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ELSEVIER

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SCIENCE@DIRECT ®

Colloids and Surfaces B:

Biointerfaces 30 (2003) 283-289

COLÓIDES

E

B

SUPERFÍCIES

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Saccharomyces cerevisiae (levedura de cerveja) encapsulada em crisotila aumenta a longevidade em até 3 anos

Flávia Cassiolaª, Helena Souza Santos b , Inês Joekesª ,

ª Departamento de Físico-Química, Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP, Cx Postal 6154, 13083-862 Campinas, SP, Brasil b Laboratório de Microscopia Eletrônica, Instituto de Física, Universidade de São Paulo, USP Cx Postal 66318, 05315-970 São Paulo, SP, Brasil

Aceito em 10 de abril de 2003.

Excerto

A viabilidade de longo prazo dos microrganismos tem sido raramente reportada, porém é

importante do ponto de vista tecnológico e científico. Demonstramos, neste trabalho, que

a Saccharomyces cerevisiae (levedura de cerveja), um biocatalizador bastante conhecido,

permanece viável e ativo em experimentos de fermentação por até 3 anos, na ausência de nutrientes, quando suportado em fibras de crisotila. Essa viabilidade de longo prazo é atribuída a um estado de latência em que a célula entra após cerca de 4 meses de armazenamento, induzido pelo encapsulamento das células no interior de fibras de

crisotila. As fibras de crisotila que se aderem não penetram a célula. Os resultados micro- gráfico eletrônico de transmissão (TEM) demonstram quem as fibras estão aderidas apenas à camada externa da parede celular e que nenhum dano é causado à estrutura da parede celular. Fibras nunca foram encontradas no interior das células. As fibras que encapsulam puderam ser observadas como um ninho de seda distinto e bem preservado em preparações nas quais as células não foram fixadas quimicamente. Não se observou qualquer degradação das fibras aderidas de crisotila. O encapsulamento é atribuído à flexibilidade do crisotila e ao tamanho das células que maximizam a aderência por interações eletrostáticas e de van der Waals entre as fibras e os polissacarídeos da superfície da célula.

© 2003 Elsevier B. V. Todos os Direitos Reservados.

Autor Correspondente. Tel/Fax: + 55-19-3788-3094. E-mail: inês@iqm.unicamp.br (I Joekes).

0927-7765/03/$ - see front matter © 2003 Elsevier B. V. Todos os Direitos Reservados.

doi:10.1016/S0927-7765(03)00099-7

Palavras-chave:

fermento suportado em crisotila; viabilidade do fermento; produção de Etanol; Biocatalizadores suportados

1.

Introdução

O

amplo e difundido desenvolvimento e aplicação da tecnologia da célula imobilizada tem

motivado, de forma intensa, a necessidade de um profundo conhecimento do comportamento das células imobilizadas, tanto do ponto de vista fisiológico e cinético. Vários processos industriais podem ser beneficiados como esse conhecimento, uma vez

muitos desses sistemas imobilizados poderiam substituir, favoravelmente, as tecnologias existentes. Como resultado da fragilidade da maioria dos biocatalizadores, muitos dos processos industriais de fermentação são processos por batelada. O emprego de biocatalizadores suportados permitiria a mudança para processos contínuos menos dispendiosos e melhor controlados, bem como a eficiência do processo contínuo aumentaria à medida que a longevidade do biocatalizador aumentasse.

A preservação de longo prazo das células suportadas foi descrita em muitos poucos

casos. Um exemplo usual é a bem conhecida longevidade ampliada, observada nalguns microrganismos em cultura de Agar, após cobertura com óleo. Recentemente, Nassif e colaboradores [1] reportaram a viabilidade de 1 mês da Escherichia coli encapsulada em sílica gel. Um caso excepcional de preservação é reportado por Argiriou e colaboradores [2] para Visanto-1 em Kissiris-suportado, uma cepa de fermento psicofrílico e resistente

ao álcool. As células imobilizadas foram conservadas, em cilindros de vidro cheios de um extrato de passas, com densidade de 7ºBe, a 0º, em geladeira. Essas células foram viáveis por 2,5 anos produzindo vinhos.

Saccharomyces ceverisiae suportada em crisotila brasileiro tem sido descrita como um excelente biocatalizador para a produção de etanol, fornecendo rendimentos de etanol de até 26% mais elevados que as células livres [3-5]. Em um trabalho anterior [6], a interação entre S.cerevisiae e as fibras de crisotila foi estudada por microscopia eletrônica de varredura, demonstrando que as células de fermento se aderem, preferencialmente, às fibras. Em casos extremos, foi observado um aprisionamento total.

