Preparacin de colorantes

1. Acido-Alcohol: (decolorante para tincin Ziehl-Neelsen)

o cido clorhdrico concentrado ..........................................................3 ml o Etanol 95% ....................................................................................97 ml 2. Azul de metileno: Colorante de contraste para tincin de flagelos. o Azul de metileno................................................................................1 g o Agua destilada...............................................................................100 ml 3. Azul de metileno de Loeffler: Tinciones simples. o Solucin de hidrxido potsico al 1%.................................................1 ml o Azul de metileno, sol. saturada en etanol al 95%...............................30 ml o Agua destilada...............................................................................100 ml 4. Colorante para esporas: o Solucin acuosa saturada de verde malaquita 5. Colorante para flagelos de Leifson: o Solucin A Fucsina bsica .........................................................................1,2 g Etanol 95%.............................................................................100 ml o Solucin B cido tnico................................................................................3 g Agua destilada.........................................................................100 ml o Solucin C Cloruro sdico..........................................................................1,5 g Agua destilada.........................................................................100 ml Para preparar la solucin de uso, se mezclan cantidades iguales de las soluciones A, B y C y se guarda en frasco cerrado hermticamente en la nevera donde es estable durante varias semanas. 6. Cristal violeta: Para tincin Gram y tincin simple. o Cristal violeta (violeta de genciana)....................................................0,5 g o Agua destilada.................................................................................100 ml 7. Eosina: Para observacin de clulas sanguneas. o Eosina...............................................................................................0,3 g o cido actico glacial......................................................................0,025 ml o Agua destilada...................................................................................100 ml 8. Fucsina diluida: Para tincin Gram y tincin simple. o Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen......................................................10 ml o Agua destilada.................................................................................100 ml 9. Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen: Para tincin cido-alcohol resistente. o Fucsina bsica......................................................................................1 g o Etanol 95%........................................................................................10 ml o Fenol 5% en solucin acuosa............................................................100 ml 10. Hematoxilina: Para observacin de clulas sanguneas. o Hematoxilina.........................................................................................2 g o Agua destilada......................................................................................1 l 11. Lactofenol: Para preparaciones microscpicas en fresco de mohos. o cido lctico.....................................................................................100 ml o Fenol................................................................................................100 g

12.

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16.

17.

o Glicerol.............................................................................................200 ml o Agua.................................................................................................100 ml Lactofenol al Azul Algodn: Para preparaciones en fresco y tinciones de mohos. o Solucin de azul algodn Sol. saturada de azul algodn (azul anilina soluble)......................10 ml Glicerol.....................................................................................10 ml Agua.........................................................................................80 ml Mezclar esta solucin con lactofenol a partes iguales Lugol: Solucin de yodo para tincin Gram. o Yodo...................................................................................................1 g o Yoduro potsico..................................................................................2 g o Agua destilada.................................................................................300 ml Orcena A: Tincin de cromosomas. o Orcena................................................................................................2 g o cido actico.....................................................................................45,8 ml o cido clorhdrico 1 mol/l......................................................................8,3 ml o Agua..................................................................................................45,8 ml Orcena B: Tincin de cromosomas. o Orcena................................................................................................2 g o cido actico.....................................................................................55 ml o Agua..................................................................................................55 ml Safranina: Colorante de contraste para tincin Gram (preferible a la fucsina) y esporas. o Safranina.........................................................................................0,25 g o Agua destilada..................................................................................100 m Sudn III: Tincin especfica de grasas. o Alcohol etlico...................................................................................100 ml o Sudn III...................................................................................hasta saturacin

18. Verde de metilo actico: Igual composicin que la eosina (num. 7)

Prueba de la Catalasa

Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepcin es Streptococcus. Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes gneros:

Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos tcnicas:

1. Mtodo del portaobjetos (recomendado):

Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del mtodo (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

2. Mtodo del tubo de ensayo:

Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en slant densamente inoculado. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo).

Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaucin de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dar un falso resultado positivo.

Prueba del Citrato

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Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono y compuestos amoniacales como nica fuente de nitrgeno en su metabolismo, provocando una alcalinizacin del medio. Entre las enterobacterias estas caractersticas se dan en los siguientes gneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella

paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.

Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrgeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Slo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrn multiplicarse en este medio y liberarn iones amonio lo que, junto con la eliminacin del citrato (cido), generar una fuerte basificacin del medio que ser aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.

Fenilalanina Desaminasa

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Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminocido fenilalanina en cido fenilpirvico por su actividad enzimtica de fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las especies del gnero Proteus y del grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos gneros de otras enterobacterias Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del slant con abundante inculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente se aade 0,2ml de una solucin de cloruro frrico al 10% de manera que inunde todo el crecimiento. La presencia de cido fenilpirvico (prueba positiva) se manifiesta por la aparicin de un color caracterstico verde oscuro o verdeazulado. Foto de los resultados de esta prueba

Prueba del Indol

Mediante esta prueba se detecta la liberacin de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberacin se debe a la degradacin del aminocido triptfano mediante el enzima triptofanasa. Para la realizacin de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptfano). Para la posterior deteccin del indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede preparar con los siguientes ingredientes:

Alcohol amlico o isoamlico (puede sustituirse por alc.butlico)........150ml p-dimetilamino-benzaldehdo..........................................................10g HCl (concentrado).........................................................................50ml

Se disuelve primero el aldehdo en el alcohol y despus se agrega lentamente a esta mezcla el cido. Para el control de calidad del reactivo se pueden utilizar cultivos conocidos. Las ms convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas las especies de Klebsiella (indol-). Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al aadir al medio 5 gotas del reactivo de Kovacs, se producir un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba ser considerada positiva. Si esto ocurre despus de 24 horas, la prueba se considera completa, pero si es negativo deber incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba. Por ello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo incubado sino en una porcin de unos 2ml que se retira de l aspticamente.

Foto de los resultados de esta prueba

Prueba de la Lactosa

Esta prueba se usa para diferenciar entre las enterobacterias en general y el grupo de las coliformes. Se trata por tanto de una prueba de gran importancia debido a que los coliformes se utilizan como organismos indicadores de contaminacin fecal en anlisis, sobre todo, de aguas. En bacteriologa se define el grupo de organismos coliformes como los "bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no formadores de esporas y que fermentan la lactosa con formacin de gas a 35C en 48 horas". No se trata de un grupo taxonmico e incluye una gran variedad de bacterias, la mayora de ellas de origen intestinal. Una manera sencilla de realizar la prueba de la fermentacin de la lactosa en enterobacterias es sembrar el microorganismo en agar McConkey, ya que este medio, adems de selectivo frente a bacterias no entricas, es diferencial ya que contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro). En agar McConkey las bacterias Gram positivas ven inhibido su crecimiento debido a la presencia de sales biliares y cristal violeta y slo crecern las enterobacterias, pero entre ellas las que fermenten la lactosa (coliformes) liberarn productos cidos que producirn un cambio de pH que se detectar gracias al rojo neutro. Las colonias lactosa (+) aparecern de color rojo o violeta contrastando con la coloracin amarillenta de las colonias lactosa (-).

Foto de los resultados de esta prueba

Manitol-Movilidad-Nitratos

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Se incluyen en este apartado 3 pruebas bioqumicas debido a que se pueden realizar cultivando el microorganismo en un nico medio, el Manitol Movilidad, que se prepara en tubo con agar recto y se siembra en picadura, incubndose a 37C durante 24 horas. Tambin existe la posibilidad de hacer las pruebas en otros medios y por separado. Prueba del Manitol Sirve para detectar si los grmenes son capaces de fermentar el manitol liberando productos cidos que sern detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiar a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae. Entre las bacterias de importancia clnica, la prueba del manitol sirve para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-). Prueba de la Movilidad Sirve para determinar si un organismo es mvil o inmvil. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos aunque existen algunas formas de cocos mviles. El medio manitol movilidad permite la realizacin de esta prueba gracias a ser semislido ya que presenta solamente 3,5 g/l de agar. En estas condiciones, las bacterias mviles producirn un enturbiamiento homogneo del medio debido a la distribucin aleatoria de los microorganismos. Por el contrario, las bacterias inmviles permanecern en la misma lnea de la picadura en que se sembraron. Entre las enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el gnero Klebsiella (-) de las restantes que suelen ser movilidad (+). Dentro del gnero Bacillus, nos permite diferenciar B.anthracis (-) de otras especies generalmente (+). Prueba de la reduccin de nitratos Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos. Para ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y para revelar la presencia de nitritos despus de su incubacin se aaden los reactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambio de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba completa con resultado positivo. Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo de cinc pursimo, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se observa el cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se realiza la interpretacin final.

