BIOCATALISIS ENZIMATICA I.

RESUMEN

II. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVOS GENERALES Disear y realizar diferentes experiencias de estudios cinticos de la enzima Inulinasa (2,1--D-fructan fructanohidrolasa [EC 3.2.1.7]) de un caldo crudo libre de clulas Kluyveromyces marxianus ATCC-16045 en sus formas soluble e inmovilizada. 2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 1.Preparar reactivos y obtener curvas de calibrados de protenas y azucares reductores.

2. Obtener el caldo enzimtico de Kluyveromyces marxianus ATCC-16045.

3.Determinar el rango de linealidad y actividad enzimtica (actividades volumtrica y especfica) de la enzima en el caldo crudo. 4.Determinar los parmetros cinticos de la enzima soluble. 5.Inmovilizar Inulinasa en geles. 6.Disear y montar el sistema mini-reactor con Inulinasa inmovilizada, para determinar los parmetros cinticos de la enzima. Analizar su comportamiento.

III. Fundamento terico Como todos los catalizadores, las enzimas disminuyen la energa requerida para conseguir una reaccin comenzada. Debajo se demuestra un diagrama similar con ms detalle para el patrn de la energa para la reaccin catalizada enzima. Primero, la energa se requiere para formar el complejo entre la enzima y el substrato (complejo del E-S) que es un estado de una energa ms alta que la enzima y el substrato/el producto libres.

Figura 01. Diagrama de la energtica de la enzima cataliz la reaccin contra la reaccin nocatalizada. Las enzimas utilizan energa de enlace del atascamiento de substratos para llevar a cabo una catlisis. Porque la enzima es flexible, la poder del marco absorbe energa de una manera muy eficiente y puso esta energa al uso para asistir con catlisis. Enzima + substrato = complejo E + S = complejo del ES Este atascamiento lanza energa. Sin embargo. La enzima toma algo de la energa de enlace. Esta energa absorbida tomada por el marco de la enzima es utilizada por ella para asistir a catlisis. As, esto ayuda a explicar porqu las enzimas son tan grandes que es la enzima tiene un marco grande para utilizarlo mientras que un recurso para almacenar energa de enlace hizo disponible cuando el substrato ata a la enzima que puede utilizar ms adelante para conducir la formacin de productos. Para que todo este intercambio de la energa sea eficiente, la enzima debe ser muy flexible. ACTIVIDAD ENZIMATICA Las enzimas son de naturaleza proteica y, aunque muchas contienen en su estructura otro tipo de molcula, su funcionabilidad biolgica radica siempre en su porcin proteica. La capacidad cataltica de la enzima reside en su sitio activo, que esta conformado por un nmero de residuos aminoaciditos que se agrupan en la estructura tridimensional para generar un nicho, donde el

substrato es ligado y qumicamente transformado. La presencia de la estructura de este nicho es esencial para la expresin de dicha capacidad cataltica, por lo que la estabilidad configuracional de la estructura `proteica de la enzima resulta fundamental parta su funcionabilidad. Desde el punto de vista termodinmica las enzimas actan rebajando la barrera energtica que presenta la energa de activacin requerida para lograr un complejo de transicin activado que dar origen al producto. Desde l punto de vista cintico, la actividad enzimtica, que corresponde a la capacidad cataltica de la enzima, se traduce en un incremento de la velocidad de la reaccin catalizada y, dado que en ausencia de la enzima la velocidad es generalmente despreciada, la cuantificacin de la actividad enzimtica se basa justamente en la medicin de la velocidad de la reaccin. De este modo en la reaccin: S E P Se tendr que: act = V = dp = ds dt dt La actividad enzimtica representa en consecuencia el mximo potencial cataltico de la enzima para un conjunto de condiciones ambientales dadas. Es preciso sealar que estos valores iniciales de velocidad de reaccin no representan aquellos que se obtendrn en un proceso enzimtico, en donde, dados los tiempos de operacin prolongados, es razonable suponer que los factores descritos estarn presentes. La actividad enzimtica se expresa en trminos de unidades de actividad. La definicin de unidades de actividad a sido bastante arbitraria lo que dificulta muchas veces el anlisis comparativo de los resultados obtenidos por diversos obtenidos. En general se ha adoptado la definicin propuesta por la UI de bioqumica. Se define la UI como la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de un micro mol de sustrato por minuto.

pH Temperatura optima.

Concentracin de substrato saturante

CLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA

La representacin grfica de la ecuacin de Michaelis-Menten (v0 frente a [S]0) es una hiprbola (Figura de la izquierda). La Vmax corresponde al valor mximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentracin de sustrato a la cual la velocidad de la reaccin es la mitad de la Vmax. Para determinar grficamente los valores de KM y Vmax es ms sencillo utilizar la representacin doble recproca (1/v0 frente a 1/[S]0), ya que es una lnea recta. Esta representacin doble recproca recibe el nombre de representacin de Lineweaver-Burk (Figura de la derecha). Es una recta en la cual:

La pendiente es KM/Vmax La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/KM La ordenada en el origen (1/[S]0 = 0) es 1/Vmax

De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular grficamente, los valores de KM y Vmax de un enzima para diversos sustratos.

