Replicacin del ADN EL ADN COMO PORTADOR DE INFORMACIN GENTICA Por muchos aos, la gentica clsica se dedic a estudiar

los mecanismos de la herencia, a dilucidar la manera en que las unidades hereditarias pasan de una generacin a la siguiente y a investigar cmo los cambios en el material hereditario se expresan en los organismos individuales. En la dcada de 1930, surgieron nuevas preguntas y los genetistas comenzaron a explorar la naturaleza del gen, su estructura, composicin y propiedades. A comienzos de la dcada de 1940, ya no quedaban dudas sobre la existencia de los genes ni sobre el hecho de que estuviesen en los cromosomas. Ciertos cientficos pensaban que si se llegaba a comprender la estructura qumica de los cromosomas, entonces se podra llegar a comprender su funcionamiento como portadores de la informacin gentica. Los primeros anlisis qumicos del material hereditario mostraron que el cromosoma eucaritico est formado por cido desoxirribonucleico (DNA) y protenas, en cantidades aproximadamente iguales. Antes de conocerse cul era, tanto el DNA como las protenas eran buenos candidatos para ser la molcula portadora del material gentico. Esta lnea de pensamiento marc el comienzo de la vasta gama de investigaciones que conocemos como gentica molecular. Ya avanzada la dcada de 1940, algunos investigadores llegaron a una conclusin importante: el material hereditario poda ser el cido desoxirribonucleico (DNA). Los cientficos de muchas disciplinas se abocaron a investigaciones dedicadas a estudiar la correspondencia entre el lenguaje de nucletidos en el DNA y el lenguaje de aminocidos en las protenas. As, finalmente se dilucid el cdigo gentico. Una vez conocido el cdigo gentico, se pudo centrar la atencin en el problema de cmo la informacin codificada en el DNA y transcripta en el mRNA es luego traducida a la secuencia especfica de aminocidos en las protenas. De esta manera, se establecieron los principios bsicos de la sntesis de protenas. Estos principios son los mismos en las clulas eucariticas y en las procariticas, pero hay algunas diferencias en la localizacin de los procesos, adems de algunos detalles. Hasta la dcada de 1940, muchos bilogos tericos se apresuraron en sealar que los aminocidos, cuyo nmero era tan llamativamente cercano al nmero de letras de nuestro alfabeto, podan disponerse en una variedad de formas distintas; crean que los aminocidos constituan un lenguaje, "el lenguaje de la vida", que deletreaba las instrucciones para las numerosas actividades de la clula. Muchos investigadores prominentes, en particular los que haban estudiado protenas, crean que los genes mismos eran protenas. Pensaban que los cromosomas contenan modelos maestros de todas las protenas que podra necesitar la clula y que las enzimas y otras protenas activas durante la vida celular eran copiadas de estos modelos maestros. Esta era una hiptesis lgica pero, segn se vio posteriormente, errnea.

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Una evidencia importante del papel del DNA como portador de la informacin gentica, aunque no aceptada generalmente, fue aportada por Frederick Griffith, un bacterilogo de salud pblica de Inglaterra. Griffith estaba estudiando la posibilidad de desarrollar vacunas contra Streptococcus pneumoniae, un tipo de bacteria que causa una forma de neumona. Como saba Griffith, estas bacterias, llamadas comnmente neumococos, posean formas virulentas -causantes de la enfermedad- y formas no virulentas, o inocuas. Las virulentas estaban cubiertas por una cpsula de polisacridos y las no virulentas carecan de cpsula. La produccin de la cpsula y su constitucin son determinadas genticamente, es decir, son propiedades hereditarias de las bacterias. El descubrimiento de la sustancia que puede transmitir caractersticas genticas de una clula a otra result de los estudios con neumococos, las bacterias que causan la neumona. Una cepa de estas bacterias tiene cpsulas de polisacridos (cubiertas externas protectoras), y otra no. La capacidad para fabricar cpsulas y causar la enfermedad es una caracterstica heredada que pasa de una generacin bacteriana a otra, cuando las clulas se dividen. Griffith realiz un experimento con neumococos en el que primero (a) inyect neumococos vivos encapsulados a ratones y stos murieron. En este caso (b) la cepa no encapsulada no produjo infeccin. Si las bacterias encapsuladas eran muertas por la aplicacin de calor antes de la inyeccin (c), tampoco producan infeccin. Si las bacterias encapsuladas muertas por calor se mezclaban con bacterias vivas no encapsuladas, y la mezcla se inyectaba a los ratones (d), stos moran. Griffith tom muestras de sangre de los ratones muertos y las analiz (e). Los resultados revelaron la existencia de neumococos encapsulados vivos. "Algo" se haba transferido de las bacterias muertas a las vivas que las dotaba de la capacidad para formar cpsulas de polisacridos y causar neumona. Este "algo" fue aislado; luego se encontr que era DNA.

