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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE EDUCAO SUPERIOR NORTE RS DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA AMBIENTAL

CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (HPLC)

RELATRIO DE AULA LABORATORIAL DE QUMICA

Andrise Janana Follmann Joseane Kolzer Schroeder

Frederico Westphalen, RS, Brasil 2010

CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (HPLC)

por

Andrise Janana Follmann Joseane Kolzer Schroeder

Relatrio de aula em laboratrio de Qumica Geral, apresentado para anlise e aprovao. Curso de Engenharia Ambiental. Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) Centro de Educao Superior Norte RS (CESNORS).

Professora: Eliane Pereira dos Santos

Frederico Westphalen, RS, Brasil 2010

SUMRIO

INTRODUO....................................................................................................................3 2 REFERENCIAL TERICO.............................................................................................4 2.1 Classificao da Cromatografia......................................................................5 2.1.1 Classificao pela forma fsica.............................................................5 2.1.2 Classificao pela fase mvel empregada...........................................5 2.1.3 Classificao quanto ao mecanismo de separao.............................6 2.2 Cromatografia Lquida de Alta Eficincia .....................................................6 2.2.1 Componentes e funcionamento da CLAE ...........................................7 2.2.2 Detectores de Absoro no UV- Vsvel ..............................................8 2.2.3 Fases Mveis e Estacionrias usadas na CLAE .................................9 2.2.4 Cromatografia em Fase Normal (NPC) e em Fase reversa (RPC)......9 2.2.5 Vantagens e Desvantagens da CLAE................................................10 3 METODOLOGIA ...........................................................................................................11 3.1 Material ...........................................................................................................11 3.2 Mtodos ..........................................................................................................11 4 RESULTADOS E DISCUSSES .................................................................................13 5 CONCLUSO ...............................................................................................................15 6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................................16

INTRODUO
A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao no qual os constituintes da amostra so particionados em duas fases, uma estacionria e a outra mvel. A grande variedade de combinaes entre fases mveis e estacionrias a torna uma tcnica extremamente verstil e de grande aplicao Collins et al. (1993 apud SILVA, 2009, p.1). So vrios os critrios usados para a classificao das diferentes modalidades de cromatografia, sendo os mais comuns relacionados tcnica empregada, ao mecanismo de separao envolvido e aos diferentes tipos de fases utilizadas Collins et al. (1997 apud TRRES, 2009, p.9). Dentre os vrios mtodos cromatogrficos, a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) do ingls High Performance Liquid Chromatography (HPLC), o mais novo e mais importante membro de uma famlia inteira de tcnicas de separao. Por meio da CLAE pode-se detectar a maioria dos compostos e analisar traos de compostos em amostras complexas, como sangue, urina, solo, alimentos e petrleo. Deste modo, o objetivo deste relatrio descrever a tcnica de Cromatografia lquida de alta eficincia utilizada para determinao da concentrao de uma amostra desconhecida a partir de uma amostra padro.

2 REFERENCIAL TERICO
A cromatografia foi descoberta em 1903 pelo botnico italiano Mikahail Tswett, que separou pigmentos de plantas usando um hidrocarboneto como solvente e a inulina (carboidrato) em p como fase estacionria. A separao das bandas coloridas fez com que a tcnica fosse chamada de cromatografia, a partir da palavra grega cromatos, que significa cor (HARRIS, 2005). A cromatografia um mtodo de anlise que ocupa um lugar de destaque em vrios campos da Cincia devido sua capacidade de identificao e purificao de compostos, por comparao com padres preexistentes, separando as substncias indesejveis e os componentes de uma mistura (FRACETO; LIMA, 2003). O processo cromatogrfico consiste na separao dos componentes de uma mistura, realizada atravs da distribuio destes componentes em duas fases, uma permanecendo estacionria e a outra se movendo atravs dela. A fase mvel (o solvente se movendo atravs da coluna), pode ser um lquido ou um gs, e a fase estacionria (fixa dentro da coluna) normalmente um lquido viscoso quimicamente ligado a superfcie de partculas slidas empacotadas dentro da coluna (HARRIS, 2008). A distribuio dos solutos entre as fases mvel e estacionria provoca a separao dos componentes de uma mistura. A passagem de um lquido ou de um gs por uma coluna cromatogrfica chamado de eluio, desse modo, o fludo que entra na coluna o eluente e o fludo que emerge pelo final da coluna e chamado de eluato (HARRIS, 2005) So as foras fsicas e qumicas que atuam entre os solutos, e as duas fases so responsveis pela reteno dos solutos sobre a coluna cromatogrfica. A diferena na magnitude dessas foras que determina a resoluo e portanto a separao dos solutos individuais (CEFET, 2008). A informao obtida de um ensaio cromatogrfico dada num cromatograma, isto , um registro da concentrao ou da massa dos componentes da amostra em funo do tempo ou do volume de fase mvel. A informao obtida de um cromatograma inclui uma indicao da complexidade da amostra com base no nmero de picos ou manchas, informao qualitativa com base na posio na determinao da posio dos picos ou manchas, informao quantitativa com base no valor do integral da variao da concentrao do componente em funo do