MOTIVOS QUE HACEN DE KM UN PARMETRO CINTICO IMPORTANTE La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parmetro cintico importante pr mltiples razones:

KM es la concentracin de sustrato para la cual la velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima. En efecto, si KM = [S], la ecuacin de Michaelis-Menten se reduce a: v = Vmax/2.

El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: A menor KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor K M, menor afinidad. Este hecho tiene fcil explicacin si tenemos en cuenta que KM se define como (k2+k3/k1), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el complejo ES, mientras que la reaccin 1 lo forma. As, si KM es grande, el complejo ES es inestable pues predomina la tendencia a destruirlo (poca afinidad hacia el sustrato), y si KM es pequea, el complejo ES es estable, ya que predomina la tendencia a formarlo (gran afinidad hacia el sustrato).

La KM del sustrato natural es menor que la de los sustratos anlogos. Si dos sustratos del mismo enzima tienen distinta KM, el que presente mayor KM tiene menor afinidad por el enzima, y la reaccin transcurre siempre a menor velocidad que con el sustrato de menor KM, salvo a concentraciones saturantes de sustrato, donde la v = Vmax.

Los valores de KM de muchos enzimas son prximos a los de la concentracin fisiolgica de sus sustratos, de forma que pequeas variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metablica.

Cintica de un substrato: Principales hechos experimentales: debemos sealar como un prembulo la necesidad absoluta de que las enzimas sean puras y desprovistas de actividad parasita. Los tres hechos experimentales principales, en que se basan las leyes generales de de la cintica enzimtica son:

a) El substrato S, forma con la enzima, E, un complejo intermediario transitorio ES. este complejo resulta de una complementaria de la estructura entre el sitio activo de la enzima y de la molcula del substrato. b) La velocidad de la reaccin en el tiempo t, es decir la velocidad de la desaparicin del substrato, dS dP , o de aparicin del producto, que se representa por la pendiente dt dt

de la tangente a la curva, P o S = f (t) no es constante para las concentraciones dadas en enzimas o en substrato, y disminuye en funcin del tiempo debido a la desaparicin del substrato en el curso de desarrollo de la reaccin. Siempre al principio de la reaccin, se puede considerar que la tangente a la curva se confunde con aquella en que la velocidad permanece constante. Los estudios de cintica enzimtica corresponden siempre a esta parte lineal de la curva; lo que implica el trabajar a velocidades inciales. En estas condiciones, al principio de la reaccin, la concentracin en producto es muy dbil; puede despreciarse, as como la reaccin inversa de transformacin del producto en substrato. Entonces se puede escribir:
E+S k 1 K3 [ ES ] E + P k2

c) Por otra parte, para una concentracin dada de substrato, el estudio de las variaciones de la velocidad inicial de reaccin en funcin de la concentracin de enzimas, muestra que esta variacin no es lineal. La curva presenta un trazo hiperblico correspondiente al hecho de que para una cierta concentracin de enzima, la totalidad del substrato se encuentra bajo la forma de complejo enzima-substrato; de lo que resulta que la velocidad inicial, funcin de la concentracin de este complejo, permanece constante. Para los estudios cinticos, es necesario situarse en las condiciones que corresponden al principio de la curva, donde es lineal, es decir a concentracin bajas de enzimas. En otros trminos, al cantidad de enzima debe ser pequea en comparacin a la concentracin del substrato, de tal manera, que la formacin del complejo enzima substrato, ES, no modifica, o modifica poco la concentracin del substrato. Influencia del contenido de agua: Las enzimas son protenas globulosas solubles en agua y las reacciones enzimticas se efectan, en su mayor parte, en medio acuoso.