En 1940, los microbilogos Max Delbrck y Salvador Luria iniciaron una serie de estudios sobre el papel del DNA usando un grupo de virus que atacan a las clulas bacterianas: los bacterifagos 2

Replicacin del ADN ("comedores de bacterias") o fagos, para abreviar. Cada tipo conocido de clula bacteriana es atacado por un tipo particular de virus bacteriano y, a su vez, muchas bacterias son hospedadores de muchos tipos diferentes de virus. Veinticinco minutos despus de que un solo virus infectaba una clula bacteriana, esa clula estallaba, liberando una centena o ms de virus nuevos, todos copias exactas del original. Otra ventaja (que no se descubri hasta despus de comenzada la investigacin) fue que este grupo de bacterifagos tiene una forma altamente distintiva que permite identificarlos fcilmente con el microscopio electrnico. El anlisis qumico de los bacterifagos revel que consisten sencillamente en DNA y protena, los dos contendientes prominentes que se disputaban, en ese momento, el papel de portador del material gentico. La simplicidad qumica del bacterifago ofreci a los genetistas una oportunidad notable. Los genes virales, el material hereditario que dirige la sntesis de nuevos virus dentro de las clulas bacterianas, deban ser llevados o bien por la protena o bien por el DNA. Si poda determinarse cul de los dos contena la informacin gentica, entonces poda conocerse la identidad qumica del gen. Los cientficos Hershey y Chase demostraron mediante un memorable experimento que la protena es slo un "envase" para el DNA del bacterifago. Es el DNA del bacterifago el que penetra en la clula y lleva el mensaje hereditario completo de la partcula viral, dirigiendo la formacin de nuevo DNA viral y de las nuevas protenas virales.

a) Luego de obtener los dos tipos de virus (unos con el DNA marcado con fsforo y otros con las protenas marcadas con azufre) los cientficos infectaron cultivos de bacterias con ambos tipos de fagos marcados. Una vez infectadas (b), las clulas se incubaron en un agitador (c) y luego fueron centrifugadas para separarlas de cualquier material viral que permaneciera fuera de las clulas (d). Las dos muestras, la que contena material extracelular y la que contena material intracelular, se analizaron luego en busca de radiactividad. Hershey y Chase encontraron que el 35S haba permanecido fuera de las clulas bacterianas, en las cubiertas virales vacas, y que el 32P haba entrado a las clulas, las haba infectado y haba causado la produccin de nueva progenie viral. Por consiguiente, se concluy que el material gentico del virus era el DNA y no la protena. El apoyo al papel del DNA como material gentico procedi tambin de otros datos adicionales: 1) Casi todas las clulas somticas de cualquier especie dada contienen cantidades iguales de DNA, y 2) Las proporciones de bases nitrogenadas son las mismas en el DNA de todas las clulas de una especie dada, pero varan en diferentes especies.