Las enterobacterias son generalmente nitratos (+). Esta prueba se utiliza principalmente para diferenciar entre s determinadas bacterias de los gneros Haemophylus y Neisseria.

Foto de los resultados de manitol-movilidad

Foto de los resultados de nitratos

Prueba de la Oxidasa

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Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidacin del citocromo que es reducido por el oxgeno molecular que produce agua o perxido de hidrgeno segn la especie bacteriana. El oxgeno acta por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa slo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algn microaerfilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asmismo, la presencia de oxidasa va ligada a la produccin de catalasa, ya que sta degrada el perxido de hidrgeno (ver prueba de la catalasa) que se produce como consecuencia de la reduccin del oxgeno y cuya acumulacin es txica.

La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para Identificar todas las especies de Neisseria (+) Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.

El reactivo de la oxidasa ms recomendado es la solucin acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos txico y mucho ms sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es ms caro. Este reactivo tie las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a prpura-negruzco intenso. Realizacin de la prueba:

1. Mtodo en placa directa

Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla. Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reaccin se produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.

2. Mtodo indirecto sobre papel

Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri. Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel. Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado. La reaccin de color positiva se produce a los 5-10 segundos.

Rojo de Metilo/Voges-Proskauer

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Estas dos pruebas forman parte del IMVIC de las colimetras y permiten la diferenciacin dentro de las enterobacterias del grupo coli y aergenes. Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarn la glucosa en dos fases: primero la metabolizarn aerobiamente (respiracin oxibintica) consumiendo rpidamente el oxgeno del medio, para, en segundo lugar, continuar metabolizndola por va anaerobia (fermentacin). sta puede ser de dos tipos:

Fermentacin cido mixta: La realizan las bacterias del grupo de E.coli y los productos finales son cidos orgnicos (cidos frmico, actico, lctico y succnico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio. Puede detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4. Fermentacin butiln gliclica: La realizan las bacterias del grupo Klebsiella-Enterobacter (antiguo aergenes). Los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, producindose acetona como intermediario que podr ser detectada aadiendo al medio KOH (reactivo A de Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B de VogesProskauer) que reaccionarn con este compuesto produciendo un color rojo caracterstico.

Para la realizacin de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo en caldo RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 30C durante un periodo de 3 das como mnimo y 5 como mximo. Al revelar las pruebas, se separa el cultivo en dos porciones de unos 2,5ml que servirn para cada uno de los ensayos. Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le aade unas gotas (4-5) de solucin indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para homogeneizar y se observa la coloracin. Se considera positiva si vira al rojo y negativa si permanece amarillo. Foto de los resultados de esta prueba Voges-Proskauer: A la otra porcin de cultivo se le aade: o 0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (alfa-naftol 5% en etlico absoluto). El medio adquiere un aspecto lechoso. o 0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%). Desaparece el aspecto lechoso y se agita fuertemente. Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color rosadoviolceo, ms o menos intenso, que se inicia en la parte superior del tubo. Si la prueba es negativa no aparece coloracin alguna.

Prueba de la Ureasa

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Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos molculas de amoniaco por accin del enzima ureasa. Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este gnero de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado. Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este medio se complementa despus del autoclavado con 50ml/l de urea. sta ser degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta degradacin produce amoniaco que har variar el color del indicador de amarillo a rojo, ponindose as de manifiesto la actividad ureasa. Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubacin ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco despus de la inoculacin y sus resultados deben ser ledos en las primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubacin.

