FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA .................................................................................... 9 Microbiologia Básica.................................................................................................... 9 Leveduras ..............

................................................................................................... 9 Morfologia da célula............................................................................................. 9 Forma da célula ................................................................................................ 9 Tamanho da célula ............................................................................................ 9 Estrutura da célula .............................................................................................. 10 Parede celular ................................................................................................. 10 Membrana citoplasmática ou Plasmalema ..................................................... 10 Núcleo............................................................................................................. 11 Vacúolos ......................................................................................................... 11 Mitocôndria .................................................................................................... 12 Citoplasma ...................................................................................................... 13 Cápsulas .......................................................................................................... 13 Reprodução ......................................................................................................... 13 Reprodução vegetativa ................................................................................... 13 Reprodução por esporos ................................................................................. 14 Fissão .............................................................................................................. 14 Leveduras contaminantes ou nativas .................................................................. 14 Fisiologia, metabolismo oxidativo e fermentativo das leveduras....................... 17 Nutrição e crescimento das leveduras ................................................................ 19 Bactérias ................................................................................................................. 20 Morfologia das células bacterianas..................................................................... 20 Forma das bactérias ........................................................................................ 20 Dimensões da célula bacteriana...................................................................... 21 Estrutura bacteriana ............................................................................................ 21 Membrana citoplasmática ou protoplasmática ............................................... 23 Citoplasma ...................................................................................................... 23 Material celular ............................................................................................... 23 Flagelos........................................................................................................... 24 Cápsulas .......................................................................................................... 24 Reprodução bacteriana ....................................................................................... 24 Ciclo normal de crescimento da cultura bacteriana ............................................ 26

Fermentacaoalcoolica v2.0.doc

1

6/7/2011

Caracterização e Classificação dos Microrganismos.......................................... 27 Classificação em Nível de Gênero.................................................................. 28 Classificação em Nível de Espécie ................................................................. 29 Grupos Relevantes em Usinas de Açúcar e Álcool ............................................ 30 Estudo do fenômeno da floculação......................................................................... 37 Medida da Floculação......................................................................................... 39 Monitoramento e interpretação dos dados do laboratório industrial .......................... 40 Tabela para interpretação das análises laboratoriais............................................... 41 Procedimentos ........................................................................................................ 43 Fatores que afetam o desempenho fermentativo ........................................................ 47 Glicerol ................................................................................................................... 48 Ácido succínico ...................................................................................................... 49 Ácido acético .......................................................................................................... 49 Biomassa................................................................................................................. 50 Estequiometria da fermentação .............................................................................. 50 Carboidratos de reserva .......................................................................................... 50 Espécie de levedura ................................................................................................ 51 Identificação de leveduras pela técnica da cariotipagem.................................... 52 Permanência de leveduras tradicionais no processo fermentativo ..................... 53 Seleção de linhagens para fermentação industrial .............................................. 53 Nutrição mineral da levedura ................................................................................. 54 Principais nutrientes e suas funções ................................................................... 55 Potássio ........................................................................................................... 55 Magnésio ........................................................................................................ 55 Cálcio .............................................................................................................. 55 Zinco ............................................................................................................... 56 Manganês ........................................................................................................ 56 Ferro ............................................................................................................... 56 Cobre .............................................................................................................. 56 Molibidenio, Cobalto e Boro .......................................................................... 56 Nitrogênio ....................................................................................................... 56 Fósforo ............................................................................................................ 57 Enxofre ........................................................................................................... 58

Fermentacaoalcoolica v2.0.doc

2

6/7/2011

Inibidores da fermentação ...................................................................................... 58 Alumínio ............................................................................................................. 58 Sulfito ................................................................................................................. 59 Temperatura ........................................................................................................ 59 pH ....................................................................................................................... 60 Contaminação bacteriana.................................................................................... 61 MATÉRIAS-PRIMAS PARA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA ................................. 62 Caldo: composição, pré-tratamento, controle de qualidade ....................................... 62 Composição ............................................................................................................ 62 Pré-tratamento do caldo .......................................................................................... 63 Processos de tratamento ......................................................................................... 63 Processo de tratamento do caldo para destilaria – 1 ........................................... 63 Processo de tratamento do caldo para destilaria – 2 ........................................... 64 Processo de tratamento do caldo para destilaria – 3 ........................................... 64 Processo de tratamento do caldo para destilaria – 4 ........................................... 64 Controle de qualidade do caldo .............................................................................. 65 Mel final: composição, armazenamento e controle de qualidade. .............................. 65 Composição ............................................................................................................ 65 Armazenamento ...................................................................................................... 66 Controle de qualidade ............................................................................................. 66 CONTROLE MICROBIOLÓGICO – MICROSCOPIA ............................................... 67 Microscópio ótico ....................................................................................................... 67 Microscopia de Campo Claro ................................................................................. 67 Parte mecânica .................................................................................................... 68 Parte Óptica ........................................................................................................ 68 Recomendações para uso do microscópio ótico ................................................. 68 Antes de iniciar o uso. .................................................................................... 68 Ajuste da Dioptria........................................................................................... 69 Manutenção do equipamento .............................................................................. 69 Método de determinação da viabilidade celular de leveduras .................................... 70 Especificações da câmara de NEUBAUER............................................................ 71 Preparo das soluções............................................................................................... 72 Solução estoque de Eritrosina............................................................................. 72

Fermentacaoalcoolica v2.0.doc

3

6/7/2011

.......................................................................................... 74 Contagem de células em brotamento ......................................... 73 Procedimento analítico ................................................................. 85 Solução de verde malaquita .................. 84 Detecção de esporos ...................................... 80 Preparo das soluções................ 82 Interpretação ....................................................................................................... 83 Quantificação ...................................................................................................................................................................... 81 Procedimento analítico .........................................................................................azul de metileno .................................................... 80 Solução de cristal violeta ..............sulfato azul de nilo ....................................................................... 81 Para Microrganismos de Cultivos Sólidos .............................. 77 Procedimento analítico .................................................................................................. 75 Preparo das soluções.................. 74 Viabilidade celular.......... 77 Solução A ........................................ 85 Fermentacaoalcoolica v2............................................ 78 Amostras de vinho bruto e levedo tratado ................................................... 79 Exercícios . 81 Para Microrganismos em Suspensão Líquida................................................................................................Tampão Fosfato ................................0............................................................................................ 78 Cálculos ..........................................0....... 82 Técnica de Coloração .............................................................................................................................................................................. 79 Teste de Gram..................................... 85 Solução de safranina .......................... 77 Solução B ................................................................................................................................................................................................................................................ 74 Exercícios ...............................0% .............................................................. 84 Preparo das soluções.... 80 Solução de safranina ............................. 72 Solução de trabalho ............................................................................................... 74 População de Leveduras .........20% .................... PCTS.. 75 Método para contagem de bactérias ao microscópio ótico ...... 81 Solução de iodo-lugol ................................................................................................................................................. primário e misto ........................................ 77 Solução de trabalho .................. 73 Cálculos .................................................................................................................. 78 Amostras de caldos.......................................................................................................................................................................................................................................2........doc 4 6/7/2011 ....................................................................................................................................................................................................................................................................

.................................................................................................................................................................................. 89 Procedimento analítico .................................................................................. 97 Pipetadores automáticos ...........doc 5 6/7/2011 ................................... 89 Determinação da acidez ..................................................................... .............................................. 96 Equipamentos ............... 1961) ............................Procedimento analítico ................... 93 Meio de Cultivo (Mayeux & Colmer........................................................................................................................................................................ 94 Leitura da Densidade Óptica ( D............................................................................. 95 Interpretação dos Resultados ................................................................................................................................................. 86 Teste de Floculação .. através da variação da acidez ..................................................................... O .......................................................................... 97 Moenda .......... .................................................................................................................. 96 Outros .................................. 91 Interpretação dos resultados .................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 89 Solução estoque de actidiona (inibidor de leveduras).................... 97 Modelos de boletim para o controle microbiológico por microscopia .......................... 90 Determinação da acidez sulfúrica (inicial e final) das amostras............................................ 87 Procedimento Analítico . 93 Meio de Cultivo ( GLT) ...................................................................................................................................................... 89 Solução estoque de Antimicrobianos ................................................ 92 Teste de sensibilidade de bactérias aos antibióticos por spectrofotometria .... 88 Preparo das soluções............................... 85 Interpretação/Quantificação dos Esporos ......................... 95 Relação de materiais necessários para instalação do laboratório de controle microbiológico – microscopia ................................... 96 Vidraria ..... 90 Cálculo ........ 92 Meios de Cultivo ............................ ) . 91 Exemplo ........................................................................................................................................ 92 Preparo das Soluções Estoque .............. 98 Fermentacaoalcoolica v2.............................. 97 Matéria-prima ............................................................................................................ 96 Reagentes ............................................................ 93 Preparo do Inóculo ..........................................................................................................0................................................... 94 Realização do Teste ............................................................................... 87 Teste de sensibilidade de bactérias aos antibióticos................

............................... 108 Cálculo do número UFC/ml.................. 107 Plaqueamento por Incorporação ou Profundidade (Método “Pour Plate”) ........................................ 101 Esterilização por Calor Seco .........T........................................0............................................................................................................... 103 2............................ Rogosa & Sharpe (MRSA) .... 106 INIBIDORES de CRESCIMENTO MICROBIOANO – Soluções Estoque .......................................... 108 Plaqueamento de Superfície (Método “Spread Plate”).............................................................. – Teste de Sensibilidade ..................................................... 104 Plate Count Agar (P C A ............................................................................................ 103 Esterilização por Filtração ...... 110 Procedimento analítico .............................................Peptona........................................2 Operação da estufa .................................................. 101 Operação da autoclave ..... 106 Bactérias ........................................... 99 Esterilização por Calor Úmido .................................. 98 CONTROLE MICROBIOLÓGICO – PLAQUEAMENTO .................. 99 Introdução ........................................................................................... 109 Cálculo do número de UFC/ml...................... 106 MÉTODOS PARA CONTAGEM DE CÉLULAS VIÁVEIS: LEVEDURAS E BACTÉRIAS ...................................................... 113 Fermentacaoalcoolica v2.................................................................................. 99 Constituição da Autoclave .............................................. L ...............................................Autoclave ...................................................................................................................................Dextrose ....... ....... 105 Extrato de Levedura............................................................ 104 Ágar................................................1...................................................... 112 Cálculo do número de UFC/ml........................................................................... ........ 113 Procedimento analítico .................................Fermentação ................................................................................doc 6 6/7/2011 .......................................... 106 Leveduras .......................................Man..................................................................................................................................... 105 Meio – Mayeux & Colmer – Teste de Sensibilidade ................. 99 Esterilização ........................................................Bactérias Lácticas Totais .......... 107 Técnica de plaqueamento ......................Ágar (YEPD + A) – Leveduras .................................... 103 MEIOS de CULTIVO .............................. 112 Cultivo por Estrias ........... 110 Avaliação da População Microbiana por Filtração em Membrana........................................ 107 Diluição em série ..............................................................................................................................................................................Agar Padrão) – Bactérias Aeróbios Mesófilas Totais ........................................ 102 Esterilização por calor seco – Estufa ............................... 105 Meio de Cultivo G....

............................................................................................. 130 Padrões de fermentação de carboidratos em bactérias láticas .................................................. 128 Considerações Gerais ............................................................................................................................................................. 125 Ação de bactérias ................................................... 125 Cofloculação levedura-bactéria .............................. 115 Avaliação da Floculação da Levedura .................. 129 Bactérias láticas ................................................................................................. 124 Hidrofobicidade celular .............. 124 Mecanismos de floculação ....................................................... 128 Produção de ácidos por microrganismos ............................................................................................................................. 124 Aspectos químicos ...................................................................................................................... 126 Considerações importantes ...................................... 127 ÁCIDO LÁTICO ......................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 115 OUTRAS ANÁLISES ............................................................... 114 Cálculo do número de UFC/ml...............doc 7 6/7/2011 ....................... 120 Aspectos genéticos .................. 129 Requerimentos nutricionais ................................................................................................................ 131 Principais bactérias láticas ............................................................................................................. 130 Tolerância à acidez: ..............0......................................................................................................................................................................................................................................................................................... 117 Floculação da levedura pela bactéria Lactobacillus fermentum ................................................ 125 Reconciliação dos dois mecanismos ........................................................................................................................................................ 122 Ação de íons ................................. 128 Histórico ...................................................................................................................................................................... 130 Bactérias homofermentativas ........................................................................................................................... 123 Aspectos físico-químicos............................................................ 130 Bactérias heterofermentativas ............................................................................................................ 114 Procedimento analítico .................. 130 Características da colônia ............Cultivo em PetriFilm® ................................................ 124 Ligação tipo-lectina ........................... 131 TIPOS DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA.......................... 119 Aspectos gerais ..................... 116 FLOCULAÇÃO DAS CÉLULAS DE LEVEDURAS ............ 131 Fermentacaoalcoolica v2....................... 115 Procedimento Analítico ...........

.................................................................... 146 Carregamento.................................. 151 Fermentação .................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 148 Caldo e mosto ........................................................................................................................................................................................... 146 Lavoura .............................. 140 Resfriamento de dornas ..................................................................doc 8 6/7/2011 ........................... 142 Centrífugas de fermento ... transporte e recepção........................ 139 Critérios de dimensionamento da fermentação alcoólica ......... 132 Partida com tubo de cultura pura ............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................. 131 Partida e sistemas de partida.............................. 152 Fermentacaoalcoolica v2.......................................................................................... 133 Partida com leite de fermento selecionado ......................................................... 131 Providencias preliminar para partida ............................................................................................................................................... 138 Introdução e estratégias .................................. 140 Dornas............................................................................................................................................................................. 151 Tempo de aproveitamento ................................................................Fermentação descontínua ou batelada .......................................................................................... 149 Aquecimento e decantação .................. 135 Partida com fermento prensado . 131 Condução da fermentação .......................... 149 Resfriamento do mosto ................................................................................. 145 PERDAS DURANTE O PROCESSO.......0................................... 148 Preparo e extração . 137 Controle operacional da fermentação contínua .............. 144 Tratamento do fermento – pé-de-cuba. 151 Centrifugação ........................................................................................................................ 147 Lavagem .............................................................................................................. 145 Qualidade da cana-de-açúcar ................... 147 Armazenamento: pátio e barracão ........................................ 138 Interpretação dos parâmetros do laboratório .......

embora existam certas leveduras com formas altamente características. De uma maneira geral as leveduras industriais variam consideravelmente no que se refere às suas dimensões. dizer que uma determinada forma de célula é característica de uma dada espécie ou gênero. Entretanto. não significa que em uma população de leveduras todas as células apresentarão aquela forma. pois os dois termos têm sido muito associados através da história. Estas disparidades podem ser usadas para diferenciação entre espécies e algumas vezes até mesmo entre linhagens da mesma espécie. mas pelo menos em um determinado período do desenvolvimento celular as células terão uma forma característica. com limites desde 1 a 5 μm de largura e 5 a 30 μm de comprimento. Fermentacaoalcoolica v2.0. Entretanto. mas numa cultura jovem o tamanho da célula pode ser bem uniforme em algumas espécies ou extremamente heterogêneo em outras. em 1876. As formas que mais comumente são encontradas são esférica. é que se caracterizou a individualidade da levedura como um organismo vivo com características próprias. Tamanho da célula O tamanho da célula de levedura é também variado. globosa.doc 9 6/7/2011 . ovóide e alongada. as quais podem ser os resultados da maneira de reprodução vegetativa bem como das condições de cultivo e idade da cultura. Morfologia da célula Forma da célula A célula da levedura pode apresentar várias formas. o desenvolvimento do conceito de levedura pode ser considerado como tendo tido início por volta de 1680 (Van Leeuwenhoek). Mas foi somente após os estudos do gênio Pasteur.FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA Microbiologia Básica Leveduras A palavra levedura traz imediatamente à mente a idéia "fermentação".

Na parede celular são encontrados ainda outros compostos. técnicas de coloração da célula para componentes específicos. sua rigidez é responsável pela forma particular que a célula apresenta. Embora um pouco elástica.5%. quando a célula íntegra é observada pode-se verificar perfeitamente a presença das cicatrizes dos brotamentos na parede celular. Parede celular A parede celular pode ser vista com um simples microscópio óptico (campo claro) como uma linha externa da célula. As concentrações em lipídeos variam de 8.Estrutura da célula A maioria das investigações feitas sobre as estruturas da célula de levedura é baseada em trabalhos feitos com Saccharomyces cerevisiae. como lipídeos e heteropolissacarídeos. microscopia eletrônica de transmissão de cortes ultrafinos das células. o núcleo.doc 10 6/7/2011 . A quantidade de quitina também varia com a espécie sendo que Saccharomyces cerevisiae apresenta entre 1 a 2% deste composto.5 a 13.0. já a glicosamina foi encontrada em pequenas quantidades nas paredes das leveduras. Com o microscópio eletrônico de varredura. dependendo do gênero e espécie considerados. A parede celular das leveduras é fina nas células jovens. As principais micro-estruturas da célula de levedura são: a parede celular. um ou mais vacúolos e a mitocôndria. Basicamente a parede celular do gênero Saccharomyces consiste de três camadas: a camada interna de β glucana insolúvel em alcali. a camada intermediária de β glucana solúvel em alcali e a camada exterior de glicoproteína na qual o carboidrato é a manana fosforilada. Os principais constituintes da parede celular de Saccharomyces cerevisiae são os polissarídeos glicano (30 a 34%) e manano (30%). bem como através da microscopia de varredura. As proteínas são constituintes constantes das paredes celulares das leveduras. já que invertases e outras hidrolases foram identificadas na parede celular. espessando-se com a idade. Membrana citoplasmática ou Plasmalema Fermentacaoalcoolica v2. As informações sobre a citologia da levedura têm sido obtidas por observações diretas com o microscópio óptico. a membrana citoplasmática ou plasmalema. parte das quais provavelmente enzimas. Saccharomyces cerevisiae apresenta 6 a 8% de proteínas.

esfingolipídeos complexos. o nucléolo. Ela protege também a célula de perder compostos de baixo peso molecular por vazamento do citoplasma e ela representa a "matriz" sobre a qual os compostos da parede celular são depositados durante o crescimento da célula. o núcleo contém várias categorias de RNA e um tipo de polifosfato com uma cadeia de 20 a 40 resíduos de ortofosfato. Os exames de cortes ultrafinos mostram que o núcleo das leveduras é uma organela bem definida. glicerofosfatideos. Quando as células são colocadas em meio nutritivo e começam a emitir brotamentos os grandes vacúolos se dividem por constrição em numerosos pequenos vacúolos. neutro e ácido glicolipídeos.doc 11 6/7/2011 . Durante a formação do brotamento das leveduras a divisão do núcleo é acompanhada por alongamento e constrição deste. Durante o desenvolvimento do broto os vacúolos são distribuídos entre as células mãe e filha (brotamento). O núcleo é composto de uma parte opticamente densa. usualmente pode-se observar um ou mais vacúolos de diferentes tamanhos (0. nucléolo e a porção contendo cromatina se dividem e são incorporados no núcleo das duas novas células. Ambos.0.0 μm de diâmetro).3 .Esta estrutura é localizada diretamente abaixo da parede celular e tem uma importante função na entrada seletiva de nutrientes do meio de crescimento. Vacúolos Quando as células de levedura são vistas ao microscópio de contraste.C26) com o ácido oléico (C18:1) sendo o ácido graxo mais importante. di e triglicerídeos). Além do DNA. Os ácidos graxos nos vários componentes são de cadeia longa (C16 . Núcleo O núcleo das células de levedura não é facilmente visto ao microscópio óptico (campo claro) quando as células são preparadas para observação em suspensão aquosa. e uma porção menos densa que contém o material cromatínico. circundada por uma membrana nuclear semipermeável. Depois de Fermentacaoalcoolica v2. Eles têm geralmente aparência (forma) esférica e são mais transparentes a um feixe de luz que o citoplasma que os circunda. a qual acontece naturalmente no pescoço do broto. com funções metabólicas e reprodutivas. Por outro lado. ao microscópio de contraste de fase. o núcleo pode ser observado em leveduras desenvolvidas em meio nutritivo contendo 18-21% de gelatina. Na composição química do plasmalema é encontrada uma mistura complexa de lipídeos neutros (mono. esterois livres e esterificados (principalmente ergosterol).3.

purinas. fosfolipídeos e ergosterol. os quais apresentam ativo movimento Brawniano e. Os vacúolos também funcionam como reservatório energético. derivados de purina de baixa solubilidade formando cristais. Os vacúolos servem também como vesículas de armazenamento para várias enzimas hidrolíticas. Durante o brotamento celular as mitocôndrias também se dividem e são distribuídas entre a célula mãe e a filha. Mitocôndria As mitocôndrias ocorrem como organelas membranas-limitadas que. Por exemplo. RNA e proteínas. ao exame microscópico têm a aparência de filamentos pregueados com diâmetro de 0. portanto conhecidos como "dancing bodies". incluindo proteases. Quando em condições adversas.doc 12 6/7/2011 .completado o processo de brotamento os pequenos vacúolos podem se fundir para formar novamente grandes vacúolos. As mitocôndrias são ricas em lipídeos. mas em leveduras aeróbias obrigadas elas estão mais distribuídas através do citoplasma. sua principal função é a de conversão aeróbia de energia. ribonucleases e esterases. o vacúolo pode se romper e o processo de autólise da célula acontecer. A existência de hidrolases nos vacúolos também sugere que estes sejam os lisossomos celulares (compartimento onde se dão a cisão e síntese de macromoléculas). com os materiais acima temporariamente não metabolizados. Elas contêm também DNA. Uma grande variedade de compostos de alto e baixo peso molecular pode entrar no vacúolo. Sob condições anaeróbias de fermentação de glucose ou mesmo sob condições Fermentacaoalcoolica v2.3 a 1 μm e comprimento de até 3 μm. Estas organelas são envolvidas por uma membrana externa e outra interna as quais formam as cristas que se estendem dentro do estroma mitocondrial. Em Saccharomyces elas estão geralmente localizadas bem próximas à periferia da célula. Também uma grande porção dos aminoácidos livres da levedura é armazenada no vacúolo e tem sido sugerida inclusive a presença de lipídeos nos vacúolos. Uma vez que as mitocôndrias contêm as enzimas respiratórias. a qual dada a sua constituição está relacionada ao transporte de substâncias armazenadas no vacúolo. incluindo RNA polimerase e um grande número de enzimas respiratórias participando no ciclo do TCA e transporte de elétrons. O número de mitocôndria pode variar de um a vinte por célula.0. Ao microscópio eletrônico pode-se observar que o vacúolo é cercado por uma simples membrana. no vacúolo podem ser encontrados polimetafosfatos (volutina).

o que faz com que diminua a capacidade respiratória. forma-se uma parede transversal.0. o aparelho nuclear de ambas as células se reorienta. As gemulações sucessivas são sempre formadas em locais diferentes na superfície celular. Completada a divisão nuclear.0 a 5. Ele contém grandes quantidades de ribosoma. Quando a gêmula estiver com tamanho aproximado ao da célula-mãe. Durante sua vida uma célula madura produz. etc. A parede do broto contém apenas material recentemente sintetizado. de modo semelhante ao que ocorre nas leveduras em divisão. O tubo passa para a protuberância. Citoplasma O citoplasma é a matriz na quais todas as organelas discutidas até agora estão localizadas. Ali. produzida por um enfraquecimento local da parede celular existente. permanecendo cicatrizes das gêmulas como resultado deste processo de reprodução. De 1.0% de DNA da levedura podem estar presentes no citoplasma. A maior parte das cápsulas de leveduras tem composição polissacarídica. transformando-se na chamada promitocôndria. que aumenta de volume e se enche com material nuclear e citoplasmático da célula-mãe. a respiração pode ser restabelecida facilmente pela diminuição da concentração de glucose e arejamento das células. incluindo heteropolissacarídeos e substâncias semelhantes ao amido. com cristas pouco desenvolvidas. polifosfato e os polissacarídeos de reserva. forma-se uma pequena protuberância na superfície mais externa da célula. por gemulação (brotamento) ou por fissão. orientando para um ponto da parede celular mais próxima do vacúolo. por gemulação. glicogênio e trealose.aeróbias em altas concentrações de glucose (5-10%) as mitocôndrias parecem se degenerar. Fermentacaoalcoolica v2. enzimas glicolíticas. de modo que os entrossomos de cada unidade sejam vistos no ponto de união. Por outro lado. Reprodução Reprodução vegetativa As leveduras podem se reproduzir por esporulação. adjacente ao núcleo da célula-mãe. que é a substância capsular. uma média de 24 células-filhas. Cápsulas Algumas leveduras são cobertas por um material extracelular limoso. O método mais comum é o da gemulação onde forma-se um tubo a partir do vacúolo nuclear.doc 13 6/7/2011 . viscoso e aderente.

Fissão Durante este processo reprodutivo a levedura aumenta de tamanho ou se alonga. mutação. processos esses que levam as mudanças evolucionárias (melhoramento genético). nas safras 84/85 até 88/89. Leveduras contaminantes ou nativas A presença de leveduras contaminantes (selvagem) tem trazido sérios problemas para a fermentação. embora não se tenha feito testes específicos. Entretanto. tamanho.0. principalmente a deterioração do produto final. até mesmo na produção de fermento prensado para panificação. tanto na produção de vinhos como na fabricação de cerveja. provocando o aparecimento de sabores e aromas que descaracterizam totalmente a bebida. formando-se cadeias de células. Esses contaminantes podem trazer problemas graves no que se refere ao processo fermentativo e. tipo de colônias) daquelas da levedura alcoólica foi constatada. Em algumas leveduras o número máximo é oito. Este processo de reprodução é característico para o gênero Schizosaccharomyces. Mas na maioria das leveduras ascosporogenas (Saccharomyces cerevisiae) o número máximo de esporos é quatro por asco. Na produção de álcool a partir do melaço e/ou do caldo de cana-de-açúcar a presença de leveduras contaminantes tem sido pouco ou raramente mencionada. e. em algumas destilarias a presença de células de levedura com características diferentes (forma. É geralmente conhecido que condições de aerobiose são essenciais para esporulação.Reprodução por esporos A formação de esporos sexuados em leveduras é de grande importância biológica. embora a maioria das leveduras forme um número máximo definido de esporos em cada asco. Este ciclo permite a levedura sofrer recombinações genéticas. isto é. uma vez que pouco ou nenhum esporo são formados sob condições anaeróbias (fermentação).doc 14 6/7/2011 . Fermentacaoalcoolica v2. as células podem se dividir sem se separarem. o núcleo se divide e as duas células-filhas são formadas. O número de esporos pode variar para uma espécie particular. A esporulação constitui uma fase do ciclo sexual da levedura. hibridação e seleção. embora ascos com dois ou três esporos sejam comuns nesta espécie. alternância da condição haplóide (1n cromossomos) e diplóide (2n cromossomos). Durante os períodos de rápida multiplicação.

Montpellier. Esta levedura foi encontrada no caldo. a água de lavagem de cana e o próprio solo. concentração. A maior ou menor intensidade desses fatores vai depender das características fisiológicas da espécie de levedura contaminante. etc. ocorreram dois casos de contaminação com levedura selvagem entre os clientes da Fermentec. desde algumas células até quase total dominância. Assepsia rigorosa. formando verdadeiros cachos. no caso) e as células filhas não se soltavam da célula mãe. O caso encontrado por nós (Fermentec) mais impressionante. na água de refrigeração das dornas. controle da temperatura de aquecimento do caldo e controle da temperatura da fermentação foram as maneiras que conjuntamente se conseguiu contornar o problema. ou seja. se Saccharomyces ou não Saccharomyces. o melaço. Os efeitos da presença de leveduras contaminantes na fermentação alcoólica podem ser sentidos pelo abaixamento do rendimento da fermentação. maior tempo de fermentação. França) como sendo uma Candida krusei. ou seja. com sérios problemas para o processo. onde a levedura selvagem provocou sérios prejuízos. uma vez que a levedura contaminante dominou completamente o processo. com ou sem tratamento térmico do caldo (aquecimento. na vinhaça. etc. destacando-se como principais. o xarope. maior formação de espumas pelo aumento da viscosidade. Essas leveduras podem chegar as dornas de fermentação tanto na forma vegetativa como de esporos. monitoramento constante. decantação. Um levantamento feito por plaqueamento. A quantidade de espuma era intensa e foi necessário modificar todo o processo para poder continuar produzindo álcool. e por incrível que pareça. foi na fermentação contínua da Usina Vale do Rosário (Morro Agudo).0. mostrou que esta levedura se encontrava disseminada em todo o processo. Na safra 88/89. A passagem pelo aparelho de destilação não conseguia eliminá-la completamente.doc 15 6/7/2011 .A proporção destas leveduras em relação à levedura alcoólica tem variado bastante. Esta levedura foi identificada (Barre. que era oriunda da cana e que estava passando pelo tratamento térmico uma vez que a temperatura de aquecimento era igual ou inferior a 100ºC. A predominância de uma ou de outra forma vai depender do tipo de processo empregado pela indústria.). Fermentacaoalcoolica v2. A origem destas leveduras contaminantes (selvagem) é variável. Sua forma era diferente da levedura industrial (TA. Em ambas as indústrias houve um grande aumento do tempo de fermentação e uma sensível diminuição do rendimento.

Torulaspora pretoriensis e Kluyveromyces vanudenii entre outras. Durante as safras 91/92 a 97/98 várias outras leveduras contaminantes foram isoladas e caracterizadas de amostras de mosto de alimentação e vinho bruto de clientes da Fermentec.doc 16 6/7/2011 . Saccharomyces capensis. Trichosporum brassicae.0. Pichia ohmeri.110ºC. segundo o procedimento da taxonomia numérica descrito por GRIFFITHS (1981) foram encontradas Saccharomyces chevalieri.3 e 4: Células vegetativas e colônias de Saccharomyces chevalieri Fermentacaoalcoolica v2. Saccharomyces bayanus. e segundo Barre. FOTO . Candida krusei.As características básicas diferenciais desta levedura contaminante eram células alongadas com brotamento exclusivamente unipolar (apical).1 e 2: Células vegetativas e colônias de Saccharomyces cerevisiae FOTO . O problema foi resolvido pela troca de todo o fermento em processo e a elevação da temperatura de aquecimento do caldo para 105 . Através de testes de assimilação e fermentação de carboidratos. era uma Candida krusei de linhagem diferente da encontrada na Vale do Rosário. Testes realizados com meios diferenciais pelo setor de Microbiologia da Fermentec e pelo Instituto National De La Recherche Agronomique da França (INRA) mostraram que esta levedura não pertencia ao gênero Saccharomyces.

outros que reprimem a ação enzimática. vitaminas. se o substrato for completamente oxidado diz-se que há respiração e se o substrato for parcialmente degradado acarretando a formação de metabólitos diz-se que há fermentação.7 e 8: Células vegetativas e colônias de Candida krusei Fisiologia. Fermentacaoalcoolica v2. realiza a fermentação do açúcar com o objetivo de conseguir a energia química necessária à sua sobrevivência. enquanto que a oxidação total do açúcar (respiração) se dá na mitocôndria. isto é. minerais. afetando assim o desempenho do processo. A transformação do açúcar (glicose) até resultar em etanol e CO2 envolve 12 reações em seqüência ordenada. pH. com maior eficiência na produção de etanol. temperatura. cada qual catalisada por uma enzima específica.doc 17 6/7/2011 . A célula de levedura possui compartimentações para adequação de sua atividade metabólica. condições ideais para que as mesmas trabalhem a seu favor. Se o homem pretende beneficiar-se dessa habilidade metabólica. Tais enzimas sofrem ações de diversos fatores (nutrientes.0. etc. inibidores.5 e 6: Células vegetativas e colônias de Kluyveromyces vanudenii FOTO . alguns que estimulam. A levedura como entidade viva independente. substâncias do próprio metabolismo. sendo o etanol apenas e tão somente um subproduto desse processo. A fermentação alcoólica (glicólise anaeróbia) ocorre no citoplasma.FOTO . Em biotecnologia é corrente o emprego do termo fermentação para definir reações microbianas. ele deve buscar os conhecimentos que lhe permitam propiciar às leveduras.). No conceito bioquímico. metabolismo oxidativo e fermentativo das leveduras.

Entretanto o etanol e outros produtos de excreção podem ser oxidados metabolicamente. a oxigenação permite uma maior multiplicação da levedura. os ácidos orgânicos (principalmente o succínico e o acético). etc. Fermentacaoalcoolica v2. O etanol e o CO2 resultantes se constituem em produtos de excreção. intrínsecas à formação de etanol. acopladas à produção de etanol e de glicerol. gerando mais ATP e biomassa. relacionados direta ou indiretamente com a adaptação e sobrevivência. A fermentação alcoólica é um processo não oxidativo.) bem como para a formação de outros produtos de interesse metabólico. mas apenas em condições de aerobiose. e. os quais desviam esqueletos carbônicos provenientes do açúcar. é gerar uma forma de energia química (ATP) que será empregada na realização dos diversos trabalhos fisiológicos (absorção.0. sem a participação do oxigênio molecular (O2). todo NADH formado (em reações de oxidação) deve ser consumido em reações de redução. o glicerol. proteínas. etc.doc 18 6/7/2011 . Em termos energéticos a respiração é muito mais eficiente (produção de ATP) do que a fermentação. É ele. para se manter o equilíbrio de redox celular. necessários à manutenção da vida. reduzindo a produção de etanol. crescimento e multiplicação. ácidos nucléicos. na seqüência de reações de produção de ATP. sem utilidade metabólica para a célula em anaerobiose. perpetuando assim a espécie. motivo pelo qual. que conjuntamente com a biomassa são quantitativamente os principais subprodutos metabolicamente relacionados ao equilíbrio do redox celular em anaerobiose. rotas metabólicas alternativas aparecem para propiciar a formação de materiais necessários à produção da biomassa (polissacarídeos.O objetivo primordial da levedura ao metabolizar anaerobicamente o açúcar. portanto. Durante a fermentação. excreção.) e biossínteses.

