ANÁLISES TOXICOLÓGICAS

Profa. Lusiane Malafatti Picca

Análises Toxicológicas
• 1. FINALIDADES (para quê?)

• 2. TOXICANTE (o quê?)

• 3. AMOSTRA (onde?)

• 4. MÉTODO (como?)
Áreas da Toxicologia

TOXICOLOGIA E
ANÁLISES
TOXICOLÓGICAS
 1. Finalidades
1.1 PREVENIR intoxicações: análises de controle ou monitorização

- monitorização terapêutica (quantitativas)

- monitorização biológica da exposição ocupacional ou ambiental (quantitativas)

- controle da farmacodependência (qualitativas, exceção para cafeína)

- controle de contaminantes em alimentos (quantitativas)

 1. Finalidades
1.2 DIAGNÓSTICO de intoxicações agudas e crônicas (fatais ou não)

. análises de urgência (quali ou quantitativas)

. análises para diagnóstico diferencial (quali ou quantitativas)
. análises forenses ( aspecto legal, quali e/ou quantitativas)

PODEM SER para detecção de substâncias química suspeita OU desconhecida

2. Toxicante
Necessidade de conhecimentos de toxicocinética e toxicodinâmica

•Substância química inalterada

•Produto de biotransformação
•Alteração enzimática ou outro parâmetro bioquímico ou hematológico

Podem estar presentes em quantidades muito pequenas: mg,µg, ng, pg (ppm,

ppb, ppt)
 3. Amostra
Escolha depende: finalidade da análise e natureza do analito
Sangue/ plasma/ urina/ vísceras e órgãos (intoxicações agudas, fatais ou não)

Amostras biológicas não usuais: cabelo, unha, ar exalado, leite materno, tecido
adiposo materno, tecido adiposo.

Substratos não-biológicos: erva, pó, alimentos diversos, água, ar, entre outros.

Cuidados na coleta e conservação de amostras biológicas: quantidade, horário,

Anticoagulante/conservante, vasilhame, tempo e temperatura de conservação, etc.
3. Amostra
Amostras Biológicas convencionais

URINA
Apresenta concentrações detectáveis de xenobióticos e seus produtos de
biotransformação.

- Amostra de escolha para triagem toxicológica

- Resultado obtido: indicativo da presença da SQ (correlação baixa com os efeitos)

Amostras Biológicas convencionais
SANGUE

- Possibilidade de correlação com os efeitos

- Os achados no sangue + conhecimento de toxicocinética= inferência sobre o

momento do uso, quantidade de substância introduzida e possíveis alterações
fisiológicas e/ou psíquicas

- Período de detecção curto

- Soro: composição completamente inalterada

Amostras Biológicas convencionais
SANGUE

- Amostras de sangue post-mortem

* redistribuição quando cessados os fenômenos vitais

podem modificar os valores encontrados

*punção na veia subclávia e/ou femoral (probabilidade de

contaminação por difusão de outras regiões é
significativamente menor)
Amostras Biológicas convencionais
SANGUE

- sangue mais viscoso (pequenos coágulos)- alíquota que seja representativa

- Alcoolemia: cuidado com resultados superestimados

Amostras Biológicas não convencionais
SALIVA
Determinação de fármacos e drogas de abuso

-Estudos de farmacocinética, monitorização terapêutica e verificação do uso de

drogas ilícitas.

-Vantagens: facilidade na obtenção, permite coleta assistida sem

contrangimento, não invasiva.
-Permite traçar paralelos com a concentração sanguínea.
Amostras Biológicas não convencionais
SALIVA
- Reflete a fração livre da substância no plasma
- Período de detecção curto: do instante que a substância cai na circulação
sanguínea até quatro meias-vidas após a administração.

- Quantidade disponível é frequentemente baixa e pode diminuir dependendo

do estado patológico e emocional e alguns fármacos.
Amostras Biológicas não convencionais
SALIVA
- Representa a fração não-ionizada e não ligada às proteínas plasmáticas

- Bases fracas se acumulam na saliva (ionizadas não retornam para o plasma)

- Viscosidade variável

- Volume da amostra secretada

Amostras Biológicas não convencionais
AR EXALADO
-Mecanismo de eliminação que indica exposição recente
- Analitos voláteis
- Período de detecção curto
- Quantidade de amostras, análise rápida
Amostras Biológicas não convencionais
SUOR
- Coleta através de coletores “sweat patch”

- Vantagens: coleta não invasiva, indolor, sem constrangimento, assistida.

