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NDICE

INTRODUCCIN DETERMINACIN DE PROTENAS POR ANLISIS ELEMENTAL MINERALIZACIN DETERMINACIN DE NITROGENO EN FORMA DE NH4+ o NH3 OTROS MTODOS DETERMINACIN DE PROTENAS POR MTODOS QUMICOS MTODE DE BIURET MTODE DE LOWRY MTODO DE FIJACIN DE COLORANTES DETERMINACIN DE PROTENAS POR MTODOS INSTRUMENTALES DETERMINACIN DE SUSTNCIAS NITROGENADAS NO PROTECAS

INTRODUCCIN De todos los compuestos nitrogenados en los alimentos, la parte ms importante desde el punto de vista nutricional protenas El trmino prtidos incluye: Protenas Pptidos Aminocidos Importancia Nutricional (aminocidos esenciales) Propiedades organolpticas y de textura en productos agroalimentarios y de origen animal Control de calidad: alergas a ciertas protenas (gluten) Punto de vista de anlisis de alimentos evaluacin del contenido total de protenas = principal inters La mayor parte de los procedimientos de determinacin de protena total se basan en la determinacin del nitrgeno + procedimientos de clculo empricos aproximados.

INTRODUCCIN CONTENIDO EN PROTENAS EN ALIMENTOS SELECCIONADOS.

ORIGEN ANIMAL TERNERA SECA TERNERA ASADA HUEVOS LECHE DESCREMADA LECHE ENTERA ORIGEN VEGETAL SOJA GUISANTES FRUTOS SECOS TRIGO, HARINA PATATA ARROZ MAZ

PROTENAS 81-90 72 35-70 34-38 22-25 PROTENAS 33-42 22-28 15-28 10-14 10-13 5-9 0-9

Apolares

Quirales Esenciales Val Leu Ile Thr Phe Met Trp Lys

Polares

cidos

Bsicos

Funciones: estructural, transporte, enzimas,

DETERMINACIN DE PROTENAS POR ANLISIS ELEMENTAL (N) Los mtodos se basan en medidas de la cantidad de nitrgeno liberado por las protenas: El mtodo Kjeldahl Reactivo de Nessler Mtodo Dumas Las protenas contienen una cantidad de nitrgeno que se puede relacionar con la cantidad de protena por unos factores de conversin: 5.7 para ciertas protenas vegetales 6.25 para el resto Por lo tanto, en las protenas, por trmino medio, debe haber un 16% de nitrgeno (100/16 = 6.25) La AOAC recomienda el uso del factor 6.25 para todas las muestras excepto harina y derivados

Alanina, 15.7%N Glicina, 18.6%N

16%

Triptofano, 13.7%N Histidina, 26.7%N

DETERMINACIN DE PROTENAS POR ANLISIS ELEMENTAL (N) El contenido de nitrgeno se determina despus de mineralizacin o pirlisis de la muestra El mtodo de mineralizacin fue introducido por Kjeldahl (1883) y es el ms generalizado y utilizado en mtodos de referencia y oficiales. Problema: presencia en las muestras de nitrgeno no proteico

Normalmente, se convierte el amonio formado en amonaco a pH bsico, y se destila recogiendolo sobre un exceso medido de HCl. El HCl sobrante se valora por retroceso con NaOH utilizando NM para no valorar el NH4+ generado previamente en la neutralizaci del NH3 destilado (anlisis realizado en el laboratorio de prcticas).

