INSTITUTO TECNOLOGICO DE ACAPULCO

INGENIERA QUMICA Y BIOQUMICA EN ALIMENTOS

MICROBIOLOGA GENERAL

PRCTICA I
PREPARACION, FIJACION Y COLORACION SIMPLE DE FROTIS INTEGRANTES DEL EQUIPO 5: JUREZ PREZ ALEJANDRA MACARENA LORENZO SANTIAGO MIGUEL ANGEL MONTES HUICOHEA LAURA NELY RTIZ CATALN VELIN PROFESOR: M.C. MIGUEL NGEL DAZ ALDAY

FECHA DE REALIZACIN: 8 DE SEPTIEMBRE DEL 2009 FECHA DE ENTREGA: 15 DE SEPTIEMBRE DEL 2009

INDICE CAPITULO I Pgs Introduccin Planteamiento del problema Justificacin Objetivo. General Objetivo particular 3 5 5 5 5

CAPITULO II Materiales Mtodos Equipos Reactivos Procedimiento 6 6 6 6 7

CAPITULO III Resultados 18

CAPITULO IV Discusin de Resultados Conclusiones 22 22

CAPITULO V Bibliografa Cuestionario

ANEXOS 1. Partes del microoscopio y su funcin 2. Preparacin de colorantes 3. Morfologa bacteriana

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CAPITULO I INTRODUCCIN El microscopio es indispensable en el Laboratorio de Microbiologa para el estudio de la morfologa y estructura de los microorganismos, as como su reaccin a diferentes colorantes, lo cual permitir la identificacin de estos. Por lo que es importante conocer su adecuado manejo. Antonio van Leeuwenhoek, en 1676, fue el primero en observar bacterias y protozoarios en agua de lluvia, en infusiones diversas y en su sarro dental. La mxima amplificacin que logr Leeuwenhoek en los diversos microscopios que construy fue de 300 dimetros. La perfeccin del microscopio compuesto facilita el estudio de la morfologa de microorganismos y de algunas estructuras de la clula bacteriana. MICROSCOPIO PTICO Se usa para aumentar el tamao de la imagen aparente de los objetos, lo cual permite observar los detalles estructurales de los microorganismos. El microscopio ptico normal que se usa para observar bacterias y otros organismos celulares es un microscopio compuesto, el cual est provisto de una fuente luminosa, una lente condensadora de luz que la dirige hacia el objeto a observar y dos juegos de lentes que ayudan a la amplificacin de la imagen. A travs de la refraccin o reflexin de los rayos luminosos mediante el sistema de lentes del microscopio, se forma la imagen del objeto, que es ms grande que el objeto mismo, permitiendo el examen de sus estructuras en detalle. AMPLIFICACIN La capacidad amplificadora de un microscopio compuesto es el producto del aumento individual de los oculares y los lentes objetivos. Un microscopio tpico que se usa en bacteriologa tiene objetivos con poder de resolucin de 10X, 40X y 100X y oculares de 10X, por lo cual es capaz de amplificar la imagen de la muestra 100, 400 y 1000 veces. PODER DE RESOLUCIN La resolucin se define como el espacio de mxima aproximacin entre dos puntos en el que an se pueden observar como dos entidades independientes. El poder de resolucin de un microscopio est sujeto a la longitud de onda de la luz y a la propiedad de las lentes conocidas como la apertura numrica (AN). A menor longitud de onda de la luz y AN de las lentes, ser mejor el poder de resolucin del microscopio. APERTURA NUMERICA Esta expresin, que suele abreviarse AN, indica la cantidad de luz que entra en un objetivo desde un punto del campo del microscopio. Este valor es de suma importancia, ya que de l depende el Poder de resolucin. PARTES DEL MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO Sistema mecnico Soporte: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
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Platina: Lugar donde se deposita la preparacin. Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular. Revlver: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. Tornillos de enfoque: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico que consigue el enfoque correcto. Sistema ptico Ocular: Lente situado cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo. Objetivo: Lente situado cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta. Condensador: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin. Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. Foco: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador. TINCIN Es un procedimiento para teir bacterias; permite observar coloreadas las bacterias que normalmente no sera visibles al microscopio ptico por se transparentes. Las tinciones se efectan generalmente sobre bacterias desecadas y calentadas para coagular sus protenas (fijacin). Todas las tcnicas de tincin exigen una preparacin previa del frotis antes de proceder a la tincin en s. Los pasos a seguir son: Extensin: consiste en formar una fina pelcula de la muestra sobre un portaobjetos limpio y desengrasado. La muestra debe ocupar aproximadamente una superficie de 1cm3. Desecacin: siempre debe realizarse al aire. Puede favorecerse colocando el frotis bajo una lmpara o sobre el calor suave de la llama de un mechero. Fijacin: esta operacin pretende que los microorganismos se adhieran al portaobjetos por coagulacin de sus protenas plasmticas mediante calor. Se realiza pasando el portaobjetos por la llama de un mechero dos o tres veces, evitando el calentamiento excesivo.

