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N5 MICROPROPAGACION DE 0RQUIDEAS.

I.-ANTECEDENTES HISTORICOS. Hardley ( 19829) lleg a la conclusin que las orqudeas obtenian los hidratos de carbono de los hongos. Pero est lejos de la realidad. Sin embargo se ha comprobado que las orqudeas reciben a veces aminocidos ( glutamina, cido glutmico, cido asprtico y cido nicotnico) provenientes del hongo. (Hyner y Arditti 1973). Knudson ( 1922), demostr que era posible la germinacin sobre un medio simple que contuviera minerales y azcartes, sin la presencia de hongos. La investigacin desarrollada por Knudson (1922) supuso una conmocin en el mundo de las orqudeas, al demostrar que las semillas de Cattleya, Epidendrum y otras orqudeas eran capaces de germinar asimbiticamente in vitro. A pesar del descubrimiento de Knudson, se comprob que no siempre es posible hacer un medio en el que una determinada especie de orqudea pueda germinar y desarrollar..Se han descrito muchos medios nutritivos, para muchos gneros y especies diferentes (Arditti,1967, 1982, Arditti y Ernst, 1982 y Fast, 1980). Razones por las que no puede germinar: 1.-Las semillas de orqudea son muy pequeas y alimenticia. 2.-La germinacin y el subsiguiente desarrollo de la plntula, dependen en la naturaleza de la relacin simbitica con un hongo, sin embargo, en in vitro es posible sustituir la accin del hongo por un medio nutritivo, a esta germinacin se denomina asimbitica. 3.-La siembra in vitro permite germinar embriones inmanduros de orqudea, disminuyendo su ciclo de mejora. 4.-La germinacin y el desarrollo es ms eficiente en in vitro, ya que se realiza en un ambiente acondicionado, y sin competencia con hongos y bacterias. contienen poco o nada de reserva

II.- DESCRIPCION DE LAS ORQUIDEAS2.1.-LAS CARACTERISTICAS ANATOMICAS DE LAS SEMILLAS. Las semillas de orqudeas son muy pequeas, 1-2mm de largo y 0.5-1mm de ancho.. Se producen en cantidades elevadas por cpsula : 1300 -4 000 000. Las semillas constan de una testa gruesa, que encierra un embrin de alrededor de 200 clulas.La cubierta tiene un aspecto exterior caracterstico, en forma de red, que es diferente para cada especie.La testa est formada por un tejido muerto, compuesto hasta en un 96% de aire, de tal forma que cada semilla puede ser considerada como un autntico globo. El embrin tiene una forma redondeada o esfrica. La mayor parte de las semillas de orqudeas estn escasamente diferenciadas: No se distinguen cotiledones ni races y carecen de endospermo. En el extremo distal del embrin existe un punto de crecimiento potencial, no identificable en el estado de semilla. 2.2.-LA GERMINACION DE LAS SEMILLAS. La germinacin de las semillas de orqudeas, segn Arditti (1967), Harley (1969) y Pierik ( 1982) se puede describir de la siguiente forma: El embrin absorbe agua a travs de la testa, aumentando de volumen. Despus se inicia la divisin celular, rompiendo el embrin la cubierta seminal. A continuacin se forma una estructura de tipo protocormo, a partir del agregado de clulas, y sobre aquel se puede distinguir un meristemo del vstago. Luego se diferencia los rganos ( meristemo del vstago en un lado y rizoides en el opuesto), comienza un perodo de crecimiento intenso. Si el protocormo est expuesto a la luz, adquiere el color verde y al mismo tiempo se desarrolla hojas.Como resultado de la formacin de la clorofila de planta se hace auttrofo. Luego se forman las races verdaderas en forma endgena. Posteriormente el protocormo y los rizoides pierden su misin nutritiva y desaparecen.