Fermentacaoalcoolica v2. Deficiências ou concentrações elevadas de tais minerais.0. Nutrição e crescimento das leveduras As leveduras exigem diversos íons inorgânicos (minerais) em concentrações tanto micro como milimolar para manifestarem ótimos crescimento e rendimento fermentativo. ou seja. provoca alterações metabólicas significativas.Denise '95 RESPIRAÇÃO CICLO DE KREBS CADEIA RESPIRATÓRIA Figura 3: Esquema da fermentação (em anaerobiose) e da respiração.doc 19 6/7/2011 . um desequilíbrio entre os nutrientes minerais. De todos os elementos encontrados na levedura apenas alguns são considerados essenciais sendo que muitos deles aparecem fortuitamente dependendo da composição do meio no qual a levedura cresceu. quando a célula está sob aerobiose e aparecem as mitocôndrias ativas (no destaque).

Mn e Cu). complexam diversos íons com diferentes afinidades. e ainda do ponto de vista estrutural. P e S são as mais facilmente justificáveis por integrarem constituintes celulares tanto estruturais quanto metabolicamente ativos. membranas fosfolipídicas e fosfomananas da parede celular).0. tornando desnecessária a síntese dos mesmos. apresentar o produto final de uma reação catalizada por uma metalo-enzima. geralmente complexo. polifenóis. Mg e Zn neutralizando cargas negativas do DNA. Assim. como mantenedor de um controle fisiológico (pela ação antagônica exercida entre íons). forma.doc 20 6/7/2011 . Embora se possam postular concentrações ótimas para cada elemento.As necessidades de N. alguns íons atuam como antagônicos minimizando efeitos inibitórios de outras espécies iônicas e por outras inter-relações metabólicas que determinam a quantidade absorvida do íon e os efeitos conseqüentes. estrutura e arranjo celular. Ca. Bactérias Morfologia das células bacterianas Das características principais das células bacterianas destacam-se suas dimensões. sequestrantes e absorventes os quais reduzem a concentração efetiva de espécies iônicas. Os elementos minerais que afetam negativamente a levedura podem ser classificados como elementos tóxicos. RNA. Forma das bactérias Fermentacaoalcoolica v2. minerais de argila. pode-se considerar que a necessidade de um elemento qualquer pode ser diminuída. os mostos empregados na indústria podem conter agentes quelantes. Assim o mineral pode funcionar como o centro catalítico de uma enzima (Zn. os quais constituem a morfologia da célula. Mg). como ativador ou estabilizador da função enzimática (K. aminoácidos. ácido fítico. proteínas. existe uma vasta gama de interações entre os nutrientes minerais resultando que tal concentração ótima é altamente dependente da concentração de outros minerais no meio. atuando como neutralizador de forças eletrostáticas em diversas unidades celulares aniônicas (K. NH4. bases nitrogenadas e outros compostos orgânicos e que são utilizados pela levedura. Já os íons minerais estão predominantemente implicados na atividade enzimática. Isso ocorre quando o mosto apresenta aminoácidos. ácidos orgânicos. proteínas. polifosfatos e outros materiais coloidais. se o mosto empregado na indústria. como é o caso do alumínio. Igualmente. Co. Para tornar a situação mais complexa. ácidos húmicos. Por outro lado.

3 μm a 1.0.Apesar de existirem milhares de espécies bacterianas. bastonetes e espiralada/helicoidal.0 μm de diâmetro. outras são mais características de uma espécie de que de outra. Já as bactérias em forma de bastonetes (bacilos) variam de 1. Dimensões da célula bacteriana A unidade de medida da célula bacteriana é o micro.5 μm a 1. Algumas dessas estruturas aparecem apenas em certas espécies. as quais são esquematizadas abaixo. aos pares (diplobacilos) e em cadeias (estrepto bacilos). mas é devida a etapa de crescimento ou às condições de cultura. Estrutura bacteriana O exame da célula bacteriana mostra estruturas. que equivale a 10-3 mm. De um modo geral essas duas formas de bactérias são as mais comuns entre os contaminantes nas indústrias do açúcar e do álcool. Estas características podem ser usadas para a caracterização das espécies bacterianas. Em alguns casos esses arranjos não constituem padrões morfológicos característicos. As células bacterianas elipsoidal-esféricas denominadas de cocos podem apresentar os seguintes tipos de arranjos: As células bacterianas cilíndricas ou em bastonetes (bacilos) não se dispõem de acordo com os padrões encontrados entre os cocos. Fermentacaoalcoolica v2.0 μm a 5. As formas esféricas (cocos) variam de tamanho de 0.0 μm de largura. mas podem se apresentar isolados.doc 21 6/7/2011 . os organismos isolados podem apresentar uma das três formas gerais: elipsoidal/esférica.0 μm de comprimento é de 0. mas a parede celular e o citoplasma são naturalmente comuns a maioria das células bacterianas.

A parede celular representa uma porção significativa do peso seco total da célula. Outros compostos principais da parede celular das bactérias são aminoácidos. Ela parece ter uma função importante na divisão e crescimento celulares. responsável pela rigidez da parede celular. Várias substâncias são encontradas na parede celular bacteriana como. como é o caso do composto polimérico conhecido como peptidoglicano.Parede celular Esta se encontra externamente à delicada membrana citoplasmática e devido a sua rigidez própria mantém a forma característica da célula mesmo quando esta é submetida a condições físicas extremas (altas pressões osmóticas ou temperaturas abaixo de zero). O conteúdo lipídico das bactérias Gram negativas é consideravelmente maior do que a dos organismos Gram positivos. Fermentacaoalcoolica v2. Todas estas substâncias são reunidas para formar substâncias poliméricas complexas que formam a estrutura da parede celular.0. carboidratos e lipídeos. mas de um modo geral a parede celular das células Gram negativas é quimicamente mais complexa. açúcares aminados. podendo ser responsável por 10 a 40% do peso seco do microrganismo. o ácido murâmico e o ácido teicóico.doc 22 6/7/2011 . o ácido diaminopimélico (DPA). uma vez que a célula bacteriana desprovida de parede celular (protoplasto) é incapaz de promover a divisão ou crescimentos normais. Nas bactérias Gram negativas o peptoglicano constitui uma fração menor do total da parede celular do que nas bactérias Gram positivas. por exemplo. Estas substâncias são típicas das bactérias.

como transporte de elétrons e fosforilação oxidativa.0. Dentre estas se incluem grânulos de amido. provocar alterações morfológicas que possam ser verificadas ao microscópio comum. Membrana citoplasmática ou protoplasmática A membrana citoplasmática ou protoplasmática ou simplesmente membrana plasmática está situada imediatamente abaixo da parede celular. sem. controla a passagem de nutrientes e de resíduos para dentro e para fora da célula. Acredita-se que geralmente os grânulos podem servir como fonte de material nutritivo de reserva. Nesta são encontrados também várias enzimas responsáveis por diversas funções celulares. respectivamente. onde é encontrado o ADN da célula bacteriana. dentro do citoplasma são encontrados corpúsculos que são considerados como estrutura nuclear. mas várias outras inclusões podem ser encontradas através de técnicas microscópicas especiais. Nenhum vacúolo tem sido observado no conteúdo citoplasmático. polímero de fósforo inorgânico. uma área rica em ácido desoxiribonucleico (ADN) (área nuclear ou cromatínica) e uma área fluida com nutrientes dissolvidos. Nele pode-se distinguir uma área de aparência granular rica em ácido ribonucleico (área citoplasmática). contudo. Desta forma qualquer modificação (lesão) da membrana citoplasmática poderá resultar em morte da célula. de pigmentos. etc. Material celular Embora as bactérias não possuam o núcleo típico das células de animais e vegetais superiores. separando esta do material citoplasmático.Acredita-se que a função da parede celular seja a de proporcionar uma moldura rígida que suporte e proteja as entidades protoplasmáticas mais sensíveis.doc 23 6/7/2011 . Citoplasma Este representa todo o material celular contido dentro da membrana citoplasmática. O núcleo da célula bacteriana pode ser revelado pelo corante Fermentacaoalcoolica v2. Estas partículas ribonucleoproteicas são denominadas de ribossomos. Entretanto deve-se usar o termo núcleo. uma vez que se trata de uma forma primitiva de núcleo. O ácido ribonucleico juntamente com proteínas forma corpúsculos ou macromoléculas densamente aglomeradas por todo o citoplasma. Trata-se de uma membrana de real importância e sendo semipermeável e seletiva.

Uma vez que os flagelos são responsáveis pela mobilidade das bactérias e que nem todas as bactérias são flageladas. uma vez que é menos denso que o citoplasma. Os flagelos são muito pequenos para serem vistos em seu estado natural. Outra sugere um mecanismo rotatório.de Feulgen. de uma hélice relativamente rígida. Uma das hipóteses diz que as cadeias protéicas se contraem e se relaxam produzindo um movimento ondulatório que puxa ou empurra o organismo. Cápsulas Algumas bactérias estão envoltas por uma substância viscosa que forma uma camada de cobertura ou envelope ao redor da célula. Não há evidência de uma membrana separando o núcleo do citoplasma e durante a replicação do núcleo bacteriano não se tem observado o aparelho mitótico. Reprodução bacteriana Durante o crescimento bacteriano o processo mais comum de divisão celular (multiplicação) é a fissão binária. a partir de uma extremidade fixa. O método exato pelo quais os flagelos movimentam a célula bacteriana não é conhecido.doc 24 6/7/2011 . mas pode-se generalizar que muitas espécies de bacilos o apresentam e raramente eles ocorrem em cocos e lactobacilos. que se exteriorizam através da parede celular e se originam de uma estrutura granular imediatamente abaixo da membrana citoplasmática são denominados de flagelos. após o Fermentacaoalcoolica v2. típico das células superiores.0. A mobilidade pode ser facilmente observada pela microscopia com preparação em gota pendente. ou pela microscopia eletrônica. Nem todas as bactérias possuem flagelos. As bactérias capsuladas são responsáveis pelo aparecimento de certos prejuízos em processos industriais uma vez que este material é de natureza polissacarídica pertencentes a diversos tipos como o dextrano. Estas estruturas são designadas como cápsula ou camada limosa. Flagelos Os apêndices muito finos. pelo microscópio óptico. conclui-se que existem espécies móveis e imóveis. o levano e a celulose. o qual é específico para ADN. semelhantes a cabelos. onde uma única célula se divide em duas. a dextrina. As cápsulas representam um envoltório protetor e podem servir também como reservatório de alimentos armazenados e como locais de despejo de substâncias de escória.

A resistência dos esporos bacterianos as altas temperaturas é variável de espécie para espécie. O tempo necessário para que a célula se divida ou para que a população duplique é conhecido por tempo de geração. ou seja. o qual pode variar de 15 a 20 minutos até algumas horas. podem crescer e multiplicar-se por muitas gerações como células vegetativas. que dará origem ao esporo.doc 25 6/7/2011 . Esses esporos são formados no interior das células e portanto são denominados de endosporos. e quando este germina resulta uma única célula bacteriana. sob certas condições. temperaturas ao redor de 80ºC ou mais são apenas suficientes para provocar a germinação dos mesmos. Clostridium) são capazes de formar.0. O tempo de geração depende da espécie bacteriana e das condições ambientais. podendo utilizar alimentos muito diferentes.desenvolvimento de uma parede celular transversal. Eles contém somente parte dos constituintes celulares e a sua posição e forma na célula são importantes critérios na classificação dos bacilos. mas seu crescimento ótimo requer condições específicas para uma dada espécie. Essa divisão da célula é um tipo de reprodução assexual. Muitas espécies bacterianas pertencentes a vários gêneros (Bacillus. A germinação dos esporos geralmente requer a presença de um aminoácido específico e pode ocorrer somente após o esporo ter sofrido a ação de fatores físicos (choque térmico). e de um modo geral. mas num determinado momento do desenvolvimento pode ocorrer no interior do citoplasma vegetativo. as bactérias são capazes de crescer numa ampla faixa de condições físicas. É importante mencionar que as bactérias capazes de formar esporos. unidades celulares conhecidas como esporos. ou como meio de disseminação da espécie. Entretanto a fissão binária não é o único processo de reprodução das bactérias. Fermentacaoalcoolica v2. a síntese de um novo protoplasma. Nas espécies do gênero Bacillus somente um esporo é formado por célula.

verifica-se que inicialmente parece não haver crescimento.fase estacionária Fermentacaoalcoolica v2.0. fase estacionária e fase de declínio ou de morte. Ciclo normal de crescimento da cultura bacteriana Quando se inocula um meio de cultura com certo número de bactérias e se observa o número de células a intervalos regulares por mais ou menos 24 horas. grandes quantidades de cálcio. e são assim denominados: lag fase. os quais formam um complexo Ca. em seguida há um rápido aumento da população e depois há uma diminuição do número de células.A composição química do esporo é típica e todos os esporos bacterianos contêm grandes quantidades de ácido dipicolínico (5 a 10%). Esta capacidade de sobrevivência pode ser atribuída à sua parede ou capa impermeável a qual por sua vez está associada ao complexo ácido dipicolínico-cálcio.doc 26 6/7/2011 .fase exponencial C . Esses períodos são conhecidos como fases do crescimento bacteriano.lag fase B .ácido dipicolínico-peptoglicano que constitui a camada cortical do esporo. Comparados com as formas vegetativas. os esporos são extremamente resistentes aos agentes físicos e químicos adversos. peptidoglicano. Log do número de bactérias B C D A Tempo (h) A . fase logarítmica ou exponencial.

(Pelczar. com menos freqüência. Na fase logarítmica ou exponencial as células se dividem firmemente. Por serem individualmente tão pequenos que não podem ser visualizados sem ajuda de um microscópio. particularmente à exaustão de alguns nutrientes e. Caracterização e Classificação dos Microrganismos As comparações das características de grande número de microrganismos resultam num sistema de agrupamento das espécies semelhantes. isto é. atividade metabólica e outras características fisiológicas. a produção de produtos tóxicos. são fisiologicamente ativas e estão sintetizando novo protoplasma. ao contrário durante esta fase as células aumentam de tamanho. A tendência para o fim do crescimento pode ser atribuída a uma série de cirscuntâncias. 1) Na fase lag não significa que as células estejam em repouso ou dormentes. (B) fase log (logarítmica). Fermentacaoalcoolica v2. talvez como resultado da completa cessação das divisões ou do equilíbrio entre o ritmo de reprodução e o equivalente ritmo da morte. quando todas as células passam a ter capacidade de divisão em tempos regulares. Chan . 8.doc 27 6/7/2011 . vol. não é prático trabalhar com um único microrganismo. que é considerado como uma espécie e recebe um nome específico. num ritmo constante.1981. (A) fase lag. (D) fase de morte ou de declínio.D . Na fase estacionária a população permanece constante durante certo tempo. no entanto como nem todos os indivíduos completaram sua etapa lag simultaneamente ocorre um aumento gradual da população até o término desta fase. as bactérias passam a morrer mais rapidamente do que a produção de novas células. Na fase de declínio ou de morte. cria-se um grupo com características muito semelhantes. o microrganismo adquire um nome.fase de declínio Fig. Curva de crescimento típica das bactérias. Reid. Ao final da fase lag cada organismo se divide. As bactérias no novo meio podem ser deficientes em enzimas ou coenzimas que devem ser sintetizadas em quantidades suficientes para o funcionamento ótimo da maquinaria química da célula.0. Por fim. Várias condições contribuem para a morte bacteriana. A população é grandemente uniforme em termos de composição química. (C) fase estacionária. as mais importantes são a depleção de nutrientes essenciais e o acúmulo de substâncias inibidoras como os ácidos.

as idéias a respeito de seus agrupamentos podem sofrer modificações. de fato. b) características morfológicas: as dimensões das células. Classificação em Nível de Gênero Fermentacaoalcoolica v2. originada do crescimento de uma única célula microbiana. incluem as seguintes: a) características culturas: os nutrientes exigidos para o crescimento e as condições físicas do ambiente que favorecem o desenvolvimento. assim como a determinação das relações entre o ADN isolado de diferentes microrganismos. d) características de composição química: a identificação dos principais e típicos constituintes químicos da célula. é possível identificá-lo pela consulta a livros de referência que contêm descrições das espécies microbianas (exemplo: Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology). seus arranjos. descobrir que o organismo que está sendo pesquisado é muito diferente de qualquer um dos que foram descritos anteriormente e pode.doc 28 6/7/2011 . ou seja. e) características antigênicas: a detecção de componentes especiais da célula que fornecem evidência de semelhança entre as espécies. a diferenciação e a identificação de suas estruturas. mesmo hoje. Antes de se identificar e classificar um microrganismo. Entretanto é comum. quanto mais informações forem coletadas sobre os microrganismos existentes.0. Uma vez que as características de um microrganismo tenham sido adequadamente determinadas e catalogadas. Além disso. cultura que consiste de uma única espécie de microrganismos. tratar-se de uma nova espécie.Por esta razão é comum se trabalhar com culturas puras. c) características metabólicas: a maneira pela qual o microrganismo desenvolve os processos químicos vitais. suas características devem ser determinadas com detalhes adequados. As principais a serem determinadas ou observadas. f) características genéticas: a análise da composição do ácido desoxiribonucleico (ADN). Se dois ou mais tipos crescem juntos tem-se uma cultura mista.

mas os Pediococcus são mais tolerantes a ácidos e crescem em condições estritamente anaeróbias. A tolerância a 6. as que formam. e exeções as características consideradas típicas são bastante freqüentes entre as bactérias. Algumas características importantes em nível de classificação de espécie são: (1) tolerância a pH e sal. (10) demanda de fatores de crescimento. envolvendo um número grande de provas bioquímicas.0. Assim as bactérias são divididas em bastonetes e cocos. ácido acético. Classificação em Nível de Espécie As análises das características fenotípicas são ainda importantes na classificação preliminar e no conhecimento de algumas propriedades importantes do ponto de vista industrial. Enterococcus crescem a 10°C e 45°C. (6) formação de acetoína (teste Voges Proskauer). A divisão celular em um ou dois planos é importante na diferenciação dos cocos. (7) tolerância a sais de bile.láctico e os Lactobacillus DL-láctico. Os Leuconostoc produzem apenas ácido D . Os Enterococcus são considerados bem tolerantes a pH extremos. Os Pediococcus e Aerococcus são morfologicamente idênticos. A tolerância a acidez e alcalinidade pode ser usada para distinção entre os gêneros. Lactococcus e Vagococcus a 10°C. (8) tipo de hemólise. vitaminas e disponibilidade limitada de oxigênio). (4) fermentação de diferentes carboidratos. Crescimento a determinadas temperaturas é usado pra distinguir cocos. Assim a identificação segura destas bactérias requer métodos sofisticados.doc 29 6/7/2011 . (11) presença de certas Fermentacaoalcoolica v2. (3) configuração do ácido láctico produzido. Deve-se considerar que há superposição nos fenótipos entre os diferentes gêneros. gás carbônico e etanol. Lactococcus e Estreptococcus. envolvendo aquelas que convertem glicose quase exclusivamente a ácido láctico e (2) heterofermentativa. (9) produção extracelular de polissacarídeos.5% de sal pode ser usada para distinção entre Enterococcus.A morfologia celular é ainda uma característica muito importante na descrição dos gêneros de bactérias. Uma característica importante na diferenciação de bactérias em nível de gênero é o tipo de fermentação da glicose em condições padronizadas ( suprimento ilimitado de glicose e de fatores de crescimento como aminoácidos. (2) crescimento a determinadas temperaturas. além de ácido láctico . A formação de diferentes isômeros de ácido láctico na fermentação da glicose pode ser usada para distinguir Leuconostoc e Lactobacillus heterofermentativos. (5) hidrólise da arginina. mas não a 45°C e Estreptococcus não cresce a 10°C e a 45°C é variável conforme a espécie. Nessas condições as bactérias são divididas em dois grupos: (1) homofermentativo.

T ótima 30-35ºC (mínima 10-35°C e máxima 40-60ºC).0. isolados e raramente em cadeias.5. Aeróbios ou anaeróbios facultativos.5 .5 μm). esporulados. ativo em pH 5. Gram (+) e com mobilidade. (12) características de crescimento no leite e (13) tipificação sorológica. tendência à formar pequenas cadeias trançadas.doc 30 6/7/2011 . Bacillus brevis Bastonetes (1. catalase (+). esporulados. Gram (+) e com mobilidade.8 μm). Grupos Relevantes em Usinas de Açúcar e Álcool Veremos a seguir a descrição de algumas espécies dos diferentes gêneros de bactérias que frequentemente são encontradas como contaminantes do processo de produção de açúcar e álcool. Bacillus megaterium Aeróbios.0 μm x 1. levana extracelularmente de sacarose. Fermentação da glucose com produção de 2.0 μm x 0.2 μm).5-4.3 butanodiol + acetoína + CO2. Espécie Bacteriana Características Morfológicas e Citológicas Características Fisiológicas Produtos do metabolismo Fermentacaoalcoolica v2. esporo elíptico central ou terminal. Bastonetes (2. isolados e raramente em cadeias. catalase (+).8.70.81. Outras características incluem a taxonomia molecular e quimiotaxonomia. catalase (+). T ótima 30ºC (mínima 3-20ºC e máxima 35-45ºC). (2) presença e tipo de ácidos teicóicos. Aeróbios.0 μm x 0.21.0-5. T ótima 30-37ºc (mínima 5-20ºC). (4) relação de G + C no DNA.enzimas. Gram (+) e com mobilidade. esporos elíptico central. esporulados. Espécie Bacteriana Bacillus subtilis Características Morfológicas e Citológicas Características Fisiológicas Produtos do metabolismo Bastonetes (2. como (1) tipo de peptidoglicanas de ácido diamínicos.0-3. ácido de glucose. esporo elíptico central. (5) composição de ácidos graxos e (6) mobilidade eletroforética de desidrogenase do lactato. ácido de glucose (v). (3) presença e tipo de menaquinonas.

8. aos pares e/ou em pequenas cadeias. Lactobacillus plantarum Bastonetes (3.Bacillus coagulans Bastonetes (2. fermentação de glucose com produção de ác. 4. Gram (+) e com motilidade. isolados.0-8.0 μm x 0.0 μm x 0.5esporulados. pH mínimo p/ cresc. catalase (-). Anaeróbios facultativos.5-5.5-5. Anaeróbios facultativos.5-5..8. esporulados. Gram (+) não esporulados. isolados e/ou aos pares.3 butanodiol + acetoína + ác.0. Espécie Características Morfológicas Características Fisiológicas - Fermentacaoalcoolica v2. lático + 2. heterofermentativos: ácidos de glucose. T ótima 30-40ºC (15ºC (+) e 45ºC (-)).0. catalase (-).05.5-5. lático + acetato + etanol + CO2 de glucose. principalmente isolados.50. Bacillus stearothermophilus Bastonetes (2.9. de glucose. heterofermentativos: produção de ác. 1. frutose e sacarose. Aeróbios. não esporulados. Gram (+) e com motilidade. Bastonetes (0. Aeróbios ou anaeróbios facult. raramente com motilidade. T ótima 35-40ºC (mínima 15-25ºC e máxima 5560ºC.8 μm). 45-50ºC (mínima 35ºC e Lactobacillus fermentum Anaeróbios facultativos.61.2 μm). pH Ótimo: 5. pH ótimo: 5.0 μm) isolados e em cadeias. isolados e/ou em pequenas cadeias.0 μm x 0. acético + etanol. não esporulados. T ótima máxima 65ºC). frutose e sacarose. T ótima 30-40ºC (15ºC (-) e 45ºC (+)) pH ótimo 5.9 μm de largura e comprimento muito variável). catalase (-). T ótima 40ºC (15ºC (-) e 45ºC (+)). frutose e sacarose.doc 31 6/7/2011 . catalase (+). homofermentativos: ácido lático de glucose.91.0 μm x 0. raramente com motilidade. Gram (+). Gram (+).5-0.0 μm). catalase (+). esporo oval terminal. ácido de glucose.0-9. Lactobacillus delbruecki Bastonetes (2..0-4. ác. raramente com motilidade. esporo elíptico central ou terminal.

0-3.0 μm) isolados.0-6.1 μm) isolados. sacarose.8.Bacteriana Lactobacillus helveticus e Citológicas Produtos do metabolismo Bastonetes (2. catalase (-).81. isolados e em pequenas cadeias. heterofermentativo facultativo: ácido de glucose. pH ótimo: 5. T. celobiose. arabinose. catalase (-).0-6.0 μm). Anaeróbios facultativos.71. Lactobacillus vaccinostercus Bastonetes (1. pares e cadeias.0. heterofermentativos: ácido lático de glucose. Lactobacillus brevis Bastonetes (2.0-3.0 μm x 0.0 μm). não esporulado.7 μm). heterofermentativos: ácidos de glucose.0-4. 0. heterofermentativos: ácidos de glucose. aos pares e/ou em pequenas cadeias. maltose. frutose. frutose e sacarose.5-5. ramnose. frutose. raramente com motilidade Lactobacillus yamanashiensis Bastonetes (2.5- Anaeróbios facultativos. não esporulados.0 μm x 0. catalase (-). frutose e sacarose. T ótima 30-40ºC (15ºC (+) e 45ºC (-)). Gram (+).doc 32 6/7/2011 . T ótima 30-35ºC (15ºC(-) e 45ºC (-)). hemofermentativos: produção de ácido lático de glucose.0 μm x 0. maltose. não esporulados e sem motilidade Anaeróbios facultativos catalase (-).0 μm x 0. Gram (+) e sem motilidade Espécie Características Morfológicas Características Fisiológicas - Fermentacaoalcoolica v2. Gram (+). não esporulados. não esporulados e com motilidade Lactobacillus coryniformis Bastonetes (1. galactose. manitol.61. xilose. pH ótimo: 5. isolados.5-5. catalase (-). pares e cadeias. ribose.51. pares.0 μm x 0. Anaeróbios facultativos. Gram (+). T ótima 30-35ºC (10ºC (+) e 45ºC (-) ). raramente com motilidade.8. galactose. T ótima 30-35ºC (10ºC (+) e 45ºC (-) ). Gram (+). ótima 30-40ºC (15ºC (-) e 45ºC (+)). Anaeróbios facultativos.

raramente com motilidade.05.0). isolados e em cadeias heterofermentativos.0. Gram (+).0curtas.8 μm x 2. pH 5. Anaeróbios facultativos.2. Gram (+).2. Gram (+). catalase (-).0. 4.5-6.Bacteriana Lactobacillus viridescens e Citológicas Produtos do metabolismo Bastonetes (0. heterofermentativas. Lactobacillus fructosus Bastonetes (0. crescimento a 15ºC (+). fermentação de glucose (+). pH favorável 5. não esporulados. isolados.9 μm x 2. crescimento a 15ºC (+).56.5-0. não cresce em pH > 6. Anaeróbios facultativos. não esporulados. crescimento a 45ºC (-). geralmente com crescimento em pH < 5. frutose (+) e sacarose (V). Microaerófilos.0 μm). não esporulados.0 μm x 2. fermentação da glucose (+). heterofermentativos. fermentação da glucose (+). Gram (+). frutose (+) e sacarose (V). oxidase (-).7-0.0 μm). crescimento a 45ºC (-).0.0.7-1. aos pares e em cadeias. fermentação de glucose (+). pode utilizar etanol para crescimento. extremidades arredondadas.8 μm x 154. isolados ou aos pares.doc 33 6/7/2011 . heterofermentativos. frutose e sacarose (+). cresce em pH < 5. Lactobacillus buchneri Bastonetes (0.0. sem motilidade. crescimento a 45ºC (-). raramente com motilidade. Anaeróbios facultativos.5-0. raramente com motilidade. não esporulados. pH 5. acidófilo (pH favorável 5.0 μm). crescimento a 15ºC (+). isolados. geralmente com crescimento em pH < 5. aos pares e em pequenas cadeias. Espécie Características Morfológicas Características Fisiológicas - Fermentacaoalcoolica v2.0. crescimento a 45ºC (-).5-6. Lactobacillus fructivorans Bastonetes (0.0 μm).04. frutose (+) e sacarose (-). com extremidades arredondadas.

sem motilidade. ótima: 20-30ºC. homofermentativos com produção de DL-ácido lático. Gram (+).9 μm x 1. não esporulados. (-). isolados. rafinose. (mínima 10ºC e máxima 37ºC). Anaeróbios facultativos. não esporulados. frutose (+).7 μm).0 μm). crescimento em pH 4. pH ótimo 5.5-6. esporulados e com motilidade.7(+). Formação de dextrana. fermentação de glucose (+). Microaerófilos. Sporolactobacillus sp Bastonetes (3.8 (-). Espécie Bacteriana Características Morfológicas e Citológicas Características Fisiológicas Produtos do metabolismo Fermentacaoalcoolica v2. crescimento em pH 4. Anaeróbios facultativos. glucose.7-1.8 μm) isolados e pares. heterofermentativos: ác. sacarose. sacarose (+). não produz gás. aos sem motilidade.2 μm x 0. catalase (-).Bacteriana Lactobacillus acidophilus e Citológicas Produtos do metabolismo Bastonetes (0. pares ou em cadeias. ácido de frutose (+).50. sacarose (+). crescimento em 10% (-).7-1. oxidase (-).56.0-5. aos pares ou cadeias. aos pares e em pequenas cadeias.0. crescimento a 15ºC (-).5-0. Gram homofermentativos: ácido lático Leuconostoc mesenteroides Células esféricas e frequentemente lenticulares (0. não esporuladas.doc 34 6/7/2011 . de glucose.8 (-). crescimento a 37ºC (+). catalase (-) de frutose.6-0.5. Gram (+). maltose. Anaeróbios facultativos. crescimento a 45ºC (+). Gram (+). glucose (+). T. fermentação de carboidratos resultando em D (-) ácido lático e etanol ou ácido acético ao invés de etanol. 0. crescimento 10% etanol Leuconostoc dextranicum Células esféricas ou lenticulares (0. catalase (-).7 μm). raramente com motilidade. frutose e sacarose. esporos elípticos terminais.2 μm x 0.0 μm x 0.

sem cápsula. Gram (+). heterofermentativos: ác. Anaeróbios facultativos.5-0. não esporulado.0-6. não esporulado. sem cápsula. aos pares ou em tétrades.6 μm de ∅) isoladas.0 (+) e 8. (mínima 10ºC e máxima 40ºC). de glucose.7-1.8-1. T ótima: 25-30ºC. 50ºC (-). pH ótimo 5.6-1. sem cápsula. Gram (+).0. crescimento 10% etanol Micrococcus lylae Células esféricas (0. Tº ótima: 35ºC (40ºC (+).8-1. Gram (+). sem cápsula. Aeróbios (oxidativos).Leuconostoc lactis Células esféricas e frequentemente lenticulares (0. frutose e sacarose. catalase (-).6 μm de ∅).0-6. Ácido de glucose. sem motilidade.0 (+) e 8. homofermentativos: ácido lático de glucose. não exibe metabolismo fermentativo. pH ótimo 5.0 (pH 4.doc 35 6/7/2011 . pH ótimo 5. aos sem motilidade. sem motilidade. Temperatura Ótima: 3035ºC (crescimento 37ºC (+)). Pediococcus parvulus Anaeróbios facultativos.2 μm x 0.0 μm de ∅).5-6.8 (-). 40ºC (-)). Micrococcus halobius Aeróbios (Oxidativos). catalase (+). pares ou em cadeias. catalase (-).8-1. homofermentativos: ácido lático de glucose e sacarose (v).5 (-)). não esporulados. sem motilidade. predominante em tétrades. sem motilidade. catalase (+).7 μm).0 μm de ∅). catalase (-). temperatura ótima: 3037ºC. Pediococcus pentosaceus Cocos (0. aos pares e ocasionalmente em tétrades e cachos. Cocos (0. Gram (+). não esporuladas. formação de dextrana.0 (pH 4. crescimento em pH 4. Espécie Características Morfológicas Características Fisiológicas - Fermentacaoalcoolica v2.0. não esporuladas. T ótima: 30ºC (crescimento 35ºC (+). Anaeróbios Facultativos. Células esféricas (0. Gram (+).5 (v)). (-). aos pares ou em tétrades.

aos pares ou tétrades. não esporuladas. T ótima: 35-40ºC (15ºC (+). colônias negras brilhantes em BairdParker Agar. pH ótimo: 6. Aeróbios ou anaeróbios facultativos. sem motilidade. isoladas. T ótima = 40ºC. ácido de sacarose (-). isoladas são raras e nunca em cadeias.5 μm de ∅). sem motilidade. ótima: 30ºC sensibilidade a penicilina. sem motilidade.6 (-)).0. Espécie Bacteriana Características Morfológicas e Citológicas Características Fisiológicas Produtos do metabolismo Fermentacaoalcoolica v2.catalase (+).5-1. Gram (+). gelatinase (+). não esporuladas. homofermentativos: ácido lático de glucose e sacarose (v).0-7. sem motilidade. catalase (-).2 μm de ∅). pH ótimo 7. oxidase (-). crescimento a 50ºC (+). aos pares ou em (10ºC(+). isoladas. Anaeróbios facultativos. metabolismo oxidativo e fermentativo: ácidos de glucose. Gram (+). 45ºC (v)). frutose e sacarose. aos pares e ocasionalmente em tétrades.doc 36 6/7/2011 . Anaeróbios facultativos. tolerância a até 10% de NaCl. catalase (+).0 μm de ∅.5 (+).07. pH 9. T. crescimento entre 18 e 40ºC (+). 1. Staphylococcus xylosus Células esféricas (0.5-1. crescimento em pH 7. aos pares. Lactococcus lactis Células ovais alongadas no sentido das cadeias. Gram (+).5 μm de ∅). colônias amarelas/laranja em Staphylococcus medium 110.0(+). Anaeróbios facultativos.Bacteriana Pediococcus acidilactici e Citológicas Produtos do metabolismo Células esféricas (0. com 0.5. não esporuladas. algumas espécies crescem a 45ºC.6-1. não esporuladas. tétradas e cachos. Gram (+). 45ºC (-).5cadeias. catalase (-). Staphylococcus sp Células esféricas (0.0 (pH 9. fermentação de glucose com produção de DL ou L (+) lactato.

