenta ISs mas tem marcas de resistncia a antibiticos.
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Transposo composto: apresenta duas sequncias IS e tambm marcas de resistncia a antibiticos. De notar que apenas uma das sequncia de genes que d origem transposase resulta numa protena efectivamente activa!
Mecanismos de transposio: 1. Conservativo: o nmero de cpias conservado. Pode entender-se como sendo um cut and paste. 2. Replicativo: inicialmente ocorre a cpia do transposo e s ulteriormente que se d a transposio; o nmero de cpias aumenta; Origina-se um cointegrado, que consiste numa sequncia de DNA com duas cpias do transposo. Retrovirus So vrus de RNA; Quando infectam uma clula tm de inserir o seu genoma no genoma do hospedeiro. Desta forma, o seu genoma apresenta genes que codificam para uma enzima, a transcritase reversa, a qual transforma RNA em DNA ds! S depois deste processo, o genoma do vrus se pode inserir no genoma da clula hospedeira. Quando a clula hospedeira replica, o vrus tambm replica.
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9 Aula: 07/09/2004 Sumrio: Retrotransposes (cont.). Replicao do DNA, fragmentos de Okasaki, DNA polimerases I e III. Um retrotransposo no um retrovirus. Retrotransposio 1. Gene gag: envolvido na maturao do RNA 2. Gene pol: Gene que codifica para a transcritase reversa. 3. Gene env: gene que codifica para a parte proteica do vrus, nomeadamente o envelope.
Classe com LTR (long terminal repeat)
Classe sem LTR (contem na mesma o gene Pol).
As sequncias Alu so retrotransposes. Porm no apresentam o gene que codifica para a transcritase reversa, utilizando transcritases reversas que outros genes codificam, como, por exemplo, um dos LINES que existem no organismo. DNA mvel: classificao quanto forma de transposio: 1. Via DNA 2. Via RNA: normalmente no tm a capacidade de se transpor novamente.
Replicao
A replicao semiconservativa.
Garfo de Replicao
A cadeia lder ou leading strand sintetizada continuamente, no sentido 5 para 3. J a cadeia Lagging sintetizada de forma descontnua, por intermdio de fragmentos com uma dimenso de cerca de 1000 nucletidos, os fragmentos de Okasaki.
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Nota: Tanto a cadeia lder como a lagging so sintetizadas no sentido 5 para 3. Desta forma se assume que a cadeia lagging tem de ser sintetizada no sentido contrrio ao da cadeia leading Todas as DNA polimerases conhecidas necessitam de um primer com uma extremidade 3 OH livre para poderem iniciar a sntese de DNA.
Primer: Normalmente, trata-se de uma sequncia de bases com cerca de 11/12 (ribo) nucletidos, um dos quais apresenta na extremidade um grupo OH livre, a qual serve como sinal para a DNA polimerase iniciar a sntese de uma nova cadeia de DNA. Aps a sntese da cadeia de DNA, os primers (caso sejam de RNA) so removidos pela actividade 5 3 exonucleotdica da DNA polimerase I. No entanto, um primer pode assumir diversas formas2.
necessria uma enzima especfica, uma primase, para catalisar a reaco de formao do primer. Esta enzima resulta da expresso do gene dnaG. A dnaG primase uma RNA polimerase que utilizada apenas em circunstncias especficas, como quando h necessidade de sintetizar uma pequena cadeia de bases ribonucleotdicas necessrias ulterior sntese de DNA.
Helicases: Enzimas responsveis pela separao da dupla hlice de DNA em duas cadeias de nucletidos, recorrendo, normalmente hidrlise de ATP para obter a energia necessria. So enzimas multimricas e de forma geral, hexmeros, e se deslocam ao longo da molcula de DNA utilizando a sua estrutura multimrica para providenciar mltiplos DNA binding sites. Torna-se passvel que existam duas conformaes, uma das quais se liga ao DNA ds e outra que se liga ao DNA ss. Uma alternncia de conformaes proporciona o movimento da enzima que progressivamente vai quebrando a dupla hlice de DNA, originando duas cadeias polinucleotdicas.
Pode inclusive ser uma protena!
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Ao nvel das bolsas de DNA, ocorre a quebra das pontes de hidrognio, especialmente no que trata s ligaes entre as bases Timina e Adenina, que so as mais fceis de quebrar (so duplas). As protenas SSB (single strand binding proteins) ligam-se s cadeias polinucleotdicas (DNAss) impedindo assim a sua juno. As Topoisomerases facilitam o desenrolamento da hlice, quebrando igualmente algumas ligaes. Nota: O primeiro nucletido do primer de RNA est trifosfatado.
DNA polimerase I o A DNA pol I responsvel pela remoo dos primers, degradando-os no sentido 53 e ao mesmo tempo e no mesmo sentido, incorpora nucletidos (elongamento da cadeia de DNA) impedindo assim a formao de gaps. Desta forma: o Esta enzima polimeriza DNA no sentido 5 3 o uma 3 5 proofreading3 exonuclease o igualmente uma 5 3 error correcting exonuclease. A DNA polimerase I necessita dos quatro tipos de desoxiribonuclesidos 5 trifosfatos, ou seja, dATP, dGTP, dTTP e dCTP, para alm de Mg2+. Esta enzima adiciona desoxiribonucletidos extremidade livre 3 OH da cadeia que sofre alongamento, a qual segue no sentido 5 3. tambm uma gap filler. Trata-se de um pptido simples de 103 kD. A cadeia pode ser clivada em duas regies por intermdio de proteases. O produto resultante de maiores dimenses (68 kD) denomina-se fragmento de Klenow, o qual utilizado em diversas reaces sintticas in vitro e apresenta actividade 3 5 exonucleotdica e de polimerase no sentido 5 3.
Nota: A velocidade de polimerizao desta enzima relativamente baixa quando comparada com outra de seu nome, DNA polimerase III, a qual se encarrega da maior parte da polimerizao das cadeias de DNA.
Reviso de provas.
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DNA polimerase III o a enzima que sintetiza a maior parte do DNA. o Caracteriza-se por uma alta capacidade de processamento, grande potncia cataltica e por uma elevada fidelidade. o Tambm designada de holoenzima, tem a capacidade de formar muitos milhares de ligaes fosfodiester, antes de se libertar do molde (template), comparativamente s 20 processadas pela pol I. o Outro aspecto marcante liga-se sua capacidade cataltica: a DNA pol III tem a capacidade de adicionar 1000 nucletidos por segundo, comparativamente aos escassos 20 por segundo atingidos pela pol I. Esta velocidade atingida pela pol III sem qualquer perca de preciso. o Todas estas propriedades implicam uma grande complexidade. De facto, a DNA polimerase III formada por 10 tipos de cadeias polipeptdicas, apresentando uma massa de 900 kD, quase uma ordem de grandeza maior que a cadeia simples, apresentada pela pol I. o A holoenzima um dmero pois ambas as cadeias de DNA parental tm de ser sintetizadas no mesmo local e ao mesmo tempo. Porm um dmero assimtrico, j que as cadeias leading e lagging so sintetizadas de formas diferentes. Desta forma: Tem actividade de polimerase 5 3 Funciona como exonuclease com proofreading 3 5 Porm no apresenta correco de erros, pelo que a actividade da pol I continua a ser fundamental para a manuteno da integridade do DNA. Antes e aps a replicao existem outros mecanismos de reparao, para alm do exercido pela DNA polimerase no momento da replicao (como o uvrABC, ou os Muts).
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10 Aula: 12/09/2004 Sumrio: Modelos de replicao em eucariotas e procariotas; Replicao do DNA eucaritico (polimerases). Sntese das extremidades dos cromossomas (telomerase). Sequenciao de genoma; tcnica dos terminadores de cadeia. Tanto em eucariotas como em procariotas, a replicao : 1. Semiconservativa 2. Apresenta uma origem de replicao
Ao nvel do garfo de replicao, ocorre a sntese tanto da cadeia leading como da cadeia lagging ao mesmo tempo, podendo ser uni ou bidireccional. No entanto, o tipo de sntese ir variar de acordo com o tipo de molcula de DNA.
Modelo de replicao do tipo (DNA circular)
Surge muitas vezes em vrus e bacterifagos. Ocorre a separao das duas cadeias e ulteriormente tero de ocorrer cortes para que as cadeias neossintetizadas de possam soltar, mecanismo que ainda no est totalmente estudado, subsistindo ainda algumas dvidas relativamente ao mecanismo em questo.
Replicao baseada em oriC (E. coli) O genoma da Enterobacteriaceae E. coli replica-se de forma bidireccional, a partir de uma nica origem, identificada como sendo o locus oriC. A adio deste locus a uma qualquer cadeia de DNA cria um plasmdeo artificial o qual tem a capacidade de se replicar nesta bactria. Atravs da reduo da dimenso do fragmento clonado de oriC, foi possvel atribuir-lhe a dimenso de 245 pb.
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A replicao de uma molcula circular evita os problemas que surgem ao replicar as extremidades de uma molcula de DNA linear (que sero vistos mais frente). Quando se inicia a replicao surgem dois garfos de replicao no locus oriC, os quais se vo movendo em torno do genoma (a aproximadamente a mesma velocidade) at chegarem a um ponto onde se encontram. Uma questo pertinente a que garante que o DNA seja replicado mesmo ao nvel da regio em que os garfos se encontram. Aps a terminao da replicao do DNA, diversas enzimas capazes de manipular uma estrutura mais complexa e de ordem superior do DNA, so necessrias para que as duas cadeias polinucleotdicas filhas se separem das parentais. As sequncias que provocam a terminao da replicao designam-se locais ter, os quais contm uma pequena sequncia (23 pb) que leva terminao in vitro. A terminao requer igualmente o produto do gene tus, cuja protena resultante da expresso reconhece uma sequncia de consenso4 e impede o garfo de replicao de continuar. Modelo do crculo rolante Partindo de uma cadeia circular de DNA ds, a replicao inicia-se na origem atravs do corte de uma das cadeias. Aps a sntese da nova cadeia (uma volta molcula), a protena do gene A cliva a nova cadeia e liga as duas extremidades.
A cadeia deslocada (displaced stand) pode passar para uma outra bactria (por exemplo. se esta for competente) e s nessa clula bacteriana ocorre a sntese da cadeia complementar da cadeia recebida (DNAss!).
O DNA eucaritico no apresenta uma s origem de replicao (ou ori) mas sim muitos. Replico: unidade de DNA que resulta de um s acto de replicao.
Ou consensus. Sequncia idealizada e na qual cada posio representa a base mais frequentemente encontrada quando diversas sequncias de diversos organismos so encontradas.
