1.

Unidades de medida em microscopia e métodos de investigação celular
Métodos de Exploração Citológica:
Microscopia de Luz Microscopia Eletrônica Citoquímica / Histoquímica Imunocitoquímica Radioautografia Criofratura Fracionamento Celular Cromatografia Eletroforese Cultura de Células Hibridização “in situ”

1.1.

Microscopia:
de Luz (MO): limite de resolução (distância mínima entre duas células permitindo visualizá-las individualmente) = 0,25μm Observação do material: É observado por transparência à incidência de luz incandescente; Se não é fino suficiente, deve-se corta-lo ou desgasta-lo até uma espessura entre 30μm – 5μm de espessura. Fixados ou não fixados; Inclusão em parafina, gelatina, glicolmetacrilato ou sem inclusão; São obtidos em micrótomo de navalha de aço ou vidro; Micrótomo de congelação (vaporização de CO2 líquido); Criostato (câmara fria entre –30°C e –25°C); Micrótomo de parafina; Possível a obtenção de cortes seriados; Cortes devem ser corados.

1.1.1.Microscópio

Obtenção de cortes: -

-

Figuras: 01-04 + pasta MO

1.1.2.Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET ou TEM): resolução de 2nm cerca de 200x aquele obtido pelo microscópio de luz. Observação do material:

os cortes seriados são muito difíceis.scanning): resolução de 3 – 20 nm. amostras de 1cm ou mais. como platina ou ouro. Observação do material: esta superfície é varrida por um feixe de elétrons que são refletidos em uma tela sensível ligada a um computador. 0K) seguindo-se uma CRIOFRATURA (“freeze-fracture”) por lâmina afiada de metal. Obtenção de cortes: - Material fixado e impregnado por vaporização de metais pesados como o tetróxido de ósmio (OsO4). Preparo da amostra: a) Sem fixação prévia. após a remoção do tecido vivo com solução ácida ou hipoclorito de sódio.Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV ou SEM . Araldite. citrato de chumbo. Figuras: 08 –10 + 42-43 + 53-55 + 58 1. .1. Os elétrons que atravessam a amostra em suas áreas ditas elétrons-lúcidas alcançam uma tela de projeção onde são interpretadas como áreas claras. podendo ou não atravessar o material. acetato de uranila. ou diferentes tons de cinza. nestes casos.4.1. Segue-se a sublimação (“etching”) com resfriamento do gelo e exposição das superfícies externas e/ou internas das quais obtêm-se uma réplica (“freeze-etch”) em carbono e metal. capaz de montar e colorir as imagens da superfície analisada. b) Previamente fixadas e dessecadas. Figuras: 05-07 + 44-46 + 56-57 1. Spur) para cortes ultrafinos (20-100nm) em ultramicrótomo com navalha de vidro ou diamante. para observação. posteriormente incluído em resina (Epon. podem ser examinadas inteiras após recobrimento com fina camada de ouro ou com platina depositada a vácuo.3. sendo que. -273°C = zero absoluto.- O material é bombardeado por feixes de elétrons acelerados. permitindo a observação do deslocamento sobre o meio de observação. Microscópio de Campo Escuro: Observação do material: feixe de luz produz brilho nas bordas do material analisado contra o escuro do fundo do campo. os elétrons que não atravessam a amostra em suas áreas ditas elétron-densas não alcançam a tela de projeção e traduzem áreas em negro. A composição destas áreas formam a imagem a ser observada de forma direta na tela de projeção. amostra é congelada em nitrogênio líquido (-196°C) ou hélio líquido (-269°C.

