Você está na página 1de 42

6 Descrever os principais mtodos usados para a verificao da actividade de uma protena produzida de forma recombinante.

Anlise Biofsica e Bioqumica de Protenas Recombinantes Para uma protena recombinante poder ser til na teraputica humana, as suas propriedades biofsicas e bioqumicas tm que estar completamente estudadas e compreendidas.
1

1. Estabelecer comparao da reproductibilidade.

2. Estabelecer intervalo de condies para estabilizar a protena durante a sua produo.

Propriedades Biofsicas e Bioqumicas so a base para: 4. Identificar caractersticas teis para monitorizar a estabilidade durante o armazenamento a longo prazo.

3. Armazenamento e transporte.

A determinao destas propriedades pode ser feita utilizando vrias tcnicas. Estas analisam tambm a integridade bioqumica e biolgica das protenas em estudo.

Resultados so comparados com os obtidos quando utilizada a protena que ocorre naturalmente, de modo a assegurar/garantir que a protena recombinante apresente as caractersticas desejveis.

Estrutura Proteica

Estrutura Primria As propriedades funcionais das protenas derivam do seu enrolamento em estruturas tridimensionais. Cada enrolamento da protena baseado na sua sequncia polipeptdica especfica, na qual diferentes aminocidos esto interligados atravs de ligaes peptdicas de uma forma especfica. Este alinhamento de 20 aminocidos, designado de sequncia primria, contm normalmente toda a informao necessria para o enrolamento numa estrutura terciria distinta, compreendendo diferentes estruturas secundrias, tais como: -hlice e folha-. Uma vez que os 20 aminocidos possuem diferentes cadeias laterais, podem ser obtidos polipptidos com uma grande diversidade de propriedades. Todos os 20 aminocidos consistem num carbono- (C), ao qual se ligam um grupo amino, um grupo carboxilo, um tomo de hidrognio e uma cadeia lateral, em configurao L (figura 1). Estes aminocidos ligam-se por condensao para formar uma ligao peptdica que consiste num grupo carboxilo de um aminocido ligado com um grupo amino do aminocido seguinte (figura 2).

A condensao possibilita a formao de um grupo amida, NH, no N-terminal de C e um grupo carbonilo, C=O, no C-terminal. Estes grupos, assim como as cadeias laterais aminoacil, so de grande importncia para o enrolamento da protena. Devido sua capacidade em formar ligaes de hidrognio, do grandes contribuies energticas para a formao de duas estruturas secundrias: hlice e folha-. As ligaes peptdicas entre os vrios aminocidos so equivalentes, pelo que no determinam qual a parte de uma sequncia vai formar uma -hlice ou uma folha-. Assim, o aspecto fundamental para se originar uma ou outra estrutura secundria a sequncia presente nas cadeias laterais, e no as ligaes entre os vrios aminocidos.

Os 20 aminocidos normalmente encontrados nas protenas so os seguintes:

As suas cadeias laterais so estruturalmente diferentes: A pH neutro, os cidos asprtico e glutmico esto carregados negativamente, enquanto a lisina e a arginina apresentam carga positiva. A histidina positivamente carregada, mas essa extenso depende do valor de pH. Assim, a pH 7.0, em mdia metade das cadeias laterais tm carga positiva. A tirosina e a cistena esto protonadas e no tm carga a pH neutro, porm tornam-se negativamente carregadas acima de pH 10 e pH 8, respectivamente. Os aminocidos polares englobam a serina, treonina, asparagina, glutamina e cistena. Os aminocidos no polares so alanina, valina, fenilalanina, prolina, metionina, leucina e isoleucina. A glicina tem comportamento constante, mas a cistina (forma oxidada da cistena) tem caractersticas hidrofbicas. Embora a tirosina e o triptofano intervenham em interaces polares, so melhor caracterizados como sendo no-polares ou hidrofbicos. Estes 20 aminocidos so incorporados numa nica sequncia baseada no cdigo gentico, com o objectivo de o pptido formado desempenhar uma determinada funo. Deste modo e, embora as propriedades especficas de uma protena dependam da localizao de cada aminocido e, consequentemente, da localizao de cada cadeia lateral na estrutura tridimensional, muitas das suas propriedades podem ser deduzidas facilmente a partir da composio do aminocido. (tabela 1A) Usando os valores de pKa destas cadeias laterais e um terminal amino e carboxilo, pode-se calcular as cargas totais (cargas positivas + cargas negativas) e cargas lquidas (cargas positivas cargas negativas) de uma protena em funo do pH, isto , recorrendo a uma curva de titulao. Uma vez que a cistena pode estar sob a forma oxidada, formando uma ligao dissulfurada, ou ento estar na forma livre, o clculo rigoroso acima de pH 8.0, implica o conhecimento do estado dos resduos cisteinil na protena. A curva de titulao assim obtida apenas uma aproximao, uma vez que alguns resduos carregados podem ser mascarados, pelo que os valores de pKa efectivos dependem no ambiente local de cada resduo. No entanto, a curva de titulao calculada d uma aproximao prvia do estado total de uma protena a um dado pH e, portanto, das propriedades da sua soluo. Outros parmetros moleculares, tais como o seu ponto isoelctrico (pI; quando a carga lquida de uma protena se torna nula), peso molecular, coeficiente de extino, volume especfico parcial e hidrofobicidade, podem ser estimados a partir da composio do aminocido.
4

A estrutura primria de uma protena, ou seja, a sequncia dos 20 aminocidos, pode levar a uma estrutura tridimensional, pois esses aminocidos apresentam diversas propriedades. Isto porque cada tipo de aminocido tem propenso para se incorporar preferencialmente em certas estruturas secundrias. As frequncias com que cada aminocido encontrado nas vrias estruturas secundrias podem ser calculadas (tabela 2):
5

A estrutura de folha- tem uma configurao distinta, consistindo em 4 aminocidos sequenciais, sendo essas posies ocupadas por aminocidos especficos: Asparagina normalmente observada na primeira e terceira posies da estrutura, devido sua cadeia lateral ser susceptvel de uma possvel N-glicosilao.

Os efeitos da glicosilao nas propriedades biolgicas e fsico-qumicas das protenas so de extrema importncia. No entanto, a sua contribuio para a estrutura no facilmente previsvel baseada na composio do aminocido.

Baseado nestas frequncias, pode prever-se para segmentos polipeptdicos especficos qual o tipo de estrutura secundria que tm maior tendncia em adquirir. H alguns mtodos que permitem prever uma estrutura secundria a partir da sequncia primria das protenas.

Outra propriedade dos aminocidos que tem impacto no enrolamento da protena a hidrofobicidade das cadeias laterais:

Aminocidos no-polares normalmente so hidrofbicos. No entanto, importante saber o quo hidrofbicos so!
6

Logo, calcula-se o coeficiente de partio ou a solubilidade dos aminocidos na gua e em solventes orgnicos, normalizando os parmetros relativamente glicina.

Relativamente s cadeias laterais da glicina, um nico tomo de hidrognio quando sujeito a normalizao demonstra a fora/intensidade com que as cadeias laterais de aminocidos no-polares preferem a fase orgnica em detrimento da fase aquosa.

Estes valores indicam que a energia livre aumenta quando a cadeia lateral do triptofano e da tirosina so transferidas de um solvente orgnico para a gua e, que essa transferncia termodinamicamente desfavorvel.

