FUNDAMENTOS DE ENZIMOLOGA

SEGUNDA EDICIN

FUNDAMENTOS DE ENZIMOLOGA

IVN PAZ ALIAGA

Profesor de Enzimologa y Bioqumica de la Facultad de Ciencias Farmacuticas, Bioqumicas y Biotecnolgicas de la Universidad Catlica Santa Mara

AREQUIPA 2009
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NDICE

PRLOGO A LA SEGUNDA EDICIN...............................8 INTRODUCCIN...................................................................10 CAPITULO I Historia.................................................................................11 Aplicaciones en la industria.................................................14 Caractersticas......................................................................15 Terminologa........................................................................18 CAPTULO II NOMENCLATURA ENZIMTICA........................................25 Clases de enzimas................................................................25 Nombre sistmico de las enzimas........................................30 CAPTULO III CINTICA ENZIMTICA.......................................................32 Velocidad inicial..................................................................32 Modos de expresar la actividad enzimtica.........................33 Cintica de las reacciones enzimticas................................34 Ecuacin de Michaelis-Menten...........................................35 Importancia de la KM...........................................................39 Mtodos experimentales de parmetros cinticos...............39 CAPTULO IV REACCIONES ENZIMTICAS MULTISUSTRATO............44 Procedimientos para deducir las ecuaciones de velocidad de reacciones bisustrato............................................................44 Mecanismos cinticos bisustrato.........................................45 Ecuaciones para las reacciones bisustrato...........................47 CAPTULO V ESTRATEGIAS CATALTICAS.............................................53 Tipos de estrategias catalticas.............................................53 5

Mecanismo cataltico de las proteasas.................................54 Mecanismo cataltico de anhidrasa carbnica.....................61 Mecanismo cataltico de enzimas de restriccin..................64 Mecanismo cataltico de nuclesido monofosfato quinasas 69 Mecanismo cataltico de lisozima........................................72 CAPTULO VI FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE UNA ENZIMA ...................................................................................................80 Efecto del pH.......................................................................80 Determinacin de los pKs de los grupos ionizables de una enzima .............................................................................................85 Seleccin de buffers para estudios de pH............................87 Efecto de la temperatura......................................................88 Ecuacin de Arrhenius.........................................................90 CAPTULO VII INHIBICIN ENZIMTICA...................................................92 Tipos de inhibicin reversible..............................................92 Inhibicin por exceso de sustrato.........................................97 Inhibicin por producto en reacciones bisustrato................98 CAPTULO VIII REGULACIN ENZIMTICA..............................................100 Regulacin covalente.........................................................101 Regulacin no covalente o alostrica.................................104 Caractersticas de las enzimas alostricas..........................105 CAPTULO IX PURIFICACIN DE ENZIMAS............................................108 Introduccin.......................................................................108 Precauciones en el trabajo con enzimas.............................108 Etapas generales de un proceso de purificacin................109 Preparacin del extracto.....................................................112 Ruptura celular...................................................................113 Tcnicas de purificacin por precipitacin........................116 Tcnicas cromatogrficas..................................................124 Mtodos auxiliares de purificacin....................................135 Concentracin...........................................................135 Eliminacin de sales.................................................136 Mtodos para determinar protena............................137

CAPTULO X PRODUCCIN DE ENZIMAS MICROBIANAS.................139 El Microorganismo............................................................139 Hacia que apuntan las investigaciones actuales.................140 Mecanismos de biosntesis.................................................141 Enzimas inducibles...................................................141 Mecanismos de represin..........................................141 Mejoramiento gentico.............................................142 Medida de la actividad enzimtica durante la produccin.143
Caractersticas de los procesos de fermentacin en la produccin de enzimas microbianas.................................................................144

El cultivo semislido y el cultivo sumergido............144 Temperatura y pH..............................................................145 El medio de cultivo............................................................146 Recuperacin de la enzima................................................149 Extraccin.................................................................150 Ruptura celular..........................................................150 Separacin de slidos................................................151 Precipitacin, extracciones y cromatografas...........151 Secuencia de operaciones.........................................152 Estabilizacin, secado y formulacin.......................152 Costos........................................................................153 CAPTULO XI INMOVILIZACIN DE ENZIMAS.......................................154 Introduccin.......................................................................154 Aspectos generales sobre inmovilizacin................................ Mtodos de inmovilizacin por retencin fsica...................... Mtodos de inmovilizacin por unin qumica....................... Efectos de la inmovilizacin.................................................... Inmovilizacin de cofactores................................................... Eleccin del mtodo de inmovilizacin................................... BIBLIOGRAFA