Amostras Biológicas não convencionais

CABELO

* análise de orgânicos e inorgânicos; capaz de

comprovar ou excluir a suspeita de exposição
passada ou uso crônico de determinada SQ
* Período de detecção maior que as outras
matrizes (semanas ou meses)
* Facilidade de obtenção, coleta não invasiva,
assistida e raramente requer cuidados especiais no
transporte e armazenamento
Amostras Biológicas não convencionais
CABELO

* Na dopagem: pequena utilização (considerar taxa de incorporação, preparo

de amostra e descontaminação da amostra (lavagem, descoloração, tingimento
(podem influenciar a concentração do xenobióticos)
* Análise complementar às outras matrizes
* Desvantagens: falta de correlação com a dose, possibilidade de
contaminações ambientais.
Amostras Biológicas não convencionais
UNHAS

• Refletem exposição passada ou crônica

* Vantagens e desvantagens semelhantes ao cabelo, todavia a quantidade de

amostra disponível é escassa.
Amostras Biológicas não convencionais
HUMOR VÍTREO

* Fluído que se encontra na

cavidade posterior do olho
preenchendo o espaço entre o
cristalino e a retina (1,5 a 3,0
mL de cada olho)
* Fluído gelatinoso, transparente e incolor,
viscoso, 90-98% de água
Amostras Biológicas não convencionais
HUMOR VÍTREO

*Fluído menos sujeito a alterações químicas post-mortem

*Estudos bem estabelecidos somente para o álcool

* Análises post-mortem, relevância para a Toxicologia Forense

Amostras Biológicas não convencionais
HUMOR VÍTREO

• Possibilidade de coleta em corpos politraumatizados, carbonizados ou em

estado de decomposição

• Isolado em um compartimento protegido de contaminação externa e invasão

de micro-organismos

* SQ= não ligada às proteínas plasmáticas, lipossolubilidade adequada

Amostras Biológicas não convencionais
HUMOR VÍTREO
Amostras Biológicas não convencionais
FÍGADO
Concentração do xenobiótico maior que no sangue e praticamente não sofrem
redistribuição post-mortem

* Desvantagens: grande quantidade de lipídios, rapidamente entra em estado

de putrefação.
Amostras Biológicas não convencionais
CONTEÚDO ESTOMACAL
* Forma inalterada e ionizada da SQ básica

• Após a overdose, a concentração da SQ pode continuar alta

* Desvantagens: composição variável, dependendo do tipo e da quantidade de

alimento presente.
Amostras Biológicas não convencionais
OUTROS ÓRGÃOS, FLUÍDOS E TECIDOS