Pensa-se que: o Cadeias laterais hidrofbicas juntam-se, formando o ncleo da protena (interior), com propriedades semelhantes a um solvente orgnico; Estas caractersticas hidrofbicas dos aminocidos no-polares e as caractersticas hidroflicas dos aminocidos polares geram uma diviso de resduos aminoacil num ncleo hidrofbico e numa superfcie hidroflica, resultando da a estrutura global da protena.

Estrutura Secundria -Hlice Cada aminocido est ligado por uma ligao peptdica. O grupo NH funciona como um dador de protes e o grupo C=O, como aceitador, formando uma ponte de hidrognio estvel se estiverem posicionados numa configurao apropriada da cadeia polipeptdica. Tanto a estrutura de a-hlice como a de folha-b acomodam estas ligaes de hidrognio estveis. A cadeia principal forma uma hlice direita, pois apenas os aminocidos em configurao L esto constituem as protenas, rodando 3,6 resduos.

O comprimento total das a-hlices extremamente varivel.

Numa -hlice curta, o grupo C=O do resduo 1 forma uma ligao de hidrognio como grupo NH do resduo 5, e o grupo C=O do resduo 2 forma o mesmo tipo de ligao com o resduo 6.

Logo:

No inicio da estrutura, h sempre 4 grupos NH livres e no final, h tambm 4 grupos C=O livres.

Ambos os terminais da -hlice so altamente polares.


8

Todos os tomos de hidrognio esto alinhados ao longo do eixo da hlice: Uma vez que, ambos os grupos NH e C=O tm momentos dipolares na mesma direco, estes vo adicionar um momento dipolar substancial extra ao longo de toda a -hlice, com carga parcial negativa no C-terminal e carga parcial positiva no N-terminal. As cadeias laterais projectam-se para o exterior da -hlice: Esta projeco significa que todas as cadeias laterais circundam a superfcie exterior de uma hlice e interagem entre si e com as cadeias laterais de outras regies que contactam com estas.

Estas interaces de longo alcance conseguem estabilizar a estrutura helicoidal e funcionar como unidade de enrolamento. Por vezes, uma -hlice serve para construir um bloco para a estrutura tridimensional de protenas globulares, atravs da produo de cadeias laterais hidrofbicas de um lado da hlice e cadeias hidroflicas do lado oposto da mesma hlice. Os resduos das cadeias laterais ficam num plano perpendicular ao eixo da hlice. (Figura 7)

Uma das hlices previstas para a eritropoietina : Crculo Aberto cadeias laterais hidrofbicas Rectngulo Aberto cadeias laterais hidroflicas Um lado da hlice altamente hidrofbico, sugerindo a formao de um ncleo interno, enquanto o outro lado relativamente hidroflico, pelo que fica mais exposto superfcie. Uma vez que muitas protenas biologicamente importantes exercem a sua funo pela interaco com outras macromolculas, a informao obtida a partir da composio e forma da hlice extremamente til. Exemplo: Mutaes de aminocidos no lado que est exposto ao solvente podem levar identificao de zonas responsveis pela actividade biolgica; Mutaes no ncleo interno podem levar alterao da estabilidade da protena.
9

-Sheet a segunda estrutura secundria principal. constituda por pontes de hidrognio entre diferentes regies do polipptido que se podem encontrar bastante afastadas dentro da sequncia. Podem interagir umas com as outras de forma paralela ou anti-paralela: Numa -Sheet paralela cada cadeia est orientada na mesma direco, com pontes de hidrognio formadas entre as cadeias enquanto que numa -Sheet anti-paralela, as sequncias de polipptidos esto orientadas em direces opostas. Em ambas as estruturas, os grupos CO e NH projectam-se para lados opostos da cadeia polipetdica e assim, cada cadeia pode interagir atravs de ambos os lados da cadeia para formar pontes de hidrognio. Por esse motivo, mais do que 2 cadeias podem contactar entre si de forma paralela ou anti-paralela ou at mesmo de forma combinada. Este agrupamento pode levar a que todas as cadeias se encontrem situadas no mesmo plano como se se tratasse de uma folha. As cadeias laterais projectam-se em direces opostas, de forma perpendicular relativamente a este plano, podendo interagir com outras cadeias laterais dentro da mesma -Sheet ou com outras regies da molcula, podendo ainda estar expostas ao solvente.

Em quase todas as estruturas de protenas, as cadeias encontram-se torcidas no sentido dos ponteiros do relgio, podendo-se assim adaptar a diferentes conformaes.

Loops and Turns Formam estruturas mais ou menos lineares e interagem entre elas dando origem a uma estrutura tridimensional enrolada. So constitudas por uma sequncia de aminocidos que geralmente hidroflica e se encontra exposta ao solvente. Estas regies consistem a -turns, short hairpin loops e long loops. So necessrias muitas hairpin loops para ligar duas cadeias antiparalelas. Os aminocidos mais comuns nas -turns (prolina e glicina) no costumam ser encontrados nos outros tipos de estruturas secundrias (-sheet e -helix). A prolina aparece frequentemente na segunda posio das -turns e a glicina na terceira e quarta posio. Estes aminocidos tambm podem formar long loops. Embora estas sejam difceis de prever, elas so uma importante estrutura secundria uma vez que formam uma regio da protena fortemente exposta ao solvente permitindo que esta se enrole.
10

Estrutura terciria A estrutura terciria resulta da combinao de diversas estruturas secundrias numa forma tridimensional sendo esta que determina a funo das protenas devido ao facto de que necessria uma estrutura tri-dimensional especfica para poder ocorrer a aco de enzimas, anticorpos, etc... Muitas protenas enrolam-se de uma forma muito compacta originando uma estrutura globular. Uma estrutura terciria particular, pode resultar na organizao da protena numa estrutura quaternria distinta consistindo numa estequiometria fixa de cadeias peptdicas dentro do complexo proteico. Esta juno pode ocorrer entre o mesmo tipo de protenas ou entre cadeias polipeptdicas diferentes. Cada molcula dentro do complexo representa uma sub-unidade. A formao da estrutura quaternria ocorre atravs de interaces no covalentes ou atravs de ligaes dissulfidicas entre as sub-unidades.

Foras As interaces (tanto atractivas como repulsivas) que ocorrem entre os diversos grupos qumicos dentro das protenas so responsveis pela formao das estruturas secundrias, tercirias e quaternrias. As interaces repulsivas consistem em impedimento estereoqumico e efeitos electroestticos.
11

O enrolamento das protenas leva a uma posio fixa para cada tomo reduzindo a entropia. Para isto poder acontecer, necessrio que as foras atractivas (interaces hidrofbicas, pontes de hidrognio, foras de Van der Waals, etc...) superem as repulsivas. A estabilidade da estrutura enrolada tem uma importncia fundamental no desenvolvimento de agentes teraputicos proteicos.

Interaces hidrofbicas Este tipo de interaco representa a soma das foras de Van der Waals entre grupos no polares existentes no interior da protena. A transferncia de grupos no polares do interior para a superfcie requer uma grande diminuio da entropia. Por este motivo, a grande variao de energia livre positiva que resulta, impede que esta transferncia possa ocorrer espontaneamente. Assim, os grupos no polares encontram-se preferencialmente no interior das protenas enquanto que os grupos polares se encontram expostos na superfcie.