Es comn observar que alimentos han sido protegidos del desarrollo microbiano por aplicacin de diferentes tratamientos de deshidratacin (secado de legumbres, en crudo) sufren sin embargo, a pesar del bajo contenido de agua, degradaciones enzimticas que conducen a la aparicin de olor y sabor desagradables. En estos casos, el papel del disolvente de la enzima que corresponden habitualmente al agua, es del todo secundario y no es indispensable. La lipasa, situada en la interfase aceite-agua, y la lipogenasa que actan en presencia de cantidades de agua, son un buen ejemplo de este tipo de comportamiento. Pero siempre el agua interviene en todas las reacciones de hidrlisis como un segundo substrato. En este caso, el factor a considerar no es en realidad el tenor en agua, si no la actividad del agua en el medio considerado, actividad que cifra su grado de disponibilidad, especialmente para participar en la reaccin de hidrlisis enzimtica. Las curvas de sorcin desorcin del agua, constituyen el mtodo clsico para determinar la variacin de la actividad del agua en funcin del tenor en agua. Cuando el tenor en agua es dbil, todo factor que aumenta la movilidad de la enzima y la frecuencia de las colaciones enzima-substrato, acelera el desarrollo de reacciones enzimticas; uno de los ejemplos mejor conocidos es el del amasamiento intensificadito que favorece la accin de las lipoxigenasas. Considerando la existencia de factores limitantes ligados a la movilidad de los reactivos, las cinticas no son michelianas. Enzimas inmovilizadas: Desde 1916, Nelson y Griffin haban demostrado que la inulinasa absorbida sobre carbn activo, conserva su actividad. Pero de cualquier modo hubo que esperar hasta la dcada de los 50s para que aparecieran las primeras aplicaciones de esta tcnica, en particular con los trabajos de Grub-hofer y Schleith. Despus de 1960, las investigaciones, las investigaciones se han intensificado y bajo al impulso de los equipos de Katchalski en Israel y de Manecke en Alemania, se han multiplicado las utilizaciones potenciales de las enzimas inmovilizadas. En 1969 Chibata y sus colaboradores desarrollaron en Japn el primer reactor industrial con enzima fijada, una L-aminocidos a partir de la correspondiente mezcla racemica. Esta tcnica permitira, segn los autores, disminuir el precio de costo a menos del 40% con relacin al procedimiento convencional. La gran especificidad en la accin de las enzimas y de las condiciones tan suaves en las cuales funcionan les confiere una decidida ventaja sobre los catalizadores qumicos ordinarios. Por

ello en numerosos sectores se han desarrollado considerablemente el uso de preparaciones enzimticas. Pero el alto costo de los de los procedimientos de extraccin y de purificacin de las macromolculas enzimticas, su alta inestabilidad cundo estn en solucin, son un obstculo a su recuperacin despus de haber sido utilizado este biocatalizador. En la prctica la mayor parte de las operaciones industriales se realizan de forma discontinua, en lotes, con la renovacin de la enzima al principio de cada ciclo (como se muestra en la fig.1)

Figura N 01 La inmovilizacin sobre un soporte insoluble, que a menudo se acompaa de un aumento en la estabilidad de la enzima, facilita el desarrollo de reactores en continuo, que funcionan durante periodos largos, sin necesidad de renovar el catalizador. Permiten tambin utilizar preparaciones ms puras, cierto es que ms caras, pero de especificidad en su accin mas estrecha, lo que mejora la calidad de los productos que se obtienen. En la actualidad, se han desarrollado numerosos mtodos de fijacin de inters para ms de 100 enzimas, tanto en la etapa de laboratorio como en escala piloto y se ha abierto un campo de experimentacin, despus de algunos aos, para la inmovilizacin de clulas intactas, vivas o muertas. Esta multiplicacin de de trabajos ha dado lugar a una abundante literatura cientfica. Microencapsulacin: La tcnica de microencapsulacion se utiliza comnmente en las industrias farmacuticas, de cosmticos o de colorantes y en la industria alimentaria. Se trata de retener un producto en el interior de una capsula delimitada por una membrana semipermeable. Se han descrito varios procedimientos de micro encapsulacin. En el mtodo por polimerizacin interfacial una solucin acuosa que contiene la enzima en un monmero hidrofilico (poliamina o glicol) es emulsionada dentro de un disolvente orgnico miscible con agua. Al adicionar un segundo monmero hidrfobo (cloruro de acido polibsico) se provoca

una reaccin de polimerizacin produciendo la formacin de una membrana (poliamida o polister) alrededor de microgotitas acuosas. Con frecuencia es necesario adicionar algn agente tensoactivo que estabiliza la accin la emulsin y permite ajustar el tamao de las capsulas a las dimensiones que se desean, que pueden variar de 1 a 100 micrones. La inmovilizacin de los biocatalizadores por enlaces covalentes se caracteriza por la fijeza del enlace protena-soporte. La cantidad de enzimas desarrolladas es menor que en el caso de inclusin o de la fijacin por adsorcin y las prdidas por liberacin en el medio son mnimas. Esta tcnica, aunque relativamente compleja para ponerla en accin es particularmente adaptable a las enzimas de precio elevado. El principal inconveniente del procedimiento reside en los riesgos de inactivacin parcial o total de la enzima en el transcurso de la reaccin de fijacin. Por otro lado, como en las otras tcnicas, los soportes orgnicos son susceptibles de ser atacados por los microorganismos y son sensibles a las condiciones del medio: variaciones de pH, empleo de ciertos disolventes. Para mejorar las propiedades mecnicas de las preparaciones, en algunas ocasiones la enzima es absorbida previamente sobre un soporte antes de la reticulacion. Propiedades de las enzimas inmovilizadas: La inmovilizacin puede causar perturbaciones estructurales en la protena, reduciendo la eficacia cataltica de la enzima. Adems, la inmovilizacin puede limitar el acceso del reactivo al centro activo de la enzima, reduciendo nuevamente la actividad. Ambos fenmenos pueden ser descritos como efectos conformacionales. La inmovilizacin altera significativamente el comportamiento de las enzimas. 1. Se producen cambios en su estabilidad. 2. La enzima inmovilizada es un sistema heterogneo en el cual todos los componentes que intervienen en el proceso cataltico (pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores, activadores, etc.) se encuentran en interfase: en el medio de reaccin y en la fase constituida por el soporte con la enzima. 3. Como consecuencia, la actividad enzimtica se ve afectada por efectos de tipo difusional, estrico y del microentorno. Los efectos de la inmovilizacin sobre la actividad de las enzimas resultan de la interaccin de diferentes factores:

a) Modificaciones de la estructura tridimensional de la enzima, a causa de tensiones durante la fijacin. b) Modificaciones del microambiente: ph local, interacciones electrostticas. c) Fenmenos difusionales en el interior del complejo. d) Impedimentos estricos. Este conjunto de factores juega un papel determinante en la actividad y estabilidad de la enzima. Aplicaciones de la enzima inmovilizada: Las aplicaciones ms importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden clasificar en: 1. Aplicaciones analticas: biosensores 2. Aplicaciones mdicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas 3. Aplicaciones industriales: en la industria qumica, farmacutica, alimentaria y de tratamiento de residuos. Medicin de la actividad: Las condiciones ptimas de accin de las enzimas inmovilizadas difieren a menudo de las enzimas en solucin y deben ser perfectamente conocidas para evitar todo riesgo de error de interpretacin. As para la ureasa, fijada sobre bentonita, la actividad de ph es de 7.7 no alcanza sino a 75% de la actividad de la enzima libre mientras que es de100% a ph 7.1. Con las reservas antes dichas, parece que la inmovilizacin entraa con frecuencia una perdida de de actividad, muy variable segn sea la naturaleza de la enzima y el modo de fijacin; pero tambin se han sealado algunos casos en los que hay aumento de la actividad. Estas variaciones en un sentido o en otro podran explicarse por una modificacin estrica del sitio activo de la enzima de bajo el efecto de un cambio de conformacin de la cadena polipeptidica. Influencia de las condiciones de operacin: Si la actividad residual de las enzimas inmovilizadas es ms dbil que de las enzimas nativas, por el contrario, su estabilidad se encuentra generalmente aumentada. La duracin de la vida de los complejos es sin embargo muy variable y las cifras citadas en las diferentes obras cientficas varan de algunas decenas de horas a varios meses y para algunos casos excepcionales, a varios aos. la estabilidad de las preparaciones comerciales es un factor primordial para la explotacin industrial de los reactores de enzimas. Las cantidades de protena retenidas son tambin muy variables (2-400% de la masa de polmero) y depende de la enzima considerada, del soporte que se utiliza y del mtodo de inmovilizacin empleado. No se presentan fenmenos de impedimento estrico, de relacin

lineal entre la actividad en relacin a la unidad de masa del complejo y ala cantidad de biocatalizador fijado (cuadro N1). La inmovilizacin de la enzima, en presencia del substrato o de un inhibidor competitivo, protege el sitio activo e impide la formacin de enlaces entre el soporte y los cidos aminados que interviene en la catlisis. Para las enzimas con agrupamientos SH, muy sensibles ala oxidacin, es preferible bloquear las funciones tiol antes de la fijacin y de regenerarlas en el momento del empleo. Las condiciones de pH y de temperatura necesarias para la reaccin de inmovilizacin pueden provocar la desnaturalizacin parcial o total de la protena. Pero, una vez que se ha realizado la inmovilizacin, se observa menudo, que las enzimas fijadas resisten mejor las variaciones de pH y a los tratamientos trmicos, que las especies en solucin. La respuesta es diferente segn el origen de la enzima, el soporte utilizado y el mtodo de fijacin sostenido. Cuadro N1: Influencia de la naturaleza del soporte sobre la cantidad de papana fijada y la actividad residual medida (segn Manecke y col) SOPORTE Copolimero acido acrlico/m136 155 172 ENZIMA FIJADA ACTIVIDAD RESIDUAL % (mg./g soporte)

isotiocianatoestireno 1/1 450 2/1 1,500 4/1 1,745 Copolimero acido metacrilico/misotiocianatoestireno 1/1 2/1 4/1 Fenmenos de difusin: 330 1,600 2,380

48 102 76

Mientras que la actividad de las enzimas en solucin es regida por las leyes de la catlisis homognea, el empleo de las enzimas inmovilizadas hace que intervengan dos fases distintas. Se tiene catlisis heterognea y los mecanismos de difusin tienen un lugar importante. En la interfase entre las partculas slidas del soporte y la solucin acuosa se encuentra una capa lmite en la cual se establece un gradiente de concentracin de los reactivos. Si se denomina d a la velocidad de difusin de la materia (masa de substrato o de producto que difunde a travs de la capa lmite, por unidad de tiempo) y k a la constante de velocidad

