RESIDENCIA BSICA ANTIOXIDANTES EN CHA

MARTINS MARIANO MATRCULA 37010036 DIRECTORA: Dra. Viviana Spotorno LUGAR DE TRABAJO: Instituto Tecnologa de Alimentos INTA AO 2009

OBJETIVOS: Determinar y cuantificar los antioxidantes naturales presentes en semilla de chia, harina, en el fino de la harina y en la Fraccin Rica en fibra (FRF) de semilla de chia Capacitacin en manejo de las tcnicas de laboratorio de anlisis de alimentos, como concentracin, purificacin de las muestras y tcnicas instrumentales de deteccin: HPLC. INTRODUCCIN La Cha (Salvia hispnica L.) se la considera una buena fuente de fibra dietaria, protenas y antioxidantes. Es una planta anual, de verano, que pertenece a la familia de las Lamiaceae; es originaria de reas montaosas de Mxico. Si bien resulta una verdadera novedad en nuestro mercado, se sabe que hace ya 3500 aos a.C. era conocida como un importante alimento y medicina. En la poca precolombina era para los mayas y aztecas uno de los cuatro cultivos bsicos destinados a su alimentacin, junto al maz, el poroto y el amaranto. Ellos utilizaban la cha en distintos preparados nutricionales y medicinales, como as tambin en la elaboracin de ungentos cosmticos. Era fuente de energa para travesas prolongadas y alimento para los guerreros, combinada con maz. La harina de cha tostada se utilizaba en la preparacin de una popular bebida refrescante y nutritiva, costumbre que, con variantes, hoy persiste en Centroamrica y se denomina cha fresca (agua, limn y cha). Los ceramistas y pintores utilizaban el aceite de cha para la preparacin de barnices y pinturas, que se destacaban por su brillo y resistencia al envejecimiento dado su alto poder antioxidante. Con el objeto de ahondar en sus caractersticas benficas, en el ao 1991 se inici un programa de desarrollo e investigacin en la Universidad de Arizona, que promova la recuperacin de este cultivo subtropical en EEUU, Mxico y Argentina. La semilla en cuestin es fuente de cidos grasos esenciales para la nutricin humana, ya que stos no pueden ser sintetizados por el cuerpo. Las cantidades necesarias de estos cidos grasos, Omega-3 y Omega-6, dependen del ciclo de vida de cada persona y de su estado fisiolgico. La ingesta de los cidos grasos esenciales, no es en si un problema, sin embargo hay pocos alimentos que contengan Omega-3, siendo la semilla de cha, una fuente importante de estos cidos grasos (1). Por otro lado, la autooxidacin de los cidos grasos poliinsaturados afecta negativamente la calidad nutricional de los alimentos y sus productos constituyen un importante factor de riesgo para la salud, relacionado con el dao de membranas celulares, procesos de envejecimiento, enfermedades cardiovasculares y cncer. Los antioxidantes protegen la calidad de los alimentos retardando el deterioro de los lpidos. (2). Los polifenoles en particular, actan como antioxidantes debido a la capacidad de captacin de electrones y radicales libres, formando compuestos estables y evitando la propagacin de la oxidacin de los cidos grasos poliinsaturados(PUFA). Los polifenoles responsables de esta accin protectora frente a la oxidacin son comnmente los flavonoides y los derivados del cido cinmico, que se encuentran en gran cantidad en la cha, tanto en aceites, semillas o harina. (3)