2.3.-METODOS DE LA PRUEBA DE LA VIABILIDAD. Sing (19819) demostr que el test del tetrazolio ( los embriones viables se tien de rojo, mientras que los no viables quedan blancos), puede ser utilizado para determinar la viabilidad de las semillas de orqudeas tropicales epfitas. Van Waes y Debergh (1986) han demostrado que el mtodo Sing no puede ser aplicado a las orqudeas del oeste de Europa, cuya viabilidad se determina bajo tres etapas: 1.-Preparacin de la semilla en una solucin al 5% de Ca (0Cl)2 ms 1% tween 80. 2.-Inmersin en agua estril durante 24 horas. 3.-Aplicacin, al final, la prueba clsico del tetrazolio.

Se aconseja almacenar las semillas maduras a 5C ( Fast 1980). Lucke (1971) afirm que, en principio, las semillas de orqudea se pueden sembrar cuando la semilla se encuentra en el estado intermedio entre la fertilizacin y la maduracin de la cpsula.El mismo recomienda que las semillas no se deben sembrar in vitro, antes de que la cpsula haya llegado a los dos tercios de su madurez.En la tabla que se da a continuacin (Lucke 1971) se indican los perodos de tiempo entre la fertilizacin y la madurez. Calanthe Cattleya Coelogyne Dendrobium Epidendrum Miltonia Phalaenopsisi 4 meses 11 meses 13 meses 12 meses 4 meses 9 meses. 6 meses.

Odontoglossum 7 meses

2.4.-ESTERILIZACION. La esterilizacin se realiza de dos formas: 1.-CAPSULAS CERRADAS.-En este caso la esterilizacin es muy simple:

Se baa la cpsula en alcohol de 96% y posteriormente se flamea. La cpsula que contiene las semills, que generalmente est estril en su interior, luego se abre con una escapel estril. 2.-CAPSULAS ABIERTAS.- La esterilizacin de las semillas individuales constituye un proceso ms delicado y complejo.Se colocan las semillas en un pequeo matrz conteniendo leja al 10% t Tween 20 en una proporcin de 2-5 % (v/v).La esterilizacin se realiza durante 5-10 minutos. Las semillas viables se hunden en la leja, mientras los que flotan, no contienen embrin.Despus de la fertilizacin el lquido es retirado, bien por vertido, o con la ayuda de una pipeta, posteriormente se aclaran las semillas con agua esterilizada. 2.5.-LA SIEMBRA. La siembra se realiza generalmente sobre un medio nutritivo slido con una cierta pendiente.Se utiliza una esptula aguja de siembra para distribuir las semillas de forma uniforme sobre el medio, tambin se pueden suspender las semillas en agua estril y hacer la siembra por medio de una gota (Arditti,1982). Las semillas se siembra sobre el agar. La densidad a la que se siembran dependen de la proporcin de las semillas viables y tambin de la especie de orqudea de que se trate. Smith (1975) afirm que la cubierta seminal no tiene efecto inhibidor sobre la germinacin. Sin embargo, Van Der Kinderen (1982) indica que la germinacin de algunas orqudeas, es influida por la concentracin de ABA de las semillas: De manera que si la concentracin de ABA es alto, la germinacin es baja. Para ser trasplantado al suelo, es necesario repicar las plntulas de orqudeas dos a tres veces. El medio en el que se repican es generalmente diferente de la siembra. El tiempo que las orqudeas permanecen en el tubo es muy variable : entre 6 meses y 2 aos. El repicado es necesario, sino se realiza las plantas llegan a estar demasiado apretados y el crecimiento es lento. Las orqudeas in vitro se refieren en grupos, ya que las semillas crecen as mejor que cuando estn aislados. Cuando las orqudeas se trasplantan al suelo, generalmente se llevan en macetas madre.