5 tempo (rea do pico ou intensidade da mancha) e ainda uma indicao do estado de conservao do sistema cromatogrfico (TRRES, 2009).

2.1 Classificaes da cromatografia A cromatografia classificada de acordo com vrios critrios sendo os mais comuns relacionados forma fsica, aos diferentes tipos de fases utilizadas e ao 2.1.1 Classificao pela forma fsica Em relao forma fsica do sistema, a cromatografia pode ser subdividida em cromatografia em coluna, onde a fase estacionria colocada em um tubo cilndrico, e cromatografia planar, disposta sobre uma superfcie planar. Enquanto a cromatografia planar resume-se cromatografia em papel (CP) e cromatografia em camada delgada (CCD). A cromatografia em coluna mais entendida quando classificada quanto outro critrio Neto e Nunes (2003 apud TRRES, 2009 p. 4).

2.1.2 Classificao pela fase mvel empregada

Quanto fase mvel, existem trs tipos de cromatografia: gasosa, lquida e supercrtica (CSC). No entanto h uma de alta eficincia (CLAE). Na fase gasosa tambm ocorre uma subdiviso, e os mtodos podem ser classificados em: cromatografia gasosa (CG) e cromatogrfica gasosa de alta resoluo (CGAR). A6 classificao da cromatografia est melhor representada a seguir pela figura 1: [Digite uma citao do documento ou o resumo de uma questo interessante. Voc pode posicionar a caixa de texto em qualquer lugar do documento. Use a guia Ferramentas de Caixa de Texto para alterar a formatao da caixa de texto da citao.] importante subdiviso dentro da cromatografia lquida: cromatografia lquida clssica (CLC) e a cromatografia lquida

FIGURA 1. Representao esquemtica dos diferentes tipos de cromatografia

2.1.3 Classificao quanto ao mecanismo de separao Por este critrio, separaes cromatogrficas se devem adsoro, partio, troca inica, excluso ou afinidade.

2.2 Cromatografia Lquida de alta Eficincia A cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) um processo de anlise de separao fsica, que permite a anlise qualitativa e quantitativa dos componentes de uma amostra em poucos minutos, com alta resoluo, eficincia e sensibilidade (OLIVEIRA et al., 2007). A CLAE utiliza instrumentos muito sofisticados que podem ser totalmente automatizados, mas foi somente a partir dos anos 70 que se conseguiu um avano considervel da tcnica. O avano foi gradual e atingiu o atual nvel de sofisticao que a CLAE apresenta, devido ao revolucionrio desenvolvimento tecnolgico deste tipo de cromatografia (PERES, 2002). A cromatografia a lquido de alto desempenho um tipo de cromatografia que emprega uma fase mvel lquida e uma fase estacionria finamente dividida e que, 7 para ter um fluxo razovel, opera a presses elevadas. Originalmente chamava-se cromatografia lquida de alta presso e esta terminologia foi abandonada quando se constatou que o diferencial de comportamento desta para as demais cromatografias lquidas no era a maior presso, mas sim o melhor desempenho cromatogrfico (SILVA, 2009).

2.2.1 Componentes e funcionamento da CLAE

A CLAE emprega um conjunto de equipamentos especiais, que podero diferir em caractersticas e grau de automao, no entanto so necessrios para uma execuo correta do cromatgrafo lquido (TRRES, 2009). Os cromatgrafos lquidos se caracterizam por apresentarem os seguintes componentes (Figura 2): Reservatrio e sistema de bombeamento da fase mvel (bomba); Sistema de introduo da amostra (injetor); Sistema analtico coluna cromatogrfica e termostato das colunas (coluna); Sistema de deteco (detector); Sistema de registro e tratamento de dados (registrador);

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Figura 2. Componentes da CLAE Fonte: Adaptado de: Cromatografia Lquida de Alta Eficincia- Instituto de Qumica UNICAMP.

