Hereditariedade ligada aos CROMOSSOMAS SEXUAIS Thomas H.

Morgan embriologista, desenvolveu trabalho com as moscas Drosophila Melanogaster (mosca da fruta). Razes para o uso de Drosophila Melanogaster: Apresenta um curto perodo de desenvolvimento e apresenta cromossomas muito grandes, que facilitam o seu estudo e observao.

Aspecto da Drosophila Melanogaster

Forma selvagem Corpo cinzento Olhos vermelhos Asas longas Forma mutante Corpo negro Olhos brancos Asas vestigiais

Representamos a constituio gentica das formas alternativas pela letra inicial da palavra inglesa que expressa a caracterstica que elas manifestam. Exemplo: alelo para olhos brancos -> w (white). Quando da forma selvagem w+. Nas experincias de Mendel no era relevante que um determinado fentipo pertencesse a uma fmea ou a um macho o cruzamento recproco no interferia nos resultados. Os resultados obtidos por Morgan eram diferentes ao cruzar uma fmea de olhos vermelhos com um macho de olhos brancos no obtinha os mesmos resultados de quando cruzava uma fmea de olhos brancos com um macho de olhos vermelhos. No 1 cruzamento todos os indivduos apresentavam olhos vermelhos, sendo 50% machos e 50% fmeas de acordo com o previsto por Mendel. No 2 cruzamento as fmeas tm todas olhos vermelhos e os machos olhos brancos no se verifica a uniformidade fenotpica dos indivduos da primeira gerao.

COMO EXPLICAR? Na Drosophila, como na maioria das espcies animais, existe um par de cromossomas chamado cromossomas sexuais. Indivduos que HOMOGAMTIC apresentam dois OS cromossomas sexuais idnticos Indivduos que HETEROGAMTIC apresentam dois OS cromossomas sexuais diferentes entre si Como a espcie humana, as fmeas de Drosophila, para alm dos autossomas, apresentam dois cromossomas sexuais X, enquanto que os machos apresentam, para alm dos autossomas, um cromossoma sexual X e outro, mais curto e praticamente desprovido de genes, Y. O sexo heterogamtico portanto o masculino. Se considerarmos que o alelo da cor branca dos olhos de Drosophila se localiza no cromossoma X, podemos justificar o resultado dos dois cruzamentos. As caractersticas hereditrias que dependem de genes localizados no cromossoma X so caractersticas ligadas ao sexo. Nestes casos, os resultados obtidos no cruzamento directo e no seu recproco so diferentes. Estes resultados devem-se ao facto de o cromossoma Y do macho no possuir os alelos correspondentes do cromossoma X, dado que os dois cromossomas no so totalmente homlogos. A maior parte dos genes localizados no cromossoma X no tm alelo correspondente no cromossoma Y, pelo que existe um nico alelo para esse gene e esse alelo exprime-se sempre no fentipo dos machos, que so hemizigticos. Os genes presentes no cromossoma Y so transmitidos DE PAI PARA FILHO. Os genes presentes no cromossoma X so transmitidos de PAI PARA FILHA e de ME PARA FILHO OU FILHA.
Transmisso de um alelo DOMINANTE ligado ao cromossoma X O carcter exprime-se sempre nos homens, de uma forma mais severa do que nas mulheres O carcter exprime-se nas mulheres homozigticas dominantes e heterozigticas Um homem afectado tem uma me afectada Uma mulher afectada tem uma Transmisso de um alelo RECESSIVO ligado ao cromossoma X O carcter exprime-se sempre nos homens O carcter exprime-se apenas nas mulheres homozigticas recessivas ( e nos homens?) Um homem afectado tem uma me afectada ou portadora Uma mulher afectada tem

me afectada ou um pai afectado Sndrome de Rett, hipertricose

obrigatoriamente um pai afectado e uma me afectada ou portadora Daltonismo, hemofilia, diabetes inspidos

Os trabalhos de Morgan so excepes s Leis de Mendel contudo, apoiaram a teoria cromossmica da hereditariedade.