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El modelo de Watson y Crick James Watson y Francis Crick se dedicaron a examinar y constrastar todos los datos existentes acerca del DNA , y a unificarlos en una sntesis significativa. En el momento en que Watson y Crick comenzaron sus estudios, ya haba un cmulo de abundante informacin.e saba que la molcula de DNA era muy grande, tambin muy larga y delgada, y que estaba compuesta de nucletidos que contenan las bases nitrogenadas adenina, guanina, timina y citosina. Los fsicos Maurice Wilkins y Rosalind Franklin haban aplicado la tcnica de difraccin de rayos X al estudio del DNA. Las fotografas obtenidas mostraban patrones que casi con certeza reflejaban los giros de una hlice gigante. Tambin fueron cruciales los datos que indicaban que, dentro del error experimental, la cantidad de adenina (A) es igual que la de timina (T) y que la de guanina (G) es igual que la de citosina (C): A=T y G=C. A partir de estos datos, algunos de ellos contradictorios, Watson y Crick intentaron construir un modelo de DNA que concordara con los hechos conocidos y explicara su papel biolgico. Para llevar la gran cantidad de informacin gentica, las molculas deban ser heterogneas y variadas. Reuniendo los diferentes datos, los dos cientficos fueron capaces de deducir que el DNA es una doble hlice, entrelazada y sumamente larga. Si se tomase una escalera y se la torciera para formar una hlice, manteniendo los peldaos perpendiculares, se tendra un modelo grosero de la molcula de DNA. Los dos parantes o lados de la escalera estn constituidos por molculas de azcar y fosfato alternadas. Los peldaos perpendiculares de la escalera estn formados por las bases nitrogenadas adenina, timina, guanina y citosina. Cada peldao est formado por dos bases, y cada base est unida covalentemente a una unidad azcar-fosfato. En la doble hlice, las bases enfrentadas se aparean y permanecen unidas por puentes de hidrgeno, esos puentes relativamente dbiles que Pauling haba encontrado en sus estudios sobre la estructura de las protenas. De acuerdo con las mediciones efectuadas mediante rayos X, las bases apareadas (los peldaos de la escalera) deban ser siempre combinaciones de una purina con una pirimidina. Cuando Watson y Crick analizaron los datos, armaron modelos reales de las molculas usando alambre y hojalata, ensayando dnde poda encajar cada pieza en el rompecabezas tridimensional. A medida que trabajaban con los modelos, advirtieron que los nucletidos situados en cualquiera de las cadenas de la doble hlice podan acoplarse en cualquier orden o secuencia. Dado que una molcula de DNA puede tener miles de nucletidos de largo, es posible obtener una gran variedad de secuencias de bases diferentes, y la variedad es uno de los requisitos primarios del material gentico. Notaron tambin que la cadena tiene direccin: cada grupo fosfato est unido a un azcar en la posicin 5' -el quinto carbono en el anillo de azcar- y al otro azcar en la posicin 3' -el tercer carbono en el anillo de azcar-. As, la cadena tiene un extremo 5' y un extremo 3'. Sin embargo, el descubrimiento ms excitante ocurri cuando Watson y Crick comenzaron a construir la cadena complementaria. Encontraron otra restriccin interesante e importante. No solamente las purinas no podran aparearse con purinas, ni las pirimidinas con pirimidinas, sino que, a causa de las estructuras particulares de las bases, la adenina slo poda aparearse con la timina, formando dos puentes de hidrgeno (A=T) y la guanina solamente con la citosina, formando tres puentes de hidrgeno (G=C). Las bases apareadas eran complementarias. Las dos cadenas corren en direcciones opuestas, es decir, la direccin desde el extremo 5' al 3' de cada cadena es opuesta y se dice que las cadenas son antiparalelas. Aunque los nucletidos dispuestos a lo largo de una cadena de la doble hlice pueden presentarse en cualquier orden, su secuencia determina el orden de los nucletidos en la otra cadena. Esto es necesariamente as, porque las bases son complementarias (G con C y A con T).

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El armazn de la hlice est compuesto por las unidades azcar-fosfato de los nucletidos. Los peldaos estn formados por las cuatro bases nitrogenadas, adenina y guanina (purinas) -cada una de ellas con un anillo doble en su estructura- y timina y citosina (pirimidinas), ms pequeas, cada una con un slo anillo. Cada peldao est formado por dos bases. El conocimiento de las distancias entre los tomos fue crucial para establecer la estructura de la molcula de DNA. Las distancias fueron determinadas con fotografas de difraccin de rayos X del DNA, tomadas por Rosalind Franklin y Maurice Wilkins.

