Curso Básico de purificação

de Proteínas.

Marcus Aurélio Miranda de Araújo

Enzimologia – farmácia - UnB
Estabilização das proteínas

• Uma vez removida do seu ambiente natural, ela

fica exposta a muitos agentes que podem danificá-
la de forma irreversível.

• Fatores que devem ser considerados:

1. pH
2. Temperatura
3. Presença de enzimas degradativas (proteases)
4. Armazenamento por longo tempo (contaminação,
oxidação)
5. Adsorção a superfície
 Tabela com os métodos comuns
de purificação de proteína.
Property Methods
solubility Precipitation with
• os procedimentos de purificação
ammonium
são voltados para manter a proteína
nos estado nativo, embora algumas
sulfate (salting
proteínas possam se renaturar. out)*

• para purificar uma proteína de uma

Size / shape Size-exclusion
mistura, bioquímicos exploram as
diferenças entre elas. Elas diferem
chromotography
em:
• termoestabilidade, Isoelectricpoint Ion exhange
• pH. (charge) chromatography

binding to small Affinity

molecules chromatography
Purification is a multi-step procedure.

Sample
Separation
technique

Repeat with another

Fractionation
separation
technique until pure

No
Assay total protein
Assay enzyme activity

No yes Combine Pure?

Set aside Is there activity? Monitor purity
Fractions

yes

Prepare for analytical technique

First steps: Preparing the sample – Crude extract.

Protein from cells or

tissue
Supernatant with
Soluble protein
Break cells,
tissue, or organ

Blender,
homogenizer,
sonication,
pressure,
Microbial cells psmotic Pellet with intact cells, organelles, membranes and membrane proteins
or tissue
 Solubilidade das proteínas

• Precipitação com sulfato de amônia

(NH4)2SO4:

Muitas proteínas são insoluveis em altas

concentrações de sal, o que a torna uma técnica
viável.
 Solubilidade das proteínas
• Salting-in → íons adicionados blindam as várias
cargas da proteína , enfraquecendo as forças de
atração.

• Salting-out → solubilidade da proteína volta a

decrescer e com isso precipita.
 Solubilidade das proteínas

• Mecanismo:
• As proteínas são solúveis em soluções aquosas,
• Quando se adiciona sal, a água para de interagir com a
proteína para interagir com o sal.
• Inicialmente a água sai das regiões hidrofóbicas da
proteína, devido a baixa afinidade por estas regiões.
• Estas regiões hidrofóbicas são instáveis e tendem a se
interagir, formando um agregado de proteínas que
precipita.
• Este é o termo denominado ´´Salting out``.
• Qual a melhor concentração de Sulfato
de Amônia?

– 100% de sulfato de amônia precipita a

maioria das proteínas.

– Diferentes concentrações do sulfato de

amônia pode precipitar diferentes proteínas:
• Baixas concentrações precipita pouca proteína,
• Altas concentrações precipita muitas proteínas.
 Cromatografia

• São necessário:

1) mistura de proteínas,
2) fase estacionária: resina que será usada para purificar,
3) fase móvel: tampão.

• Conceitos básicos:

– se a proteína tiver alta afinidade pela resina do que pela fase

móvel, a proteína irá mover-se lentamente.
– Se a proteína tiver uma alta afinidade pela fase móvel do que
pela resina, a proteína irá mover-se.
– A afinidade é baseada no tamanha, carga, solubilidade ou
interação especifica.
Classes de cromatografias:

Pode ser utilizado para realizar uma corrida

cromatográfica:
• 1) Gravity Flow
• 2) Peristaltic Pump
• 3) FPLC (Fast Performance Liquid
Chromatography)
• 4) HPLC (High Pressure Liquid Chromatography)
Cromatografia de troca-iônica.

• Conceitos básicos:
– Proteínas são separadas de acordo com a
carga.
– Uma resina carregada é usada como fase
estacionária.
– A fase móvel é composta de um tampão com
carga neutra ou carga,
– deve-se levar em consideração o ponto
isoelétrico da proteína,
– em pH 7,0 a maioria das proteínas (~85%) são
carregadas negativamente.
Cromatografia de troca-iônica.