Descrio Os genes localizados no mesmo cromossoma, no sofrem geralmente, segregao independente na meiose ficam juntos nos mesmos gmetas e, por isso, os fentipos da descendncia no seguem as propores previstas pelas Leis de Mendel. Os fenmenos de crossing-over podem separar genes ligados, o que faz com que se comportem como se estivessem localizados em cromossomas diferentes e apaream recombinados na descendncia. Quanto mais distantes estiverem dois genes no mesmo cromossoma, maior a probabilidade de serem separados por crossing-over.

Exemplos de situaes em que se verifica

Ligao factorial

O gene do grupo sanguneo Rh e o gene da eliptocitose (uma forma de anemia) esto localizados no mesmo cromossoma. Estes dois cromossomas so herdados em bloco por 96% dos indivduos e 4% dos indivduos so recombinantes.

Explicao do manual Cada cromossoma tem de ter muitos genes. Os genes que se dispem linearmente ao longo do mesmo cromossoma dizem-se em linkage e constituem um grupo de ligao factorial so transmitidos em bloco.

Cruzam-se indivduos de duas linhas puras com caractersticas antagnicas. Fenotipicam Corpo x Corpo cinzento ente negro e e asas longas asas vestigiais Genotipicam bbvgvg x b+b+vg+vg+ ente
b smbolo do alelo responsvel pela cor negra (black) vg smbolo do alelo responsvel pelas asas vestigiais ( vestigials) b+ - smbolo do alelo responsvel pela cor selvagem (cinzenta DOMINANTE) vg+ - smbolo do alelo responsvel pela forma selvagem das asas (longas DOMINANTE)

O cruzamento destas linhas puras resulta numa gerao F1 cujos resultados correspondem a uma situao normal de diibridismo, em que os descendentes so HETEROZIGTICOS e manifestam as caractersticas do ALELO DOMINANTE. Fentipo Corpo cinzento e asas longas Gentipo heterozigtico b+bvg+vg para que se mantivessem as previses mendelianas, deviam agora surgir quatro classes fenotpicas, que seriam:
Fentipo dos descendentes Corpo cinzento e asas longas Corpo negro e asas longas Corpo cinzento e asas vestigiais Corpo negro e asas vestigiais Resultados esperados em diibridismo 9/16 3/16 3/16 1/16 Resultados Estes observados 3/4 1/4

resultados so explicados pelo facto de os alelos do corpo negro e asas vestigiais esto situados no mesmo cromossoma so transmitidos em conjunto (no h segregao independente prevista por Mendel) correspondem a um cruzamento de Linhas puras em monibridismo.

Nem sempre os genes em linkage se comportam como uma unidade inseparvel pode acontecer, que como resultado de crossing-over durante a meiose, os genes se separarem, como se estivessem em cromossomas separados. Assim, obtm-se uma descendncia qualitativamente igual prevista numa segregao independente (em que os alelos so segregados de forma aleatria). Contudo, estes genes s se transmitem deste modo quando h a sua separao em crossing-over, e isto ocorre muito menos frequentemente que a transmisso em bloco. Embora possam surgir as 4 classes fenotpicas esperadas, as suas propores so completamente aleatrias.

Organizao e regulao do material gentico

Genoma totalidade do material gentico de um indivduo (contm todos os genes). Gene sequncia de nucletidos de uma molcula de DNA que origina uma molcula de RNA funcional.

Organizao do Material Gentico

Genoma dos procariontes

Genoma dos eucariontes

Vrias molculas lineares de DNA nuclear associadas a uma grande quantidade de protenas, especialmente histonas, formando a cromatina. Cada molcula de DNA associada a protenas constitui um cromossoma. Tambm possui material gentico extranuclear. As mitocndrias e cloroplastos contm DNA que codifica produtos essenciais sua funo biolgica e que muito semelhante ao DNA bacteriano.