Ligaes de hidrognio -ligao inica depende da partilha de um proto entre dois tomos electronegativos (normalmente tomos de oxignio ou azoto) -Podem formar-se entre: - tomo de uma protena - molcula de gua -entre hidrognios intramoleculares na protena -interaces intramoleculares podem ter energias livres mais favorveis (graas a consideraes entrpicas), tornando-se mais fortes graas ao ambiente hidrofbico -todas as ligaes de hidrognio na molcula de protena contribuem para a estabilidade da mesma

Interaces electrostticas -ocorrem entre quaisquer dois grupos carregados -cargas do mesmo sinal repulso maior energia -cargas de sinal oposto atraco energia mais baixa -so bastante dependentes da distncia entre tomos e inversamente proporcionais constante dielctrica do meio -estas interaces so mais fortes no interior da protena graas a uma menor constante dielctrica -as ligaes podem ocorrer, por exemplo, entre grupos carboxilo (negativos) e grupos amino (positivos) -a energia livre resultante destas interaces uma propriedade de toda a estrutura
12

Interaces de van der Walls -existem entre tomos, sejam eles polares ou apolares -resultam das interaces atractivas entre dipolos permanentes e/ou induzidos -a fora repulsiva depende da carga repulsiva e da distncia entre dois tomos

Hidratao -as molculas de gua esto ligadas s protenas interna e externamente -a gua pode ligar-se ocasionalmente em cavidades internas da protena (por ligaes de hidrognio a pptidos, a cadeias laterais, grupos prostticos ou cofactores) -a superfcie da protena hidratada a partir do ambiente envolvente -o solvente que se encontra volta da superfcie da protena tem um papel na hidratao do pptido e das cadeias laterais mas pode-se esperar que as interaces sejam mveis e no especficas -molculas de gua bem ordenadas podem fazer uma contribuio significativa -uma molcula de gua pode ligar-se a dois grupos distantes na estrutura primria da molcula proteica, funcionando como uma ponte entre os grupos

-pode ser muito restrita no movimento e pode contribuir para a estabilidade da protena, uma vez que esta ligao pode apenas ocorrer na configurao prpria para acomodar a molcula de gua pode diminuir a flexibilidade dos grupos -pode ocorrer solvatao nos grupos hidrofbicos na superfcie da protena a interaco desfavorvel, resultando no clustering das molculas de gua -a hidratao hidrofbica facilita a interaco hidrofbica -a hidratao desfavorvel diminuda medida que os grupos hidrofbicos entram em contacto intra ou intermolecularmente, levando ao enrolamento das estruturas intracadeia ou a interaces protenaprotena -uma ligao forte ou fraca vai ter impacto na estabilidade e funo proteicas -a gua ligada pode modular a dinmica dos grupos superficiais crtico para a funo enzimtica -enzimas secas so, normalmente, inactivas tornam-se activas aps absorverem 0,2g de gua quantidade suficiente para cobrir os grupos polares da superfcie
13

Enrolamento proteico

-as protenas tornam-se funcionais apenas quando assumem uma estrutura terciria -quando se produzem protenas recombinantes na E.coli, podem formar corpos de incluso fazendo com que elas sejam depositadas como protenas insolveis no ocorre nas clulas quando as protenas so formadas naturalmente

Num processo in vitro requerido um re-enrolamento de protenas recombinantes insolveis no seu estado nativo

Conseguido atravs da solubilizao de protenas insolveis com detergentes ou desnaturantes, seguido de purificao e remoo destes reagentes

-estados desenrolados da protena so normalmente estveis e solveis na presena de agentes desnaturantes quando so enroladas correctamente so tambm estveis -durante a transio entre o estado desenrolado para o estado nativo passa por vrios estados de transio nos quais no est completamente enrolada e os agentes desnaturantes esto em pequenas concentraes ou at mesmo ausentes
14

-o re-enrolamento pode ser atingido de vrias formas

-a diluio das protenas numa concentrao de desnaturante elevada no tampo aquoso vai diminuir simultaneamente a concentrao de protena e de desnaturante

-a adio de um tampo aquoso a uma soluo de protena-desnaturante causa uma diminuio tanto no desnaturante como na protena

-as concentraes de protena e de desnaturante so muito baixas ao incio e aumentam gradualmente medida que o processo continua

-concentraes de desnaturante e de protena so muito elevadas no incio e vo diminuindo ao longo do processo

-Dilise ou diafiltrao podem ser utilizados uma vez que a concentrao de desnaturante aumenta medida que o processo continua

-o re-enrolamento tambm pode ser feito ao ligar a protena nos desnaturantes a uma fase slida, ou seja, a uma matriz em coluna, equilibrando em seguida com um tampo aquoso concentrao de protenas no bem definida -se as protenas possuem no seu estado nativo pontes dissulfito deve-se oxidar as cisteinas oxidao pelo ar, troca de dissulfito catalizada pela glutationa, etc

-o enrolamento apenas pode ser alcanado se a sequncia de aminocidos possuir toda a informao necessria para o enrolamento no estado nativo -normalmente as protenas no re-enrolam apenas num passo normalmente possuem vrios intermedirios de estrutura secundria interaces intracadeia destas estruturas secundrias podem levar ao seu estado nativo
15

-a ausncia de uma estrutura rgida na estrutura secundria pode expor um cluster de grupos hidrofbicos aos de outras cadeias polipeptdicas mais do que s suas prprias agregao intermolecular

-a recuperao da forma nativa depende de como se minimiza a agregao pode-se usar chaperones ou polietilenoglicol so usados para estabilizar intermedirios e mais tarde para solvatar a protena durante o enrolamento e diminui a agregao -solues fisiolgicas contm gua, vrios ies e solutos de alto e baixo peso molecular, por vezes em elevadas concentraes estes ies e solutos tm um papel em manterem a estrutura funcional das protenas e so tambm usados in vitro para assistir no enrolamento e para estabilizar as protenas na purificao, produo e armazenamento de longo prazo -estes solutos podem ser denominados de co-solventes quando usados em elevadas concentraes tambm servem como solventes junto com as molculas de gua ex: aucares, sais orgnicos e inorgnicos e poliis interagem fracamente com a superfcie das protenas estabilizando a energia sem interferir com a estrutura funcional -quando so expressas protenas recombinantes nas clulas eucariticas e de seguida so excretadas para o meio, so normalmente enroladas na sua conformao nativa -se as protenas possuem stios onde possam ocorrer N- ou O-glicosilao, elas sofrem vrios nveis de glicosilao dependendo das clulas hospedeiras e no nvel de expresso -para algumas glicoprotenas, a glicosilao no essencial para o enrolamento, uma vez que elas podem ser re-enroladas na conformao nativa sem hidratos de carbono e tambm no necessria para a ligao ao receptor e a actividade biolgica no entanto pode alterar as propriedades qumicas e biolgicas das protenas.

Tcnicas especialmente vocacionadas para caracterizar o enrolamento das protenas Tcnicas espectroscpicas convencionais

CD Dicroismo circular Fluorescncia

FTIR Espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier

16

CD e FTIR so amplamente utilizadas para estimar a estrutura secundria de protenas. A -hlice de uma protena pode ser facilmente estimada pelo CD na regio do UV distante (180260 nm) e por FTIR. O FTIR pode fielmente estimar o teor de -estrutura, bem como a distino entre formas paralelas e antiparalelas. Os sinais de FTIR das estruturas em loop, por vezes, coincidem com as decorrentes de uma hlice. O -sheet d sinais fracos no CD, que so variveis em posies e intensidades de pico devido a tores de interaco com -strands, sendo o CD UV distante confivel para a avaliao dessas estruturas.