Anaeróbios facultativos. aos pares. oxidase (-).1-1. resistência a KCN (±). móteis por flagelos peritrigueos acético e fórmico.06. as leveduras floculentas estão normalmente presentes como contaminantes das leveduras normais (não floculentas).Acinetobacter calcoaceticus Bastonetes curtos (1. As células floculentas apresentam superfície fimbriada ou ciliada e as não floculentas. o termo floculação é normalmente usado para designar o fenômeno reversível de agrupamento celular que comumente se desenvolve no final da fase exponencial de crescimento ou na fase estacionária. A diferença da estrutura entre linhagens floculentas e não floculentas não pode ser detectada pela análise química.5 μm). não esporulados. por agentes químicos ou microbiológicos. Gram (-). T ótima: 30-32ºC. Estudo do fenômeno da floculação No estudo de leveduras. x 1. fermentação ácido-mista (produção de ácidos lático.0. sem motilidade. mas pode ser visualizada por microscopia eletrônica. O fator responsável pela floculação de leveduras é governado geneticamente. a partir de glucose). com ou sem cápsula. relativamente lisa. Gram (-).0 μm). Na fermentação alcoólica industrial. a presença de leveduras floculentas em concentração superior a 12% causa dificuldade significativa na operação de centrifugação do vinho devido ao fenômeno de co-floculação.0-1. ou sem motilidade. T ótima = 37ºC. Nestas condições acentua-se a sedimentação das células de leveduras nas dornas e interfere na operação das centrífugas contínuas.5 μm Metabolismo oxidativo. catalase (+). pH ótimo: 7. Fermentacaoalcoolica v2.5 μm x 2. Nas usinas alcooleiras.5-2.0. Escherichia coli Bastonetes (1. fermentação de lactose com produção de gás. Isto pode ser causado pela ação de propriedades inerentes das células. O meio de cultivo também interfere na floculação. A anaerobiose reprime a floculação e a aerobiose induz a formação de proteína responsável pela floculação. não esporulados. isolados.doc 37 6/7/2011 . resistente a penicilina. aos pares e em pequenas cadeias. Além do fator genético há outros que interferem ou inibem a sua ação. ácidos de glucose.

mas depende do pH. Esse componente protéico está associado à parede celular não podendo ser removido pelo calor ou tratamento químico. O sítio susceptível à temperatura e proteinase está localizado na célula bacteriana e não na levedura. Como no caso de leveduras floculentas. presença de íons e manose. Já glicose. Magnésio pode substituir Ca+2. associada o grupo carboxila da proteína da parede celular. A força de ligação entre as células floculentas pode ser dada pela ponte de hidrogênio ou polissacarídeos da parede celular e íon Ca+2. Trabalhos realizados com linhagens floculentas mostraram que a manana da parede celular participava da floculação. plantarum. (2) A hidrólise de proteína de células não floculentas ou floculentas não altera a sua interação com células floculentas intactas. O Fermentacaoalcoolica v2. há uma relação numérica celular entre a bactéria e a levedura onde se consegue o máximo de floculação. e a sua interação com células de levedura é afetada com variação de pH.0). por exemplo.0 enquanto que Ca+2 atua a intervalo de pH maior (pH >3. A floculação é dependente do Ca+2 em quantidades mínimas (10-6 a 10-8).O mecanismo exato de floculação da levedura não é conhecido. é termolábil e destruído por proteinase.0. indicando que existe um número fixo de sítios na levedura para formação do agregado. O envolvimento da manana é indicado por diversos experimentos: (1) A floculação é inibida competitivamente por manana. A necessidade de íons Ca+2 para floculação depende do pH sendo que em concentrações elevadas (> 10-1 M) há desfloculação das células. e atua somente ao redor de pH 4. É possível que a ligação seletiva de Ca+2 com proteína seja mediada por arranjo específico do grupo carboxila. Além disso. No caso da floculação causada por Lactobacillus fermentum o fator responsável é de natureza protéica encontrado na célula bacteriana. O tratamento térmico aplicado sobre a célula bacteriana provoca a perda da sua capacidade floculadora.0 e é inibido por sais neutros.0 e 4. como susceptibilidade às altas temperaturas. A interação se estende por toda área causando distorção da parede no local do contato. Na fermentação alcoólica industrial é freqüente a contaminação por bactérias do gênero Lactobacillus. a manose causa a desfloculação. Uma floculação específica também pode ser causada por L. necessidade de íons metálicos e inibição por manose e excesso de íons. proteinase e pH’s extremos. maltose e sacarose não produzem nenhum efeito. O fenômeno ocorre a pH entre 2.doc 38 6/7/2011 . Algumas dessas bactérias são capazes de provocar a floculação de leveduras como. Esta floculação apresenta algumas características similares às leveduras floculentas. Lactobacillus fermentum. mas também pode ser que o íon Ca+2 atue como cofator na ativação da capacidade de ligação da proteína com a manana.

A seguir é apresentada uma das técnicas utilizadas para se avaliar a floculação. temperatura. além de estar sujeita a erros individuais do observador. é essencial a padronização das etapas para a sua medida porque a floculação é afetada por íons e outros componentes do meio.doc 39 6/7/2011 . Nas diversas técnicas disponíveis. usando como parâmetro a velocidade ou grau de sedimentação dos flocos formados. as técnicas mais comumente utilizadas para quantificar a floculação consistem na medida da sedimentação. a) Condições de cultivo de células para o teste de floculação Fermentacaoalcoolica v2. embora forneça informações detalhadas como o número de células que integram cada floco e o número e diversidade de flocos em relação ao total de células de levedura. a estimativa das células do sedimento formado ou remanescente na suspensão após a sedimentação é feita por turbidimetria. Para medir a sedimentação usa-se no geral. No geral. a técnica da absorbância tanto da parte não floculada (sobrenadante) como do sedimento formado após a ressuspensão. A diversidade dos microrganismos e dos agentes envolvidos na floculação do fermento nas dornas de fermentação.0. pH.estudo da mobilidade eletrostática das células de bactérias e levedura mostrou que a floculação era causada pela atração eletrostática entre as superfícies celulares de bactérias e leveduras com cargas opostas. é uma técnica trabalhosa e demorada. essa observação fornece resultados apenas qualitativos. O exame direto do material ao microscópio. mesmo os mais simples que se baseiam na observação visual do sedimento formado. torna o controle do processo de floculação um desafio de grande importância e dificuldade. mas a maioria das técnicas encontradas em literatura mede indiretamente. fornecem resultados mais consistentes. Medida da Floculação Algumas técnicas medem diretamente a floculação através do exame microscópico ou redução da turbidez da suspensão celular. grau e forma de agitação. Assim. que é uma forma indireta de avaliar o grau de floculação. Já os testes de sedimentação. Embora os flocos grandes que se formam sejam visíveis a olho nú. Com a elucidação das causas envolvidas neste processo são prováveis que se obtenham meios eficientes e econômicos para o controle da floculação. A redução da absorbância pela formação de agregado celular pode ser medida em espectrofotômetro. bem como o grande volume de mosto manuseado durante a fermentação alcoólica industrial.

Esta ferramenta de trabalho foi uma nova luz na seleção de novas leveduras para a fermentação em escala industrial. sendo posteriormente ressuspendidas em tampão citrato 0. adaptado para a utilização de suspensões mistas de leveduras e bactérias. O investimento em treinamento de pessoal e criar equipe têm um retorno rápido e seguro. utilizando como inóculo 1% de um cultivo de 24 horas em caldo .05M acrescido de EDTA 0.5. Monitoramento e interpretação dos dados do laboratório industrial O acompanhamento analítico do processo é condição sine qua non para se obter alto rendimento.005M. sendo que após 5 minutos. A seguir os tubos serão agitados manualmente por 2 minutos.0.doc 40 6/7/2011 . medindo-se sua absorbância em espectrofotômetro a 600nm.MRS.As leveduras devem ser cultivadas em caldo YEPD por 24-48 horas a 30°C. Em algumas ocasiões era necessário mais de um mês para debelar uma contaminação e neste tempo as perdas em rendimento eram enormes. Há dezenove anos atrás não se fazia contagem de bactérias ao microscópio. as células serão centrifugadas a 2000 G por 10 minutos a 4°C e lavadas duas vezes com solução EDTA 0. assim como o da equipe da destilaria. se acompanha até a linhagem da levedura que está dominando a dorna com a ajuda da técnica de cariotipagem do DNA cromossômico. Com o avanço nas metodologias e pesquisas. utilizando como inóculo 1% de um cultivo de 24 horas em caldo . esse intervalo de tempo caiu para apenas três dias.0 . Hoje. Fermentacaoalcoolica v2. Após o crescimento. pH 7. As bactérias devem ser cultivadas em caldo MRS por 24-48 horas a 30°C. 3 ml da suspensão de bactérias e solução de CaCl2 5x10-2M em quantidade suficiente para se obter uma concentração final de 1x10-2M (1. Serão adicionados em tubos de ensaio (16 x 150 mm) 3 ml da suspensão de leveduras. pH 4. Por outro lado. b) Teste de floculação Os testes de floculação devem ser realizados de acordo com o método de Stratford & Keenan (1988).5 ou tampão Tris-HCl 10-1 M. E a meta é ser cada vez mais rápida.025M. além de retardar a fermentação. O entrosamento laboratório e gerência do processo ou produção é básico também. e é claro o conhecimento era muito menor. em dois anos.7.YEPD.5 ml). serão coletados 3 ml da amostra do sobrenadante. também nos indica se estamos com leveduras não Saccharomyces que podem ser prejudiciais ao rendimento fermentativo e produzir muita espuma. com auxilio de um pipetador automático.

9.Para um bom acompanhamento do desempenho de destilaria.0g H2SO4/litro = normal idem caldo decantado 27 . e o chefe da destilaria não "domine" o laboratório.doc 41 6/7/2011 . O bom senso deve sempre prevalecer. O entrosamento entre o laboratório e a destilaria é fundamental. estes números poderão sofrer alterações. Devem-se estabelecer regras rígidas para que o chefe do laboratório não ultrapasse a linha de atuação do controle.104 = regular 104 .0. Os números apresentados na Tabela a seguir não são fixos e no futuro. é necessário se ter uma idéia de como as análises do laboratório pode ajudar no julgamento do processo de fermentação e destilação.0 . Tabela para interpretação das análises laboratoriais Amostra Análise Observação cana PCTS caldo do 1º terno e caldo misto bactérias nº bast/ml < 104 = ótimo 1. melhor 200 ppm 40-60 ppm 1000-1500 ppm 50-150 ppm até 25% = baixo 26% .0 x 105 = regular > 106 = mau acima de 2 significa moenda suja < 102 2 3 relação contagem bactérias caldo misto/caldo 1º terno caldo decantado bactérias nº bast/ml = ótimo 10 .10 = bom 103 .5.29ºC = normal acima 100 mg/l afeta fermentação deve ser menor que 2 quanto menor.0 x 105 = bom 6.0 .35% = normal um pouco acima das contagens das Fermentacaoalcoolica v2.105 = regular para mau > 105 mosto acidez bactérias bast/ml temperatura SO2 Ca/Mg Ca Mg+ NH4 K P levedo tratado ou % levedo bactérias bast/ml = mau até 2.

doc 42 6/7/2011 .81% = regular abaixo de 80 = mau Fermentacaoalcoolica v2.dornas é normal.90% = normal > 90% = cuidado com perdas de levedura bactéria: bast/ml < 106 = ótimo 1.0 .0. indica contaminação 5% a 15% ideal (depende da manutenção do fermento na dorna) < 80% = alta temperatura ou muito ácido 80 . levedo pronto Amostra Análise Observação vinho dornas % levedo 10 . 33-35ºC.107 = mau fermentação temperatura manter a temperatura o mais constante possível durante toda a fermentação. rendimento % fermentação 91 .5 vezes acidez do mosto = normal.9.0 . e acima.0 x 106 = bom 1.90% = regular abaixo de 88% = mau geral da destilaria ídem fermentação (não se deve perder mais que 0.0 .92 ou maior = ótimo 90 .91% = bom 88 .5.13% = ótimo acima de 14% = cuidado abaixo de 10% = baixo acidez brotamento viabilidade levedura 2.5% na destilação) global da indústria 83% e acima = excelente 81 a 83% = bom 80 .0 x 107 = regular > 6.

Usar ácido e antibiótico alternados. Bactérias no vinho Fazer teste com os antibióticos toda semana (HJ.0. tem muita importância pois o tratamento se torna mais eficiente.0 x 106 = diminuir pH da cuba de tratamento para pH = 2.doc 43 6/7/2011 .0. Se estiver floculando muito aplicar o ácido duas horas antes de alimentar a dorna. O uso de antibiótico é essencial quando a viabilidade está abaixo de 70%. para 2. ou há problemas nas canalizações (ponto morto) ou água de embebição. Brotamento e viabilidade da levedura Fermentacaoalcoolica v2. VM e penicilina ou outro que aparecer). Nas paradas só aplicar ácido na cuba pois na dorna não tem agitação. Se não baixar os bastonetes. baixar mais o pH da cuba. Nas paradas usar antibiótico na cuba e não aplicar ácido algum. Obs.Procedimentos Contaminação: Bactérias no caldo primário e misto Relação entre as contagens do caldo misto/caldo primário maior que dois. Bastonetes: mais que 1. Bastonetes: mais que 5. Dosagem de antibiótico deve ser de 2 a 3 ppm considerando o volume da dorna.0 x 105 = verificar sanidade da torre de recuperação do álcool. precisa ser lavada. o tempo que o fermento ficar na cuba de tratamento. o ácido também vai afetar significativamente a viabilidade e o desempenho da levedura. Bactérias na água de diluição do fermento Bastonetes + cocos: mais que 5.2.0 x 106 = usar biocida. O tempo mínimo é ao redor de uma hora e o máximo de três horas. significa que a moenda está suja.: Em caso de contaminação. Depois de quatro horas.

Se for maior. faça o combate indicado. para isto basta termos alto teor alcoólico junto com alta temperatura. queima de açúcar no vácuo. é porque está havendo contaminação. Pode-se ter perda com viabilidade baixa. pois vai-se atingir o numero ideal de células em menor tempo. a acidez gira em torno de 0. quanto maior o brotamento.5 a 2. Verificar temperatura da fermentação.0g H2SO4/litro pode ser normal. melhor. se estiver usando e for necessário). ou alta de mais (» 38ºC). pois deve estar havendo caramelização. cristalizador ou bombeamento. e até se atingir cerca de 6% de fermento na dorna. Pode ser também muita perda de fermento na centrífuga ou no fundo de dorna. kamoran HJ.0g H2SO4/litro. Verificar acidez do mel (se for o caso). Viabilidades acima de 90% freqüentemente indicam perda de fermento na centrífuga ou no fundo de dorna.5 a 1. às vezes está muito baixa (abaixo de 30ºC). Baixar o pH da cuba. acidez até no máximo 1.doc 44 6/7/2011 . Mosto de caldo. a porcentagem de brotamento deve ser a menor possível. dependendo se há ou não contaminação). Se for maior procure averiguar. indica contaminação no caldo ou mosto. dependendo do tipo de contaminação: bastonetes pode-se usar penicilina. diminuir ou eliminar o sal sulfato de amônia ou uréia e outros (menos o zinco. Geralmente é temperatura alta.2 ou mais. Verificar o pH da cuba de tratamento. desde que se mantenha a porcentagem de fermento estável na dorna. Fazer teste em espectrofotômetro ou Δ acidez para verificar qual é o melhor Fermentacaoalcoolica v2. o que indica uma boa recirculação de fermento e pouca perda.No início da safra. se estiver alto. virginiamicina ou antibiótico.5 vezes a acidez do mosto. quando a quantidade de fermento está estabilizada. Acima de 15% de brotamento: verificar temperatura máxima da fermentação (dornas). pode estar muito alta. Brix do mel muito alto e pureza baixa favorecem acidez alta e caramelização. isto é. às vezes pode estar abaixo de 2. Entretanto. Abaixo de 5%: verificar contagem de bactérias. Vinho: Se for maior que 2. A viabilidade deve estar entre 80 a 90%. Acidez: Mosto: mosto de melaço.0 (elevar o pH para 2.0.

principalmente de bastonetes. pois as perdas são mais freqüentes. pois a cada grau centígrado acima de 33ºC o rendimento fermentativo decresce de 0.5% indicam apreensão.0. tiver centrífuga suficiente. baixar o pH do fermento na cuba para 2. já vista e se não conseguir. Baixar o Brix do mosto um ou dois pontos se o Brix for até 20.2.5. Se não for contaminação comunicar os superiores e solicitar que entrem em contato a Fermentec. Use bicos nas centrífugas compatíveis com o teor de fermento na dorna. baixar para 2.5. e a perda é alta. baixar. Caso use caldo não decantado. Entretanto cuidado dobrado quando estiver trabalhando com teores altos. Dextrana pode fazer flocular o fermento. tolera-se perdas até 2%. Vinho: centrifugado (turbinado). Teores acima de 0. quatro pontos: Exemplo: Estamos trabalhando com 26 de Brix no mosto.0% pode parar a centrífuga para a lavagem.doc 45 6/7/2011 . do contrário os bicos vão entupir com facilidade e aí fica difícil operar. até 13%. O ideal é trabalhar com concentrações entre 10% e 13%. pois deve estar suja. Acima de 1. Creme ou leite: Teores de 70 a 80% são ideais para a fermentação. Acima de 75% cuidado para não perder muito no vinho centrifugado (turbinado). e se estiver a 2. Verificar temperatura máxima das dornas em fermentação. baixar para 2. melhor. Floculação: Tanto na dorna como na cuba. alimentar a dorna mais devagar para que a temperatura não se eleve demais. Fermentação: Temperatura: Procurar manter as temperaturas máximas indicadas na Tabela.2%. Se for contaminação aplicar os antimicrobianos indicados. Se estiver a 2.0. reduzir para 22 Brix se começar a flocular. Se a Fermentacaoalcoolica v2. Verificar contagens. Se estiver trabalhando com Brix acima de 20.Levedura (fermento): Dorna: Quanto maior a se quantidade de fermento na dorna.8% a 1.2. mesmo com baixa contaminação (nível de 106).

suba o Brix para 22 e espere o resultado do laboratório para ver se é preciso subir mais. É importante saber porque a viabilidade caiu. injetar ar na dorna. Se não houver possibilidade de enviar mosto quente. fazer uma "injeção" de uma dorna que esteja fermentando bem e com uma temperatura acima de 32ºC. mas apenas com uma diferença: não colocar ácido. arejar o tempo todo de tratamento (2 a 3 horas. com mel mais caldo. alimentar mais rápido. baixar um pouco ou deixar aí mesmo. ou se não for possível. aplicar 20 kg de sulfato de amônia ou uréia mais Quinfóz (10 kg) para cada 100 m3 de dorna. . gaste lenha).Se a moenda parar e não houver mel ou xarope suficiente para trabalhar com mel ou xarope e água. e aplicar antibiótico (com o teste da Fermentec. com mel mais água. verificar qual o melhor antibiótico para esta ocasião). centrifugar todo o vinho das dornas e destilar todo este vinho (se não houver bagaço.0. Checar todos os outros parâmetros. . Exemplo: o Brix estava em 18.0 fazer uma "injeção" de uma outra dorna que já esteja cheia e fermentando. refrigerar mais as dornas. .temperatura for baixa. se for menor que 50%. Diluir o fermento com água o mais que puder. não mais) e voltar este fermento para a dorna (não arejar na dorna) até que Fermentacaoalcoolica v2. agora. alimentar com mosto a 40ºC até a temperatura subir para 33ºC. .Verificar a temperatura da dorna. Fermento que não quer pegar: . Se estiver abaixo de 29ºC. Paradas: . trabalhar com um Brix maior. Se o pH for menor que 2. até o pH desta dorna se elevar pelo menos a 3.0.Verificar o pH do pé de cuba.Se houver mel. O fermento centrifugado é colocado na cuba e recebe um tratamento igual ao normal.doc 46 6/7/2011 . para baixar a temperatura destas e atrasar a fermentação (paradas até de 3 horas).Verificar a porcentagem de células vivas (viabilidade).Se a parada for maior que seis horas. alimentar com mosto mais quente.

perpetuando assim a espécie. Fatores que afetam o desempenho fermentativo A levedura como entidade viva independente. mas apenas em condições de aerobiose. ele se acumula no fundo. excreção. pH. realiza a fermentação do açúcar com o objetivo de conseguir energia química necessária à sua sobrevivência.Devem-se deixar umas dornas cheias de vinho centrifugado prontas para destilar nas paradas para acertar o balanço de vapor quando reiniciar a fermentação e destilação. temperatura. Fermentacaoalcoolica v2. sem utilidade metabólica para a célula em anaerobiose. Entretanto o etanol e outros produtos de excreção podem ser oxidados metabolicamente. Se o ácido já tiver sido aplicado em alguma cuba. afetando assim. Deixar o maior volume de fermento que puder.5. substancias do próprio metabolismo. adicionar soda até pH 3. necessários à manutenção da vida. é gerar uma forma de energia química (ATP) que será empregada na realização dos diversos trabalhos fisiológicos (absorção. e na cuba temos agitação. nas cubas. minerais. A fermentação alcoólica (glicólise anaeróbica) ocorre no citoplasma. Tais enzimas sofrem ações de diversos fatores (nutrientes. inibidores.doc 47 6/7/2011 . isto é. O objetivo primordial da levedura ao metabolizar anaerobicamente o açúcar. enquanto que a oxidação total de açúcar (respiração) se dá na mitocôndria. A célula de levedura possui compartimentações para adequação de sua atividade metabólica. gerando mais ATP e biomassa. alguns que estimulam outros que reprimem a ação enzimática. É mais fácil de iniciar a fermentação se o fermento estiver na cuba. com maior eficiência na produção de etanol. O etanol e o gás carbônicos resultantes se constituem em produtos de excreção. o desempenho do processo.). sendo o etanol apenas e tão somente um subproduto desse processo. . Na dorna.0. etc. etc. a oxigenação permite uma maior multiplicação da levedura. motivo pelo qual.haja mosto para reiniciar a fermentação novamente. Se o homem pretende beneficiar-se dessa habilidade metabólica. vitamina. para depois "arrear" o fermento na dorna. ele deve buscar os conhecimentos que lhe permitam propiciar as leveduras. crescimento e multiplicação. condições ideais para que as mesmas trabalhem a seu favor. cada qual catalisada por uma enzima específica. O fermento assim tratado agüentará muitos dias.) e biossínteses. A transformação do açúcar (glicose) até resultar em etanol e gás carbônico envolve 12 reações em seqüência ordenada. Em termos energéticos a respiração é muito mais eficiente (produção de ATP) do que a fermentação.

A fermentação alcoólica é um processo não oxidativo. Tipo de levedura influencia na produção de glicerol. na medida em que esta é uma característica genética. Forma-se na mesma via de síntese do etanol. portanto. Dados de laboratório demonstram que incrementos no teor de K+ de 1. A espécie Debaryomyces hansenii.doc 48 6/7/2011 .000 mg/litro de potássio aumentando em 10 vezes o glicerol formado. Glicerol O glicerol é o composto secundário formado em maior quantidade. da pressão osmótica do meio. e. motivo pela qual sua produção é inversamente a do etanol. reduzindo a produção de etanol. causando queda na eficiência fermentativa. O glicerol é considerado um metabólito osmorregulador. que têm comportamentos muito parecidos. É ele.) bem como para a formação de outros produtos de interesse metabólico relacionados direta ou indiretamente com a adaptação e sobrevivência.000 mg/litro aumentam significativamente a produção de glicerol. na seqüência de reações de produção de ATP. competindo com este pela utilização do poder redutor (NADH). rotas metabólicas alternativas aparecem para propiciar a formação de materiais necessários à produção de biomassa (polissacarídeos. desviam de 3 a 8% do açúcar para formar glicerol. sem a participação do oxigênio molecular (O2). para se manter o equilíbrio de redox celular. proteínas. pois sua formação é aumentada em meios com baixa atividade de água (alta pressão osmótica) determinada pela presença de solutos tais como açúcar ou sais. e a literatura descreve valores de 56. por exemplo.Durante a fermentação. todo NADH formado (em reações de oxidação) deve ser consumido (em reações de redução) estas acopladas à produção de etanol e glicerol. A quantidade de açúcar desviado para a formação de glicerol varia até mesmo em nível de linhagens.0. intrínsecas à formação de etanol. ácidos nucléicos.000 para 10. da formação de ácidos orgânicos (succínico e acético) e do crescimento da levedura. uma quantidade muito grande se comparada a algumas linhagens industriais (leveduras que aparecem e persistem no processo). acumula o glicerol que produz. Fermentacaoalcoolica v2. como um desvio. A formação de glicerol é função do tipo de levedura. que conjuntamente com a biomassa são quantitativamente os principais subprodutos metabolicamente relacionados ao equilíbrio do redox celular em anaerobiose. De maneira que as leveduras Fleischmann e TA. o glicerol. enquanto que a Saccharomyces cerevisiae o excreta. os quais desviam esqueletos carbônicos provenientes do açúcar. etc. os ácidos orgânicos (principalmente o succínico e o acético).

produz 5 NADH. parte do glicerol formado está acoplada à manutenção do equilíbrio de redox intracelular. tem-se que 4g de glicerol serão produzidos para cada grama de ácido succínico formado. que é feito através da produção de glicerol. Como a biossíntese do glicerol utiliza o poder redutor (NADH). a levedura é capaz de sintetizá-lo. Fermentacaoalcoolica v2. que foi acompanhada por alta contaminação bacteriana. Como a produção de um mol de glicerol consome um mol de NADH. quando 60% do total são produzidos. Observa-se que para formação de um mol de ácido acético ocorre a produção de dois moles de NADH. a produção do mesmo é aumentada quando há excesso de NADH na célula. causou drástica redução da formação de ácido succínico. quando a mitocôndria está reprimida em anaerobiose. Este poder redutor (analogamente ao descrito para o ácido succínico) é utilizado para a formação de dois moles de glicerol necessários à manutenção do equilíbrio de redox. é necessário o consumo desse poder redutor. Ácido acético O ácido acético aparece na fermentação por ação principal do metabolismo bacteriano. Observa-se que para a formação de um mol de succinato. No entanto.Em nível bioquímico.0. Isto ocorre quando processos oxidativos se desenvolvem. há conseqüente formação de cinco moles de NADH (poder redutor). Convertendo-se os valores molares em gramas. oxidativo. A produção de ácido succínico ocorre em maior velocidade que a do etanol até a 1ª hora de fermentação. cinco moles de glicerol serão produzidos quando ocorrer a formação de um mol de succinato. Para se estabelecer o equilíbrio de redox da célula.doc 49 6/7/2011 . A formação de ácido succínico é pouco variável de acordo com as condições do ambiente fermentativo. As razões fisiológicas que levam a levedura a produzir e excretar o ácido succínico (depois do glicerol é o produto secundário mais abundante na fermentação) ainda é discutível. processo este. sejam decorrentes da produção de biomassa (crescimento) ou formação de ácidos orgânicos (succínico e acético). correspondendo a um processo oxidativo. Sua formação ocorre pela atividade residual de enzimas respiratórias. que como visto. Ácido succínico Este é o principal ácido produzido pela levedura. mas quando um inibidor de crescimento. o ácido benzóico foi adicionado em meio fermentativo.

7 – 1. Tais carboidratos sofrem oscilações em seus teores durante a fermentação. trealose e glicogênio. supõe-se seja de 1:1. Biomassa Havendo incrementos de leveduras (crescimento). que. portanto com produção de NADH (0.6 gramas de glicerol por cada grama de biomassa seca. Nos primeiros 30 minutos de fermentação ocorre intensa degradação da Fermentacaoalcoolica v2.6.para rendimento entre 90 – 95%: etanol= 45 – 49. sem considerar o açúcar integrando os constituintes celulares. Carboidratos de reserva Os carboidratos de reserva. o poder redutor gerado será utilizado na formação de glicerol para manter o equilíbrio de redox. 3 gramas de glicerol devem ser formados.6 gramas de açúcar por cada grama de biomassa seca produzida. totalizando 1.0. mas o que parece chegar mais próximo da realidade seria de 0. com dados médios obtidos no laboratório. calculando o açúcar desviado da síntese de etanol. tem-se que para cada grama de ácido acético produzido. ácido succínico= 0. podem representar parte significativa da composição da levedura (até 30% da matéria seca). Os dados abaixo mostram a proporção dos diversos produtos da fermentação alcoólica (em gramas/100 gramas de glicose metabolizada). O valor exato que correlaciona glicerol para manter o equilíbrio de redox. para a formação de tais produtos secundários da fermentação.4. O crescimento é um processo oxidativo. glicerol= 2 – 5.2 – 0.7. sendo em parte responsáveis pelas oscilações no rendimento fermentativo de um ciclo para outro.5. ácido acético= 0 – 1. pode-se estabelecer uma estequiometria da fermentação.doc 50 6/7/2011 . para formação de aminoácidos que irão compor as proteínas. encampando os carboidratos de reserva. biomassa (massa seca)= 0. O valor exato que correlaciona glicerol com biomassa ainda não está definido na literatura.Convertendo-se em gramas. . Estequiometria da fermentação Com base nas relações molares descritas anteriormente.6. podendo terminar o processo com teores diferentes (maiores ou menores) daqueles do início. Consequentemente.5 – 1. butileno glicol= 0. inclusive a biomassa. óleo fúsel= 0. trealose e glicogênio.2 – 0. gás carbônico= 43 – 47. ocorre desvio de esqueletos carbônicos através do piruvato.6 moles de NADH por 100 gramas de matéria seca de levedura).