Prlogo de la segunda edicin

El autor se complace en presentar esta segunda edicin del texto de Enzimologa, la cual corrige algunos errores fundamentalmente de redaccin de la primera edicin, as como informacin que ha cambiado en su interpretacin, e incluye adems nuevos temas dado el acelerado avance de esta ciencia en los ltimos aos. Los nuevos temas adjuntos son sobre estrategias catalticas de algunas enzimas: endonucleasas de restriccin, anhidrasa carbnica y nuclesido monofosfato quinasas cuyos mecanismos estn siendo entendidos ltimamente. Se extiende un poco la informacin sobre el mecanismo de las enzimas regulatorias, tanto las de modulacin covalente como las enzimas alostricas y se incluye ntegramente un nuevo captulo, la Inmovilizacin de enzimas, metodologa que est desarrollando nuevas propuestas. Esta segunda edicin mejora adems la redaccin de algunos captulos para hacerlos ms accesibles a nuestros estudiantes del tercer ao de la carrera de Ingeniera biotecnolgica y estoy convencido seguir siendo de gran ayuda como texto de consulta para reforzar los conocimientos que se brindan en las clases tericas y prcticas. Se ha incluido un poco ms de color en algunas figuras y se ha mejorado otras, solo con la intencin de que el alumno interprete mejor los conceptos que va aprendiendo. El texto a pesar del avance cientfico, mantiene algunos conceptos clsicos de la enzimologa para que el alumno vea como el desarrollo de nuevas tecnologas redundan definitivamente en el desarrollo de esta ciencia y pueda darse cuenta de hasta que punto nuestra tecnologa actual de pas subdesarrollado, nos permite involucrarnos con la tecnologa tan desarrollada de pases del primer mundo. El siglo XXI est mostrando la nueva revolucin biotecnolgica, la terminacin de la etapa genoma a dado lugar a que las protenas tomen nuevamente protagonismo y con ello las enzimas las que diramos son el 8

grupo de protenas mas verstiles en cuanto a su funcin. Por esta razn, sigue siendo para nosotros la comercializacin de las enzimas una gran oportunidad de desarrollo para nuestra regin, no solo al venderlas sino tambin al comprarlas ya que cada vez son ms las industrias que se enteran de sus grandes propiedades y hacen uso de ellas. Es la gran diversidad de organismos que tiene nuestra Regin, sobre todo hongos microscpicos y bacterias, la que nos permite contar con la materia prima suficiente para producirlas, es pues el momento de iniciar este gran proyecto que en definitiva cambiara la condicin econmica de nuestros poblacin. El autor, que est por cumplir 25 aos como profesor de Bioqumica y Enzimologa en las Universidades Catlica de Santa Mara y San Agustn, ambas de la ciudad de Arequipa, espera nuevamente no defraudar a sus estudiantes con este nuevo texto y por supuesto est presto a recibir sugerencias y crticas para mejorarlo en su tercera edicin.

Arequipa, 27 de setiembre del 2009

El Autor

INTRODUCCIN

La Enzimologa es la ciencia que se encarga del estudio de las enzimas, catalizadores biolgicos cuyo uso por las diferentes industrias manufactureras en los ltimos aos, se ha incrementado notablemente, esto se debe fundamentalmente a la alta eficiencia y alta especificidad que muestran respecto a otros catalizadores; a que trabajan en condiciones moderadas de pH, temperatura y presin; asimismo, a que durante su accin no forman subproductos, por lo cual pueden trabajar varias veces. Actualmente, con el desarrollo de la Ingeniera Gentica, estas molculas pueden hacerse ms estables a los factores ambientales, introduciendo por ejemplo a sus genes que las codifican, varios tripletes correspondientes al aminocido cistena para que al sintetizarse la enzima, estos aminocidos entablen entre si puentes disulfuro que estabilicen mejor su estructura, aumentando notablemente su vida media.

Con la culminacin del proyecto genoma y el desarrollo de la protemica, las enzimas, que son protenas, han adquirido nuevamente protagonismo y el inters por las mismas se hace cada vez mayor porque en definitiva, las industrias que hacen uso de ellas, obtienen productos mucho mejores que con tcnicas convencionales.

Inicialmente la Enzimologa nace como una ciencia que formaba parte de la Bioqumica, en el momento esta se ha independizado y seguramente que muchos de sus captulos se constituirn con el pasar de los aos en nuevas ciencias. La Bioqumica, la Biologa molecular y la Biotecnologa han utilizado a esta ciencia como una herramienta fundamental para su desarrollo en los ltimos aos.

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Ivn Paz Aliaga

CAPTULO I

CONTENIDO
Historia Algunas aplicaciones enzimticas en la industria: historia Caractersticas de las enzimas Terminologa

HISTORIA El primer dato histrico que se tiene sobre el uso de las enzimas aparece en el libro del Gnesis, la historia narra que No logr la fermentacin de la uva; adems del vino por esa poca, se elaboraba tambin vinagre, bebidas alcohlicas como la cerveza y se acidificaba la leche. A comienzos del siglo XVIII la digestin de los alimentos fue considerada por primera vez como una transformacin qumica y a finales del mismo, los catalizadores biolgicos fueron reconocidos y descritos por primera vez, en estudios sobre la digestin de la carne por secreciones del estmago. Son importantes en esta poca REAMUR en 1713 y SPALLANZANI en 1783, quienes realizaron muchos experimentos con animales domsticos con el afn de entender este proceso. Sus experimentos consistan desde abrir el tracto digestivo de los animales cuando estaban en plena digestin, hasta la introduccin por va oral de alimento envuelto en mallas metlicas, sujetas a una cuerda que les permita recuperarlas luego de la digestin y as observar lo ocurrido.