Este artigo relata os resultados de um estudo de longo prazo de células encapsuladas, mostrando que além da interação não usual (encapsulamento) já reportada [6], uma viabilidade de longo prazo das células inteiras se revela e que pode ser atribuída com essa interação com o suporte.

2. Materiais e Métodos

2.1 Preparação da amostra

A cepa da S. cerevisiae CCT3174 (Fundação Tropical André Tosello, Campinas, SP,

Brasil) foi estudada. Essa cepa foi previamente selecionada como sendo a que daria os melhores rendimentos na fermentação da cana de açúcar quando aderidas a crisotila [4].

As células do fermento cresceram a 28ºC em meio YMP (3 g 1 - 1

1 - 1 extrato de malte , 5 g 1 - 1 peptona e 10 g 1 - 1 D-glucose). O crisotila 5R (Padrão Quebec), obtido de SAMA Mineração de Amianto Ltda. (Minaçu, GO, Brasil) foi lavado com água de torneira e ativado por sônica a pH controlado (4.7) conforme descrito em outro local [7]. Dispersou-se 1 g de crisotila ativado em 200 ml de água destilada e

extrato de fermento, 3 g

esterilizada. Após resfriamento, 0,6 g de células foram adicionadas à suspensão, agitadas por 1 h a 30ºC e peneirada (malha 200). As 58 amostras preparadas de células de fermento imobilizadas foram armazenadas em frascos plásticos, foram testadas quanto à atividade de fermentação, peneiradas e armazenadas em geladeira a ~ 4ºC.

2.2 Experimentos de fermentação

Cada amostra foi transferida para um frasco Erlenmeyer (25 ml), com 15 ml de meio de fermentação (30% (w/v) D-glucose anidra , 0,5 g 1 - 1 MgSO 4 . 7H 2 O e 3,0 g 1 -1 uréia); foram acrescentadas molduras de vidro para evitar flutuação. Os frascos foram fechados com tampa de borracha, perfuradas com uma agulha, e pesadas (t = t 0 ). A fermentação foi efetuada em um misturador termostaticamente controlado, a 30ºC. O peso foi tomado a intervalos controlados (t = ti) e a diferença de peso foi tomada como a massa de CO 2 evoluída após Ti. Foram efetuadas aproximadamente 2500 tomadas de peso.

2.3 Microscopia eletrônica

Das 58 amostras, cerca de 200 preparações foram estudadas por microscopia eletrônica, registrando cerca de 300 micro-gráficos de microscópio eletrônico de varredura – SEM e 150 micro-gráficos TEM. Para o SEM, as células de fermento suportadas foram fixadas usando-se uma solução de glutaraldeído tamponada com fosfato (0.1 mol 1 - 1 , pH 7) 2,5% (v/v), agitando-se suavemente por 2 horas a 4ºC e enxaguando na mesma solução tampão. A pós-fixação foi realizada em 1% de tetróxido de ósmio em tampão de fosfato, agitando-se suavemente por 2 h em temperatura ambiente. As amostras foram lavadas 10 vezes em água destilada e desidratadas através de uma série graduada de soluções de etanol (50, 70, 80, 95, 100% (v/v)) secas com CO 2 pelo método do ponto critico, montadas em adaptadores e revestidas por crepitação com ouro (4 nm). As observações SEM foram realizadas com um microscópio eletrônico de varredura JEOL JSM-840A a uma voltagem de aceleração de 25 kV. As amostras de crisotila/S. cerevisiae foram protegidas com gaze de nylon (cerca de 0,5nm de abertura), para evitar a perda de células durante o manuseio. A gaze de nylon foi necessária para reter todas as células, uma vez que durante o período de 3 anos do estudo várias células apareceram aderidas a fibras curtas ou quebradas, retidas de forma tão solta na massa de fibras que caíram no adaptador; essas células foram perdidas nas preparações sem a gaze de nylon.