Replicacin del ADN En el modelo de Watson y Crick, cada nucletido consiste en un azcar desoxirribosa, un grupo fosfato y una base prica o pirimdica. Ntese la secuencia repetida azcar-fosfato-azcar-fosfato que forma el esqueleto de la molcula. Cada grupo fosfato est unido al carbono 5' de una subunidad de azcar y al carbono 3' de la subunidad de azcar del nucletido contiguo. As, la cadena de DNA tiene un extremo 5' y un extremo 3' determinados por estos carbonos 5' y 3'. La secuencia de bases vara de una molcula de DNA a otra. Las cadenas se mantienen unidas por puentes de hidrgeno (representados aqu por guiones) entre las bases. Ntese que la adenina y la timina pueden formar dos puentes de hidrgeno, mientras que la guanina y la citosina pueden formar tres. Dados estos requerimientos de enlace, la adenina puede aparearse slo con la timina y la guanina slo con la citosina. As, el orden de las bases en una cadena -TTCAG- determina el orden de las bases en la otra cadena -AAGTC. Las cadenas son antiparalelas, es decir, la direccin desde el extremo 5' a 3' de una es opuesta a la de la otra. GENOMAS EUCARITICOS El tamao de los genomas eucariticos es sumamente grande comparado con el de los procariticos. Esto es en parte debido a la complejidad de los organismos eucariticos comparados con los procariotas debido a la gran presencia de una gran cantidad de ADN no codificado. Las funciones de estas secuencias de cidos nucleicos no codificados no se comprenden completamente. Algunas secuencias estn implicadas en el control de la expresin del gen mientras que otras pueden simplemente estar presentes en el genoma para actuar como un buffer evolutivo capaz de soportar la mutacin del nucletido sin la interrupcin de la integridad del organismo. Una clase abundante de ADN es denominado ADN repetitivo. Hay 2 diferentes subclases de ADN repetitivo, los altamente repetitivos y los moderadamente repetitivos. El ADN altamente repetitivo consiste en secuencias cortas de 6-10 bp de largo reiterado desde 100.000 a 1.000.000 de veces. El ADN que subsiste en los genes del genoma (secuencias de codificacin) se identifica como ADN no repetitivo, puesto que la mayora de los genes se encuentran una sola vez en un organismo de genoma haploide. Sin embargo, se debe precisar que varios genes existen como grupos secuenciales de mltiples copias del mismo gen que van desde 50 a 10.000 copias tal como es el caso de los genes de rRNA y los genes de histona. Otra caracterstica que distingue los genes eucariticos de los procariticos es la presencia de intrones. Los intrones son tramos de secuencias de cidos nuclecos que separan los exones de codificacin de un gen. La existencia de intrones en los procariotas es extremadamente rara. Esencialmente todos los genes humanos contienen intrones. Una excepcin notable son los genes de histona los cuales no tienen intrones. En muchos genes la presencia de intrones separa los exones en las regiones de codificacin exhibiendo distintos dominios funcionales. ESTRUCTURA DE LA CROMATINA La cromatina es un trmino que designa a la estructura en la cual el ADN existe dentro de las clulas. La estructura de la cromatina es determinada y estabilizada con la interaccin del ADN con las protenas ligadoras del ADN. Hay 2 clases de protenas ligadoras del ADN. Las histonas son la principal clase de protenas ligadoras involucradas en mantener la estructura compacta de la cromatina. Hay 5 diferentes protenas de histona identificadas como H1, H2A, H2B, H3 y H4. La otra clase de protenas ligadoras del ADN es un diverso grupo de protenas llamadas simplemente, protenas no histonas. Esta clase de protenas incluyen los distintos factores de transcripcin, polimerasas, receptores hormonales y otras enzimas nucleares. En cualquier clula hay ms de 1000 tipos diferentes de protenas no histonas unidas al ADN. La unin del ADN con las histonas genera una estructura llamada nucleosoma. La parte central del nucleosoma contiene una protena octamrica que consiste en 2 subunidades, incluyendo dos molculas de H2A, H2B, H3 y H4. La histona H1 ocupa el espacio del ADN internucleosomal y es identificada como la histona ligadora. La parte central del nucleosoma contiene aproximadamente 150 bp de ADN. El enlace entre el ADN de cada nucleosoma puede variar de 20 a ms de 200 bp. Estas estructuras de la parte central nucleosomal aparecen como "bolas en una cadena", si se observa el ADN extendido en una estructura lineal, en un microscopio electrnico.