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En 1787 aparece el nombre de FABRONI quien define las fermentaciones como la descomposicin de una sustancia por otra calificada como fermento; muchos aos pasaron sin tener referencias histricas hasta el ao de 1833 en que A. PAYEN y J. E. PERZOS, observaron que un extracto de granos de centeno en germinacin era susceptible de transformar el almidn en glucosa; concentraron el principio activo del extracto y obtuvieron un polvo blanco al que llamaron diastasa, sustancia termolbil y que actuando a concentraciones muy pequeas transformaba gran cantidad de almidn. En 1836 SCHAWANN y EBERLE extrajeron la pepsina del jugo gstrico; dos aos despus, en 1838 BERZELIUS profetiz que en las plantas y animales tenan lugar millares de procesos catalticos entre los tejidos y fluidos, dando lugar a multitud de compuestos qumicos; el mismo introdujo por primera vez el trmino catlisis y llam catalizadores a aquellas sustancias capaces de aumentar la velocidad de una reaccin; la palabra catlisis proviene del griego kata (hacia abajo) y lisis (ruptura). En 1850 WILHELMY demostr que la velocidad de hidrlisis cida de la sacarosa era proporcional a la concentracin del azcar a una concentracin constante de cido, esto demostraba que la reaccin era de primer orden respecto a la sacarosa. Tuvieron que pasar 52 aos hasta que por fin en 1902 BROWN demostr que a concentraciones bajas de sacarosa la reaccin es de primer orden respecto al sustrato y que a concentraciones mayores se convierte en cintica de orden cero. Algunos aos despus, en la misma dcada de 1850 Louis PASTEUR concluy que la fermentacin del azcar a alcohol por la levadura estaba catalizada por fermentos; postulo que tales fermentos son inseparables de las clulas de levadura vivas, punto de vista denominado vitalismo que prevaleci por muchos aos, dado el respeto que le tenan a Pasteur por ese entonces. Algunos aos despus, debido a los resultados experimentales encontrados por varios investigadores, Pasteur tuvo que instituir una discriminacin entre fermentos solubles como las diastasas y fermentos figurados donde se consideraban a las levaduras. En 1876 Friedrich Wilhelm KHNE, profesor de fisiologa de la Universidad de Heilderberg, present una comunicacin a la Sociedad de Historia Natural y Medicina sobre los fermentos en donde acua por primera vez el trmino alemn enzime, palabra griega que significa en la levadura, para designar a aquellas sustancias catalizadoras de 2

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origen biolgico. En 1878 el propio Kuhne sugiri que el trmino enzima sea utilizado para designar a todos los fermentos, los figurados y no figurados. Otro renombrado cientfico de aquella poca, HOPPESEYLER critic este nuevo trmino indicando que este es uno de los tantos trminos acuados por Khne de los que nadie se acordara, lo cierto es que seis aos mas tarde el trmino Enzimologa, derivado de enzima, como ciencia que estudia a las enzimas, apareci en el ttulo de una monografa escrita por MAYER en 1882 en la misma Universidad. En 1897 Eduard BUCHNER descubre que los extractos de levadura pueden fermentar el azcar a alcohol y CO2 demostrando que la fermentacin era debida a molculas que continan funcionando cuando se separan de las clulas, con esto se sentaron las bases de la Enzimologa moderna. As se llega a finales del siglo XIX y hasta entonces se haban caracterizado alrededor de una decena de enzimas, casi todas hidrolticas y obtenidas de secreciones digestivas: tripsina, lipasa, renina, diastasa y pepsina u obtenidas de semillas vegetales: emulsina, mirosina, invertina y ureasa. La pregunta que faltaba resolver era Cul es la naturaleza qumica de las enzimas?; HARDEN y YOUNG descubrieron en 1906 que cuando se dializa un extracto de levadura capaz de efectuar fermentacin, sta no tena lugar; pareca pues que ni las macromolculas no filtrables (que ya se pensaba eran de naturaleza proteica) ni las molculas pequeas filtrables que acompaaban a aquellas (hoy conocidas como coenzimas), eran por si solas capaces de efectuar la catlisis. WILLSTTTER propuso que todas las enzimas estaban integradas por un grupo activo, el componente dializable de bajo peso molecular y un soporte coloidal, mas o menos inerte, para facilitar el contacto entre el sustrato y el grupo activo; por esta razn, muchos autores crean que eran fundamentalmente los coenzimas los encargados de realizar la catlisis. En 1926 James SUMNER cristaliza la primera enzima, la ureasa a partir de frijol de soya, l mismo demostr que se trataba qumicamente de protena pura, proponiendo que todas las enzimas son protenas; la falta de trabajos de cristalizacin de otras enzimas determin que la idea fuera motivo de controversia durante algn tiempo, hasta que por fin en la dcada de 1930 John NORTHROP y Moses KUNITZ cristalizaron a la pepsina, la tripsina y otras enzimas digestivas as como a la ribonucleasa y la lisozima, y descubrieron que tambin eran protenas. 3