DETERMINACIN DE PROTENAS POR ANLISIS ELEMENTAL (N) El fundamento de la etapa de mineralizacin es la conversin de la materia orgnica proteica en in amonio segn la reaccin:

C
|

NH 2 + mH 2 SO4

catalitzador

calor

CO2 + ( NH 4 )2 SO4 + SO2

proteina
Reactivo de mineralizaci: KMnO4 (original Kjeldahl): resultados no satisfactorios y poco reproducibles cido sulfrico concentrado Mezclas sulfrico/fosfrico y H2O2

DETERMINACIN DE PROTENAS POR ANLISIS ELEMENTAL (N)


| catalitzador

C
|

NH 2 + mH 2 SO4

calor

CO2 + ( NH 4 )2 SO4 + SO2

proteina
Es necesario adicionar un catalizador y realizar el ataque a temperatura alta (hasta 370-410C segn autores) Catalizadores estudiados: Casi todos los elementos del sistema peridico Ms conocidos: Hg, Cu, Fe, Se, Ti o mezclas Otros aditivos: K2SO4 o Na2SO4 sustancias para aumentar la temperatura de ebullicin de la mezcla de reaccin Inconveniente (aunque es la ms utilizada) Tiempo total necesario para la mineralizacin (hasta 3 horas para unos pocos gramos de muestra)

DETERMINACIN DE PROTENAS POR ANLISIS ELEMENTAL (N) DETERMINACIN DEL N EN FORMA DE NH4+ o NH3 Reactivo de Nessler Basado en medidas colorimtricas sobre la propia muestra mineralizada Genera en presencia de NH4+ (NH3 en medio bsico) un complejo de color entre amarillo y rojo:

NH 3 + 2K 2 HgI 4 + 3KOH Hg 2OINH 2 + 7KI + 2H 2O


Se puede mejorar la sensibilidad por destilacin previa del amonaco pero se alarga el tiempo del proceso global Si se realiza la reaccin sobre el mineralizado directamente se debe aadir un agente enmascarante de los metales interferentes (habitualmente CN- que compleja a los metales inhibidores de la reaccin)

DETERMINACIN DE PROTENAS POR ANLISIS ELEMENTAL (N) Otros reactivos: Fenol + hipoclorito en medi bsico (Mtodo de Van Slyke and Hiller, 1935). Medida colorimtrica del indofenol producido, color azul) Timol + bromito en medio bsico (similar)
ClOOH NH3 O N OH

Fenol
H3C BrO2OH NH3 CH3 H3C H3C O

Indofenol
CH3 N H3C OH

CH3 CH3 H3C

Timol

Indotimol

DETERMINACIN DE PROTENAS POR ANLISIS ELEMENTAL (N)

Electrodos selectivos sensibles a NH3 Un electrodo que contiene NH4+ y una membrana permeable a NH3, que la atraviesa y desplaza el equilibrio:

NH + H O NH + + OH 3 2 4

Cuando se alcanza el equilibrio dentro del electrodo, el potencial de ste es proporcional a la concentracin de amonaco en la disolucin de muestra

DETERMINACIN DE PROTENAS POR ANLISIS ELEMENTAL (N) Mtodo de Dumas por pirlisis Se basa en la calcinacin de la muestra en presencia de xido de cobre, se eliminan posteriormente todos los gases (CO2 y H2O) excepto el nitrgeno (N2) que se mide de forma volumtrica Aplicaciones como mtodo micro con sistemas que permiten analizar hasta muestras de 1g en tiempos de anlisis cortos (unos 5 minutos por muestra) Posibilidad de sistemas automticos que acoplan la pirlisis con un GC/TCD para separar y determinar el nitrgeno: tiempo de anlisis de unos 4 minutos/muestra Resultados comparables a los del Kjeldahl. Ventajas: + rpido que Kjeldahl, sin reactivos txicos, automatizacin, simple Inconvenientes: coste inicial alto, problemas con representatividad de la muestra

DETERMINACIN DE PROTENAS POR ANLISIS ELEMENTAL (N) OTROS MTODOS Basados en activacin (neutrnica y protnica) y posterior medida de la radiacin emitida Desarrollos con gran originalidad para la determinacin de nitrgeno en protenas: Son rpidos (unos segundos) Simples Automatizados Coste por muestra bajo Equipamientos muy costosos

DETERMINACIN DE PROTENAS POR ANLISIS ELEMENTAL (N) Activacin neutrnica: Medida de la radiacin gamma emitida cuando el nitrgeno 15 generado vuelve a su estado fundamental

DETERMINACIN DE PROTENAS POR ANLISIS ELEMENTAL (N)

Activacin protnica:

14 N +1H 14O + n

14O + + +14N

La medida de la radiacin gamma liberada por el 14O es proporcional a la cantidad de nitrgeno La medida es muy selectiva al utilizar una energia caracterstica (2.31 MeV) Las dos tcnicas de activacin presentan resultados semejantes y comparables a Kjeldahl, con mucha rapidez (hasta 10 muestras por minuto).