Terminada a fermentação. exerce uma influência na atividade de água do citossol contribuindo para desaceleração do metabolismo (latência). havendo uma correlação direta entre os teores do carboidrato e a resistência ao estresse térmico. a levedura encontra-se exposta continuamente a um conjunto de situações estressantes. A trealose. o teor de trealose pode suplantar o teor inicial. Por exemplo. Enquanto a levedura é capaz de manter seus níveis de trealose. tais reservas podem ser metabolizadas produzindo mais etanol e consequentemente enriquecendo a levedura com nitrogênio. seja pela tradição de seu uso. como as leveduras Fermentacaoalcoolica v2. um dissacarídeo constituído por duas moléculas de glicose é de uma importância tecnológica relevante. como Saccharomyces cerevisiae.0. Sua presença no citoplasma. sendo que no final da fermentação. é desencadeado por “flashes” do agente. responsável pela manutenção das células vegetativas e esporos viáveis. Muitas dessas situações constituem os fatores físico-químicos e microbiológicos que afetam o desempenho fermentativo como um todo. onde é acumulada. pois além da função básica de carboidrato de reserva. quando a levedura é então induzida a acumular trealose.doc 51 6/7/2011 . tornando-se menos vulnerável. mas na 1ª hora a ressíntese torna-se evidente. ou seja. a trealose na membrana (nos dois lados da camada fosfolipídica) substitui as moléculas de água. que o desenvolvimento de resistência a agentes estressantes permitido pelo acúmulo de trealose como divulgado pela literatura. Em condições de baixa atividade de água. Numa fermentação industrial. É interessante ressaltar. que de acordo com a intensidade pode acarretar a exaustão do seu conteúdo de trealose acompanhada pela queda da viabilidade. a viabilidade é mantida. A função protetora da trealose é resultado da inter-relação entre sua localização e mobilização na célula. o choque térmico desencadeia a termotolerância. aumentando a resistência ao estresse hídrico. É uma prática muito freqüente nas destilarias se iniciar o processo fermentativo com uma determinada levedura. um período curto de exposição. exerce uma função protetora contra estresses.trealose. Tais alterações são de grande significado na remoção de parte da levedura do processo para produção de ração. pela facilidade de obtenção em grandes quantidades. mantendo a integridade da membrana. Espécie de levedura O desempenho do processo fermentativo é enormemente afetado pelo tipo de levedura que o desenvolve.

pois que as características macromorfológicas de colônias bem como os aspectos das células ao microscópio nem sempre fornecem dados seguros para se discriminar diferentes linhagens de leveduras.de panificação. acrescidos o fato de que uma mesma linhagem pode apresentar alterações morfológicas das colônias e das células em função das condições do meio. que já foi utilizada na tipificação de leveduras nas indústrias de vinho e cerveja. Tem sido documentado que no processo industrial leveduras contaminantes de diferentes origens (do campo. mas o tempo exigido inviabiliza tal procedimento para uma rápida identificação de leveduras.). da cana. das próprias instalações industriais) se instalam na dorna e acabam competindo com as leveduras tradicionalmente empregadas.doc 52 6/7/2011 . Neste particular a contaminação com Candida krusei tem sido detectada especialmente quando ocorrem condições de aerobiose suficiente para o crescimento desta espécie. tem se mostrado como uma excelente ferramenta na diferenciação de gêneros. Fermentacaoalcoolica v2. espécies. que acarreta grande proporção de espuma com queda do rendimento e aumento do tempo da fermentação. Tal técnica. foi adaptada para as necessidades da indústria alcooleira e nos permitiu acompanhar a permanência das leveduras tradicionais ao longo de várias safras.0. contidas no núcleo da levedura e primordialmente relacionadas com suas características genéticas). Em algumas ocasiões e especificamente quando ocorrem sérios problemas na condução da fermentação industrial. Os testes de assimilação e fermentação de diferentes carboidratos se mostram de grande valia. ou seja. pelo fato da mesma ser obtida através de melhoramento genético para se melhor adequar às necessidades do processo industrial. tais leveduras contaminantes foram identificadas (inclusive pelas técnicas clássicas mencionadas anteriormente) e responsabilizadas por tais transtornos (baixo rendimento. Identificação de leveduras pela técnica da cariotipagem A permanência das leveduras tradicionais ao longo da safra nunca pôde ser sistematicamente avaliada devido à falta de um procedimento analítico confiável. A técnica da cariotipagem. bem como de diferentes linhagens de uma mesma espécie. baseada na separação eletroforética do DNA cromossômico intacto (moléculas que se diferenciam tanto em número como em tamanho. floculação. excesso de espuma. etc. do mel.

crescimento em biomassa. Seleção de linhagens para fermentação industrial Leveduras dominantes e persistentes no processo industrial foram identificadas e isoladas com o auxílio da técnica de cariotipagem. como também de uma linhagem de Saccharomyces não floculante oriunda do Canadá. tais como. As leveduras substituintes. Foram selecionas aquelas com características fermentativas desejáveis e que igualmente se apresentaram com maior tolerância aos fatores estressantes testados. conquanto se mostre altamente competitivas no ambiente da dorna. viabilidade durante reciclos. podem tanto congregar um grande número de diferentes Saccharomyces que se alternam durante a safra. Algumas dessas leveduras foram reintroduzidas no processo industrial. ao mesmo tempo em que se avaliaram os diversos parâmetros da fermentação. salinidade. monitorada a sua permanência ao longo da safra. Tais resultados sugerem que as leveduras contaminantes com características de dominância (representando porção significativa da biomassa da dorna) e persistência (capacidade da levedura de sobreviver as condições estressantes da fermentação industrial) reúnem importantes atributos para uma leveduras alcoólica industrial.doc 53 6/7/2011 . dependendo da destilaria e das condições do processo. sulfito. conhecida até então por “fase de adaptação” da levedura. Itaiquara. Demonstrou-se ainda que as leveduras tradicionais sejam substituídas por linhagens contaminantes. altas temperaturas e contaminação bacteriana). Os resultados obtidos ao longo de 4 safras demonstram que tais leveduras não permanecem no processo por mais do que 30 – 40 dias. Tais leveduras foram avaliadas.Permanência de leveduras tradicionais no processo fermentativo A técnica da cariotipagem possibilitou acompanhar a permanência. contaminação bacteriana e conteúdo de trealose) e tolerância a alguns agentes estressantes (etanol. em escala laboratorial confrontando-as com as tradicionais quanto as suas habilidades fermentativas (rendimento de fermentação. IZ-1904. pode ser considerada uma fase de substituição. não só de leveduras tradicionalmente empregadas pela indústria. Fermentacaoalcoolica v2. ou serem representadas por um pequeno número de leveduras com dominância e persistência no processo industrial. sendo que em algumas ocasiões tais leveduras desaparecem por completo em até 15 dias. formação de glicerol. e que a queda da viabilidade na indústria durante o início de safra. Fleischmann. osmolaridade.0.

como ativador ou estabilizador da função enzimática (K. polifosfatos e outros materiais coloidais. NH4. Para tornar a situação mais complexa. se o mosto empregado na indústria. ácidos húmicos. Assim o mineral pode funcionar como o centro catalítico de uma enzima (conforme o Zn. Deficiências ou concentrações de tais minerais. Mg). Ca. apresentar o produto final de uma reação catalizada por uma metalo-enzima. sequestrantes e absorventes os quais reduzem a concentração efetiva de espécies iônicas. Mg e Zn neutralizando cargas negativas do DNA. Embora se possam postular concentrações ótimas para cada elemento. As necessidades de N. existe uma vasta gama de interações entre os nutrientes minerais resultando que tal concentração ótima é altamente dependente da concentração de outros minerais no meio. Co e Cu). complexam diversos Fermentacaoalcoolica v2. membranas fosfolipídicas e fosfomananas da parede celular).doc 54 6/7/2011 . RNA. proteínas. P e S são as mais facilmente justificáveis por integrarem constituintes celulares tanto estruturais quanto metabolicamente ativos. tornando desnecessária a síntese dos mesmos. e ainda do ponto de vista estrutural. bases nitrogenadas e outros compostos orgânicos e que são utilizados pela levedura. ou seja. minerais de argila. alguns íons atuam como antagônicos minimizando efeitos inibitórios de outras espécies iônicas e por outras inter-relações metabólicas que determinam à quantidade absorvida do íon e os efeitos conseqüentes. um desequilíbrio entre os nutrientes minerais. provoca alterações metabólicas significativas. polifenóis. pode-se considerar que a necessidade de um elemento qualquer pode ser diminuída. geralmente complexo. Já os íons minerais estão predominantemente implicados na atividade enzimática.0.Nutrição mineral da levedura As leveduras exigem diversos íons inorgânicos (minerais) em concentrações tanto micro como milimolar para manifestarem ótimos crescimento e rendimento fermentativo. De todos os elementos encontrados na levedura apenas alguns são considerados essenciais sendo que muitos deles aparecem fortuitamente dependendo da composição do meio no qual a levedura cresceu. Por outro lado. Mn. proteínas. aminoácidos. Igualmente. atuando como neutralizador de forças eletrostáticas em diversas unidades celulares aniônicas (K. Assim. ácidos orgânicos. ácido fítico. como mantenedor de um controle fisiológico (pela ação antagônica exercida entre íons). os mostos empregados na indústria podem conter agentes quelantes. Isso ocorre quando o mosto apresenta aminoácidos.

potássio e H2PO4. Nestas condições. Estimula a absorção de H2PO4. O potássio é necessário ao crescimento e à fermentação e sua absorção é facilitada pela absorção da glicose.são interrelacionadas. Os elementos minerais que afetam negativamente a levedura podem ser classificados como elementos tóxicos. Resulta dessas observações que as concentrações ótimas de Magnésio. pode-se assumir a necessidade de uma levedura industrial que seja tolerante às altas concentrações salinas. Inibe absorção de aminoácidos em concentração de 1mM e inibe o crescimento em concentrações de 25 mM. A necessidade desse nutriente para a célula gira ao redor de 700 ppm. de cátions bivalentes (Zn e Co).incrementando a fermentação. Mantém integridade da membrana plasmática em condições adversas. Fermentacaoalcoolica v2.doc 55 6/7/2011 .íons com diferentes afinidades. com mostos à base de melaço. Principais nutrientes e suas funções Potássio Ativador enzimático inclusive de reações da glicólise.0. a levedura encontra-se exposta às concentrações de K+ que podem atingir 6. Estabilizador de membranas. Mantém a integridade e permeabilidade das membranas e regula o transporte de cátions bivalentes. Participa da absorção. Por outro lado a absorção de nitrogênio é proporcional à concentração de fosfato. Sofre ação antagônica do cálcio.000 ppm. Cálcio Parece não ser importante para fermentações e multiplicação. mas na prática. Magnésio Ativador enzimático no processo glicolítico de transferases e carboxilases. controlando o pH intracelular. inclusive H-. por troca. Aumenta a tolerância para íons tóxicos. mas se mostra inibidor a 10mM. como é o caso do alumínio. Na deficiência de potássio o H2PO4-não é absorvido e a absorção de magnésio é dependente do fosfato. Ativa ATPase em concentração 1mM. Necessário para a absorção do H2PO4-.

Requerido para multiplicação na concentração de 1 a 3 μ M. purinas. aldolases e desulfidrases. enzimas. Não é substituído por nenhum outro íon em suas funções. constituindo as moléculas de aminoácidos. Molibidenio. Nitrogênio O teor de nitrogênio na levedura está ao redor de 8% (com base na matéria seca). etc. Na concentração de 7 μ M estimula os efeitos do zinco. porém nas leveduras da fermentação alcoólica este teor é mais baixo (5 – 6%). É integrante de desidrogenases. A absorção é reduzida. proteínas. piridimidimas.5 μ M estimula fermentação e crescimento. Fermentacaoalcoolica v2. Concentrações de 10 a 15 μ M inibem crescimento e fermentação. ácidos nucléicos. já em concentrações de 10 μ M inibe o crescimento. Aumenta o teor de desidrogenase alcoólica.Zinco Participa da glicólise e da síntese de vitaminas. Cobre Integrante de algumas enzimas.doc 56 6/7/2011 . Cobalto e Boro Estimulam crescimento e fermentação em baixas concentrações (1 μ M). Manganês Estimula a síntese de proteínas e tiamina. cefalinas. em pH abaixo de 5 e é efetuada mediante troca com 2 íons Potássio. Em concentrações de 1 a 1. vitaminas. Ferro Participa do sítio ativo de diversas enzimas (hemoenzimas).0. pigmentos respiratórios (citocromos). Inibição com concentrações acima de 5 μ M. lecitina. sendo essencial ao crescimento e a fermentação. O nitrogênio se mostra essencial não apenas para o crescimento como para uma fermentação adequada.

mas nitidamente é menor na presença de sulfato de amônio. participa ativamente nos processos de transformação e transferência de energia química (glicólise. e a % de levedo no vinho estão diretamente relacionados com a concentração de (NH4+). A permease geral de aminoácidos garante a absorção dos mesmos na ausência de íons amônio. O fósforo é.A levedura é capaz de utilizar uma ampla gama de compostos nitrogenados tais como aminoácidos. pois em detrimento da produção de etanol. O fosfato absorvido. com temperatura controlada e sem perdas na centrífuga. Esta forma de nitrogênio na cana é intermediária. pois o nitrato (NO3-) absorvido do solo pela planta. da levedura. o teor ideal encontra-se entre 40 e 70 ppm de (NH4+) por litro de mosto. que inibem tal transporte. contra um gradiente de concentração se necessário. é reduzido a N amoniacal e este transformado em aminoácidos. o que pode ser desejável. ou seja. bases nitrogenadas.5. proteínas. utilizando-se de vários sistemas de transporte para as diferentes fontes. baixo brotamento e baixo rendimento fermentativo. A levedura absorve o fósforo na forma do íon H2PO4-.doc 57 6/7/2011 . uréia e amônio. O nitrogênio na forma amoniacal (NH4+) é encontrado no mosto proveniente do caldo da cana e o brotamento. Teores abaixo de 40 ppm ocasionam fermentação lente. As outras formas iônicas não são absorvidas. Fósforo O fósforo além de integrar as moléculas informacionais – DNA e RNA. a levedura acumula trealose. forma predominante no pH=4. uma vez que certos aminoácidos são precursores dos álcoois superiores. biossíntese. A absorção de amônio (NH4+) ocorre à custa da saída de íons H+. entra naturalmente na célula entra naturalmente na célula quando os teores no meio são altos. na taxa de multiplicação. Destilarias com (NH4+) maior de 70 ppm no mosto. estruturais – membranas fosfolipídicas.0. é o pH do meio exterior. ácidos nucléicos e demais compostos nitrogenados. que pouco é afetado quando se utiliza uréia. com gasto de energia e acidificação do meio externo. A uréia pode ser absorvida por difusão facilitada. fermentação. Existe correlação positiva entre o teor de fósforo da levedura e o rendimento da fermentação. Fato que distingue a uréia e o amônio como fonte nitrogenada e decorrente do modo de absorção. apresentam problemas com excesso de levedura na dorna. sem ser acionado o sistema dependente de energia. respiração. portanto necessário a multiplicação do fermento bem como à fermentação. etc.). pode participar de imediato nas fosforilações ou ser Fermentacaoalcoolica v2.

Entretanto tais aspectos “benéficos” Fermentacaoalcoolica v2. sendo que glucose e nitrogênio assimilável devem estar presentes no meio. o cobre e o manganês. O alumínio bloqueia o crescimento do fermento e a formação de trealose. Em conseqüência se observa aumento na eficiência fermentativa e diminuição na formação de glicerol. se o pH for acima de 6. Ésteres fosfóricos orgânicos também podem se constituir em fonte de P. já a partir de 10 ppm acarreta efeito estressante sobre a levedura em mosto de caldo e xarope. faz precipitar o fósforo. assim como o zinco. durante o tratamento do caldo. Os íons fosfatos são mais intensamente absorvidos em presença do íon K+ do que de Na+. Inibidores da fermentação Muitos minerais às vezes encontrados no meio se mostram deletérios à multiplicação e à fermentação. Enxofre O sulfato é uma fonte de enxofre para a levedura e a absorção do mesmo requer gasto de energia.doc 58 6/7/2011 . Tais efeitos tóxicos podem ser minimizados pela presença de agentes precipitantes e complexantes nos mostos industriais. quer inibindo enzimas quer alterando a permeabilidade de membranas. reduzindo a velocidade de fermentação. parece fornecer quantidade suficiente do elemento para fermentação. Concentrações de 2 μ M diminuem o crescimento. O excesso de cal.0. principalmente de melaço.armazenado como metafosfatos em elevadas concentrações. Sulfito e o tiossulfato podem substituir o sulfato. O enxofre utilizado na sulfitação bem como o oriundo do ácido sulfúrico empregado no tratamento ácido do fermento. visto que a quantidade de enxofre necessária é relativamente baixa. mas os aminoácidos cisteína e cistina não se constituem em fonte de S para a levedura.0. após a ação da fosfatase localizada na parede celular. Mas frequentemente o que ocorre quando se usa melaço sulfitado na fermentação é o efeito tóxico do sulfito. Análises de mostos industriais demonstram a existência de quantidades tóxicas de alumínio o qual. Porém a precipitação é significativa. Em algumas ocasiões o sulfato origina SO2 e H2S. Alumínio Tóxico ao nível das membranas. liberando fosfato que é absorvido.

quanto menor o pH do meio. Já o mosto quente. aumento do tempo de fermentação e diminuição da viabilidade quando se moeu uma cana que não havia sido calcareada e adubada. aminoácidos. O mosto sulfitado pode comprometer seriamente o desenvolvimento da fermentação alcoólica.) Sulfito A sulfitação do caldo de cana como clarificante resulta em melaços com teores de sulfito (SO2) que podem atingir 1. comprometendo a eficiência fermentativa. pode acarretar um Fermentacaoalcoolica v2. e irá aumentar a acidez do álcool. favorecendo assim a fermentação. Porém. a acidificação equivalente à presença do alumínio. acima de 30ºC. aliás. Além disso. quando se emprega mostos à base de melaço. foi detectado abaixamento no rendimento. a fermentação não desenvolve devido ao choque térmico. O sulfito faz a levedura produzir mais aldeído acético. os efeitos tóxicos do Al são atenuados ou quase desaparecem muito possivelmente pela presença de maiores teores de substancias complexantes (ácidos orgânicos. propicia maior formação de glicerol. com incrementos nos teores alcoólicos. que na coluna A. sem. o que é resolvido alimentando-se a dorna com mosto mais quente. etc. Entretanto. contudo comprometer o processo fermentativo.000 ppm.0.doc 59 6/7/2011 . Em condições industriais. Temperatura Na indústria.observados nos primeiros ciclos fermentativos desaparecem com a queda na viabilidade do fermento nos ciclos subseqüentes. devido à sua ação no metabolismo da levedura. onde é menos tolerante ao alumínio. causou discretas reduções nos teores de trealose e na viabilidade. não permitindo beneficiar-se dos efeitos aparentemente benéficos. Existem cepas de leveduras com menor capacidade de armazenar trealose. resultando apenas em benefícios à fermentação. fornecendo mostos com até 300 ppm de SO2/litro. como reduções do crescimento e da formação de glicerol. em uma destilaria. com o aquecimento se oxida a ácido acético. e é tanto mais tóxico. Por outro lado. Uma outra solução é cortar uma dorna em fermentação para dorna problema até que a referida dorna reaja. quando a contaminação é alta. demonstram de maneira inequívoca os efeitos deletério de tal elemento. a temperatura do mosto é um fator crítico no processo fermentativo. as quedas acentuadas na viabilidade e nos teores de trealose do fermento quando em presença do alumínio. Se a temperatura for baixa (menor que 26 – 27ºC). O teor de Al chegou a 150 ppm nestes dias críticos. depois abaixou para 30 ppm e o problema desapareceu. pode-se até apontar um efeito benéfico do sulfito. Concluindo. reduzindo a infecção.

pode ser mascarada. Portanto. até 40ºC. A própria fermentação de 1 kg de açúcar (ART) pela levedura para produzir álcool. se a temperatura do mosto for acima de 30ºC.5 com uma boa capacidade tamponante. o número de bactérias aumentará proporcionalmente com o aumento da temperatura. taxa de fermentação e formação de subprodutos. Assim. mas as leveduras mantém sua homeostase Fermentacaoalcoolica v2. quando há aumento no rendimento.5 a 5. Entretanto tais “aspectos benéficos” são à custa da biomassa (incluindo trealose) que está sendo consumida. leva a produção de 160 Kcal. Entretanto com o aumento da temperatura a levedura se torna mais vulnerável a toxidez exercida pelo etanol produzido.doc 60 6/7/2011 . Os ácidos graxos saturados conferem rigidez. as leveduras podem aumentar as proporções de ácidos graxos saturados. bem como o comprimento de suas cadeias. diminuição do crescimento e da formação de glicerol. Alguns efeitos podem ser atribuídos às alterações na composição da membrana a fim de preservar a integridade das mesmas. As leveduras de destilaria crescem bem em temperatura de 30 – 33ºC e as fermentações podem ocorrer com altas velocidades em temperatura até mais elevadas. Um fator extremamente importante. principalmente entre 30 – 40ºC.0. pH O pH é um fator significativo para as fermentações industriais devido à sua importância tanto no controle de algumas bactérias contaminantes quanto ao seu efeito sobre o crescimento da levedura. especialmente quando se desconsidera outros parâmetros na fermentação. porém não tem sido apontada pela literatura como o único fator determinante na aquisição de termotolerância. em temperatura mais elevadas os ácidos graxos saturados conferem à fluidez necessária à célula. Mas o mosto quente não é o único responsável pela elevação da temperatura. correlacionando positivamente com a temperatura do mosto é a contaminação bacteriana. por isso.superaquecimento nas dornas em fermentação. Os valores de pH dos mostos industriais geralmente encontram-se na faixa de 4. O efeito prejudicial da elevada temperatura. O papel da trealose como mantenedora da viabilidade também é notado em temperaturas elevadas. ocorrendo queda na viabilidade. enquanto que os insaturados fluidez às membranas. e com progredir dos ciclos fermentativos ocorrerá o desaparecimento da levedura no processo. propiciando um aumento da temperatura do vinho e consequentemente uma diminuição do rendimento.

de forma quase independente dos valores de pH do meio. via de regra.doc 61 6/7/2011 . A acidez muito elevada do vinho é devida à atividade bacteriana. pois além do efeito deletério sobre a levedura.0. Os mecanismos através dos quais as bactérias exercem efeito direto sobre as leveduras. mesmo com o aumento da contaminação bacteriana. de sorte que a fermentação industrial se inicia com pH muito baixo. há aumentos significativos na formação dos ácidos lático e às vezes de acético. As relações antagônicas são travadas pela produção de uma ampla gama de substancias tóxicas. propiciam maior contaminação bacteriana. como sendo também um produto da levedura. ele pode ser considerado um indicador mais preciso da contaminação. por isso toleram o tratamento ácido. o pH no final da fermentação se eleva acima de 4. são pouco conhecidos. Na indústria quando se utiliza muito melaço esgotado. O ácido acético. Onde há presença aumentada de bactérias. mesmo que a toxidez bacteriana seja exercida por componentes outros. pela presença de ácido lático. Fatores como as altas temperaturas são duplamente prejudiciais. Trabalhos efetuados em laboratório e os dados da indústria são coincidentes quanto ao prejuízo que a contaminação pode exercer no rendimento fermentativo. O tratamento ácido também provoca lixiviação de nutrientes tais como N. posto que em o mais freqüente agente estressante presente. compreendendo ácidos orgânicos. álcoois e até complexos compostos do metabolismo secundário. ou mesmo por serem capazes de controlar a contaminação num estado basal. A coexistência das leveduras com as bactérias láticas requer uma habilidade por parte das leveduras em resistirem ao ambiente proporcionado pelas bactérias. Fermentacaoalcoolica v2. Como o ácido lático é um produto bacteriano. P e K da levedura que acaba por elevar o pH. mais complexos que o referido ácido.0 e aumenta a floculação do fermento além de propiciar um aumento significativo na infecção. correspondendo ao pH da cuba de tratamento. pois reflete a atividade metabólica dessas bactérias. Contaminação bacteriana A contaminação bacteriana é um dos fatores preponderantes dentre aqueles que afetam a fermentação alcoólica. pode até ter sua formação diminuída.

ferro e alumínio. representadas pelas cinzas. não açúcares e inorganicos. glicose e frutose. sendo estes agrupados em açúcares orgânicos. em média é de 74. alguns componentes das cinzas são considerados importantes para o processo fermentativo. Os açúcares são representados pela sacarose. das propriedades físicas. para o aumento do teor de açúcar total. quando expressos em glicose ou açúcar invertido. cálcio.doc 62 6/7/2011 . é constituído de água (+/. magnésio. químicas e microbiológicas do solo. As substancias inorgânicas. definido como uma solução impura e diluída de sacarose. apresentam um teor de cerca de 15 – 16%. os açúcares redutores contribuem embora com uma pequena percentagem. sendo este a rigor. enxofre. pré-tratamento. 99% são devido aos elementos hidrogênio. gorduras. Os compostos orgânicos não açúcares são constituídos de substancias nitrogenadas (proteínas. tem um valor médio de 14%. da idade. etc.4%. A distribuição destes elementos no colmo. do estágio de maturação. a matéria-prima para a indústria do álcool. do tipo de cultivo. succínico. sódio. oxigênio e carbono.18%). como o componente mais importante.82%) e sólidos solúveis ou Brix (+/.MATÉRIAS-PRIMAS PARA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA Caldo: composição.5% em água. Para a fabricação de álcool. No entanto. como também a nutrição da levedura. além da presença de outras substancias indesejáveis ao processamento. ácidos (málico. aminoácidos. pectinas.5% de matéria mineral. As duas frações principais da cana-de-açúcar para processamento são a fibra e o caldo. Estes carboidratos que constituem o açúcar total. ceras. controle de qualidade Composição A composição química da cana-de-açúcar é muito variável em função das condições climáticas. dependendo do estado de maturação. A sacarose.) e de matérias corantes (clorofila. do estado sanitário. entre outros fatores. sacaretina e antocianina).). etc. aconítico. potássio. Fermentacaoalcoolica v2. O caldo. 25% de matéria orgânica e 0. Da sua composição. respectivamente para a frutose e glicose. glicose e frutose. tem como componentes principais: sílica. Os açúcares redutores – glicose e frutose – quando em teores elevados mostram um estágio pouco adiantado de maturação da cana. em nosso caso.2 a 0.0. em canas maduras. enquanto os demais. 0. da variedade. fósforo.

Pré-tratamento do caldo
Para uma boa evolução do processo de fermentação-destilação deve ser requerida da matéria-prima a ser processada, em nosso caso o caldo de cana, uma qualidade que não comprometa o desenvolvimento normal de uma fermentação e nem cause problemas na centrifugação do vinho ou na destilação. Para que isto aconteça, devem ser exigidos os seguintes requisitos no tratamento: - Eliminação de impurezas grosseiras (bagacilho, areia, etc.); - Máxima eliminação de partículas coloidais; - Preservação de nutrientes: vitaminas, açúcares, fosfatos, traços de metais, aminoácidos essenciais e, - Minimização de contaminantes microbianos.

Processos de tratamento
Todos os processos de tratamento que vamos referir estão esquematizados em anexo, sendo que as vantagens, desvantagens e comentários adicionais serão também citados. Não consideraremos em nenhum processo citado a hipótese da não retirada das impurezas grosseiras, (bagacilho, areia, etc.) como ocorre em algumas usinas, já que entendemos esta como uma condição primordial no tratamento do caldo para destilaria. Deve-se salientar que em todos os processos a serem ilustrados, na separação dessas impurezas, considerou-se a utilização de peneiras DSM.

Processo de tratamento do caldo para destilaria – 1
Conforme a Figura 1, este processo consiste basicamente em eliminar as partículas leves (bagacilhos) nas peneiras DSM e as partículas pesadas (areia, terra, etc.) nos hidrociclones. Neste caso, devido ao fato de não existir um choque térmico e, consequentemente, não havendo a degradação das proteínas, com certeza a formação de espuma será acentuada. Este problema deverá ser contornado com razoável adição de antiespumantes. Parece que a não eliminação de colóides poderá causar a adsorção dos mesmos na parede celular, provocando, ao longo do tempo, uma inibição na fermentação, além de favorecer também a formação de espuma.

Fermentacaoalcoolica v2.0.doc

63

6/7/2011

Nota-se que este tratamento atende apenas 2 dos 4 requisitos básicos do tratamento do caldo para destilaria; no entanto é o melhor processo no que se refere ao investimento inicial, ou seja, de baixo custo.

Processo de tratamento do caldo para destilaria – 2
Neste processo, Figura 2, além da retirada das partículas leves e pesadas, é realizado também uma pasteurização do caldo, ou seja, um aquecimento com posterior resfriamento. Através de alguns testes realizados notou-se que a contaminação bacteriana era a mesma antes do aquecimento e após o resfriamento. Isto implica que o tratamento térmico em si não resolve os problemas de contaminação. No entanto já ficou provado que com este tratamento a formação de espuma é minimizada. Para minimizar os problemas de infecção a tubulação deverá ter o mínimo número de flanges e outros pontos possíveis de acúmulo de resíduos, como também o resfriamento deverá ser instalado o mais próximo possível da fermentação. Este processo atende apenas os requisitos 1 e 3, com a vantagem em relação ao processo de tratamento 1, de diminuir a formação de espuma.

Processo de tratamento do caldo para destilaria – 3
Este processo, Fig 3, se diferencia do anterior, somente pela introdução do trocador de calor regenerativo. As vantagens deste processo em relação ao tratamento 2 é o menor consumo de vapor para aquecimento e menor consumo de água para resfriamento, além da necessidade de menor superfície global de transferência de calor (aquecimento e resfriamento). No entanto possui a desvantagem de ser enviado o caldo a 50ºC para destilaria, contra 100ºC do tratamento 2, já que a temperatura mínima para não se desenvolverem bactérias termófilas é da ordem de 80ºC, contribuindo para o acréscimo da infecção em relação ao tratamento 2.

Processo de tratamento do caldo para destilaria – 4
Este processo, conforme a Fig 4, é o que mais se aproxima do tratamento ideal de acordo com os cinco requisitos citados anteriormente, porém com a desvantagem de eliminar parte dos nutrientes (N e P) e micro nutrientes (Mg, Mn, Zn, na forma de sulfatos) presentes no caldo que são floculados pela ação da cal – polieletrólitos – calor. Cuidados especiais devem ser tomados no que se refere a dosagem de cal no caldo. O pH do caldo dosado deverá ser mantido na faixa de 6.3, pois o excesso de cal pode

Fermentacaoalcoolica v2.0.doc

64

6/7/2011

prejudicar o bom andamento da fermentação (o excesso de cal afeta o crescimento da cultura), além de causar incrustações na coluna de destilação e trocadores. A complementação de fósforo (na forma de P2O5) e adição de polieletrólitos também deve ser realizada neste caso.

Controle de qualidade do caldo
O controle de qualidade do caldo em qualquer dos processos apresentados é de fundamental importância para o bom andamento dos processos de fermentação/destilação. Os controles mínimos a serem adotados são: - análise de pH do caldo do primeiro terno; - controle de infecção na moenda e cush-cush, com lavagem com vapor ou água quente a cada 4 -5 horas; - adição de bactericida por choque e continuamente conforme a dosagem a ser determinada de acordo com o produto utilizado; - clarificação (quando existir) - controle de pH em torno de 6.3 pela adição do leite de cal 5ºBé - dosagem de polímeros na faixa de 1 a 3 ppm - controle de temperatura na entrada do balão de flash de 110ºC – 113ºC - análise de Brix, pol e ART do caldo

Mel final: composição, armazenamento e controle de qualidade.
Composição
Vários são os fatores que influem na composição do melaço ou mel final, destacandose entre eles a natureza da matéria-prima, a qualidade da cana processada, os métodos de fabricação, o sistema e o tempo de armazenamento e as regiões açucareiras. Segundo alguns autores, com tantas variáveis agindo individualmente ou conjuntamente, não há possibilidades de aplicação de números médios de aplicação geral que sejam comparáveis entre si. Mesmo considerando-se uma só variedade de cana e um só método de fabricação numa dada região, a composição do mel final varia com a época do ano e com o ano agrícola. Como ilustração da composição do mel final citaremos na tabela abaixo a média dos valores de Brix, Pol, sacarose, açúcares redutores e cinzas gravimétricas, obtidos em 4 épocas em 5 usinas diferentes, na região de Jaú, estado de São Paulo.

Fermentacaoalcoolica v2.0.doc

65

6/7/2011

Brix 1 2 3 4 média 90,85 91,42 91,53 89,66 90,87

Pol 39,30 36,01 38,79 37,54 37,91

Sacarose 39,87 38,59 39,27 38,72 39,11

AR 9,67 9,16 9,49 9,52 9,46

ART 51,5 49,7 50,7 51,1 50,8

Cinzas 8,04 8,31 7,96 7,83 8,04

Sabe-se que a composição do mel final das usinas é muito diferente da tabela acima no que se refere ao Brix, Pol e sacarose, devido ao esgotamento do mesmo. No entanto quanto aos AR e cinzas acredita-se que a diferença percentual não seja muito significativa.

Armazenamento
Devido a problemas de decomposição da sacarose e dos açúcares redutores do mel final durante o armazenamento por ação de fungos, leveduras e bactérias (dependendo da concentração e temperatura de armazenamento) e consequentemente desprendimento de gases inflamáveis, principalmente metano e hidrogênio, alguns critérios devem ser seguidos durante a armazenagem: - posicionamento do tanque no interior de uma bacia de contenção com volume igual ao volume armazenado, com altura do talude no máximo 1,8 mt - devido a possibilidade de formação de espuma e aumento da velocidade de degradação térmica dos açúcares em temperaturas acima de 45ºC, deverá ser instalada uma tubulação retornando do sistema de recalque ao topo do tanque, de forma a possibilitar a recirculação e conseqüente movimentação e resfriamento do mel.

Controle de qualidade
Para o perfeito conhecimento da matéria-prima empregada na fabricação do álcool, alguns controles de qualidade do mel são desejáveis. As principais análises rotineiras que podem ser empregadas são: Brix, ART, cinzas, SO2. A maior parte dos controles é na realidade feita após a mistura do mel com o caldo, no tanque de mosto. Estes controles são: nitrogênio amoniacal, P2O5, pH, acidez, Brix, temperatura, cinzas, contaminação bacteriana.

Fermentacaoalcoolica v2.0.doc

66

6/7/2011

1 – oculares 2 – tubo binocular 3 – parafuso de fixação 4 – revólver 5 – cabeçote 6 – estativo 7 – platina ou mesa 8 – condensador 9 – diafragma do condensador 10 – manipulador da lente do condensador 11 – parafuso de centralização do condensador 12 – porta filtro 13 – suporte para lente auxiliar 14 – controle de focalização macro e micro 15 – suporte para lâmpada 16 – diafragma de iluminação 17 – base Fermentacaoalcoolica v2. 1. por sua vez. 40X e 100X). Basicamente existem dois tipos de microscópio. os de campo claro. o qual é formado basicamente por dois conjuntos de lentes.CONTROLE MICROBIOLÓGICO – MICROSCOPIA Microscópio ótico Para se observar imagens ampliadas dezenas. amplia a imagem real do objeto que. que são os mais comuns e mais utilizados e os microscópios de campo escuro. é ampliada novamente pelo segundo conjunto. as objetivas (4X. ou centenas. de vezes recorre-se ao microscópio. 10X.0. leveduras) Consideram-se no microscópio as seguintes partes essenciais e que podem ser vistas na Fig. Microscopia de Campo Claro (usado em biologia: bactérias.doc 67 6/7/2011 . Um destes. as oculares (10 a 15X).

Campo escuro: usado para contraste Recomendações para uso do microscópio ótico Antes de iniciar o uso. Parte Óptica • • • • Sistema de iluminação. Mesa ou platina. Revólver ou mecanismo para câmbio da lente objetiva.doc 68 6/7/2011 . certificando-se de que está com a lamínula para cima. entre as garras do carrinho Ligar a iluminação do aparelho. Fermentacaoalcoolica v2. até Olhar pela ocular. Tubo ou canhão. utilizando o parafuso de ajuste grosseiro (macro). Lentes oculares. luz que emerge do orifício da platina (OLHANDO POR FORA). Mover o carrinho para aproximar o material montado na lâmina para o foco de Levantar a preparação.0. Levantar lentamente a platina com o parafuso de focalização grosseira até que para não bater com as objetivas na platina ou no carrinho. Condensador e diafragma.Parte mecânica • • • • • • Base ou pé. • • • • • • • Posicionar a objetiva de menor aumento no eixo óptico do aparelho cuidando Colocar a preparação microscópica sobre a platina. Estativo ou coluna. Lentes objetivas. (charriot). que a preparação fique bem próxima da lente objetiva (OLHANDO POR FORA). a imagem fique nítida no campo visual. Parafusos de focalização macro e micro..

que deve Desejando-se ampliação maior. percorrendo a área coberta pela lamínula. Observações: • • • Ao mudar de objetiva e trabalhando a seco. se então metodicamente esses objetos. Manutenção do equipamento Fermentacaoalcoolica v2. • • Assim. após focalizar a borda da lamínula. trazer a objetiva seguinte para o eixo óptico do aparelho. • • • Ajustar a imagem utilizando o parafuso de focalização precisa (micro). Proceder à nova regulagem do diafragma íris. quando o material é muito transparente. Ajuste da Dioptria • • Dioptria é a unidade de medida do poder refrativo de uma lente.• • Posicionar uma borda da lamínula ou algo que deva estar no mesmo nível de Com objetos muito transparentes. abrindo-o convenientemente. nunca passe a objetiva de imersão Mudança de objetiva e/ou de preparação exigem novo controle do diafragma.doc 69 6/7/2011 . dioptria (que existe apenas no encaixe da ocular esquerda) até obter foco também nesse olho. olhando apenas com o olho esquerdo. inicie com a objetiva de menor aumento. até conseguir uma boa nitidez de imagem. após conseguir-se boa nitidez da imagem com estar em posição alta. focalização diferente. procura- focalização do objeto. Para focalizar uma preparação. vira-se o anel de ajuste da olho direito. é conveniente proceder-se ao ajuste da dioptria quando se trabalha em um aparelho binocular. Este ajuste é Como freqüentemente os dois olhos de uma pessoa têm capacidade de necessário para uma melhor observação do campo visual.0. sobre a preparação microscópica. a objetiva de menor aumento e estando o objeto bem no centro do campo. movendo o parafuso de focalização precisa. de início focaliza-se nitidamente uma estrutura olhando apenas com o A seguir. Ajustar a iluminação regulando o diafragma íris do condensador. • • Focalizar. faixa por faixa.