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Mientras tanto los estudios referentes al comportamiento cintico de las enzimas empezaron a dar frutos con Victor HENRI el ao de 1903 quien propuso sobre la existencia de una relacin hiperblica entre la velocidad de reaccin y la concentracin de sustrato, debido a que la enzima con el sustrato se unen para formar un complejo ES necesario para la catlisis. Esta idea fue ampliada por Leonor MICHAELIS y Maud MENTEN en 1913 indicando que la enzima se combina en primer lugar en forma reversible con su sustrato, formando el complejo ES relativamente rpido; seguidamente el complejo se descompone en un segundo paso mas lento, dando lugar al producto y a la enzima libre. En 1925 G. E. BRIGGS y HALDANE presentan el concepto de estado estacionario. En el ao de 1957, F. SANGER empieza a secuenciar varias enzimas debido a que en la dcada de 1950 desarrollaron notablemente las tcnicas de aislamiento y purificacin de enzimas; gracias a esto es que ya se pudo determinar la estructura y las propiedades de estas macromolculas y aos despus, en 1965, se publica el mecanismo de accin de la lisozima. En el ao de 1981, Thomas CECH de la Universidad de Colorado descubri un RNA con capacidad cataltica, estudiando las condiciones mnimas para el autoprocesamiento del rRNA, trabajo que se public en la Revista Science; a estos nuevos catalizadores se los conoce actualmente como Ribozimas. Asimismo, de acuerdo a lo sugerido por Linus PAULING en 1948 quien deca que las enzimas son molculas complementarias al estado de transicin de los sustratos, los investigadores de la dcada de 1980 empezaron a producir anticuerpos monoclonales frente a haptenos, anlogos estructurales al estado de transicin de algunos sustratos; estos anticuerpos que tienen propiedades catalticas reciben el nombre de Abzimas y muestran una especificidad por el sustrato an mayor que las enzimas. Las Abzimas y las Ribozimas han ampliado el paradigma de la Enzimologa.

ALGUNAS APLICACIONES INDUSTRIA: HISTORIA

ENZIMATICAS

EN

LA

La aplicacin de la Ingeniera Enzimtica se inicia en el siglo XIX con TAKAMINE, quien patent las amilasas (diastasas) producidas por hongos en fermentacin slida. 4

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HANSEN en 1875 inici una empresa para la extraccin de renina a partir de tracto digestivo de ternera. TAKAMINE se instala en 1890 en EEUU para producir la Takadiastasa, una mezcla de proteasas y amilasas de Aspergillus oryzae. Para 1925 ya se empleaba gran nmero de enzimas de origen animal y vegetal en diferentes industrias, habindose otorgado una patente a WALLERSTEIN para el uso de papana en la clarificacin en fro de la cerveza y a ROHM en 1913 para el uso de tripsina en detergentes. En Francia en el mismo ao, BOIDIN y EFFRONT desarrollaron la produccin de amilasas de Bacillus subtilis para ser usadas en la industria textil. El uso de pectinasas en la industria frutcola se inicia lentamente en 1930, aunque recin en 1955 se hace el primer escalamiento de un proceso de produccin de enzimas por fermentacin, la glucoamilasa. Durante la dcada de los 60, las enzimas provenientes de plantas o tejidos animales eran econmicamente de mayor importancia que las microbianas, hasta 1965 las ventas de la empresa NOVO (la mas importante en el sector), no pasaban del milln de dlares al ao. Despus de 1965, surge el explosivo desarrollo de las enzimas proteolticas de origen bacteriano, empleadas en la elaboracin de detergentes; para el ao de1969, las ventas de NOVO en enzimas, sobrepasaban los 50 millones de dlares. En la dcada de los 70, se aplicaron las tcnicas de produccin, recuperacin, purificacin y formulacin desarrolladas hasta ese entonces, a otras enzimas de inters industrial. La produccin de enzimas en ese entonces era muy variable, por ejemplo la proteasa bacteriana se produca en fermentadores hasta de 450m3, mientras que las enzimas intracelulares se producan en fermentadores cuyo volumen vara entre 3 y 30m3. Hasta 1988 los fermentadores para la produccin de anticuerpos monoclonales no excedan de los 2000 litros. La produccin de una sola enzima por una empresa justificara de lejos la produccin y por supuesto la ganancia, pero la realidad es que actualmente no existen compaas dedicadas a la produccin de una sola enzima. 5

