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Processos Fermentativos Industriais: Fundamentos e Aplicaes

Isolamento de Culturas

1 INTRODUO

Os microrganismos so seres de extrema importncia para pesquisas biotecnolgicas, bem como para aplicaes industriais, principalmente em indstrias que procuram produzir derivados deles, biomassa ou produtos de sua ao metablica. Para o uso desses microrganismos, eles devem ser coletados, isolados, ter a sua produo testada e medida para ento ser usados em larga escala. O microrganismo, como bem se sabe, constitui num dos quatro pilares de um processo fermentativo, ou seja, sua seleo de extrema importncia para o processo e ditar procedimentos e caractersticas que se seguiro at a obteno do produto final. Isolar um microrganismo consiste em obter culturas puras que envolvem somente o organismo de interesse. Na fase do isolamento, ocorre a seleo de uma colnia atravs da observao da produo de determinado produto ou mesmo da prpria morfologia da colnia. A primeira etapa para a utilizao de um microrganismo de interesse industrial quase sempre a etapa de isolamento de uma colnia. Tratar de um nico tipo de microrganismo , na maioria das vezes, mais fcil do que manipular vrios ao mesmo tempo. Uma cultura livre de outros microrganismos contaminantes onde o microrganismo de interesse est presente de forma homognea denominada cultura axnica. Um cultivo desse tipo d oportunidade de investigao de caractersticas fisiolgicas e genticas sem a interferncia de outros microrganismos e em uma densidade populacional muito maior do que a encontrada em amostras de meio ambiente. Entretanto, pode-se perder informaes quando se leva em conta as associaes que os organismos criam entre si na natureza. Muitas vezes um organismo apresenta determinada atividade ou produo de determinado metablito justamente devido s interaes com o meio em que est inserido. Isolado, esse microrganismo pode apresentar a caracterstica investigada em menor proporo ou mesmo no apresent-la.

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O isolamento de novos microrganismos, apesar de existirem as alternativas de uso de organismos geneticamente modificados e de bancos de cepas, justifica-se pela imensa biodiversidade observada na natureza. Centros de cepas podem fornecer microrganismos de caractersticas j conhecidas, mas nem sempre esto presentes os melhores caracteres desejados, enquanto o ambiente possui uma infinidade de variaes. Os bancos de culturas tm como funo o armazenamento, a preveno de eventuais mudanas nas suas caractersticas, o ensino e a pesquisa sobre manuteno e caracterizao de cepas. Alm disso, sempre possvel encontrar novas espcies, que produzam determinada biomolcula de forma mais eficiente ou que produzam novas biomolculas. O isolamento de culturas a partir de amostras do meio ambiente tem tambm a funo de identificao de novos microrganismos. Quando se realiza o isolamento de todas as colnias de uma amostra, observa-se que esse nmero de clulas diferenciadas de 4 a 6 vezes menor que o que se detecta na amostra original. Comeou-se a observar, tambm, que em certa amostra do ambiente, algum tipo de metablito era produzido e tal metablito no se apresentava nas culturas isoladas. A partir dessas hipteses, estimouse ento que havia uma grande quantidade de microrganismos no cultivveis pelos mtodos tradicionais. A figura 1 exemplifica a viabilidade de cultura dependendo simplesmente do estado fisiolgico do microrganismo. Levando-se em conta que em apenas 1g de solo apresenta de 1 a 10 milhes de espcies de microrganismos, concluiu-se tambm que esses organismos no cultivveis poderiam representar uma quantidade imensa de organismos desconhecidos. A tabela 1 mostra o nmero de espcies de seres vivos atualmente conhecido e a estimativa das espcies existentes no mundo. Mais adiante sero abordadas novas tecnologias baseadas na biologia molecular que em muito contribuem na descoberta desses novos organismos, auxiliando na explorao de toda a rica diversidade disponvel no ambiente.

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FIGURA 1 - Estados fisiolgicos dos microrganismos e possibilidade de cultivo

FONTE: OGUNSEITAN, 2005

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TABELA 1 - Nmero de espcies de seres vivos atualmente conhecidas e


estimativa de espcies existentes no mundo

FONTE: EMBRAPA, 1998.

O isolamento, assim como todo o processo que ir se desenvolver futuramente, deve ser o mais econmico possvel, levando-se em

considerao a produtividade que ser obtida pelo microrganismo e os gastos necessrios para isolamento de tal microrganismo. Fatores importantes na escolha de um microrganismo so as suas caractersticas nutricionais, pois se almeja obter microrganismos que utilizem substratos baratos, que podem ser obtidos atravs da formulao adequada do meio de isolamento; a temperatura tima, pois organismos com temperatura tima de 40C para cima facilitam o isolamento e reduzem os custos de resfriamento do fermentador; a compatibilidade com o fermentador utilizado e com o processo de cultivo desejado; e a estabilidade gentica, ou seja, quando se deseja a manipulao gentica, devem ser conhecidos os melhores mecanismos. Pode

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ser mais barato comprar uma cultura do que isol-la da natureza, mas tambm pode ser que se encontre um organismo muito melhor depois de uma procura extensa no meio ambiente. Entretanto, geralmente necessrio utilizar uma cepa dos bancos como uma referncia para comparao com novos microrganismos descobertos atravs do isolamento da natureza. Toda essa variabilidade implica, portanto, numa variabilidade de substratos e condies em que microrganismos se desenvolvem. Nesse sentido, a diversidade e a busca por microrganismos desconhecidos representam uma fonte de alternativas que devem ser analisadas