CD na regio do UV-prximo (250-340 nm)

Fluorescncia Reflecte o ambiente

Reflecte o ambiente

Aminocidos aromticos (triptofano, tirosina e fenilalanina)

Estruturas com dissulfureto.

Tirosina

Triptofano

O CD e a fluorescncia, em muitos casos, so drasticamente alteradas aps re-enrolamento (refolding) e, portanto, podem ser utilizadas para acompanhar a formao da estrutura terciria de uma protena.

Nenhuma destas tcnicas consegue dar a estrutura enrolada a nvel atmico, ou seja, no do nenhuma informao sobre a localizao exacta de cada resduo amino-acil na estrutura tridimensional da protena. Estrutura Tridimensional Cristalografia de raio X RMN

17

CD, FTIR, Fluorescncia

Mtodos rpidos Menor concentrao de proteina (que o RMN e cristalografia) Anlise de proteinas em condies muito diferentes

CD UV-prximo, Fluorencncia

Quando uma forma natural da protena est disponvel, estas podem verificar rapidamente se a protena refolded assume a estrutura enrolada nativa.

CD, FTIR, Fluorescncia

Dependem da temperatura

Informaes acerca do enrolamento das protenas

Alteraes trmicas podem levar ao desenrolamento de protenas transio cooperativa trmica numa estreita faixa de temperatura. Protenas no enroladas podem alterar a sua estrutura transies trmicas no-cooperativas numa ampla faixa de temperatura.

Esta transio cooperativa tambm pode ser analisada por calorimetria diferencial exploratria. Quando a estrutura se desenvolve, necessrio calor. A absoro de calor, pode ser determinada usando a tcnica de calorimetria que altamente sensvel.

Anlise das propriedades Hidrodinmicas Estas propriedades mudam muito durante o processo de enrolamento das protenas, passando de estruturas alongadas e expandidas para estruturas compactas e globulares. 2 Tcnicas:
18

Velocidade de sedimentao Cromatografia de excluso molecular (mais acessvel)

O que se analisa? O coeficiente de sedimentao (o quo rpido uma molcula migra num campo centrfugo) funo do tamanho molecular e tamanho hidrodinmico das protenas. A posio de eluio em cromatografia de excluso (o quo rpido migra atravs dos poros) depende apenas do tamanho hidrodinmico.

Estas tcnicas fornecem informaes acerca da compactao durante o enrolamento da protena.

Anlise de protenas oligomricas Para protenas oligomricas, a determinao do peso molecular dos estados associados e a aquisio da estrutura quaternria podem ser usados para avaliar a estrutura enrolada. Tcnicas Se a associao de protenas foi obtida atravs de ligaes covalentes electroforese em gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sdio (PAGE). Se a associao de protenas envolve interaces no covalentes equilbrio de sedimentao e o espalhamento de luz.

Novas tcnicas

Ultracentrifugao analtica

Espalhamento de luz laser

Tcnicas de espalhamento da luz que caracterizam as protenas recombinantes Espalhamento da luz esttico mede a intensidade da luz espalhada Espalhamento da luz dinmico mede as flutuaes da intensidade da luz espalhada, como as molculas se difundem para dentro e fora de uma regio de espalhamento pequena (movimento bowniano) O espalhamento da luz esttico muitas vezes usado on-line em conjunto com a cromatografia de excluso molecular (SEC).
19

Tcnica:
OOO

O sinal de espalhamento proporcional ao peso molecular x concentrao. Dividindo este sinal por um proporcional concentrao, tais como os provenientes de um detector de absoro de UV ou ndice de refraco, d uma medida directa e absoluta da massa de cada pico eludo da coluna, independente da conformao molecular e a posio de eluio.

Esta tcnica permite a identificao rpida se o estado nativo de uma protena um monmero ou um oligmero e a estequiometria de complexos multi-protena. tambm muito til na identificao da massa de agregados que podem estar presentes e, portanto, til para avaliar a estabilidade da protena.

Espalhamento da luz dinmico (DLS) Mede a taxa de difuso das molculas, o que pode ser traduzido pelo raio de Stokes, uma medida do tamanho hidrodinmico. O raio de Stokes fortemente correlacionado com a massa molecular, que tambm fortemente influenciada pela forma molecular (conformao). O DLS muito menos preciso do que espalhamento esttico para medir a massa molecular. Vantagens: Capacidade para cobrir uma grande faixa de tamanho Detectar quantidades muito pequenas de grandes agregados (<0,01% de peso). Relativamente ao espalhamento esttico com SEC esta tcnica tem grande variedade de escolha de condies tampo e sem perda potencial de espcies atravs da aderncia coluna.

Ultracentrifugao analtica Constituda por um sistema ptico, rotores especiais e clulas numa centrfuga de alta velocidade para permitir a medio da concentrao de uma amostra versus posio dentro de uma clula centrfuga que gira. Anlise Velocidade de sedimentao Equilbrio de sedimentao

20

Tcnica de velocidade de sedimentao Ao analisar a velocidade de sedimentao, o rotor girado a alta velocidade, ento a amostra de protena sedimenta e forma um pellet. A velocidade de formao do pellet medida pelo sistema ptico para obter o coeficiente de sedimentao, que depende da massa e conformao molecular. Quando mais de uma espcie est presente (por exemplo, um monmero e mais um produto de degradao do dmero covalente), a separao alcanada a partir do coeficiente de sedimentao relativo a cada espcie.

Como o coeficiente de sedimentao sensvel conformao molecular e pode ser medido com grande preciso (~ 0,5%), a velocidade de sedimentao pode detectar diferenas bastante subtis na conformao.

Esta tcnica pode ser usada, por exemplo, para confirmar que a protena recombinante tem a mesma conformao que a protena natural do tipo selvagem, ou para detectar pequenas mudanas na estrutura, devido a mudanas no pH ou concentrao de sal, que podem ser muito subtis para serem detectadas por outras tcnicas, tais como o CD ou a calorimetria diferencial de varrimento.

Tcnica de equilbrio de sedimentao No equilbrio de sedimentao usa-se uma velocidade muito menor de agitao e a fora centrfuga mais leve do que para a velocidade de sedimentao. A protena no sedimenta. Este gradiente de concentrao na clula continuamente contrrio difuso, que tenta restaurar uma concentrao uniforme. Depois de rodar por um longo tempo (normalmente 12-36 horas), o equilbrio alcanado, onde a sedimentao e a difuso so equilibradas e a distribuio de protenas no muda com o tempo.

No equilbrio de sedimentao a distribuio da concentrao depende apenas da massa molecular e independente da forma da molcula. Assim, a auto-associao para a formao de dmeros ou de grandes oligmeros (seja reversvel ou irreversvel) facilmente detectada, assim como as interaces entre protenas diferentes.

Para a associao reversvel, possvel determinar a fora da interaco da ligao atravs da medio de amostras sobre uma vasta gama de concentraes de protena.
21

Em processos biotecnolgicos

Equilbrio de sedimentao "Padro de ouro"


Protena

Massa molecular esperada

Estado de oligomerizao biolgico em soluo activo

Tambm pode ser usado para determinar a quantidade mdia de glicosilao ou conjugao de molculas. A medida da afinidade de ligao para receptores - citocinas, antgeno-anticorpo, ou outra interaco s vezes tambm pode servir como uma caracterizao funcional de protenas recombinantes (embora no possa ser utilizado nalgumas interaces por serem muito fortes).