De acordo com a Figura 2, o solvente que se encontra no reservatrio, bombeado com a ajuda da bomba atravs do sistema de introduo da amostra at a coluna cromatogrfica, que geralmente recoberta por slica. Aps a chegada do solvente na coluna, ocorre a separao dos componentes da mistura de acordo com a natureza da fase mvel, fase estacionria e dos componentes analisados. Sendo

assim, a fase mvel sai da coluna e passa pelo sistema de deteco onde as alteraoes de fsicas de alguma propriedade da mistura so identificadas. Essas alteraes so transformadas em um sinal eltrico, que registrado e tratado em um processador de dados (TRRES, 2009). A partir dos dados registrados pelo processador gerado um grfico, chamado de cromatograma. Para avaliar os cromatogramas, existem frmulas prestabelecidas, como para calcular o nmero de pratos tericos, eficincia e resoluo. Os pratos tericos esto relacionados ao equilbrio entre as fases mvel e estacionria, e entre o componente analisado, assim, quanto maior o nmero de pratos tericos maior o equilbrio existente. A eficincia de uma coluna est relacionada com o alargamento dos picos, pois quanto maior o alargamento dos picos, menor ser a eficincia na separao. Um cromatograma com boa resoluo caracterizado pelos picos separados, sendo ideais picos finos e altos, e todos os picos finalizados na linha da base antes de iniciar outro pico (COLLINS et al., 1997).

2.2.2 Detectores de absoro no UV-Visvel Um detector um transdutor que converte uma mudana de concentrao na fase mvel eluente num sinal, que registrado num processador de dados (CEFET, 2008) Nos detectores de absoro no UV-visvel, o funcionamento se baseia na absorbncia da luz por parte da amostra ao passar atravs dela qualquer radiao eletromagntica (ultravioleta at o infravermelho), em um dado comprimento de onda (TRRES, 2009). A resposta deste detector ser seletiva, porque s detectar os compostos que absorvem no comprimento de onda em que opera o detector (PATONAY, 1992). 9 2.2.3 Fases Mveis e Estacionrias usadas na CLAE

Na CLAE e em todos as cromatografias lquidas, a fase mvel deve ser um lquido, e deve apresentar as caractersticas: alto grau de pureza ou de fcil purificao, dissolver a amostra sem decompor seu componentes, no dissolver ou

decompor na fase estacionria, ter baixa viscosidade, ser compatvel com o tipo de detector utilizado e ter polaridade adequada para permitir a separao dos componentes da amostra (AQUINO-NETO, 2003). As fases estacionrias na CLAE devem ser os materiais ideais, ou seja, aqueles que em menor tempo possuem a mxima capacidade de dar a resoluo na separao da mistura, sejam de fcil introduo na coluna, produzam o mnimo de presso possvel e possuam menos custo. As fases mveis e estcionris devem ser de polaridades opostas, para que o analito possa passar pela coluna sendo conseqentemente separado, j que interage mais com a fase estacionria. (TRRES, 2009). Por mais de 30 anos a slica tem sido o material preferido para a preparao das fases estacionrias, sendo que mecanicamente estvel altas presses, pode ser facilmente modificada, existe um vasto conhecimento de sua estrutura e suas propriedades e comercialmente disponvel em uma grande variedade de tamanho de partculas, formas e tamanhos de poros (TONHI et al., 2001).

2.2.4 Cromatografia em Fase Normal (NPC) e em Fase Reversa (RPC)

As separaes em CLAE podem se dar por adsoro, partio ou ambos, sendo que o suporte mais utilizado para esse tipo de cromatografia a slica. Essas fases, dependendo da modificao feita ao suporte podem atuar no modo normal ou reverso (DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998) A cromatografia em fase reversa caracterizada por apresentar a fase estacionria mais apolar do que a fase mvel, e no entanto a cromatografia lquida chamada de fase normal. Cromatografia em fase inversa permite separar molculas com base na sua 10 polaridade, sendo a fase estacionria quimicamente modificada com slica hidrocarbonetos saturados, insaturados ou tipos aromticos. Isso faz com que a fase estacionria seja uma matriz apolar. Portanto, para este tipo de cromatografia utilizada misturas de solventes polares como a gua, acetonitrila, acetato de etila, entre outros (OLIVEIRA et al., 2007).