economicamente. O isolamento inicia com a escolha da fonte mais provvel de conter o microrganismo desejado, podendo variar desde solo at guas, ar, lodo, alimentos ou rgos. Caractersticas que um determinado organismo possui para se desenvolver em certo ambiente so usadas como fatores seletivos no processo de isolamento. Depois de recolhida a amostra, a cultura pode necessitar ou no de um pr-tratamento ou enriquecimento do meio sinttico onde a cultura ser feita. Caso no necessite, a caracterizao do microrganismo poder ser o passo seguinte ao isolamento direto. Se for necessrio um pr-tratamento, este poder ou no ser seguido de um enriquecimento. Apenas depois dessa etapa o isolamento, dito indireto, poder ser feito seguido da caracterizao do microrganismo. O pr-tratamento uma etapa que visa facilitar o isolamento do microrganismo de interesse. Ele aplicado em amostras que no podem ser utilizadas de imediato, necessitando serem modificadas para que as etapas subsequentes sejam satisfatrias. O enriquecimento geralmente aplicado em amostras onde se sabe que o nmero de microrganismos de interesse pequeno em comparao com o nmero dos outros que l se encontram. Nesse caso, as condies de cultivo geralmente favorecem o crescimento e multiplicao do microrganismo de interesse.

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Alm disso, deve-se observar alguns procedimentos padres, como a total assepsia desde a coleta do material, passando pelo seu manuseio, at a estocagem da cultura isolada. Tambm importante que a amostra seja identificada com o maior nmero de detalhes (data da coleta, parmetros do ambiente como pH, temperatura, presso, salinidade, entre outros).

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2 MEIOS DE CULTURA

Para fazer o isolamento de um microrganismo, deve-se empregar o meio de cultivo mais adequado para o seu desenvolvimento. O meio de cultura um material nutriente preparado em laboratrio cuja utilizao importante para o crescimento, transporte e estocagem de microrganismos. Os meios de cultivo podem ser classificados em meios sintticos (quimicamente definidos) e meios complexos. Os meios sintticos so aqueles em que a composio qumica exata conhecida. Alguns microrganismos necessitam de um meio definido com muitos fatores necessrios para o crescimento e so denominados fastidiosos ou muito exigentes em termos nutricionais. Meios quimicamente definidos so utilizados normalmente em trabalhos experimentais em laboratrios ou para o crescimento de seres autotrficos. J os meios complexos so aqueles que apresentam algum componente que tem uma composio varivel. Nesse caso esto includos extratos de leveduras, de carne, de plantas ou produtos da digesto protica como peptonas. Quando o meio complexo est na forma lquida chamado de caldo nutriente e quando est na forma solidificada chamado de gar nutriente. Esses meios so utilizados normalmente para bactrias heterotrficas e fungos. No caso de microrganismos anaerbios deve-se utilizar um meio especial denominado meio redutor. Eles contm reagentes como o tioglicolato de sdio que capaz de se combinar com o oxignio dissolvido, eliminando-o da cultura. A tabela 2 abrange os tipos de meio de cultivo existentes e em que ocasies eles devem ser utilizados.

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TABELA 2 Meios de cultura


Tipo Finalidade

Quimicamente definido Crescimento de quimioautotrficos e autotrficos e anlises microbiolgicas. Complexo Redutor Crescimento da maioria dos organismos quimio-heterotrficos. Crescimento de anaerbios obrigatrios. Impedir o crescimento de microrganismos no desejados; favorecer o crescimento do organismo de interesse (meios com telurito de potssio para Seletivo isolamento de Corynebacterium diphtheriae, gar Salmonella-Shigella (SS) e gar MacConkey, meios com sais biliares e verde brilhante para isolamento seletivo de Salmonella) Diferenciar colnias do organismo de interesse dos outros microrganismos (meio Diferencial de Teague ou Eosina Azul de Metileno diferencial para coliformes, gar MacConkey para a diferenciao de enterobactrias, gar sangue, agar BairdParker para isolamento e diferenciao de cocos Gram positivos) Semelhante ao seletivo, mas com a caracterstica importante de aumentar o Enriquecimento nmero de bactrias de interesse tornando-a detectvel (Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonelas, Caldo Tioglicolato para Clostridium perfringens.) Fonte: Adaptado de TORTORA et al., 2006.

A figura 2 ilustra um exemplo de meio diferencial, o gar MRS com corante azul de anilina, que diferencia as bactrias hemolticas (formam halo ao seu redor) das no hemolticas (no formam halo). Alm desses, existem meios com funes menos conhecidas, como os de triagem (avaliam determinadas atividades metablicas permitindo

caracterizao e identificao presuntiva de muitos microrganismos), identificao (prestam-se para a realizao de provas bioqumicas e verificao de funes fisiolgicas de organismos), dosagem (determinaes de vitaminas, antibiticos e aminocidos), contagem e estocagem.

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FIGURA 2 Meio diferencial gar MRS com corante azul de anilina

FONTE: FACHIN, et al, 2008

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3 TCNICAS BSICAS DE ISOLAMENTO Algumas tcnicas so procedimento padro no isolamento de microrganismos. A seguir sero listadas as mais conhecidas e utilizadas com maior frequncia em procedimentos laboratoriais:

3.1 TCNICAS DE ISOLAMENTO EM CULTIVO SLIDO 3.1.1 Semeadura por estrias Esse mtodo tambm chamado de esgotamento de ala. Atravs de uma ala de platina, de um fio de platina ou at mesmo um swab, coleta-se uma pequena parcela do meio de inculo e o espalha sobre uma placa de Petri com gar fazendo movimentos em zigue-zague, formando um caminho na forma de estrias. importante que a cada mudana de direo no estriamento, uma parte da amostra anterior seja arrastada para o esgotamento, para garantir que a cultura continue no procedimento e que se produza o efeito de diluio. Numa nova seleo, deve-se escolher as culturas mais diludas, que tm maior chance de estar melhor isoladas. A figura 3 ilustra a direo das estrias na placa, bem como o efeito de diluio esperado aps o terceiro estriamento.