Para TEM, as amostras de crisotila/S. cerevisiae foram fixadas em uma solução cacodilato de sódio (0.1 mol 1 -1 , pH 7) mais 5 mmol 1 -1 MgCl 2 solução tamponada de glutaraldeído a 2,5% (v/v), agitando-se suavemente por 2 h a 4ºC e enxaguadas na mesma solução tampão. A pós-fixação foi realizada com 1% de tetróxido de ósmio em tampão de cacodilato de sódio contendo 5 mmol 1 -1 MgCl 2 e 0,8% (w/v) de ferrocianato de potássio, agitando-se suavemente por 2 h à temperatura ambiente. As amostras foram lavadas dez vezes em água destilada e coloridas en bloc em solução de acetato de uranilo a 2% (w/v), agitando suavemente por 2 h à temperatura ambiente. As amostras foram desidratadas através de uma serie graduada de soluções de etanol (50, 70, 80, 95, 100% (v/v)) e foram fixadas em uma resina à base de Epon. Obtiveram-se secções ultrafinas utilizando-se faca de diamante, colhidas em rede de malha 200 e coradas com citrato de chumbo de Reynold. Secções ultrafinas coradas foram observadas por meio de um microscópio eletrônico de transmissão analítica CM200, a uma voltagem de aceleração de 160 ou 200kV.

3. Resultados

Cinqüenta e oito amostras de células de fermento suportadas em crisotila foram acompanhadas por microscopia eletrônica e atividade de fermentação durante 3 anos. Todas as 58 amostras foram submetidas a um teste de fermentação de 8 h imediatamente após a preparação. As amostras filtradas foram, a seguir, mantidas em geladeira. Nenhum nutriente foi adicionado a qualquer amostra.

Quatro amostras foram escolhidas (ao acaso) e acompanhadas mensalmente por testes quanto à atividade de fermentação, durante os primeiros 7 meses e, a partir daí, a intervalos de 6 meses durante 3 anos. Das amostras restantes, quatro delas foram escolhidas por vez, ao acaso, para testes de atividade de fermentação e não foram testadas novamente.

A Fig 1 mostra a atividade de fermentação das quatro amostras que foram acompanhadas, de forma contínua, e das 36 amostras, selecionadas ao acaso, quatro a cada vez, durante os primeiros 8 meses deste estudo. A característica importante é que todas as amostras demonstraram atividade de fermentação reduzida após 4 meses. Ambos os conjuntos de amostras se comportaram de modo semelhante. Dessa forma, a redução da atividade não depende dos nutrientes fornecidos durante os testes de fermentação, mas devem depender da interação com o suporte. O SEM demonstrou que ambos os grupos de amostras foram encapsuladas nas fibras de modo semelhante.

(Consta Figura)

Fig 1. Atividade de fermentação em função do tempo de armazenamento para S. cerevisiae suportada em crisotila. Dados obtidos após 6 h nos meios de fermentação. Quadrados vazios: valores médios para as mesmas quatro amostras selecionadas a cada período. Triângulos hachurados: valores médios para um conjunto de 4 amostras diferentes, selecionadas ao acaso a cada período.

No oitavo mês, as quatro amostras selecionadas não apresentaram qualquer atividade de fermentação, mas apresentaram um bom odor. Supondo-se que o número de células ativas na amostra tenha diminuído a um nível em que sua produtividade de CO 2 estivesse abaixo do limite de detecção dos testes de atividade de fermentação, acrescentaram-se meios de crescimento. Posteriormente, as observações SEM demonstraram uma densidade de células muito elevada nessas amostras.

3.1 Estado Latente

As quatro outras amostras testadas no oitavo mês foram deixadas no meio de fermentação por um período mais longo quando, por descoberta acidental, verificou-se que houvera um período de indução antes de a fermentação aparecer , conforme mostrado pelas cruzes na Fig. 2. Esse período foi considerado como mais longo que 24h após as amostras terem sido colocadas no meio de fermentação. Outras amostras testadas quanto à fermentação após um período de 8 meses também demonstraram esse período de indução. Isso implica que as células encontram-se latentes após o quarto mês e podem ser reativadas.

(Consta Figura )

Fig. 2. Atividade de fermentação de S. cerevisiae suportada em crisotila como uma função do tempo de fermentação. Quadrados vazios: valores médios das amostras selecionadas (que receberam nutrientes no ano 1) após 3 anos de armazenamento. Cruzes: valores médios de conjuntos de quatro amostras após 8 meses de armazenamento. Triângulos vazios: valores médios de conjuntos de quatro amostras testadas no mês 8, após armazenamento adicional de 28 meses. Círculos hachurados: valores médios de um conjunto de quatro amostras após 3 anos de armazenamento. Durante as 10 horas do período, todas as amostras estão em zero.