Los flavonoides, adems de ser antioxidantes, tambin presentan otras propiedades como la estimulacin de las comunicaciones a travs de las neuronas, el impacto sobre la regulacin del crecimiento celular (por esta cuestin se lo atribuye como anticancergeno) e induccin de enzimas de destoxificacin. En varios vegetales, estos compuestos son pigmentos naturales que otorgan una proteccin frente al dao que produce la oxidacin de los rayos ultravioleta y sustancias qumicas presentes en alimentos (4). Estos compuestos no pueden ser sintetizados por el propio organismo humano, por eso es importante ingerirlos mediante una adecuada alimentacin o en situaciones extremas, por medio de suplementos. Dentro de los flavonoides, se subclasifican en: flavanonas, flavonas, flavonoles e isoflavonas.(5) Los flavonoides que se estudian en la semilla de chia y sus derivados son la mircetina, quercetina y kaempferol, pertenecientes al subgrupo de los flavonoles. (6) Los derivados del cido cinmico tambin son agentes antioxidantes presentes en la semilla de cha y sus derivados. Ellos son: el cido clorognico y el cido cafeico, que a diferencia de los flavonoides, son compuestos de mayor polaridad, por lo que son ms solubles en fase acuosa. (6) Tcnica de anlisis. Los compuestos, objetos de este estudio, se encuentran en muy pequeas concentraciones, lo cual hay requiere recurrir a una tcnica de deteccin adecuada. Utilizaremos la cromatografa liquida de alta eficiencia, o HPLC ( por sus siglas en ingles High Performance Liquid Chromatography) con deteccin por absorcin ultravioleta (UV). La cromatografa es un mtodo utilizado primariamente para la separacin de los componentes de una muestra, distribuyndolos por equilibrio de dos fases, una estacionaria y otra mvil. En la cromatografa lquida de alta eficiencia, la fase mvil es lquida, que son los solventes de elusin, y la fase estacionaria es el material cromatogrfico que se halla dentro de la columna. El equilibrio es un fenmeno superficial, que en el HPLC es ms eficiente pues se observa un aumento de superficie por reduccin del tamao de la partcula. Esto da como resultado la reduccin de la seccin de paso, con el consiguiente aumento de la presin del lquido. Bsicamente un cromatgrafo lquido esta compuesto por una bomba, reservorio de la fase mvil, inyector, detector y un sistema de toma y procesamiento de los datos. Como resultado del anlisis cromatogrfico se obtiene un grfico o cromatograma y en el eluido, que es el liquido proveniente de la columna, contiene la fase mvil y los componentes de la muestra separados. La fase mvil en HPLC cumple un rol fundamental, ya que puede por si misma modificar completamente la selectividad de las separaciones en fase normal (fase estacionaria polar y fase mvil no polar) y es a la vez el verdadero motor de las separaciones en fase reversa (fase mvil polar y fase estacionaria no polar). Es decir que

es posible lograr un nmero muy grande de diferentes separaciones con una misma columna, variando la composicin de la fase mvil. Se debe tener en cuenta que no todos los solventes son adecuados para trabajar como fase mvil en un HPLC, deben cumplir requisitos como los siguientes: Alto poder solubilizante de las muestras Baja reactividad Compatibilidad con el detector utilizado Adecuado punto de ebullicin Baja viscosidad Seguridad Alto grado de pureza Por lo que los solventes mas utilizados en HPLC de fase reversa son: agua, metanol, acetonitrilo, tetrahidrofurano y dioxanos. La fase mvil luego de ser preparada, debe ser filtrada por medio de filtros de membrana de 0.45 o 0.22 m de porosidad siendo til para filtrar tanto partculas como micro organismos. Hay que aclarar que las muestras a inyectar tambin deben ser filtradas de la misma manera, solo que para filtrar las muestras es necesario utilizar dispositivos de filtracin ms pequeos. En cuanto al sistema de deteccin de compuestos en el HPLC se utiliza distintos tipos, entre ellos el de absorcin UV es uno de los ms usados, pero menos selectivo. Otro ejemplo es el detector por espectroscopia de masas que se considera el ms selectivo.(7) Trabajo experimental. Se quiere estudiar la cantidad de cido colorognico, cido cafeico, mircetina, quercetina y kaempferol en la semilla entera, harina, fraccin rica en fibra y en los finos de la harina. Se utilizar tcnicas de HPLC por absorbancia al UV. Se evaluarn las tcnicas exctractivas en su eficiencia y se compararn las concentraciones de estas flavonas y derivados del cido cinmico en cada una de las fracciones del procesado de la cha.

MATERIALES Y MTODOS. Muestras. Para la realizacin de los ensayos empleados se utiliz semillas de Cha provenientes de la provincia de Salta (Argentina). Fueron analizadas muestras de semillas de cha como tal. Una parte de ellas fueron trituradas en un molinillo de laboratorio y posteriormente desgrasadas mediante equipo soxhlet con solvente n-hexano a 90C durante 8 horas. El residuo remanente de la extraccin es la harina de cha, que se la utiliz tambin como muestra. Luego, la harina de cha se fraccion en finos y FRF (fraccin rica en fibra), mediante un proceso de tamizado con tamiz Zonytest, malla n100 A.S.T.M. A la fraccin retenida en el tamiz se la denomin FRF y al resto finos de la harina (figura 1).