FIGURA 3 Semeadura por estrias

FONTE: TORTORA, et al, 2006

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3.1.2 Tcnica de semeadura por espalhamento Nessa tcnica, um pequeno volume da soluo de microrganismos contendo de 30-300 clulas transferido para o centro de uma placa de gar j solidificado com o auxlio de uma pipeta estril. Em seguida, mergulha-se uma ala de Drigalski em lcool e a flamba-se de modo a manter todo o material estril. Com o auxlio dessa ala, espalha-se aquele volume depositado por toda a superfcie do gar. As colnias crescem espalhadas por toda a superfcie do gar.

3.1.3 Tcnica de semeadura por derramamento O mtodo de semeadura por derramamento, ou tambm denominado de pour plate muito utilizado para bactrias e fungos. A amostra original diluda de forma que quando feita a placa consegue-se colnias bem separadas. Um pequeno volume da melhor diluio ento derramado em uma placa de Petri sem gar. Em seguida, derrama-se gar fundido na temperatura de 45C e mistura-se os dois com uma agitao leve da placa e deixa-se o meio solidificar. Esse mtodo permite o crescimento de colnias na superfcie e dentro do gar. Microrganismos sensveis ao calor certamente podem ser danificados pelo gar fundido e ficarem impossibilitados de formarem colnias. Alm disso, quando se deseja identificar microrganismos atravs da morfologia da colnia, esse mtodo no muito indicado, pois as colnias presentes dentro do gar no fornecero dados corretos. A figura 4 ilustra um comparativo entre o mtodo do espalhamento e o pour plate. A principal diferena est no local de crescimento das colnias. Na tcnica de espalhamento, elas crescem apenas na superfcie do gar; j na semeadura por derramamento, observa-se crescimento tanto na superfcie quanto no interior da placa.

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FIGURA 4 Comparativo entre a tcnica de semeadura por espalhamento e o pour plate

FONTE: TORTORA, et al, 2006.

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3.1.4 Tcnica de semeadura em profundidade Faz-se a utilizao da agulha de platina e semeia-se o material contido nela picando um gar slido contido num tubo. Com isso haver o crescimento de microrganismos em anaerobiose no fundo e aerobiose perto da superfcie do gar. Alm disso, possvel observar caractersticas de mobilidade de microrganismos.

3.2 TCNICAS DE ISOLAMENTO EM CULTIVO LQUIDO Para cultivos lquidos, utiliza-se a tcnica das diluies sucessivas. Toma-se 1g ou 1ml da amostra e dilui-se em 9ml de, geralmente, uma soluo salina 0,85%. Dessa diluio, toma-se novamente 1ml, que diludo novamente em 9ml de soluo, obtendo a diluio correspondente a 10 -2, e assim sucessivamente, como mostra a figura 5. Espera-se que em certo momento se obtenha culturas provenientes de somente uma nica clula. dessa forma que feita o isolamento e a contagem de clulas de Escherichia coli em guas ou alimentos, por exemplo. Toma-se para isolamento, em geral, as trs ltimas diluies.

FIGURA 5 Diluies sucessivas

FONTE: Adaptado de PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002.

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3.3 ISOLAMENTO EM CULTIVO CONTNUO A prevalncia do microrganismo desejado com relao aos outros depender da taxa mxima de crescimento dele com relao aos outros organismos capazes de tambm crescer no meio. Portanto, aquele capaz de crescer mais rapidamente com os substratos disponveis poder ter um nmero maior de clulas. No entanto, nem sempre o organismo com maior taxa de crescimento o desejvel, mas sim aquele que apresenta uma maior afinidade pelo substrato limitante. Para isso, faz-se uso de um cultivo contnuo, onde novo meio de cultivo adicionado de tempos em tempos e as presses seletivas so restauradas. A taxa de crescimento depende da taxa de diluio e da concentrao do substrato limitante.

A seguir, sero abordadas tcnicas especiais para quatro classes de microrganismos de grande interesse comercial para a Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia: fungos, algas, bactrias e actinomicetos.

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4 ISOLAMENTO DE FUNGOS

4.1

CARACTERSTICAS

GERAIS

DOS

FUNGOS

IMPORTNCIA

BIOTECNOLGICA Fungos so seres heterotrficos, eucariontes, uni ou pluricelulares. Quando unicelulares, so as chamadas leveduras. So ditos seres ubquos, ou seja, habitam praticamente todos os lugares do ambiente (desde solos cobertos de folhas a solos detrticos, rizosfera, areia, cascalhos e pedras, partes de plantas, esturios, esgotos, lagos e ambientes marinhos). Assim, o isolamento desses organismos deve levar em conta os objetivos do pesquisador, ou seja, qual a molcula que se deseja obter desses microrganismos ou qual espcie se deseja isolar. A importncia para a biotecnologia dos fungos diversificada, vai desde controle biolgico de insetos, produo de etanol, cido ctrico e outros cidos orgnicos importantes, enzimas industriais, hormnios de crescimento vegetal, antibiticos dos mais diversos espectros de ao at fermentados na indstria alimentcia como os produtos derivados da fermentao de leveduras, como sua funo como fermento de po, na indstria cervejeira e na vinicultura. Alm disso alguns tipos de queijos (Camembert e Roquefort) e produtos orientais (shoyo, miss) so provenientes de fermentao com fungos especficos.

4.2 COLETA A coleta deve ser feita utilizando luvas e todo o material deve estar esterilizado. A amostra coletada deve ser usada imediatamente ou guardada a 5C por 12 horas.

