Ministério da Educação

Universidade Tecnológica Federal do Paraná

Curso Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
Campus Toledo

RELATÓRIO
EXTRAÇÃO, ANÁLISE E MANIPULAÇÃO
DE DNA

Alunos: Amanda Engel – 2315033

Eduardo Geliel Pasa – 1911325
Jhazmin Vivian Jara Garvizu – 2371430
Marina Angélica Machado - 2371472

Professor: Thiago Cintra Maniglia

Toledo, 2023.
 Ministério da Educação
Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Curso Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
Campus Toledo

1. INTRODUÇÃO
A Biologia Molecular é uma área que engloba diversas técnicas que possibilitam a
obtenção, manipulação e análise do material genético dos organismos. (Zaha, 2012).
Segundo Moreira (2014), algumas das enzimas amplamente utilizadas na tecnologia do
DNA recombinante são as enzimas de restrição, conhecidas como endonucleases de restrição.
Estas reconhecem e efetuam cortes no DNA no sítio de restrição, podendo manifestar-se de
duas formas: com extremidade coesiva ou com extremidade cega.
Estas enzimas promovem a clivagem das ligações entre o grupo hidroxila 3' de um
nucleotídeo e o grupo fosfato 5' do nucleotídeo adjacente. As extremidades resultantes dessas
clivagens, conhecidas como extremidades coesivas, têm a capacidade de emparelhar por
complementaridade quando entram em contato com outras extremidades coesivas resultantes
da ação da mesma enzima (Moreira, 2014).
Técnicas de extração de DNA ou RNA são empregadas para separar o ácido nucleico
dos constituintes celulares, diversas metodologias foram documentadas na literatura, sendo
crucial selecionar a mais apropriada, considerando a molécula almejada, o tipo de amostra,
nível de pureza desejado, rendimento pretendido e também a disponibilidade de recursos para
a execução do procedimento (Nonohay, 2017).
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica altamente específica e versátil,
com centenas de protocolos descritos. Sua característica mais destacada é a habilidade de
amplificar exponencialmente cópias de uma determinada região do DNA a partir de quantidades
reduzidas de material (Mesquita, 2001).
O procedimento compreende três etapas distintas. Inicialmente, ocorre a desnaturação,
um processo que visa separar a fita dupla de DNA em fitas simples. A segunda etapa é o
anelamento, durante a qual a sequência complementar é hibridizada a uma temperatura
específica, determinada pela temperatura de melting ideal para os primers. Por fim, temos a
extensão, que ocorre na temperatura adequada para a atividade maxima da enzima Taq DNA
polimerase (Nascimentos, 2010).
Entre as técnicas de separação de DNA, a eletroforese destaca-se como um método
amplamente utilizado em laboratórios, consistindo na análise de moléculas com base em suas
cargas elétricas e mobilidade em um campo elétrico (Oliveira, 2015).
Atualmente, são empregados dois métodos distintos o primeiro método consiste na
eletroforese convencional por zonas, onde as proteínas percorrem poros presentes em suportes
como acetato de celulose, gel de agarose ou poliacrilamida, resultando na formação de bandas
 Ministério da Educação
Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Curso Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
Campus Toledo

no eletroforetograma. Por outro lado, tem-se a eletroforese capilar, no qual as moléculas são
segregadas com base em seu tamanho e outras propriedades físico-químicas, por meio do fluxo
em um tubo capilar, de pequeno diametro, onde uma carga maior de voltagem pode ser aplicada,
tornando-o mais eficiente (Oliveira, 2015).

2. OBJETIVOS
Investigar os mecanismos que englobam a extração de DNA, restrição por meio de enzimas,
a compreensão dos processos envolvidos na PCR e a análise dos resultados por meio da técnica
de eletroforese.

3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Extração de DNA
3.1.1. Preparação do lisado
Utilizando um Swab, foram raspadas células da epiderme da boca. Em um tubo de
microcentrífuga estéril de 1,5 mL com 300 μL de Tampão PBS o Swab bucal foi adicionado e
agitado por 2 minutos para transferir as células para o liquído. Foi adicionado20 μL de
Proteinase K ao microtubo e misturado por pipetagem. Foi adicionado 300 μl de PureLink®
Genomic Lysis/Binding Buffer ao lisado e agitado com vórtex. A amostra foi incubada a 55°C
por 10 minutos. Foram adicionados 200 μL de etanol 96% ao tubo. Levado ao vórtex por 5
segundos.