Entretanto. Limpar as lentes do microscópio. até o momento não existe um método que forneça resultados totalmente seguros na determinação da viabilidade celular. No controle da viabilidade celular nos processos de produção de levedura (fermento prensado) e fermentação alcoólica. Cobrir para que não se empoeire ou guardar em lugar fechado e seco. Para estimar a proporção de células viáveis em uma cultura ou processo fermentativo. Fermentacaoalcoolica v2. 2). Devem ser contadas entre 300 a 500 células por câmara. Não desmontar as oculares. JAMAIS O ARRASTE! trabalhar comodamente. a diluição da amostra deve ser tal que não se tenha mais que 1250 células por câmara.0.• • • • • • • • • Conservar o microscópio sempre limpo. Não esfregue os dedos nas lentes. e.doc 70 6/7/2011 . a coloração das células da levedura com azul de metileno ou eritrosina e o cultivo por plaqueamento são os mais empregados. Na determinação da viabilidade através do uso de eritrosina a porcentagem ou o número de células viáveis/ml é determinado transferindo-se uma amostra já colorida para a câmara de Neubauer. Método de determinação da viabilidade celular de leveduras Não existe um método absoluto para determinação da viabilidade celular de uma população de células de levedura. Devido às facilidades e a rapidez da análise. Colocar com cuidado o microscópio sobre a mesa em posição tal que possa Daí por diante não mais altere a posição do instrumento. nas indústrias de produção de álcool o emprego de eritrosina é o mais indicado. limpar a objetiva de imersão com álcool. Transportar segurando-o pelo estativo ou pelo corpo do microscópio. Para maior precisão da análise. não menos que 100 retículos da câmara (os retículos centrais de cada quadrículo) sejam contados. métodos baseados no plaqueamento ou na observação microscópica têm sido usados. o que é regulado pela diluição adequada da amostra. Nesta são contadas as células incolores e as coloridas de rosa (Fig. objetivas ou qualquer outra parte do aparelho. Após o uso. somente com papel apropriado. utilizando-se a objetiva de imersão (100x).

0025 mm2 Volume de líquido em cada retículo: 0.doc 71 6/7/2011 .1 mm3 Fermentacaoalcoolica v2.Fig. Fig.00025 mm3 Volume total da câmara: 0. Especificações da câmara de NEUBAUER • • • • • • • Profundidade: 0.0. 3: Preparo da câmara de Neubauer e imagem ao microscópio ótico de células não coradas e de células coradas com eritrosina.1 mm Número de quadrículos: 25 Número de retículos em cada quadrículo: 16 Número de retículos em cada câmara: 400 Área do retículo: 0. 2: Solução Eritrosina Uso da Câmara de Neubauer.

1 g de eritrosina. Dissolver em 250. Misturar as soluções A e B. Dissolver em 10..90 g de Na2HPO4 .89 g de NaH2PO4 .0. Transferir a solução para um frasco plástico e conservar sob refrigeração.0 ml de água destilada esterilizada.doc 72 6/7/2011 .0 ml de água destilada esterilizada (solução B). Preparo das soluções Solução estoque de Eritrosina • • • Pesar 0. Conservar a solução estoque em frasco âmbar fora do alcance da luz e em refrigerador.0 ml de água destilada esterilizada (solução A).Fig. Pesar 6. Observação: Fermentacaoalcoolica v2. Validade: 8 meses desde que armazenada protegida da luz e sob refrigeração. Validade: 8 meses desde que armazenada sob refrigeração. Tampão Fosfato • • • • • • Pesar 17. Dissolver em 250. 4: Esquema de uma Câmara de Neubauer.

Preparar a câmara de Neubauer. Homogeneizar em agitador para tubos. Solução de trabalho • • • • Misturar 0. Deixar em repouso durante 5 min. Homogeneizar em agitador para tubos.1 ml da solução estoque de eritrosina para cada 5. Transferir uma alíquota da amostra (3 .0 ml do tampão Preparar um volume da solução de trabalho o suficiente para uso durante uma Recomenda-se que uma porção dessa solução. suficiente para um dia de Caso ao final da jornada. não se utilizar todo o volume preparado. Adicionar papaína na amostra. proceder da seguinte maneira: • • • • • • • • • • • • Homogeneizar a amostra.5 ml) para um tubo de ensaio.Para o uso da solução tampão deve-se retirar o frasco do refrigerador e aguardar até que o mesmo atinja a temperatura ambiente.doc 73 6/7/2011 . Observação: Soluções que apresentem contaminações devem ser imediatamente descartadas. Diluir a amostra com água destilada (a diluição é realizada para que o número Transferir 1 ml da amostra diluída para outro tubo de ensaio. Fermentacaoalcoolica v2. seja transferida para um tubo de ensaio. Procedimento analítico Após a coleta da amostra de vinho bruto e/ou creme de levedura. Transferir 1 ml da solução de trabalho de eritrosina para o tubo de ensaio que Homogeneizar em agitador para tubos.0. lâmínula 24x24 mm área da câmara de Neubauer. o restante fosfato. deverá ser descartado para evitar contaminações. semana e conservá-la fora do alcance da luz. trabalho. cobrindo a superfície espelhada com uma Transferir um volume suficiente da solução (amostra + corante) para cobrir a de células seja adequado para a faixa de maior precisão da metodologia). contém 1 ml da amostra diluída.

Contar, utilizando a objetiva de imersão (100X), as células presentes nos

quatro retículos centrais dos 25 quadrículos; Observação: • A contagem utilizando a objetiva de imersão (100X) permite uma observação mais precisa das células da levedura quanto a sua estrutura celular.

Cálculos

Viabilidade celular
A viabilidade celular indica a porcentagem de células em atividade na população de leveduras da amostra considerada. Total de células viáveis % Cel. viáveis = -------------------------------x 100 Total cel. viáveis + não viáveis

Contagem de células em brotamento
Indica a porcentagem de leveduras em atividade que estão se multiplicando Total de cel. viáveis em brotamento % Brotamento = ------------------------------------------- x 100 Total de células viáveis

População de Leveduras
Total de cel. viáveis x 4000 População leved./ml = Onde: D = diluição final --------------------------------- ----- x 1000 x D Total de retículos contados

Fermentacaoalcoolica v2.0.doc

74

6/7/2011

Exercícios
Calcular a viabilidade celular, a porcentagem de brotamento e a população de leveduras: a) Total de células viáveis: 199 Total de células não viáveis: 27 Total de células em brotamento: 21 Diluição: 1:40

b) Total de células viáveis: 270 Total de células não viáveis: 60 Total de células em brotamento: 16 Diluição: 1:30

Método para contagem de bactérias ao microscópio ótico
Esta técnica é mais adequada para a contagem de bacilos (bastonetes), embora outros tipos de bactéria (cocos) possam ser contados, e para população bacteriana acima de 104/ml. Maior precisão e repetibilidade são conseguidas quando o número de bastonetes/ml da amostra está entre 106 e 107. A contagem direta ao microscópio tem, portanto sua maior aplicabilidade para quantificação de bastonetes em amostras de caldos primário e misto e vinho (em fermentação ou final de fermentação). Para caldo clarificado e mosto onde a população normalmente é inferior a 104 - 105 bast./ml, esta técnica apresenta menor precisão. Não recomendamos realizar contagem em levedo tratado.

Fermentacaoalcoolica v2.0.doc

75

6/7/2011

Nesta preparação as células viáveis aparecerão incolores enquanto as não viáveis estarão coloridas de azul (Fig. 6). Deve-se diluir conveniente a amostra para que não mais que 3 a 5 bastonetes sejam encontrados por campo do microscópio.

Fig. 5: Corante sulfato azul de Nilo + azul de metileno, para contagem de bactérias e preparação de uma lâmina.

Fermentacaoalcoolica v2.0.doc

76

6/7/2011

sulfato azul de nilo .0 g de sulfato azul de Nilo. Dissolver em 100. Observação: Fermentacaoalcoolica v2.azul de metileno .doc 77 6/7/2011 . Deixar em repouso durante 24 h.0 ml de água destilada esterilizada. Preparo das soluções Solução A . Solução B . 6: Lâmina preparada para a contagem e uma amostra de vinho com a presença de bastonetes corados e não corados.2 g de azul de metileno. Validade: 12 meses desde que armazenada em frasco fechado.0 ml de água destilada esterilizada.Fig.0. Dissolver em 100.0.0% • • Pesar 2.20% • • Pesar 0. Filtrar em papel de filtro. Solução de trabalho • • • Misturar partes iguais das soluções A e B.2.

Procedimento analítico Amostras de caldos. PCTS. Homogeneizar a amostra.0 L (lamínula de 20 x 20mm) ou 3.0 L (lamínula de 22 x 22mm) suspensão. • Realizar a contagem de bastonetes não corados presentes em 70 campos. Transferir 1 ml da solução corante para o tubo de ensaio que contém a amostra de células bacterianas seja adequado para a faixa de maior precisão da metodologia). tomando o cuidado para não formar Amostras de vinho bruto e levedo tratado • • • • • • • • • diluída. da amostra corada para uma lâmina de vidro (26x76 mm).0. amostra filtrada. Transferir 2. Filtrar a amostra em algodão para eliminar as impurezas sólidas em Transferir 1 ml de amostra filtrada para um tubo de ensaio. Adicionar papaína na amostra. Colocar uma lamínula sobre a preparação. Homogeneizar em agitador para tubos. Transferir uma alíquota da amostra (3 – 5 ml) para um tubo de ensaio. caso seja detectada contaminação a solução deve ser imediatamente descartada. Fermentacaoalcoolica v2. utilizando a objetiva de imersão (100x).Checar semanalmente a solução de trabalho para verificar a presença de microrganismos contaminantes. Homogeneizar em agitador para tubos. Deixar em repouso durante 5 min. uniformemente distribuídos em toda a área da lamínula. Diluir a amostra com água destilada (a diluição é realizada para que o número Transferir 1 ml da amostra diluída para outro tubo de ensaio. primário e misto • • • • • • • bolhas. Transferir 1 ml da solução corante para o tubo de ensaio que contém 1 ml da Homogeneizar em agitador para tubos. • Homogeneizar em agitador para tubos.doc 78 6/7/2011 . Homogeneizar a amostra.

• Transferir 2.004 24 x 24 Cálculos 1 População bastonetes/ml = FM x --------------------.0. Volume (ml) Lamínula (mm) 0.doc 79 6/7/2011 . tomando o cuidado para não formar Proceder a contagem de bastonetes não corados presentes em 50 campos. utilizando a objetiva para imersão (100x). amostra onde: FM = fator do microscópio M = média total de bastonetes não corados / número campos contados D = diluição final Exercícios a) Calcular a população de bastonetes/ml das amostras.• • bolhas. amostra = 0.0 L (lamínula de 20 x 20mm) ou 3.x M x D Vol.002 20 x 20 0. Observação: O volume de amostra transferida para a lâmina depende do tamanho da lamínula utilizada. Colocar uma lamínula sobre a preparação.0 L (lamínula de 22 x 22mm) da amostra corada para uma lâmina de vidro (26x76 mm).003 ml no de bastonetes contados = 3 Fermentacaoalcoolica v2. Caldo: no de campos contados = 70 diluição final = 1:2 FM = 15406.2 Vol. uniformemente distribuídos em toda a área da lamínula.003 22 x 22 0.

Preparo das soluções Solução de cristal violeta Solução A • Dissolver 2. Validade: 12 meses.8 g de oxalato de amônia em 80.2 Vol.0%.0.0 g de cristal violeta em 20. A coloração não deve ser executada rotineiramente.Vinho: no de campos contados = 50 diluição da amostra = 1:4 FM = 15406.003 ml no de bastonetes contados = 158 Teste de Gram A coloração de Gram é realizada para diferenciar microrganismos (Gram + e Gram -) tanto de suspensões líquidas como de colônias de cultivos sólidos.doc 80 6/7/2011 . amostra = 0.0 ml de álcool 95. Solução de trabalho • • Misturar as soluções A e B Filtrar. Fermentacaoalcoolica v2.0 ml de água destilada esterilizada. Solução B • Dissolver 0. mas quando forem detectados problemas de contaminação.

Solução de safranina Solução estoque • Dissolver 2. Aguardar a lâmina esfriar.0 ml.0 %.0. Validade: 12 meses. Solução de trabalho: • Diluir 10.doc 81 6/7/2011 . lâmina sobre chama baixa. Fermentacaoalcoolica v2.0 ml com água destilada esterilizada. através de aquecimento na chama de um bico de Bunsen. passando a Evitar que a lâmina aqueça demasiadamente. Espalhar a amostra sobre a lâmina. Aguardar secar o filme formado. Solução de iodo-lugol • Diluir 10 ml da solução de iodo-lugol (lugol forte) para 100.5 g de safranina em 100.0 ml da solução estoque para 100. com água destilada esterilizada. Proceder a coloração da preparação fixada. Procedimento analítico Para Microrganismos em Suspensão Líquida • • • • • • • Transferir uma alíquota da suspensão para uma lâmina (26x76mm) bem limpa. até formar um filme. utilizando uma alça de platina esterilizada. com a alça da platina. Validade: 12 meses. Fixar.0 ml de álcool 95.

até obter uma suspensão uniforme. Técnica de Coloração • • • • • • • • • • • Cobrir o filme fixado com algumas gotas da solução de cristal violeta. Aguardar 2 minutos. limpa e seca. Aguardar 1.doc 82 6/7/2011 . Cobrir o filme com solução de safranina.5 minuto. Espalhar a suspensão com a alça de platina até se formar um filme.Para Microrganismos de Cultivos Sólidos • • • • • • • • • Transferir uma gota de água destilada esterilizada para uma lâmina Remover uma pequena porção da colônia do microrganismo usando uma alça Transferir a amostra para a gotícula de água na lâmina. Descolorir com solução de álcool a 95% durante 30 a 60 segundos até que Lavar cuidadosamente com água fria. lavando a lâmina com água fria. evitando que a lâmina Aguardar a lâmina esfriar. Lavar cuidadosamente o excesso de corante com água fria. Fermentacaoalcoolica v2. Homogeneizar. Aguardar a preparação secar a temperatura ambiente. com a alça de platina. Aguardar 1 minuto. Remover cuidadosamente o excesso de corante com água fria. esta escorra da lâmina sem nenhuma coloração. Cobrir o filme com solução de iodo-iodeto de potássio (lugol). de platina esterilizada. à chama do bico de Bunsen. (26x76mm).0. Remover o corante. Proceder a coloração da preparação fixada. aqueça demasiadamente. Fixar por aquecimento.

0. ou secar cuidadosamente (sem esfregar)a lâmina entre duas folhas de papel absorvente (papel de filtro).doc 83 6/7/2011 . 7: Corantes utilizados e alguns procedimentos durante a realização da coloração de Gram. Fig. • Examinar ao microscópio utilizando a objetiva para imersão (100X). Interpretação As células de bactérias Gram positivas (+) se colorem de azul-violeta forte e aquelas Gram negativas (-) se colorem de vermelho (Fig 8). Fermentacaoalcoolica v2.• Aguardar a preparação secar à temperatura ambiente.

fazer em seguida a porcentagem de cada uma delas em relação ao total de bactérias contadas através da seguinte fórmula: Total de bactérias Gram (+) % Gram + = -----------------------------------------------x 100 Total de bactérias Gram(+) e Gram(-) Detecção de esporos Muitos gêneros de bactérias apresentam a capacidade de produzir certas formações ou corpos de parede espessa. 8: Exemplo de bactérias Gram positivas (+) e Gram negativas (-) Observações: • É indicado utilizar-se de cultivos de 18 a 24 horas para se obter melhores resultados. mesmo em condições adversas e/ou resistência ao aquecimento a temperaturas superiores a 100ºC. A natureza resistente de seus esporos lhes confere uma característica especial de sobrevivência por longos períodos de tempo. ação Em alguns casos as bactérias podem apresentar reação de Gram variável.Fig.0. pois as células jovens têm maior afinidade para os corantes do que as células velhas. • • Microrganismos que sofreram danos físicos na membrana (ação do calor. dependendo do seu estágio de desenvolvimento.. Quantificação Após realizar a contagem das bactérias Gram + e Gram . Estas formações são denominadas "endosporos" ou mais comumente "esporos". Fermentacaoalcoolica v2.doc 84 6/7/2011 . que nada mais são que estruturas altamente resistente. Isto é mais comum com as bactérias formadoras de esporos. química)podem apresentar resultados falsos. De modo geral todas as espécies dos gêneros Bacillus e Clostridium são capazes de produzir endosporos sendo algumas termófilas e a maioria mesófila.

Deixar a lâmina esfriar à temperatura ambiente. Os esporos aparecerão coloridos de verde e as células vegetativas coradas de vermelho (Fig. Completar o volume com água destilada esterilizada Validade: 12 meses. Transferir o corante para balão volumétrico de 100. Solução de safranina • • • Pesar 0. Aquecer a lâmina. com emissão de vapores por quatro vezes. dissolver com água destilada esterilizada.0%. Pesquisas mais recente (Fermentec) têm detectado a presença de bactérias em forma de bacilos esporulados em caldo clarificado (± 100ºC). Fixar a preparação. Cobrir a preparação com algumas gotas de solução de verde malaquita 5. 9). Fermentacaoalcoolica v2. Lavar o excesso de corante com água cuidadosamente.A presença de esporos nos caldos e outros materiais se revestem de grande importância para o processo fermentativo.0. Transferir para balão volumétrico de 100.0 g de verde malaquita. Preparo das soluções Solução de verde malaquita • • • Pesar 5.0 ml. os quais são capazes de utilizar glucose. após ativação dos mesmos.doc 85 6/7/2011 . produzindo por outro lado ácidos orgânicos (ácido láctico e. dependendo do meio onde estão suspensos. por aquecimento à chama do bico de Bunsen. sacarose e outros açúcares. Procedimento analítico • • • • • • • Preparar um esfregaço da cultura sobre uma lâmina de vidro (26x76mm). outros). Completar o volume com água destilada esterilizada. É importante não deixar o corante na lâmina entrar em ebulição. A determinação do número de esporos pode ser feita ou por cultivo em placas.0 ml. por um minuto. uma vez que com a germinação destes a carga bacteriana pode elevar-se rapidamente prejudicando todo o processo. A coloração é normalmente empregada quando se pretende diferenciar os esporos das células vegetativas. Validade: 12 meses.5 g de safranina e dissolver com água destilada esterilizada. ou por contagem direta ao microscópio com ou sem coloração.

Examinar ao microscópio usando a objetiva para imersão (100x).0. Total bactérias com esporos % bactérias com esporos = ----------------------------------. contudo é possível que se faça a quantificação.doc 86 6/7/2011 . Aguardar a lâmina secar. em relação ao total de bastonetes contados.5% Aguardar 15 a 20 segundos. Fig. Os esporos se apresentarão corados de verde enquanto as células vegetativas apareceram coradas de vermelho. considerando a quantidade de esporos encontrados.x 100 Total bactérias contadas Fermentacaoalcoolica v2.• • • • • • Contra corar a preparação com safranina a 0. Exemplo ilustrativo de esporos (coloração verde) e células vegetativas (coloração vermelha). 9: Corantes utilizados e alguns procedimentos durante a realização da coloração de esporos. Interpretação/Quantificação dos Esporos Normalmente é verificada apenas a presença ou não de esporos. Lavar o excesso de corante com água fria.

Teste de Floculação A floculação da levedura é um dos mais graves problemas e um importante parâmetro para o controle do processo de fermentação alcoólica. Ajustar o menisco para 100 ml.0. Fermentacaoalcoolica v2. Cronometrar 15 minutos. Fazer a leitura quantificando de cima para baixo o espaço existente entre o volume total (100 ml) e início da separação do levedo. especialmente pela redução de produtividade e de dificuldades ocasionadas na centrifugação da levedura.doc 87 6/7/2011 . principalmente o aumento da contaminação bacteriana. O teste é realizado com amostra de vinho bruto em final de fermentação Procedimento Analítico • • • • • Homogeneizar a amostra. Transferir para uma proveta de 100 ml. A floculação pode ser causada pela própria linhagem da levedura e pelas condições da fermentação. excesso de cálcio e elevados níveis de temperatura.

o que torna a utilização de antimicrobianos mais racional.doc 88 6/7/2011 . de certa forma. econômica e eficaz. através da variação da acidez do meio onde se desenvolvem os microrganismos contaminantes. através da variação da acidez Este tem como objetivo avaliar a sensibilidade de bactérias contaminantes da fermentação alcoólica. Fermentacaoalcoolica v2. em relação à antimicrobianos. indicando o melhor produto a ser empregado.0. avaliar o efeito de antimicrobianos sobre a microbiota contaminante presente.% FLOCULAÇÃO = 79 % Fig. dentro de um período relativamente curto (6 a 8 horas). 12: Ilustração do teste de floculação Teste de sensibilidade de bactérias aos antibióticos. Esta metodologia é relativamente simples de ser realizada e permite.

Completar o volume para 100 ml. seguir as recomendações do fabricante para a solubilização do produto). Procedimento analítico Preparar 4 erlenmeyers (para testar 3 antimicrobianos + 1 testemunha). estoque de actidiona.01 g do antimicrobiano. • • • • Pesar 0. Solubilizar em algumas gotas de álcool. como descrito a seguir: . Dissolver com água destilada esterilizada. se necessário (é imprescindível Completar a dissolução com água destilada esterilizada.Preparo das soluções Solução estoque de actidiona (inibidor de leveduras). estoque do antibiótico A (= 3 ppm). Transferir para balão volumétrico de 100 ml.. Este é o tratamento testemunha.0. estoque de actidiona + 3 ml da sol. Transferir para balão volumétrico de 100 ml. Observação: Recomenda-se que as soluções de antibióticos sejam preparadas no mesmo dia do seu uso.1 g de actidiona. Este é o tratamento A Fermentacaoalcoolica v2. Completar o volume para 100 ml com água destilada esterilizada. Solução estoque de Antimicrobianos • • • • • Pesar 0.doc 89 6/7/2011 . com capacidade para 250 ml cada. Erlenmeyer 1: colocar 70 ml de mosto de alimentação + 30 ml de vinho bruto + 1 ml da sol. Erlenmeyer 2: colocar 70 ml de mosto de alimentação + 30 ml de vinho bruto + 1 ml da sol.

para Determinar a acidez final de cada tratamento.Erlenmeyer 3: colocar 70 ml de mosto de alimentação + 30 ml de vinho bruto + 1 ml da sol.0ºC durante 6 h. tem-se: Erlenmeyer 1: Testemunha Erlenmeyer 2: Tratamento antibiótico A (3 ppm) Erlenmeyer 3: Tratamento antibiótico B (3 ppm) Erlenmeyer 4: Tratamento antibiótico C (5 ppm) • • • • • • • • Homogeneizar.0 ml de cada tratamento. frasco Erlenmeyer de 250 ml separados. para Determinar a acidez inicial de cada tratamento. para Adicionar 50 ml de água destilada. Este é o tratamento C. estoque de actidiona + 5 ml da sol. Homogeneizar. usando pipeta volumétrica. Homogeneizar. frascos separados. Este é o tratamento B. usando pipeta volumétrica. estoque de actidiona + 3 ml da sol.doc 90 6/7/2011 . Aquecer até atingir ebulição e manter em refluxo durante 5 minutos. Assim. estoque do antibiótico C (= 5 ppm). estoque do antibiótico B (= 3 ppm). frascos separados.0. usando pipeta volumétrica. Fermentacaoalcoolica v2. Determinação da acidez Determinação da acidez sulfúrica (inicial e final) das amostras. Procedimentos: • • • • Transferir 20. Transferir 20.0 ml de cada tratamento. 1. Erlenmeyer 4: colocar 70 ml de mosto de alimentação + 30 ml de vinho bruto + 1 ml da sol.0 ml de cada tratamento.0ºC Retirar os Erlenmeyers da estufa. Incubar os Erlenmeyers em estufa a 35. Transferir 20.

corresponde ao antimicrobiano mais recomendado para ser dosado na fermentação. 13: Ilustração da incubação e refluxo da amostra para avaliação de delta acidez. Calcular acidez. até pH = 8. Acidez (g H2SO4) = Volume de NaOH gasto x 0. Anotar o volume gasto para cada amostra. O tratamento que apresentar a menor variação da acidez. Fermentacaoalcoolica v2.5. Cálculo Delta Acidez (g H2SO4/L) = Acidez final – Acidez inicial Observação: Na ausência de refluxo deve-se manter a amostra em ebulição durante 2 minutos.0.acidez inicial) para todos os tratamentos.doc 91 6/7/2011 .• • • • Resfriar Titular com NaOH 0. Fig. Interpretação dos resultados Calcular a variação da acidez (acidez final .245 x fator do NaOH.1 N.

todo o material necessário.98 0. O teste consiste em avaliar a ação dos antimicrobianos. o laboratório deverá estar aparelhado com um bom espectrofotômetro.Exemplo Testemunha Antibiótico A (3 ppm) Antibiótico B (3 ppm) Antibiótico C (5 ppm) acidez inicial acidez final Δ acidez 0. indicar o produto mais eficaz e/ou dosagem a ser empregada. o efeito de antimicrobianos sobre bactérias contaminantes da fermentação alcoólica.31 0. e por último. o antibiótico C. incubada com ou sem o produto em teste.82 1.07 0.91 0. dentro de um período relativamente curto (6 a 8 horas).doc 92 6/7/2011 . seguido do antibiótico B.88 0. É uma metodologia relativamente simples de ser realizada e permite.1 g de actidiona.83 0. Teste de sensibilidade de bactérias aos antibióticos por espectrofotometria Este teste tem como objetivo avaliar em laboratório. o antibiótico A foi o produto que apresentou melhor eficiência. de certa forma. como antibióticos e outros compostos. através da leitura espectrofotométrica da densidade ótica (absorbância) de uma suspensão microbiana. Preparo das Soluções Estoque • Soluções estoque de inibidores de leveduras: Solução de Actidiona . Dissolver com água destilada esterilizada. Completar o volume para 100 ml com água destilada esterilizada Validade e conservação – Até um mês armazenado sob refrigeração. Transferir para balão volumétrico de 100 ml.0. • Soluções estoque dos antimicrobianos a serem testados : Fermentacaoalcoolica v2. bem como.84 0. para o emprego desta metodologia. Apesar de simples. o que torna a utilização dos antimicrobianos mais econômica e racional.15 Neste exemplo.49 0.84 0.04 0. para o cultivo de microrganismos.inibidor do desenvolvimento de leveduras • • • • Pesar 0.

. dosagem de 3............0g Dextrose ... Retirar os tubos da Autoclave e deixar esfriar........... autoclavável... é necessário transferir 0..........doc 93 6/7/2011 . Repetir o procedimento a cada teste realizado...........01 g do antimicrobiano.... Após o uso... Transferir com pipeta 15 ml para tubos de ensaio com tampa de rosca Colocar os tubos na Autoclave e esterilizar por 15 min..........5g Fermentacaoalcoolica v2....... para se conseguir a concentração de 3 ppm.................... 2.45 ml da solução estoque do antimicrobiano para cada tubo contendo 15.0 ppm...Exemplo: “antimicrobiano – A”............. • • • • • Pesar 0... Observação A concentração de antimicrobiano para a realização do teste é a mesma recomendada para a aplicação na dorna...10.......... 1961) • • • • • • • • • Extrato de levedura. Solubilizar em algumas gotas de álcool...0.......... Completar o volume para 100 ml...............0g Fosfato monobásico de potássio ( K H2 PO4).. Meios de Cultivo Meio de Cultivo (Mayeux & Colmer....0g Água destilada ..20..0 ml de meio de cultivo........0g Proteose – peptona . descartar a solução. Neste exemplo...1000.... seguir as recomendações do fabricante para a solubilização do produto). Meio de Cultivo ( GLT) • Extrato de Levedura .............................. se necessário (é imprescindível Completar a dissolução com água destilada esterilizada.. Validade e conservação – Preparar a solução no dia que realizar o teste ou no máximo um dia antes e armazenar sob refrigeração....5.. 2. a 121ºC ....0 ml Dissolver os componentes do meio por aquecimento em bico de Bunsen........... Transferir para balão volumétrico de 100 ml.

...... Adicionar papaína e homogeneizar em agitador de tubos... Transferir com pipeta 15 ml para tubos de ensaio com tampa de rosca Colocar os tubos na Autoclave e esterilizar por 15 min.......0g Glucose (Dextrose) .0 ml da amostra de vinho bruto para tubo de ensaio contendo 15 ml de • • • Incubar a 35 C por 12 horas.... autoclavável. 5 mg)... Preparo do Inóculo • • • • • • • Coletar uma amostra de vinho bruto (dornas em final de fermentação)..........• • • • • • • Triptona ...doc 94 6/7/2011 . para atingir a concentração desejada...0g Água destilada ..1000.... Adicionar papaína ( Aguardar 5 min.... 5. Transferir 5. 1...0.... Este será o inóculo para a realização do teste.... Fazer a leitura (inicial) da absorbância da amostra testemunha e dos tubo com 15 ml do meio de cultivo esterilizado......... pré inóculo já contendo papaína) tratamentos no aparelho de espectrofotômetro a 520 nm logo após a homogeneização.0 ml da amostra para tubo de cultivo.0 ml Dissolver os componentes do meio por aquecimento em bico de Bunsen. Homogeneizar a amostra.. a 121ºC ......15 ml do inóculo preparado (amostra de vinho ou Homogeneizar em agitador de tubos... Fermentacaoalcoolica v2.......15 ml da solução estoque de actidiona para cada Transferir com pipeta o volume necessário de antimicrobiano a ser testado Transferir com pipeta 0. meio de cultivo esterilizado..... Realização do Teste • • • • • Transferir com pipeta 0.. Transferir 1...... Homogeneizar em agitador de tubos. Retirar os tubos da Autoclave e deixar esfriar.........

mais eficiente será o produto. Importante Inocular apenas dois tubos por vez e. ) • • • • Ajustar o comprimento de onda do espectrofotômetro para 520 nm. Lavar a cubeta do espectrofotômetro com a amostra a ser lida. Em seguida inocular mais dois tubos e assim sucessivamente até inocular todos os tubos. quanto maior for o efeito antimicrobiano do produto. Leitura da Densidade Óptica ( D. novamente homogeneizar o inóculo.• • • • Transferir os tubos com as amostras testemunha e tratamentos para estufa Incubar por 6 horas. maior a turbidez do meio e. Assim sendo. consequentemente maior será a leitura da absorbância. é dada pela diferença entre a absorbância final menos a absorbância inicial.doc 95 6/7/2011 .0. Retirar os tubos da estufa e homogeneizar em agitador de tubos. Quanto menor for a variação da absorbância. Assim tem-se: Delta ABS = ( ABS final – ABS inicial ) x 100. por esta metodologia. Fazer a leitura (final) da absorbância nos tubos testemunha e tratamentos a 35º C +/.1º C. A eficiência do produto testado. logo após a homogeneização. Realizar a leitura da absorbância. O . menor será a turbidez e menor a leitura da absorbância. no controle da microbiota presente na amostra testada. Calibrar o espectrofotômetro para zero absorbância com água destilada. Fermentacaoalcoolica v2. Interpretação dos Resultados Quanto maior o desenvolvimento bacteriano.

doc 96 6/7/2011 . Fermentacaoalcoolica v2. Pipetas graduadas de 10ml (1/10). Pipetas graduadas de 0. Lâminas 26x76mm. Câmara de Neubauer. Contador para células. Vidraria • • • • • • • • • • Tubos de ensaio 16x150mm. Funil 0. Eritrosina. Lamínulas 22x22mm Pipetas graduadas de 0. Pipetas graduadas de 1. Erlenmeyers de 500ml.1ml (1/10).0ml (1/10). Sulfato azul de nilo. Agitador automático para tubos de ensaio (marca Phoenix.A tabela abaixo é uma sugestão de como tabular os dados das leituras espectrofotométricas: Tempo Inicial (0h) Final (6h) Δ ABS x 100 Testemunha Produto A Produto B Relação de materiais necessários para instalação do laboratório de controle microbiológico – microscopia Equipamentos • • • • Microscópio óptico (campo claro).0.1 ml (1/1000) Seringas de capacidade 5 L Reagentes • • • Azul de metileno. modelo AT-56).