Semilla
Trituracin en molino de laboratorio Soxhlet, desgrasado

Aceite

Harina
Tamiz

Fraccin rica en fibra (FRF)

Fino de harina

Figura 1. Diagrama de flujo de obtencin de las muestras a analizar Son muestras analizadas en este trabajo, las que se encuentran encuadradas en color. Extraccin y purificacin Se pesaron 2 g de cada muestra por triplicado en un primer experimento (E1) y 0,2 g en un segundo experimento (E2). A cada muestra se le realizaron tres extracciones con distintas concentraciones de cido actico al 10%v/v y acetonitrilo: Primera extraccin: 10 ml(E1) o 3ml(E2) cido actico 10%:acetonitrilo (70:30) Segunda extraccin: 10 ml(E1) o 3ml(E2) cido actico 10%:acetonitrilo (50:50) Tercera extraccin: 10 ml(E1) o 3ml(E2) cido actico 10%:acetonitrilo (30:70) Los procedimientos en cada extraccin fue el siguiente: 1. treinta segundos a golpe de vortex 2. agitador rotativo durante 10 minutos 3. centrfuga durante 15 minutos a 500g (centrifuga Sorwall instruments RC3C) 4. extraccin del sobrenadante 5. centrifugacin del sobrenadante durante 10 minutos a 300g 6. evaporacin en atmsfera de nitrgeno a 37C 7. evaporacin por vaco a 40C a sequedad.

Al ver que al concentrarse las muestras, se denotaba la formacin de un gel, se decidi aplicar 400 L de etanol absoluto para romper el gel por precipitacin. Luego se lo centrifug en una microcentrfuga, y se llevo a volumen con etanol absoluto, y antes de inyectarlo en el HPLC, a las muestras se las pas por un microfiltro de 0,2 m, con ayuda de la microcentrfuga . (Figura 2) Muestra: 2g(E1); 0,2g(E2)
+ cido actico 10%:acetonitrilo (70:30)

Extracto

Residuo
+ cido actico 10%:acetonitrilo (50:50)

Extracto

Residuo
+ cido actico 10%:acetonitrilo (30:70)

Extracto

Residuo

Evaporacin a sequedad -N2(37C) -Vaco (40C)

Resuspendido con etanol absoluto

Microfiltracin 0,2 m HPLC Figura 2. Diagrama de flujo del procedimiento de extraccin Para evaluar la eficiencia de extraccin de este mtodo se fortificaron muestras con estndares, a una concentracin determinada (0,01 mol/g muestra). Cuantificacin Para determinar los compuestos mencionados inicialmente se utiliz el mtodo por HPLC, cuyo equipo estaba compuesto por una bomba de tipo binaria AGILENT 1200

SERIES, un termostatizador de columna, y la columna es tipo C18 5m (Vydac, 25 x 0,45 cm), y una fase mvil en gradiente de acetonitrilo: actico 10%. La tabla 1 muestra el perfil del gradiente expresado en porcentaje de acetonitrilo en la mezcla de fase mvil. Tabla 1. Tiempo (minutos) 0 5 15 16 18 20 % Me CN (acetonitrilo) 5 5 60 80 80 5

Para detectar cido clorognico y cido cafeico se utiliz la deteccin por medio de absorcin a una longitud de onda de 323 nm, mientras que para detectar los compuestos menos polares, que son la mircetina, la quercetina y el kaempferol, se ha utilizado la deteccin por el mismo mtodo a una longitud de onda de 375 nm. Se realiz una curva de calibracin para cada compuesto (cido clorognico, cido cafeico, mircetina, quercetina y kaempferol) con soluciones patrn de distintas concentraciones de los polifenoles, en el orden de 10-4 a 10-7M . (concentracin versus rea de los picos) Utilizando regresin lineal de las curvas se determinaron las concentraciones en las muestras. RESULTADOS Cuantificacin. A continuacin se tabulan los tiempos de retencin caractersticos de los picos cromatogrficos de patrones. Debido a pequeas variaciones de estabilidad del sistema, se calcularon los promedios de 25 cromatogramas. Tabla 2. Compuesto detectado cido colorognico cido cafeico Miricetina Quercetina Kaempferol Tiempo de retencin 3.865 4,719 11,340 13,029 14,276

D A D 1 A , S ig = 3 7 5 ,8 R e f= o ff ( FL A V O N A \0 9 0 1 1 2 0 0 0 1 2 6 .D ) 13. 123 1 A 1 .5 8 2 re a: 16 4

