Anglica M. Olmo Fontnez angelica.olmo@upr.edu Horas de oficina= L: 2-3pm; y V: 10-12md B-218B (Lab.

Matas Cafaro)

Describa la reaccin mediada por las LDH. 2. Detectando la presencia de _____________, se puede inferir que ocurri la reaccin. 3. Como se puede diferenciar experimentalmente entre las isoenzimas utilizadas en el laboratorio? 4. Funcin del cido actico
1.

1. Familiarizarse con dos tipos de cromatografa utilizadas en la separacin de molculas con propiedades diferentes tamaos (aminocidos y protenas). 2. Determinar la composicin de una mezcla de aminocidos. 3. Determinar el grado de afinidad de los aminocidos por medio del clculo de Rf.

 Cromatografa:
Tcnica de separacin selectiva de molculas en donde

los componentes de una mezcla compleja pueden ser identificados y/o purificados.
Consiste de una fase mvil y una fase estacionaria. Cromatografa de capa fina.

Cromatografa de columna.

 Procedimiento para separar molculas relativamente

pequeas.
Azcares simples, lpidos, aminocidos, nucletidos,

metabolitos, y cadenas cortas de polipptidos y cidos nuclecos.

La sustancia de inters se adhiere a la fase estacionaria

Fase estacionaria El tipo de fase estacionaria depende de la molculas que se quieran separar.
Puede ser de: Papel, celulosa o gel de silicato unido a

una superficie slida.

La muestra tambin puede moverse con la fase mvil,

viajando una distancia que es inversamente proporcional a la afinidad por la fase estacionaria.

Fase Mvil El solvente sube por capilaridad, y las muestras se movern segn su afinidad a la fase estacionaria.
Fase mvil: agua, solvente orgnico o mezcla de

ambos.
Se analiza por color o luego se trata con sustancia

desarrolladora (developer).

Relacin entre la distancia recorrida por la muestra y la recorrida por el disolvente en el mismo tiempo

RF= h /D
Los valores de RF para un determinado compuesto varan ampliamente con los cambios de disolvente y depende de sus caractersticas fisicoqumicas. Medir desde el centro de la mancha. Manchas que no superan los 5 mm de dimetro.

2. Marque a los bordes de la placa con lpiz

1. Coloque una placa de silicato sobre la gua plstica.
NO TOQUE EL SILICATO.

3 . Haga otra marca a 10 cm por encima de la marca inferior.

CUIDADO!!!!!!...... NO MEZCLE LAS MUESTRAS

4. Coloque 2 l de cada muestra individual de aminocidos sobre la placa de silicato.

5. Secar en horno la placa de silicato x 5 min.

7. Deje secar en el horno x 5 min.

6. Vuelva y aada 2l ms de las muestras

7. Coloque la lamina en el tanque con solvente.

CUIDADO!!!!!!...... Solvente a menos de 1 cm de profundidad

8. Tape el tanque porque el solvente es voltil y se evapora con facilidad.

9. Deje que el solvente suba por Capilaridad 10 cm aprox.

10. Secar en horno la placa de silicato x 5 min. 12. Secar hasta que vea las manchas de colores. 11. Deje enfriar y roce con ninhidrina.

Dibuje o fotografi su placa, identificando cada uno de las muestras.

Distancia recorrida por el solvente: ______cm

Nm ero

Nombre de la Muestra

Color de la mancha

Distanci a recorrida

Rf

1
2 3

Calcule el Rf de cada muestra estndar y determine cules son los aminocidos en las muestras desconocidas.

Rf = Distancia recorrida por la muestra Distancia recorrida por el solvente

Una mezcla de molculas son separadas de acuerdo a su afinidad con la columna. TIPOS DE CROMATOGRAFIA DE COLUMNA:

A. Cromatografa de filtracin en gel

Inico

B. Cromatografa de Intercambio

C. Cromatografa de Fase Inversa

 Cromatografa de filtracin en gel (Sephadex):

Separacin por tamao Fase estacionaria Gel (sefadex) con poros pequeos.
Molculas pequeas quedan atrapadas Molculas grandes pasan mas rpido por la columna Sephadex G-75: Poros separan molculas entre 30,000-

70,000 daltons (> de 70,000 daltons no pasan por los poros).

Identidad de la muestra: por mediciones fotomtricas,

SDS -PAGE, ensayos enzimticos

 Separacin en base a carga

inica
Fase estacionaria tiene una

matriz con carga.