TINCIN SIMPLE Se realiza utilizando un solo colorante. Se suele emplear cualquier colorante bsico, preferiblemente azul de metileno o fuchina, dejndolo actuar durante un tiempo variable, y eliminando el exceso por lavado. Una vez seca la preparacin se visualiza al microscopio. Este tipo de tincin ofrece orientacin sobre la presencia, concentracin morfologa y modo de agrupacin bacteriana.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

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La manipulacin del material de laboratorio es fundamental para la realizacin de una prctica y el xito de la misma pero el alumno debe conocer el material y formarlo parte de su vida laboral y poder a si lograr que el puede elegir correctamente el material a utilizar es por eso que la practica est enfocada en la manipulacin de un material fundamental para la microbiologa y este es el microscopio. Es importante saber su procedimiento de las tinciones, ya que nosotros como alumnos en este campo es indispensable saber acerca de ello y que hay bacterias que necesitan diferente tipo de tincin y es necesario que sepan cual le corresponde a cada una para as, al realizar sus practicas puedan identificar mejor a los microorganismos existentes en sus muestras. JUSTIFICACIN Esta prctica se realiza con el fin de que el alumno se utilice el microscopio a si como tambin conozca la aplicacin de la tincin simple y el tipo de muestra se debe trabajar y elegir la metodologa correcta para conocer el tipo de microorganismo que se buscan. OBJETIVO GENERAL Que el alumno conozca la manipulacin del microscopio. Conocer los diferentes tipos de tinciones que existen y saber para que se utilizan y su debido procedimiento, para as tener un mejor resultado en las muestras y poder observar en el microscopio. OBJETIVO ESPECIFICO Conocer los diferentes enfoques que el microscopio tiene y Aprender a identificar, de acuerdo al tipo de coloracin, de su forma y de su estructura que tipos de microorganismos son los que estn presentes en nuestra muestra al observarlos al microscopio. Conocer que hay bacterias que son muy resistentes y esto se debe a las esporas, por eso es de suma importancia saber que hay microorganismos diferentes unos con otros.

CAPITULO II
MATERIAL Portaobjetos y aplicadores Asa de platino Cristalizador Pinzas portaobjetos Mechero de Bunsen Aceite de inmersin Algodn Gasas estriles Guantes de ltex Cubre boca

REACTIVOS Azul de metileno Solucin salina

MUESTRAS Heces fecales (beb). Exudado farngeo. Tbicos. Yogurt.

METODO TINCIN SIMPLE Se realiza utilizando un solo colorante. Se suele emplear cualquier colorante bsico, preferiblemente azul de metileno o fuchina, dejndolo actuar durante un tiempo variable, y eliminando el exceso por lavado. Una vez seca la preparacin se visualiza al microscopio. Este tipo de tincin ofrece orientacin sobre la presencia, concentracin morfologa y modo de agrupacin bacteriana. EQUIPO Microscopio

PROCEDIMIENTO 1.- Antes de iniciar con las tinciones el maestro dio las instrucciones de cmo realizar la prctica para que no hubiese confusiones al momento de realizarse. Comenz con unos diagramas en el pizarrn para que todos entendiramos de qu se trataba el procedimiento y que finalidad tena el que hiciramos esta prctica. 2.- Lo primero que hicimos fue buscar el material y ordenarlo de manera que lo tuviramos al alcance para que se nos facilitara el manejo del mismo. 3.- Prendimos una torunda con alcohol tomndola con una pinza para portaobjetos ya que no podamos utilizar el mechero por que no haba suministro de gas, mas sin embrago esto no afecto en el resultado

4.- Comenzamos la prctica limpiando los portaobjetos con gasas y un poco de agua destilada y alcohol para evitar que intervinieran factores externos como lo es el talco de los guantes, polvo o fibras en caso de que limpiramos con algodn por esta razn se prefiere que sean gasas.

5.- Se rotulan los portaobjetos y las muestras con lpiz graso para evitar equivocaciones al momento de teir. Despus le agregamos tres gotas de solucin salina de diferentes tamaos al portaobjeto que es donde posteriormente aremos nuestras disoluciones.

6.- Comenzamos con la muestra de copro. Lo primero que hicimos fue esterilizar el asa de platino antes de tomar la muestra, la esterilizacin se realiza introduciendo la punta del asa a la flama del mechero hasta que esta se ponga de color rojo, el color es el que indica que ya se encuentra estril.