1.1. + 41 1. que após atravessarem a amostra. b) em microscópio de contraste de fase. (ex: riboflavina – vitamina B2. axonema flagelar de ouriço em presença de ATP. áreas escuras que não alteraram os feixes de luz. + 31. sua orientação ou arranjo.7.5. célula ou microrganismos vivos em cultura ou recém coletados. Observação do material: feixes de luz pareados são analisados após passarem o tecido e o meio.Microscópio de Contraste de Fase e Interferência: Possibilitam observação do tecido. c)em microscópio de luz polarizada. a)fuso mitótico em microscópio de contraste de fase. feixes. porfirinas). a)célula animal não-corada sob iluminação direta em microscópios de luz (campo claro). feixes de luz alcançam um outro prisma na ocular (filtro analisador).1. 1.6. emitem luz quando seus elétrons são excitados por radiações de certos comprimentos de onda. definindo os contornos do material.Microscópio de Fluorescência: Alguns compostos naturais são fluorescentes. como a das fibrilas de celulose na PCV. disposição em pilhas.Microscópio de Polarização: Usando para o estudo da organização molecular dos constituintes celulares. Figura: 12. Somando-se ou anulando-se os comprimentos de onda do feixe resultante. sem coloração. b)em microscópio de contraste de interferência diferencial. paralelamente. que absorve ou deixa passar os feixes de luz que atravessaram as estruturas da amostra. . Figura: 13. são absorvidos pelo filtro analisador sem formar imagem O feixe de luz após passarem pela amostra é coletado por uma tela sensível e interpretadas em um analisador de imagens. c) em microscópio de contraste diferencial de interferência (tipo Normasky). porque alteraram os feixes de luz e esta luz alterada pelas estruturas consegue atravessar o filtro analisador e formar imagem estruturas sem refringência/isotrópicas = não são visualizadas.32 e 33.  • estruturas birrefringentes/anisotrópicas = visualizadas como áreas claras. + 50-51 1. produzem brilho ou cor. etc.Figura: 11. mostrando o deslizamento dos MT’s. isto é. Observação do material: luz fragmentada (polarizada) por um prisma (filtro polarizador) sobre o condensador incide sobre o material analisado atravessando-o. vitamina A.

10. Proteínas básicas: Eosina DNA: reação de Fuelgen RNA: Azul de toluidina Polissacarídeos. Delafield. Figura: 16 1. por isso os cortes podem ser mais espessos. marcacados por corantes ou imunomarcadoresfluorescentes. +47-48 1. fuso mitótico com confocal.8. Observação indireta. Glicosaminoglicanos (GAGs): Alcian Blue Proteínas: Xilidine de Ponceau Lipídeos: Sudam III.1.9. etc. 1. Algumas reações seguem a Lei de Lambert-Beer. assim. portanto tem maior poder de penetração no material. Figura: 15. produzindo uma intensidade de cor proporcional à concentração de substância no tecido ou célula. através de reações específicas com radicais ou moléculas da substância a ser identificada. o microscópio usa a radiação ultrvioleta para excitar estes compostos ou outros.1.A. nas quais o produto desta reação deve ser visível e insolúvel. Observação direta.2.Figura: 14. glicogênio. Alguns exemplos de reações (testes histoquímicos): DNA e RNA: Hematoxilina de Harris. Mayer. se desejado.Microscopia Confocal a Laser (CSM = confocal scanning microscope) Observação do material: cortes ou células vivas são analisadas camada por camada por feixes de luz acelerada (laser). glicoproteínas: P.Microscópio Eletrônico de Alta Voltagem: Elétrons são acelerados pela alta voltagem e.1. que mede a intensidade da cor observada. podese estimar sua quantidade através do citofotômetro. e um computador interpreta e colori as imagens compondo-as tridimensionalmente. + 37-40 1. (ácido periódico de Schiff).S. Cito e Histoquímica: Permite a localização de substâncias no tecido ou célula. IV ou Black .Microscópio de Tunelamento: Alta resolução para visualização de moléculas até átomos. com 1 – 5 μm de espessura.