DETERMINACIN DE PROTENAS POR MTODOS QUMICOS Procedimientos basados en el uso de propiedades fsicas o qumicas de las protenas Problemas: Interferencias al utilizar propiedades que no son especficas de las protenas Las respuestas varan de una protena a otra Etapas previas en los procedimientos qumicos: Tratamiento de la muestra para solubilizar las protenas con una base, p.ej. disolucin de KOH (no en muestras lquidas o disoluciones Separacin por precipitacin (con cido trifluoractico o sulfosaliclico,...) y centrifugacin o filtracin

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DETERMINACIN DE PROTENAS POR MTODOS QUMICOS Mtodos ms utilizados: De Biuret De Lowry (Folin) Fijacin de colorante (Bradford) 1-10 mg protena 20-300 g protena 1-100 g protena

DETERMINACIN DE PROTENAS POR MTODOS QUMICOS MTODO DE BIURET Basado en la reaccin entre los enlaces peptdicos y disoluciones alcalinas de Cu(II), dando un complejo de coloracin prpura Procedimiento: Rpido Simple Econmico Especfico de protenas: la reaccin la dan los enlaces peptdicos No es un procedimiento absoluto: es necesario hacer una calibracin para cuantificar: Con patrones (normalmente BSA, Bovine Serum Albumine) Por comparacin con procedimientos de referencia, Kjeldhal Longitud de onda de medida: entre 540 y 650 nm, segn las protenas presentes (habitualmente a 550 nm)

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DETERMINACIN DE PROTENAS POR MTODOS QUMICOS MTODE DE BIURET Reactivos de biuret Mucha variedad disponible Disoluciones de Cu(II) en medio alcalino con adicin de un complejante como tartrato para evitar la precipitacin. Poco cuestionado, dentro de los mtodos qumicos, ya que no hay prcticamente ningn constituyente de los alimentos que pueda dar interferencia importante, al ser la reaccin especfica del enlace peptdico. Quizs, su baja sensibilidad (en otros campos). Tambin se puede aplicar el procedimento por adicin directa de los reactivos en medio KOH sobre la muestra finamente dividida: extraccin y reaccin de determinacin al mismo tiempo

DETERMINACIN DE PROTENAS POR MTODOS QUMICOS MTODO DE BIURET


Shows positive test for: Biuret and proteins. How to perform the test: Prepare a solution or suspension of the sample by placing ~0.2 g in 10 ml of water. Ten drops of 1.5 M NaOH (a colorless solution) and 2 drops of 0.1 M CuSO4 (a light blue solution) are added. A positive test is indicated by: a deep blue/purple color due to the copper ion complex with the amide group of the protein.

a negative test (left)

a positive test (right)

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DETERMINACIN DE PROTENAS POR MTODOS QUMICOS MTODE DE LOWRY (1951, J. Biol. Chem., 193, 265-275)

Uno de los ms conocidos y utilizados para la determinacin de protenas en alimentos (y otras muestras biolgicas) Basado en la interaccin de las protenas con el reactivo de Folin (tungstato, molibdato y fosfato) en medio alcalino (pH 10-10.5) y con Cu (II) Reaccin debida principalmente a la presencia de aminocidos facilmente oxidables como la tirosina, cistena y triptfano. Reaccin entre el enlace peptdico y el cobre (como Biuret) y despus una oxidacin con el reactivo de Folin por parte del grupo fenol, tiol,... y el fosfomolibdato: color azul (500-750 nm)

DETERMINACI DE PROTEINES PER MTODES QUMICS MTODO DE LOWRY Mtodo con muy alta sensibilidad (hasta 100 veces ms sensible que el mtode biuret) y una relativa especificidad: pocas interferencias importantes Procedimiento emprico: intensidad de color vara con los aminocidos presentes y condiciones analticas (tiempo de incubacin, pH,...). Inconvenientes: mtodo destructivo, largo y que requiere la incubacin de la muestra entre la adicin de los diferentes reactivos.