Modelos de boletim para o controle microbiológico por microscopia Matéria-prima Data Bast.• • • • • • Citrato de sódio. Outros • • Algodão hidrófilo. Verde malaquita./ml % álcool Acidez pH Fermentacaoalcoolica v2. Lugol forte.0. 200 uL.doc 97 6/7/2011 . Observação: Os reagentes para as análises por microscopia devem ser da marca Merck. Cristal violeta. Óleo para imersão (Marca Merck). Safranina. Pipetadores automáticos Para maior segurança no trabalho sugere-se o uso de pipetadores automáticos com volume variável de. • • 1000 uL. Oxalato de amônia.

acidez e pH devem ser fornecidos pelo controle químico.0. máxima Fermento % Álcool % Média Fermentacaoalcoolica v2. % Temp. % Brotam.Média * Os valores de % álcool. Média Fermentação Data Viabil. % Bast./ml Flocul.doc 98 6/7/2011 ./ml % Álcool Brix Caldo secundário TAXA MULTI. Moenda Caldo primário Data Bast./ml % Álcool Brix Bast.

que possam inibir qualquer atividade microbiana. no ar. usados para avaliação das populações microbianas e/ou. etc. agentes químicos. sendo. por tempo variável de 15 a 30 minutos. dependendo do Fermentacaoalcoolica v2. deve-se esterilizar todo o material a ser utilizado. o calor seco é o mais empregado.. De um modo geral. como glutaraldeído 2%. água. etc. alimentos. isolamento de microrganismos. os microrganismos submetidos à esterilização não serão capazes de se multiplicarem formando colônias. tornando o microrganismo mais resistente e. por calor úmido emprega-se vapor saturado sob pressão (1 atmosfera /121 C). pode-se usar: • • meios físicos: calor. as vidrarias e peças ou equipamentos metálicos. Para se controlar a contaminação microbiana nos processos industriais e. portanto.CONTROLE MICROBIOLÓGICO – PLAQUEAMENTO Introdução O plaqueamento ou cultivo é uma das técnicas mais antigas para se avaliar a população microbiana. para a esterilização dos meios de cultivo. filtração. a inativação completa (esterilização) vai depender do binômio tempo/temperatura empregado. etc. enquanto. enquanto. solo. Para se conseguir a esterilização. De uma forma ou de outra. os microrganismos (bactérias e leveduras) na forma vegetativa são menos resistentes ao calor do que na forma de esporos. significa completa destruição de qualquer forma de vida. Para tal. com calor seco as proteínas são desidratadas. emprega-se normalmente o calor úmido. como gases (dióxido de etileno). Esterilização Esterilização.Autoclave Na esterilização de meios de cultivo.doc 99 6/7/2011 . Esterilização por Calor Úmido . os microrganismos são inativados por desnaturação das proteínas. radiações ionizantes e não ionizantes. Desta forma.0. Na esterilização empregando-se o calor úmido. Também pode ser utilizada quando se pretende isolar e caracterizar os diferentes grupos de microrganismos de seu habitat natural. ou compostos químicos. portanto necessita-se de temperaturas mais elevadas e maior tempo de esterilização. considerados inativos (mortos). em termos absolutos.

São encontrados dois tipos de Autoclaves: vertical e horizontal.0.material a ser esterilizado. Fermentacaoalcoolica v2.doc 100 6/7/2011 . em equipamentos denominados Autoclaves.

Fechar a válvula de descarga. que fecha hermeticamente a câmara. termômetro e manômetro. Manter esta temperatura durante todo o tempo de esterilização (20 / 30 Verificar se há água suficiente na câmara de aquecimento.0oC. colocando todas as serpentinas para funcionar ( Deixar a válvula de descarga aberta até que todo o ar tenha sido removido. Carregar a Autoclave com o material a ser esterilizado. Nesta tampa são encontrados uma válvula de descarga (saída de vapor e ar). 1: Aparelho de Autoclave de laboratório Constituição da Autoclave A Autoclave comum de laboratório é um equipamento constituído de uma câmara metálica vertical. Fermentacaoalcoolica v2. ou seja. Abrir a válvula de descarga de gases. por uma borracha de vedação. posição máxima do termostato). pressão de trabalho e. por serpentina de vapor ou diretamente com bico de gás. através de resistência elétrica. O aquecimento pode ser feito eletricamente. Iniciar o aquecimento.0. Operação da autoclave • • • + ar ). uma tampa metálica resistente.Fig. • • • • • • • min). uma válvula de segurança. Ajustar a válvula de segurança para a pressão de trabalho. A pressão aumentará na câmara até atingir a Nestas condições a temperatura terá atingido 121. a válvula de segurança emitirá pequena quantidade de vapor.doc 101 6/7/2011 . Fechar a tampa e apertar os parafusos para vedar a saída de gases (vapor cobrindo as serpentinas.

• • • Autoclave. Cuidados • Desligar o aquecimento (termostato).0) o material poderá ser retirado da esterilização. Mudanças bruscas de temperatura poderão provocar a quebra da vidraria. Bunsen. Fermentacaoalcoolica v2. usam-se a técnica de flambagem. etc.3. até que se torne vermelho rubro (alças de platina. agulhas. e esperar baixar à pressão a zero. depois de completado o tempo de Abrir a válvula de descarga bem lentamente. sem.. seringas de vidro. a esterilização pode ser feita por: • • Aquecimento ao rubro: mantendo-se a peça na chama de um bico de Flambagem: para a descontaminação de bocas de frascos. etc). • Em Estufas: a esterilização é feita em estufas esterilizadoras. tubos de cultivo. em temperatura a 180oC por duas horas. antes que a pressão tenha chegado a zero. frascos de vidro. contudo deixar que os mesmos se tornem vermelho rubro. com calor seco. etc. O material a ser esterilizado deverá ser acondicionado em papel especial (papel manilha ou alumínio) ou recipiente metálico. Não abrir a válvula de descarga de vapor e de ar. • Autoclave. lâminas. Deve-se esterilizar em estufas: placas de Petri. pipetas. Esterilização por Calor Seco No caso do calor seco. pois provocará ebulição violenta do líquido contido nos recipientes (frascos) e estes poderão até mesmo explodir • Não remover o material da Autoclave imediatamente após abri-la.0. agulhas.doc 102 6/7/2011 . Esperar até que todo o vapor tenha saído (3 a 5 min) e abrir a tampa da Depois de alguns minutos (+/. passando-se com cuidado estes matérias pela chama do bico de Bunsen várias vezes. instrumentos metálicos.

Somente abrir os recipientes no momento de uso do material e próximo à chama do bico de Bunsen.doc 103 6/7/2011 . É utilizada para esterilização de meios de cultivo que não podem ser esterilizados por aquecimento às altas temperaturas. Esterilização por Filtração Feita em membranas de acetato de celulose. com poros de diâmetros adequados para retenção de microrganismos (bactérias ou leveduras).1.0.Esterilização por calor seco – Estufa Fig. etc. ANÁLISES de CONTROLE MICROBIOLÓGICO por PLAQUEAMENTO Fermentacaoalcoolica v2.2 Operação da estufa • • • • • • Acondicionar o material a ser esterilizado em recipiente metálico ou papel Kraft Colocar todo o material na estufa Ligar a estufa e esperar a temperatura atingir 180ºC Monitorar a temperatura por duas horas (Tempo de esterilização) Desligar e esperar a estufa esfriar Retirar o material da estufa e mantê-lo em local apropriado Observações • • Não abrir a estufa antes de decorrido o tempo total de esterilização. soluções de antibióticos. 2: Aparelho de Estufa 2.

....0g Agar ......... Assim..... de acordo com a finalidade do plaqueamento... MEIOS de CULTIVO São usados diferentes meios de cultivo. embora o tempo para se obter os resultados seja maior...Agar Padrão) – Bactérias Aeróbios Mesófilas Totais • • • • • Extrato de Levedura ......doc 104 6/7/2011 . Entretanto........... • • Mel final (fábrica.....0 ml Fermentacaoalcoolica v2. 5.........0... a técnica de contagem por Microscopia não é a mais indicada...... 1. ........ sua aplicação se faz necessária principalmente nas etapas em que os níveis de contaminação são relativamente baixos e.........A técnica de plaqueamento praticamente pode ser aplicada em todas as etapas dos processos de produção de açúcar e de álcool .bactérias e leveduras Após tratamento térmico (caldo decantado ou pré-evaporado): leveduras e bactérias • Mosto (antes e após trocadores de calor e alimentação das dornas) : bactérias principalmente.....0g Dextrose .......... o plaqueamento fornecerá resultados mais precisos e confiáveis...1000................5g Triptona .15.......... o plaqueamento é a técnica mais adequada.........0g Água destilada ......... em amostras em que os níveis de contaminação sejam inferiores a 1.... saída turbinas e tanque depósito): bactérias e leveduras Águas para diluição do fermento e do mosto Observação Para um rastreamento e detecção de pontos mortos na fábrica de açúcar.. 2.0 x 105 ....... Plate Count Agar (P C A ............ O controle microbiológico por plaqueamento deve ser feito para as seguintes amostras: • • • Matéria-prima : caldo da prensa – leveduras Caldo misto (amostra antes do aquecimento)........

..........0 ml Extrato de Levedura..............0g Água destilada .1000......................................0g Citrato bibásico de amônio ................0......5................................1.....Bactérias Lácticas Totais • • • • • • • • • • • • Peptona .......................20.....0g Meio – Mayeux & Colmer – Teste de Sensibilidade • • • Extrato de levedura......................20...Ágar (YEPD + A) – Leveduras • • • • • Extrato de Levedura .....0.......................2................0g Dextrose .................0g Sulfato de magnésio .....................20.....doc 105 6/7/2011 ..................0g Dextrose ................................................0g Proteose – peptona ................5.............15....2.....Peptona.........................................05g Ágar ...................................... Rogosa & Sharpe (MRSA) ..........................0g Dextrose ........0g Fermentacaoalcoolica v2..................0g Extrato de carne ...............0g Água destilada .0 ml Fosfato bibásico de potássio ................0g Peptona .Dextrose ....................0g Extrato de levedura ............15.......0g Tween 80 ...0........10...Man....5..........0g Acetato de sódio ............ 10....0g Ágar ............20.....Ágar..................1000......5...10..........1g Sulfato de manganês ............

....0g Glucose (Dextrose) ....• • Fosfato monobásico de potássio ( K H2 PO4.....0.0g Água destilada .... – Teste de Sensibilidade • • • • Extrato de Levedura ................1000.. 2. Validade e conservação – Até um mês armazenado sob refrigeração.......5g Triptona ......1000. Bactérias Cloranfenicol: • • • Dissolver 250 mg de cloranfenicol em 25 ml de água destilada esterilizada Dosagem recomendada ...... L ... INIBIDORES de CRESCIMENTO MICROBIOANO – Soluções Estoque Dependendo do plaqueamento/isolamento a ser feita.... • Validade e conservação – Até um mês armazenado sob refrigeração...0 ml Meio de Cultivo G...........0 ml Observação Todos os meios de cultivo devem ser usados somente dentro do prazo de validade.. 1........100 ppm....... Leveduras Actidiona (ciclohexemide) : Fermentacaoalcoolica v2......T... Tetraciclina : • • Dissolver 250 mg de tetraciclina em 25 ml de água destilada esterilizada Dosagem recomendada – 100 ppm.......doc 106 6/7/2011 .................. é necessário que se use inibidores de crescimento de leveduras ou bactérias...0g Água destilada ........... 5..................... 2.............

doc 107 6/7/2011 . 1:100 (102).0 ml de água esterilizada. para homogeneização.0 ml da diluição (101) para tubo de ensaio contendo 9. • • Agitar em agitador para tubos. Dosagem recomendada – 10 ppm.• • Dissolver 100 mg de actidiona em 100 ml de água destilada esterilizada. Fermentacaoalcoolica v2. Cada colônia desenvolvida é supostamente originada a partir de uma unidade viável. para homogeneização. Diluição em série • Transferir 1 ml da amostra para um tubo de ensaio contendo 9. Pipetar 1. Como para uma maior precisão da análise somente devem ser contadas as placas com número de colônias > que 30 e < 300. Diluição. Diluição . deve-se fazer uma diluição da amostra para evitar que as colônias se desenvolvam aglomeradas e dificulte a contagem. • Validade e conservação – Até um mês armazenado sob refrigeração.0. Plaqueamento por Incorporação ou Profundidade (Método “Pour Plate”) Como a população microbiana presente no material pode ser variável. 1:10 (101). uma diluição da amostra deve ser feita antes de se proceder a sua mistura com meio de cultivo. Este procedimento é conhecido como diluição em série ou diluições sucessivas.0 ml de água esterilizada. MÉTODOS PARA CONTAGEM DE CÉLULAS VIÁVEIS: LEVEDURAS E BACTÉRIAS A semeadura em placas ou plaqueamento revela o número de leveduras e/ou bactérias capazes de se multiplicarem e formarem colônias em meios de cultivo apropriados e sob condições de incubação adequadas. • Agitar em agitador de tubos. antes de se realizar o plaqueamento.

0. Para se calcular o número de UFC / ml. a uma temperatura de 45 C/46 C. Após este tempo. da amostra deve-se multiplicar o número de colônias contadas pela diluição. 1mL DA AMOSTRA 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 9 mL de H2O DESTILADA ESTERILIZADA 101 102 103 104 105 106 Técnica de plaqueamento • • • • Conseguida a diluição mais conveniente. Transferir 1 ml desta para a placa de Petri. Agitar a placa com movimentos rotativos para direita e para a esquerda para misturar a amostra e o meio de cultivo.0 ml de cada diluição para tubos de ensaio com 9.• Para diluições maiores basta transferir 1. distribuindo os microrganismos presentes uniformemente no meio.doc 108 6/7/2011 . fazer a contagem das colônias formadas em contador de colônias (Aumento 30/50 x).000 = 1. • • • Aguardar esfriar (solidificar) o meio e inverter as placas antes de incubar. até conseguir-se a diluição desejada. por 24 a 48 horas. Ex: Número de colônias contadas = 120 Diluição 1:1000 (103) 120x1000 = 120.0 1 C. Cálculo do número UFC/ml. previamente esterilizada.0 ml água esterilizada.2x105 UFC/ml Fermentacaoalcoolica v2. como mostrado no esquema a seguir. Adicionar o meio de cultivo líquido. Em seguida incubar as placas em estufa 35.

Transferir com pipeta. espalhar a amostra sobre a superfície do meio solidificado. 3: Plaqueamento por Incorporação ou Profundidade. Fermentacaoalcoolica v2. em autoclave ou forno microondas. • Incubar até o completo desenvolvimento das colônias (48 / 72 h ). Plaqueamento de Superfície (Método “Spread Plate”) • • • • • Fundir o meio de cultivo.Observação Para amostras que não se pode pipetar. também esterilizada. Multiplicar o resultado final pela diluição realizada.0. • Levar a placa de Petri. diluída ou não para a placa. Observação Fazer a contagem das colônias formadas em contador de colônias (Aumento 30/50X). 0. esta será pesada para se fazer as diluições e o resultado deverá ser expresso em UFC / g. como o mel por exemplo. inoculada para a estufa com temperatura regulada. Com auxílio de uma alça de Drigalsky. Deixar solidificar.doc 109 6/7/2011 . Distribuir o meio de cultivo fundido (líquido) na placa de Petri. de acordo com o microrganismo (bactéria ou levedura). Fig.1ml da amostra.

doc 110 6/7/2011 . pois excesso de líquido poderá causar o agrupamento das colônias. tornando difícil a contagem. Observações • É importante que a superfície do meio de cultivo na placa de Petri esteja bem seca. • Volumes maiores que 0.1 x104 UFC/ml.0. Fig.1 ml devem ser evitados. deve-se multiplicar o número de colônias contadas pela diluição e por 10. antes de transferir a amostra para a placa.Cálculo do número de UFC/ml Para se calcular o número de UFC/ml da amostra. Ex: Número de colônias contadas = 31 Diluição: 1: 100 (102) Tem-se: 31 x 100 x 10 = 31000 = 3. 4: Plaqueamento de Superfície Avaliação da População Microbiana por Filtração em Membrana. Fermentacaoalcoolica v2.

Esta técnica é bastante útil quando se têm amostras com pequeno número de células viáveis.É uma opção para se avaliar a população microbiana. Assim. através de membranas específicas com porosidade de diâmetro uniforme capaz de reter os microrganismos. porque se podem filtrar volumes maiores. além do plaqueamento e. pode também ser usada para amostras com altas contaminações.doc 111 6/7/2011 . têm-se membranas para retenção de bactérias (poro 0. se baseia na filtração sob vácuo. Neste caso podem-se filtrar volumes menores. fazendo-se diluições sucessivas da amostra. As membranas para uso em contagens Microbiológicas já vêm esterilizadas e embaladas individualmente.45 micra) e com diâmetros de filtro variáveis.0. Fermentacaoalcoolica v2. da amostra a ser analisada. porém.22 micra) e para retenção de leveduras (poro 0.

5: Membrana.0 UFC/ml Observações • Qualquer que seja o volume de amostra filtrado. contendo meio de cultivo apropriado. para se expressar em UFC/ml. Esterilizar o conjunto de filtração Montar em condições assépticas (câmara de fluxo) o conjunto de filtração com a membrana apropriada. Procedimento analítico • • • • Verter 15 a 20 ml de meio de cultivo em placa de Petri. Fazer a contagem das colônias que se desenvolveram na superfície da membrana. à temperatura adequada para o microrganismo que se pretende avaliar (bactéria ou levedura). deve-se dividir por este volume. Fermentacaoalcoolica v2.0. conjunto de filtração.5 / 8. • • • • • Ligar a bomba ou trompa de vácuo.Fig. Retirar a membrana com pinça metálica esterilizada. deve-se expressar em UFC/g. multiplica-se pela diluição e dividi-se pelo peso da amostra. Em condições assépticas filtrar a amostra. • • Incubar por 24 / 48 horas. da mesma forma que se faz no plaqueamento convencional. deve-se multiplicar o número de colônias contadas pela diluição Ex: Número de colônias contadas = 75 Diluição 1:10 (101) Volume de amostra filtrada = 100 ml 75 x 10 / 100 = 750 / 100 = 7. Levar para a estufa.doc 112 6/7/2011 . Cálculo do número de UFC/ml Para o cálculo do número de UFC/ml. Caso contrário deve-se expressar como UFC/volume de amostra filtrada. Deixar em repouso para solidificar. Colocá-la na placa previamente preparada. • Em caso de amostras sólidas.

diluída ou não. • • • • • • Esperar solidificar. Incubar em estufa por 48/72 h à temperatura adequada.doc 113 6/7/2011 . Mergulhar a alça de platina na amostra.Cultivo por Estrias Este não é um método de contagem propriamente dito. para posterior caracterização e classificação. • Considerar para análises posteriores somente as colônias bem isoladas.0. Esfriá-la em água esterilizada. Observação Este procedimento vai propiciar o desenvolvimento de colônias separado as quais serão depois transferidas para meio de cultivo líquido. de acordo com o microrganismo a ser cultivado (bactéria ou levedura) . Fazer estrias na superfície do meio de cultivo. e sim uma técnica muito usada no isolamento de microrganismos. em vários sentidos. • Distribuir 15/20 ml do meio previamente fundido em placas de Petri esterilizadas. para posterior aplicação dos testes bioquímicos específicos ou técnicas moleculares. Fermentacaoalcoolica v2. Procedimento analítico • Fundir o meio de cultivo apropriado (bactérias ou leveduras). em Autoclave ou microondas. Flambar a alça de platina ao rubro (bico de Bunsen) .

É uma modificação da técnica convencional de contagem de células viáveis por plaqueamento. A placa Petrifilm é composta por dois filmes estéreis. Fazer a distribuição da amostra com o espalhador específico. • • Levar as placas Petrifilm para a estufa. reidratáveis. Sob condições assépticas (câmara de fluxo laminar). também com corantes próprios (compostos cromogênicos). por leve pressão manual. de acordo com o microrganismo sendo avaliado. Expressar o resultado. bolores e leveduras. que após a incubação. com UFC/ml . erguer o filme superior de celofane da placa Petrifilm com pinça metálica esterilizada. Fermentacaoalcoolica v2. revelarão o desenvolvimento microbiano. impregnados pelo meio de cultivo e por substâncias geleificantes solúveis em água fria e. Incubar à temperatura e tempo variáveis com o tipo de microrganismo em avaliação.0. • Inocular o filme inferior (meio de cultivo).Fig 6: Placa de Petri com cultivo por Estrias Cultivo em PetriFilm® Esta técnica pode ser aplicada para contagem de mesófilos aeróbios totais. Procedimento analítico • • Fazer diluições em série da amostra a ser avaliada. • • Fazer a contagem das colônias formadas (pontos coloridos). em praticamente todas as etapas do processamento de açúcar e álcool. • • Retornar o filme superior à posição original.doc 114 6/7/2011 . com 1ml das diluições a serem plaqueadas.

Exemplo: Número de colônias contadas = 99 Diluição = 1: 1000 (103) 99 x 1000 = 99. para sua reutilização no processo (reciclagem).Cálculo do número de UFC/ml Para calcular o número de UFC/ml. especialmente pela redução de produtividade e aumento nas dificuldades de centrifugação da levedura. Fig 7 e 8: Plaqueamento em Petrifilm OUTRAS ANÁLISES Avaliação da Floculação da Levedura A floculação da levedura é um dos mais graves problemas no processo de fermentação alcoólica. tomando-se por base o peso da amostra usado para se fazer as diluições. Fermentacaoalcoolica v2. deve-se expressar em UFC/g . com grande economia de tempo de trabalho • Em caso de amostras sólidas.000 = 9.9 x 104 UFC/ml Observações • Este método é considerado equivalente ao convencional.0.doc 115 6/7/2011 . deve-se multiplicar o número de colônias contadas pela diluição.

A floculação reversível se caracteriza pelo agrupamento de células no final da fase exponencial de crescimento ou na fase estacionária. dos gêneros Lactobacillus e Bacillus e também de agentes químicos (Ca++).0. Procedimento Analítico • • • • • Homogeneizar a amostra. 9: Flocos de leveduras. Fazer a leitura quantificando de 100 mL. cima para baixo o espaço existente entre o volume total (100 mL) e início da separação do levedo. Já a floculação irreversível pode ser o resultado de características próprias da levedura (levedura floculante) ou como resultado de falhas no desprendimento do broto (célula filha).O fenômeno de floculação pode ser de duas categorias: reversível e irreversível. Cronometrar 15 minutos. ou se induzida pela deficiência de minerais como nitrogênio e magnésio. % FLOCULAÇÃO = 79 % Fermentacaoalcoolica v2. Fig. Transferir para uma proveta de Ajustar o menisco para 100 mL. como resultado principalmente de contaminações bacterianas.doc 116 6/7/2011 .

o que causa diminuição na velocidade de fermentação e de reprodução e aumento na taxa de morte.Fig. torna a operação da centrífuga extremamente crítica e pouco produtiva. Fermentacaoalcoolica v2. em conjunto com o grande diâmetro dos flocos. A alta concentração de fermento que se acumula no fundo das dornas no início da centrifugação. Além disso. O agrupamento das leveduras diminui a área específica das leveduras expostas ao meio externo. outros problemas que complicam o tratamento. carregando sólidos em suspensão e colóides (argila. Há.0. O tratamento ácido também auxilia no controle da floculação. e mais. qualquer manobra errada significando grandes perdas de fermento e/ou redução de produção. carrega consigo não apenas as bactérias aderidas as leveduras como aquelas que originalmente não estavam aderidas. havendo separação de fases assim que a agitação causada pela liberação de CO2 diminuir. como o floco tem um diâmetro muito maior que o de uma célula isolada. quebrando os flocos e permitindo que as bactérias em seu interior percam a proteção do floco e sejam agredidas pelos antibióticos. proteínas e polissacarídeos extracelulares). relacionado tanto as condições de centrifugação como a presença dos flocos.doc 117 6/7/2011 . porém. ele se torna muito mais pesado. 10: Ilustração do teste de floculação FLOCULAÇÃO DAS CÉLULAS DE LEVEDURAS A floculação segue sendo um dos principais problemas de fermentação. Quando um floco (formado por milhares de leveduras) é acelerado dento da centrífuga. em vista de sua grande área e voluma. pois é de difícil previsão e de difícil controle. o que diminui a velocidade de retirada de açúcar e nutrientes e torna mais difícil a liberação do álcool e do CO2.

quatro vezes por dia. algumas leveduras contaminantes. este pH fica na faixa de 2. Quando existem principalmente leveduras contaminantes. redução na produção. por produção de ácidos e glicerol. tem a capacidade de aderir a diversas leveduras simultaneamente formando os flocos.2 e quando existirem principalmente bactérias. Fermentacaoalcoolica v2. desgaste acelerado nas centrífugas e perdas de rendimento por sobra de açúcares. a manana. com grande consumo de ácido. O maior consumo de ácido e em conseqüência maior acidez torna o tratamento mais agressivo. diminuição da viabilidade. o pH de desfloculação estará abaixo de 2.controle da assepsia do mosto (monitorada pelo delta-pH ou delta-acidez): deve ser minimizada a entrada de bactérias no mosto através de limpezas freqüentes de todas as linhas e os equipamentos em contato com o açúcar. Para complicar esta situação. A maior parte dos problemas de floculação nas destilarias envolve a presença de um contaminante especial. resultando tudo isso em uma lenta recuperação do processo. já que haverá grande aumento no número de bactérias no leite. também têm a capacidade de co-flocular com a levedura normal. por exemplo).0. bastando 20 a 30% do número total de leveduras nesta forma para promover a total aglomeração da população. aumento no tempo de fermentação.Todo este material orgânico irá “reagir” com o ácido sulfúrico competindo pela ação desfloculante dos íons [H+] e reduzindo a eficiência do tratamento. as linhas devem ser esgotadas e limpas com água e depois com água e biocida. para alterar a estrutura da proteína que estabiliza o floco.5. um tipo de bactéria do gênero Lactobacillus que tem a capacidade de sintetizar um tipo de proteína (associada a sua parte externa) que se adere firmemente a uma fração de carboidrato da parede celular da levedura. diminuindo a viabilidade do fermento. A única diferença entre estes dois tipos de floculação é a faixa de pH necessário para desflocular. A área por unidade do volume sendo tanto menor quanto maior o diâmetro do floco reduz ainda mais a eficiência de tratamento ácido. preferencialmente passando caldo na temperatura de ebulição por pelo menos 15 minutos. A bactéria pelo seu pequeno tamanho e grande área. diminuição do teor de fermento.doc 118 6/7/2011 . ou seja. Nas paradas. que são naturalmente floculantes (como as utilizadas em cervejarias. Os principais controles para evitar uma grave floculação bacteriana no processo são: .

Nas usinas alcooleiras. a presença de leveduras floculentas em concentração superior a 12% causa dificuldade significativa na operação de centrifugação do vinho devido ao fenômeno de co-floculação. Floculação da levedura pela bactéria Lactobacillus fermentum No estudo de leveduras.6. As células floculentas apresentam superficie fimbriada ou ciliada e as não floculentas.0. A anaerobiose reprime a floculação e a aerobiose induz a formação de proteína responsável pela floculação. relativamente lisa. Na fermentação alcoólica industrial. O meio de cultivo também interfere na floculação. Trabalhos realizados com linhagens floculentas mostraram que a manana da parede celular participava da floculação. o termo floculação é normalmente usado para designar o fenômeno reversível de agrupamento celular que comumente se desenvolve no final da fase exponencial de crescimento ou na fase estacionária. A interação se estende por toda área causando distorção da parede no local do contato. Isto pode ser causado pela ação de propriedades inerentes das células. cuidando-se principalmente do estado do trocador de calor. por exemplo. A diferença da estrutura entre linhagens floculentas e não floculentas não pode ser detectada pela análise química mas pode ser visualizada por microscopia eletrônica. O fator responsável pela floculação de leveduras é governado geneticamente. pela inversão do lado de fluxo (caldo/água). que deve ser mantido limpo. Além do fator genético há outros que interferem ou inibem a sua ação. as leveduras floculentas estão normalmente presentes como contaminantes das leveduras normais (não floculentas). antes que o delta-pH suba. O envolvimento da manana é indicado por diversos experimentos: (1) A floculação é inibida competitivamente por manana. associada a grupo carboxila da proteina da parede celular. Esse componente proteico está associado à parede celular não podendo ser removido pelo calor ou tratamento químico. A força de ligação entre as células floculentas pode ser dada pela ponte de hidrogênio ou polissacarídeos da parede celular e íon Ca+2. O mecanismo exato de floculação da levedura não é conhecido. Nestas condições acentua-se a sedimentação das células de leveduras nas dornas e interfere na operação das centrífugas contínuas. por agentes químicos ou microbiológicos. (2) A hidrólise de proteina de células não floculentas ou floculentas não altera a sua interação com células floculentas intactas.O valor do delta-pH deve estar abaixo de 0.doc 119 6/7/2011 . É possível que a ligação seletiva de Ca+2 com proteina seja mediada por arranjo Fermentacaoalcoolica v2.

Já glicose. tornam o controle do processo de floculação um desafio de grande importância e dificuldade. A diversidade dos microrganismos e dos agentes envolvidos na floculação do fermento nas dornas de fermentação. e a sua interação com células de levedura é afetada com variação de pH. A necessidade de íons Ca+2 para floculação depende do pH sendo que em concentrações elevadas (> 10-1 M) há desfloculação das células. é importante fazer a distinção entre a (não reversível) formação da cadeia. Magnésio pode substituir Ca+2. necessidade de íons metálicos e inibição por manose e excesso de íons. mas depende do pH. e atua somente ao redor de pH 4. No caso da floculação causada por Lactobacillus fermentum o fator responsável é de natureza proteica encontrado na célula bacteriana. O sítio susceptível à temperatura e proteinase está localizado na célula bacteriana e não na levedura. indicando que existe um número fixo de sítios na levedura para formação do agregado.0.0 e 4.específico do grupo carboxila. e a Fermentacaoalcoolica v2. Aspectos gerais Quando se estuda floculação.0 enquanto que Ca+2 atua a intervalo de pH maior (pH >3. O tratamento térmico aplicado sobre a célula bacteriana provoca a perda da sua capacidade floculadora. bem como o grande volume de mosto manuseado durante a fermentação alcoólica industrial. mas também pode ser que o íon Ca+2 atue como cofator na ativação da capacidade de ligação da proteina com a manana. como susceptibilidade às altas temperaturas.0). proteinase e pH’s extremos. maltose e sacarose não produzem nenhum efeito. O estudo da mobilidade eletrostática das células de bactérias e levedura mostrou que a floculação era causada pela atração eletrostática entre as superfícies celulares de bactérias e leveduras com cargas opostas. Uma floculação específica também pode ser causada por L. a manose causa a desfloculação. presença de íons e manose. onde células mães e filhas não se soltam umas das outras.doc 120 6/7/2011 . plantarum.0 e é inibido por sais neutros. Além disso há uma relação numérica celular entre a bactéria e a levedura onde se consegue o máximo de floculação. A floculação é dependente do Ca+2 em quantidades mínimas (10-6 a 10-8). Como no caso de leveduras floculentas. é termolábil e destruido por proteinase. Na fermentação alcoólica industrial é frequente a contaminação por bactérias do gênero Lactobacillus. Algumas dessas bactérias são capazes de provocar a floculação de leveduras como por exemplo Lactobacillus fermentum. O fenômeno ocorre a pH entre 2. Esta floculação apresenta algumas características similares às leveduras floculentas.

além disso. a regulação da floculação mostra uma evolução paralela com outras respostas de estresse. A floculação começa com a exaustão do meio. a floculação foi demonstrada ocorrer entre a bactéria Grampositiva Lactobacillus fermentum e a levedura que não é inteiramente dependente do cálcio. sua habilidade de floculação é considerada ser maior de importância. Na verdade. Durante a seleção de uma cepa de levedura para propósitos fermentativos. Por isso. Mais recentemente. como uma resposta de um baixo nível de nutrientes ou um mecanismo de defesa contra altas concentrações de etanol. mas também para flotação. As células localizadas na periferia do floco protegeriam as células que estão no centro contra as condições desfavoráveis do meio.real. a agregação mostrou ser dependente do pH. A formação de cadeias está relacionada com o crescimento e começa no início da fermentação. a levedura deve ser removida do meio por floculação. Especialmente em procedimentos contínuos a separação das células do meio pode ser obtida sem centrifugação.doc 121 6/7/2011 .0. Provavelmente. Consiste na agregação de células fazendo com que elas sedimentem. a floculação pode ser considerada como uma estratégia de sobrevivência. A floculação real pode ser considerada como uma reação de estresse. tal como o acúmulo de trealose. Estes flocos podem sedimentar ou. Entretanto o termo floculação é mais usado para descrever apenas o fenômeno de sedimentação. Após o término de seu papel metabólico numa fermentação. podem flutuar para a superfície. a produção de proteínas por choque térmico e formação de pseudomicélio. Comparativamente poucos estudos foram enfocados na floculação de leveduras induzida por bactérias. centrifugação e/ou filtração. Entretanto de um ponto de vista prático os dois últimos procedimentos podem criar sérios problemas. desta forma é compreensível que os vários ensaios de floculação (ou precisamente de sedimentação) são baseados nas medidas visuais ou fotométricas da velocidade de sedimentação do depósito de células. uma compreensão dos mecanismos de floculação e os fatores que a afetam são de grande importância para a fermentação e indústria relacionadas. Tem sido relatado que a agregação de leveduras por Lactobacillus é devido a força eletrostática entre as superfícies das paredes celulares de bactérias e leveduras. A floculação é um fenômeno muito comum observado em suspensão de microrganismos. Fermentacaoalcoolica v2. A floculação é classicamente descrita como um fenômeno reversível em que células de leveduras aderem-se em flocos e sedimentam-se rapidamente do meio em que estão em suspensão. floculação induzida e reversível. ignorando que a agregação de células não é apenas pré-requisito para sedimentação. devido à inclusão de CO2.

e cátions. tanto quanto a concentração das células. função mitocondrial. tanto quanto a concentração de células. Tais medidas também resultam em um grau de confusão entre floculação. as células agregam-se antes da fusão celular para formarem Fermentacaoalcoolica v2. por exemplo etanol. Genes FLO). produtos da fermentação. O mecanismo desta agregação é um assunto de considerável controvérsia que é mencionada em várias literaturas. Estas velocidades são muito dependentes das condições usadas. Existem três razões possíveis para as células de leveduras agregarem-se. especialmente Cálcio. Muitos fatores exercem uma influência na floculação de leveduras. diz respeito a combinação de células de leveduras sexuadas. Igualmente. Elas não fornecem informação direta no estado de agregação de células de leveduras como elas passam pela fermentação.Primeiramente para se produzir uma cerveja de alta qualidade é essencial que as células de leveduras sejam removidas do mosto fermentado quando elas terminam seu trabalho. que é chamada de autofloculação. especificamente. e sedimentação. tais medidas são freqüentemente levadas a cabo externamente na fermentação do mosto com a presença de substâncias conhecidas para induzirem a floculação.doc 122 6/7/2011 . a deposição subseqüente das células agregadas restantes. proteínas e peptídios. pH. Cepas haplóides de dois tipos de leveduras sexuadas no caso de Saccharomyces cerevisiae trocam poucos feromônios peptídeos. geometria do recipiente. Aspectos genéticos A velocidade de floculação em levedura depende de parâmetros genéticos e ambientais. temperatura e concentração de íons bivalentes. Não é dada uma medida direta do tamanho do resultado da agregação. A característica da floculação é estimada primeiramente como uma manifestação da parede celular externa da levedura. Um importante estágio desta remoção é a agregação espontânea de células de leveduras em flocos. a população inicial de células de leveduras. Dentre estes são componentes genéticos (por exemplo.0. A floculação de leveduras é quase que exclusivamente estudada por medida direta ou indireta da velocidade de deposição de flocos de leveduras. agitação e estresse. composição da solução e agitação. Depois destas modificações. O primeiro e melhor entendido. todas com mecanismos distintos de adesão. a manose . fatores a e α que causam um número de mudanças fisiológicas. Uma outra razão para a diversidade de explicações de floculação de leveduras encontra-se na diversidade de metodologias usadas em investigações experimentais.componente de proteínas.

e é conhecido como uma formação de uma ramificação. A floculação. eventualmente crescendo em agregados de mais de 100 células. Ca++ causando agregação das células. a formação de ramificação é um fenômeno inteiramente separado da floculação ou agregação por combinação. mãe e filha. A formação desta ramificação envolve o crescimento de leveduras em agregados multicelulares. Há duas tradições básicas no uso de leveduras floculentas. Ação de íons A floculação de leveduras depende da presença de íons bivalentes como. cepas que fermentam no fundo da dorna para um tipo de cerveja leve e clara (lager) e as cepas que fermentam na parte superior da dorna para a produção de uma cerveja mais incorpada (ale). A floculação tem sido usada pela indústria cervejeira. Isto é comum em cepas Saccharomyces cerevisiae de cervejaria. A quantidade de EDTA para se evitar a agregação é Fermentacaoalcoolica v2. para separar a levedura da cerveja no final da fermentação. A floculação foi relatada por Pasteur em 1876 e desde aquela época.doc 123 6/7/2011 . ao contrário da cepa ale. A floculação. e agregação envolve um ajuntamento de células isoladas para formação de um floco. Cepas de baixa fermentação são tradicionalmente mais floculentas e decantam para o fundo da dorna de fermentação. a cepa da levedura ou mutação em um gene. inibida por agentes quelantes ou por açúcares específicos. A ligação parece ser proteína/carboidrato e requer a presença de íons de cálcio. menos floculentas cujos flocos são carregados para cima para formar uma grossa espuma de leveduras no topo da dorna de fermentação. Pela ligação de Ca++ com EDTA esta agregação pode ser inibida. A floculação geralmente ocorre entre células de apenas uma cepa de levedura. O fracasso dos brotos em separar-se pode dar-se pelo baixo nível de nutrientes. Independente do tipo de combinação ou ploidia. não parece envolver combinação sexuada. A terceira razão para encontrarem-se agregados de leveduras é o fracasso dos brotos em separar-se das células mães durante a multiplicação da levedura. em contraste. mas parece superficialmente similar. provavelmente por muitos séculos. continuam a formar novos brotos. Estudos apontam que isto não é estritamente uma forma de agregação já que as células nunca estiveram isoladas.0. A adesão entre células é por ligação proteína/proteína entre aglutininas a e α fixadas nas paredes celulares complementares. muito da pesquisa em floculação tem sido orientada para o papel da floculação nas cervejarias.diplóides. As células. é reversível. não como uma agregação por combinação. Seja como for. talvez uma tentativa de um crescimento micelial e adoção de um tipo de vida multicelular. por exemplo.