Enzimologa CARACTERSTICAS DE LAS ENZIMAS

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1. Las enzimas son protenas, estas macromolculas han sido seleccionadas para tal fin debido a su complejidad estructural, permitiendo se pueda cumplir eficientemente con la especificidad que se requiere para catalizar las miles de reacciones distintas que suceden en los organismos vivos. Actualmente se sabe que algunas molculas de RNA tienen tambin funcin cataltica, principalmente autocataltica; estas molculas son conocidas ahora como Ribozimas. Las ribozimas mejor conocidas son los intrones, cuya funcin es el autoprocesamiento del RNA transcrito (mRNA) y la subunidad de RNA de la ribonucleasa P de Escherichia coli, enzima cuya accin cataltica reside en la subunidad compuesta por RNA; la funcin de esta enzima es procesar el extremo 5 de los tRNAs. Estas enzimas tan particulares, comparten muchas caractersticas con las enzimas convencionales: especificidad de sustrato, especificidad de accin, cintica de saturacin hiperblica, estructura tridimensional, requieren de iones metlicos (Mg 2+), no forman subproductos, pueden ser inhibidas y catalizan un amplio repertorio de reacciones qumicas; pero a diferencia de las protenas, no son molculas con la suficiente diversidad estructural que les permita encargarse de todas o casi todas las reacciones metablicas. Actualmente el estudio de las Ribozimas es una materia separada de la Enzimologa y no vamos agregar mas sobre ellas en nuestro curso, tan solo para finalizar diremos que las podemos considerar como fsiles moleculares. 2. Son molculas altamente especficas es decir, para cada reaccin que se realice en una clula, debe existir all una enzima determinada que la catalice, si esta ltima no est presente, entonces no se llevar a cabo la reaccin; esto nos indica que las enzimas tambin cumplen un rol muy importante en la regulacin del metabolismo. La especificidad puede ser considerada desde dos puntos de vista: a. Especificidad de accin: las enzimas son especficas para determinada actividad cataltica; as por ejemplo la hexoquinasa tiene como sustrato a la glucosa, pero su accin sobre la misma es fosforilarla, en tanto que la glucosa oxidasa, enzima que tambin tiene como sustrato a la glucosa, la oxida. 6

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b. Especificidad de sustrato: Las enzimas son especficas para el sustrato de la reaccin que catalizan, debiendo tener por tanto la capacidad de reconocerlo; muchas veces este reconocimiento es tan fino que inclusive puede diferenciar entre un ismero L de un D (estereoespecificidad), esto se debe a que la unin del sustrato con la enzima es a travs de varios puntos, 3 por lo menos; por ejemplo la mayora de enzimas que actan en el metabolismo de los aminocidos slo pueden procesar a los ismeros de tipo L. Como toda regla tiene sus excepciones, existen enzimas que pueden procesar a mas de un sustrato, la xantino deshidrogenasa por ejemplo tiene dos sustratos naturales, la xantina y la hipoxantina e incluso puede oxidar a sustratos artificiales como el aldehido frmico, mostrando especificidad de accin mas no de sustrato. Las endopeptidasas de la digestin pepsina, tripsina y quimotripsina, muestran especificidad sobre determinados enlaces peptdicos, mientras que la subtilisina, proteasa de Bacillus subtilis, puede hidrolizar cualquier enlace proteico. 3. Las enzimas no modifican la constante de equilibrio (Keq) de las reacciones que catalizan, tan solo permiten alcanzar el equilibrio en un tiempo mas corto; esto se debe a que el catalizador a pesar de que participa en la reaccin, no participa en el balance energtico de la misma, es decir, en los estados iniciales y finales; por lo tanto, no modifica la Energa libre (delta G) de la reaccin, que al ser una funcin de estado no depende del camino. La enzima al no modificar la Energa libre de la reaccin en condiciones estandar, consecuentemente no modificar la constante de equilibrio. Como el catalizador disminuye la Energa de activacin de las reacciones, stas se hacen ms rpidas, determinando un aumento en la constante de velocidad (k1); si tenemos en cuenta que en una reaccin ocurre:

S=

K2

K1

y que

K eq =

[ P] = { S}

k1 k2

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el que aumente k1 por accin de la enzima, implica que la misma enzima debe aumentar tambin k2 para que no vare la constante de equilibrio. 4. Las enzimas son altamente eficientes, podemos decir que aumentan la velocidad de las reacciones entre 108 a 1012 veces. Si comparamos el tiempo en el que ocurre la transformacin siguiente: H2O + CO2

CO3 H2

Sin catalizador: aproximadamente 6 horas Con catalizador qumico como el platino coloidal: cerca de una hora Con anhidrasa carbnica, la enzima propia de esta reaccin: 0,1 segundos podemos darnos cuenta de esta eficiencia. 5. Trabajan en condiciones moderadas temperatura y presin, compatibles con la vida. de pH,

6. Las enzimas, a pesar que durante un proceso cataltico pasan por una serie de formas de transicin intermediarias, salen de las reacciones tal como ingresaron, es decir, no forman subproductos, esto permite que sean tiles varias veces; asimismo, en un proceso industrial (por ejemplo al utilizar un reactor enzimtico tipo batch), esto facilita la purificacin del producto, ya que hay menos contaminantes y los residuos enzimticos por ser de naturaleza macromolecular, pueden ser eliminados por mtodos sencillos. 7. Las enzimas deben su excelente capacidad cataltica a que disminuyen fuertemente la Energa de activacin (Ea) de las reacciones que catalizan, por ejemplo la catalasa disminuye la Ea necesaria para descomponer el H2O2 desde 18 Kcal/mol hasta el valor de 1; asimismo, si comparamos la capacidad cataltica del pH cido vs la actividad de invertasa para hidrolizar a la sacarosa, esta es grande, el pH baja la Ea hasta el valor de 25 Kcal/mol en tanto que la enzima baja Ea hasta 7. El perfil de energa libre de cualquier reaccin qumica se representa en la figura 1.