Foto de los resultados de esta prueba

PRUEBA Catalasa Citrato Fenilalanina desaminasa Indol Lactosa Manitol Movilidad Nitratos Oxidasa Rojo de Metilo Ureasa Voges-Proskauer

RESULTADO POSITIVO Aparicin de burbujas de O2 Medio de color azul Aparicin de color verde oscuro Aparicin de un anillo rojo Colonias de color violeta Aparicin de color amarillo Difusin a partir de la lnea del inculo Cambio de color (rojo oscuro) Aparicin de color azul Aparicin de color rojo Aparicin de color rojo Aparicin de color rojo

/03/2009 Prova de Kligler Iron Agar ou de Triple Sugar Iron Agar TSI

Esta prova , geralmente, usada para diferenciar os diferentes gneros das Enterobacteriaceae e para distinguir esta famlia de outros bacilos Gram negativo de origem intestinal. Esta diferenciao feita atendendo s diferenas na fermentao dos hidratos de carbono presentes no meio e produo de sulfureto de hidrognio (H2S). Tanto o meio agar TSI (triple sugar iron) como o agar Kligler Iron contm glicose em pequena concentrao (0,1%), lactose em concentrao superior (1%), o indicador de pH, vermelho de fenol, para detectar a produo de cidos resultantes da fermentao dos hidratos de carbono, tiossulfato de sdio, substrato para a produo de H2S, e sulfato de ferro para a deteco desse produto final. A diferena entre estes dois meios diferenciais que o TSI possui mais um acar, a sacarose, em concentrao igual da lactose (1%). Ambos os meios so inoculados por picada, no cilindro e por estria, na rampa. essencial que as culturas sejam observadas aps 18 a 24 h de incubao para evitar que os hidratos de carbono sejam completamente utilizados e que ocorra degradao das peptonas, formando produtos finais alcalinos. na rampa que se faz a leitura da lactose e da sacarose, no fundo do cilindro a da glicose e no meio do cilindro a de H2S. Aps incubao podem ser determinadas as actividades fermentativas, a produo de gs e a produo de H2S, podendo ocorrer vrios resultados: Cilindro cido (amarelo) e rampa alcalina (vermelha): S a glicose foi fermentada. Os microrganismos degradam, preferencialmente, a glicose em primeiro lugar, mas como este substrato est presente em concentrao mnima, a quantidade de cido produzida limitada e rapidamente oxidada na superfcie da rampa. Por outro lado, as peptonas do meio so tambm usadas na produo de substncias alcalinas. No cilindro, a reao cida mantida devido tenso reduzida do oxignio e ao crescimento mais lento dos microrganismos. O indicador, vermelho de fenol, muda para amarelo devido persistncia da formao de cido no cilindro. Cilindro cido (amarelo) e rampa cida (amarela): Ocorreu a fermentao da lactose e/ou da sacarose, para alm da glicose. Como as duas primeiras substncias esto presentes em altas concentraes so substratos para a atividade fermentativa contnua com manuteno da reao cida (cor amarela) em todo o meio (rampa e cilindro). Produo de gs: Nota-se pela ocorrncia de fraturas no meio de cultura. Produo de H2S: Ocorre enegrecimento, principalmente na zona intermdia do cilindro. Isto deve-se ao fato do microrganismo em estudo ser capaz de produzir sulfureto de hidrognio (H2S), que se conjuga com um composto de ferro existente no meio, dando origem a sulfureto de ferro que, sendo

insolvel, precipita. Cilindro alcalino (vermelho) e rampa alcalina (vermelha) ou inalterada (tijolo): No ocorreu fermentao dos hidratos de carbono presentes no meio, nem produo de gs ou de H2S. As peptonas do meio podem ser catabolizadas sob condies anaerbias e/ou aerbias, resultando num pH alcalino devido produo de amnia. Se s ocorrer degradao aerbia das peptonas, a reao alcalina s evidenciada na superfcie da rampa. Se houver degradao aerbia e anaerbia das peptonas, a reao alcalina visvel em todo o meio. Postado por Horikini s 1/03/2009 05:46:00 PM Marcadores: Bioquimica, Enterobacteriaceae, H2S, Kligler Iron Agar, Lactose, Prova, Teste, Tripli Sugar Iron, Triplice de acuar e ferro, TSA

/03/2009 Prova do sulfureto de hidrognio (H2S)