7 .5 5 2 .5 0 - 2 .5 -5 - 7 .5 - 10 0 5 D A D 1 C , S i g =3 2 3 ,8 R e f =o ff (F L A V O N A \0 9 0 1 1 2 0 0 0 1 2 6 .D ) 4 .0 0 2
79 4 .9 1.1 13 4 9 .4

4
10 15 20 min
87

m AU 15

:2

24

re

10

-5

re

a:

10

re

10

1 4 .3 4 5 A re a: 15 4

.5

.1

24

a:

15

.1

m AU

20

min

Figura 3. Cromatograma perteneciente a una solucin de estndar. 1:cido clorognico 10-5M, 2: cido cafeico 10-5M, 3: mircetina 10-5M, 4: quercetina 10-5M, 5: kaempferol 10-5M. Curvas de calibracin El rango de concentraciones para construir las curvas fueron de 1x10-7 M hasta 1x10-4 M. Las curvas de tipo lineales, en el rango mencionado anteriormente exhiben muy buenas correlaciones, mayores a 0,93 en todos los casos. Los limites de deteccin se pueden determinar considerando: rea(y)=a. Conc.(x)+b Si el rea es igual a cero, la concentracin minima detectable es igual a |b/a|, luego: cido clorognico cido cafeico Miricetina Quercetina Kaempferol Lmites de deteccin (M) 3,87.10-8 2.48.10-7 3,27.10-6 5,47.10-7 4,67.10-7 Coeficiente de correlacin 0,9949 0,9979 0,9310 0,9890 0,9734

A c ido c l o r o g nic o 500 450 400 350 rea del pico 300 250 200 150 100 50 0 0,00E+00 5,00E-06

y = 23011090,2140x + 0,8943 R2 = 0,9949

1,00E-05

1,50E-05

2,00E-05

Concentracin (M)

Figura 4. Curva de calibracin del cido clorognico.

c ido c a f eic o 3000 2500 2000 rea del pico 1500 1000 500 0 0,00E+ 2,00E05 -500 00 y = 24184200,8051x - 6,0014 R2 = 0,9979

4,00E- 6,00E- 8,00E05 05 05 Concentracin (M)

1,00E- 1,20E04 04

Figura 5. Curva de calibracin del cido cafeico.

mir c et in a 3500 3000 2500 rea del pico 2000 1500 1000 500

y = 25834078,8746x - 84,4059 R 2 = 0,9310

0 0,00E+ 2,00E- 4,00E- 6,00E- 8,00E- 1,00E- 1,20E-500 00 05 05 05 05 04 04 Concentracin (M)

Figura 6. Curva de calibracin de la mircetina.

ka empf er o l 3500 3000 2500 rea del pico 2000 1500 1000 500 0 0,00E+ 2,00E- 4,00E- 6,00E- 8,00E- 1,00E- 1,20E00 05 05 05 05 04 04 Concentracin (M ) y = 24064033,4886x + 13,1715 R2 = 0,9734

Figura 7. Curva de calibracin del kaempferol.

q uer c et ina 3500 3000 2500 rea del pico 2000 1500 1000 500

y = 31380541,2396x - 14,6760 R2 = 0,9890

0 0,00E+ 2,00E- 4,00E- 6,00E- 8,00E- 1,00E- 1,20E-500 00 05 05 05 05 04 04 Concnetracin (M )

Figura 8. Curva de calibracin de la quercetina. Tcnica extractiva Se calcul el porcentaje de recuperacin de los compuestos analizados, para comprobar la eficiencia de la extraccin. En el primer experimento (E1), donde se parta de 2g de muestra, la eficiencia de la extraccin arroj los siguientes resultados: Tabla 3. Porcentaje de recuperacin para 2g de muestra. Compuestos Porcentaje de recuperacin (%) cido clorognico 77,57 cido cafico 14,34 Mircetina 7,60 Quercetina -3,30 Kaempferol 4,04 En este primer experimento, el usar 2 gramos result mucha cantidad de muestra lo cual produjo un problema en la extraccin. Esta complicacin sucedi en el paso de la evaporacin por vaco, se observo que cerca de la extraccin a sequedad se formaba un gel. Este efecto se observ en todas las muestras, siendo de mayor importancia en las muestras que contenan fracciones ricas en fibras. Para solucionarlo, se busc precipitar el gel por medio del agregado de etanol absoluto, lo cual fue efectivo. Adems se observ que el proceso de evaporacin demor mucho tiempo, sobretodo la muestra que era de semilla. Como sabemos la semilla tiene aceites, que pudo quedar interfiriendo en la extraccin del sobrenadante luego de la centrifugacin, quedando en el proceso de evaporacin. Esto complic mucho ms a la muestra de semillas que a las dems muestras.