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Figura 1.1: Perfil energtico de una reaccin catalizada por una enzima (lnea discontinua) y una reaccin no catalizada (lnea continua); Ea corresponde a la Energa de activacin y se define como la energa que se debe suministrar a un mol de molculas de reactante para que alcancen un estado energtico de transicin tal, que les permita transformarse en su producto correspondiente. Para que cualquier reaccin qumica ocurra, necesariamente se debe vencer esa barrera energtica (Ea); esto se puede conseguir, aumentando la temperatura, la presin o aumentando varias veces la concentracin del reactante por ejemplo; pero como esto no se puede hacer dentro de la clula, es que es imprescindible la presencia de la enzima para que ocurra la reaccin, vencer esa menor Energa de activacin es mucho mas fcil, bastara con un pequeo aumento en la concentracin del reactante, tal como ocurre en la realidad. Para una reaccin de un solo reactante y un solo producto, es de suponer que la catlisis ocurra a travs del paso por varios estados transicionales que seran como mnimo los siguientes: E + S ==== ES ==== EP ==== E + P Esto implica que el perfil energtico de la reaccin cambiara a como se muestra en la figura 1.2, en donde podemos observar ahora tres picos de Energa de activacin. Si consideramos que la mayora de reacciones que ocurren en la naturaleza tienen ms de un sustrato y ms de un producto, el perfil energtico se har ms complejo pues mostrar ms intermediarios.

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Figura 1.2: Perfil energtico mnimo para una reaccin enzimtica de un solo sustrato y un solo producto; T1* corresponde al estado de transicin de la formacin del complejo ES, T2* es el complejo activado en el estado de transicin de la reaccin global y T3* es el estado de transicin de la formacin del complejo EP cuando la reaccin tiene lugar en la direccin de producto a reactante. Nota: Antiguamente se pensaba que las enzimas evolucionaban modificando su estructura para facilitar la unin con su sustrato, esto energticamente hablando, implicara una gran cada de la energa libre cuando se forma el complejo ES; los estudios termodinmicos actuales han demostrado que el nivel energtico de este complejo no debe ser muy bajo pues la reaccin caera en un pozo energtico del cual sera muy difcil salir; esto quiere decir que la enzima no necesariamente debe buscar una mayor afinidad por su sustrato durante su evolucin. TERMINOLOGA: SUSTRATO: Es el reactante; por el nmero de reactantes que participan en la reaccin, esta puede ser, monosustrato, bisustrato o multisustrato. De acuerdo a la nomenclatura propuesta por CLELAND, que es la que usaremos, stos deben ser nominados con las primeras letras del abecedario, en mayscula: A, B, C, D, etc. 10

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PRODUCTO: Es el resultado de la transformacin del sustrato o sustratos; las reacciones pueden tener uno o ms productos, los cuales deben ser nominados (de acuerdo a Cleland) como P, Q, R, S, etc. Nota: Cleland tambin propone su nomenclatura para designar a los diferentes estados que puede tomar la enzima durante la catlisis, esta utiliza las letras maysculas E, F, G, H, etc. SITIO DE UNIN DEL SUSTRATO: Es el lugar de la enzima donde tiene lugar la unin del sustrato o sustratos es decir, el lugar de reconocimiento del sustrato; si tomamos en cuenta que la mayora de enzimas tienen un tamao entre 30 y 50 kD y que la masa molecular media de la mayora de sustratos oscila entre 0,2 y 0,4 kD, por la diferencia de tamaos, la unin se da en un punto privilegiado de la protena. Existen reacciones en donde el sustrato es de mayor tamao que la enzima por ejemplo las reacciones de hidrlisis de protenas, polisacridos y cidos nucleicos. Para explicar la seleccin que hace la enzima para interactuar con su sustrato, el qumico Emil FISCHER en 1890 propuso el famoso modelo de llave - cerradura donde la llave es el sustrato y la cerradura la enzima, esto implicaba la existencia de una complementariedad de forma entre estos dos; esta propuesta era muy esttica y no explicaba apropiadamente la catlisis, tal como se la concibe en la actualidad. Muchos aos despus, en 1958 Daniel KOSHLAND propone el modelo de encaje inducido, el cual supone que durante el proceso de unin, tanto la enzima como el sustrato sufren cambios conformacionales los cuales en definitiva, explican la catlisis enzimtica, ver figura 1.3. Este tambin se conoce como modelo de guante mano.

