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BIOENSAIOS DE TOXICIDADE AGUDA COM SEMENTES DE ALFACE (Lactuca sativa L.

) Princpio: As substncias txicas podem afetar o desenvolvimento normal das plantas, principalmente nas suas etapas iniciais como germinao e desenvolvimento de razes. Ao observar e medir o comprimento de razes jovens e comparar estas medidas com um controle, ser avaliado a presena de compostos qumicos txicos no ambiente. O ensaio pode ser aplicado na avaliao de toxicidade de guas superficiais (lagos e rios) guas potveis, residurias, lixiviados de solo, sedimentos e outras amostras slidas. O coeficiente de variao normalmente alto neste teste, necessitando de um grande nmero de amostras para ser validado. Materiais: Placas de Petri de plstico de 100x15 mm Discos de papel de filtro Whatman N0 3, ou equivalente, 90 cm dimetro gua Dura ou Mineral sem gs Sementes de alface ou outra semente pequena Proveta de 100 ml Pipetas Palitos ou pinas Rgua ou papel milimetrado Frascos para as diluies Amostra a ser testada Procedimento: Preparo das diluies: Para realizar a curva de dose resposta, se recomenda preparar um mnimo de 4 a 5 diluies da amostra a ser analisada, de maneira tal a obter valores intermedirios de toxicidade entre 100 a 0%. Para as amostras ambientais se recomenda o uso do fator de diluio de 0,3 a 0,5. O uso do fator 0,3 permite avaliar a toxicidade em intervalos entre 100 a 1% e 0,5% entre 100, 30, 10, 3 e 1%. Ao aplicar o fator 0,5 necessrio utilizar maior nmero de diluies para abranger o mesmo intervalo de concentraes (100, 75, 50 e 25), entretanto se obtm maior preciso dos resultados. Para fazer as diluies se utiliza gua dura ou mineral. O controle negativo realizado com gua dura ou mineral (com a gua de diluio empregada). Com a finalidade de testar a sensibilidade da semente utilizada, simultaneamente ao teste da toxicidade da amostra, deve ser realizado um controle positivo, utilizando um txico referencia. Para o caso de amostras desconhecidas (por exemplo: ambientais), antes de realizar o experimento, recomenda-se fazer um teste preliminar utilizando doses em escala logartmicas (100, 10, 1, 0,1 e 0,01%) que permitam estabelecer intervalo conveniente para obter valores de efeito entre 100, 50 e 0% necessrios para calcular o CE50 ou CI50. Protocolo: Colocar em cada placa de Petri um papel de filtro. Etiquetar cada placa com a diluio e amostra correspondente, autor e data de incio e termino do experimento. Saturar o papel de filtro com 4 ml das amostras a serem estudadas, evitando bolhas de ar, com a pina ou palito colocar cada semente no lugar. Cada placa deve conter 20 sementes, que sero repeties. Fechar as placas, passar filme plstico para no ocorrer perda de umidade. Cobrir com papel escuro e incubar por 120 h ou 5 dias a temperatura de 22 0C. Terminado o tempo de exposio, medir cuidadosamente o comprimento da raiz de cada uma das plntulas, correspondente a cada concentrao e controles positivo e negativo. Quantificar o nmero de sementes que no germinaram e porcentagem de variao do crescimento da raiz. Colocar em um grfico dose-resposta, onde na ordenada coloca-se a porcentagem de inibio e na abcissa a concentrao. Calcular a concentrao que produz 50% de inibio CE/CI50 para cada "end point".

Formulas: Comprimento mdio = comprimento total/N0 de sementes germinadas Porcentagem de variao da germinao = N0 de sementes germinadas da amostra - N0 de sementes germinadas do controle normal * 100 / N0 de sementes germinadas do controle normal Porcentagem de variao do crescimento da raiz = comprimento mdio das amostras - comprimento mdio normal (controle negativo) * 100/ comprimento mdio do controle normal Bioensaio com semente
compr.da raiz Controle Normal Controle Negativo Amostra 100% Amostra 75% Amostra 50% Amostras 25%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
comprimento total N0 germinadas comprimento mdio % variao crescimento % variao germinao
Referncias Dutka, B. 1989 Short-term root elongation toxicity bioassay. Methods for toxicological analysis of waters, wastewaters and sediments. National water research institute (NWRI), Environment Canada. Greene, J.C. et al. 1988. Protocols for short term toxicity screening of hazardous waste sites. U.S. EPA 600/3-88/029. Corvallis. OR. Santos, M.A.P.F., Vicensotti, J. E Monteiro, R.T.R. Sensitivity of four test organisms (Chironomus xanthus, Daphnia magna, Hydra attenuata and Pseudokirchneriella subcapitata) to Na Cl: an alternative reference toxicant. JBSE v. 2, n.3, p. 229-236: Wang, W. 1987. Root elongation method for toxicity testing of organic and inorganic pollutants. Environmental Toxicology &Chemistry, v.6,p.409-414, 1987.