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Representacin de Diagrama de un Nucleosoma Los propios nucleosomas se compactan en una bobina solenoide de forma que a su vez ms bobinas se compactan para formar la estructura del ADN. Estas bobinas estn ms compactadas en la caracterstica cromatina vista en una metafase. La estructura protena-ADN de la cromatina, es estabilizada por unin con protenas no-histonas andamio, es llamada matriz nuclear.

Jerarqua de Estructura de la Cromatina En una consideracin amplia de la estructura de la cromatina hay dos formas: heterocromatina y eucromatina que originalmente fueron designados sobre la base de estudios citolgicos, en las cuales se observaron dos regiones teidas diferenciables. La heterocromatina es ms densa que la eucromatina y se encuentra a menudo cerca de los centrmeros de los cromosomas. La heterocromatina es transcripcionalmente inactiva. La eucromatina por otra parte, es activa en la transcripcin de genes. La replicacin del ADN Todas las clulas experimentan un ciclo de divisin durante su vida. Algunas clulas se estn dividiendo continuamente (por ejemplo, las clulas madre), otras se dividen un nmero especfico de veces hasta que ocurre su muerte (apoptosis), y algunas se dividen unas pocas veces antes de entrar en un estado de diferenciacin terminal o en un estado de inactividad. La mayora de las clulas del cuerpo entran en esta ltima categora. Durante el proceso de la divisin celular todo 7

Replicacin del ADN dentro de la clula se debe duplicar para asegurar la supervivencia de las dos clulas hijas resultantes. De particular importancia para la supervivencia celular es la duplicacin exacta, eficiente y rpida del genoma celular. Este proceso se denomina replicacin del ADN. La replicacin del DNA comienza en una secuencia de nucletidos particular en el cromosoma: el origen de la replicacin. Ocurre bidireccionalmente por medio de dos horquillas de replicacin que se mueven en direcciones opuestas. Las enzimas helicasas desenrollan la doble hlice en cada horquilla de replicacin y protenas de unin a cadena simple estabilizan las cadenas separadas. Otras enzimas, las topoisomerasas, relajan el superenrollamiento de la hlice, ya que cortan las cadenas por delante de las horquillas de replicacin y luego las vuelven a unir. Para que pueda comenzar la replicacin se necesita una secuencia de cebador de RNA -sintetizado por la enzima RNA primasa-, con sus bases correctamente apareadas con la cadena molde. La adicin de nucletidos de DNA a la cadena es catalizada por las DNA polimerasas. Estas enzimas sintetizan nuevas cadenas slo en la direccin 5' a 3', aadiendo nucletidos uno a uno al extremo 3' de la cadena creciente. La replicacin de la cadena adelantada es continua, pero la replicacin de la cadena rezagada es discontinua. En la cadena rezagada, fragmentos de Okazaki se sintetizan en la direccin 5' a 3'. La enzima DNA ligasa une fragmentos de Okazaki contiguos. En el proceso de replicacin del DNA se pierden nucletidos en los extremos de las molculas de DNA lineales. En algunas clulas eucariticas, esta prdida es compensada por la actividad de la enzima telomerasa. En el curso de la sntesis de DNA, la DNA polimerasa corrige los errores, retrocediendo cuando es necesario para eliminar nucletidos que no estn correctamente apareados con la cadena molde. Otros errores en el DNA ocurren en forma independiente del proceso de replicacin y son usualmente reparados por distintos mecanismos. Los nucletidos, antes de ser incorporados a las cadenas crecientes de DNA, se encuentran en forma de trifosfatos. La energa requerida para impulsar la replicacin proviene de la eliminacin de dos fosfatos "supernumerarios" y la degradacin del enlace P ~ P.

Las dos cadenas de la doble hlice de DNA se separan y sirven como moldes para la sntesis de nuevas cadenas complementarias. Las helicasas, enzimas que operan en las horquillas de replicacin, separan las dos cadenas de la doble hlice original. Las topoisomerasas, evitan el superenrollamiento, catalizando la formacin y resellado de cortes en una o ambas cadenas delante de las horquillas de replicacin. Las protenas de unin a cadena simple estabilizan las cadenas abiertas.