2.2.5 Vantagens e Desvantagens da CLAE

A CLAE possui muitas vantagens significativas, onde sua fase estacionria pode ser utilizada vrias vezes, possui um menor tempo de anlise e eficiente preciso, tendo uma alta resoluo (picos cromatogrficos mais separados). uma boa tcnica para anlises quantitativas e qualitativas, onde a segunda se baseia em parmetros de identificao como, o tempo de reteno e o espectro de absoro no UV, j a anlise quantitativa apresenta desvios inferiores a 5%. Tem tambm pontos positivos como a boa detectabilidade da absoro UV-Visvel e de fluorescncia. Outra importante vantagem a sua automao, devido o autosampler e o computador, pois o uso deste tem aumentado a capacidade de utilizao dos aparelhos para a preparao da amostra, a injeo, o controle, aquisio e tratamento de dados (BOTTOLI, 2008). Em contrapartida, tem como uma vantagem bastante significativa o alto custo do equipamento, assim como alto custo para mant-lo em situaes normais para uso. No existe um detector universal que possua boa detectabilidade e baixo custo respectivamente (BOTTOLI, 2008).

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3 METODOLOGIA
3.1 Material

Os materiais utilizados para a anlise das amostras, e determinao da concentrao da amostra desconhecida, atravs da Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE), foram os seguintes: Cromatgrafo Lquido de Alta eficincia (CLAE); Amostra padro de 2,4-D (2,4 dicloro-fenxiactico); Amostra desconhecida; Fase mvel: Aceto Nitrila (60%) e gua (40%); Fase estacionria: Slica recoberta com LC-C18 (octadecil silano); Computador para processamento de dados; 3.2 Mtodos O CLAE um equipamento muito desenvolvido e como o prprio nome diz, trabalha com uma alta eficincia, dessa forma no h a necessidade de outros materiais para realizar a separao e classificao da amostra, a no ser o prprio equipamento. O procedimento de anlise das amostras iniciou-se com a explicao terica sobre o funcionamento do equipamento. Dessa forma, ocorreu a injeo da amostra padro de 2,4-D, injeo essa que foi feita atravs de um autosampler, o qual possui uma vlvula de injeo que puxou a amostra. Posteriormente a amostra padro passou por um detector, neste caso UV visvel, que possui uma pequena clula de fluxo conectado na sada da coluna e que monitora a concentrao dos analitos, este detector detecta a sensibilidade e a especificidade da amostra. Por fim, ocorreu o tratamento de dados, feito atravs de um computador que 12 possui um software especfico que coletou os dados e os processou na forma de cromatogramas. Em seguida, todo esse processo foi feito para determinar a concentrao da amostra desconhecida, a qual gerou novamente um cromatograma que foi comparado amostra padro.

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4 RESULTADOS
No CLAE utilizado, a cromatografia foi em coluna RP, ou seja, de fase reversa com 15 centmetros, com um suporte contendo partculas de slica (superfcie polar),

as quais so revestidas por um grupo funcional C18 (octadecil silano), que possui uma superfcie apolar, dessa maneira, as cadeias carbnicas atraram substncias apolares, deixando as substncias polares passarem com mais facilidade. A coluna, continha aceto nitrila e gua como fase mvel e, slica como fase estacionria. O equipamento possui tambm um bujo (cartucho) que forma uma prcoluna, o qual retm impurezas protegendo a coluna e tambm possibilitando a ela uma vida til e mais longa. Todo esse processo de cromatografia resultou em um cromatograma que formou picos de deteco. Sendo assim, no primeiro cromatograma, ou seja, da amostra padro, injetada com um volume de 0,01 mL, o tempo de reteno em que a amostra passou pelo detector foi de 4,83 min. A deteco emitiu duas luzes, uma azul claro, com 230 nanmetros e a outra, azul escuro, com 280 nanmetros. A velocidade do fluxo foi de 1 mL/min., com concentrao de 25 g/mL, uma rea de 323,696 [mV.s] e altura de 42,848 [mV]. Dessa maneira, segue abaixo o grfico 1 referente a amostra padro:

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Grfico 1. Cromatograma de uma amostra padro de 2,4 dibromofenxiactico

A segunda amostra foi injetada com um volume de 0,01 mL, apresentando uma rea de 55,88 [mV.s] e altura de 7,445 [mV]. A rea do pico foi proporcional a concentrao da amostra, porm como a concentrao da amostra no era conhecida, foi comparada amostra padro. Desta forma, para encontrar a

concentrao, foi calculada atravs de regra de trs resultando em uma concentrao de 4,3 g/mL. O grfico 2, da amostra desconhecida, esta apresentado a seguir:

Grfico 2. Cromatograma da amostra desconhecida

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5 CONCLUSO

Atravs da prtica realizada, foi possvel concluir que a amostra dois, de concentrao antes desconhecida, apresentou 4,3 g/mL de concentrao. Quanto maior a rea do pico, maior a concentrao da substncia. A aplicabilidade da CLAE ampla em vrios setores reas, como na qumica, indstria, sade e meio ambiente, porm ainda pouco explorada, provavelmente por falta de conhecimento de suas utilizaes. Para utilizao da CLAE, necessrio conhecimento e estudo prvio de todos os mecanismos e fatores que esto relacionados tcnica, pois apesar de os equipamentos cromatogrficos serem aparelhos automatizados, o manejo e a padronizao para cada amostra diferente e necessita de experincia. A CLAE apresenta vrias vantagens, a principal delas a sua capacidade de separao e quantificao de compostos presentes em uma determinada mistura. Indubitavelmente, a prtica serviu para adquirirmos um maior conhecimento na rea da cromatografia, e conseqentemente suas aplicaes na Engenharia Ambiental.

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6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

AQUINO-NETO, F.R; NUNES, D.S.S. Cromatografia: princpios bsicos e tcnicas afins. Rio de Janeiro:Intercincia, 2003, 187p. BOTTOLI, C. B. G. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia. Instituto de Qumica UNICAMP, 2008.

CENTRO FEDERAL DE EDUCAO TECNOLGICA. Cromatografia lquida de alta resoluo. Rio de janeiro, 2008. Disponvel em: <http://www.ifrj.edu.br/aluno/a/instrumental/CLAE.pdf>. Acesso em: 10 jun. 2010. COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P.S. Introduo a mtodos cromatogrficos. 5 ed. Campinas, SP, 1993. DEGANI, A. L. G.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia: um breve ensaio. 7 ed. 1998. Disponvel em: <http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc07/atual.pdf>. Acesso em: 14 jun. 2010. FRACETO, L. F.; LIMA de, S. L. T. Aplicao da cromatografia em papel na separao de corantes em pastilhas de chocolates. 18 ed. p. 46, 2003. Disponvel em: < http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc18/A10.PDF>. Acesso em: 10 jun. 2010. HARRIS, D. C. Anlise qumica Quantitativa. Rio de Janeiro: Focus, 6 ed. 2005. NETO, F. R. A.; NUNES, D. S. S. Cromatografia: Princpios bsicos e tcnicas afins. Rio de Janeiro, RJ, 2003. OLIVEIRA, R. F.; SIQUEIRA,A. K. P. B.; FERREIRA, A. L. O.; GONALVES, L. R. B. Departamento de Engenharia Quimica - Universidade Federal do Ceara. Disponvel em: < http://www.ufscar.br/cobeqic07/pdf/poster_i/pi103.pdf>. Acesso em: 17 jun. 2010. PATONAY, G. HPLC Detection: Newer methods. New York: VCH, 1992, 236p. PERES, T.B. Noes bsicas de cromatografia. Biolgico. So Paulo, 2002, v.63, n.2, p.227-229.

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SILVA da. D. S. M. Cromatografia Lquida de alta eficincia (HPLC). 2009. Disponvel em: <http://www.webartigos.com/articles/19831/1/Cromatografia-Liquidade-Alta-Eficiencia-HPLC-/pagina1.html>. Acesso em: 14 jun. 2010. TONHI, E.; COLLINS, K.E.; JARDIM, I.C.S.F.; COLLINS, C.H. Fases estacionrias para cromatografia lquida de alta eficincia em fase reversa (CLAE-FR) baseadas em superfcies de xidos inorgnicos funcionalizados. So Paulo, 2001. TRRES, A. C. B. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia. Goinia, 2009.