Permite determinar a capacidade dos microrganismos para produzirem sulfureto de hidrognio (H2S) a partir de substratos como aminocidos sulfurados ou compostos sulfurados inorgnicos. Muitas protenas so ricas em aminocidos sulfurados, como a cistena. Quando estas protenas esto presentes no meio de cultura podem ser degradadas pelas enzimas microbianas a aminocidos que so utilizados como nutrientes. O aminocido cistena, na presena da enzima cistena desulfurase, perde o seu tomo de enxofre que por sua vez reduzido pela adio de hidrognio da gua para formar H2S. O H2S ento produzido pela hidrogenao (reduo) do enxofre orgnico presente no aminocido cistena. Por outro lado, o H2S pode ser produzido pela reduo de compostos sulfurados inorgnicos, como os tiossulfatos (S2O32-), os sulfatos (SO42-) e os sulfitos (SO32-). Quando o meio contm tiossulfato de sdio alguns microrganismos tm capacidade para o reduzir a sulfitos usando a enzima tiossulfato redutase, com libertao de H2S. Os tomos

de enxofre atuam como aceitadores de hidrognio durante a oxidao dos compostos inorgnicos. O meio de cultura agar SIM contm peptonas (a cistena um dos componentes) e tiossulfato de sdio como substratos sulfurados, e sulfato ferroso amoniacal (Fe (NH4)2 SO4) que atua como indicador da presena de H2S. Como o H2S incolor, e por conseguinte no visvel, o sulfato ferroso amoniacal serve como indicador, pois o ferro combina-se com o H2S formando sulfureto de ferro que um precipitado negro insolvel. A presena deste composto ocorre ao longo da linha de inoculao e indica que houve produo de sulfureto de hidrognio (reao positiva). A ausncia do precipitado negro evidencia uma reao negativa. O meio de SIM um meio semi-slido que tambm pode ser usado para detectar a presena ou ausncia de mobilidade nas bactrias e a produo de indol. Postado por Horikini s 1/03/2009 06:42:00 PM Marcadores: Bacteriana, bacterias, Bioquimismo, H2S, Hidrognio, Prova, Sulfureto, Teste

1/03/2009 Prova da Coagulase

As coagulases so enzimas com capacidade para coagular o plasma sanguneo atravs de um mecanismo similar ao da coagulao normal. A atividade da coagulase utilizada para distinguir espcies patogenicas de

Staphylococcus de espcies no patogenicas, sendo um bom indicador da patogenicidade do S.aureus.

A prova da coagulase em tubo consiste em juntar num tubo de ensaio contendo plasma (obtido de sangue a que se juntou um anticoagulante, por exemplo oxalato, citrato, heparina) uma suspenso de microrganismos (caldo de cultura) ou colnias provenientes de um meio slido e incubar a 37 C. A formao de cogulos s 2 h, s 6 h ou s 24 h de incubao interpretada como uma prova positiva. A ausncia de coagulao aps 24 horas de incubao uma prova negativa.

Esta prova pode ser realizada de um modo mais rpido (prova em lmina) colocando-se duas pores de bactrias da espcie em estudo nos extremos de uma lmina, fazendo-se de seguida uma pequena suspenso, sendo depois adicionado a uma delas uma gota de gua destilada (controle) e a outra uma gota de plasma. Homogeneiza-se bem e observa-se, no fim de uns minutos. Se o aspecto idntico a prova negativa ou se ocorreu formao de pequenos agregados resultantes do fato das bactrias ficarem aprisionadas na rede de fibrina ento formada a prova positiva. Procedimento Em um tubo contendo 0,3 mL de plasma de coelho adicione o mesmo volume da Incube a 37 oC por cerca de 2 horas.

cultura lquida do microrganismo. Interpretao O teste de coagulase tem a finalidade de demonstrar se o microrganismo produz a

enzima capaz de coagular o plasma. Postado por Horikini s 1/03/2009 01:02:00 PM Marcadores: Coagulase, Prova, Staphylococcus, Teste