Replicacin del ADN La DNA polimerasa cataliza la adicin de nucletidos a ambas cadenas operando slo en direccin 5' a 3'. Para comenzar a aadir nucletidos, esta enzima requiere la presencia de un cebador de RNA, unido por puentes de hidrgeno a la cadena molde que es luego reemplazado por nucletidos de DNA. El cebador de RNA es sintetizado por la RNA primasa. La cadena adelantada se sintetiza en la direccin 5' a 3' en forma continua. En este caso, el nico cebador de RNA est situado en el origen de replicacin, que no es visible en este esquema. La cadena rezagada tambin se sintetiza en la direccin 5' a 3', a pesar de que esta direccin es opuesta a la del movimiento de la horquilla de replicacin. El problema se resuelve mediante la sntesis discontinua de una serie de fragmentos, los fragmentos de Okazaki. Cuando un fragmento de Okazaki ha crecido lo suficiente como para encontrar a un cebador de RNA por delante de l, otra DNA polimerasa reemplaza a los nucletidos de RNA del cebador con nucletidos de DNA. Luego, la DNA ligasa conecta cada fragmento con el fragmento contiguo recin sintetizado en la cadena. La replicacin del ADN ocurre durante el ciclo de divisin celular. Debido a que el complemento gentico de las clulas hijas resultantes debe ser igual que el de la clula madre, la replicacin del ADN debe poseer un muy alto grado de fidelidad. El proceso entero de la replicacin del ADN es complejo e implica mltiples actividades enzimticas. Los mecanismos de la replicacin del ADN fueron originalmente caracterizados en la bacteria E. coli, la cual contiene 3 distintas enzimas capaces de catalizar la replicacin del ADN. stas han sido identificadas como ADN polimerasa (pol) I, II, y III. La pol I tiene una actividad importante en la replicacin en E. coli, pero tiene como funcin principal asegurar la fidelidad de la replicacin a travs de la reparacin del dao y la incompatibilidad del ADN. La replicacin del genoma de E. coli es llevada a cabo por la pol III. Esta enzima es mucho menos abundante que pol I, sin embargo, su actividad es cerca de 100 veces mayor que la de pol I. Se han identificado 5 distintas ADN polimerasas en clulas eucariticas, , , , y . La identidad de las enzimas individuales se relaciona con su localizacin sub-celular as, como por su actividad replicativa primaria. La polimerasa de las clulas eucariticas que es el equivalente de pol III de E. coli es pol-. El equivalente de pol I en eucariotas es pol-. La polimerasa- es responsable de la replicacin del ADN mitocondrial. La capacidad de las ADN polimerasas para replicar el ADN depende de un nmero de protenas accesorias adicionales. La combinacin de las polimerasas con varias de las protenas accesorias produce un complejo identificado como holoenzima ADN-polimerasa. Estas protenas accesorias incluyen: 1. Primasa 2. Protenas accesorias de procesamiento 3. Protenas ligadas de un solo filamento 4. Helicasa 5. ADN ligasa 6. Topoisomerasas 7. Uracil-ADN N- glicosilasa El proceso de replicacin del ADN comienza en los sitios especficos de los cromosomas denominados orgenes de la replicacin, y requieren de un iniciador (cebador) que tiene un (OH-) en posicin 3' libre, y procede especficamente en la direccin 5'3' en ambos filamentos del ADN y resulta en la copia del patrn de filamentos de una manera semiconservativa. La naturaleza semiconservativa de la replicacin del ADN indica que los nuevos filamentos hijos sintetizados, siguen conteniendo material gentico de los filamentos patrones. El gran tamao de los cromosomas eucariticos y los lmites de la incorporacin de nucletidos durante la sntesis del ADN, hacen necesario de que existan mltiples orgenes de replicacin para completar la replicacin en un perodo de tiempo razonable. La naturaleza exacta de los orgenes de la replicacin en organismos eucariticos mayores no es clara. Sin embargo, est claro que en el origen de la replicacin de los filamentos del ADN, estos deben disociarse y desenrollarse para permitir el acceso a la ADN polimerasa. El desenrollamiento de las dos cadenas del ADN en el origen, as como tambin en los filamentos mientras el proceso de replicacin, se lleva a cabo por la accin de las helicasas. Las regiones resultantes de filamentos simples del ADN son estabilizadas por la unin de las protenas ligadoras de un solo filamento. Las regiones estabilizadas de un solo