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Nos procariotas, existem diversos tipos de DNA polimerases, como o caso da I, II, III, etc. No caso dos eucariotas, surgem tipos diferentes de polimerases, aos quais se d o nome de , , entre outras. a DNA polimerase que tem como funo a sntese da cadeia complementar da cadeia molde (template). Sntese das extremidade dos cromossomas Este problema coloca-se aquando da replicao de molculas de DNA linear. Para a cadeia leading, a adio de (poli) nucletidos durante a replicao pode efectuar-se at ao fim pois parte de um primer precedente. Porm, na extremidade, a cadeia lagging atinge um ponto no qual o sistema de primers de RNA se v impossibilitado de prosseguir a sntese. Desta forma, forma-se uma extremidade 3 projectada ao nvel da cadeia molde passvel de ataque pelas exonucleases intracelulares. Em cada replicao a dimenso do cromossoma seria encurtada o que eventualmente levaria a mutaes, etc. Como forma de resolver o dito problema, as extremidades dos cromossomas, as quais se designam telmeros, apresentam repeties adjacentes de sequncias simples de DNA. Na espcie H. sapiens sapiens a repetio TTAGG. Estas repeties no codificam para um RNA ou para uma protena mas tm uma funo na replicao. Uma enzima denominada telomerase adiciona estas unidades repetitivas simples poro terminal dos cromossomas. A telomerase um tipo especial de enzima, uma transcritase reversa, a qual aporta uma pequena sequncia de bases ribonucleotdicas. Parte desta sequncia serve de molde para a polimerizao da sequncia repetitiva telomrica a ser adicionada extremidade 3 OH. Para o caso a sequncia de RNA na telomerase seria 3AATCC5. A extremidade estendida pela telomerase dobra e assim se previne o ataque por parte das exonucleases. De notar que a enzima responsvel pela adio destes ditos telmeros aps uma certa idade passa a surgir apenas em certo tipo de clulas: Clulas germinais Clulas embrionrias
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Como j foi referido, a DNA pol I foi a primeira enzima deste tipo a ser descoberta, tendo sido isolada de E. coli. Era necessrio uma enzima que sintetizasse DNA 5 3 e que procedesse igualmente a uma reviso de provas. Desta forma se manipulou esta enzima de forma a adquirir estas propriedades, tendo sido obtido o chamado fragmento de Klenow. A descoberta deste fragmento foi muito importante a nvel dos processos de clonagem.
Utilizando este fragmento da DNA pol I, possvel mapear diversas sequncias de DNA desconhecido, bastando para isso inseri-las num plasmdeo ao nvel do MCS. Adjacentes sequncia MCS (mais precisamente dos dois lados) surgem sequncias que se podem emparelhar com primers (5 3) e possibilitam uma primer extension, juntamente com a amplificao da sequncia desconhecida que se pretende estudar.
Sequenciao de DNA
Mtodo de Sanger dideoxy (ou dos terminadores de cadeia) Este mtodo, desenvolvido na dcada de 70 tem a capacidade de gerar fragmentos de DNA que terminam com os quatro tipos diferentes de nucletidos, os quais se encontram marcados radioactivamente. Os fragmentos obtidos so ulteriormente separados por electroforese em gel para que molculas com um nucletido de diferena em tamanho fiquem separadas. Utilizam-se 4 lanes para a determinao de cada uma das sequncias, sendo que cada lane corresponde a sequncias que terminam em cada um dos 4 nucletidos, Adenina, timina, etc. As posies dos fragmentos so localizados por autoradiografia e dessa forma as sequncias podem ser lidas directamente a partir do gel. 1. Em primeiro lugar necessrio efectuar uma cpia da sequncia de cadeia simples (como obvio..) utilizando a DNA polimerase. De notar que esta enzima utiliza desoxiribonuclesidos 5 trifosfatos como substrato, adicionando-os a um primer (como foi dito na aula 9) 2. Aos quatro tubos de incubao, adicionam-se quatro molculas anlogas (uma diferente por tubo) aos diversos nucletidos 5 trifosfatos, molculas essas denominadas didesoxinucletidos, j que o glcido que as forma, no apresenta a extremidade 3 hidroxilo (OH). Desta forma, a continuao do alongamento da cadeia deixa de poder efectuar-se. Estes didesoxinucletidos agem assim como terminadores de cadeia (da o nome do mtodo).
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1. Os fragmentos obtidos so radioactivos, devido ao uso de tanto um primer radioactivo como da marcao radioactiva dos didesoxinucletidos. 2. efectuada ento uma electroforese destes fragmentos e as suas posies so determinadas ulteriormente por autoradiografia. 3. Por fim, ao alinhar as quatro lanes dos quatro didesoxinucletidos 5 trifosfatos, e anotando a posio de cada fragmento relativamente ao seu vizinho, a sequncia de DNA cpia pode ser lida directamente a partir do gel.
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11 Aula: 14/10/2004 Sumrio: Recombinao; modelos de recombinao homloga, nomeadamente, modelo de Holiday; protena RecA. Transferncia de DNA. Insero de DNA a nvel de um cromossoma. Nota: os primers hibridam a uma certa distncia dos locais de clonagem. Aquando da leitura, so lidos tambm nucletidos do prprio vector. No entanto, quando se atinge a sequncia de corte da enzima de restrio, sabe-se que a partir da se estar a ler a sequncia do fragmento inserido! Desta forma, torna-se fundamental detectar uma sequncia conhecida.
Recombinao
A recombinao o processo base do crossing over. Existem diversos modelos que explicam este processo, sendo que nenhum tem uma importncia absoluta.
Recombinao homloga
Este tipo de recombinao implica trs aspectos principais: 1. Consiste no acto de ligar duas molculas de DNA em cadeia dupla 2. A regio homloga dever ser extensa (poder apresentar apenas quasihomologia) 3. A troca de informao ocorre dentro da prpria molcula.
Recombinao stioespecfica Envolve sequncias curtas de DNA homlogo. Surge tambm aquando da integrao de DNA fgico.
Transposio
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Modelo de Holiday Trata-se do modelo mais aceite actualmente para explicar a recombinao homloga. Este tipo de recombinao ocorre sobretudo durante a meiose (profase I). Desta forma:
1. Em primeiro lugar, necessrio ocorrer um corte em cadeia simples em cada cadeia. De notar que condio igualmente necessria o facto de as cadeias recombinantes apresentarem a mesma polaridade (5 3 ou a contrria).
2. De seguida sucede uma invaso de uma cadeia pela outra e ulterior migrao. A progresso pode ser maior ou menor. Porm existem sequncias especficas cujo objectivo parar o prosseguimento da progresso (passe a redundncia).
Para que ocorra recombinao necessrio que os alelos que ladeiam a zona de crossing over sejam diferentes. Pode igualmente ocorrer troca sem recombinao. S se o corte se der ao nvel das cadeias que no ficaram envolvidas na recombinao que se forma DNA recombinante. As restantes cadeias de DNA no so recombinantes. Os cortes podem ser: Transversais Horizontais
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DNA heterodplice: No local de recombinao, cada dplice apresenta uma regio constituda por uma cadeia de cada uma das molculas de DNA parental. Existem cerca de 25 genes conhecidos envolvidos nos processos de recombinao. Um dos genes mais importantes o gene recA, o qual codifica para um protena igualmente fulcral no processo, a protena RecA. Em E. coli esta protena conduz a cadeia de DNA ss para a ulterior invaso da outra cadeia. Nota: Uma mutao ao nvel desta protena leva a uma impossibilidade de a bactria realizar recombinao homloga. As estirpes de E. coli recA (-) so muito importantes em engenharia gentica se no se quiser que o DNA plasmdico (vector) nativo recombine com o DNA cromossomal.
Transferncia de DNA (in vivo) 1. Transduo: a transferncia de DNA feita por intermdio de um vector viral 2. Transformao: entrada de DNA livre para o interior da bactria 3. Conjugao: a transferncia envolve contacto clulaclula assim como um plasmdeo conjugativo presente na clula dadora. O DNA que entra na bactria receptora tem de se recombinar (ao inserir-se no genoma da receptora) pois no pode existir no interior desta sem ser degradado pelas endonucleases. Para ocorrer transformao, necessrio que a bactria em questo seja competente. Por outras palavras, que tenha a capacidade de se transformar ao absorver para dentro de si uma molcula de DNA. A competncia em bactrias transformveis geralmente regulada, pelo que so protenas especficas que medeiam o uptake e processamento do DNA. Estas competence specific proteins podem incluir protenas associadas membrana como DNA binding proteins, autolisinas e diversas nucleases. Uma pathway para a competncia natural em Bacillus subtilis faz parte do seu sistema de quorumsensing. De uma forma geral, neste gnero s cerca de 20% das clulas so competentes, mantendo-se assim durante vrias horas. Em Streptococcus sp, 100% das clulas podem tornar-se competentes. Porm isso s sucede durante alguns minutos e durante uma fase especfica do seu ciclo de vida.
Quando o DNA (cadeia simples) entra na bactria pode ser automaticamente degradado. Para impedir que tal suceda caso o DNA apresentar locais homlogos com o DNA da clula, protegido por protenas e conduzido pela RecA, inserindo-se no genoma desta. O DNA que entra na clula s recombina e forma molculas de DNA recombinante se for de alguma forma homlogo com o DNA da bactria receptora.
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Insero da informao partindo de um plasmdeo no DNA cromossomal
O interesse desta tcnica consiste na possibilidade de substituir determinados alelos. possvel recorrer a esta tcnica desde que existam sequncias homlogas na sequncia a ser inserida! A integrao ectpica rara e pouco conhecida, sendo que o seu local de ocorrncia tambm aleatrio.
Nota: Se se tratar de uma molcula de DNA circular basta ocorrer um crossing over para se formar uma molcula de DNA recombinante. Por outro lado, se a molcula de DNA for linear, j so necessrios 2 fenmenos de crossing over para se formar uma molcula de DNA recombinante.
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12 Aula: 25/10/2004 Sumrio: Conjugao; plasmdeo F, integrao de um plasmdeo; sequncias de insero. Transfeco; via lisognica; Transduo e fago .
Conjugao
O processo de conjugao bacteriana um processo de transferncia de material gentico que envolve contacto clulaclula. De notar igualmente o facto do mecanismo de conjugao se tratar de um mecanismo controlado geneticamente via um plasmdeo. Um plasmdeo conjugativo utiliza esta tcnica para transferir uma cpia de si prprio para um novo hospedeiro. Outros elementos podem ser mobilizados durante o processo de conjugao: Outros plasmdeos O cromossoma da clula hospedeira
De facto, a conjugao foi descoberta pois o plasmdeo F da E. coli tem a capacidade de mobilizar o cromossoma da clula receptora. (O nome de plasmdeo F advm de fertilidade). Os mecanismos de transferncia por conjugao podem diferir de acordo com o plasmdeo envolvido. Porm, a maior parte dos plasmdeos em bactrias gramnegativas empregam um mecanismo semelhante ao utilizado pelo plasmdeo F em E. coli. A conjugao envolve assim: Clula dadora: a qual contm um tipo especfico de plasmdeo Clula receptora
Os genes que controlam a conjugao situam-se numa regio denominada tra, no plasmdeo. Diversos genes ao nvel desta regio encontramse envolvidos na sntese de uma estrutura superficial qual se d o nome de sex pilus ou mais simplesmente pili. Apenas a clula dadora apresenta estes pili. Plasmdeos diferentes podem apresentar regies tra diferentes e os pili podem ser igualmente diferentes. O plasmdeo F e outros semelhantes codificam pili F.