1/03/2009 Prova da utilizao do citrato

Permite diferenciar microrganismos atendendo sua capacidade para usar o citrato como nica fonte de carbono.A prova feita no meio de citrato ou meio de Simmons. Na ausncia de glicose ou lactose fermentveis, alguns microrganismos so capazes de usar o citrato como nica fonte de carbono para produzir energia. Esta capacidade depende da presena de citrato permease que facilita o transporte do citrato para o microrganismo. Uma vez dentro da clula o citrato degradado pela enzima citrase, produzindo cido oxalactico e acetato. Estes produtos so depois convertidos enzimaticamente em cido pirvico e CO2. O meio de Simmons contm citrato de sdio como nica fonte de carbono, NH4+ como fonte de azoto e o indicador de pH, azul de bromotimol. Esta prova feita em tubos em rampa, uma vez que o O2 necessrio para a utilizao do citrato. Quando o microrganismo remove o citrato do meio e o oxida, ocorre libertao de CO2. Durante esta reao o meio torna-se alcalino, pois o CO2 gerado combina-se com sdio (fornecido pelo citrato de sdio) e gua para formar carbonato de sdio, que um produto alcalino. A presena de carbonato de sdio faz aumentar o pH e virar o indicador de pH do meio de verde para azul forte. Aps incubao, as culturas citrato positivo so identificadas pela presena de crescimento, na superfcie da rampa, acompanhado de colorao azul no meio de cultura. Nas culturas citrato negativas a cor do meio mantm-se verde e no apresentam crescimento no meio de cultura. Postado por Horikini s 1/03/2009 06:34:00 PM Marcadores: bacterias, Bioquimismo, Citrato, Prova, Teste

1/03/2009 Prova de Voges-Proskauer - VP

O objetivo determinar a capacidade dos microrganismos produzirem produtos finais no cidos ou neutros, como o acetilmetilcarbinol, a partir dos cidos orgnicos que resultam da metabolizao da glicose. Prova feita no meio MR - VP (Methyl Red, Voges - Proskauer). A adio do reagente de Barritts (soluo 40% KOH e soluo de naftol em etanol absoluto) permite detectar a presena de acetilmetilcarbinol (acetona) que percursor da sntese de 2,3 butanediol, pois ocorre a formao de um complexo rosa/vermelho que d essa cor ao meio de cultura. O desenvolvimento de uma cor rosa/vermelha na cultura, 15 minutos aps a adio do reagente de Barritts representa uma prova positiva. A ausncia dessa cor uma prova negativa. Este tipo de fermentao da glicose caracterstico do E.aerogenes. Postado por Horikini s 1/03/2009 06:26:00 PM Marcadores: Prova, Teste, Voges - Proskauer

Prova Vermelho de Metila - MR

Tem como objectivo determinar a capacidade dos microrganismos para oxidar a glicose com produo e manuteno de concentraes altas de produtos finais cidos. Fazer a prova no meio MR - VP (Methyl Red, Voges-Proskauer). A glicose o mais importante substrato oxidado por todos os microrganismos intestinais para a produo de energia. No entanto, os produtos finais deste processo variam, dependendo do equipamento enzimtico presente na bactria. Apesar de todos os microrganismos intestinais fermentarem a glicose com produo inicial de cidos orgnicos, h uns (ex. Escherichia coli) que mantm um pH de 4 at ao fim da incubao, enquanto outros (ex. Enterobacter aerogenes) durante o ltimo perodo de incubao convertem esses cidos a produtos finais no cidos como o etanol e a acetona, resultando assim num pH mais elevado (pH 6) no final da incubao. Nesta prova o indicador de pH, vermelho de metila, detecta a presena de grandes concentraes de produtos finais cidos, pois tem um ponto de viragem baixo. A pH 4, o vermelho de metila vira para vermelho, o que indica uma reao positiva. Quando o pH 6,

apesar de ainda ser cido, como h menos ions de hidrognio, o indicador muda para amarelo e uma prova negativa. Postado por Horikini s 1/03/2009 06:17:00 PM Marcadores: Bacteriana, Bioquimismo, Enterobacteriaceae, Methyl Red, MR-VP, Teste, Vermelho de Metila, Voges - Proskauer

1/03/2009 Prova do Indol

O objetivo determinar a capacidade do microrganismo degradar o aminocido triptofano (presente em quase todas as protenas) at indol. O triptofano um aminocido essencial que pode sofrer oxidao pelas atividades enzimticas de algumas bactrias. A converso do triptofano em produtos metablicos mediada pela enzima triptofanase. Como a capacidade de hidrolisar o triptofano com produo de indol (no utilizado e acumula-se no meio) no uma caracterstica de todos os microrganismos serve como marcador bioqumico. H microrganismos que no metabolizam o triptofano ou ento fazem metabolizao completa desse aminocido sem produzir indol. Utiliza-se um meio de cultura que contenha o aminocido triptofano por ex.: gua peptonada. Aps o crescimento pesquisa-se a presena de indol adicionando o reagente de Kovacs (cor amarelo) ao longo das paredes do tubo, de modo que no se misture com o meio de cultura. Este reagente reage com o indol produzindo um composto rosado. As culturas que produzem um anel avermelhado na superfcie do meio aps adio do reagente so indol positivo. A persistncia da colorao amarela do reagente demonstra que o substrato triptofano no foi hidrolisado a indol e indica uma reao negativa.