Molcula circular de DNA associada a protenas no histnicas, que forma o seu nico cromossoma e se concentra na regio do nucleide. Algumas bactrias tambm possuem molculas circulares de DNA chamadas plasmdeos.

Um caritipo organiza os cromossomas metafsicos aos pares com base no seu tamanho e noutras marcas fsicas, como a posio do centrmero. O caritipo humano tem 46 cromossomas, organizados em 23 pares. 44 so autossomas e so idnticos nos dois sexos (possuem os mesmos genes, na mesma sequencia) e 2 so heterossomas (ou cromossomas sexuais). A anlise do caritipo til para confirmar diagnsticos clnicos de certas doenas de transmisso hereditria a comparao de caritipos de diferentes espcies permite encontrar relaes evolutivas. Regulao do material gentico Temos muitos genes no nosso corpo, mas s apenas alguns se manifestam. Tem de haver portanto uma regulao dos genes. Este processo foi estudado pelos franceses Franois Jacob e Jacques Monod. Os organismos unicelulares reagem s variaes do meio ambiente, variando a expresso dos genes e ajustando o seu metabolismo desenvolveram mecanismos de resposta RPIDOS face s alteraes das condies do meio, das quais dependem muito. Nos eucariontes multicelulares, o controlo da expresso dos genes torna possvel que as clulas com o mesmo DNA possam divergir (em forma e funo), tornando-se especializadas. A transcrio do DNA para mRNA um exemplo da regulao da expresso dos genes. Modelo do Opero (principal mecanismo de controlo da expresso dos genes em bactrias) Opero Unidade funcional constituda pelos elementos descritos Genes estrutu rais Gene promot or Gene operad
abaixo. Conjunto de genes que codificam protenas com funes relacionadas. Ex.: enzimas de uma determinada via metablica Sequncia especfica de nucletidos do DNA qual se liga a RNA polimerase e onde tem incio a transcrio Sequncia de DNA que controla o acesso da RNA polimerase ao promotor e que permite activar ou

or Gene regulad or Repres sor

desactivar a transcrio de todos os genes estruturais Encontra-se a uma determinada distncia do opero, tem o seu prprio promotor e codifica o repressor uma protena alostrica com duas formas, uma activa e uma inactiva. especfico, reconhece e liga-se apenas ao operador de um determinado opero.

Explicao do funcionamento do opero lac.:

Explicao do funcionamento do opero trp.:

Funcionamento de um operao do tipo

NA AUSNCIA DE LACTOSE O gene regulador determina a sntese de um repressor; O repressor bloqueia o promotor, ao ligar-se ao operador; A enzima RNA polimerase no se liga ao promotor; Os genes estruturais no so transcritos;

indutivo

NA PRESENA DE LACTOSE A lactose liga-se ao repressor, inactivando-o; O operador fica desbloqueado; A enzima RNA polimerase ligase ao promotor; Os genes estruturais so transcritos;

No ocorre a sntese das trs enzimas.

D-se a sntese de enzimas.

Funcionamento de um operao do tipo

repressivo
NA AUSNCIA DE TRIPTOFANO O gene regulador produz um repressor que est inactivo; O operador est livre; A RNA polimerase pode ligarse ao promotor; D-se a transcrio; NA PRESENA DE TRIPTOFANO O triptofano liga-se ao repressor, activando-o; O repressor liga-se ao operador; A RNA polimerase no pode ligar-se ao promotor; No se d a transcrio;

Ocorre a sntese de enzimas.

No se sintetizam as enzimas.

Muitos genes de um genoma se destinam a regular o funcionamento de outros genes. Os genes que se expressam numa determinada situao dependem das interaces que o ambiente estabelece com o DNA.

Transmisso Gentica de Genes Mitocndriais

O material gentico contido nas mitocndrias transmitido pela me para os filhos e filhas. A razo para este facto simples: o citoplasma (e todos os seus constituintes) que vai dar origem ao zigoto proveniente do ocito (tem, portanto, todos os organelos celulares da me incluindo a mitocndria!); o espermatozide, apenas contribui com o ncleo para a

formao do zigoto, pelo que no so transmitidas as mitocndrias do progenitor masculino. Diferenas e semelhanas entre o DNA mitocondrial e o DNA nuclear.