7.- Abrimos el frasco y tomamos la muestra con ayuda del asa, y diluimos la muestra en la gota de solucin salina hasta que quedara completamente uniforme la solucin.

8.-Volvimos a esterilizar el asa, enfriamos en la segunda gota y tomamos muestra de la primera que ya esta diluida con copro y comenzamos hacer otra disolucin.

9.- Volvimos a esterilizar el asa, enfriamos en la tercera gota y tomamos muestra de la segunda que ya esta diluida con copro y comenzamos hacer la ultima disolucin.

10.- Dejamos enfriar a temperatura ambiente, despus sellamos cortando la flama de 2-3 veces, esto con el fin de que se impregne bien la muestra en el portaobjetos.

11.- Llevamos el portaobjetos a los vertederos donde los impregnaremos de azul de metileno donde los dejamos por 15 minutos aproximadamente, esto con el fin de que se tian los microorganismos para despus observarlos en el microscopio.

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12.- Despus del lapso de tiempo se lavan con agua destilada, y se dejan secar a temperatura ambiente.

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 PARA LA TINCIN DEL FROTIS DE EXUDADO FARINGEO SE TOM LA MUESTRA DE UN INTEGRANTE DEL EQUIPO. 1.- Lo primero que hicimos fue tomar la muestra con un hisopo estril, la muestra se toma cerca de la garganta haciendo movimientos circulares para poder tomar lo ms que se pueda de muestra.

2.- Esterilizamos el asa de platino antes de tomar la muestra. Diluimos la muestra en la gota de solucin salina hasta que quedara completamente uniforme la solucin.

3.- Volvimos a esterilizar el asa, enfriamos en la segunda gota y tomamos muestra de la primera que ya esta diluida con exudado faringeo y comenzamos hacer otra disolucin.

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4.- Volvimos a esterilizar el asa, enfriamos en la tercera gota y tomamos muestra de la segunda que ya esta diluida con exudado faringeo y comenzamos hacer la ultima disolucin.

5.- Dejamos enfriar a temperatura ambiente, despus sellamos cortando la flama de 2-3 veces, esto con el fin de que se impregne bien la muestra en el cubreobjetos.

6.- Llevamos el portaobjeto a los vertederos donde los impregnaremos de azul de metileno donde los dejamos por 15 minutos aproximadamente, esto con el fin de que se tian los microorganismos para despus observarlos en el microscopio.

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7.- Despus del lapso de tiempo se lavan con agua destilada, y se dejan secar a temperatura ambiente.

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 PARA LA TINCIN DEL FROTIS DEL YOGURT UTILIZAMOS YOGURT NATURAL.

1.- Esterilizamos el asa de platino antes de tomar la muestra. Diluimos la muestra en la gota de solucin salina hasta que quedara completamente uniforme la solucin.

2.- Volvimos a esterilizar el asa, enfriamos en la segunda gota y tomamos muestra de la primera que ya esta diluida con yogurth y comenzamos hacer otra disolucin.

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3.- Volvimos a esterilizar el asa, enfriamos en la tercera gota y tomamos muestra de la segunda que ya esta diluida con yogurth y comenzamos hacer la ultima disolucin.

4.- Dejamos enfriar a temperatura ambiente, despus sellamos cortando la flama de 2-3 veces, esto con el fin de que se impregne bien la muestra en el portaobjetos.

5.- Llevamos el cubreobjeto a los vertederos donde los impregnaremos de azul de metileno donde los dejamos por 15 minutos aproximadamente, esto con el fin de que se tian los microorganismos para despus observarlos en el microscopio.

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6.- Despus del lapso de tiempo se lavan con agua destilada, y se dejan secar a temperatura ambiente.

CAPTULO III
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RESULTADO MUESTRA DE COPRO DE BEBE.

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

En el estudio del frotis de copro encontramos Staphylococcus aureus como primera instancia, lo identificamos por sus caractersticas que son: Clulas esfricas gram positivas, que suelen estar distribuidas en grupos irregulares a manera de racimo de uvas.
STREPTOCOCCUS FAECALIS

Cocos gram positivos que se observan en parejas o en cadenas cortas. Son anaerobios facultativos. Forman parte de la flora normal, aunque suelen ser responsables de infecciones. Pueden crecer en un intervalo de temperatura de 10 a 45C. Sobreviven al medio ambiente durante un largo periodo, aun en condiciones adversas.
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 EXUDADO FARINGEO.