Postado por Horikini s 1/03/2009 06:08:00 PM Marcadores: Bacteriana, Bioquimica, Bioquimismo, Indol, Prova

1/03/2009 Hidrlise de Gelatinase

O objetivo desta prova determinar a capacidade do microrganismo excretar uma enzima hidroltica extracelular capaz de degradar a gelatina (gelatinase). A gelatina uma protena produzida pela hidrlise do colagnio que abaixo dos 25 C mantm as suas propriedades de gel e slida, enquanto acima dos 25 C lquida. Determinados microrganismos tm capacidade para produzir a gelatinase, que atua hidrolisando a gelatina em aminocidos. Se a degradao ocorre no se consegue restaurar as caractersticas de gel da gelatina, mesmo a baixas temperaturas (fica lquido). A hidrlise da gelatina uma caracterstica importante na diferenciao dos microrganismos e pode tambm ser usada para determinar a sua patogenicidade. A liquefaco da gelatina pode ser determinada inoculando-se por picada um meio de cultura nutritivo, em tubo, suplementado com 12% de gelatina. Aps incubao a 37 C durante 24 a 48 h, as culturas so colocadas no frigorfico a 4 C durante 30 minutos ou em banho de gelo durante 3 a 5 minutos. Se a gelatina foi hidrolisada pela gelatinase, o meio mantm-se lquido aps refrigerao (reao positiva). Se o microrganismo no possui gelatinase, o meio resolidifica durante o perodo em que est no frigorfico (reao negativa).

Foto: (A) negativo, (B) e (C) Positivo. Postado por Horikini s 1/03/2009 05:56:00 PM Marcadores: bacterias, Bioquimica, Bioquimismo, Gelatina, Gelatinase, Hidrlise, Prova

Observacin microscpica de hongos

OBJETIVOS 1. Realizar preparaciones en fresco y en cinta adhesiva de distintas especies de mohos.

2. Observar la morfologa de los hongos y distinguir entre hifas septadas y no septadas y entre distintos tipos de esporas y las estructuras que las originan MATERIAL Microscopio Portaobjetos y cubreobjetos (22x22 mm) muy limpios y desengrasados con alcohol Aguja enmangada o lanceta Trozo enmohecido de fruta o pan o un cultivo de hongos Solucin de lactofenol al azul algodn Cinta adhesiva transparente

PREPARACIN EN FRESCO DE MOHOS

TCNICA

1.

Colocar sobre un portaobjetos una gota de solucin de lactofenol no demasiado grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparacin quede demasiado gruesa. Realizar la misma operacin en otro portaobjetos que se usar para lavar la muestra. 2. Tomar el material a observar en una mnima cantidad con agujas finas o lancetas procurando arrancarlo desde la base y disponerlo con cuidado sobre la gota de uno de los portaobjetos. Con esta especie de lavado se consigue desprender el exceso de conidios que casi siempre llenan estas preparaciones y que impiden ver lo que realmente interesa, los conidiforos. 3. Transportar el material con la lanceta a la gota del segundo portaobjetos que ser ya el definitivo. Si se trata de hongos con picnidios (estructuras globosas tapizadas en su interior por los conidiforos), se aplastarn stos ligeramente sobre la gota o se seccionarn con un bistur. 4. Con agujas muy finas se distribuye el material en la gota de manera que no quede amontonado.