Outras tcnicas poderosas para estudar o enrolamento de protenas Modificao qumica especfica de stio Digesto proteoltica

ESTABILIDADE DE PROTENAS

As protenas no so quimicamente ou fisicamente estveis. A superfcie da protena quimicamente muito heterognea e contm grupos reactivos. A exposio a longo prazo destes grupos a stress ambiental provoca alteraes qumicas diferentes.
22

Exemplo de alteraes: Oxidao de resduos de cisteina e grupos metionil Hidrlise pode ocorrer em ligaes peptdicas e amidas de resduos de asparagina e glutamina. A seguinte tabela mostra uma srie de reaces que podem ocorrer durante a purificao e armazenamento de protenas e mtodos que podem ser utilizados para detectar tais mudanas.

A estabilidade fsica de uma protena expressa como a diferena de energia livre, GU, entre os estados nativo e desnaturado. Assim, as molculas de protena esto em equilbrio entre os dois estados. Enquanto o desenrolamento reversvel e GU positivo, no importa quo pequena a GU. Em muitos casos, essa reversibilidade no se mantm. Isto v-se frequentemente quando a GU diminuda pelo aquecimento. A maioria das protenas desnatura aps aquecimento e ocorre

posterior agregao irreversvel. Assim, o desenrolamento feito irreversivelmente pela agregao.

Portanto, todo o esforo que diminui a GU e que aumenta o k far com que haja o acmulo da forma irreversvel inactivada de protena. Stress
23

pH Temperatura Concentrao de proteina

Fora inica

O desenvolvimento de uma formulao adequada, que prolonga a vida til da protena recombinante essencial quando esta para ser utilizada na teraputica humana.

Uso de agentes de estabilizao

Estes compostos afectam a estabilidade da protena, aumentando a GU. Porm, tambm pode aumentar k e, consequentemente, o seu efeito sobre o armazenamento a longo prazo das protenas pode variar entre as protenas, bem como sobre as condies de armazenamento.

Forma de diminuir o desenrolamento irreversvel

Uso de um detergente suave

Aumenta a estabilidade

Antes de seleccionar a concentrao de detergente e o tipo, os seus efeitos na GU devem ser cuidadosamente avaliados.

Outra abordagem para aumentar a estabilidade de protenas Liofilizao

Congelamento

A liofilizao pode minimizar a etapa de agregao durante o armazenamento, uma vez que ambas as modificaes qumicas e a agregao so reduzidas na ausncia de gua. Os efeitos de um processo de liofilizao na GU e k no so totalmente compreendidas e, portanto, este processo deve ser optimizado para cada protena teraputica.

24

TCNICAS ANALTICAS

BLOTTING TECHNIQUES Usadas para detectar nveis muito baixos de molculas nicas num meio de protenas, cidos nucleicos e outros componentes celulares. Podem ser detectados agregados ou produtos de degradao que ocorrem durante o armazenamento a longo prazo e podem ser usados para detectarem componentes de clulas hospedeiras usados na produo de protenas recombinantes Frequentemente as amostras so sujeitas a algum tipo de fraccionamento (ex. PAGE) As biomolculas so transferidas para uma membrana (blotting) que contm reagentes especficos para identificar a molcula de interesse. As amostras lquidas tambm podem ser analisadas por mtodos designados blots ou slot blots
Nitroclulose, nylon, polivinilide difluoride (PVDF)

dot

Formato circular ou em disco

Configurao rectangular Permite uma quantificao mais precisa das biomolculas desejadas e relacionar resultados integrados obtidos com quantidades de material conhecidas

Diferentes designaes de acordo com o material em estudo Southern blots Northern blots Western blots DNA RNA Protenas Envolve o uso de anticorpos para detectar protenas especficas

Transferncia de protenas Aco capilar

A membrana colocada entre o gel e o papel absorvente

O lquido do gel arrastado para o papel absorvente e a protena capturada pela membrana

Mancha ou impresso da protena no gel

25

Electroblotting a transferncia da protena para a membrana ocorre sob a influncia de um campo elctrico

O campo elctrico aplicado perpendicularmente ao campo original usado na separao

A distncia mxima que a protena necessita percorrer para migrar apenas a espessura do gel

A transferncia de protenas corre muito rapidamente

Sistemas de deteco Imunoblotting os anticorpos so os reagentes para a identificao das protenas de interesse pode ser usado para mostrar a ausncia de protenas: anticorpos contra protenas no organismo no qual as protenas recombinantes tm sido expressas. Este mtodo pode atestar a pureza das protenas pretendidas.

Principais etapas do mtodo

1. Transferncia das protenas para a membrana (ex. electroblotting) 2. Bloqueio dos locais residuais de ligao das protenas na membrana com protenas no relacionadas (ex. protenas do leite) 3. Tratamento da membrana com anticorpos que reconhecem as protenas de interesse. Se o anticorpo marcado com um grupo de deteco ir para passo 5 4. Incubao da membrana com anticorpo secundrio (marcado com grupos radioactivos ou enzimticos) que reconhece o anticorpo primrio usado no passo 3. Este anticorpo marcado com um grupo de deteco 5. Tratamento da membrana com reagentes apropriados para localizar o local de ligao da membrana do anticorpo ligado no passo 4 ou 5.

para que os anticorpos utilizados para a deteco reajam apenas com a molcula alvo ou antignio e no em locais no especficos

26

Em vez de se purificar vrios anticorpos primrios, apenas o anticorpo secundrio necessita ser purificado e marcado para o reconhecimento dos anticorpos primrios

O anticorpo reage apenas com uma protena especfica na membrana devido interaco especfica com esse antignio. Podem ser utilizados vrios procedimentos para detectarem este complexo: Os anticorpos so marcados com marcadores radioactivos tal como o 125I Os anticorpos esto ligados a uma enzima (ex. HRP ou AP). Na incubao com o substrato forma-se um produto colorido insolvel que localiza o anticorpo. Alternativamente a localizao do anticorpo pode ser detectada usando um substrato que produz um produto quimioluminescente O anticorpo marcado com biotina. A streptavidina ou avidina so adicionadas para fortalecer a ligao com a biotina. Cada streptavidina tem 4 locais de ligao. Os locais de ligao restantes podem combinar-se com outras molculas de biotina que esto covalentemente ligadas a HRP ou a AP.

O anticorpo primrio ou secundrio usado para deteco. Pode estar marcado com um grupo radioactivo ou acoplado com uma enzima tal como a horseradish peroxidase (HRP) ou fosfatase alcalina (AP). O substrato adicionado e convertido num produto colorido insolvel no local de protenaanticorpo primrio-anticorpo secundrio-HRP. Como alternativa ao substrato podem ser usados produtos quimioluminescentes. Uma reaco qumica leva produo de luz que pode ser detectada por exemplo por filmes raio-X. A streptavidina, ou alternativamente a avidina, e a biotina desempenham um importante papel na deteco de protenas por imunoblottig. A biotina forma firmes complexos com a streptavidina e avidina. Secundariamente, estas protenas so multimricas e contm 4 locais de ligao para a biotina. Quando a biotina est covalentemente ligada a protenas, anticorpos e enzimas, a streptavidina liga-se biotina, reconhecendo assim o local na membrana onde a protena de interesse est localizada.
27

IMUNOENSAIOS - ELISA prev quantitativamente a medida de quantidades de protenas muito pequenas nos fluidos biolgicos e serve como uma ferramenta para a anlise de protenas especficas durante a purificao. Vantagem: superfcies plsticas so capazes de adsorver quantidades baixas, mas detectveis de protenas. Anticorpos contra a protena pretendida adsorvem nas placas de microtitulao

Aps a incubao dos anticorpos nos poos da placa durante um perodo de tempo especfico, o excesso de anticorpo removido e os locais residuais de ligao s protenas so bloqueados com uma protena inerte.