DNA mitocondrial
No possui exes No ocorre crossing-over Possui vrias cpias de DNA em cada mitocndria, permitindo que na mesma clula existam diferentes alelos para o mesmo gene Taxa de mutao muito elevada No possui enzimas que reparam o DNA

DNA nuclear
Possui exes Ocorre crossing-over S possui uma cadeia (com dupla hlice) de DNA no ncleo da clula Taxa de mutao pouco elevada Possui enzimas que reparam o DNA

Mutaes
Mutao alterao permanente no material gentico que afecta a expresso de um ou mais genes. Apesar de se darem centenas de alteraes do DNA por dia, as clulas possuem enzimas capazes de corrigir ou eliminar pores mutadas do DNA, diminuindo a hiptese de esta ser uma mutao que se manifeste fenotipicamente. Podem ser gnicas ou cromossmicas. m. gnicas alteram a estrutura do DNA; m. cromossmicas alteram a estrutura/nmero de cromossomas; m. silenciosas no alteram a protena ou a sua aco; m. letais provocam a morte ou doenas e anomalias; m. benficas levam evoluo das espcies; m. prejudiciais provocam a morte do indivduo. Agentes mutagnicos so factores do meio que provocam mutaes em genes e/ou cromossomas.

As mutaes podem ocorrer em clulas somticas ou germinativas. Mutao somtica Ocorre durante a replicao do DNA que precede uma diviso mittica. Pode originar um conjunto ou um clone de clulas mutantes identicas entre si, que se distinguem das restantes clulas do indivduo. A descendncia do indivduo no afectada. Este tipo de mutao est na origem de certos cancros. Mutao nas clulas germinativas Ocorre durante a replicao do DNA que precede a meiose. A mutao afecta os gmetas e todas as clulas que dela descendem aps a fecundao. Mutaes gnicas Ocorrem quando se d uma alterao pontual ao nvel dos nucletidos de um gene, constituindo-se uma nova verso do gene. Alteram a sequencia de nucletidos do DNA, por substituio, adio (insero) ou remoo (deleco) de bases. Estas mutaes podem conduzir modificao da molcula de mRNA que transcrita a partir do DNA e altero da protena produzida. O efeito desta alterao imprevisvel, dependendo de qual o tipo de mutao e qual a protena que passa a ser codificada. Pode ter efeitos benficos e levar evoluo da espcie, ou pode ser prejudicial e causar a morte do indivduo ou um grande numero de doenas e anomalias. Pode tambm ter um efeito neutro, no causando quaisquer modificaes.

Mutaes gnicas
Substitui o Insero Ocorre a troca de um ou mais pares de bases. Acontece quando uma ou mais bases so adicionadas ao DNA, modificando a ordem de leitura da molcula durante a replicao ou transcrio. Acontece quando uma ou mais bases so retiradas do DNA, modificando a ordem de leitura, durante a replicao ou transcrio.

Deleco

A adio/remoo de um numero que no seja mltiplo de trs altera completamente a mensagem do gene.

Mutaes cromossmicas
Traduzem-se numa alterao da estrutura ou do nmero de cromossomas. Podem afectar uma determinada regio de um cromossoma, um cromossoma inteiro ou todo o complemento cromossmico de um indivduo.