Figura 1.3: Cambios conformacionales posibles durante la accin de una hidrolasa: 11

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La unin del sustrato a la enzima se da a travs de enlaces dbiles como, interacciones elctricas, interacciones hidrofbicas, puentes de hidrgeno, fuerzas de Vander Walls y enlaces covalentes dbiles; esto contribuye a que el proceso cataltico sea rpido. CENTRO ACTIVO: Es el lugar de la enzima donde ocurre la catlisis, generalmente este se encuentra en el sitio de unin del sustrato; lo interesante es que los aminocidos responsables del centro activo se encuentran muy alejados en la estructura primaria, as por ejemplo en la enzima quimotripsina los aminocidos involucrados en la catlisis son el aspartato 102, la histidina 57 y la serina 195. Hay muchos aminocidos en el centro activo que no tienen funcin cataltica (grupos secundarios), cuya funcin es evitar que otros sustratos se unan. COFACTOR: Existen enzimas que adems de su estructura proteica, requieren de un compuesto de distinta naturaleza el cual se une estrechamente, constituyendo un grupo prosttico; aproximadamente el 50% de las enzimas hasta hoy conocidas requieren de cofactor y este generalmente es un in metlico o la forma activa de una vitamina hidrosoluble. Es importante indicar que el cofactor es indispensable para la catlisis, si no esta presente, esta no se lleva a cabo .pues sufre cambios durante el proceso, para diferenciarlos de aquellos compuestos que actan como activadores de la enzima o estabilizadores de su estructura los que aumentan la velocidad de la catlisis pero no son imprescindibles en el proceso. Iones con funcin de cofactor: Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mg2+, Mn2+ y Co3+. Iones con funcin activadora o estabilizadora: normalmente son iones que pertenecen al grupo de los elementos alcalino o alcalino trreos como el Na+, el K+, el Mg2+, el Ca2+, etc. Los derivados de vitaminas hidrosolubles mas importantes que participan como cofactores los podemos ver en la Tabla 1.1. COENZIMA: Es un cofactor que no est unido estrechamente a la enzima, se caracteriza por ser dializable, por salir de la reaccin modificado, debiendo recuperar su forma inicial en otra reaccin enzimtica cercana; si se hace un ensayo enzimtico en donde participa, este debe ser agregado al medio; asimismo, durante un proceso de purificacin, este se pierde. Son coenzimas el NAD+, el NADP+, el Coenzima A y el Coenzima Q. 12

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TABLA 1.1: Vitaminas del complejo B que son cofactores enzimticos:

VITAMINA Tiamina Riboflavina Niacina Biotina Piridoxina Acido pantotnico Acido flico Cobalamina COFACTOR Tiamina pirofosfato (TPP) FAD y FMN NAD+ y NADP+ Biotina Piridoxal fosfato (PLP) Coenzima A Tetrahidrofolato (THF) Metilcobalamina, Cianocobalamina FUNCIN Descarboxilaciones Transferencia de hidrgenos Transferencia de hidrgenos Carboxilaciones y transferencia de grupos carboxilo Transferencia de distintos grupos funcionales Transferencia de grupos acilo Transferencia de grupos de un carbono Metilaciones y reordenamientos intramoleculares

El funcionamiento de una coenzima se observa en las siguientes reacciones:

Gliceraldehido 3 fosfato Pi Gliceraldehido 3P Deshidrogensa 1,3 bifosfoglicerato NADNADH H

+

Lactato

Lactato Deshidrogenasa Piruvato

Muchos autores consideran a las coenzimas como verdaderos sustratos; vale la pena indicar que antiguamente se llamaba coencimas a los cofactores de naturaleza orgnica. APOENZIMA: Parte proteica de una enzima HOLOENZIMA: Enzima completa es decir, apoenzima + cofactor ZIMGENO o PROENZIMA: Precursor inactivo que tienen algunas enzimas; la razn de su presencia es que no deben actuar en el tejido 13

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donde son sintetizados, sino en otro distinto. Tienen zimgeno las enzimas de la digestin, sintetizadas en el pncreas bajo la forma de tripsingeno, quimotripsingeno, precarboxipeptidasa, proelastasa, etc las cuales se transforman en tripsina, quimotripsina, carboxipeptidasa y elastasa respectivamente, al llegar al intestino delgado. Los zimgenos presentan un trozo de cadena peptdica adicional que cubre el centro activo de la enzima, este pequeo pptido generalmente es retirado por otra enzima, en el momento que debe actuar el catalizador. Tambin las enzimas de la coagulacin (factores de coagulacin) presentan zimgeno. ISOENZIMAS: Son ismeros de una misma enzima, catalizan la misma reaccin (la que debe ser reversible), pero con distinta afinidad por la direccin de la misma. Las enzimas que tienen isoenzimas son protenas oligomricas de cuya sntesis son responsables dos o ms genes, determinando muchos ismeros posibles cuyo nmero depende del nmero de cadenas peptdicas que tenga la enzima. Lactato deshidrogenasa enzima de la gliclisis, tiene cinco isoenzimas diferentes; cataliza la siguiente reaccin: LACTATO + NAD+ ====== PIRUVATO + NADH + H+ Esta enzima tiene cuatro cadenas peptdicas y de su sntesis son responsables dos genes los cuales son nominados como M y H, de tal suerte que pueden existir cinco ismeros posibles: MMMM, MMMH, MMHH, MHHH y HHHH; el primero se distribuye en msculo esqueltico (M de muscle) y es activo para la reaccin de derecha a izquierda, es decir para la formacin de lactato, en tanto que la ltima isoenzima se localiza en el msculo cardiaco (H de heart) y tiene afinidad por la reaccin de izquierda a derecha es decir, para formar piruvato; los ismeros hbridos, se distribuyen de una manera muy propia en los otros tejidos, dependiendo de la funcin de los mismos. Asimismo, los patrones isoenzimticos dentro de un mismo tejido pueden variar con el desarrollo, as, durante la oognesis de Telmatobius arequipensis, en los primeros estados del oocito abunda la isoenzima H4 mientras que en los ltimos la M4. Otro dato interesante de este anfibio es que la actividad especfica para LDH de los oocitos de los primeros estados es mucho ms alta que la de los ltimos, indicando que al inicio hay una alta tasa de gliclisis.