A Fig. 2 também mostra os níveis de atividade de fermentação dos três conjuntos de amostras após 3 anos de armazenamento. Observe que as quatro amostras selecionadas, testadas periodicamente, mostram um período de indução mais curto 2 anos após terem sido expostas aos meios de crescimento, o que se pode atribuir à densidade bem mais elevada dessa amostra. Os outros dois conjuntos de amostras não demonstram, novamente, qualquer diferença de comportamento, o que significa que os nutrientes fornecidos com os meios de fermentação não exercem influência significativa sobre o estado latente.

Esse estado latente deve originar-se da interação das células com o suporte de crisotila, uma vez que não há outras evidências na literatura com relação a tal intervalo de ciclo de vida tão prolongado na ausência absoluta de nutrientes e sob as condições de armazenamento que utilizamos.

Utilizamos microscopia eletrônica para investigar a natureza dessa interação. A Fig. 3 mostra um micro-gráfico SEM de células de fermento encapsuladas em crisotila. Esse tipo de encapsulamento é a forma usual em todas as nossas observações. Como anteriormente relatado [6], o grau de encapsulamento depende do tempo de contato, mas o SEM não conseguiu mostrar qualquer diferença nas amostras antes e após 4 meses de armazenamento, exceto que a capacidade de gemação parece diminuir. Dados de experimentos por batelada demonstraram que as células suportadas armazenadas por períodos mais longos crescem mais vagarosamente que as células livres nos meios de fermentação o que poderia explicar o rendimento adicional do etanol, observado para o biocatalizador suportado [8].

4. Discussão

Pode-se propor um mecanismo de adesão, utilizando-se nossos resultados TEM. O micro-gráfico TEM na Fig. 4 mostra uma única célula de fermento encapsulada em fibras de crisotila. A célula se encontra degradada, uma vez que não foi utilizada qualquer técnica de preservação na preparação dessas amostras TEM. Todavia, o “ninho” do crisotila está muito estável, mesmo sendo submetido ao feixe eletrônico de 200 kV, não demonstrando qualquer sinal de degradação. Várias fibras mostram flexão para se adaptarem à curvatura de célula. Supomos que o mecanismo de adesão envolve uma primeira fase em que uma fibra se adere através de um ponto à superfície da célula, sendo posteriormente flexionadas por interações de Coulomb e de van der Waals com a superfície da célula [9-12]. A superfície da célula está coberta por polissacarídeos [13,14] que podem estabelecer essas interações com os grupos polares e ionizados na superfície do crisotila. Essa flexão é possível uma vez que as fibras são bastante flexíveis [15], mas precisam depender do tamanho do microrganismo. Essa flexão não é observada quanto à interação do crisotila com microrganismos menores, tais como as bactérias Serratia

rubidae e Pseudomonas oleovaruns, embora se adiram bastante bem às fibras de crisotila, mas são observadas com fungos que são microrganismos maiores [16]. Flexão também não foi observada ao se utilizar fibras de crocidolito (amianto azul) que são mais duras que as fibras de crisotila [15]. Sugerimos que essa flexão representa passo importante no desenvolvimento do “ninho” e que a “cobertura total” observada após interação de longo prazo é causada pela ruptura de várias fibras flexionadas.

(Consta Figura)

Fig. 3. Micrográfico eletrônico de varredura de células de fermento suportadas em crisotila após 3 anos de armazenamento sem nutrientes

(Consta Figura)

Fig. 4. Micro-gráfico eletrônico de transmissão de uma única célula de fermento encapsulada em fibras de crisotila após 3 anos de armazenamento. A célula se encontra degradada, uma vez que não foram utilizadas técnicas de preservação, para evidenciar melhor o “ninho” de crisotila.

Também utilizamos TEM para investigar se as fibras de crisotila penetraram as células. A Fig. 5 demonstra uma secção muito fina de uma célula de fermento após 3 anos em

contato com o crisotila. Não se observa nenhuma fibra no interior da célula, embora a superfície esteja totalmente recoberta. A Fig. 6 mostra que as fibras de crisotila se aderem

à parte exterior da parede celular, interagindo com os polissacarídeos nessa região. A flecha indica para uma lacuna deixada pela extração de uma fibra da parede celular, indicando que a fibra extraída levou consigo os polissacarídeos, apoiando, ainda, a sugestão de alta força de adesão. Embora permitindo o desenvolvimento de um modelo para adesão, TEM foi incapaz de proporcionar uma indicação sobre o estado latente verificado após armazenamento de longo prazo.