5. Colocar el portaobjetos poco a poco y empezando por un lado para evitar que se formen burbujas entre los dos vidrios. PREPARACIN EN CINTA ADHESIVA

TCNICA 1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solucin de lactofenol no demasiado grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparacin quede demasiado gruesa. Cortar un trozo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 2cm. Tocar con el lado adhesivo de la cinta la superficie de la fruta o el pan enmohecidos o el borde de una colonia de hongo de un cultivo. En la zona central de una colonia puede haber una excesiva concentracin de esporas. Pegar la cinta adhesiva sobre la gota del portaobjetos. Eliminar el colorante sobrante con un papel de filtro.

2. 3.

4. 5.

RESULTADOS Moho del tomate: x600 x1500 Aspergillus: x150 x600 (foto a / foto b)

Penicillum: x600 x1500

Aspergillus

Penicillum:

Tincin de esporas Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Asa de siembra Cubeta de tincin Pinzas Frasco lavador Mechero de alcohol Papel de filtro Verde Malaquita Safranina

Cultivo bacteriano REALIZACIN

1. Preparar los frotis bacterianos indicados. 2. Teir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima de la llama del mechero para que el colorante humee, pero sin que hierva, durante 5 min. Aadir ms colorante si la muestra se seca. 3. Lavar con agua el resto de colorante. 4. Teir con safranina 1 min. 5. Lavar con agua el resto de colorante. 6. Secar la preparacin. 7. Observar la preparacin al microscopio. Foto de los resultados

Tincin cido-alcohol resistente

Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Asa de siembra Cubeta de tincin Cultivo bacteriano Pinzas

Frasco lavador Mechero de alcohol Papel de filtro azul de metileno fucsina-fenol mezcla de cido y alcohol

REALIZACIN 1. Prepara un frotis bacteriano. 2. Cubrir la preparacin con carbofucsina. 3. Calentar la preparacin en un mechero Bunsen durante 5 min. No debe hervir. Si se evapora, se aade ms carbofuxina para que no se seque en ningn momento. 4. Lavar con agua el resto de colorante. 5. Decolorar con la mezcla cido-alcohol. 6. Lavar con agua para que no prosiga la decoloracin. 7. Teir con azul de metileno 1 min. 8. Lavar con agua el resto de colorante. 9. Secar la preparacin. 10. Examinar al microscopio.

Gemacin de levaduras

MATERIAL TCNICA 1. Disolver con ayuda de una aguja enmangada un poco de levadura sobre un porta que contenga 2 o 3 gotas de agua ligeramente azucarada. 2. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio. 3. Repetir los pasos anteriores mezclando sobre el portaobjetos la suspensin acuosa de la levadura con una gota de lactofenol-safranina. Con este procedimiento se consigue una doble finalidad: o Ver mejor las clulas de las levaduras, teidas por la safranina. o Retrasar un poco el desprendimiento de las clulas hijas gracias a la accin desfavorable del fenol para la vida normal de las levaduras. RESULTADOS Las siguientes fotos han sido obtenidas a partir de preparaciones teidas con azul de metileno y no con lactofenol-safranina. Levadura x600 Levadura x1500 Gemacin de levaduras Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Levadura Agua azucarada Aguja enmangada Lactofenol-safranina

Tincin Gram

Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Asa de siembra Cubeta de tincin Cultivo bacteriano Pinzas

Frasco lavador Mechero de alcohol Papel de filtro Cristal violeta Lugol Alcohol-acetona Safranina

REALIZACIN 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Preparar los frotis bacterianos. Teir con cristal violeta 1min. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. Cubrir con Lugol 1min. Lavar con agua el exceso de Lugol. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparacin deje de perder color (30seg) Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente. Teir con safranina 1min. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste. Secar la preparacin. Examinar al microscopio fijndose sobre todo en el color de cada preparacin.

Los tiempos de exposicin a los colorantes son orientativos. Cada vez que se prepara la batera de colorantes para realizar la tincin Gram presentan algunas diferencias respecto a los preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los tiempos. En un laboratorio de Microbiologa, cada vez que se preparan los colorantes, se suelen hacer pruebas con cultivos patrn de los dos tipos (Gram+ y Gram-) para ajustar as los tiempos y tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones que se hagan mientras duren esos colorantes son fiables. Otra posibilidad es adquirir el equipo completo de colorantes ya preparados, pero es mucho ms caro. FOTOS DE LOS RESULTADOS foto de tincin mixta foto de Bacillus foto de Enterobacter