Os pili permitem um emparelhamento especfico entre a clula dadora e a clula receptora, sendo responsveis pela aproximao de ambas as clulas quando se retraem (despolimerizam).
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A sntese de DNA necessria para ocorrer transferncia, tornando-se evidente que uma das cadeias de DNA deriva da clula dadora e a outra sintetizada de novo na clula receptora no decurso do processo de transferncia. Alguns genes da regio tra so mesmo responsveis pela transferncia e replicao de DNA.
O modelo que melhor explica a transferncia de DNA durante o processo de conjugao o modelo do crculo rolante (j discutido).
O conjunto de eventos desencadeado devido ao contacto entre as clulas, sendo que durante este, uma cadeia de DNA do plasmdeo cortada e uma cadeia de DNA parental transferida. Uma enzima que leva a cabo o corte ao nvel do plasmdeo da clula dadora necessrio para iniciar o processo designa-se TraI, sendo codificada pelo opero tra do plasmdeo F. Esta protena possui tambm uma actividade de helicase estando envolvida no desenrolamento da cadeia a ser transferida. medida que a transferncia ocorre, o DNA sintetizado por intermdio do mecanismo do crculo rolante substitui a cadeia transferida na clula dadora. Uma cadeia complementar igualmente sintetizada na clula receptora. No terminus do processo, tanto a clula dadora como a receptora apresentam plasmdeos completos.
O plasmdeo F de E. coli , de facto, um episoma, pois tem a capacidade de, para alm da conjugao, se integrar no cromossoma da clula receptora. Clulas contendo um plasmdeo F no integrado denominam-se F+, ao passo que aquelas que apresentam um plasmdeo F integrado no DNA cromossomal tm o nome de Hfr (high frequency of recombination).
O plasmdeo integrado pode ser excisado e transferido para outra clula. Se contiver algum material gentico cromossmico da clula dadora designa-se plasmdeo F. Tanto as clulas F+ como as Hfr podem servir como dadoras. No entanto, a conjugao utilizando clulas Hfr poder resultar tambm na transferncia de DNA cromossomal j que o plasmdeo faz parte do cromossoma.
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Integrao de um plasmdeo A integrao de um plasmdeo, que para o caso seria o F, no cromossoma da clula hospedeira ocorre em diversos locais especficos chamados IS (ou insertion sequences). O mecanismo envolvido tem o nome de recombinao stioespecfica. Deduz-se ento que estes locais IS so homlogos, tanto entre o plasmdeo F como com o DNA cromossomal. De uma forma geral, os plasmdeos tm a capacidade de autoreplicar, partindo de um locus denominado ori. Quando o processo de conjugao desencadeado, a transferncia de DNA inicia-se partindo de um locus, o locus oriT, quer o plasmdeo se encontre integrado no cromossoma ou no. Caso se encontre inserido no DNA cromossomal, pode, como j foi dito, transportar consigo tambm algumas marcas de DNA cromossomal. O processo de mobilizao do plasmdeo demora cerca de duas horas. A marca que se encontra mais prxima do plasmdeo transferida mais frequentemente que uma que se encontre mais longe. A descoberta destes mecanismos envolvendo a conjugao foram muito importantes na medida em que permitiram proceder a um mapeamento gentico e determinar a ordem me certos genes. Conforme os locais de insero (que vo diferindo), e as marcas genticas foi possvel efectuar o chamado mapeamento gentico (no entanto ainda no fsico). A seleco dos genes transferidos vai depender de: 1. Local de insero do plasmdeo 2. Orientao da origem de replicao aps a insero (sense do oriT) 3. Alinhamento de genes Nota: possvel obter diferentes tipos de recombinao atendendo, para alm do tipo de molculas de DNA envolvidas, ao tipo de presso selectiva exercida.
Transfeco As bactrias podem ser igualmente ser transformadas com DNA proveniente de fagos (vrus que infectam bactrias), num processo denominado transfeco.
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Transduo: Consiste na transferncia de DNA entre clulas por intermdio de fagos. Para ocorrer transduo necessrio que os lisados sejam ricos em partculas transdutoras; DNA bacteriano que foi clivado poder ser incorrectamente encapsidado.
Esta transferncia de material gentico pode ocorrer de duas formas: 1. Transduo generalizada: DNA da clula hospedeira derivado de praticamente qualquer poro do genoma desta pode vir a fazer parte do genoma da partcula viral madura em detrimento do prprio genoma do vrus. 2. Transduo especializada: quando o DNA de uma regio especfica do cromossoma da clula hospedeira directamente integrado no genoma do vrus, ocasionalmente substituindo alguns genes virais; ocorre somente em vrus (fagos) temperados.
Nota: A partcula viral transdutora resultante tanto da transduo especializada como da generalizada defeituosa como vrus pois alguns genes bacterianos tero j substitudo determinados genes virais importantes.
Transduo generalizada
Quando uma populao de bactrias sensveis infectada por um fago, o ciclo ltico deste poder ter incio. Durante o referido processo, as enzimas responsveis pelo packaging do DNA viral para o interior da cpside por vezes cometem erros, encapsidando DNA da clula hospedeira em vez do genoma do vrus. A partcula resultante tem o nome de partcula transdutora. Estas partculas no tm capacidade de gerar uma infeco j que no contm DNA viral e dizem-se defeituosas (defective). Quando o lisado (obtido aps a lise da clula e contendo partculas virais e transdutoras) utilizado para infectar uma populao de clulas receptoras, a maior parte delas fica infectada por partculas virais sendo que s uma pequena poro atingida por estas partculas transdutoras. O DNA que as clulas recebem das partculas transdutoras no tem a capacidade de se replicar. No entanto pode ser alvo de recombinao com o DNA da clula hospedeira ficando integrado.
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Vias ltica e lisognica Muitos vrus so virulentos. Porm outro tipo de vrus, apesar de possurem a capacidade de destruir as clulas, apresentam um ciclo bastante diferente, com efeito mais subtis sobre o hospedeiro. A este tipo de vrus d-se o nome de vrus temperados, sendo que apresentam uma capacidade de entrarem num estado lisognico e durante o qual, grande parte dos genes virais no se expressam e o DNA do vrus replicado em conformidade com o do hospedeiro. O vrus temperado no existe no seu estado maduro e infeccioso no interior da clula apresentado-se numa forma latente chamada provrus ou profago. O profago encontra-se inserido no DNA cromossomal. Por induo, possvel a um vrus temperado passar para um ciclo ltico (radiao UV por exemplo).
Transduo especializada A transduo especializada permite a transferncia de material gentico com grande eficincia, ao mesmo tempo que proporciona a replicao independente de uma pequena regio de DNA do cromossoma da bactria. A insero do fago tambm especfica, ocorrendo sempre no mesmo local. O fago muito utilizado como vector de transduo especializada: A integrao do DNA do fago ocorre num local especfico no cromossoma de E. coli, sendo necessria para a progresso do ciclo lisognico. No decurso da injeco, as extremidades coesivas do DNA linear do fago unem-se dando origem a uma molcula de DNA circular. esta molcula de DNA circular que ir integrar-se no genoma da clula hospedeira. O local criado quando as duas extremidades se unem designa-se cos. Para se estabelecer lisogenia, os genes cI e int (codifica para a integrase) tm de se expressar. O processo de integrao requer esta topoisomerase stioespecfica, a qual cataboliza a recombinao entre o DNA do fago e o DNA cromossomal do hospedeiro. Estes locais em que existe uma pequena homologia tm o nome de att.
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Nota: ver pgina 254, figura 9.21, Brock. Aps a integrao e durante o ciclo lisognico, por induo, o DNA do fago excisado como uma unidade. Porm, e em condies raras, possvel que o genoma do fago seja excisado incorrectamente e alguns genes bacterianos adjacentes (como por exemplo o opero da galactose) serem excisados juntamente com DNA fgico. Um tipo de partcula fgica chamada lambda dgal ou dgal (dgal quer dizer defective galactose) defeituosa pois diversos genes necessrios maturao do fago perderam-se e j no forma partculas fgicas maduras.
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13 Aula: 27/10/2004 Sumrio: Mutaes; bases moleculares; transies e transverses (substituies de bases); frameshift mutations. Protenas de fuso. As mutaes surgem devido a alteraes na sequncia de bases do material gentico de um determinado organismo. Em muitos casos, as mutaes tm expresso fenotpica no organismo, sendo tambm e, de uma forma geral, nefastas ou neutras, podendo no entanto resultar em alteraes benficas, ainda que apenas ocasionalmente. As mutaes podem ser: 1. Espontneas: resultantes da aco da radiao natural (raios csmicos, etc.) que alteram a estrutura das bases do DNA; taxa constante; surgem em todas as clulas. 2. Induzidas: mutaes devidas a agentes qumicos, raios UV, ocorrendo a taxas relativamente elevadas comparativamente s mutaes espontneas. A classificao das mutaes atende : Origem Ocorrncia (clulas somticas por ex.) Expresso o Condicionais: mutao que s se expressa em determinadas condies, que por sua vez podem ser restritivas ou permissivas. Exemplos de mutaes condicionais so as mutaes termosensveis (a temperatura uma condio restritiva): o gato siams; a utilizao de microorganismos com mutaes termosensveis importante j que possvel produzir-se uma protena com um aminocido diferente e cujo folding no seja o correcto. o No condicionais Efeito de uma mutao na funo: Por vezes, as mutaes podem dar origem a uma perda de funo de determinado gene (knockout), tanto por deleco de uma sequncia de aminocidos, como atravs da insero de uma sequncia que inactive o gene (transposo, cassete, etc.). Mutaes leaky levam geralmente produo de uma protena, cuja funo normal reduzida. Mutaes que possam ocorrer a nvel da regio promotora so tambm de grande importncia, pois podem igualmente afectar a regulao da expresso gnica. Mutaes com gain of function: aumento da expresso de determinada protena; genes expressos fora do local ou do tempo em que deviam ser expressos.
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Classificao de mutaes como alteraes a nvel molecular: Substituio de nucletidos Insero de nucletidos Deleces Substituies de nucletidos As mutaes envolvendo uma ou muito poucas bases (ou pares de bases) so referidos como mutaes pontuais ou point mutations. Este tipo de mutaes pode resultar em substituies de nucletidos no DNA, ou na insero e deleco de um par de nucletidos (denominadas microinseres ou microdeleces). As substituies de nucletidos podem ser de dois tipos: Transies: se a substituio for de uma purina com uma purina ou de uma pirimidina com uma pirimidina (AG ou CT) Transverses: caso se trate de uma substituio de uma purina por uma pirimidina ou vice-versa (a substituio feita por uma base diferente)
