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Prtica 2: Cultura de Microrganismos

Introduo Os microrganismos tal como outros organismos vivos necessitam de obter os nutrientes apropriados do seu meio ambiente. Assim se queremos cultivar e manter microrganismos vivos em laboratrio, necessitamos de os colocar em meios de cultura, contendo os nutrientes apropriados para o seu crescimento. Para alm de nutrientes igualmente necessrio que as condies de oxignio (presena ou ausncia), pH e presso osmtica sejam adequadas ao crescimento desses microrganismos. Na preparao dos meios e na manuteno das culturas de microrganismos importante observar as necessrias condies de asspsia, de modo a se evitarem contaminaes com outros microrganismos. Os meios de cultura dividem-se primeiramente em meios slidos, aqueles que contm agar, e meios liquidos, sem agar. Ambos os meios so preparados com gua destilada, aquecidos at que se dissolvam completamente e posteriormente esterilizados por autoclavagem a 121oC. Nos meios slidos o crescimento pra por exausto de nutrientes, devendo realizar-se a transferncia de colnias para novo meio. No entanto estes meios permitem a individualizao das colnias. Os meios liquidos permitem melhor difuso de metablitos, mas no o isolamento de colnias. Aps autoclavagem, os meios slidos vertem-se em caixas de petri de forma a cobrir uniformemente o fundo da caixa e aps solidificao guardam-se por 24h na estufa a 37oC para testar a sua esterilidade e em seguida no frigorifico at altura das sementeiras. Os meios slidos podem tambm ser vertidos em tubos de ensaio de vidro. Os meios liquidos so mantidos em tubos de ensaio de vidro (os meios ditos slidos esto liquidos quando saiem do autoclave e solidificam aps o arrefecimento). Quanto ao grau nutritivo dos meios de cultura consideram-se: meios nutritivos gerais: contendo elementos minerais e metablitos orgnicos. Ex. Agar Nutriente, Caldo Nutriente meios enriquecidos: contendo produtos biolgicos (sangue, soro), vitaminas. Ex: Agar Sangue, meio geral no selectivo. meios complexos: contm todos os ingredientes necessrios para o crescimento de um determinado microrganismo, mas no se conhecem as quantidades exactas de todos os componentes.

meios definidos: aqueles em que se sabe a concentrao exacta dos seus componentes. A composio destes meios varia consoante os requisitos dos organismos a cultivar. Classificam-se ainda os meios em: Selectivos, meios para seleco de determinados grupos de bactrias, os quais contm substncias que inibem o crescimento de outras bactrias distintas daquelas que nos interessam (meios slidos). Ex: Agar Pseudomonas, Tiossulfato-citrato-bilis-sacarose (TCBS) para Vibrio, Agar MacConkey para coliformes. Diferenciais, para identificao de microrganismos, meios slidos com a composio quimica adequada para evidenciar uma caracteristica bioquimica (meios slidos). Ex: MacConkey Agar p isolamento de coliformes, patognios intestinais na gua produtos derivados do leite, e espcimens biolgicos. Neste agar aps 24h a 35oC as colnias de Escherichia coli so vermelhas e mucides, enquanto que as colnias de Salmonella e Shigella so brancas. Indicadores, meios liquidos, com a mesma funo dos diferenciais, servem para evidenciar uma caracteristica bioqumica, mas no para separar as colnias positivas e as negativas. O pH do meio ajustado antes de autoclavar. A cultura de bctrias iniciada num meio estril por transferncia de inoculo para o meio estril atravs de uma ansa. Essa ansa esterilizada chama antes e depois desta operao. Aps a inoculao de um meio com bactrias, necessrio incubar o meio num ambiente adequado aos requisitos de crescimento dos microrganismos. O crescimento de bactrias num meio liquido identifica-se por turvao do meio, formao de uma pelicula na sua superficie, ou aparecimento de sedimento, enquanto que num meio slido por aparecimento de colnias. Os meios liquidos so designados de caldos (broth). Os meios slidos podem ainda ser vertidos em tubos de ensaio de vidro, os quais so inclinados, de modo a que, durante a solidificao do meio, se forme um slope ou slant (Fig.1). Este slant oferece uma superficie adequada ao cultivo de microrganismos aerbios e anaerbios facultativos. Para inoculao de microrganismos nestes slants, utiliza-se uma ansa recta e o tipo de sementeira chama-se por picada (agar stab) (Fig.1). A sementeira por picada faz-se tambm em meios slidos mantidos em tubos de vidro sem slant. Este tipo de cultura utiliza-se para a manuteno de cultura stocks, em meios designados de conservao (3g de Tryptose Soy Broth, TSB; 3g de BactoAgar em 100 ml de gua destilada, acrescentar 1.5g de NaCl para Vibrio). Estas culturas stock so mantidas em laboratrio, podendo ser utilizadas para experincias.