de la reaccin cataltica para la enzima no fijada, se pueden de acuerdo a Durand y Monsan visualizar tres casos: a) d >> k: la transferencia de materia juega un papel desprecible. b) d = k: transferencia de materia y reaccin enzimtica que intervienen para la misma parte. c) d << k: la transferencia de materia es la etapa limitante. La reaccin cataltica consume el substrato ms rpido, que ya no difunde hacia el sitio activo. Se tiene un rgimen difusional. Es posible reducir el espesor de la capa lmite disminuyendo el tamao de las partculas portadoras de enzimas. Se observa as una disminucin del Km aparente de la enzima. La velocidad de agitacin del medio de reaccin y el gasto de la alimentacin de las columnas de reactivo son tambin factores importantes. Numerosos soportes utilizados para inmovilizar los biocatalizadores son porosos; en este caso, ala transferencia en la capa limite se agregan fenmenos de difusin de la materia a travs d los poros, hasta la protena enzimtica. Para los substratos de alta masa molecular, la velocidad de reaccin puede disminuir considerablemente. Para optimizar los reactores enzimticos es indispensable identificar la etapa limitante del proceso. Una de las dificultades mayores reside en que las mediciones de actividad no dan si no la resultante d un conjunto de fenmenos a escala molecular, difcilmente accesibles. Con frecuencia el desarrollo de los procesos se hace en forma emprica. IV. MATERIALES Y MTODOS EXPERIMENTALES 1. Determinacin de protenas: Mtodo Bradford La curva de calibrado se obtiene a partir de muestras de concentracin conocida de una solucin estndar de albmina suero bovino y analizadas segn este procedimiento. 1.1. Materiales 0.1g de azul de coomassie G-250 Etanol al 98% Acido fosfrico al 85% Agua destilada Micropipetas Tubos de ensayo Espectrofotmetro Suero de bobino 0.3g/l

Matraces

1.2. Procedimiento Reactivo: Disolver 0.1g de azul de Coomassie G-250 en 250 ml de etanol al 98%, mas 100ml de acido fosforco al 85% y con agua destilada aforar a un litro. minutos. Leer la absorbancia a una longitud de onda de 595 nm, contrastndola con un blanco de agua destilada de 500 L. de calibrado. La concentracin se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva Agregar en un tubo de ensayo 500 L de muestra convenientemente diluida. Aadir 5 ml de reactivo Bradford (a cada muestra) y dejar reaccionar durante 5

Fig.1 Obtencin de Protena a partir del Caldo Crudo Enzimtico 2. Rango de linealidad de la enzima y la Actividad Especfica de la Enzima Se realizar a diferentes concentraciones de enzimas, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, y 1, se graficar tiempo vs. Sustrato o Tiempo vs. Producto. Se obtendra una grfica parecida a la siguiente
S P 0.8 0.6 0.2

Figura 02: rango de linealidad de la enzima en el tiempo La actividad enzimtica de la inulinasa adems de indicarnos su recuperacin puede servir como un ndice de la calidad y rendimiento de nuestro trabajo durante el proceso de purificacin. Utilizaremos el mtodo del DNS para determinar la actividad enzimtica. La conversin de la sacarosa en glucosa y fructosa. 2.1. Materiales Equipos Equipo Bao mara Tubo de ensayo Solucin de sacarosa (0.2M) Caldo crudo enzimtico NaOH 10N DNS

2.2. Procedimiento A cada uno de los 5 tubos de ensayo agregar 2.9 ml de solucin de sacarosa (0.1M) (34.2gr/l) a pH 5.2 y colocar a bao mara a 50C durante 50min. Agregar 0.1ml de caldo crudo enzimtico a los 4 ltimos tubos de ensayo y dejas reaccionar por los tiempos requeridos por el experimento (0, 2, 6,10 y15min). Detener la reaccin adicionando 0.1ml de NaOH 10N. agitar fuertemente retirar el tubo de bao mara y ponerlo en refrigeracin. Hacer la determinaron de azucares reductores

Fig.2 Preparando las muestras para el rango de linealidad

Fig.3 Los tubos pasan por Bao Maria 100C por 10min.

3. Determinacin de azcares reductores mediante el mtodo del DNS Para la preparacin de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 20 ml de agua, paralelamente se disuelve el DNS en pequeas cantidades con ayuda de un agitador magntico y calentando. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 50 mL y se agita hasta la completa disolucin de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta 50 mL. 3.1. Materiales: Reactivo DNS Espectrofotmetro Mechero Agua destilada Micro pipeta Matraces 3.2. Procedimiento: Se precisa realizar los siguientes pasos para el anlisis de la muestra: Se aade 0.5 mL de reactivo DNS a un 0.5 mL de muestra a analizar. Se mantiene la mezcla en bao de agua a ebullicin durante 5 minutos Se aaden 5 ml de agua destilada, y se deja reposar por 15 minutos, Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco. La concentracin se obtiene interceptando la medida de absorbancia en La curva de calibrado para el azcar se obtiene a partir de muestra de

para luego enfriar con agua helada. luego agitar.

la curva de calibrado. concentracin conocida y analizadas segn este procedimiento.

Fig.4: Realizamos el mtodo del DNS para evaluar el contenido de azucares reductores.