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4.3 PARMETROS IMPORTANTES No caso do isolamento de espcies de fungos, quaisquer modificaes no meio e nas condies de isolamento so extremamente seletivos, privilegiando uma ou outra forma. Parmetros como pH, salinidade, fontes nutrientes e salinidade do ambiente devem ser levados em conta na escolha do meio para o isolamento. O uso de altas razes C/N propicia o surgimento de muitas colnias, possibilitando grande quantidade de espcies identificadas. As temperaturas de incubao devem levar em conta a obteno de fungos psicrfilos (5 a 15C), mesfilos (20 a 35C) ou termfilos (45 a 50C). A luz um importante fator a ser considerado quando se precisa induzir frutificao. O uso de substratos estreis junto ao meio de isolamento pode possibilitar o isolamento de uma espcie ou outra. A adio de extrato de solo ou infuses vegetais exemplo de seletividade no isolamento. Quando se deseja obter a partir de uma amostra somente exemplares de fungo, pode-se usar um antibitico. Outros mtodos de inibio bacteriana so a secagem das placas a serem usadas 3 a 4 dias antes do uso, abaixamento de pH do meio ou uso de rosa bengala no meio de isolamento. Quando se deseja inibir o crescimento de fungos pois no se deseja isolar os mesmos, pode-se utilizar antifngicos, altas concentraes de CO2 ou sais de clcio.

4.4 TCNICAS DE ISOLAMENTO DE FUNGOS 4.4.1 Mtodo de implantao Consiste no uso de um objeto estril, como um pina ou esptula, para se depositar uma poro da amostra (como solo ou partes de plantas) e pression-la no gar, incubando-se a placa em seguida. O crescimento do

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fungo se dar do ponto de aplicao em diante e os prximos isolamentos devem ser realizados usando a frente de crescimento como amostra.

4.4.2 Mtodo de diluio e plaqueamento Nesse mtodo, sucessivas diluies so realizadas (utilizando-se 1,0 g de amostra slida e 9,0 ml de diluente) e o resultante da terceira diluio plaqueado com o auxlio de uma haste de vidro. Essa diluio garante o aparecimento de aproximadamente 40 a 60 colnias de fungos. Aps a incubao e crescimento das culturas, a placa pode ser usada para reisolamento de culturas especficas.

4.4.3 Mtodo Warcup Esse mtodo se baseia no implante da amostra slida na placa de petri dispersando-a com algumas gotas de gua, seguindo-se o verter de meio com gar derretido e posterior incubao. um mtodo eficiente para fungos que demoram mais a apresentar crescimento.

4.4.4 Mtodo de carimbo Consiste no uso de um objeto estril impregnado com a amostra slida que em seguida carimbado nas placas, sendo ideal o uso de 6 a 8 placas sem se adicionar mais amostra ao objeto para produzir efeito de diluies sucessivas. Um grande nmero de colnias e espcies pode ser obtido por essa tcnica e com a adio de NaCl de 4 a 10% a eficcia do mtodo aumentada.

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4.4.5 Mtodo da impresso Esse mtodo consiste na aplicao de partes de plantas,

especialmente da folha, diretamente no gar, com o uso de luvas estreis. As folhas devem ser pressionadas em vrias placas diferentes, para produzir efeito de diluio e utlizando-se a parte frontal e posterior. Diversos tipos de fungos no esporulados podem ser obtidos dessa forma.

4.4.6 Mtodo de lavagem Neste mtodo, a amostra slida primeiramente colocada sob agitao (por 2 a 5 minutos) num frasco com Tween 80 e gua e em seguida filtrada e lavada ou usada em mtodos de diluio. O uso desse mtodo privilegia o isolamento de espcies formadoras de miclio. As partes lavadas (como partes vegetais) podem ser ento usadas para mtodos de impresso ou carimbo.

4.4.7 Mtodo de macerao Consiste nos procedimentos semelhantes aos mtodos de diluio ou impresso sendo que, no entanto, antes da realizao desses mtodos a amostra deve ser macerada para abertura da amostra. Esse mtodo pode no entanto ser benfico (aumentando o nmero de espcies pois expe melhor a amostra) ou malfico (afetando a viabilidade de algumas espcies de fungos).

4.4.8 Mtodo de isolamento a partir da gua A diluio deve ser feita at que se obtenha em mdia 50 colnias por placa e a partir disso que seja realizado o isolamento.

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4.4.9 Isolamento de Basidiomicetos a partir do Esporocarpo Basidiomicetos podem ser isolados a partir de suas estruturas frutferas e os meios para seu isolamento devem incluir infuso de batata (PDA), gar e meios seletivos para basidiomicetos. A escolha de onde ser coletada a amostra deve levar em conta a escolha das estruturas mais recentes pois as mais antigas trazem consigo maior quantidade de contaminantes.

4.4.10 Isolamento de tecidos do esporocarpo Nesse mtodo deve-se primeiramente raspar os restos contidos na superfcie do fungo e em seguida limpar a parte externa do mesmo com lcool. Em seguida o esporocarpo aberto e seu interior exposto. Deve-se ento retirar o tecido e plaque-lo em meio com gar ou em meio lquido depois de apreendido em papel filtro.

4.4.11 Isolamento de esporos O principal fator no isolamento de esporos ou fungos que esporulam que as placas sejam depositadas com a rampa para baixo para que os esporos no contaminem a placa toda. A abertura da placa tambm deve ser cuidados, evitando o espalhamento dos esporos. Esporos podem ser tambm isolados em meio lquido ou em placas com gar derretido vertido aps ser colocada a amostra.

4.4.12 Isolamento de Basidiomicetos a partir das estruturas vegetativas A parte interessada (como por exemplo razes com micorrizas) deve ser coletada com materiais estreis e seguido a isso o material deve ser

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esterilizado superficialmente seguido de lavagens com gua destilada. Em seguida o material modo, esfarelado ou fatiado sobre a placa com meio. O miclio crescer para fora do tecido e poder ser posteriormente isolado. Quando a amostra estiver em pedaos de madeira, deve-se optar pelo uso de reas com a o fungo em crescimento ativo.

4.5 PURIFICAO Em geral, aps obtido o isolado procedimentos de reinoculao e posteriores isolamentos so necessrios. Aparentemente isolado,

crescimento deve ser acompanhado em lminas ao microscpio.

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5 ISOLAMENTO DE ALGAS

5.1

CARACTERSTICAS

GERAIS

DAS

ALGAS

IMPORTNCIA

BIOTECNOLGICA As algas so importantes organismos uni ou pluricelulares, aquticos e autotrficos. Entre as de importncia para biotecnologia esto principalmente as unicelulares (microalgas), como as diatomceas, clorofceas e cianofceas. Entre os principais usos de microalgas em processos biotecnolgicos destacam-se tratamento de efluentes (nas lagoas de tratamento de esgoto como depurador, inclusive de fsforo e nitrognio), produo de energia (como o caso do biodiesel a partir das espcies ricas em lipdios), adubo, alimentao humana (devido ao alto teor de protenas contido na sua biomassa), espessante, emulsificantes, enriquecimento de rao animal, pigmentos (entre eles a astaxantina, a ficocianina e a prpria clorofila) e polissacardeos para uso em frmacos e cosmticos. As algas podem ser encontradas nos mais diversos ambientes, desde gua salgada ou de rios, lagos e lagoas at solos mido, enlamaados, pedras, musgos, galhos de plantas (ou qualquer outro material vegetal) ou mesmo de um agregado de algas em processo de proliferao.

5.2 COLETA Em geral, apenas coleta-se duas ou trs amostras de cada ambiente para que as espcies principais sejam isoladas, tendo em vista que dificultoso para pesquisa industrial o uso de vrias amostras na tentativa de isolamento de uma alga que produza a biomolcula de interesse. A coleta das amostras deve ser toda realizada com material estril e preferencialmente com diluente para que possa ser conservada mais estvel

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(a 4C por alguns dias) sendo no entanto no recomendvel uma grande demora no uso das amostras.

5.3 PARMETROS IMPORTANTES importante que se avalie a relao rea/volume desejada pela espcie e a salinidade, sendo este ltimo parmetro facilmente ajustvel por concentrao em gua salina (podendo esta ser artificial) ou com NaCl. Os parmetros pH e temperatura so extremamente variveis sendo que no geral a temperatura de 25C bastante razovel para isolamento de algas no geral. Para se obter algas fixadoras de nitrognio deve-se retirar fontes nitrogenadas normalmente presentes nos meios, deixando apenas o nitrognio atmosfrico como fonte. No caso de inibio de diatomceas, podese utilizar dixido de germnio e no caso de se obter as mesmas deve-se adicionar slica ao meio. Euglenides em geral necessitam de amnia e algumas espcies requerem selnio. H ainda espcies que requerem fontes de crescimento bacteriano (como alguns dinoflagelados e crisfitas) e outras que necessitam de fontes de nutrio caractersticas de eucariotos. H ainda alguns elementos trao que so necessrios ao crescimento como por exemplo vitaminas que podem ser adicionadas a amostra bruta para um enriquecimento da mesma antes das tentativas de isolamento. A adio de vitamina deve ser mnima pois facilita o crescimento exagerado de fungos e bactrias. Esse enriquecimento pode ser obtido atravs da adio de extrato de solo. Outro possvel pr-tratamento da amostra uma centrifugao para que espcies maiores sejam separadas de menores. O uso dessa tcnica deve ser branda, para evitar rompimento celular e consequente perda de algumas espcies.

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Cianofceas, uma vez que so protistas, podem ser inibidas com uso de antibiticos.

5.4 TCNICAS DE ISOLAMENTO DE ALGAS 5.4.1 Mtodo de Isolamento baseado em diluies O mtodo das diluies sucessivas bastante eficiente, aplicvel a maioria das amostras e bastante rpido. importante ressaltar que o tempo de crescimento de espcies algais em geral muito superior ao tempo de crescimento de outros microrganismos. Aps o plaqueamento, portanto, preciso aguardar de 10 a 15 dias para observao das primeiras colnias.

5.4.2 Mtodo de pour plate Utilizado para isolamento de cianobactrias filamentosas consiste na adio de meio para isolamento de algas (genrico) com gar derretido em tubos em banho maria a 45C. Em seguida 1,0 ml da soluo amostra diluda adicionado a cada tubo e com o devido cuidado para no expor em excesso a amostra temperatura elevada, esse meio vertido em placa de petri. Aps a solidificao deve ser encubado com luz cclica e temperatura apropriada.

5.4.3 Mtodo de espalhamento em placa Usado no isolamento de cianobactrias filamentosas e unicelulares ou clorfitas e se baseia no espalhamento com uma ala de vidro da soluo de amostra diluda sobre a placa com gar e posterior incubao. O espalhamento deve ser feito utilizando-se 0,1 ml da diluio.

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5.4.4 Mtodo do estriamento Utilizado para isolamento de cianobactrias e clorfitas, o mtodo se baseia na remoo de uma gota da diluio e posterior disperso da gota na forma de estrias em placa de petri com meio contendo gar seguido de incubao. 5.4.5 Mtodo de caldo Usado para algas que no apresentam crescimento em meios slidos. Esse mtodo utiliza-se de 1,0 ml da diluio adicionados a 9,0 ml de meio genrico (dependendo do que se deseja obter ao final) contidos em tubo com tampo (este deve ficar ligeiramente aberto para permitir trocas gasosas). Incubar juntamente com os tubos de diluies.