* Bile: SQ que sofreram conjugação

Morfina: concentrações até 1000 x maior na bile

* Cérebro e pulmão: voláteis ou xenobióticos administrados por via pulmonar

(crack)
Amostras Biológicas não convencionais
OUTROS ÓRGÃOS, FLUÍDOS E TECIDOS
• Rins e baço: metais (rins) e verificação de intoxicação por CN e CO (baço)
• Maggots= larvas ou fase imatura de Diptera (insetos) que se alimentam de
organismo morto, podem ser coletados na ausência de amostras biológicas
(morfina, praguicidas)
4. MÉTODO
●cromatografia em camada delgada, clássica ou de alta eficiência (triagem;
análises qualitativas)
● cromatografia gasosa (detectores de ionização de chama, captura de
elétrons ou de chama alcalina, fotométrico de chama, espectrômetro de massa)
● cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC), detector de ultra-
violeta, arranjo de diodo ou de fluorescência
● espectrofotometria, especialmente no visível
● espectrofotometria de absorção atômica (metais)
● imunoensaios
Estudo de caso
Possível agente etiológico= chumbinho (Aldicarbe®)
• Nome químico: [(E)-(2-methyl-2-methylsulfanylpropylidene)amino] N-
methylcarbamate
•Constante de ionização (pka)= 2,9
•Log P= 1,1
•Característica= base fraca
•Toxicodinâmica= inibição reversível da acetilcolinesterase
•Sinais:
•Receptores Muscarínicos: sialorréia, sudorese, lacrimejamento, miose,
borramento visual, hiperemia conjuntival, náusea, vômito, diarréia,
tenesmo, dor abdominal, incontinência fecal, hipersecreção brônquica,
rinorréia, sibilos, broncoespasmo, dispnéia, cianose, bradicardia,
hipotensão, bloqueio AV, aumento da frequência urinária, incontinência
urinária.
•Receptores Nicotínicos: taquicardia, hipertensão, palidez, midríase,
fasciculações musculares, fraqueza muscular, fadiga, cãibras, paralisia,
tremores, arreflexia, paralisia flácida, insuficiência ou parada respiratória
por fraqueza muscular.
•Receptores Sistema Nervoso Central: Sonolência, letargia, labilidade
emocional, coma, cefaléia, confusão mental, ataxia, tremores, respiração
tipo Cheyne-Stokes, dispnéia, fadiga, convulsões, depressão respiratória
e cardiovascular.
Identificação do agente causador- como proceder?
• Metodologia de triagem (análises colorimétricas ou por cromatografia em
Camada Delgada)

• Casos com histórico: análises direcionadas

• Casos sem histórico: análise toxicológica sistemática

 Análise direcionada – Exemplo ELL
• Amostra: amostras de estômago obtidas durante a necropsia de cães e gatos recebidos pelo
serviço de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Santa Maria, que possuíam como
hipótese diagnóstica a intoxicação exógena. A obtenção da amostra constou da abertura do
estômago, seguida da lavagem estomacal, com água destilada (máximo 150mL), sendo retirado o
conteúdo e raspada a parede do estômago, com posterior homogeneização do material. Todo o
conteúdo gástrico foi coletado e conservado sob refrigeração (4ºC) por, no máximo, dois dias até a
realização da análise.

• Extração: após a lavagem e homogeneização do conteúdo gástrico, uma alíquota de 30 mL da

amostra foi adicionada a 30mL de uma solução de tampão tris (pH 9,0) e extraída com 10 mL de
diclorometano. A extração foi realizada em triplicata, e a fase orgânica foi filtrada com sulfato de
sódio anidro, evaporada totalmente e ressuspendida com 250μL de metanol.

• Cromatografia em camada delgada: após extração, as amostras foram cromatografadas contra os

respectivos padrões em placa cromatográfica analítica de sílica gel G, sendo utilizados benzeno:
hexano: metanol: hidróxido de amônio (50:20:20:2) como eluente e solução de Draggendorf iodado
como agente cromogênico. Foi realizada visualização com luz ultravioleta, já que alguns desses
compostos absorvem nessa região, como, por exemplo, o aldicarb.

Ciência Rural, v.40, n.5, mai, 2010.

Extração líquido- líquido
• Utiliza-se um funil de separação, onde ambos os solventes são
adicionados (fase orgânica- lipofílica, fase aquosa- amostra
hidrofílica). Com a agitação do funil de separação, o soluto
passa a fase na qual está o solvente com maior afinidade. A
separação é feita, então, sendo que a fase mais densa é
recolhida antes.
• A escolha adequada do solvente orgânico e o ajuste de pH da
amostra são necessários para assegurar uma boa recuperação
do analito. A extração de substâncias básicas é, normalmente,
realizada a pH maiores que 7 e a extração de substâncias
ácidas é feita em pH menores que 5. Vários tipos de solventes
orgânicos têm sido empregados na extração de drogas ácidas
e básicas presentes em amostras de fluidos biológicos, quanto
maior a afinidade do analito pelo solvente orgânico maior a
recuperação.
Cromatografia – Definição
• É um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura. Essa
técnica se destaca devido à sua facilidade em efetuar a separação, identificação e
quantificação das espécies químicas, por si mesma ou em conjunto com outras
técnicas instrumentais de análise.

• É realizada através da distribuição destes componentes entre duas fases, que estão
em contato íntimo. Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra se
move através dela (fase móvel).

• Durante a passagem da fase móvel sobre a fase

estacionária, os componentes da mistura são distribuídos entre as duas fases, de tal
forma que cada um dos componentes é seletivamente retido pela fase estacionária,
resultando em migrações diferenciais destes componentes, ou seja, os componentes
da amostra têm diferentes velocidades ao passarem pela fase estacionária.
Cromatografia em camada delgada
• A cromatografia em camada delgada (CCD) consiste na separação dos
componentes de uma mistura sólido- líquido onde a fase móvel (líquida)
migra sobre uma camada delgada de ADSORVENTE retido em uma
superfície plana (fase estacionária – sólida). O processo de separação está
fundamentado, principalmente no fenômeno de ADSORÇÃO.
Cromatografia em Camada Delgada- Adsorvente
• É um pó insolúvel, dividido de forma muito fina, inerte e é capaz de adsorver as
toxinas ou outras substâncias em sua superfície extensa.
• Sílica ou alumina
 Aplicação da amostra
Soluções ƒ
• 0,1-1%, dependendo da sensibilidade do revelador
• Solvente volátil ƒ

Aplicador
• M
ƒ icropipetas ƒ
• Seringas ƒ
• Capilares de vidro (pouca precisão)

Gotas ƒ
• Aplicadas a uma distância d da borda inferior ƒ
• d > altura atingida pelo solvente na cuba
• ~ 1,0 cm entre as gotas ƒ
• Alinhamento horizontal uniforme
Preparação da cuba
Cuba de vidro com fundo plano

•ƒ
Saturação da cuba
• ƒ1,5 cm de altura da FM
• ƒPapel de filtro
• ƒFechamento hermético

Colocação da placa na cuba

• ƒRápida (evitar evaporação)
• ƒVertical
Revelação
• Tornar visíveis as substâncias incolores presentes na amostra presentes na
amostra
• ƒNem sempre é necessário

Formas de visualização
• ƒFísica
• ƒQuímica
• ƒBiológica
 Reveladores
Física: Exposição à radiação U.V. para compostos para compostos fluorescentes.
Químicos

Biológicos: Utiliza Utiliza-se reações enzimáticas ou bacterianas ou bacterianas

Cromatografia em camada delgada - Princípio

hRf= rf x 100
Casos sem histórico - ATS
Extração em fase sólida
Técnica analítica que leva a remoção de interferentes da matriz, a
concentração e o isolamento dos analitos. O fator de concentração é obtido
pela razão entre o volume inicial de amostra aplicado no cartucho e o volume
final de solução concentrada. A concentração pode ser aumentada por um
fator de 100 a 5000, tornando possível a análise qualitativa e quantitativa a
nível de traços.
 Em Dragendorff
Resultados CCD- Padronização iodado
Cafeína= castanho
• Placas básicas
• Distância total:
Nicotina = cinza
1- 7 cm
2- 7 cm
3- 8,5 cm
4- 9,5 cm
 • Placas básicas

Resultados CCD- Padronização • Distância total:

1- 7 cm
2- 7 cm
3- 8,5 cm
4- 9,5 cm

Resultados
1- sem manchas interpretáveis
2- Nicotina 1 e 2= 5 cm
cafeína 1 e 2= 6,0 cm
Resultados CCD- Padronização • Placas básicas
• Distância total:
1- 7 cm
2- 7 cm
3- 8,5 cm
4- 9,5 cm

Resultados
3- Nicotina 1- 6,5 cm
cafeína= 8,5 cm
Nicotina 2- não apareceu

4- Nicotina 1 e 2= 9 cm
Cafeína= não apareceu
Resultados CCD- Padronização Em cloreto férrico
AS= Violeta
Em Dragendorff iodado
Cafeína= castanho

• Placas ácidas
• Distância total:
1- 6,5 cm
2- 7,0 cm
 • Placas ácidas

Resultados CCD- Padronização • Distância total:

1- 6,5 cm
2- 7 cm

Resultados
1- AS 1 e 2 = 1,0 cm
2- AS 1 e 2= 7 cm e 6 cm
Resultados CCD- Padronização
• Placas ácidas
• Distância total:
1- 6,5 cm
2- 7 cm

Resultados
1- Cafeína 1 e 2 = 4,5 cm
2- Cafeína 1 e 2= 5,0 cm