Na Natureza, ocorrem mais transies que transverses. Ao interpretar os resultados de uma mutao e atendendo a que o cdigo gentico degenerado, nem todas as mutaes resultam em alteraes a nvel proteico. Mutaes sinnimas ou silenciosas: mutao que advm da alterao de um nucletido, alterao essa que no produz efeito no aminocido produzido. Ex. UAC UAU em que o codo alterado mas corresponde na mesma tirosina. Mutaes missense: nome dado a uma mutao que resulta na alterao de 1 aminocido na protena resultante da expresso do gene. O significado qumico do polipptido resultante alterado. Se a alterao ocorrer num ponto crtico da cadeia polipeptdica, a protena resultante pode ser inactiva ou apresentar uma actividade reduzida.
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Mutaes nonsense: outro resultado de substituies nucleotdicas a formao de um codo stop, o qual ir provocar uma terminao prematura na transcrio e o resultado ser, muito provavelmente, uma protena no funcional.
Mutaes frameshift ou de grelha de leitura Dado que o DNA lido com uma determinada polaridade e em blocos consecutivos de 3 bases, qualquer deleco ou insero de um par de nucletidos resulta numa alterao da grelha de leitura, ficando a traduo de uma srie de genes completamente alterada. Como lgico, alteraes de bases em 3 ou mltiplos de 3 no traz grandes alteraes leitura dos genes.
Nota: As microinseres e microdeleces do origem a mutaes frameshift s se ocorrem numa sequncia correspondente a um gene que codifica para uma protena, includo na grelha de leitura. A insero de um nico par de bases ao nvel de um promotor de um gene pode resultar em alteraes dramticas na funo do gene (alteraes na sua regulao) contudo, no seria um caso de mutao frameshift. Protenas de fuso: protenas construdas atravs da fuso de duas. Este processo possvel atravs da coalescncia de duas grelhas de leitura, pela inactivao de um codo stop.
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14 Aula: 28/10/2004 Sumrio: Mutaes (cont.); mecanismos de reparao; Exciso; sistema AP, sistema MutHLS, sistema uvr e sistema SOS. Os danos no DNA so minimizados por sistemas que os reconhecem e corrigem, sendo bastante complexos. Como j foi dito, os danos ao nvel do DNA podem inserir-se em, basicamente, duas categorias: Alteraes simples de bases Distores da dupla hlice
Estas distores da cadeia de DNA so causadas pela formao de dmeros de pirimidina, insero incorrecta de bases (devido a uma alterao do seu tautomerismo), extremidades projectadas 5, etc. Modelos de reparao em E. coli Directos: no tem de ocorrer substituio. Cortes em cadeia simples podem ser novamente ligados por intermdio de uma DNA ligase; quando surgem gaps, estas so preenchidas pela DNA polimerase I; em casos de corte em cadeia dupla, a recombinao homloga pode ser responsvel pela reparao. raro acontecer. Indirectos: exciso de nucletidos Radiao UV (distores da dupla hlice) A radiao ultravioleta responsvel pela ocorrncia de diversos fotoprodutos no DNA. Dois tipos de leses podem assim surgir, nomeadamente relativos formao de uma ligao covalente entre duas pirimidinas adjacentes, formando-se um dmero de pirimidinas (pyrimidine dimer). Estes dmeros de pirimidinas podem ser anis de ciclobutano derivados das ligaes dos carbonos 5 e 6 das timinas ou ento fotoprodutos do tipo 6-4. As transies mais frequentes que se pensa estarem associadas radiao UV so transies do tipo CT. No entanto tambm podem surgir transverses assim como frameshifts (duplicaes ou deleces).
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Outro tipo de alteraes podem ocorrer no DNA, desde alquilao at depurinao, entre outros, no sendo devidas a radiaes mas sim a agentes qumicos.
Fig. Depurinao e alquilao
Sistemas de reparao
Reparao directa (ou por direct reversal of damage) Trata-se da forma mais simples de reparao de leses e consiste essencialmente na reverso directa, regenerando a base normal. Note-se que nem sempre possvel reverter uma mutao pois alguns tipos de danos so essencialmente irreversveis. O fotodmero de ciclobutano pirmidnico pode ser reparado por uma enzima, a fotoliase, a qual est presente em bactrias e em eucariotas inferiores mas no em seres humanos. Esta enzima reage com o fotodmero, clivando as ligaes que o unem, na presena de certos comprimentos de onda da gama do visvel, dando de novo origem s bases originais. De notar que esta enzima no tem a capacidade de operar no escuro. As alquiltransferases so outro tipo de enzimas responsveis pela reverso directa de leses. Estas enzimas removem certos grupos alquilo, adicionados guanina, na posio O-6, por agentes qumicos como as NG5 e EMS6.
Reparao por exciso General excision repair ou reparao por exciso de nucletidos Este sistema envolve a quebra de uma ligao fosfodiester em ambas as extremidades da leso e na mesma cadeia, da qual resulta a exciso de um oligonucletido. A lacuna (gap) formada ulteriormente preenchida por uma DNA polimerase e de seguida a DNA ligase liga a sequncia de oligonucletidos neossintetizada. Como exemplo de um sistema de reparao por exciso de nucletidos existe o sistema uvr.
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Nitrosoguanidina Ethylmethanesulfonate
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Fig. A reparao por exciso remove e substitui uma sequncia de oligonucletidos de DNA que incluem a, ou as, bases danificadas
Sistema uvr
O sistema de exciso e de reparao uvr inclui 3 genes uvrA,B,C, os quais codificam para uma endonuclease com funo de reparao. As diferentes fases de reparao encontram-se descriminadas na imagem abaixo. Em primeiro lugar, uma combinao de protenas, a UvrAB, reconhece dmeros de pirimidina entre outras leses (scanning do DNA). Em seguida a protena UvrA dissocia-se (o que requer ATP) e UvrC junta-se a UvrB. A combinao UvrBC faz ento uma inciso em cada um dos lados da leso, nomeadamente uma a 7 nucletidos de distncia para a extremidade 5 e a outra a 3 nucletidos de distncia da leso, para o lado 3 (tambm necessrio ATP). UvrD uma helicase que ajuda a desenrolar o DNA, permitindo a libertao da cadeia simples entre os dois cortes.
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Reparao por exciso especfica (reparao por exciso de bases e nucletidos) Algumas leses so demasiado subtis para causar uma distoro suficientemente grande para ser reconhecida pelo sistema de exciso e reparao uvrABC. Desta forma, outras formas de reparo so necessrias para a correco deste tipo de leses. Reparo pelo sistema AP endonuclease (restaura locais AP) Todas as clulas apresentam endonucleases que atacam os locais resultantes da perda espontnea de uma purina ou pirimidina. Estas enzimas, denominadas AP endonucleases so de uma importncia vital para a clula, j que a depurinao espontnea um processo relativamente frequente. As AP endonucleases fazem cortes em cadeia simples, clivando as ligaes fosfodiester (5), nestes locais AP (apurnicos). A clivagem desta ligao inicia um processo de exciso e reparo mediado por mais 3 enzimas: uma exonuclease, DNA polimerase I e DNA ligase. A grande fidelidade deste sistema pode indicar que se trate de um dos passos finais do processo de reparao. Caso as bases danificadas possam ser excisadas deixando um local apurnico ou apirimidnico (AP), as AP endonucleases podem completar a reparao, como sucede no caso no sistema de reparo por intermdio da DNA glicosilase. Sistema de reparao referente DNA glicosilase As DNA glicosilases no clivam ligaes fosfodiester mas sim ligaes N-glicosdicas (entre a base e o glcido), excisando a base alterada e gerando um local apurnico ou apirimidnico, designado local AP (j que so bioquimicamente equivalentes). Este local AP resultante ento reparado por uma AP endonuclease, durante o mecanismo de reparo anteriormente mencionado. Existem numerosas DNA glicosilases. Uma delas, a uraciloDNA glicosilase, remove as bases de uracilo do DNA. Os resduos de uracilo surgem devido desaminao espontnea da citosina e podem, se no forem corrigidos, dar origem a transies CT. Outras glicosilases removem bases alquiladas (como a 7-metilguanina, 3-metiladenina, etc.), purinas com o anel danificado, bases danificadas por agentes oxidantes e, em alguns organismos removem tambm fotodmeros.
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Reparao ps replicativa Alguns mecanismos de reparao tm a capacidade de reconhecer erros mesmo aps a replicao do DNA. Um destes sistemas designa-se sistema de mismatch repair. Um sistema deste gnero tem conseguir levar a cabo 3 processos: 1. Reconhecer as bases com erros de emparelhamento (missmatch). 2. Determinar qual a base incorrecta no missmatch. 3. Excisar a base incorrecta e reparar a cadeia. Os erros de replicao produzem missmatches na cadeia de DNA neossintetizada, pelo que so estes nucletidos incorporados que tero de ser excisados. Coloca-se ento uma questo pertinente: como que se faz a distino entre a base incorrecta e a correcta, se forem ambas bases normais presentes no DNA?
Num mecanismo conhecido (E. coli), imediatamente aps a replicao do DNA metilado (pois o DNA encontra-se normalmente metilado em locais especficos), apenas a cadeia de DNA parental est metilada. Durante o perodo em que acaba a replicao at metilao da cadeia neossintetizada possvel distinguir as duas cadeias (existe um hiato entre os dois processos).
esta a base para um sistema que corrige erros aps a replicao. O gene dam codifica para uma metilase cujo alvo uma adenina nas sequncias GATCCTAG. O estado hemimetilado (em que s a cadeia parental se encontra metilada) assim utilizado para fazer a distino entre cadeias oriundas da replicao e cadeias molde (template).
Um sistema de reparao missmatch o sistema MutHLS.
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Sistema MutHLS Este sistema consiste em diversas protenas, codificadas pelos genes mut. A protena MutS liga-se ao local de missmatch juntando-se-lhe seguidamente MutL. A protena MutS (um dmero) pode utilizar dois DNA binding sites e localiza especificamente os locais em que ocorreu o emparelhamento incorrecto (scanning do DNA). MutL no especfica para uma sequncia ou estrutura e tem como funo a translocao ao longo da cadeia at atingir uma sequncia GATC. Dado que MutS se encontra ligada tanto ao local de incorrecto emparelhamento como tambm cadeia de DNA, medida que translocada, cria um loop na cadeia. O reconhecimento da sequncia GATC leva outra protena, a MutH endonuclease, a ligar-se a MutSL. Esta endonuclease cliva ento a cadeia no metilada, sendo que a exciso ocorre desde a sequncia GATC at ao local de missmatch. A exciso pode dar-se tanto no sentido 53 (utilizando RecJ ou exonuclease VII) ou ento no sentido 35 (utilizando a exonuclease I), assistida pela helicase UvrD. Uma nova cadeia ento sintetizada pela DNA polimerase III.
Sistema SOS (em E. coli)