• Tipos de resinas de troca-iônica:

– 1) Aniônica (resina positiva)
– 2) Catiônica (resina negativa)

• A cadeia central da resina é formada por uma

molécula de carbohidrato (bead).

• Anion exchangers or cation exchangers são

ligados covalentemente aos beads.
 Cromatografia
de troca-iônica.
pos

pos

pos

• Matriz com carga pos

positiva
• Apenas proteínas pos

com cargas positivas pos

passam pela coluna.

 Only the POS charged
proteins run through
the column.

How can we elute the

20 1 other proteins?
Tubes march in from left

A280

Fraction #
 Add salt

Increase the salt.

Tubes march in from left

A280

Fraction #
 Increase the salt. Add salt

What protein will come - - ---

of the column next?

Don’t show the charges on the color spots -

students should figure this out on their own!

Tubes march in from left

A280

Fraction #
 Increase the salt.
What protein(s) will
come of the column
next? + --- ---

Feedback statement.
Run column

Tubes march in from left

A280

Fraction #
 Red and yellow will
have the same neg
charge and will co-
elute.

1.5

Tubes march in from left

A280 Salt
concentration

0.0

Fraction #
 Add salt

Increase the salt

concentration

1.5

Tubes march in from left

A280 Salt
concentration

0.0

Fraction #
 Run the column.

Run column

1.5

Tubes march in from left

A280 Salt
concentration

0.0

Fraction #
 1.5

Tubes march in from left

A280 Salt
concentration

0.0

Fraction #
 Cromatografia de gel filtração
• Conceitos básicos:

– Proteína é purificada de acordo com o seu tamanho.

– Os beads da resina apresentam pequenos buracos.
– o tempo de retenção depende do tamanho da
proteína.
– Se a proteína for muito grande ela será eluída no
volume de exclusão.
• The matrix of a size-
exclusion
chromatography
Run column
column is porous
beads.
Need two pore sizes (other size
bigger than black proteins, smaller
than existing pores.)
• The matrix of a gel
filtration column are
beads with pores.
• The large green
proteins can’t fit in
pores so flows faster.
• The red/yellow
medium sized
proteins get trapped
in the pores.
• The black small
proteins stay trapped
in pores longer.
 Cromatografia de afinidade
• Conceitos básicos:
– Um ligante especifico para determinada
proteína é imobilizado nos beads.
– apenas a proteína de interesse se liga na
coluna, ou seja é retida na fase estacionária.
– a proteína é eluída pela adição de uma alta
concentração de um ligante competitivo.
 HPLC
(High pressure liquid chromatography)

– Predominantemente usado para purificação

de pequenas moléculas orgânicas, pequenos
peptídeos.
– As resinas são fisicamente fortes e podem
surportar altas pressões.
– As colunas são, usualmente, do tipo partição
(interação hidrofóbica, fase reversa C18 ou
sílica).
• Vantagens:

– Alta resolução – os picos são bem definidos,

e é necessário pouca fase móvel.

– Rápida separação – usualmente o tempo de

corrida é menor que uma hora.

– Automação.
• Desvantagens:

– desnaturação de muitos complexos

proteícos.

– Rendimento baixo.

– muito caro (80.000 $ para as bombas,

detectores + 1.000 – 5.000 $ pelas colunas).
 FPLC
(Fast Performance Liquid Chromatography).
– combina um sistema programável de
bombas não peirstalticas que podem utilizar
pressões intermediárias, com um detector
UV/VIS, e uma extensa livraria de colunas.

– as colunas incluem; troca-ionica, gel filtração,

adsorção, afinidade, etc.
• Vantagens:

– Alta resolução,

– corridas utilizando um pequeno tempo,

– Boa reprodutibilidade.
• Desvantagens:

– Custo!! (40,000$, + columns run 1,000$ to

5,000$),

– Rendimento baixo.