El exudado faringeo es un estudio en el que se buscan especies bacterianas asociadas a infecciones del tracto respiratorio superior (orofaringe), principalmente estreptococcos betahemolticos ya que son los de mayor importancia. En este estudio encontramos Streptococcus pneumoniae y Streptococcus mutans . STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE: Es un microorganismo patgeno capaz de causar en humanos diversas infecciones y procesos invasivos severos. Se trata de una bacteria Gram positiva de 1,2-1,8 m de longitud, que presenta una forma oval y el extremo distal lanceolado. Es inmvil, no forma endosporas, y es un miembro alpha-hemoltico del gnero Streptococcus.
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STREPTOCOCCUS MUTANS

Enfermedades causadas: Habituales en la boca donde pueden dar lugar: a) caries dental o b) endocarditis si alcanzan el torrente circulatorio de individuos con valvulopatas. Control: Higiene oral adecuada incluyendo revisiones dentales regulares.

YOGHURT 20

LACTOBACILUS BULGARIS

Lactobacilos blgaros, nombre comn con el que se conoce a las colonias de las microagelga. Lactobacillus bulgaricus, las cuales son conglomerados bacterias lcticas y levaduras de asociacin simbitica estable embebidas en una matriz de polisacridos, cuyo tamao vara de entre 5mm y 2.5 mm; de consistencia elstica y de color blanco-amarillento. Es una bacteria lctea homo fermentativa. * Se desarrolla muy bien entre 42 y 45. * Produce disminucin del pH, * Puede producir hasta un 2,7% de cido lctico, es proteo ltica. * Produce hidrolasas que hidrolizan las protenas. * Esta es la razn por la que se liberan aminocidos como la valina, la cual tiene inters porque favorece el desarrollo del streptococcus thermophilus.

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CAPTULO IV DISCUSIN DE RESULTADOS Gracias a los resultados que obtuvimos, los integrantes de este equipo podemos decir que s pudimos descubrir bacterias (diplococos y bacilos) en las muestras que utilizamos, pero para que estos resultados fueran posibles, fue necesario realizar esta prctica con mucho cuidado, porque a pesar de que no se trato de un trabajo complicado, necesitamos paciencia y participacin de todos.

CONCLUSIN

Es de gran importancia conocer y saber manejar el microscopio, ya que si no se

utiliza de una manera correcta y adecuada no se observaran los resultados requeridos. No todas las bacterias son iguales, todas tienen una clasificacin, una morfologa, un modo de reproduccin, y son estas caractersticas las que las diferencian. No es fcil identificar bacterias cuando no se tiene prctica, pero se puede lograr si se es paciente y cuidadoso.

CAPITULO V
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BIBLIOGRAFIA 1. Microbiologa General Autor: Hans G. Schlegel. Editorial: Omega Nueva edicin, Pgs.: 17-25, 89-103. 2. Microbiologa Mdica Autores: Patrick R. Murray, Ken S. Rosenthal, Michael A. Pfaller. Editorial: ELSEVIER, 5 edicin, Pgs.: 711, 221265, 401418. 3. Microbiologa en Ciencias de la Salud Conceptos y aplicaciones Autores: Manuel de la Rosa, Jos Prieto Prieto. Editorial: ELSERVIER 2 edicin, Pgs.: 8-10, 71-84. 4. Microbiologa Clnica Prctica Autores: P. Garca Martos, M. T. Fernndez del Barrio, F. Paredes Salido. Servicio de publicaciones de la universidad de Cdiz 2 edicin, Pgs.: 31-40. LINKOGRAFA

http://www.scribd.com/doc/14173114/3-Estudio-Microscopico-de-Los-Microorganismos http://www.unicit.edu.ni/BV/Manual_de_practicas%20Microbiologia.pdf http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp6.pdf http://kidshealth.org/teen/en_espanol/infecciones/staph_esp.html http://www.sepeap.es/libros/MEDICINE98/Artikulu/m7803.pdf http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/bacteriologia/informacion.php http://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria#Morfolog.C3.ADa_bacteriana http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm http://www.joseacortes.com/microbiologia/colorantes.htm http://www.seme.org/area_seme/actualidad_articulo.php?id=151 http://www.monografias.com/trabajos5/estmicro/estmicro.shtml

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CUESTIONARIO 1. Cul es el uso del microscopio? El microscopio es un equipo ptico que permite ampliar el tamao de las imgenes; aumentando la capacidad de observar dos puntos muy prximos, que a simple vista parecen uno solo. 2. Mencione las partes pticas y mecnicas que componen al microscopio: Sistema mecnico: Soporte, Platina, Cabezal, Revlver, Tornillos de enfoque Sistema ptico: Ocular, Objetivo, Condensador, Diafragma, Foco:
3. Qu es el poder de resolucin?