Mutaes cromossmicas numricas

Tipo de mutao Definio/causas Existe pelo menos um conjunto completo de cromossomas a mais.
Entre as causas possiveis: -fecundao de um ocito por 2 espermatozides; -fecundao de um gmeta diplide (triploidia); -falta de diviso do zigoto aps a replicao dos cromossomas

Consequncias/exempl os
comum nas plantas. As plantas poloplides podem autopolinizar-se ou cruzar-se com plantas semelhantes. Nos humanos embies poliplides no se desenvolvem e so abortados espontaneamente. Algumas clulas somticas podem ser poliplides. Anuploidias mais comuns em seres humanos so as trissomias dos cromossomas 21, 13, 18 e a monossomia do X. Aneuploidias de outros cromossomas no permitem o desenvlvimento at ao nascimento e resultam num aborto espontneo. As aneuploidias nos cromossomas sexuais so melhor toleradas que as dos autossomas. Sndrome.

Poliploidia Aneuploidia

Existem cromossomas a mais ou a menos em relao ao numero normal.

Geralmente, envolve apenas um par de cromossomas e pode ser autossmica ou nos cromossomas sexuais. Podem distinguir-se: Polissomia um ou mais cromossomas extra; Monossomia um cromossoma em falta; As aneuploidias so causadas pela nodisjuno dos cromossomas homlogos ou dos cromatdeos na anafase da meiose I ou II. Um gmeta recebe 2 cromossomas do mesmo par e outro no recebe nenhum.

Sindromes estudadas: Trissomia 21 (47,XX) ou (47,XY) SNDROME DE DOWN Cromossoma extra no lote 21. Monossomia do X (45,X0) SNDROME DE TURNER Afecta apenas mulheres, que carecem de um dos cromossomas sexuais. (47,XXY) SNDROME DE KLINEFELTER

Mutaes cromossmicas estruturais

Tipo de mutao Deleco Definio/Causas
Representa uma perda no material cromossmico. As deleces visveis de cromossomas humanos esto sempre associadas a grandes incapacidades. Caracteriza-se pela repetio de uma poro de cromossoma. As duplicaes so alteraes cromossmicas muito importantes sob o ponto de vistaa evolutivo, porque fornecem informao gentica complementar, potencialmente capaz de assumir novas funes. Ocorre uma inversao quando um segmento cromossmico experimenta uma rotao de 180 em relao posio normal, sem alterar a sua localizao no cromossoma. A transferencia de uma poro de um cromossoma, ou mesmo de um cromossoma inteiro para outro no homlogo designa-se por translocao simples. As translocaes mais comuns so as translocaes recprocas, havendo troca de segmentos entre cromossomas no homlogos. As translocaes podem alterar drasticamente o tamanho dos cromossomas, assim como a posio do centrmero.

Consequncias/Exempl os

Duplica o

Transloca o

Inverso

Poliploidia
Os inivduos poliplides so indivduos em que o nmero de conjuntos completos de cromossomas multiplo do numero haploide primitivo

existente nos gmetas. Apresentam caritipos triploides (3n), tetraploides (4n) ou mesmo numeros mais elevados de cromossomas. A poliploidia surge: - acidentalmente; - a partir da no-disjuno dos cromossomas durante a meiose ou mitose. Tambm pode acontecer que no h citocinese na repartio dos cromossomas pelas clulas filhas. - cruzamento entre indivduos de espcies diferentes (o que muito comum entre as plantas) os indivduos resultantes deste processo so naturalmente estreis, uma vez que no possuem cromossomas homologos, no podendo estes emparelhar durante a meiose. Como que estes indivduos se reproduzem ento? Atravs de reproduo assexuada no caso dos individuos que resultam do cruzamento entre espcies diferentes, estes acabam por tornar-se ferteis apos algumas geraes, devido a uma ocorrencia de uma duplicao cromossmica resultante de uma no-disjuno dos cromossomas na diviso celular. A poliploidia muitas vezes provocada em laboratrio para que se obtenham plantas mais resistentes, com grandes frutos, sem caroo ou sementesm gros de trigo maiores, etc.