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Otro ejemplo interesante es la enzima Creatinoquinasa (CK), la cual tiene dos cadenas peptdicas y dos genes responsables de su sntesis: M de muscle y B de brain; las isoenzimas que forman son tres: MM, BB y MB, la ltima se localiza especficamente en corazn, razn por la cual la medida de su actividad en sangre es utilizada actualmente para monitorear cualquier problema cardiaco. ENZIMAS MARCADORAS: Son enzimas que se localizan especficamente en determinados tejidos, debido a la funcin particular que cumplen en ellos; esta caracterstica nos permite diagnosticar dao en el tejido implicado, cuando por destruccin del mismo, aumenta el nivel de la enzima en sangre, siendo la magnitud de la actividad de la enzima en la sangre un indicador del grado de dao del tejido afectado. En este sentido en el laboratorio clnico se realizan ensayos enzimticos para el diagnstico y tratamiento de muchas enfermedades, ver Tabla 1.2. TABLA 1.2: Ensayos de utilidad diagnstica en el Laboratorio Clnico.
ENZIMA Fosfatasa cida Fosfatasa alcalina Amilasa Transaminasa glutmico pirvica (TGP) Trasaminasa glutmico oxalactica (TGO) Lactato deshidrogenasa (LDH-H4) LDH-H3M Creatinoquinasa (CK-BB) LDH-M4 CK-MB CK-MM LDH-H2M2 Pepsina RGANO o ENFERMEDAD Carcinoma prosttico Hgado, enfermedad sea Enfermedad pancretica Hgado Enfermedad cardiaca Corazn Eritrocito Cerebro Msculo esqueltico Corazn Msculo esqueltico Cerebro, rin Estmago

Existen tambin enzimas marcadoras de estructuras subcelulares, lo cual es muy til en los procesos de purificacin enzimtica, ver Tabla 1.3.

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TABLA 1.3: Enzimas marcadoras de estructuras subcelulares.

Componente subcelular Ncleo Cloroplasto Membrana externa mitocondrial Membrana mitocondrial interna Matriz mitocondrial Lisosoma Peroxisoma Retculo endoplsmico Membrana plasmtica Citosol Enzima marcadora RNA polimerasa Ribulosa bifosfato carboxilasa Monoamino oxidasa Citocromo oxidasa Glutamato deshidrogenasa Fosfatasa cida Catalasa Glucosa 6 fosfatasa 5 nucleotidasa Lactato deshidrogenasa

REACCIONES ACOPLADAS: El ensayo cintico de una enzima puede no mostrar cambios fcilmente detectables a medida que la reaccin procede, por lo cual, muchas veces se acopla la reaccin a otra en la cual ocurren cambios convenientes de ser medidos; esto exige colocar en el ensayo, una cantidad suficiente de la segunda enzima as como de los sustratos de las dos reacciones que no son producidos durante la catlisis. En este principio se basan casi todas las determinaciones bioqumicas que se realizan en el laboratorio clnico, el cual le da a la determinacin una alta especificidad por un lado y una fcil y rpida medicin por otro. Un ejemplo de esto lo tenemos en la determinacin enzimtica de la glicemia, la cual tiene el siguiente esquema: Primera reaccin:
Glucosa oxidasa Glu cos a +O 2 +H 2 O cidogluc nico +H 2 O 2

Segunda reaccin:
H 2 O 2 +4 a m ofenazona in +fenol P eroxid asa quinona +4H 2 O

La quinona formada es de color rojo y de fcil determinacin, en tanto que la reaccin utiliza un tiempo de incubacin de tan solo cinco minutos.

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EJERCICIOS CAPTULO I
1. Indique las reacciones acopladas que participan en una determinacin de Transaminasa glutmico oxalactica (TGO) en suero sanguneo, en la cual se mezclan, la muestra de suero con aspartato, alfa cetoglutarato, NADH y un exceso de malato deshidrogenasa; explique el fundamento de la medicin.

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