Replicacin del ADN filamento son entonces accesibles a las actividades enzimticas requeridas para proceder a la replicacin. El sitio de los filamentos patrn desenrollado se denomina horquilla de la replicacin. Para que las polimerasas del ADN sinteticen ADN deben encontrar un OH- libre en posicin 3', el cual es el sustrato para la inclusin de los 5'-fosfato del nucletido entrante. Durante la reparacin del ADN daado el 3'-OH puede provenir de la hidrlisis del esqueleto de uno de los dos filamentos. Durante la replicacin el 3'-OH es abastecido con el uso de un cebador de RNA, sintetizado por la primasa. La primasa utiliza los filamentos del ADN como patrones y sintetiza un corto trecho de RNA que genera un cebador para la polimerasa del ADN. La sntesis del ADN procede en la direccin 5'3' a travs de la unin del 5'-fosfato de un dNTP entrante a los 3'-OH existentes en los filamentos del ADN que se est elongando con la liberacin concomitante de pirofosfato. La iniciacin de la sntesis, en los orgenes de la replicacin, ocurre simultneamente en ambos filamentos del ADN. La sntesis entonces procede bidireccionalmente, con la copia continua de un filamento en cada direccin y la copia de un filamento discontinuo en cada direccin. Durante el proceso las ADN polimerasas que estn incorporando dNTPs al ADN en la direccin 5'3' se mueven en la direccin 3'5', en relacin al filamento original. Para que la sntesis del ADN ocurra simultneamente en ambos filamentos originales as como tambin en forma bidireccional, un filamento parece que est siendo sintetizado en la direccin 3'5'. En realidad un filamento de ADN sintetizado a nuevo es producido discontinuamente. El filamento de ADN sintetizado continuamente se denomina filamento principal y el filamento discontinuo se denomina filamento rezagado. El filamento rezagado del ADN se compone de tramos cortos del cebador de RNA ms ADN sintetizado a nuevo de aproximadamente 100-200 bases de largo (la distancia aproximada entre los nucleosomas adyacentes). Los filamentos rezagados del ADN tambin se conocen como fragmentos de Okazaki. El concepto de sntesis continua del filamento es algo inapropiado, puesto que las polimerasas del ADN no se mantienen asociadas con un filamento patrn indefinidamente. La capacidad de una polimerasa particular para permanecer asociada con el filamento patrn se denomina procesividad. Mientras ms tiempo est asociada ms larga es la procesividad de la enzima. La procesividad de la polimerasa del ADN es aumentada por las actividades proteicas adicionales del replisoma identificado como protenas accesorias de procesividad. La progresin de la bifurcacin de replicacin requiere que el ADN por delante de la horquilla sea continuamente desenrollado. Debido al hecho que el ADN cromosmico eucaritico est unido a una estructura proteica, el movimiento progresivo de la bifurcacin de replicacin introduce un estrs de torsin severo en el ADN duplicado que est delante de la bifurcacin. Este estrs de torsin es disminuido por las topoisomerasas del ADN. Las topoisomerasas alivian el estrs de torsin en los duplex de ADN al introducir rupturas dobles (topoisomerasa II) o simples (topoisomerasa I) en el esqueleto del ADN. Estas rupturas permiten el desenrollamiento del duplex y la remocin del estrs de torcin inducido por la replicacin. Las rupturas son reparadas por las topoisomerasas. Los cebadores de RNA de los filamentos principales y de los fragmentos Okazaki son removidos por las ADN polimerasas de reparacin y simultneamente reemplazan los ribonucletidos con los desoxiribonucletidos. Los vacios existentes entre el 3'-OH de un filamento principal y el 5'-fosfato de otro, as como entre un fragmento Okazaki y otro son reparados por las ligasas del ADN, completando as el proceso de la replicacin. Actividades Adicionales de la ADN Polimerasa La actividad enzimtica principal de las ADN polimerasas es la actividad sinttica 5'3'. Sin embargo, las ADN polimerasas poseen dos actividades adicionales de importancia tanto para replicacin como para la reparacin. Estas actividades adicionales incluyen una funcin de exonucleasa 5'3' y una funcin de exonucleasa 3'5'. La actividad de exonucleasa 5'3' permite la remocin de los ribonucletidos del cebador de RNA, utilizados para iniciar la sntesis del ADN, junto con su reemplazo simultneo con los desoxiribonucletidos mediante la actividad de la polimerasa 5'3'. La exonucleasa 5'3' tambin es utilizada durante la reparacin del ADN daado. La exonucleasa 3'5' es vital durante la replicacin para permitir que la ADN polimerasa remueva las bases mal unidas. Es posible (pero raro) que las ADN polimerasas incorporen una base incorrecta durante la replicacin. Estas bases mal unidas son reconocidas por la polimerasa inmediatamente debido a la carencia de la base de apareamiento de Watson-Crick. La base mal unida es entonces removida por la actividad de la exonucleasa 3'5' y la base correcta es insertada antes de la progresin de la replicacin.