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DETERMINACIN DE PROTENAS POR MTODOS QUMICOS MTODO DE LOWRY


Equipment In addition to standard liquid handling supplies a spectrophotometer with infrared lamp and filter is required. Glass or polystyrene (cheap) cuvettes may be used. Reagents 1. Reagent A consists of 2 gm sodium potassium tartrate x 4 H20, 100 gm sodium carbonate, 500 ml 1N NaOH, H20 to one liter (that is, 7mM Na-K tartrate, 0.81M sodium carbonate, 0.5N NaOH final concentration). Keeps 2 to 3 months. 2. Reagent B consists of 2 gm 2 gm sodium potassium tartrate x 4 H20, 1 gm copper sulfate (CuSO4 x 5H20), 90 ml H20, 10 ml 1N NaOH (final concentrations 70 mM Na-K tartrate, 40 mM copper sulfate). Keeps 2 to 3 months. 3. Reagent C consists of 1 vol Folin-Ciocalteau reagent diluted with 15 vols water. Assay 1. Prepare a series of dilutions of 0.3 mg/ml bovine serum albumin in the same buffer containing the unknowns, to give concentrations of 30 to 150 micrograms/ml (0.03 to 0.15 mg/ml). 2. Add 1.0 ml each dilution of standard, protein-containing unknown, or buffer (for the reference) to 0.90 ml reagent A in separate test tubes and mix. 3. Incubate the tubes 10 min in a 50 degrees C bath, then cool to room temperature. 4. Add 0.1 ml reagent B to each tube, mix, incubate 10 min at room temperature. 5. Rapidly add 3 ml reagent C to each tube, mix, incubate 10 min in the 50 degree bath, and cool to room temperature. Final assay volume is 5 ml. 6. Measure absorbance at 650 nm in 1 cm cuvettes.

DETERMINACIN DE PROTENAS POR MTODOS QUMICOS MTODO DE FIJACIN DE COLORANTE Fundamento: formacin de un precipitado (par inico insoluble) entre la protena y ciertas molculas orgnicas coloreadas (colorantes orgnicos) Separar el precipitado del sobrenadante por centrifugacin o filtracin y por comparacin entre la absorbancia inicial de la disolucin de colorante y la absorbancia del sobrenadante, determinar la concentracin de colorante precipitado y relacionarlo con protenas Colorantes cidos (por ejemplo con grupos sulfnicos) que reaccionan con los grupos bsicos de las protenas a pH bajo (~ 2) ya que se encuentran protonados. Procedimientos totalmente empricos. Definir y controlar rigurosamente las condiciones experimentales para garantizar la calidad de los resultados Principal ventaja: rapidez, con equipos comerciales a 100 muestras por hora, sin necesidad de manipulacin experta ni uso de reactivos altamente corrosivos

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DETERMINACIN DE PROTENAS POR MTODOS QUMICOS MTODO DE FIJACIN DE COLORANTE Colorantes:

Orange G

Cochineal red (rojo cochinilla)

Amido black

DETERMINACIN DE PROTENAS POR MTODOS QUMICOS MTODO DE FIJACIN DE COLORANTE Mtodo de Bradford, Coomasie Brilliant Blue G-250 (comercial desde 1980)
reactivo absorbe a 465nm, pero cuando se adsorbe sobre la arginina de las proteinas cambia su mximo de absorcin a 595 nm Tres veces ms sensible que Amido Black. Menos interferencias que Lowry. Se trabaja en disolucin (no hay que precipitar)