2.6.-FACTORES QUE AFECTAN A LA GERMINACION Y AL CRECIMIENTO. Los factores complejos que influyen la germnacin y el crecimiento de orqudeas, adems dependen en gran medida de la especie.Esta informacin se ha recopilado con la ayuda de los siguientes artculos: Arditti (1967,1977,1982), Arditti y Ernst (1982), Fast (1980) Hadley (1975, 1982), Harley (1969) , Rao (1977), Thomale (1957) y Zimmer (1980). Las Revistas American orchid Society bulletin, die orquidae. 1.-La temperatura.-Las semillas germinan a 20- 25C. 2.-LUZ.- La duracin del da es de 12-16 horas ( tubos fluorescentes) se aconseja una irradiacin baja de 2.5-10 w/m2. 3.-AGAR.-La concentracin recomendada es de 0.6 - 0.8 % (Bacto-Agar-Difco). 4.-MINERALES.-Se recomienda utilizar un medio que contenga micro-macronutrientes. Las orqudeas generalmente necesitan Fe para germinar y es muy probable que necesite Mn. Las orqudeas terrestres requieren un medio, pobre en sales, mientras las epfitas necesitan un medio ms rico en sales. 5.-AZUCAR.-Es importante como fuente de energa, especialmente para las semillas que germinan en la oscuridad. Por lo general se emplea Sacarosa, a veces se utiliza una mezcla de glucosa y fructosa. 6.-EL pH debe situarse entre 4.8-5.8 . Un pH ms bajo de 4 o ms alto de 7 resulta muy desfavorable. 7.-VITAMINAS.-Es necesario aadir las siguientes vitaminas : biotina, cido Nicotnico, vitamina C, piridoxina, cido pantotnico. 8.-LOS REGULADORES.- Generalmente no son necesarios para la germinacin de las semillas y su presencia puede producir efectos no deseados ( Formacin de callos , de las plntulas de endrobium, Cattleya y otros. 9.-MEZCLAS COMPLEJAS.- Se utiliza el homogenizado de pltano, Leche de coco, peptona, triptona, Levadura de fermentacin, Hidrolizado de casena, jugo de pia, jugo de tomate y extracto de patata.Los efectos estimuladores de estas mezclas se explica por su contenido en vitaminas y aminocidos. o vstago Adventicio) . Concentraciones bajas de IBA y NAA, a veces estimulan el crecimiento

III.- OBJETIVOS.

IV.-MATERIALES Y METODOS, A.- MATERIALES. a.-MATERIALES VEGETALES. Semillas provenientes de cpsulas dehiscentes. Brotes vegetativos de 5-15 cm de longitud. Frutos inmaduros (cpsulas). b.-REACTIVOS Y OTROS. -Sales Nutritivas Bsicas del medio de cultivo Murashige Skoag (1962). -Medio Knudson C (1946) -Agar -Gel-Rite. -Sucrosa -Tiamina -Carbn activado -Kinetina -Alcohol etilico al 96% -Hipoclorito de calcio -Hipoclorito de sodio al 10% -Teween 20 -Trifenil tetrazolium -Tubos de ensayo -Tapones de tubos -Macetas de plsticos y arcilla. -Carbn vegetal -Polipropileno. -Musgo