28

A soluo de amostra que contm a protena de interesse incubada nos poos e a protena (Ag) capturada pelos anticorpos que revestem a superfcie dos poos. O excesso de amostra removido e outros anticorpos que tm uma enzima (E) ligada so adicionados para reagir com o antignio ligado. Este formato designado de sandwich uma vez que o antignio de interesse est localizado entre o anticorpo na superfcie do poo e o anticorpo que contm a enzima ligada (comummente HRP ou AP). Um substrato apropriado adicionado e a enzima que est ligada ao anticorpo-antignio-anticorpo converte esse composto num produto colorido. A quantidade de produto obtido proporcional enzima adsorvida no poo da placa. A curva padro pode ser preparada a partir de concentraes conhecidas de antignios e a quantidade de antignio desconhecida das amostras pode ser estimada desta curva padro. Os poos podem ser revestidos directamente com o antignio. A quantificao feita por comparao com quantidades conhecidas de antignio usadas para o revestimento dos poos individuais. Outra opo a utilizao de um anticorpo especfico que se liga ao anticorpo que est ligado protena de antignio. Este anticorpo secundrio est ligado enzima que usada para a deteco. Tal como nos imunoblots, a streptavidina ou avidina podem ser utilizadas se a biotina estiver ligada covalentemente aos anticorpos e enzimas. Se for utilizado um marcador radioactivo no lugar da enzima, o ensaio designa-se de radioimunoensaio em fase slida (RIA). Estes ensaios tm sido afastados devido ao facto da

utilizao dos radioistopos levarem a problemas de segurana e com a eliminao dos resduos radioactivos.

ELECTROFORESE Os sistemas usados para a anlise de protenas tm um maior poder de resoluo e limite de deteco que os usados na purificao. Os dois principais mtodos para anlise tm a sua base em tcnicas cromatogrficas ou electroforticas.
29

PAGE As protenas (molculas anfotricas com grupos carregados positiva e negativamente na sua estrutura primria) so separadas de acordo com a sua carga elctrica. Um segundo factor responsvel pela separao a massa da protena.
O ratio carga/massa determina a forma como as protenas so separadas num campo elctrico

A carga da protena pode ser controlada pelo pH da soluo na qual separada: Quanto mais afastada do seu ponto isoelctrico (pH ao qual a carga zero), maior ser a carga e o ratio carga/massa

A direco e velocidade da migrao da protena depende do pH do gel: Se pH > pI, a protena ter carga negativa e migra em direco ao nodo (quanto maior o pH, mais rpida ser a migrao) Electroforese de gel nativo O principal componente dos geles de poliacrilamida a gua. No entanto, eles oferecem um suporte flexvel fazendo com que, aps a protena ter sido sujeita a um campo elctrico durante um perodo de tempo, haja uma matriz para manter as protenas no lugar at que sejam detectadas pelos reagentes adequados.

Ao ajustar-se a quantidade de acrilamida usada nestes geles, pode-se controlar a migrao do material no gel: Quanto mais acrilamida, maior impedimento migrao das protenas

A adio de um detergente (dodecil sulfato de sdio SDS) ao sistema electrofortico (SDSPAGE) permite que a separao ocorra primariamente em funo do tamanho da protena. Os ies dodecil sulfato (carga negativa) formam complexos com as protenas, resultando num desdobramento de protenas, e a quantidade de detergente que complexado proporcional massa da protena quanto maior for a protena, mais detergente estar complexado. Quando as protenas esto numa soluo de SDS, acontece que a sua carga balanada pelo dodecil sulfato complexado fazendo com que as protenas recebam a carga negativa proporcional sua massa.
30

Nota: O ratio carga/massa praticamente constante entre as protenas (dado que todas as protenas recebem carga negativa, com as maiores a ligarem mais SDS) Ento se o ratio o mesmo, como se separam? A separao conseguida atravs do controlo da concentrao da acrilamida ao longo do caminho feito pelas protenas durante a migrao.

Quanto maior for a concentrao de acrilamida (menor o tamanho dos poros no gel), mais difcil para as protenas de maior tamanho migrarem em relao s mais pequenas. Se a concentrao for suficientemente alta, algumas protenas de grande peso molecular podero no migrar no gel. Como as protenas no SDS-PAGE so desnaturadas, o seu tamanho hidrodinmico e o grau de retardao pelos efeitos de peneiramento so directamente relacionados com a sua massa. As protenas com ligaes dissulfito possuem uma estrutura mais compacta e maior mobilidade a no ser que as ligaes sejam reduzidas antes da electroforese.

Electroforese em gel nativa e SDS-PAGE: mecanismos diferentes para a separao de protenas Electroforese nativa As protenas esto no estado nativo e migram atravs das suas prprias cargas Esta electroforese pode ser usada para caracterizar protenas no estado nativo SDS-PAGE As protenas sofrem um desdobramento e migram consoante a massa molecular

Caso intermdio uso de um corante para marcar as bandas das protenas (azul da Coomassie). Este corante liga-se superfcie hidrofbica das protenas e adiciona cargas negativas (permanecem no estado nativo e migram consoante as cargas, que depende das cargas intrnsecas e da quantidade de corante carregado negativamente)
Particularmente interessante para analisar protenas membranares que tm a tendncia a agregar na ausncia de detergentes (o corante previne a agregao ao ligar-se superfcie hidrofbica)

31

Focagem Isoelctrica (IEF) Tira partido do ponto isoelctrico. Primeiro, estabelecido um gradiente de pH no gel usando uma mistura de anfolticos de baixo peso molecular e vrios pI. As condies de maior valor de pH so estabelecidas no ctodo. Aps ser colocada no gel, a protena vai migrar at chegar ao valor de pH no gel onde a sua carga zero.

Electroforese bi-dimensional em gel Combinao dos dois mtodos anteriores (electroforese 2-D). Primeiro as protenas so fraccionadas por IEF segundo os seus pI. Depois so sujeitas a SDSPAGE perpendicular primeira dimenso e fraccionadas com base nos pesos moleculares. O SDS-PAGE no pode ser feito antes da IEF porque uma vez que o SDS se liga e desnatura as protenas, elas j no migrariam com base no seu pI.

Deteco de protenas com geles de poliacrilamida Apesar dos geles de poliacrilamida fornecerem um suporte flexvel s protenas, com o passar do tempo elas vo difundir e espalhar no gel. Consequentemente, comum fix-las no local para onde migraram. Isto conseguido colocando o gel numa soluo fixadora na qual as protenas se tornam insolveis. H muitos mtodos para a colorao de protenas em geles, mas os mais comuns e bem estudados so a colorao com o azul de Coomassie ou um mtodo que usa prata. O ltimo usado quando necessria uma maior sensibilidade.

Colorao com azul de Coomassie h interaco hidrofbica entre o corante e a protena. Logo, o gel fica corado onde a protena est localizada.

Quantificao atravs do mtodo de colorao de prata menos preciso. No entanto, dada a maior sensibilidade deste mtodo, quantidades muito pequenas de contaminantes podem ser detectadas.