En cambio en el experimento segundo, con 0,2 gramos de muestra, se obtuvo lo siguiente: Tabla 4. Porcentaje de recuperacin para 0,2g de muestra. Compuestos Porcentaje de recuperacin (%) cido clorognico 66,03 cido cafico 59,52 Mircetina 38,40 Quercetina 30,37 Kaempferol 47,73 Si bien disminuy el porcentaje de recuperacin del cido clorognico, se logr mejorar la eficiencia de extraccin de los dems compuestos. Adems en este experimento fue mucho ms fcil el manejo de las muestras, ya que la menor cantidad de muestra, requera menor cantidad de extractante, y por lo tanto requiri menor tiempo de evaporacin.

Resultados de las muestras Las muestras no fortificadas contenan las siguientes concentraciones de polifenoles.

D A D 1 A , S ig = 3 7 5 ,8 R e f= o ff ( FL A V O N A \0 9 0 1 1 2 0 0 0 1 2 0 .D ) 1 1 .7 9 1
9 .7

mAU 10 7 .5 5 2 .5 0 - 2 .5 -5 - 7 .5 - 10 0 2 .5 5 D A D 1 C , S i g = 3 2 3 ,8 R e f =o ff (F L A V O N A \0 9 0 1 1 2 0 0 0 1 2 0 .D ) mAU 160 140 120 100 80 60 40 20 0 7 .5

re

62

a:

21

1 A 3 .4 6 8 re a: 1 5. 43 4 1 A 4 .5 1 1 2 re a :9 .6 3 23 2

10

1 2 .5

15

1 7 .5

20

22. 5

min

2
3 A .7 2 4 re a: 2 53 .9 4 5 A .7 1 1 1 re a: 10 5. 78 7

2 .5

7 .5

10

1 2 .5

15

1 7 .5

20

22. 5

min

Figura 9. Cromatograma perteneciente a una muestra de semilla. 1:cido clorognico, 2: cido cafeico, 3: mircetina, 4: quercetina, 5: kaempferol.

Experimento 1: Valores obtenidos por cuantificacin de 2g las muestras. (n/d= no detectable)

valores muestras ( mol/g) semilla chia Harina FRF fino harina clorognico cafeico mircetina quercetina kaempferol n/d 0,033722592 0,719563745 0,000910469 0,004439814 0,007640432 0,086708535 1,081015519 0,000581447 0,014439814 0,02362883 0,067286796 0,770432725 0,001145664 0,041041542 0,006844456 0,107331155 0,921189207 0,001057824 0,049159762

Experimento 2: Valores obtenidos por cuantificacin de 0,2g las muestras. (n/d= no detectable)
valores muestras ( mol/g) semilla chia Harina FRF fino harina clorognico cafeico mircetina quercetina kaempferol 0,05921319 0,01303115 0,0745693 0,004330762n/d 0,0285479 0,07835476 0,27894266 0,035911351n/d 0,09014461 0,06707413 0,25967166 0,040144776n/d 0,01225717 0,04205074 0,31081981 0,016606065n/d