Es el espacio de mxima aproximacin entre dos puntos en el que an se pueden observar como dos entidades independientes. El poder de resolucin de un microscopio est sujeto a la longitud de onda de la luz y a la propiedad de las lentes conocidas como la apertura numrica (AN). 4. Cules son los tres pasos para realizar cualquier tcnica de tincin? Extensin. Consiste en formar una fina pelcula de la muestra sobre un portaobjetos limpio y desengrasado. Desecacin. Siempre debe realizarse al aire. Puede favorecerse colocando el frotis bajo una lmpara o sobre el calor suave de la llama de un mechero. Fijacin. Pretende que los microorganismos se adhieran al portaobjetos por coagulacin de sus protenas plasmticas mediante calor. 5. En qu consiste la tincin simple? Se realiza utilizando un solo colorante. Se puede emplear cualquier colorante bsico, preferiblemente azul de metileno o fuchina, dejndolo actuar durante un tiempo variable, y eliminando el exceso por lavado. Una vez seca la preparacin se visualiza al microscopio. Ofrece orientacin sobre la presencia, concentracin, morfologa y modo de agrupacin bacteriana.
6. Menciona 4 colorantes bsicos utilizados en las tinciones:

Fuchina Cristal violeta Violeta de genciana Azul de metileno 7. Describe dos formas en las que pueda realizarse el examen microscpico de las bacterias: Examen fresco: o montaje nico, consiste en colocar el material a examinar entre un porta y un cubreobjetos; si se trata de un producto slido, se debe realizar una suspensin del mismo en agua destilada o solucin salina, estriles. Para la observacin se utiliza el microscopio ptico con el condensador bajo y el objetivo seco fuerte (40x).
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Examen por tincin: permite observar con detalle la morfologa bacteriana y proporciona informacin complementaria sobre su comportamiento frente a determinados colorantes. Las preparaciones teidas se visualizan al microscopio con el condensador alto y el objetivo de inmersin de gran aumento (100x)

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ANEXO 1 MICROSCOPIO PARTES DEL MICROSCOPIO Y SU FUNCION

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Base, soporte y brazo. Sirven para mantener en posicin las partes pticas esenciales. La base y el brazo son fuertes, para disminuir la vibracin. Tubo intercambiable. Su funcin es ajustar la longitud mecnica del tubo, es decir, la distancia entre la lente del ocular que est arriba y la unin del objetivo al revlver, que est abajo. Tornillos macromtrico y micromtrico. Sirven para enfocar, logrando que la muestra se vea ntida y clara, ya que permiten subir y bajar todo el cuerpo del tubo junto con sus lentes y en microscopios modernos, junto con la platina. El tornillo micromtrico permite subir o bajar muy ligeramente. Platina. Parte del microscopio donde se coloca la muestra que va a ser examinada. Pinzas de la Platina. Estas sirven para sujetar la muestra a examinar. Tornillos para desplazar la Platina. Estos sirven para mover la muestra que est sobre la platina, hacia arriba, abajo, derecha izquierda, hasta enfocar el campo adecuado. Fuente de Luz. Se encuentra colocada debajo del objeto; sta emite la luz que pasa por el condensador, para despus iluminar la preparacin. Condensador. Antes de que la luz alcance la muestra en la platina, se condensa y enfoca a travs de una gran lente condensadora que se halla bajo la platina. Diafragma. Sirve para controlar la luz a travs del condensador. Objetivos. La funcin de stos es delimitar el tamao de la imagen: Objetivo de pequeo aumento "Seco dbil". Util para observar microorganismos grandes, p. ej. Protozoarios. Este objetivo est marcado como 10X. Tiene una lente en el extremo mucho ms grande que cualquiera de los otros objetivos. Objetivo de gran aumento "Seco fuerte". Este se usa para el examen de microorganismos vivos suspendidos en gotas de agua u otros lquidos. Est marcado como 45X 50X. La lente del extremo es de menor tamao que la del seco dbil. Objetivo de inmersin en aceite. Este objetivo es indispensable para el examen de frotis teidos de bacterias. La lente visible del extremo es mucho ms corta que la de los objetivos secos. Este objetivo esta marcado con 97X 100X. Las marcas 10X, 45X y 97X con que suelen estar marcados los objetivos del microscopio corresponden a la potencia amplificadora, y las letras N.A., a la apertura numrica. Mientras mayor sea la cifra N.A., mayor ser el detalle que revela el objetivo. Oculares. Son tubos cortos, cada uno con dos lentes. La funcin de stos es amplificar la imagen del objeto formado por el objetivo. Los oculares estn marcados 5X, 10X, etc. indicando que amplan la imagen del objetivo 5 veces, 10 veces, etc. Cuando se utiliza el ocular 10X con el objetivo de pequeo aumento da una amplificacin final de 100 veces. El de 50X dar una amplificacin final de 500 veces y el de 100X una amplificacin final de 1000 veces.
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CUIDADO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO

1. Para transportar el microscopio a la mesa de trabajo deber tomarse del brazo con la

mano derecha y de la base con la mano izquierda y en posicin vertical.