Por vezes, o prprio DNA pode induzir os processos de reparao. De facto, um complexo sistema celular, denominado Sistema SOS, activado como resultado de alguns tipos de danos ao nvel do DNA. A reparao do DNA por intermdio deste sistema ocorre na ausncia de um molde, ou seja, sem complementaridade de bases, o que resulta na criao de diversos erros e da, muitas mutaes. Este tipo se sistemas so ento error prone7. O sistema SOS normalmente reprimido por uma protena, a LexA. Porm, se ocorrem grandes danos ao nvel do DNA (nomeadamente formao de DNA em cadeia simples) o resultado ir ser a activao de uma protena, a RecA.
Propensos a erros.
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A activao da RecA leva clivagem proteoltica do produto do gene lexA. LexA uma pequena protena (22kD) que funciona normalmente como um repressor em diversos operes, assim como apresenta tambm uma actividade de protease latente, activvel pela RecA. Quando a RecA activada, leva a LexA a efectuar uma clivagem autocataltica, o que a inactiva como repressora e de forma coordenada, a leva a induzir todos os operes aos quais se encontrava ligada.
A protena LexA reprime diversos genes ao ligar-se a uma sequncia de 20 pb de DNA denominada SOS box8 a qual inclui uma sequncia consensus com 8 posies extremamente conservadas.
A protena LexA normalmente reprime a actividade do gene recA e tambm dos genes uvrA e umuD. (a protena UmuD uma das subunidades da DNA polimerase V). Muitas das mutaes so originadas pela DNA polimerase V, a qual codificada pelos genes umuC e umuD. A error prone DNA polimerase IV tambm induzida como parte do sistema SOS. A este tipo de enzimas tambm se d o nome de DNA mutases.
5 GTC (20)GAG 3
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15 Aula: 02/11/2004 Sumrio: Mutaes (concluso). Expresso gnica e regulao; promotores, TATA box. Terminadores (rho e no rho dependentes). Os sistemas de reparao discutidos anteriormente so de grande complexidade, incluindo diversas protenas e respectivas subunidades. Mutaes reversas: G=C T=C G=C Mutaes supressoras: so mutaes que suprimem outras mutaes. Este tipo de mutaes pode, ser ento: 1. Intragnicas 2. Intergnicas: mutao que ocorrem num gene, e que iro suprimir um outro gene. 3. tRNA repressores de mutaes nonsense: na sequncia nucleotdica ocorreu uma mutao que alterou o anticodo do tRNA, pelo que este passou a codificar no para um codo STOP mas sim para um outro aminocido.
Expresso gnica
A expresso gnica engloba dois processos principais: a transcrio e a traduo. Transcrio (procariotas) A transcrio baseia-se essencialmente na complementaridade de bases. A dupla cadeia de DNA separa-se localmente e uma das cadeias serve de molde para a sntese da cadeia de RNA. Em seguida, nucletidos livres so adicionados sequencialmente e alinhados com o template de DNA. A complementaridade de bases basicamente a mesma, existindo uma nica excepo: A emparelha com U e no com T. Todo o processo catalisado por uma enzima, a RNA polimerase9. A cadeia de RNA sempre estendida (cresce) no sentido 5 3. Dito de outra forma, os nucletidos so sempre adicionados extremidade 3 do nucletido anterior. No entanto, e contrastando com a replicao, no necessrio a existncia de uma extremidade 3OH livre para ser possvel iniciar a sntese. Outro aspecto importante: o primeiro ribonucletido trifosfatado.
Devido ao carcter antiparalelo do emparelhamento dos nucletidos e ao facto dos DNA ser sintetizado no sentido 5 3, sinnimo de que a cadeia molde para a sntese de RNA tem uma orientao contrria, ou seja 3 5.
Organismos procariotas apresentam apenas uma RNA polimerase ao passo que organismos eucariotas possuem trs enzimas deste tipo: RNA polimerases I, II e III.
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O RNA apresenta assim uma sequncia com a mesma polaridade que a cadeia sense do DNA ou seja, 5 3. RNA polimerase Em E. coli, a RNA polimerase formada por 5 subunidades diferentes:
Duas subunidades Duas subunidades ( e ) Uma subunidade
Os sinais codificados no DNA do uma indicao RNA polimerase dos locais em que deve iniciar e terminar a transcrio. De modo a transcrever uma gene correctamente, a RNA polimerase tem de reconhecer determinadas sequncias existentes no DNA
A iniciao da transcrio um passo de grande importncia na expresso gnica pois ao nvel desta etapa que a clula regula o processo e determina quais as protenas a serem expressas. A RNA polimerase um complexo proteico formado por diversas subunidades. a subunidade destacvel, factor que responsvel pela capacidade que a RNA polimerase apresenta de reconhecer os sinais no DNA, indicativos de incio de transcrio. De uma forma geral, a RNA polimerase interage de forma fraca com o DNA bacteriano ao colidir com este, deslizando um pouco at que se dissocia de novo. No entanto, caso a polimerase deslize at uma zona no DNA denominada promotor, liga--se a este de forma mais forte. Utilizando o seu factor , a polimerase reconhece esta sequncia de DNA estabelecendo um contacto especfico com determinadas pores de bases, expostas na zona exterior da hlice.
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Aps a RNA polimerase se ligar firmemente ao promotor, esta abre a dupla hlice, expondo uma pequena sequncia de nucletidos em cada uma das cadeias10. Com o DNA desenrolado, uma das duas cadeias serve de molde para o emparelhamento com os ribonucletidos do RNA, dois dos quais so ligados pela polimerase, para iniciar a cadeia. Quando os primeiros 10 (mais ou menos) nucletidos tiverem sido adicionados (processo relativamente ineficiente e durante o qual a enzima sintetiza e de seguida descarta pequenas sequncias de nucletidos), o factor dissocia-se da RNA polimerase. Durante este processo, a enzima sofre alteraes conformacionais que a possibilitam de prosseguir a sntese da cadeia de RNA mais rapidamente, mesmo sem o factor . O alongamento da cadeia prossegue at a enzima deparar com um segundo sinal no DNA denominado terminador e ao nvel do qual a RNA polimerase liberta o DNA molde assim como a cadeia neossintetizada de RNA. Aps a libertao da RNA polimerase, a core enzime volta a associar-se com um factor livre e procura um novo promotor, ao nvel do qual pode iniciar de novo o processo de transcrio. A transcrio inicia-se a cerca de 512 pb de distncia do promotor.
Promotores Como j foi dito, as sequncias promotoras ou simplesmente promotores, desempenham um papel fundamental na iniciao da sntese de RNA. a estas sequncias que a RNA polimerase se liga e tambm o factor , fazendo parte da RNA polimerase, que o responsvel pelo reconhecimento destes promotores. Um nico organismo pode apresentar diversos factores diferentes11. Os diversos factores codificados pelas bactrias permitem que a RNA polimerase reconhea diversas sequncias diferentes de promotores. Todas as sequncias na figura so reconhecidas pelo mesmo factor em E. coli. Ao analisar as sequncias possvel notar que no so completamente idnticas. No entanto, duas regies so extremamente conservadas entre os diversos promotores, sendo estas sequncias as identificadas por sigma. Ambas as sequncias se localizam a montante do local de incio de transcrio. Os promotores (em E. coli) so assim caracterizados por estas duas sequncias hexamricas de DNA.
10
Contrastando com a reaco da DNA helicase, esta reaco da RNA polimerase no necessita de ATP para efectuar a hidrlise das ligaes entre as bases. 11 E. coli codifica 7 por exemplo.
65