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DETERMINACIN DE PROTENAS POR ANLISIS INSTRUMENTAL


TCNICA Espectrofotometria UV CARACTERSTICAS DEL MTODO Protenas: absorcin en el UV entre190 y 290 nm Medida de la absorcin a 280 nm (evitar problemas instrumentales a longitudes de onda ms bajas, 200-215 nm muy sensible) Absorcin debida fundamentalmente a: tirosina, triptfano y fenilalanina, que se encuentran en cantidades semejantes en las protenas Tcnica muy utilizada en bioqumica y en control de fraccionamiento de protenas por LC Mtodo simple, rpido y no destructivo Fluorescencia UV Emisin de radiacin a 340 nm despus de excitacin a 275-280 nm (Triptfano) Aplicar directamente sobre suspensiones Rpido y no destructivo Turbidimetria, Suspensiones de protenas con los precipitantes habituales de protenas nefelometria (cido tricloroactico, ferricianuro o cido sulfosaliclico Los resultados dependen mucho de la reproducibilidad de las condiciones experimentales Electrodos especficos de Un electrodo especfico con una membrana de Ag2S mide el contenido en protenas protenas con grupos SH en medio alcalino

DETERMINACIN DE PROTENAS POR ANLISIS INSTRUMENTAL ANLISIS CUALITATIVO MEDIANTE ESI-TOF o MALDI-TOF
Unregistered

Mioglobina
12 Ala 2 Arg 3 Asp-NH2 8 Asp 1 Cis 14 Glu 7 Glu-NH2 15 Gli 9 Hist 8 Ileu 17 Leu 20 Lis 3 Met 7 Fen 5 Pro 7 Ser 4 Treo 2 Trip 2 Tir 7 Val

100 90 80 70 60

17052.60 17042.92

(M+H)+ C769H1215N209O221S4 PM Medio 17052.6

50 40 30 20 10

ESI+

0 17 040 17 050 17 060 17 070

100 90 80

(M+10H)10+ C769H1215N209O221S4 PM Medio 1706.2

m = 0.045 uma R=m/m = 37915

70 60 50 40 30 20 10 0 1 705 1 706 1 707 1 708

TOF
1 uma

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DETERMINACIN DE PROTENAS POR ANLISIS INSTRUMENTAL ANLISIS CUALITATIVO MEDIANTE ESI-TOF o MALDI-TOF
(M+H)+ C252H370N65O77S6 PM 5734.5

ESI-TOF

DETERMINACIN DE PROTENAS POR ANLISIS INSTRUMENTAL ANLISIS CUALITATIVO MEDIANTE ESI-TOF o MALDI-TOF
2D-PAGE Separacin de protenas Digestin enzimtica de la protena para obtener pptidos que se miden por MALDI-TOF (MH)+

MALDI-TOF
A partir de la masa de los pptidos se propone una secuencia de los mismos, y una posible protena que los contiene

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DETERMINACIN DE PROTENAS POR ANLISIS INSTRUMENTAL ANLISIS CUALITATIVO MEDIANTE ESI-Q/TOF o MALDI-TOF/TOF
89 89-H2O= 89-18= 71 1318.7-1247.4 = 71.3
A Ala R Arg N Asp-NH2 D Asp C Cis E Glu Q Glu-NH2 G Gli H Hist I Ileu L Leu K Lis M Met F Fen P Pro S Ser T Treo W Trip Y Tir V Val

Si a partir de la masa de los pptidos hay duda de cual puede ser su secuencia, o si existen modificaciones post-traduccionales, se realiza un espectro MS/MS del pptido en cuestin, asocindose los fragmentos a prdidas de aminocidos concretos o aminocidos modificados (azcares, fosfatos,).