Mecanismos de floculação Vários mecanismos são propostos para explicar a floculação. A proteína da parede é uma fonte de grupos negativos de carboxilas. pH. que produz uma carga líquida negativa para seus grupos de fosfatos. A estrutura da parede é complexa. Aspectos físico-químicos Recentemente. mas sabe-se que a camada externa é composta geralmente de fosfomanana. O aumento da Fermentacaoalcoolica v2.0. Os modelos mais interessantes são aqueles que estão baseados em um aumento da hidrofobicidade celular durante a fermentação ou em uma ligação tipo-lectina de interação. etanol e sensibilidade a açúcares podem ser concomitantemente avaliadas. É chamado de taxa de floculação e é expressa em *mol de EDTA. Aspectos químicos Existe uma grande concordância que a estabilidade da suspensão de leveduras é devida em grande parte negativamente encarregado pela parede celular. foram feitos muitos estudos no mecanismo e aspectos físico-químicos do fenômeno da floculação. Estes trabalhos mostram que a limitação de nutrientes está induzindo a mudança nas características fisico-química da parede celular da levedura. Esta mudança leva a um forte aumento na hidrofobicidade da levedura. e grupos positivos de amino. Hidrofobicidade celular Vários autores enfatizaram a importância da hidrofobicidade celular na agregação celular. Estudos mostraram que a determinação de características de leveduras floculantes com respeito ao cálcio. observando que íons cálcio intensificavam a agregação e que a agitação da mistura de células era essencial para o início da floculação. A taxa de floculação pode ser usada para caracterizar tanto leveduras sedimentares quanto leveduras floculantes.doc 124 6/7/2011 . O restante da parede é constituído de proteína. quitina e lipídios. Análises químicas da parede celular mostram que aproximadamente 80% do peso seco são compostos por *-glucana e *-manana.específica para diferentes cepas de leveduras. Nenhum destes mecanismos foi provado ser uma forma equivocada. como no caso das leveduras floculantes. Estudos mostram que a floculação de leveduras é realizada por algumas linhagens de Lactobacillus. A quitina não é utilizada e o lipídio não é encontrado na superfície externa da célula.

Além de que o aumento na hidrofobicidade é causado pela síntese de uma glicoproteína muito hidrofóbica que pode ser a maior causa da floculação de leveduras.. Cofloculação levedura-bactéria Um caso especial da ligação tipo-lectina de floculação é a cofloculação levedurabactéria. Estudos sustentam que há pelo menos duas famílias de lectinas de leveduras: grupo FLO1 (inclusive as cepas que carregam o gene FLO1. Fermentacaoalcoolica v2. O cálcio que ativou a proteína é hábil em unir as cadeias de manose das glicoproteínas das leveduras. mas também outros tipos de bactérias (Escherichia coli.0. Cepas de cervejarias. Muitas cepas de laboratório pertencem ao grupo FLO1. Bactérias láticas. maltose e glucose. Além disso. As sínteses destas proteínas resultarão em um grande aumento na hidrofobicidade da célula de levedura. a ligação de lectina é primariamente inibida por manose e a ligação é sem dúvida independente do pH do meio. Ligação tipo-lectina Lectinas são proteínas que são hábeis em ligar resíduos de açúcar. As proteínas da parede celular do grupo FLO1 são fortemente hidrofóbicas. este é também o caso para outras proteínas glicosiladas da parede celular que podem agir como açúcar ligante na ligação tipo-lectina. Isto não é necessariamente o caso. hidrofobicidade e ligação tipo-lectina deveriam ser consideradas como dois aspectos do mesmo mecanismo. Esta ligação resultaria na formação de flocos e por seqüência a floculação de proteínas. Neste grupo.doc 125 6/7/2011 . frequentemente pertencem ao grupo NewFlo em que a floculação não é apenas inibida pela manose. Por um mecanismo similar. mas também por sacarose. mas também aquelas com os genes FLO5 e FLO8 e presumariamente aquelas com o gene floculante) e o grupo NewFlo. a dependência do pH na floculação está muito distante no grupo FLO1. Reconciliação dos dois mecanismos Frequentemente a teoria da hidrofobicidade e a teoria da ligação tipo-lectina são tratadas como dois mecanismos independentes. mais do que como dois mecanismos. algumas proteínas da parede celular das leveduras podem ligar-se os resíduos de açúcares das glicoproteínas desta mesma parede celular e em outras células de leveduras.hidrofobicidade coincide com a floculação. Portanto. entretanto. Esta ligação induziria a floculação. A proteína tipo-lectina seria sintetizada durante a fermentação e o cálcio seria necessário para a ativação da proteína.

A floculação da suspensão de leveduras pode ter pelo menos duas causas: (1) presença de linhagem floculante de levedura. o transtorno é grande.Hafinia protea) podem aderir-se a levedura por indução de cálcio. A floculação da levedura nas dornas de fermentação alcoólica causada por bactérias é conhecida pela maioria dos técnicos de usina. Na maioria dos casos. identificando uma espécie de Sporolactobacillus como responsável pela floculação do fermento. porém sabe-se que um nível elevado de contaminação pode causar: (1) redução da produtividade e no rendimento fermentativo pela competição pelo substrato. Em alguns casos. No entanto apesar da floculação do fermento ser citada como um dos possíveis efeitos da contaminação. Foi mostrado que algumas cepas de leveduras têm uma afinidade melhor com o ácido lático produzido por bactérias do que outras. este aspecto não foi investigado com maior profundidade. ligação tipo-lectina e inibição de açúcar são comparáveis com o mecanismo da floculação lectina-levedura.0. dificultando principalmente a separação das leveduras nas centrífugas e afetando a produtividade na fermentação. como conseqüência da diminuição da superfície útil das células de levedura e redução de aproximadamente 15% no rendimento. Fermentacaoalcoolica v2. uma caracterização cuidadosa da cepa da levedura pode ajudar a prevenir problemas. Esta interação pode ser positiva. O efeito do contaminante sobre a levedura é ainda pouco conhecido. Estudos mostraram a relação entre a contaminação bacteriana presente nas dornas com o problema da floculação. Comparável com a floculação de leveduras. Também neste caso.doc 126 6/7/2011 . e (3) floculação das leveduras pela ação das células bacterianas. O principal efeito dessa infecção. consistiria no aumento progressivo de tempo de fermentação. (2) redução da vitalidade das células de leveduras pela “intoxicação” por metabólitos do agente contaminante. de acordo com estes autores. de qualquer maneira. Ação de bactérias Vários estudos sobre os efeitos da contaminação microbiana na fermentação alcoólica têm sido relatados na literatura. (2) presença de bactéria que causa a floculação de leveduras. a ligação levedura-bactéria depende fortemente da cepa. A sensibilidade à contaminação da levedura pode não ser deduzida do comportamento da floculação da própria levedura: floculação de leveduras e cofloculação levedura-bactéria são determinadas por outra proteína da parede celular. a ligação leva a contaminações indesejáveis. como é o caso na produção de cervejas ácidas ou cervejas claras naturalmente acidificadas.

fermentum apresentouse como a bactéria predominante entre os Lactobacillus. Verificou-se que o problema da floculação de leveduras por contaminantes bacterianos tem sido intensificado pelo reciclo de células que consiste na reutilização do chamado “leite de leveduras”. embora o sistema de floculação de Saccharomyces cerevisiae causado por bactérias do gênero Lactobacillus.0 se comparada com a floculação provocada por leveduras floculentas. bactérias sabidamente produtoras de goma não estariam implicadas na floculação. Considerações importantes Sugere-se que a floculação de Saccharomyces cerevisiae causada por bactérias do gênero Lactobacillus envolva um mecanismo intercelular em nível da parede celular destes microrganismos. este pode Fermentacaoalcoolica v2. Desta forma. o número de células de bactérias deveria atingir um valor crítico com relação ao número de células de leveduras. A desfloculação com a acidificação da suspensão de levedura (“leite”) tem sido comumente observada nas destilarias de álcool. Este efeito mostrouse reversível. uma vez que não são capazes de sobreviver por longos períodos nas condições de fermentação do álcool. A floculação causada por L.doc 127 6/7/2011 . uma vez que a floculação era restabelecida quando o pH era ajustado a valores superiores a 2. as bactérias pertencentes ao gênero Lactobacillus sobreviveriam sob tais condições e constituiriam aproximadamente 60% das espécies de bactérias encontradas na dorna de fermentação. mais especificamente. Outros estudos indicaram uma linhagem de Lactobacillus fermentum como responsável pela floculação. Essa prática provocaria o acúmulo dos agentes da floculação limitando o número de reciclos e diminuindo a eficiência da fermentação. No entanto. tenha sido classificado de acordo com o modelo simbiótico.0 e 12. e carboidratos da parede celular da levedura. Os íons de Ca++. os grupos funcionais feno e indol. uma relação em massa seca de 0.061 e na contagem microscópica uma razão de 5:1 célula de bactéria/célula de levedura. a floculação máxima foi observada com 1380mg de leveduras. Estudos observaram que a adição de ácido provocou a separação das células. Assim para 84 mg/50ml de suspensão bacteriana.Estudos de contaminação microbiana na indústria do álcool no estado de São Paulo indicaram que provavelmente as espécies de Leuconostoc. fermentum ocorre numa faixa mais ampla de pH entre 2. sendo que a espécie L.5. ou seja. Ao contrário. também atuam diretamente neste sistema. desfazendo os flocos. para que houvesse floculação. por sua vez. Este processo deve envolver componentes protéicos da superfície celular das bactérias.0.

glucônico. As bactérias utilizadas industrialmente são as anaeróbias e microaerófilas. . identificou-o como um produto de fermentação. ou para a produção de alimentos como queijos. fumárico. e a cepa isolada foi de Streptococcus lactis. lático. lático. descobriu sua estrutura. Delbruek verificou que temperaturas relativamente altas eram favoráveis à produção do ácido. isolou-o e identificou-o como sendo o principal constituinte do leite ácido.O ácido lático é o nome comum do ácido 2-OH propiônico (CH3-CHOH-COOH). Os principais ácidos são: cítrico. sendo que. gálico. ÁCIDO LÁTICO Produção de ácidos por microrganismos Os fungos e as bactérias podem ser usados pelo homem para obtenção de produtos com grande valor econômico.Para Pasteur. Os fungos também são usados na produção de ácidos por via fermentativa. itacônico. . conhecido como um componente dos leites ácidos. para a produção de ácido acético. glucônico.doc 128 6/7/2011 . em 1877. Histórico . propiônico e outros. vinagres. Os ácidos são provenientes da degradação anaeróbica de glicídeos por oxidação incompleta. no entanto. em 1847. devido ao envolvimento de um componente protéico da parede celular do microrganismo floculante. picles. a presença de íons se mostrou importante para a manutenção deste processo. São.A produção industrial do ácido lático passou a ter maior importância após 1881. de maior interesse econômico algumas das bactérias produtoras de ácido lático. chucrutes. leites fermentados e outros. como cultura pura. .ser enquadrado no modelo das lectinas.O pesquisador Blandeau. em 1780. giberélico. As bactérias envolvidas nos processos para obtenção de ácidos são principalmente as do gênero Acetobacter e Lactobacillus.Nesta época. ácidos graxos e outros. o qual possui características de uma lectina e apresenta afinidade por sítios receptores constituídos por carboidratos.O farmacêutico Schelle. Fermentacaoalcoolica v2. o ácido lático foi um dos primeiros problemas microbiológicos. .O primeiro a isolar os microrganismos. foi Lister. . As bactérias podem formar inúmeros ácidos diferentes.0. kógico. ácido acético e de ácido propiônico. .

. As bactérias láticas são todas anaeróbias aerotolerante que crescem prontamente na superfície de um meio sólido exposto ao ar.O ácido lático. que pode combinar-se com heme suprida exogeneamente para produzir uma enzima com as propriedades da catalase.0. Certas bactérias láticas adquirem atividade de catalase quando desenvolvidas na presença de uma fonte de heme (ex. melaços e soro de queijos. normalmente é sob forma racêmica. demonstrada pela ausência de formação de O2 quando as células são misturadas com uma gota de H2O2 diluído. Tem sido demonstrado que essa enzima prolonga a viabilidade das células em fase estacionária incubadas sob condições aeróbias. não esporulados. obtido por fermentação. Considerações Gerais Bactérias láticas As bactérias láticas são organismos sem mobilidade. Entretanto. .Atualmente. é um dos mais úteis testes para o reconhecimento destes organismos. no entanto Lactobacillus que produzem formas opticamente ativa. Tais espécies sintetizam uma proteína denominada pseudocatalase. mas parece não ser importante para as células em crescimento ativo. Pseudocatalase é uma enzima contendo manganês que apresenta fraca atividade de catalase mesmo na ausência de heme. produzindo ácido lático como principal produto final. Fermentacaoalcoolica v2. existindo. a partir de glicose de milho. em meio contendo hemácias). é produzido. portanto não pode mediar a decomposição de H2O2 de acordo com a seguinte reação: 2 H2O2---2 H2O + O2 A ausência de atividade de catalase. elas são incapazes de sintetizar ATP por meio respiratório. em forma de bastonetes ou cocos. principalmente. Uma conseqüência da incapacidade de sintetizar hemeproteínas é que as bactérias láticas são catalase-negativas e. G+. um reflexo de sua incapacidade de sintetizar citocromos e enzimas contendo o grupo heme (a porfirina que é o grupo prostético de algumas enzimas e proteínas). A denominação bactérias láticas vem do fato que a energia na forma de ATP é obtida através da fermentação de carboidratos. já que eles são virtualmente as únicas bactérias despojadas de catalase que podem crescer na presença de ar.doc 129 6/7/2011 ..

Tolerância à acidez: Uma característica fisiológica diferenciadora das bactérias láticas é sua alta tolerância à acidez. como resultado da ausência de citocromos. Como resultado desses requerimentos.0. um considerável número de aminoácidos e bases purínicas e pirimidínicas. A capacidade das bactérias de produzir e tolerar uma concentração relativamente alta de ácido lático é de grande valor seletivo. uma conseqüência do seu metabolismo exclusivamente fermentativo. O tamanho reduzido das colônias é atribuído principalmente ao baixo rendimento de crescimento. Características da colônia Mesmo crescendo em meios muito ricos. extrato de levedura ou outros materiais vegetais ou animais digeridos. já que as capacita a eliminar a competição da maioria das outras bactérias em ambientes ricos em nutrientes. as bactérias láticas são normalmente cultivadas em meios contendo peptona. até que o pH tenha reduzido-se a um valor menor ou igual a 5. Embora as bactérias láticas na forma de cocos possam iniciar o crescimento em meios com pH neutros ou alcalinos. O crescimento de todas as bactérias láticas continua através da fermentação. Raramente são pigmentadas. Bactérias homofermentativas São muito importantes e tem grande interesse na fabricação do ácido lático. Padrões de fermentação de carboidratos em bactérias láticas As bactérias láticas podem ser divididas em dois subgrupos bioquímicos de acordo com os produtos formados a partir de glicose. Estes devem ser suplementados com um carboidrato fermentável para prover uma fonte de energia.doc 130 6/7/2011 . a maioria das formas bastonetes não podem crescer em meios com um pH inicial maior que 6. Fermentacaoalcoolica v2. as colônias de bactérias láticas sempre permanecem relativamente pequenas.Requerimentos nutricionais Estes organismos possuem requerimentos complexos de fatores de crescimento: requer vitaminas do complexo B.

bulgaricus: temperatura na faixa de 45 . Principais bactérias láticas Para a produção do ácido lático.50°C.L. Os compostos intermediários importantes na via heterofermentativa são o ácido piruvico e o aldeído acético. No final da via glicolíticas. leishmanii: temperatura acima de 30°C. o ácido pirúvico.0. O intermediário importante para a formação do ácido lático é o ácido pirúvico.Os primeiros estágios da via metabólica da fermentação lática são os mesmos da fermentação alcoólica. as heterofermentativas degradam a glicose através da via oxidativa das pentoses fosfato. TIPOS DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA Fermentação descontínua ou batelada Condução da fermentação Providencias preliminar para partida O sucesso da fermentação depende basicamente do número e do estado fisiológico da população inicial de leveduras.Lactobacillus delbrueckii. L. sob a ação da enzima lactato desidrogenase dá origem ao ácido lático. casei e Streptococcus lactis: temperatura ao redor de 30°c. . L. Enquanto as bactérias homofermentativas degradam a glicose através da via glicolíticas. pentosis. ou mais especificamente a via de Embden-Meyerhof ou via glicolíticas. são as bactérias homoláticas do gênero Lactobacillus e Streptococcus.doc 131 6/7/2011 . . devendo-se trabalhar com muito critério na fase de partida.L. Bactérias heterofermentativas As fermentações da glicose por essas bactérias resultam em vários produtos. A espécie escolhida depende do carboidrato disponível e da temperatura a ser empregada: . Fermentacaoalcoolica v2. O rendimento líquido em ATP: 2 moles / mol de glicose pela via homofermentativa e apenas 1 mol / mol de glicose pela via heterofermentativa.

tubulação e caixas de caldo. bombas e peneiras de caldo. . . É particularmente importante contabilizar a moagem com o consumo inicial de açúcar na fermentação. sistema de recalque de água de resfriamento e diluição. partindo de tubo de cultura pura.válvulas e conexões da tubulação sem vazamentos e pontos estagnantes. Partida e sistemas de partida Existem atualmente três opções para a partida da fermentação: . tanques e tubulações de ácido sulfúrico.centrífugas e sistemas de proteção – filtros e hidrociclones – testados e em condições de uso. O pessoal da operação e de controle deve estar suficientemente treinado e motivado.fermento selecionado. sistema de geração e aspersão de ar comprimido.6 mm. serpentinas. geração de vapor e energia elétrica. O laboratório de controle químico deve estar em condições de uso. A data do início da propagação do fermento deve ser consensualmente decidida em função da data do início da moagem. verificados o funcionamento e a aferição dos seus equipamentos.verificar estoque de boquilhas de diversos tamanhos – 0. preparadas as soluções padrões e reagentes necessários para toda a safra.O trabalho deve iniciar pela limpeza e teste geral da instalação de fermentação. particularmente agitador da cuba.85 até 1. tanques e bombas de méis.fermento prensado. além de estar atualizada toda a vidraria e reagentes. padronizado o método de análise e atualizado os boletins e outros impressos necessários. trocadores de calor. .dornas e pés-de-cuba limpa e com acessórios verificados.0. bem como da expectativa de paradas em período próximo do início da propagação.linhas de fornecimento verificadas: tubulações. tubulação de vapor de baixa pressão. Fermentacaoalcoolica v2. compressores e tubulação de ar. . .fermento selecionado. de mosto.instrumentação e controladores em condições de uso. do estoque de méis e do avanço da manutenção da instalação como um todo – moendas. preparados os corantes. . o número e o estado de laminas e lamínulas..doc 132 6/7/2011 . pé-de-cuba e vinho limpos com água quente. devendo-se verificar os seguintes pontos: . Em paralelo deve-se atualizar o estoque de produtos químicos – nutrientes. que devem ser minimizadas. É particularmente importante verificar a limpeza do microscópio. etc. . partindo de leite de leveduras e. antibióticos e ácido sulfúrico etc. .

seguindo-se incubação à temperatura ambiente (ou a 30 – 32º C). ao acúmulo de produtos metabólicos e outros fatores. que afetam a performance da levedura. Kamoran WP. solidificados com Agar. devido ao método de manutenção utilizado: repliques (subculturas). Infelizmente não existe um único fermento que atenda satisfatoriamente a todos os requisitos acima.doc 133 6/7/2011 .alta flexibilidade para suportar as variações normais na composição e vazão das matérias-primas e insumos. Fermentacaoalcoolica v2.baixos requisitos nutricionais e alta afinidade com o meio em termos da habilidade de fermentar os açúcares presentes no mosto. . diferentes variedades. de fato. ao risco de seleção e principalmente à variação de crescimento.Cada uma das opções tem suas vantagens e desvantagens. Este método baseia-se no semeamento periódico da superfície de meios de cultura.5.temperatura ótima para reprodução e fermentação compatíveis com o sistema de resfriamento e de recuperação do álcool evaporado. Corstan. entre elas: . .controle eficaz da contaminação bacteriana com o uso de antibióticos de alto espectro de atuação – Kamoran.0. da capacidade de resfriamento e capacidade de centrífugas. .compatibilidade do fermento com a instalação. no ambiente normal de trabalho. com quantidades muito pequenas de leveduras. o tubo de cultura contém o microrganismo com as habilidades requeridas. os quais levam à necessidade de repliques (transferência) freqüentes. . como por exemplo. A principal desvantagem deste método é que o microrganismo tem um período de viabilidade pequeno devido à perda de água. . É bastante provável que haja variações.baixa tendência à floculação e/ou decantação. em termos de número de dornas. HJ Gold e KG. É importante ressaltar que já existe uma tecnologia perfeitamente dominada – na indústria de produção de fermento para panificação e outras indústrias que se utilizam do microrganismo – para garantir a estabilidade genética e fenotípicas de microrganismos selecionados. Partida com tubo de cultura pura A primeira desvantagem é a dúvida se. . Isso pode levar facilmente à contaminação externa.0 a 4. .alta estabilidade no comportamento fermentativo. considerando-se ainda que cada instalação tem particularidades.pH e acidez ótimos compatíveis com o processo normal de controle – pH da fermentação variável de 2. produtividades e graus de maturação da cana.

aumentando a probabilidade de infecção com bactérias e outras leveduras.doc 134 6/7/2011 . Em condições aeróbias. principalmente nas cubas. a propagação realizada a partir de tubo de cultura pura só tem sentido em laboratórios de microbiologia e fermentação bem aparelhados. Assim.0 ppm em relação ao volume de mosto a ser adicionado. entretanto. de acordo com o exposto.5% ART). que deve ser suficientemente baixa (< 0. Isso poderia ser conseguido por congelamento profundo em nitrogênio líquido. A segunda desvantagem é a necessidade de assepsia completa nas fases iniciais de propagação. O controle da contaminação bacteriana deverá ser mantido desde o início da propagação em laboratório sempre em dosagem de no mínimo 5. pois a concentração celular inicial é baixa. que costumeiramente tem leveduras já adaptadas (da ordem de 105 lev. Ainda com relação a propagação na fase industrial. porém. seria altamente recomendável que se fizesse em meio fracamente aeróbio e com controle de concentração de açúcares no meio em fermentação. haverá produção de álcool em detrimento da produção de leveduras. de uma técnica cara e que exige precauções especiais de manipulação e de segurança. provavelmente teremos um volume de vinho em fermentação ainda com uma pequena concentração de leveduras (em geral em torno de 1 – 2% vol. ou menos de 3x107 leveduras/ml) que será alimentado com um mosto não estéril. a velocidade específica de consumo de açúcares é mais baixa que em condições anaeróbias. o que levará a um tempo longo de propagação. É fato conhecido que mesmo em meio aeróbio.0. valor este dependente da cepa e da velocidade específica de reprodução (em geral menor que 0. se a concentração de açúcares for acima de um valor máximo.5% ART) para garantir a conversão da maior parte dos açúcares em leveduras com alta atividade enzimática. tornando desfavorável qualquer competição com outras leveduras./ml).O método ideal de manutenção seria aquele que paralisasse de forma não seletiva toda atividade metabólica de uma população crescida em condições que preservem as habilidades específicas. pois o volume de mosto adicionado será muitas vezes maior que o volume de vinho inicial. levando assim a uma competição desfavorável. pois a concentração inicial de leveduras é muito baixa. A baixa concentração inicial leva também a um tempo excessivamente longo de propagação. tratando-se. inicialmente presentes no mosto (ou vidraria) não estéril. aumentando o número de transferências de volumes e em conseqüência. Chegando-se finalmente a fase industrial. Fermentacaoalcoolica v2./vol. Há a necessidade também de complementação do mosto com quantidades compatíveis de nutrientes e da capacidade adequada de resfriamento.

se foram produzidas. Partida com leite de fermento selecionado Se for admitida a hipótese de que o leite de leveduras recebido pela destilaria contém uma grande proporção de leveduras com habilidades específicas. A única vantagem da partida com o tubo de cultura é que haverá um grande aumento na massa celular e. Seca/kg ART x 0.59 kg N/m3 mosto = 1. é possível então propaga-lo de forma otimizada. seca x 65 kg ART/m3 = 1.35 kg de levedura seca por quilograma de ART convertido e. em aerobiose 0. pois temperaturas maiores tenderiam a desviar o metabolismo para produção de álcool. O objetivo da propagação é a produção da maior quantidade possível de fermento com a maior atividade enzimática. recomendando-se mais de 108 leveduras/ml. Para tanto.mesmo assim.5%N. A aplicação de antibióticos com alto espectro é fundamental para o controle efetivo da população de bactérias. Com respeito a esse controle. sempre em relação ao volume de mosto a ser utilizado durante a propagação do fermento. o uso de mostos diluídos (digamos caldo ou méis diluídos a 8º Brix). Fermentacaoalcoolica v2. O pH deve ser controlado na faixa de 3. se for garantida a presença de material genético adequado e ainda se o produto final da propagação resultar em alta concentração celular (>108 lev/ml). as leveduras passarão por várias gerações no meio de cultura (mosto-vinho) e assim resultarão bem adaptadas a este meio. para que se mantenha sempre um teor baixo de ART. a concentração de leveduras deve ser suficientemente alta para evitar competição com as leveduras e bactérias do meio.2. portanto./vol. Assim. facilita o trabalho por não tamponar excessivamente o meio em fermentação. ainda se for controlada a adição de açúcar a partir de um mosto a 8º Brix (65 g ART/lt).5 a 4. há a necessidade de aeração intensa para que exista oxigênio dissolvido no meio e.07 kg N/kg mt. recomendando-se entre 25 a 28ºC. se a levedura contém 7% de nitrogênio em relação à matéria seca e. citado acima. podendo chegar mais próximo de 3.). ou mais de 6% (vol. minimizando assim.35kg mat.0.5. além disso. isto pode ser conseguido facilitando as atividades construtivas (anabolismo) da levedura. A dosagem deve ser em torno de 5. que exista muito pouco açúcar em solução para evitar o efeito inibidor da reprodução. O controle da temperatura nesta fase é essencial. O mosto deve ser complementado com todos os elementos que fazem parte da composição da levedura. Desde o início da propagação.0 ppm. o mosto deverá conter: 0.doc 135 6/7/2011 . a competição pelos açúcares.

Após o tratamento ácido deverá ser alimentado mosto na proporção de 2 – 5 % do volume Fermentacaoalcoolica v2. Após a fase de cortes. devendo-se complementar.8 de 5 – 7%.35g de H2SO4 por litro de mosto supre as necessidades de enxofre. portanto. verificar se os requisitos de enxofre estão atendidos. a melhor estratégia é a prevenção. recomenda-se usa-lo na complementação do mosto na forma de H2PO4.1 kg S/m3 mosto = 0. pH=2. neste caso. ou cerca de 1. já se deve usar o tratamento ácido do fermento.35kg mat./m3..Por exemplo. Deve ser ressaltado que a complementação é necessária principalmente na fase inicial da propagação. recomendando-se inicialmente pH=3 para um teor de fermento até 5%. não havendo contra-indicação de se colocar mais que o suficiente para controle do pH na faixa de 3.35 kg mat.5 a 4. devendo-se.5 a 2. etc.ou HPO4= para que se atenda ao requisito de 0. pH=2. o teor de fermento. cortes. se for determinado que o mosto a 8ºBrix contém 0. o teor alcoólico. exigem um alto nível de controle microbiológico medindo-se a viabilidade celular. viabilidade e produção de leveduras. etc. portanto. Com relação ao fósforo. isto representa 0. a acidez produzida.seca x 65 kg ART/m3 mosto = 1. deverá ser adicionado ao mosto 0. uma vez que após a propagação serão feitos cortes com menor adição de nutrientes e os mostos mais concentrados conterão maior proporção de nitrogênio e fósforo. perfeitamente possível utilizar somente DAP na proporção de 1.seca/kg ART x 65 kg ART/m3 – 0. ou seja.5.12% de nitrogênio assimilável. pois os nutrientes adicionados e não convertidos serão conservados em solução.2 para teores superiores a 7%. alimentação.0 ppm do mosto a ser fermentado. É.seca x 0. O teor de açúcar do mosto deve ser aumentado gradativamente (10 – 20% por ciclo). sempre em dosagem em 5. pois seriam necessários: 0.0.32 kg H2PO4.3g de nitrogênio por litro.14 kg H2PO4. com aproximadamente 1. ou: 0. observando-se a resposta do fermento em tempos do tempo de fermentação.5 g de MAP (ou DAP) por litro de mosto.0004kg S/kg mat.3 kg SO4=/m3 mosto A adição de 0. Em relação à infecção.6mM/g célula seca.seca/Kg ART x 0.5 g de sulfato de amônia ou DAP.doc 136 6/7/2011 ..6 x 97g H2PO4. a contaminação bacteriana. Toda a fase de propagação. através da aplicação de antibiótico com alto espectro./kg mat./m3 mosto Se o mosto a 8ºBrix contiver 100 ppm P2O5. devendo-se tomar medidas urgentes caso sejam detectados problemas.5g/lt para atender os requisitos de nitrogênio e fósforo.

ao contrário das outras opções onde a adaptação é gradual. quando o aumento adicional do teor alcoólico (através do aumento do teor de açúcares do mosto). um inoculo de 1:100 até 1:1. portanto. pouco adaptada ao meio ambiente da fermentação.0. Assim.5%) e junto com o mosto todos os nutrientes. seu processo de fabricação é rigorosamente controlado para a produção de leveduras com habilidade de fazer crescer rapidamente a massa de pão que. Uma sugestão para aquisição de fermento prensado é exemplificada abaixo: . com abundante aeração e com muita complementação nitrogenada.000=420 kg Recomenda-se.teor de fermento desejado: 10%. principalmente da velocidade desejada com que se pretende atingir a produção máxima. Apesar destas restrições. tenderá a limitar a reprodução. Um outro ponto importante é que o fermento prensado destina-se basicamente para à panificação. . resultando em uma população muito ativa.massa a ser adquirida (partida em 4 semanas): 420/1. No período inicial (mínimo de 2 semanas).de cuba (teor de açúcares na cuba inferior a 0. embora seja um processo fermentativo. a produção de álcool (e o teor alcoólico do vinho) deverá ser proporcional ao teor de fermento vivo nas dornas. baixar o teor de açúcares do mosto em 20 – 30%. ou seja. haverá uma mudança brusca do ponto de vista do fermento.000 em relação à massa de fermento após partida. pois minimiza o tempo de partida. porém.massa de fermento “prensado” em processo (após partida): 14 x 300 x 0. . tem características totalmente diversas da produção industrial de álcool.2 tons . Partida com fermento prensado Com relação ao uso do fermento prensado na partida da fermentação.0h com agitação e aeração.massa a ser adquirida (partida em 2 semanas): 420/100=4. alguns esclarecimentos são importantes: o primeiro é o fato de que este fermento é produzido em condições particulares. A quantidade inicial de fermento a ser adquirida depende de uma série de fatores.1 = 420 tons . a partida com este fermento é talvez a melhor opção para médias e grandes instalações.5 a 2. o aumento de produção deve seguir o aumento da massa de leveduras ativas. ou seja. deve ficar claro que.instalação de fermentação: 14 dornas de 300 m3 cada. Fermentacaoalcoolica v2. devendo-se deixar por mais 1. Caso haja redução de viabilidade.doc 137 6/7/2011 . até que seja atingida a concentração desejada (6 a 12% vol/vol).