As Mutaes, a tecnologia e a vida

Um agente mutagnico qualquer agente responsvel por uma mutao. O processo que conduz ao aparecimento de mutaes pelo agente mutagnico a mutagnese. As nossas clulas tem a capacidade de reparar alguns danos causados ao DNA. H portanto, um equilbrio entre a proliferao celular, em que as clulas se renovam e multiplicam e entre a morte das clulas. Apesar disso, este equilbrio por vezes perde-se umas das consequncias o aparecimento de um cancro. Um cancro (neoplasia maligna/tumor maligno) um conjunto muito heterogneo e multifactorial de doenas que tm em comum o facto de apresentarem sempre o crescimento de um tecido neoformado. Outra definio O cancro uma doena gentica que resulta da perda de controlo do ciclo celular. A diviso da clula com mais frequncia d origem a uma populao de clulas em proliferao descontrolada e forma um tumor. As clulas cancerosas: -so pouco especializadas e com forma arredondada; -dividem-se continuamente; -invadem os tecidos adjacentes; -podem instalar-se noutros lugares do organismo. O aparecimento de cancros est normalmente associado a alteraes dos mecanismos que regulam a diviso celular. Necrose as clulas morrem devido aco de substncias txicas ou falta de nutrientes essenciais. Apesar de manterem o ncleo intacto, aumentam de volume, rompe-se a membrana plasmtica e verte-se o contedo da clula no meio extracelular, causando uma pequena inflamao.

Apoptose ocorre um conjunto de fenmenos programados geneticamente e que levam morte da clula processo mais comum. Quando as clulas apresentam anomalias sobretudo genticas ou j no so necessrias ao organismo, desencadeia-se um suicdio por parte das clulas. 1. A cromatina comea a condensar; 2. A clula isola-se das clulas vizinhas, compactando o citoplasma e a cromatina; 3. Uma enzima (endonuclease/enzima de restrio) fragmenta o DNA em pequenas unidades; 4. A clula fragmenta-se sem que ocorra ruptura nem resposta inflamatria. Quando este equilbrio, entre a diviso celular e a apoptose quebrado, pode surgir um cancro. As neoplasias tm origem gentica, pois resultam de alteraes no DNA. No caso de as alteraes se darem a nvel dos proto-oncogenes: Estes so genes que estimulam a diviso celular, mas que esto inactivos em clulas que no se dividem. Devido aco de agentes mutagnicos podem tornar-se activos, e passam a estimular permanentemente a diviso celular, passando a oncogenes. No caso de as alteraes se dares ao nvel dos genes supressores tumorais: Estes genes tm a funo de regulam a proliferao celular, contrabalanando a aco dos proto-oncogenes, inibindo-os. Estes genes esto normalmente activos (bloqueiam a diviso celular), mas devido influencia de agentes mutagnicos podem desactiv-los, fazendo com que as clulas se continuem a dividir. As infeces por vrus contribuem para o aparecimento de cancro pela integrao do material gentico do vrus no DNA das clulas infectadas. O DNA viral pode ser inserido num local onde destrua a actividade de um gene supressor tumoral ou converta um proto-oncogene num oncogene. Todos os cancros so genticos, mas quase nenhuns so hereditrios. Nestes casos, a alterao gentica est presente em todas as clulas do indivduo, manifestando-se muito cedo. A maioria dos cancros espordica (95%) e surgem como resultado de mutaes nas clulas somticas. Estas alteraes so promovidas pela interaco entre o genoma do indivduo e o ambiente.

As componentes gentica e ambiental esto sempre presentes, apesar de nem sempre assumirem igual importncia. Ex: melanoma radiaes solares + alterao de um gene supressor tumoral (MTS) localizado no cromossoma 9. Todos os dias surgem neoplasias no nosso corpo, que so eliminadas por apoptose. Quando isto no acontece, inicia-se um cancro, que corresponde ao momento em que estas clulas se proliferam e invadem tecidos vizinhos. Pode seguir-se um processo de metastizao, em que as clulas cancerosas se podem movimentar atravs da corrente sangunea ou linftica e continuar a desenvolver-se noutras partes do corpo.