As sequncias 35 e 10 (tambm conhecida por pribnow box) devem o nome devido sua relativa proximidade do local onde se inicia a transcrio (designado +1). Ao comparar as regies 10 de todos os promotores reconhecidos por sigma possvel determinar que bases ocorrem mais frequentemente em cada local. Determina-se assim uma sequncia consensus TATAAT. No exemplo, cada promotor apresenta 3 a 5 bases que correspondem sequncia consensus. A segunda regio, designada 35, sendo a TTGACA. Mais uma vez, a maioria das sequncias no so exactamente idnticas sequncia de consensus. No obstante de E. coli apresentar sete factores diferentes, cada um destes reconhece uma sequncia consensus diferente, pelo que cada um destes factores ir direccionar a RNA polimerase para sequncias diferentes das indicadas. Para alm disso, cada um destes promotores estar associado a genes diferentes. Note-se que na figura apenas consta uma das cadeias. Por conveno, a cadeia mostrada a cadeia orientada 5 3 (pelo que no a cadeia utilizada como molde pela RNA polimerase!). tambm importante ver que os promotores so sequncias de DNA em cadeia dupla e que a RNA polimerase reconhece e liga-se a sequncias de DNA em cadeia dupla! No entanto, apenas uma cadeia servir como molde.
Por fim, concedido muito pouco espao de manobra (passe a expresso) s bases crticas que so reconhecidas e em E. coli, os promotores que sejam mais parecidos com as sequncias consensus ligam-se de forma mais eficaz com a RNA polimerase. Os promotores mais eficazes designam-se promotores fortes (estudos recaem em mutaes a nvel do promotor que alteram o nvel de expresso do gene). Nota: Um gene apresenta tipicamente apenas um promotor e dado que a sequncia do promotor (tanto em eucariotas como em procariotas) assimtrica, a polimerase s pode ligar-se com uma determinada orientao e no aleatoriamente. Regio terminadora (terminadores) To importante quanto a iniciao da traduo a sua terminao. Um terminador consiste numa sequncia de DNA, representada no final do transcrito e que leva a RNA polimerase a terminar a transcrio. A terminao requer que todas a pontes de hidrognio que ligam o hbrido de DNA-RNA sejam quebradas depois do que se volta a formar o dplex de DNA.
A identificao dos locais correspondentes s sequncias de terminao difcil12 e a melhor identificao dos locais de terminao dada por sistemas nos quais a RNA polimerase procede terminao in vitro. As sequncias de terminao em procariotas no mostram quaisquer similaridades para alm do ponto em que adicionado ltimo ribonucletido. Desta forma se infere que so as sequncias j transcritas pela RNA polimerase, as responsveis pela terminao. Os terminadores foram distinguidos em E. coli com base na necessidade ou no, por parte da RNA polimerase, de factores adicionais para a terminao (in vitro).
12
Numa clula viva sempre possvel que a extremidade 3 da molcula tenha sido gerada por clivagem do primary transcript e por isso no represente o local exacto em que a RNA polimerase terminou a transcrio.
66