DETERMINACIN PROTEICAS

DE

SUSTNCIAS

NITROGENADAS

NO

Inters en la determinacin de las sustncias nitrogenadas presentes en los alimentos diferentes de las protenas Este grupo incluye: Aminocidos Aminas (heterocclicas) Nitrosamines Derivados inorgnicos (NH4+, NO3- y NO2-)

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DETERMINACIN PROTEICAS

DE

SUSTNCIAS

NITROGENADAS

NO

Contribuir al valor nutricional de los alimentos, etc... (aminocidos) Relacionadas con procesos que pueden modificar la calidad (degradacin,...) Compuestos txicos: N-nitrosamines, Aminas Aromticas Heterocclicas (HAAs) o Acrilamida con actividad txica, mutagnica o carcinognica Derivados inorgnicos del nitrgeno: amonaco, nitrato y nitrito

DETERMINACIN PROTEICAS

DE

SUSTNCIAS

NITROGENADAS

NO

Primera etapa: eliminar las protenas de las muestras (o extractos de muestra): Precipitacin (con agentes precipitantes de protenas como TFA) Dialisis (muy adecuada para obtener muestras representativas de N no proteico) Ultracentrifugacin (sedimentar las protenas) Los extractos libres de protenas se pueden analizar para determinar los compuestos nitrogenados no proteicos

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DETERMINACIN DE SUSTNCIAS NITROGENADAS NO PROTEICAS

Aminocidos libres
Cromatografa Lquida con deteccin fluorescente (LC-FD) Derivatizacin pre-columna: FMOC Carbamatos
+ CH2 O C O Cl H2N CH R COOH

estables
CH2 O C O NH CH R COOH

FMOC-Cl

primarias secundarias

exc =263 nm em = 317 nm

DETERMINACIN DE SUSTNCIAS NITROGENADAS NO PROTEICAS

Aminocidos libres
Cromatografa Lquida con deteccin fluorescente (LC-FD) Derivatizacin post-columna: OPA/Mercaptoetanol
SH NH2
R

SCH2CH2OH N CHCOOH
R

CHCOOH

CH2CH2OH CHO

Inestable

exc =340 nm em = 450 nm

slo primarias

Isoindol sustituido CHO

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DETERMINACIN DE SUSTNCIAS NITROGENADAS NO PROTEICAS

Nitrosaminas (cancergenas) LC-UV Nitrito + aminas GC-FID Nitrato Protenas

DETERMINACIN DE SUSTNCIAS NITROGENADAS NO PROTEICAS

Aminas Heterocclicas Aromticas (HAAs) LC-MS/MS (carnes cocinadas, g/kg)

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DETERMINACIN DE SUSTNCIAS NITROGENADAS NO PROTEICAS

Acrilamida Formacin en frituras, tostados (mg/kg)


Azcares reductores t 175-200C Acrilamida MW 71 Patata fritas
VAL326 Sm ooth(Mn,2x1) Pat Acrilam ida 0.1 ppb 2.40 8.340* 100

Caf
MRM of 4 channels ,AP+ 71.5 > 26.8 1.967e+002

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Muy polar, f.m. H2O, col. esp.

LC-MS/MS
VAL326 Sm ooth(Mn,2x1) Pat Acrilam ida 0.1 ppb 2.40 263.939 100

% 1.61 1.65 1.92 2.22 2.53 2.80 3.02 3.34 3.38 3.65 3.95

Difcil ionizacin (APCI+)


MRM of 4 channels ,AP+ 71.5 > 54.9 6.721e+003
0

2.00

2.50

3.00

m Confirmacinin 3.50 4.00

55 - 17 (NH3)
%

VAL314 Sm ooth(Mn,2x1) Agua de red 0.1 ppb 2.40 264.114 100

MRM of 4 channels ,AP+ 71.5 > 54.9 7.239e+003

100%
1.56 2.26 2.82 2.50 3.07 3.33 3.49 3.73 3.91 3.50 m in 4.00

1.52

2.10 2.32

2.97 2.50 3.00

3.37

3.48 3.50

3.61

3.95 m in 4.00
0

0 2.00

2.00

3.00

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