5. Conclusões

Demonstramos que as células encapsuladas em crisotila são ativas na fermentação por até 3 anos, mesmo quando armazenadas na ausência absoluta de nutrientes. O encapsulamento pode ser explicado utilizando-se um modelo físico- químico simples, com base na flexibilidade das fibras de crisotila e nas dimensões das células de fermento. As células crescem, mas apresentam capacidade reduzida de gemação.

A reprodução reduzida poderá estar associada com bem conhecido efeito de “densidade

de saturação” pelo qual as células deixam de crescer caso sua população atinja um nível superior [17]. O “ninho” de crisotila poderia iludir as células para sentirem que a população de células atingiu a densidade de saturação. Essa suposição poderia ser verificada caso se identifique outro material para “aninhar” células de fermento de modo semelhante. Estamos estudando células de fermento armazenadas por longo período, suportadas em crisotila livre de brucite [18]. Esse suporte é obtido após extensa remoção, por ácido, das camadas de óxido de magnésio das fibras de crisotila, resultando em tridimite fibrosa

(SiO 2 ) com cerca de. 500 m² g 1 de área de superfície. Essas fibras são muito curtas, quando comparadas com o crisotila. As células de suporte aparecem amplamente cobertas nas observações SEM. Essas amostras contam agora com 12 meses de idade e

a maioria delas não demonstra qualquer degradação. Todavia, não dispomos, até o momento, de dados conclusivos sobre gemação.

Também demonstramos que as fibras de crisotila permanecem na parte exterior da parede celular e que essas fibras de amianto não são tóxicas para as células de fermento. As fibras de amianto têm sido relacionadas a uma série de doenças pulmonares, incluindo o mesotelioma, uma forma de câncer [19-25]. Em ambos os casos, as células reagem de forma muito diferente quando expostas ao crisotila e poderá ser muito interessante estudar que proteína, ou grupo de proteínas, é expressa pelas células cancerosas, como uma forma de entender as “vantagens” que as células de fermento com seu revestimento de polissacarídeos obtêm da interação com tais fibras.

(Consta Figura)

Fig. 5. Micro-gráfico eletrônico de transmissão de uma secção muito fina de uma célula de fermento suportada em crisotila, após 3 anos de armazenamento. As fibras (cortadas) de crisotila podem ser observadas aderidas em toda a superfície. Nenhuma fibra adentrou a célula.

(Consta Figura)

Fig. 6. Micro-gráfico eletrônico de transmissão de uma secção muito fina de uma célula de fermento suportada em crisotila após 3 anos de armazenamento. A parede celular mostra várias fibras de crisotila (*) aderindo aos polissacarídeos externos. A flecha aponta para uma lacuna deixada nesse revestimento de polissacarídeo pela extração de uma fibra.

As questões que restam estão relacionadas ao estado latente. Poderia ser que os íons de Mg da fibra fossem utilizados pelas células como um único nutriente de manutenção da vida nessas condições extremas [26]? Demonstramos [4] que os íons solúveis de Mg fornecidos nos meios de fermentação não têm qualquer efeito na atividade de fermentação ou sobre a duração da vida das células livres. Realizamos também alguns experimentos utilizando outros minerais contendo Mg, tais como montmorilonite, com resultados pouco conclusivos.

As células de fermento têm sido usadas como catalisador biotecnológico desde os tempos históricos. Elas se revelaram um modelo valioso para a ciência da vida, incluindo as novas disciplinas de genômica, proteômica e bioinformática. O fermento se tornou um sistema -modelo que é aplicado às células mais elevadas da célula eucariótica, dos mamíferos e dos vegetais [27-29]. Acreditamos que a divulgação da origem do estado latente através da expressão de proteínas, por exemplo, poderá levar a modelos que possam ser aplicados para o melhor entendimento dos processos de envelhecimento em outros organismos.

Agradecimentos

Agradecemos SAMA Mineração de Amianto Ltda. pelo fornecimento das amostras de crisotila; M. Silveira e P. K. Kiyohara do LEM-IFUSP; P. J. S. Moran, J.R.A. Rodrigues A.J. Marsaioli da IQ/UNICAMP e P.R. Massaguer da FEA/UNICAMP por conversações esclarecedoras, bem como a C.H. Collins por um exame crítico do manuscrito. Patrocinado por verbas do CNPq, O Conselho de Pesquisas Brasileiro (Concessão 141633/1997-2) e FAPESP, a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Concessão 98/10180-4).

Referências:

(Constam referências bibliográficas)