Para exemplificar o que significa o controle da população de leveduras. mas também permitir a identificação da sua tendência de evolução (degeneração ou recuperação). . facilitando a tomada de decisões. foi também dito que um aumento da temperatura eleva a taxa de morte de leveduras e aumenta as perdas por evaporação e arraste de álcool nas dornas. uma delas parece ser a mais eficiente: trata-se de dirigir a atenção ao agente da fermentação que é a população de leveduras. Controle operacional da fermentação contínua Introdução e estratégias O objetivo básico do controle é fornecer os parâmetros necessários para a tomada de decisões que levem concomitantemente à maximização do rendimento e da produtividade do processo com custos mínimos (insumos. Assim. Fermentacaoalcoolica v2. não só quantitativamente como também qualitativamente. as decisões possíveis são: . para identificar a existência de correlações entre os parâmetros.Todas as recomendações em relação ao pH.reduzir o teor de açúcares no mosto: porque reduz a carga térmica horária.reduzir a velocidade de alimentação das dornas: pelo mesmo motivo. em uma determinada instalação de fermentação que esteja funcionando no máximo de sua capacidade de resfriamento. Ultrapassado este valor crítico. o que se pode conseguir com a realização de gráficos de controle. Uma fase posterior do controle envolve o tratamento estatístico dos dados. aerações constantes e dosagem de antibiótico são igualmente válidas para os itens anteriores e importantes para o fermento prensado.doc 138 6/7/2011 . Os boletins devem não apenas colecionar informações sobre as condições reais de operação.0. Dentre as diversas estratégias que podem ser seguidas para cumprir o objetivo do controle. que deve ser maximizada. o controle deve identificar qual o limite de temperatura em que o sistema pode operar de forma estável para que o rendimento não cais. de onde são obtidos os parâmetros. Os principais instrumentos do controle operacional são os boletins e gráficos de controle. energia e perdas). mão-de-obra. anteriormente foi citado que a temperatura de fermentação afeta tanto a velocidade de fermentação e de crescimento das leveduras como também afeta a velocidade de crescimento das bactérias contaminantes. nutrientes.

doc 139 6/7/2011 . Torna-se claro. portanto. Normalmente este aumento está associado à infecção. pois altos teores elevam à inibição e morte de leveduras. ou seja. Fermentacaoalcoolica v2.aumentar a aeração nas cubas e dornas: regenerar os danos causados pelo tratamento ácido intenso. Há evidencia de que quando o teor de levedura viva diminui.. o parâmetro mais importante é o índice de viabilidade. A queda neste índice (teor de levedura viva) está associada à nutrição (carência de nitrogênio). o mais útil é o teor de leveduras vivas (que se encontra multiplicando a viabilidade pelo teor de levedura). Assim. ou seja.das análises microscópicas. que não é possível estabelecer qualquer controle operacional se não houver condições para obter estimativas razoáveis dos parâmetros do processo. Da experiência prática temos verificado que: . à temperatura elevada (esta reduz a velocidade de reprodução e aumenta a taxa de morte) e principalmente ao teor alcoólico. se os métodos de medida não são confiáveis. as decisões que se seguem às diversas perturbações que ocorrem no processo em geral devem se dirigir a manutenção da maior e melhor população de leveduras que for possível. porém. .0.aumentar a diluição do pé-de-cuba: rebaixar o nível inicial de temperatura pelo uso de mais água fria e diminuir a concentração inicial de leveduras. há necessidade de maximizar o rendimento fermentativo. principalmente. aumentando a taxa de morte de bactérias e selecionando a população de leveduras. dentro de restrições impostas pela instalação de fermentação de principalmente pela necessidade de integração com a fabricação de açúcar. deve-se investir prioritariamente em recursos laboratoriais (equipamento e principalmente mãode-obra) para a implantação do controle. o rendimento cai.aumentar a dosagem de antibiótico: tornar mais seletivas as condições de tratamento. aumenta o tempo de fermentação. . . se associados a temperatura elevada.quando aumentar o índice de acidez produzida. Interpretação dos parâmetros do laboratório Uma vez atingida a capacidade adequada de produção de álcool. O índice de produção de leveduras também se correlaciona com o tempo de fermentação e o rendimento. Seguindo esta estratégia. reduzindo a carga térmica horária. estabelecido o nível desejado de produtividade.

redução do Brix do mosto. viabilidade muito baixa. . A redução na carga térmica para uma mesma produção. do tempo de turbinagem (descarga). deve ser estimada a carga térmica que está sendo efetivamente retirada.8. .aumentos no consumo de antiespumantes em geral. que é a soma do tempo de fermentação (aí incluído o tempo de alimentação).as análises microscópicas. caso seja constatado sobra de açúcar inferior a 5%.perdas de fermento superiores a 10% em geral causam redução de produtividade e rendimento embora sejam menos importantes que a queda de viabilidade.0. considerando o tempo do ciclo. realizadas. podem detectar alguma tendência à floculação e neste caso deve-se agir rapidamente para o seu controle com algumas medidas: redução do pH do tratamento ácido para 2 – 2. do tempo de tratamento ácido (que pode ser reduzido a um mínimo. devidos à própria cana ou ao pré-tratamento do caldo. do tempo de limpeza. etc. aumentando o consumo de antiespumantes. implica obrigatoriamente em aumento da temperatura de fermentação e em redução do rendimento.sendo que quedas substanciais podem estar associadas também a produtos inibidores no mosto ou nos nutrientes. do tempo de pós-fermentação (tempo de espera para início da turbinagem). A presença de sólidos insolúveis como argila e bagacilho tendem a estabilizar a espuma. Muita atenção deve ser prestada ao ponto de aplicação do produto antiespumante. Critérios de dimensionamento da fermentação alcoólica Dornas O volume total de dornas deve ser suficiente para atender à máxima produção de álcool projetada. em 20 – 30%. por exemplo. . deve-se procurar sérias falhas de operação. regeneração aeróbia do fermento. turbinagem de dornas vivas.. Fermentacaoalcoolica v2. substituição da fonte nitrogenada por nitrogênio orgânico. Em geral a redução na carga térmica está associada à formação de incrustação (orgânica) do lado da água.sempre que possível. Assim.2 ou até 1. A flotação de leveduras na espuma em geral está associada à floculação. redução das perdas de fermento através de homogeneização das dornas com aeração antes da turbinagem e controle eficiente da centrifugação. . . o que se pode fazer conhecendo-se a vazão de água e as temperaturas de entrada e saída. pH de tratamento ácido muito variável. refletem variações no teor de polissacarídeos e/ou proteínas no mosto.em fermentações contínuas é bastante raro índices de conversão de açúcares inferiores a 95%.doc 140 6/7/2011 .

o volume necessário de dornas será: volume.com o uso de fermentos adicionais ou do tratamento ácido contínuo) e do tempo d descarga do pé-de-cuba.de. Fermentacaoalcoolica v2. espaço para controle da espuma e considerado o espaço ocupado por eventuais acessórios como serpentinas de resfriamento.0.05m 3 3 2.08 Supondo que na produção máxima teremos um teor de fermento no vinho de 10%.doc 141 6/7/2011 .turbinado = VT = VT = 1.ciclo 100 x x x 24 ocupação. o tempo do ciclo pode chegar a 14.0 horas.turbinado = o 1 1 = = 12. será necessário um volume de vinho de: vinho = 1.225VT FL − FVT 50 − 10. o volume de vinho (antes das turbinas) necessário será: vinho = FL − FVT 50 − 1 49 X .5 horas.vinho.286 dia 10.95 m álcool / dia Para uma fermentação não otimizada. No volume das dornas. para produzir 1m3 de álcool (100%.31m 3 Se o tempo de um ciclo for de 10. deve estar previsto também espaço para o gás preso (“hold up”). Se considerarmos um teor alcoólico mínimo de 8ºGL (onde a produção é máxima) terá para a produção de 1m3 de álcool (a 100%.5m 3 GLVT 0.dornas = dornas 15.5 = 15.dorna GLV FL − FV tempo ciclo= tempo fermentação + tempo pós-fermentação + tempo turbinagem + tempo espera e. cada dorna funcionará: vezes 24 = 2.31 = 7.de.0 40 Portanto. 20ºC): volume. 20ºC).95 14 No caso geral: volume.dornas = Onde: o 100 FL − FVT tempo.de. um teor de fermento de 1% no vinho turbinado e 50% de fermento no leite.de.5 Portanto.vinho.4m 3 3 24 m álcool / dia x0.286 x0. Pode-se considerar 95% de aproveitamento do volume da dorna como um bom valor.dornas = dornas 15. que necessitaria de um volume de dornas de: volume.225 x12.31 = 9.

de.tempo espera= tempo tratamento + tempo de descarga pé-cuba e. como calculado acima. nem dornas muito pequenas que aumentam muito o número de operações manuais ou automáticas. que pode ser aproximadamente a 150 Kcal/kg ART. subtraída a entalpia retirada pela evaporação de água e álcool.individual = 2. Por exemplo. O calor total desprendido é igual à massa de ART fornecida multiplicada pela entalpia líquida da reação.total.468m 3 volume.doc 142 6/7/2011 . não inclui a dorna volante e deve ser dividido em um número mínimo de dornas. deveriam ser instaladas 7 dornas de volume em torno de 400 m3. evitando-se dornas muito grandes. que levam a um tempo de turbinagem muito longo e dificuldades de homogeneização. sujeitas a erro como: alimentação. controle de adição de antiespumantes. o dimensionamento do sistema de resfriamento passa obrigatoriamente pelo conhecimento das temperaturas do mosto. se esta instalação pretendesse produzir 350 m3 álcool anidro/dia (máximo) teríamos: volume.0. ocupação dorna= 92 – 98%. descarga. Quanto maior forem as temperaturas do mosto e do pé-de-cuba. Este volume. que é um valor razoável. pé-de-cuba e evidentemente da água de resfriamento. etc.dornas = 350 x7. controle de pressão.468 = 411m 3 6 Considerando mais uma dorna como volante. Deste total aproximadamente 8% é perdido como evaporação de água e álcool. O balanço entálpico em torno de uma dorna mostra que a entalpia a ser retirada é a diferença entre a gerada e a “absorvida” pelo mosto e pelo pé-de-cuba. O tempo de turbinagem será aproximadamente 1 hora e 50 minutos. No caso acima.05 = 2. o restante elevará a temperatura do mosto e pé-de-cuba até o valor de controle e então o trocador de calor manterá a temperatura neste valor. Assim. limpeza. maior será a temperatura máxima a ser atingida na fermentação para um dado trocador e uma dada vazão de água fria ou maior terá de ser a vazão de água para manter a temperatura máxima constante. Resfriamento de dornas Os equipamentos de troca de calor têm que ser acoplados às dornas tendo em vista que o processo é altamente exotérmico. no caso acima temos: Fermentacaoalcoolica v2.

- 400 m3 de vinho, dos quais: 140 m3 são pé-de-cuba e 260 m3 de mosto; - temperatura do pé-de-cuba: 27ºC; - temperatura do mosto: 30ºC. Neste caso, cada dorna receberá 45,9 tons ART, que corresponderá à uma carga térmica liberada de:

C .T . = 45,9 x150.000 x 0,92 = 6.334.200 kcal
O mosto absorverá:

mosto = 260.000 x1,09 x (35 − 30) = 1.417.000 kcal
O pé-de-cuba absorverá:

pé − de − cuba = 140.000 x1,3 x(35 − 27 ) = 1.153.600 kcal
Resultando em uma carga térmica total a retirar de:

C.R. = 1.417.000 + 1.153.600 = 3.763.600kcal
Se 2/3 desta carga é liberada no período de enchimento, que neste caso é próximo de 2 horas, o trocador deverá retirar:

2 x1.763.600 = 1.254.533kcal 3x 2
Um trocador, instalado nesta dorna e que pode ser compartilhado com outro, teria uma equação de funcionamento como a seguir:

Q = UxAxΔT , ou.1.254.533 = UxAxΔT
Para U=3.500 kcal/m2 x h x ºC e ΔT =3,5ºC (trocador a placas),

A=

1.254.533 = 102,4m 2 3.500 x3,5

Como são seis dornas poderia ser comprados 3 trocadores de calor com uma área total de 307,2 m2. Neste caso a relação área de trocador/produção álcool fica em 307,2/350=0,88 m2/m3 de álcool por dia. Neste mesmo caso, seria impossível manter a mesma temperatura máxima com serpentinas, pois teria de ser instalada uma área de:

1.254.533 896,1 = 896,1m 2 , ou, = 2,24m 2 serpentinas/m3 dorna. A máxima área 400 x3,5 400
instalada de serpentinas ( em dornas de até 300 m3 ) é de 1,0 m2/m3, que já causa problema na limpeza. Ainda neste caso (por absurdo) seria necessário adquirir 6x896,1m2=5.376,6m2 de serpentinas (15,4 m2/m3 álcool por dia), que custaria muito mais que o conjunto de 3 trocadores de calor a placas.

Fermentacaoalcoolica v2.0.doc

143

6/7/2011

Centrífugas de fermento
Para produzir 1 m3 de álcool (100ºGL, 20ºC) é necessário processar um volume de vinho de:

vinho =

FL − FVT FL − FVT

Este volume, acrescido da reserva de vazão necessária para permitir limpezas freqüentes, é a capacidade operacional das centrífugas que devem ser instaladas, sempre considerando a máxima produção, no mínimo teor alcoólico. Para definir o número de unidades a serem adquiridas, considerar o máximo teor de fermento no vinho, pois quanto maior este teor, menor a capacidade individual de cada máquina, mantida a eficiência. Vazão centrífugas (m3/h)=produção horária x vinho =

FL − FVT 100 100 xo x FL − FVT GL %utilização

A porcentagem de utilização situa-se entre 90 a 95%, dependendo do tipo de centrífuga, do teor de sólidos insolúveis, não leveduras no vinho, ou seja do tempo e da freqüência de limpeza. Para o exemplo acima, correspondendo a uma produção máxima de 350 m3/dia (14,58m3 álcool/h) e um teor alcoólico correspondente de 8ºGL, com uma ocupação de 92,5%, a vazão a ser instalada é de:

14,58 x

50 − 1 100 100 x x = 241,3m 3 / h 50 − 10 8 92,5

Se o teor de fermento no vinho for maior, digamos 20%, mantido 50% no leite, teríamos uma capacidade de:

14,58 x

50 − 1 100 100 x x = 321,8m 3 / h 50 − 20 8 92,5

Por outro lado se for possível manter um teor de fermento no leite substancialmente maior, por exemplo, 70%, ficaríamos com:

14,58 x

70 − 1 100 100 x x = 271,9m 3 / h 70 − 20 8 92,5

Finalmente, dependendo da flexibilidade desejada e das condições do vinho (sólidos não leveduras) devem ser instaladas entre 240 e 320 m3/h ou entre 3 a 4 máquinas com capacidade efetiva de 80 m3/h cada uma.

Fermentacaoalcoolica v2.0.doc

144

6/7/2011

Tratamento do fermento – pé-de-cuba
O volume necessário de pé-de-cuba, depende do volume de leite gerado, da diluição desejada, do número de dornas processadas por dia e finalmente, do tempo de tratamento desejado. Para o tratamento convencional (batelada) são necessárias 1,75m3 cubas/m3 álcool por dia, divididos em 4 cubas. No exemplo, para a produção de 350m3 álcool por dia, o volume total de cubas seria de 612,5m3 ou 153,0m3 em cada cuba. Se o volume ocupado for de 150m3, seria possível uma diluição de 1:1. Diluições maiores exigiriam matérias-primas concentradas e evidentemente maiores cubas. O uso do tratamento ácido contínuo permite operar com 1,3m3 cubas/m3 álcool por dia (economia de 25% no volume) podendo-se dividir o volume total em 3 cubas.

PERDAS DURANTE O PROCESSO
Desde o preparo do solo para o plantio da cana até o carregamento do caminhão de álcool pode-se perder açúcar e/ou álcool. A otimização de cada etapa do processo de produção de álcool é condição prioritária para se obter altos rendimentos em litros de álcool por hectare. A origem das perdas pode ser de natureza não microbiológica, mas é via de regra, microbiológica. De todas as etapas da produção de álcool, existem duas onde as variações no rendimento são bem maiores que as outras: ART (açúcar total) por hectare e fermentação alcoólica. Encontramos locais onde a produção de cana por hectare é de 40 tons e em outros, 120 tons/há. Por outro lado a variação média anual do AART na cana de destilaria para destilaria pode variar de 13.5 ART% cana à 18,0 ART% cana (30% de variação). Na fermentação, caso semelhante pode ocorrer, pois fermentações infeccionadas ou com muita perda de fermento podem chegar a rendimentos de 70% ou menos, enquanto que se houverem bons equipamentos, e a operação for bem conduzida, este rendimento pode ir além dos 90% (22% de variação). Nas outras fases do processo de produção de álcool, como corte, transporte, pátio, barracão, extração, filtro rotativo, destilação e indeterminadas, é muito difícil chegar nesta variação que encontramos com certa facilidade em açúcar/há e rendimento fermentativo. Sem dúvida, é muito importante para se avaliar as perdas, métodos acurados no laboratório industrial, e claro, a partir de amostragens bem feitas na indústria.

Fermentacaoalcoolica v2.0.doc

145

6/7/2011

9X10 7 7 1.0. etc.78 0. pois este aspecto pode afetar significativamente o rendimento fermentativo e a produção e qualidade do açúcar. portanto o prejuízo é dobrado. pois devido à grande superfície em contato com o ambiente. é impossível com as atuais tecnologias disponíveis. traz para a indústria mais bactérias.7X105 1.80 0.04 0.6X105 8. A tabela abaixo mostra a evolução de bactérias.04 0.08 0.4X107 5. o mais moderno.4X106 NQ=não queimada Fermentacaoalcoolica v2.6 0. Cana brocada.4 16.7X10 5 5 16. A cana picada deve ser moída diretamente assim que chega à indústria.86 0.doc 146 6/7/2011 . Tempo (horas) Levedura contaminante Bactérias (bastonetes) Pol (%) Acidez Álcool (%) NQ NQ 12 24 36 48 60 72 2. Por outro lado. traz mais bactérias para a indústria.2X108 5. leveduras e seus produtos em uma cana cortada e deixada na lavoura.01 0.45 0.4X108 5.0X108 1. portanto.6 17.7X10 8. terra na cana. nota-se então a importância da qualidade da matéria prima.11 1.3X106 3.85 0.67 0.7X107 1.6X105 1.11 0. terra.Qualidade da cana-de-açúcar A produção de açúcar por hectare é de responsabilidade do setor agrícola.42 0. qualidade da cana para a fermentação significa “nível microbiológico” ou “sanidade” da cana. Eliminar a infecção.78 0 0 0.0 17. mas tudo isso vaia penas diminuir percentualmente a contaminação que a cana está trazendo. esterilizar o caldo.2 16. A broca além de trazer infecção diminui o teor de açúcar na cana.1X10 5. Lavoura A indústria pode se preparar da melhor maneira possível com todo o equipamento. cana com terra e cana plantada em solo que recebeu vinhaça.2 16.5 16.4X105 7. esta cana se infecciona com mais facilidade e a destruição de açúcar é grande. e com todo o biocida que quiser.3 16. além de desgastes de equipamentos por corrosão. Uma parte do açúcar é transformada em álcool e ácido lático que saem no caldo e parte do álcool é evaporado..

a terra se localiza principalmente na parte de baixo. as canas que caem devem ser imediatamente retiradas. o pátio é mais susceptível. bem como através de uma adequação das operações de queima. bombas. Pode-se notar também que a cana queimada já inicia com uma contagem microbiológica bem maior que a não queimada. químicos ou de ambos. e as condições operacionais da indústria. no descarregamento dos caminhões. etc. No campo. pois perdeu. Nos Hilos. Armazenamento: pátio e barracão Os dois tipos de armazenamento da cana têm suas vantagens e desvantagens. transporte e recepção O carregamento da cana pode trazer muita terra.0. Por outro lado.É bom notar que neste ensaio não choveu. No pátio se amassa mais cana. ela se infecciona e leva esta infecção para a moenda e para toda a fábrica.3% lavada direta na mesa.doc 147 6/7/2011 . quanto mais rápido moer a cana depois do ateamento do fogo no canavial. Como se pode observar. O aumento da POL não significa que a cana não perdeu açúcar. Carregamento. exaustores das chaminés. pois a infecção seria maior se a umidade também fosse maior. menos se perde em açúcar. corte e transporte. pois traz infecção e aumenta a corrosão nas moendas. além de perder açúcar. Um bom manejo dos barracões e pátios de cana também são fatores importantes no controle do aumento da população bacteriana. mas em termos de perda de açúcar e aumento de infecção. detalharam bem as perdas de ART. Com base em 20. Portanto. esta cana amassada. a determinação do teor alcoólico no caldo é um parâmetro importante na determinação da deteriorização da cana. e esta terra tem um efeito grande na indústria. pois com a trepidação. e também perdeu água. Na realidade o açúcar total decresceu embora a concentração tenha se elevado devido à perda de água por evaporação. o desenvolvimento dos agentes contaminantes pode ser controlado através de um bom programa fitossanitário da cultura. as conclusões foram que as máquinas no pátio destroem 1.78% da cana desviada para o pátio e 35. ela desce. Isto pode ser conseguido por ação de meios físicos. na indústria. pois seu amassamento provoca uma multiplicação bacteriana significativa. fora a perda de açúcar por esmagamento. Dados da Usina da Pedra. No caminhão.21% do açúcar correspondente da cana que passa pelo Fermentacaoalcoolica v2. o desenvolvimento dos agentes contaminantes pode ser controlado através de meios que impeçam a sua multiplicação ou que provoquem a destruição dos mesmos.

varia de acordo com o tipo de corte da cana.0.26%. como a cana chega com amassamento transversais e longitudinais da lavoura. Algumas usinas têm trabalhado assim. e também da maneira que a cana é estocada. Entretanto. acreditamos que se possa moer a cana sem lavar. a lavagem 0. a água de lavagem arrasta 1. se as facas não estiverem bem amoladas e no desfibrador os martelos não estiverem também acertados. 0.21% do açúcar que passa no pátio e 1. a lavoura 0. Lavagem Na maior parte das usinas e destilarias. a cana desfibrada que fica aderente à esteira. A cana picada perde de 1. A cana inteira perde cerca de 0.doc 148 6/7/2011 . as máquinas contribuem com 0. não é sabido.pátio. A quantidade de água que lava a cana não parece afetar significativamente a perda (acima de 3m3/ton) pois a quase totalidade do açúcar que é lavado é o que está na superfície da cana ou do corte. pois o tipo de solo vai influenciar muito.8 a 1. Resumindo. A cana amassada pode perder até 15% do ART original da cana. se um bom trabalho for feito na parte agrícola.7% do açúcar que ela contém.26% da perda do açúcar total que entrou na Usina da balança até a esteira alimentadora. Em média. ou 0. há um amassamento grande da cana e o caldo desta cana cai na esteira que é lavada posteriormente. No preparo. A cana inteira de pátio perde cerca de 25% mais açúcar na lavagem do que a cana de barracão pois aquela é mais esmagada. Quanto maior.29% na mesa.0 a 3. se a cana não for lavada. Cada caso é um caso.47% e do açúcar total entrado. dependendo do tamanho do tolete. pode-se perder mais açúcar neste preparo e na extração do que imaginamos. quebra de decantador. Se o investimento que tem que ser feito nas indústrias se paga.25% do total que entrou na Usina. e assim caem novamente na esteira Fermentacaoalcoolica v2. bombas. o desgaste da moenda. A quantidade de açúcar que se perde na cana quando esta é lavada.21%.70% do total que entrou na Usina.0%. Esta água geralmente vai se juntar á água de lavagem da cana. qualidade do produto são fortemente afetados. menor a perda. No pátio e na mesa representam 0.70%. há uma perda de açúcar a mais na lavagem dessa cana. pátio ou barracão. se não tomarmos cuidado. perde cerca de 1. Por outro lado. Preparo e extração No preparo da cana (facas e desfibrador). Entretanto.26%. o objetivo é extrair mais açúcar na moenda. totalizando 1.25%. totalizando 0. tubulações. é retirada por ventiladores ou escovas.

rápida e são levados à moenda.5%. Medições efetuadas em cinco usinas e destilarias evidenciaram que esta perda variou de 0. onde o ventilador da esteira parou por defeito no motor.0. e o caldo de cana amassada pelas facas e desfibrador pode ser significativo. uma destilaria sem decantador pode até ter rendimento maior do que uma com decantador. o custo do decantador e filtro. parando pelo restante da hora.1 a 0. o rendimento da fermentação não poderá ser bom. ou ainda se a decantação for mal feita. pois se o sistema de refrigeração das dornas e do mosto não forem adequados. Os biocidas aconselhados para moenda. que devem ser usados em dosagem por um período de 15 minutos com concentração em torno de 100 ppm. A diferença em rendimento é significativa.doc 149 6/7/2011 . o tratamento do caldo por decantação tem conseguido mais adeptos a cada ano que passa. ou por falta de área de troca térmica ou por deficiência de água. A moenda é um dos grandes focos de infecção da indústria quando esta não é tratada convenientemente. durante um dia. fizeram que muitas destilarias fossem montadas sem este sistema. Atualmente não há dúvida que o decantador e filtro se pagam rapidamente. Entretanto. e é necessário lavagem de 3 em 3 horas com jato de água quente. e não se conseguir diminuir a infecção somente com água. dependendo das condições dos mesmos. durante todo o dia. bagacilho e diminui a infecção bacteriana e de leveduras contaminantes. A quantidade de cana desfibrada que fica na estira. devido ao fato de que ter decantador e filtro não significam “a priori” alto rendimento na fermentação. Caldo e mosto Aquecimento e decantação Polêmico por muitos anos. apenas quando a cana já vem infeccionada (acima de 5x106 bastonetes/ml) ou quando a contagem do caldo misto é acima do dobro da contagem do caldo primário.3 para 2. a perda de ART no filtro. pois além do equipamento ainda vai depender da operação. Pode-se controlar a infecção na moenda com uma boa assepsia com água e biocida. Houve um caso. a decantação bem feita elimina terra. O medo de se perder elementos importantes para a fermentação no processo de decantação. são os baseados em amônia quaternária. reiniciando na hora seguinte. portanto dosa-se 15 minutos (tempo de residência do caldo nas moendas). algumas dúvidas ainda persistem em algumas destilarias. O gasto com Fermentacaoalcoolica v2. o arraste de cana desfibrada elevou a perda na água de lavagem da cana de 1. Entretanto.5% do ART da cana. Portanto.0% do açúcar da cana foi perdido somente na esteira. portanto cerca de 1.

O enxofre que vai produzir o sulfito com a combinação com o oxigênio. Com isto. precipita o fósforo e o zinco principalmente. Quanto a precipitação de nutrientes. entretanto. A maior diferença em rendimento entre uma destilaria com e sem decantador. O fósforo vai se precipitar significativamente somente a pH acima de 6. Ao contrário dos desgastes dos bicos. Em várias destilarias não se usa cal 90% do tempo. Impureza no mosto afeta negativamente o rendimento da fermentação.8 é suficiente para decantar bem na maior parte do tempo. fica mais barato colocar um pouco de fósforo e zinco do que não ter decantação.0. enquanto algumas boas operaram com 0. e se quiser manter a produção. O excesso de cal faz diminuir a absorção de magnésio e na clarificação. com as conseqüências desagradáveis que todos sabem: o creme não concentra. mas só que para fermentação não é necessário fazer calagem muito forte como para o açúcar. e irá aumentar a acidez do álcool. a média foi de 0. é tanto mais tóxico para a levedura. existe o entupimento. que na coluna A. O sulfito faz a levedura produzir mais aldeído acético. é impossível evitar. Fermentacaoalcoolica v2. na decantação realmente há. a aumentam a produção de glicerol. e a sujeira vai toda para a destilaria. com o aquecimento se oxida a ácido acético. a viabilidade do fermento diminui e o tempo de fermentação aumenta. que faz perder fermento pois há que parar as centrífugas com muita freqüência para limpeza.doc 150 6/7/2011 .42% do ART da cana. O uso excessivo da cal e enxofre na clarificação do caldo para açúcar pode afetar negativamente a fermentação. É preciso ter cuidado para interpretar esta perda quanto ao real prejuízo para a indústria. Um pH de no máximo 5. A terra e o bagacilho dão um desgaste grande nos bicos das centrífugas. é na época que chove. abaixando o rendimento fermentativo. quanto menor o pH. há maior gasto de ácido. Se for necessário. Uma conseqüência do não aquecimento do caldo. se gasta mais ácido para manter o pH desejado. etc. e o cobre e o manganês também.antiespumantes é bem menor. assim como o gasto com ácido sulfúrico quando o caldo é decantado. pois a terra que acompanha a cana realmente afeta toda a fermentação.20%. Sem aquecimento do caldo. que não conseguem concentrar o fermento. tem que se forçar as outras máquinas. e que já foi constatado foi a infecção com levedura contaminante (não Saccharomyces). há um maior retorno de vinho para a cuba. Quanto a perda de ART na torta de filtro das destilarias autônomas. assim como o zinco. pois as vezes uma perda baixa na torta é devido a má decantação.0.

bem como pelos microbiológicos. Fermentacaoalcoolica v2. e menos sujeita à infecção. se o projeto for bem feito e executado. portanto. no preparo do mosto. Se a temperatura for acima de 35ºC. que conferem cor escura. onde o tempo de fermentação era de 18 a 20 horas. Centrifugação A introdução das centrífugas na fermentação foi um marco histórico em termos de rendimento. e se a centrifugação for eficiente. há um efeito direto em aumentar a toxidez exercida pelo álcool à levedura.0.doc 151 6/7/2011 . quando se eleva além do ótimo. estas podem variar de 0. são tóxicos para a levedura. que além de refletir em perdas de açúcar. melanoidinas. que por sua vez afeta negativamente o rendimento da fermentação.4 a 2. A economia com o volume de dornas de fermentação também é grande. resfriar o mosto para se controlar a temperatura da dorna ao redor de 33 – 35ºC. a concentração de fermento na dorna se eleva e a fermentação fica mais rápida. Resfriamento do mosto Um soa fatores críticos para o rendimento fermentativo é a temperatura da fermentação. As causas do descontrole da temperatura na fermentação são devidas principalmente a erros de projeto no sistema de refrigeração das dornas. Usam-se taxas de fermentação de vinte anos atrás. no tocante às leveduras e bactérias. o que promove o aumento da acidez. Fermentação A fermentação é a fase da produção de álcool mais importante e há que ser monitorada com muita precisão e bom senso.0% do álcool produzido dependendo do teor alcoólico da dorna e da temperatura. O rendimento é afetado por dois motivos. pois elas permitem usar o mesmo fermento para várias fermentações. é. pois pode ser afetada pelos fatores físico-químicos do meio. o que às vezes pode não ocorrer. O fechamento das dornas e a recuperação do álcool se pagam em menos de uma safra. temos que considerar tempo de fermentação de 4 a 6 horas para que possamos calcular a demanda de água e superfície de troca. A degradação do açúcar produz ácidos orgânicos. A temperatura do mosto afeta diretamente a temperatura máxima da fermentação. Quanto as perdas de álcool por evaporação na fermentação. propiciando a proliferação bacteriana.A perda de ART no aquecimento do melaço ocorre principalmente nos dias frios. e o outro motivo é indireto. além de outros produtos. Fundamental. Hoje.

doc 152 6/7/2011 . e as reservas são queimadas. Quando se inicia a fermentação. há lixiviação de sais da levedura para o meio. em poucos dias. Se a temperatura máxima da fermentação não ultrapassar os limites já citados. As paradas de um ou dois dias por chuva ou falta de cana afetam significativamente o rendimento da fermentação. o açúcar é desviado principalmente para refazer as reservas da levedura. com antibióticos de alto espectro.05 – 0.O desempenho das centrífugas é fator primordial para se obter altos rendimentos. como o Kamoran. As paradas afetam até a extração. Hoje. Acontece. Tempo de aproveitamento Nas paradas longas.0. porém. muitas horas ou dias. produz mais glicerol e depois vai fazer álcool. se deixa o fermento até 4 – 5 dias (sempre sem ácido) em condições adequadas à conservação. que se há infecção. haverá excesso de fermento na dorna. Daí será necessário sangrar. menor o rendimento. dependendo da composição mineral do mosto. A variação na queda do rendimento nas pararas vai depender do preparo e conhecimento da equipe. Quanto maior o tempo. e não houver problemas de infecção. é necessário pelo menos duas horas de tratamento para que o ácido faça o efeito desejado. O tempo médio de espera na cuba de tratamento pode afetar o rendimento da fermentação. Fermentacaoalcoolica v2. Um bom desempenho significa concentrar o leite ou creme o mais que puder (70 – 80%) e perder no vinho centrifugado o mínimo que puder (0.1% de concentração de levedo) ou cerca de 5% do fermento da dorna.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful