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Um mtodo eficaz para preparaes histolgicas de materiais de Origem Vegetal Jaime Maia dos Santos Em Nematologia, freqente fazemos

estudos histopatolgicos com o propsito de entendermos aspectos particulares das interrelaes entre certos fitonematides endoparasitos e seus hospedeiros. Nesses estudos, usualmente fazemos preparaes histolgicas de tecidos sados e de tecidos infectados. Aqui na FCAVJ temos usado uma tcnica, vulgarmente chamada de Mtodo da Parafina, que tem proporcionado excelentes tecidos no pesadamente lignificados. Os seguintes passos so requeridos para a preparao de material vegetal pelo mtodo em questo:
1. Seleo e preparao do tecido

Se o estudo for histopatolgico, e no simplesmente anatmico, amostras de tecido sado e infetado devero ser processadas. Razes devero ser coletadas cuidadosamente do solo. Partculas de solo aderentes, ainda que pequenssimas, podero causar srios danos navalha do micrtomo. Os tecidos devero ser cortados em segmentos de no mximo 1 (um) cm de comprimento. Razes finas devero ser cortadas enquanto imersas em gua, numa placa de petri de plstico usando-se lminas novas. Razes e caules de mais que 1 cm de dimetro devero ser cortados tambm longitudinalmente para facilitar as trocas das substncias qumicas durante o processamento. Durante todo o processo de preparao todo cuidado deve ser tomado para se evitar o dessecamento da amostra ou sua compresso, especialmente quando manipulada por pinas. 2. Fixao A fixao mata e proporciona certa resistncia mecnica ao tecido, preservando a estrutura celular. Um dos mais comuns e melhores fixativos para tecido vegetais o FAA - formalina-aceto-alcool: 90 ml de etanol 50%, 5 ml de cido actico glacial e 5 ml de formaldedo 37%. A concentrao dessas substncias no fixativo satisfatria para a grande maioria dos tecidos. Em certos casos, porm, so necessrios ajustes na concentrao do cido e/ou do formaldedo. Na fixao, o tecido dever ser submerso em um volume do fixativo pelo menos dez vezes maior que o volume do material a ser fixado. Isto para evitar que a gua contida nos tecidos amostras ao serem colocadas no fixativo ficarem boiando, me vez de descerem prontamente para o fundo dos recipientes, um indcio de que h olhas de ar no interior dos tecidos, impedindo a penetrao do fixativo. Este problema dever ser imediatamente corrigido submetendo-se o recipiente, contendo as amostra, a um vcuo moderado em um dessecador. O tecido deve permanecer no fixador por 24 horas ou vrios

dias, dependendo de sua espessura. As amostras podem tambm ser guardadas indefinidamente no fixador. 3. Desidratao Na desidratao removemos a gua contida no tecido gradualmente, para evitar plasmlise, utilizando a srie de alcois listada na Tabela 1. Tabela 1. Srie alcolica utilizando lcool butlico tercirio TBA. Quantidade (ml) necessria para a soluo Tempo gua Etanol Etanol TBA destilada 95% 100% 100% 2h ou 50 40 0 10 mais 1 noite 30 50 0 20 1-2h 15 50 0 35 1-2h 0 45 0 55 1-3h 0 0 25 75 1-3h 0 0 0 100 1-3h 0 0 0 100 1 noite 0 0 0 100

Passo 1 2 3 4 5 6+ 7+ 8+

lcool (%) 50 70 85 95 100 100 100 100

Durante a desidratao as solues so trocadas inclinando-se o recipiente para verter a soluo atual, e imediatamente aplica-se a soluo correspondente ao prximo passo. Todo cuidado deve ser tomado para no se permitir a dessecao da amostra pela ao do ar. A espessura do material ir determinar o seu tempo de permanncia nas solues desidratantes. Por exemplo, tecidos tenros e finos podem requerer os menores intervalos de tempo, enquanto que materiais mais espessos e lignificados vo requerer os intervalos e tempos mximos. Se os materiais forem deixados nas solues alcolicas de concentraes mximas por um perodo de tempo excessivamente longo, tornaram-se quebradios em contato com a navalha do micrtomo. Sua textura, nesse caso, tem um aspecto arenoso. 4. Infiltrao Nessa etapa, o lcool (TBA) no tecido (passo 8) substitudo por parafina. Primeiro o TBA 100% e parafina lquida. O tecido deixado nessa soluo por uma hora ou mais, dependendo de sua espessura. Imediatamente antes do prximo passo, outro recipiente preenchido cerca de de seu volume com parafina fundida, e deixado em repouso para que a parafina se solidifique ligeiramente. O tecido na soluo de TBA-parafina lquida transferida para o todo topo da parafina ligeiramente solidificada no segundo recipiente e coberto com uma camada de RBA-parafina lquida. Esse recipiente colocado

destampado em uma estufa com temperatura ligeiramente acima do ponto de fuso a parafina. O tecido ir descer para o fundo do recipiente, medida que for havendo a fuso da parafina. Aps 1 a 3 hora, a mistura de TBA-parafina lquida substituda por parafina fundida pura. O recipiente destampado recolocado na estufa por 3h. Esse passo dever ser repetido por, pelo menos, uma vez. Em seguida, a parafina fundida substituda por um tipo especial de parafina fundida, tal como Paraplast ou TissuePrep, os quais so feitos especialmente para uso histolgico. O tecido dever permanecer na estufa, nesse tipo de parafina fundida, por uma noite (cerca de 12 horas). Aps uma ou mais trocas de parafina especial fundida (1hora casa) o tecido estar pronto para a incluso.