Intercambio catinico:

matriz

negativa Intercambio aninico: matriz positiva

Molculas con carga igual a fase

estacionaria pasarn primero (menor afinidad con la matriz)

Cromatografa de Intercambio Inico

 Para desprender las

molculas adheridas en la columna, se utiliza un gradiente de sales (Cloruro de potasio o sodio).

Soluciones con diferentes salinidades.

Se agrega la solucin de menor concentracin de sal primero.

Al subir poco a poco

las concentraciones de sal, podemos recolectar las muestras desde las que poseen menos afinidad por la columna hasta las de mayor afinidad.

Con 1M KCL se lograr separar la protena de inters.

El

pH puede alterar la carga de la columna.

Tipo de Intercambio?

 Separacin por afinidad Fase estacionaria:

Fibras de silicato con cadenas de hidrocarburos (hidrofbica).

mientras que los compuestos hidrofbicos interactan con la fase estacionaria.

Las molculas polares pasan por toda la columna,

Las molculas hidroflicas saldrn primero con el

amortiguador (fase mvil).

Fse mvil: Solventes orgnicos
En nuestro caso se usar isopropanol.

Compuestos polares y no polares

Compuestos no polares retenidos por el filtro

Compuestos polares sin retener

Rotule:

CUIDADO!!!!!!...... lentamente aadir de 1 ml en 1 ml.. No deje que la columna se Seque.

1. Coloque la columna en forma vertical en el soporte.

2. Abra la columna y quite el tapn inferior.

3. Agregue loading buffer (Imidazole 1X) y deje gotear hasta que casi no quede buffer en la parte superior del gel 4. Agregue 300l de la muestra

6. Aada de loading buffer tratando de no perturbar la superficie, deje gotear. Contine echando buffer hasta que la primera banda de color est a punto de salir.

5. Deje que la muestra penetre el empaque, hasta que la columna deje de gotear.

6. Recolectar la primera fraccin de color.

7. Recoger el buffer hasta que la siguiente fraccin de color est por salir.

NO DESCARTE LA SEGUNDA FRACCIN: LA NECESITARAN PARA LA SIGUIENTE CROMATOGRAFA.

9. Cuando termine, lave la columna echando de loading buffer. Sin que se seque la columna. Coloque el tapn inferior y la tapa superior.

8. Contine eluyendo las fracciones hasta obtener tres fracciones de colores distintos.

Esta columna gotea mucho ms rpido que la de gel.

1. Coloque la columna de CM-celulosa en el soporte y brala para que gotee. Lavar con loading buffer

2. Aada la fraccin 2 que guard de la anterior cromatografa.

3. Deje que la muestra penetre el empaque, hasta que la columna deje de gotear.

5. lave la columna con

loading buffer
Lquido incoloro.

4. Lave dos veces con de loading buffer, colocando el primer tubo de ensayo para recolectar la primera banda de color.

6. Eche 10 gotas de elution buffer (Imidazole con KCL). Se supone que el color que esta atrapado en la columna comience a bajar.

7. Coloque el segundo tubo y Siga aadiendo elution buffer hasta que salga todo el color de la columna.

8. Cuando termine, lave la columna con loading buffer. Tape la columna cuando quede poco buffer.

1. Rotule: W

CUIDADO!!!!!!.... .. lentamente

2 3

2. Agregue 5 ml de isopropanol al 35% a la jeringa. Colocar el cartucho.

3. Inyecte a travs de la Columna (cartucho) al tubo W.

1 6. Agregue 2 ml de agua (debe salir claro).

5. Remover cartucho. Agregar 2ml de jugo de uva . Colocar el cartucho. Inyecte a travs de la Columna (cartucho) en tubo 1

4. Remover cartucho y Agregar 5mL de agua.. Colocar el cartucho. Inyecte a travs de la Columna (cartucho) al tubo W.

7. Agregue 3mL de isopropanol al 8%. Recoja las gotas en el tubo 2. Si sigue vindose color rosado en la columna, aada ms.

8. Agregue 3mL de isopropanol al 35%. Recoja las gotas en el tubo 3. Contine eluyendo hasta que no se vea ms azul en la columna.

10. Anote los resultados utilizando la leyenda en el embase de Diastix.

9. Coloque un Diastix en las fracciones 1 a 3 para determinar presencia de azcar.

1. Coloque una placa de silicato sobre la mesa.

NO TOQUE LA PARTE DE LA PLACA CON EL POLVO DE SILICATO. SUS DEDOS TIENEN SUSTANCIAS QUE SE ADHIEREN A LA SUPERFICIE DEL SILICATO Y AFECTARAN LA VISIBILIDAD DE LAS MUESTRAS.