Fundamentos da Engenharia Gentica

A engenharia gentica permite manipular directamente os genes de determinados organismos com objectivos prticos. Aps a descoberta de que tambm o DNA podia ser manipulado, a primeira ferramenta da engenharia gentica foram as enzimas de restrio (ou endonucleases). Estas enzimas cortam a hlice dupla do DNA em zonas especficas, sempre que as encontram. Funcionamento das enzimas de restrio Os vrus invadem as bactrias e afectam o seu DNA. Algumas bactrias tm um mecanismo de defesa contra os vrus, que consiste na produo de enzimas de restrio. Ou seja: 1. As enzimas cindem a cadeia de DNA do vrus quando encontram uma determinada sequncia de pares de bases. 2. Estas enzimas actuam em pontos especficos (ZONAS DE RESTRIO), catalisando o desdobramento do DNA em fragmentos menores. 3. Estes fragmentos possuem nas extremidades a sequncia de nucletidos reconhecida pela enzima de restrio so constitudos por cadeia simples ligada a cadeia dupla e chamam-se extremidades coesivas. As extremidades coesivas podem ligar-se por complementaridade a outro DNA. Intervm as ligases do DNA, que catalisam o processo que permite que fragmentos de DNA se voltem a ligar. Para a transferncia destes genes, tambm necessria a existncia de um vector, que ser a entidade que leva o material gentico do genoma de onde foi retirado para o genoma que o vai receber. Os plasmdeos das bactrias so exemplos de vectores.

Tcnica do DNA recombinante

A tcnica do DNA recombinante permite combinar na mesma molcula de DNA genes provenientes de fontes diferentes, mas no necessariamente de espcies diferentes, obtendo uma molcula de RNA recombinante (rDNA). Nesta tcnica, recorre-se a enzimas de restrio para cortar o DNA em pontos especficos e a ligases do DNA para reconstruir a molcula. Obteno e expresso da molcula de rDNA:

1. Seleco de uma molcula de DNA (a integrar) contendo um gene com interesse, que se pretende transferir e clonar; seleco de um vector adequado (plasmdeo); 2. A molcula de DNA e o vector so tratados com a mesma enzima de restrio, que corta as duas molculas em regies com a mesma sequncia de nucletidos; 3. Misturam-se os fragmentos de restrio da molcula de DNA e o vector, adicionando ligases do DNA. O vector e os fragmentos de restrio emparelham pelas extremidades coesivas e a ligase estabelece a ligao entre eles; 4. O vector, contendo o DNA dador, transferido para uma clula/organismo receptor; 5. O DNA dador incorporado no genoma da clula/organismo receptor, que passa a possuir um DNA recombinante; Os plasmdeos possuem genes que lhes conferem resistncia a um antibitico, permitindo localizar as bactrias que tm o DNA recombinante. O cultivo de bactrias que foram misturadas com plasmdeos num meio com esse antibitico, possvel isolar as bactrias que resistem essas tm certamente os plasmdeos recombinantes, porque as que no tm desaparecem com a aplicao do antibitico. Os vrus tambm podem ser utilizados como vectores. As clulas hospedeiras dos genes j no so s bactrias, mas podem ser outras clulas, como leveduras e mesmo clulas eucariticas. So comuns as plantas e os animais em cujo genoma foram introduzidos genes que determinam caractersticas vantajosas, constituindo os OGM. A tcnica do rDNA utilizada, por exemplo, na produo de insulina

humana.

Tcnica do DNA complementar

Os procariontes so organismos muito utilizados em Engenharia Gentica como receptores de DNA estranho porque: So fceis de cultivar, Tm um crescimento rpido, Processos bioqumicos bem conhecidos. No entanto, os seres procariontes no processam o mRNA e se, em alternativa, recebem genes com intres, no so capazes de os retirar e a protena produzida no funcional. Este problema ultrapassado pela obteno e transferncia de DNA complementar ou cDNA. Para a tcnica de DNA complementar so necessrios: Molcula de mRNA; Transcriptase reversa (enzima que catalisa a formao da cadeia complementar do DNA transcriptase porque um processo de transcrio, reversa porque inverso ao processo de transcrio da molcula de DNA em mRNA); DNA polimerase que catalisa a formao da cadeia complementar de DNA; Nucletidos livres.