5. Incluso A incluso feita na parafina especial pelos mtodos clssicos comumente usados nos laboratrios de histologia. 6. Secionamento O secionamento, tambm, tem sido realizado pelos modos usuais em micrtomos rotativos. medida que as sees vo sendo cortada, uma borda de cada seo se prende seo previa formando uma tira. Quando a tira adquire certo tamanho (cerca de 20 a 30 cm) ela deve ser removida para uma superfcie limpa e plana com a face brilhante voltada para baixo. Segmentos da tira podero ser montados em lminas, imediatamente, ou guardados em ambiente com temperatura amena, livre de poeira. 7. Montagem dos segmentos da tira de parafina A tira primeira dever ser cortada em segmentos menores, de acordo com o tamanho da lmina a ser usada. As laminas devero ser cuidadosamente etiquetadas. Ento, cobre-se a superfcie superior de cada uma delas com uma fina camada do adesivo de Haupt: 1g de gelatina em p altamente pura (p. a.), 100 ml de gua destilada, 2 g de cristais de fenol e 50 ml de glicerina. Na preparao do adesivo, primeiro dissolve-se a gelatina em gua destilada a 30C. Em seguida, acrescenta-se o fenol e a glicerina. Aps a filtrao o adesivo estar pronto para o uso. Aplica-se uma gota do adesivo no centro a lamina e promove-se o seu espalhamento uniforme, com o dedo, sobre toda superfcie. Esfregase o dedo em movimentos rpidos de vai e vem, longitudinalmente sobre a superfcie, at se perceber certa resistncia ao deslocamento do dedo. Repete-se, uma vez mais, todo o processo. Ento, recobre-se a superfcie da lamina com uma soluo de formalina 2 a 3%, preparada imediatamente antes do uso. Em seguida, transfere-se uma ou mais seguimentos da tira (dependendo de sua largura) para a lmina. Estes

iro flutuar sobre a soluo de formalina. O conjunto colocado sobre uma chapa quente (35 a 40C), perfeitamente em nvel, at o completo estiramento da tira. Em seguida, remove-se o excesso da formalina com tiras de papel filtro e guarda-se a lmina ao abrigo de poeira por vrias horas at a completa secagem. Nesse ponto tambm, as laminas podero ser guardadas indefinidamente at que se complete o processo com a colorao e montagem da lmina. 8. Colorao O processo de colorao remove a parafina das sees e aumenta o contraste nos tecidos. Existem vrios tipos de colorao. Temos obtido resultados excelentes com a colorao Qudrupla Triarca, segundo HAGQUIST, 1974. Os passos para execuo dessa colorao esto listados na Tabela 2. Tabela 2. Colorao qudrupla triarca. Passos 1 2 3 4 5 +6 7 8 9 10 11 12 Solues Xilol Xilol Xilol etanol absoluto (1:1) Etanol 95% Etanol 70% Safranina 1% em etanol 50% Lavar em gua destilada Soluo aquosa de cristal violeta 1% Lavar em gua destilada Tempo 5 minutos 5 minutos 5 minutos 5 minutos 5 minutos 5 a 15 minutos 1 a 2 minutos

Etanol absoluto 30 segundos Etanol absoluto 30 segundos Orange G* - Fast Green FCF** (135 3 minutos ml 15 ml) 13 Orange G* - Fast Green FCF** (145 2 minutos ml 5 ml) 14 Orange G* Fast Green FCF* (148 2 minutos ml 2 ml) 15 Orange G 1 minuto 16 Etanol absoluto 5 minutos 17 Xilol 5 minutos ou mais 18 Xilol * Orange G preparado dissolvendo-se 0,4 g do corante em 100 ml de leo de cravo. ** Fast Green FCF preparado dissolvendo-se 1 g de corante em 100 ml de etanol absoluto.

Aps o ltimo passo da colorao, procede-se a montagem. A lmina removida do xilol e colocada sobre uma superfcie plana, forrada com algum tipo de papel absorvente. Algumas gotas do meio de montagem (blsamo do Canad ou Permount) so aplicadas sobre a superfcie da lmina, rapidamente, antes que haja evaporao do xilol. Ento, aplica-se a lamnula, gradualmente, de modo a evitar a formao de bolhas de ar entre a lmina e a lamnula. Da por diante, procede-se como nos demais mtodos at se completar todo o processo. Por esse mtodo, a parede de clulas lignificadas assume a colorao vermelha (Safranina 0); materiais celulsicos assumem a colorao verde(Fast Green FCF), enquanto que gros de amido se tornam violceos(Cristal Violeta). Comparado a outros mtodos, a colorao qudrupla triarca proporciona resultados melhores que a grande maioria deles e pode ser considerado um mtodo rpido. Como principal inconveniente, aponta-se o fato de que o mtodo requer uma quantidade aprecivel de leo de cravo e que o torna um mtodo caro. Razes de caf, fumo, tomate, ip-amarelo e seringueira, infectadas por Meloidogyne spp., folhas e pecolos de algodoeiro, e flores de abacaxizeiro tm sido processados por esse mtodo tendo-se obtido resultados excelentes.

Literatura consultada: DARKIN, M. E.; HUSSEY, R. S. Staining and histopathological techiniques in namatology. In: BARKER, K. R.; CARTER, C. C.; SASSER, J. N. An advanced treatise on Meloidogyne. RALEIGH, North Carolina State University Graphics, 1985. 2v. p. 39-48. HAQUIST, C. W. Preparation and care of Microscope slides. Am. Biol. Teacher 36:414-417. 1974. JOHANSEN, D. A. Plant microtechnique. New York, McGraw-Hil Book Co. 1940. 523p.

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