METODOS. Se aplican las tcnicas de cultivo in vitro en la propagacin de las especies de orqudeas, a partir de semillas (Arditti, 1982) y de yemas (Marel,1984) de la siguiente manera. 1.-SIEMBRA DE SEMILLAS PROVENIENTES DE CAPSULA DEHISCENTE. Para su esterilizacin las semillas pueden colocarse en un pequeo sobre de papel de filtro bien cerrado, a fin de evitar que se pierdan las semillas durante el enjuague. Se utiliza el Hipoclorito de calcio sodio al 2%, durante 15-25 minutos. Pasado este tiempo el sobre es trasladado a agua destilada estril para el enjuague. Luego se procede a sembrar las semillas en condiciones aspticas en el medio basal de Muraashige y Skoog (1962), suplementado con 0.4mg/L de Tiamina, 0.5mg/L de Acido nicotnico, 2g/L de Carbn activado, 2g/L de Gel-Rite o 8g/L de Agar y 20g/L sucrosa, y en el medio Knudson C suplementado en 20 g/L de sucrosa, 2g/L de Carbn activado, 2g/L de Gel-Rite o 8g/L de Agar ,( Len Fernndez Marco 1995). 2.-PROPAGACI0N POR YEMAS DE BROTES VEGETATIVOS. Se colectaron brotes vegetativos de Cattleya Mxima y Cattleya Rex en pleno crecimiento de 5 a 15 cm de longitud, mediante el corte en la parte basal. Se eliminaron los restos de tejidos muerto que podra ser fuente de contaminacin.Los brotes fueron lavados con una escobilla suave, agua y detergente para luego ser sumergido por unos segundos en alcohol al 75 %. Se hicieron dos esterilizaciones superficiales.En la primera esterilizacin los brotes fueron sumergidos por 20 minutos en una solucin de Hipoclorito de sodio al 4% a la cual se agreg Tween -20 (2 gotas/100ml). Pasado este tiempo el brote se ubica en una placa petri estril y se eliminan las hojas envolventes descubriendo las yemas. Se realiza la segunda esterilizacin de los brotes sumergidos por 10 minutos en una solucin de Hipoclorito de sodio al 2% a la cual se agreg 2 gotas /l00 ml de tween 20. Se enjuaga con agua destilada estril y se ubican en placa estril .(Tesis, Len Fenndez, 1995). El aislamiento de las yemas de brote vegetativo se realiza mediante cortes laterales a las yemas expuestas. Los explantes sembraron en medio basal de Murashije y Skoog (1962).

ACLIMATACION DE LAS ORQUIDEAS. Luego del segundo replante,, cuando las plantas desarrollaron varias hojas y un buen sistema radicular, fueron extrados de los frascos y sometidos al proceso de aclimatacin. 1.-PREPARACION DEL SUSTRATO. El sustrato en el que se sembraron las plntulas fue una mezcla de musgo y pequeos trozos de carbn 3 partes de musgo: 1 parte de carbn) que permite una buena retencin de humedad y a la vez un buena ventilacin de las races. Este sustrato fue esterilizado en una estufa a 80C por 6 horas. 2.-PREPARACION DE LAS PLANTULAS. Las plantas fueron retiradas de los frascos limpiados y lavados eliminando el agar adherida a las raices. Se eliminan las races delgadas que podra ser una va de infeccin para la plntula. Se seleccionaron plntulas por tamaos: Grandes, medianos y pequeos. 3,-SIEMBRA. Se sembr por grupos en macetas comunitarios cuyo tercio inferiior fue llenado con pedazos pequeos de polipropileno y dos tercios superior rstante con el sustrato estril (Wright-Tippit, 1994). (Tesis Len Fernndez, 1995). Luego de ser sembrados las plntulas se trasfieren a la cmara de Aclimatacin que esta condiocionado para proporcionar una alta humedad y evitar su deshidratacin.

V.- BIBLIOGRAFIA. 1.-ALEX D. HAWKES . Encyclopaedia of cultivated Orchids. 2.-H.T Hartmann, D.E Kester.F.T. davies. 1997. Plant Propagation Principles and Practices- 6ta Edicin. 3.-PIERIK R.L.M. 1989. Cultivo in vitro de las plantas superiores. 4.-LEON MARTINEZ, Marco A. TESIS. CONSERVACION DE ESPECIES PERUANAS DE ORQUIDEAS UTILIZANDO TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS IN VITRO - 1995. 5.-MICROPROPAGACION. http:/grffin.rbgkew.org.uk/microprop. Royal Botanic Gardens, Kew: Information sheets:

6.-THE Many Dimensions of Plant Tissue Culture Research.. http:/aggie-horticulture.tamu.edu/tissult/pltissue/pltissue