“Anticorpo”: marcador fluorescente.26 e 27 1.3. portanto. localiza-se e quantifica-se a proteína X nestes tecidos pela visualização do marcador do antígeno (anti-anticorpo). desta forma a técnica também permite determinar a velocidade da síntese. este deve ser usado com propriedades fluorescentes. Do sangue do coelho obtêm-se os anticorpos específicos que deverão ser marcados (ou não) antes de utilizados para a detecção da proteína X em qualquer outro tecido ou organismo similar. quando aquele não é visível.4. “Anti-anticorpo”: marcador do marcador. - Obtenção de um anticorpo: proteína X (antígeno) é extraída de um determinado órgão em um rato (homogeneizado) e esta é injetada em um coelho. e P 32. Radioautografia: Consiste em localizar substâncias do metabolismo marcadas radiativamente pela incorporação de isótopos radioativos como carbono radioativo (C14). Reação “Imunohistoquímica”: Direta: injeta-se o purificado (anticorpo X) novamente no rato ou deposita-se sobre amostra fresca de qualquer tecido.. Figuras 23. injeta-se um marcador do marcador (anti-anticorpo para a proteína X) visível pela presença de um radical fluorescente. etc. I125. ou não visível. S35. radioativo ou sujeito à reação posterior onde se produz um precipitado visível no local da reação. que produzirá anticorpos para a proteína X injetada (anticorpo específico para a proteína X). Figuras 24 e 25 Indireta: injeta-se primeiro o marcador (anticorpo para a proteína X) não visível e. Figuras: 17-19 + 34-36 + 59-60 1. Os . intra/extracelular) = proteína X. localizando assim.- Proteínas Enzimáticas (marcadoras): Fác. posteriormente. trício (H3). “Antígeno”: substância a ser localizada (proteína de biomembrana. a segurança na localização e identificação do composto a ser localizado.. radioativo. SDH. LDH. I131. aumentando. TPPase. Imunocitoquímica: Conceitos: - Baseia-se na especificidade reação “antígeno-anticorpo” de ocorrência natural no organismo vivo. decorrido algum tempo. durante a sua síntese natural no organismo. radioativas ou ser precipitável em uma reação secundária. indiretamente a proteína X no tecido da célula.

de modo que não causam dano às células. ao MET. do local de incorporação nos cortes histológicos. Ressalta-se a obrigatoriedade de todo o processo dar-se em câmara escura sob luz vermelha. + 52 . Figura: 20. b)mesma glândula.isótopos emitem partículas β (elétrons) de fraco poder de penetração. a)glândula submandibular com grânulos secretores marcados pela incorporação de H3-fucose identificada nos pontos pretos. ao MO. A identificação. aqui a H3-fucose é identificada por filamentos pretos. se dá com a exposição do tecido à emulsão fotográfica enegrecendo no tecido os locais dos isótopos ou por sobreposição de película fotográfica que reage com os isótopos radiativos incorporados no tecido e quando esta é revelada mostra pontos enegrecidos no local de depósito e pelo tamanho do ponto determina-se também sua quantidade relativa.

para fazer cortes a serem observados em ME 31-33 – exemplos de foto com microscópio de campo escuro (33: laranja coberta com micélio de fungo) 34-36 – exemplos de marcação citoquímica 37-40 – exemplos de microscopia confocal 41 – exemplo de microscopia de contraste de fase 42-43 – criofratura. 47-48 – exemplos de fotos com microscopia de fluoescência 49 – marcação de uma parte do cérebro com histoquímica de metais pesados 50-51 – comparação entre observação de sílica nos tecidos entre microscopia de polarização (51) e histoquímica (50). 52.exemplo de foto com técnica de radioautograma 53-55 – exemplos de MEV’s.Figuras adicionais: 21 – comparação entre medidas 22 – criostato. usado para 28-29 – funcionamento dos microscópios eletrônicos 30 – ultramiscrótomo. pasta MO – exemplos de microscópios óticos atuais e antigos . máquina de preparo e exemplo de foto 44-46 – exemplos de ME e primeiro Mev.

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