Quando a RNA polimerase consegue executar a terminao in vitro na ausncia de qualquer outro factor, o local designa-se terminador intrnseco (ou no rho dependente).
Os terminadores intrnsecos apresentam duas particularidades: 1. Um hairpin na estrutura secundria 2. Uma sequncia de 6 resduos de U no final da estrutura.
Toda a estrutura tem o nome de stem loop, sendo uma estrutura secundria.
Ambas as particularidades so necessrias para ocorrer terminao (devido a uma pausa a nvel da transcrio?). O hairpin contm, de uma forma geral, uma regio rica em Gs e Cs junto base do stem. A distncia tpica entre o hairpin e as sequncias de Us so entre 7-9 bases.
A nvel do DNA, a sequncia de terminao apresenta um inverted repeat com uma sequncia central no repetitiva. Esta sequncia ao ser transcrita origina ento a estrutura secundria descrita.
67

Rho dependente (mutaes mostram que o factor se encontra envolvido na terminao in vitro).
Um terminador rho dependente apresenta uma sequncia rica em Cs e pobre em Gs a preceder o local de terminao. Este factor uma protena essencial em E. coli funcionando unicamente no passo da terminao da transcrio. Na figura ao lado est representado um modelo de funcionamento do factor rho.
Em procariotas, a traduo dos transcritos um processo simultneo com a transcrio. No sendo necessrio splicing, o RNA produzido imediatamente mRNA, podendo ser transcrito logo de seguida.
68

16 Aula: 04/11/2004 Sumrio: Factores (concluso). Regulao da expresso gnica ao nvel da transcrio em procariotas; Opero lac, regulao positiva e negativa. Factores em E. coli Como j foi dito, o genoma de E. coli codifica para diversos factores diferentes. Em caso de choque trmico (Heat shock), outros genes (sequncias) passam a ser transcritos, devido ao facto de outros factores serem transcritos, os quais reconhecem sequncias de promotores diferentes.
Em B. subtilis, a fosforilao do pro-e um sinal para o incio de esporulao. Do processo resulta um factor e activado. A diferente activao destes factores leva activao de diversos genes, os quais conferem tambm diferentes orientaes aos diferentes compartimentos da clula. A activao diferencial dos factores consiste j num mecanismo de regulao da transcrio (?).
Regulao da expresso gnica ao nvel da transcrio

O cromossoma de E. coli consiste numa molcula de DNA circular com cerca de 4.6 Mb. Esta molcula codifica numerosas protenas. No entanto apenas uma pequena parte se encontra activa. A expresso destas protenas regulada pela quantidade de nutrientes disponvel no ambiente.
69

De uma forma geral, os genes em procariotas encontram-se arranjados em operes, ou seja, encontram-se situados uns ao lado dos outros no cromossoma, sendo transcritos partindo do mesmo promotor e como uma nica molcula de mRNA. O opero lac codifica para diversas protenas necessrias ao transporte do dissacrido lactose para o interior da clula e a seu ulterior metabolismo. Este opero encontra-se sob controlo transcricional tanto negativo como positivo por um repressor (protena) e por outra protena, a CAP, respectivamente.
Controlo Negativo
Como j foi descrito, um promotor uma sequncia de DNA especfica que tem como funo, dirigir a RNA polimerase, etc. No seio do promotor que dirige a transcrio dos genes do opero, existe um elemento regulador designado operador. O operador assim, uma sequncia de DNA reconhecida por uma protena, o repressor (a montante do opero). O promotor e o operador esto arranjados de forma a que quando o repressor se encontra ligado ao operador, este bloqueia o acesso da RNA polimerase ao promotor, impedindo desta forma a expresso dos diversos genes do opero lac. Este tipo de controlo, em que existe um repressor (e para o caso, parte da situao OFF ON) denomina-se controlo negativo. Para ser possvel RNA polimerase ligar-se ao promotor para iniciar a sntese da cadeia de mRNA necessrio que o repressor perca a capacidade de se ligar ao DNA. Tal sucede caso na bactria exista um indutor. O repressor desta forma, induzvel (grfico da situao no Brock.). O composto indutor um glcido derivado da lactose, a alolactose (neste caso).
Existem tambm repressores repressveis, ligados a vias metablicas, especialmente anabolismo. Neste caso, o repressor s se torna activo quando a ele se liga um corepressor. protena sem o corepressor d-se o nome de apoprotena. Neste caso, o sistema estaria ON e ento passaria a OFF.
70
Apontamentos por TIAGO MADEIRA Controlo Positivo

Em certos casos, os promotores de certos genes so promotores fracos sendo fracamente reconhecidos pela RNA polimerase e/ou a RNA polimerase tem dificuldade em abrir a cadeia para iniciar a transcrio. Quando tal sucede, possvel, atravs de protenas que se ligam a um local prximo no DNA, entrando igualmente em contacto com a RNA polimerase, aumentar de forma dramtica a probabilidade de iniciao da transcrio naquele local.
Dado que este tipo de protenas permitem ligar genes, o controlo por elas efectuado designa-se controlo positivo, sendo as protenas designadas de activadores. Para o activador funcionar necessrio a presena de um indutor (que para o caso seria a maltose). Outro tipo de controlo positivo consiste num processo denominado represso catablica13.
Opero lac
O opero lac formado por diversos genes (dando origem a um s transcrito e portanto uma molcula de mRNA policistrnica) os quais codificam para diversas molculas: 1. LacZ: -galactosidase 2. LacY: Lac permease 3. LacA: transacetilase A enzima Lac permease permite a entrada da lactose para o interior da clula.
13
Para detalhes, ver Anexos.
71

No interior da clula, a lactose, um dissacrido, separa nos seus constituintes bsicos, a glucose e a galactose, por intermdio da -galactosidase. No entanto, esta enzima tem tambm a capacidade de sintetizar alolactose a partir de lactose.
Todos estes genes se encontram sujeitos mesma regulao, formando o opero.
Porm, existe um outro gene que no faz parte do opero, apresentando igualmente um promotor prprio, e que d origem protena responsvel pelo controlo do opero, o repressor, o qual se liga ao operador (O). Este gene tem o nome de LacI, e est situado a montante do opero lac. ainda importante notar que este gene apresenta uma expresso constitutiva, devido ao seu promotor que igualmente constitutivo. Foi a partir de organismos mutantes que foi possvel perceber como funcionava o opero, assim como a sua regulao. Sendo o repressor um produto do gene LacI, mutaes ao nvel deste gene e que resultem na sntese de um repressor no funcional (I-) originam uma sntese constitutiva das protenas do opero.
72

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6 Aula: 23/09/2004 7 Aula: 28/09/2004

8 Aula: 30/09/2004 9 Aula: 07/10/2004 10 Aula: 12/10/2004

Pg. 31 Pg. 34 Pg. 38

14 Aula: 28/10/2004 15 Aula: 02/11/2004

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22 Aula: 23/11/2004 23 Aula: 25/11/2004 24 Aula: 30/11/2004

Pg. 105 Pg. 110 Pg. 117

26 Aula: 07/12/2004 27 Aula: 07/12/2004

Pg. 132 Pg. 141

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Exames: 1 chamada: 11 de Janeiro 2 chamada: 25 de Janeiro

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Base Purinas Pirimidinas Adenina e Guanina Citosina Uracilo Timina

Nuclesido Adenosina e Guanosina Citidina Uridina Timidina

Nuclesido: nome dado ao conjunto formado pela base azotada e o glcido.

Nota: difere da ribose pois falta-lhe um grupo O no C 2.

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Desnaturao da molcula de DNA

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Dogma central da Biologia

DNA Transcrio mRNA

mRNA Traduo pptido

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Estruturas Secundrias e Tercirias

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Estrutura das protenas:

As protenas apresentam, de um modo geral, 4 tipos de estruturas:

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NOTA: s sequncias codificantes num intro d-se o nome de snRNAs

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