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Replicacin del ADN Reparacin del ADN Daado El cncer, que en la mayora de los casos no es provocado por virus, es la consecuencia mdica ms severa de relevancia debido a la inhabilidad de reparar el ADN daado. Est claro que las mltiples mutaciones somticas de la clula en el ADN pueden conducir a la gnesis de un fenotipo transformado. Por lo tanto, es obvio que la comprensin completa de los mecanismos de reparacin del ADN sera invaluable en el diseo de agentes teraputicos potenciales para el tratamiento de cncer. El dao del ADN puede ocurrir como resultado de la exposicin a los estmulos ambientales tales como productos qumicos de alquilacin, o irradiacin ultravioleta o radiactividad, a la presencia de radicales libres generados espontneamente en el ambiente de oxidacin de la clula. Estos fenmenos pueden, y lo hacen, conducir a la introduccin de mutaciones en la capacidad de codificacin del ADN. Las mutaciones en el ADN tambin, raramente, se presentan por la tautomerizacin espontnea de las bases. La modificacin de las bases del ADN por alquilacin (predominantemente por la incorporacin de grupos -CH3) ocurren frecuentemente en los residuos de purinas. La metilacin de los residuos G permite que estos se unan con T en lugar de C. Una nica enzima llamada O6-alquilguanina transferasa remueve el grupo alquil de los residuos G. Esta enzima se alquila a s misma y ya no es activa, as, una nica molcula de protena puede remover sola un grupo alquilo. Las mutaciones en el ADN son de dos tipos. Las mutaciones de transicin que resultan del intercambio de una purina, o pirimidina, por otra purina, o pirimidina. Las mutaciones de transversin resultan del intercambio de una purina por una pirimidina o viceversa. El prominente subproducto de la irradiacin UV sobre el ADN es la formacin de dmeros de timina. stos se forman a partir de dos residuos T adyacentes en el ADN. QUIMIOTERAPIAS PARA LA REPLICACIN DEL ADN La clase de compuestos que han sido utilizados ms ampliamente como drogas anticncer son los agentes alquilantes. Los principales agentes alquilantes se derivan de las mostazas nitrogenadas que fueron originalmente desarrolladas para uso militar. Los agentes alquilantes comnmente usados incluyen ciclofosfamida (Cytoxan, Neosar), ifosfamida, decarbazina, clorambucil (Leukeran) y procarbazina (Matulane, Natulan). Los agentes alquilantes funcionan reaccionando con el ADN y modificando la estructura del mismo. Algunos agentes reaccionan con los grupos alquil en el ADN dando lugar a la fragmentacin del ADN como consecuencia de la accin de las enzimas de reparacin del ADN. Algunos agentes catalizan la unin cruzada de las bases en el ADN, lo que previene la separacin de los dos filamentos durante la replicacin del ADN. Algunos agentes inducen a un mal apareamiento de nucletidos dando como resultado mutaciones permanentes en el ADN. Los agentes alquilantes actan sobre el ADN en todas las etapas del ciclo celular, por lo que son drogas anticncer potentes. Sin embargo, debido a su potencia, el uso prolongado de agentes alquilantes puede conducir a cnceres secundarios, particularmente leucemias. Varias clases de drogas anticncer funcionan con interferencia con las acciones de las topoisomerasas. Dos de estas clases son antraciclinas y camptotecinas.

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