3.1.2. Ligando o DNA

Foram adicionados 700 μl do lisado na coluna de centrifugação PureLink® Spin Column.
A coluna foi centrifugada a 10.000 × g por 1 minuto em temperatura ambiente (11.000 rpm). O
liquido do tubo de coleta foi descartado e a coluna de centrifugação foi recolocada no tubo.

3.1.3. Lavando o DNA

Foram adicionados 500 μL de tampão de lavagem 1 preparado com etanol à coluna. A
coluna foi centrifugada em temperatura ambiente a 10.000 × g por 1 minuto. O líquido do tubo
de coleta foi descartado e a coluna foi novamente colocada no tubo coletor. Foram adicionados
500 μL de Wash Buffer 2 preparado com etanol à coluna. A coluna foi centrifugada na
velocidade máxima por 3 minutos à temperatura ambiente. O tubo coletor foi descartado.
 Ministério da Educação
Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Curso Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
Campus Toledo

3.1.4. Eluição do DNA

Foi colocado a coluna de centrifugação em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5
mL.Foram adicionados 60 μL de PureLink® Genomic Elution Buffer à coluna. Foi ncubado à
temperatura ambiente durante 1 minuto. A coluna foi centrifugada a velocidade máxima durante
1 minuto à temperatura ambiente. O DNA purificado foi armazenado a –20°C.

3.2. PCR
Foram identificados dois tubos de 1,5 mL (B e D), para preparar os Mix. B para a Beta
Globina e D para o DYS 14, colocando os primers específicos de cada gene em tubos separados.
O mix foi preparado da seguinte forma:

• H2O ultrapura – 85,0 µL

• Tampão 10x – 12,5 µL
• MgCl (250 mM) – 2,5 µL
• Primer F (10mM) – 5,0 µL
• Primer R (10 mM) – 5,0 µL
• dNTP (10 mM) – 2,5 µL
• Taq DNA polimerase – 2,5 µL

Após o preparo do Mix, foram distribuídos 23 µL em microtubos de 0,2 mL previamente

identificados e adicionados 2,0 µL de DNA nos tubos (exceto no branco). As amplificações dos
fragmentos de interesse foram realizadas em termociclador programado para realizar uma etapa
inicial de 5 min a 94 ° C, seguido de 35 ciclos de 1 min a 94 ° C, 1 min a 55 ° C e 62 ° C, 1
min a 72 ° C e um último passo de 5 min a 72 ° C.

3.3.Enzima de restrição
Foi preparado um Mix com a enzima, tampão e água. Depois, foram distribuídos 15 μL do
Mix em um tubo e adicionado 10 μL de DNA. A reação foi montada da seguinte forma:
• 10X NEBuffer (tampão): 2,5 μL (1X)
• H2O miliq: 10,5 μL (completar o volume final)
• DNA: 10 μL
• Enzima de Restrição HIND III: 2 μL (10 unidades de enzima)
A reação foi incubada do processo a 37 °C por 60 minutos.
 Ministério da Educação
Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Curso Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
Campus Toledo

3.4.Eletroforese
Foi pesado 1 g de agarose para cada 100 mL de gel, foram adicionados 100 mL de
Tampão TBE 1X e aquecidos até solubilizar a agarose. A cuba foi montada com o pente, após
esfriar, o gel foi vertido no recipiente. Após solidificar o gel, o pente foi retirado. Foi colocado
o gel na cuba de eletroforese com tampão TBE 1X com quantidade suficiente para que o gel
ficasse submerso. Foram aplicados 10 µL amostras de DNA e 2 µL de corante Sybr Safe. A
fonte elétrica foi ligada a 85 V e corrente de 30 mA. Após uma hora foi retirado o gel. O gel foi
visualizado no transiluminador (luz LED azul).

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após as aulas práticas, aplicando métodos como extração de DNA, PCR, enzima de
restrição e eletroforese, obteve-se como resultado os seguintes géis abaixo:

Figura 1: Gel 1 resultante da eletroforese.

Fonte: Autores, 2023.

