Artigo Congresso Nacional

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ASSESSORIA E SERVIOS EM MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL LTDA.
REVERSO DE LEVEDURAS Saccharomyces DE PROCESSOS FERMENTATIVOS DE VRIAS USINAS, DA FORMA DE PSEUDOMICLIO (CACHOS) PARA FORMA UNICELULAR Teresa Cristina Vieira Possas
Ttulo, Autores, Referncia dos Autores, Resumo (no mximo de 200 palavras), Summary (Abstract), Palavras- Chave, Introduo, Material e Mtodos, Resultados e Discusso, Concluses, Agradecimentos (no mximo 50 palavras) e Referncias Bibliogrficas
RESUMO
Desde o ano de 1987 vem-se observando que mesmo em se colocando na fermentao leveduras unicelulares, com o decorrer dos dias de safra as leveduras lentamente vo formando pseudomiclios (cachos de at 50 clulas). Aproximadamente 95% das fermentaes de 45 usinas analisadas observou-se este fato. Vrios so os fatores de estresse que concorrem para esta alterao fenotpica, sendo o de maior relevncia a temperatura, quando esta excede os 34oC. O fato que esta levedura alterada (colnias rugosas) no tem o mesmo rendimento fermentativo da que tem a forma unicelular e produzem no processo muito mais espuma. Este fato comprovado pelas anlises comparativas de teor alcolico, massa seca, tolerncia ao etanol, taxa de crescimento especfico, pH e acidez e espuma que mostramos a seguir, entre a levedura com pseudomiclio e a idntica a ela revertida em laboratrio a clulas isoladas. J colocamos no processo fermentativo estas leveduras as quais chamamos LPT (Levedura do Processo Transformada). Tambm, para comprovar, j fizemos tipagem gentica antes e aps reverso e conferiu ser a mesma.
Abstract Since 1987 it has been observed that even when only unicellular yeast are put in the fermentation, as the days go by them slowly start to develop pseudohyphal ( bunches with maximum 50 cells). This fact was seen in nearly 95% of the fermentations from the 45 analyzed plants. There are many stress factors that could lead on this phenotypic alteration, but temperature is the one that affect most when it exceeds 34 C. The fact is that those modified yeasts (bunches colony) dont have the same fermentative yield and make much more foam than those which have unicellular form. This fact is proved by comparative analysis of alcohol content, dry mass, ethanol tolerance, specific growth rate, pH and acidity, which we will show below, between the yeasts with pseudohyphal and the identical ones, reversed on laboratory in
Rua Industrial Luiz Calheiros Jnior,517, Farol, Macei AL, CEP 57.055.230 fone fax 082 3372 5270 E-mail: teresapossas@uol.com.br cel (82) 9921-4479
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isolated cells. We had put these yeasts into the fermentative process, which we called PYT (Processs yeast transformed). To prove, we had already done genetic typing before and after the reversion and it was the same. 2.0 MATERIAL E MTODOS
2.1. Microrganismos usados no teste Foram usadas culturas puras de leveduras, originrias de unidades industriais. Estas colnias de leveduras mostraram-se ser do gnero Saccharomyces (resultado obtido preliminarmente pelo mtodo da Taxonomia Numrica, proposta por Griffiths1), onde verificou-se serem predominantes nas fermentaes de onde foram isoladas. A morfologia das colnias eram rugosas e as clulas se apresentavam com pseudomiclios. Utilizamos tambm culturas de colnias lisas, clulas soltas, correspondentes e originadas das rugosas.
Figura 1. Fotografia placa de Petri contendo meio de cultivo WL, observandose crescimento de colnias de leveduras totalmente lisas. V-se no detalhe da
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segunda fotografia (da esquerda para a dreita) o aspecto dessas colnias, numa aproximao digital. Fotomicrografias ao microscpio (400x, contraste de fase) das colnias de leveduras de aspecto liso, observando-se as clulas em disposio unicelular.
Figura 2. Fotografia placa de Petri contendo meio de cultivo WL observando-se crescimento de colnias de leveduras predominantemente rugosas, observandose algumas poucas colnias lisas. No detalhe da segunda fotografia (da esquerda para a dreita) o aspecto dessas colnias demonstra o formato irregular. Fotomicrografias ao microscpio (400x, contraste de fase) das colnias de leveduras de aspecto liso, observando-se as clulas em disposio de pseudomiclios (cachos).
2.2. Espalhamento em superfcie para leveduras Inicialmente procedeu-se a diluio do fermento in-natura do processo fermentativo, usando-se diluies sucessivas at diluio conveniente, em seguida utilizou-se um volume de 0,02 mL da
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diluio e inoculou-se em placa de Petri contendo meio de cultivo especfico base de glicose (5%), sais minerais e agente solidificante (gar a 2% ), logo aps, foi realizado o espalhamento na superfcie do meio de cultivo, com auxlio de uma ala de Drigalski devidamente estril. Estas placas semeadas foram incubadas por aproximadamente 48 horas a uma temperatura de 32C + 1C, ficando em seguida temperatura ambiente por 72 horas.
2.3. Avaliao crescimento colnias celulares e Purificao de colnias para os testes bioqumicos Aps o perodo de incubao foi realizada a contagem total da populao de colnias crescidas, fazendo-se uma separao por morfologia (quanto a cor, forma, tamanho e textura). Em seguida as colnias predominantes foram isoladas, usando-se ala de platina devidamente esterilizada, tocando-se na colnia e transferindo-se para meio de cultivo slido e esgotando a colnia por toda a superfcie do meio. Em seguida as placas foram incubadas a uma temperatura de 32C + 1C por 48 horas e aps este perodo foi avaliado se as colnias isoladas correspondiam s originais.
2.4. Transferncias colnias isoladas para tubos As colnias isoladas foram transferidas para tubos com meio de cultivo, sendo transferidas com auxlio da ala de platina, semeadas e incubadas por aproximadamente 48 horas, a uma temperatura de 32C + 1C, em seguida aps o perodo de incubao utilizou-se leo mineral estril para conservao das culturas.
2.5. Reverso clulas formadoras de pseudomiclios Inicialmente foi transferida uma alquota da colnia estocada em leo mineral para um tubo de ensaio, utilizando-se ala de platina. O tubo foi incubado por aproximadamente 48 horas a uma temperatura de 32C + 1C. O procedimento para reverso das clulas em forma de pseudomiclios ocorreu em condies de laboratrio, fazendo-se uso de metodologia desenvolvida pela Microserv, em condies apropriadas, tais como cultivao, condies de temperatura e tempo de fermentao.
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Aps a reverso, de duas culturas obtivemos quatro, para que fossem trabalhadas comparativamente, duas a duas, lisas e rugosas.
3.0 TESTES COMPARATIVOS ENTRE LEVEDURAS DE FORMATO UNICELULAR E EM FORMA DE PSEUDOMICLIOS, VISANDO COMPARAR A PERFORMANCE DE CADA UMA NO PROCESSO FERMENTATIVO
TESTES FSICO-QUMICOS Os testes fsico-qumicos foram conduzidos utilizando-se as culturas tanto de colnias lisas como de colnias rugosas, previamente inoculadas e crescidas em meio de cultivo pr-fermentao (2% glicose) e sais minerais, autoclavado a 121C (1 atm), por 20 minutos, num tempo de crescimento de aproximadamente 24 horas. Os testes comparativos foram conduzidos a partir do mosto fermentado (pr-fermentao), sequenciando-se nos meios apropriados para cada teste, como sendo: Teor de etanol produzido (v/v); Acidez sulfrica (g/L); pH final Massa seca (g/100g); Fator de espuma (h x min); Taxa de crescimento especfico (h-1); Tolerncia ao etanol (k).
Teor de etanol produzido (v/v) O teor de etanol produzido foi detectado utilizando-se o mtodo dicromato, em comprimento de onda de 600 nm em absorbncia, utilizando espectrofotmetro Femto 600S, aps as amostras serem tratadas e microdestiladas em destilador de Kjedahl.
Acidez sulfrica (g/L) e pH Consiste em determinar a acidez (NBR 13856 - ABNT, 1997) total formada pelos cidos liberados naturalmente pelo processo fermentativo, relacionando esta ao pH final do meio. O pH (NBR 10891 ABNT, 1997) final do mosto fermentado foi analisado utilizando-se potenciometro Quimis.
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Massa seca (g/100g) Consiste num mtodo gravimtrico observado por HISS, 2001, consistindo na investigao da massa seca final obtida no processo fermentativo, cuja metodologia consiste em pesar a membrana antes e aps filtrao e secagem em estufa at evaporao total da gua. Fator de espuma (altura x tempo) Esta determinao foi implantada por POSSAS e MELO, 2001, como variao da metodologia j existente em literaturas, tendo sido implementada com a verificao do tempo em que a espuma leva para se desfazer aps ter sua formao induzida, ou seja, como uma investigao para a densidade da espuma formada, onde tanto se avalia a formao da espuma (coluna de espuma, simulando o processo fermentativo natural) como o tempo em que a mesma leva para se desfazer. A relao entre as duas grandezas fornece dados que auxiliaram na avaliao comparativa entre os dois tipos de leveduras. Taxa de crescimento especfico (h-1) Esta anlise foi realizada com objetivo de se determinar a velocidade de multiplicao da populao celular, atravs da densidade tica, proposta por HISS, 2001, obtida com auxlio de espectrofotmetro, no comprimento de onda de 600 nm em absorbncia, utilizando espectrofotmetro Femto 600S. Com os resultados obtidos foi possvel comparar qual dos tipos de leveduras possui uma maior velocidade de multiplicao.
Tolerncia ao etanol (k) Segundo NAGODAWITHANA, 1976, as clulas possuem uma determinada tolerncia ao etanol e quando expostas a altas concentraes deste, apresentam uma reduo na sua populao. Representa a capacidade do fermento em se mostrar resistente ao perodo de exposio ao etanol, simulando um processo de fermentao, onde as clulas so expostas a diferentes concentraes de etanol, verificando-se a liberao de prtons para o meio extracelular, onde, por meio da potenciometria possvel determinar qual das culturas possui uma melhor tolerncia ao etanol, os dados nos possibilitou prever os ganhos considerveis na viabilidade celular, inibio do desvio de substrato para a formao de clulas, e principalmente definir qual das culturas estudadas apresenta uma maior probabilidade de resistir ao ciclo fermentativo. Os resultados tm sido confirmados na prtica com relao viabilidade celular. 4.0 RESULTADOS E DISCUSSES
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Os dados obtidos foram suficientes para provar a suposio de que as leveduras em forma de pseudomiclios possuem desvantagens em relao a celulas soltas unicelulares, pois como demonstraremos, as mesmas possuem uma menor capacidade de converter o substrato recebido em etanol, sugerindo uma maior probabilidade de fornecer perdas no processo fermentativo devido aos residuais de acares no assimilados.
8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 USINA A - RUGOSA 5,83
7,18
8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 5,23 6,42
USINA A - LISA
USINA B - RUGOSA
USINA B - LISA
Figura 03. Teor alcolico (GL), comparativo entre fermentaes conduzidas com fermentos do tipo rugoso e liso, originrios de duas unidades industriais diferentes.
Percebe-se claramente comparando-se os dois tipos de leveduras alimentadas com o mesmo teor de acares totais. Os resultados comprovam que o tipo rugoso tem menor capacidade de converso do substrato em etanol, devido a uma menor rea de contato com o meio, pois as clulas esto em disposio aglomerada, diferentemente das unicelulares que possuem uma rea de contato muito maior com o meio. Indicando que este fato reduz significativamente o rendimento fermentativo uma vez que a no converso do substrato em etanol demanda perdas significativas, bem como diminuio da eficincia global da indstria. Os resultados apresentaram semelhana entre o comportamente dos fermentos estudados tanto da Usina A como da B, indicando ser esta caracterstica comum a todos os fermentos de aspecto rugoso.
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4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 USINA A - RUGOSA USINA A - LISA ACIDEZ pH 3,27 3,55 3,31 3,35
4,50 4,00
4,09 3,54 3,63
3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00
3,27
ACIDEZ pH
USINA B - RUGOSA
USINA B - LISA
Figura 04. Relao entre o teor de cidos totais e pH final do meio.
Percebemos que a acidez se apresentou em teores maiores quando tambm o teor alcolico foi maior. Dessa maneira observamos que na menor taxa de converso dos acares em etanol, pelas leveduras rugosas, o mosto fermentado originrio das mesmas no tiveram seu pH diminudo pela formao do etanol. Correlacionando este fato a formao do etanol, percebe-se claramente que a acidez total do meio foi diretamente proporcional ao etanol formado.
8,00 7,00 6,00 5,00 5,83
7,18 3,31
3,32 3,31 3,30 3,29 pH GL 3,28 ACIDEZ
8,00 7,00 6,00 5,00 4,09 4,00 3,00 2,00 3,27 3,63 5,23
3,54 6,42
3,60 3,55 3,50 3,45 3,40 3,35 3,30 3,25 3,20 pH GL ACIDEZ
4,00 3,00 2,00 1,00 0,00
3,55 3,27
3,35
3,27 3,26 3,25 USINA A - RUGOSA USINA A - LISA
1,00 0,00 USINA B - RUGOSA USINA B - LISA
3,15 3,10
Figura 05. Relao entre o teor alcolico, teor de cidos totais e pH final do meio. Observamos que o etanol formado influenciou na acidificao final.
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USINA A - RUGOSA
y = 0,4248x + 3,6524 R2 = 0,8751
USINA A - LISA
y = 0,4962x + 3,4998 R2 = 0,8724
4,00 3,90 3,80 3,70 3,60 3,50 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80
3,90 3,80 3,70 3,60 3,50 3,40 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80
USINA B - RUGOSA
y = 0,5514x + 3,739 R2 = 0,9776
USINA B - LISA y = 0,6229x + 3,6931 R2 = 0,9361 4,30 4,20 4,10 4,00 3,90 3,80 3,70 3,60 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80
4,20 4,10 4,00 3,90 3,80 3,70 3,60 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80
Figura 06. Determinao comparativa da tolerncia ao etanol das cepas de duas unidades industriais diferentes.
Os dados comprovaram que o tipo que se apresenta com pseudomiclios possue maior capacidade de tolerar o etanol formado, portanto se aglomeram em cachos a fim de se autoproteger, evitando a exposio das clulas-filhas aos fatores adversos. Este fato percebido no resultado da equao da reta do tipo y = ax+b, onde o valor da tolerncia ao etanol o valor de a. Quanto maior o valor de a menor ser a tolerncia ao etanol. Esta capacidade de formar cachos tambm est relacionada a temperatura a que so submetidas nas dornas de fermentao, onde tendem a se aglomerar com o mesmo objetivo. Esta caracterstica transmitida de me para filha, tornando esta caracterstica um fator natural de defesa.
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1,0000 0,9000 0,8000 0,7000 0,6000 0,5000 0,4000 0,3000 0,2000 0,1000 0,0000 1 0,8569
0,9651
1,0000 0,9000 0,8000 0,7000 USINA A RUGOSA USINA A LISA 0,6000 0,5000 0,4000 0,3000 0,2000 0,1000 0,0000 1 0,4044 0,4970 USINA B RUGOSA USINA B LISA
Figura 07. Obteno do rendimento de massa seca (g/100g) comparando-se as mesmas pores do inculo original e a capacidade de multiplicao celular frente as mesmas condies de incubao.
Verifica-se tambm que a capacidade de formar massa bem inferior no fermento do tipo rugoso em comparao com o liso, sugerindo uma populao inferior tambm. Na prtica, observa-se uma maior diminuio na viabilidade celular nas clulas unicelulares, pois estas ainda no desenvolveram mecanismos de defesa, logo quando este mecanismo ativado, percebe-se a mudana na morfologia de unicelular para pseudomiclios, sendo esta forma mais resistente a estresses e, portanto apresenta teores de viabilidade maiores.
0,700
USINA A Rugo sa (%A )
0,600
USINA B Rugo sa (%A )
0,600
USINA A Lisa (%A )
0,500
USINA B Lisa (%A)
0,500
P olin mio (USINA A Rugosa (%A ))
0,400
0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

P olin mio (USINA A Lisa (%A ))
P olin mio (USINA B Rugosa (%A ))
0,300
P olin mio (USINA B Lisa (%A ))
0,200
0,100
0,000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Figura 08. Determinao da taxa de crecimento ( mximo) das leveduras rugosas e lisas.
Da mesma forma, pudemos constatar que a velocidade de multiplicao do fermento tipo rugoso mais lenta que o liso, onde a explicao para este fato est justamente na condio de inibio
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das clulas que no conseguem transmitir s filhas a informao de que o meio externo apresenta ou no algum fator estressante, sendo assim, as clulas no conseguem se separar nem promover o brotamento.
45,00 40,00 35,00 30,02 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 USINA A - RUGOSA USINA A - LISA 8,56
45,00 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 USINA B - RUGOSA USINA B - LISA 10,86 39,03
Figura 09. Determinao do fator de espuma produzida.
As anlises para determinao do fator de espuma demonstraram que o tipo rugoso apresenta nveis de formao de espuma muito superiores aos do tipo liso. Esta caracterstica deve-se provavelmente aos produtos liberados pela fermentao retrtil da rugosa, onde, provavelmente so expelidos em maior quantidade pelas clulas substncias que agregam uma condio que aumenta a tenso superficial das bolhas formadas, impedindo assim a sua ruptura. Esta condio se apresenta altamente indesejvel na fermentao industrial pois verifica-se um consumo muito alto de produtos para diminuir a tenso superficial, os chamados anti-espumantes.
5.0 CONCLUSES As clulas de leveduras aos cachos so oriundas de clulas isoladas, que em condies de estresse se tornam assim, principalmente temperatura de fermentao acima de 34oC. As clulas de colnias de leveduras de aspecto rugoso podem ser revertidas em colnias de leveduras de aspecto liso no laboratrio sob condies especiais; O teor alcolico das leveduras aos cachos revertidas em soltas maior do que a original rugosa, portanto tem uma melhor Efcincia de Fermentao. de se esperar, ento, que a unidade industrial que estiver trabalhando com leveduras soltas vai influenciar na melhoria da Eficiencia de Recuperao em ART ;
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A massa seca das leveduras aos cachos revertidas em soltas maior do que a original rugosa. Portanto as leveduras soltas com menos sacarose produz mais massa celular. Isto bom para o processo fermentativo, pois no desvia tanta sacarose para a produo de biomassa; O taxa de multiplicao das leveduras aos cachos revertidas em soltas maior do que a do original rugoso significando que no processo o fermento com leveduras soltas mais rpido do que o de leveduras aos cachos. O fator de espuma das leveduras aos cachos revertidas em soltas menor do que a original aos cachos. Portanto, quando a temperatura na fermentao acima de 34oC e a levedura forma pseudomiclios se gasta bem mais antiespumante e dispersante na fermentao.
6.0 Referncias bibliogrficas
GRIFFITHS, A. J., A numericlature of the Yeasts. Antonie van Leewenhoek 47: 5437-563. 1981. SALIK, F. L. M. e POVH, N. P., Mtodo espectrofotomtrico para a determinao de teores alcolicos em misturas hidroalcolicas.Universidade Estadual de Maring, PR, 1990, 262-266p. ASSOCIAO BRASILEIRA DE NORMAS TCNICAS - ABNT. NBR 13856: acidez titulvel total, voltil total e fixa. So Paulo: ABNT, 1997. ASSOCIAO BRASILEIRA DE NORMAS TCNICAS - ABNT. NBR 10891: Potencial hidrogeninico: So Paulo: ABNT, 1997. HISS, H. Cintica de Processos fermentativos. In: SCMIDELL, W. (Coord.); LIMA, U.A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. Biotecnologia Industrial: Engenharia Bioqumica. So Paulo: Edgard Blcher, 2001. v. 2. p. 93-122. POSSAS, T. C. V., MELO, E. M. G., Determinao fator de espuma, ensaio, 2002. NAGODAWITHANA, T.W.; STEINKRAUS,K.H. Influence of the rate of ethanol production and accumulation on the viability of Saccharomyces cerevisiae in rapid fermentation., Applied Environmental Microbiology, v. 31, p. 158-162, 1976 apud
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FERREIRA, L.V. Estudo da fermentao alcolica em frascos agitados. Campinas: Universidade Estadual de Campinas, 2002, 266 p.

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4,09 3,54 3,63

3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00

Figura 04. Relao entre o teor de cidos totais e pH final do meio.

8,00 7,00 6,00 5,00 5,83

3,32 3,31 3,30 3,29 pH GL 3,28 ACIDEZ

4,00 3,00 2,00 1,00 0,00

3,27 3,26 3,25 USINA A - RUGOSA USINA A - LISA

1,00 0,00 USINA B - RUGOSA USINA B - LISA

y = 0,4248x + 3,6524 R2 = 0,8751

y = 0,4962x + 3,4998 R2 = 0,8724

y = 0,5514x + 3,739 R2 = 0,9776

USINA B Rugo sa (%A )

USINA B Lisa (%A)

0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

P olin mio (USINA B Rugosa (%A ))

P olin mio (USINA B Lisa (%A ))

Figura 09. Determinao do fator de espuma produzida.

6.0 Referncias bibliogrficas

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