2. Utilizando la gua plstica, haga una marca con lpiz solamente en los bordes laterales de la placa de silicato.

3. Haga otra marca a 10 cm por encima de la marca inferior.

Estas marcas servirn de gua para colocar sus muestras e indicarles hasta dnde deben dejar correr la cromatografa. No use tinta: sta se correr con el solvente No raye la placa de lado a lado: esto interferir con el movimiento del solvente

4. Utilizando la gua plstica para colocar muestras, coloque 2 l de cada una de las muestras individuales sobre la placa de silicato.
Quedarn unas manchitas de humedad sobre el silicato. Anote en su libreta el orden y las muestras que puso en la cromatografa.

5. Coloque la placa de silicato, SIN la gua plstica, en el horno por 5 minutos, para secarla. 6. Saque la placa y aada 2l ms de las muestras segn el orden establecido, para concentrar ms el compuesto. Deje secar en el horno.
(CUIDADO: NO MEZCLE LAS MUESTRAS)

7. Coloque las muestras en el tanque con solvente. Este ltimo

debe estar a menos de 1 cm de profundidad para que no entre en contacto directo con las muestras. 8. Tape el tanque porque el solvente es bastante voltil y se evapora con facilidad. 9. Deje que el solvente suba por capilaridad hasta unos 10 cm del punto donde usted coloc las muestras. (Hasta la marca superior). 10. Si por falta de tiempo no se puede esperar hasta que el solvente llegue a 10 cm, marque con lpiz hasta dnde subi el solvente.

11. Seque la placa en el horno por 5 minutos. 12. Saque, deje enfriar y roce con ninhidrina.
Ninhidrina: Sustancia que se adhiere a los aminocidos y los tie. Tenga cuidado al rocear la ninhidrina o se mancharnlas manos por varios das.

13. Coloque de nuevo en el horno por varios minutos hasta que note manchas de colores. 14. Mida la distancia recorrida por cada mancha desde el lugar donde coloc la muestra hasta el centro de la mancha de color. No olvide anotar el color de cada mancha. 15. Mida la distancia recorrida del solvente, segn los puntos que usted marc.
16. Calcule el Rf para cada mancha que observe.

Distancia recorrida por el solvente: ________________

Nombre de la Nmero Muestra 1
2 3

Color de la mancha

Distancia recorrida

Rf

4 5
6 7

8 9

Rf = Distancia recorrida por la muestra Distancia recorrida por el solvente

Haga un dibujo de su placa, identificando cada uno de las muestras. Tambin puede utilizar una fotografa en la cual se observen CLARAMENTE las distancias recorridas y los colores.

Calcule el Rf de cada muestra estndar y determine cules son los aminocidos en las muestras desconocidas.

Columna con sephadex G-75 (tamao) (clara)

Muestra, 300 l 75 ml loading buffer (0.05 M imidazol pH 6.0) vasos de precipitado

Cartucho Sep-Pac C-18

Jeringa de 3 cc
50 ml de agua 15 ml isopropanol al 8% 15 ml isopropanol al 35%

tubos de ensayo
soporte pipetas de tansferencia

3 ml de refresco de uva sin gas

vasos

Columna con carboximetil celulosa (CM) (opaca) (carga)

30 ml loading buffer (0.05 M imidazol pH 6.0) 15 ml elution buffer (0.05 M imidazol pH 6.0, 1M

Clinistix

KCl)
Fraccin 2 del primer experimento Tubos y soportes

A. Filtracin en gel (Sefadex D-75) 1. Coloque la columna en forma vertical en el soporte. Coloque un vaso o un matraz debajo. Abra la columna y quite el tapn inferior.

2. Eche 3 ml loading buffer (Imidazole 1X) a la columna y djenla gotear hasta que casi no quede buffer en la parte superior del gel. 3. Agregue 300l de la muestra en la columna.
4. Deje que la muestra penetre el empaque, hasta que la columna deje de gotear.

Filtracin en gel (Sefadex) 5. Aada 0.5 ml de loading buffer a la columna, tratando de no perturbar la superficie, y deje gotear. Contine echando buffer hasta que la primera banda de color est a punto de salir.
Coloque el primer tubo de ensayo para recolectar la primera fraccin de color.