Como pode-se observar as análises em eletroforeses foram bastante satisfatórias para as

técnicas empregadas, transcorrendo sem nenhuma casualidade, resultando em um gel visível,
sem aparentes contaminações.
O Letter, aplicado na primeira e última cavidade de cada placa para as devidas
comparações, não se apresenta tão visível, porém, os resultados são aceitáveis.
Na Figura 1, na segunda, terceira, quarta e quinta cavidade encontram-se as amostras de
DNA. As mesmas mostram-se bem visíveis o que confirma a existência de pares de bases na
amostra, que a extração do DNA ocorreu de forma satisfatória. O fato de as bandas estarem um
pouco arrastadas demostra que o DNA pode ter degradado em parte, mas que ainda há traços
suficiente do mesmo para se analisar. A quinta amostra, a do grupo em questão, ao ter sua
intensidade luminosa comparada com a da banda do Letter apresenta ser um pouco maior, uma
vez que o Letter é composto de 84 nanogramas podemos incidir que a amostra contém
aproximadamente 100 nanogramas de DNA por microlitro.
 Ministério da Educação
Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Curso Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
Campus Toledo

Da sexta a nona amostra representa o experimento da enzima de restrição. A enzima

tem a função de cortar a molécula de DNA em sequencias alvo. No gel é possível ver duas
bandas, uma logo abaixo da cavidade de aplicação e outra mais abaixo, devido a seu diferencial
de tamanho, onde a de cima representa ter uma quantidade maior de pares de bases. Isso mostra
que o DNA foi quebrado em 2 partes. A nona amostra, a do grupo, apesar de primeiramente
não ser visível, há a quebra.

Figura 2: Gel 2 resultante da eletroforese

Fonte: Autores, 2023.

Na Figura 2, a primeira cavidade representa o Letter, a segunda o branco, por apresentar

somente o primer podemos observar que a sua banda é meio espalhada, quase como se fosse
uma banda fantasma, bem perto do final do gel, devido à baixa concentração de pares de base.
Da 3ª a 6ª cavidade são as 4 amostras contendo a Beta globina, elas servem de controle
do experimento, para saber se os resultados podem ser validados, se todo o processo de extração
e as etapas do PCR foram realizadas com êxito. Como todos os grupos apresentaram a banda
pode-se dizer que o resultado é validado.
Da 7ª a 10ª estão os testes dos 4 grupos para o DYS 14. A presença desse marcador
indica que a amostra é de origem do sexo masculino. A 8º e a 9º apresentam a banda positiva,
note a intensa luminosidade devido a grande quantidade de DNA sintetizado. A 10ª amostra, a
do grupo, como deveria, não apresenta, pois teve origem em um indivíduo do sexo feminino.

5. CONCLUSÃO
Com os resultados apresentados podemos concluir que todas as praticas ocorreram
devidamente, o gel de eletroforese produzido apresentou ótima visualização e separação das
moléculas, com isso foi possível confirmar que o DNA foi extraído da forma correta,
manipulado por meio das enzimas e utilizado num teste de diferenciação sexual.
 Ministério da Educação
Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Curso Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
Campus Toledo

6. REFERÊNCIAS
FONSECA JUNIOR, A. A. et al. Detecção de agentes associados com doenças respiratórias de
suínos por PCR em tempo real. Revista Brasileira de Saúde e Produção Animal, v. 16, p. 300-
307, 2015.

MACKAY, I. et al. Real-time PCR in virology. Nucleic Acid Research, Volume 30, Issue 6, 15
mar. 2002, pág. 1292–1305. https://doi.org/10.1093/nar/30.6.1292.

MESQUITA, R. A. et al. Avaliação de três métodos de extração de DNA de material parafinado

para amplificação de DNA genômico pela técnica da PCR. Pesquisa Odontológica Brasileira,
v. 15, n. 4, p. 314-318, 2001.

MOREIRA, C.; FACULDADE DE CIÊNCIAS DA UNIVERSIDADE DE LISBOA. Enzima

de restrição. Revista de Ciência Elementar, v. 2, n. 2, 30 jun. 2014.

NASCIMENTO, S; SUAREZ, E. R; PINHAL, M. A. da S. Tecnologia de PCR e RT-PCR em

tempo real e suas aplicações na área médica. Revista Brasileira de Medicina, v. 67, p. 7-19,
2010.

OLIVEIRA, E. de et al. Eletroforese: conceitos e aplicações. Repositório da Universidade

Federal de Goiás, dez. 2015. Disponível em: http://repositorio.bc.ufg.br/handle/ri/12385.

ZAHA, Arnaldo; FERREIRA, Henrique Bunselmeyer; PASSAGLIA, Luciane M. P.. Biologia

molecular básica. 4. ed. Porto Alegre: Artmed, 2012.