As culturas em meio slido so convenientes para isolamento de colnias de bactrias. As colnias de diferentes espcies de bactrias diferem no tamanho, forma, textura e cor. A cultura de bactrias em meio slido faz-se por sementeira por "streak" (esgotamento) ou por "pour plate" (incorporao). No tipo de cultura por streak, utilizam-se placas de petri com meio slido e faz-se a sementeira com uma ansa esterilizada arrastando a ansa levemente sobre o meio (Fig. 2). O objectivo a obteno de clonias isoladas para se poderem posteriormente identificar. Aps a incubao e havendo crescimento devemos observar a forma da colnia, os seus bordos, a cor, se houve hmolise (caso de cultura em meios com sangue). Na tcnica de pour plate, a inoculao do agar feita antes da sua solidificao (no entanto aps retirada do meio do autoclave necessrio deix-lo arrefecer at 45oC). Nesta tcnica o meio de cultura arrefecido mas ainda liquido misturado com inculo de bactrias, posteriormente vertido em caixas de petri e incubado. Assim as colnias podem desenvolver-se por todo o meio (Fig. 3) Material e Mtodos -Bales de fundo chato e pescoo curto -Tubos de ensaio de vidro -Algodo cardado, gaze, papel de embrulho e fio -Caixas petri esterilizadas -Balana -Placa de aquecimento -Goblets e provetas -Agar nutriente e caldo nutriente desidratados -gua destilada. Para a preparao dos meios Agar e Caldo Nutriente proceder do seguinte modo: 1- Pesar as quantidades dos meios desidratados de acordo com as instrues do seu orientador. Diluir o meio desidratado em gua destilada, mexer bem at dissolver todo o p. 2- Cozinhar os meios tendo o cuidado de agitar os bales de quando em quando, de modo a que permanecem com aspecto homogneo e no se formem grnulos. 3- Aps o cozimento rolhar os bales de Agar Nutriente com rolha confeccionada com algodo cardado e gaze. Envolver a rolha aps colocada com papel de embrulho e amarrar bem com o fio de embrulho. 4- Dispender o Caldo Nutriente por tubos de ensaio at metade do tubo e igualmente rolhar os tubos com algodo cardado.

5- Leve os bales de Agar Nutriente e os tubos do Caldo Nutriente a autoclavar por 15 minutos temperatura de 1210C. 6- Aps a esterilizao retire os meios da autoclave. Deixe arrefecer o Agar Nutriente at cerca de 450C. Em seguida dispense o meio em caixas de petri esterilizadas, cerca de 20ml em cada uma delas. O procedimento ser o seguinte: abra a tampa ligeiramente, verta a quantidade necessria de meio, feche a tampa e movimente a caixa de modo a espalhar o meio homogneamente por todo o seu fundo. Deixe o meio solidificar . 7- Inverta as caixas, identifique-as com data e tipo de meio e incube por 48h a 370C para a prova de esterilidade. Incube tambm os tubos de Caldo Nutriente. 8- Guarde todos os meios aps a prova de esterilidade no frigorfico, at a prxima aula prtica. 9- Trabalhe sempre junto da chama da lamparina ou Bunsen Na aula seguinte poder analisar os meios e verificar se efectivamente esto estreis. Ser ento possivel elaborar o seu relatrio sobre preparao de meios de cultura e esterilizao. Bibliografia de apoio: Seeley, H.W. Jr., VanDemark, P.J., Lee, J.J. (1991). Microbes in action. W.H. Freeman & Company, New York: chapter 8 & 9. DIFCO Manual: pp. 4-16

Anexos:

Figura 1 & 2: (1) Slope ou Slant de Agar; (2) Sementeira por esgotamento (Streak Plate) (a). Retirado de Black, 2002.

Figura 3: Sementeira por incorporao (Pour-Plate) e por espalhamento (Spread-Plate). Retirado de Black, 2002.