5.4.6 Mtodo por filtragem ou carimbo O mtodo baseia-se em filtrao inicial (em papel filtro, com funil de Bchner e vcuo) da amostra para que haja concentrao das espcies algais em menor quantidade na amostra e que poderiam ser perdidas no caso de uma posterior diluio. Aps filtrado, o papel contendo a amostra concentrada carimbado nas placas, sendo que este deve ser carimbado sucessivamente em mais de uma placa para produzir efeito de diluio. O papel deve ento ser colocado numa placa de petri com gar a 45 e em seguida recoberto com meio contendo gar derretido. Esse mtodo de carimbo pode ser tambm utilizado para isolamento a partir de pedras, galhos e solo podendo-se implantar a amostra no meio com gar, pression-la ou rol-la sobre o meio. Em seguida, as placas so incubadas.

5.4.7 Citometria de fluxo Utilizada principalmente para isolamento de clulas pequenas do fitoplancton, j que esse nicho tem mostrado ser uma importante fonte de

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novos microrganismos. Quando analisada num citmetro de fluxo as populaes distintas podem aparecer como conjuntos. No entanto, a lgica de classificao eletrnica rpida faz as medidas necessrias das caractersticas celulares e assim que a clula de interesse observada, a gota contendo a clula de interesse recebe uma carga que faz com que a mesma seja defletida sendo coletada num tubo de amostra. Com essa tcnica possvel identificar clulas nicas dentro destas populaes sendo este um mtodo bastante eficaz pois garante, em geral, a obteno de culturas puras logo no primeiro isolamento. O funcionamento do citmetro de fluxo est

esquematizado na figura 6.

FIGURA 6 Funcionamento de um citmetro de fluxo

FONTE: ANDERSEN, 2005

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5.4.8 Outras tcnicas Outro possvel mtodo a seleo de espcies visveis na amostra, como as espcies filamentosas que ao serem implantadas em meio com gar estabelecem, em geral, uma cultura isolada numa primeira tentativa. No entanto preciso que o pesquisador saiba reconhecer essas. Outro mtodo o uso de pipetas com microcapilares fotossintticos para aquelas algas que apresentam resposta fotosttica.

5.5 PURIFICAO Aps observao de crescimento de colnias, as placas devem ter amostras retiradas para observao em microscpio. Se mais de uma espcie for observada, o isolamento deve ser repetido, partindo-se agora da amostra contida na placa resultante do primeiro isolamento. A manuteno da colnia obtida pode ser feita em tubo inclinado com meio que obedea as observaes requeridas pela alga em temperatura ambiente (ou a mais desejvel pela espcie) e sob luz fraca.

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6 ISOLAMENTO DE BACTRIAS

6.1 CARACTERSTICAS GERAIS DAS BACTRIAS E IMPORTNCIA BIOTECNOLGICA Bactrias so microrganismos unicelulares procariontes que podem viver de forma isolada ou em colnias. Quanto a fonte de carbono podem ser autotrficas (fonte de carbono o dixido de carbono) e heterotrficas (compostos orgnicos). As bactrias fototrficas so aquelas que usam luz como fonte de energia e as quimiotrficas usam compostos qumicos (substncias inorgnicas ou orgnicas). So tambm encontradas nos mais diversos ambientes, solos, detritos, pedras, plantas e razes, guas e rizosfera. importante ressaltar que a rizosfera comporta uma quantidade e uma variedade de bactrias muito maior do que qualquer outra amostra de solo. As bactrias podem atuar no tratamento de resduos, produo de biogs, fixao de nitrognio, produo de vitaminas e aminocidos, polissacardeos,produo de vacinas entre vrias outras aplicaes.

6.2 COLETA Uma gama diversa de meios podem ser utilizados alguns gars devem conter de 10 a 50% di liquido, podem conter diversas fontes de nitrognio e carbono , e devem conter agentes antifngicos cycloheximidi e nystatin numa concentrao de 50 microgramas por ml.

6.3 PARMETROS IMPORTANTES Assim como em todos os outros microrganismos j citados, extremamente importante que se observe parmetros como pH, salinidade, temperatura, relao C/N.

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Muitas bactrias exigem um meio complementado com fontes complexas, parmetro que varia de espcie para espcie. Pode-se promover o enriquecimento por adio de alguns substratos como acar,

polissacardeos e protenas, e ainda amostras do solo ou plantas prximas. Tambm importante adicionar agentes antifngicos e o tempo de incubao varia para bactrias psicrfilos, mesofilos ou termfilos.

6.4 TCNICAS DE ISOLAMENTO DE BACTRIAS 6.4.1 Isolamento de Bactrias diretamente do solo A amostra de solo deve ser diluda e esta suspenso por sua vez diluda em um diluente adequado em torno de trs vezes. Cada diluio deve ter uma amostra espalhada em diversas placas contendo diferentes gars e incubada por 4 a 10 dias. Numa anlise turbidimtrica das amostras, quanto mais turvo devido a presena de argila menor a quantidade de clulas bacterianas que devem ser encontradas.

6.4.2 Enriquecimento simples de solo Este enriquecimento tem por objetivo promover o crescimento de alguma cultura especfica e que necessite disso para se sobressair em relao as outras. Pode estar relacionado com algum substrato especfico ou ainda

emprego de alguma enzima que ative alguma parte do genoma. Pode-se usar um substrato presente no meio da onde a amostra foi retirada, e a temperatura e pH devem ser ajustados conforme interesse.

6.4.3 Isolamento direto de bactrias de plantas Uma parte da amostra deve ser diluda sob agitao durante alguns minutos. A seguir o extrato sequencialmente diludo e ento plaqueado em gar para isolamento adequado. O enriquecimento prvio pode ser feito

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adicionando primeiramente polissacardeos, aucares e protenas antes das diluies sucessivas ainda no extrato da planta.

6.4.4 Isolamento de bactrias da gua Para coletar as amostras necessrio utilizar material esterilizado e a coleta no deve ser realizada na superfcie. O material deve ser estocado a 5C por no mximo 24 horas para que as condies no sejam alteradas. A amostra tem de ser filtrada (membrana de 0.22 micrmetros) juntamente com um extrato estril do solo prximo a onde a amostra foi coletada. Ento, retirase uma amostra da suspenso, que diluda novamente e agitada por 5 minutos. Segue-se a diluio sucessiva e o plaqueamento.