32

Estes procedimentos de fixao e colorao desnaturam as protenas. Logo, protenas separadas sob condies nativas, como acontece na electroforese nativa, sero desnaturadas. Para manter o estado nativo, os geles pode ser corados com cobre ou outros ies metlicos.

Electroforese capilar Tem ganho presena na anlise e caracterizao de protenas recombinantes durante o processo de desenvolvimento e em estudos de estabilidade. Em vez de haver uma matriz, como no PAGE, atravs da qual as protenas migram, elas esto livres em soluo num campo elctrico, dentro de um tubo capilar. O tubo capilar passa atravs de uma luz UV ou um detector fluorescente que mede a presena de protenas a migrar no campo elctrico. O movimento de uma protena em relao a outra funo da massa molecular e da carga. A carga pode ser influenciada pelo pH e analitos na soluo. Dificuldades: reprodutibilidade dos capilares e validao do sistema

CROMATOGRAFIA Estas tcnicas so muito usadas em biotecnologia, no apenas na purificao de protenas mas tambm na avaliao da integridade do produto. Uma quantidade/volume conhecida de material para anlise colocada no fluxo de soluo em direco a uma coluna de separao usada para fraccionar a amostra. Outra parte do sistema o mdulo bomba que fornece uma taxa de fluxo reprodutvel. Alm disso, o sistema de bombeamento pode provocar um gradiente que altera as propriedades da soluo (pH, fora inica, hidrofobicidade). O sistema de deteco est localizado no final da coluna e mede a quantidade relativa de protena existente na coluna.

Acoplado ao detector est um sistema que transforma o sinal do detector num valor relacionado com a quantidade de material. Quando a protena aparece, o sinal aumenta e medida que a protena passa pelo detector o sinal vai diminuindo. A rea sob o pico do sinal proporcional quantidade de material que passou pelo detector.

33

Ao analisar quantidades conhecidas de protena, pode gerar-se um grfico rea vs quantidade de protena e este pode ser usado para estimar as quantidades da protena na amostra mas em outras circunstncias. Nota: os pequenos nveis de componentes que aparecem ao longo do tempo podem ser estimados relativamente protena a ser analisada e isto particularmente til quando a estabilidade a longo termo est a ser avaliada.

Cromatografia de excluso de tamanho Separa as protenas com base no seu tamanho ou peso molecular ou forma. A matriz consiste em grnulos com cavidades e poros acessveis a molculas de um certo tamanho ou mais pequenas, mas inacessveis a molculas maiores.

O princpio desta tcnica a distribuio das molculas entre o volume da soluo nos grnulos vs o volume da soluo volta dos grnulos as molculas pequenas tm acesso a um volume maior. medida que a soluo passa atravs da coluna, as molculas podem difundir para a frente e para trs, dependendo do seu tamanho, para dentro e para fora dos poros dos grnulos. As molculas mais pequenas podem ficar nos poros por um perodo de tempo finito enquanto as maiores, incapazes de entrar nestes espaos, continuam no fluxo. As molculas de tamanho intermdio passam um tempo intermdio dentro dos poros. Podem ser fraccionadas a partir de molculas maiores que no conseguem aceder ao espao da matriz e a

partir de molculas pequenas que tiveram acesso livre a este volume e passaram a maior parte do tempo nos grnulos. As molculas das protenas podem distribuir-se entre o volume nos grnulos e o volume excludo com base na massa e forma da molcula. Esta distribuio baseada na concentrao relativa da protena nos grnulos vs volume excludo. Esta cromatografia pode ser usada para estimar a massa de protenas ao calibrar a coluna com uma srie de protenas globulares de massa conhecida. No entanto, a separao depende da forma molecular (conformao) bem como da massa
34

As protenas altamente elongadas (protenas que contm regies desordenadas e flexveis) e glicoproteinas, aparecero com massas 2 e 3x maiores que o valor real. Outras protenas interagem muito fracamente com a coluna da matriz e so retardadas, aparecendo como se tivessem uma massa mais pequena. por isso, usam-se outros mtodos para a medio precisa da massa Com o passar do tempo, as protenas podem sofrer alteraes que afectam a sua massa. As ligaes peptdicas podem hidrolisar-se originando duas cadeias polipeptdicas mais pequenas. Esta cromatografia usada comummente para avaliar as formas agregadas das protenas. Exemplo:

Protena agregada

Protena nativa

Cadeias polipeptdicas originadas da protena degradada

A agregao pode ocorrer quando a molcula desdobra e expe superfcies que so atradas por outras complementares em molculas adjacentes. Esta interaco pode levar dimerizao ou duplicar o peso molecular ou originar oligmeros de peso molecular mais elevado.

Cromatografia lquida de alta eficincia de fase reversa (RP-HPLC)

RP-HPLC tira proveito das propriedades hidrofbicas das protenas. Os grupos funcionais na matriz da coluna contm de 1 a 18 tomos de carbono numa cadeia hidrocarbonada. Quanto mais longa esta cadeia, mais hidrofbica a matriz.
35

Os fragmentos hidrofbicos das protenas interagem com a matriz cromatogrfica hidrofbica. As protenas so depois eludas da matriz atravs do aumento da natureza hidrofbica do solvente que passa atravs da coluna.

acetonitrilo um solvente comummente usado, embora outros solventes orgnicos como o etanol tambm possam ser empregados.
O

O solvente tornado cido atravs da adio de cido trifluoroactico, uma vez que as protenas tm maior solubilidade em valores de pH mais afastados do seu pI.

Um gradiente com aumento da concentrao de solvente hidrofbico passado atravs da coluna. Diferentes protenas tm diferentes hidrofobicidades e so eludas da coluna, dependendo do "potencial hidrofbico" do solvente.

Esta tcnica pode ser muito poderosa. Ela pode detectar a adio de um nico tomo de oxignio protena, como quando um resduo metionil oxidado.

A formao de pontes dissulfeto tambm muda as caractersticas hidrofbicas da protena. Assim, a RP-HPLC pode ser usada no s para avaliar a homogeneidade da protena, mas tambm para acompanhar processos de degradao que ocorrem durante o armazenamento a longo prazo.

A cromatografia de fase reversa da digesto proteoltica de protenas recombinantes pode servir para identificar esta protena. A digesto enzimtica produz pptidos nicos que eluem em diferentes tempos de reteno ou em diferentes concentraes de solventes orgnicos. Alm disso, o cromatograma de peptdeos resultantes da digesto enzimtica de uma protena bastante diferente do obtido de outra protena. Vrias proteases diferentes, tais como a tripsina,

quimotripsina e outras endoproteinases, so utilizados para esses testes de identidade (ver Espectrometria de Massa).

Cromatografia de interaco hidrofbica (HIC) Companheira da RP-HPLC. Cromatografia de fase normal sistema de solvente aquoso utilizado, ao invs de um orgnico, para protenas fraccionadas. As caractersticas hidrofbicas da soluo so modulados pela concentrao de sais inorgnicos (ex. sulfato de amnia e cloreto de sdio, desde que sejam muito solveis em gua)

36

Na presena de altas concentraes de sal, as protenas so atradas por superfcies hidrofbicas na matriz de resinas usada nesta tcnica.

Com a diminuio da concentrao de sal, as protenas tm menos afinidade com a matriz e, finalmente, eluem da coluna.

Este mtodo no tem o poder de resoluo do RP-HPLC, mas um mtodo mais suave, pois os valores baixos de pH ou solventes orgnicos utilizados na RP-HPLC podem ser prejudiciais para algumas protenas.