6.

7.

Colocar de nuevo el matraz para recoger el buffer hasta que la siguiente fraccin de color est por salir. NO DESCARTE LA SEGUNDA FRACCIN: LA NECESITARAN PARA LA SIGUIENTE CROMATOGRAFA.
Contine eluyendo las fracciones hasta obtener tres fracciones de colores distintos.

8.

9.

Cuando termine, lave la columna echando 3mL de loading buffer.

10. Sin que se seque la columna, tpela colocando el tapn inferior y la tapa superior. 11. Remueva la columna del estante y guarde.

B. Cromatografa de Intercambio Inico.

1. Coloque la columna de CM-celulosa en el soporte, coloque el vaso debajo de la columna y brala.
Esta columna gotea mucho ms rpido que la de gel. Debe trabajar rpido y tener todo a la mano

2. Djela gotear hasta que casi no quede buffer sobre el empaque. 3. Aada la fraccin 2 que guard de la primera parte del laboratorio. 4. Deje que la muestra penetre el empaque, hasta que la columna deje de gotear.
5. Lave dos veces con 0.5 ml de loading buffer, colocando el primer tubo de ensayo para recolectar la primera banda de color.

B. Cromatografa de Intercambio Inico.

6. Una vez recolecte la fraccin, coloque el vaso debajo de la columna y lave la columna con loading buffer hasta que el lquido salga incoloro.

7. Coloque el segundo tubo y eche 10 gotas de elution buffer (Imidazole con KCL). Se supone que el color que esta atrapado en la columna comience a bajar.
8. Aada 0.5mL de elution buffer (Imidazole con KCL). Siga aadiendo elution buffer hasta que salga todo el color de la columna.

9. Cuando termine, lave la columna con 5mL de loading buffer. Tape la columna cuando quede poco buffer.

C. Cromatografa de Fase Inversa.

1. Identifique cuatro tubos como W, 1,2 y 3.
2. Retire el cartucho de la jeringuilla y llnela con isopropanol al 35%.

3. Conecte la jeringuilla al cartucho de C18 e inyecte el alcohol a travs de la columna hacia el tubo W.
4. Equilibre la columna inyectando 5mL de agua. Lave y use la misma jeringa para esto.

5. Inyecte 2ml de refresco de uva, colectando las gotas en el tubo 1 (debe salir claro).

C. Cromatografa de Fase Inversa. 6. Eluya el colorante rojo inyectando 3mL de isopropanol al 8%. Recoja las gotas en el tubo 2. Si sigue vindose color rosado en la columna, aada ms alcohol. 7. Eluya el colorante azul con 3mL de isopropanol al 35%. Recoja las gotas en el tubo 3. Contine eluyendo hasta que no se vea ms azul en la columna. 8. Coloque un diastick en las fracciones 1 a 3 para determinar presencia de azcar. Anote los resultados utilizando la leyenda en el pote de los Diastix.

Parte A: 1) Cuntas bandas de color aparecieron en la columna? 2) De qu colores son? 3) Cul fue el orden de elucin de las fracciones? 4) Haga un dibujo de cmo se vea la columna durante la separacin y colorela. 5) Qu puede concluir en cuanto al tamao relativo de las molculas en cada banda? 6) Cul (es) de los colores puede moverse rodeando las esferas? 7) Cul (es) de los colores puede moverse penetrando las esferas?

Parte B:
1) Cuntas bandas de color se obtuvieron de la fraccin 2 en la parte 1? 2) Cules fueron los colores? 3) Por qu se separan estas molculas en la parte 2? 4) Basado en sus observaciones, describa las diferencias en comportamiento qumico de estas molculas. 5) Identifique las molculas encontradas en cada fraccin, segn su color: a) Dextrn b) DNP-glutamato c) Mioglobina d) Citocromo c 6) Organice las molculas en orden de tamao. 7) Qu molculas no se separaron en la primera parte y por qu?

Parte C:
1) Cul es el propsito del experimento de fase inversa? 2) Qu colorante se recolect primero?Por qu? 3) Cul es la funcin del alcohol? 4) Por qu se usan dos porcentajes diferentes de alcohol? 5) Qu pasara si usamos el propanol al 35% primero? 6) Qu fraccin tena la mayor concentracin de azcar? 7) Qu significa el trmino elur? 8) En qu se diferencia la cromatografa de fase inversa de la de filtracin en geles?