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7 ISOLAMENTO DE ACTINOMICETOS

7.1 CARACTERSTICAS GERAIS DOS ACTINOMICETOS E IMPORTNCIA BIOTECNOLGICA Os actinomicetos compreendem um grupo heterogneo de bactrias filamentosas pertencentes ao ramo das bactrias (filogeneticamente). So gram-positivas com alto teor de guanina e citosina. Dentro deste grupo esto presentes bactrias com as mais diferentes caractersticas desde fisso binria, miclio substrutural rudimentar a miclio areo desenvolvidos, ou seja, apresentam caractersticas tpicas de fungos e bactrias. Uma caracterstica importante deste grupo o seu crescimento lento, que pode levar de 2 a 3 dias. So responsveis pela produo de vrios compostos de alto valor comercial e pela biodegradao de polmeros como lignina, quitina, amido. Por exemplo, dos 6000 antibiticos existentes, 65% so produzidos pelo gnero Streptomyces. Os actinomicetos podem ser encontrados em diversos locais. No solo cr-se que 80% deles encontrem-se nos 10 primeiros centmetros. Tambm podem ser encontrados em ambientes aquticos e relacionados a plantas.

7.2 COLETA A amostra, como j foi dito, deve ser coletada de forma assptica usando equipamentos esterilizados para evitar contaminao e deve ser representativa, ou seja, em quantia que possa garantir a existncia de quantia razovel de colnias. Estas amostras podem ento ser conservadas em local adequado 4C.

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7.3 PARMETROS IMPORTANTES A seletividade do meio de isolamento influenciada pela sua composio em nutrientes pH, adio de inibidores e pelas condies de cultivo. A populao de actinomicetos pode ser aumentada por alguns prtratamentos qumicos ou fsicos que eliminem endsporos de bactrias das placas. Um mtodo pode ser por aquecimento que reduz o numero de bactrias, especialmente as gram-negativas mas tambm de alguns actinomicetos. Outro a filtrao por membrana serve para concentrar amostras. Tcnicas convencionais de diluio seriada em placa usando meios de cultura seletivos no indica a populao real de actinomicetos naquele ambiente no qual a amostra foi coletada, j que estes podem ser inibidos por competidores ou apresentar crescimento lento sendo superado por outros actinomicetos mais rpidos. Aps a primeira parte do isolamento necessrio identificar as culturas que cresceram atravs da morfologia (forma das colnias, cor dos esporos, pigmentos e outras caractersticas). Um microscpio pode ajudar nessa caracterizao bem como uma pessoa treinada.

7.4 TCNICAS DE ISOLAMENTO DE ACTINOMICETOS 7.4.1 Isolamento de actinomicetos do solo As amostras previamente secas de solo na forma de p so espalhadas sobre o agar de isolamento de actinomicetos e com o auxilio de um esponja o excesso removido. De acordo com a faixa de temperatura que a incubao for feita promove-se o crescimento de alguns gneros em relao a outros. Pode se fazer esse isolamento de uma forma mais seletiva, melhorando o crescimento de determinado gnero, atravs do uso de prtratamento e de meios seletivos especficos.

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7.4.2 Isolamento de actinomicetos de plantas As amostras colhidas na primavera possuem quantia menor de microrganismos do que no vero, alm disso as diferentes partes da planta apresentam diferentes gneros. A amostra deve ser introduzida em gar ou ento rolado sobre ele. Pode-se preparar um extrato da planta e pegar uma amostra bem diluda que ser inserida no gar e ento espalhada na placa de Petri.

7.4.3 Isolamento de actinomicetos associados a plantas Para coletar actinomicetos associados a plantas necessrio o uso de um equipamento semelhante a uma calha de vidro no qual gar adicionado juntamente com agentes antifngicos. Tal equipamento inserido nos galhos e troncos das arvores a fim de colher material durante 2 a 5 dias. Depois o gar removido, lavado, diludo e ento plaqueado num agar de isolamento adequado. Incuba-se por uma noite a 28 C e ento tiram-se tiras, incubando novamente por 10 a 15 dias.

7.4.4 Isolamento de actinomicetos da gua Pr-tratamento e filtrao concentrao a amostra. Por exemplo, para isolar Rhodoococcus e Micromonospora aquece-se a amostra em tubos de vidro com rolhas de borracha por 6mim a 55C. As amostras ento so diludas em soluo de Ringer contendo gelatin (pH 7) e plaqueadas em gar M3. Incuba-se a 30C. Rhodoococcus aparecem aps 5 a 7 dias e Micromonospora aps 10 a 21 dias.

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8 METAGENMICA

O termo metagenmica no tem conceitos universais, uma vez que se trata de uma cincia extremamente recente. Embora este termo tenha sido criado em 1998, esta rea de pesquisa tem tido seu maior impacto nos ltimos anos. O primeiro seqenciamento completo de uma bactria no cultivvel, Treponema pallidum, causadora da sfilis, foi realizado em 1998 e representou um grande marco no sequenciamento de genomas. Embora este agente infeccioso tenha sido descoberto mais de um sculo atrs, ele nunca havia sido isolado em cultura anteriormente. A metagenmica definida por uma abordagem revolucionria da anlise genmica de comunidades microbianas presentes em amostras retiradas da natureza que entra em contraste marcado com as prticas anteriores as quais envolviam a remoo de um organismo de seu habitat e posterior crescimento em cultura no laboratrio. Esta metodologia s tem sido possvel graas aos avanos na biologia molecular e genmica eucaritica, que lanaram as bases para a clonagem e anlise funcional de genomas coletivos da microflora do solo. A metagenmica apresenta dois principais diferenciais que a distingue das estratgias tradicionais. Primeiramente, ela baseada na anlise genmica do DNA microbiano extrado diretamente de amostras retiradas do meio ambiente e no de amostras cultivadas em laboratrio. Em segundo lugar, ela conduzida em grande escala, ou seja, tem-se a anlise simultnea de todo o genoma contido na amostra. Ao contrrio dos mtodos tradicionais de manipulao gentica e anlise do genoma, a metagenmica centra-se na utilizao do sequenciamento de DNA para prever recursos de organismos e compreender as bases genticas de certos traos. A metagenmica a princpio foi estimulada por pesquisas em solo, mas pode ser expandida para outros ambientes.