4. Determinacin de V y K: 4.1. Materiales Buffer acetato 0.1 M pH 5.2 Caldo crudo inulinasa Micropipeta Puntas Pipeta Viales NaOH 10N Hielo Shaker Bao mara

Equipos

4.2. Procedimiento Poner Buffer acetato en el matraz del shaker a temperatura de 50C por un tiempo de 5min. Tener la solucin Caldo crudo inulinasa en bao Maria a temperatura de 50C. Luego, una vez que la solucin esta lista (T=50C) llevar el caldo mas el Buffer acetato. Luego se coloca cada 0, 2, 6, 10 y 15 min 1 ml de la muestra a los viales (0.05 ml de NaOH ) Luego poner los viales a congelacion. 5. Mtodo de Inmovilizacin de Inulinasa en Alginato de Sodio.El mtodo de inmovilizacin es por unin qumica. Se debe procurar que la inmovilizacin incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibicin, ampli el intervalo de pH ptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. 5.1. Materiales:

Solucin de Alginato de Sodio al 2%. Caldo crudo libre de clulas conteniendo inulinasa. Solucin de CaCl2 0.1 M. Solucin de CaCl2 0.05 M Agua destilada Pipetas Tubos de ensayo Jeringa con aguja. Matraces Mechero Mini-reactor

5.2 Procedimiento: Preparar una disolucin de Alginato de sodio al 2% y calentar a 80 C De la disolucin anterior tomar 5 ml, mezclar con 1ml de caldo crudo por 15 minutos y luego enfriar a 45 C. aguja. libre de clulas conteniendo Inulinasa y cargar todo a una jeringa provista de

Con la jeringa gotear la mezcla dentro de 30 ml de solucin agitada de

CaCl2 0.1 M. Los beads esfricos de enzima inmovilizada dejarlos en reposo en Empacar los beads dentro del mini-reactor.

refrigeracin por 3 a 4 horas y luego lavarlos con una solucin de CaCl2 0.05M.

6. Disear y montar el sistema mini-reactor con inulinasa inmovilizada, para determinar los parmetros cinticos de la enzima. La forma usual de determinar los parmetros cinticos es a travs de mediciones de velocidad inicial de reaccin a diferentes concentraciones de sacarosa en un reactor por lote. La manera ms adecuada de obtenerlos es por linealizacin de la ecuacin cintica. Para ello emplearemos el mtodo de los inversos o Lineweaver Burke, para un modelo cintico simple

E + S

E S E + P

6.1. Materiales Solucin de Sacarosa 0.1 M Agua destilada Solucin tampn acetato a pH 5.2 CaCl2 DNS Pipetas Micropipeta Puntas Equipo Bao mara Biorreactor

Equipos

6.2. Procedimiento: Preparar solucin de sacarosa 0.1M. Extraer 60 ml d la solucin de sacarosa y colocar en el birreactor Agregarle 30 ml de solucin tampn acetato a pH 5.2 Colocar en bao Maria (T=50C) y agitar constantemente. Extraer el punto 0.

Realizar el lavado de las bioparticulas con CaCl2

Agregar las biopartculas al birreactor. Y muestrear cada hora extrayendo 1 ml de la muestra y colocarlo en hielo antes de refrigerar para hacer un previo enfriamiento. Llevar las muestras a refrigeracin. Hacer la determinacin de azucares reductores por el mtodo del DNS.

V. RESULTADOS Y DISCUSIONES 5.1 DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE PROTENAS DEL CALDO ENZIMTICO CRUDO (METODO DE BRADFORD) Utilizando la siguiente curva de calibrado: Abs= 0.9168*protena (g/l) + 0.0571 R2 = 0.9283 Cuadro N1: Obtencin del contenido de Protenas presente en el Caldo Enzimtico Crudo a distintas diluciones N Muestras 1 2 Promedio Dilucin 1:1 0.349 0.354 0.352

1:2 0.265 0.266 0.266

Protena (g/l) 0.3217 0.2279

Grafica N1:"Determinacion de Proteinas en el Caldo Enzimatico Crudo"

0,35 0,3 [Proteinas]g/l 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Muestras Proteinas

INTERPRETACIN: Estudios realizados sobre la produccin de inulinasa por Kluyveromices marxianus, demostraron que el extracto de levadura es la mejor fuente de nitrgeno para la produccin de esta enzima". Se ha reportado que K. fiagilis produce cantidades equivalentes de inulinasa en un intervalo amplio de pH 3.5-6.0. La inulinasa es una glicoprotena extracelular, parcialmente asociada a la pared celular y parcialmente excretada al melo de cultivo, aunque tambin se ha encontrado enzima unida la clula en cantidades apreciables. La localizacin de las enzimas se debe al papel fisiolgico que desempefian en el metabolismo del microorganismo quelas produce. Para la especie K. marxianus obtuvo un contenido de protena de 32%, 34% utilizando como sustrato suero de leche. La levadura Kluyveromyces marxianus ha sido estudiada para la produccin de inulinasa, con el interes fundamental de producir fructosa a partir de inulina. Nuestro contenido de proteina es 0.3212 g/L - 0.266 g/L en las diferentes diluciones que se realizaron en la practica. 5.2 DETERMINACIN DEL RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD

ENZIMATICA 5.2.1. DETERMINACIN DEL RANGO DE LINEALIDAD

Cuadro N2: Obtencin de absorbancia a diferentes diluciones y diferentes tiempos Tiempo (min.) 0 2 6 10 15 Dilucin 1:1 0.083 0.090 0.094 0.114 0.116

1:2 0.064 0.068 0.077 0.084 0.086

1:3 0.055 0.057 0.059 0.061 0.065

Utilizando la siguiente curva de calibrado obtenemos los siguientes productos:

Abs = 0.44672 * Glu cos a ( g / l ) + 0.03791

Cuadro N3: Producto obtenido a diferentes diluciones y diferentes tiempos Tiempo (min.) 0 2 6 10 15 Producto 1:1 0.1009 0.1166 0.1256 0.1703 0.1748

1:2 0.0584 0.0674 0.0875 0.1032 0.1077

1:3 0.0383 0.0427 0.0472 0.0517 0.0606

Grafico N2:"Rango de Linealidad de la Enzima de Kluyveromyces marxianus ATTC-16045"

0,2 Producto (g/l) 0,15 0,1 0,05 0 0 5 10 Tiempo (min.) 15 20

1:01 1:02 1:03

INTERPRETACION: La Grfica N 2 nos indica el rango de linealidad de la enzima; las curvas obtenidas se basan en la reaccin enzimtica y su dependencia con el tiempo. La forma de la curva representa la velocidad de formacin de productos en el tiempo a diferentes concentraciones de enzima, esto demuestra que a una mayor concentracin de enzimas el rango de linealidad de reaccin es mayor y por lo tanto mantiene su capacidad cataltica durante ms tiempo y mientras este se vaya diluyendo la capacidad cataltica de la enzima disminuye. El calor es un factor que desnaturaliza las protenas por lo tanto si la temperatura se eleva demasiada, la enzima pierde su actividad. La temperatura ptima es la resultante de dos procesos: el incremento de la velocidad de reaccin con la temperatura y el incremento de la desnaturalizacin trmica de la enzima por encima de la temperatura crtica. La mayor parte de las enzimas se inactivan a temperaturas superiores a 55 60 C. La temperatura empleada en esta practica fue de 50C por 5 minutos. Workman y Day: la enzima inulinasa producida por Kluyveromices fiagilis es una glicoproteina con un contenido de carbohidratos del 66% en peso, estable a 50C, con un pH optimo de 4.5 cuya actividad disminuye a temperaturas mayores. La mayor parte de las enzimas tienen un pH caracterstico en el cual su actividad es mxima. Cuando los valores de pH son muy cidos o muy alcalinos, no solo se modifica el sitio activo, sino que se altera la estructura terciaria de toda molcula, pudiendo llegar a la desnaturalizacin y no habr actividad enzimtica. En la practica usamos una solucin tampn de Acetato de sodio a un pH de 5.2. Caracteristicas determinadas de algunas inulinasas obtenidas de diferentes microorganismos son las siguientes: Kluyveromices marxianus: Temperatura optima de produccin 55C y Temperatura de incubacin 55C , pH optimo 5 5.2

5.2.2.

DETERMINACIN CALDO CRUDO

DE

LA

ACTIVIDAD

ENZIMTICA

(ACTIVIDAD VOLUMTRICA Y ESPECFICA) DE LA ENZIMA EN EL

a. ACTIVIDAD VOLUMTRICA A UNA DILUCIN DE 1:1

Grafico N3: "Determinacion de la Actividad Volumetrica en 1:1"

Producto (g/l) 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 5 10 Tiempo (min) 15 20 y = 0.0052x + 0.1031 01:01

Sabiendo que a es la pendiente entonces lo multiplicamos por el factor de conversin y obtenemos la siguiente respuesta: UI ml

a = 0.0052 * 5.56 = 0.029

b. ACTIVIDAD VOLUMTRICA A UNA DILUCIN DE 1:2

Grafico N4: "Determinacion de la Actividad Volumetrica en 1:2"

0,12 Producto (g/l) 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 0 5 10 Tiempo (min) 15 20 y = 0,0034x + 0,0621 1:02 Lineal (1:02)

Sabiendo que a es la pendiente entonces lo multiplicamos por el factor de conversin y obtenemos la siguiente respuesta: UI ml

a = 0.0034 * 5.56 = 0.019

c. ACTIVIDAD VOLUMTRICA A UNA DILUCIN DE 1:3

Grafico N5: "Determinacion de la Actividad Volumetrica en 1:3"

0,07 0,06 Producto (g/l) 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0 5 10 Tiempo (min) 15 20 y = 0,0014x + 0,0388 1:03 Lineal (1:03)

Sabiendo que a es la pendiente entonces lo multiplicamos por el factor de conversin y obtenemos la siguiente respuesta: UI ml

a = 0.0014 * 5.56 = 0.0078

Grafica N6: "Actividad Cataltica de la Enzima de Kluyveromyces marxianus ATTC-16045 a diferentes diluciones"
0,04 Actividad (UI/ml) 0,03 0,02 0,01 0 1 1,1 1,2 Diluciones 1,3 1,4