2. Antes de usarlo, limpiar perfectamente la fuente de luz del microscopio, parte superior

del condensador, oculares y objetivos con vaho y frotando suavemente con hisopos. 3. No encender la fuente de luz, sino hasta que se vaya a usar. 4. Colocar la muestra sobre la platina y girar el objetivo que se va a usar colocndolo en la posicin correcta mientras que se observa el material. 5. Ver por el ocular y controlar la cantidad de luz adecuada, moviendo el condensador y diafragma. 6. Para enfocar, bajar el objetivo que se va a usar con el uso del tornillo macromtrico hasta donde tope, sin forzarlo, luego enfocar primero con el tornillo macromtrico y una vez que se ha localizado el campo, usar el tornillo micromtrico para enfocar adecuadamente. 7. Con respecto al objetivo de inmersin, hay que tener mucho cuidado, ya que la distancia focal es muy corta y habr que emplear nicamente el tornillo micromtrico y no el macromtrico debido a que se puede daar la preparacin y la lente del objetivo, para su utilizacin es recomendable: a) Levantar el tubo ptico del microscopio, antes de poner el objetivo en posicin. b) Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin. No usar aceite en exceso, ya que daa el cemento de las lentes. c) Viendo por fuera del microscopio, como ya se insisti anteriormente, bajar el objetivo con el macromtrico hasta que toque la gota de aceite. A partir de ese momento el objetivo estar prcticamente dentro de su distancia focal. d) Enfocar la preparacin con movimientos del tornillo micromtrico.
8. Evitar girar el revlver de los objetivos sin antes levantar el tubo ptico del

microscopio. 9. Recordar que el objetivo 45X es ms largo que el de 10X y ms todava que el de inmersin, por lo que deber tenerse cuidado, pues si llegan a rozar, la platina los inutiliza permanentemente. 10. Cuando se vaya a utilizar el objetivo seco fuerte (45X), hacer primero el enfoque de la preparacin con el objetivo seco dbil, luego, girar el revlver de tal manera que el siguiente objetivo sea el seco fuerte, cuidando que la lente no tope con la preparacin. 11.Ajustar el enfoque usando el tornillo micromtrico. 12.Mantener el microscopio retirado de la orilla de la mesa. METODOS DE MICROSCOPIA Examen de organismos vivos. La forma ms simple de examinar las bacterias y otros microorganismos vivos es suspenderlos en agua u otro lquido, colocar una gota de esta suspensin en un portaobjetos ordinario y encima un cubreobjetos, utlizando para su observacin al microscopio los objetivos seco dbil y seco fuerte. Existen otros mtodos como son el de gota pendiente y el microcultivo.
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Examen de bacterias teidas. La forma y estructura de las bacterias se revelan con ms claridad cuando son desecadas sobre un portaobjetos y son coloreadas o examinadas contra un fondo teido. Existen diversas tcnicas de tincin.

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ANEXO 2 PREPARACIN DE COLORANTES

1. Acido-Alcohol: (decolorante para tincin Ziehl-Neelsen)

o cido clorhdrico concentrado ..........................................................3 ml o Etanol 95% ....................................................................................97 ml 2. Azul de metileno: Colorante de contraste para tincin de flagelos. o Azul de metileno................................................................................1 g o Agua destilada...............................................................................100 ml 3. Azul de metileno de Loeffler: Tinciones simples. o Solucin de hidrxido potsico al 1%.................................................1 ml o Azul de metileno, sol. saturada en etanol al 95%...............................30 ml o Agua destilada...............................................................................100 ml 4. Colorante para esporas: o Solucin acuosa saturada de verde malaquita 5. Colorante para flagelos de Leifson: o Solucin A Fucsina bsica .........................................................................1,2 g Etanol 95%.............................................................................100 ml o Solucin B cido tnico................................................................................3 g Agua destilada.........................................................................100 ml o Solucin C Cloruro sdico..........................................................................1,5 g Agua destilada.........................................................................100 ml Para preparar la solucin de uso, se mezclan cantidades iguales de las soluciones A, B y C y se guarda en frasco cerrado hermticamente en la nevera donde es estable durante varias semanas. 6. Cristal violeta: Para tincin Gram y tincin simple. o Cristal violeta (violeta de genciana)....................................................0,5 g o Agua destilada.................................................................................100 ml 7. Eosina: Para observacin de clulas sanguneas. o Eosina...............................................................................................0,3 g o cido actico glacial......................................................................0,025 ml o Agua destilada...................................................................................100 ml 8. Fucsina diluida: Para tincin Gram y tincin simple. o Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen......................................................10 ml o Agua destilada.................................................................................100 ml 9. Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen: Para tincin cido-alcohol resistente. o Fucsina bsica......................................................................................1 g o Etanol 95%........................................................................................10 ml o Fenol 5% en solucin acuosa............................................................100 ml 10. Hematoxilina: Para observacin de clulas sanguneas. o Hematoxilina.........................................................................................2 g o Agua destilada......................................................................................1 l 11. Lactofenol: Para preparaciones microscpicas en fresco de mohos. o cido lctico.....................................................................................100 ml o Fenol................................................................................................100 g o Glicerol.............................................................................................200 ml o Agua.................................................................................................100 ml 12. Lactofenol al Azul Algodn: Para preparaciones en fresco y tinciones de mohos. o Solucin de azul algodn Sol. saturada de azul algodn (azul anilina soluble)......................10 ml