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A estratgia deste novo empreendimento isolar o DNA metagenmico diretamente do solo, clon-lo em grandes partes dentro de um organismo previamente cultivado, como E. coli, criar uma biblioteca e selecionar os clones com atividade biolgica. O primeiro obstculo para isso clonar e manter grandes pedaos de DNA. Uma das escolhas atuais de vetor o cromossomo artificial de bactria (BAC), que podem carregar insertos de DNA to grandes quanto 350 kilobases. O uso de E. coli como clula hospedeira amplia o alcance desta abordagem, j que tal bactria comumente utilizada em fermentaes industriais. Assim, mtodos sofisticados que facilitam a produo em batelada, separaes bem como os processos de downstream j so conhecidos. Isto significa que muitos estgios de desenvolvimento para produo comercial de produtos teis j vem sendo conduzidos antes da clonagem dos genes. O processo de extrao e anlise metagenmica est esquematizado na figura 7.

FIGURA 7 Diagrama de representao do processo metagenmico

FONTE: Harvard Science Review, 2006.

Duas abordagens so possveis para extrair as informaes biolgicas contidas nas bibliotecas metagenmicas: a anlise por sequncia dirigida e a

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anlise por funo dirigida. Estes dois tipos de anlise esto esquematizados na figura 8.

FIGURA 8 Anlise por funo dirigida e anlise por sequncia dirigida

FONTE: Current Opinion in Biotechnology, 2003

A anlise funo dirigida iniciada pela identificao de clones que expressam uma caracterstica desejada, seguida pela caracterizao dos clones ativos pela sequncia e anlise bioqumica. Esta abordagem identifica rapidamente os clones que apresentam aplicaes potenciais na medicina, agricultura ou na indstria, centrando-se sobre os produtos naturais ou

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protenas que tem utilidade. As limitaes desta tcnica so que ela exige a expresso da funo de interesse na clula hospedeira e o agrupamento de todos os genes necessrios para a funo. Alm disso, ela depende da disponibilidade de um ensaio para a funo de interesse que pode ser realizado de modo eficiente em bibliotecas vastas porque a freqncia de clones ativos muito baixa. A anlise de sequncia dirigida baseia-se na utilizao de sequncias de DNA conservadas para projetar sondas de hibridizao ou iniciadores de PCR para a realizao de um screening em bibliotecas metagenmicas de clones que contem sequncias de interesse. Descobertas significativas tambm resultaram a partir de sequenciamento aleatrio de clones metagenmicos. Utilizando a metagenmica, agora possvel sequenciar genomas construdos a partir de uma mistura de organismos, mesmo aqueles cujos genes so contaminados com DNA de outras espcies. Todo esse desenvolvimento tem permitido aos cientistas estudar as sequncias de organismos inacessveis. Espera-se tambm que a anlise de microrganismos em seu ambiente contribua para a compreenso a respeito da dinmica das comunidades, especialmente as interaes entre espcies e seleo natural. Alm de suas contribuies para a compreenso do mundo microbiano, a anlise da metagenmica resultou em um entendimento de por que certas bactrias no podem crescer em cultura, contribuindo para uma melhoria nas tcnicas de cultura, diagnsticos e terapias para micrbios no cooperativos. Os mtodos desenvolvidos para a descoberta das novas vias de sntese de produtos naturais a partir de microrganismos do solo podem, no futuro, ser aplicados em outros habitats, como a microflora de insetos ou animais marinhos, os quais se imagina serem uma boa fonte de novos compostos mas ainda muitas vezes, difceis de cultivar. que vivem em ambientes anteriormente considerados

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9 CONCLUSO

O isolamento da cultura de interesse o primeiro passo para a realizao do processo industrial e de extrema importncia para o andamento desse processo at a obteno de seu produto final, j que o microrganismo constitui num dos quatro pilares do processo fermentativo. Operaes unitrias, operaes de downstream e parmetros de controle devem levar em conta as caractersticas do microrganismo utilizado. Levando-se em conta toda a biodiversidade que pode ser encontrada na natureza, o isolamento de novas culturas representa uma fonte de alternativas economicamente mais viveis. Assim, mesmo que haja a possibilidade de se trabalhar com bancos de cepas e organismos geneticamente modificados, interessante para a indstria que se mantenha uma linha de pesquisas a fim de encontrar microrganismos que produzam mais e melhor, ou ainda que produzam algum produto de interesse comercial at ento no obtido. Cada microrganismo possui caractersticas morfofisiolgicas e

parmetros importantes que devem ser observados quando se d o isolamento. Sabe-se que grande parte dessa diversidade microbiana disponvel no meio ambiente ainda no foi explorada. Nesse sentido, ferramentas da biologia molecular tm auxiliado no isolamento de novas espcies a partir de anlise genmica de amostras diretamente do ambiente (metagenmica). A perspectiva de que seja possvel ampliar nosso conhecimento e consequente aproveitamento econmico da diversidade microbiana. Alm disso, essas novas tcnicas de caracterizao podem permitir a compreenso do motivo pelo qual certos microrganismos no so cultivveis e o desenvolvimento de novas tcnicas de isolamento e de ensaios para atividades de metablitos at ento desconhecidos.

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