Cromatografia de troca inica

Esta tcnica tira vantagem das propriedades de carga electrnica de protenas. Alguns dos resduos de aa so carregadas negativamente e outros so carregados positivamente.

A carga da protena pode ser modulada pelo pH do seu ambiente em relao ao valor do pI da protena.

pH < pI, protena tem carga positiva

pH > pI, protena tem carga negativa

Em cromatografia de troca inica, os opostos atraem-se. As resinas podem conter grupos funcionais com cargas positivas ou negativas.

37

Protenas com carga positiva ligam-se a matrizes carregadas negativamente e protenas de carga negativa ligam-se a matrizes carregadas positivamente.

As protenas so deslocadas da resina atravs do aumento da concentrao de sal (ex. cloreto de sdio).

Protenas com diferentes cargas podem ser separadas umas das outras durante a eluio atravs dum aumento do gradiente de sal.

A escolha da resina carregada e condies de eluio so dependentes da protena de interesse. Em vez de alterar a fora inica da soluo, as protenas podem ser eludas por mudana do pH do meio, ou seja, com a utilizao de um gradiente de pH.

Este mtodo chamado chromatofocusing - as protenas so separadas com base nos valores de pI.

Quando o pH do solvente atingir o valor pI de uma protena especfica, a protena tem carga zero e no mais atrado pela matriz e, portanto, eluda.

Outras tcnicas cromatogrficas Outros grupos funcionais podem ser associadas s matrizes cromatogrficas para tirar proveito de propriedades exclusivas de certas protenas. Estas metodologias de afinidade, no entanto, so mais frequentemente utilizadas no processo de fabricao do que em tcnicas de anlise. Ex. sistemas convencionais de afinidade para purificao de anticorpos usam colunas de protenas.
38

BIOENSAIOS Fundamental ao desenvolvimento duma protena teraputica ter um ensaio que identifique a sua funo biolgica. A cromatografia e tcnicas electroforticas podem abordar a homogeneidade de uma bioteraputica e serem teis na investigao de parmetros de estabilidade. No entanto, tambm necessrio verificar se a protena tem actividade biolgica aceitvel. A bioactividade pode ser determinada in vivo, ou seja, atravs da administrao da protena num animal e verificar algumas mudanas no seu corpo (funo), ou in vitro. Os bioensaios in vitro monitorizam a resposta de um receptor especfico ou linha de clulas dum tecido quando a protena teraputica adicionada ao sistema.

Ex. o aumento da sntese de DNA na presena da protena teraputica medido pela incorporao de timidina marcada radioactivamente. O factor de protena liga-se a receptores na superfcie celular, o que desencadeia mensageiros secundrios para enviar sinais para o ncleo da clula para sintetizar DNA.

Ensaio in vitro que mostram uma resposta mitognica em que a timidina radioativa incorporada no DNA na presena de uma quantidade crescente de um fator de protena.

A figura apresenta uma curva dose-resposta de incorporao da timidina em funo da concentrao do factor. Em concentraes baixas, o factor muito baixo para provocar uma resposta. Com o aumento da concentrao, a incorporao de timidina ocorre. Em concentraes muito altas, a quantidade de incorporao de timidina cessa quando a sntese de DNA ocorre a uma velocidade mxima.
39

Uma curva padro pode ser obtida utilizando quantidades conhecidas do factor de protena.

Atravs da experincia durante o desenvolvimento da protena teraputica, um valor obtido para a protena totalmente funcional.

Comparaes posteriores a este valor podem ser usadas para determinar: - qualquer perda na actividade durante os estudos de estabilidade - alteraes na actividade quando os resduos de aminocidos da protena acil so modificados.

Outros bioensaios in vitro podem medir as variaes no nmero de clulas ou a produo de um outro factor de protenas em resposta estimulao de clulas pela protena teraputica. A quantidade da protena secundria produzida pode ser estimada por meio de ELISA.

ESPECTROMETRIA DE MASSA

Os avanos recentes na quantificao da massa molecular de protenas tornaram esta tcnica uma importante ferramenta analtica.

Por causa da preciso do mtodo, modificaes ps-translacionais como acetilao ou glicosilao podem ser previstas.

As massas de novas formas de protenas que possam surgir durante os estudos de estabilidade fornecem informaes sobre a natureza dessa forma.

Ex. um aumento na massa de 16 Dalton sugere que um tomo de oxignio foi adicionado protena

A massa molecular dos pptidos obtidos aps digesto proteoltica e separao por HPLC indica de que regio da estrutura primria estes derivam.
40

Ex. Isto obtido por digesto de uma protena com pepsina e posterior separao dos pptidos digeridos por HPLC. Este padro muito caracterstico de uma protena chamado de "impresso digital da protena." Os picos so identificados pelos tempos de eluio em HPLC. Podem ser feitas ainda estimativas da massa molecular para os pptidos obtidos a partir de digesto proteoltica no fraccionada. Massas moleculares que diferem dos valores esperados indicam que uma parte da molcula de protena foi alterada, por glicosilao ou outra modificao, ou que a protena em estudo ainda contm contaminantes.

Mapa peptdico da digesto pela pepsina da b-secretase recombinante humana. Cada pptido marcado pelo tempo de eluio em HPLC.

A espectrometria de massa pode ainda ser usada como uma ferramenta de anlise no sequenciamento de pptidos.

Numa estrutura recorrente, a ligao peptdica, em pptidos tende a produzir fragmentos de peptdeo maduro que diferem por um resduo de amino acil. A diferena em massa entre os dois fragmentos indica a remoo de um aa para gerar outro fragmento. Com excepo de leucina e isoleucina, cada aminocido tem uma massa diferente e, portanto, uma sequncia pode ser lida a partir do espectrgrafo de massa. A remoo gradual pode ocorrer a partir de qualquer terminal amino ou carboxil.
41

Mudando trs componentes bsicos do espectrmetro de massa, a fonte de ies, o analisador e o detector, diferentes tipos de medio pode ser realizada.

- Normalmente as fontes de ies que volatilizam as protenas so: ionizao em electrospray (EI), bombardeamento de tomos rpidos e io lquido secundrio.

- Analisadores comuns incluem: quadrupolo, sector magntico, e tempo de instrumentos de vo. A funo do analisador separar as biomolculas ionizadas com base na sua razo massa carga.

- O detector mede a corrente provocada por partculas carregadas. El e dessoro a laser assistida por matriz (MALDI) so duas fontes que podem gerar protenas de alto peso molecular voltil. No mtodo antigo, as gotas so geradas por asperso ou nebulizao da soluo de protena na fonte do espectrmetro de massa. Como o solvente evapora, a protena fica para trs na fase de gs e passa atravs do analisador para o detector. Em MALDI, as protenas so misturadas com uma matriz que evapora quando expostos luz laser, realizando assim a protena na fase gasosa.

Ex. de anlise de MALDI-massa mostrado na seguinte figura , indicando o io de carga nica (116118 Dalton) e os ies duplamente carregados (58036,2) para uma protena purificada

42

Anlise de massa MALDI de uma b-secretase recombinante humana purificada

Concluses Com a introduo de protenas recombinantes na teraputica humana, a necessidade de mtodos para avaliar a sua estrutura, funo e homogeneidade tornou-se primordial. Vrias tcnicas analticas so utilizadas para caracterizar a estrutura primria, secundria e terciria da protena e para determinar a qualidade, pureza e estabilidade do produto recombinante. Os bioensaios estabelecem a sua actividade.