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Glicerol.....................................................................................10 ml Agua.........................................................................................80 ml Mezclar esta solucin con lactofenol a partes iguales 13. Lugol: Solucin de yodo para tincin Gram. o Yodo...................................................................................................1 g o Yoduro potsico..................................................................................2 g o Agua destilada.................................................................................300 ml 14. Orcena A: Tincin de cromosomas. o Orcena................................................................................................2 g o cido actico.....................................................................................45,8 ml o cido clorhdrico 1 mol/l......................................................................8,3 ml o Agua..................................................................................................45,8 ml 15. Orcena B: Tincin de cromosomas. o Orcena................................................................................................2 g o cido actico.....................................................................................55 ml o Agua..................................................................................................55 ml 16. Safranina: Colorante de contraste para tincin Gram (preferible a la fucsina) y esporas. o Safranina.........................................................................................0,25 g o Agua destilada..................................................................................100 m 17. Sudn III: Tincin especfica de grasas. o Alcohol etlico...................................................................................100 ml o Sudn III...................................................................................hasta saturacin

18. Verde de metilo actico: Igual composicin que la eosina (num. 7)

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ANEXO 3 MORFOLOGA BACTERIANA

Existen bacterias con mltiples morfologas.

Las bacterias presentan una amplia variedad de tamaos y formas. La mayora presentan un tamao diez veces menor que el de las clulas eucariotas, es decir, entre 0,5 y 5 m. Sin embargo, algunas especies como Thiomargarita namibiensis y Epulopiscium fishelsoni llegan a alcanzar los 0,5 mm, lo cual las hace visibles al ojo desnudo. En el otro extremo se encuentran bacterias ms pequeas conocidas, entre las que cabe destacar las pertenecientes al gnero Mycoplasma, las cuales llegan a medir solo 0,3 m, es decir, tan pequeas como los virus ms grandes. La forma de las bacterias es muy variada y, a menudo, una misma especie adopta distintos tipos morfolgicos, lo que se conoce como pleomorfismo. De todas formas, podemos distinguir tres tipos fundamentales de bacterias:

Coco (del griego kkkos, grano): de forma esfrica. o Diplococo: cocos en grupos de dos. o Tetracoco: cocos en grupos de cuatro. o Estreptococo: cocos en cadenas. o Estafilococo: cocos en agrupaciones irregulares o en racimo. Bacilo (del latn baculus, varilla): en forma de bastoncillo. Formas helicoidales: o Vibrio: ligeramente curvados y en forma de coma, juda o cacahuete. o Espirilo: en forma helicoidal rgida o en forma de tirabuzn. o Espiroqueta: en forma de tirabuzn (helicoidal flexible). 33

Algunas especies presentan incluso formas tetradricas o cbicas. Esta amplia variedad de formas es determinada en ltima instancia por la composicin de la pared celular y el citoesqueleto, siendo de vital importancia, ya que puede influir en la capacidad de la bacteria para adquirir nutrientes, unirse a superficies o moverse en presencia de estmulos. A continuacin se citan diferentes especies con diversos patrones de asociacin:

Neisseria gonorrhoeae en forma diploide (por pares). Streptococcus en forma de cadenas. Staphylococcus en forma de racimos. Actinobacteria en forma de filamentos. Dichos filamentos suelen rodearse de una vaina que contiene multitud de clulas individuales, pudiendo llegar a ramificarse, como el gnero Nocardia, adquiriendo as el aspecto del micelio de un hongo.

Rango de tamaos que presentan las clulas procariotas en relacin a otros organismos y biomolculas.