O cDNA uma molcula de DNA sem intres, que directamente transcrita numa molcula de mRNA funcional. O processo de obteno de cDNA o seguinte: 1. Isola-se uma molcula de mRNA funcional das clulas; 2. Adiciona-se a trancriptase reversa e nucletidos livres; 3. Junta-se uma enzima que degrada o mRNA que serviu de molde e DNA polimerase, que catalisa a formao da cadeia complementar do DNA. O cDNA pode ser inserido num procarionte atravs de um vector contendo o promotor e sequncias reguladoras.

Reaces de polimerizao em Cadeia PCR

O PCR uma tcnica que permite amplificar qualquer poro de DNA fora das clulas. Esta tcnica til para quando necessria uma determinada quantidade de DNA que no se possui, mas que pode ser obtido atravs desta tcnica. Esta tcnica consiste nas seguintes etapas: 1. O fragmento de DNA a amplificar aquecido de modo a separar as duas cadeias da dupla hlice, quebrando as ligaes entre os aminocidos DESNATURAO; 2. Obtm-se duas cadeias simples; 3. So adicionados nucletidos livres e DNA polimerase resistente ao calor esta DNA polimerase obtida a partir de microrganismos termfilos, uma vez que vivem a temperaturas muito elevadas, e aguentam ser mantidos s mesmas, enquanto a DNA polimerase normalmente usada acaba por sofrer tambm DESNATURAO quando sujeita a temperaturas muito elevadas; 4. A DNA polimerase catalisa a formao das cadeias complementares, restituindo a dupla hlice, formando duas molculas de DNA a partir de uma; 5. Arrefecimento das novas molculas; 6. Repetio do processo em cada ciclo a quantidade de DNA duplicada. Esta tcnica permite a obteno de bilies de cpias de uma poro de DNA em poucas horas e executada por aparelhos

DNA fingerprint
No genoma humano existem sequncias de DNA repetitivas que so reconhecidas e cortadas por determinadas enzimas de restrio. O DNA fica ento fragmentado estes fragmentos apresentam tamanhos e composio diferentes, variando de pessoa para pessoa. Quando submetidos a tcnicas como a electroforese, o resultado um padro de bandas que difere de indivduo para individuo, sendo possvel identificar uma pessoa atravs destas bandas, com quase (ou mesmo) 100% de certezas. O processo de identificao por DNA fingerprint feito da seguinte forma:

1. Obteno de fragmentos da molcula de DNA, colocando em recipientes amostras de DNA e enzimas de restrio, que a fragmentam nas respectivas zonas de restrio; 2. Os fragmentos obtidos so colocados num meio apropriado (por exemplo gel) e quando submetidos a um campo elctrico, deslocam-se at extremidade oposta de onde foram inseridos, a velocidades diferentes, consoante o tamanho e peso do fragmento; 3. Ao fim de algum tempo, os fragmentos localizam-se em diferentes seces do gel, permitindo identificar um indivduo pelo padro obtido por electroforese.

Tcnica

Aplicaes
Investigao fundamental torna possvel isolar genes de organismos complexos e estudar as suas funes a nvel molecular Obteno de organismos geneticamente modificados (OGM) organismos em cujo genoma foram introduzidos genes que conferem caractersticas vantajosas. So usados: -na produo de alimentos em maior quantidade e qualidade; -na produo de grandes quantidades de substancias com aplicao mdica ou farmacutica; -na com aplicao industrial; -biorremediao. Obteno de cpias de genes que codificam produtos com interesse. Obteno de grandes quantidades de DNA em pouco tempo. -Investigao criminal, forense e histrica; -Determinao de paternidade.

DNA Recombinan te (rDNA)

DNA Complement ar (cDNA) Polimeriza o por reaco em cadeia (PCR) DNA fingerprint