INTERPRETACION: La actividad enzimatica de la inulinasa disminuye no solo por el efecto del tiempo de reaccin si no tambin por el efecto de la concentracin de la enzima presente en el medio ya que al

reducir la concentracin la actividad de esta disminuye y al aumentar la concentracin de enzima en el medio la actividad aumenta. La actividad volumtrica se determina para los rangos de linealidad, indicando la cantidad de enzima que cataliza la conversin de 1 mol de sustrato por minuto. Nuestra actividad volumtrica fue 0.029 UI/ml a una dilucin 1:1, 0.019 UI/ml a una dilucin 1:2 y 0.0078UI/ml Las determinaciones de la actividad enzimtica demostraron que la inulinasa excretada presenta una mayor actividad especfica que la enzima retenida en la pared celular, sobre rafinosa, sacarosa e inulina, a pH 4.5. La actividad especifica de inulinasa (UI/mg de proteina) usando como sustrato sacarosa es de 1.388. VI. CONCLUSIONES Las enzimas que generan los microorganismos pueden estar dentro o afuera de la clula y esto depende de la funcin que cumplen. La enzima que obtuvimos (inulinasa) cumple su funcin cataltica especialmente en inulina (cadena lineal de fructosa) esto se debe a su especificidad. La enzima inulinaza presenta una actividad enzimtica ptima a 50C ya que a temperaturas mayores la enzima se desnaturaliza. Nuestra actividad volumtrica indica que se necesita 0.029 de enzima para catalizar 1 mol de sacarosa, y a medida que se diluye la enzima su actividad volumtrica disminuye.

VII. BIBLIOGRAFA [1] www.smbb.com.mx/congresos%20smbb/veracruz01/TRABAJOS/AREA_V/CV-32.pdf http://148.206.53.231/UAM21519.PDF http://148.206.53.231/tesiuami/Duplicadas/UAM0568-0567-508.pdf http://www.mag.go.cr/rev_meso/v17n02_151.pdf

DISCUSIONES PARA KM Tambin determinaron los valores de Km de la inulinasa sobre sacarosa (13 .6 mM a pH 5.0) Inmovilizacin

VIII. ANEXOS ANEXO N1 1.- Determinacion de proteinas METODO DE BRADFORD

Prepara reactivo de Bradford (500ml) Aforar hasta 500ml con agua destilada Disolver 0.05g azul de Coomassie G-250 en 25ml de atanol al 98%, mas 50ml de acido fosforito al 85% y con agua destilada aforarlo a 500ml.

PROCEDIMIENTO:

a) Agregar un tubo de ensayo 500 l de muestra convenientemente diluida

b) Aadir 5ml de reactivo de Bradford (a cada muestra) y dejar de reacciona por 5min.

c) Leer la absorbancia a = 595nm, contrastndola con un blanco de agua

d) La concentracin se obtiene interceptando la medida de la absorbancia de la curva de calibrado.

La curva de calibrado se obtiene a partir de muestras de concentracion conocidas de una solucion estndar de albumina,suero de bobino de albmina y analizadas segn este procedimiento.

Reactivo de Bradford (Dilucin 1:5) Protena [g/l] 0.1 0.08 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 Absorbancia (595nm) 0.143 0.128 0.118 0.104 0.102 0.086 0.082 0.051

C urva de C alibrado para la Obtencion de Proteina en el C aldo C rudo

0,16 0,14 0,12 Absorbancia 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 0 0,02 0,04 0,06 Pr ote ina (g/l) 0,08 0,1 0,12 y = 0,9168x + 0,0571 R2 = 0,9283

ANEXO N2 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA (ACTIVIDAD

VOLUMTRICA) DE LA ENZIMA EN EL CALDO CRUDO

 Calculando el factor de conversin:

1mol glu cos a 180 g. x 1g / l min x = 5.56 * 10 3 mol / l min

convirtien do a : 5.56 *10 3 *10 6 = 5.56 *10 3 mol / l min sabiendo que :

mol = UI min .

5.56 * 10 3

mol 1 1l UI * * = 5.56 min l 1000 ml ml

CURVA DE CALIBRADO DE GLUCOSA: METODO DEL DNS (2.5g/l)

N Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8

Glucosa Estndar 1,0 0,8 0,6 0,5 0,4 0,2 0,1 0,0

H2O 0,0 0,2 0,4 0,5 0,6 0,8 0,9 1,0

[ ] (g/L) 2,50 2,00 1,50 1,25 1,00 0,50 0,25 0,00

ABS. (540nm) 1,081 0,899 0,684 0,599 0,480 0,218 0,102 0,000

"Curva de Calibrado de Azucares Reductores"

3,00 2,50 2,00 [g/l] 1,50 1,00 0,50 0,00 0,000 0,200 0,400 0,600 Absorbancia 0,800 1,000 1,200 y = 2,2552x - 0,0203 R 2 = 0,9961