Las bacterias presentan la capacidad de anclarse a determinadas superficies y formar un agregado celular en forma de capa denominado biopelcula o biofilme, los cuales pueden tener un grosor que va desde unos pocos micrmetros hasta medio metro. Estas biopelculas pueden congregar diversas especies bacterianas, adems de protistas y arqueas, y se caracterizan por formar un conglomerado de clulas y componentes extracelulares, alcanzando as un nivel mayor de organizacin o estructura secundaria denominada microcolonia, a travs de la cual existen multitud de canales que facilitan la difusin de nutrientes. En ambientes naturales tales como el suelo o la superficie de las plantas, la mayor parte de las bacterias se encuentran ancladas a las superficies en forma de biopelculas. Dichas biopelculas deben ser tenidas en cuenta en las infecciones bacterianas crnicas y en los implantes mdicos, ya que las bacterias que forman estas estructuras son mucho ms difciles de erradicar que las bacterias individuales. Por ltimo, cabe destacar un tipo de morfologa ms compleja an, observable en algunos microorganismos del grupo de las mixobacterias. Cuando estas bacterias se encuentran en
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un medio escaso en aminocidos son capaces de detectar a las clulas de alrededor, en un proceso conocido como quorum sensing, en el cual todas las clulas migran hacia las dems y se agregan, dando lugar a cuerpos fructferos que pueden alcanzar los 0,5 mm de longitud y contener unas 100.000 clulas.Una vez formada dicha estructura las bacterias son capaces de llevar a cabo diferentes funciones, es decir, se diferencian, alcanzando as un cierto nivel de organizacin pluricelular. Por ejemplo, entre una y diez clulas migran a la parte superior del cuerpo fructfero y, una vez all, se diferencian para dar lugar a un tipo de clulas latentes denominadas mixosporas, las cuales son ms resistentes a la desecacin y, en general, a condiciones ambientales adversas.

Estructura de la clula bacteriana.

Estructura de la clula bacteriana. A-Pili B-Ribosomas C-Cpsula D-Pared celular E-Flagelo; F-Citoplasma G-Vacuola H-Plsmido I-Nucleoide J-Membrana citoplasmtica.

Las bacterias son organismos relativamente sencillos. Sus dimensiones son muy reducidas, unos 2 m de ancho por 7-8 m de longitud en la forma cilndrica (bacilo) de tamao medio; aunque son muy frecuentes las especies de 0,5-1,5 m. Carecen de un ncleo delimitado por una membrana aunque presentan un nucleoide, una estructura elemental que contiene una gran molcula circular de ADN. El citoplasma carece de orgnulos delimitados por membranas y de las formaciones protoplasmticas propias de las clulas eucariotas. En el citoplasma se pueden apreciar plsmidos, pequeas molculas circulares de ADN que coexisten con el nucleoide, contienen genes y son comnmente usados por las bacterias en la conjugacin. El citoplasma tambin contiene vacuolas
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(grnulos que contienen sustancias de reserva) y ribosomas (utilizados en la sntesis de protenas). Una membrana citoplasmtica compuesta de lpidos rodea el citoplasma y, al igual que las clulas de las plantas, la mayora posee una pared celular, que en este caso est compuesta por peptidoglicano (murena). Algunas bacterias, adems, presentan una segunda membrana lipdica (membrana externa) rodeando a la pared celular. El espacio comprendido entre la membrana citoplasmtica y la pared celular (o la membrana externa si esta existe) se denomina espacio periplsmico. Algunas bacterias presentan una cpsula y otras son capaces de evolucionar a endosporas, estadios latentes capaces de resistir condiciones extremas. Entre las formaciones exteriores propias de la clula bacteriana destacan los flagelos y los pili.

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Crecimiento

Fases del crecimiento bacteriano. El crecimiento bacteriano sigue tres fases. Cuando una poblacin bacteriana se encuentra en un nuevo ambiente con elevada concentracin de nutrientes que le permiten crecer necesita un perodo de adaptacin a dicho ambiente. Esta primera fase se denomina fase de adaptacin o fase lag y conlleva un lento crecimiento, donde las clulas se preparan para comenzar un rpido crecimiento, y una elevada tasa de biosntesis de las protenas necesarias para ello, como ribosomas, protenas de membrana, etc. La segunda fase de crecimiento se denomina fase exponencial, ya que se caracteriza por el crecimiento exponencial de las clulas. La velocidad de crecimiento durante esta fase se conoce como la tasa de crecimiento k y el tiempo que tarda cada clula en dividirse como el tiempo de generacin g. Durante esta fase, los nutrientes son metabolizados a la mxima velocidad posible, hasta que dichos nutrientes se agoten, dando paso a la siguiente fase. La ltima fase de crecimiento se denomina fase estacionaria y se produce como consecuencia del agotamiento de los nutrientes en el medio. En esta fase las clulas reducen drsticamente su actividad metablica y comienzan a utilizar como fuente energtica aquellas protenas celulares no esenciales. La fase estacionaria es un perodo de transicin desde el rpido crecimiento a un estado de respuesta a estrs, en el cual se activa la expresin de genes involucrados en la reparacin del ADN, en el metabolismo antioxidante y en el transporte de nutrientes.

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