CONCLUSIONES Y DISCUSIN Esta tcnica de cuantificacin, mediante una cromatografa lquida de alta eficiencia y en las condiciones mencionadas en el trabajo, result eficiente: los picos en el sistema cromatogrfico son detectables, utiliza un corto tiempo operativo del equipo y detecta concentraciones muy bajas. En particular, en cuanto a los lmites de deteccin, la miricetina resulta ser el compuesto que tiene el limite de deteccin ms alto. Esto podra deberse a que su tiempo de retencin, es prximo al comienzo del gradiente, y la composicin de la fase mvil no es siempre constante en esa zona de la cromatografa. Esto dificulta a la hora de identificar el pico en las muestras, como en su integracin. En cuanto a la tcnica extractiva, el segundo experimento (E2) result mejor, ya que los porcentajes de recuperacin son mayores, el manejo de menor cantidad de muestra minimiz la formacin de geles, acort el tiempo de evaporacin, y ahorr muestra. Ms an, en el primer experimento (E1), con mayor cantidad de muestra, hubo que utilizar mayor cantidad de extractante para semilla, pues inicialmente sta absorbe una cierta cantidad obtenindose una pasta hmeda, que luego no se poda mezclar ni centrifugar. En cambio, en el experimento 2 se trabaja con menor cantidad de muestra, y por ende con menor cantidad de solventes de extraccin, y se puede separar ms eficientemente. En E2, se lograron porcentajes de recuperacin ms altos y dentro de un mismo rango para todos los compuestos, tanto para los polares como para los no polares. En el proceso de evaporacin a sequedad, surgi un problema: la formacin de gel. Fue solucionado de forma sencilla, por precipitacin con etanol. Las fracciones ricas en fibras fueron las que mostraron mayor tendencia a la formacin de gel, por lo que es posible que este efecto se deba a la fibra soluble presente en la semilla de cha y derivados, formando una red tridimensional que ocluye agua. La muestra de semilla, adems, de la formacin de gel, tuvo una complicacin adicional por contener aceites. Se dificult la extraccin del sobrenadante luego de la centrifugacin, ya que siempre quedaba una porcin lipidica, que por ms mnima que fuera, dificultaba el proceso de evaporacin. En cuanto a los resultados de las muestras, a continuacin se muestran grficos que facilitaran la comprensin de las mismas:

Experimento 1 (E1)

1,2 1 0,8 Concentracin 0,6 (mol/g) 0,4 0,2 0 clorognico cafeico mircetina Compuestos quercetina kaempferol semilla chia harina FRF fino harina

Figura 10. Grfico de resultados del experimento con 2 g de muestra.

Experimento 2 (E2)

1,2 1 0,8 Concentracin 0,6 ( mol/g) 0,4 0,2 0 clorognico cafeico mircetina Compuestos quercetina kaempferol semilla chia harina FRF fino harina

Figura 11. Grfico de resultados del experimento con 0,2 g de muestra.

En ambos experimentos los valores encontrados para todos los compuestos, entran en el mismo orden de concentracin, a excepcin de la mircetina. Lo que podemos observar es que tanto en el experimento 1 como en el experimento 2, la miricetina da valores muy elevados y valores muy distintos entre ellos, por lo tanto no esperados para este tipo de muestras. Esto puede ser debido a que en el pico donde se encontraba el tiempo de retencin de este compuesto, haya otro compuesto que interfiera. En el experimento 2, debido a que se trabaja con menos masa, es tambin de esperar que las interferencias sean menores. En todas la muestras analizadas las concentraciones del cido clorognico son mayores en el experimento 2 que en el 1. Esto podra deberse a que las dificultades en el E1 llevaron a aumentar la temperatura y prolongar el tiempo de evaporacin. Esto pudo producir un efecto degradacin del cido clorognico a cafeico por hidrlisis. En la semilla los polifenoles estudiados, se encuentran en menor proporcin con respecto a los productos procesados: harina, FRF y fino de harina. Esto es lgico ya que en la semilla se encuentran diluidos, con otros componentes, por ejemplo: aceites, que contribuyen a la masa total de la semilla. En ambos experimentos, la muestra que tiene mayor concentracin de cido clorognico es la fraccin rica en fibra (FRF), esto es debido a que ste cido, como los azcares (fibra soluble) que se encuentran en esta fraccin, son compuestos con cierta polaridad. El cido clorognico es el ms hidrosoluble de los antioxidantes analizados, lo que se correlaciona con el hecho de que tiene el tiempo de retencin ms corto (3,8 min). En cuanto a los antioxidantes con menor polaridad, es decir con ms afinidad a los aceites, se puede decir que se encuentran en menor cantidad que el cido clorognico y el cido cafeico, en harina, FRF y Fino de harina. Exceptuamos de este anlisis a la miricetina, que en el ensayo dio valores aberrantes en ambos experimentos. Es posible que en el aceite (no analizado en este trabajo), la quercetina y el kaempferol se encuentren en mayor proporcin por su afinidad. Dentro de los objetivos planteados para este trabajo, se determinaron compuestos polifenlicos y derivados del cido cinmico en semilla y fracciones del procesamiento de la harina de cha, si bien quedan por resolverse la interferencia de la mircetina como la interconversin del cido clorognico a cafico por accin de la hidrlisis.

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